CN118159658A - 免疫球蛋白结合性蛋白质 - Google Patents
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Abstract
提供一种化学稳定性、特别是对碱的稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质或能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质、以及固定有该蛋白质的吸附剂。通过下述发明来解决上述课题：包含源自芬戈尔德菌属细菌的蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，其中将该氨基酸序列中的该结构域中的特定位置的氨基酸残基置换成其它特定氨基酸残基，来提高对碱的稳定性或抗体洗脱特性。
Description
技术领域
本发明涉及与免疫球蛋白特异性结合的蛋白质。一个方式中，本发明涉及对碱的稳定性优异的免疫球蛋白结合性蛋白质。另外，一个方式中，本发明涉及能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质。
背景技术
抗体药物是利用生物体内承担免疫功能的分子、即抗体(免疫球蛋白)的药物。抗体药物根据抗体所具有的可变区的多样性而以高的特异性和亲和性与靶分子结合。因此，抗体药物的副作用少，另外，近年适应症也越来越广泛，市场正在迅速扩大。
抗体药物的制造包括培养工序和纯化工序，在培养工序中，为了提高生产率，正在寻求抗体产生细胞的改造、培养条件的优化。另外，在纯化工序中，采用亲和色谱作为粗纯化，并且经历此后的中间纯化、最终纯化和病毒去除而制剂化。
在纯化工序中，使用特异性识别抗体分子的亲和载体。作为上述载体中使用的配体蛋白，大多使用具有与抗体(免疫球蛋白)结合的性质的、源自葡萄球菌(Staphylococcus)属细菌的蛋白A。但是，蛋白A是与抗体的Fc区特异性结合的蛋白质，因此不能用于纯化单链Fv(scFv)、Fab、F(ab’)2、IgA以及双特异性T细胞诱导(BiTE)抗体之类的不具有Fc区的抗体。另一方面，源自芬戈尔德菌(Finegoldia)属细菌的蛋白L是与免疫球蛋白的κ轻链结合的蛋白质，因此通过将蛋白L作为配体蛋白，还能够纯化上述用蛋白A无法纯化的不具有Fc区的抗体。
在制造抗体药物时，为了保证其生产成本较低，亲和载体会被使用多次，并且在使用后进行去除残留于该载体的杂质的工序。上述去除杂质的工序中，通常进行使用氢氧化钠的原位清洗(Cleaning in Place)而使亲和载体再生。因此，上述配体蛋白需要具有即使进行上述再生工序也能维持对抗体的结合性这样的化学稳定性(特别是碱稳定性)。
作为碱稳定性提高的蛋白L的例子，可列举：
专利文献1记载的将特定位置的天冬酰胺置换为谷氨酰胺而形成的蛋白L；
专利文献2记载的包括如下的缺失和/或置换的蛋白L：使包含脯氨酸的N末端侧氨基酸残基的一部分发生缺失、和/或将容易因为碱而水解的天冬酰胺与甘氨酸的连续部位置换为其它氨基酸；
专利文献3记载的将赖氨酸置换为除了赖氨酸以外的碱性氨基酸或具有羟基的氨基酸而形成的蛋白L；
专利文献4记载的利用了不含天冬酰胺与甘氨酸的连续部位的结构域的蛋白L。
但是，使用这些文献中公开的蛋白L作为配体蛋白时，需要用20mM至50mM的氢氧化钠水溶液来进行碱清洗(非专利文献1)，碱稳定性对于用于工艺规模的纯化而言并不充分。
另外，在抗体药物的纯化工序中，包括在中性pH条件下使抗体分子吸附于亲和载体后、在酸性pH条件下使抗体分子从上述载体洗脱的工序，但是该酸性pH条件会对抗体分子造成损伤、成为发生聚集的原因，因此洗脱时的pH优选为高(即，接近中性)。
作为提高抗体洗脱pH的方法，已知有下述方法：将具有柔性的氨基酸残基的寡肽插入到免疫球蛋白结合性蛋白质的方法(非专利文献2)；将免疫球蛋白结合性蛋白质中的特定氨基酸残基置换为组氨酸残基的方法(专利文献5)。但是，有报道指出这些文献中记载的方法会使免疫球蛋白结合性蛋白质的化学稳定性降低。因此，正在寻求不会使化学稳定性降低且抗体洗脱pH高(即，能够在温和的pH条件下洗脱抗体)的免疫球蛋白结合性蛋白质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2016/096643号
专利文献2：WO2017/191748号
专利文献3：WO2017/069158号
专利文献4：日本特开2016-079149号公报
专利文献5：WO2019/059400号
非专利文献
非专利文献1：Rodrigo G.et.al.，Antibodies，2015，4，259-277
非专利文献2：Susanne Gulich等，Journal of Biotechnology，2000，76，233-244
发明内容
发明要解决的问题
在一个方式中，本发明的课题在于，提供化学稳定性、特别是对碱的稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质和固定有该蛋白质的吸附剂。另外，在一个方式中，本发明的课题在于，提供能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质和固定有该蛋白质的吸附剂。
用于解决问题的方案
本发明人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过鉴定源自芬戈尔德菌属细菌的蛋白L(FpL)的免疫球蛋白结合结构域中的与稳定性提高或抗体洗脱特性相关的氨基酸残基、并且将该氨基酸残基置换为其它特定氨基酸残基而能够解决上述课题，从而完成了本发明。
即，一个方式中，本发明包括以下的方式。
[1]一种蛋白质，其包含源自芬戈尔德菌属细菌的蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自以下的(1)至(53)中的1个以上氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性，
(1)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(2)与序列号1的第1位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或缬氨酸
(3)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(4)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或甘氨酸
(5)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(6)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(7)与序列号1的第8位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸
(8)与序列号1的第9位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(9)与序列号1的第17位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(10)与序列号1的第21位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(11)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或精氨酸
(12)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(13)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(14)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(15)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(16)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或甘氨酸
(17)与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或异亮氨酸
(18)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸、赖氨酸和天冬氨酸中的任一种
(19)与序列号1的第51位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(20)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、甘氨酸和天冬氨酸中的任一种
(21)与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(22)与序列号1的第54位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或甲硫氨酸
(23)与序列号1的第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸、精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和色氨酸中的任一种
(24)与序列号1的第65位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(25)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(26)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或脯氨酸
(27)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(28)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或精氨酸
(29)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、赖氨酸和异亮氨酸中的任一种
(30)与序列号1的第32位的苯丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(31)与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(32)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸、
(33)与序列号1的第47位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或精氨酸
(34)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬酰胺
(35)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(36)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸
(37)与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或苏氨酸
(38)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(39)与序列号1的第14位的缬氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(40)与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸或缬氨酸
(41)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(42)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为甲硫氨酸
(43)与序列号1的第33位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的任一种
(44)与序列号1的第35位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(45)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(46)与序列号1的第37位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(47)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或酪氨酸
(48)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸或精氨酸
(49)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或酪氨酸
(50)与序列号1的第60位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(51)与序列号1的第64位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(52)与序列号1的第66位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(53)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或缬氨酸。
[2]根据[1]所述的蛋白质，其为以下的(a)至(c)中的任一者所述的蛋白质，
(a)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自以下的(1)至(53)中的1个以上氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性，
(1)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(2)与序列号1的第1位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或缬氨酸
(3)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(4)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或甘氨酸
(5)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(6)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(7)与序列号1的第8位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸
(8)与序列号1的第9位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(9)与序列号1的第17位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(10)与序列号1的第21位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(11)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或精氨酸
(12)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(13)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(14)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(15)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(16)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或甘氨酸
(17)与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或异亮氨酸
(18)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸、赖氨酸和天冬氨酸中的任一种
(19)与序列号1的第51位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(20)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、甘氨酸和天冬氨酸中的任一种
(21)与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(22)与序列号1的第54位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或甲硫氨酸
(23)与序列号1的第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸、精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和色氨酸中的任一种
(24)与序列号1的第65位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(25)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(26)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或脯氨酸
(27)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(28)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或精氨酸
(29)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、赖氨酸和异亮氨酸中的任一种
(30)与序列号1的第32位的苯丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(31)与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(32)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸、
(33)与序列号1的第47位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或精氨酸
(34)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬酰胺
(35)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
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(37)与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或苏氨酸
(38)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(39)与序列号1的第14位的缬氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(40)与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸或缬氨酸
(41)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(42)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为甲硫氨酸
(43)与序列号1的第33位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的任一种
(44)与序列号1的第35位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(45)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(46)与序列号1的第37位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(47)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或酪氨酸
(48)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸或精氨酸
(49)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或酪氨酸
(50)与序列号1的第60位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(51)与序列号1的第64位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(52)与序列号1的第66位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(53)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或缬氨酸；
(b)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自上述(1)至(53)中的1个以上氨基酸置换，进而除了上述(1)至(53)以外还包含1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性；
(c)蛋白质，其包含与序列号1或18记载的氨基酸序列或其部分序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自上述(1)至(53)中的1个以上氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性。
[3]根据[1]或[2]所述的蛋白质，其为以下的(d)至(f)中的任一者所述的蛋白质，
(d)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有以下的(1)的氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性，
(1)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸；
(e)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有上述(1)的氨基酸置换，进而包含除了上述氨基酸置换以外的1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性；
(f)蛋白质，其包含与序列号1或18记载的氨基酸序列或其部分序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列，其中至少具有上述(1)的氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的蛋白质，其中，进而至少具有选自以下的(54)至(64)中的1个以上氨基酸置换，
(54)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为谷氨酰胺
(55)与序列号1的第13位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(56)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸或异亮氨酸
(57)与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(58)与序列号1的第8位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(59)与序列号1的第15位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(60)与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸或亮氨酸
(61)与序列号1的第34位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸中的任一种
(62)与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(63)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为甲硫氨酸
(64)与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的蛋白质，其中，进而至少具有选自以下的(I)至(VII)中的1个以上赖氨酸残基被置换为除了赖氨酸以外的碱性氨基酸或具有羟基的氨基酸残基：
(I)与序列号1的第7位相当的赖氨酸残基
(II)与序列号1的第13位相当的赖氨酸残基
(III)与序列号1的第22位相当的赖氨酸残基
(IV)与序列号1的第29位相当的赖氨酸残基
(V)与序列号1的第38位相当的赖氨酸残基
(VI)与序列号1的第48位相当的赖氨酸残基
(VII)与序列号1的第67位相当的赖氨酸残基。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的蛋白质，其中，进而具有选自下述中的1个以上氨基酸置换：与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换、与序列号1的第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第23位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、和与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的蛋白质，其至少具有以下的(W)、(X)、(Y)、(Z)、(AA)、(AB)、(AC)、(AD)和(AE)中的任意氨基酸置换：
(W)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第22位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酰胺的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、以及与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换；
(X)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、以及与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换；
(Y)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、以及与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换；
(Z)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、以及与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换；
(AA)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、以及与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换；
(AB)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换、与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换、以及与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换；
(AC)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换以及与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换；
(AD)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换以及与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换；
(AE)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第48位的赖氨酸相当的氨基酸残基向组氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换、与序列号1的第64位的异亮氨酸相当的氨基酸残基向亮氨酸的置换以及与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的蛋白质，其包含序列号179、186、199、224、240、271、275、408和413中的任一者记载的氨基酸序列。
[9]一种具有免疫球蛋白结合活性的蛋白质的制造方法，其包括下述工序：培养包含编码[1]至[8]中任一项所述的蛋白质的多核苷酸的基因重组宿主或包含含有该多核苷酸的表达载体的基因重组宿主并使其表达该蛋白质的工序；和，回收所表达的上述蛋白质的工序。
[10]根据[9]所述的制造方法，其中，宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)。
[11]一种填充有免疫球蛋白吸附剂的柱，其中，上述免疫球蛋白吸附剂包含不溶性载体和固定于该不溶性载体的[1]至[8]中任一项所述的蛋白质。
[12]一种包含在溶液中的免疫球蛋白的分离方法，其包括下述工序：向[11]所述的柱中添加包含免疫球蛋白的溶液，使该免疫球蛋白吸附于上述柱中所填充的免疫球蛋白吸附剂的工序；和，对吸附于上述免疫球蛋白吸附剂的免疫球蛋白进行洗脱的工序。
另外，在一个方式中，本发明包括以下方式。
[A1]一种蛋白质，其包含源自芬戈尔德菌属细菌的蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自以下的(1)至(53)中的1个以上氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性，
(1)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(2)与序列号1的第1位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或缬氨酸
(3)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(4)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或甘氨酸
(5)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(6)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(7)与序列号1的第8位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸
(8)与序列号1的第9位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(9)与序列号1的第17位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(10)与序列号1的第21位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(11)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或精氨酸
(12)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(13)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(14)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(15)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(16)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或甘氨酸
(17)与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或异亮氨酸
(18)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸、赖氨酸和天冬氨酸中的任一种
(19)与序列号1的第51位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(20)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、甘氨酸和天冬氨酸中的任一种
(21)与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(22)与序列号1的第54位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或甲硫氨酸
(23)与序列号1的第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸、精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和色氨酸中的任一种
(24)与序列号1的第65位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(25)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(26)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或脯氨酸
(27)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(28)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或精氨酸
(29)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、赖氨酸和异亮氨酸中的任一种
(30)与序列号1的第32位的苯丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(31)与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(32)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸、
(33)与序列号1的第47位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或精氨酸
(34)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬酰胺
(35)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(36)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸
(37)与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或苏氨酸
(38)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(39)与序列号1的第14位的缬氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(40)与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸或缬氨酸
(41)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(42)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为甲硫氨酸
(43)与序列号1的第33位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的任一种
(44)与序列号1的第35位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(45)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(46)与序列号1的第37位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(47)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或酪氨酸
(48)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸或精氨酸
(49)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或酪氨酸
(50)与序列号1的第60位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(51)与序列号1的第64位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(52)与序列号1的第66位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(53)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或缬氨酸。
[A2]根据[A1]所述的蛋白质，其为以下的(a)至(c)中的任一者所述的蛋白质，
(a)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自以下的(1)至(53)中的1个以上氨基酸置，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性，
(1)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(2)与序列号1的第1位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或缬氨酸
(3)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(4)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或甘氨酸
(5)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(6)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(7)与序列号1的第8位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸
(8)与序列号1的第9位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(9)与序列号1的第17位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(10)与序列号1的第21位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(11)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或精氨酸
(12)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(13)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(14)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(15)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(16)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或甘氨酸
(17)与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或异亮氨酸
(18)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸、赖氨酸和天冬氨酸中的任一种
(19)与序列号1的第51位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(20)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、甘氨酸和天冬氨酸中的任一种
(21)与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(22)与序列号1的第54位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或甲硫氨酸
(23)与序列号1的第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸、精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和色氨酸中的任一种
(24)与序列号1的第65位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(25)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(26)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或脯氨酸
(27)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(28)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或精氨酸
(29)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、赖氨酸和异亮氨酸中的任一种
(30)与序列号1的第32位的苯丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(31)与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(32)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸、
(33)与序列号1的第47位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或精氨酸
(34)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬酰胺
(35)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(36)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸
(37)与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或苏氨酸
(38)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(39)与序列号1的第14位的缬氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(40)与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸或缬氨酸
(41)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(42)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为甲硫氨酸
(43)与序列号1的第33位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的任一种
(44)与序列号1的第35位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(45)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(46)与序列号1的第37位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(47)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或酪氨酸
(48)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸或精氨酸
(49)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或酪氨酸
(50)与序列号1的第60位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(51)与序列号1的第64位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(52)与序列号1的第66位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(53)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或缬氨酸；
(b)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自上述(1)至(53)中的1个以上氨基酸置换，进而除了上述(1)至(53)以外还包含1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性；
(c)蛋白质，其包含与序列号1或18记载的氨基酸序列或其部分序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自上述(1)至(53)中的1个以上氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性。
[A3]根据[A1]或[A2]所述的蛋白质，其为以下的(d)至(f)中任一者所述的蛋白质，
(d)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有以下的(1)的氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性，
(1)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸；
(e)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有上述(1)的氨基酸置换，进而包含除了上述氨基酸置换以外的1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性；
(f)蛋白质，其包含与序列号1或18记载的氨基酸序列或其部分序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列，其中至少具有上述(1)的氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性。
