JP2014508118A - プロテインaの新規アルカリ抵抗性変異体及びアフィニティークロマトグラフィーにおけるその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図3
Description
特段に定義を与えない限り、本明細書におけるあらゆる専門及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同様の意味を有する。また、特段の記載が無い限り、特許請求の範囲を除き、「又は」の使用は、「及び」を包含し、その逆もまた同じである。非限定的な用語は、他に特に記述がなければ、或いは文脈がそれ以外を明示する場合を除き、限定的な用語として解釈すべきではない(例えば、「包含する」、「有する」及び「含む」は通常、「限定することなく包含する」を示す)。特許請求の範囲も含め、単数形(「a」、「an」及び「the」等)は、他に特に記述がない限り複数への参照を包含する。
本発明は、アルカリ抵抗性を有する数種の免疫グロブリン(Ig)リガンドタンパク質に関する。本発明は、その一実施形態において、野生型又は親Ig結合タンパク質の少なくとも1個のアスパラギン(Asn)残基が、ヒスチジン(His)残基、セリン(Ser)残基、アスパラギン酸(Asp)残基又はスレオニン(Thr)残基に置換された、免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質の変異体に関する。図3Bに示すように、該少なくとも1個の置換は、変異体Ig結合タンパク質のアルカリ性溶液中における安定性を、野生型Ig結合比べて向上させることができる。
本発明は、その一実施形態において、免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質の変異体に関する。該変異体は、少なくとも1個のAsn残基がHis、Ser、Asp又はThr残基に置換されたIg結合タンパク質を含むことができる。少なくとも1個の置換は、変異体Ig結合タンパク質に、野生型Ig結合と比較した場合に、アルカリ性溶液において向上した安定性を付与することができる。
本発明は、その一実施形態において、アフィニティー分離のためのマトリクスに関する。該マトリクスは、固体支持体とカップリングした、本発明のIg結合タンパク質のいずれかから作製することが可能なIgリガンドを含むことができる。図2に示すように、本発明の実施形態に係るマトリクスは、親分子をIgリガンドとして構成されたマトリクス(図2におけるZ)と比較して、断続的アルカリクリーニングを行った2回以上の分離プロセスにおいて結合能の増加を示す。予期せぬことに本発明者らは、アスパラギン残基のアスパラギン酸(D)への突然変異が、Igリガンドに改善された結合能を付与することを見出した。本発明のIgリガンドタンパク質は、好ましくは、Fcフラグメント結合タンパク質であり得、IgG、IgA及び/又はIgM、好ましくはIgGの選択的結合に用いることができる。
本発明は、その一実施形態において、組成物からIgG、IgA及び/又はIgM等の免疫グロブリン(Ig)、又はFc融合タンパク質を分離する方法に関する。該組成物は、Ig、及びIgが分離されるべき少なくとも1種の他の物質から構成され得る。本方法は、固体支持体とカップリングした本発明の実施形態に係る変異体又は変異体Ig結合タンパク質、本発明に係るマルチマー又はマトリクスを含む、アフィニティー分離のためのマトリクスと、該組成物とを接触させることにより、該組成物における該少なくとも1種の他の物質から該Igを分離する工程を含むことができる。本方法は更に、溶出剤をマトリクスに添加することにより、固体支持体からIgを溶出させる工程を含むことができる。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のプロテインAのBドメインの変異体であるZドメイン(配列番号1)を鋳型として用いて、Quickchange(ストラタジーン社)により突然変異を誘発させ、1、2又は3個のアミノ酸残基の部位特異的突然変異を含む変異体を作製した。ニッケルアフィニティーカラム(キアゲン社)におけるタンパク質精製を容易にするため、(His)6タグを備えるpETM11発現ベクターに、Zドメイン変異体をクローニングした。GEヘルスケア社製エポキシ活性化樹脂、又は(5)多孔性ビーズの合成セクションに示す独自開発したエポキシ樹脂に、精製Zドメイン変異体を固定化した。後述のように、各Zドメイン変異体のIgG結合能及びアルカリ抵抗性能力を評価した。
クローニング手順のフローチャートを図4に示す。野生型Zドメイン(図4(a))(NcoI−EcoRIによりpETM11にライゲーションされている)を構成ブロックとして用いて、4HDS(Zドメイン及び三重変異体N3H/N6D/N23Sの4タンデムコピー)構築物を作製した。
(1)プロテインA発現ベクターの構築
pETM11ベクター(ヨーロピアンモレキュラーバイオロジーラボラトリー)又はpET24aベクター(ノバジェン)のいずれかにおいて全構築物を発現させた。プロテインA遺伝子を含有するTAP−Tagプラスミド(EMBL)を鋳型として用いたPCR法により、オリジナルのプロテインA遺伝子を増幅した。PCRによる部位特異的突然変異誘発(PCR assisted site-directed mutagenesis)によりZドメインを作製した(後述を参照)。
