JP2022088356A - 改変型ストレプトリジンｏ - Google Patents
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Abstract
【課題】抗原活性、熱安定性などの特性に優れた、ストレプトリジンＯ及びその製造法、並びにその用途を提供することを課題とする。【解決手段】特定のアミノ酸配列の２位のリジン残基から３１位のアラニン残基、３２位のグルタミン酸残基、３３位のセリン残基、３４位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、前記アミノ酸配列の４６５位のイソロイシン残基から４７２位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。【選択図】なし
Description
本発明はストレプトリジンＯ（以下、本明細書ではＳＬＯとも表記する。）及びその用途に関する。詳しくは、本発明はストレプトリジンＯ、及び当該タンパク質の生産菌、当該タンパク質の製造法、当該タンパク質を使用した抗ストレプトリジンＯ（Ａｎｔｉ Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ Ｏ）（以下、本明細書ではＡＳＯとも表記する。）の測定方法などに関する。
ＳＬＯは溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）が菌体外に生産する溶血活性を有するタンパク質で、溶血性連鎖球菌の感染有無を診断するためのＡＳＯ測定試薬の原料に広く使用されている。
従来、ＳＬＯの製造のためには、溶血性連鎖球菌が培養されてきたが、溶血性連鎖球菌のＳＬＯ生産性は非常に低く、溶血性連鎖球菌から製造されたＳＬＯは純度も低いため、ＳＬＯの品質が安定しないという問題があった。そこで、生産性の向上と安定性の向上を目的として、組換え大腸菌を利用したＳＬＯの研究が行われている（特許文献１、特許文献２、非特許文献１及び非特許文献２）。
しかしながら、組換え大腸菌を用いてＳＬＯを製造する場合、全長型ＳＬＯに加え、Ｃ末端側から少なくとも５０アミノ酸残基離れた領域で切断された低分子量型のＳＬＯも生産されることが報告されていた（非特許文献１）（非特許文献１では、全長型ＳＬＯは高分子量型ＳＬＯと記載されている）。非特許文献１では、組換え大腸菌を用いることで生産性は向上しているが、全長型ＳＬＯ（以下、本明細書ではＦｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｔｙｐｅとも表記する。）と低分子量型ＳＬＯの比率を工業スケールで制御することは難しく、品質の安定性という課題は克服できていない。
さらに、ＳＬＯは溶血活性を有するタンパク質であるため、製造者の安全性の観点から溶血活性は低減させることが望まれており、Ｃ末端の数アミノ酸残基を欠損させると溶血活性が低減することが報告されている（非特許文献２）。
ＭＩＣＨＡＥＬ Ａ． ＫＥＨＯＥ ｅｔ ａｌ．，ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤＩＭＭＵＮＩＴＹ，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．７，２７７６－２７７９，１９９５
ＡＫＩＲＡ ＴＡＫＥＴＯ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６５（１２），２６８２－２６８９，２００１，４５（１４），４４５５－６２
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、ＳＬＯの生産性が高く、全長型ＳＬＯと低分子量型ＳＬＯが混在せず、天然のＳＬＯと同等のエピトープを有するＳＬＯを提供することにある。また、製造の観点からは、溶血活性が無く、熱安定性の高いＳＬＯが望まれており、そのような特性も兼ね備えたＳＬＯを提供することにある。
本発明者は、上記目的を達成するために、ＳＬＯの発現領域を鋭意検討した結果、いずれの課題も克服するＳＬＯを見出した。具体的には、全長型ＳＬＯと低分子量型ＳＬＯの混在を防ぐために、Ｃ末端領域を欠損させた改変型ＳＬＯ（以下、本明細書ではＦｒａｇｍｅｎｔ ｔｙｐｅとも表記する。）を発現させた。
この改変型ＳＬＯはエピトープの損失の問題が懸念されたが、驚くべきことに、本発明者は、全長型ＳＬＯのＣ末端側の約１００アミノ酸残基の領域を欠損させても抗原活性は損失されず、むしろタンパク質あたりの抗原活性が全長型ＳＬＯに対して向上することを確認した。このことは、全長型ＳＬＯから削除した約１００アミノ酸残基の領域には重要なエピトープが存在しないことを意味する。
また、本発明者は、改変型ＳＬＯが溶血活性を損失していることを確認した。さらに、熱安定性に関しても、改変型ＳＬＯが全長型ＳＬＯに対して向上していることを見い出し、本発明を完成させた。
この改変型ＳＬＯはエピトープの損失の問題が懸念されたが、驚くべきことに、本発明者は、全長型ＳＬＯのＣ末端側の約１００アミノ酸残基の領域を欠損させても抗原活性は損失されず、むしろタンパク質あたりの抗原活性が全長型ＳＬＯに対して向上することを確認した。このことは、全長型ＳＬＯから削除した約１００アミノ酸残基の領域には重要なエピトープが存在しないことを意味する。
また、本発明者は、改変型ＳＬＯが溶血活性を損失していることを確認した。さらに、熱安定性に関しても、改変型ＳＬＯが全長型ＳＬＯに対して向上していることを見い出し、本発明を完成させた。
本発明は以上の知見ないし成果に基づくものであり、以下に示すＳＬＯを提供する。
［項１］
下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドからなるＳＬＯ；
（ａ）配列番号１に記載の２位のセリン残基から３１位のアラニン残基、３２位のグルタミン酸残基、３３位のセリン残基、３４位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号１に記載の４６５位のイソロイシン残基から４７２位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列のＮ末端領域もしくはＣ末端領域にタグを１つ以上有するポリペプチド。
（ｃ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド。
（ｄ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド。
［項２］
下記の（ｅ）～（ｉ）のいずれかのＤＮＡ：
（ｅ）項１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２において、Ｎ末端のａｔｇの配列を除く５’末端側の０、３、６または９個の塩基が欠損し、かつ、３’末端側の３ｎ（ｎは０から７のうちいずれかの整数）個の塩基が欠損した塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｇ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［項３］
以下の（ｋ）～（ｎ）のいずれかのＤＮＡ：
（ｋ）配列番号３において、Ｎ末端のａｔｇの配列を除く５’末端側の０、３、６または９個の塩基が欠損し、かつ、３’末端側の３ｎ（ｎは０から７のうちいずれかの整数）個の塩基が欠損した塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）配列番号３に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｍ）配列番号３に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｎ）配列番号３に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［項４］
項２または３に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
［項５］
項４に記載のベクターを含む形質転換体。
［項６］
項５に記載の形質転換体を培養することを含む、項１に記載のＳＬＯを製造する方法。
［項７］
項１に記載のＳＬＯを架橋処理して得られる架橋型ＳＬＯ。
［項８］
項１に記載のＳＬＯもしくは項７に記載の架橋型ＳＬＯがコーティングされたラテックス粒子。
［項９］
項８に記載のラテックス粒子を使用した抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）の測定方法。
［項１０］
項８に記載のラテックス粒子を含む抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）測定試薬。
［項１］
下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドからなるＳＬＯ；
（ａ）配列番号１に記載の２位のセリン残基から３１位のアラニン残基、３２位のグルタミン酸残基、３３位のセリン残基、３４位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号１に記載の４６５位のイソロイシン残基から４７２位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列のＮ末端領域もしくはＣ末端領域にタグを１つ以上有するポリペプチド。
（ｃ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド。
（ｄ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド。
［項２］
下記の（ｅ）～（ｉ）のいずれかのＤＮＡ：
（ｅ）項１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２において、Ｎ末端のａｔｇの配列を除く５’末端側の０、３、６または９個の塩基が欠損し、かつ、３’末端側の３ｎ（ｎは０から７のうちいずれかの整数）個の塩基が欠損した塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｇ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［項３］
以下の（ｋ）～（ｎ）のいずれかのＤＮＡ：