[A4]根据[A1]至[A3]中任一项所述的蛋白质，其中，进而至少选自以下的(I)至(VII)中的1个以上赖氨酸残基被置换为除了赖氨酸以外的碱性氨基酸或具有羟基的氨基酸残基：
(I)与序列号1的第7位相当的赖氨酸残基
(II)与序列号1的第13位相当的赖氨酸残基
(III)与序列号1的第22位相当的赖氨酸残基
(IV)与序列号1的第29位相当的赖氨酸残基
(V)与序列号1的第38位相当的赖氨酸残基
(VI)与序列号1的第48位相当的赖氨酸残基
(VII)与序列号1的第67位相当的赖氨酸残基。
[A5]根据[A1]至[A4]中任一项所述的蛋白质，其中，进而具有选自下述中的1个以上氨基酸置换：与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换、与序列号1的第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第23位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、和与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换。
[A6]根据[A1]至[A5]中任一项所述的蛋白质，其至少具有以下的(W)、(X)、(Y)、(Z)、(AA)、(AB)和(AC)中的任意种氨基酸置换，
(W)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第22位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酰胺的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、以及与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换；
(X)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、以及与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换；
(Y)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、以及与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换；
(Z)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、以及与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换；
(AA)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、以及与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换；
(AB)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换、与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换以及与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换；
(AC)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换以及与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换。
[A7]根据[A1]至[A6]中任一项所述的蛋白质，其包含序列号179、186、199、224、240、271和275中任一者记载的氨基酸序列。
[A8]一种多核苷酸，其编码[A1]至[A7]中任一项所述的蛋白质。
[A9]一种表达载体，其包含[A8]所述的多核苷酸。
[A10]一种基因重组宿主，其包含以下的(A)或(B)，
(A)编码[A1]至[A7]中任一项所述的蛋白质的多核苷酸；
(B)包含编码[A1]至[A7]中任一项所述的蛋白质的多核苷酸的表达载体。
[A11]根据[A10]所述的基因重组宿主，其中，宿主为大肠杆菌(Escherichiacoli)。
[A12]一种具有免疫球蛋白结合活性的蛋白质的制造方法，其包括下述工序：培养包含编码[A1]至[A7]中任一项所述的蛋白质的多核苷酸的基因重组宿主或包含含有该多核苷酸的表达载体的基因重组宿主并使其表达该蛋白质的工序；和，回收所表达的上述蛋白质的工序。
[A13]根据[A12]所述的制造方法，其中，宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)。
[A14]一种免疫球蛋白吸附剂，其包含不溶性载体和固定于该不溶性载体的[A1]至[A7]中任一项所述的蛋白质。
[A15]一种包含在溶液中的免疫球蛋白的分离方法，其包括下述工序：向填充有[A13]所述的吸附剂的柱中添加包含免疫球蛋白的溶液并使该免疫球蛋白吸附于上述吸附剂的工序；和，对吸附于上述吸附剂的免疫球蛋白进行洗脱的工序。
另外，在一个方式中，本发明包括以下方式：
[B1]一种蛋白质，其包含源自芬戈尔德菌属细菌的蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自以下的(54)至(64)中的1个以上氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性，
(54)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为谷氨酰胺
(55)与序列号1的第13位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(56)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸或异亮氨酸
(57)与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(58)与序列号1的第8位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(59)与序列号1的第15位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(60)与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸或亮氨酸
(61)与序列号1的第34位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸中的任一种
(62)与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(63)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为甲硫氨酸
(64)与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸。
[B2]根据[B1]所述的蛋白质，其为以下的(a)至(c)中的任一者所述的蛋白质，
(a)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自上述(54)至(64)中的1个以上氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性；
(b)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自上述(54)至(64)中的1个以上氨基酸置换，进而除了上述(54)至(64)以外还包含1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性；
(c)蛋白质，其包含与序列号1或18记载的氨基酸序列或其部分序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自上述(54)至(64)中的1个以上氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性。
[B3]根据[B1]或[B2]所述的蛋白质，其中，进而至少具有选自以下的(1)至(63)中的1个以上氨基酸置换，
(1)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(2)与序列号1的第1位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或缬氨酸
(3)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(4)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或甘氨酸
(5)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(6)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(7)与序列号1的第8位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸
(8)与序列号1的第9位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(9)与序列号1的第17位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(10)与序列号1的第21位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(11)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或精氨酸
(12)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(13)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(14)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(15)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(16)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或甘氨酸
(17)与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或异亮氨酸
(18)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸、赖氨酸和天冬氨酸中的任一种
(19)与序列号1的第51位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(20)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、甘氨酸和天冬氨酸中的任一种
(21)与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(22)与序列号1的第54位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或甲硫氨酸
(23)与序列号1的第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸、精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和色氨酸中的任一种
(24)与序列号1的第65位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(25)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(26)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或脯氨酸
(27)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(28)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或精氨酸
(29)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、赖氨酸和异亮氨酸中的任一种
(30)与序列号1的第32位的苯丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(31)与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(32)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸、
(33)与序列号1的第47位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或精氨酸
(34)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬酰胺
(35)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(36)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸
(37)与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或苏氨酸
(38)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(39)与序列号1的第14位的缬氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(40)与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸或缬氨酸
(41)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(42)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为甲硫氨酸
(43)与序列号1的第33位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的任一种
(44)与序列号1的第35位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(45)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(46)与序列号1的第37位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(47)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或酪氨酸
(48)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸或精氨酸
(49)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或酪氨酸
(50)与序列号1的第60位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(51)与序列号1的第64位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(52)与序列号1的第66位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(53)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或缬氨酸。
[B4]根据[B1]至[B3]中任一项所述的蛋白质，其中，进而，至少选自以下的(I)至(VII)中的1个以上赖氨酸残基被置换为除了赖氨酸以外的碱性氨基酸或具有羟基的氨基酸残基：
(I)与序列号1的第7位相当的赖氨酸残基
(II)与序列号1的第13位相当的赖氨酸残基
(III)与序列号1的第22位相当的赖氨酸残基
(IV)与序列号1的第29位相当的赖氨酸残基
(V)与序列号1的第38位相当的赖氨酸残基
(VI)与序列号1的第48位相当的赖氨酸残基
(VII)与序列号1的第67位相当的赖氨酸残基。
[B5]根据[B1]至[B4]中任一项所述的蛋白质，其中，进而具有选自下述中的1个以上氨基酸置换：与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换、与序列号1的第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第23位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换和与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换。
[B6]根据[B1]至[B5]中任一项所述的蛋白质，其至少具有以下的(X)或(Y)的氨基酸置换，
(X)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换以及与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换；
(Y)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第48位的赖氨酸相当的氨基酸残基向组氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换、与序列号1的第64位的异亮氨酸相当的氨基酸残基向亮氨酸的置换以及与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换。
[B7]根据[B1]至[B6]中任一项所述的蛋白质，其包含序列号408或413记载的氨基酸序列。
[B8]一种多核苷酸，其编码[B1]至[B7]中任一项所述的蛋白质。
[B9]一种表达载体，其包含[B8]所述的多核苷酸。
[B10]一种基因重组宿主，其包含以下的(A)或(B)，
(A)编码[B1]至[B7]中任一项所述的蛋白质的多核苷酸；
(B)包含编码[B1]至[B7]中任一项所述的蛋白质的多核苷酸的表达载体。
[B11]根据[B10]所述的基因重组宿主，其中，宿主为大肠杆菌(Escherichiacoli)。
[B12]一种免疫球蛋白结合性蛋白质的制造方法，其包括下述工序：培养包含编码[B1]至[B7]中任一项所述的蛋白质的多核苷酸的基因重组宿主或包含含有该多核苷酸的表达载体的基因重组宿主并使其表达该蛋白质的工序；和，回收所表达的上述蛋白质的工序。
[B13]根据[B12]所述的制造方法，其中，宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)。
[B14]一种免疫球蛋白吸附剂，其包含不溶性载体和固定于该不溶性载体的[B1]至[B7]中任一项所述的蛋白质。
[B15]一种包含在溶液中的免疫球蛋白的分离方法，其包括下述工序：向填充有[B14]所述的吸附剂的柱中添加包含免疫球蛋白的溶液并使该免疫球蛋白吸附于上述吸附剂的工序；和，通过pH变化对吸附于上述吸附剂的免疫球蛋白进行洗脱的工序。
[B16]根据[B15]所述的方法，其中，上述pH变化为pH降低。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
本发明的蛋白质为特定的免疫球蛋白结合性蛋白质。本说明书中，“免疫球蛋白结合性蛋白质”是指对免疫球蛋白具有结合性的蛋白质。即，本发明的蛋白质对特定免疫球蛋白具有结合性。本发明的蛋白质具体而言可以为对免疫球蛋白的κ轻链具有结合性的蛋白质。本说明书中，也将对免疫球蛋白的结合性称为“免疫球蛋白结合活性”或“抗体结合活性”。免疫球蛋白结合活性例如可以通过ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，酶联免疫吸附测定)法来测定。ELISA法例如可以通过实施例记载的条件来实施。
本发明的蛋白质为包含源自芬戈尔德菌属细菌的蛋白L(也称为“FpL”)的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列、其中在该氨基酸序列中具有特定位置处的氨基酸置换的蛋白质。以下，在本说明书中，将作为FpL的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列、并且不具有特定位置处的氨基酸置换的氨基酸序列也称为“非改变型氨基酸序列”，将作为FpL的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列、并且具有特定位置处的氨基酸置换的氨基酸序列也称为“改变型氨基酸序列”。即，改变型氨基酸序列可以是除了具有特定位置处的氨基酸置换以外与非改变型氨基酸序列相同的氨基酸序列。另外，本发明的蛋白质例如可以是包含除了具有特定位置处的氨基酸置换以外与非改变型氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白质。另外，本发明的蛋白质例如可以是包含改变型氨基酸序列的蛋白质。非改变型氨基酸序列可以是天然存在的氨基酸序列，也可以并非如此。非改变型氨基酸序列例如可以以具有期望性质的方式进行了改变。非改变型氨基酸序列例如可以具有除了特定位置处的氨基酸置换以外的氨基酸置换。
关于作为FpL的来源的芬戈尔德菌属细菌，可列举大芬戈尔德菌(Finegoldiamagna)。作为源自大芬戈尔德菌的蛋白L的免疫球蛋白结合结构域，可列举：
结构域B1(序列号209(GenBank No.AAA25612)的第104位至第173位的氨基酸残基)、
结构域B2(序列号209的第176位至第245位的氨基酸残基)、
结构域B3(序列号209的第248位至第317位的氨基酸残基)、
结构域B4(序列号209的第320位至第389位的氨基酸残基)、
结构域B5(序列号209的第393位至第462位的氨基酸残基)、
结构域C1(序列号210(GenBank No.AAA67503)的第249位至第317位的氨基酸残基：序列号112)、
结构域C2(序列号210的第320位至第389位的氨基酸残基：序列号113)、
结构域C3(序列号210的第394位至第463位的氨基酸残基：序列号1)、和
结构域C4(序列号210的第468位至第537位的氨基酸残基：序列号18)。
本说明书中，关于非改变型氨基酸序列，
(i)可以为上述的FpL的免疫球蛋白结合结构域的全部氨基酸序列，
(ii)只要具有对免疫球蛋白的结合活性则也可以为上述结构域的部分氨基酸序列。
需要说明的是，关于上述(ii)，FpL的免疫球蛋白结合结构域由四个β片层和一个α螺旋、将它们连接的环部和N末端环区域构成，但是，N末端环区域等与对免疫球蛋白的结合无关的区域的氨基酸残基也可以缺损。作为具体例，已知FpL的结构域C3(序列号1)的与N末端环区域相当的第1位的谷氨酸至第9位的谷氨酸的氨基酸残基即使缺损，也具有免疫球蛋白结合能力(Housden N.G.et.al.Biochemical Society Transaction，2003，31，716-718)。即，可以说，上述(ii)中的部分氨基酸序列只要至少包含了对免疫球蛋白的结合部位的氨基酸序列即可。即，作为上述(ii)中的部分氨基酸序列，可列举包含对免疫球蛋白的结合部位的氨基酸序列的部分序列。
作为本说明书中的改变型氨基酸序列，具体而言，可列举在序列号1记载的氨基酸序列等上述免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列中在特定位置处具有氨基酸置换的氨基酸序列。即，作为本发明的蛋白质，具体而言，可列举如下的蛋白质，即，其包含序列号1记载的氨基酸序列等上述免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中在特定位置处具有氨基酸置换。换言之，本发明的蛋白质例如可以为包含下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列为除了具有特定位置处的氨基酸置换以外与序列号1记载的氨基酸序列等上述免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
本说明书中，也将蛋白质包含氨基酸序列称为“蛋白质包含由氨基酸序列构成的氨基酸残基”，也将蛋白质或氨基酸序列具有氨基酸置换称为“蛋白质或氨基酸序列中发生氨基酸置换”。另外，也将构成蛋白质或氨基酸序列的氨基酸称为“氨基酸残基”。
在一个方式中，本发明的蛋白质可以为碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质。本发明的蛋白质具体而言可以为相较于不具有改变型氨基酸序列(例如由非改变型氨基酸序列构成)的免疫球蛋白结合性蛋白质而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质。本发明的蛋白质具体而言可以为相较于不具有上述特定位置处的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质。换言之，本发明的蛋白质可以为通过具有上述特定位置处的氨基酸置换、从而碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质。另外，换言之，上述特定位置处的氨基酸置换可以为能提高免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性的氨基酸置换。
“碱稳定性”可以是指对碱条件下的失活的抗性。碱稳定性提高例如可以作为碱处理后残留活性提高来进行测定。这里所称的“活性”是指免疫球蛋白结合活性。碱处理例如可以通过实施例记载的条件来实施。
在一个方式中，本发明的蛋白质可以是能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质。本发明的蛋白质具体而言可以是相较于不具有改变型氨基酸序列(例如由非改变型氨基酸序列构成)的免疫球蛋白结合性蛋白质而言能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质。本发明的蛋白质具体而言可以是相较于不具有上述特定位置处的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质而言能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质。换言之，本发明的蛋白质可以是通过具有上述特定位置处的氨基酸置换、从而能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质。另外，换言之，上述特定位置处的氨基酸置换可以是能实现以温和的pH条件从免疫球蛋白结合性蛋白质洗脱抗体的氨基酸置换。
“温和的pH条件”可以是指接近中性的pH条件。即，“能够以温和的条件洗脱抗体”可以是指能够以接近中性的pH条件洗脱抗体。另外，典型的抗体的洗脱pH可以是酸性，因此“能够以温和的条件洗脱抗体”可以是指抗体的洗脱pH升高。抗体的洗脱pH例如可以通过实施例记载的条件来测定。
在一个方式中，本发明的蛋白质可以是碱稳定性提高、并且能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质。
上述特定位置处的氨基酸置换包括第1组变异和/或第2组变异。上述特定位置处的氨基酸置换可以仅包含第1组变异和第2组变异中的第1组变异，可以仅包含第2组变异，也可以包含第1组变异和第2组变异这两者。上述特定位置处的氨基酸置换可以至少包含第1组变异，可以还包含第2组变异。上述特定位置处的氨基酸置换可以至少包含第2组变异，可以还包含第1组变异。
第1组变异可以是能提高免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性的变异。因此，上述特定位置处的氨基酸置换包含第1组变异的情况下，上述特定位置处的氨基酸置换可以是能提高免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性的变异。例如本发明的蛋白质为碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质时，上述特定位置处的氨基酸置换可以包含第1组变异。例如本发明的蛋白质为碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质时，上述特定位置处的氨基酸置换可以至少包含第1组变异，可以还包含第2组变异。另外，至少具有第1组变异的本发明的蛋白质可以是碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质。
第2组变异可以是能实现以温和的pH条件从免疫球蛋白结合性蛋白质洗脱抗体的变异。因此，上述特定位置处的氨基酸置换包含第2组变异时，上述特定位置处的氨基酸置换可以是能实现以温和的pH条件从免疫球蛋白结合性蛋白质洗脱抗体的变异。例如本发明的蛋白质为能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质时，上述特定位置处的氨基酸置换可以包含第2组变异。例如本发明的蛋白质为能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质时，上述特定位置处的氨基酸置换可以至少包含第2组变异，可以还包含第1组变异。另外，至少具有第2组变异的本发明的蛋白质可以为能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质。
上述特定位置处的氨基酸置换包含第1组变异和第2组变异这两者的情况下，上述特定位置处的氨基酸置换可以是能提高免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性、并且能实现以温和的pH条件从免疫球蛋白结合性蛋白质洗脱抗体的变异。另外，具有第1组变异和第2组变异这两者的本发明的蛋白质可以为碱稳定性提高、并且能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质。
第1组变异具体而言为选自Asn50Tyr(该记载表示与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基被置换为酪氨酸；以下的其它氨基酸置换也同样解释)、Glu1Gly、Glu1Val、Pro3Ser、Glu4Lys、Glu4Gly、Glu5Val、Lys7Ala、Glu8Gly、Glu9Val、Ile17Phe、Gly21Arg、Glu27Gly、Glu27Arg、Lys29Pro、Thr31Leu、Thr36Ala、Ala41Thr、Asn44Ser、Asn44Gly、Glu49Thr、Glu49Ile、Asn50Ser、Asn50Lys、Asn50Asp、Gly51Val、Glu52Val、Glu52Gly、Glu52Asp、Tyr53Phe、Thr54Ile、Thr54Met、Asn62His、Asn62Arg、Asn62Leu、Asn62Met、Asn62Trp、Asn65Tyr、Ala69Thr、Thr2Ser、Thr2Pro、Pro3Arg、Glu5Lys、Glu5Arg、Glu27Val、Glu27Lys、Glu27Ile、Phe32Leu、Lys38Ala、Asn44Ile、Ala47Thr、Ala47Arg、Glu52Asn、Thr2Ala、Glu5Asp、Pro6Leu、Pro6Thr、Lys7Pro、Val14Ala、Ile23Arg、Ile23Val、Lys29Phe、Thr31Met、Glu33Asp、Glu33Gly、Glu33Val、Ala35Thr、Thr36Ser、Ala37Thr、Ala41Ile、Ala41Tyr、Asn44His、Asn44Arg、Glu52Leu、Glu52Tyr、Gly60Arg、Ile64Leu、Ile66Val、Ala69Leu、Ala69Val中的至少1个以上氨基酸置换。
换言之，第1组变异为选自下述中的1个以上氨基酸置换：
(1)Asn50Tyr
(2)Glu1Gly或Glu1Val
(3)Pro3Ser
(4)Glu4Lys或Glu4Gly
(5)Glu5Val
(6)Lys7Ala
(7)Glu8Gly
(8)Glu9Val
(9)Ile17Phe
(10)Gly21Arg
(11)Glu27Gly或Glu27Arg
(12)Lys29Pro
(13)Thr31Leu
(14)Thr36Ala
(15)Ala41Thr
(16)Asn44Ser或Asn44Gly
(17)Glu49Thr或Glu49Ile
(18)Asn50Ser、Asn50Lys和Asn50Asp中的任意者
(19)Gly51Val
(20)Glu52Val、Glu52Gly和Glu52Asp中的任意者
(21)Tyr53Phe
(22)Thr54Ile或Thr54Met
(23)Asn62His、Asn62Arg、Asn62Leu、Asn62Met和Asn62Trp中的任意者
(24)Asn65Tyr
(25)Ala69Thr
(26)Thr2Ser或Thr2Pro
(27)Pro3Arg
(28)Glu5Lys或Glu5Arg
(29)Glu27Val、Glu27Lys和Glu27Ile中的任意者
(30)Phe32Leu
(31)Lys38Ala
(32)Asn44Ile
(33)Ala47Thr和Ala47Arg
(34)Glu52Asn
(35)Thr2Ala
(36)Glu5Asp
(37)Pro6Leu或Pro6Thr
(38)Lys7Pro
(39)Val14Ala
(40)Ile23Arg或Ile23Val
(41)Lys29Phe
(42)Thr31Met
(43)Glu33Asp、Glu33Gly和Glu33Val中的任意者
(44)Ala35Thr
(45)Thr36Ser
(46)Ala37Thr
(47)Ala41Ile或Ala41Tyr
(48)Asn44His或Asn44Arg
(49)Glu52Leu或Glu52Tyr
(50)Gly60Arg
(51)Ile64Leu
(52)Ile66Val
(53)Ala69Leu或Ala69Val。
即，本发明的蛋白质可以具有选自上述(1)至(53)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换。本发明的蛋白质例如可以具有选自上述(1)至(53)的氨基酸置换中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸置换，也可以具有选自上述(1)至(53)的氨基酸置换中的10个以上氨基酸置换。其中，(1)的氨基酸置换(Asn50Tyr)是特别能提高对碱的稳定性的氨基酸置换。因此，至少具有(1)的氨基酸置换(Asn50Tyr)的免疫球蛋白结合性蛋白质为本发明的蛋白质的优选例。即，本发明的蛋白质例如可以至少具有(1)的氨基酸置换(Asn50Tyr)。本发明的蛋白质具体而言例如可以仅具有(1)至(53)的氨基酸置换中的(1)的氨基酸置换(Asn50Tyr)，可以具有(1)的氨基酸置换(Asn50Tyr)与选自由(2)至(53)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换的组合。另外，上述特定位置处的氨基酸置换例如可以包含选自上述(1)至(53)的氨基酸置换中的1个以上(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上)氨基酸置换。
第2组变异具体而言为选自Lys7Gln、Lys13Val、Lys29Val、Lys29Ile、Pro6Ala、Glu8Arg、Asn15Val、Ile23Phe、Ile23Leu、Glu34Asp、Glu34Phe、Glu34Leu、Glu34Val、Lys38Leu、Asn50Met和Tyr53Ser中的至少1个以上氨基酸置换。
换言之，第2组变异为选自下述中的1个以上氨基酸变异：
(54)Lys7Gln
(55)Lys13Val
(56)Lys29Val或Lys29Ile
(57)Pro6Ala
(58)Glu8Arg
(59)Asn15Val
(60)Ile23Phe或Ile23Leu
(61)Glu34Asp、Glu34Phe、Glu34Leu和Glu34Val中的任意者
(62)Lys38Leu
(63)Asn50Met
(64)Tyr53Ser。
即，本发明的蛋白质可以具有选自上述(54)至(64)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换。本发明的蛋白质例如可以具有选自上述(54)至(64)的氨基酸置换中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸置换，可以具有选自上述(54)至(64)的氨基酸置换中的10个以上氨基酸置换。另外，上述特定位置处的氨基酸置换例如可以包含选自上述(54)至(64)的氨基酸置换中的1个以上(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上)氨基酸置换。
换言之，本发明的蛋白质具有选自上述(1)至(64)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换。本发明的蛋白质具体而言具有选自上述(1)至(53)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换和/或选自上述(54)至(64)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换。本发明的蛋白质例如可以具有选自上述(1)至(53)的氨基酸置换中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上氨基酸置换和/或选自上述(54)至(64)的氨基酸置换中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上氨基酸置换。本发明的蛋白质例如可以至少具有上述(1)的氨基酸置换(Asn50Tyr)与选自上述(54)至(64)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换的组合。至少具有(1)的氨基酸置换(Asn50Tyr)与选自(2)至(53)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换的组合的本发明的蛋白质可以为碱稳定性提高、并且能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质的优选例。
需要说明的是，上述(1)至(64)的氨基酸置换中的同一位置的氨基酸置换不可同时选择。例如，(3)的氨基酸置换和(27)的氨基酸置换不可同时选择。
本发明的蛋白质具有2个或多于2个的氨基酸置换时，这些氨基酸置换的组合只要包含第1组变异和/或第2组变异则没有特别限制。
作为选自上述(1)至(53)的氨基酸置换的氨基酸置换的组合(也称为“第1组变异的组合”)的一个方式，可列举：
Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换；
Ile17Phe和Asn50Ser的氨基酸置换；
Glu8Gly和Glu52Val的氨基酸置换；
Glu27Gly、Ala41Thr、Asn50Lys和Asn65Tyr的氨基酸置换；
Pro3Ser、Asn50Asp和Thr54Ile的氨基酸置换；
Asn44Ser、Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换；
Asn44Ser和Asn50Tyr的氨基酸置换；
Asn50Tyr和Glu52Val的氨基酸置换；
Asn44Gly、Asn50Tyr和Glu52Val的氨基酸置换；
Asn44Gly、Asn50Ser和Glu52Val的氨基酸置换；
Lys7Ala和Gly21Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换；
Lys7Ala、Gly21Arg、Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换；
Glu1Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换；
Glu1Val、Lys7Ala、Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换；
Glu4Lys、Lys7Ala、Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换；
Lys7Ala、Glu27Arg、Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换；
Lys7Ala、Thr36Ala、Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换；
Lys7Ala、Glu9Val、Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换；
Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Gly和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Gly和Thr54Met的氨基酸置换；
Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Gly和Ala69Thr的氨基酸置换；
Glu1Val、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Gly和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Gly和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Asn50Tyr、Glu52Gly和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Lys7Ala、Gly21Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Asn50Tyr、Glu52Gly和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys38Ala、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Phe32Leu、Ala47Thr、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Thr2Ser、Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Glu27Lys、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Thr2Pro、Pro3Arg、Glu4Gly、Lys7Ala、Glu9Val、Asn50Tyr、Glu52Asn和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Glu27Ile、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn44Ile、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Glu5Lys、Lys7Ala、Asn44Ile、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Pro3Arg、Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Glu5Lys、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Glu27Val、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Glu5Arg、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Glu27Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Ala47Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys29Phe、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Glu8Gly、Glu33Val、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Ile23Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Ala41Ile、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Ala41Tyr、Asn50Tyr、Glu52Asp和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Leu和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Val和Tyr53Phe的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Val、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Leu、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Pro3Arg、Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Pro3Arg、Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Ile66Val和Ala69Val的氨基酸置换；
Pro3Arg、Glu4Gly、Lys7Ala、Thr31Met、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Pro6Leu、Lys7Ala、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Ala35Thr、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Glu33Gly、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Glu5Asp、Pro6Leu、Lys7Ala、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Leu的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Ala37Thr、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Glu33Asp、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Thr2Ala、Glu4Gly、Lys7Pro、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Ile23Val、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Pro6Thr、Lys7Ala、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Thr36Ser、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Val14Ala、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Gly21Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn44Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn44His、Asn50Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Glu52Tyr、Tyr53Phe和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Gly60Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Ile64Leu和Ala69Val的氨基酸置换。
