WO2019093439A1 - 免疫グロブリン結合性タンパク質 - Google Patents

免疫グロブリン結合性タンパク質 Download PDF

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WO2019093439A1
WO2019093439A1 PCT/JP2018/041551 JP2018041551W WO2019093439A1 WO 2019093439 A1 WO2019093439 A1 WO 2019093439A1 JP 2018041551 W JP2018041551 W JP 2018041551W WO 2019093439 A1 WO2019093439 A1 WO 2019093439A1
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amino acid
seq
acid sequence
binding protein
immunoglobulin
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PCT/JP2018/041551
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直紀 山中
侑枝 内田
陽介 寺尾
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東ソー株式会社
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)

Definitions

  • the present invention relates to proteins that specifically bind to immunoglobulins. More particularly, the present invention relates to an immunoglobulin binding protein which is excellent in stability to alkali.
  • Antibody drug is a drug using an antibody (immunoglobulin) which is a molecule responsible for in vivo immune function.
  • Antibody drugs bind with high specificity and affinity to target molecules due to the diversity of variable regions possessed by antibodies. Therefore, antibody drugs have few side effects, and in recent years, the market has been rapidly expanding due to the spread of adaptation diseases.
  • the production of antibody drugs includes a culture step and a purification step.
  • the culture step modification of antibody-producing cells and optimization of culture conditions are attempted in order to improve the productivity.
  • affinity chromatography is adopted as crude purification, and is formulated via subsequent intermediate purification, final purification, and virus removal.
  • an affinity carrier that specifically recognizes an antibody molecule is used, and as a ligand protein used in the carrier, protein A or protein G having a property of binding to an antibody (immunoglobulin) is used.
  • these affinity carriers are used multiple times in order to keep the production cost low, and after use, the step of removing the impurities remaining on the carrier is carried out.
  • the step of removing the impurities usually, in-place washing with sodium hydroxide is performed, and the affinity carrier is regenerated by this step. Therefore, the ligand protein needs to have chemical stability enough to maintain the binding to the antibody even when the above steps are carried out.
  • a ligand protein having chemical stability is an alkaline stable chromatography ligand using an amino acid sequence of domain C of protein A (SpA) derived from a bacterium of the genus Staphylococcus (patent (patented) Reference 1) and an affinity chromatography ligand (patent document 2) comprising an amino acid sequence in which a part of the amino acid sequence of any one of domain B, domain C, and domain Z of protein A is deleted. It can be mentioned.
  • SpA amino acid sequence of domain C of protein A
  • Patent document 2 an affinity chromatography ligand
  • An object of the present invention is to provide an immunoglobulin binding protein with improved stability to alkali.
  • the present inventors have identified amino acid residues involved in the improvement of the stability in domain C of protein A (SpA) derived from Staphylococcus bacteria, and It has been found that substitution with an amino acid residue for another specific amino acid residue has excellent stability to alkali, and the present invention has been accomplished.
  • SpA protein A
  • the present invention includes the following aspects.
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence of the immunoglobulin binding domain of protein A, but having in the amino acid sequence at least one amino acid substitution selected from (1) to (8) below: (1) The amino acid residue corresponding to the second aspartic acid of SEQ ID NO: 1 is substituted with glutamic acid (2) The amino acid residue corresponding to the 49th lysine of SEQ ID NO: 1 is substituted with methionine (3) The amino acid residue corresponding to asparagine at position 21 is substituted with tyrosine (4) The amino acid residue corresponding to lysine at position 58 in SEQ ID NO: 1 is substituted with glutamic acid, valine, glycine or aspartic acid (5) in SEQ ID NO: 1 The amino acid residue corresponding to the third asparagine is substituted with isoleucine or threonine (6) The amino acid residue corresponding to the 11th asparagine in SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine or tyrosine (7) the 15
  • the said immunoglobulin binding protein which is a protein as described in the following (a), (b), (c), or (d): (A) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, provided that said at least one amino acid substitution in said amino acid sequence; (B) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, provided that at least one amino acid substitution is included in the amino acid sequence, and further at one or several positions other than the position of the at least one amino acid substitution Or a protein which comprises substitution, deletion, insertion and / or addition of several amino acid residues and which has immunoglobulin binding activity; (C) an amino acid sequence having 70% or more homology to the entire amino acid sequence having the at least one amino acid substitution in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the at least one amino acid substitution remains A protein comprising a sequence and having an immunoglobulin binding activity; (D) an amino acid sequence of the protein described in (a), (b) or (c), provided that the amino acid sequence further comprises at least
  • the immunoglobulin binding protein which comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, provided that at least the amino acid substitution shown in the following (3-1) and / or (4-1) in the amino acid sequence: (3-1)
  • the 21st asparagine of SEQ ID NO: 1 is substituted with tyrosine (4-1)
  • the 58th lysine of SEQ ID NO: 1 is substituted with glutamic acid.
  • the immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 8, 9, 13, 15, 17, 19, and 21.
  • the immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17, but having at least one amino acid substitution selected from the following (I) to (V) in the amino acid sequence: (I) Substitution of the third asparagine of SEQ ID NO: 17 with isoleucine or threonine (II) Substitution of the 11th asparagine of SEQ ID NO: 17 with lysine or tyrosine (III) Glutamate of position 58 of SEQ ID NO: 17 is valine, glycine, Or substitution with aspartic acid (IV) substitution of glutamic acid at position 15 of SEQ ID NO: 17 with alanine (V) substitution of valine at position 40 of SEQ ID NO: 17 with alanine.
  • the immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 28 to 32, 34, 35, and 37 to 40.
  • the immunoglobulin binding protein which comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, provided that at least the amino acid substitution shown in the following (2-1) in the amino acid sequence: (2-1) The 49th lysine of SEQ ID NO: 1 is substituted with methionine.
  • the immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • An expression vector comprising the polynucleotide.
  • a transformant comprising the polynucleotide or the expression vector.
  • the transformant which is Escherichia coli.
  • a method for producing an immunoglobulin binding protein comprising the steps of: expressing the immunoglobulin binding protein by culturing the transformant; and recovering the expressed protein.
  • An immunoglobulin adsorbent comprising an insoluble carrier and the immunoglobulin-binding protein immobilized on the insoluble carrier.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention is a specific immunoglobulin binding protein.
  • the "immunoglobulin binding protein” means a protein having the binding property to immunoglobulin. That is, the immunoglobulin binding protein of the present invention has binding to immunoglobulins. Specifically, the immunoglobulin binding protein of the present invention may have binding to an Fc region of an immunoglobulin. Binding to an immunoglobulin is also referred to as "immunoglobulin binding activity" or "antibody binding activity”. Immunoglobulin binding activity can be measured, for example, by ELISA. The ELISA method can be performed, for example, under the conditions described in the examples.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention includes the amino acid sequence of the immunoglobulin binding domain of protein A, provided that the protein has an amino acid substitution at a specific position in the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of the immunoglobulin binding domain of protein A which does not have an amino acid substitution at a specific position is also referred to as "non-modified amino acid sequence".
  • the amino acid sequence of the immunoglobulin binding domain of protein A which has an amino acid substitution at a specific position is also referred to as "modified amino acid sequence”. That is, the modified amino acid sequence may be the same amino acid sequence as the non-modified amino acid sequence except having an amino acid substitution at a specific position.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention may be, for example, a protein comprising an amino acid sequence identical to the non-modified amino acid sequence except having an amino acid substitution at a specific position.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention may be, for example, a protein comprising a modified amino acid sequence.
  • the unmodified amino acid sequence may or may not be a naturally occurring amino acid sequence.
  • the non-modified amino acid sequence may, for example, be modified to have the desired properties.
  • An unmodified amino acid sequence may have, for example, an amino acid substitution other than an amino acid substitution at a specific position.
  • protein A examples include protein A (SpA) derived from bacteria of the genus Staphylococcus.
  • Staphylococcus genus bacteria Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) is mentioned.
  • the immunoglobulin binding domain includes domain C, domain E, domain D, domain A and domain B.
  • Immunoglobulin binding domains include, in particular, domain C.
  • domain C of SpA derived from Staphylococcus aureus GenBank No. 1 is used. Amino acid residues from 270 to 327 of AAA26676 can be mentioned.
  • the amino acid sequence of the domain C is shown in SEQ ID NO: 1.
  • domain E of SpA derived from Staphylococcus aureus GenBank No. 1 is used.
  • the amino acid residues 37 to 92 of AAA26676 can be mentioned.
  • domain D of SpA derived from Staphylococcus aureus GenBank No. 1 is used.
  • Amino acid residues 93 to 153 of AAA26676 can be mentioned.
  • domain A of SpA derived from Staphylococcus aureus GenBank No. 1
  • Amino acid residues 154 to 211 of AAA26676 can be mentioned.
  • domain B of SpA derived from Staphylococcus aureus GenBank No. 1 is used.
  • the amino acid residues from 212 to 269 of AAA26676 can be mentioned. That is, as the non-modified amino acid sequence, specifically, the amino acid sequence of the above exemplified immunoglobulin binding domain such as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
  • specific examples of the modified amino acid sequence include an amino acid sequence having an amino acid substitution at a specific position in the amino acid sequence of the above-exemplified immunoglobulin binding domain such as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention specifically includes the amino acid sequence of the above exemplified immunoglobulin binding domain such as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, provided that the amino acid at a specific position in the amino acid sequence Included are proteins with substitutions.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention has, for example, an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the above exemplified immunoglobulin binding domain such as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 except having an amino acid substitution at a specific position.
  • the protein may be
  • That a protein comprises an amino acid sequence is also referred to as "the protein comprises an amino acid residue consisting of an amino acid sequence". That a protein or amino acid sequence has an amino acid substitution is also referred to as “an amino acid substitution occurs in the protein or amino acid sequence”.
  • the amino acids that make up a protein or amino acid sequence are also referred to as "amino acid residues”.
  • the amino acid substitution at the specific position is Asp2Glu (this notation represents that the amino acid residue corresponding to the second aspartic acid of SEQ ID NO: 1 is substituted with glutamic acid, and so forth), Lys49 Met, At least one amino acid substitution selected from Asn21Tyr, Lys58Glu, Lys58Val, Lys58Gly, Lys58Asp, Asn3Ile, Asn3Thr, Asn11Lys, Asn11Tyr, Glu15Ala, and Val40Ala.
  • the amino acid substitution at the specific position is specifically, (1) Asp2Glu, (2) Lys49Met, (3) Asn21Tyr, (4) Lys58Glu, Lys58Val, Lys58Gly, or Lys58Asp (5) Asn3Ile or Asn3Thr, 6) At least one amino acid substitution selected from Asn11 Lys or Asn11 Tyr, (7) Glu15Ala, and (8) Val40Ala.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention has, for example, one, two, three, four, five, six, seven or eight amino acid substitutions selected from these amino acid substitutions. You may The immunoglobulin binding protein of the present invention may have, for example, at least an amino acid substitution of Asp2Glu and / or Lys49Met.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention may have, for example, at least one amino acid substitution selected from at least Asp2Glu, Lys49Met, Asn21Tyr, and Lys58Glu.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention may have at least one amino acid substitution selected from, for example, Atp2Glu, Lys49Met, Asn21Tyr, Lys58Glu, Lys58Val, Asn3Ile, Asn3Tle, Asn11Lys, and Asn11Tyr.
  • Asn21Tyr and Lys58Glu are amino acid substitutions with particularly improved stability to alkalis.
  • an immunoglobulin binding protein having at least Asn21Tyr or Lys58Glu amino acid substitution is a preferred example of the immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • an immunoglobulin binding protein having at least Asn21Tyr and Lys58Glu amino acid substitutions is a particularly preferred example of the immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • An immunoglobulin binding protein having at least an amino acid substitution of Lys49Met is also a preferred example of the immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention may further have at least one other amino acid substitution.
  • Other amino acid substitutions include amino acid substitutions of Gly29Ala (Bjorn Nilsson et al., Protein Engineering, 1 (2), 107-113, 1987) known to increase structural stability.
  • Other amino acid substitutions also include amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn6Asp, Lys42Arg. That is, as a modified amino acid sequence, an amino acid sequence having an amino acid substitution at the specific position and another amino acid substitution such as Gly29Ala in the non-modified amino acid sequence exemplified above (for example, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1) can also be mentioned. .
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention includes the non-modified amino acid sequence exemplified above (for example, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1), provided that the amino acid substitution at the specific position, Gly29Ala etc. Also included are proteins having other amino acid substitutions of In other words, the immunoglobulin-binding protein of the present invention has, for example, the non-modified amino acid sequence exemplified above except having an amino acid substitution at the specific position and other amino acid substitutions such as Gly29Ala (eg, SEQ ID NO: 1)
  • the protein may be an amino acid sequence identical to the amino acid sequence).
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention has two or more amino acid substitutions
  • the combination of those amino acid substitutions is not particularly limited.
  • the immunoglobulin binding proteins of the present invention include the following immunoglobulin binding proteins. These immunoglobulin binding proteins are preferred in that the stability to alkali is improved.
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having an amino acid substitution of Asn21Tyr in the amino acid sequence (immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having an amino acid substitution of Lys58Glu in the amino acid sequence (immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys7Glu, Asn21Tyr and Gly29Ala in said amino acid sequence (immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys7Glu, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence (immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15) .
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence (immunoglobulin binding comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 protein).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn21Tyr, Gly29Ala, Lys49Met and Lys58Glu in the amino acid sequence (an immunoglobulin comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19) Binding protein).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Gly29Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence (immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21) .
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having an amino acid substitution of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence (an immunoglobulin comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28) Binding protein).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having the amino acid substitution of Asn3Thr, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence (an immunoglobulin comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29) Binding protein).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11 Lys, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence (an immunoglobulin comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30) Binding protein).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Tyr, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence (an immunoglobulin comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 31) Binding protein).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Val in the amino acid sequence (immunoglobulin binding comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32) protein).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having an amino acid substitution of Lys49Met in said amino acid sequence (immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11 Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence (including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 Immunoglobulin binding protein).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11 Lys, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Gly in the amino acid sequence (an immunoglobulin comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 35) Binding protein).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11 Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala, Val40Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 37) Immunoglobulin binding proteins).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Asn3Ile, Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11 Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence (amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 38 Immunoglobulin binding proteins).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11 Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Asp in the amino acid sequence (including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 Immunoglobulin binding protein).
  • An immunoglobulin binding protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but having amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11 Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Val in the amino acid sequence (including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 Immunoglobulin binding protein).
  • combinations of amino acid substitutions include, for example, combinations of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Glu with at least one amino acid substitution selected from (I) to (V) below: : (I) Asn3Ile or Asn3Thr (II) Asn11 Lys or Asn11 Tyr (III) Lys58Val, Lys58Gly, or Lys58Asp (IV) Glu15Ala (V) Val40Ala.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention has amino acid substitution of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 17 (the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1
  • proteins having at least one amino acid substitution selected from the above (I) to (V) in the amino acid sequence, except the amino acid sequence include, in particular, immunoglobulin binding proteins comprising an amino acid sequence according to any of SEQ ID NOs: 28 to 32, 34, 35 and 37 to 40 as described above.