（ｋ）配列番号３において、Ｎ末端のａｔｇの配列を除く５’末端側の０、３、６または９個の塩基が欠損し、かつ、３’末端側の３ｎ（ｎは０から７のうちいずれかの整数）個の塩基が欠損した塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）配列番号３に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｍ）配列番号３に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｎ）配列番号３に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［項４］
項２または３に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
［項５］
項４に記載のベクターを含む形質転換体。
［項６］
項５に記載の形質転換体を培養することを含む、項１に記載のＳＬＯを製造する方法。
［項７］
項１に記載のＳＬＯを架橋処理して得られる架橋型ＳＬＯ。
［項８］
項１に記載のＳＬＯもしくは項７に記載の架橋型ＳＬＯがコーティングされたラテックス粒子。
［項９］
項８に記載のラテックス粒子を使用した抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）の測定方法。
［項１０］
項８に記載のラテックス粒子を含む抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）測定試薬。
本発明の改変型ＳＬＯは抗原活性、熱安定性に優れたＡＳＯ試薬に用いる診断薬原料として有用である。
（改変型ストレプトリジンＯ）
本発明の実施形態のひとつは、下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドからなるＳＬＯである。
（ａ）配列番号１に記載の２位のセリン残基から３１位のアラニン残基、３２位のグルタミン酸残基、３３位のセリン残基、３４位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号１に記載の４６５位のイソロイシン残基から４７２位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列のＮ末端領域もしくはＣ末端領域にタグを有するポリペプチド。
（ｃ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド。
（ｄ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド。
本発明の実施形態のひとつは、下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドからなるＳＬＯである。
（ａ）配列番号１に記載の２位のセリン残基から３１位のアラニン残基、３２位のグルタミン酸残基、３３位のセリン残基、３４位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号１に記載の４６５位のイソロイシン残基から４７２位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列のＮ末端領域もしくはＣ末端領域にタグを有するポリペプチド。
（ｃ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド。
（ｄ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド。
上記（ａ）のポリペプチドにおいて、配列番号１はＳＬＯの全長（全長型ＳＬＯ）であり５７１アミノ酸からなる。配列番号１の１位はＮ末端のメチオニンであり、本発明のＳＬＯは、Ｎ末端側において、２位から３１位、２位から３２位、２位から３３位、および、２位から３４位からなる群のうちいずれかが欠損している。Ｎ末端から３１残基までは分泌シグナルであって、本発明のＳＬＯを大腸菌等のグラム陰性菌で菌体内に発現させる場合には削除することが好ましい。菌体外に発現させる場合は、宿主に合わせた適当な分泌シグナルを付与してもよい。
また、本発明のＳＬＯは、Ｃ末端側において、４６５位から５７１位、４６６位から５７１位、４６７位から５７１位、４６８位から５７１位、４６９位から５７１位、４７０位から５７１位、４７１位から５７１位、および、４７２位から５７１位からなる群のうちいずれかが欠損している。
また、本発明のＳＬＯは、Ｃ末端側において、４６５位から５７１位、４６６位から５７１位、４６７位から５７１位、４６８位から５７１位、４６９位から５７１位、４７０位から５７１位、４７１位から５７１位、および、４７２位から５７１位からなる群のうちいずれかが欠損している。
上記の本発明のＳＬＯにおいて、Ｎ末端側の欠損とＣ末端側の欠損との組合せは特に限定されないが、好ましい例として、Ｎ末側の３２位からＣ末側の４６４位からなるポリペプチドが挙げられる（なお、本明細書では、このようなポリペプチドを、両端のアミノ酸の位置を示す数字をハイフンで結び、Ｎ３２－Ｃ４６４のようにも表す。）。それ以外に、Ｎ３２－Ｃ４６４、Ｎ３２－Ｃ４６６、Ｎ３２－Ｃ４７１、Ｎ３５－Ｃ４６４、Ｎ３５－Ｃ４６６、Ｎ３５－Ｃ４７１なども好ましいものとして挙げられる。
本発明のＳＬＯは、上記（ａ）のものに限定されず、
（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列のＮ末端領域もしくはＣ末端領域にタグを１つ以上有するポリペプチド。
（ｃ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加（本明細書ではこれらを一括して「改変」とも表す。）したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド、及び、
（ｄ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド、
も、含まれる。
（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列のＮ末端領域もしくはＣ末端領域にタグを１つ以上有するポリペプチド。
（ｃ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加（本明細書ではこれらを一括して「改変」とも表す。）したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド、及び、
（ｄ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド、
も、含まれる。
これは、タンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質であることが多いからである。
上記（ｂ）のポリペプチドにおいて、タグは特に限定されないが、Ｈｉｓタグ、ＨＱタグ、ＨＮタグ、ＨＡＴタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐ（II）タグ等のアフィニティータグなどが挙げられる。これらの中から１つ以上を選択することが好ましい。中でも、エピトープとしての機能を極力影響を及ぼさないという観点からすると、Ｈｉｓタグ、ＨＱタグ、ＨＮタグ、ＨＡＴタグ、Ｓｔｒｅｐ（II）タグ等が好ましい。Ｎ末端へのタグの挿入方法としては特に限定されないが、Ｎ末端のメチオニン残基の直下にタグが挿入されることが好ましい。また、数アミノ酸残基の後にタグを挿入してもよい。そのアミノ酸残基数としては特に限定されないが、好ましい上限は２０残基以下、さらに好ましくは１０残基以下、さらに好ましくは５残基以下であり、下限は１残基以上であれば良い。Ｃ末端へのタグの挿入方法としては特に限定されないが、終止コドンの直前にタグが挿入されることが好ましい。また、数アミノ酸残基前にタグを挿入してもよい。そのアミノ酸残基数としては特に限定されないが、好ましい上限は２０残基以下、さらに好ましくは１０残基以下、さらに好ましくは５残基以下であり、下限は１残基以上であれば良い。また、発現ベクター骨格にタグが含まれる場合は、遺伝子配列が適宜、削除されてもよい。
上記（ｃ）のポリペプチドにおいて「数個」の下限は２個である。上限はＡＳＯに対する抗原活性が維持される限り数は制限されないが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造やＡＳＯに対する抗原活性を大きく損なわない範囲であることが好ましい。例えば、全アミノ酸の２０％未満に相当する数であり、好ましくは１５％未満に相当する数、さらに好ましくは１０％未満に相当する数、さらに好ましくは５％未満に相当する数、さらに好ましくは１％未満に相当する数である。換言すれば、個数とは、例えば、１１４個以下、好ましくは８６個以下、さらに好ましくは５７個以下、さらに好ましくは２９個以下、さらに好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１５個以下、さらに好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下、さらに好ましくは４個以下、さらに好ましく３個以下である。
上記（ｃ）のポリペプチドにおいては、ＡＳＯに対する抗原活性が、後述の「ＳＬＯの抗原活性測定方法」で測定した場合、それぞれの改変前のタンパク質の５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上保持していることが望ましい。
上記（ｄ）のポリペプチドにおいて、上記（ａ）に示されるアミノ酸配列との同一性は８０％以上であることが好ましい。この同一性は、好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である。
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本明細書においては、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が公開している相同性検索プログラムであるＢＬＡＳＴのウェブサイトにおいてｂｌａｓｔｐを選択しデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、同一性を算出する。
あるポリペプチドがＡＳＯに対する抗原活性を有するかどうかは、後述の「ＳＬＯの抗原活性測定方法」にしたがって判断する。
ＡＳＯに対する抗原活性を有するタンパク質の改変体及びその遺伝子は、例えばＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製、ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；東洋紡製などの市販のキットやＰＣＲ法を利用して配列番号２に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。