作为选自上述(54)至(64)的氨基酸置换中的氨基酸置换的组合(也称为“第2组变异的组合”)的一个方式，可列举：
Pro6Ala和Lys29Ile的氨基酸置换；
Glu8Arg和Lys29Ile的氨基酸置换；
Ile23Phe和Lys29Ile的氨基酸置换；
Ile23Leu和Lys29Ile的氨基酸置换；
Lys29Ile和Lys38Leu的氨基酸置换；
Lys29Ile和Asn50Met的氨基酸置换；
Lys59Ile和Tyr53Ser的氨基酸置换；
Asn15Val和Lys29Ile的氨基酸置换；
Lys29Ile和Glu34Asp的氨基酸置换；
Lys29Ile和Glu34Phe的氨基酸置换；
Lys29Ile和Glu34Leu的氨基酸置换；
Lys29Ile和Glu34Val的氨基酸置换。
作为选自上述(1)至(64)的氨基酸置换中的氨基酸置换的组合的一个方式，可列举上述例示的第1组变异的组合中的任意者与上述例示的第2组变异的组合中的任意者的组合。
另外，作为氨基酸置换的组合的另一方式，可列举至少选自上述(1)至(64)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换(具体而言，选自上述(1)至(53)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换和/或选自上述(54)至(64)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换)与至少选自以下的(I)至(VII)中的1个以上赖氨酸(Lys)残基向除了赖氨酸以外的碱性氨基酸(精氨酸(Arg)或组氨酸(His))或具有羟基的氨基酸(丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)或酪氨酸(Tyr))的置换的组合。
(I)与序列号1的第7位相当的赖氨酸残基
(II)与序列号1的第13位相当的赖氨酸残基
(III)与序列号1的第22位相当的赖氨酸残基
(IV)与序列号1的第29位相当的赖氨酸残基
(V)与序列号1的第38位相当的赖氨酸残基
(VI)与序列号1的第48位相当的赖氨酸残基
(VII)与序列号1的第67位相当的赖氨酸残基
本发明的蛋白质可以具有选自上述(I)至(VII)中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个赖氨酸残基的置换。
其中，
在选择了上述(I)的赖氨酸残基的置换的情况下，(6)Lys7Ala和(38)Lys7Pro的氨基酸置换被上述(I)的赖氨酸残基的置换所覆盖(overwrite)，
在选择了上述(IV)的赖氨酸残基的置换的情况下，(12)Lys29Pro和(41)Lys29Phe的氨基酸置换被上述(IV)的赖氨酸残基的置换所覆盖，
在选择了上述(V)的赖氨酸残基的置换的情况下，(31)Lys38Ala的氨基酸置换被上述(V)的赖氨酸残基的置换所覆盖。
另外，
在选择了上述(I)的赖氨酸残基的置换的情况下，(54)Lys7Gln的氨基酸置换被上述(I)的赖氨酸残基的置换所覆盖，
在选择了上述(II)的赖氨酸残基的置换的情况下，(55)Lys13Val的氨基酸置换被上述(II)的赖氨酸残基的置换所覆盖，
在选择了上述(IV)的赖氨酸残基的置换的情况下，(56)Lys29Val或Lys29Ile的氨基酸置换被上述(IV)的赖氨酸残基的置换所覆盖，
在选择了上述(V)的赖氨酸残基的置换的情况下，(62)Lys38Leu的氨基酸置换被上述(V)的赖氨酸残基的置换所覆盖。
或者，也可以不选择上述(I)至(VII)的氨基酸置换中的、与选自上述(1)至(64)中的1个以上氨基酸置换处于同一位置的氨基酸置换。即，例如从上述(1)至(64)的氨基酸置换中至少选择了(6)Lys7Ala、(38)Lys7Pro或(54)Lys7Gln的氨基酸置换时，可以不选择上述(I)的氨基酸置换。另外，氨基酸置换的组合以至少残留有选自上述(1)至(64)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换的方式来进行选择。即，例如从上述(1)至(64)的氨基酸置换中单独选择(6)Lys7Ala、(38)Lys7Pro或(54)Lys7Gln的氨基酸置换的情况下，不能选择上述(I)的氨基酸置换。另外，氨基酸置换的组合可以以至少残留有选自上述(1)至(53)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换的方式来进行选择。另外，氨基酸置换的组合可以以至少残留有选自上述(54)至(64)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换的方式来进行选择。
需要说明的是，除了已被置换为碱性氨基酸或具有羟基的氨基酸的赖氨酸残基以外的赖氨酸残基(即，上述(I)～(VII)的赖氨酸残基中的未被选择的赖氨酸残基)可以保持未置换(赖氨酸残基)的状态，可以置换为除了碱性氨基酸和具有羟基的氨基酸以外的氨基酸。作为后者的例子，可列举赖氨酸残基向谷氨酰胺或异亮氨酸的置换以及上述的(6)Lys7Ala、(12)Lys29Pro、(31)Lys38Ala、(38)Lys7Pro、(41)Lys29Phe、(55)Lys13Val、(56(一部))Lys29Val和(62)Lys38Leu的氨基酸置换。
作为包含第1组变异的氨基酸置换的组合的另一方式的具体例，可列举：
Lys7Arg、Lys13Arg、Gly21Arg、Lys22Arg、Lys29Arg、Lys38Arg、Lys48Arg和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Arg、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Arg、Lys38Arg、Lys48Arg、Gly51Val和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Arg、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Arg、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Gly21Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Gly21Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu1Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu1Val、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Lys、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Thr、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Gln、Glu27Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Thr36Ala、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Glu9Val、Lys13Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Thr54Met和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Lys67Arg和Ala69Thr的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Thr54Met和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu1Val、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ser、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Gly21Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ser、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ser、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Ala、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Phe32Leu、Lys38Arg、Ala47Thr、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Thr2Ser、Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Glu27Lys、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Thr2Pro、Pro3Arg、Glu4Gly、Lys7Ala、Glu9Val、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asn、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Glu27Ile、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Asn44Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Glu5Lys、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Asn44Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Pro3Arg、Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Glu5Lys、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Glu27Val、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Glu5Arg、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Glu27Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Ala47Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Phe、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Glu8Gly、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Glu33Val、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Ala41Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Ala41Tyr、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Leu、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Val、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Val、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Val、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Leu、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Pro3Arg、Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Pro3Arg、Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Pro3Arg、Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Ilr66Val、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Pro3Arg、Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Thr31Met、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Pro6Leu、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Ala35Thr、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Glu33Gly、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Glu5Asp、Pro6Leu、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Leu的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Ala37Thr、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Glu33Asp、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Thr2Ala、Glu4Gly、Lys7Pro、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Val、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Pro6Thr、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Thr36Ser、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Val14Ala、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Gly21Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Asn44Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Asn44His、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Gly60Arg、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Ile64Leu、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换。
作为包含第2组变异的氨基酸置换的组合的另一方式的具体例，可列举：
Lys7Gln、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Arg、Lys48Arg和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Arg、Lys13Val、Lys22Arg、Lys29Arg、Lys48Arg和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Arg、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Val、Lys48Arg和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Arg、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Glu9Val、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48rg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Thr54Met和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48rg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Lys67Arg和Ala69Thr的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu1Val、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ser、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Gly21Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Glu8Gly、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Glu33Val、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Ala41Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Ala41Tyr、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Leu、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Val、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Pro6Ala、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Glu8Gly、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Glu8Arg、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Gly21Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Phe、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Leu、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Glu33Val、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38His、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Leu、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Asn44His、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Asn44Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Asn44His、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Met、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Tyr、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Ser和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Val、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Val、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Leu、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Val14Ala、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Gly21Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Asn44Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Asn44His、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Gly60Arg、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Ile64Leu、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Arg、Lys29Ile、Asn44Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Arg、Lys29Ile、Asn44His、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Ile64Leu、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Asn44Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Ile64Leu、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Asn44His、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、IIle64Leu、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Arg、Lys29Ile、Asn44Arg、Lys48His、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Ile64Leu、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Asn44His、Lys48His、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Ile64Leu、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Asn15Val、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Glu34Asp、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Glu34Phe、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Glu34Leu、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Glu34Val、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换。
作为氨基酸置换的组合的另一方式的具体例，特别列举：
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Glu27Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Asn50Tyr、Glu52Val、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Asn44Arg、Lys48Arg、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Asn44Arg、Lys48His、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Ile64Leu、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换。
需要说明的是，本发明的蛋白质可以进而具有至少1个其它氨基酸置换。作为其它氨基酸置换，可列举Glu49Asp、Pro6Ser、Asn44Asp、Glu49Val、Asn62Tyr、Ile23Thr、Ala41Arg。其它氨基酸置换例如可以为能提高免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性的氨基酸置换。例如，Asn44Asp、Glu49Val、Asn62Tyr、Ile23Thr和Ala41Arg的氨基酸置换均可以为能提高免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性的氨基酸置换。本发明的蛋白质例如可以具有1个、2个、3个、4个、5个或6个上述其它氨基酸置换。
其中，
在选择了Glu49Asp的氨基酸置换时，(17)的氨基酸置换(Glu49Thr或Glu49Ile)被Glu49Asp的氨基酸置换所覆盖，
在选择了Pro6Ser的氨基酸置换时，(37)的氨基酸置换(Pro6Leu和Pro6Thr中的任意者)被Pro6Ser的氨基酸置换所覆盖，
在选择了Asn44Asp的氨基酸置换时，(16)的氨基酸置换(Asn44Ser或Asn44Gly)、(32)的氨基酸置换(Asn44Ile)和(48)的氨基酸置换(Asn44His或Asn44Arg)被Asn44Asp的氨基酸置换所覆盖，
在选择了Glu49Val的氨基酸置换时，(17)的氨基酸置换(Glu49Thr或Glu49Ile)被Glu49Val的氨基酸置换所覆盖，
在选择了Asn62Tyr的氨基酸置换时，(23)的氨基酸置换(Asn62His、Asn62Arg、Asn62Leu、Asn62Met和Asn62Trp中的任意者)被Asn62Tyr的氨基酸置换所覆盖，
在选择了Ile23Thr的氨基酸置换时，(40)的氨基酸置换(Ile23Arg或Ile23Val)和(60)的氨基酸置换(Ile23Phe或Ile23Leu)被Ile23Thr的氨基酸置换所覆盖，
在选择了Ala41Arg的氨基酸置换时，(15)的氨基酸置换(Ala41Thr)和(47)的氨基酸置换(Ala41Ile或Ala41Tyr)被Ala41Arg的氨基酸置换所覆盖。
或者，也可以不选择其它氨基酸置换中的、与选自上述(1)至(64)中的1个以上氨基酸置换处于同一位置的氨基酸置换。即，例如从上述(1)至(64)的氨基酸置换中至少选择(17)的氨基酸置换(Glu49Thr或Glu49Ile)的情况下，可以不选择Glu49Asp和Glu49Val的氨基酸置换。另外，氨基酸置换的组合以至少残留有选自上述(1)至(64)中的1个以上氨基酸置换的方式来进行选择。即，例如从上述(1)至(64)的氨基酸置换中单独选择(17)的氨基酸置换(Glu49Thr或Glu49Ile)的情况下，不能选择Glu49Asp和Glu49Val的氨基酸置换。另外，氨基酸置换的组合可以以至少残留有选自上述(1)至(53)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换的方式来进行选择。另外，氨基酸置换的组合可以以至少残留有选自上述(54)至(64)的氨基酸置换中的1个以上氨基酸置换的方式来进行选择。即，作为改变型氨基酸序列，还可列举在上述例示的非改变型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)中具有上述特定位置处的氨基酸置换和Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换的氨基酸序列。即，作为本发明的蛋白质，还可列举包含上述例示的非改变型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)、其中在该氨基酸序列中具有上述特定位置处的氨基酸置换和Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换的蛋白质。换言之，本发明的蛋白质例如可以为包含下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列为除了具有上述特定位置处的氨基酸置换和Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换以外与上述例示的非改变型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)相同的氨基酸序列。需要说明的是，上述作为其它氨基酸置换而例示出的Glu49Asp、Pro6Ser是能够与亚群(subgroup)无关地结合免疫球蛋白的κ轻链的氨基酸置换。
作为包含上述其它氨基酸置换的氨基酸置换的组合，可列举在上述例示的氨基酸置换的组合中还包含1个、2个、3个、4个、5个或6个上述其它氨基酸置换的组合。作为包含上述其它氨基酸置换的氨基酸置换的组合，特别列举在上述例示的氨基酸置换的组合中还至少包含Asn62Tyr的氨基酸置换的组合。
作为进而具有上述其它氨基酸置换的本发明的蛋白质的一例，可列举以下的蛋白质。这些蛋白质在碱稳定性提高、并且能够与亚群无关地结合免疫球蛋白的κ轻链方面是优选的。
包含序列号1记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中具有Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Glu52Gly、Asn62Tyr和Lys67Arg的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号179记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。
包含序列号1记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中具有Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe、Asn62Tyr和Lys67Arg的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号186记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。
包含序列号1记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中具有Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe、Asn62Tyr和Lys67Arg的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号199记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。
包含序列号1记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中具有Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Glu27Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe、Asn62Tyr和Lys67Arg的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号224记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。
包含序列号1记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中具有Glu4Gly、Pro6Ser、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe、Asn62Tyr和Lys67Arg的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号240记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。
包含序列号1记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中具有Glu4Gly、Pro6Ser、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Glu52Val、Tyr53Phe、Asn62Tyr、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号271记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。
包含序列号1记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中具有Glu4Gly、Pro6Ser、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Asn62Tyr、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号275记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。
作为进而具有上述其它氨基酸置换的本发明的蛋白质的一例，还可列举以下蛋白质。这些蛋白质在碱稳定性提高、并且能够与亚群无关地结合免疫球蛋白的κ轻链方面是优选的。另外，将这些蛋白质固定于不溶性载体而得到的本发明的免疫球蛋白吸附剂相较于以往的免疫球蛋白吸附剂而言，在能够与亚群无关地以温和的pH条件洗脱具有κ轻链的免疫球蛋白(抗体)方面是优选的。
包含序列号1记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中具有Glu4Gly、Pro6Ser、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Asn44Arg、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Asn62Tyr、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号408记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。
包含序列号1记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中具有Glu4Gly、Pro6Ser、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Asn44Arg、Lys48His、Glu49Asp、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Asn62Tyr、Ile64Leu、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(包含序列号413记载的氨基酸序列的免疫球蛋白结合性蛋白质)。
换言之，作为本发明的蛋白质具有的氨基酸置换的一例，可列举以下的氨基酸置换：
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Gln、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Glu52Gly、Asn62Tyr和Lys67Arg的氨基酸置换；
Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Glu52Gly、Tyr53Phe、Asn62Tyr和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe、Asn62Tyr和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Glu27Arg、Lys29Ile、Lys38Arg、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe、Asn62Tyr和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Pro6Ser、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Glu52Asp、Tyr53Phe、Asn62Tyr和Lys67Arg的氨基酸置换；
Glu4Gly、Pro6Ser、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Glu52Val、Tyr53Phe、Asn62Tyr、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Pro6Ser、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Asn62Tyr、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换。
Glu4Gly、Pro6Ser、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Asn44Arg、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Asn62Tyr、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换；
Glu4Gly、Pro6Ser、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Ile23Arg、Lys29Ile、Lys38Glu、Asn44Arg、Lys48His、Glu49Asp、Asn50Tyr、Tyr53Phe、Asn62Tyr、Ile64Leu、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换。
本说明书中，也将序列号1记载的氨基酸序列中具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)的氨基酸序列称为“源自序列号1的置换氨基酸序列”。源自序列号1的置换氨基酸序列换言之为发生了上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)的序列号1记载的氨基酸序列。另外，源自序列号1的置换氨基酸序列换言之为除了具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)以外与序列号1记载的氨基酸序列相同的氨基酸序列。源自序列号1的置换氨基酸序列为本说明书中的改变型氨基酸序列的一例。
作为本说明书中的改变型氨基酸序列，还可列举上述例示的改变型氨基酸序列(例如源自序列号1的置换氨基酸序列)的变体(variant)序列。即，作为本发明的蛋白质，还可列举包含上述例示的改变型氨基酸序列(例如源自序列号1的置换氨基酸序列)的变体序列、并且具有免疫球蛋白结合活性的蛋白质。以下例示说明源自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列的情况，该说明也可以沿用于任意改变型氨基酸序列的变体序列。
源自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列以残留有上述特定位置处的氨基酸置换的方式(即，本发明的蛋白质具有上述特定位置处的氨基酸置换的方式)来设定。另外，源自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列可以以残留有Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换的方式(即，本发明的蛋白质具有Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换的方式)来设定。另外，源自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列例如可以进一步具有选自上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)中的、源自序列号1的置换氨基酸序列所不具有的1个以上氨基酸置换。例如，源自序列号1的置换氨基酸序列不具有Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换的情况下，源自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列可以具有上述其它氨基酸置换。
作为源自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列，可列举源自序列号1的置换氨基酸序列中包含1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列。即，本发明的蛋白质只要具有免疫球蛋白结合活性，则可以在上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)的基础上在序列号1记载的氨基酸序列中还包含1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加。即，作为本发明的蛋白质，还可列举如下的蛋白质，即，其包含序列号1记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)且还包含1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性的蛋白质。换言之，本发明的蛋白质例如可以为包含下述氨基酸序列且具有免疫球蛋白结合活性的蛋白质，所述氨基酸序列除了具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)且还包含1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加以外与序列号1相同。需要说明的是，上述的氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加以残留有上述特定位置处的氨基酸置换的方式来进行选择。即，上述的氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加例如可以发生在除了上述特定位置以外的位置。另外，上述的氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加可以以残留有上述其它氨基酸置换的方式来进行选择。即，上述的氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加例如可以发生在除了上述其它氨基酸置换以外的位置。另外，上述的氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加例如可以包含选自上述例示的氨基酸置换中的、源自序列号1的置换氨基酸序列所不具有的1个以上氨基酸置换。上述“1或多个”也根据氨基酸残基在蛋白质的立体结构中的位置、氨基酸残基的种类而不同，具体而言，例如是指1至20个、1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1至2个、1个中的任意者。作为上述的氨基酸残基的置换的一例，可列举在物理性质和/或化学性质相似的氨基酸之间发生置换的保守性置换。本领域技术人员已知，在保守性置换的情况下，通常在发生了置换的蛋白质与未发生置换的蛋白质之间，蛋白质的功能是得以维持的。作为保守性置换的一例，可列举甘氨酸与丙氨酸之间的置换、丝氨酸与脯氨酸之间的置换、或谷氨酸与丙氨酸之间的置换(蛋白质的结构与功能，MEDICAL SCIENCES INTERNATIONAL,LTD.，9，2005)。另外，上述的氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加也包括了例如通过基于蛋白质或编码其的基因所来源的微生物的个体差异、种属差异等情况而自然产生的变异(突变(mutant)或变体)从而产生的氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加。
另外，作为源自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列，还可列举对源自序列号1的置换氨基酸序列具有高同源性的氨基酸序列。即，作为本发明的蛋白质，还可列举包含下述氨基酸序列且具有免疫球蛋白结合活性的蛋白质，所述氨基酸序列相对于在序列号1记载的氨基酸序列中具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)的氨基酸序列具有高同源性。需要说明的是，上述那样的同源性范围内的氨基酸序列的变化以残留有上述特定位置处的氨基酸置换的方式来进行选择。即，上述那样的同源性范围内的氨基酸序列的变化例如可以发生在除了上述特定位置以外的位置。另外，上述那样的同源性范围内的氨基酸序列的变化可以以残留有其它氨基酸置换的方式来进行选择。即，上述那样的同源性范围内的氨基酸序列的变化例如可以发生在除了其它氨基酸置换以外的位置。另外，上述那样的同源性范围内的氨基酸序列的变化例如可以包含选自上述例示的氨基酸置换中的、源自序列号1的置换氨基酸序列所不具有的1个以上氨基酸置换。上述“同源性”可以是指相似性(similarity)或一致性(identity)，特别是指一致性。“相对于氨基酸序列的同源性”是指相对于氨基酸序列整体的同源性。上述“高同源性”可以是指70％以上、80％以上、90％以上或95％以上的同源性。氨基酸序列之间的“一致性”是指这些氨基酸序列中的种类相同的氨基酸残基的比率((日本)实验医学2013年2月号Vol.31No.3、羊土社)。氨基酸序列之间的“相似性”是指这些氨基酸序列中的种类相同的氨基酸残基的比率以及侧链的性质相似的氨基酸残基的比率之和((日本)实验医学2013年2月号Vol.31No.3、羊土社)。关于侧链的性质相似的氨基酸残基，如上文所述。氨基酸序列的同源性可以利用BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)、FASTA等比对程序(alignment program)来确定。
另外，作为改变型氨基酸序列，还可列举上述例示的变体序列中进而具有选自上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)中的1个以上氨基酸置换的氨基酸序列。例如，改变型氨基酸序列可以为在至少具有上述特定位置处的氨基酸置换的变体序列中进而具有其它氨基酸置换的氨基酸序列。
