WO2016063926A1 - 精製方法、精製キット、および、これらに用いられる酸化ケイ素結合タグ - Google Patents

精製方法、精製キット、および、これらに用いられる酸化ケイ素結合タグ Download PDF

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WO2016063926A1
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silicon oxide
binding
polypeptide
tag
arginine
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PCT/JP2015/079753
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章夫 黒田
丈 池田
久景 舟橋
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国立大学法人広島大学
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    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a purification method, a purification kit, and a silicon oxide binding tag used in these.
  • proteins related to silicon oxide have been discovered, and these proteins can be used in various applications (for example, technology for polymerizing silicon oxide, technology for immobilizing a desired substance on silicon oxide, and immobilization on silicon oxide). Attempts have been made to use it in a technique for purifying a desired desired material.
  • Patent Document 1 discloses a specific protein (CotG protein) derived from Bacillus bacteria and a fragment polypeptide thereof.
  • silica is polymerized using the above-described protein and a fragment of the protein.
  • Patent Document 2 discloses a specific protein (SBP: silica-material-binding-protein) that can bind to silicon oxide (for example, silica) and a tag derived from the protein.
  • SBP silica-material-binding-protein
  • a desired protein is immobilized on silicon oxide via a tag using a fusion protein of the tag and the desired protein.
  • Patent Document 3 discloses a specific protein (SBP: silica-material-binding-protein) that can bind to silicon oxide (for example, silica) and a tag derived from the protein.
  • SBP silica-material-binding-protein
  • a desired protein is immobilized on silicon oxide via a tag using a fusion protein of a tag and a desired protein, and further, a divalent cation-containing solution is used to Are dissociated from silicon oxide.
  • Patent Document 4 discloses a peptide capable of binding to silicon dioxide.
  • a desired protein is immobilized on silicon dioxide via a peptide using a fusion protein of the peptide and the desired protein, and further, the desired protein is obtained using an arginine-containing solution. Is dissociated from silicon dioxide.
  • the fusion protein in order to prevent proteins other than the target fusion protein from non-specifically adsorbing to silicon oxide or silicon dioxide, the fusion protein is removed from the silicon oxide or silicon dioxide in a solution containing a high concentration of salt. It is fixed on the top.
  • a high-purity fusion protein is purified by using a solution containing a high-concentration salt.
  • JP 2012-31100 A (published February 16, 2012) WO2007 / 055288 (released May 18, 2007)
  • Japanese Published Patent Publication “Japanese Patent Laid-Open No. 2010-37222” (published on February 18, 2010)
  • Japanese Patent Publication “JP 2009-136280 A” (published on June 25, 2009)
  • this technique has a problem in that there is a possibility that a substance (in particular, protein) to be purified is denatured by a divalent cation.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and the object thereof is a target substance using a silicon oxide binding tag and a method for specifically dissociating the silicon oxide binding tag from silicon oxide. And a silicon oxide-binding tag used in the purification method.
  • the present inventors In the process of studying the mechanism by which prokaryotes (for example, Bacillus cereus) take up silicic acid into the body, the present inventors have (i) the specificity between a Bacillus-derived protein having a binding ability to silicon oxide and silicon oxide. And (ii) a complex of a silicon oxide binding tag and a substance can be specifically bound to silicon oxide in a binding solution to which no salt is added. The inventors have found that unnecessary substances other than the complex can be prevented from binding to silicon oxide, and as a result, the complex can be purified with high yield and high purity, and the present invention has been completed.
  • the method for purifying a complex of the present invention specifically binds a complex of a silicon oxide binding tag and a substance to silicon oxide in a binding solution to which no salt is added. And a dissociation step of dissociating the complex from the silicon oxide, wherein the dissociation step is a step of dissociating the bond between the silicon oxide binding tag and the silicon oxide with arginine. It is characterized by being.
  • the binding solution is preferably a solution comprising a pH buffer solution and a solvent, or a solution comprising a pH buffer solution, a surfactant and a solvent.
  • the substance is preferably a protein.
  • the dissociation step is a step of bringing the complex bound to silicon oxide into contact with an eluent containing arginine, and the eluent is the silicon oxide-binding tag.
  • a dissociating agent for dissociating specific bond between silicon and silicon oxide it is preferable to contain only arginine.
  • the silicon oxide is preferably contained in shirasu.
  • the silicon oxide binding tag includes a polypeptide, and it is preferable that 5/14 or more and less than 7/7 of all amino acids constituting the polypeptide is arginine. .
  • the polypeptide is preferably composed of 14 or less amino acids.
  • the polypeptide preferably contains at least part of the polypeptide described in (a) or (b) below; (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 20 or 21; (B) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 20, or 21 and has an ability to bind to silicon oxide. Polypeptide.
  • the silicon oxide-binding tag of the present invention is a silicon oxide-binding tag comprising a polypeptide composed of 7 or less amino acids, and 3 / of all amino acids constituting the polypeptide. 7 or more and less than 7/7 is characterized by arginine.
  • the polypeptide preferably contains at least a part of the polypeptide described in the following (c) or (d); (C) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, (D) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having a binding ability to silicon oxide.
  • the kit of the present invention is a kit for purifying a complex of a silicon oxide binding tag and a substance, the column comprising silicon oxide as a stationary phase for separation, Between a silicon oxide binding tag that binds to silicon oxide, a binding solution that does not contain a salt for specifically binding the complex to the silicon oxide, and between the silicon oxide binding tag and the silicon oxide And a dissociation solution containing arginine for dissociating the bonds.
  • the target substance can be purified with high purity.
  • the present invention can purify the target substance with a high recovery rate.
  • a silicon oxide binding tag having a small size can be designed. Therefore, if the silicon oxide binding tag is linked to a desired substance (for example, a polymer such as a protein), the structure of the desired substance Can be prevented from changing greatly.
  • a silicon oxide binding tag when a silicon oxide binding tag is linked to a desired substance (eg, a polymer such as a protein), the desired substance is prevented from losing its function (eg, enzyme activity). be able to.
  • Arginine has an effect of stabilizing the structure of a target substance (for example, protein) (in other words, an aggregation suppressing effect). Therefore, the present invention can purify the target substance without losing its function (for example, enzyme activity).
  • a target substance for example, protein
  • Arginine has a low molecular weight and can be easily removed by dialysis or the like. Therefore, the present invention can easily remove arginine from the purified product.
  • the complex is specifically bound to silicon oxide via the silicon oxide conjugate.
  • the complex is eluted from the column by dissociating the specific binding with arginine. That is, in the present invention, arginine is used as a dissociator used to elute the complex from the column.
  • arginine stabilizes the protein structure. Therefore, in the above-described prior art, arginine is used in combination as a stabilizer that simply prevents protein denaturation during elution.
  • citric acid in other words, an acidic solution
  • arginine is used as a protein stabilizer.
  • ammonium sulfate is used as a dissociating agent
  • arginine is used as a protein stabilizer.
  • arginine has the ability to dissociate a silicon oxide conjugate from silicon oxide, and there is no such technical idea.
  • a substance to be purified can be purified with a high purity and a high recovery rate.
  • the method for purifying the complex according to the present embodiment includes a binding step in which a complex of a silicon oxide binding tag and a substance is specifically bound to silicon oxide in a binding solution to which no salt is added.
  • a dissociation step of dissociating the body from silicon oxide, and the dissociation step is a step of dissociating the bond between the silicon oxide binding tag and the silicon oxide with arginine.
  • a binding solution to which no salt is added prevents unnecessary substances other than the complex from binding non-specifically to silicon oxide.
  • Contemplated are solutions in which no salt intended (eg, NaCl, KCl, or ammonium sulfate) is intentionally added.
  • a substance that is not intended to prevent non-specific binding of an unnecessary substance other than the complex to silicon oxide, and a substance for adjusting the property of the binding solution to a desired property contain salts, and adding these substances to the binding solution may result in the binding solution containing salt.
  • a binding solution is included in the category of the “binding solution to which no salt is added” of the present invention.
  • a complex is prepared using a living body (for example, an expression vector into which a polynucleotide encoding the complex is inserted is introduced into a microorganism such as Escherichia coli or yeast.
  • a biological lysate it is possible to use a biological lysate as a binding solution.
  • the binding solution contains a salt derived from a living body, but the binding solution is also included in the category of the “binding solution to which no salt is added” of the present invention.
  • binding solution to which no salt is added examples include a solution composed of a pH buffer solution and a solvent, or a solution composed of a pH buffer solution, a surfactant and a solvent.
  • pH buffer More specific examples of the pH buffer include Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, MOPS buffer, and citrate buffer, and more specific examples of surfactants.
  • Tween 20 registered trademark
  • Tween 80 registered trademark
  • Triton X-100 registered trademark
  • n-octylglucoside and CHAPS.
  • More specific examples of the solvent include water, Examples include, but are not limited to, acetonitrile, DMSO, glycerol, and mixtures thereof.
  • the binding solution is a substance that is not intended to prevent unnecessary substances other than the complex from binding non-specifically to silicon oxide. Salts derived from substances to modulate can be included. Even in this case, the concentration of the salt contained in the binding solution is preferably as low as possible from the viewpoint of increasing the purification purity of the complex.
  • the concentration of the salt contained in the binding solution is preferably, for example, 0 mM to 100 mM, more preferably 0 mM to 80 mM, further preferably 0 mM to 60 mM, and further preferably 0 mM to 40 mM. 0 mM to 20 mM is more preferable, and 0 mM is most preferable.
  • the silicon oxide binding tag is a tag having binding ability to silicon oxide (for example, silicon dioxide (silica), quartz, cristobalite, silica gel, etc.). Therefore, by linking the silicon oxide binding tag and the desired substance (the combination of the silicon oxide binding tag and the substance is also called a complex of the silicon oxide binding tag and the substance), the silicon oxide binding tag The desired substance can be bonded to silicon oxide via In the purification method of the present embodiment, the specific bond between the silicon oxide binding tag and the silicon oxide is dissociated by arginine.
  • the specific structure of the silicon oxide to which the silicon oxide binding tag binds is not particularly limited, but is preferably silicon oxide contained in shirasu (in other words, a mixture of volcanic ash and pumice).
  • shirasu may be used instead of silicon oxide.
  • the complex of the silicon oxide binding tag and the substance can be purified with a high purification purity and a high recovery rate.
  • the low-cost purification method is realizable.
  • “Shirasu” refers to particles of pumice and volcanic ash that are distributed as a stratum in the southern area of Kyushu, and that contain silicon oxide as a component.
  • binding ability to silicon oxide means that an excessive amount of silicon oxide (for example, silicon oxide having a mass 1000 times that of the silicon oxide binding tag) and the silicon oxide binding tag are mixed in a desired aqueous solution at room temperature for 30 minutes. It can be measured by contacting and measuring the amount of silicon oxide binding tag that binds to silicon oxide.
  • the silicon oxide binding tag is silicon oxide. If it can bind to the peptide, it can be determined that the peptide has the ability to bind to silicon oxide.
  • the percentage of the silicon oxide binding tag bonded to the silicon oxide is determined by, for example, bringing the silicon oxide and the silicon oxide binding tag into contact with each other, and then separating the supernatant into a precipitate by centrifugation. And the precipitate are subjected to SDS-PAGE, and then the gel used for SDS-PAGE is stained by a desired method, and the band corresponding to the silicon oxide binding tag observed in the gel is compared. Can do.
  • aqueous solution used for the contact between the excessive amount of silicon oxide and the silicon oxide-binding tag examples include 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0).
  • an aqueous solution used for contacting an excessive amount of silicon oxide with a silicon oxide-bonded tag is a surfactant (for example, polyoxyethylene sorbitan monolaurate (more specifically, Tween 20 (registered trademark))). It may be a 25 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0).
  • the binding between the silicon oxide binding tag and the silicon oxide maintained in the 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) is defined as “specific binding”. Furthermore, it is maintained in a 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing a surfactant (for example, polyoxyethylene sorbitan monolaurate (more specifically, Tween 20 (registered trademark)).
  • a surfactant for example, polyoxyethylene sorbitan monolaurate (more specifically, Tween 20 (registered trademark)
  • the bond between the silicon oxide binding tag and the silicon oxide is defined as “more specific bond” among the “specific bonds”.
  • the concentration of the surfactant in the aqueous solution is 0.05% (v / v), more preferably 0.1% (v / v), more preferably 0.5% (v / v), more preferably 1.0% (v / v), most preferably 1.5% (v / v).
  • the silicon oxide binding tag is not particularly limited as long as it has a binding ability to silicon oxide and can dissociate a specific bond with silicon oxide by arginine.
  • the silicon oxide binding tag preferably comprises a polypeptide.
  • the type of amino acid constituting the polypeptide is not particularly limited, but 5/14 or more and less than 7/7 of all amino acids constituting the polypeptide is arginine. More preferably, 5/14 or more and 6/7 or less of all amino acids are arginine, more preferably 5/14 or more and 5/7 or less of all amino acids are arginine, and 5/14 or more of all amino acids. More preferably, 4/7 or less is arginine, and most preferably 5/14 or more and 3/7 or less of all amino acids is arginine.
  • the number of amino acids constituting the polypeptide is not particularly limited, but is preferably 100 or less, more preferably 90 or less, more preferably 80 or less, Preferably it is 70 or less, more preferably 60 or less, more preferably 50 or less, more preferably 40 or less, more preferably 30 or less, more preferably 20 or less, still more preferably 14 or less, more preferably Is 10 or less, most preferably 7 or less.
  • the silicon oxide binding tag is the larger the structure of the desired substance can be prevented when the silicon oxide binding tag is linked to the desired substance.
  • the smaller the silicon oxide binding tag the more functional the desired substance (eg, enzyme activity) when the silicon oxide binding tag is linked to the desired substance (eg, a polymer such as a protein). You can prevent losing.
  • the smaller the silicon oxide binding tag is, the more the solubility of the complex of the silicon oxide binding tag and the substance in an aqueous solution can be increased when the silicon oxide binding tag is linked to a desired substance.
  • the silicon oxide binding tag is provided with a polypeptide, the number of amino acids constituting the polypeptide is preferably 14 or less, and more preferably 7 or less.