  • the immunoglobulin-binding protein of the present invention particularly includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17, provided that at least one amino acid substitution selected from the following (A1) to (A3) in the amino acid sequence Proteins may also be mentioned: (A1) Asn3Ile or Asn3Thr (A2) Asn11 Lys or Asn11 Tyr (A3) Lys58Val.
  • the immunoglobulin-binding protein of the present invention particularly, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 30 (amino acid having amino acid substitution of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 And a protein having the following amino acid substitutions (B1) and / or (B2) in the amino acid sequence: (B1) Glu15Ala (B2) Lys58Gly.
  • immunoglobulin binding protein of the present invention particularly, amino acid substitution of Lys4Arg, Lys7Glu, Asn11Lys, Glu15Ala, Asn21Tyr, Gly29Ala and Lys58Glu in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 34 And a protein having at least one amino acid substitution selected from the following (C1) to (C3) in the amino acid sequence: (C1) Asn3Ile (C2) Lys58Val or Lys58Asp (C3) Val40Ala.
  • the amino acid sequence having the amino acid substitution exemplified above in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is also referred to as "SEQ ID NO: 1 derived substituted amino acid sequence".
  • SEQ ID NO: 1 derived substituted amino acid sequence is, in other words, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which the amino acid substitution exemplified above (ie, the amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitution such as Gly29Ala) has occurred.
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is, in other words, the amino acid described in SEQ ID NO: 1 except that it has the above-exemplified amino acid substitution (ie, amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitution such as Gly29Ala). It is an amino acid sequence identical to the sequence.
  • a variant sequence of the above-exemplified modified amino acid sequence (for example, a substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1) can also be mentioned. That is, as the immunoglobulin binding protein of the present invention, a protein which contains a variant sequence of the above-exemplified modified amino acid sequence (for example, a substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1) and which has immunoglobulin binding activity can also be mentioned.
  • the variant sequence of SEQ ID NO: 1 derived substituted amino acid sequence will be described by way of example, but the description can also be applied to the variant sequence of any modified amino acid sequence.
  • the variant sequence of SEQ ID NO: 1 derived substituted amino acid sequence is set such that the amino acid substitution at the specific position remains (ie, the immunoglobulin binding protein of the present invention has the amino acid substitution at the specific position) I assume. Also, a variant sequence of the SEQ ID NO: 1 derived substituted amino acid sequence is such that other amino acid substitutions such as Gly29Ala remain (ie, the immunoglobulin binding protein of the invention has other amino acid substitutions such as Gly29Ala). It may be set.
  • a variant sequence of SEQ ID NO: 1 derived substitution amino acid sequence is selected from SEQ ID NO: 1 selected from, for example, the amino acid substitution exemplified above (ie, amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitution such as Gly29Ala). It may additionally have one or more amino acid substitutions that the amino acid sequence does not have. For example, when the SEQ ID NO: 1 derived substituted amino acid sequence has no other amino acid substitution such as Gly29Ala, the variant sequence of the SEQ ID NO: 1 derived substituted amino acid sequence may have another amino acid substitution such as Gly29Ala.
  • SEQ ID NO: 1 As a variant sequence of SEQ ID NO: 1 derived substitution amino acid sequence, substitution, deletion, insertion and / or addition of one or several amino acid residues at one or several positions in SEQ ID NO: 1 derived substitution amino acid sequence Amino acid sequences containing That is, as long as the immunoglobulin binding protein of the present invention has immunoglobulin binding activity, in addition to the amino acid substitution exemplified above (ie, the amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitution such as Gly29Ala),
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 may include substitution, deletion, insertion, and / or addition of one or several amino acid residues at one or several positions.
  • the immunoglobulin-binding protein of the present invention comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, provided that the amino acid substitution exemplified above in the amino acid sequence (ie, amino acid substitution at the specific position and optionally Gly29Ala etc.) A protein having an amino acid substitution of 1), and further includes substitution, deletion, insertion, and / or addition of one or several amino acid residues at one or several positions, and a protein having immunoglobulin binding activity It can be mentioned.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention has, for example, the amino acid substitution exemplified above (ie, the amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitution such as Gly29Ala), and further one or several positions.
  • a protein comprising an amino acid sequence identical to that of SEQ ID NO: 1 but containing substitution, deletion, insertion and / or addition of one or several amino acid residues with It is also good.
  • substitution, deletion, insertion, and / or addition of the above-mentioned amino acid residue shall be selected so that the amino acid substitution in the said specific position may remain. That is, the substitution, deletion, insertion, and / or addition of the above amino acid residue may occur, for example, at a position other than the specific position.
  • substitutions, deletions, insertions and / or additions of the above amino acid residues may be selected such that other amino acid substitutions such as Gly29Ala remain.
  • substitutions, deletions, insertions and / or additions of the above amino acid residues may occur at positions other than other amino acid substitutions such as, for example, Gly29Ala.
  • the substitution, deletion, insertion, and / or addition of the above amino acid residue is, for example, one or more amino acid substitutions not selected from the amino acid substitution exemplified above, and not having a substituted amino acid sequence derived from May be included.
  • the “one or several” is different depending on the position of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein and the kind of amino acid residue, but specifically, for example, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, any of 1 means Do.
  • substitution of amino acid residues is conservative substitution in which substitution occurs between amino acids having similar physical and / or chemical properties.
  • conservative substitutions it is generally known in the art that the function of the protein is maintained between those in which the substitution occurs and those in which the substitution does not occur.
  • An example of conservative substitution is substitution between glycine and alanine, serine and proline, or glutamic acid and alanine (protein structure and function, Medical Science International Ltd., 9, 2005).
  • substitution, deletion, insertion, and / or addition of amino acid residues naturally occur, for example, based on individual differences or species differences of a microorganism from which a protein or a gene encoding the same is derived. Also included are those caused by mutations (mutants or variants).
  • an amino acid sequence having high homology to the SEQ ID NO: 1 derived substituted amino acid sequence is also mentioned. That is, as the immunoglobulin binding protein of the present invention, an amino acid sequence having the amino acid substitution exemplified above in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (ie, an amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitution such as Gly29Ala). Also included are proteins having an amino acid sequence having high homology to and having immunoglobulin binding activity. In addition, the change of the amino acid sequence in the above-mentioned range of homology shall be selected so that the amino acid substitution in the said specific position may remain.
  • changes in the amino acid sequence in the range of homology as described above may occur, for example, at a position other than the specific position.
  • changes in the amino acid sequence within the homology range as described above may be selected such that other amino acid substitutions such as Gly29Ala remain. That is, changes in the amino acid sequence within the homology range as described above may occur at positions other than other amino acid substitutions such as, for example, Gly29Ala.
  • changes in the amino acid sequence within the homology range as described above include, for example, one or more amino acid substitutions not selected from the amino acid substitution exemplified above but not having a substituted amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1.
  • “High homology” may mean 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more homology.
  • "Homology” may mean similarity or identity.
  • “Homology” may mean, in particular, identity.
  • Amino acid sequence homology can be determined using an alignment program such as BLAST. For example, identity of amino acid sequences may mean identity between amino acid sequences calculated using blastp, and specifically, identity between amino acid sequences calculated using blastp as a default parameter It may mean sex.
  • modified amino acid sequence one or more selected from the amino acid substitutions exemplified above (ie, an amino acid substitution at the specific position and optionally another amino acid substitution such as Gly29Ala) in the above-exemplified variant sequences
  • amino acid sequences having amino acid substitutions are also included.
  • the modified amino acid sequence may be an amino acid sequence having another amino acid substitution such as Gly29Ala, at least in a variant sequence having an amino acid substitution at the specific position.
  • a variant sequence of the non-modified amino acid sequence (for example, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1) exemplified above is also included. That is, as the modified amino acid sequence, in the variant sequence of the non-modified amino acid sequence exemplified above (for example, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1), the amino acid substitution exemplified above (namely, the amino acid substitution at the specific position and optionally Gly29Ala) And other amino acid substitutions (such as amino acid substitutions).
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention includes a variant sequence of the above-exemplified non-modified amino acid sequence (for example, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1). That is, a protein having an amino acid substitution at the specific position and optionally another amino acid substitution such as Gly29Ala) and having an immunoglobulin binding activity can also be mentioned.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention is identical to, for example, the variant sequence of the non-modified amino acid sequence exemplified above (for example, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1) except having the amino acid substitution exemplified above. It may be a protein containing an amino acid sequence.
  • the variant sequence of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 will be described by way of example, but the description can also be applied to the variant sequence of any non-modified amino acid sequence.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, provided that one or several amino acid residue substitutions or deletions at one or several positions in the amino acid sequence are concerned.
  • a protein comprising an amino acid substitution as described above (ie, an amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitution such as Gly29Ala) including deletion, insertion, and / or addition, and also a protein having immunoglobulin binding activity It can be mentioned.
  • substitution, deletion, insertion and / or addition of the above amino acid residue may occur, for example, at a position other than the specific position. Also, substitutions, deletions, insertions and / or additions of the above amino acid residues may occur at positions other than other amino acid substitutions such as, for example, Gly29Ala.
  • the variant sequence of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 also includes an amino acid sequence having high homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. That is, the immunoglobulin binding protein of the present invention comprises an amino acid sequence having high homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, provided that the amino acid sequence (with respect to the amino acid sequence shown in SEQ In the amino acid sequence having high homology), a protein having the above-exemplified amino acid substitution (ie, an amino acid substitution at the specific position and optionally another amino acid substitution such as Gly29Ala) and having an immunoglobulin binding activity may also be mentioned. . Changes in amino acid residues within the range of homology as described above may occur, for example, at positions other than the specific position. In addition, changes in amino acid residues within the homology range as described above may occur at positions other than other amino acid substitutions such as, for example, Gly29Ala.
  • the “Xth amino acid in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1” means an amino acid present at the position of position X, counting from the N-terminus of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the “amino acid residue corresponding to the Xth amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1” in an amino acid sequence is an amino acid residue in the amino acid sequence, and the amino acid sequence and the SEQ ID NO: It means an amino acid residue arranged at the same position as the Xth amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the alignment with the amino acid sequence of 1.
  • the “amino acid residue corresponding to the second aspartic acid of SEQ ID NO: 1” in an amino acid sequence is an amino acid residue in the amino acid sequence. It means an amino acid residue arranged at the same position as a second aspartic acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the alignment between the amino acid sequence and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the “amino acid residue corresponding to the Xth amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1” in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 means the Xth amino acid itself in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 means.
  • the positions of the amino acid substitutions exemplified above do not necessarily indicate the absolute position in the immunoglobulin binding protein of the present invention
  • the relative position based on the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is shown. That is, for example, when the immunoglobulin binding protein of the present invention comprises an insertion, deletion, or addition of an amino acid residue at the N-terminal side of the position of the amino acid substitution exemplified above, the absolute value of the amino acid substitution accordingly Position can vary.
  • the positions of the above exemplified amino acid substitutions in the immunoglobulin binding protein of the present invention can be identified, for example, by alignment of the amino acid sequence of the immunoglobulin binding protein of the present invention with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Alignment can be performed, for example, using an alignment program such as BLAST. The same applies to the positions of the above exemplified amino acid substitutions in any amino acid sequence such as a variant sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid residue before substitution of the amino acid substitution exemplified above is the amino acid residue before substitution in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 In the non-modified amino acid sequence other than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, it may or may not be conserved.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention may contain only one modified amino acid sequence, and may contain a plurality of modified amino acid sequences.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention may contain, for example, 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more of modified amino acid sequences, and 10 or less, 7 or less, 5 or less Or less, 3 or less, or 2 or less, and may include the number of consistent combinations thereof.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention comprises a plurality of modified amino acid sequences
  • the amino acid sequences of the plurality of modified amino acid sequences may or may not be identical.
  • the plurality of modified amino acid sequences may be linked to each other, for example, via a suitable linker.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention may consist of a modified amino acid sequence, and may further contain other amino acid sequences (eg, oligopeptides). That is, the immunoglobulin binding protein of the present invention may further contain, for example, another amino acid sequence at the N-terminal side or C-terminal side. In other words, in the immunoglobulin binding protein of the present invention, for example, another amino acid sequence may be added to the N-terminal side or C-terminal side of the modified amino acid sequence.
  • Other amino acid sequences are not particularly limited as long as they do not impair the immunoglobulin binding property and stability of the immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • the type and length of other amino acid sequences are not particularly limited as long as the immunoglobulin binding properties and stability of the immunoglobulin binding protein of the present invention are not impaired.
  • the immunoglobulin binding proteins of the invention may, for example, comprise portions of other immunoglobulin binding domains in addition to the selected immunoglobulin binding domain.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention comprises the modified amino acid sequence of domain C
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention further comprises an N-terminal region of domain C of protein A (domain E, domain D , Domain A, domain B / Z), or part of the C-terminal region of domain C of protein A.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention may contain, for example, an N-terminal side or a C-terminal side, an oligopeptide useful for the purpose of specifically detecting or separating an object.
  • oligopeptides include polyhistidine and polyarginine.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention is useful, for example, in immobilizing the immunoglobulin binding protein of the present invention on a solid phase such as a support for chromatography at the N-terminal side or C-terminal side thereof.
  • Oligopeptides may be included. Such oligopeptides include oligopeptides comprising lysine and cysteine.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention may be produced, for example, in a form containing other amino acid sequences beforehand, or separately Other amino acid sequences as described above produced may be added.
  • the immunoglobulin binding protein of the invention comprises other amino acid sequences as described above
  • the immunoglobulin binding protein of the invention comprises immunity of the invention comprising other amino acid sequences as described above. It can be produced by expression from a polynucleotide encoding a full-length amino acid sequence of a globulin binding protein.
  • a polynucleotide encoding another amino acid sequence and a polynucleotide encoding an immunoglobulin binding protein of the present invention (for example, one not containing another amino acid sequence), and another amino acid sequence
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention may be expressed by adding it to the N-terminal side or C-terminal side of the globulin binding protein.
  • another chemically synthesized amino acid sequence may be chemically linked to the N-terminal side or C-terminal side of the immunoglobulin binding protein of the present invention (for example, one not containing other amino acid sequences) .
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention can be produced, for example, by expression from a polynucleotide encoding the immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • the polynucleotide encoding the immunoglobulin binding protein of the present invention is also referred to as "the polynucleotide of the present invention".
  • the polynucleotide of the present invention may specifically be a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention can be obtained, for example, by a chemical synthesis method or a DNA amplification method such as a PCR method.
  • the DNA amplification method can be performed, for example, using a polynucleotide containing a nucleotide sequence to be amplified, such as a nucleotide sequence encoding the immunoglobulin binding protein of the present invention, as a template.
  • the polynucleotide used as a template includes genomic DNA of an organism that expresses the immunoglobulin-binding protein of the present invention, cDNA of the immunoglobulin-binding protein of the present invention, and a vector containing the polynucleotide of the present invention.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention can be designed, for example, by conversion from the amino acid sequence of the immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • a standard codon table can be used, but conversion is preferably performed in consideration of the usage frequency of codons in a host transformed with a polynucleotide of the present invention.
