JP2023064059A - 免疫グロブリン結合性タンパク質 - Google Patents

免疫グロブリン結合性タンパク質 Download PDF

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崇俊 長谷見
Takatoshi Hasemi
瑛大 岩瀬
Akihiro Iwase
諭 遠藤
Satoshi Endo
亨 田中
Toru Tanaka
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Abstract

【課題】 化学的安定性、特にアルカリに対する安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質、および当該タンパク質を固定化した吸着剤を提供すること。【解決手段】 Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ菌属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において当該ドメインにおいて特定位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換し、アルカリに対する安定性を向上させることで、前記課題を解決する。【選択図】 なし

Description

本発明は免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質に関する。より詳しくは、本発
明はアルカリに対する安定性に優れた免疫グロブリン結合性タンパク質に関する。
抗体医薬は生体内の免疫機能を担う分子である抗体（免疫グロブリン）を利用した医薬
である。抗体医薬は抗体が有する可変領域の多様性により標的分子に対し高い特異性と親
和性をもって結合する。そのため抗体医薬は副作用が少なく、また、近年では適応疾患が
広がってきていることもあり市場が急速に拡大している。
抗体医薬の製造は培養工程と精製工程を含み、培養工程では生産性を向上させるために
抗体産生細胞の改質や培養条件の最適化が図られている。また、精製工程では粗精製とし
てアフィニティークロマトグラフィーが採用され、その後の中間精製、最終精製、および
ウイルス除去を経て製剤化される。
精製工程では抗体分子を特異的に認識するアフィニティー担体が用いられる。前記担体
で用いられるリガンドタンパク質として、抗体（免疫グロブリン）に結合する性質を有し
た、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａが多く
用いられている。しかしながら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａは抗体のＦｃ領域に特異的に結合す
るタンパク質であるため、シングルチェーンＦｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２
、ＩｇＡおよび二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）抗体といったＦｃ領域を有しない抗体
の精製には適用できなかった。一方、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｌは、免疫グロブリンのκ軽鎖に結合するタンパク質であるため、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌを
リガンドタンパク質とすることで、前述したＰｒｏｔｅｉｎ Ａでは精製できない、Ｆｃ
領域を有しない抗体の精製も可能となる。
抗体医薬を製造する際、その生産コストを低く保つため、アフィニティー担体は複数回
使用され、使用後は当該担体に残存した不純物を除去する工程を行なう。前記不純物を除
去する工程では、通常、水酸化ナトリウムを用いた定置洗浄を行ない、アフィニティー担
体を再生させる。従って前記リガンドタンパク質は、前記再生工程を行なっても、抗体へ
の結合性が維持されるだけの化学的安定性（特にアルカリ安定性）を有する必要がある。
アルカリ安定性が向上したＰｒｏｔｅｉｎ Ｌの例として、
特許文献１に記載の特定位置のアスパラギンをグルタミンに置換したＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ
、
特許文献２に記載のプロリンを含むＮ末端側アミノ酸残基の一部欠失や、アルカリにより
加水分解を受けやすい、アスパラギンとグリシンの連続部位に対する他のアミノ酸への置
換を含むＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ、
特許文献３に記載のリジンをリジン以外の塩基性アミノ酸またはヒドロキシ基を有するア
ミノ酸に置換したＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ、
特許文献４に記載のアスパラギンとグリシンの連続部位を含まないドメインを利用したＰ
ｒｏｔｅｉｎ Ｌ、
があげられる。しかしながら、これら文献で開示したＰｒｏｔｅｉｎ Ｌをリガンドタン
パク質として利用したとき、アルカリ洗浄を２０ｍＭから５０ｍＭの水酸化ナトリウム水
溶液で行なう必要があり（非特許文献１）、プロセススケールでの精製に用いるにはアル
カリ安定性が不十分であった。
ＷＯ２０１６／０９６６４３号 ＷＯ２０１７／１９１７４８号 ＷＯ２０１７／０６９１５８号 特開２０１６－０７９１４９号公報
Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｇ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１５，４，２５９－２７７
本発明の課題は、化学的安定性、特にアルカリに対する安定性が向上した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質、および当該タンパク質を固定化した吸着剤を提供することにある。
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細
菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ（ＦｐＬ）の免疫グロブリン結合ドメインにおける安定性向上
に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換す
ることで、アルカリに対して優れた安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至
った。
すなわち、本発明は以下の態様を包括する。
［１］
Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌの免疫グロブリン結合ドメインの
アミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも以下の（１）から（
５３）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有
するタンパク質：
（１）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（２）配列番号１の１番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたはバリ
ンに置換
（３）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
（４）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンまたはグリシ
ンに置換
（５）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（６）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（７）配列番号１の８番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（８）配列番号１の９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（９）配列番号１の１７番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン
に置換
（１０）配列番号１の２１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（１１）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたは
アルギニンに置換
（１２）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置換
（１３）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
（１４）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１５）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（１６）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンまたはグ
リシンに置換
（１７）配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がスレオニンまた
はイソロイシンに置換
（１８）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリン、リジン
およびアスパラギン酸のいずれかに置換
（１９）配列番号１の５１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（２０）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、グリシ
ンおよびアスパラギン酸のいずれかに置換
（２１）配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに
置換
（２２）配列番号１の５４番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンまた
はメチオニンに置換
（２３）配列番号１の６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジン、ア
ルギニン、ロイシン、メチオニンおよびトリプトファンのいずれかに置換