  • the polypeptide constituting the silicon oxide binding tag comprises at least a part of the polypeptide described in (a) or (b) below, or consists of the polypeptide described in (a) or (b) below: May be. That means (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 20 or 21; (B) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 20, or 21 and has an ability to bind to silicon oxide. Polypeptide.
  • polypeptide consisting of the amino acids described in SEQ ID NOs: 1, 3 and 5 is a partial peptide of CotB1 protein derived from prokaryotic Bacillus cereus (for example, Bacillus cereus ATCC 14579).
  • Polypeptides consisting of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 20 and 21 (SEQ ID NO: 20 amino acid sequence: GRKKRRQRRRPPQ, SEQ ID NO: 21 amino acid sequence: YGRKKRRQRRR) are TAT (Transactivatorivatof transcription) involved in the transcriptional control of human immunodeficiency virus It is a partial peptide of a protein.
  • the partial peptide has been identified as an intracellular translocation peptide having a function of translocating the TAT protein into the cell.
  • the polypeptide described in (b) above is an amino acid sequence in which one or several amino acids other than arginine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 20, or 21 are deleted, substituted, or added. And a polypeptide having a binding ability to silicon oxide. If it is the said structure, not only can a silicon oxide bond tag bind
  • “one or several amino acids are deleted, substituted or added” means that deletion or substitution is performed by a known mutant peptide production method such as site-directed mutagenesis. Or a number that can be added (preferably 9 or less, more preferably 8 or less, more preferably 7 or less, more preferably 6 or less, more preferably 5 or less, more preferably 4 or less, more preferably Means that 3 amino acids or less, more preferably 2 amino acids or less, most preferably 1 amino acids or less) are deleted, substituted or added.
  • the peptide described in the above (b) is preferably 30% or more, more preferably 35% or more, more preferably 40% or more, more preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 20 or 21. Is at least 45%, more preferably at least 50%, more preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably It may be a polypeptide having an amino acid sequence having a homology of 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more, and having a binding ability to silicon oxide. .
  • the homology of amino acid sequences can be determined by a known method. Specifically, GENETYX-WIN (manufactured by Genetics Co., Ltd.) is used in accordance with the GENETYX-WIN manual, for example, a homology search (homology search) between a specific amino acid sequence and an amino acid sequence to be compared is performed, and the same The homology can be calculated as the percentage (%) of amino acids. More specifically, the homology can be calculated as the ratio (%) of the number of identical amino acids to the total number of amino acids in the longer amino acid sequence of the amino acid sequences to be compared.
  • Preferred mutations include amino acid substitutions, deletions, or additions. Of the mutations described above, amino acid substitutions are more preferred.
  • amino acid substitution is not particularly limited, and examples thereof include substitution in which any amino acid is substituted with glycine or alanine. More specifically, examples of amino acid substitution include substitution in which serine, glycine, alanine or glutamine is substituted with glycine or alanine. Of course, the present invention is not limited to the above-described substitutions.
  • the silicon oxide binding tag can be easily produced according to any technique known in the art.
  • the silicon oxide-binding tag comprises a polypeptide
  • the polypeptide may be chemically synthesized or produced by genetic engineering.
  • the chemical synthesis method include a solid phase method and a liquid phase method.
  • various commercially available peptide synthesizers Model MultiPep RS (Intavis AG) etc.
  • a forced expression system using prokaryotes (for example, E. coli etc.) or eukaryotes (for example, yeast) can be used.
  • the substance to which the above-described silicon oxide binding tag is linked is not particularly limited, and may be a desired substance.
  • the substance include a polypeptide (in other words, a protein), a nucleic acid, a sugar, a low molecular compound, or a high molecular compound.
  • a polypeptide in other words, a protein
  • a polypeptide is used. preferable.
  • the method for linking the silicon oxide binding tag to the substance is not particularly limited, and a desired method can be used as appropriate.
  • a well-known crosslinking agent in other words, a linker
  • a linker can be used to link a silicon oxide binding tag to a substance.
  • the silicon oxide binding tag comprises a polypeptide and the substance to which the silicon oxide binding tag is linked is a polypeptide
  • the silicon oxide binding tag and the substance (polypeptide) are combined into one fusion protein.
  • the silicon oxide binding tag may be arranged at the amino terminus of the substance (polypeptide), may be arranged inside the substance (polypeptide), or the substance (polypeptide) It may be arranged at the carboxyl end. From the viewpoint of keeping the structure of the substance (polypeptide) stable, it is preferably arranged at the amino terminus or the carboxyl terminus.
  • the purification method of the present embodiment has a dissociation step of dissociating specific bonds between the silicon oxide binding tag and silicon oxide with arginine.
  • the substance to which the silicon oxide binding tag is linked specifically binds to silicon oxide via the silicon oxide binding tag.
  • the specific bond between the silicon oxide binding tag and the silicon oxide is dissociated by arginine.
  • the dissociation step can be performed, for example, by bringing a complex bound to silicon oxide (specifically, a complex of a silicon oxide binding tag and a substance) into contact with an eluent containing arginine.
  • a complex bound to silicon oxide specifically, a complex of a silicon oxide binding tag and a substance
  • the specific bond between the silicon oxide binding tag and the silicon oxide is dissociated by arginine, so the eluate dissociates the specific bond between the silicon oxide binding tag and the silicon oxide.
  • arginine As a dissociator to be used, it is only necessary to contain arginine.
  • the eluate contains arginine, and NaCl, KCl, ammonium sulfate, a surfactant (for example, polyoxyethylene sorbitan monolaurate or Triton X-100 (registered trademark)), acetonitrile, Alternatively, it may be a solvent not containing citric acid (for example, water, Tris-HCl buffer, HEPES buffer, or phosphate buffer).
  • a surfactant for example, polyoxyethylene sorbitan monolaurate or Triton X-100 (registered trademark)
  • acetonitrile Alternatively, it may be a solvent not containing citric acid (for example, water, Tris-HCl buffer, HEPES buffer, or phosphate buffer).
  • the eluate contains arginine, and contains NaCl, KCl, ammonium sulfate, a surfactant (for example, polyoxyethylene sorbitan monolaurate or Triton X-100 (registered trademark)), acetonitrile, and citric acid.
  • a solvent not containing at least one selected from the group consisting of water for example, water, Tris-HCl buffer, HEPES buffer, or phosphate buffer may be used.
  • the eluate contains arginine, and contains NaCl, KCl, ammonium sulfate, a surfactant (for example, polyoxyethylene sorbitan monolaurate or Triton X-100 (registered trademark)), acetonitrile, and citric acid.
  • a surfactant for example, polyoxyethylene sorbitan monolaurate or Triton X-100 (registered trademark)
  • acetonitrile for example, sodium citric acid.
  • the eluate may be a solvent containing only arginine (for example, water or Tris-HCl buffer).
  • the concentration of arginine contained in the eluate is not particularly limited, but is preferably 0.01 M or more, more preferably 0.05 M or more, more preferably 1.0 M or more, more preferably 1.5 M. It is above, Most preferably, it is 2.0M or more.
  • the upper limit of the concentration of arginine is not particularly limited, and may be 10M, 9.0M, 8.0M, 7.0M, 6.0M, 5.0M, 4.0M, or 3.0M. . According to the said structure, the coupling
  • the pH of the eluate is not particularly limited, but is preferably pH 6.0 or more and pH 9.0 or less, more preferably pH 7.0 or more and 8.0 or less. According to the said structure, the coupling
  • the purification method of the present embodiment can include steps other than the dissociation step.
  • the purification method of the present embodiment may include a removal step of removing arginine from the mixture.
  • the specific structure of a removal process is not specifically limited, For example, you may remove arginine from a mixture by dialysis using a commercially available dialysis membrane. If it is the said structure, a composite with higher purity can be obtained.
  • the silicon oxide binding tag of the present embodiment has a binding ability to silicon oxide.
  • the silicon oxide binding tag of the present embodiment may be one in which the bond between the silicon oxide binding tag and the silicon oxide is dissociated by arginine in addition to the above binding ability.
  • the silicon oxide binding tag of the present embodiment is a silicon oxide binding tag comprising a polypeptide composed of 7 or less amino acids, and 3/7 of all amino acids constituting the polypeptide. More than 7/7 may be arginine.
  • the smaller the silicon oxide binding tag the more functional the desired substance (eg, enzyme activity) when the silicon oxide binding tag is linked to the desired substance (eg, a polymer such as a protein). You can prevent losing.
  • the smaller the silicon oxide binding tag is, the more the solubility of the complex of the silicon oxide binding tag and the substance in an aqueous solution can be increased when the silicon oxide binding tag is linked to a desired substance. Since the silicon oxide binding tag of the present embodiment is a silicon oxide binding tag including a polypeptide composed of 7 or less amino acids, these effects are very high.
  • the number of amino acids constituting the polypeptide may be 7 or less, more preferably 6 or less, more preferably 5 or less, and most preferably 4 or less.
  • the lower limit of the number of amino acids is not particularly limited, but may be 7, 6, 5, 4, or 3.
  • the type of amino acid constituting the polypeptide is not particularly limited, but 3/7 or more and less than 7/7 of all amino acids constituting the polypeptide is preferably arginine, more preferably 3/7 or more of all amino acids. / 7 or less is arginine, more preferably 3/7 or more and 5/7 or less of all amino acids is arginine, more preferably 3/7 or more and 4/7 or less of all amino acids is arginine, most preferably all 3/7 of the amino acids are arginine. If it is the said structure, a silicon oxide coupling
  • bonding tag and silicon oxide can be dissociated efficiently by arginine.
  • all the amino acids constituting the silicon oxide binding tag are arginine, the binding efficiency of the silicon oxide binding tag to silicon oxide tends to decrease.
  • the polypeptide constituting the silicon oxide-binding tag of the present embodiment may contain at least part of the polypeptide described in the following (c) or (d).
  • polypeptide consisting of the amino acid described in SEQ ID NO: 3 is a partial peptide of the CotB1 protein derived from the prokaryote Bacillus cereus (for example, Bacillus cereus ATCC 14579).
  • the polypeptide described in (d) above has an amino acid sequence in which one or several amino acids other than arginine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 are deleted, substituted, or added, and A polypeptide having binding ability is preferred. If it is the said structure, not only can a silicon oxide bond tag bind
  • “one or several amino acids are deleted, substituted or added” means that deletion or substitution is performed by a known mutant peptide production method such as site-directed mutagenesis. Alternatively, it means that as many amino acids as can be added (preferably 4 or less, more preferably 3 or less, more preferably 2 or less, most preferably 1 or less) amino acids are deleted, substituted or added.
  • the peptide described in (d) above is preferably 30% or more, more preferably 35% or more, more preferably 40% or more, more preferably 45% or more, more preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97 % Or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more of the amino acid sequence having a homology and having a binding ability to silicon oxide.
  • Preferred mutations include amino acid substitutions, deletions, or additions. Of the mutations described above, amino acid substitutions are more preferred.
  • amino acid substitution is not particularly limited, and examples thereof include substitution in which any amino acid is substituted with glycine or alanine. More specifically, examples of amino acid substitution include substitution in which serine, glycine, alanine or glutamine is substituted with glycine or alanine. Of course, the present invention is not limited to the above-described substitutions.
  • the kit of the present embodiment is a kit for purifying a complex of a silicon oxide binding tag and a substance, a column having silicon oxide as a stationary phase for separation, and silicon oxide that binds to silicon oxide Contains a binding tag, a non-salt binding solution for specifically binding the complex to silicon oxide, and arginine for dissociating the bond between the silicon oxide binding tag and silicon oxide A solution for dissociation.
  • the column may be any column provided with silicon oxide as a stationary phase for separation, and the specific configuration is not limited.
  • the column may be a commercially available column.
  • the kit of the present embodiment may include the silicon oxide binding tag itself, or the silicon oxide binding tag or the silicon oxide.
  • complex of a binding tag and a substance may be provided.
  • the kit of the present embodiment may include a recombinant protein expression vector into which a polynucleotide encoding a silicon oxide binding tag is inserted.
  • the user of the kit may insert the polynucleotide encoding the desired protein into the vector so that the vector becomes a vector for complex expression.
  • the present invention can also be configured as follows.
  • the purification method of the present invention includes a dissociation step in which a complex of a silicon oxide binding tag and a substance is dissociated from silicon oxide to which the complex is specifically bound.
  • the dissociation step is characterized in that the bond between the silicon oxide binding tag and the silicon oxide is dissociated with arginine.
  • the substance is preferably a protein.
  • the dissociation step is a step of bringing the complex bonded to silicon oxide into contact with an eluent containing arginine, and the eluate contains the silicon oxide-binding tag and the oxidation
  • a dissociating agent for dissociating specific bonds with silicon it is preferable to contain only arginine.
  • the silicon oxide is preferably contained in shirasu.
  • the silicon oxide-binding tag includes a polypeptide, and it is preferable that 5/14 or more and less than 7/7 of all amino acids constituting the polypeptide is arginine.
  • the polypeptide is preferably composed of 14 or less amino acids.
  • the polypeptide preferably contains at least part of the polypeptide described in (a) or (b) below; (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 20 or 21; (B) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 20, or 21 and has an ability to bind to silicon oxide. Polypeptide.
  • the silicon oxide-binding tag of the present invention is a silicon oxide-binding tag comprising a polypeptide composed of 7 or less amino acids, and 3 / of all amino acids constituting the polypeptide. 7 or more and less than 7/7 is characterized by arginine.
  • the polypeptide preferably contains at least a part of the polypeptide described in the following (c) or (d); (C) a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, (D) A polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having a binding ability to silicon oxide.
  • plasmid for expressing fusion protein of tag and GFP> In order to identify the silicon oxide-binding domain in the CotB1 peptide, a plasmid for expressing a fusion protein of a mutant peptide lacking a part of the CotB1 peptide consisting of 14 amino acids and GFP (Green Fluorescent Protein) is prepared. did.