  • AGA / AGG / CGG / CGA for arginine (Arg), ATA for isoleucine (Ile), CTA for leucine (Leu), glycine (Gly) Since GGA and CCC in Proline (Pro) are less frequently used (so-called rare codons), they may be converted to avoid their codons. Analysis of codon usage can also be performed by using a public database (eg, Codon Usage Database on the website of Kazusa DNA Research Institute).
  • the polynucleotide of the present invention may be, for example, a polynucleotide encoding an immunoglobulin binding protein which does not have the amino acid substitution exemplified above (ie, the amino acid substitution at the specific position and optionally other amino acid substitution such as Gly29Ala). Alternatively, they can also be obtained by introducing a mutation such that the encoded protein has the amino acid substitution exemplified above.
  • the immunoglobulin-binding protein having no amino acid substitution exemplified above includes a protein containing the non-modified amino acid sequence exemplified above (for example, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or a variant sequence thereof).
  • a polynucleotide encoding an immunoglobulin binding protein having no amino acid substitution exemplified above can be obtained, for example, by a chemical synthesis method or a DNA amplification method such as a PCR method.
  • those amino acid substitutions may be introduced, for example, simultaneously or sequentially.
  • a polynucleotide encoding an immunoglobulin binding protein having at least one amino acid substitution selected from the amino acid substitutions exemplified above another encoded at least one amino acid selected from the amino acid substitutions exemplified above Mutations may be introduced to have a substitution.
  • the amino acid residue at a certain position may be altered two or more times.
  • an amino acid substitution of Lys58Val may be further introduced into an immunoglobulin binding protein which already has an amino acid substitution of Lys58Glu.
  • the polynucleotide is not limited to the mutation that causes the amino acid substitution exemplified above, and any mutation such as a mutation for construction of a variant sequence is introduced to obtain the polynucleotide of the present invention or a material for obtaining the same. You may use it.
  • Examples of methods for introducing mutations into polynucleotides include error-prone PCR.
  • the reaction conditions in the error-prone PCR method are not particularly limited as long as they can introduce a desired mutation into a polynucleotide.
  • concentration of four kinds of deoxynucleotides (dATP / dTTP / dCTP / dGTP) which are substrates is made nonuniform, and the concentration of 0.01 to 10 mM (preferably 0.1 to 1 mM) of MnCl 2 is added to the PCR reaction solution Mutation can be introduced into the polynucleotide by PCR after addition.
  • a mutation is caused to a polynucleotide by causing an agent acting as a mutagen to act on the polynucleotide or irradiating the polynucleotide with ultraviolet light.
  • the mutagenic agents include mutagenic agents commonly used by those skilled in the art such as hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfurous acid, hydrazine and the like.
  • the method of introducing a mutation into such a polynucleotide is not limited to the introduction of the amino acid substitution exemplified above, but construction of a variant sequence (eg, introduction of substitution, deletion, insertion, and / or addition of amino acid residue,
  • the present invention is also applicable to changes in amino acid sequence within the above-mentioned range of homology.
  • the polynucleotide of the present invention may be obtained, for example, by collectively obtaining its full-length sequence, or by obtaining and linking partial sequences of each.
  • the description of the method for obtaining the polynucleotide of the present invention as described above is not limited to the case of obtaining the full-length sequence at one time, but can also be applied to the case of obtaining the partial sequence.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention can be specifically produced, for example, by expressing the immunoglobulin binding protein of the present invention in a transformant having the polynucleotide of the present invention.
  • the transformant having the polynucleotide of the present invention is also referred to as "the transformant of the present invention".
  • the transformant of the present invention can rely on having the polynucleotide of the present invention to express the immunoglobulin binding protein of the present invention. That is, the transformant of the present invention is, in other words, a transformant capable of expressing the immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • the transformant of the present invention can be obtained, for example, by transforming a host with the polynucleotide of the present invention. That is, the transformant of the present invention may be, for example, a host transformed with the polynucleotide of the present invention, a host having the polynucleotide of the present invention, and the immunoglobulin-binding property of the present invention. It may be a host capable of expressing the protein. The host is not particularly limited as long as it can express the immunoglobulin binding protein of the present invention by being transformed with the polynucleotide of the present invention. Hosts include animal cells, insect cells, and microorganisms.
  • Animal cells include COS cells, CHO cells, Hela cells, NIH3T3 cells, and HEK293 cells.
  • the insect cells include Sf9 and BTI-TN-5B1-4.
  • the microorganisms include yeast and bacteria. Examples of yeast include Saccharomyces yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Pichia yeasts such as Pichia Pastoris, and Schizosaccharomyces yeasts such as Schizosaccharomyces pombe. Examples of bacteria include bacteria belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli. E. coli include JM109 strain and BL21 (DE3) strain. The use of yeast or Escherichia coli as a host is preferable in terms of productivity, and the use of Escherichia coli as a host is more preferable.
  • the polynucleotide of the present invention may be expressible and held in the transformant of the present invention. Specifically, the polynucleotide of the present invention may be maintained so as to be expressed under the control of a promoter that functions in a host.
  • a promoter that functions in a host include trp promoter, tac promoter, trc promoter, lac promoter, T7 promoter, recA promoter, and lpp promoter when using Escherichia coli as a host.
  • the polynucleotide of the present invention may be present, for example, on a vector that replicates autonomously outside genomic DNA. That is, the polynucleotide of the present invention can be introduced into a host, for example, as an expression vector containing the polynucleotide of the present invention. That is, the transformant of the present invention may, in one aspect, be a transformant carrying an expression vector containing the polynucleotide of the present invention.
  • An expression vector containing the polynucleotide of the present invention is also referred to as "the expression vector of the present invention".
  • the expression vector of the present invention can be obtained, for example, by inserting the polynucleotide of the present invention at an appropriate position of the expression vector.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it stably exists in the host to be transformed and can be replicated.
  • As an expression vector for example, when using Escherichia coli as a host, pET plasmid vector, pUC plasmid vector, pTrc plasmid vector can be exemplified.
  • the expression vector may be provided with a selectable marker such as an antibiotic resistance gene.
  • the appropriate position means a position that does not destroy the replication function of the expression vector, the selective marker, and the region involved in transferability.
  • the polynucleotide of the present invention may be introduced, for example, on genomic DNA.
  • Introduction of the polynucleotide of the present invention into genomic DNA can be carried out, for example, using gene transfer by homologous recombination.
  • a gene transfer method by homologous recombination a Red-driven integration method (Datsenko, KA, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 6640-6645 (2000)), etc.
  • the method of using linear DNA, the method of using a vector containing a temperature sensitive replication origin, the method of using a vector having no replication origin that functions in a host, and the transduction method using a phage can be mentioned.
  • Transformation of a host using a polynucleotide such as the expression vector of the present invention can be performed, for example, by methods commonly used by those skilled in the art.
  • transformation can be performed by the competent cell method, heat shock method, electroporation method or the like.
  • the transformant of the present invention can be obtained by screening after transformation by an appropriate method.
  • the expression vector of the present invention can be prepared from the transformant of the present invention.
  • the expression vector of the present invention can be prepared from a culture obtained by culturing the transformant of the present invention using a commercially available extraction kit such as alkaline extraction method or QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by QIAGEN). .
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention can be expressed. Furthermore, the immunoglobulin binding protein of the present invention can be produced by culturing the transformant of the present invention to express the immunoglobulin binding protein of the present invention and recovering the expressed protein. That is, the present invention includes, for example, the step of expressing the immunoglobulin-binding protein of the present invention by culturing the transformant of the present invention, and the step of recovering the expressed protein. Provided is a method of producing a globulin binding protein. The medium composition and culture conditions can be appropriately set according to various conditions such as the type of host and the characteristics of the immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • Media composition and culture conditions can be set, for example, such that the host can grow and express the immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • the culture medium for example, a culture medium that appropriately contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, other various organic components and inorganic components can be used.
  • LB Lia-Bertani
  • W / v nutrient sources
  • a transformant corresponding to the antibiotic resistance gene contained in the expression vector is added to the culture medium and cultured, in order to selectively grow the transformant of the present invention depending on the presence or absence of the introduction of the expression vector of the present invention.
  • the expression vector contains a kanamycin resistance gene
  • kanamycin may be added to the medium.
  • the medium may also contain one or more reducing agents selected from the group consisting of glutathione, cysteine, cystatin, thioglycollate and dithiothreitol.
  • the culture medium may contain a reagent such as glycine which promotes protein secretion from the transformant into the culture solution.
  • a reagent such as glycine which promotes protein secretion from the transformant into the culture solution.
  • the culture temperature may be, for example, generally 10 ° C. to 40 ° C., preferably 20 ° C. to 37 ° C., more preferably about 25 ° C., when the host is Escherichia coli.
  • the pH of the culture medium may be, for example, pH 6.8 to pH 7.4, preferably about pH 7.0, when the host is Escherichia coli.
  • an inducer according to the type of promoter can be used.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • an appropriate amount of IPTG is added when the turbidity of the culture solution (absorbance at 600 nm) becomes about 0.5 to 1.0, and the culture is continued by the present invention.
  • the expression of the immunoglobulin binding protein can be induced.
  • the addition concentration of IPTG may be, for example, 0.005 to 1.0 mM, preferably 0.01 to 0.5 mM.
  • Expression induction such as IPTG induction can be performed, for example, under conditions well known in the art.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention can be separated and recovered from the culture in a manner suitable for its expression form.
  • culture means the whole or a part of a culture solution obtained by culture.
  • the said part will not be restrict
  • cultivated culture medium (namely, culture supernatant) of the transformant of this invention currently cultured can be mentioned.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention accumulates in the culture supernatant, cells can be separated by centrifugation and the immunoglobulin binding protein of the present invention can be recovered from the obtained culture supernatant.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention when the immunoglobulin binding protein of the present invention accumulates in cells (including periplasm), the cells are recovered by centrifugation and then disrupted by adding an enzyme treatment agent, surfactant or the like. Thus, the immunoglobulin binding protein of the present invention can be recovered from the disrupted product.
  • Recovery of the immunoglobulin-binding protein of the present invention from the culture supernatant or cell debris can be performed, for example, by a known method used for protein separation and purification. Such methods include ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, isoelectric point precipitation.
  • the immunoglobulin binding proteins of the present invention can be used, for example, for separation or analysis of immunoglobulins (antibodies).
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention can be used, for example, immobilized on an insoluble carrier.
  • separation or analysis of an immunoglobulin (antibody) specifically uses, for example, an immunoglobulin adsorbent comprising an insoluble carrier and the immunoglobulin-binding protein of the present invention immobilized on the insoluble carrier.
  • An immunoglobulin adsorbent comprising an insoluble carrier and the immunoglobulin-binding protein of the present invention immobilized on the insoluble carrier is also referred to as "the immunoglobulin adsorbent of the present invention".
  • the "separation of immunoglobulins” is not limited to the separation of immunoglobulins from the solution in the presence of contaminants, but also includes the separation of immunoglobulins based on their structure, properties, activity or the like.
  • the insoluble carrier is not particularly limited. Examples of insoluble carriers include carriers derived from polysaccharides such as agarose, alginate (alginate), carrageenan, chitin, cellulose, dextrin, dextran, starch, etc., polyvinyl alcohol, polymethacrylate, poly (2-hydroxyethyl methacrylate) Examples of such carriers include carriers made of synthetic polymers such as polyurethane, and carriers made of ceramics such as silica.
  • carriers derived from polysaccharides and carriers derived from synthetic polymers are preferred as insoluble carriers.
  • the preferable carrier include polymethacrylate gel into which a hydroxyl group is introduced such as Toyopearl (manufactured by Tosoh Corp.), agarose gel such as Sepharose (manufactured by GE Healthcare), and cellulose gel such as Celfine (manufactured by JNC).
  • the form of the insoluble carrier is not particularly limited.
  • the insoluble carrier may, for example, be in a form that can be packed into a column.
  • the insoluble carrier may, for example, be particulate or non-particulate.
  • the insoluble carrier may, for example, be porous or non-porous.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention can be immobilized on an insoluble carrier, for example, by covalent bonding.
  • the immunoglobulin-binding protein of the present invention is specifically immobilized on an insoluble carrier, for example, by covalently linking the immunoglobulin-binding protein of the present invention and the insoluble carrier via an active group possessed by the insoluble carrier. can do. That is, the insoluble carrier may have an active group.
  • the insoluble carrier may, for example, have an active group on its surface.
  • the active group examples include N-hydroxysuccinimide (NHS) activated ester group, epoxy group, carboxyl group, maleimide group, haloacetyl group, tresyl group, formyl group and haloacetamide.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the insoluble carrier having an active group for example, a commercially available insoluble carrier having an active group may be used as it is, or an active group may be introduced to the insoluble carrier and used.
  • TOYOPEARL AF-Epoxy-650M TOYOPEARL AF-Tresyl-650M (all manufactured by Tosoh Corporation), HiTrap NHS-activated HP Columns, NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow, Epoxy-activated Sepharose 6B (all are manufactured by GE Healthcare) and SulfoLink Coupling Resin (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • a method of introducing an active group on the surface of a carrier a method of reacting one of a compound having two or more active sites with a hydroxyl group, an epoxy group, a carboxyl group, an amino group or the like present on the carrier surface can be exemplified.
  • epichlorohydrin, ethanediol diglycidyl ether, butanediol diglycidyl ether, hexanediol diglycidyl ether can be illustrated as a compound which introduce
  • a compound for introducing a carboxyl group into an epoxy group present on the surface of a carrier 2-mercaptoacetic acid, 3-mercaptopropionic acid, 4-mercaptobutyric acid, 6-mercaptobutyric acid, glycine, 3-aminopropionic acid
  • Examples include 4-aminobutyric acid and 6-aminohexanoic acid.
  • N- ( ⁇ -maleimidocaproic acid) hydrazide N- ( ⁇ -maleimidopropionic acid) hydrazide 4- (4-N-maleimidophenyl) acetic acid hydrazide, 2-amino maleimide, 3-amino maleimide, 4-amino maleimide, 6-amino maleimide, 1- (4-aminophenyl) maleimide, 1- (3-amino Phenyl) maleimide, 4- (maleimide) phenyl isocyanate, 2-maleimidoacetic acid, 3-maleimidopropionic acid, 4-maleimidobutyric acid, 6-maleimidohexanoic acid, N- ( ⁇ -maleimidoacetoxy) succinimide ester, (m-maleimido Benzo
  • chloroacetic acid bromoacetic acid, iodoacetic acid, chloroacetic acid chloride, bromoacetic acid chloride, bromoacetic acid chloride, bromoacetic acid bromide, chloroacetic acid anhydride, bromo Acetic anhydride, iodoacetic anhydride, 2- (iodoacetamido) acetic acid-N-hydroxysuccinimide ester, 3- (bromoacetamido) propionic acid-N-hydroxysuccinimide ester, 4- (iodoacetyl) aminobenzoic acid-N- Hydroxysuccinimide ester can be illustrated.
  • the ⁇ -alkenyl moiety is halogenated with a halogenating agent.