得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の抗原活性は、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この形質転換体、この形質転換体の菌体破砕液もしくは精製した酵素タンパク質を後述の「ＳＬＯの抗原活性測定方法」で測定することによって確認することができる。
得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の抗原活性は、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この形質転換体、この形質転換体の菌体破砕液もしくは精製した酵素タンパク質を後述の「ＳＬＯの抗原活性測定方法」で測定することによって確認することができる。
（改変型ストレプトリジンＯをコードするＤＮＡ）
本発明の別の実施形態は、下記の（ｅ）～（ｉ）のいずれかのＤＮＡである。
（ｅ）上記の本発明のＳＬＯのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２において、Ｎ末端のａｔｇの配列を除く５’末端側の０、３、６または９個の塩基が欠損し、かつ、３’末端側の３ｎ（ｎは０から７のうちいずれかの整数）個の塩基が欠損した塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｇ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
本発明の別の実施形態は、下記の（ｅ）～（ｉ）のいずれかのＤＮＡである。
（ｅ）上記の本発明のＳＬＯのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２において、Ｎ末端のａｔｇの配列を除く５’末端側の０、３、６または９個の塩基が欠損し、かつ、３’末端側の３ｎ（ｎは０から７のうちいずれかの整数）個の塩基が欠損した塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｇ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
上記（ｅ）のＤＮＡにおいて、本発明のＳＬＯのアミノ酸配列は、上記の（ａ）～（ｄ）のいずれかに示されるＳＬＯのアミノ酸配列である。本発明のＤＮＡでは、前記アミノ酸配列における各アミノ酸に対応するコドンが複数ある場合は、その選択には特に制限はない。
上記（ｆ）のＤＮＡにおいて、配列番号２は、前記の配列番号１のアミノ酸で示される全長型ＳＬＯのメチオニン及び３２位から４７１位に相当する部分をコードしている。配列番号２において、開始コドンを除く５’末端側の３個の塩基が欠損したものは、配列番号１におけるＮ３３－Ｃ４７１をコードしていることになる。同様に、５’末端側の６個の塩基が欠損したものはＮ３４－Ｃ４７１を、５’末端側の９個の塩基が欠損したものはＮ３５－Ｃ４７１を、それぞれコードしていることになる。
また、３’末端側の３ｎ（ｎが１）個の塩基が欠損したものは、配列番号１におけるＮ３２－Ｃ４７０をコードしていることになる。同様に、３’末端側の３ｎ（ｎが２）個の塩基が欠損したものはＮ３２－Ｃ４６９を、３’末端側の３ｎ（ｎが３）個の塩基が欠損したものはＮ３２－Ｃ４６８を、３’末端側の３ｎ（ｎが４）個の塩基が欠損したものはＮ３２－Ｃ４６７を、３’末端側の３ｎ（ｎが５）個の塩基が欠損したものはＮ３２－Ｃ４６６を、３’末端側の３ｎ（ｎが６）個の塩基が欠損したものはＮ３２－Ｃ４６５を、３’末端側の３ｎ（ｎが７）個の塩基が欠損したものはＮ３２－Ｃ４６４を、それぞれコードしていることになる。
また、３’末端側の３ｎ（ｎが１）個の塩基が欠損したものは、配列番号１におけるＮ３２－Ｃ４７０をコードしていることになる。同様に、３’末端側の３ｎ（ｎが２）個の塩基が欠損したものはＮ３２－Ｃ４６９を、３’末端側の３ｎ（ｎが３）個の塩基が欠損したものはＮ３２－Ｃ４６８を、３’末端側の３ｎ（ｎが４）個の塩基が欠損したものはＮ３２－Ｃ４６７を、３’末端側の３ｎ（ｎが５）個の塩基が欠損したものはＮ３２－Ｃ４６６を、３’末端側の３ｎ（ｎが６）個の塩基が欠損したものはＮ３２－Ｃ４６５を、３’末端側の３ｎ（ｎが７）個の塩基が欠損したものはＮ３２－Ｃ４６４を、それぞれコードしていることになる。
上記の本発明のＤＮＡにおいて、５’末端側の欠損と３’末端側の欠損との組合せは特に限定されないが、好ましい例としては、上述の本発明のＳＬＯのＮ末端側の欠損とＣ末端側の欠損との組合せとして例示されているものをコードするＤＮＡが挙げられる。
また、本発明のＤＮＡは、上記（ｅ）、（ｆ）のものに限定されず、
（ｇ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｈ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び、
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
も含まれる。
（ｇ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｈ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び、
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
も含まれる。
これは、タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果としてタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質であることが多いからである。
また、本発明のＳＬＯをコードするＤＮＡを、由来生物以外の宿主生物（大腸菌など）に組込んで本発明のＳＬＯを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。コドンの至適化については、かずさＤＮＡ研究所が公開しているコドン使用頻度の一覧表（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）などを参考にして、コドンが最適化される。
例えば、宿主生物として大腸菌を選択した場合は、配列番号３のような人工配列が挙げられる。
また、本発明のＳＬＯをコードするＤＮＡを、由来生物以外の宿主生物（大腸菌など）に組込んで本発明のＳＬＯを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。コドンの至適化については、かずさＤＮＡ研究所が公開しているコドン使用頻度の一覧表（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）などを参考にして、コドンが最適化される。
例えば、宿主生物として大腸菌を選択した場合は、配列番号３のような人工配列が挙げられる。
上記（ｇ）のＤＮＡにおいて、配列番号２に示される塩基配列との同一性は８０％以上であることが好ましい。この同一性は、好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である。
塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本明細書においては、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が公開している相同性検索プログラムであるＢＬＡＳＴのウェブサイトにおいてｂｌａｓｔｎを選択しデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、同一性を算出する。
上記（ｈ）のＤＮＡにおいて、「ストリンジェントな条件」とは、一般には、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照して設定することができる。
本明細書では、「ストリンジェントな条件」とは、以下に示す条件を言う。ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ ＳＤＳ、１０％ デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いて約４２℃～約５０℃でインキュベーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて約６５℃～約７０℃で洗浄する条件を挙げることができる。
更に好ましいストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ ＳＤＳ、１０％ デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いて約４２℃～約５０℃でインキュベーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて約６５℃～約７０℃で洗浄する条件を挙げることができる。
このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、酵素活性を公知の手法で測定することによって容易に取り除くことができる。
上記（ｉ）のＤＮＡにおいて、「数個」の下限は２個である。上限は、そのＤＮＡがコードするポリペプチドのＡＳＯに対する抗原活性が維持されている限り数は制限されないが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造やＡＳＯに対する抗原活性を大きく損なわない範囲であることが好ましい。例えば、改変前のポリペプチドの全アミノ酸の２０％未満に相当する数であり、好ましくは１５％未満に相当する数、さらに好ましくは１０％未満に相当する数、さらに好ましくは５％未満に相当する数、さらに好ましくは１％未満に相当する数である。換言すれば、個数とは、例えば、２６４個以下（全アミノ酸の２０％に相当する塩基数）、好ましくは１９８個以下（１５％）、さらに好ましくは１３２個以下（１０％）、さらに好ましくは６６個以下（５％）、さらに好ましくは４０個以下、さらに好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１５個以下、さらに好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下、さらに好ましくは４個以下、さらに好ましく３個以下である。
あるＤＮＡが、ＡＳＯに対する抗原活性を有するポリペプチドをコードしているかどうかは、そのＤＮＡを、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、得られたポリペプチドのＡＳＯに対する抗原活性を後述の「ＳＬＯの抗原活性測定方法」で測定することによって判断する。