  • an expression plasmid (pET-GFP-CotB1p: Abdelhamid et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 98 (12), 5677-5684 of a fusion protein (CotB1p-GFP) of wild-type CotB1 peptide and GFP shown in Table 1 , 2014) as a template, a plasmid (pET-GFP) for expressing a fusion protein of each of the three mutant CotB1 peptides shown in Table 1 (# 9 to # 11) and GFP -CotB1p (# 9), pET-GFP-CotB1p (# 10), and pET-GFP-CotB1p (# 11)) were constructed.
  • the end of a DNA fragment obtained by the inverse PCR method was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase (Takara Bio), and the phosphorylated DNA fragment was circularized using Ligation high (TOYOBO).
  • Escherichia coli JM109 which is a cloning host, was transformed using the circularized DNA fragment, and Escherichia coli into which the desired plasmid was introduced was selected. Then, the desired plasmid was purified from E. coli according to a known method.
  • the transformant was cultured in 2 ⁇ YT medium containing 1% glucose at 37 ° C. until the OD 600 reached 0.5, and then 0.2 mM IPTG (isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside) was added to the medium. Was added, and further cultured at 37 ° C. for 4 hours to obtain bacterial cells expressing each fusion protein in large quantities.
  • IPTG isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside
  • Each bacterial cell was suspended in a reaction buffer (25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% (v / v) Tween 20 (registered trademark)), and the bacterial cell was disrupted by ultrasonication. The disrupted solution was centrifuged (20,000 ⁇ g, 30 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was recovered as a fusion protein extract. The fusion protein extract was used as a bacterial cell extract fraction.
  • a reaction buffer 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% (v / v) Tween 20 (registered trademark)
  • a suitably diluted fusion protein extract was added to 0.1 mL of a reaction buffer containing 10 mg of silicon oxide particles (Silicon dioxide fine powder ca. 0.8 ⁇ m, Soekawa Rikagaku), and mixed at room temperature for 30 minutes. Thereafter, silicon oxide particles were precipitated by centrifugation (5,000 ⁇ g, 2 minutes, 25 ° C.), and the supernatant was recovered as an unbound fraction and the precipitate was recovered as a silicon oxide-bound fraction.
  • silicon oxide particles Silicon dioxide fine powder ca. 0.8 ⁇ m, Soekawa Rikagaku
  • Fluorescence value derived from GFP of each obtained sample was measured, and the fluorescence value of the cell extract fraction was subtracted from the fluorescence value of the unbound fraction was the fluorescence value of the silicon oxide bound fraction.
  • CotB1 peptide of each mutant type using as an index the ratio of fusion protein bound to silicon oxide among the fusion proteins in the bacterial cell extract fraction (fluorescence value of silicon oxide binding fraction / fluorescence value of bacterial cell extract fraction) The binding strength of was compared.
  • Escherichia coli Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen) introduced with a plasmid (pET-GFP-CotB1p) for expressing a fusion protein of wild-type CotB1 peptide and GFP, and only GFP as a negative control.
  • pET-GFP-CotB1p plasmid for expressing a fusion protein of wild-type CotB1 peptide and GFP
  • the mutant CotB1 peptide (particularly # 9) was found to exhibit a high binding force comparable to that of the wild-type CotB1 peptide while being a small peptide consisting of very few amino acids (7 amino acids). .
  • the size of the mutant CotB1 peptide is approximately the same size as His-tag (a tag consisting of 6 amino acids and showing affinity for Ni 2+ ), which is widely used for purification of recombinant proteins.
  • His-tag a tag consisting of 6 amino acids and showing affinity for Ni 2+
  • the tag to be fused is very small. Therefore, when fused to a desired protein, the effect on the desired protein is considered to be very small. Table 2 lists typical well-known tags.
  • Plasmids (pET-GFP-CotB1p (# 12), pET-GFP-CotB1p (# 13)) for expressing a fusion protein of each of the types of CotB1 peptides (# 12 to # 18) or R 9 -tag and GFP ), PET-GFP-CotB1p (# 14), pET-GFP-CotB1p (# 15), pET-GFP-CotB1p (# 16), pET-GFP-CotB1p (# 17), pET-GFP-CotB1p (# 18) Or pET-GFP- (R 9 -tag)).
  • the seven types of mutant CotB1 peptides shown in Table 3 are peptides in which each of the seven amino acids constituting the mutant CotB1 peptide (# 9) is substituted with alanine.
  • the end of a DNA fragment obtained by the inverse PCR method was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase (Takara Bio), and the phosphorylated DNA fragment was circularized using Ligation high (TOYOBO). Thereafter, the circularized DNA fragment was used to transform E. coli JM109, which is a cloning host, and E. coli introduced with the desired plasmid was selected. Then, the desired plasmid was purified from E. coli according to a known method.
  • the binding strength of each fusion protein was evaluated according to the method described in ⁇ 2>.
  • the expression of the fusion protein of R 9 -tag and GFP is described in Taniguchi et al. (Koji Taniguchi et al., Biotechnology and Bioengineering Vol. 96, No. 6, April 15, p1023-1029, 2007). According to the method.
  • R 9 -tag has already been reported to bind to silicon oxide (SM Fuchs & RT Raines [2005] Polyarginine as a multifunctional fusion tag, Protein Sci. 14, 1538-1544). Then, by the surfactant (specifically, polyoxyethylene sorbitan monolaurate (more specifically, 0.5% (v / v) Tween 20 (registered trademark)) contained in the reaction buffer, It is thought that the binding to silicon oxide was inhibited.
  • surfactant specifically, polyoxyethylene sorbitan monolaurate (more specifically, 0.5% (v / v) Tween 20 (registered trademark)
  • arginine is most important for the binding of mutant CotB1 peptide (# 9) to silicon oxide, but the binding power of R 9 -tag composed only of arginine was low.
  • the contribution of other amino acids is also considered to be significant.
  • amino acids other than arginine are considered to function as spacers between arginine and arginine.
  • each E. coli can be expressed at various concentrations (0% (v / v), 0.05% (v / v), 0.1% (v / v), Alternatively, it is suspended in a 25 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 0.5% (v / v)) Tween 20 (registered trademark), and extracted according to the method described in ⁇ 2>. Fractions were prepared.
  • silicon oxide particles Silicon dioxide fine powder ca. 0.8 ⁇ m, Soekawa Riken
  • the silicon oxide particles were washed five times using a Tris-HCl buffer solution having the same composition as that of the suspended cells.
  • the silicon oxide particles are suspended in a sample buffer for SDS-PAGE and heated at 95 ° C. for 5 minutes to bind to the surface of the silicon oxide particles. Protein was dissociated from the silicon oxide particles. Then, the sample buffer containing the dissociated fusion protein was subjected to SDS-PAGE.
  • the test results are shown in FIG. In FIG. 1, “M” indicates a molecular weight marker, “S” indicates the test result of the bacterial cell extract fraction, and lanes “1” and “2” include Tween 20 (registered trademark).
  • the test results of the Tris-HCl buffer without lanes are shown, lane “3” shows the test results of the Tris-HCl buffer containing 0.05% (v / v) Tween 20®, and the lanes “4” "Shows the test results of Tris-HCl buffer containing 0.1% (v / v) Tween 20 (registered trademark), and lane” 5 "shows 0.5% (v / v) Tween 20
  • the test result of the Tris-HCl buffer containing (registered trademark) is shown.
  • the fusion protein of mutant CotB1 peptide (# 9) and GFP binds to silicon oxide regardless of the presence or absence of the surfactant Tween 20 (registered trademark).
  • R 9 -tag and GFP fusion protein failed to bind to silicon oxide in the presence of Tween 20®.
  • Tween 20 (registered trademark) is used to prevent non-specific adsorption of proteins other than the desired protein to the purification column or the like, in other words, to increase the purity of the desired protein to be purified. Widely used.
  • the mutant CotB1 peptide can bind to silicon oxide even in the presence of Tween 20 (registered trademark), it is more versatile than R 9 -tag and has a higher purity and a desired protein. It can be fixed and purified.
  • E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen) into which pET-GFP-CotB1p (# 9) was introduced was prepared according to the method described above.
  • the E. coli After expressing a desired fusion protein in the above-mentioned E. coli, the E. coli is added to a 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 0.05% (v / v) Tween 20 (registered trademark). The suspension was suspended, and a bacterial cell extract fraction was prepared according to the method described in ⁇ 2>.
  • silicon oxide particles Silicon dioxide fine powder ca. 0.8 ⁇ m, Soekawa Riken
  • 25 mg of silicon oxide particles were added to 1 mL of the bacterial cell extract fraction and mixed at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the silicon oxide particles were washed four times using a Tris-HCl buffer solution having the same composition as that in which the cells were suspended. The silicon oxide particles after washing were recovered by centrifugation.
  • the silicon oxide particles were suspended in a 25 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 0.2 M arginine. Thereafter, silicon oxide particles were precipitated by centrifugation, and the supernatant was collected. Then, the supernatant was subjected to SDS-PAGE. An image of the gel stained with Coomassie brilliant blue R-250 was taken, and the purity and yield of the desired fusion protein were analyzed by image analysis software ImageJ.
  • the test results are shown in FIG. In FIG. 2, “M” indicates a molecular weight marker, “S” indicates the test result of the bacterial cell extract fraction, and “B” indicates the binding to silicon oxide particles after four washes.
  • the lane “1” shows the test result of the protein bound to the silicon oxide particles after the elution with arginine, and the lane “2” dissociates from the silicon oxide by the elution with arginine.
  • the protein test results are shown.
  • the desired fusion protein can be specifically dissociated from silicon oxide by using arginine.
  • arginine was used, the purification purity of the desired fusion protein was 90%, and the yield of the desired fusion protein was 70%.
  • Si-tag fused protein A Antibody protein protein A fused with Si-tag (Si-tag fused protein A: expression and purification methods include Ikeda et al. (Analytical Biochemistry, Vol. 385, p132-137 (2009))) To 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 5 mg of silicon oxide particles (Silicon Dioxide fine powder ca. 0.8 ⁇ m, Soekawa Riken) were added, mixed for 15 minutes, and Si-tag fusion protein A was added. Adsorbed on silicon oxide particles. The silicon oxide particles were washed three times with 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and the washed silicon oxide particles were collected by centrifugation.
  • the silicon oxide particles were suspended in a 25 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 1M or 2M arginine. Thereafter, silicon oxide particles were precipitated by centrifugation, and the supernatant was collected. Then, the supernatant was subjected to SDS-PAGE. The purity and yield of the desired fusion protein were determined according to the method described in ⁇ 5>.
  • FIG. 3 it was revealed that arginine can dissociate the desired fusion protein from silicon oxide.
  • 1M arginine was used, the recovery rate of the desired fusion protein was 60%, and when 2M arginine was used, the recovery rate of the desired fusion protein was 85%.
  • the silicon oxide particles were suspended in a 25 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 1 M arginine. Thereafter, silicon oxide particles were precipitated by centrifugation, and the supernatant was collected. Then, the supernatant was subjected to SDS-PAGE.
  • TAT-tag> A plasmid for expressing a fusion protein of TAT-tag and GFP was prepared.
  • DNA encoding a fusion protein in which GFP was added to the C-terminal side of a partial peptide of the TAT protein (SEQ ID NO: 20) was synthesized. Note that an NdeI recognition sequence was added to the 5 'end of the DNA, and an EcoRI recognition sequence was added to the 3' end.
  • the digest and the pET-47b plasmid similarly digested with the restriction enzyme NdeI and the restriction enzyme EcoRI were combined with Ligation High (TOYOBO). And ligated for 2 hours at 16 ° C. Thereafter, Escherichia coli JM109 as a cloning host was transformed with the ligation product, and Escherichia coli into which a desired plasmid (pET-TAT-GFP) was introduced was selected. Then, the desired plasmid was purified from E. coli according to a known method.
  • E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen) into which pET-TAT-GFP was introduced was prepared.
  • the E. coli After expressing the desired fusion protein in E. coli as described above, the E. coli is suspended in 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and the bacterial cell extract fraction is obtained according to the method described in ⁇ 2>.
  • the bacterial cell extract fraction is obtained according to the method described in ⁇ 2>.
  • 100 mg of silicon oxide particles Silicon oxide particles (Silicon dioxide fine powder ca. 0.8 ⁇ m, Soekawa Rikagaku) were added to 1 mL of the bacterial cell extract fraction and mixed at room temperature for 15 minutes. Thereafter, the silicon oxide particles were washed four times using a Tris-HCl buffer solution having the same composition as that in which the cells were suspended. The silicon oxide particles after washing were recovered by centrifugation.
  • the silicon oxide particles were suspended in a 25 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 1.0 M arginine. Thereafter, silicon oxide particles were precipitated by centrifugation, and the supernatant was collected. Then, the supernatant was subjected to SDS-PAGE. Purity and yield were analyzed according to the method described in ⁇ 5>.
  • test results are shown in FIG. In FIG. 6, “M” indicates a molecular weight marker, “S” indicates the test result of the bacterial cell extract fraction, and lane “1” indicates a test for proteins dissociated from silicon oxide by elution with arginine. Results are shown.
  • the desired fusion protein can be specifically dissociated from silicon oxide by using arginine.
  • arginine was used, the purification purity of the desired fusion protein was 80%, and the yield of the desired fusion protein was 70%. Therefore, elution with arginine is considered to be a technique that can be used for various silicon oxide-binding proteins and silicon oxide-binding peptides.
  • the E. coli After expressing the desired fusion protein in E. coli described above, the E. coli is suspended in 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1% (v / v) Tween 20 (registered trademark).
  • the cell extract fraction was prepared according to the method described in ⁇ 2>.
  • shirasu particles produced in Kagoshima Prefecture
  • a pyroclastic flow deposit containing silicon oxide as a main component was added to 1 mL of the bacterial cell extract fraction and mixed at room temperature for 5 seconds. Thereafter, the silicon oxide particles were washed three times using a Tris-HCl buffer solution having the same composition as that in which the cells were suspended. The silicon oxide particles after washing were recovered by centrifugation.
  • the silicon oxide particles were suspended in a 25 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 0.3 M arginine. Thereafter, shirasu particles were precipitated by centrifugation, and the supernatant was collected. Then, the supernatant was subjected to SDS-PAGE. Purity and yield were analyzed according to the method described in ⁇ 5>.