  • a method of activation can also be exemplified.
  • the ⁇ -alkenyl alkane glycidyl ether include allyl glycidyl ether, 3-butenyl glycidyl ether and 4-pentenyl glycidyl ether.
  • the halogenating agent include N-chlorosuccinimide, N-bromosuccinimide and N-iodosuccinimide.
  • a method for introducing an active group on the surface of a carrier a method for introducing an active group to a carboxyl group present on the surface of a carrier using a condensing agent and an additive can also be exemplified.
  • the condensing agent include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), dicyclohexyl carbodiimide, and carbonyl diimidazole.
  • the additive include N-hydroxysuccinimide (NHS), 4-nitrophenol, and 1-hydroxybenztriazole.
  • Immobilization of the immunoglobulin binding protein of the present invention to an insoluble carrier can be carried out, for example, in a buffer.
  • a buffer solution acetate buffer solution, phosphate buffer solution, MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid) buffer solution, HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) buffer solution, tris buffer solution, borate buffer solution can be illustrated.
  • the reaction temperature for immobilization can be appropriately set according to various conditions such as the reactivity of the active group and the stability of the immunoglobulin binding protein, for example.
  • the reaction temperature for immobilization may be, for example, 5 ° C. to 50 ° C., preferably 10 ° C. to 35 ° C.
  • the immunoglobulin adsorbent of the present invention can be, for example, packed in a column and used for separation of immunoglobulin (antibody). Specifically, for example, a solution containing an immunoglobulin is added to a column packed with the immunoglobulin adsorbent of the present invention, the immunoglobulin is adsorbed to the adsorbent, and the immunoglobulin adsorbed to the adsorbent is eluted. Thus, immunoglobulins can be separated.
  • a solution containing an immunoglobulin is added to a column packed with the immunoglobulin adsorbent of the present invention to adsorb the immunoglobulin to the adsorbent, and the immunoglobulin adsorbed to the adsorbent And eluting the immunoglobulins.
  • the solution containing immunoglobulin can be added to the column, for example, using a liquid delivery means such as a pump. Adding a liquid to a column is also referred to as “sending a liquid to the column”.
  • the solution containing the immunoglobulin may be solvent-replaced beforehand using an appropriate buffer before being added to the column.
  • the column may be equilibrated with an appropriate buffer prior to adding the immunoglobulin containing solution to the column.
  • Column equilibration is expected to allow, for example, higher purity separation of immunoglobulins.
  • buffers used for solvent replacement and equilibration include phosphate buffer, acetate buffer, and MES buffer.
  • inorganic salts such as 10 mM to 100 mM sodium chloride may be added.
  • the buffer used for solvent replacement and the buffer used for equilibration may or may not be identical.
  • components other than immunoglobulin such as contaminants remain in the column after passing the solution containing the immunoglobulin into the column, such components should be removed before eluting the immunoglobulin adsorbed to the immunoglobulin adsorbent.
  • the components may be removed from the column.
  • Components other than immunoglobulin can be removed from the column using, for example, an appropriate buffer.
  • the buffer used for removing components other than immunoglobulin for example, the description of the buffer used for solvent replacement and equilibration can be applied correspondingly.
  • the immunoglobulin adsorbed to the immunoglobulin adsorbent can be eluted, for example, by weakening the interaction between the immunoglobulin and the ligand (the immunoglobulin binding protein of the present invention).
  • pH reduction with buffer, addition of counter peptide, temperature rise, and change in salt concentration can be exemplified.
  • the immunoglobulin adsorbed to the immunoglobulin adsorbent can be eluted using, for example, a suitable elution solution.
  • the eluate may be a buffer which is more acidic than the buffer used for solvent replacement and equilibration.
  • buffer examples include citrate buffer, glycine hydrochloride buffer, and acetate buffer.
  • the pH of the eluate can be set, for example, within the range that does not impair the function of immunoglobulin (such as the ability to bind to an antigen).
  • the method of separating immunoglobulins may be a method of manufacturing immunoglobulins, specifically, a method of manufacturing separated immunoglobulins.
  • the immunoglobulin is obtained, for example, as an eluted fraction containing immunoglobulin. That is, a fraction containing eluted immunoglobulin can be fractionated. Fractionation of fractions can be performed, for example, by a conventional method.
  • immunoglobulin can also be recovered from a fraction containing immunoglobulin. Recovery of immunoglobulin from the immunoglobulin-containing fraction can be performed, for example, by a known method used for protein separation and purification.
  • Example 1 Preparation of Immunoglobulin Binding Protein Expression Vector (1)
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 was designed by converting the amino acid sequence of the immunoglobulin binding protein set forth in SEQ ID NO: 1 using an E. coli type codon.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 was produced using PCR.
  • the PCR is carried out by using an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 4 (5′-TAGCCATGGGCGCGGATAACAAGTTC-3 ′) and SEQ ID NO: 5 (5′-CTACTCGAGTTTCGGAGCTTGCGCATC-3 ′) using the synthesized polynucleotide as a template DNA
  • the reaction liquid is subjected to a first step of 10 seconds at 98 ° C., a second step of 5 seconds at 55 ° C., and a third step of 60 seconds at 72 ° C.
  • the cycled reaction was carried out by repeating 30 cycles.
  • the obtained polynucleotide is purified, digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, ligated in expression vector pET-28a previously digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, and Escherichia coli BL21 (DE3) strain using the ligation product was transformed.
  • the resulting transformant was cultured in LB medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, and then the expression vector pET-SpA was extracted using QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by QIAGEN).
  • a polynucleotide encoding an immunoglobulin binding protein and its surrounding region were subjected to a cycle sequencing reaction using Big Dye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction kit (manufactured by Life Science) based on the chain terminator method.
  • the nucleotide sequence was analyzed using a fully automatic DNA sequencer ABI Prism 3700 DNA analyzer (manufactured by Life Science).
  • an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 (5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ′) or SEQ ID NO: 7 (5′-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3 ′) was used as a primer for sequencing.
  • Example 2 Mutation Introduction to Immunoglobulin Binding Protein and Preparation of Library
  • the error prone PCR was performed using pET-SpA prepared in Example 1 as a template DNA. After preparing a reaction solution having the composition shown in Table 2, the error-prone PCR heat-processes the reaction solution at 95 ° C. for 2 minutes, and the first step for 30 seconds at 95 ° C., the second step for 30 seconds at 50 ° C. 72 The reaction was carried out for 30 cycles with one cycle of the third step of 90 ° C. for 30 seconds, and finally heat treatment was carried out at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the error-prone PCR successfully introduced a mutation into the polynucleotide (SEQ ID NO: 3) encoding the immunoglobulin binding protein, and the average mutation introduction rate was 1.15% to 1.26%.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed with the reaction solution, cultured on LB plate medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin (37 ° C., 16 hours), and then formed on the plate The colonies were used as a random mutant library.
  • Example 3 Screening of Alkali Stabilized Immunoglobulin Binding Protein (Part 1) (1) 2 ⁇ YT liquid medium (tryptone 1.6% (w / v) containing 50 ⁇ g / mL kanamycin) of a random mutant library (transformant) of about 1900 prepared in Example 2; yeast extract 1% (w) (V) 250 ⁇ l of sodium chloride 0.5% (w / v) was inoculated and cultured with shaking overnight at 37 ° C. using a 96-well deep well plate.
  • YT liquid medium tryptone 1.6% (w / v) containing 50 ⁇ g / mL kanamycin
  • transformant of about 1900 prepared in Example 2
  • yeast extract 1% (w) (V) 250 ⁇ l of sodium chloride 0.5% (w / v) was inoculated and cultured with shaking overnight at 37 ° C. using a 96-well deep well plate.
  • the antibody binding activity of the immunoglobulin binding protein upon alkali treatment is measured by the ELISA method shown below, and the antibody binding activity of the immunoglobulin binding protein upon alkali treatment is not subjected to alkali treatment The residual activity was calculated by dividing by the antibody binding activity of the immunoglobulin binding protein.
  • the human antibody gamma globulin preparation (made by Chemical and Serum Therapy Research Institute), prepared at 10 ⁇ g / mL using Tris-Buffered Saline (TBS), is dispensed into the wells of a 96-well microplate and immobilized (4.degree. C., 16 hours).
  • Immunoglobulin binding protein (already having improved residual activity) having improved alkaline stability compared to the natural type (without amino acid substitution) immunoglobulin binding protein (SEQ ID NO: 1) from the residual activity calculated in (4) Transformants expressing E. coli were selected.
  • the immunoglobulin binding protein in which the amino acid substitution of Asn21Tyr is the highest with remaining activity is designated as SpA1
  • the polynucleotide encoding SpA1 is The expression vector contained was named pET-SpA1.
  • the amino acid sequence of SpA1 is shown in SEQ ID NO: 8
  • the nucleotide sequence encoding SpA1 is shown in SEQ ID NO: 10.
  • Example 4 Preparation of Amino Acid-Substituted Immunoglobulin Binding Protein (1)
  • a protein designated SpA '
  • an amino acid substitution of Gly29Ala Protein Engineering, 1, 107-113; Non-patent document 1
  • SEQ ID NO: 1 An expression vector (designated as pET-SpA ') containing a polynucleotide coding for The amino acid sequence of SpA 'is shown in SEQ ID NO: 11, and the nucleotide sequence encoding SpA' is shown in SEQ ID NO: 12.
  • A A protein in which an amino acid substitution of Lys7Glu and Asn21Tyr is further introduced to SpA '(designated as SpA2)
  • B A protein in which an amino acid substitution of Lys58Glu has been introduced into SpA2 (designated as SpA3a)
  • C A protein in which an amino acid substitution of Lys4Arg is further introduced to SpA3a (designated as SpA4a)
  • D A protein in which an amino acid substitution of Lys49Met is further introduced to SpA4a (designated as SpA5a)
  • E A protein in which amino acid substitutions of Lys4Arg, Lys7Glu and Lys58Glu have been introduced into SpA '(designated as SpA3b)
  • A SpA2 (A-1) Among the amino acid substitutions involved in alkaline stability improvement, which were revealed in Example 3, Lys7Glu and Asn21Tyr were selected, and a protein SpA2 was designed in which those amino acid substitutions were accumulated against SpA ′ (SEQ ID NO: 11). .
  • PCR was used to produce a polynucleotide comprising the nucleotide sequence.
  • the PCR is carried out by using an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 23 (5′-TAGCCATGGGCGCGGACAACAAA-3 ′) and SEQ ID NO: 26 (5′-CTACTCGAGTTTTGGCGCTTGTGCATC-3 ′) with the synthesized polynucleotide as a template DNA Then, after preparing a reaction liquid having the composition shown in Table 1, the reaction liquid is heat treated at 98 ° C.
  • the obtained polynucleotide is purified, digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, ligated to expression vector pET-28a previously digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, and Escherichia coli BL21 (DE3) using the ligation product.
  • the strain was transformed.
  • A-4 The resulting transformant was cultured in LB medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, and then an expression vector (designated as pET-SpA2) was extracted using QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by QIAGEN).
  • PCR was used to prepare a polynucleotide containing the nucleotide sequence.
  • the PCR is carried out in the same manner as (a-2) using an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 27 (5′-CTACTCGAGTTCTGGCGCTTGTGCATCGTTCAG-3 ′) with the synthesized polynucleotide as a template DNA.
  • PCR was performed according to
  • PCR was used to prepare a polynucleotide containing the nucleotide sequence.
  • the PCR is carried out similarly to (a-2), using as a PCR primer an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 24 (5′-TAGCCATGGGCGCGGACAATCGATTC-3 ′) with the synthesized polynucleotide as a template DNA.
  • PCR was performed according to
  • C-3 The obtained polynucleotide is purified, digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, ligated to expression vector pET-28a previously digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, and Escherichia coli BL21 (DE3) using the ligation product. The strain was transformed.
  • PCR was used to prepare a polynucleotide containing the nucleotide sequence.
  • the PCR is carried out in the same manner as (a-2) using as a PCR primer an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 25 (5′-TAGCCATGGGCGCGGACAACGCGTCTCACAAGAA ′ ′) with the synthesized polynucleotide as a template DNA.
  • PCR was performed according to
  • the obtained polynucleotide is purified, digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, ligated to expression vector pET-28a previously digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, and Escherichia coli BL21 (DE3) using the ligation product.
  • the strain was transformed.
  • PCR was used to prepare a polynucleotide containing the nucleotide sequence.
  • PCR was performed in the same manner as (a-2), using the synthesized polynucleotide as a template DNA and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27 as PCR primers.
  • E-3 The obtained polynucleotide is purified, digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, ligated to expression vector pET-28a previously digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, and Escherichia coli BL21 (DE3) using the ligation product. The strain was transformed.
  • TBS Tris-Buffered Saline
  • Example 3 The antibody binding activity of the protein solution of alkali treatment (mixing 1 M NaOH) and alkali non-treatment (mixing TBS) after adding 4 volumes of 1 M Tris buffer (pH 7.0) is described in Example 3 (4).
  • the remaining activity is calculated by dividing the antibody binding activity of the immunoglobulin binding protein when alkaline treatment is performed by the antibody binding activity of the immunoglobulin binding protein when alkaline treatment is not performed, and the alkaline stability is calculated. evaluated.
  • Example 6 Mutagenesis of Alkaline Stability-Enhancing Immunoglobulin Binding Protein and Preparation of Library Among the mutant immunoglobulin binding proteins evaluated in Example 5, SpA4a (Example 4 (c)) was selected, Mutations were randomly introduced into the polynucleotide part (SEQ ID NO: 18) encoding SpA4a by error prone PCR.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed with the reaction solution, cultured on LB plate medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin (37 ° C., 16 hours), and then formed on the plate The colonies were used as a random mutant library.
  • Example 7 Screening of Alkali Stabilized Immunoglobulin Binding Protein (Part 2) (1) The immunoglobulin-binding protein was expressed by culturing the random mutant library (transformant) of about 1000 strains prepared in Example 6 by the method described in Example 3 (1) to (2).
  • the culture supernatant containing the immunoglobulin-binding protein obtained by centrifugation was diluted 40-fold with pure water.
  • the diluted solution was mixed equally with 2M NaOH and alkali treated at 60 ° C. for 30 minutes. After alkali treatment, it was neutralized with 4 volumes of 1 M Tris buffer (pH 7.0).
  • the residual activity is calculated by dividing the antibody binding activity of the immunoglobulin binding protein when alkaline treatment is performed by the antibody binding activity of the immunoglobulin binding protein when alkaline treatment is not performed, and compared with SpA4a.
  • a transformant expressing an immunoglobulin binding protein with improved alkaline stability (improved residual activity) was selected.
  • the selected transformant was cultured, and an expression vector was prepared using QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by QIAGEN).
  • amino acid sequence of the protein in which the amino acid substitution of Asn3 17 Thr has occurred (designated as SpA5c)
  • SEQ ID NO: 29 the protein of the amino acid substitution Asn 11 17 Lys
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 and the amino acid sequence of the amino acid substitution of Asn11 17 Tyr (designated as SpA5e) are SEQ ID NO: 31 and the protein of the amino acid substitution of Lys (Glu) 58 17 Val (SpA4 b and No.) amino acid sequence of SEQ ID NO: Each is shown in 32.