BL21(DE3)pLysSコンピテント細胞は、T7プロモーターの制御下にありリボソーム結合部位を有する任意の遺伝子からの、高効率のタンパク質発現を可能にする。BL21(DE3)pLysSは、lac UV5プロモーターの制御下においてT7 RNAポリメラーゼをコードするT7バクテリオファージ遺伝子Iを含有するλ−DE3に対し溶原性である。BL21(DE3)pLysSは、T7リゾチームをコードする遺伝子を保有するプラスミド、pLysSも含有する。T7リゾチームは、T7プロモーターの制御下における標的遺伝子のバックグラウンド発現レベルを低下させるが、IPTGによる誘導後に達成される発現のレベルに干渉しない。標的DNAプラスミドを用いて、BL21コンピテント細胞をトランスフェクトした。約0.5gのDNAを含有する0.5μLのプラスミドDNAをトランスフェクションに用いた。BL21コンピテント細胞は−80℃で保存した。BL21細胞のアリコート(20μL)を解凍し、氷上に置いた。0.5μLのプラスミドDNAをコンピテント細胞と混合し、氷上に60分間置いた。氷上におけるインキュベーション後に、このプラスミドDNAを含有する細胞に、45℃水浴において45秒間「熱ショック」を与え、直ちに更に2分間氷上に置いた。次に、細菌細胞に30μLのLB培地を添加し、37℃で1時間振盪した。続いて、カナマイシン(終濃度:100μg/mL)を含有する寒天/LBプレート上にこの細胞を蒔いた。このプレートを37℃で一晩インキュベートした。
PCRに基づく部位特異的な突然変異誘発方法を用いてZ又はBドメインに変異を導入した。即ち、所望の変異を保有する重複するオリゴヌクレオチドを適切な隣接プライマーと組み合わせ、2個の重複する変異体産物を得た。変異したドメインを適切な発現ベクターに方向性を考慮してサブクローニングした。全ての変異はDNA配列決定により確認した。
ポリアクリルアミドゲルにおいてドデシル硫酸ナトリウム(SDS)存在下で電気泳動を行った。試料(10μL)を10μLのサンプルバッファー(62.5mM Tris−HCl、pH6.8、2%SDS、5%メルカプトエタノール、10%グリセロール及び0.0025%ブロモフェノールブルー(brophenol blue))と混合し、90℃で2分間加熱し、冷却し、ゲルにロードした。バイオラッドから購入された装置にて75mAにて電気泳動を行った。5:5:1メタノール/水/酢酸(acidic acid)に溶解した0.5mg/mLクーマシーブルー溶液中でゲルを染色し、電子レンジ内で加熱した水中で脱染した。
8.2gのメタクリル酸グリシジル(三菱レイヨン社製)、65.9gのトリメタクリル酸トリメチロールプロパン(サルトマー社製)及び90.6gのモノメタクリル酸グリセロール(NOF社製)を245.8gの2−オクタノン(東洋合成社製)及び62gのアセトフェノン(和光純薬社製)に溶解し、2gの2,2’−アゾイソブチロニトリル(和光純薬社製)を溶液に添加して、有機モノマー溶液を調製した。
プロテインAドメインZのHDS変異体の4コピーを、マルチクローニング部位の前にヒスチジンタグをコードする改変型pETM−11ベクターにクローニングする。大腸菌において発現すると、このpETM−4HDSコンストラクトは、配列番号10に示す配列を有するタンパク質を産生する。4HDS(+)と呼ばれるこのタンパク質は、N末端(His)7タグ、Tev切断配列ENLYFQG(配列番号18)及びATKASK(配列番号15)リンカー(アンカー)を特色とする。2個のドメイン間残基、EF(緑色)は、クローニングに用いたEcoRI制限酵素部位に由来する(図4)。
上述のように、4HDS(+)タンパク質はN末端にTev切断部位を含有する。TEVプロテアーゼは、タバコエッチウイルス(TEV)において発見された高度に部位特異的なシステインプロテアーゼである。この酵素の最適な認識配列は、Glu−Asn−Leu−Tyr−Phe−Gln−(Gly/Ser)(又はENLYFQ(G/S))(配列番号19)であり、切断は、GlnとGly/Ser残基との間で行われる。本発明者らは、TEV酵素(MoBiTech)を用いて、標準的な消化及び精製プロトコールに従って4HDS(+)タンパク質を消化し、Hisタグ配列を除去した。Tev切断により、4HDS(−)と呼ばれるタンパク質を産生した。4HDS(−)のアミノ酸配列を配列番号11に示す。
4HDS(+)のクローニングに関して記載されている手順と同じ手順を用いて、ヒスチジン(histine)タグ及びTev切断部位が先行するZドメインの4タンデム反復を含有するX03(+)を調製することができる。X03 DNAは、ヒスチジンタグとTev切断配列との間に(His)6タグ及び10個の追加的な残基(PMSDYDIPTT)(配列番号20)を含有する親pETM−11ベクターにサブクローニングする。特異的なアンカー又はリンカー配列は、この構築物に導入されていない。
本発明者らは、TEV酵素(MoBiTech)を用いて、標準的な消化及び精製プロトコールに従ってX03(+)タンパク質を消化し、Hisタグ配列を除去した。得られたタンパク質をX03(−)と呼ぶ。X03(−)のアミノ酸配列を配列番号13に示す。