本発明の別の実施形態は、以下の（ｋ）～（ｎ）のいずれかのＤＮＡである。
（ｋ）配列番号３において、５’末端側の０、３、６または９個の塩基が欠損し、かつ、３’末端側の３ｎ（ｎは０から７のうちいずれかの整数）個の塩基が欠損した塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）配列番号３に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｍ）配列番号３に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｎ）配列番号３に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｋ）配列番号３において、５’末端側の０、３、６または９個の塩基が欠損し、かつ、３’末端側の３ｎ（ｎは０から７のうちいずれかの整数）個の塩基が欠損した塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）配列番号３に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｍ）配列番号３に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｎ）配列番号３に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
上記（ｋ）～（ｎ）のＤＮＡにおいて、配列番号３は、本発明のＳＬＯをコードするＤＮＡを由来生物以外の宿主生物に組込んで発現させるにあたり、発現効率向上等を目的として、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更したものであり、宿主生物として大腸菌を選択した場合に好ましく適用されるものとして例示される。
上記（ｋ）～（ｎ）のＤＮＡにおいて、塩基の欠損についての説明、塩基配列の同一性の計算方法についての説明、ストリンジェントな条件の説明、当該ＤＮＡがＡＳＯに対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするものであるか確認する方法の説明、改変個数の上限・下限の説明などについては、上記の（ｆ）～（ｉ）のＤＮＡで記載した内容を準用する。
（ストレプトリジンＯの製造方法等）
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のＤＮＡを組み込んだベクター、前記のベクターを含む形質転換体、または、前記の形質転換体を培養することを含む前記のＳＬＯを製造する方法、である。
本発明のＳＬＯは、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のＤＮＡを組み込んだベクター、前記のベクターを含む形質転換体、または、前記の形質転換体を培養することを含む前記のＳＬＯを製造する方法、である。
本発明のＳＬＯは、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
ベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター、ウィルスベクター等が包含される。組換えベクターの調製は、特に限定されないが常法に従って行えばよく、例えば、これらのベクターに、本発明のＳＬＯの遺伝子を適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより容易に行うことができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。
また、宿主細胞としては、従来公知のものが使用可能であり、組換え発現系が確立しているものであれば特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌、放線菌、麹菌、酵母といった微生物ならびに昆虫細胞、動物細胞、高等植物などが挙げられ、より好ましくは微生物が挙げられ、特に好ましくは大腸菌（例えば、Ｋ１２株、Ｂ株など）が挙げられる。形質転換体の調製は、特に限定されないが常法に従って行えばよい。宿主が大腸菌の場合、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＢＬ２１などが用いられ、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＱＥ、ｐＥＴなどが例として挙げられる。宿主が酵母の場合は、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリス、ピキア・パストリスなどが例として挙げられ、ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが挙げられる。宿主が糸状菌細胞である場合は、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ等を例示することができる。
得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適当な培養条件で一定期間培養すれば、組込まれた遺伝子から本発明のＳＬＯが発現されて、形質転換体中に蓄積する。
形質転換体中に蓄積した本発明のＳＬＯは、未精製のまま用いることができるが、精製したものを使用しても良い。この精製方法としては、特に限定されないが従来公知のものが使用可能であり、例えば、培養後の形質転換体あるいはその培養物を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこからタンパク質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ－６Ｂ （ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ－６Ｂ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。
（ストレプトリジンＯの架橋）
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のＳＬＯを架橋処理して得られる架橋型ＳＬＯである。
ＳＬＯは、安定化するために二官能価物質に共有結合させてもよい。従って、本発明の改変型ＳＬＯも、二官能価物質への共有結合が行われても良く、そのような二官能価物質の例は、グルタルアルデヒド及びカルボジイミドである。グルタルアルデヒドのアルデヒド基とアミノ基との反応によって形成されるシッフ塩基は水溶液中で不安定なため、シアノ水素化ホウ素ナトリウムや水素化ホウ素ナトリウムによって、還元的アミノ化反応が行われても良い。共有結合は、その共有結合がｐＨ又は温度変化により影響されない点で、物理的に不可逆的である。架橋処理の際は、バッファーの種類、ｐＨ、処理温度、処理時間、ＳＬＯ濃度、二官能化物質の濃度を設定する必要があるが、ＳＬＯ及び架橋型ＳＬＯに悪影響を与えない条件であれば良く、特に限定されない。下記に一例を示す。バッファーは、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液などのグッドバッファー、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液，ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液などが例示される。ｐＨ条件は、ｐＨ５～ｐＨ１１の範囲が好ましく、さらに好ましくはｐＨ６～ｐＨ１０の条件である。温度条件は、４℃～４０℃が好ましく、さらに好ましくは１０℃～３０℃の条件である。タンパク濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの条件が好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌの条件が好ましい。反応時間は、１分～２４時間の反応が好ましく、さらに好ましくは１０分～５時間の反応が好ましい。架橋反応における二官能化物質の濃度は、０．０００１％～１％の条件が好ましく、さらに好ましくは、０．００１％～０．１％の条件である。架橋反応後、未架橋のグルタルアルデヒドがさらに反応するのを防ぐために終濃度０．１％～１０％グリシンが添加されてもよい。
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のＳＬＯを架橋処理して得られる架橋型ＳＬＯである。
ＳＬＯは、安定化するために二官能価物質に共有結合させてもよい。従って、本発明の改変型ＳＬＯも、二官能価物質への共有結合が行われても良く、そのような二官能価物質の例は、グルタルアルデヒド及びカルボジイミドである。グルタルアルデヒドのアルデヒド基とアミノ基との反応によって形成されるシッフ塩基は水溶液中で不安定なため、シアノ水素化ホウ素ナトリウムや水素化ホウ素ナトリウムによって、還元的アミノ化反応が行われても良い。共有結合は、その共有結合がｐＨ又は温度変化により影響されない点で、物理的に不可逆的である。架橋処理の際は、バッファーの種類、ｐＨ、処理温度、処理時間、ＳＬＯ濃度、二官能化物質の濃度を設定する必要があるが、ＳＬＯ及び架橋型ＳＬＯに悪影響を与えない条件であれば良く、特に限定されない。下記に一例を示す。バッファーは、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液などのグッドバッファー、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液，ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液などが例示される。ｐＨ条件は、ｐＨ５～ｐＨ１１の範囲が好ましく、さらに好ましくはｐＨ６～ｐＨ１０の条件である。温度条件は、４℃～４０℃が好ましく、さらに好ましくは１０℃～３０℃の条件である。タンパク濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの条件が好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌの条件が好ましい。反応時間は、１分～２４時間の反応が好ましく、さらに好ましくは１０分～５時間の反応が好ましい。架橋反応における二官能化物質の濃度は、０．０００１％～１％の条件が好ましく、さらに好ましくは、０．００１％～０．１％の条件である。架橋反応後、未架橋のグルタルアルデヒドがさらに反応するのを防ぐために終濃度０．１％～１０％グリシンが添加されてもよい。
（ラテックス粒子）
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のＳＬＯもしくは架橋型ＳＬＯがコーティングされたラテックス粒子である。