  • Example 8 Mutation of Alkaline Stability-Enhancing Immunoglobulin Binding Protein and Preparation of Library Among the mutant immunoglobulin binding proteins evaluated in Example 7, SpA5d (Example 6) was selected, and SpA5d was encoded. Mutations were randomly introduced into the polynucleotide portion (SEQ ID NO: 33) by error prone PCR.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed with the reaction solution, cultured on LB plate medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin (37 ° C., 16 hours), and then formed on the plate The colonies were used as a random mutant library.
  • Example 9 Screening of Alkali Stabilized Immunoglobulin Binding Protein (Part 3) (1)
  • the immunoglobulin-binding protein was expressed by culturing the random mutant library (transformant) of about 1000 strains prepared in Example 8 according to the method described in Example 3 (1) to (2).
  • the culture supernatant containing the immunoglobulin-binding protein obtained by centrifugation was diluted 40-fold with pure water.
  • the diluted solution was mixed equally with 2 M NaOH and alkali treated at 62 ° C. for 30 minutes. After alkali treatment, it was neutralized with 4 volumes of 1 M Tris buffer (pH 7.0).
  • the residual activity was calculated by dividing the antibody binding activity of the immunoglobulin binding protein when alkaline treatment was performed by the antibody binding activity of the immunoglobulin binding protein when alkaline treatment was not performed, and compared with SpA5d. A transformant expressing an immunoglobulin binding protein with improved alkaline stability (improved residual activity) was selected.
  • the selected transformant was cultured, and an expression vector was prepared using QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by QIAGEN).
  • An immunoglobulin binding protein in which at least one amino acid substitution of Glu15Ala or Lys (Glu) 58Gly has occurred in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30 has improved alkaline stability compared to SpA 5 d (SEQ ID NO: 30) It can be said that
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30 a protein (designated SpA 6 a) in which an amino acid substitution of Glu 15 30 Ala (this notation represents that glutamic acid at position 15 in SEQ ID NO: 30 is substituted with alanine, the same applies hereinafter) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34), the amino acid sequence of Lys (Glu) 58 30 Gly of the protein amino acid substitutions were generated (SpA5f named) in SEQ ID NO: 35, respectively.
  • Example 10 Mutation of Alkaline Stability-Enhancing Immunoglobulin Binding Protein and Preparation of Library Among the mutant immunoglobulin binding proteins evaluated in Example 9, SpA6a (Example 8) was selected and SpA6a was encoded. Mutations were randomly introduced into the polynucleotide portion (SEQ ID NO: 36) by error prone PCR.
  • the above error-prone PCR successfully introduces a mutation into the polynucleotide (SEQ ID NO: 36) encoding the mutant immunoglobulin binding protein (SpA6a), and the average mutation introduction rate is PCR under the conditions (composition) of Table 2.
  • the case of 1.03% the case of PCR under the conditions (composition) of Table 9 was 1.44%, and the case of PCR under the conditions (composition) of Table 10 was 2.87%.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed with the reaction solution, cultured on LB plate medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin (37 ° C., 16 hours), and then formed on the plate The colonies were used as a random mutant library.
  • Example 11 Screening of Alkali Stabilized Immunoglobulin Binding Protein (Part 4) (1) Random mutant library (transformant) about 2500 strains prepared in Example 10 (about 1000 strains from the library obtained under the conditions of Table 2; about 1000 strains from the library obtained under the conditions of Table 9; Immunoglobulin binding proteins were expressed by culturing approximately 500 strains of the library obtained under the conditions of 10 according to the method described in Example 3 (1) to (2).
  • the culture supernatant containing the immunoglobulin-binding protein obtained by centrifugation was diluted 40-fold with pure water.
  • the diluted solution was mixed equally with 2M NaOH and alkali treated at 65-68 ° C. for 30 minutes. After alkali treatment, it was neutralized with 4 volumes of 1 M Tris buffer (pH 7.0).
  • the remaining activity is calculated by dividing the antibody binding activity of the immunoglobulin binding protein when alkaline treatment is performed by the antibody binding activity of the immunoglobulin binding protein when alkaline treatment is not performed, and compared with SpA6a.
  • a transformant expressing an immunoglobulin binding protein with improved alkaline stability (improved residual activity) was selected.
  • the selected transformant was cultured, and an expression vector was prepared using QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by QIAGEN).
  • the summarized results are shown in Table 11, Table 12, and Table 13.
  • An immunoglobulin binding protein in which at least one amino acid substitution of any of Val40Ala, Asn3Ile, Lys (Glu) 58Asp, and Lys (Glu) 58Val occurs in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 34 is SpA6a (SEQ ID NO: 34) It can be said that the alkali stability is improved as compared with.
  • a protein in which amino acid substitution of Val40 34 Ala (this notation represents that valine at position 40 in SEQ ID NO: 34 has been substituted by alanine, and so forth) occurs in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 34
  • Amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, amino acid sequence of a protein in which an amino acid substitution of Asn3 34 Ile has occurred is SEQ ID NO: 38, and protein in which amino acid substitution of Lys (Glu) 58 34 Asp has occurred (SpA 6 b) named) an amino acid sequence in SEQ ID NO: 39, the Lys (Glu) 58 34 amino acid sequence SEQ ID NO: 40 of the protein amino acid substitution occurs in Val (SpA6c named), respectively.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention is a protein comprising an amino acid sequence in which an amino acid residue at a specific position of an immunoglobulin binding domain such as domain C of Staphylococcus Alga-derived protein A is substituted with another specific amino acid residue It is.
  • the immunoglobulin binding protein of the present invention has improved stability to alkali and is useful as a ligand protein in an adsorbent for separating an antibody (immunoglobulin).

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Abstract

化学的安定性、特にアルカリに対する安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を提供すること。スタフィロコッカス属細菌由来プロテインＡのドメインＣ等のイムノグロブリン結合ドメインにおける特定位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することにより、アルカリに対する安定性を向上させることができ、以て前記課題を解決する。

Description

免疫グロブリン結合性タンパク質
　本発明は、免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、アルカリに対する安定性に優れた免疫グロブリン結合性タンパク質に関する。
　抗体医薬は生体内の免疫機能を担う分子である抗体（免疫グロブリン）を利用した医薬である。抗体医薬は抗体が有する可変領域の多様性により標的分子に対し高い特異性と親和性をもって結合する。そのため抗体医薬は副作用が少なく、また、近年では適応疾患が広がってきていることもあり市場が急速に拡大している。
　抗体医薬の製造は培養工程と精製工程を含み、培養工程では生産性を向上させるために抗体産生細胞の改質や培養条件の最適化が図られている。また、精製工程では粗精製としてアフィニティークロマトグラフィーが採用され、その後の中間精製、最終精製、およびウイルス除去を経て製剤化される。
　精製工程では抗体分子を特異的に認識するアフィニティー担体が用いられ、当該担体で用いられるリガンドタンパク質には抗体（免疫グロブリン）に結合する性質を有したプロテインＡやプロテインＧが用いられている。抗体医薬を製造する際は、その生産コストを低く保つため、これらアフィニティー担体は複数回使用され、使用後は当該担体に残存した不純物を除去する工程を行なう。前記不純物を除去する工程では、通常、水酸化ナトリウムを用いた定置洗浄を行ない、この工程によりアフィニティー担体を再生させる。従って、前記リガンドタンパク質は、前記工程を行なっても、抗体への結合性が維持されるだけの化学的安定性を有する必要がある。
　化学的安定性を有する、アフィニティー担体で用いられるリガンドタンパク質の一例としては、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のプロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインＣのアミノ酸配列を利用したアルカリ安定クロマトグラフィーリガンド（特許文献１）や、前記プロテインＡのドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＺのうち、いずれかのドメインの一部のアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列から構成されるアフィニティークロマトグラフィーリガンド（特許文献２）が挙げられる。また、ドメインＺにおいて２９番目のグリシンをアラニンに置換することにより、構造が安定化することが知られている（非特許文献１）。
特表２０１０－５０４７５４号公報 特開２０１２－２５４９８１号公報
Ｂｊｏｒｎ　Ｎｉｌｓｓｏｎ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１（２），１０７－１１３，１９８７
　本発明の課題はアルカリに対する安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を提供することである。
　本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のプロテインＡ（ＳｐＡ）のドメインＣにおける安定性向上に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することでアルカリに対して優れた安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
［１］
　プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（１）から（８）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、免疫グロブリン結合性タンパク質：
（１）配列番号１の２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換
（２）配列番号１の４９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに置換
（３）配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（４）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸、バリン、グリシン、またはアスパラギン酸に置換
（５）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンまたはスレオニンに置換
（６）配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がリジンまたはチロシンに置換
（７）配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（８）配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換。
［２］
　以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に記載のタンパク質である、前記免疫グロブリン結合性タンパク質：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、さらに前記少なくとも１つのアミノ酸置換の位置以外の１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質；
（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに、以下の（９）から（１３）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、タンパク質：
（９）配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１０）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（１１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換
（１２）配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換
（１３）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換。
［３］
　配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（３－１）および／または（４－１）に示すアミノ酸置換を少なくとも有する、前記免疫グロブリン結合性タンパク質：
（３－１）配列番号１の２１番目のアスパラギンがチロシンに置換
（４－１）配列番号１の５８番目のリジンがグルタミン酸に置換。
［４］
　配列番号８、９、１３、１５、１７、１９、および２１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、前記免疫グロブリン結合性タンパク質。
［５］
　配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（Ｉ）から（Ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、前記免疫グロブリン結合性タンパク質：
（Ｉ）配列番号１７の３番目のアスパラギンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（ＩＩ）配列番号１７の１１番目のアスパラギンがリジンまたはチロシンに置換
（ＩＩＩ）配列番号１７の５８番目のグルタミン酸がバリン、グリシン、またはアスパラギン酸に置換
（ＩＶ）配列番号１７の１５番目のグルタミン酸がアラニンに置換
（Ｖ）配列番号１７の４０番目のバリンがアラニンに置換。
［６］
　配列番号２８から３２、３４、３５、および３７から４０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、前記免疫グロブリン結合性タンパク質。
［７］
　配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（２－１）に示すアミノ酸置換を少なくとも有する、前記免疫グロブリン結合性タンパク質：
（２－１）配列番号１の４９番目のリジンがメチオニンに置換。
［８］
　配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、前記免疫グロブリン結合性タンパク質。
［９］
　前記免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［１０］
　前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１１］
　前記ポリヌクレオチドまたは前記発現ベクターを有する形質転換体。
［１２］
　エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、前記形質転換体。
［１３］
　前記形質転換体を培養することにより前記免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む、免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法。
［１４］
　不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された前記免疫グロブリン結合性タンパク質とを備える、免疫グロブリン吸着剤。
［１５］
　前記吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、免疫グロブリンの分離方法。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、特定の免疫グロブリン結合性タンパク質である。「免疫グロブリン結合性タンパク質」とは、免疫グロブリンに対する結合性を有するタンパク質を意味する。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、免疫グロブリンに対する結合性を有する。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、具体的には、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合性を有するものであってもよい。免疫グロブリンに対する結合性を、「免疫グロブリン結合活性」または「抗体結合活性」ともいう。免疫グロブリン結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ法により測定することができる。ＥＬＩＳＡ法は、例えば、実施例に記載の条件で実施することができる。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、特定位置におけるアミノ酸置換を有するタンパク質が挙げられる。プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列であって、特定位置におけるアミノ酸置換を有さないものを、「非改変型アミノ酸配列」ともいう。プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列であって、特定位置におけるアミノ酸置換を有するものを、「改変型アミノ酸配列」ともいう。すなわち、改変型アミノ酸配列は、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は非改変型アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は非改変型アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、改変型アミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。非改変型アミノ酸配列は、天然に見出されるアミノ酸配列であってもよく、そうでなくてもよい。非改変型アミノ酸配列は、例えば、所望の性質を有するように改変されていてもよい。非改変型アミノ酸配列は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換以外のアミノ酸置換を有していてもよい。
　プロテインＡとしては、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のプロテインＡ（ＳｐＡ）が挙げられる。スタフィロコッカス属細菌としては、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。イムノグロブリン結合ドメインとしては、ドメインＣ、ドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢが挙げられる。イムノグロブリン結合ドメインとしては、特に、ドメインＣが挙げられる。スタフィロコッカス・オーレウス由来のＳｐＡのドメインＣとしては、ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２７０番目から３２７番目までのアミノ酸残基が挙げられる。当該ドメインＣのアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、スタフィロコッカス・オーレウス由来のＳｐＡのドメインＥとしては、ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の３７番目から９２番目までのアミノ酸残基が挙げられる。また、スタフィロコッカス・オーレウス由来のＳｐＡのドメインＤとしては、ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の９３番目から１５３番目のアミノ酸残基が挙げられる。また、スタフィロコッカス・オーレウス由来のＳｐＡのドメインＡとしては、ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の１５４番目から２１１番目のアミノ酸残基が挙げられる。また、スタフィロコッカス・オーレウス由来のＳｐＡのドメインＢとしては、ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＡＡＡ２６６７６の２１２番目から２６９番目のアミノ酸残基が挙げられる。すなわち、非改変型アミノ酸配列として、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示したイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列が挙げられる。また、改変型アミノ酸配列として、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示したイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列において特定位置におけるアミノ酸置換を有するアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示したイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、特定位置におけるアミノ酸置換を有するタンパク質が挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は配列番号１に記載のアミノ酸配列等の上記例示したイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってよい。
　タンパク質がアミノ酸配列を含むことを、「タンパク質がアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を含む」ともいう。タンパク質またはアミノ酸配列がアミノ酸置換を有することを、「タンパク質またはアミノ酸配列においてアミノ酸置換が生じる」ともいう。タンパク質またはアミノ酸配列を構成するアミノ酸を、「アミノ酸残基」ともいう。
　前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、Ａｓｐ２Ｇｌｕ（この表記は配列番号１の２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換されていることを表す、以下同じ）、Ｌｙｓ４９Ｍｅｔ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｙ、Ｌｙｓ５８Ａｓｐ、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ａｓｎ３Ｔｈｒ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ１１Ｔｙｒ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、およびＶａｌ４０Ａｌａから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換である。言い換えると、前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、（１）Ａｓｐ２Ｇｌｕ、（２）Ｌｙｓ４９Ｍｅｔ、（３）Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、（４）Ｌｙｓ５８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｙ、またはＬｙｓ５８Ａｓｐ（５）Ａｓｎ３ＩｌｅまたはＡｓｎ３Ｔｈｒ、（６）Ａｓｎ１１ＬｙｓまたはＡｓｎ１１Ｔｙｒ、（７）Ｇｌｕ１５Ａｌａ、および（８）Ｖａｌ４０Ａｌａから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換である。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、これらのアミノ酸置換から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのアミノ酸置換を有していてよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、少なくとも、Ａｓｐ２Ｇｌｕおよび／またはＬｙｓ４９Ｍｅｔのアミノ酸置換を有していてもよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、少なくとも、Ａｓｐ２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４９Ｍｅｔ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、およびＬｙｓ５８Ｇｌｕから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を有していてもよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、少なくとも、Ａｓｐ２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４９Ｍｅｔ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ５８Ｖａｌ、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ａｓｎ３Ｔｈｒ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、およびＡｓｎ１１Ｔｙｒから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を有していてもよい。また、中でも、Ａｓｎ２１ＴｙｒおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕは、アルカリに対する安定性が特に向上したアミノ酸置換である。そのため、Ａｓｎ２１ＴｙｒまたはＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を少なくとも有する免疫グロブリン結合性タンパク質は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の好ましい例である。また、Ａｓｎ２１ＴｙｒおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を少なくとも有する免疫グロブリン結合性タンパク質は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の特に好ましい例である。また、Ｌｙｓ４９Ｍｅｔのアミノ酸置換を少なくとも有する免疫グロブリン結合性タンパク質も、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の好ましい例である。