  • test results are shown in FIG. In FIG. 5, “M” indicates a molecular weight marker, “S” indicates the test result of the bacterial cell extract fraction, and lane “1” indicates a test for proteins dissociated from shirasu particles by elution with arginine. Results are shown.
  • the desired fusion protein can be specifically dissociated from the shirasu particles by using arginine.
  • arginine was used, the purification purity of the desired fusion protein was 95%, and the yield of the desired fusion protein was 80%.
  • an expression plasmid (pET-CotB1p-SC: Abdelhamid et al., Applied Microbiology and Biotechnology, (98 (12), a fusion protein of wild-type CotB1 peptide, SUMO and mCherry (CotB1p-GFP), 5677-5684, 2014) was used as a template to construct a plasmid excluding the region encoding SUMO.
  • An inverse PCR method was performed again using the obtained plasmid as a template, and a desired plasmid (pET-CotB1p (# 9) -mCherry) was constructed by deleting a part of the wild-type CotB1 region.
  • E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen) into which pET-CotB1p (# 9) -mCherry was introduced was prepared.
  • the E. coli After expressing the desired fusion protein in the above-mentioned E. coli, the E. coli is placed in 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.5% (v / v) Tween 20 (registered trademark). The suspension was suspended, and a bacterial cell extract fraction was prepared according to the method described in ⁇ 2>.
  • silicon oxide particles Silicon dioxide fine powder ca. 0.8 ⁇ m, Soekawa Riken
  • 2 mL of the bacterial cell extract fraction 0.4 g were added to 2 mL of the bacterial cell extract fraction and mixed at room temperature for 5 minutes. Thereafter, the silicon oxide particles were washed three times using a Tris-HCl buffer solution having the same composition as that in which the cells were suspended. The silicon oxide particles after washing were recovered by centrifugation.
  • the silicon oxide particles were suspended in a 25 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 0.5 M arginine. Thereafter, silicon oxide particles were precipitated by centrifugation, and the supernatant was collected. Then, the supernatant was subjected to SDS-PAGE. Purity and yield were analyzed according to the method described in ⁇ 5>.
  • FIG. 7 The test results are shown in FIG. In FIG. 7, “M” indicates a molecular weight marker, lane “1” indicates the test result of the cell extract fraction, and lane “2” remains in the supernatant after mixing with silicon oxide particles.
  • the lane “3” shows the test result of the protein dissociated from the silicon oxide by elution with arginine.
  • the desired fusion protein can be specifically dissociated from silicon oxide by using arginine.
  • arginine was used, the purification purity of the desired fusion protein was 89%, and the yield of the desired fusion protein was 88%.
  • the E. coli (wet weight about 10 mg) is suspended in 500 ⁇ L of 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and the method according to ⁇ 2> According to the procedure, a bacterial cell extract fraction was prepared.
  • the spin column was transferred into a new 1.5 mL microtube. 1 mL of 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.5 M arginine was added to the spin column, and the mixture was subjected to centrifugation in the same manner to recover the solution that passed through the silica membrane. Then, the solution was subjected to SDS-PAGE. Purity and yield were analyzed according to the method described in ⁇ 5>.
  • test results are shown in FIG. In FIG. 8, “M” represents a molecular weight marker, lane “1” represents the test result of the cell extract fraction, and lane “2” represents the cell extract fraction that passed through the silica membrane. The test result is shown, and lane “3” shows the test result of the protein dissociated from the silica membrane by elution with arginine.
  • the desired fusion protein can be adsorbed to the silica membrane by centrifugation, and the desired fusion protein can be removed from the silica membrane by the arginine solution. It became clear that it could be dissociated.
  • the purification purity of the desired fusion protein was 89%, and the yield of the desired fusion protein was 88%.
  • the E. coli After expressing a desired fusion protein in the above-mentioned E. coli, the E. coli is (i) 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.) containing 0.5% (v / v) Tween 20 (registered trademark). 0) or (ii) 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.5% (v / v) Tween 20 (registered trademark) and 0.15 M or 0.5 M NaCl.
  • the bacterial cell extract fraction was prepared according to the method described in ⁇ 2>.
  • silicon oxide particles Silicon dioxide fine powder ca. 0.8 ⁇ m, Soekawa Riken
  • the silicon oxide particles were washed three times using a Tris-HCl buffer solution having the same composition as that in which the cells were suspended.
  • the silicon oxide particles are suspended in a sample buffer for SDS-PAGE and heated at 95 ° C. for 5 minutes to bind to the surface of the silicon oxide particles. Protein was dissociated from the silicon oxide particles. Then, the sample buffer containing the dissociated fusion protein was subjected to SDS-PAGE.
  • test results are shown in FIG. In FIG. 9, “M” represents a molecular weight marker, lane “S” represents the test result of the cell extract fraction, and lane “1” represents 0.5% (v / v) Tween. Test results of purified protein using 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 20 (registered trademark) are shown.
  • Lane “2” shows 0.15 M NaCl and 0.5% ( v / v) Tween 20 (registered trademark) and 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing the purified protein test results
  • lane “3” shows 0.5 M
  • the test result of the purified protein at the time of using 25 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing NaCl and 0.5% (v / v) Tween 20 (registered trademark) is shown.
  • B. DNA encoding a fusion protein in which CotB1p peptide (wild type) or CotB1p peptide (# 9) was added to the carboxyl terminal side of DHFR (SEQ ID NO: 23) of subtilis 168 strain was synthesized. Note that a SacII recognition sequence was added to the 5 'end of the DNA, and a XhoI recognition sequence was added to the 3' end.
  • the digested product and the pET-47b plasmid (Novagen) digested with the restriction enzyme SacII and the restriction enzyme XhoI in the same way were ligated High (TOYOBO). And ligated for 2 hours at 16 ° C. Thereafter, Escherichia coli JM109, which is a cloning host, was transformed with the ligation product, and Escherichia coli into which a desired plasmid (pET-DHFR-GFP) was introduced was selected. Then, the desired plasmid was purified from E. coli according to a known method.
  • E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen) into which pET-DHFR-GFP was introduced was prepared.
  • the E. coli After expressing the desired fusion protein in the above-mentioned E. coli, the E. coli is placed in 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.5% (v / v) Tween 20 (registered trademark). The suspension was suspended, and a bacterial cell extract fraction was prepared according to the method described in ⁇ 2>.
  • silicon oxide particles Silicon dioxide fine powder ca. 0.8 ⁇ m, Soekawa Riken
  • 2 mL of the bacterial cell extract fraction 0.4 g were added to 2 mL of the bacterial cell extract fraction and mixed at room temperature for 5 minutes. Thereafter, the silicon oxide particles were washed three times using a Tris-HCl buffer solution having the same composition as that in which the cells were suspended. The silicon oxide particles after washing were collected by centrifugation.
  • the silicon oxide particles were suspended in a 25 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 0.5 M arginine. Thereafter, silicon oxide particles were precipitated by centrifugation, and the supernatant was collected. This elution operation with arginine was performed twice in total. Then, the supernatant was subjected to SDS-PAGE. Purity and yield were analyzed according to the method described in ⁇ 5>.
  • test results are shown in FIG. In FIG. 10, “M” indicates a molecular weight marker, “S” indicates the test result of the cell extract fraction, and “U” indicates a mixture of the cell extract fraction and silicon oxide particles.
  • M indicates a molecular weight marker
  • S indicates the test result of the cell extract fraction
  • U indicates a mixture of the cell extract fraction and silicon oxide particles.
  • the test results of the proteins that did not bind to the silicon oxide particles (unbound fraction) were shown.
  • Lanes “1” and “2” show the test results of the proteins dissociated from silicon oxide by elution with arginine. Yes.
  • the fusion protein is more soluble when a smaller peptide (eg, CotB1p peptide (# 9)) is used.
  • a smaller peptide eg, CotB1p peptide (# 9)
  • the CotB1p peptide (# 9) was fused to DHFR, about 7% of the total protein contained in the cell extract fraction was the desired fusion protein, whereas the CotB1p peptide (# 9) was fused to DHFR.
  • the wild type was fused, less than 1% of the total protein contained in the bacterial cell extract fraction was the desired fusion protein.
  • the present invention can be used for purification of various substances.

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Abstract

　目的物質の精製方法、目的物質の精製キット、および、これらに用いる酸化ケイ素結合タグを提供する。本発明では、塩が添加されていない結合用溶液の中で、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を酸化ケイ素に特異的に結合させ、アルギニンを用いて、酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を解離させる。

Description

精製方法、精製キット、および、これらに用いられる酸化ケイ素結合タグ
　本発明は、精製方法、精製キット、および、これらに用いられる酸化ケイ素結合タグに関する。
　近年、酸化ケイ素に関連するタンパク質が数多く発見され、当該タンパク質を、様々な用途（例えば、酸化ケイ素を重合させる技術、所望の物質を酸化ケイ素上に固定化させる技術、および、酸化ケイ素上に固定化された所望の物質を精製する技術）に利用しようとする試みがなされている。
　例えば、特許文献１には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に由来する特定のタンパク質（ＣｏｔＧタンパク質）、および、その断片のポリペプチドが開示されている。特許文献１に記載の技術では、上述したタンパク質、および、当該タンパク質の断片を用いて、シリカを重合させている。
　特許文献２には、酸化ケイ素（例えば、シリカ）に結合することができる特定のタンパク質（ＳＢＰ：silica material binding protein）、および、当該タンパク質に由来するタグが開示されている。特許文献２に記載の技術では、タグと所望のタンパク質との融合タンパク質を用いて、タグを介して、所望のタンパク質を酸化ケイ素上に固定化している。
　特許文献３には、酸化ケイ素（例えば、シリカ）に結合することができる特定のタンパク質（ＳＢＰ：silica material binding protein）、および、当該タンパク質に由来するタグが開示されている。特許文献３に記載の技術では、タグと所望のタンパク質との融合タンパク質を用いて、タグを介して、所望のタンパク質を酸化ケイ素上に固定化し、更に、２価カチオン含有溶液を用いて、所望のタンパク質を酸化ケイ素から解離させている。
　特許文献４には、二酸化ケイ素に結合することができるペプチドが開示されている。特許文献４に記載の技術では、ペプチドと所望のタンパク質との融合タンパク質を用いて、ペプチドを介して、所望のタンパク質を二酸化ケイ素上に固定化し、更に、アルギニン含有溶液を用いて、所望のタンパク質を二酸化ケイ素から解離させている。