本発明に用いるラテックス粒子としては、特に限定されず、例えば、ポリスチレン、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックス粒子の平均粒径は特に限定されないが、被検物質の被検試料中での濃度あるいは測定機器の検出感度などを考慮し、０．０５μｍ～１．０μｍのものが適宜選択される。
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のＳＬＯもしくは架橋型ＳＬＯがコーティングされたラテックス粒子である。
本発明に用いるラテックス粒子としては、特に限定されず、例えば、ポリスチレン、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックス粒子の平均粒径は特に限定されないが、被検物質の被検試料中での濃度あるいは測定機器の検出感度などを考慮し、０．０５μｍ～１．０μｍのものが適宜選択される。
（抗原を固定化したラテックス粒子）
本発明のラテックス粒子における改変型ＳＬＯの固定化方法は、特に限定されず、物理吸着（疎水結合）法、化学結合法等を適宜選択することができる。物理吸着（疎水結合）法においては、ポリハプテンを形成させて吸着させる方法、化学結合法においてはマレイミド基などの結合性の官能基を抗原に導入したりすることができる。抗原をラテックスに吸着させる際は、バッファーの種類、ｐＨ、処理温度、処理時間、ＳＬＯ濃度を設定する必要があるが、特に限定されない。下記に一例を示す。バッファーは、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液などのグッドバッファー、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液，ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液などが例示される。ｐＨ条件は、ｐＨ５～ｐＨ１１の範囲が好ましく、さらに好ましくはｐＨ６～ｐＨ１０の条件である。温度条件は、４℃～４０℃が好ましく、さらに好ましくは１０℃～３０℃の条件である。ＳＬＯ濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌ～３０ｍｇ／ｍｌの条件が好ましく、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ～３ｍｇ／ｍｌの条件が好ましい。反応時間は、１分～２４時間の反応が好ましく、さらに好ましくは１０分～５時間の反応が好ましい。また、非特異反応を抑制するためや免疫測定試薬自体の安定性を高めるために、特に限定されるものではないが、１種類もしくは２種類以上の添加剤を含んだ状態でＳＬＯをラテックスに吸着させてもよい。
本発明のラテックス粒子における改変型ＳＬＯの固定化方法は、特に限定されず、物理吸着（疎水結合）法、化学結合法等を適宜選択することができる。物理吸着（疎水結合）法においては、ポリハプテンを形成させて吸着させる方法、化学結合法においてはマレイミド基などの結合性の官能基を抗原に導入したりすることができる。抗原をラテックスに吸着させる際は、バッファーの種類、ｐＨ、処理温度、処理時間、ＳＬＯ濃度を設定する必要があるが、特に限定されない。下記に一例を示す。バッファーは、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液などのグッドバッファー、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液，ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液などが例示される。ｐＨ条件は、ｐＨ５～ｐＨ１１の範囲が好ましく、さらに好ましくはｐＨ６～ｐＨ１０の条件である。温度条件は、４℃～４０℃が好ましく、さらに好ましくは１０℃～３０℃の条件である。ＳＬＯ濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌ～３０ｍｇ／ｍｌの条件が好ましく、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ～３ｍｇ／ｍｌの条件が好ましい。反応時間は、１分～２４時間の反応が好ましく、さらに好ましくは１０分～５時間の反応が好ましい。また、非特異反応を抑制するためや免疫測定試薬自体の安定性を高めるために、特に限定されるものではないが、１種類もしくは２種類以上の添加剤を含んだ状態でＳＬＯをラテックスに吸着させてもよい。
（測定試薬）
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のラテックス粒子を使用したＡＳＯの測定方法、または、上記の本発明のラテックス粒子を含むＡＳＯ測定試薬である。
本発明の免疫測定試薬を用いる免疫測定法もまた、本発明の１つである。本発明の免疫測定法としては、本発明の免疫測定試薬を用いるのであれば特に限定されず、通常の方法により行うことができる。例えば、被測定物質を含む媒体に本発明の免疫測定試薬を加え、被測定物質と本発明の免疫測定試薬に含まれるラテックス粒子上に固定された抗原とが抗原抗体反応により結合して生じた凝集を光学的に観察または目視により観察する。反応のｐＨの好ましい下限は５、上限は１０であり、より好ましい下限は６、上限は９である。反応の温度の好ましい下限は４℃、上限は５０℃であり、より好ましい下限は２０℃、上限は４０℃である。反応時間は適宜決められる。
上記媒体としては、被測定物質の種類に応じて適当な各種緩衝液が用いられる。かかる緩衝液としては、被測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、各種グッド緩衝液等の公知の緩衝液が挙げられる。これらの緩衝液は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
上記媒体は、反応の感度を高めるために公知の水溶性添加剤、例えばポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコシルエチルメタクリレート、プルラン、デキストラン、エルシナン等の水溶性高分子等を含有してもよい。また、特異性の向上、試薬の安定性向上等の目的から、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質又はその分解物、変性物；塩化コリン等の第４級アンモニウム塩、ＥＤＴＡ、ポリアニオン、カオトロピックイオン（Ｃｌ－，Ｉ－，ＳＣＮ－等）、アミノ酸、界面活性剤等を含有してもよい。また、防腐剤として、例えば、アジ化ナトリウムやフェニルメタンスルホニルフルオリドなどを含有してもよい。
上記抗原抗体反応によって生じた凝集の度合いを検出する方法は特に限定されないが、例えば光学的な観察又は目視により観察することにより検出される。具体的には、不溶性担体の凝集の程度を光学的に検出する方法としては、例えば、散乱光強度、吸光度又は透過光強度の増加又は減少を測定する方法等が挙げられる。また、目視により観察して判定する方法としては、例えば、試料と本発明の免疫測定試薬とを判定板上で混合し、１～５分間揺り動かしたあと、凝集の有無を判定する方法等が挙げられる。また、像を撮影し画像処理を施してもよい。
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のラテックス粒子を使用したＡＳＯの測定方法、または、上記の本発明のラテックス粒子を含むＡＳＯ測定試薬である。
本発明の免疫測定試薬を用いる免疫測定法もまた、本発明の１つである。本発明の免疫測定法としては、本発明の免疫測定試薬を用いるのであれば特に限定されず、通常の方法により行うことができる。例えば、被測定物質を含む媒体に本発明の免疫測定試薬を加え、被測定物質と本発明の免疫測定試薬に含まれるラテックス粒子上に固定された抗原とが抗原抗体反応により結合して生じた凝集を光学的に観察または目視により観察する。反応のｐＨの好ましい下限は５、上限は１０であり、より好ましい下限は６、上限は９である。反応の温度の好ましい下限は４℃、上限は５０℃であり、より好ましい下限は２０℃、上限は４０℃である。反応時間は適宜決められる。
上記媒体としては、被測定物質の種類に応じて適当な各種緩衝液が用いられる。かかる緩衝液としては、被測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、各種グッド緩衝液等の公知の緩衝液が挙げられる。これらの緩衝液は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
上記媒体は、反応の感度を高めるために公知の水溶性添加剤、例えばポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコシルエチルメタクリレート、プルラン、デキストラン、エルシナン等の水溶性高分子等を含有してもよい。また、特異性の向上、試薬の安定性向上等の目的から、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質又はその分解物、変性物；塩化コリン等の第４級アンモニウム塩、ＥＤＴＡ、ポリアニオン、カオトロピックイオン（Ｃｌ－，Ｉ－，ＳＣＮ－等）、アミノ酸、界面活性剤等を含有してもよい。また、防腐剤として、例えば、アジ化ナトリウムやフェニルメタンスルホニルフルオリドなどを含有してもよい。
上記抗原抗体反応によって生じた凝集の度合いを検出する方法は特に限定されないが、例えば光学的な観察又は目視により観察することにより検出される。具体的には、不溶性担体の凝集の程度を光学的に検出する方法としては、例えば、散乱光強度、吸光度又は透過光強度の増加又は減少を測定する方法等が挙げられる。また、目視により観察して判定する方法としては、例えば、試料と本発明の免疫測定試薬とを判定板上で混合し、１～５分間揺り動かしたあと、凝集の有無を判定する方法等が挙げられる。また、像を撮影し画像処理を施してもよい。
（ＳＬＯの抗原活性測定方法）
本発明において、ＳＬＯの抗原活性測定は以下の条件で行う。本抗原活性測定方法は、ＳＬＯが固定化されたラテックス粒子と被検試料中のＳＬＯ（被検物質）とを競合させて、当該ラテックス粒子と抗体との免疫複合体の形成を阻害し、免疫複合体の形成阻害に伴う当該ラテックス粒子の凝集阻害の程度から被検物質（抗原）を測定する方法である。なお、本明細書で「抗原活性」という場合は、具体的には、特に断りのない限り、以下の方法で測定した値を意味する。
＜試薬＞
デンカ生研社製 ＡＳＯラテックスＸ１「生研」 Ｒ１試薬（緩衝液）
デンカ生研社製 ＡＳＯラテックスＸ１「生研」 Ｒ２試薬（ラテックス（ＳＬＯ吸着ラテックス）浮遊液）