　なお、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、少なくとも１つのその他のアミノ酸置換をさらに有してもよい。他のアミノ酸置換としては、構造安定性が増すことが知られているＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換（Ｂｊｏｒｎ　Ｎｉｌｓｓｏｎ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１（２），１０７－１１３，１９８７）が挙げられる。また、他のアミノ酸置換としては、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ６Ａｓｐ、Ｌｙｓ４２Ａｒｇのアミノ酸置換も挙げられる。すなわち、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）において前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有すること以外は上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が２つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する場合、それらアミノ酸置換の組み合わせは特に制限されない。
　アミノ酸置換の組み合わせとして、具体的には、例えば、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１ＴｙｒおよびＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換；Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｌｙｓ４９ＭｅｔおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ａｓｎ３Ｔｈｒ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｔｙｒ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｖａｌのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｙのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換；Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｖａｌのアミノ酸置換が挙げられる。
　すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、より具体的には、下記の免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。これらの免疫グロブリン結合性タンパク質はアルカリに対する安定性が向上する点で好ましい。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ２１Ｔｙｒのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１ＴｙｒおよびＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｌｙｓ４９ＭｅｔおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｔｈｒ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｔｙｒ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｖａｌのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４９Ｍｅｔのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｙのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９Ａｌａ、Ｖａｌ４０ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＡｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ａｓｐのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｖａｌのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
　また、アミノ酸置換の組み合わせとして、具体的には、例えば、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕと、以下の（Ｉ）から（Ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換との組み合わせが挙げられる：
（Ｉ）Ａｓｎ３ＩｌｅまたはＡｓｎ３Ｔｈｒ
（ＩＩ）Ａｓｎ１１ＬｙｓまたはＡｓｎ１１Ｔｙｒ
（ＩＩＩ）Ｌｙｓ５８Ｖａｌ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｙ、またはＬｙｓ５８Ａｓｐ
（ＩＶ）Ｇｌｕ１５Ａｌａ
（Ｖ）Ｖａｌ４０Ａｌａ。
　すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質として、より具体的には、配列番号１７に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記（Ｉ）から（Ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。そのようなタンパク質としては、特に、上述した配列番号２８から３２、３４、３５、および３７から４０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質が挙げられる。なお、ここで（ＩＩＩ）を選択した場合、配列番号１７に含まれるＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換はＬｙｓ５８Ｖａｌ等のアミノ酸置換で上書きされるため、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質はＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有さない。（Ｉ）から（Ｖ）のアミノ酸置換は、いずれも、配列番号１７を参照配列として適宜読み替えることができる。すなわち、例えば、ここでいう「Ｌｙｓ５８Ｖａｌ」は、配列番号１７の５８番目のグルタミン酸がバリンに置換されるアミノ酸置換として読み替えることができる。他のアミノ酸配列を参照配列とする場合も同様である。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、特に、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（Ａ１）から（Ａ３）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる：
（Ａ１）Ａｓｎ３ＩｌｅまたはＡｓｎ３Ｔｈｒ
（Ａ２）Ａｓｎ１１ＬｙｓまたはＡｓｎ１１Ｔｙｒ
（Ａ３）Ｌｙｓ５８Ｖａｌ。
　また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、特に、配列番号３０に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（Ｂ１）および／または（Ｂ２）のアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる：
（Ｂ１）Ｇｌｕ１５Ａｌａ
（Ｂ２）Ｌｙｓ５８Ｇｌｙ。
　また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、特に、配列番号３４に記載のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＬｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ｇｌｕ１５Ａｌａ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｇｌｙ２９ＡｌａおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（Ｃ１）から（Ｃ３）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる：
（Ｃ１）Ａｓｎ３Ｉｌｅ
（Ｃ２）Ｌｙｓ５８ＶａｌまたはＬｙｓ５８Ａｓｐ
（Ｃ３）Ｖａｌ４０Ａｌａ。
　配列番号１に記載のアミノ酸配列において上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を、「配列番号１由来置換アミノ酸配列」ともいう。配列番号１由来置換アミノ酸配列は、言い換えると、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）が生じた配列番号１に記載のアミノ酸配列である。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列は、言い換えると、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有すること以外は配列番号１に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列である。
　また、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１由来置換アミノ酸配列）のバリアント配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１由来置換アミノ酸配列）のバリアント配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。以下、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列の場合を例示して説明するが、当該説明は任意の改変型アミノ酸配列のバリアント配列にも準用できる。
　配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように（すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が前記特定位置におけるアミノ酸置換を有するように）設定されるものとする。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換が残存するように（すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質がＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するように）設定されてもよい。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を追加的に有していてもよい。例えば、配列番号１由来置換アミノ酸配列がＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有さない場合に、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列がＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有していてもよい。
　配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１由来置換アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、免疫グロブリン結合活性を有する限り、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）に加えて、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含んでいてもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、さらに１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、さらに１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むこと以外は配列番号１と同一のアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質であってもよい。なお、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように選択されるものとする。すなわち、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換が残存するように選択されてもよい。すなわち、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個のいずれかを意味する。上記のアミノ酸残基の置換の一例としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が挙げられる。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換が挙げられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加には、例えば、タンパク質またはそれをコードする遺伝子が由来する微生物の個体差や種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。
　また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１由来置換アミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。なお、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように選択されるものとする。すなわち、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換が残存するように選択されてもよい。すなわち、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。「高い相同性」とは、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を意味してよい。「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよい。「相同性」とは、特に、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してもよい。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して決定することができる。例えば、アミノ酸配列の同一性とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。
　また、改変型アミノ酸配列としては、上記例示したバリアント配列において、さらに、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列も挙げられる。例えば、改変型アミノ酸配列は、少なくとも前記特定位置におけるアミノ酸置換を有するバリアント配列において、さらに、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列であってよい。
　また、非改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列も挙げられる。すなわち、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列を含み、ただし当該バリアント配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、上記例示したアミノ酸置換を有すること以外は上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。以下、配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列の場合を例示して説明するが、当該説明は任意の非改変型アミノ酸配列のバリアント配列にも準用できる。
　配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、さらに上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。
　配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列）において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。上記のような相同性の範囲でのアミノ酸残基の変化は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸残基の変化は、例えば、Ｇｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。
　その他、配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列については、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列についての記載を準用できる。
　「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端から数えてＸ位の位置に存在するアミノ酸を意味する。或るアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、当該或るアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該或るアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。例えば、Ａｓｐ２Ｇｌｕのアミノ酸置換の場合、或るアミノ酸配列における「配列番号１の２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基」とは、当該或るアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該或るアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号１に示すアミノ酸配列における２番目のアスパラギン酸と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸そのものを意味する。すなわち、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）の位置は、必ずしも本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号１に記載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。すなわち、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が、上記例示したアミノ酸置換の位置よりもＮ末端側にアミノ酸残基の挿入、欠失、または付加を含む場合、それに応じて当該アミノ酸置換の絶対的な位置は変動し得る。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質における上記例示したアミノ酸置換の位置は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のアミノ酸配列と配列番号１に記載のアミノ酸配列とのアラインメントにより特定することができる。アラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して実施することができる。配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列等の任意のアミノ酸配列における上記例示したアミノ酸置換の位置についても同様である。また、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）の置換前のアミノ酸残基は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における置換前のアミノ酸残基の種類を示すものであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列以外の非改変型アミノ酸配列においては保存されていてもよく、いなくてもよい。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、改変型アミノ酸配列を１個のみ含んでいてもよく、改変型アミノ酸配列を複数個含んでいてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、改変型アミノ酸配列を２個以上、３個以上、４個以上、または５個以上含んでいてもよく、１０個以下、７個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下含んでいてもよく、それらの矛盾しない組み合わせの個数含んでいてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が複数個の改変型アミノ酸配列を含む場合、それら複数個の改変型アミノ酸配列のアミノ酸配列は同一であってもよく、そうでなくてもよい。それら複数個の改変型アミノ酸配列は、例えば、適切なリンカーを介して互いに連結されていてよい。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、改変型アミノ酸配列からなるものであってもよく、他のアミノ酸配列（例えばオリゴペプチド）をさらに含んでいでもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に他のアミノ酸配列をさらに含んでいでもよい。言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質においては、例えば、改変型アミノ酸配列のＮ末端側またはＣ末端側に他のアミノ酸配列が付加されていてもよい。他のアミノ酸配列は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の免疫グロブリン結合性や安定性を損なわない限り、特に制限されない。例えば、他のアミノ酸配列の種類や長さは、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の免疫グロブリン結合性や安定性を損なわない限り、特に制限されない。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、選択したイムノグロブリン結合ドメインに加えて、他のイムノグロブリン結合ドメインの一部を含んでいてもよい。例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質がドメインＣの改変型アミノ酸配列を含む場合、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、さらに、プロテインＡのドメインＣのＮ末端側領域（ドメインＥ、ドメインＤ、ドメインＡ、ドメインＢ／Ｚ）の一部を含んでいてもよく、プロテインＡのドメインＣのＣ末端側領域の一部を含んでいてもよい。
　また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に、目的物を特異的に検出または分離する目的で有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。そのようなオリゴペプチドとしては、ポリヒスチジンやポリアルギニンが挙げられる。
　また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。そのようなオリゴペプチドとしては、リジンやシステインを含むオリゴペプチドが挙げられる。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が上記のような他のアミノ酸配列を含む場合、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、予め他のアミノ酸配列を含む形態で製造されてもよいし、別途製造された上記のような他のアミノ酸配列が付加されてもよい。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が上記のような他のアミノ酸配列を含む場合、典型的には、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、上記のような他のアミノ酸配列を含む本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の全長アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから発現させることにより、製造することができる。すなわち、例えば、他のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質（例えば他のアミノ酸配列を含まないもの）をコードするポリヌクレオチドとを、他のアミノ酸配列が本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加されるように連結し、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させてもよい。また、例えば、化学的に合成した他のアミノ酸配列を本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質（例えば他のアミノ酸配列を含まないもの）のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させてもよい。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドから発現することにより、製造することができる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」ともいう。本発明のポリヌクレオチドは、具体的には、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであってよい。
　本発明のポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法により、または、ＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅法により、取得できる。ＤＮＡ増幅法は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列等の増幅すべきヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを鋳型として実施することができる。鋳型とするポリヌクレオチドとしては、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する生物のゲノムＤＮＡ、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のｃＤＮＡ、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質のアミノ酸配列からの変換により設計することができる。アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際には、標準のコドンテーブルを使用することができるが、本発明のポリヌクレオチドで形質転換する宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換してよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ　Ｕｓａｇｅ　Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
　また、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｙ２９Ａｌａ等の他のアミノ酸置換）を有さない免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、コードされるタンパク質が上記例示したアミノ酸置換を有するように変異を導入することによっても、取得できる。上記例示したアミノ酸置換を有さない免疫グロブリン結合性タンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列またはそのバリアント配列）を含むタンパク質が挙げられる。上記例示したアミノ酸置換を有さない免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法により、または、ＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅法により、取得できる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が２つ以上のアミノ酸置換を有する場合、それらのアミノ酸置換は、例えば、同時に、あるいは順次、導入されてよい。例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに、コードされるタンパク質が上記例示したアミノ酸置換から選択される別の少なくとも１つのアミノ酸置換を有するように変異を導入してもよい。また、或る位置のアミノ酸残基を２回以上改変してもよい。例えば、既にＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質にさらにＬｙｓ５８Ｖａｌのアミノ酸置換を導入してもよい。
　また、ポリヌクレオチドは、上記例示したアミノ酸置換を生じる変異に限られず、バリアント配列の構築のための変異等の任意の変異を導入して、本発明のポリヌクレオチドまたはそれを取得するための材料として利用してよい。
　ポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、エラープローンＰＣＲ法が挙げられる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に制限されない。例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。また、ポリヌクレオチドへ変異を導入する方法としては、エラープローンＰＣＲ法以外にも、ポリヌクレオチドに変異原となる薬剤を作用させることにより、またはポリヌクレオチドに紫外線を照射することにより、ポリヌクレオチドに変異を導入する方法が挙げられる。変異原となる薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等の、当業者が通常用いる変異原性薬剤が挙げられる。このようなポリヌクレオチドへ変異を導入する方法は、上記例示したアミノ酸置換の導入に限られず、バリアント配列の構築（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加の導入や、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化）にも利用できる。
　本発明のポリヌクレオチドは、例えば、その全長配列を一括して取得してもよく、その部分配列をそれぞれ取得して連結することにより取得してもよい。上記のような本発明のポリヌクレオチドを取得する手法についての説明は、その全長配列を一括して取得する場合に限られず、その部分配列を取得する場合にも準用できる。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、具体的には、例えば、本発明のポリヌクレオチドを有する形質転換体に本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させることにより製造できる。本発明のポリヌクレオチドを有する形質転換体を、「本発明の形質転換体」ともいう。本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを有することに依拠して、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現することができる。すなわち、本発明の形質転換体は、言い換えると、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能な形質転換体である。
　本発明の形質転換体は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換することにより得られる。すなわち、本発明の形質転換体は、例えば、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主であってよく、本発明のポリヌクレオチドを有する宿主であってよく、また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能な宿主であってよい。宿主は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換されることにより本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現可能となるものであれば特に制限されない。宿主としては、動物細胞、昆虫細胞、微生物が挙げられる。動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、Ｓｆ９、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４が挙げられる。微生物としては、酵母や細菌が挙げられる。酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ　Ｐａｓｔｏｒｉｓ等のＰｉｃｈｉａ属酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ等のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母が挙げられる。細菌としては、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。なお、酵母やエシェリヒア・コリを宿主として用いると生産性の面で好ましく、エシェリヒア・コリを宿主として用いるとさらに好ましい。