另外，作为非改变型氨基酸序列，还可列举上述例示的非改变型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)的变体序列。即，作为改变型氨基酸序列，还可列举在上述例示的非改变型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)的变体序列中具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)的氨基酸序列。即，作为本发明的蛋白质，还可列举如下的蛋白质，即，其包含上述例示的非改变型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)的变体序列，其中该变体序列中具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性。换言之，本发明的蛋白质例如可以为包含除了具有上述例示的氨基酸置换以外与上述例示的非改变型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)的变体序列相同的氨基酸序列的蛋白质。需要说明的是，上述例示的非改变型氨基酸序列(例如序列号1记载的氨基酸序列)的变体序列在芬戈尔德菌属细菌中实际存在或不存在均可。即，“源自芬戈尔德菌属细菌的蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列(FpL的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列)”不限于芬戈尔德菌属细菌中实际存在的蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，也包含作为该氨基酸序列的变体序列的、在芬戈尔德菌属细菌中实际上不存在(即，假想)的氨基酸序列。以下例示说明序列号1记载的氨基酸序列的变体序列的情况，该说明也可以沿用于任意非改变型氨基酸序列的变体序列。
作为序列号1记载的氨基酸序列的变体序列，可列举在序列号1记载的氨基酸序列中包含1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列。即，作为本发明的蛋白质，还可列举如下的蛋白质，即，其包含序列号1记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中包含1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，进而具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性。上述的氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加例如可以发生在除了上述特定位置以外的位置。另外，上述的氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加例如可以发生在除了其它氨基酸置换以外的位置。
作为序列号1记载的氨基酸序列的变体序列，还可列举相对于序列号1记载的氨基酸序列具有高同源性的氨基酸序列。即，作为本发明的蛋白质，还可列举如下的蛋白质，即，其包含相对于序列号1记载的氨基酸序列具有高同源性的氨基酸序列，其中该氨基酸序列(相对于序列号1记载的氨基酸序列具有高同源性的氨基酸序列)中具有上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性。上述那样的同源性范围内的氨基酸残基的变化例如可以发生在除了上述特定位置以外的位置。另外，上述那样的同源性范围内的氨基酸残基的变化例如可以发生在除了其它氨基酸置换以外的位置。
其它关于序列号1记载的氨基酸序列的变体序列，可以沿用关于源自序列号1的置换氨基酸序列的变体序列的记载。
本说明书中，“序列号1记载的氨基酸序列中的第X位的氨基酸”是指：存在于从序列号1记载的氨基酸序列的N末端数起的第X位的位置的氨基酸。特定氨基酸序列中的“与序列号1记载的氨基酸序列中的第X位的氨基酸相当的氨基酸残基”是指：为该特定氨基酸序列中的氨基酸残基、并且在该特定氨基酸序列与序列号1的氨基酸序列的比对(alignment)中排列在与序列号1所示的氨基酸序列中的第X位的氨基酸相同的位置的氨基酸残基。例如，Asn50Tyr的氨基酸置换的情况下，特定氨基酸序列中的“与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基”是指：为该特定氨基酸序列中的氨基酸残基、并且在该特定氨基酸序列与序列号1的氨基酸序列的比对中排列在与序列号1所示的氨基酸序列中的第50位的天冬酰胺相同的位置的氨基酸残基。需要说明的是，序列号1记载的氨基酸序列中的“与序列号1记载的氨基酸序列中的第X位的氨基酸相当的氨基酸残基”是指：序列号1记载的氨基酸序列中的第X位的氨基酸本身。即，上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的其它氨基酸置换)的位置并不一定表示在本发明的蛋白质中的绝对位置，而是表示基于序列号1记载的氨基酸序列的相对位置。即，例如，当本发明的蛋白质在比上述例示的氨基酸置换的位置靠N末端侧包含氨基酸残基的插入、缺失或添加时，与此相应地，该氨基酸置换的绝对位置可能发生变动。本发明的蛋白质中的上述例示的氨基酸置换的位置例如可以通过本发明的蛋白质的氨基酸序列与序列号1记载的氨基酸序列的比对来确定。上述比对例如可以利用BLAST、FASTA等比对程序来实施。关于序列号1记载的氨基酸序列的变体序列等任意氨基酸序列中的上述例示的氨基酸置换的位置，也同样。另外，上述例示的氨基酸置换(即，上述特定位置处的氨基酸置换和任选的Glu49Asp、Pro6Ser等其它氨基酸置换)的置换前的氨基酸残基表示序列号1记载的氨基酸序列中的置换前的氨基酸残基的种类，在除了序列号1记载的氨基酸序列以外的非改变型氨基酸序列中可以保留也可以不保留。
本发明的蛋白质可以仅包含1个改变型氨基酸序列，也可以包含多个改变型氨基酸序列。本发明的蛋白质例如可以包含2个以上、3个以上、4个以上或5个以上改变型氨基酸序列，可以包含10个以下、7个以下、5个以下、4个以下、3个以下或2个以下改变型氨基酸序列，可以包含它们的彼此不矛盾的组合的个数。本发明的蛋白质包含多个改变型氨基酸序列时，这些多个改变型氨基酸序列的氨基酸序列可以相同也可以不同。这些多个改变型氨基酸序列可以为直接连接(直接相连)的方式，也可以为借助合适的接头(linker)(例如由5个以上且个25以下氨基酸残基构成的寡肽)而连接的方式。
本发明的蛋白质可以由改变型氨基酸序列构成，也可以还包含其它氨基酸序列。即，本发明的蛋白质例如可以在其N末端侧或C末端侧还包含其它氨基酸序列。换言之，本发明的蛋白质中，例如可以在改变型氨基酸序列的N末端侧或C末端侧添加有其它氨基酸序列。作为其它氨基酸序列，可列举寡肽。用作其它氨基酸序列的寡肽可列举除了上述接头以外的寡肽。其它氨基酸序列只要不损害本发明的蛋白质的免疫球蛋白结合活性、稳定性则没有特别限制。例如，其它氨基酸序列的种类、长度只要不损害本发明的蛋白质的免疫球蛋白结合性、稳定性则没有特别限制。
本发明的蛋白质例如除了包含所选择的免疫球蛋白结合结构域以外还可以包含其它免疫球蛋白结合结构域的一部分。例如，本发明的蛋白质包含FpL的结构域C3的改变型氨基酸序列时，本发明的蛋白质可以还包含FpL的结构域C3的N末端侧区域(结构域C1、结构域C2)的一部分，可以还包含FpL的结构域C3的C末端侧区域(结构域C4)的一部分。
本发明的蛋白质例如可以在其N末端侧或C末端侧包含对于特异性检测或分离目标物而言有用的寡肽。作为这样的寡肽，可列举聚组氨酸、聚精氨酸。另外，本发明的蛋白质例如可以在其N末端侧或C末端侧包含在将本发明的蛋白质固定于色谱用支撑体等固相时有用的寡肽。作为这样的寡肽，可列举包含赖氨酸、半胱氨酸的寡肽。
本发明的蛋白质包含上述那样的其它氨基酸序列时，本发明的蛋白质例如既可以通过预先包含其它氨基酸序列的方式来制造，也可以添加另行制造的上述那样的其它氨基酸序列。本发明的蛋白质包含上述那样的其它氨基酸序列时，典型情况下，本发明的蛋白质可以通过由编码包含上述那样的其它氨基酸序列的本发明的蛋白质的全长氨基酸序列的多核苷酸进行表达来制造。即，例如，可以将编码其它氨基酸序列的多核苷酸和编码本发明的蛋白质(例如不含其它氨基酸序列的本发明的蛋白质)的多核苷酸以其它氨基酸序列被添加在本发明的蛋白质的N末端侧或C末端侧的方式来连接，使其表达本发明的蛋白质。另外，例如，也可以将化学合成的其它氨基酸序列通过化学方式键合于本发明的蛋白质(例如不含其它氨基酸序列的本发明的蛋白质)的N末端侧或C末端侧。
本发明的蛋白质例如可以通过由编码本发明的蛋白质的多核苷酸进行表达来制造。本说明书中，也将编码本发明的蛋白质的多核苷酸称为“本发明的多核苷酸”。本发明的多核苷酸具体而言可以为包含编码本发明的蛋白质的核苷酸序列的多核苷酸。
本发明的多核苷酸例如可以通过化学合成法、基于PCR法等的DNA扩增法来获得。DNA扩增法例如可以将包含编码本发明的蛋白质的核苷酸序列之类的待扩增核苷酸序列的多核苷酸作为模板来实施。作为模板的多核苷酸可以例示出表达本发明的蛋白质的生物的基因组DNA、本发明的蛋白质的cDNA、包含本发明的多核苷酸的载体。
本发明的多核苷酸的核苷酸序列例如可以通过由本发明的蛋白质的氨基酸序列进行转换而设计。由氨基酸序列转换为核苷酸序列时，可以使用标准密码子表，优选考虑用本发明的多核苷酸进行转化的宿主中的密码子的使用频率来进行转换。作为一例，在宿主为Escherichia coli(大肠杆菌)的情况下，对精氨酸(Arg)而言AGA/AGG/CGG/CGA的使用频率低，对异亮氨酸(Ile)而言ATA的使用频率低，对亮氨酸(Leu)而言CTA的使用频率低，对甘氨酸(Gly)而言GGA的使用频率低，对脯氨酸(Pro)而言CCC的使用频率低(所谓的稀有密码子)，因此可以避免使用这些密码子进行转换。密码子的使用频率的分析也可以利用公共数据库(例如Kazusa DNAResearch Institute网站中的Codon Usage Database等)。
本发明的多核苷酸既可以一次性获得该多核苷酸的全长，也可以在获得由该多核苷酸的部分序列构成的多核苷酸后进行连接而获得。关于上述那样的获得本发明的多核苷酸的方法的说明，不仅限于一次性获得其全长序列时，在获得其部分序列时也可以沿用。
需要说明的是，本发明的多核苷酸可以以与编码任意多肽的氨基酸序列的多核苷酸连接、编码融合型氨基酸序列的方式来进行设计。
本发明的蛋白质例如可以如下制造：培养包含本发明的多核苷酸的基因重组宿主(以下也简称为“本发明的基因重组宿主”)并使其表达上述蛋白质，然后回收所表达的上述蛋白质。本发明的基因重组宿主例如可通过使用本发明的多核苷酸转化宿主来得到。宿主只要通过用本发明的多核苷酸转化而能够表达本发明的蛋白质则没有特别限制。作为宿主的例子，可列举动物细胞、昆虫细胞、微生物。其中，作为动物细胞，可例示COS细胞、CHO(Chinese Hamster Ovary，中国仓鼠卵巢)细胞、Hela细胞、NIH3T3细胞、HEK293细胞，作为昆虫细胞，可例示Sf9细胞、BTI-TN-5B1-4细胞，作为微生物，可例示酵母、细菌。进而，作为酵母，可列举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌属酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)等毕赤属酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等裂殖酵母属酵母，作为细菌，可列举大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属细菌。作为大肠杆菌，可列举JM109株、BL21(DE3)株。需要说明的是，使用酵母、大肠杆菌作为宿主在生产率方面是优选的，进一步优选使用大肠杆菌作为宿主。
本发明的基因重组宿主以可表达方式保持本发明的多核苷酸即可。具体而言，以在上述宿主中发挥功能的启动子的控制下表达本发明的多核苷酸的方式保持本发明的多核苷酸即可。上述宿主为大肠杆菌时，作为在宿主中发挥功能的启动子的一例，可列举trp启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、T7启动子、recA启动子、lpp启动子。
另外，本发明的基因重组宿主中，本发明的多核苷酸可以存在于基因组DNA外的能自主复制的载体上。即，也可以用包含本发明的多核苷酸的表达载体(以下也简称为“本发明的表达载体”)转化宿主而制作本发明的基因重组宿主。本发明的表达载体例如通过在表达载体的合适位置插入本发明的多核苷酸而得到。需要说明的是，表达载体只要能够在要转化的宿主内稳定存在、复制则没有特别限制。上述宿主为大肠杆菌时，作为表达载体，可例示pET质粒载体、pUC质粒载体、pTrc质粒载体。需要说明的是，本发明的表达载体可以具备抗生素抗性基因等选择标记。另外，上述合适位置是指：不破坏表达载体的复制功能、选择标记、与传递性相关的区域的位置。在上述表达载体中插入本发明的多核苷酸时，优选以连接到表达所必需的启动子等功能性多核苷酸的状态进行插入。
另外，本发明的基因重组宿主中，本发明的多核苷酸可以导入到基因组DNA上。本发明的多核苷酸向基因组DNA的导入例如可以利用基于同源重组的基因导入法来实施。作为基于同源重组的基因导入法，可例示Red-driven integration法(Datsenko，K.A，andWanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，97：6640-6645(2000))等使用直链状DNA的方法、使用包含温度敏感性复制起点的载体的方法、使用不具有在宿主内发挥功能的复制起点的载体的方法、使用噬菌体的转导法。
使用本发明的表达载体等多核苷酸的宿主转化例如可以通过本领域技术人员通常使用的方法来实施。例如，在选择大肠杆菌作为宿主时，可以通过感受态细胞法、热休克法、电穿孔法等进行转化。转化后，通过用合适的方法筛选包含本发明的多核苷酸的宿主，可以获得本发明的基因重组宿主。
需要说明的是，各种微生物所能利用的表达载体、启动子等基因工程学方法相关信息例如可以利用“微生物学基础讲座8基因工学、共立出版、1987年”等公知文献获得。
本发明的基因重组宿主包含本发明的表达载体的情况下，可以由本发明的基因重组宿主制备本发明的表达载体。例如，可以从培养本发明的基因重组宿主而得到的培养物中，使用碱提取法或QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)等市售的提取试剂盒来制备本发明的表达载体。
通过培养本发明的基因重组宿主，可以表达本发明的蛋白质。另外，通过培养本发明的基因重组宿主而使其表达本发明的蛋白质，并且回收所表达的上述蛋白质，由此可以制造本发明的蛋白质。即，本说明书公开本发明的蛋白质的制造方法，其包括通过培养本发明的基因重组宿主而使其表达本发明的蛋白质的工序；和，回收所表达的上述蛋白质的工序。培养基组成、培养条件可以根据宿主的种类、本发明的蛋白质的特性等各种条件来适当设定。培养基组成、培养条件例如可以设定为宿主能增殖、且能够表达本发明的蛋白质的条件。培养基例如可以使用适当包含碳源、氮源、无机盐、其它各种有机成分、无机成分的培养基。具体而言，宿主为大肠杆菌时，可列举补充了必要的营养源的LB(Luria-Bertani)培养基(胰蛋白胨1％(w/v)、酵母提取物0.5％(w/v)、1％(w/v)NaCl)作为优选的培养基的一例。需要说明的是，为了使本发明的基因重组宿主根据是否导入了本发明的表达载体而选择性地增殖，优选向培养基中添加与该表达载体所含的抗生素抗性基因对应的抗生素并进行培养。例如，该表达载体包含卡那霉素抗性基因时，可以向培养基中添加卡那霉素。将本发明的多核苷酸导入到基因组DNA上时也同样。另外，培养基可以包含选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)、巯基乙酸盐和二硫苏糖醇组成的组中的一种以上还原剂。另外，培养基可以包含甘氨酸等促进从上述转化体向培养液分泌蛋白质的试剂。例如，宿主为大肠杆菌时，优选相对于培养基添加2％(w/v)以下的甘氨酸。关于培养温度，例如宿主为大肠杆菌时，通常为10℃以上且40℃以下、优选为20℃以上且37℃以下、更优选为25℃左右。关于培养基的pH，例如宿主为大肠杆菌时，为pH6.8以上且pH7.4以下、优选为pH7.0左右。另外，在诱导性启动子的控制下表达本发明的蛋白质时，优选施加诱导，使得能够良好地表达本发明的蛋白质。在表达诱导中，例如可以使用与启动子的种类对应的诱导剂。作为诱导剂，可例示IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)。宿主为大肠杆菌时，例如可以通过在培养液的浊度(600nm下的吸光度)达到约0.5至1.0时添加适量的IPTG并继续进行培养，从而诱导本发明的蛋白质的表达。IPTG的添加浓度例如为0.005mM以上且1.0mM以下、优选为0.01mM以上且0.5mM以下。IPTG诱导等表达诱导例如可以在该技术领域中公知的条件下进行。
本发明的蛋白质可以通过适合于其表达方式的方法从培养物中分离并回收。需要说明的是，本说明书中“培养物”是指通过培养而得到的培养液的整体或其一部分。该一部分只要是包含本发明的蛋白质的部分则没有特别限制。作为该一部分，可列举培养而得的本发明的转化体的细胞、培养后的培养基(即，培养上清)等。例如，在培养上清中累积本发明的蛋白质时，可以通过离心分离操作分离出细胞，从得到的培养上清中回收本发明的蛋白质。另外，在细胞内(包括周质)中累积本发明的蛋白质时，可以在通过离心分离操作回收细胞后添加酶处理剂、表面活性剂等而将细胞破碎，从该破碎物中回收本发明的蛋白质。上述从培养上清、细胞破碎物中回收本发明的蛋白质例如可以通过蛋白质的分离纯化中使用的公知方法来实施。作为上述回收方法的一例，可列举硫酸铵分级、离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、等电点沉淀。
本发明的蛋白质例如可以用于免疫球蛋白(抗体)的分离或分析。用于上述目的时，例如可以以包含不溶性载体和固定于该不溶性载体的本发明的蛋白质的免疫球蛋白吸附剂(以下也简称为“本发明的免疫球蛋白吸附剂”)的方式来使用。需要说明的是，本说明书中，“免疫球蛋白的分离”不限于从共存有夹杂物的溶液中分离免疫球蛋白，也包括基于结构、性质或活性等而分离免疫球蛋白彼此。不溶性载体只要是相对于水溶液为不溶性的载体则没有特别限制。作为不溶性载体，可例示出以琼脂糖、海藻酸盐(alginate)、角叉菜胶、几丁质、纤维素、糊精、葡聚糖、淀粉等多糖为原料的载体；以聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚氨酯等合成高分子为原料的载体；以二氧化硅等陶瓷为原料的载体。其中，优选以多糖为原料的载体、以合成高分子为原料的载体作为不溶性载体。作为上述优选的载体的一例，可列举：TOYOPEARL(东曹公司制)等导入了羟基的聚甲基丙烯酸酯凝胶、Sepharose(Cytiva公司制)等琼脂糖凝胶、Cellufine(JNC公司制)等纤维素凝胶。关于不溶性载体的形状，没有特别限制。不溶性载体例如可以为能够填充于柱的形状。不溶性载体例如可以是粒状物或非粒状物。另外，不溶性载体例如可以是多孔性或非多孔性的。
本发明中的分离对象或分析对象即免疫球蛋白(抗体)只要是本发明的蛋白质具有结合性的免疫球蛋白则没有特别限制。免疫球蛋白具体而言可以是具有κ轻链的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以除了κ轻链以外还包含Fc区等其它区域，也可以不包含。免疫球蛋白例如可以是单链Fv(scFv)、Fab、F(ab’)2、IgA、双特异性T细胞诱导(BiTE)抗体等不具有Fc区的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。免疫球蛋白例如可以为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE中的任意者。IgG例如可以为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的任意者。免疫球蛋白的来源没有特别限制。免疫球蛋白可以源自单一生物，也可以源自2种或多于2种的生物的组合。作为免疫球蛋白，可列举嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、它们的变体(例如氨基酸置换体)。另外，作为免疫球蛋白，还可列举双特异性抗体(bispecificantibody)、κ轻链与其它蛋白质的融合抗体、κ轻链与药物的复合体(ADC)等人工进行了结构改变的抗体。需要说明的是，“免疫球蛋白”中也包括了抗体药物。
本发明的蛋白质例如可以通过共价键固定于不溶性载体。作为具体例，可以借助不溶性载体所具有的活性基团使本发明的蛋白质与不溶性载体进行共价键合，从而将上述蛋白质固定于不溶性载体。即，上述不溶性载体可以在其表面等具有活性基团。作为上述活性基团的一例，可列举N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化酯基、环氧基、羧基、马来酰亚胺基、卤代乙酰基、三氟代乙磺酰基(Tresyl)、甲酰基、卤代乙酰胺。作为具有活性基团的不溶性载体，例如可以直接使用具有活性基团的市售的不溶性载体，也可以向不溶性载体中导入活性基团而使用。作为具有活性基团的市售的载体，可例示出TOYOPEARL AF-Epoxy-650M、TOYOPEARL AF-Tresyl-650M(均为东曹公司制)、HiTrap NHS-activated HP Columns、NHS-activated Sepharose 4Fast Flow、Epoxy-activated Sepharose 6B(均为Cytiva公司制)、SulfoLink Coupling Resin(赛默飞世尔科技公司制)。
作为向载体表面导入活性基团的方法，可例示出使具有2个以上活性位点的化合物中的一个位点对存在于载体表面的羟基、环氧基、羧基、氨基等进行反应的方法。
作为向存在于载体表面的羟基、氨基导入环氧基的化合物，可例示出表氯醇、乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚、己二醇二缩水甘油醚。
另外，作为向存在于载体表面的环氧基导入羧基的化合物，可例示出2-巯基乙酸、3-巯基丙酸、4-巯基丁酸、6-巯基丁酸、甘氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸。
另外，作为向存在于载体表面的羟基、环氧基、羧基、氨基导入马来酰亚胺基的化合物，可例示出：N-(ε-马来酰亚胺己酸)酰肼、N-(ε-马来酰亚胺丙酸)酰肼、4-(4-N-马来酰亚胺苯基)乙酰肼、2-氨基马来酰亚胺、3-氨基马来酰亚胺、4-氨基马来酰亚胺、6-氨基马来酰亚胺、1-(4-氨基苯基)马来酰亚胺、1-(3-氨基苯基)马来酰亚胺、4-(马来酰亚胺)苯基异氰酸酯、2-马来酰亚胺乙酸、3-马来酰亚胺丙酸、4-马来酰亚胺丁酸、6-马来酰亚胺己酸、N-(α-马来酰亚胺乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯、(间马来酰亚胺基苯甲酰基)N-羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羰基-6-氨基己酸、琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸、(对马来酰亚胺基苯甲酰基)N-羟基琥珀酰亚胺酯、(间马来酰亚胺基苯甲酰基)N-羟基琥珀酰亚胺酯。
另外，作为向存在于载体表面的羟基、氨基导入卤代乙酰基的化合物，可例示出：氯乙酸、溴乙酸、碘乙酸、氯乙酰氯、溴乙酰氯、溴乙酰溴、氯乙酸酐、溴乙酸酐、碘乙酸酐、2-(碘乙酰胺)乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、3-(溴乙酰胺)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(碘乙酰基)氨基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
另外，作为向载体表面导入活性基团的方法，还可例示出使存在于载体表面的羟基、氨基与ω-烯基烷基缩水甘油醚反应之后，用卤化剂将ω-烯基部位卤化而进行活化的方法。作为ω-烯基烷基缩水甘油醚，可例示出烯丙基缩水甘油醚、3-丁烯基缩水甘油醚、4-戊烯基缩水甘油醚。作为卤化剂，可例示出N-氯琥珀酰亚胺、N-溴琥珀酰亚胺、N-碘琥珀酰亚胺。
另外，作为向载体表面导入活性基团的方法，还可例示出对存在于载体表面的羧基使用缩合剂和添加剂而导入活化基团的方法。作为缩合剂，可例示出1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺、羰基二咪唑。作为添加剂，可例示出N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4-硝基苯酚、1-羟基苯并三唑。
本发明的蛋白质向不溶性载体的固定化例如可以在缓冲液中实施。作为缓冲液，可例示出乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid，2-吗啉乙磺酸)缓冲液、HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液、Tris缓冲液、硼酸缓冲液。固定化时的反应温度例如可以根据活性基团的反应性、本发明的蛋白质的稳定性等各种条件来适当设定。固定化时的反应温度例如可以为5℃以上且50℃以下，优选为10℃以上且35℃以下。
本发明的免疫球蛋白吸附剂例如可以制成填充有上述吸附剂的柱的方式而用于免疫球蛋白(抗体)的分离。例如，通过向填充有本发明的免疫球蛋白吸附剂的柱中添加包含免疫球蛋白的溶液而使该免疫球蛋白吸附于上述吸附剂，对吸附于上述吸附剂的免疫球蛋白进行洗脱，由此可以分离免疫球蛋白。即，本说明书公开了溶液所包含的免疫球蛋白的分离方法，其包括下述工序：向填充有本发明的免疫球蛋白吸附剂的柱中添加包含免疫球蛋白的溶液而使该免疫球蛋白吸附于上述吸附剂的工序；和，对吸附于上述吸附剂的免疫球蛋白进行洗脱的工序。包含免疫球蛋白的溶液例如可以使用泵等送液手段添加到柱中。需要说明的是，包含免疫球蛋白的溶液在添加到柱中之前可以预先用合适的缓冲液进行溶剂置换。另外，将包含免疫球蛋白的溶液添加到柱中之前，可以用合适的缓冲液对柱进行平衡化。通过柱的平衡化，例如可期待能够以更高的纯度分离免疫球蛋白。作为溶剂置换、平衡化中使用的缓冲液，可以例示磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、MES缓冲液。这样的缓冲液中，例如可以还添加1mM以上且1000mM以下的氯化钠等无机盐。溶剂置换中使用的缓冲液和平衡化中使用的缓冲液可以相同也可以不同。另外，将包含免疫球蛋白的溶液通过柱中之后夹杂物等除了免疫球蛋白以外的成分残留在柱中的情况下，可以在对吸附于免疫球蛋白吸附剂的免疫球蛋白进行洗脱之前将这样的成分从柱中去除。例如可以使用合适的缓冲液将除了免疫球蛋白以外的成分从柱中去除。关于去除除了免疫球蛋白以外的成分时使用的缓冲液，例如可以沿用关于溶剂置换、平衡化中使用的缓冲液的记载。吸附于免疫球蛋白吸附剂的免疫球蛋白例如可以通过减弱免疫球蛋白与配体(本发明的蛋白质)的相互作用而洗脱。作为减弱免疫球蛋白与配体(本发明的蛋白质)的相互作用的手段，可例示出改变pH、添加抗衡肽、升高温度、改变盐浓度。作为减弱免疫球蛋白与配体(本发明的蛋白质)的相互作用的手段，尤其可例示出改变pH。即，作为对吸附于上述吸附剂的免疫球蛋白进行洗脱的工序，尤其可例示出通过改变pH来洗脱吸附于上述吸附剂的免疫球蛋白的工序。作为改变pH，可例示出降低pH。作为降低pH，可例示出利用缓冲液来降低pH。吸附于免疫球蛋白吸附剂的免疫球蛋白具体而言例如可以使用合适的洗脱液来洗脱。作为洗脱液，可列举相较于溶剂置换、平衡化中使用的缓冲液而言更靠酸性侧的缓冲液。作为上述酸性侧的缓冲液，可例示出柠檬酸缓冲液、甘氨酸盐酸缓冲液、乙酸缓冲液。即，可以利用上述酸性侧的缓冲液来降低pH。洗脱液的pH例如可以设定在不损害免疫球蛋白的功能(对抗原的结合性等)的范围。洗脱液的pH例如可以为2以上、2.1以上、2.2以上、2.3以上、2.4以上、2.5以上、2.6以上、2.7以上、2.8以上、2.9以上、3以上、3.1以上或3.2以上，可以为4以下、3.5以下、3.2以下、3.1以下、3以下、2.9以下、2.8以下、2.7以下、2.6以下或2.5以下，可以为它们的彼此不矛盾的组合。洗脱液的pH具体而言可以为例如2以上且4以下、2.2以上且4以下、或2.4以上且4以下。
需要说明的是，在通过利用缓冲液降低pH来进行吸附于免疫球蛋白吸附剂的免疫球蛋白的洗脱的情况下，如果作为本发明的免疫球蛋白吸附剂的构成要素的本发明的蛋白质是能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质，则与包含不溶性载体和固定于该不溶性载体的由非改变型氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合性蛋白质的免疫球蛋白吸附剂相比能够将洗脱液的pH设为更高(即，在pH更高(接近中性的)条件下洗脱免疫球蛋白)。例如，至少具有从Gly21Arg、Gly51Val以及选自Asn62His、Asn62Arg和Asn62Trp中的任意者中选择的1个以上氨基酸置换的本发明的蛋白质可以为能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质。另外，例如至少具有第2组变异的本发明的蛋白质为能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质。即，通过使用作为能够以温和的pH条件洗脱抗体的免疫球蛋白结合性蛋白质的本发明的蛋白质来作为免疫球蛋白吸附剂的构成要素、即免疫球蛋白结合性蛋白质，从而相较于使用由非改变型氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合性蛋白质时而言，能够以更温和的pH条件(即，接近中性的条件)来洗脱免疫球蛋白。这种情况下，洗脱液的pH例如可以为上述例示的洗脱液的pH范围。另外，洗脱液的pH例如可以为2.5以上、2.6以上、2.7以上、2.8以上、2.9以上、2.95以上、3以上、3.05以上、3.1以上、3.15以上或3.2以上，可以为4以下、3.5以下、3.3以下、3.2以下、3.1以下或3以下，可以为它们的彼此不矛盾的组合。洗脱液的pH具体而言可以为例如2.5以上且4以下、2.8以上且4以下、2.95以上且4以下、3以上且4以下、或3.05以上且4以下。
通过利用上述方法来分离免疫球蛋白(抗体)，可得到经分离的免疫球蛋白。即，在其中的一个方式中，免疫球蛋白的分离方法可以为免疫球蛋白的制造方法，具体而言，可以为经分离的免疫球蛋白的制造方法。免疫球蛋白例如可以作为包含免疫球蛋白的洗脱级分而得到。即，可以对包含洗脱出的免疫球蛋白的级分进行分取。级分的分取例如可以利用常规方法来进行。作为对级分进行分取的方法，可列举：每隔一定时间、每隔一定体积更换回收容器的方法；与洗脱液的色谱图形状相匹配地更换回收容器的方法；用自动取样仪等自动级分采集器等对级分进行分取的方法。进而，还可以从包含免疫球蛋白的级分中回收免疫球蛋白。免疫球蛋白从包含免疫球蛋白的级分中的回收例如可以利用用于蛋白质的分离纯化的公知方法来进行。
实施例
以下使用实施例进一步具体地说明本发明，但是，本发明不受实施例限定。需要说明的是，参考例不构成本发明。
实施例1蛋白L免疫球蛋白结合结构域C3表达载体的制作
(1)合成编码由序列号1记载的氨基酸序列构成的源自芬戈尔德菌属菌(Finegoldia magna，大芬戈尔德菌)的蛋白L(以下记作FpL)的免疫球蛋白结合结构域C3(GenBank No.AAA67503(序列号210)的第394位至第463位的氨基酸残基，以下也记作“FpL_C3”)的氨基酸序列的多核苷酸(序列号2)。需要说明的是，合成时在5’末端侧添加了限制酶NcoI的识别序列(5’-CCATGG-3’)，在3’末端侧添加了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(5’-CATCACCACCATCACCAC-3’；序列号232)、终止密码子和限制酶HindIII的识别序列(5’-AAGCTT-3’)。
(2)将包含合成而得的序列号2的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII处理后，通过琼脂糖凝胶电泳确认目标物的尺寸的条带。切出目标条带后，利用QIAquick GelExtraction kit(QIAGEN公司制)纯化多核苷酸。
(3)用DNALigation Kit(宝生物公司制)对(2)中得到的多核苷酸和预先用限制酶NcoI和HindIII消化的质粒pET-26b进行连接。使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB(Luria-Bertani)平板培养基进行培养(37℃、16小时)。
(4)对(3)中得到的转化体(基因重组大肠杆菌)进行选择，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养后，通过利用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)的纯化获得能够表达FpL_C3的载体(命名为pET-FpL_C3)。
(5)对于(4)中得到的表达载体pET-FpL_C3中的编码FpL_C3的多核苷酸和其周边区域，使用基于链终止法的Big Dye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction kit(赛默飞世尔科技公司制)供于循环测序反应，利用全自动DNA测序仪ABIPrism3700DNAanalyzer(赛默飞世尔科技公司制)分析核苷酸序列。需要说明的是，该分析时使用由序列号3(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)或序列号4(5’-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3’)记载的序列构成的寡核苷酸作为测序用引物。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3中插入了由序列号2记载的序列构成的多核苷酸。
实施例2向FpL_C3导入变异和文库制作(其1)
向实施例1中制作的表达载体pET-FpL_C3中的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸部分(序列号2)，通过易错PCR随机地导入变异。
(1)使用实施例1中制作的pET-FpL_C3作为模板DNA，进行易错PCR。易错PCR如下进行：制备表1所示的组成的反应液后，将该反应液在95℃下热处理2分钟，使将95℃下30秒的第1步骤、50℃下30秒的第2步骤、72℃下90秒的第3步骤作为1个循环的反应进行30个循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。通过上述易错PCR向编码FpL_C3的多核苷酸(序列号2)中良好地导入了变异，其平均变异导入率为1.6％。
【表1】
表1
| 组成 | 体积 |
| 10ng/μL模板DNA | 1μL |
| 2.5mM dNTP混合物 | 8μL |
| 10μM PCR正向引物(序列号3) | 4μL |
| 10μM PCR反向引物(序列号4) | 4μL |
| 10mM MnCl2 | 2μL |
| 10mM MgCl2 | 12μL |
| Go Taq DNA聚合酶(普洛麦格公司制) | 1μL |
| H2O | 加至100μL |
(2)对得到的PCR产物进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII消化，连接于预先用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pET-26b。
(3)连接反应结束后，使用反应液转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37℃、16小时)后，将平板上形成的菌落作为随机变异体文库。
实施例3 FpL_C3氨基酸置换体的筛选(其1)
(1)将实施例2中制作的随机变异体文库(转化体)或实施例1中制作的表达FpL_C3(序列号1)的转化体接种于包含50μg/mL的卡那霉素的2×YT液体培养基(胰蛋白胨1.6％(w/v)、酵母提取物1％(w/v)、氯化钠0.5％(w/v))250μL，使用96孔深孔板在37℃下震荡培养一整夜。
(2)培养后，将(1)的培养液5μL接着接种于包含50μg/mL的卡那霉素、0.3％(w/v)的甘氨酸和0.01mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)的2×YT液体培养基500μL中，使用96孔深孔板进一步在20℃下震荡培养一整夜。
(3)培养后，将通过离心操作得到的培养上清和1.0M NaOH等量混合，在38℃下进行15分钟碱处理。
(4)通过下述所示的ELISA法来测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，通过将进行了(3)的碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行(3)的碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性。
(4-1)将使用Tris缓冲盐水(TBS)制备成10μg/mL的人抗体(丙球蛋白制剂、化学和血清疗法研究所制)分注于96孔微孔板的各孔并进行固定化(4℃、16小时)。固定化后，使用利用TBS制备成2％(w/v)的脱脂乳(BD公司制)进行封闭。
(4-2)用清洗缓冲液(包含0.15M NaCl和0.05％(w/v)Tween 20(商品名)的0.05MTris缓冲液(pH7.5)，以下也记作“清洗缓冲液A”)清洗96孔微孔板的各孔后，添加包含要评价抗体结合活性的免疫球蛋白结合性蛋白质的溶液，使免疫球蛋白结合性蛋白质与固定化丙球蛋白进行反应(30℃、1小时)。
(4-3)反应结束后，用清洗缓冲液A进行清洗，以100μL/孔添加稀释成100ng/mL的Anti-6-His抗体(BETHYL LABORATORIES公司制)进行反应(30℃、1小时)。
(4-4)反应结束后，用清洗缓冲液A进行清洗，以50μL/孔添加TMB过氧化物酶底物(KPL公司制)。接着以50μL/孔添加1M磷酸而使反应停止，用酶标仪(TECAN公司制)测定450nm的吸光度。
(5)对约1600株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于天然型(无氨基酸置换)FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(6)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(7)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸置换位置。
(8)将(5)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体，分别接种于包含50μg/mL的卡那霉素的2mL的2×YT液体培养基，在37℃下在有氧下振荡培养一整夜，由此进行预培养。
(9)向添加有50μg/mL的卡那霉素的20mL的2×YT液体培养基中接种预培养液200μL，在37℃下在有氧下进行振荡培养。
(10)培养起始起2小时后，将培养温度变更为20℃，以终浓度为0.01mM的方式添加IPTG，在20℃下在有氧下振荡培养一整夜。
(11)培养结束后，通过离心分离收集菌体，使用BugBuster蛋白提取试剂(默克公司制)制备蛋白质提取液。
(12)使用(4)记载的ELISA法测定(11)所制备的蛋白质提取液中的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性。
(13)以使各蛋白质的浓度相等的方式使用TBS进行稀释。将稀释液二等分，向一份中添加等量的0.2M NaOH(碱处理)并混合，向另一份中添加等量的TBS(未碱处理)并混合，然后在25℃下静置5小时。
(14)加入4倍量的1M Tris缓冲液(pH7.0)后，利用(4)记载的ELISA法测定碱处理(用终浓度0.1M NaOH在25℃下处理5小时)和未碱处理的蛋白质溶液的抗体结合活性。通过将经碱处理的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未碱处理的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表2。可以说，序列号1记载的氨基酸序列中至少具有选自Pro3Ser(该记载表示与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸，以下同样)、Glu5Val、Glu8Gly、Ile17Phe、Glu27Gly、Ala41Thr、Asn44Ser、Glu49Val、Asn50Ser、Asn50Tyr、Asn50Lys、Asn50Asp、Glu52Val、Glu52Gly、Thr54Ile、Asn62Tyr和Asn65Tyr中的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质相较于天然型FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高。
其中，具有Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(序列号11，命名为FpL_C3 2a)确认到显著的碱稳定性提高(天然型FpL_C3：40％、FpL_C3 2a：94％)。单独具有Glu52Gly的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(序列号16)的情况下碱稳定性提高不显著(天然型FpL_C3：40％、序列号16：48％)，因此推测带来显著的碱稳定性提高的氨基酸置换为Asn50Tyr。
【表2】
表2
※碱处理:25℃，0.1M NaOH(终浓度)，5h
实施例4 FpL免疫球蛋白结合结构域C4表达载体的制作
(1)合成编码由序列号18记载的氨基酸序列构成的FpL的免疫球蛋白结合结构域C4(GenBank No.AAA67503(序列号210)的第468位至第537位的氨基酸残基，以下也记作“FpL_C4”)的氨基酸序列的多核苷酸(序列号19)。需要说明的是，合成时在5’末端侧添加了限制酶NcoI的识别序列(5’-CCATGG-3’)，在3’末端侧添加了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(序列号232)、终止密码子和限制酶HindIII的识别序列(5’-AAGCTT-3’)。
(2)通过与实施例1(2)相同的方法纯化包含(1)中合成的序列号19的多核苷酸。
(3)通过与实施例1(3)相同的方法将(2)中得到的多核苷酸和预先用限制酶NcoI和HindIII消化的质粒pET-26b连接后，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株，进行培养。
(4)对(3)中得到的转化体(基因重组大肠杆菌)进行选择，然后通过与实施例1(4)相同的方法进行培养和质粒纯化，得到能表达FpL_C4的载体(命名为pET-FpL_C4)。
(5)对于(4)中得到的表达载体pET-FpL_C4中编码序列号19记载的FpL_C4的多核苷酸和其周边区域，通过与实施例1(5)相同的方法进行序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C4中插入了由序列号19记载的序列构成的多核苷酸。
实施例5向FpL_C4导入变异和文库制作
向实施例4中制作的表达载体pET-FpL_C4中的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸部分(序列号19)，通过与实施例2相同的方法通过易错PCR随机地导入变异，从而制作文库。变异导入率为3.5％。
实施例6 FpL_C4氨基酸置换体的筛选
(1)通过与实施例3(1)至(2)相同的方法培养实施例5中制作的随机变异体文库(转化体)或实施例4中制作的表达FpL_C4(序列号18)的转化体。
(2)培养后，将通过离心操作得到的培养上清与1.0M NaOH以等量进行混合，在42℃下进行15分钟碱处理。
(3)使用实施例3(4)记载的ELISA法来计算残留活性。
(4)对约600株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于天然型(无氨基酸置换)FpL_C4(序列号18)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(5)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(6)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸置换位置。
(7)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(4)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体，通过实施例3(11)中记载的方法制备蛋白质提取液。
(8)使用实施例3(4)记载的ELISA法测定(7)所制备的蛋白质提取液中的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性。
(9)将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表3。可以说，序列号18记载的氨基酸序列中至少具有选自Glu1Gly和Asn50Asp中的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质相较于天然型的FpL_C4(序列号18)而言碱稳定性提高。
【表3】
表3
※碱处理:25℃,0.1M NaOH(终浓度)，15h
实施例7 FpL_C3氨基酸置换集成体的制作(其1)
(1)FpL_C3氨基酸置换集成体的设计
通过使实施例3中已明确的与免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性提高有关的氨基酸置换集成于FpL_C3(序列号1)，来谋求碱稳定性的进一步提高。具体而言，设计并制作了以下的(a)至(l)所示的12种免疫球蛋白结合性蛋白质。
(a)对FpL_C3导入了Asn50Tyr、Glu52Gly和Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(序列号23、命名为FpL_C3 3a)
(b)对FpL_C3导入了Glu49Val、Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换的蛋白质(序列号27、命名为FpL_C3 3b)
(c)对FpL_C3导入了Asn44Ser、Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换的蛋白质(序列号30、命名为FpL_C3 3c)
(d)对FpL_C3导入了Asn44Asp、Asn50Tyr和Glu52Gly的氨基酸置换的蛋白质(序列号33、命名为FpL_C3 3d)
(e)对FpL_C3导入了Glu49Val、Asn50Tyr、Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(序列号36、命名为FpL_C3 3e)
(f)对FpL_C3导入了Asn44Ser、Glu49Val、Asn50Tyr、Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(序列号38、命名为FpL_C3 4a)
(g)对FpL_C3导入了Asn44Asp、Glu49Val、Asn50Tyr、Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(序列号40、命名为FpL_C3 4b)
(h)对FpL_C3导入了Glu49Val、Asn50Tyr、Glu52Gly和Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(序列号42、命名为FpL_C3 4c)
(i)对FpL_C3导入了Asn44Ser、Asn50Tyr、Glu52Gly和Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(序列号44、命名为FpL_C3 4d)
(j)对FpL_C3导入了Asn44Asp、Glu49Val、Asn50Tyr和Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(序列号46、命名为FpL4e)