　なお、従来の技術では、目的の融合タンパク質以外のタンパク質が非特異的に酸化ケイ素または二酸化ケイ素に吸着することを防ぐために、高濃度の塩を含む溶液中で、融合タンパク質を酸化ケイ素または二酸化ケイ素上に固定化している。そして、従来の技術では、高濃度の塩を含む溶液を用いることによって、純度の高い融合タンパク質を精製することを実現している。
　以上のように、酸化ケイ素に関連するタンパク質を様々な用途に利用しようとする試みがなされているが、これらの中でも、特に酸化ケイ素上に固定化された所望の物質を精製する技術に注目が集まっており、当該技術の開発が急がれている。当該技術にとって、酸化ケイ素に結合し得るタグを見出すことは重要であるが、それと同様に、酸化ケイ素に結合したタグを、酸化ケイ素から特異的に解離させる方法を見出すことも重要である。
日本国公開特許公報「特開２０１２－３１１００号公報」（２０１２年２月１６日公開） ＷＯ２００７／０５５２８８（２００７年５月１８日公開） 日本国公開特許公報「特開２０１０－３７２２２号公報」（２０１０年２月１８日公開） 日本国公開特許公報「特開２００９－１３６２８０号公報」（２００９年６月２５日公開）
　上述したように、特許文献３に記載の技術では、２価カチオン含有溶液を用いて、酸化ケイ素に結合した特定のタグを酸化ケイ素から解離させている。
　しかしながら、当該技術は、２価カチオンによって精製目的の物質（特に、タンパク質）が変性する虞があるという問題点を有している。
　それ故に、タグと、酸化ケイ素に結合した当該タグを酸化ケイ素から特異的に解離させ得る方法と、の新たな組み合わせを見出すことが、当該分野において強く望まれている。
　本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、酸化ケイ素結合タグと、当該酸化ケイ素結合タグを酸化ケイ素から特異的に解離させる方法と、を利用した目的物質の精製方法、および、当該精製方法に用いる酸化ケイ素結合タグを提供することにある。
　本発明者らは、原核生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）が体内にケイ酸を取り込む機構を研究する過程において、（ｉ）酸化ケイ素に対する結合能を有するＢａｃｉｌｌｕｓ由来のタンパク質と酸化ケイ素との間の特異的な結合を、アルギニンによって解離させ得ること、および、（ｉｉ）塩が添加されていない結合用溶液の中で、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を酸化ケイ素に特異的に結合されば、複合体以外の不要な物質が酸化ケイ素に結合することを防ぐことができ、その結果、複合体を収率高く、かつ、純度高く精製できること、を見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明の複合体の精製方法は、上記課題を解決するために、塩が添加されていない結合用溶液の中で、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を、酸化ケイ素に特異的に結合させる結合工程と、上記複合体を、上記酸化ケイ素から解離させる解離工程と、を含み、上記解離工程は、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を、アルギニンによって解離させる工程であることを特徴としている。
　本発明の複合体の精製方法では、上記結合用溶液は、ｐＨ緩衝液および溶媒からなる溶液、または、ｐＨ緩衝液、界面活性剤および溶媒からなる溶液であることが好ましい。
　本発明の複合体の精製方法では、上記物質は、タンパク質であることが好ましい。
　本発明の複合体の精製方法では、上記解離工程は、酸化ケイ素に結合している上記複合体を、アルギニンを含有する溶出液に接触させる工程であり、上記溶出液は、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の特異的な結合を解離させる解離剤として、アルギニンのみを含有しているものであることが好ましい。
　本発明の複合体の精製方法では、上記酸化ケイ素は、シラスに含まれているものであることが好ましい。
　本発明の複合体の精製方法では、上記酸化ケイ素結合タグは、ポリペプチドを備えるものであり、上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の５／１４以上７／７未満が、アルギニンであることが好ましい。
　本発明の複合体の精製方法では、上記ポリペプチドは、１４個以下のアミノ酸からなるものであることが好ましい。
　本発明の複合体の精製方法では、上記ポリペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含むものであることが好ましい；
（ａ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
　本発明の酸化ケイ素結合タグは、上記課題を解決するために、７個以下のアミノ酸によって構成されているポリペプチドを備える酸化ケイ素結合タグであって、上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の３／７以上７／７未満が、アルギニンであることを特徴としている。
　本発明の酸化ケイ素結合タグでは、上記ポリペプチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるものであることが好ましい；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
　本発明のキットは、上記課題を解決するために、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を精製するためのキットであって、分離用の固定相として酸化ケイ素を備えているカラムと、上記酸化ケイ素に結合する酸化ケイ素結合タグと、上記複合体を上記酸化ケイ素に特異的に結合させるための、塩が添加されていない結合用溶液と、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を解離させるための、アルギニンを含む解離用溶液と、を備えることを特徴としている。
　本発明は、目的の物質を純度高く精製することができる。
　本発明は、目的の物質を回収率高く精製することができる。
　本発明であれば、小さなサイズの酸化ケイ素結合タグを設計することができるので、当該酸化ケイ素結合タグを所望の物質（例えば、タンパク質などの高分子）に連結させれば、所望の物質の構造を大きく変化させることを防ぐことができる。換言すれば、本発明であれば、酸化ケイ素結合タグを所望の物質（例えば、タンパク質などの高分子）に連結させたときに、所望の物質が機能（例えば、酵素活性）を失うことを防ぐことができる。
　本発明であれば、安価なシリカ粒子を精製用の担体として用いることができるので、低コストの精製方法を実現することができる。
　アルギニンは、目的の物質（例えば、タンパク質）の構造を安定化させる効果（換言すれば、凝集抑制効果）を有している。それ故に、本発明は、目的の物質を、機能（例えば、酵素活性）を失うこと無く精製することができる。
　アルギニンは、分子量が小さいので、透析などによって容易に除去することができる。それ故に、本発明は、精製物から容易にアルギニンを除去することができる。
本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの像である。 本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの像である。 本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの像である。 本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの像である。 本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの像である。 本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの像である。 本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの像である。 本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの像である。 本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの像である。 本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのゲルの像である。
　本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
　〔１．精製方法〕
　従来から、タンパク質をカラムから溶出させるときに用いる溶出液にアルギニンを添加する技術が用いられている（例えば、（ｉ）Tsutomu Arakawa et al., Protein Expression and Purification, 36 (2004) 244-248、（ｉｉ）Daisuke Ejima et al., Analytical Biochemistry 345 (2005) 250-257、（ｉｉｉ）Tsutomu Arakawa et al., Protein Expression and Purification, 54 (2007) 110-116）。しかしながら、このような従来技術と本発明とは、技術思想（具体的には、アルギニンの役割）が全く異なっている。この点について、まず説明する。
　本発明では、酸化ケイ素結合体を介して、複合体が酸化ケイ素に対して特異的に結合している。そして、本発明では、当該特異的な結合をアルギニンによって解離することによって、カラムから複合体を溶出させる。つまり、本発明では、カラムから複合体を溶出させるために用いる解離剤として、アルギニンが用いられる。
　一方、従来から、アルギニンがタンパク質の構造を安定化させることが知られている。それ故に、上述した従来技術では、単に溶出時のタンパク質の変性等を防ぐ安定化剤として、アルギニンが併用される。
　具体的に、上記（ｉ）および（ｉｉ）に記載の従来技術では、解離剤としてクエン酸（換言すれば、酸性溶液）が用いられ、タンパク質の安定化剤としてアルギニンが用いられている。上記（ｉｉｉ）に記載の技術では、解離剤として硫酸アンモニウムが用いられ、タンパク質の安定化剤としてアルギニンが用いられている。
　以上のように、本発明と従来技術とでは、アルギニンが担っている役割が全く異なっている。従来技術に関して、アルギニンに、酸化ケイ素結合体を酸化ケイ素から解離する能力があるという報告はなく、このような技術思想もない。
　更に、従来から、精製対象である物質をカラムに結合させるときには、不要な物質がカラムに結合することを防止するために、意図的に塩を添加した結合用溶液の中で精製対象である物質を担体に結合させ、これによって、精製対象である物質の精製純度を高めている。
　ところが、後述する実施例に示すように、カラムの分離用の固定相として酸化ケイ素を用いる場合には、結合用溶液に含まれる塩の濃度が高いほど、不要な物質がカラムに結合してしまい、かえって、精製対象である物質の精製純度が低下する。このことは、本発明者らが独自に見出した、新たな知見である。
　本発明では、塩が添加されていない結合用溶液を用いることによって、精製対象である物質を、純度高く、かつ、回収率高く精製することができる。
　以下に、本発明の精製方法の実施形態の一例について詳細に説明する。
　本実施の形態の複合体の精製方法は、塩が添加されていない結合用溶液の中で、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を、酸化ケイ素に特異的に結合させる結合工程と、複合体を、酸化ケイ素から解離させる解離工程と、を含み、解離工程は、酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を、アルギニンによって解離させる工程である。
　本明細書において「塩が添加されていない結合溶液（換言すれば、塩を含まない結合溶液）」とは、複合体以外の不要な物質が酸化ケイ素に非特異的に結合することを防止することを目的とした塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、または、硫酸アンモニウム）が、意図的に添加されていない溶液を意図する。
　例えば、複合体以外の不要な物質が酸化ケイ素に非特異的に結合することを防止することを目的としていない物質であって、結合溶液の性質を所望の性質に調節するための物質（例えば、ｐＨ緩衝液、界面活性剤、還元剤、または、キレート剤）が、塩を含んでおり、これらの物質を結合溶液に加えた結果、結果的に結合溶液が塩を含むものになる場合がある。このような結合溶液は、本発明の「塩が添加されていない結合溶液」の範疇に含まれる。
　また、生体を用いて複合体を作製する場合（例えば、大腸菌または酵母などの微生物に、複合体をコードするポリヌクレオチドが挿入された発現用ベクターを導入し、これによって、微生物内で複合体を発現させる場合）には、生体の破砕液を結合溶液として用いることが可能である。この場合、当該結合溶液には生体に由来する塩が含まれるが、当該結合溶液も、本発明の「塩が添加されていない結合溶液」の範疇に含まれる。
　塩が添加されていない結合溶液の具体例としては、ｐＨ緩衝液および溶媒からなる溶液、または、ｐＨ緩衝液、界面活性剤および溶媒からなる溶液を挙げることができる。
　ｐＨ緩衝液の更に具体的な例としては、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、および、クエン酸緩衝液が挙げられ、界面活性剤の更に具体的な例としては、Ｔｗｅｅｎ　２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ　８０（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（登録商標）、ｎ－オクチルグルコシド、および、ＣＨＡＰＳが挙げられ、溶媒の更に具体的な例としては、水、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、グリセロール、および、これらの混合物が挙げられるが、本発明は、これらに限定されない。
　上述したように、結合溶液には、複合体以外の不要な物質が酸化ケイ素に非特異的に結合することを防止することを目的としていない物質であって、結合溶液の性質を所望の性質に調節するための物質に由来する塩が含まれ得る。この場合であっても、複合体の精製純度を上げるという観点からは、結合溶液に含まれる塩の濃度は、低ければ低いほど好ましい。
　結合溶液に含まれる塩の濃度は、例えば、０ｍＭ～１００ｍＭであることが好ましく、０ｍＭ～８０ｍＭであることが更に好ましく、０ｍＭ～６０ｍＭであることが更に好ましく、０ｍＭ～４０ｍＭであることが更に好ましく、０ｍＭ～２０ｍＭであることが更に好ましく、０ｍＭであることが最も好ましい。
　酸化ケイ素結合タグは、酸化ケイ素（例えば、二酸化ケイ素（シリカ）、石英、クリストバライト、シリカゲルなど）に対する結合能を有するタグである。それ故に、酸化ケイ素結合タグと所望の物質とを連結させることにより（酸化ケイ素結合タグと物質とを連結させたものを、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体とも呼ぶ）、酸化ケイ素結合タグを介して、所望の物質を酸化ケイ素に結合させることができる。そして、本実施の形態の精製方法では、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の特異的な結合を、アルギニンによって解離させる。
　酸化ケイ素結合タグが結合する酸化ケイ素の具体的な構成は、特に限定されないが、シラス（換言すれば、火山灰と軽石との混合物）に含まれている酸化ケイ素であることが好ましい。換言すれば、本実施の形態の精製方法では、酸化ケイ素の代わりにシラスを用いてもよい。当該構成によれば、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を、精製純度高く、かつ、回収率高く精製することができる。また、当該構成によれば、低コストの精製法を実現することができる。なお、「シラス」とは、九州南部一帯に地層として分布する、軽石および火山灰の粒子のことであって、成分として酸化ケイ素を含んでいる粒子である。
　上述した「酸化ケイ素に対する結合能」は、過剰量の酸化ケイ素（例えば、酸化ケイ素結合タグの１０００倍の質量の酸化ケイ素）と酸化ケイ素結合タグとを、所望の水溶液中で室温にて３０分間接触させて、酸化ケイ素に結合する酸化ケイ素結合タグの量を測定することによって測定することができる。
　例えば、酸化ケイ素結合タグの好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、最も好ましくは５０％以上が酸化ケイ素に結合することができれば、当該ペプチドは、酸化ケイ素に対する結合能を有すると判定することができる。
　酸化ケイ素結合タグの何％が酸化ケイ素に結合したかは、例えば、酸化ケイ素と酸化ケイ素結合タグとを接触させた後、遠心分離処理によって上清と沈殿物とに分画し、当該上清と沈殿物とをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、所望の方法によってＳＤＳ－ＰＡＧＥに用いたゲルを染色し、ゲル中に観察される酸化ケイ素結合タグに相当するバンドを比較することによって決定することができる。
　過剰量の酸化ケイ素と酸化ケイ素結合タグとの接触に用いられる水溶液としては、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）を挙げることができる。また、過剰量の酸化ケイ素と酸化ケイ素結合タグとの接触に用いられる水溶液は、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（より具体的には、Ｔｗｅｅｎ　２０（登録商標）））を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）であってもよい。
　本明細書では、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）中で維持される、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を、「特異的な結合」と定義する。更に、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（より具体的には、Ｔｗｅｅｎ　２０（登録商標）））を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）中で維持される、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を、「特異的な結合」の中でも、「より特異性が高い結合」と定義する。
　水溶液中の界面活性剤の濃度としては、０．０５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは０．１％（ｖ／ｖ）、より好ましくは０．５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは１．０％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは１．５％（ｖ／ｖ）を挙げることができる。
　酸化ケイ素結合タグは、酸化ケイ素に対する結合能を有し、かつ、アルギニンによって酸化ケイ素との特異的な結合を解離させるものであればよく、その具体的な構成は、特に限定されない。
　例えば、酸化ケイ素結合タグは、ポリペプチドを備えるものであることが好ましい。
　酸化ケイ素結合タグがポリペプチドを備えるものである場合、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸の種類は特に限定されないが、ポリペプチドを構成する全アミノ酸の５／１４以上７／７未満がアルギニンであることが好ましく、全アミノ酸の５／１４以上６／７以下がアルギニンであることがより好ましく、全アミノ酸の５／１４以上５／７以下がアルギニンであることがより好ましく、全アミノ酸の５／１４以上４／７以下がアルギニンであることがより好ましく、全アミノ酸の５／１４以上３／７以下がアルギニンであることが最も好ましい。上記構成であれば、酸化ケイ素結合タグが効率よく酸化ケイ素に結合できるのみならず、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を、効率よくアルギニンによって解離させることができる。一方、酸化ケイ素結合タグを構成する全アミノ酸の５／１４未満がアルギニンである場合、および、酸化ケイ素結合タグを構成する全アミノ酸がアルギニンである場合には、酸化ケイ素結合タグの酸化ケイ素に対する結合効率が低下する傾向を示す。
　酸化ケイ素結合タグがポリペプチドを備えるものである場合、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１００個以下、更に好ましくは９０個以下、更に好ましくは８０個以下、更に好ましくは７０個以下、更に好ましくは６０個以下、更に好ましくは５０個以下、更に好ましくは４０個以下、更に好ましくは３０個以下、更に好ましくは２０個以下、更に好ましくは１４個以下、更に好ましくは１０個以下、最も好ましくは７個以下である。
　酸化ケイ素結合タグが小さければ小さいほど、当該酸化ケイ素結合タグを所望の物質に連結させたときに、所望の物質の構造を大きく変化させることを防ぐことができる。換言すれば、酸化ケイ素結合タグが小さければ小さいほど、酸化ケイ素結合タグを所望の物質（例えば、タンパク質などの高分子）に連結させたときに、所望の物質が機能（例えば、酵素活性）を失うことを防ぐことができる。また、酸化ケイ素結合タグが小さければ小さいほど、当該酸化ケイ素結合タグを所望の物質に連結させたときに、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体の、水溶液に対する溶解性を増すことができる。これらの観点から、酸化ケイ素結合タグがポリペプチドを備えるものである場合、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸の数は、１４個以下であることが好ましく、７個以下であることが更に好ましい。
　酸化ケイ素結合タグを構成するポリペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含むもの、または、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドからなるもの、であってもよい。つまり、
（ａ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
　ここで、配列番号１、３および５に記載のアミノ酸からなるポリペプチドは、原核生物であるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１４５７９）に由来するＣｏｔＢ１タンパク質の部分ペプチドである。
　配列番号２０および２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（配列番号２０のアミノ酸配列：GRKKRRQRRRPPQ、配列番号２１のアミノ酸配列：YGRKKRRQRRR）は、ヒト免疫不全ウイルスの転写制御にかかわるＴＡＴ（Transactivator of transcription）タンパク質の部分ペプチドである。当該部分ペプチドは、ＴＡＴタンパク質を細胞内へ移行させる機能を有する、細胞内移行ペプチドとして同定されている。