　本発明のポリヌクレオチドは、発現可能に本発明の形質転換体に保持されていればよい。本発明のポリヌクレオチドは、具体的には、宿主で機能するプロモーターの制御下で発現するように保持されていればよい。宿主で機能するプロモーターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主とする場合は、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーターが挙げられる。
　本発明の形質転換体において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムＤＮＡ外で自律複製するベクター上に存在していてよい。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターとして宿主に導入することができる。すなわち、本発明の形質転換体は、一態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有する形質転換体であってよい。本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、「本発明の発現ベクター」ともいう。本発明の発現ベクターは、例えば、発現ベクターの適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる。なお、発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限されない。発現ベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクターを例示できる。発現ベクターは、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを備えていてよい。また、前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、選択マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモーター等の機能性ポリヌクレオチドに連結された状態で挿入すると好ましい。
　また、本発明の形質転換体において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムＤＮＡ上に導入されていてもよい。ゲノムＤＮＡへの本発明のポリヌクレオチドの導入は、例えば、相同組み換えによる遺伝子導入法を利用して実施することができる。相同組み換えによる遺伝子導入法としては、Ｒｅｄ－ｄｒｉｖｅｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，　Ｋ．　Ａ，　ａｎｄ　Ｗａｎｎｅｒ，　Ｂ．　Ｌ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ　Ｓ　Ａ．　９７：６６４０－６６４５　（２０００））等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むベクターを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないベクターを用いる方法、ファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法が挙げられる。
　本発明の発現ベクター等のポリヌクレオチドを用いた宿主の形質転換は、例えば、当業者が通常用いる方法で行なうことができる。例えば、宿主としてエシェリヒア・コリを選択する場合には、コンピテントセル法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等により形質転換することができる。形質転換後に適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明の形質転換体を取得することができる。
　各種微生物において利用可能な発現ベクターやプロモーター等の遺伝子工学的手法に関する情報については、例えば、「微生物学基礎講座８　遺伝子工学、共立出版、１９８７年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
　本発明の形質転換体が本発明の発現ベクターを有する場合、本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを調製することができる。例えば、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の市販の抽出キットを用いて本発明の発現ベクターを調製することができる。
　本発明の形質転換体を培養することにより、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させることができる。また、本発明の形質転換体を培養することにより本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させ、発現した前記タンパク質を回収することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を製造できる。すなわち、本発明は、例えば、本発明の形質転換体を培養することにより本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させる工程と、発現された前記タンパク質を回収する工程とを含む、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法を提供する。培地組成や培養条件は、宿主の種類や本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の特性等の諸条件に応じて適宜設定することができる。培地組成や培養条件は、例えば、宿主が増殖でき、且つ、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現できるように設定することができる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩、その他の各種有機成分や無機成分を適宜含有する培地を用いることができる。例えば、宿主がエシェリヒア・コリの場合、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（トリプトン　１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス　０．５％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム　１％（ｗ／ｖ））が好ましい培地の一例として挙げられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該発現ベクターに含まれる抗生物質耐性遺伝子に対応した抗生物質を添加して培養すると好ましい。例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は培地にカナマイシンを添加すればよい。本発明のポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ上に導入されている場合も同様である。また、培地は、グルタチオン、システイン、シスタチン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含有していてもよい。また、培地は、グリシン等の前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を含有していてもよい。例えば、宿主がエシェリヒア・コリの場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は、例えば、宿主がエシェリヒア・コリの場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であってよい。培地のｐＨは、例えば、宿主がエシェリヒア・コリの場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後であってよい。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を誘導性のプロモーターの制御下で発現する場合は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が良好に発現できるように誘導をかけると好ましい。発現誘導には、例えば、プロモーターの種類に応じた誘導剤を用いることができる。誘導剤としては、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。例えば、宿主がエシェリヒア・コリの場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加し、引き続き培養することで、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は、例えば、０．００５から１．０ｍＭ、好ましくは０．０１から０．５ｍＭであってよい。ＩＰＴＧ誘導等の発現誘導は、例えば、当該技術分野において周知の条件で行なうことができる。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、その発現形態に適した方法で培養物から分離して回収することができる。なお、「培養物」とは、培養により得られた培養液の全体またはその一部を意味する。当該一部は、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を含有する部分であれば特に制限されない。当該一部としては、培養された本発明の形質転換体の細胞や培養後の培地（すなわち培養上清）が挙げられる。例えば、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が培養上清に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を回収することができる。また、本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質が細胞内（ペリプラズムを含む）に蓄積する場合、細胞を遠心分離操作により回収した後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより細胞を破砕して、破砕物から本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質を回収することができる。培養上清や細胞破砕物からの本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析に使用することができる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、不溶性担体に固定化して使用することができる。すなわち、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析は、具体的には、例えば、不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質とを備える、免疫グロブリン吸着剤を用いて実施することができる。不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質とを備える、免疫グロブリン吸着剤を、「本発明の免疫グロブリン吸着剤」ともいう。なお、「免疫グロブリンの分離」とは、夾雑物質共存下の溶液からの免疫グロブリンの分離に限らず、構造、性質、または活性等に基づく免疫グロブリン間の分離も包含される。不溶性担体は特に制限されない。不溶性担体としては、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルが挙げられる。不溶性担体の形状は特に制限されない。不溶性担体は、例えば、カラムに充填できる形状であってよい。不溶性担体は、例えば、粒状物または非粒状物であってよい。また、不溶性担体は、例えば、多孔性または非多孔性であってもよい。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、例えば、共有結合により不溶性担体に固定化することができる。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、具体的には、例えば、不溶性担体が有する活性基を介して本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることにより、不溶性担体に固定化することができる。すなわち、不溶性担体は、活性基を有していてよい。不溶性担体は、例えば、その表面に活性基を有していてよい。活性基としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミドが挙げられる。活性基を有する不溶性担体としては、例えば、活性基を有する市販の不溶性担体をそのまま用いてもよいし、不溶性担体に活性基を導入して用いてもよい。活性基を有する市販の担体としては、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｒｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が例示できる。
　担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基、エポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。
　例えば、担体表面に存在する水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。
　また、例えば、担体表面に存在するエポキシ基にカルボキシル基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。
　また、例えば、担体表面に存在する水酸基、エポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
　また、例えば、担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
　また、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化することにより活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示できる。ハロゲン化剤としては、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。
　また、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性基を導入する方法も例示できる。縮合剤としては、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。添加剤としては、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質の不溶性担体への固定化は、例えば、緩衝液中で実施することができる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、活性基の反応性や免疫グロブリン結合性タンパク質の安定性等の諸条件に応じて適宜設定することができる。固定化させるときの反応温度は、例えば、５℃から５０℃であってよく、好ましくは１０℃から３５℃であってよい。
　本発明の免疫グロブリン吸着剤は、例えば、カラムに充填して免疫グロブリン（抗体）の分離に使用することができる。具体的には、例えば、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させ、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させることで、免疫グロブリンを分離することができる。すなわち、本発明は、例えば、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、免疫グロブリンの分離方法を提供する。免疫グロブリンを含む溶液は、例えば、ポンプ等の送液手段を用いてカラムに添加することができる。液体をカラムに添加することを、「液体をカラムに送液する」ともいう。なお、免疫グロブリンを含む溶液は、カラムに添加する前に予め適切な緩衝液を用いて溶媒置換してよい。また、免疫グロブリンを含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化してよい。カラムの平衡化により、例えば、免疫グロブリンをより高純度に分離できると期待される。溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が例示できる。そのような緩衝液には、例えば、さらに、１０ｍＭから１００ｍＭの塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。溶媒置換に用いる緩衝液と平衡化に用いる緩衝液は、同一であってもよく、なくてもよい。また、免疫グロブリンを含む溶液のカラムへの通液後に夾雑物質等の免疫グロブリン以外の成分がカラムに残存している場合、免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出する前に、そのような成分をカラムから除去してよい。免疫グロブリン以外の成分は、例えば、適切な緩衝液を用いてカラムから除去することができる。免疫グロブリン以外の成分の除去に用いる緩衝液については、例えば、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液についての記載を準用できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンとリガンド（本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質）との相互作用を弱めることにより、溶出することができる。免疫グロブリンとリガンド（本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質）との相互作用を弱める手段としては、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、具体的には、例えば、適切な溶出液を用いて溶出することができる。溶出液としては、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液よりも酸性側の緩衝液が挙げられる。そのような緩衝液としては、クエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。溶出液のｐＨは、例えば、免疫グロブリンの機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定することができる。
　このようにして免疫グロブリン（抗体）の分離を実施することにより、例えば、分離された免疫グロブリンが得られる。すなわち、免疫グロブリンの分離方法は、一態様において、免疫グロブリンの製造方法であってよく、具体的には、分離された免疫グロブリンの製造方法であってよい。免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンを含有する溶出画分として得られる。すなわち、溶出された免疫グロブリンを含有する画分を分取することができる。画分の分取は、例えば、常法により行なうことができる。画分を分取する方法としては、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等により画分の分取をする方法が挙げられる。さらに、免疫グロブリンを含有する画分から免疫グロブリンを回収することもできる。免疫グロブリンを含有する画分からの免疫グロブリンの回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法により行うことができる。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。
実施例１　免疫グロブリン結合性タンパク質発現ベクターの作製
（１）
　配列番号１に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質のアミノ酸配列から、エシェリヒア・コリ型コドンを用いて変換することで、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を設計した。
（２）
　（１）で設計したヌクレオチド配列を合成した後、ＰＣＲを用いて配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号４（５’－ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＧＴＴＣ－３’）および配列番号５（５’－ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＣＧＧＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＴＣ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、表１に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（３）
　得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化後、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（４）
　得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡを抽出した。
（５）
　得られた抽出物のうち、免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ライフサイエンス社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００　ＤＮＡ　ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号６（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）または配列番号７（５’－ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
　配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡに配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。
実施例２　免疫グロブリン結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
　実施例１で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡに挿入されている免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号３）にエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。
（１）
　実施例１で作製したｐＥＴ－ＳｐＡを鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲにより免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）に良好に変異が導入され、その平均変異導入率は１．１５％から１．２６％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）
　得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化し、予め制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションした。
（３）
　ライゲーション反応終了後、反応液を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
実施例３　アルカリ安定化免疫グロブリン結合性タンパク質のスクリーニング（その１）
（１）
　実施例２で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）約１９００株を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地（トリプトン　１．６％（ｗ／ｖ）、酵母エキス　１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム　０．５％（ｗ／ｖ））２５０μＬに接種し、９６ウェルディープウェルプレートを用いて３７℃で終夜振とう培養した。
（２）
　培養後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、０．３％のグリシン、０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を含む２×ＹＴ液体培地５００μＬに５μＬの培養液を植え継ぎ、９６ウェルディープウェルプレートを用いてさらに２０℃で終夜振とう培養した。
（３）
　培養後、遠心操作によって得られた培養上清を純水で４０倍に希釈した。希釈した溶液を２Ｍ　ＮａＯＨと等量混合し２５℃で１６時間アルカリ処理を行なった。その後、４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。
（４）
　アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。
（４－１）Ｔｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を用いて１０μｇ／ｍＬに調製したヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を９６ウェルマイクロプレートのウェルに分注し固定化した（４℃、１６時間）。固定化後、ＴＢＳを用いて１％（ｗ／ｖ）に調製したＢｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いてブロッキングした。
（４－２）洗浄緩衝液（０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ　２０（商品名））で９６ウェルマイクロプレートのウェルを洗浄後、抗体結合活性を評価する免疫グロブリン結合性タンパク質を含む溶液を添加し、免疫グロブリン結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃、１時間）。
（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６－Ｈｉｓ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＥＴＨＹＬ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し反応させた（３０℃、１時間）。
（４－４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。次に１Ｍ　リン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加することで反応を停止し、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５）
　（４）で算出した残存活性より、天然型（アミノ酸置換がない）免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）と比較してアルカリ安定性が向上した（残存活性が向上した）免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
（６）
　選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（７）
　得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列を実施例１（５）に記載の方法により解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
　選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質の、天然型（アミノ酸置換がない）免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）に対するアミノ酸置換位置および０．５Ｍ　ＮａＯＨを用いて２５℃で１５時間アルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結果を表３および表４に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列において、Ａｓｐ２Ｇｌｕ（この表記は配列番号１の２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ４９Ｍｅｔ、Ａｓｎ６Ａｓｐ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｌｙｓ４２Ａｒｇ、Ｌｙｓ５８Ｇｌｕのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じた免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３および表４に示すアミノ酸置換された免疫グロブリン結合性タンパク質のうち、最も残存活性の高い、Ａｓｎ２１Ｔｙｒのアミノ酸置換が生じた免疫グロブリン結合性タンパク質をＳｐＡ１と命名し、ＳｐＡ１をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴ－ＳｐＡ１と命名した。ＳｐＡ１のアミノ酸配列を配列番号８に、ＳｐＡ１をコードするヌクレオチド配列を配列番号１０に、それぞれ示す。
実施例４　アミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質の作製
（１）
　天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）に対し、構造安定化に寄与するＧｌｙ２９Ａｌａのアミノ酸置換（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１，１０７－１１３；非特許文献１）を導入したタンパク質（ＳｐＡ’と命名）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ’と命名）を作製した。ＳｐＡ’のアミノ酸配列を配列番号１１に、ＳｐＡ’をコードするヌクレオチド配列を配列番号１２に、それぞれ示す。
（２）
　実施例３で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＳｐＡ’（配列番号１１）に対し集積することで、更なる安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）から（ｅ）に示す５種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＳｐＡ’に対し、さらにＬｙｓ７ＧｌｕおよびＡｓｎ２１Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ２と命名）
（ｂ）ＳｐＡ２に対し、さらにＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ３ａと命名）
（ｃ）ＳｐＡ３ａに対し、さらにＬｙｓ４Ａｒｇのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ４ａと命名）
（ｄ）ＳｐＡ４ａに対し、さらにＬｙｓ４９Ｍｅｔのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ５ａと命名）
（ｅ）ＳｐＡ’に対し、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７ＧｌｕおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＳｐＡ３ｂと命名）
　以下、（ａ）から（ｅ）に示す５種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作製方法について説明する。
（ａ）ＳｐＡ２
（ａ－１）
　実施例３で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ７ＧｌｕおよびＡｓｎ２１Ｔｙｒを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ’（配列番号１１）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ２を設計した。
（ａ－２）
　（ａ－１）で設計したＳｐＡ２をコードするヌクレオチド配列を合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２３（５’－ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＡＣＡＡＡ－３’）および配列番号２６（５’－ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＧＣＧＣＴＴＧＴＧＣＡＴＣ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、表１に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で３０秒間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で２分間熱処理することで行なった。
（ａ－３）
　得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した後、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ－４）
　得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ２と命名）を抽出した。
（ａ－５）
　ｐＥＴ－ＳｐＡ２のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ２にＳｐＡ２をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ２のアミノ酸配列を配列番号１３に、ＳｐＡ２をコードするヌクレオチド配列を配列番号１４に、それぞれ示す。
（ｂ）ＳｐＡ３ａ
（ｂ－１）
　実施例３で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１ＴｙｒおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ’（配列番号１１）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ３ａを設計した。
（ｂ－２）
　（ｂ－１）で設計したＳｐＡ３ａをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２３および配列番号２７（５’－ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＧＴＧＣＡＴＣＧＴＴＣＡＧ－３’）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ－２）と同様の方法でＰＣＲを行なった。