(k)对FpL_C3导入了Asn44Ser、Glu49Val、Asn50Tyr、Glu52Gly和Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(序列号48、命名为FpL_C3 5a)
(l)对FpL_C3导入了Asn44Asp、Glu49Val、Asn50Tyr、Glu52Gly和Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(序列号50、命名为FpL_C3 5b)
(2)FpL_C3氨基酸置换集成体的制作
以下说明上述(a)至(l)所示的12种免疫球蛋白结合性蛋白质的制作方法。
(a)FpL_C3 3a
本蛋白质通过选择实施例3中已明确可提高碱稳定性的氨基酸置换中的Asn62Tyr、并且将该氨基酸置换导入到FpL_C3 2a(序列号11)中而制作。
(a-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3 3a(序列号23)的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR如下进行：以包含编码FpL_C3 2a的多核苷酸(序列号24)的表达载体(以下也记作“pET-FpL_C3 2a”)为模板DNA，以由序列号25记载的序列构成的寡核苷酸为PCR正向引物，以由序列号26记载的序列构成的寡核苷酸为PCR反向引物，制备表4所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下热处理2分钟，使将95℃下10秒的第1步骤、50℃下5秒的第2步骤、72℃下6分钟的第3步骤作为1个循环的反应进行30个循环，最后在72℃下热处理7分钟。
【表4】
表4
| 组成 | 体积 |
| 1ng/μL模板DNA | 1μL |
| 10μM PCR正向引物 | 1μL |
| 10μM PCR反向引物 | 1μL |
| PrimeSTAR HS(premix)(宝生物公司制) | 25μL |
| H2O | 加至50μL |
(a-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(a-3)用包含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养所得到的转化体，然后使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)提取表达载体(命名为pET-FpL_C3 3a)。
(a-4)通过与实施例1(5)相同的方法进行pET-FpL_C3 3a的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3 3a中插入了编码FpL_C3 3a(序列号23)的多核苷酸。
(b)FpL_C3 3b
本蛋白质通过选择实施例3中已明确可提高碱稳定性的氨基酸置换中的Glu49Val、并且将该氨基酸置换导入到FpL_C3 2a(序列号11)中而制作。
(b-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3 3b(序列号27)的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用pET-FpL_C3 2a作为模板DNA，使用由序列号28记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用由序列号29记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与(a-1)相同的方法来进行。
(b-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(b-3)对于得到的转化体，通过与(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3 3b)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3 3b中插入了编码FpL_C33b(序列号27)的多核苷酸。
(c)FpL_C3 3c
本蛋白质通过选择实施例3中已明确可提高碱稳定性的氨基酸置换中的Asn44Ser、并且将该氨基酸置换导入到FpL_C3 2a(序列号11)中而制作。
(c-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3 3c(序列号30)的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用由序列号31记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用序列号32记载的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与(a-1)相同的方法来进行。
(c-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(c-3)对于得到的转化体，通过与(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3 3c)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3 3c中插入了编码FpL_C3 3c(序列号30)的多核苷酸。
(d)FpL_C3 3d
本蛋白质通过选择实施例3中已明确可提高碱稳定性的氨基酸置换中的Asn44Asp、并且将该氨基酸置换导入到FpL_C3 2a(序列号11)中而制作。
(d-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3 3d(序列号33)的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用由序列号34记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用序列号35记载的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与(a-1)相同的方法来进行。
(d-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(d-3)对于得到的转化体，通过与(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3 3d)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3 3d中插入了编码FpL_C3 3d(序列号33)的多核苷酸。
(e)FpL_C3 3e
(e-1)合成编码FpL_C3 3e(序列号36)的多核苷酸(序列号37)。需要说明的是，合成时在5’末端侧添加了限制酶NcoI的识别序列(5’-CCATGG-3’)，在3’末端侧添加了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(5’-CATCACCACCATCACCAC-3’；序列号232)、终止密码子和限制酶HindIII的识别序列(5’-AAGCTT-3’)。
(e-2)通过与实施例1(2)相同的方法纯化(e-1)中合成的多核苷酸。
(e-3)通过与实施例1(3)相同的方法将(e-2)中得到的多核苷酸和预先用限制酶NcoI和HindIII消化的质粒pET-26b连接后，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株，进行培养。
(e-4)对于得到的转化体，通过与实施例1(4)相同的方法进行培养和质粒纯化，得到表达载体(命名为pET-FpL_C3 3e)后，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3 3e中插入了编码FpL_C33e(序列号36)的多核苷酸(序列号37)。
(f)FpL_C3 4a
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3 4a(序列号38)的多核苷酸(序列号39)，除此以外通过与(e)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3 4a)。表达载体pET-FpL_C3 4a的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C34a中插入了编码FpL_C3 4a(序列号38)的多核苷酸(序列号39)。
(g)FpL_C3 4b
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3 4b(序列号40)的多核苷酸(序列号41)，除此以外通过与(e)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3 4b)。表达载体pET-FpL_C3 4b的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C34b中插入了编码FpL_C3 4b(序列号40)的多核苷酸(序列号41)。
(h)FpL_C3 4c
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3 4c(序列号42)的多核苷酸(序列号43)，除此以外通过与(e)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3 4c)。表达载体pET-FpL_C3 4c的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C34c中插入了编码FpL_C3 4c(序列号42)的多核苷酸(序列号43)。
(i)FpL_C3 4d
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3 4d(序列号44)的多核苷酸(序列号45)，除此以外通过与(e)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3 4d)。表达载体pET-FpL_C3 4d的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C34d中插入了编码FpL_C3 4d(序列号44)的多核苷酸(序列号45)。
(j)FpL_C3 4e
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3 4e(序列号46)的多核苷酸(序列号47)，除此以外通过与(e)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3 4e)。表达载体pET-FpL_C3 4e的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C34e中插入了编码FpL_C3 4e(序列号46)的多核苷酸(序列号47)。
(k)FpL_C3 5a
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3 5a(序列号48)的多核苷酸(序列号49)，除此以外通过与(e)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3 5a)。表达载体pET-FpL_C3 5a的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C35a中插入了编码FpL_C3 5a(序列号48)的多核苷酸(序列号49)。
(l)FpL_C3 5b
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3 5b(序列号50)的多核苷酸(序列号51)，除此以外通过与(e)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3 5b)。表达载体pET-FpL_C3 5b的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C35b中插入了编码FpL_C3 5b(序列号50)的多核苷酸(序列号51)。
实施例8 FpL_C3氨基酸置换集成体的碱稳定性评价
(1)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养实施例1中制作的表达天然型FpL_C3(序列号1)的转化体、实施例3所得到的表达变异型(进行了氨基酸置换的)免疫球蛋白结合性蛋白质FpL_C3 2a(序列号11)的转化体、以及实施例7中制作的表达变异型免疫球蛋白结合性蛋白质FpL_C3 3a(序列号23)、FpL_C3 3b(序列号27)、FpL_C3 3c(序列号30)、FpL_C3 3d(序列号33)、FpL_C3 3e(序列号36)、FpL_C3 4a(序列号38)、FpL_C3 4b(序列号40)、FpL_C3 4c(序列号42)、FpL_C3 4d(序列号44)、FpL_C3 4e(序列号46)、FpL_C3 5a(序列号48)和FpL_C3 5b(序列号50)中的任意者的转化体，通过实施例3(11)中记载的方法制备蛋白质提取液。
(2)使用实施例3(4)记载的ELISA法测定(1)所制备的蛋白质提取液中的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性。
(3)将处理中使用的NaOH的浓度设为0.4M(终浓度0.2M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表5。本实施例中评价的变异型免疫球蛋白结合性蛋白质相较于天然型FpL_C3(序列号1)而言残留活性均高，确认这些变异型免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性提高。另外，对FpL_C3 3a(序列号23)、FpL_C33b(序列号27)、FpL_C3 3c(序列号30)、FpL_C3 3d(序列号33)和FpL_C33e(序列号36)的结果进行了比较，结果具有Asn62Tyr的氨基酸置换的变异型免疫球蛋白结合性蛋白质(FpL_C3 3a和FpL_C3 3e)的碱稳定性尤其提高，由此可知Asn62Tyr的氨基酸置换非常有助于提高免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性。
【表5】
表5
※碱处理:25℃,0.2M NaOH(终浓度),15h
实施例9向FpL_C3导入变异和文库制作(其2)
基于实施例3的结果，以变异型免疫球蛋白结合性蛋白质中的特定位置的氨基酸残基具有多个备选项的方式设计了包含混合碱基的寡核苷酸，将它们连接而制作变异体制作文库。以下对细节进行具体说明。
(1)以将编码由序列号2记载的序列构成的天然型FpL_C3的多核苷酸分成五份、并且第44位的氨基酸残基、第49位的氨基酸残基、第50位的氨基酸残基、第52位的氨基酸残基和第62位的氨基酸残基具有多个备选项的方式设计寡核苷酸(序列号52至61)。需要说明的是，设计出的寡核苷酸的内容如下。
[序列号52]
第1位至第24位：与pET26b的连接部
第28位至第80位：与序列号2的第1位至第53位相当的区域第57位至第80位：与序列号54的连接部
[序列号53]
序列号52的互补序列
[序列号54]
第1位至第75位：与序列号2的第30位至第104位相当的区域第1位至第24位：与序列号52的连接部
第51位至第75位：与序列号56的连接部
[序列号55]
序列号54的互补序列
[序列号56]
第1位至第75位：与序列号2的第80位至第156位相当的区域第1位至第25位：与序列号54的连接部
第51位至第77位：与序列号58的连接部
[序列号57]
序列号56的互补序列
[序列号58]
第1位至第76位：与序列号2的第130位至第205位相当的区域第1位至第27位：与序列号56的连接部
第47位至第76位：与序列号60的连接部
[序列号59]
序列号58的互补序列
[序列号60]
第1位至第35位：与序列号2的第176位至第210位相当的区域第1位至第30位：与序列号58的连接部第36位至第53位：编码6个组氨酸残基的区域
第54位至第56位：编码终止密码子的区域
第57位至第80位：与pET26b的连接部
[序列号61]
序列号60的互补序列
需要说明的是，对于序列号56的第51位至第53位，以与序列号1的第44位相当的氨基酸成为Asn(天冬酰胺)、Asp(天冬氨酸)、Ser(丝氨酸)或Gly(甘氨酸)的方式导入混合碱基，对于第66位至第68位，以与序列号1的第49位相当的氨基酸成为Glu(谷氨酸)或Val(缬氨酸)的方式导入混合碱基，对于第69位至第71位，以与序列号1的第50位相当的氨基酸成为Asn、Asp、Ser或Cys(半胱氨酸)的方式导入混合碱基，对于第75位至第77位，以与序列号1的第52位相当的氨基酸成为Gly或Val的方式导入混合碱基。
另外，对于序列号58的第55位至第57位，以与序列号1的第62位相当的氨基酸成为Asn或Tyr(酪氨酸)的方式导入了混合碱基。
(2)将合成的多核苷酸(序列号52至61)稀释为0.05pmol后，利用NEBBuilder(NEB公司制)连接于预先用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pET-26b。
(3)反应结束后，使用反应液转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37℃、16小时)后，将平板上形成的菌落作为随机变异体文库。
实施例10 FpL_C3氨基酸置换体的筛选(其2)
(1)通过与实施例3(1)至(2)相同的方法培养实施例3中制作的FpL_C32a和实施例9中制作的变异体文库(转化体)。
(2)培养后，将通过离心操作得到的培养上清与1.0M NaOH以等量进行混合，在43℃下进行15分钟碱处理。
(3)使用实施例3(4)记载的ELISA法来计算残留活性。
(4)对约540株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于FpL_C3 2a(序列号11)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(5)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(6)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸置换位置。
(7)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(4)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体、实施例1中制作的表达FpL_C3(序列号1)的转化体和实施例3所得到的表达FpL_C3 2a(序列号11)的转化体中的任意者，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。
(8)使用实施例3(4)记载的ELISA法测定(7)所制备的蛋白质提取液中的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性。
(9)将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将(4)中选择出的转化体所表达的免疫球蛋白结合性蛋白质相对于(序列号1)的氨基酸置换位置、经碱处理时的残留活性[％]和未碱处理的蛋白质溶液的抗体结合活性(吸光度)的汇总结果示于表6。本筛选中获得了下述3种变异型免疫球蛋白结合性蛋白质：
相对于FpL_C3导入了Asn44Asp、Asn50Tyr、Glu52Val和Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(命名为FpL_C3 4f，序列号62)、
相对于FpL_C3导入了Asn44Gly、Glu49Val、Asn50Tyr、Glu52Val和Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(命名为FpL_C3 5c，序列号63)、相对于FpL_C3导入了Asn44Gly、Glu49Val、Asn50Ser、Glu52Val和Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(命名为FpL_C3 5d，序列号64)。
上述3种变异型免疫球蛋白结合性蛋白质相对于FpL_C3 2a均提高了碱稳定性。由此可以说，在序列号1记载的氨基酸序列中至少具有选自Asn44Asp、Asn44Gly、Glu49Val、Asn50Ser、Glu52Val和Asn62Tyr中的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性提高。其中，具有Asn50Ser的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(FpL_C3 5d)相较于具有Asn50Tyr的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(FpL_C3 2a、FpL_C3 4f和FpL_C3 5c)而言，大幅降低了未碱处理的蛋白质溶液的抗体结合活性。
【表6】
表6
※碱处理:25℃,0.1M NaOH(浓度),15h
实施例11向FpL_C3导入变异和文库制作(其3)
(1)以实施例1中制作的pET-FpL_C3为模板，制作针对第21位、第22位、第31位、第49位、第51位和第62位的氨基酸残基的饱和置换体文库。引物依据22c-Trick法(SabrinaKille et.al.，ACS Synthetic Biology，2013，2，83-92)以在变异导入位置配置合适的混合碱基、能够进行以变异导入位置为中心的反向PCR的方式来设计(序列号65至100)。对于这些引物，针对每一个位置的置换以6条引物为一组，以表7和表8的组成进行混合，制备PCR引物混合液(正向/反向引物混合物)。
【表7】
表7
【表8】
表8
(2)以实施例1中制作的pET-FpL_C3为模板DNA，通过反向PCR进行位点特异性变异导入。反向PCR如下进行：在制备表9所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下热处理2分钟，将使95℃下10秒的第1步骤、50℃下5秒的第2步骤、72℃下6分钟的第3步骤作为1个循环的反应进行30个循环，最后在72℃下热处理7分钟。
【表9】
表9
| 组成 | 体积 |
| 1ng/μL模板DNA | 1μL |
| 正向/反向引物混合物 | 1μL |
| PrimeSTAR HS(premix)(宝生物公司制) | 25μL |
| H2O | 加至50μL |
(3)对得到的PCR产物进行纯化后，使用反应液转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37℃、16小时)后，将平板上形成的菌落作为位点特异性变异体文库。
实施例12 FpL_C3氨基酸置换体的筛选(其3)
(1)通过与实施例3(1)至(2)相同的方法培养实施例1中制作的能表达FpL_C3的转化体和实施例11中制作的位点特异性氨基酸置换体文库(转化体)。
(2)培养后，对于通过离心操作得到的培养上清，通过与实施例3(3)相同的方法进行碱处理，使用实施例3(4)记载的ELISA法来计算残留活性。
(3)对约500株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于天然型FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(4)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(5)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸置换位置。
(6)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(3)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体或实施例1中制作的表达FpL_C3(序列号1)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。
(7)使用实施例3(4)记载的ELISA法测定(6)所制备的蛋白质提取液中的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性。
(8)通过实施例3(13)中记载的方法进行碱处理后，通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将(3)中选择出的转化体所表达的免疫球蛋白结合性蛋白质相对于(序列号1)的氨基酸置换位置和经碱处理时的残留活性[％]的汇总结果示于表10。可以说，在序列号1记载的氨基酸序列中至少具有选自Gly21Arg、Lys22Thr、Thr31Leu、Glu49Thr、Glu49Ile、Gly51Val、Asn62His、Asn62Arg、Asn62Leu、Asn62Met、Asn62Tyr和Asn62Trp中的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高。
由表10可知，通过将序列号1的第62位的天冬酰胺(Asn62)置换为组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)之类的体积较大的氨基酸可提高碱稳定性。尤其可知，Asn62Tyr的氨基酸置换(序列号5)的碱稳定性最高(天然型FpL_C3：46％、Asn62Tyr：66％)。关于除了Asn62以外的位置，通过Gly21Arg、Glu49Thr和Gly51Val的氨基酸置换，可尤其提高碱稳定性。
【表10】
表10
※碱处理:25℃，0.1M NaOH(终浓度),5h
参考例1
(1)免疫球蛋白结合性蛋白质(赖氨酸置换体)的设计
WO2017/069158号公开了通过将FpL的免疫球蛋白结合结构域所具有的赖氨酸残基置换为除了赖氨酸以外的其它碱性氨基酸或具有羟基的氨基酸而提高了碱稳定性的免疫球蛋白结合性蛋白质。在此，为了确认上述文献的效果，制作了将FpL的免疫球蛋白结合结构域所具有的赖氨酸残基置换为作为除了赖氨酸以外的其它碱性氨基酸的精氨酸残基而形成的免疫球蛋白结合性蛋白质。具体而言，设计了以下的(α)至(δ)所示的4种免疫球蛋白结合性蛋白质。
(α)将FpL的免疫球蛋白结合结构域C1(GenBank No.AAA67503的第249位至第317位的氨基酸残基、序列号112、以下也记作“FpL_C1”)所具有的全部赖氨酸残基(具体而言序列号112的第12位、第28位、第33位、第46位、第47位、第59位和第66位的赖氨酸残基)置换为精氨酸残基的免疫球蛋白结合性蛋白质(序列号114、以下也记作“FpL_C1KR”)。
(β)将FpL的免疫球蛋白结合结构域C2(GenBank No.AAA67503的第320位至第389位的氨基酸残基、序列号113、以下也记作“FpL_C2”)所具有的全部赖氨酸残基(具体而言序列号113的第2位、第7位、第13位、第22位、第29位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸残基)置换为精氨酸残基的免疫球蛋白结合性蛋白质(序列号115、以下也记作“FpL_C2KR”)。
(γ)将FpL_C3(序列号1)的全部赖氨酸残基(具体而言序列号1的第7位、第13位、第22位、第29位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸残基)置换为精氨酸残基的免疫球蛋白结合性蛋白质(序列号116、以下也记作“FpL_C3KR”)
(δ)将FpL_C4(序列号18)的全部赖氨酸残基(具体而言序列号18的第7位、第13位、第22位、第29位、第48位和第67位的赖氨酸残基)置换为精氨酸残基的免疫球蛋白结合性蛋白质(序列号117、以下记作“FpL_C4KR”)
(2)免疫球蛋白结合性蛋白质(赖氨酸置换体)的制作
(α)FpL_C1KR
(α-1)合成编码FpL_C1KR(序列号114)的多核苷酸(序列号120)。需要说明的是，合成时在5’末端侧添加了限制酶NcoI的识别序列(5’-CCATGG-3’)，在3’末端侧添加了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(5’-CATCACCACCATCACCAC-3’；序列号232)、终止密码子和限制酶HindIII的识别序列(5’-TAAGCTT-3’)。
(α-2)通过与实施例1(2)相同的方法纯化(α-1)中合成的多核苷酸。
(α-3)通过与实施例1(3)相同的方法将(α-2)中得到的多核苷酸与预先用限制酶NcoI和HindIII消化的质粒pET-26b连接后，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株，进行培养。
(α-4)对于得到的转化体，通过与实施例1(4)相同的方法进行培养和质粒纯化，得到表达载体(命名为pET-FpL_C1KR)后，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C1KR中插入了编码FpL_C1KR(序列号114)的多核苷酸(序列号120)。
(β)FpL_C2KR
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C2KR(序列号115)的多核苷酸(序列号121)，除此以外通过与(α)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C2KR)。表达载体pET-FpL_C2KR的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C2KR中插入了编码FpL_C2KR(序列号115)的多核苷酸(序列号121)。
(γ)FpL_C3KR
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3KR(序列号116)的多核苷酸(序列号122)，除此以外通过与(α)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3KR)。表达载体pET-FpL_C3KR的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C3KR中插入了编码FpL_C3KR(序列号116)的多核苷酸(序列号122)。
(δ)FpL_C4KR
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C4KR(序列号117)的多核苷酸(序列号123)，除此以外通过与(α)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C4KR)。表达载体pET-FpL_C4KR的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C4KR中插入了编码FpL_C4KR(序列号117)的多核苷酸(序列号123)。
(3)免疫球蛋白结合性蛋白质(天然型)的制作
(ε)FpL_C1
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C1(序列号112)的多核苷酸(序列号118)，除此以外通过与(α)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C1)。表达载体pET-FpL_C1的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C1中插入了编码FpL_C1(序列号112)的多核苷酸(序列号118)。
(ζ)FpL_C2
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C2(序列号113)的多核苷酸(序列号119)，除此以外通过与(α)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C2)。表达载体pET-FpL_C2的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C1中插入了编码FpL_C1(序列号113)的多核苷酸(序列号119)。
参考例2
(1)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养实施例1中制作的表达FpL_C3(序列号1)的转化体、实施例4中制作的表达FpL_C4(序列号18)的转化体、以及参考例1中制作的表达FpL_C1(序列号112)、FpL_C2(序列号113)、FpL_C1KR(序列号114)、FpL_C2KR(序列号115)、FpL_C3KR(序列号116)和FpL_C4KR(序列号117)中的任意者的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清添加到预先用包含0.5M的NaCl和0.02M咪唑的0.05MTris缓冲液(pH7.5)(以下记作清洗缓冲液B)平衡化的填充有Ni-NTA Sepharose 6 FastFlow(Cytiva公司制)的柱中。用上述柱中所填充的载体的10倍量的清洗缓冲液B清洗后，通入包含0.5M的NaCl和0.5M咪唑的0.05M Tris缓冲液(pH7.5)，从而回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺电泳)，确认了已将上述蛋白质纯化为良好纯度。
(4)将处理中使用的NaOH的浓度设为1.0M(终浓度0.5M)，将处理温度设为42℃，将处理时间设为15分钟，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表11。FpL_C2(序列号113)、FpL_C3(序列号1)和FpL_C4(序列号18)通过将全部赖氨酸残基置换为精氨酸残基(FpL_C2KR(序列号115)、FpL_C3KR(序列号116)和FpL_C4KR(序列号117))而碱稳定性提高。
【表11】
表11
/>
※碱处理:42℃,0.5M NaOH(终浓度),15min
实施例13向FpL_C4KR导入变异和文库制作
(1)以参考例1(2)(δ)中得到的pET-FpL_C4KR为模板，制作针对第7位和第29位的氨基酸残基的饱和置换体文库。引物与实施例11(1)同样地依据22c-Trick法以在变异导入位置配置合适的混合碱基、能够进行以变异导入位置为中心的反向PCR的方式来设计(序列号124至135)。对于这些引物，针对每一个位置的置换以6条引物为一组，以表7和表12的组成进行混合，制备PCR引物混合液(正向/反向引物混合物)。
【表12】
表12
(2)以pET-FpL_C4KR为模板DNA，除此以外通过与实施例11(2)相同的方法通过反向PCR进行位点特异性变异导入。
(3)对得到的PCR产物进行纯化后，使用反应液转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37℃、16小时)后，将平板上形成的菌落作为位点特异性变异体文库。
实施例14FpL_C4KR氨基酸置换体的筛选
(1)通过与实施例3(1)至(2)相同的方法培养参考例1(2)(δ)中制作的表达FpL_C4KR(序列号117)的转化体和实施例13中制作的位点特异性氨基酸置换体文库(转化体)。
(2)培养后，对于通过离心操作得到的培养上清，通过与实施例3(3)相同的方法进行碱处理，使用实施例3(4)记载的ELISA法来计算残留活性。
(3)对约200株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于FpL_C4KR(序列号117)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(4)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(5)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸置换位置。
(6)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(3)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体或参考例1中制作的表达FpL_C4KR(序列号117)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。
(7)使用实施例3(4)记载的ELISA法测定(6)所制备的蛋白质提取液中的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性。
(8)通过实施例3(13)中记载的方法进行碱处理后，通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将(3)中选择出的转化体所表达的免疫球蛋白结合性蛋白质相对于(序列号117)的氨基酸置换位置和经碱处理时的残留活性[％]的汇总结果示于表13。可以说，在序列号117记载的氨基酸序列中至少具有Lys(Arg)7Ala(该记载表示与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基(序列号18中第7位的赖氨酸)在暂时置换为精氨酸后、进一步置换为丙氨酸，以下同样)和/或Lys(Arg)29Pro的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质相较于FpL_C4KR(序列号117)而言碱稳定性提高。
【表13】
表13
※碱处理:25℃,0.1M NaOH(终浓度),5h
实施例15FpL_C3KR氨基酸置换集成体的制作
(1)FpL_C3KR氨基酸置换集成体的设计
通过使实施例8和实施例12中已明确的与免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性提高有关的氨基酸置换集成于FpL_C3KR(序列号116)，来谋求稳定性的进一步提高。具体而言，设计并制作了以下的(m)至(p)所示的4种免疫球蛋白结合性蛋白质。
(m)相对于FpL_C3KR导入了Gly21Arg的氨基酸置换的蛋白质(命名为FpL_C3KR1a)
(n)相对于FpL_C3KR导入了Gly51Val的氨基酸置换的蛋白质(命名为FpL_C3KR1b)
(o)相对于FpL_C3KR导入了Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(命名为FpL_C3KR1c)
(p)相对于FpL_C3KR导入了Asn50Tyr、Glu52Gly和Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(命名为FpL_C3KR 3a)
(2)FpL_C3KR氨基酸置换集成体的制作
以下说明上述(m)至(p)所示的4种免疫球蛋白结合性蛋白质的制作方法。
(m)FpL_C3KR 1a
本蛋白质通过选择实施例12中已明确可提高碱稳定性的氨基酸置换中的Gly21Arg、并且将该氨基酸残基导入到FpL_C3KR(序列号116)中而制作。
(m-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3KR 1a(序列号138)的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用pET-FpL_C3KR作为模板DNA，使用由序列号146记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用由序列号147记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(m-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(m-3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KR 1a)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KR 1a中插入了编码FpL_C3KR 1a(序列号138)的多核苷酸。
(n)FpL_C3KR 1b
本蛋白质通过选择实施例12中已明确可提高碱稳定性的氨基酸置换中的Gly51Val、并且将该氨基酸残基导入到FpL_C3KR(序列号116)中而制作。
(n-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3KR 1b(序列号139)的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用包含pET-FpL_C3KR的多核苷酸作为模板DNA，使用由序列号148记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用由序列号149记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(n-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(n-3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KR 1b)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KR 1b中插入了编码FpL_C3KR 1b(序列号139)的多核苷酸。
(o)FpL_C3KR 1c
(o-1)设计包含pET26b和编码FpL_C3KR 1c(序列号140)的多核苷酸(序列号150)的表达载体pET-FpL_C3KR 1c的核苷酸序列，分成以下3个区域。
第一区域：pET26b的核苷酸序列、编码FpL_C3KR 1c的第1位至第20位的氨基酸残基的核苷酸序列(序列号150的第1位至第60位的核苷酸序列)、编码FpL_C3KR 1c的第53位至第70位的氨基酸残基的核苷酸序列(序列号150的第157位至第210位的核苷酸序列)、编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(序列号232)、终止密码子和限制酶HindIII的识别序列(5’-TAAGCTT-3’)
第二区域：编码FpL_C3KR 1c的第16位至第37位的氨基酸残基的核苷酸序列(由序列号153[正向]和154[反向]记载的序列构成的多核苷酸)
第三区域：编码FpL_C3KR1c的第33位至第57位的氨基酸残基的核苷酸序列(由序列号155[正向]和156[反向]记载的序列构成的多核苷酸)
(o-2)通过反向PCR制备上述第一区域的多核苷酸。反向PCR中，使用pET-FpL_C4KR作为模板DNA，使用由序列号151记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用由序列号152记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。反向PCR后，纯化包含上述第一区域的多核苷酸。
(o-3)将(o-2)所制备的上述第一区域的多核苷酸、以及(o-1)中设计的上述第二区域和上述第三区域的多核苷酸(通过直接化学合成而制作)使用NEBuilder(NEB公司制)进行连接。需要说明的是，将上述三个区域(以多核苷酸计为5种)的多核苷酸分别向反应液中添加了0.05pmol。
(o-4)使用连接而形成的多核苷酸转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(o-5)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KR 1c中插入了编码FpL_C3KR 1c(序列号140)的多核苷酸(序列号150)。
(p)FpL_C3KR 3a
(p-1)设计包含pET26b和编码FpL_C3KR 3a(序列号141)的多核苷酸(序列号157)的表达载体pET-FpL_C3KR 3a的核苷酸序列，分成以下3个区域。
第一区域：pET26b的核苷酸序列、编码FpL_C3KR 3a的第1位至第20位的氨基酸残基的核苷酸序列(序列号141的第1位至第60位的核苷酸序列)、编码FpL_C3KR 3a的第53位至第70位的氨基酸残基的核苷酸序列(序列号141的第157位至第210位的核苷酸序列)、编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(序列号232)、终止密码子和限制酶HindIII的识别序列(5’-TAAGCTT-3’)
第二区域：编码FpL_C3KR 3a的第16位至第37位的氨基酸残基的核苷酸序列(由序列号153[正向]和154[反向]记载的序列构成的多核苷酸)
第三区域：编码FpL_C3KR 3a的第33位至第57位的氨基酸残基的核苷酸序列(由序列号158[正向]和159[反向]记载的序列构成的多核苷酸)
(p-2)通过(o-2)记载的反向PCR制备上述第一区域的多核苷酸并进行纯化。
(p-3)将(p-2)所制备的上述第一区域的多核苷酸、以及(p-1)中设计的上述第二区域和上述第三区域的多核苷酸(通过直接化学合成而制作)通过与(o-3)相同的方法连接。
(p-4)使用连接而形成的多核苷酸转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(p-5)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KR 3a中插入了编码FpL_C3KR 3a(序列号141)的多核苷酸(序列号157)。
实施例16 FpL_C3氨基酸置换集成体的制作(其2)
(1)FpL_C3氨基酸置换集成体的设计
制作将FpL_C3KR(序列号116)中由赖氨酸残基置换成的精氨酸残基的一部份置换为其它氨基酸残基(具体而言，具有Lys(Arg)7Ala、Lys(Arg)22Gln和Lys(Arg)29Ile的氨基酸置换)的免疫球蛋白结合性蛋白质FpL_C3KX(序列号142)，使实施例8和实施例12中已明确的与免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性提高有关的氨基酸置换集成于FpL_C3KX(序列号142)。具体而言，设计并制作了以下的(q)至(s)所示的4种免疫球蛋白结合性蛋白质。
(q)相对于FpL_C3KX导入了Gly21Arg的氨基酸置换的蛋白质(命名为FpL_C3KX1a)
(r)相对于FpL_C3KX导入了Asn50Tyr、Glu52Gly和Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(命名为FpL_C3KX 3a)
(s)相对于FpL_C3KX导入了Gly21Arg、Asn50Tyr、Glu52Gly和Asn62Tyr的氨基酸置换的蛋白质(命名为FpL_C3KX 4g)
(2)FpL_C3 KX的制作
(2-1)设计了包含pET26b和编码FpL_C3KX(序列号142)的多核苷酸(序列号161)的表达载体pET-FpL_C3KX的核苷酸序列，分为以下3个区域。
第一区域：pET26b的核苷酸序列、编码FpL_C3KX的第1位至第20位的氨基酸残基的核苷酸序列(序列号161的第1位至第60位的核苷酸序列)、编码FpL_C3KX的第53位至第70位的氨基酸残基的核苷酸序列(序列号161的第157位至第210位的核苷酸序列)、编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(序列号232)、终止密码子和限制酶HindIII的识别序列(5’-TAAGCTT-3’)
第二区域：编码FpL_C3KX的第16位至第37位的氨基酸残基的核苷酸序列(由序列号163[正向]和164[反向]记载的序列构成的多核苷酸)
第三区域：编码FpL_C3KX的第33位至第57位的氨基酸残基的核苷酸序列(由序列号155[正向]和156[反向]记载的序列构成的多核苷酸)
(2-2)通过反向PCR制备包含上述第一区域的多核苷酸。反向PCR中，使用包含编码FpL_C4KR K7A(向FpL_C4KR中导入了Lys(Arg)7Ala的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质、序列号136)的多核苷酸(序列号160)的表达载体pET-FpL_C4KR K7A作为模板DNA，使用由序列号162记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用由序列号152记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。反向PCR后，纯化包含上述第一区域的多核苷酸。