　上記（ｂ）に記載のポリペプチドは、配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列中のアルギニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチドであることが好ましい。上記構成であれば、酸化ケイ素結合タグが効率よく酸化ケイ素に結合できるのみならず、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を効率よくアルギニンによって解離させることができる。
　上記（ｂ）に記載のペプチドにおいて、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは９個以下、より好ましくは８個以下、より好ましくは７個以下、より好ましくは６個以下、より好ましくは５個以下、より好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、最も好ましくは１個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。
　上記（ｂ）に記載のペプチドは、配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列と、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは４５％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチドであってもよい。
　アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、例えば、特定のアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｓｅａｒｃｈ）を行い、同一のアミノ酸の割合（％）として相同性を算出することができる。更に具体的には、比較するアミノ酸配列のうちの長い方のアミノ酸配列の総アミノ酸数に対する、同一のアミノ酸の数の割合（％）として、相同性を算出することができる。
　ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該ポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のポリペプチドにおいて、当該ポリペプチドの構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
　好ましい変異としては、アミノ酸の置換、欠失、または付加を挙げることができる。上述した変異の中では、アミノ酸の置換が更に好ましい。
　アミノ酸の置換としては特に限定されないが、例えば、任意のアミノ酸が、グリシンまたはアラニンへ置換されるような置換を挙げることができる。更に具体的に、アミノ酸の置換として、セリン、グリシン、アラニンまたはグルタミンが、グリシンまたはアラニンへ置換されるような置換を挙げることもできる。勿論、本発明は、上述した置換に限定されない。
　酸化ケイ素結合タグは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に作製され得る。例えば、酸化ケイ素結合タグがポリペプチドを備えるものである場合、当該ポリペプチドは、化学合成されても、遺伝子工学によって作製されてもよい。化学合成の方法としては、固相法または液相法を挙げることができる。固相法において、例えば、市販の各種ペプチド合成装置（Model MultiPep RS（Intavis AG）など）を利用することができる。遺伝子工学によって作製する場合、原核生物（例えば、大腸菌など）または真核生物（例えば、酵母など）を用いた強制発現システムを用いることができる。
　上述した酸化ケイ素結合タグが連結される物質（換言すれば、精製対象の物質）は、特に限定されず、所望の物質であり得る。当該物質として、例えば、ポリペプチド（換言すれば、タンパク質）、核酸、糖、低分子化合物、または、高分子化合物などを挙げることができ、これらの中ではポリペプチド（換言すれば、タンパク質）が好ましい。
　酸化ケイ素結合タグを物質に連結させる方法は、特に限定されず、適宜、所望の方法を用いることができる。例えば、周知の架橋剤（換言すれば、リンカー）を用いて、酸化ケイ素結合タグを物質に連結させることができる。
　酸化ケイ素結合タグがポリペプチドを備えるものであり、かつ、当該酸化ケイ素結合タグが連結される物質がポリペプチドである場合には、酸化ケイ素結合タグと物質（ポリペプチド）とを１つの融合タンパク質として作製してもよい。なお、この場合には、酸化ケイ素結合タグを、物質（ポリペプチド）のアミノ末端に配置させてもよいし、物質（ポリペプチド）の内部に配置させてもよいし、物質（ポリペプチド）のカルボキシル末端に配置させてもよい。物質（ポリペプチド）の構造を安定に保つという観点からは、アミノ末端、または、カルボキシル末端に配置することが好ましい。
　本実施の形態の精製方法は、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の特異的な結合を、アルギニンによって解離させる解離工程を有している。酸化ケイ素結合タグが連結されている物質は、酸化ケイ素結合タグを介して、酸化ケイ素に特異的に結合する。そして、上記解離工程では、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の特異的な結合を、アルギニンによって解離させることになる。
　上記解離工程は、例えば、酸化ケイ素に結合している複合体（具体的には、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体）を、アルギニンを含有する溶出液に接触させることで行い得る。
　上記解離工程では、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の特異的な結合をアルギニンによって解離させるので、上記溶出液は、酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の特異的な結合を解離させる解離剤として、アルギニンのみを含有していればよい。
　具体的に、上記溶出液は、アルギニンを含有し、かつ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、または、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（登録商標））、アセトニトリル、または、クエン酸を含まない溶媒（例えば、水、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、または、リン酸緩衝液）であってもよい。
　上記溶出液は、アルギニンを含有し、かつ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、または、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（登録商標））、アセトニトリル、および、クエン酸からなる群より選択される少なくとも１つを含まない溶媒（例えば、水、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、または、リン酸緩衝液）であってもよい。
　上記溶出液は、アルギニンを含有し、かつ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、または、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（登録商標））、アセトニトリル、および、クエン酸を含まない溶媒（例えば、水、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、または、リン酸緩衝液）であってもよい。
　上記溶出液は、アルギニンのみを含有する溶媒（例えば、水、または、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液）であってもよい。
　溶出液に含まれるアルギニンの濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．０１Ｍ以上であり、より好ましくは０．０５Ｍ以上であり、より好ましくは１．０Ｍ以上であり、より好ましくは１．５Ｍ以上であり、最も好ましくは２．０Ｍ以上である。このとき、アルギニンの濃度の上限値は、特に限定されず、１０Ｍ、９．０Ｍ、８．０Ｍ、７．０Ｍ、６．０Ｍ、５．０Ｍ、４．０Ｍ、または、３．０Ｍであり得る。上記構成によれば、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を効率よく解離させることができる。
　溶出液のｐＨは、特に限定されないが、好ましくはｐＨ６．０以上ｐＨ９．０以下であり、更に好ましくはｐＨ７．０以上８．０以下である。上記構成によれば、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を効率よく解離させることができる。
　本実施の形態の精製方法は、解離工程以外の工程を含み得る。例えば、解離工程にて酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を、アルギニンによって解離させると、精製目的である複合体とアルギニンとの混合物が得られる。そこで、本実施の形態の精製方法は、上記混合物からアルギニンを除去する除去工程を含んでいてもよい。除去工程の具体的な構成は、特に限定されないが、例えば、市販の透析膜を用いた透析によって混合物からアルギニンを除去してもよい。上記構成であれば、より純度の高い複合体を得ることができる。
　〔２．酸化ケイ素結合タグ〕
　本実施の形態の酸化ケイ素結合タグは、酸化ケイ素に対する結合能を有するものである。本実施の形態の酸化ケイ素結合タグは、上記結合能に加えて、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合がアルギニンによって解離されるものであってもよい。
　更に具体的に、本実施の形態の酸化ケイ素結合タグは、７個以下のアミノ酸によって構成されているポリペプチドを備える酸化ケイ素結合タグであって、上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の３／７以上７／７未満が、アルギニンであり得る。
　酸化ケイ素結合タグが小さければ小さいほど、当該酸化ケイ素結合タグを所望の物質に連結させたときに、所望の物質の構造を大きく変化させることを防ぐことができる。換言すれば、酸化ケイ素結合タグが小さければ小さいほど、酸化ケイ素結合タグを所望の物質（例えば、タンパク質などの高分子）に連結させたときに、所望の物質が機能（例えば、酵素活性）を失うことを防ぐことができる。また、酸化ケイ素結合タグが小さければ小さいほど、当該酸化ケイ素結合タグを所望の物質に連結させたときに、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体の、水溶液に対する溶解性を増すことができる。本実施の形態の酸化ケイ素結合タグは、７個以下のアミノ酸によって構成されているポリペプチドを備える酸化ケイ素結合タグであるので、これらの効果が非常に高い。
　上記ポリペプチドを構成するアミノ酸の数は、７個以下であればよいが、更に好ましくは６個以下、更に好ましくは５個以下、最も好ましくは４個以下である。アミノ酸の数の下限値は、特に限定されないが、７個、６個、５個、４個または３個であり得る。
　上記ポリペプチドを構成するアミノ酸の種類は特に限定されないが、ポリペプチドを構成する全アミノ酸の３／７以上７／７未満がアルギニンであることが好ましく、より好ましくは全アミノ酸の３／７以上６／７以下がアルギニンであり、より好ましくは全アミノ酸の３／７以上５／７以下がアルギニンであり、より好ましくは全アミノ酸の３／７以上４／７以下がアルギニンであり、最も好ましくは全アミノ酸の３／７がアルギニンである。上記構成であれば、酸化ケイ素結合タグが効率よく酸化ケイ素に結合できる。更に、上記構成であれば、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を効率よくアルギニンによって解離させることができる。一方、酸化ケイ素結合タグを構成する全アミノ酸がアルギニンである場合には、酸化ケイ素結合タグの酸化ケイ素に対する結合効率が低下する傾向を示す。
　本実施の形態の酸化ケイ素結合タグを構成するポリペプチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいてもよい。
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
　配列番号３に記載のアミノ酸からなるポリペプチドは、原核生物であるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１４５７９）に由来するＣｏｔＢ１タンパク質の部分ペプチドである。
　上記（ｄ）に記載のポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列中のアルギニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチドであることが好ましい。上記構成であれば、酸化ケイ素結合タグが効率よく酸化ケイ素に結合できるのみならず、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を効率よくアルギニンによって解離させることができる。
　上記（ｄ）に記載のペプチドにおいて、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、最も好ましくは１個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。
　上記（ｄ）に記載のペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは４５％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチドであってもよい。
　好ましい変異としては、アミノ酸の置換、欠失、または付加を挙げることができる。上述した変異の中では、アミノ酸の置換が更に好ましい。
　アミノ酸の置換としては特に限定されないが、例えば、任意のアミノ酸が、グリシンまたはアラニンへ置換されるような置換を挙げることができる。更に具体的に、アミノ酸の置換として、セリン、グリシン、アラニンまたはグルタミンが、グリシンまたはアラニンへ置換されるような置換を挙げることもできる。勿論、本発明は、上述した置換に限定されない。
　〔３．キット〕
　本実施の形態のキットは、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を精製するためのキットであって、分離用の固定相として酸化ケイ素を備えているカラムと、酸化ケイ素に結合する酸化ケイ素結合タグと、複合体を酸化ケイ素に特異的に結合させるための、塩が添加されていない結合用溶液と、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を解離させるための、アルギニンを含む解離用溶液と、を備えるものである。
　上記カラムは、分離用の固定相として酸化ケイ素を備えたものであればよく、具体的な構成は限定されない。当該カラムは、市販のカラムであってもよい。
　酸化ケイ素結合タグについては既に説明したので、その詳細な説明は省略するが、本実施の形態のキットは、酸化ケイ素結合タグ自体を備えていてもよいし、酸化ケイ素結合タグ、または、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を製造し得る構成を備えていてもよい。例えば、本実施の形態のキットは、酸化ケイ素結合タグをコードするポリヌクレオチドが挿入された、組み換えタンパク質発現用のベクターを備えていてもよい。この場合、キットの使用者が、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを当該ベクターへ挿入することによって、当該ベクターを、複合体発現用のベクターとすればよい。
　上記結合用溶液および解離用溶液については既に説明したので、その説明は省略する。
　本発明は、以下のように構成することも可能である。
　本発明の精製方法は、上記課題を解決するために、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を、当該複合体が特異的に結合している酸化ケイ素から解離させる解離工程を含む、複合体の精製方法であって、上記解離工程は、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を、アルギニンによって解離させる工程であることを特徴としている。
　本発明の精製方法では、上記物質は、タンパク質であることが好ましい。
　本発明の精製方法では、上記解離工程は、酸化ケイ素に結合している上記複合体を、アルギニンを含有する溶出液に接触させる工程であり、上記溶出液は、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の特異的な結合を解離させる解離剤として、アルギニンのみを含有しているものであることが好ましい。
　本発明の精製方法では、上記酸化ケイ素は、シラスに含まれているものであることが好ましい。
　本発明の精製方法では、上記酸化ケイ素結合タグは、ポリペプチドを備えるものであり、上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の５／１４以上７／７未満が、アルギニンであることが好ましい。
　本発明の精製方法では、上記ポリペプチドは、１４個以下のアミノ酸からなるものであることが好ましい。
　本発明の精製方法では、上記ポリペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含むものであることが好ましい；
（ａ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
　本発明の酸化ケイ素結合タグは、上記課題を解決するために、７個以下のアミノ酸によって構成されているポリペプチドを備える酸化ケイ素結合タグであって、上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の３／７以上７／７未満が、アルギニンであることを特徴としている。
　本発明の酸化ケイ素結合タグでは、上記ポリペプチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるものであることが好ましい；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
　＜１．タグとＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのプラスミドの作製＞
　ＣｏｔＢ１ペプチド内の酸化ケイ素結合ドメインを特定するために、１４個のアミノ酸からなるＣｏｔＢ１ペプチドの一部分を欠失した変異ペプチドと、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）との融合タンパク質を発現するためのプラスミドを作製した。
　まず、表１に示す野生型のＣｏｔＢ１ペプチドとＧＦＰとの融合タンパク質（ＣｏｔＢ１ｐ－ＧＦＰ）の発現プラスミド（ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ：Abdelhamid et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 98(12), 5677-5684, 2014）を鋳型として用いたインバースＰＣＲ法によって、表１に示す３種類の変異型のＣｏｔＢ１ペプチドの各々（♯９～♯１１）とＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのプラスミド（ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯１０）、および、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯１１））を構築した。
　具体的には、インバースＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ断片の末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Takara Bio）を用いてリン酸化し、リン酸化されたＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（TOYOBO）を用いて環状化した後、環状化されたＤＮＡ断片を用いてクローニング用宿主である大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、所望のプラスミドが導入された大腸菌を選抜した。そして、周知の方法にしたがって、大腸菌から所望のプラスミドを精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜２．酸化ケイ素に対する融合タンパク質の結合力評価＞
　＜１＞にて精製した各プラスミドを、周知の方法にしたがってタンパク質発現用の宿主である大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）に導入して、形質転換体を取得した。
　当該形質転換体を、１％グルコースを含む２×ＹＴ培地中でＯＤ６００が０．５になるまで３７℃で培養した後、培地中に０．２ｍＭ　ＩＰＴＧ（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）を添加し、更に３７℃で４時間培養することで、各融合タンパク質を大量に発現した菌体を得た。
　各菌体を反応バッファー（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）、０．５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ　２０（登録商標））に懸濁し、超音波処理によって菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離処理（２０，０００×ｇ、３０分間、４℃）し、その上清を融合タンパク質抽出液として回収した。当該融合タンパク質抽出液を菌体抽出画分とした。
　１０ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ｆｉｎｅ　ｐｏｗｄｅｒ　ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を含む０．１ｍＬの反応バッファーに、適宜希釈した融合タンパク質抽出液を添加し、室温で３０分間混合した。その後、遠心分離処理（５，０００×ｇ、２分間、２５℃）によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を未結合画分として、沈殿物を酸化ケイ素結合画分として回収した。
　得られた各サンプル（菌体抽出画分、および、未結合画分）のＧＦＰに由来する蛍光値を測定し、菌体抽出画分の蛍光値から未結合画分の蛍光値を差し引いたものを、酸化ケイ素結合画分の蛍光値とした。
　菌体抽出画分中の融合タンパク質のうち、酸化ケイ素に結合した融合タンパク質の割合（酸化ケイ素結合画分の蛍光値／菌体抽出画分の蛍光値）を指標として、各変異型のＣｏｔＢ１ペプチドの結合力を比較した。
　なお、ポジティブコントロールとして、野生型のＣｏｔＢ１ペプチドとＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのプラスミド（ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）、ネガティブコントロールとして、ＧＦＰのみを発現するためのプラスミド（ｐＥＴ－ＧＦＰ）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）についても、同様の試験を行った。