100mLの0.1Mリン酸バッファー(pH:6.8)中に11mLのPB及び200mgの4HDS(−)が分散している混合物を調製した。21gの硫酸ナトリウムを添加した後、混合物を25℃で24時間振盪して、4HDS(−)をPBに固定化した。得られたビーズを濾過し、100mLの5Mチオグリセロールと混合し、30℃で4時間反応させて、残存するエポキシ基をブロッキングした。ビーズをPBS/0.05%Tween20で洗浄し、PBSで洗浄して、11mLの4HDS(−)固定化多孔性ビーズ(4HDS(−)−PB)を得た。
4HDS(−)の代わりにX03(−)を用いる以外は上述の固定化実施例と同じ方法により、X03(−)固定化ビーズ(X03(−)−PB)を得た。
「AKTAprime plus」(GEヘルスケア)クロマトグラフィーシステムによりDBC測定を行った。カラム(内径:0.5cm)に、それぞれHDS(−)−PB、X03(−)−PB又はMabSelect SuRe(GEヘルスケア)をベッド高20cmまで充填した。20mMリン酸バッファー(pH:7.4)を用いて各カラムを平衡化した後、ヒトポリクローナルIgG(5mg/mL)を含有する20mMリン酸バッファー(pH:7.4)を、各カラムに300cm/時間の線形流速でポンプ注入した。DBCを10%ブレークスルーで計算した。4HDS(−)−PB、X03(−)−PB及びMabselect SuReのアルカリ処理を行わない初期のDBCは、それぞれ46mg/mL、45mg/mL及び42mg/mLであった。
測定実施例1において用いた各カラムを、「AKTAprime plus」機器に設置し、40mLの0.5N水酸化ナトリウムを各カラム内に流した。各カラムを装置から取り出し、密封し、室温で所定の時間静置し(0.5N NaOH浸漬実験)、次に、20mMリン酸バッファー(pH:7.4)で洗浄した。上述の動的結合測定と同じ方法で0.5N水酸化ナトリウム浸漬後のDBCを測定した。0.5N水酸化ナトリウム処理時間に対するDBC保持率を図3に示す。図3に示すように、アフィニティーマトリクス4HDS(−)−PBは、X03(−)−PBよりも、さらに最もよく知られた市販のアルカリ抵抗性プロテインAアフィニティーマトリクスであるMabSelect SuReよりも、アルカリ処理後のDBC保持率において顕著に改善した性能を有する。
Claims (34)
- 免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質の変異体であって、該Ig結合タンパク質における少なくとも1個のアスパラギン(Asn)残基が、ヒスチジン(His)残基、セリン(Ser)残基、アスパラギン酸(Asp)残基又はスレオニン(Thr)残基に置換されているIg結合タンパク質を含み、該少なくとも1個の置換によって、該Ig結合タンパク質と比べてアルカリ安定性が向上している、変異体。
- 前記Ig結合タンパク質がプロテインAであることを特徴とする、請求項1に記載の変異体Ig結合タンパク質。
- 前記Ig結合タンパク質が配列番号1のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の変異体Ig結合タンパク質。
- Asn3His置換(配列番号1の3位のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換)又はAsn3Ser置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項3に記載の変異体Ig結合タンパク質。
- Asn6Asp置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項3に記載の変異体Ig結合タンパク質。
- Asn23Ser置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項3に記載の変異体Ig結合タンパク質。
- Asn3His/Asn23Ser又はAsn3His/An23Thrから選択される二重置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項3に記載の変異体Ig結合タンパク質。
- 三重置換Asn3His/Asn6Asp/Asn23Serを有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項3に記載の変異体Ig結合タンパク質。
- 配列番号8の4個のタンデムを有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項1に記載の変異体Ig結合タンパク質。
- 少なくとも1個のAsn残基がAsp残基に置換されたIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項1に記載の変異体Ig結合タンパク質。
- 前記変異体をアフィニティー分離のためのマトリクスに固定化することができるリンカーペプチドとカップリングしていることを特徴とする、請求項1に記載の変異体Ig結合タンパク質。
- 配列番号2〜11及び14から選択されることを特徴とするIg結合タンパク質。