デンカ生研社製 ＡＳＯ標準液（５００ ＩＵ／ｍｌ）
＜測定試料＞
測定試料は、デンカ生研社製ＡＳＯ標準液（５００ ＩＵ／ｍｌ）、生理食塩水及びＳＬＯ溶液が５：４：１の比率で混合されたものが使用する。また、ＳＬＯ溶液は必要に応じて、２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）で希釈された後、使用された。盲検はＳＬＯ溶液の代わりにＳＬＯを希釈する２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）が使用する。
＜測定方法＞
上記の測定試料、上記のＲ１試薬及び上記Ｒ２試薬を下記条件で日立７１７０形自動分析装置を用いて、試料中のＳＬＯのＡＳＯに対する抗原活性（ＳＡＵ／ｍｇ：ＳｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎＯ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｕｎｉｔ／ｍｇ）を測定する。
試料 ： ３μＬ（ＡＳＯ標準液（２５０ ＩＵ／ｍｌ）を含む）
Ｒ１試薬 ： ７０μＬ
Ｒ２試薬 ： １２０μＬ
測定方法 ： ２ポイントエンド法（１９－３４）
主波長 ： ５７０ｎｍ
副波長 ： ８００ｎｍ
抗原活性（ＳＡＵ／ｍｇ）＝｛（測定値（ＢＬＡＮＫ）－測定値（ＴＥＳＴ）｝×１０×ＳＬＯ溶液の希釈率／タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）
本発明において、ＳＬＯの抗原活性測定は以下の条件で行う。本抗原活性測定方法は、ＳＬＯが固定化されたラテックス粒子と被検試料中のＳＬＯ（被検物質）とを競合させて、当該ラテックス粒子と抗体との免疫複合体の形成を阻害し、免疫複合体の形成阻害に伴う当該ラテックス粒子の凝集阻害の程度から被検物質（抗原）を測定する方法である。なお、本明細書で「抗原活性」という場合は、具体的には、特に断りのない限り、以下の方法で測定した値を意味する。
＜試薬＞
デンカ生研社製 ＡＳＯラテックスＸ１「生研」 Ｒ１試薬（緩衝液）
デンカ生研社製 ＡＳＯラテックスＸ１「生研」 Ｒ２試薬（ラテックス（ＳＬＯ吸着ラテックス）浮遊液）
デンカ生研社製 ＡＳＯ標準液（５００ ＩＵ／ｍｌ）
＜測定試料＞
測定試料は、デンカ生研社製ＡＳＯ標準液（５００ ＩＵ／ｍｌ）、生理食塩水及びＳＬＯ溶液が５：４：１の比率で混合されたものが使用する。また、ＳＬＯ溶液は必要に応じて、２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）で希釈された後、使用された。盲検はＳＬＯ溶液の代わりにＳＬＯを希釈する２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）が使用する。
＜測定方法＞
上記の測定試料、上記のＲ１試薬及び上記Ｒ２試薬を下記条件で日立７１７０形自動分析装置を用いて、試料中のＳＬＯのＡＳＯに対する抗原活性（ＳＡＵ／ｍｇ：ＳｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎＯ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｕｎｉｔ／ｍｇ）を測定する。
試料 ： ３μＬ（ＡＳＯ標準液（２５０ ＩＵ／ｍｌ）を含む）
Ｒ１試薬 ： ７０μＬ
Ｒ２試薬 ： １２０μＬ
測定方法 ： ２ポイントエンド法（１９－３４）
主波長 ： ５７０ｎｍ
副波長 ： ８００ｎｍ
抗原活性（ＳＡＵ／ｍｇ）＝｛（測定値（ＢＬＡＮＫ）－測定値（ＴＥＳＴ）｝×１０×ＳＬＯ溶液の希釈率／タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
［実施例１］ＳＬＯ遺伝子のクローニング
配列番号２に記載の人工合成遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ００３４８５）を鋳型とし、表１に記載のプライマーを用いて、各種ＳＬＯ遺伝子を増幅した（表１において、Ｆｗはフォワードプライマー、Ｒｖはリバースプライマーを表す。）。具体的には、開始コドン、ヒスチジンタグの後に、３２位のグルタミン酸残基が続き、４６４位のリジン残基を末端とするＳＬＯ（これをＮ３２－Ｃ４６４とも表記する）をコードする遺伝子は、配列番号４及び６のプライマーを用いて増幅した。同様に、Ｎ３２－Ｃ４６６、Ｎ３２－Ｃ４７１、Ｎ３５－Ｃ４６４、Ｎ３５－Ｃ４６６、Ｎ３５－Ｃ４７１、Ｎ３２－Ｃ５６０及びＮ３２－Ｃ５７１の各ＳＬＯをコードする遺伝子の増幅には、配列番号４及び７、配列番号４及び８、配列番号５及び６、配列番号５及び７、配列番号５及び８、配列番号４及び９、ならびに、配列番号４及び１０のプライマーをそれぞれ用いた。なお、本プライマーのＮ末端側には制限酵素サイトＮｄｅＩが、Ｃ末端側には制限酵素サイトＢａｍＨＩが、それぞれ付加されており、このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＢＳＫと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ライゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてＳＬＯ遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドｐＢＳＫＳＬＯ（Ｎ３２－Ｃ４６４、Ｎ３２－Ｃ４６６、Ｎ３２－Ｃ４７１、Ｎ３５－Ｃ４６４、Ｎ３５－Ｃ４６６、Ｎ３５－Ｃ４７１、Ｎ３２－Ｃ５６０及びＮ３２－Ｃ５７１）を取得した。
配列番号２に記載の人工合成遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ００３４８５）を鋳型とし、表１に記載のプライマーを用いて、各種ＳＬＯ遺伝子を増幅した（表１において、Ｆｗはフォワードプライマー、Ｒｖはリバースプライマーを表す。）。具体的には、開始コドン、ヒスチジンタグの後に、３２位のグルタミン酸残基が続き、４６４位のリジン残基を末端とするＳＬＯ（これをＮ３２－Ｃ４６４とも表記する）をコードする遺伝子は、配列番号４及び６のプライマーを用いて増幅した。同様に、Ｎ３２－Ｃ４６６、Ｎ３２－Ｃ４７１、Ｎ３５－Ｃ４６４、Ｎ３５－Ｃ４６６、Ｎ３５－Ｃ４７１、Ｎ３２－Ｃ５６０及びＮ３２－Ｃ５７１の各ＳＬＯをコードする遺伝子の増幅には、配列番号４及び７、配列番号４及び８、配列番号５及び６、配列番号５及び７、配列番号５及び８、配列番号４及び９、ならびに、配列番号４及び１０のプライマーをそれぞれ用いた。なお、本プライマーのＮ末端側には制限酵素サイトＮｄｅＩが、Ｃ末端側には制限酵素サイトＢａｍＨＩが、それぞれ付加されており、このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＢＳＫと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ライゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてＳＬＯ遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドｐＢＳＫＳＬＯ（Ｎ３２－Ｃ４６４、Ｎ３２－Ｃ４６６、Ｎ３２－Ｃ４７１、Ｎ３５－Ｃ４６４、Ｎ３５－Ｃ４６６、Ｎ３５－Ｃ４７１、Ｎ３２－Ｃ５６０及びＮ３２－Ｃ５７１）を取得した。
［実施例２］各種ＳＬＯ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現及び精製
実施例１で構築した各種のプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製コンピテントハイＪＭ１０９）を当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した５ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌後、３０℃で１６時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液を種培養液とし、５００ｍｌの坂口フラスコに入った１００ｍＬのＴＢ培地（ＩＰＴＧ１ｍＭ、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌し、振とう数１８０ｒｐｍで３０℃、２０時間培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離で集菌し、２０ｍＭイミダゾールを含む２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）に懸濁し、ガラスビーズを用いて破砕し、得られた粗酵素を、２０ｍＭイミダゾールを含む２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ１ｍＬ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）に供し、５００ｍＭイミダゾールを含む２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）で溶出することで、Ｎ３２－Ｃ５６０の発現コンストラクトを除き、高い純度のストレプトリジン溶液を得た。さらに、純度を向上させるため、ＣＭ ＦＦカラム５ｍＬ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）により分離精製することで、不純タンパク質がＳＤＳ－ＰＡＧＥレベルでは検出できないほど、純度を向上させることに成功した。前記で調製した各サンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果は図１に示す。なお、Ｃ末端を１１残基削除したＮ３２－Ｃ５６０の発現コンストラクトにおいては、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ１ｍＬ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）での溶出画分にて、全長型のバンドに加えて、分解産物とみられる低分子量型のＳＬＯが確認された（図２）。