(2-3)将(2-2)所制备的上述第一区域的多核苷酸、以及(2-1)中设计的上述第二区域和上述第三区域的多核苷酸(通过直接化学合成而制作)通过与实施例15(2)(o-3)相同的方法连接。
(2-4)使用连接而形成的多核苷酸转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(2-5)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX中插入了编码FpL_C3KX(序列号142)的多核苷酸(序列号161)。
(3)FpL_C3KX氨基酸置换集成体的制作
以下说明上述(q)至(s)所示的3种免疫球蛋白结合性蛋白质的制作方法。
(q)FpL_C3KX 1a
(q-1)设计包含pET26b和编码FpL_C3KX 1a(序列号143)的多核苷酸(序列号165)的表达载体pET-FpL_C3KX 1a的核苷酸序列，分成以下3个区域。
第一区域：pET26b的核苷酸序列、编码FpL_C3KX 1a的第1位至第20位的氨基酸残基的核苷酸序列(序列号165的第1位至第60位的核苷酸序列)、编码FpL_C3KX 1a的第53位至第70位的氨基酸残基的核苷酸序列(序列号165的第157位至第210位的核苷酸序列)、编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(序列号232)、终止密码子和限制酶HindIII的识别序列(5’-TAAGCTT-3’)
第二区域：编码FpL_C3KX 1a的第16位至第37位的氨基酸残基的核苷酸序列(由序列号166[正向]和167[反向]记载的序列构成的多核苷酸)
第三区域：编码FpL_C3KX 1a的第33位至第57位的氨基酸残基的核苷酸序列(由序列号155[正向]和156[反向]记载的序列构成的多核苷酸)
(q-2)通过(2-2)记载的反向PCR制备上述第一区域的多核苷酸并进行纯化。
(q-3)将(q-2)所制备的上述第一区域的多核苷酸、以及(q-1)中设计的上述第二区域和上述第三区域的多核苷酸(通过直接化学合成而制作)通过与实施例15(2)(o-3)相同的方法连接。
(q-4)使用连接而形成的多核苷酸转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(q-5)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 1a)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 1a中插入了编码FpL_C3KX 1a(序列号143)的多核苷酸(序列号165)。
(r)FpL_C3KX 3a
(r-1)设计包含pET26b和编码FpL_C3KX 3a(序列号144)的多核苷酸(序列号168)的表达载体pET-FpL_C3KX 3a的核苷酸序列，分为以下3个区域。
第一区域：pET26b的核苷酸序列、编码FpL_C3KX 3a的第1位至第20位的氨基酸残基的核苷酸序列(序列号168的第1位至第60位的核苷酸序列)、编码FpL_C3KX 3a的第53位至第70位的氨基酸残基的核苷酸序列(序列号168的第157位至第210位的核苷酸序列)、编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(序列号232)、终止密码子和限制酶HindIII的识别序列(5’-TAAGCTT-3’)
第二区域：编码FpL_C3KX 3a的第16位至第37位的氨基酸残基的核苷酸序列(由序列号169[正向]和170[反向]记载的序列构成的多核苷酸)
第三区域：编码FpL_C3KX 3a的第33位至第57位的氨基酸残基的核苷酸序列(由序列号158[正向]和159[反向]记载的序列构成的多核苷酸)
(r-2)通过反向PCR制备上述第一区域的多核苷酸。反向PCR中，使用pET-FpL_C4KRK7A作为模板DNA，使用由序列号151记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用由序列号152记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。反向PCR后，纯化包含上述第一区域的多核苷酸。
(r-3)将(r-2)所制备的上述第一区域的多核苷酸、以及(r-1)中设计的上述第二区域和上述第三区域的多核苷酸(通过直接化学合成而制作)通过与实施例15(2)(o-3)相同的方法连接。
(r-4)使用连接而形成的多核苷酸转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(r-5)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 3a中插入了编码FpL_C3KX 3a(序列号144)的多核苷酸(序列号168)。
(s)FpL_C3KX 4g
(s-1)设计包含pET26b和编码FpL_C3KX 4g(序列号145)的多核苷酸(序列号171)的表达载体pET-FpL_C3KX 4g的核苷酸序列，分为以下3个区域。
第一区域：pET26b的核苷酸序列、编码FpL_C3KX 4g的第1位至第20位的氨基酸残基的核苷酸序列(序列号171的第1位至第60位的核苷酸序列)、编码FpL_C3KX 4g的第53位至第70位的氨基酸残基的核苷酸序列(序列号171的第157位至第210位的核苷酸序列)、编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(序列号232)、终止密码子和限制酶HindIII的识别序列(5’-TAAGCTT-3’)
第二区域：编码FpL_C3KX 4g的第16位至第37位的氨基酸残基的核苷酸序列(由序列号166[正向]和167[反向]记载的序列构成的多核苷酸)
第三区域：编码FpL_C3KX 4g的第33位至第57位的氨基酸残基的核苷酸序列(由序列号158[正向]和159[反向]记载的序列构成的多核苷酸)
(s-2)通过(r-2)记载的反向PCR制备上述第一区域的多核苷酸并进行纯化。
(s-3)将(s-2)所制备的上述第一区域的多核苷酸、以及(s-1)中设计的上述第二区域和上述第三区域的多核苷酸(通过直接化学合成而制作)通过与实施例15(2)(o-3)相同的方法连接。
(s-4)使用连接而形成的多核苷酸转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(s-5)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 4g中插入了编码FpL_C3KX 4g(序列号145)的多核苷酸(序列号171)。
实施例17 FpL_C3KX氨基酸置换集成体的碱稳定性评价
(1)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养实施例1中制作的表达天然型FpL_C3(序列号1)的转化体、参考例1中制作的表达变异型(进行了氨基酸置换的)免疫球蛋白结合性蛋白质FpL_C3KR(序列号116)的转化体、实施例15中制作的表达变异型免疫球蛋白结合性蛋白质FpL_C3KR 1a(序列号138)、FpL_C3KR 1b(序列号139)、FpL_C3KR 1c(序列号140)和FpL_C3KR 3a(序列号141)中的任意者的转化体、以及实施例16中制作的表达变异型免疫球蛋白结合性蛋白质FpL_C3KX(序列号142)、FpL_C3KX 1a(序列号143)、FpL_C3KX 3a(序列号144)和FpL_C3KX 4g(序列号145)中的任意者的转化体，通过实施例3(11)中记载的方法制备蛋白质提取液。
(2)使用实施例3(4)记载的ELISA法测定(1)所制备的蛋白质提取液中的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性。
(3)将处理中使用的NaOH的浓度设为0.4M(终浓度0.2M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表14。可以说，通过至少具有选自Gly21Arg、Asn50Tyr、Gly51Val、Glu52Gly和Asn62Tyr中的1个以上氨基酸置换，相较于未导入这些氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(FpL_C3KR和FpL_C3KX)而言碱稳定性提高。可以说，尤其是具有Asn50Tyr、Glu52Gly和Asn62Tyr的全部氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(FpL_C3KR 3a和FpL_C3KX 3a)，可尤其提高碱稳定性(FpL_C3KR：54％、FpL_C3KR 3a：86％)(FpL_C3KX：10％、FpL_C3KX 3a：69％)。
【表14】
表14
※碱处理:25℃,0.2M NaOH(终浓度),15h
实施例18向FpL_C3KX 3a导入变异和文库制作
向实施例16(r)中制作的表达载体pET-FpL_C3KX 3a中的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸部分(序列号168)中，通过与实施例2相同的方法通过易错PCR随机地导入变异，从而制作文库。平均变异导入率为1.7％。
实施例19 FpL_C3KX 3a氨基酸置换体的筛选(其1)
(1)通过与实施例3(1)至(2)相同的方法培养实施例16(r)中制作的pET-FpL_C3KX3a(转化体)和实施例18中制作的随机变异体文库(转化体)。
(2)培养后，将通过离心操作得到的培养上清与1.0M NaOH以等量进行混合，在42℃下进行30分钟碱处理。
(3)通过实施例3(4)记载的ELISA法测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，通过将进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性。
(4)对约900株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于FpL_C3KX 3a(序列号144)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(5)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(6)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸的变异位置。
(7)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(4)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。
(8)使用实施例3(4)记载的ELISA法测定(7)所制备的蛋白质提取液中的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性。
(9)将处理中使用的NaOH的浓度设为1.0M(终浓度0.5M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表15。可以说，在序列号144记载的氨基酸序列中至少具有Glu1Gly或Glu1Val的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质即使与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 3a(序列号144)相比碱稳定性也提高。
【表15】
表15
※碱处理:25℃,0.5M NaOH(终浓度),15h
实施例20 FpL_C3KX 3a氨基酸置换体的筛选(其2)
(1)从实施例18中制作的随机变异体文库(转化体)中，通过实施例19(1)至(3)中记载的方法从新对约1400株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质(FpL_C3KX 3a)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(2)培养选择出的转化体或实施例16(r)中制作的表达FpL_C3KX 3a(序列号144)的转化体，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(3)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸的变异位置。
(4)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(1)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。
(5)使用实施例3(4)记载的ELISA法测定(4)所制备的蛋白质提取液中的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性。
(6)将处理中使用的NaOH的浓度设为0.4M(终浓度0.2M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表16。可以说，在序列号144记载的氨基酸序列中至少具有选自Glu4Lys、Glu27Arg和Thr36Ala的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质即使与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 3a(序列号144)相比碱稳定性也提高。
【表16】
表16
※碱处理:25℃，0.2M NaOH(终浓度),15h
实施例21免疫球蛋白结合性蛋白质的免疫球蛋白κ轻链结合性评价(其1)
通过下述所示的ELISA法测定变异型免疫球蛋白结合性蛋白质的免疫球蛋白κ轻链结合活性，评价氨基酸置换对人免疫球蛋白κ轻链结合活性的影响。
(1)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养参考例1中制作的表达FpL_C3KR(序列号116)的转化体和表达FpL_C4KR(序列号117)的转化体、实施例16中制作的表达FpL_C3KX 3a(序列号144)的转化体以及实施例20中得到的表达在FpL_C3KX 3a中导入有Glu49Asp的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(序列号179、以下也记作“FpL_C3KX4h”)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的各变异型免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将各变异型免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(4)通过下述所示的ELISA法测定变异型免疫球蛋白结合性蛋白质的人免疫球蛋白κ轻链结合活性，评价氨基酸置换对人免疫球蛋白κ轻链结合活性的影响。
(4-1)将使用TBS制备成10μg/mL的多克隆抗体溶液分注到96孔微孔板的孔中，进行固定化(4℃、16小时)。使用的多克隆抗体为下述中任意者：
包含人κ轻链亚组1(Vκ1)的赫赛汀(中外制药公司制)、
包含人κ轻链亚组3(Vκ3)的人PDGF R alpha抗体(R&D Systems公司制)、
包含人κ轻链亚组3(Vκ3)的人CTLA4抗体(R&D Systems公司制)和、
包含人κ轻链亚组4(Vκ4)的人PCSK9抗体(R&D Systems公司制)。固定化后，利用使用TBS制备成2％(w/v)的脱脂乳(BD公司制)进行封闭。
(4-2)用包含清洗缓冲液A(0.15M NaCl和0.05％(w/v)Tween 20(商品名)的0.05MTris缓冲液(pH7.5))清洗96孔微孔板的孔后，添加稀释为50μg/mL的包含要评价抗体结合活性的免疫球蛋白结合性蛋白质的溶液，使免疫球蛋白结合性蛋白质与固定化多克隆抗体进行反应(30℃、1小时)。
(4-3)反应结束后，用清洗缓冲液A进行清洗，以100μL/孔添加稀释成100ng/mL的Anti-6-His Antibody(BETHYL LABORATORIES公司制)进行反应(30℃、1小时)。
(4-4)反应结束后，用清洗缓冲液A进行清洗，以50μL/孔添加TMB过氧化物酶底物(KPL公司制)。接着以50μL/孔添加1M磷酸而使反应停止，用酶标仪(TECAN公司制)测定450nm的吸光度。
(4-5)计算固定有多克隆抗体的孔与未固定多克隆抗体的孔的吸光度之差，由该计算而得的吸光度评价多克隆抗体与变异型免疫球蛋白结合性蛋白质的结合性。各多克隆抗体间的吸光度差异表示与不同的人κ轻链的结合性，该数值在每种多克隆抗体间偏差大则表示与特定人κ轻链亚组的结合性降低。
将结果示于表17。FpL_C4KR(序列号117)和FpL_C3KX_4h(序列号179)在各多克隆抗体间偏差小，因此可以说能够与亚组无关地同人免疫球蛋白κ轻链结合。另一方面，FpL_C3KR(序列号116)和FpL_C3KX3a(序列号144)特别降低与人Vκ3的结合力。由以上结果可知，通过导入Glu49Asp的氨基酸置换，能够赋予与Vκ3的结合力。
【表17】
表17
实施例22向FpL_C3KX 4h导入变异和文库制作
向实施例20中制作的表达FpL_C3KX 4h(序列号179)的载体pET-FpL_C3KX 4h中的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸部分(序列号180)，通过与实施例2相同的方法通过易错PCR随机地导入变异，从而制作文库。平均变异导入率为1.7％。
实施例23FpL_C3KX 4h氨基酸置换体的筛选
(1)对于通过与实施例3(1)至(2)相同的方法培养实施例22中制作的随机变异体文库(转化体)后通过离心操作得到的培养上清，进行实施例19(2)记载的碱处理。
(2)通过实施例3(4)记载的ELISA法测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，通过将进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性。
(3)对约900株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质(FpL_C3KX 4h)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(4)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(5)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸的变异位置。
(6)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(5)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体或实施例20中制作的表达FpL_C3KX 4h(序列号179)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(7)将(6)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(8)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(9)将处理中使用的NaOH的浓度设为1.0M(终浓度0.5M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表18。可以说，在序列号179记载的氨基酸序列中至少具有选自Glu9Val、Tyr53Phe、Thr54Met和Ala69Thr中的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质即使与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 4h(序列号179)相比碱稳定性也提高。
需要说明的是，将用20mL培养基进行培养时的纯化收量进行比较，其结果，确认了通过导入Lys(Gln)22Arg的氨基酸置换显著提高蛋白质纯化收量。下文中，将在FpL_C3KX4h中导入了Lys(Gln)22Arg的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质命名为FpL_C3KX 4i(序列号182)。
【表18】
表18
※碱处理:25℃,0.5M NaOH(终浓度),15h
实施例24 FpL_C3KX 4i氨基酸置换集成体的制作
(1)FpL_C3KX 4i氨基酸置换集成体的设计
通过使实施例23中已明确的与免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性提高有关的氨基酸置换集成于FpL_C3KX 4i(序列号182)，来谋求稳定性的进一步提高。具体而言，设计并制作了以下的(t)和(u)所示的2种免疫球蛋白结合性蛋白质。
(t)相对于FpL_C3KX 4i导入了Tyr53Phe的氨基酸置换的蛋白质(序列号186、命名为FpL_C3KX 5e)
(u)相对于FpL_C3KX 4i导入了Thr54Met的氨基酸置换的蛋白质(序列号187、命名为FpL_C3KX 5f)
(2)FpL_C3KX 4i氨基酸置换集成体的制作
以下说明(t)和(u)所示的2种免疫球蛋白结合性蛋白质的制作方法。
(t)FpL_C3KX 5e
(t-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3KX 5e(序列号186)的核苷酸序列的多核苷酸。作为模板DNA，反向PCR中使用包含编码FpL_C3KX 4i(序列号182)的多核苷酸(序列号188)的表达载体(以下也记作“pET-FpL_C3KX 4i”)，并且使用序列号189记载的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用序列号190记载的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(t-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(t-3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 5e)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 5e中插入了编码FpL_C3KX 5e(序列号186)的多核苷酸。
(u)FpL_C3KX 5f
(u-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3KX 5f(序列号187)的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用pET-FpL_C3KX 4i作为模板DNA，使用序列号191记载的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用序列号192记载的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(u-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(u-3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 5f)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 5f中插入了编码FpL_C3KX 5f(序列号187)的多核苷酸。
实施例25 FpL_C3KX 4h氨基酸置换体的碱稳定性评价
(1)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养实施例20中制作的表达FpL_C3KX4h(序列号179)的转化体、实施例23中得到的表达FpL_C3KX 4i(序列号182)的转化体以及实施例24中制作的表达FpL_C3KX 5e(序列号186)的转化体和表达FpL_C3KX 5f(序列号187)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(4)将处理中使用的NaOH的浓度设为1.0M(终浓度0.5M)，将处理温度设为55℃，将处理时间设为15分钟，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表19。可以说，实施例24中制作的FpL_C3KX 5e(序列号186)和FpL_C3KX 5f(序列号187)即使与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 4h(序列号179)和FpL_C3KX 4i(序列号182)相比碱稳定性也提高。特别是确认了FpL_C3KX 5e的碱稳定性显著提高(FpL_C3KX 4h：34％、FpL_C3KX 4i：48％、FpL_C3KX 5e：73％)。
【表19】
表19
※碱处理:55℃，0.5M NaOH(终浓度),15min
实施例26向FpL_C3KX 5e导入变异和文库制作
向实施例24中制作的表达载体pET-FpL_C3KX 5e中的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸部分(序列号193)，通过与实施例2相同的方法通过易错PCR随机地导入变异，从而制作文库。平均变异导入率为1.9％。
实施例27 FpL_C3KX 5e氨基酸置换体的筛选
(1)对于通过与实施例3(1)至(2)相同的方法培养实施例26中制作的随机变异体文库(转化体)后通过离心操作得到的培养上清，进行实施例19(2)记载的碱处理。
(2)通过实施例3(4)记载的ELISA法测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，通过将进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性。
(3)对约900株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质(FpL_C3KX 5e)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(4)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(5)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸的变异位置。
(6)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(3)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体或实施例24中制作的表达FpL_C3KX 5e(序列号186)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(7)将(6)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(8)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(9)将处理中使用的NaOH的浓度设为2.0M(终浓度1.0M)，将处理时间设为17小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表20。可以说，在序列号186记载的氨基酸序列中至少具有选自Glu1Val、Glu4Gly、Gly21Arg和Glu(Gly)52Asp中的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质即使与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 5e(序列号186)相比碱稳定性也提高。
【表20】
表20
※碱处理:25℃,1.0 M NaOH(终浓度),17h
实施例28 FpL_C3KX 5e氨基酸置换集成体制作(其1)
(1)FpL_C3KX 5e氨基酸置换集成体的设计
通过使实施例27中已明确的与免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性提高有关的氨基酸置换集成于FpL_C3KX 5e，来谋求稳定性的进一步提高。具体而言，设计并制作了以下的(v)至(x)所示的3种免疫球蛋白结合性蛋白质。
(v)相对于FpL_C3KX 5e导入了Glu4Gly和Glu(Gly)52Asp的氨基酸置换的蛋白质(命名为序列号199、FpL_C3KX 6a)
(w)相对于FpL_C3KX 5e导入了Lys(Ala)7Ser和Glu(Gly)52Asp的氨基酸置换的蛋白质(命名为序列号200、FpL_C3KX 5g)
(x)相对于FpL_C3KX 5e导入了Glu4Gly和Lys(Ala)7Ser的氨基酸置换的蛋白质(命名为序列号201、FpL_C3KX 6b)
(2)FpL_C3KX 5e氨基酸置换集成体的制作
以下说明(v)至(x)所示的3种免疫球蛋白结合性蛋白质的制作方法。
(v)FpL_C3KX 6a
(v-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3KX 6a的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用包含编码FpL_C3KX 5e E52D(在FpL_C3KX 5e中导入有Glu(Gly)52Asp的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质、序列号198)的多核苷酸(序列号202)的表达载体pET-FpL_C3KX 5e E52D作为模板DNA，使用由序列号203记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用由序列号204记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(v-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(v-3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 6a)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 6a中插入了编码FpL_C3KX 6a(序列号199)的多核苷酸。
(w)FpL_C3KX 5g
(w-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3KX 5g的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用pET-FpL_C3KX 5e E52D作为模板DNA，使用由序列号205记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用由序列号206记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(w-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(w-3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 5g)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 5g中插入了编码FpL_C3KX 5g(序列号200)的多核苷酸。
(x)FpL_C3KX 6b
(x-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3KX 6b的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用包含编码FpL_C3KX 5e E4G(在FpL_C3KX 5e中导入有Glu4Gly的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质、序列号195)的多核苷酸(序列号207)的表达载体pET-FpL_C3KX 5e E4G作为模板DNA，使用序列号205记载的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用序列号208记载的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(x-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(x-3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 6b)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 6b中插入了编码FpL_C3KX 6b(序列号201)的多核苷酸。
实施例29 FpL_C3KX 5e氨基酸置换集成体的碱稳定性评价(其1)
(1)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养实施例24中制作的表达FpL_C3KX5e(序列号186)的转化体以及实施例28中制作的表达FpL_C3KX 6a(序列号199)、FpL_C3KX5g(序列号200)和FpL_C3KX 6b(序列号201)中的任意者的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(4)将处理中使用的NaOH的浓度设为2.0M(终浓度1.0M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表21。可以说，本实施例中制作的FpL_C3KX 6a(序列号199)、FpL_C3KX5g(序列号200)和FpL_C3KX 6b(序列号201)即使与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 5e(序列号186)相比碱稳定性也提高。其中，FpL_C3KX 6a显示出最优异的碱稳定性(FpL_C3KX 5e：55％、FpL_C3KX 6a：62％)。
【表21】
表21
※碱处理:25℃，1.0M NaOH(终浓度),15 h
实施例30本发明的蛋白质的免疫球蛋白洗脱pH评价
通过以下方法测定了能够将结合于实施例1中制作的天然型FpL_C3(序列号1)或实施例12中得到的变异型(进行了氨基酸置换的)免疫球蛋白结合性蛋白质FpL_C3 G21R(在FpL_C3中导入有Gly21Arg的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质、序列号101)、FpL_C3 G51V(在FpL_C3中导入有Gly51Val的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质、序列号106)、FpL_C3N62H(在FpL_C3中导入有Asn62His的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质、序列号107)、FpL_C3 N62R(在FpL_C3中导入有Asn62Arg的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质、序列号108)、FpL_C3 N62Y(在FpL_C3中导入有Asn62Tyr的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质、序列号5)或FpL_C3 N62W(在FpL_C3中导入有Asn62Trp的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质、序列号111)的免疫球蛋白洗脱下来的pH(以下也简单记作“洗脱pH”)。
(1)制备作为固定有免疫球蛋白的不溶性载体的IgG Sepharose 6 Fast Flow(Cytiva公司制)的50％(w/v)水浆料，将该浆料0.5mL添加到Tricorn 5/50柱(内径5mm×长度50mm：Cytiva公司制)中，然后用泵通入纯水，由此制作IgG Sepharose填充柱。
(2)将(1)中制作的IgG Sepharose填充柱设置于AKTA AVANT 25(Cytiva公司制)。将上述柱用0.1M柠檬酸缓冲液(pH6.5)(以下记作A液)进行平衡化，用0.1M柠檬酸缓冲液(pH2.2)(以下B液)进行清洗后，再次用A液平衡化。
(3)将用A液制备成1g/L的免疫球蛋白结合性蛋白质溶液100μL上样到IgGSepharose填充柱中，通入5倍柱体积量的A液后，以B液从0％至100％的线性梯度洗脱用时10分钟来洗脱免疫球蛋白结合性蛋白质。对得到的色谱图进行分析，将吸光度最高的洗脱位置处的pH作为洗脱pH。
将结果示于表22。可以说，在序列号1记载的氨基酸序列中至少具有选自Gly21Arg、Gly51Val、Asn62His、Asn62Arg、Asn62Tyr和Asn62Trp中的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质相较于天然型FpL_C3而言洗脱pH提高，即，能够以更温和的条件洗脱结合于免疫球蛋白结合性蛋白质的免疫球蛋白(抗体)。
【表22】
表22
| 氨基酸置换 | 序列号 | 洗脱pH |
| FpL_C3(天然型) | 1 | 2.9 |
| Gly21Arg | 101 | 3.4 |
| Gly51Val | 106 | 3.4 |
| Asn62His | 107 | 3.0 |
| Asn62Arg | 108 | 3.0 |
| Asn62Tyr | 5 | 3.0 |
| Asn62Trp | 111 | 3.0 |
实施例31向FpL_C3KX 6a导入变异和文库制作
向实施例28中制作的表达载体pET-FpL_C3KX 6a中的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸部分(序列号211)，通过与实施例2相同的方法通过易错PCR随机地导入变异，从而制作文库。平均变异导入率为1.8％。
实施例32 FpL_C3KX 6a氨基酸置换体的筛选
(1)通过与实施例3(1)至(2)相同的方法培养实施例31中制作的随机变异体文库(转化体)后，将通过离心操作得到的培养上清与1.0M NaOH以等量进行混合，在62℃下进行30分钟碱处理。
(2)通过实施例3(4)记载的ELISA法测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，通过将进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性。
(3)对约1800株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质(FpL_C3KX 6a)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(4)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(5)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸的变异位置。
(6)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(3)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体、实施例1中制作的表达FpL_C3(序列号1)的转化体、参考例1中制作的表达FpL_C4KR(序列号117)的转化体和实施例28中制作的表达FpL_C3KX 6a(序列号199)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(7)将(6)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(8)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(9)将处理中使用的NaOH的浓度设为2.0M(终浓度1.0M)，将处理时间设为17小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理后，通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表23。可以说，在序列号199记载的氨基酸序列中至少具有选自Thr2Pro、Thr2Ser、Pro3Arg、Glu5Lys、Glu9Val、Glu27Lys、Glu27Ile、Glu27Val、Phe32Leu、Lys(Arg)38Ala、Asn44Ile、Ala47Thr和Glu(Asp)52Asn中的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质即使与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX6a(序列号199)相比碱稳定性也提高。
【表23】
表23
※碱处理：25℃，1.0M NaOH(终浓度)，17h
实施例33 FpL_C3KX 6a氨基酸置换体的洗脱特性评价
(1)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养实施例1中制作的表达FpL_C3(序列号1)的转化体或实施例32中得到的表达FpL_C3KX 6a E27V(在FpL_C3KX 6a中导入有Glu27Val的氨基酸置换的蛋白质、序列号222)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的各变异型免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将各变异型免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(4)通过下述所示的ELISA法测定变异型免疫球蛋白结合性蛋白质从人免疫球蛋白κ轻链的酸洗脱特性，评价氨基酸置换对酸洗脱特性的影响。
(4-1)将使用TBS制备成10μg/mL的赫赛汀(中外制药公司制)溶液分注到96孔微孔板的孔中，进行固定化(4℃、16小时)。固定化后，利用使用TBS制备成2％(w/v)的脱脂乳(BD公司制)进行封闭。
(4-2)用清洗缓冲液A(包含0.15M NaCl和0.05％(w/v)Tween 20(商品名)的0.05MTris缓冲液(pH7.5))清洗96孔微孔板的孔后，添加稀释成2μg/mL的包含要评价抗体结合活性的免疫球蛋白结合性蛋白质的溶液，使免疫球蛋白结合性蛋白质与固定化单克隆抗体反应(30℃、1小时)。
(4-3)反应结束后，用清洗缓冲液A进行清洗，向一部份孔中以100μL/孔添加0.05M柠檬酸溶液(pH2.7)，使免疫球蛋白结合性蛋白质解离(25℃、2分钟)
(4-4)用清洗缓冲液A进行清洗，以100μL/孔添加稀释成100ng/mL的Anti-6-HisAntibody(BETHYL LABORATORIES公司制)进行反应(30℃、1小时)。
(4-5)反应结束后，用清洗缓冲液A进行清洗，以50μL/孔添加TMB过氧化物酶底物(KPL公司制)。接着以50μL/孔添加1M磷酸而使反应停止，用酶标仪(TECAN公司制)测定450nm的吸光度。
(4-6)由(4-3)中利用柠檬酸溶液使免疫球蛋白结合性蛋白质解离的孔与未进行解离的孔的吸光度的比例来评价变异型免疫球蛋白结合性蛋白质相对于单克隆抗体的在酸中的洗脱率(数值越高则酸洗脱特性越优异)。
将结果示于表24。可以说，相较于FpL_C3(序列号1)而言FpL_C3KX 6a E27V(序列号222)更容易进行酸洗脱。
【表24】
表24
酸洗脱处理:50mM柠宁檬酸钠，2 min
实施例34FpL_C3KX 6a精氨酸置换体的制作
设计并制作了以下的(y)至(aa)所示的3种FpL_C3KX 6a精氨酸置换体。
(y)相对于FpL_C3KX 6a导入了Glu5Arg的氨基酸置换的蛋白质(序列号223、命名为FpL_C3KX 7a)
(z)相对于FpL_C3KX 6a导入了Glu27Arg的氨基酸置换的蛋白质(序列号224、命名为FpL_C3KX 7b)
(aa)相对于FpL_C3KX 6a导入了Ala47Arg的氨基酸置换的蛋白质(序列号225、命名为FpL_C3KX 7c)
以下说明(y)、(z)和(aa)所示的3种免疫球蛋白结合性蛋白质的制作方法。
(y)FpL_C3KX 7a
(y-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3KX 7a(序列号223)的核苷酸序列的多核苷酸。作为模板DNA，反向PCR中使用包含编码FpL_C3KX 6a(序列号199)的多核苷酸(序列号211)的表达载体(以下也记作“pET-FpL_C3KX 6a”)，使用序列号226记载的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用序列号227记载的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(y-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(y-3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 7a)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 7a中插入了编码FpL_C3KX 7a(序列号223)的多核苷酸。
(z)FpL_C3KX 7b
(z-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3KX 7b(序列号224)的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用pET-FpL_C3KX 6a作为模板DNA，使用序列号228记载的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用序列号229记载的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(z-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(z-3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 7b)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 7b中插入了编码FpL_C3KX 7b(序列号224)的多核苷酸。
(aa)FpL_C3KX 7c
(aa-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3KX 7c(序列号225)的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用pET-FpL_C3KX 6a作为模板DNA，使用序列号230记载的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用序列号231记载的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(aa-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(aa-3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 7c)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 7c中插入了编码FpL_C3KX 7c(序列号225)的多核苷酸。
实施例35FpL_C3KX 6a精氨酸置换体的碱稳定性评价