　試験結果を表１に示す。変異型のＣｏｔＢ１ペプチドは、野生型のＣｏｔＢ１ペプチドの７０％以上もの結合力を保持していることが明らかになった。
　変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（特に、♯９）は、非常に少ないアミノ酸（７個のアミノ酸）からなる小さなペプチドでありながら、野生型のＣｏｔＢ１ペプチドに匹敵する高い結合力を示すことが明らかになった。
　変異型のＣｏｔＢ１ペプチドのサイズは、組換えタンパク質の精製に汎用されるＨｉｓ－ｔａｇ（６個のアミノ酸からなり、Ｎｉ２＋などに親和性を示すタグ）と略同じサイズであり、所望のタンパク質に融合させるタグとしては、非常に小さいものである。それ故に、所望のタンパク質に融合させた場合、所望のタンパク質に与える影響が非常に小さいと考えられる。なお、表２に、代表的な周知のタグを記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜３．タグの結合力にとって重要な、タグ内のアミノ酸の同定＞
　変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（♯９）について、７個のアミノ酸のうち、どのアミノ酸が酸化ケイ素に対する結合に重要であるかを解析した。
　まず、変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（♯９）と、ＧＦＰとの融合タンパク質の発現プラスミド（ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯９））を鋳型として用いたインバースＰＣＲ法によって、表３に示す７種類の変異型のＣｏｔＢ１ペプチドの各々（♯１２～♯１８）またはＲ９－ｔａｇと、ＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのプラスミド（ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯１２）、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯１３）、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯１４）、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯１５）、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯１６）、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯１７）、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯１８）、または、ｐＥＴ－ＧＦＰ－（Ｒ９－ｔａｇ））を構築した。なお、表３に示す７種類の変異型のＣｏｔＢ１ペプチドは、変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（♯９）を構成する７個のアミノ酸の各々をアラニンに置換したペプチドである。
　具体的には、インバースＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ断片の末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Takara Bio）を用いてリン酸化し、リン酸化されたＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（TOYOBO）を用いて環状化した後、環状化されたＤＮＡ断片を用いてクローニング用宿主である大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、所望のプラスミドが導入された大腸菌を選抜した。そして、周知の方法にしたがって、大腸菌から所望のプラスミドを精製した。
　各融合タンパク質の結合力評価は、＜２＞に記載の方法にしたがって行った。また、Ｒ９－ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質の発現は、Taniguchi等の文献（Koji Taniguchi et al., Biotechnology and Bioengineering Vol.96, No.6, April 15, p1023-1029, 2007）に記載の方法にしたがって行った。
　試験結果を表３に示す。
　解析の結果、変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（♯９）を構成する７個のアミノ酸中、３個のアルギニンの何れかをアラニンに置換した場合、顕著に結合力が低下することが明らかになった（表３の♯１２、♯１６、♯１８参照）。
　一方、アルギニン以外のアミノ酸（例えば、グルタミン、セリン、グリシン）をアラニンに置換した場合は、結合力の低下は、ほとんど観察されなかった。
　更に、比較として用いたＲ９－ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質は、本試験の条件下では、酸化ケイ素にほとんど結合しなかった。Ｒ９－ｔａｇは、酸化ケイ素に結合することが既に報告されているが（S.M. Fuchs & R.T. Raines [2005] Polyarginine as a multifunctional fusion tag, Protein Sci. 14, 1538-1544）、本試験の条件下では、反応バッファー中に含まれる界面活性剤（具体的には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（更に具体的には。０．５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ　２０（登録商標）））によって、酸化ケイ素への結合が阻害されたと考えられる。
　以上の結果から、変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（♯９）と酸化ケイ素との結合にはアルギニンが最も重要であるが、アルギニンのみで構成されるＲ９－ｔａｇの結合力が低かったことから、アルギニンだけでなくその他のアミノ酸の寄与も大きいと考えられる。但し、アルギニン以外のアミノ酸をアラニンに置換しても結合力の低下がほとんど見られなかったことから、アルギニン以外のアミノ酸は、アルギニンとアルギニンとの間のスペーサーとして働いていると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　＜４．酸化ケイ素に対する変異型のＣｏｔＢ１ペプチドの結合力と、酸化ケイ素に対するＲ９－ｔａｇの結合力との比較＞
　上述した方法にしたがって、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）、および、ｐＥＴ－ＧＦＰ－（Ｒ９－ｔａｇ）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）を作製した。
　各大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、各大腸菌を、様々な濃度（０％（ｖ／ｖ）、０．０５％（ｖ／ｖ）、０．１％（ｖ／ｖ）、または、０．５％（ｖ／ｖ））のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。
　１ｍＬの菌体抽出画分に対して２５ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ｆｉｎｅ　ｐｏｗｄｅｒ　ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で１５分間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を５回洗浄した。遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した後、当該酸化ケイ素粒子をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーに懸濁し、９５℃で５分間加熱することによって、酸化ケイ素粒子の表面に結合した融合タンパク質を酸化ケイ素粒子から解離させた。そして、解離した融合タンパク質を含むサンプルバッファーをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。
　試験結果を図１に示す。なお、図１中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、「Ｓ」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「１」および「２」は、Ｔｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含まないＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の試験結果を示し、レーン「３」は、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含むＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の試験結果を示し、レーン「４」は、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含むＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の試験結果を示し、レーン「５」は、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含むＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の試験結果を示している。
　図１から明らかなように、変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（♯９）とＧＦＰとの融合タンパク質は、界面活性剤であるＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）の有無に関わらず、酸化ケイ素に結合するのに対し、Ｒ９－ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質は、Ｔｗｅｅｎ　２０（登録商標）の存在下では、酸化ケイ素に結合できなかった。
　Ｔｗｅｅｎ　２０（登録商標）は、所望のタンパク質以外のタンパク質が精製用のカラム等に非特異的に吸着することを防止するため、換言すれば、精製される所望のタンパク質の純度を高めるため、に広く用いられている。
　変異型のＣｏｔＢ１ペプチドは、Ｔｗｅｅｎ　２０（登録商標）の存在下であっても酸化ケイ素に結合できるので、Ｒ９－ｔａｇよりも、汎用性に優れているとともに、より高純度で所望のタンパク質を固定・精製することを可能にする。
　＜５．酸化ケイ素からの、融合タンパク質の特異的な溶出－１＞
　上述した方法にしたがって、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）を作製した。
　上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌を、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．５）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。
　１ｍＬの菌体抽出画分に対して２５ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ｆｉｎｅ　ｐｏｗｄｅｒ　ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で１５分間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を４回洗浄した。遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。
　当該酸化ケイ素粒子を０．２Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を回収した。そして、当該上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ　Ｒ－２５０によって染色したゲルの画像を撮影し、画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅＪによって所望の融合タンパク質の純度・収率を解析した。
　試験結果を図２に示す。なお、図２中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、「Ｓ」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、「Ｂ」は、４回の洗浄の後に酸化ケイ素粒子に結合していたタンパク質の試験結果を示し、レーン「１」は、アルギニンによる溶出の後も酸化ケイ素粒子に結合していたタンパク質の試験結果を示し、レーン「２」は、アルギニンによる溶出によって酸化ケイ素から解離したタンパク質の試験結果を示している。
　図２から明らかなように、アルギニンを用いれば、所望の融合タンパク質を酸化ケイ素から特異的に解離できることが明らかになった。なお、アルギニンを用いた場合、所望の融合タンパク質の精製純度は９０％であり、所望の融合タンパク質の収率は７０％であった。
　＜６．酸化ケイ素からの、融合タンパク質の特異的な溶出－２＞
　Ｓｉ－ｔａｇ（アミノ酸配列：配列番号１８、ＤＮＡ配列：配列番号１９）、Ｒ９－ｔａｇ（アミノ酸配列：配列番号１６、ＤＮＡ配列：配列番号１７）、および、ＴＡＴタンパク質の部分ペプチド（ＴＡＴ－ｔａｇ、アミノ酸配列：配列番号２０）について、アルギニンによる溶出が可能であるか確認した。
　＜６－１．Ｓｉ－ｔａｇ＞
　Ｓｉ－ｔａｇを融合した抗体タンパク質ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ（Ｓｉ－ｔａｇ融合ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ：発現方法および精製方法は、Ikeda等の文献（Analytical Biochemistry, Vol.385, p132-137（2009年））を参照）を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に、５ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ｆｉｎｅ　ｐｏｗｄｅｒ　ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、１５分間混合して、Ｓｉ－ｔａｇ融合ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａを酸化ケイ素粒子に吸着させた。酸化ケイ素粒子を２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）で３回洗浄した後、遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。
　当該酸化ケイ素粒子を１Ｍまたは２Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を回収した。そして、当該上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。所望の融合タンパク質の純度および収率は＜５＞に記載の方法にしたがって行った。
　試験結果を図３に示す。図３に示すように、アルギニンによって、所望の融合タンパク質を酸化ケイ素から解離できることが明らかになった。なお、１Ｍのアルギニンを用いた場合、所望の融合タンパク質の回収率は６０％であり、２Ｍのアルギニンを用いた場合、所望の融合タンパク質の回収率は８５％であった。
　＜６－２．Ｒ９－ｔａｇ＞
　Ｒ９－ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質（発現方法および精製方法は、Taniguchi等の文献（Koji Taniguchi et al., Biotechnology and Bioengineering Vol.96, No.6, April 15, p1023-1029, 2007）を参照）を含む、５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に、５ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ｆｉｎｅ　ｐｏｗｄｅｒ　ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、１５分間混合して、Ｒ９－ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質を酸化ケイ素粒子に吸着させた。酸化ケイ素粒子を２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）で３回洗浄した後、遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。
　当該酸化ケイ素粒子を１Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を回収した。そして、当該上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。
　試験結果を図４に示す。図４に示すように、酸化ケイ素に結合したＲ９－ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質は、１Ｍのアルギニン溶液によって略１００％溶出された。このことから、アルギニンによる溶出は、様々な酸化ケイ素結合性タンパク質および酸化ケイ素結合性ペプチドに対しても利用できる手法だと考えられる。
　＜６－３．ＴＡＴ－ｔａｇ＞
　ＴＡＴ－ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのプラスミドを作製した。
　具体的には、ＴＡＴタンパク質の部分ペプチド（配列番号２０）のＣ末端側にＧＦＰが付加されている融合タンパク質をコードするＤＮＡを合成した。なお、当該ＤＮＡの５’末端にはＮｄｅＩ認識配列を、３’末端にはＥｃｏＲＩ認識配列を付加した。
　合成したＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよび制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、当該消化物と、同様に制限酵素ＮｄｅＩおよび制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したｐＥＴ－４７ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて１６℃にて２時間の間、ライゲーションさせた。その後、ライゲーション産物を用いてクローニング用宿主である大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、所望のプラスミド（ｐＥＴ－ＴＡＴ－ＧＦＰ）が導入された大腸菌を選抜した。そして、周知の方法にしたがって、大腸菌から所望のプラスミドを精製した。
　上述した方法にしたがって、ｐＥＴ－ＴＡＴ－ＧＦＰが導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）を作製した。
　上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌を、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。１ｍＬの菌体抽出画分に対して１００ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ｆｉｎｅ　ｐｏｗｄｅｒ　ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で１５分間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を４回洗浄した。遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。
　当該酸化ケイ素粒子を１．０Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を回収した。そして、当該上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。純度・収率は＜５＞に記載の方法にしたがって解析した。
　試験結果を図６に示す。なお、図６中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、「Ｓ」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「１」は、アルギニンによる溶出によって酸化ケイ素から解離したタンパク質の試験結果を示している。
　図６から明らかなように、アルギニンを用いれば、所望の融合タンパク質を酸化ケイ素から特異的に解離できることが明らかになった。なお、アルギニンを用いた場合、所望の融合タンパク質の精製純度は８０％であり、所望の融合タンパク質の収率は７０％であった。このことから、アルギニンによる溶出は、様々な酸化ケイ素結合性タンパク質および酸化ケイ素結合性ペプチドに対しても利用できる手法だと考えられる。
　＜７．酸化ケイ素（シラス粒子）からの、融合タンパク質の特異的な溶出－３＞
　上述した方法にしたがって、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）を作製した。
　上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌を、１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。
　酸化ケイ素を主要な成分として含む火砕流堆積物であるシラス粒子（鹿児島県産）１０ｍｇを１ｍＬの菌体抽出画分に対して添加し、室温で５秒間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を３回洗浄した。遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。
　当該酸化ケイ素粒子を０．３Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によってシラス粒子を沈殿させ、上清を回収した。そして、当該上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。純度・収率は、＜５＞に記載の方法にしたがって解析した。
　試験結果を図５に示す。なお、図５中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、「Ｓ」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「１」は、アルギニンによる溶出によってシラス粒子から解離したタンパク質の試験結果を示している。
　図５から明らかなように、アルギニンを用いれば、所望の融合タンパク質をシラス粒子から特異的に解離できることが明らかになった。なお、アルギニンを用いた場合、所望の融合タンパク質の精製純度は９５％であり、所望の融合タンパク質の収率は８０％であった。
　＜７．ＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）を融合したｍＣｈｅｒｒｙの精製＞
　ＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）と蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号２２）との融合タンパク質を発現するためのプラスミドを作製した。
　具体的には、まず、野生型のＣｏｔＢ１ペプチドとＳＵＭＯとｍＣｈｅｒｒｙとの融合タンパク質（ＣｏｔＢ１ｐ－ＧＦＰ）の発現プラスミド（ｐＥＴ－ＣｏｔＢ１ｐ－ＳＣ：Abdelhamid et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 98(12), 5677-5684, 2014）を鋳型として用いたインバースＰＣＲ法によって、ＳＵＭＯをコードする領域を除いたプラスミドを構築した。得られたプラスミドを鋳型として再度インバースＰＣＲ法を行い、野生型のＣｏｔＢ１領域の一部を欠失させることで、所望のプラスミド（ｐＥＴ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）－ｍＣｈｅｒｒｙ）を構築した。
　上述した方法にしたがって、ｐＥＴ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）－ｍＣｈｅｒｒｙが導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を作製した。
　上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌を、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。
　２ｍＬの菌体抽出画分に対して０．４ｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ｆｉｎｅ　ｐｏｗｄｅｒ　ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で５分間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を３回洗浄した。遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。
　当該酸化ケイ素粒子を０．５Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を回収した。そして、当該上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。純度・収率は＜５＞に記載の方法にしたがって解析した。
　試験結果を図７に示す。なお、図７中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、レーン「１」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「２」は、酸化ケイ素粒子との混合後に上清に残存していたタンパク質の試験結果を示し、レーン「３」は、アルギニンによる溶出によって酸化ケイ素から解離したタンパク質の試験結果を示している。
　図７から明らかなように、アルギニンを用いれば、所望の融合タンパク質を酸化ケイ素から特異的に解離できることが明らかになった。なお、アルギニンを用いた場合、所望の融合タンパク質の精製純度は８９％であり、所望の融合タンパク質の収率は８８％であった。
　＜８．シリカメンブレンを備えたスピンカラムによる、ＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）とＧＦＰとの融合タンパク質の精製＞
　上述した方法にしたがって、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を作製した。
　上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌（湿重量約１０ｍｇ）を、５００μＬの２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。
　Ｑｉａｇｅｎ社Ｗｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍに付属のシリカメンブレンを備えたスピンカラムに対して、菌体抽出画分５００μＬを加え、室温で１分間静置した。その後、スピンカラムを遠心分離（１６，０００×ｇ、１分間、４℃）に供することで、菌体抽出画分にシリカメンブレン内を通過させた。スピンカラムに０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）を５００μＬ加え、同様に遠心分離に供することで、シリカメンブレンを洗浄した。洗浄操作をさらに２回繰り返した後、スピンカラムを新しい１．５ｍＬ容マイクロチューブ内に移した。スピンカラムに０．５Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）を１ｍＬ加え、同様に遠心分離に供し、シリカメンブレンを通過した溶液を回収した。そして、当該溶液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。純度・収率は＜５＞に記載の方法にしたがって解析した。
　試験結果を図８に示す。なお、図８中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、レーン「１」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「２」は、シリカメンブレンを通過した菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「３」は、アルギニンによる溶出によってシリカメンブレンから解離したタンパク質の試験結果を示している。
　図８から明らかなように、シリカメンブレンを備えたスピンカラムを用いれば、遠心分離操作によって所望の融合タンパク質をシリカメンブレンに吸着させることができ、かつ、アルギニン溶液によってシリカメンブレンから所望の融合タンパク質を解離できることが明らかになった。なお、シリカメンブレンを備えたスピンカラムを用いた場合、所望の融合タンパク質の精製純度は８９％であり、所望の融合タンパク質の収率は８８％であった。
　＜９．ＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）とＧＦＰとの融合タンパク質の、酸化ケイ素粒子への結合条件の検討＞
　上述した方法にしたがって、ｐＥＴ－ＧＦＰ－ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を作製した。
　上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌を、（ｉ）０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）、または、（ｉｉ）０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）と、０．１５Ｍ若しくは０．５ＭのＮａＣｌと、を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。
　２ｍＬの菌体抽出画分に対して０．４ｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ｆｉｎｅ　ｐｏｗｄｅｒ　ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で５分間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を３回洗浄した。遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した後、当該酸化ケイ素粒子をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーに懸濁し、９５℃で５分間加熱することによって、酸化ケイ素粒子の表面に結合した融合タンパク質を酸化ケイ素粒子から解離させた。そして、解離した融合タンパク質を含むサンプルバッファーをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。
　試験結果を図９に示す。なお、図９中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、レーン「Ｓ」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「１」は、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）を用いた場合の精製タンパク質の試験結果を示し、レーン「２」は、０．１５ＭのＮａＣｌと、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）と、を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）を用いた場合の精製タンパク質の試験結果を示し、レーン「３」は、０．５ＭのＮａＣｌと、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）と、を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）を用いた場合の精製タンパク質の試験結果を示している。
　図９から明らかなように、ＮａＣｌを含む緩衝液を用いた場合は多くの大腸菌由来タンパク質も酸化ケイ素粒子に結合するのに対し、ＮａＣｌを含まない緩衝液を用いた場合は、所望の融合タンパク質を特異的に酸化ケイ素粒子に結合できることが明らかとなった。
　＜１０．ＣｏｔＢ１ｐペプチド（野生型）、または、ＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）の融合が、融合対象であるタンパク質へ及ぼす影響の比較＞
　ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）にＣｏｔＢ１ｐペプチド（野生型）またはＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）を融合した融合タンパク質を発現するためのプラスミドを作製した。
　具体的には、Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株のＤＨＦＲ（配列番号２３）のカルボキシル末端側にＣｏｔＢ１ｐペプチド（野生型）またはＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）が付加されている融合タンパク質をコードするＤＮＡを合成した。なお、当該ＤＮＡの５’末端にはＳａｃＩＩ認識配列を、３’末端にはＸｈｏＩ認識配列を付加した。
　合成したＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩＩおよび制限酵素ＸｈｏＩで消化した後、当該消化物と、同様に制限酵素ＳａｃＩＩおよび制限酵素ＸｈｏＩで消化したｐＥＴ－４７ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて１６℃にて２時間の間、ライゲーションさせた。その後、ライゲーション産物を用いてクローニング用宿主である大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、所望のプラスミド（ｐＥＴ－ＤＨＦＲ－ＧＦＰ）が導入された大腸菌を選抜した。そして、周知の方法にしたがって、大腸菌から所望のプラスミドを精製した。
　上述した方法にしたがって、ｐＥＴ－ＤＨＦＲ－ＧＦＰが導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を作製した。
　上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌を、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ　２０（登録商標）を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。
　２ｍＬの菌体抽出画分に対して０．４ｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ　ｆｉｎｅ　ｐｏｗｄｅｒ　ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で５分間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を３回洗浄した。遠心分離処理によって、洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。
　当該酸化ケイ素粒子を０．５Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を回収した。このアルギニンによる溶出操作を計２回行った。そして、当該上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。純度・収率は＜５＞に記載の方法にしたがって解析した。
　試験結果を図１０に示す。なお、図１０中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、「Ｓ」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、「Ｕ」は、菌体抽出画分と酸化ケイ素粒子とを混合した際に酸化ケイ素粒子に結合しなかったタンパク質（未結合画分）の試験結果を示し、レーン「１」およびレーン「２」は、アルギニンによる溶出によって酸化ケイ素から解離したタンパク質の試験結果を示している。
　図１０から明らかなように、ＤＨＦＲにＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）を融合させた場合は、当該融合タンパク質は、可溶性タンパク質として発現され、純度高く、かつ、高収率で回収できることが明らかになった。一方、ＤＨＦＲにＣｏｔＢ１ｐペプチド（野生型）を融合させた場合は、ＤＨＦＲにＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）を融合させた場合と比較して、当該融合タンパク質は、可溶性タンパク質として発現し難いことが明らかとなった。
　すなわち、より小さなペプチド（例えば、ＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９））を用いた方が、融合タンパク質が可溶性を示すことが明らかになった。なお、ＤＨＦＲにＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）を融合させた場合は、菌体抽出画分に含まれる全タンパク質のうちの約７％が所望の融合タンパク質であったのに対し、ＤＨＦＲにＣｏｔＢ１ｐペプチド（野生型）を融合させた場合は、菌体抽出画分に含まれる全タンパク質のうちの１％未満が所望の融合タンパク質であった。
　本発明は、様々な物質の精製に利用することができる。

Claims (11)

  1. 　塩が添加されていない結合用溶液の中で、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を、酸化ケイ素に特異的に結合させる結合工程と、
    　上記複合体を、上記酸化ケイ素から解離させる解離工程と、を含み、
    　上記解離工程は、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を、アルギニンによって解離させる工程であることを特徴とする、複合体の精製方法。
  2. 　上記結合用溶液は、ｐＨ緩衝液および溶媒からなる溶液、または、ｐＨ緩衝液、界面活性剤および溶媒からなる溶液であることを特徴とする請求項１に記載の複合体の精製方法。
  3. 　上記物質は、タンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の精製方法。
  4. 　上記解離工程は、酸化ケイ素に結合している上記複合体を、アルギニンを含有する溶出液に接触させる工程であり、
    　上記溶出液は、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の特異的な結合を解離させる解離剤として、アルギニンのみを含有しているものであることを特徴とする請求項１～３の何れか１項に記載の精製方法。
  5. 　上記酸化ケイ素は、シラスに含まれているものであることを特徴とする請求項１～４の何れか１項に記載の精製方法。
  6. 　上記酸化ケイ素結合タグは、ポリペプチドを備えるものであり、
    　上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の５／１４以上７／７未満が、アルギニンであることを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載の精製方法。
  7. 　上記ポリペプチドは、１４個以下のアミノ酸からなるものであることを特徴とする請求項６に記載の精製方法。
  8. 　上記ポリペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含むものであることを特徴とする請求項６または７に記載の精製方法；
    （ａ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｂ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
  9. 　７個以下のアミノ酸によって構成されているポリペプチドを備える酸化ケイ素結合タグであって、
    　上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の３／７以上７／７未満が、アルギニンであることを特徴とする酸化ケイ素結合タグ。
  10. 　上記ポリペプチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるものであることを特徴とする請求項９に記載の酸化ケイ素結合タグ；
    （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
  11. 　酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を精製するためのキットであって、
    　分離用の固定相として酸化ケイ素を備えているカラムと、
    　上記酸化ケイ素に結合する酸化ケイ素結合タグと、
    　上記複合体を上記酸化ケイ素に特異的に結合させるための、塩が添加されていない結合用溶液と、
    　上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を解離させるための、アルギニンを含む解離用溶液と、を備えることを特徴とするキット。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102704701B1 (ko) * 2018-11-08 2024-09-10 한국전력공사 탄산무수화효소 및 실리카 친화성 펩타이드를 포함하는 융합 단백질 및 이의 제조방법
CN114369593B (zh) * 2022-01-29 2024-04-30 天津大学 二氧化硅结合肽介导醇脱氢酶和胺脱氢酶共固定化级联反应制备手性胺的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005010031A1 (ja) * 2003-07-30 2005-02-03 Japan Science And Technology Agency チタン、銀、シリコンに結合能を有するペプチド
WO2007055288A1 (ja) * 2005-11-10 2007-05-18 National University Of Corporation Hiroshima University 酸化ケイ素含有物質に結合するタンパク質を介したタンパク質の固定化方法および固定化剤
JP2009136280A (ja) * 2007-11-16 2009-06-25 Institute Of Physical & Chemical Research 新規ペプチドおよびその利用
JP2010037222A (ja) * 2008-07-31 2010-02-18 Hiroshima Univ タンパク質の精製方法
JP2011219453A (ja) * 2010-03-26 2011-11-04 Kwansei Gakuin バイオシリカ形成能を有するペプチド
WO2012090789A1 (ja) * 2010-12-28 2012-07-05 国立大学法人広島大学 酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するポリペプチドおよびその利用
JP2015040208A (ja) * 2013-08-23 2015-03-02 国立大学法人広島大学 ペプチドおよびその利用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007055243A1 (ja) 2005-11-10 2007-05-18 National University Of Corporation Hiroshima University 石綿検出方法、石綿検出剤および石綿検出キット、並びに、石綿が病因または増悪因子となる疾病を予防または治療する薬剤候補物質のスクリーニング方法
JP2012031100A (ja) 2010-07-30 2012-02-16 Hiroshima Univ シリカを重合させるペプチドおよびその利用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005010031A1 (ja) * 2003-07-30 2005-02-03 Japan Science And Technology Agency チタン、銀、シリコンに結合能を有するペプチド
WO2007055288A1 (ja) * 2005-11-10 2007-05-18 National University Of Corporation Hiroshima University 酸化ケイ素含有物質に結合するタンパク質を介したタンパク質の固定化方法および固定化剤
JP2009136280A (ja) * 2007-11-16 2009-06-25 Institute Of Physical & Chemical Research 新規ペプチドおよびその利用
JP2010037222A (ja) * 2008-07-31 2010-02-18 Hiroshima Univ タンパク質の精製方法
JP2011219453A (ja) * 2010-03-26 2011-11-04 Kwansei Gakuin バイオシリカ形成能を有するペプチド
WO2012090789A1 (ja) * 2010-12-28 2012-07-05 国立大学法人広島大学 酸化ケイ素と窒化ケイ素とを識別するポリペプチドおよびその利用
JP2015040208A (ja) * 2013-08-23 2015-03-02 国立大学法人広島大学 ペプチドおよびその利用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3210994A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018033451A (ja) * 2016-08-24 2018-03-08 国立研究開発法人産業技術総合研究所 Ｓｉ−ｔａｇ融合異種酵素とメソポーラスシリカとの複合体
JP7029123B2 (ja) 2016-08-24 2022-03-03 国立研究開発法人産業技術総合研究所 Ｓｉ－ｔａｇ融合異種酵素とメソポーラスシリカとの複合体

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