実施例１で構築した各種のプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製コンピテントハイＪＭ１０９）を当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した５ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌後、３０℃で１６時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液を種培養液とし、５００ｍｌの坂口フラスコに入った１００ｍＬのＴＢ培地（ＩＰＴＧ１ｍＭ、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌し、振とう数１８０ｒｐｍで３０℃、２０時間培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離で集菌し、２０ｍＭイミダゾールを含む２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）に懸濁し、ガラスビーズを用いて破砕し、得られた粗酵素を、２０ｍＭイミダゾールを含む２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ１ｍＬ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）に供し、５００ｍＭイミダゾールを含む２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）で溶出することで、Ｎ３２－Ｃ５６０の発現コンストラクトを除き、高い純度のストレプトリジン溶液を得た。さらに、純度を向上させるため、ＣＭ ＦＦカラム５ｍＬ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）により分離精製することで、不純タンパク質がＳＤＳ－ＰＡＧＥレベルでは検出できないほど、純度を向上させることに成功した。前記で調製した各サンプルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果は図１に示す。なお、Ｃ末端を１１残基削除したＮ３２－Ｃ５６０の発現コンストラクトにおいては、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ１ｍＬ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）での溶出画分にて、全長型のバンドに加えて、分解産物とみられる低分子量型のＳＬＯが確認された（図２）。
［実施例３］溶血活性の評価
実施例２において調製した各ＳＬＯ溶液の溶血活性をそれぞれ測定した。測定方法としては、まず、ＰＢＳ溶液で２％に希釈されたウサギ脱繊維血液(日本バイオテスト研究所製)１ｍｌに対し、２０ｍＭシステインを含むＰＢＳ溶液で希釈されたＳＬＯ５０μｌを添加し、３７℃で１時間反応させた。なお、測定時のＳＬＯ溶液のタンパク質濃度は、全て１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で測定された。結果は表２に示した通り、全長型のＳＬＯ（Ｎ３２－Ｃ５７１）は、溶血の程度を表す５４１ｎｍの吸収（Ａ５４１）が検出され、改変型ＳＬＯに関しては、Ｂｌａｎｋとの有意な差はなく、溶血活性（Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を損失していることが確認された。
実施例２において調製した各ＳＬＯ溶液の溶血活性をそれぞれ測定した。測定方法としては、まず、ＰＢＳ溶液で２％に希釈されたウサギ脱繊維血液(日本バイオテスト研究所製)１ｍｌに対し、２０ｍＭシステインを含むＰＢＳ溶液で希釈されたＳＬＯ５０μｌを添加し、３７℃で１時間反応させた。なお、測定時のＳＬＯ溶液のタンパク質濃度は、全て１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で測定された。結果は表２に示した通り、全長型のＳＬＯ（Ｎ３２－Ｃ５７１）は、溶血の程度を表す５４１ｎｍの吸収（Ａ５４１）が検出され、改変型ＳＬＯに関しては、Ｂｌａｎｋとの有意な差はなく、溶血活性（Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を損失していることが確認された。
［実施例４］抗原活性の測定
実施例２において調製した各ＳＬＯ溶液及びＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯ（Ｃｏｄｅ：Ｔ３０００－５２５８）を用いて、抗原活性を測定した。ＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図３に示すが、全長型ＳＬＯと比較して、約４０ｋＤａ、分子量が大きいことを確認した。この結果から融合タンパク質であることが示唆されたため、本明細書では、ＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯをＦｕｓｉｏｎ ｔｙｐｅとも表記する。抗原活性の測定結果は図４に示す。なお、測定時のＳＬＯ溶液のタンパク質濃度は、改変型ＳＬＯは、０．０８ｍｇ／ｍｌの濃度で、全長型ＳＬＯは、０．１１ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯは、０．１６ｍｇ／ｍｌの濃度で測定された。改変型ＳＬＯは、全長型ＳＬＯに対して、高い抗原活性を示した。本結果は、削除した約１００アミノ酸残基の領域には重要なエピトープが存在しないことを示している。また、ＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯの抗原活性は全長型ＳＬＯよりも低いことを確認した。
実施例２において調製した各ＳＬＯ溶液及びＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯ（Ｃｏｄｅ：Ｔ３０００－５２５８）を用いて、抗原活性を測定した。ＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図３に示すが、全長型ＳＬＯと比較して、約４０ｋＤａ、分子量が大きいことを確認した。この結果から融合タンパク質であることが示唆されたため、本明細書では、ＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯをＦｕｓｉｏｎ ｔｙｐｅとも表記する。抗原活性の測定結果は図４に示す。なお、測定時のＳＬＯ溶液のタンパク質濃度は、改変型ＳＬＯは、０．０８ｍｇ／ｍｌの濃度で、全長型ＳＬＯは、０．１１ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯは、０．１６ｍｇ／ｍｌの濃度で測定された。改変型ＳＬＯは、全長型ＳＬＯに対して、高い抗原活性を示した。本結果は、削除した約１００アミノ酸残基の領域には重要なエピトープが存在しないことを示している。また、ＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯの抗原活性は全長型ＳＬＯよりも低いことを確認した。
［実施例５］熱安定性の評価
実施例２において調製した各ＳＬＯ溶液及びＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯ（Ｃｏｄｅ：Ｔ３０００－５２５８）を用いて、熱処理後の抗原活性測定により、熱安定性を評価した。結果を図５に示す。なお、測定時のＳＬＯ溶液のタンパク質濃度は、２．０ｍｇ／ｍｌの濃度において、各温度で６時間処理され、その後、抗原活性を測定することにより、熱安定性を評価した。その結果、改変型ＳＬＯは、全長型ＳＬＯに対して、熱安定性が高まっており、実用上、有益な特性を獲得していることを確認した。また、ＢＩＯＫＩＴ社製のＳＬＯ（Ｃｏｄｅ：Ｔ３０００－５２５８）よりも、熱安定性が優れていることを確認した。
実施例２において調製した各ＳＬＯ溶液及びＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯ（Ｃｏｄｅ：Ｔ３０００－５２５８）を用いて、熱処理後の抗原活性測定により、熱安定性を評価した。結果を図５に示す。なお、測定時のＳＬＯ溶液のタンパク質濃度は、２．０ｍｇ／ｍｌの濃度において、各温度で６時間処理され、その後、抗原活性を測定することにより、熱安定性を評価した。その結果、改変型ＳＬＯは、全長型ＳＬＯに対して、熱安定性が高まっており、実用上、有益な特性を獲得していることを確認した。また、ＢＩＯＫＩＴ社製のＳＬＯ（Ｃｏｄｅ：Ｔ３０００－５２５８）よりも、熱安定性が優れていることを確認した。
［実施例６］大腸菌発現でのコドンユーセージ至適化
大腸菌での発現量を向上させるため、コドンユーセージの至適化を行った。人工合成された配列は、配列番号３に示す。実施例１及び２に記載と同様の手法で、発現プラスミドを構築した。プラスミドの作成に用いたプライマーは、表３に示す。構築したプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製コンピテントハイＪＭ１０９）に当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した５ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌後、３０℃で１６時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液を種培養液とし、５００ｍｌの坂口フラスコに入った１００ｍＬのＴＢ培地（ＩＰＴＧ１ｍＭ、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌し、振とう数１８０ｒｐｍで３０℃、２０時間培養した。その結果、約３００ｍｇ／Ｌの改変型ＳＬＯの発現を確認した。この値は、コドンユーセージの至適化前の約２倍に相当し、コドン配列の至適化により、生産性が向上していることが確認された。
大腸菌での発現量を向上させるため、コドンユーセージの至適化を行った。人工合成された配列は、配列番号３に示す。実施例１及び２に記載と同様の手法で、発現プラスミドを構築した。プラスミドの作成に用いたプライマーは、表３に示す。構築したプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製コンピテントハイＪＭ１０９）に当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した５ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌後、３０℃で１６時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液を種培養液とし、５００ｍｌの坂口フラスコに入った１００ｍＬのＴＢ培地（ＩＰＴＧ１ｍＭ、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌し、振とう数１８０ｒｐｍで３０℃、２０時間培養した。その結果、約３００ｍｇ／Ｌの改変型ＳＬＯの発現を確認した。この値は、コドンユーセージの至適化前の約２倍に相当し、コドン配列の至適化により、生産性が向上していることが確認された。