(1)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养实施例28中制作的表达FpL_C3KX6a(序列号199)的转化体以及实施例34中制作的表达FpL_C3KX 7a(序列号223)、FpL_C3KX7b(序列号224)和FpL_C3KX 7c(序列号225)中的任意者的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(4)将处理中使用的NaOH的浓度设为1.0M(终浓度0.5M)，将处理温度设为25℃，将处理时间设为14小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理后，通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表25。可以说，FpL_C3KX 7a(序列号223)、FpL_C3KX 7b(序列号224)和FpL_C3KX 7c(序列号225)即使与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 6a(序列号199)相比碱稳定性也提高。特别是确认了FpL_C3KX 7b的碱稳定性显著提高(FpL_C3KX 6a：52％、FpL_C3KX 7b：70％)。
【表25】
表25
※碱处理:25℃,0.5M NaOH(终浓度),14h
实施例36 FpL_C3KX 6a精氨酸置换体的洗脱特性评价
(1)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养实施例28中制作的表达FpL_C3KX6a(序列号199)的转化体、实施例32中得到的表达FpL_C3KX 6a E27V(序列号222)的转化体、以及实施例34中制作的表达FpL_C3KX 7b(序列号224)的转化体和表达FpL_C3KX 7c(序列号225)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的各变异型免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将各变异型免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(4)将使用的0.05M柠檬酸溶液的pH设为2.4，除此以外通过与实施例33(4)相同的方法评价变异型免疫球蛋白结合性蛋白质在酸中的洗脱率。
将结果示于表26。可知，作为FpL_C3KX 6a精氨酸置换体的FpL_C3KX 7b(序列号224)和FpL_C3KX 7c(序列号225)即使与相较于天然型FpL_C3(序列号1)而言酸洗脱特性提高的FpL_KX6a E27V(序列号222)相比酸洗脱特性也提高。特别是确认了FpL_C3KX 7b的酸洗脱特性显著提高(FpL_C3KX 6a E27V：53％、FpL_C3KX 7b：61％)。
【表26】
表26
※酸洗脱处理:50mM柠檬酸钠,pH2.4,2min
实施例37免疫球蛋白结合性蛋白质的免疫球蛋白κ轻链结合性评价(其2)
评价了导入Pro6Ser的氨基酸置换对人免疫球蛋白κ轻链结合活性的影响。具体而言，制作了相对于FpL_C3KX 5e(序列号186)导入了Pro6Ser的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质，并进行了评价。
(1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码相对于FpL_C3KX 5e(序列号186)导入了Pro6Ser的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(命名为FpL_C3KX_5e_P6S、序列号236)的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用pET-FpL_C3KX 5e作为模板DNA，使用序列号234记载的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用序列号235记载的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX_5e_P6S)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX_5e_P6S中插入了编码FpL_C3KX_5e_P6S(序列号236)的多核苷酸。
(4)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(2)中得到的表达FpL_C3KX_5e_P6S(序列号236)的转化体和实施例24中制作的表达FpL_C3KX_5e(序列号186)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(5)将(4)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(6)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的各变异型免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将各变异型免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(7)通过与实施例21(4)相同的方法测定免疫球蛋白结合性蛋白质的人免疫球蛋白κ轻链结合活性，评价氨基酸置换对人免疫球蛋白κ轻链结合活性的影响。其中，结合活性评价中使用的多克隆抗体为下述中的任意种：
包含人κ轻链亚组1(Vκ1)的赫赛汀(中外制药公司制)和、
包含人κ轻链亚组3(Vκ3)的人CTLA4抗体(R&D Systems公司制)。
参考例3
评价导入Lys38Glu的氨基酸置换对人免疫球蛋白κ轻链结合活性的影响。具体而言，制作相对于FpL_C3KR(序列号116)导入了Lys(Arg)38Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质，并进行了评价。
(1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码相对于FpL_C3KR(序列号116)导入了Lys(Arg)38Glu的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质(命名为FpL_C3KR_K38E、序列号239)的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用pET-FpL_C3KR作为模板DNA，使用序列号237记载的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用序列号238记载的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(3)对于(2)中得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 5e_K38E)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KR_K38E中插入了编码FpL_C3KR_K38E(序列号239)的多核苷酸。
(4)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(2)中得到的表达FpL_C3KR_K38E(序列号239)的转化体和参考例1中制作的表达FpL_C3KR(序列号116)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(5)将(4)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(6)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的各变异型免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将各变异型免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(7)通过与实施例37(7)相同的方法测定免疫球蛋白结合性蛋白质的人免疫球蛋白κ轻链结合活性，评价氨基酸置换对人免疫球蛋白κ轻链结合活性的影响。
将实施例37和比较例3的结果一并示于表27。可知，通过导入Pro6Ser(实施例37)或Lys(Arg)38Glu(比较例3)的氨基酸置换，能够赋予与Vκ3的结合力。
【表27】
表227
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实施例38 FpL_C3KX 5e氨基酸置换集成体制作(其2)
使上述的可赋予与Vκ3的结合力的氨基酸置换和实施例27中已明确的与免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性提高有关的氨基酸置换集成于FpL_C3KX 5e。具体而言，设计并制作了以下的(ab)所示的免疫球蛋白结合性蛋白质。
(ab)相对于FpL_C3KX 5e导入了Glu4Gly、Lys(Arg)38Glu、Glu(Gly)52Asp的氨基酸置换的蛋白质(序列号240、命名为FpL_C3KX 7d)
(ab-1)合成编码FpL_C3KX 7d(序列号240)的多核苷酸(序列号241)。需要说明的是，合成时在5’末端侧添加了限制酶NcoI的识别序列(5’-CCATGG-3’)，在3’末端侧添加了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(序列号232)、终止密码子和限制酶HindIII的识别序列(5’-AAGCTT-3’)。
(ab-2)通过与实施例1(2)相同的方法纯化(ab-1)中合成的多核苷酸。
(ab-3)通过与实施例1(3)相同的方法将(ab-2)中得到的多核苷酸与预先用限制酶NcoI和HindIII消化的质粒pET-26b连接后，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株，进行培养。
(ab-4)对于得到的转化体，通过与实施例1(4)相同的方法进行培养和质粒纯化，得到表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 7d)后，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 7d中插入了编码FpL_C3KX 7d(序列号240)的多核苷酸(序列号241)。
实施例39 FpL_C3KX 5e氨基酸置换集成体的碱稳定性评价(其2)
(1)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养实施例24中制作的表达FpL_C3KX5e(序列号186)的转化体和实施例38中制作的表达FpL_C3KX 7d(序列号240)的转化体，通过实施例3(11)中记载的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(4)将处理中使用的NaOH的浓度设为1.0M(终浓度0.5M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表28。可以说，本实施例中评价的FpL_C3KX 7d(序列号240)即使与相较于天然型FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 5e(序列号186)相比碱稳定性也提高。
【表28】
表28
※碱处理:25℃,0.5M NaOH(终浓度),15h
实施例40向FpL_C3KX 7d导入变异和文库制作(其1)
向实施例38中制作的表达FpL_C3KX 7d(序列号240)的载体pET-FpL_C3KX 7d中的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸部分(序列号241)，通过与实施例2相同的方法通过易错PCR随机地导入变异，从而制作文库。平均变异导入率为1.9％。
实施例41 FpL_C3KX 7d氨基酸置换体的筛选(其1)
(1)通过与实施例3(1)至(2)相同的方法培养实施例38中制作的pET-FpL_C3KX 7d(转化体)和实施例40中制作的随机变异体文库(转化体)。
(2)培养后，将通过离心操作得到的培养上清与1.0M NaOH以等量进行混合，在58℃下进行30分钟碱处理。
(3)通过实施例3(4)记载的ELISA法测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，通过将进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性。
(4)对约1000株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于FpL_C3KX 7d(序列号240)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(5)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(6)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸的变异位置。
(7)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(4)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体或实施例38中制作的表达FpL_C3KX 7d(序列号240)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离后，使得到的上清通过过滤器而澄清化。
(8)将(7)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(9)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(10)将处理中使用的NaOH的浓度设为1.0M(终浓度0.5M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表29。可以说，在序列号240记载的氨基酸序列中至少具有选自Glu8Val、Lys(Ile)29Phe、Glu33Val和Ala69Val中的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质即使与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 7d(序列号240)相比碱稳定性也提高。
【表29】
表29
※碱处理:25℃,0.5 M NaOH(终浓度),15h
实施例42向FpL_C3KX 7d导入变异和文库制作(其2)
(1)以实施例38中制作的表达载体pET-FpL_C3KX 7d为模板，制作针对第23位、第41位和第52位的氨基酸残基的饱和置换体文库。引物与实施例11(1)同样地依据22c-Trick法以在变异导入位置配置合适的混合碱基、能够进行以变异导入位置为中心的反向PCR的方式来设计(序列号245至250、252至257、以及260至265)。对于这些引物，针对每一个位置的置换以6条引物为一组，以表7和表30的组成进行混合，制备PCR引物混合液(正向/反向引物混合物)。
【表30】
表330
(2)以pET-FpL_C3KX 7d为模板DNA，除此以外通过与实施例11(2)相同的方法通过反向PCR进行位点特异性变异导入。
(3)对得到的PCR产物进行纯化后，使用反应液转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37℃、16小时)后，将平板上形成的菌落作为位点特异性变异体文库。
实施例43FpL_C3KX 7d氨基酸置换体的筛选(其2)
(1)对于通过与实施例3(1)至(2)相同的方法培养实施例38中制作的pET-FpL_C3KX 7d(转化体)和实施例42中制作的位点特异性氨基酸置换体文库(转化体)后通过离心操作得到的培养上清，进行实施例41(2)记载的碱处理。
(2)通过实施例3(4)记载的ELISA法测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，通过将进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性。
(3)对约300株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于FpL_C3KX 7d(序列号240)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(4)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(5)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸的变异位置。
(6)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养(3)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体或实施例38中制作的表达FpL_C3KX 7d(序列号240)的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(7)将(6)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(8)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(9)将处理中使用的NaOH的浓度设为1.0M(终浓度0.5M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表31。可以说，在序列号240记载的氨基酸序列中至少具有选自Ile23Arg、Ala41Ile、Ala41Tyr、Glu(Gly，Asp)52Leu(该记载表示将与序列号1的第7位的谷氨酸相当的氨基酸残基暂时置换为甘氨酸，再置换为天冬氨酸，然后置换为亮氨酸，以下同样)和Glu(Gly，Asp)52Val的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质即使与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 7d(序列号240)相比碱稳定性也提高。
【表31】
表31
※碱处理:25℃,0.5M NaOH(终浓度),15h
实施例44FpL_C3KX 7d氨基酸置换集成体的制作
(1)FpL_C3KX 7d氨基酸置换集成体的设计
通过使实施例41和43中已明确的与免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性提高有关的氨基酸置换集成于FpL_C3KX 7d(序列号240)，来谋求碱稳定性的进一步提高。具体而言，设计并制作了以下的(ac)至(ad)所示的2种免疫球蛋白结合性蛋白质。
(ac)相对于FpL_C3KX 7d导入了Glu(Gly，Asp)52Val和Ala69Val的氨基酸置换的蛋白质(命名为序列号271、FpL_C3KX 8a)
(ad)相对于FpL_C3KX 7d导入了Glu(Gly，Asp)52Leu和Ala69Val的氨基酸置换的蛋白质(命名为序列号274、FpL_C3KX 8b)
(2)FpL_C3KX 7d氨基酸置换集成体的制作
以下说明上述(ac)至(ad)所示的2种免疫球蛋白结合性蛋白质的制作方法。
(ac)FpL_C3KX 8a
(ac-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3KX 8a(序列号271)的核苷酸序列的多核苷酸。反向PCR中，使用包含编码FpL_C3KX 7d_A69V(在FpL_C3KX 7d中导入有Ala69Val的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质、序列号242)的多核苷酸(序列号268)的表达载体(以下也记作“pET-FpL_C3KX 7d_A69V”)作为模板DNA，使用序列号269记载的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用序列号270记载的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(ac-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(ac-3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 8a)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 8a中插入了编码FpL_C3KX 8a(序列号271)的多核苷酸。
(ad)FpL_C3KX 8b
(ad-1)通过使用反向PCR的变异导入而制作包含编码FpL_C3KX 8b(序列号274)的核苷酸序列的多核苷酸。作为模板DNA，在反向PCR中使用pET-FpL_C3KX8a_A69V作为模板DNA，使用序列号272记载的寡核苷酸作为PCR正向引物，使用序列号273记载的寡核苷酸作为PCR反向引物，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法来进行。
(ad-2)对得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(ad-3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 8b)的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 8b中插入了编码FpL_C3KX 8b(序列号274)的多核苷酸。
实施例45 FpL_C3KX 7d氨基酸置换集成体的碱稳定性评价
(1)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养实施例42中得到的表达FpL_C3KX7d_A69V(序列号242)的转化体以及实施例44中制作的表达FpL_C3KX 8a(序列号271)的转化体和表达FpL_C3KX9b(序列号274)的转化体，通过实施例3(11)中记载的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(4)将处理中使用的NaOH的浓度设为1.0M(终浓度0.5M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表32。可以说，FpL_C3KX 8a(序列号271)和FpL_C3KX 8b(序列号274)即使与相较于天然型FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 7d_A69V(序列号242)相比碱稳定性也提高。
【表32】
表32
※碱处理:25℃,0.5M NaOH(终浓度)，15h
实施例46向本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质导入变异和文库制作
向编码由序列号275记载的氨基酸序列构成的本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质FpL_C3KX 7e的多核苷酸(序列号276)中，通过与实施例2相同的方法通过易错PCR随机地导入变异，从而制作文库。平均变异导入率为1.0％。需要说明的是，FpL_C3KX 7e是相对于天然型FpL_C3(序列号1)导入了Glu4Gly、Pro6Ser、Lys7Ala、Lys13Arg、Lys22Arg、Lys29Ile、Lys29Glu、Lys48Arg、Glu49Asp、Asn50Tyr、Tyr52Phe、Asn62Tyr、Lys67Arg和Ala69Val的氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质。
实施例47 FpL_C3KX 7e氨基酸置换体的筛选
(1)通过与实施例3(1)至(2)相同的方法培养能够表达FpL_C3KX 7e的转化体和实施例46中制作的随机变异体文库(转化体)后，对于通过离心操作得到的培养上清，进行实施例41(2)记载的碱处理。
(2)通过实施例3(4)记载的ELISA法测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，通过将进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性。
(3)对约1800株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于FpL_C3KX 7e(序列号275)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(4)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(5)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸的变异位置。
(6)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养实施例40中制作的表达FpL_C3KX7e(序列号275)的转化体或(4)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体，通过与实施例3(11)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(7)将(6)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(8)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(9)将处理中使用的NaOH的浓度设为1.0M(终浓度0.5M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表33。可以说，在序列号275记载的氨基酸序列中至少具有选自Thr2Ala、Pro3Arg、Glu5Asp、Pro(Ser)6Leu、Pro(Ser)6Thr、Lys(Ala)7Pro、Ile23Val、Thr31Met、Glu33Asp、Glu33Gly、Ala35Thr、Thr36Ser、Ala37Thr、Glu52Gly、Ile66Val和Ala(Val)69Leu中的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质即使与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 7e(序列号275)相比碱稳定性也提高。
【表33】
表33
实施例48 FpL_C3KX 7e氨基酸置换体的制作
使通过导入向侧链性质不同的氨基酸残基的置换或结构域间氨基酸序列不同的位置处的氨基酸残基向其它结构域的氨基酸残基的置换的方法而得到的、作为提高碱稳定性的氨基酸置换的Val14Ala、Gly21Arg、Ile23Thr、Ala41Arg、Asn44Asp、Asn44Arg、Asn44His、Glu52Tyr、Gly60Arg和Ile64Leu中的任意者集成于FpL_C3KX 7e。
(1)使用包含编码FpL_C3KX 7e(序列号275)的多核苷酸(序列号276)的表达载体(以下也记作“pET-FpL_C3KX 7e”)作为模板DNA，使用由表34的序列号记载的序列构成的寡核苷酸的组合作为PCR正向引物和PCR反向引物的组合，除此以外与实施例7(2)(a-1)相同，通过这样的方法进行反向PCR。
【表34】
表34
(2)对(1)中得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，使用该限制酶处理产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(3)对于得到的转化体，通过与实施例7(2)(a-3)相同的方法进行培养和表达载体的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。结果确认，任意表达载体中均插入了(1)中得到的多核苷酸。
实施例49 FpL_C3KX 7e氨基酸置换体的碱稳定性评价
(1)通过与实施例3(8)至(10)相同的方法培养表达FpL_C3KX 7e的转化体和实施例48中制作的表达FpL_C3KX 7e氨基酸置换体(共计10种)中的任意种的转化体，通过实施例3(11)中记载的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清通过参考例2(2)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(4)将处理中使用的NaOH的浓度设为1.0M(终浓度0.5M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例3(13)相同的方法进行碱处理，然后通过与实施例3(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表35。可以说，本实施例中评价的FpL_C3KX 7e氨基酸置换体与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX8b(序列号275)相比碱稳定性均提高。
【表35】
表35
※碱处理:25℃,0.5M NaOH(终浓度),15h
实施例50本发明的蛋白质的多聚体化(其1)
通过以下所示的方法制作作为本发明的蛋白质的一个方式的FpL_C3KX 7e(序列号275)的多聚体。
(1)FpL_C3KX 7e多聚体表达载体的制作
(1-1)作为FpL_C3KX 7e多聚体，设计了由序列号326记载的氨基酸序列构成的多肽((命名为FpL_C3KX7e)4-IT-6H3K)。需要说明的是，该多肽是4个FpL_C3KX 7e(序列号275)直接连接且其C末端侧添加有用于提高对不溶性载体的固定率的寡肽(WO2017/069158号的序列号36的第297位至第319位的氨基酸序列所构成的寡肽、IT、序列号324)、作为纯化用标签的组氨酸标签(6H、序列号325)和用于提高对不溶性载体的固定率的3个赖氨酸残基(3K，以下也记作“赖氨酸标签”)的多肽。
(1-2)设计了编码(1-1)中设计的(FpL_C3KX 7e)4-IT-6H3K(序列号326)的多核苷酸(序列号327)。需要说明的是，由序列号327记载的序列构成的多核苷酸中，第1位至第210位、第211位至第420位、第421位至第630位和第631位至第840位为编码FpL_C3KX 7e(序列号275)的多核苷酸，第841位至第909位为编码由序列号324记载的氨基酸序列构成的寡肽(IT)的多核苷酸(序列号328)，第910位至第927位为编码组氨酸标签(6H，序列号325)的寡核苷酸，第928位至第936位为编码赖氨酸标签(3K)的寡核苷酸，第937位至第939位为终止密码子。另外，序列号327中，编码FpL_C3KX 7e(序列号275)的多核苷酸的序列原则上使用序列号276，但是序列号327的第187位至第210位、第421位至第444位和第607位至第630位从容易克隆的角度出发使用了不同于序列号276的密码子，由序列号275转换而来。
(1-3)设计并合成了用于合成(1-2)中设计的由序列号327记载的序列构成的多核苷酸的引物(寡核苷酸)。具体而言，分别设计并合成了如下的引物：
用于制作pET26b载体的NcoI的限制酶位点(CCATGG)和由序列号327的第1位至第231位的序列构成的多核苷酸片段的由序列号329和序列号330记载的序列构成的引物、
用于制作由序列号327的第187位至第444位的序列构成的多核苷酸片段的由序列号331和序列号332记载的序列构成的引物、
用于制作由序列号327的第421位至第630位的序列构成的多核苷酸片段的由序列号333和序列号334记载的序列构成的引物、
用于制作由序列号327的第607位至第894位的序列构成的多核苷酸片段的由序列号335和序列号336记载的序列构成的引物、
用于制作由序列号327的第871位至第936位的序列构成的多核苷酸片段的由序列号337和序列号338记载的序列构成的引物、
用于通过反向PCR法制作包含序列号327的第916位至第936位和pET26b载体的HindIII的限制酶位点(AAGGTT)下游和pET26b的NcoI的限制酶位点和其上游的pET26b载体的由序列号339和序列号340记载的序列构成的引物。
(1-4)制备由表36所示的组成构成的反应液后，对于该反应液，重复进行30个循环的以98℃下10秒的第1步骤、50℃下5秒的第2步骤、68℃下40秒的第3步骤为1个循环的反应，从而实施PCR。需要说明的是，表36中的模板DNA/正向引物/反向引物的组合为表37的<1>至<5>所示的组合中的任意者。
【表36】
表36
| 组成 | 体积 |
| 1ng/μL模板DNA | 1μL |
| 10μM正向引物 | 1μL |
| 10μM反向引物 | 1μL |
| 2×PrimeSTAR MAX Premix(宝生物公司制) | 25μL |
| H2O | 加至50μL |
【表37】
表37
| 组合 | <1> | <2> | <3> | <4> | <5> |
| 模板DNA | 序列号275 | 序列号275 | 序列号275 | 序列号275 | pET26b |
| 正向引物 | 序列号329 | 序列号331 | 序列号333 | 序列号335 | 序列号339 |
| 反向引物 | 序列号330 | 序列号332 | 序列号334 | 序列号336 | 序列号340 |
(1-5)对使用上述<1>至<5>的组合分别得到的共计5种PCR产物(多核苷酸)进行纯化后，制备包含各0.05pmol的各多核苷酸的TE缓冲液(包含1mM EDTA的10mM Tris缓冲液)(pH8.0)。进而添加各0.05pmol的由序列号337和序列号338记载的序列构成的多核苷酸后，通过使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB公司制)的Gibson Assembly反应将这些多核苷酸连接。
(1-6)使用(1-5)的反应后的连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37℃、16小时)。
(1-7)制备由表38所示的组成构成的反应液后，添加(1-6)中得到的转化体，通过与(1-4)相同的条件进行菌落PCR。根据菌落PCR的结果而选择能够确认1000至1200个碱基对左右的PCR产物的扩增的转化体(基因重组大肠杆菌)，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养后，通过利用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)的纯化获得能够表达免疫球蛋白结合性蛋白质(FpL_C3KX 7e)4-IT-6H3K(序列号326)的载体(命名为pET-(FpL_C3KX 7e)4-IT-6H3K)。
【表38】
表38
| 组成 | 体积 |
| 2×GoTaq Green Master Mix(普洛麦格公司制) | 500μL |
| 10μM正向引物(序列号3) | 100μL |
| 10μM反向引物(序列号4) | 100μL |
| H2O | 加至1000μL |
(1-8)对于(1-7)中得到的表达载体pET-(FpL_C3KX 7e)4-IT-6H3K，通过与实施例1(5)相同的方法分析核苷酸序列。序列分析的结果是，确认上述表达载体中插入了由序列号327记载的序列构成的多核苷酸。
(2)(FpL_C3KX 7e)4-IT-6H3K的制备
(2-1)向包含50μg/mL的卡那霉素的2×YT液体培养基(胰蛋白胨1.6％(w/v)、酵母提取物1％(w/v)、氯化钠0.5％(w/v))20mL中接种(1)中制作的包含pET-(FpL_C3KX 7e)4-IT-6H3K的基因重组大肠杆菌，进行预培养(30℃、16小时)。
(2-2)将预培养后的培养液10mL接种于包含50μg/mL的卡那霉素的2×YT液体培养基1L中，在37℃下培养2小时至3小时后，添加0.5M的IPTG200μL，进一步在20℃下震荡培养一整夜。
(2-3)对培养后的培养液进行离心分离，回收培养菌体(以湿重计为8g)。对于以湿重计为2g的该培养菌体，使用BugBuster蛋白提取试剂(默克密理博公司制)进行溶菌，通过离心分离获得上清，使其通过过滤器而澄清化。
(2-4)向预先用包含0.5M的氯化钠和0.02M的咪唑的0.02M Tris缓冲液(pH7.5)(以下也简单记作“平衡化液”)平衡化的填充有Ni Sepharose 6 Fast Flow(Cytiva公司制)的柱中，添加(2-3)中澄清化后的上清，用上述柱中所填充的载体的10倍量的平衡化液清洗后，通入包含0.5M的氯化钠和0.5M的咪唑的0.02M Tris缓冲液(pH7.5)，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(2-5)通过分光光度计测定回收的级分的吸光度，对该级分所含的蛋白质量进行定量。另外，还实施了SDS-PAGE，确认了已将免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
实施例51本发明的蛋白质的多聚体化(其2)
通过以下所示的方法制作作为本发明的蛋白质的另一方式的FpL_C3KX 6c(序列号341)的多聚体。需要说明的是，FpL_C3KX 6c的氨基酸序列(序列号341)是使FpL_C3KX 7e的氨基酸序列(序列号275)的第50位的酪氨酸残基恢复至作为天然型FpL_C3(序列号1)的氨基酸残基的天冬酰胺残基的氨基酸序列。
(1)作为FpL_C3KX 6c多聚体，设计了由序列号343记载的氨基酸序列构成的多肽(命名为(FpL_C3KX 6c)4-IT-6H3K)。需要说明的是，该多肽是4个FpL_C3KX 6c(序列号341)直接连接且其C末端侧添加有用于提高对不溶性载体的固定率的寡肽(IT，序列号324)、作为纯化用标签的组氨酸标签(6H、序列号325)和用于提高对不溶性载体的固定率的赖氨酸标签(3K)的多肽。
(2)通过与实施例50(1-2)相同的方法设计了编码(1)中设计的由序列号343记载的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸(序列号344)。需要说明的是，编码FpL_C3KX 6c(序列号341)的多核苷酸的序列原则上使用序列号342。
(3)作为模板DNA/正向引物/反向引物的组合，使用表39的<5>至<9>所示的组合中的任意者，除此以外通过与实施例50(1-4)相同的方法实施PCR。
【表39】
表39
| 组合 | <5> | <6> | <7> | <8> | <9> |
| 模板DNA | pET26b | 序列号342 | 序列号342 | 序列号342 | 序列号342 |
| 正向引物 | 序列号339 | 序列号329 | 序列号331 | 序列号333 | 序列号335 |
| 反向引物 | 序列号340 | 序列号330 | 序列号332 | 序列号334 | 序列号336 |
(5)对使用上述<5>至<9>的组合分别得到的5种PCR产物(多核苷酸)进行纯化后，通过与实施例50(1-5)相同的方法进行Gibson Assembly反应，进行这些多核苷酸的连接。
(6)使用(5)的反应后的连接产物通过与实施例50(1-6)相同的方法转化大肠杆菌并进行培养。
(7)通过与实施例50(1-7)相同的方法进行菌落PCR后，通过与实施例50(1-8)相同的方法选择转化体并进行该选择出的转化体的培养和质粒提取，得到能表达免疫球蛋白结合性蛋白质(FpL_C3KX 6c)4-IT-6H3K(序列号343)的载体(命名为pET-(FpL_C3KX 6c)4-IT-6H3K)。
(8)对于(7)中得到的表达载体pET-(FpL_C3KX 6c)4-IT-6H3K，通过与实施例1(5)相同的方法分析核苷酸序列。序列分析的结果是，确认上述表达载体中插入了由序列号344记载的序列构成的多核苷酸。
实施例52免疫球蛋白吸附剂的制作
(1)对于实施例50所制备的包含(FpL_C3KX 7e)4-IT-6H3K(序列号326)(序列号326)的级分或实施例51所制备的包含(FpL_C3KX 6c)4-IT-6H3K(序列号343)的级分，通过Amicon Ultra(默克密理博公司制)浓缩至原体积的十分之一量后，加入该浓缩溶液的10倍量的磷酸钠缓冲液，通过Amicon Ultra(默克密理博公司制)浓缩至原体积的十分之一量，由此进行上述蛋白质溶液的浓缩和缓冲液置换。
(2)将具有甲酰基作为活性基团的不溶性载体即TOYOPEARL AF-Formyl-650(东曹公司制)置换为纯水后，制备50％(v/v)浆料。将100μL制备的50％(v/v)浆料添加到MINIBIO旋转柱(BIORAD公司制)。
(3)将实施例50所制备的(FpL_C3KX 7e)4-IT-6H3K的浓缩液或实施例51所制备的(FpL_C3KX 6c)4-IT-6H3K(序列号343)的浓缩液以终浓度为10g/L的方式添加到添加有不溶性载体的MINI BIO旋转柱(BIORAD公司制)后，在25℃下振荡，由此使装入该柱内的不溶性载体与蛋白质通过形成席夫碱(Schiff base)而结合。
(4)加入适量的1M硼氢钠水溶液，在室温下振荡2小时，由此将残留席夫碱还原，制作免疫球蛋白吸附剂。制作的吸附剂在水洗后置换为20％(v/v)乙醇并保存。
实施例53免疫球蛋白吸附剂的碱稳定性评价
(1)向实施例52中制作的填充有免疫球蛋白吸附剂的柱中通入0.1M甘氨酸盐酸溶液(pH2.0)(以下也记作酸性溶液)后，通入包含0.15M氯化钠的0.02M Tris缓冲液(pH7.5)(以下也记作“清洗缓冲液C”)，由此对上述柱进行清洗。
(2)将用清洗缓冲液C稀释成60mg/mL的免疫球蛋白溶液(日本血液制剂机构公司制)添加到清洗后的上述柱中，然后用恒温振荡培养机(TAITEC公司制)在25℃、1000rpm下振荡2小时，由此使免疫球蛋白吸附于不溶性载体。
(3)通过通入清洗缓冲液C而清洗未吸附的免疫球蛋白后，通入酸性溶液而对吸附于吸附剂的免疫球蛋白进行洗脱。通过分光光度计测定洗脱液的吸光度(波长280nm)，由该洗脱液所含的免疫球蛋白的量计算吸附剂的静态吸附量。
(4)通入清洗缓冲液C而对免疫球蛋白吸附剂进行平衡化后，通入0.5M的氢氧化钠溶液，在25℃下静置17小时，由此进行碱处理。对于碱处理后的免疫球蛋白吸附剂，通入清洗缓冲液C而进行中和。
(5)通过与(2)和(3)相同的方法计算吸附剂的静态吸附量，计算碱处理前后的吸附量的比例(残留活性)，评价碱稳定性。
将结果示于表40。将构成多聚体的本发明的蛋白质从FpL_C3KX 7e(序列号275)替换为FpL_C3KX 6c(序列号341)时，碱稳定性大幅降低((FpL_C3KX7e)4-IT-6H3K(序列号326)：66％、(FpL_C3KX 6c)4-IT-6H3K(序列号343)：15％)。FpL_C3KX 7e与FpL_C3KX 6c的氨基酸序列的差异仅为第50位的位置(FpL_C3KX 7e：酪氨酸残基、FpL_C3KX 6c：天冬酰胺残基(与天然型FpL_C3相同))，由此可知Asn50Tyr的氨基酸置换特别有助于碱稳定性提高。
【表40】
表40
※碱处理:25℃,0.5M NaOH(终浓度),17h
实施例54蛋白L免疫球蛋白结合性结构域C4(FpL_C4)氨基酸置换体的制作
(1)FpL_C4KR的制备
(1-1)向包含50μg/mL的卡那霉素的2×YT液体培养基2mL中接种参考例1(2)(δ)中制作的包含pET-FpL_C4KR的转化体，进行预培养(30℃、16小时)。
(1-2)将预培养后的培养液200μL接种于包含50μg/mL的卡那霉素的2×YT液体培养基20mL中，在37℃下培养1.5小时至2小时后，加入0.05M的IPTG 4μL，进一步在20℃下震荡培养一整夜。
(1-3)培养结束后，通过离心分离回收培养菌体，使用BugBuster蛋白提取试剂(默克密理博公司制)制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(1-4)向预先用清洗缓冲液B(包含0.5M的NaCl和0.02M咪唑的0.05M Tris缓冲液(pH7.5))平衡化的填充有Ni-NTA Sepharose 6 Fast Flow(Cytiva公司制)的柱中，添加(1-3)中澄清化后的上清，用上述柱中所填充的载体的10倍量的清洗缓冲液B进行清洗后，通入包含0.5M的NaCl和0.5M咪唑的0.05M Tris缓冲液(pH7.5)，从而回收与FpL_C4KR相当的级分。
(1-5)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分包含的FpL_C4KR进行定量。另外，还实施了SDS-PAGE，确认了已将FpL_C4KR(序列号117)纯化为良好纯度。
(2)向FpL_C4KR导入变异和文库制作
(2-1)以参考例1(2)(δ)中制作的pET-FpL_C4KR为模板，制作针对第7位、第13位、第22位和第29位的氨基酸残基的饱和置换体文库。引物与实施例11(1)同样地依据22c-Trick法以在变异导入位置配置合适的混合碱基、能够进行以变异导入位置为中心的反向PCR的方式来设计(序列号124至129、345至356和130至135)。对于这些引物，针对每一个位置的置换以6条引物为一组，以表7和表41的组成进行混合，制备PCR引物混合液(正向/反向引物混合物)。
【表41】
表41
(2-2)以参考例1(2)(δ)中制作的pET-FpL_C4KR为模板，通过反向PCR进行位点特异性变异导入。反向PCR如下进行：在制备表9所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下热处理2分钟，使以95℃下10秒的第1步骤、50℃下5秒的第2步骤、72℃下6分钟的第3步骤为1个循环的反应进行30个循环，最后在72℃下热处理7分钟。
(2-3)对得到的PCR产物进行纯化后，使用该纯化物转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37℃、16小时)后，将平板上形成的菌落作为饱和置换体文库。
实施例55FpL_C4KR氨基酸置换体的筛选
(1)将参考例1(2)(δ)中制作的能表达FpL_C4KR的转化体和实施例54(2)中制作的饱和置换体文库(转化体)接种于包含50μg/mL的卡那霉素的2×YT液体培养基250μL，使用96孔深孔板在37℃下震荡培养一整夜。
(2)培养后，接着将5μL的培养液接种于包含50μg/mL的卡那霉素、0.3％(w/v)的甘氨酸、0.01mM的IPTG的2×YT液体培养基500μL中，使用96孔深孔板进一步在20℃下震荡培养一整夜。
(3)培养后，将通过离心操作得到的培养上清与1.0M NaOH以等量进行混合，在38℃下进行碱处理15分钟。
(4)通过实施例3(4)所示的ELISA法测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，通过将进行了(3)的碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行(3)的碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性。
(5)对约500株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于FpL_C4KR(序列号117)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(6)对(5)中选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(7)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸置换位置。
(8)通过与实施例54(1-1)至(1-2)相同的方法培养(5)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体，通过与实施例54(1-3)相同的方法制备蛋白质提取液并澄清化。