（ｂ－３）
　得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した後、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ－４）
　得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔを用いて発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ３ａと命名）を抽出した。
（ｂ－５）
　ｐＥＴ－ＳｐＡ３ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ３ａにＳｐＡ３ａをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ３ａのアミノ酸配列を配列番号１５に、ＳｐＡ３ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号１６に、それぞれ示す。
（ｃ）ＳｐＡ４ａ
（ｃ－１）
　実施例３で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１ＴｙｒおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ’（配列番号１１）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ４ａを設計した。
（ｃ－２）
　（ｃ－１）で設計したＳｐＡ４ａをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２４（５’－ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＡＴＣＧＡＴＴＣ－３’）および配列番号２７に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ－２）と同様の方法でＰＣＲを行なった。
（ｃ－３）
　得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した後、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ－４）
　得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔを用いて発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ４ａと命名）を抽出した。
（ｃ－５）
　ｐＥＴ－ＳｐＡ４ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ４ａにＳｐＡ４ａをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ４ａのアミノ酸配列を配列番号１７に、ＳｐＡ４ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号１８に、それぞれ示す。
（ｄ）ＳｐＡ５ａ
（ｄ－１）
　実施例３で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ｇｌｕ、Ａｓｎ２１Ｔｙｒ、Ｌｙｓ４９ＭｅｔおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ’（配列番号１１）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ５ａを設計した。
（ｄ－２）
　（ｄ－１）で設計したＳｐＡ５ａをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２５（５’－ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＡＡ－３’）および配列番号２７に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ－２）と同様の方法でＰＣＲを行なった。
（ｄ－３）
　得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した後、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｄ－４）
　得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔを用いて発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ５ａと命名）を抽出した。
（ｄ－５）
　ｐＥＴ－ＳｐＡ５ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ５ａにＳｐＡ５ａをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ５ａのアミノ酸配列を配列番号１９に、ＳｐＡ５ａをコードするヌクレオチド配列を配列番号２０に、それぞれ示す。
（ｅ）ＳｐＡ３ｂ
（ｅ－１）
　実施例３で明らかになった、アルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｙｓ４Ａｒｇ、Ｌｙｓ７ＧｌｕおよびＬｙｓ５８Ｇｌｕを選択し、それらのアミノ酸置換をＳｐＡ’（配列番号１１）に対し集積したタンパク質ＳｐＡ３ｂを設計した。
（ｅ－２）
　（ｅ－１）で設計したＳｐＡ３ｂをコードするポリヌクレオチドを合成した後、ＰＣＲを用いて前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。ＰＣＲは、前記合成したポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとし、配列番号２５および配列番号２７に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ－２）と同様の方法でＰＣＲを行なった。
（ｅ－３）
　得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した後、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｅ－４）
　得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔを用いて発現ベクター（ｐＥＴ－ＳｐＡ３ｂと命名）を抽出した。
（ｅ－５）
　ｐＥＴ－ＳｐＡ３ｂのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ３ｂにＳｐＡ３ｂをコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。ＳｐＡ３ｂのアミノ酸配列を配列番号２１に、前記ＳｐＡ３ｂをコードするヌクレオチド配列を配列番号２２に、それぞれ示す。
実施例５　アミノ酸置換免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性評価
（１）
　実施例１で作製した天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）、および実施例４で作製した変異型（アミノ酸置換した）免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ２（配列番号１３）、ＳｐＡ３ａ（配列番号１５）、ＳｐＡ４ａ（配列番号１７）、ＳｐＡ５ａ（配列番号１９）、ＳｐＡ３ｂ（配列番号２１））を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２×ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で終夜、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）
　５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２×ＹＴ液体培地に前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）
　培養開始から３時間後、培養温度を２０℃に変更し、終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、２０℃で終夜、好気的に振とう培養した。
（４）
　培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
（５）
　（４）で調製したタンパク質抽出液中の天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）、および変異型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１３、１５、１７、１９および２１）の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（６）
　各タンパク質の濃度が等しくなるようＴｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を用いて希釈し、得られたタンパク質溶液のうち、一方は１Ｍ　ＮａＯＨと、もう一方はＴＢＳと、それぞれ等量混合後、２５℃で１５時間静置した。
（７）
　１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えた後、アルカリ処理（１Ｍ　ＮａＯＨを混合）およびアルカリ未処理（ＴＢＳを混合）のタンパク質溶液の抗体結合活性を実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
　結果を表５に示す。ここで評価した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ２（配列番号１３）、ＳｐＡ３ａ（配列番号１５）、ＳｐＡ４ａ（配列番号１７）、ＳｐＡ５ａ（配列番号１９）およびＳｐＡ３ｂ（配列番号２１））はいずれも、天然型免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１）と比較し、残存活性が高くなっており、これら変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例６　アルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
　実施例５で評価した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のうち、ＳｐＡ４ａ（実施例４（ｃ））を選択し、ＳｐＡ４ａをコードするポリヌクレオチド部分（配列番号１８）にエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。
（１）
　実施例４（ｃ）で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＳｐＡ４ａを鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲにより変異型の免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ４ａ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８）に良好に変異が導入され、その平均変異導入率は１．０９％であった。
（２）
　得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化し、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションした。
（３）
　ライゲーション反応終了後、反応液を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
実施例７　アルカリ安定化免疫グロブリン結合性タンパク質のスクリーニング（その２）
（１）
　実施例６で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）約１０００株を実施例３（１）から（２）に記載の方法で培養することで免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させた。
（２）
　培養後、遠心操作によって得られた免疫グロブリン結合性タンパク質を含む培養上清を純水で４０倍に希釈した。希釈した溶液を２Ｍ　ＮａＯＨと等量混合し、６０℃で３０分間アルカリ処理を行なった。アルカリ処理後は４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。
（３）
　アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性とアルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。
（４）
　アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、ＳｐＡ４ａと比較してアルカリ安定性が向上した（残存活性が向上した）免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
（５）
　選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（６）
　得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列を実施例１（５）に記載の方法により解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
　（４）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質のＳｐＡ４ａ（配列番号１７）に対するアミノ酸置換位置および０．５Ｍ　ＮａＯＨを用いて２５℃、１５時間アルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結果を表６および表７に示す。配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ａｓｎ３Ｔｈｒ、Ａｓｎ１１Ｌｙｓ、Ａｓｎ１１ＴｙｒおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ｖａｌ（この表記はＳｐＡ４ａ作製時に配列番号１の５８番目のリジンが一度グルタミン酸に置換されたが、さらにバリンに置換されたことを表す）のいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じた免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＳｐＡ４ａ（配列番号１７）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
　配列番号１７に記載のアミノ酸配列において、Ａｓｎ３１７Ｉｌｅ（この表記は配列番号１７の３番目のアスパラギン酸がイソロイシンに置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ５ｂと命名）のアミノ酸配列を配列番号２８に、Ａｓｎ３１７Ｔｈｒのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ５ｃと命名）のアミノ酸配列を配列番号２９に、Ａｓｎ１１１７Ｌｙｓのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ５ｄと命名）のアミノ酸配列を配列番号３０に、Ａｓｎ１１１７Ｔｙｒのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ５ｅと命名）のアミノ酸配列を配列番号３１に、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８１７Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ４ｂと命名）のアミノ酸配列を配列番号３２に、それぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例８　アルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
　実施例７で評価した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のうち、ＳｐＡ５ｄ（実施例６）を選択し、ＳｐＡ５ｄをコードするポリヌクレオチド部分（配列番号３３）にエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。
（１）
　実施例６で作製したランダム変異体ライブラリーから得たＳｐＡ５ｄの発現ベクターを鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲにより変異型の免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ５ｄ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３３）に良好に変異が導入され、その平均変異導入率は０．９２％であった。
（２）
　得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化し、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションした。
（３）
　ライゲーション反応終了後、反応液を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
実施例９　アルカリ安定化免疫グロブリン結合性タンパク質のスクリーニング（その３）
（１）
　実施例８で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）約１０００株を実施例３（１）から（２）に記載の方法で培養することで免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させた。
（２）
　培養後、遠心操作によって得られた免疫グロブリン結合性タンパク質を含む培養上清を純水で４０倍に希釈した。希釈した溶液を２Ｍ　ＮａＯＨと等量混合し、６２℃で３０分間アルカリ処理を行なった。アルカリ処理後は４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。
（３）
　アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性とアルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。
（４）
　アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、ＳｐＡ５ｄと比較してアルカリ安定性が向上した（残存活性が向上した）免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
（５）
　選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（６）
　得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列を実施例１（５）に記載の方法により解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
　（４）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質のＳｐＡ５ｄ（配列番号３０）に対するアミノ酸置換位置および０．５Ｍ　ＮａＯＨを用いて２５℃、１５時間アルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結果を表８に示す。配列番号３０に記載のアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１５ＡｌａおよびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ｇｌｙのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じた免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＳｐＡ５ｄ（配列番号３０）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
　配列番号３０に記載のアミノ酸配列において、Ｇｌｕ１５３０Ａｌａ（この表記は配列番号３０の１５番目のグルタミン酸がアラニンに置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ６ａと命名）のアミノ酸配列を配列番号３４に、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８３０Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ５ｆと命名）のアミノ酸配列を配列番号３５に、それぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例１０　アルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
　実施例９で評価した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のうち、ＳｐＡ６ａ（実施例８）を選択し、ＳｐＡ６ａをコードするポリヌクレオチド部分（配列番号３６）にエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入した。
（１）
　実施例８で作製したランダム変異体ライブラリーから得たＳｐＡ６ａの発現ベクターを鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表２、９、または１０に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲにより変異型の免疫グロブリン結合性タンパク質（ＳｐＡ６ａ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３６）に良好に変異が導入され、その平均変異導入率は、表２の条件（組成）でＰＣＲした場合が１．０３％、表９の条件（組成）でＰＣＲした場合が１．４４％、表１０の条件（組成）でＰＣＲした場合が２．８７％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（２）
　得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化し、予め制限酵素ＮｃｏIとＸｈｏIで消化した発現ベクターｐＥＴ－２８ａにライゲーションした。
（３）
　ライゲーション反応終了後、反応液を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
実施例１１　アルカリ安定化免疫グロブリン結合性タンパク質のスクリーニング（その４）
（１）
　実施例１０で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）約２５００株（表２の条件で得たライブラリーから約１０００株、表９の条件で得たライブラリーから約１０００株、および表１０の条件で得たライブラリーから約５００株）を実施例３（１）から（２）に記載の方法で培養することで免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させた。
（２）
　培養後、遠心操作によって得られた免疫グロブリン結合性タンパク質を含む培養上清を純水で４０倍に希釈した。希釈した溶液を２Ｍ　ＮａＯＨと等量混合し、６５～６８℃で３０分間アルカリ処理を行なった。アルカリ処理後は４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。
（３）
　アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性とアルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。
（４）
　アルカリ処理を行なったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかったときの免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、ＳｐＡ６ａと比較してアルカリ安定性が向上した（残存活性が向上した）免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
（５）
　選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（６）
　得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域のヌクレオチド配列を実施例１（５）に記載の方法により解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
　（４）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質のＳｐＡ６ａ（配列番号３４）に対するアミノ酸置換位置および０．５Ｍ　ＮａＯＨを用いて２５℃、１５時間アルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結果を表１１、表１２、および表１３に示す。配列番号３４に記載のアミノ酸配列において、Ｖａｌ４０Ａｌａ、Ａｓｎ３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ａｓｐ、およびＬｙｓ（Ｇｌｕ）５８Ｖａｌのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じた免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＳｐＡ６ａ（配列番号３４）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
　配列番号３４に記載のアミノ酸配列において、Ｖａｌ４０３４Ａｌａ（この表記は配列番号３４の４０番目のバリンがアラニンに置換されていることを表す、以下同じ）のアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ７ａと命名）のアミノ酸配列を配列番号３７に、Ａｓｎ３３４Ｉｌｅのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ７ｂと命名）のアミノ酸配列を配列番号３８に、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８３４Ａｓｐのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ６ｂと命名）のアミノ酸配列を配列番号３９に、Ｌｙｓ（Ｇｌｕ）５８３４Ｖａｌのアミノ酸置換が生じたタンパク質（ＳｐＡ６ｃと命名）のアミノ酸配列を配列番号４０に、それぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質は、スタフィロコッカス属細菌由来プロテインＡのドメインＣ等のイムノグロブリン結合ドメインの特定位置におけるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を含むタンパク質である。本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質はアルカリに対する安定性が向上しており、抗体（免疫グロブリン）を分離するための吸着剤におけるリガンドタンパク質として有用である。

Claims (15)

  1. 　プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（１）から（８）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、免疫グロブリン結合性タンパク質：
    （１）配列番号１の２番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換
    （２）配列番号１の４９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに置換
    （３）配列番号１の２１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
    （４）配列番号１の５８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸、バリン、グリシン、またはアスパラギン酸に置換
    （５）配列番号１の３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンまたはスレオニンに置換
    （６）配列番号１の１１番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がリジンまたはチロシンに置換
    （７）配列番号１の１５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
    （８）配列番号１の４０番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換。
  2. 　以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に記載のタンパク質である、請求項１に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
    （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有するタンパク質；
    （ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、さらに前記少なくとも１つのアミノ酸置換の位置以外の１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において前記少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質；
    （ｄ）前記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、さらに、以下の（９）から（１３）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、タンパク質：
    （９）配列番号１の２９番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
    （１０）配列番号１の４番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
    （１１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換
    （１２）配列番号１の６番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に置換
    （１３）配列番号１の４２番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換。
  3. 　配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（３－１）および／または（４－１）に示すアミノ酸置換を少なくとも有する、請求項２に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
    （３－１）配列番号１の２１番目のアスパラギンがチロシンに置換
    （４－１）配列番号１の５８番目のリジンがグルタミン酸に置換。
  4. 　配列番号８、９、１３、１５、１７、１９、および２１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質。
  5. 　配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（Ｉ）から（Ｖ）より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項３に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
    （Ｉ）配列番号１７の３番目のアスパラギンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
    （ＩＩ）配列番号１７の１１番目のアスパラギンがリジンまたはチロシンに置換
    （ＩＩＩ）配列番号１７の５８番目のグルタミン酸がバリン、グリシン、またはアスパラギン酸に置換
    （ＩＶ）配列番号１７の１５番目のグルタミン酸がアラニンに置換
    （Ｖ）配列番号１７の４０番目のバリンがアラニンに置換。
  6. 　配列番号２８から３２、３４、３５、および３７から４０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質。
  7. 　配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、以下の（２－１）に示すアミノ酸置換を少なくとも有する、請求項２に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質：
    （２－１）配列番号１の４９番目のリジンがメチオニンに置換。
  8. 　配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質。
  9. 　請求項１から８のいずれか１項に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  10. 　請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  11. 　請求項９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載の発現ベクターを有する形質転換体。
  12. 　エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、請求項１１に記載の形質転換体。
  13. 　請求項１１または１２に記載の形質転換体を培養することにより請求項１から８のいずれか１項に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む、免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法。
  14. 　不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された請求項１から８のいずれか１項に記載の免疫グロブリン結合性タンパク質とを備える、免疫グロブリン吸着剤。
  15. 　請求項１４に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、免疫グロブリンの分離方法。
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