［実施例７］ラテックス比濁測定用試薬における感度評価
実施例２において調製した各ＳＬＯ溶液及びＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯ（Ｃｏｄｅ：Ｔ３０００－５２５８）を２．２ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、終濃度０．１％となるよう２５％グルタルアルデヒド溶液（Ｓｉｇｍａ社製、Ｃｏｄｅ：Ｇ５８８２）を添加した。次に、その溶液を室温で１時間、機械的に攪拌する。その後、グリシンを添加し、０．１％の最終濃度にする。次に、その溶液を室温で３０分間、機械的に撹拌した後、４℃で一晩保存した。その後、ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を算出し、ラテックス粒子にコーディングされた。コーティング条件としては、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）から構成される緩衝液であって、架橋されたＳＬＯの終濃度が図６に記載の通り、０．３～０．７ｍｇ／ｍｌとなるようそれぞれ混合され、３７℃で１時間、コーティング処理を実施した。その後、遠心、上清の除去、懸濁の洗浄工程を１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５％ＢＳＡを含む５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ８．２）で２回繰り返すことで、ラテックス比濁測定用試薬における第２試薬を得た。また、第１試薬として、２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡからなる緩衝液を調製し、ラテックス試薬の感度評価を行った。測定方法としては、第１試薬と第２試薬を組合せ、日立７１７０形自動分析装置を用いてＡＳＯ濃度依存的な粒子凝集塊の形成を確認した。具体的には、濃度０（ＩＵ／ｍＬ）、２５０（ＩＵ／ｍＬ）、５００（ＩＵ／ｍＬ）のＡＳＯ溶液３μＬに、第１試薬２４０μＬを加えて３７℃で５分間加温後、第２試薬６０μＬを加えて攪拌した。その後５分間の凝集形成に伴う吸光度変化（ΔｍＡｂｓ）を、主波長５４６ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定した。その結果、ラテックスへコーティングする際のＳＬＯ濃度が０．７ｍｇ／ｍｌ、ＡＳＯ濃度５００（ＩＵ／ｍｌ）の条件では、ＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯのΔｍＡｂｓが７８．１、全長型ＳＬＯのΔｍＡｂｓが６６．９であるのに対し、本発明の改変型ＳＬＯは、約２～３倍の１８３．１であった。また、ＳＬＯ濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ、ＡＳＯ濃度５００（ＩＵ／ｍｌ）の条件においても、ＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯのΔｍＡｂｓが６０．２、全長型ＳＬＯのΔｍＡｂｓが３８．９であるのに対し、本発明の改変型ＳＬＯは、約２～３倍の１１４．２であった。本結果により、本発明の改変型ＳＬＯはタンパク質あたりの抗原活性が高く、ＡＳＯ試薬の製造に使用するＳＬＯの量を低減できることが示された。
実施例２において調製した各ＳＬＯ溶液及びＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯ（Ｃｏｄｅ：Ｔ３０００－５２５８）を２．２ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、終濃度０．１％となるよう２５％グルタルアルデヒド溶液（Ｓｉｇｍａ社製、Ｃｏｄｅ：Ｇ５８８２）を添加した。次に、その溶液を室温で１時間、機械的に攪拌する。その後、グリシンを添加し、０．１％の最終濃度にする。次に、その溶液を室温で３０分間、機械的に撹拌した後、４℃で一晩保存した。その後、ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を算出し、ラテックス粒子にコーディングされた。コーティング条件としては、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）から構成される緩衝液であって、架橋されたＳＬＯの終濃度が図６に記載の通り、０．３～０．７ｍｇ／ｍｌとなるようそれぞれ混合され、３７℃で１時間、コーティング処理を実施した。その後、遠心、上清の除去、懸濁の洗浄工程を１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５％ＢＳＡを含む５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ８．２）で２回繰り返すことで、ラテックス比濁測定用試薬における第２試薬を得た。また、第１試薬として、２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡからなる緩衝液を調製し、ラテックス試薬の感度評価を行った。測定方法としては、第１試薬と第２試薬を組合せ、日立７１７０形自動分析装置を用いてＡＳＯ濃度依存的な粒子凝集塊の形成を確認した。具体的には、濃度０（ＩＵ／ｍＬ）、２５０（ＩＵ／ｍＬ）、５００（ＩＵ／ｍＬ）のＡＳＯ溶液３μＬに、第１試薬２４０μＬを加えて３７℃で５分間加温後、第２試薬６０μＬを加えて攪拌した。その後５分間の凝集形成に伴う吸光度変化（ΔｍＡｂｓ）を、主波長５４６ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定した。その結果、ラテックスへコーティングする際のＳＬＯ濃度が０．７ｍｇ／ｍｌ、ＡＳＯ濃度５００（ＩＵ／ｍｌ）の条件では、ＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯのΔｍＡｂｓが７８．１、全長型ＳＬＯのΔｍＡｂｓが６６．９であるのに対し、本発明の改変型ＳＬＯは、約２～３倍の１８３．１であった。また、ＳＬＯ濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ、ＡＳＯ濃度５００（ＩＵ／ｍｌ）の条件においても、ＢＩＯＫＩＴ社製ＳＬＯのΔｍＡｂｓが６０．２、全長型ＳＬＯのΔｍＡｂｓが３８．９であるのに対し、本発明の改変型ＳＬＯは、約２～３倍の１１４．２であった。本結果により、本発明の改変型ＳＬＯはタンパク質あたりの抗原活性が高く、ＡＳＯ試薬の製造に使用するＳＬＯの量を低減できることが示された。
本発明の改変型ＳＬＯは抗原活性、熱安定性に優れたＡＳＯ試薬に用いる診断薬原料として有用である。
Claims (10)
- 下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドからなるストレプトリジンＯ；
（ａ）配列番号１に記載の２位のセリン残基から３１位のアラニン残基、３２位のグルタミン酸残基、３３位のセリン残基、３４位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号１に記載の４６５位のイソロイシン残基から４７２位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列のＮ末端領域もしくはＣ末端領域にタグを１つ以上有するポリペプチド。
（ｃ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列において、８６個以下のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド。
（ｄ）上記（ａ）に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチド。 - 下記の（ｅ）～（ｉ）のいずれかのＤＮＡ：
（ｅ）請求項１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２において、Ｎ末端のａｔｇの配列を除く５’末端側の０、３、６または９個の塩基が欠損し、かつ、３’末端側の３ｎ（ｎは０から７のうちいずれかの整数）個の塩基が欠損した塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｇ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｉ）配列番号２に示される塩基配列において、２６４個以下の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。 - 以下の（ｋ）～（ｎ）のいずれかのＤＮＡ：
（ｋ）配列番号３において、Ｎ末端のａｔｇの配列を除く５’末端側の０、３、６または９個の塩基が欠損し、かつ、３’末端側の３ｎ（ｎは０から７のうちいずれかの整数）個の塩基が欠損した塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）配列番号３に示される塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｍ）配列番号３に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｎ）配列番号３に示される塩基配列において、２６４個以下の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。 - 請求項２または３に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
- 請求項４に記載のベクターを含む形質転換体。
- 請求項５に記載の形質転換体を培養することを含む、請求項１に記載のストレプトリジンＯを製造する方法。
- 請求項１に記載のストレプトリジンＯを架橋処理して得られる架橋型ストレプトリジンＯ。
- 請求項１に記載のストレプトリジンＯもしくは項７に記載の架橋型ストレプトリジンＯがコーティングされたラテックス粒子。
- 請求項８に記載のラテックス粒子を使用した抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）の測定方法。
- 請求項８に記載のラテックス粒子を含む抗ストレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）測定試薬。
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