(9)通过实施例54(1-4)中记载的方法纯化(8)中澄清化后的蛋白质提取液，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(10)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
实施例56本发明的蛋白质的免疫球蛋白洗脱pH评价
通过以下方法测定能够洗脱结合于实施例1中制作的FpL_C3(序列号1)、参考例1(2)(δ)中制作的FpL_C4KR(序列号117)或实施例55中得到的FpL_C4KR氨基酸置换体的免疫球蛋白的pH(以下也简单记作“洗脱pH”)。
(1)制备作为固定有免疫球蛋白的不溶性载体的IgG Sepharose 6 Fast Flow(Cytiva公司制)的50％(w/v)水浆料，将该浆料0.5mL添加到Tricorn 5/50柱(内径5mm×长度50mm：Cytiva公司制)后，用泵通入纯水，由此制作IgG Sepharose填充柱。
(2)将(1)中制作的IgG Sepharose填充柱设置于AKTAAVANT 25(Cytiva公司制)。将上述柱用0.1M柠檬酸缓冲液(pH6.5)(以下记作A液)平衡化，用0.1M柠檬酸缓冲液(pH2.2)(以下记作B液)进行清洗后，用A液再次进行平衡化。
(3)将用A液制备成1g/L的各免疫球蛋白结合性蛋白质溶液100μL上样到IgGSepharose填充柱，通入5倍柱体积量的A液后，以B液从0％至100％的线性梯度洗脱用时10分钟来洗脱FpL_C3。对得到的色谱图进行分析，将吸光度最高的洗脱位置处的pH作为洗脱pH。
将结果示于表42。可以说，在序列号117记载的氨基酸序列中至少具有选自Lys(Arg)7Gln(该记载表示将与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基(序列号5中为第7位的赖氨酸)暂时置换为精氨酸后、进一步置换为谷氨酰胺；关于以下的其它氨基酸置换也同样进行解释)、Lys(Arg)13Val、Lys(Arg)22Thr、Lys(Arg)29Pro、Lys(Arg)29Val和Lys(Arg)29Ile中的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质相较于天然型FpL_C3(序列号1)、FpL_C4KR(序列号117)而言洗脱pH增大，即，能够在更温和的pH条件(即，接近中性的条件)下洗脱结合于免疫球蛋白结合性蛋白质的免疫球蛋白(抗体)。
【表42】
表42
| 氨基酸置换 | 序列号 | 洗脱DH |
| FpL_C3(天然型) | 1 | 2.9 |
| FpL_C4KR | 117 | 2.8 |
| Lys(Arg)7Gln | 357 | 3.0 |
| Lys(Arg)13Val | 358 | 3.1 |
| Lys(Arg)22Thr | 359 | 3.2 |
| Lys(Arg)29Pro | 360 | 3.2 |
| Lys(Arg)29Val | 361 | 3.1 |
| Lys(Arg)29Ile | 362 | 3.1 |
实施例57 FpL_C3KX 7d氨基酸置换体的设计和制作
使通过导入向侧链性质不同的氨基酸残基的置换或结构域间氨基酸序列不同的位置处的氨基酸残基向其它结构域的氨基酸残基的置换的方法得到的、作为提高酸洗脱性的氨基酸置换的Pro(Ser)6Ala、Glu8Gly、Glu8Arg、Gly21Arg、Ile23Phe、Ile23Leu、Glu33Val、Lys(Arg，Glu)38His、Lys(Arg，Glu)38Leu、Asn44His、Asn44Arg、Lys(Arg)48His、Asn(Tyr)50Met、Glu(Gly，Asp)52Tyr、Tyr(Phe)53Ser中的任意者集成于FpL_C3KX 7d(序列号240)。
(1)使用包含编码FpL_C3KX 7d(序列号240)的多核苷酸(序列号241)的表达载体pET-FpL_C3KX 7d作为模板DNA，使用由表43的序列号记载的序列构成的寡核苷酸的组合作为PCR正向引物和PCR反向引物的组合，除此以外通过与实施例7(2)(a-1)相同的方法进行反向PCR。
【表43】
表43
(2)对(1)中得到的多核苷酸进行纯化，用限制酶DpnI进行处理后，利用限制酶，使用产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(3)对于得到的转化体，通过与实施例1(4)相同的方法进行培养和表达载体的提取，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。结果确认，任意表达载体中均插入了(1)中得到的多核苷酸。
实施例58 FpL_C3KX 7d氨基酸置换体的酸洗脱性评价
(1)通过与实施例54(1-1)至(1-2)相同的方法培养表达FpL_C3KX 7d(序列号240)的转化体和实施例57中制作的表达FpL_C3KX 7d氨基酸置换体(共计15种)中的任意者的转化体，通过实施例54(1-3)中记载的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清通过实施例54(1-4)中记载的方法进行纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(4)以使各蛋白质的浓度相等的方式使用TBS进行稀释。将稀释液二等分，通过实施例3(4)记载的ELISA法(酸洗脱性评价)，一方面测定添加0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)(酸处理)时的抗体结合活性，另一方面测定添加TBS(未进行酸处理)时的抗体结合活性。通过将进行了酸处理的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行酸处理的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性。通过从1中减去残留活性来计算洗脱率，由此评价酸洗脱性。
将结果示于表44。本实施例中评价的FpL_C3KX 7d氨基酸置换体与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 7d(序列号240)相比洗脱率均提高，确认这些变异型免疫球蛋白结合性蛋白质的利用酸的洗脱性提高。
【表44】
表44
※酸处理：25℃,50mM NaOAc缓冲液(pH 3.0),15min
实施例59氨基酸置换向本发明的免疫球蛋白结合性蛋白质中的集成
(1)氨基酸置换集成体的设计
使实施例43和48中已明确的与免疫球蛋白结合性蛋白质的碱稳定性提高有关的氨基酸置换和/或实施例58中已明确的与免疫球蛋白结合性蛋白质的免疫球蛋白洗脱性提高有关的氨基酸置换集成于FpL_C3KX 7e(序列号275)。具体而言，设计并制作了以下的＜c＞至＜i＞所示的7种免疫球蛋白结合性蛋白质。
＜c＞相对于FpL_C3KX 7e导入了Ile23Arg和Asn44Arg的氨基酸置换的蛋白质(序列号408，命名为FpL_C3KX 9a)
＜d＞相对于FpL_C3KX 7e导入了Ile23Arg和Asn44His的氨基酸置换的蛋白质(序列号409，命名为FpL_C3KX 9b)
＜e＞相对于FpL_C3KX 7e导入了Ile23Arg和Ile64Leu的氨基酸置换的蛋白质(序列号410，命名为FpL_C3KX 9c)
＜f＞相对于FpL_C3KX 7e导入了Asn44Arg和Ile64Leu的氨基酸置换的蛋白质(序列号411，命名为FpL_C3KX 9d)
＜g＞相对于FpL_C3KX 7e导入了Asn44His和Ile64Leu的氨基酸置换的蛋白质(序列号412，命名为FpL_C3KX 9e)
＜h＞相对于FpL_C3KX 7e导入了Ile23Arg、Asn44Arg、Lys(Arg)48His和Ile64Leu的氨基酸置换的蛋白质(序列号413，命名为FpL_C3KX 10a)
＜i＞相对于FpL_C3KX 7e导入了Ile23Arg、Asn44His、Lys(Arg)48His和Ile64Leu的氨基酸置换的蛋白质(序列号414，命名为FpL_C3KX 10b)
(2)FpL_C3KX 7e氨基酸置换集成体的制作
以下说明上述＜c＞至＜i＞所示的7种免疫球蛋白结合性蛋白质的制作方法。
＜c＞FpL_C3KX 9a
＜c-1＞合成编码FpL_C3KX 9a(序列号408)的多核苷酸(序列号214)。需要说明的是，合成时在5’末端侧添加了限制酶NcoI的识别序列(5’-CCATGG-3’)，在3’末端侧添加了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列(序列号232)、终止密码子和限制酶HindIII的识别序列(5’-AAGCTT-3’)。
＜c-2＞通过与实施例1(2)相同的方法纯化＜c-1＞中合成的多核苷酸。
＜c-3＞通过与实施例1(3)相同的方法将＜c-2＞中得到的多核苷酸与预先用限制酶NcoI和HindIII消化的质粒pET-26b连接后，使用该连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株，进行培养。
＜c-4＞对于得到的转化体，通过与实施例1(4)相同的方法进行培养和质粒纯化，得到表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 9a)后，通过与实施例1(5)相同的方法进行该表达载体的核苷酸序列分析。
序列分析的结果是，确认表达载体pET-FpL_C3KX 9a中插入了编码FpL_C3KX 9a(序列号408)的多核苷酸(序列号415)。
＜d＞FpL_C3KX 9b
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3KX 9b(序列号409)的多核苷酸(序列号416)，除此以外通过与(a)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 9b)。表达载体pET-FpL_C3KX 9b的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C3KX 9b中插入了编码FpL_C3KX 9b(序列号409)的多核苷酸(序列号416)。
＜e＞FpL_C3KX 9c
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3KX 9c(序列号410)的多核苷酸(序列号417)，除此以外通过与(a)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 9c)。表达载体pET-FpL_C3KX 9c的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C3KX9e中插入了编码FpL_C3KX 9c(序列号410)的多核苷酸(序列号417)。
＜f＞FpL_C3KX 9d
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3KX 9d(序列号411)的多核苷酸(序列号418)，除此以外通过与(a)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 9d)。表达载体pET-FpL_C3KX 9d的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C3KX 9d中插入了编码FpL_C3KX 9d(序列号411)的多核苷酸(序列号418)。
＜g＞FpL_C3KX 9e
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3KX 9e(序列号412)的多核苷酸(序列号419)，除此以外通过与(a)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 9e)。表达载体pET-FpL_C3KX 9e的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C3KX 9e中插入了编码FpL_C3KX 9e(序列号412)的多核苷酸(序列号419)。
＜h＞FpL_C3KX 10a
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3KX 10a(序列号413)的多核苷酸(序列号420)，除此以外通过与(a)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 10a)。表达载体pET-FpL_C3KX 10a的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C3KX 10a中插入了编码FpL_C3KX 10a(序列号413)的多核苷酸(序列号420)。
＜i＞FpL_C3KX 10b
作为编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸，使用编码FpL_C3KX 10b(序列号414)的多核苷酸(序列号421)，除此以外通过与(a)相同的方法得到转化体和表达载体(命名为pET-FpL_C3KX 10b)。表达载体pET-FpL_C3KX 10b的核苷酸序列分析的结果是，确认pET-FpL_C3KX 10b中插入了编码FpL_C3KX 10b(序列号414)的多核苷酸(序列号421)。
实施例60 FpL_C3KX 8b氨基酸置换体的酸洗脱性评价
(1)通过与实施例54(1-1)至(1-2)相同的方法培养表达FpL_C3KX 7e(序列号275)的转化体以及实施例59中制作的表达FpL_C3KX 9a(序列号408)、FpL_C3KX 9b(序列号409)、FpL_C3KX 9c(序列号410)、FpL_C3KX 9c(序列号411)、FpL_C3KX 9d(序列号412)、FpL_C3KX 10a(序列号413)和FpL_C3KX 10b(序列号414)中的任意者的转化体，通过实施例54(1-3)中记载的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清通过实施例54(1-4)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(4)以使各蛋白质的浓度相等的方式使用TBS进行稀释。将稀释液二等分，通过实施例3(4)记载的ELISA法(酸洗脱性评价)，对一份测定用0.05M柠檬酸钠(NaOAc)缓冲液(pH3.2)进行5分钟酸处理时的抗体结合活性，对另一份测定添加TBS(未进行酸处理)时的抗体结合活性。通过将进行了酸处理的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行酸处理的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性。通过从1中减去残留活性来计算洗脱率，由此评价酸洗脱性。
将结果示于表45。FpL_C3KX 9a(序列号408)、FpL_C3KX 9b(序列号409)、FpL_C3KX9c(序列号410)、FpL_C3KX 9d(序列号411)、FpL_C3KX9e(序列号412)、FpL_C3KX 10a(序列号413)和FpL_C3KX 10b(序列号414)相较于FpL_C3KX 7e(序列号275)而言洗脱率提高，确认这些变异型免疫球蛋白结合性蛋白质的利用酸的洗脱性提高。获知其中的FpL_C3KX 9a(序列号408)和FpL_C3KX 10a(序列号413)尤其可提高相对于酸的洗脱性。
【表45】
表455
※酸处理:25℃，50mM NaOAc缓冲液(pH3.2)，5min
实施例61向FpL_C3KX 7e导入变异和文库制作(其3)
(1)以表达FpL_C3KX 7e(序列号275)的载体pET-FpL_C3KX 7e为模板，制作针对第15位和第34位的氨基酸残基的饱和置换体制作文库。引物与实施例11(1)同样地依据22c-Trick法以在变异导入位置配置合适的混合碱基、能够进行以变异导入位置为中心的反向PCR的方式来设计(序列号422至433)。对于这些引物，针对每一个位置的置换以6条引物为一组，以表7和表46的组成进行混合，制备PCR引物混合液(正向/反向引物混合物)。
【表46】
表46
(2)以pET-FpL_C3KX 7e为模板DNA，除此以外通过与实施例2(2-2)相同的方法利用反向PCR进行位点特异性变异导入。
(3)对得到的PCR产物进行纯化后，使用反应液转化大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37℃、16小时)后，将平板上形成的菌落作为位点特异性变异体文库。
实施例62 FpL_C3KX 7e氨基酸置换体的筛选(其3)
(1)通过与实施例55(1)至(2)相同的方法培养pET-FpL_C3KX 7e(转化体)和实施例61中制作的随机变异体文库(转化体)中所制作的位点特异性氨基酸置换体文库(转化体)后，进行实施例55(3)记载的碱处理。
(2)通过实施例2(4)记载的ELISA法测定进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性，通过将进行了碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行碱处理时的免疫球蛋白结合性蛋白质的抗体结合活性来计算残留活性。
(3)对约200株转化体进行了评价，从其中选择表达相较于FpL_C3KX 7e(序列号275)而言碱稳定性提高的免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体。
(4)对选择出的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。
(5)对于得到的表达载体中所插入的编码免疫球蛋白结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，利用实施例1(5)中记载的方法分析核苷酸序列，确定氨基酸的变异位置。
(6)通过与实施例54(1-1)至(1-2)相同的方法培养(3)中选择出的表达免疫球蛋白结合性蛋白质的转化体或表达pET-FpL_C3KX 7e(序列号275)的转化体，通过与实施例54(1-3)相同的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(7)将(6)中澄清化后的上清通过实施例54(1-4)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(8)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(9)通过与实施例60(4)相同的方法评价酸洗脱性。
将结果示于表47。在序列号275记载的氨基酸序列中至少具有选自Asn15Val、Glu34Asp、Glu34Phe、Glu34Leu和Glu34Val中的1个以上氨基酸置换的免疫球蛋白结合性蛋白质相较于FpL_C3KX 7e(序列号275)而言洗脱率提高，确认这些变异型免疫球蛋白结合性蛋白质的利用酸的洗脱性提高。
【表47】
表47
※酸处理:25℃,50mM NaOAc缓冲液(pH3.2),5min
实施例63FpL_C3KX 9a的碱稳定性评价
(1)通过与实施例54(1-1)至(1-2)相同的方法培养表达FpL_C3KX 7e(序列号275)的转化体和表达FpL_C3KX 9a(序列号408)的转化体，通过实施例54(1-3)中记载的方法制备蛋白质提取液。对上述提取液进行离心分离，将得到的上清通过过滤器而澄清化。
(2)将(1)中澄清化后的上清通过实施例54(1-4)中记载的方法纯化，回收与免疫球蛋白结合性蛋白质相当的级分。
(3)通过分光光度计测定回收而得的级分的吸光度，对该级分所含的免疫球蛋白结合性蛋白质进行定量。另外，也实施了SDS-PAGE，确认了已将选择出的免疫球蛋白结合性蛋白质纯化为良好纯度。
(4)将处理中使用的NaOH的浓度设为2.0M(终浓度1.0M)，将处理时间设为15小时，除此以外通过与实施例2(13)相同的方法进行碱处理后，通过与实施例2(14)相同的方法来计算残留活性，评价碱稳定性。
将结果示于表48。确认本实施例中评价的FpL_C3KX 9a(序列号408)与相较于天然型的FpL_C3(序列号1)而言碱稳定性提高的FpL_C3KX 7e(序列号275)具有同等碱稳定性。
【表48】
表48
※碱处理:25℃,1.0M NaOH(终浓度),15h
产业上的可利用性
在一个方式中，本发明的蛋白质的特征在于，包含源自芬戈尔德菌属的蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中具有至少一个提高碱稳定性的氨基酸置换，并且具有免疫球蛋白结合活性。一个方式中，包含不溶性载体和固定于该不溶性载体的本发明的蛋白质的本发明的免疫球蛋白吸附剂相较于以往的免疫球蛋白吸附剂而言，可通过高碱稳定性而增加重复利用次数，因此如果利用该免疫球蛋白吸附剂，则相较于以往而言，能够以低成本生产免疫球蛋白。
在一个方式中，本发明的蛋白质的特征在于，包含源自芬戈尔德菌属的蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中具有至少一个提高抗体洗脱特性的氨基酸置换，并且具有免疫球蛋白结合活性。一个方式中，根据包含不溶性载体和固定于该不溶性载体的本发明的蛋白质的本发明的免疫球蛋白吸附剂，相较于以往的免疫球蛋白吸附剂而言，能够以温和的pH条件洗脱免疫球蛋白(抗体)，因此可得到高品质的免疫球蛋白。
Claims (12)
1.一种蛋白质，其包含源自芬戈尔德菌属细菌的蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自以下的(1)至(53)中的1个以上氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性，
(1)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(2)与序列号1的第1位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或缬氨酸
(3)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(4)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或甘氨酸
(5)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(6)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(7)与序列号1的第8位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸
(8)与序列号1的第9位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(9)与序列号1的第17位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(10)与序列号1的第21位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(11)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或精氨酸
(12)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(13)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(14)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(15)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(16)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或甘氨酸
(17)与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或异亮氨酸
(18)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸、赖氨酸和天冬氨酸中的任一种
(19)与序列号1的第51位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(20)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、甘氨酸和天冬氨酸中的任一种
(21)与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(22)与序列号1的第54位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或甲硫氨酸
(23)与序列号1的第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸、精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和色氨酸中的任一种
(24)与序列号1的第65位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(25)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(26)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或脯氨酸
(27)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(28)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或精氨酸
(29)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、赖氨酸和异亮氨酸中的任一种
(30)与序列号1的第32位的苯丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(31)与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(32)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸、
(33)与序列号1的第47位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或精氨酸
(34)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬酰胺
(35)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(36)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸
(37)与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或苏氨酸
(38)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(39)与序列号1的第14位的缬氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(40)与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸或缬氨酸
(41)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(42)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为甲硫氨酸
(43)与序列号1的第33位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的任一种
(44)与序列号1的第35位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(45)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(46)与序列号1的第37位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(47)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或酪氨酸
(48)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸或精氨酸
(49)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或酪氨酸
(50)与序列号1的第60位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(51)与序列号1的第64位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(52)与序列号1的第66位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(53)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或缬氨酸。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其为以下的(a)至(c)中的任一者所述的蛋白质，
(a)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自以下的(1)至(53)中的1个以上氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性，
(1)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(2)与序列号1的第1位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或缬氨酸
(3)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(4)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或甘氨酸
(5)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(6)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(7)与序列号1的第8位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸
(8)与序列号1的第9位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(9)与序列号1的第17位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(10)与序列号1的第21位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(11)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为甘氨酸或精氨酸
(12)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(13)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(14)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(15)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(16)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或甘氨酸
(17)与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或异亮氨酸
(18)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为丝氨酸、赖氨酸和天冬氨酸中的任一种
(19)与序列号1的第51位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(20)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、甘氨酸和天冬氨酸中的任一种
(21)与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(22)与序列号1的第54位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或甲硫氨酸
(23)与序列号1的第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸、精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和色氨酸中的任一种
(24)与序列号1的第65位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸
(25)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(26)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸或脯氨酸
(27)与序列号1的第3位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(28)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为赖氨酸或精氨酸
(29)与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸、赖氨酸和异亮氨酸中的任一种
(30)与序列号1的第32位的苯丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(31)与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(32)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸、
(33)与序列号1的第47位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸或精氨酸
(34)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬酰胺
(35)与序列号1的第2位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(36)与序列号1的第5位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸
(37)与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或苏氨酸
(38)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为脯氨酸
(39)与序列号1的第14位的缬氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(40)与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸或缬氨酸
(41)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸
(42)与序列号1的第31位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为甲硫氨酸
(43)与序列号1的第33位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的任一种
(44)与序列号1的第35位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(45)与序列号1的第36位的苏氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸
(46)与序列号1的第37位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为苏氨酸
(47)与序列号1的第41位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为异亮氨酸或酪氨酸
(48)与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为组氨酸或精氨酸
(49)与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或酪氨酸
(50)与序列号1的第60位的甘氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(51)与序列号1的第64位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(52)与序列号1的第66位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(53)与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸或缬氨酸；
(b)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自所述(1)至(53)中的1个以上氨基酸置换，进而除了所述(1)至(53)以外还包含1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性；
(c)蛋白质，其包含与序列号1或18记载的氨基酸序列或其部分序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有选自所述(1)至(53)中的1个以上氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其为以下的(d)至(f)中的任一者所述的蛋白质，
(d)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有以下的(1)的氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性，
(1)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为酪氨酸；
(e)蛋白质，其包含序列号1或18记载的氨基酸序列，其中在该氨基酸序列中至少具有所述(1)的氨基酸置换，进而包含除了所述氨基酸置换以外的1或多个位置处的1或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性；
(f)蛋白质，其包含与序列号1或18记载的氨基酸序列或其部分序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列，其中至少具有所述(1)的氨基酸置换，并且所述蛋白质具有免疫球蛋白结合活性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质，其中，进而至少具有选自以下的(54)至(64)中的1个以上氨基酸置换，
(54)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为谷氨酰胺
(55)与序列号1的第13位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(56)与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为缬氨酸或异亮氨酸
(57)与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基置换为丙氨酸
(58)与序列号1的第8位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为精氨酸
(59)与序列号1的第15位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为缬氨酸
(60)与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基置换为苯丙氨酸或亮氨酸
(61)与序列号1的第34位的谷氨酸相当的氨基酸残基置换为天冬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸中的任一种
(62)与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基置换为亮氨酸
(63)与序列号1的第50位的天冬酰胺相当的氨基酸残基置换为甲硫氨酸
(64)与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基置换为丝氨酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质，其中，进而，至少选自以下的(I)至(VII)中的1个以上赖氨酸残基被置换为除了赖氨酸以外的碱性氨基酸或具有羟基的氨基酸残基：
(I)与序列号1的第7位相当的赖氨酸残基
(II)与序列号1的第13位相当的赖氨酸残基
(III)与序列号1的第22位相当的赖氨酸残基
(IV)与序列号1的第29位相当的赖氨酸残基
(V)与序列号1的第38位相当的赖氨酸残基
(VI)与序列号1的第48位相当的赖氨酸残基
(VII)与序列号1的第67位相当的赖氨酸残基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白质，其中，进而具有选自下述中的1个以上氨基酸置换：与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换、与序列号1的第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第23位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、和与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的蛋白质，其至少具有以下的(W)、(X)、(Y)、(Z)、(AA)、(AB)、(AC)、(AD)和(AE)中的任意氨基酸置换：
(W)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第22位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酰胺的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、以及与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换；
(X)与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、以及与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换；
(Y)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、以及与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换；
(Z)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第38位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第27位的谷氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、以及与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换；
(AA)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、以及与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换；
(AB)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第52位的谷氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换、与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换、以及与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换；
(AC)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换以及与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换；
(AD)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位、第48位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换以及与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换；
(AE)与序列号1的第4位的谷氨酸相当的氨基酸残基向甘氨酸的置换、与序列号1的第6位的脯氨酸相当的氨基酸残基向丝氨酸的置换、与序列号1的第7位的赖氨酸相当的氨基酸残基向丙氨酸的置换、与序列号1的第13位、第22位和第67位的赖氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第23位的异亮氨酸相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第29位的赖氨酸相当的氨基酸残基向异亮氨酸的置换、与序列号1的第38位的赖氨酸相当的氨基酸残基向谷氨酸的置换、与序列号1的第44位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向精氨酸的置换、与序列号1的第48位的赖氨酸相当的氨基酸残基向组氨酸的置换、与序列号1的第49位的谷氨酸相当的氨基酸残基向天冬氨酸的置换、与序列号1的第50位和第62位的天冬酰胺相当的氨基酸残基向酪氨酸的置换、与序列号1的第53位的酪氨酸相当的氨基酸残基向苯丙氨酸的置换、与序列号1的第64位的异亮氨酸相当的氨基酸残基向亮氨酸的置换以及与序列号1的第69位的丙氨酸相当的氨基酸残基向缬氨酸的置换。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质，其包含序列号179、186、199、224、240、271、275、408和413中的任一者记载的氨基酸序列。
9.一种具有免疫球蛋白结合活性的蛋白质的制造方法，其包括下述工序：培养包含编码权利要求1至8中任一项所述的蛋白质的多核苷酸的基因重组宿主或包含含有该多核苷酸的表达载体的基因重组宿主并使其表达该蛋白质的工序；和，回收所表达的所述蛋白质的工序。
10.根据权利要求9所述的制造方法，其中，宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)。
11.一种填充有免疫球蛋白吸附剂的柱，其中，所述免疫球蛋白吸附剂包含不溶性载体和固定于该不溶性载体的权利要求1至8中任一项所述的蛋白质。
12.一种包含在溶液中的免疫球蛋白的分离方法，其包括下述工序：向权利要求11所述的柱中添加包含免疫球蛋白的溶液，使该免疫球蛋白吸附于所述柱中所填充的免疫球蛋白吸附剂的工序；和，对吸附于所述免疫球蛋白吸附剂的免疫球蛋白进行洗脱的工序。
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| PB01 | Publication | ||
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