- アフィニティー分離のためのマトリクスであって、固体支持体とカップリングした免疫グロブリン(Ig)結合タンパク質の変異体を含み、該変異体は、該Ig結合タンパク質における少なくとも1個のAsn残基がHis、Ser、Asp又はThr残基に置換されているIg結合タンパク質を含み、該少なくとも1個の置換によって、該変異体は、該Ig結合タンパク質と比べてアルカリ安定性が向上していることを特徴とする、マトリクス。
- 前記変異体がリンカーペプチドにより前記固体支持体とカップリングしていることを特徴とする、請求項13に記載のマトリクス。
- 前記Ig結合タンパク質がプロテインAであることを特徴とする、請求項13に記載のマトリクス。
- 前記Ig結合タンパク質が配列番号1のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項13に記載のマトリクス。
- 前記変異体がAsn3His置換(配列番号1の3位のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換)又はAsn3Ser置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項16に記載のマトリクス。
- 前記変異体がAsn6Asp置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項16に記載のマトリクス。
- 前記変異体がAsn23Ser置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項16に記載のマトリクス。
- 前記変異体がAsn3His/Asn23Ser又はAsn3His/Asn23Thrから選択される二重置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項16に記載のマトリクス。
- 前記変異体が三重置換Asn3His/Asn6Asp/Asn23Serを有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項16に記載のマトリクス。
- 前記変異体が、Ig結合タンパク質における少なくとも1個のAsn残基がAsp残基に置換されたIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項13に記載のマトリクス。
- 前記変異体が配列番号2〜11及び14から選択されることを特徴とする、請求項13に記載のマトリクス。
- 前記アンカーは配列番号15のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項13に記載のマトリクス。
- 免疫グロブリン(Ig)及び該Igが分離されるべき少なくとも1種の他の物質を含む組成物から該Igを分離する方法であって、固体支持体とカップリングしたIg結合タンパク質の変異体を含むアフィニティー分離のためのマトリクスと該組成物とを接触させ、これにより該組成物における該少なくとも1種の他の物質から該Igを分離することを含み、該変異体は、該Ig結合タンパク質における少なくとも1個のAsn残基がHis、Ser、Asp又はThr残基に置換されているIg結合タンパク質を含み、該少なくとも1個の置換によって、該変異体は、該Ig結合タンパク質と比べてアルカリ安定性が向上していることを特徴とする、方法。
- 前記Ig結合タンパク質がプロテインAであることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- 前記Ig結合タンパク質が配列番号1のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- 前記変異体がAsn3His置換(配列番号1の3位のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換)又はAsn3Ser置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 前記変異体がAsn6Asp置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 前記変異体がAsn23Ser置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 前記変異体がAsn3His/Asn23Ser又はAsn3His/Asn23Thrから選択される二重置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 前記変異体が三重置換Asn3His/Asn6Asp/Asn23Serを有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 前記変異体が、Ig結合タンパク質における少なくとも1個のAsn残基がAsp残基に置換されたIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- 前記変異体が配列番号2〜11及び14から選択されることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
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