（２４）配列番号１の６５番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（２５）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（２６）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンまたはプロリ
ンに置換
（２７）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（２８）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンまたはアル
ギニンに置換
（２９）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、リジン
およびイソロイシンのいずれかに置換
（３０）配列番号１の３２番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシンに
置換
（３１）配列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（３２）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに
置換、
（３３）配列番号１の４７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンまたはア
ルギニンに置換
（３４）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギンに
置換
（３５）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（３６）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に
置換
（３７）配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはスレオ
ニンに置換
（３８）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置換
（３９）配列番号１の１４番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（４０）配列番号１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンまた
はバリンに置換
（４１）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置
換
（４２）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに置換
（４３）配列番号１の３３番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸
、グリシンおよびバリンのいずれかに置換
（４４）配列番号１の３５番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（４５）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
（４６）配列番号１の３７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（４７）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンまたは
チロシンに置換
（４８）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンまた
はアルギニンに置換
（４９）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がロイシンまたは
チロシンに置換
（５０）配列番号１の６０番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（５１）配列番号１の６４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
（５２）配列番号１の６６番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（５３）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはバリ
ンに置換
［２］
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、［１］に記載のタンパ
ク質：
（ａ）配列番号１または１８に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列にお
いて、少なくとも以下の（１）から（５３）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有
し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質：
（１）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（２）配列番号１の１番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたはバリ
ンに置換
（３）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
（４）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンまたはグリシ
ンに置換
（５）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（６）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（７）配列番号１の８番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（８）配列番号１の９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（９）配列番号１の１７番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン
に置換
（１０）配列番号１の２１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（１１）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたは
アルギニンに置換
（１２）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置換
（１３）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
（１４）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（１５）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（１６）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンまたはグ
リシンに置換
（１７）配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がスレオニンまた
はイソロイシンに置換
（１８）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリン、リジン
およびアスパラギン酸のいずれかに置換
（１９）配列番号１の５１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（２０）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、グリシ
ンおよびアスパラギン酸のいずれかに置換
（２１）配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに
置換
（２２）配列番号１の５４番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンまた
はメチオニンに置換
（２３）配列番号１の６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジン、ア
ルギニン、ロイシン、メチオニンおよびトリプトファンのいずれかに置換
（２４）配列番号１の６５番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（２５）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（２６）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンまたはプロリ
ンに置換
（２７）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（２８）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンまたはアル
ギニンに置換
（２９）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、リジン
およびイソロイシンのいずれかに置換
（３０）配列番号１の３２番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシンに
置換
（３１）配列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（３２）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに
置換、
（３３）配列番号１の４７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンまたはア
ルギニンに置換
（３４）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギンに
置換
（３５）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（３６）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に
置換
（３７）配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはスレオ
ニンに置換
（３８）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置換
（３９）配列番号１の１４番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（４０）配列番号１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンまた
はバリンに置換
（４１）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置
換
（４２）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに置換
（４３）配列番号１の３３番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸
、グリシンおよびバリンのいずれかに置換
（４４）配列番号１の３５番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（４５）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
（４６）配列番号１の３７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（４７）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンまたは
チロシンに置換
（４８）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンまた
はアルギニンに置換
（４９）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がロイシンまたは
チロシンに置換
（５０）配列番号１の６０番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（５１）配列番号１の６４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
（５２）配列番号１の６６番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（５３）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはバリ
ンに置換；
（ｂ）配列番号１または１８に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列にお
いて、少なくとも前記（１）から（５３）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し
、さらに前記（１）から（５３）以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミ
ノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性
を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１または１８に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相
同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも前記（
１）から（５３）より選択される１以上のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合
活性を有するタンパク質。
［３］
以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載のタンパク質である、［１］または［２］に
記載のタンパク質：
（ｄ）配列番号１または１８に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列にお
いて、少なくとも以下の（１）のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有
するタンパク質
（１）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換；
（ｅ）配列番号１または１８に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列にお
いて、少なくとも前記（１）のアミノ酸置換を有し、さらに前記アミノ酸置換以外の１も
しくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／また
は付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号１または１８に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相
同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし少なくとも前記（１）のアミノ酸置換を有し、
かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質。
［４］
さらに、少なくとも以下の（Ｉ）から（ＶＩＩ）より選択される１つ以上のリジン残基
がリジン以外の塩基性アミノ酸またはヒドロキシ基を有するアミノ酸残基に置換した、［
１］から［３］のいずれかに記載のタンパク質：
（Ｉ）配列番号１の７番目に相当するリジン残基
（ＩＩ）配列番号１の１３番目に相当するリジン残基
（ＩＩＩ）配列番号１の２２番目に相当するリジン残基
（ＩＶ）配列番号１の２９番目に相当するリジン残基
（Ｖ）配列番号１の３８番目に相当するリジン残基
（ＶＩ）配列番号１の４８番目に相当するリジン残基
（ＶＩＩ）配列番号１の６７番目に相当するリジン残基。
［５］
さらに、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン
酸への置換、配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、
配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換
、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のバリンへの置換、配列
番号１の６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置換、配列番号
１の２３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、および
配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換
より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、［１］から［４］のいずれかに記載の
タンパク質。
［６］
少なくとも以下の（Ｗ）、（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）、（ＡＡ）、（ＡＢ）および（ＡＣ
）のいずれかのアミノ酸置換を有する、［１］から［５］のいずれかに記載のタンパク質
：
（Ｗ）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番
号１の１３番目、３８番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残基の
アルギニンへの置換、配列番号１の２２番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミ
ンへの置換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンへの
置換、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸へ
の置換、配列番号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基の
チロシンへの置換、ならびに配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残
基のグリシンへの置換；
（Ｘ）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番
号１の１３番目、２２番目、３８番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミ
ノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基
のイソロイシンへの置換、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基
のアスパラギン酸への置換、配列番号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当
するアミノ酸残基のチロシンへの置換、配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当する
アミノ酸残基のグリシンへの置換、ならびに配列番号１の５３番目のチロシンに相当する
アミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換；
（Ｙ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換、
配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の
１３番目、２２番目、３８番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残
基のアルギニンへの置換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソ
ロイシンへの置換、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアス
パラギン酸への置換、配列番号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するア
ミノ酸残基のチロシンへの置換、配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ
酸残基のアスパラギン酸への置換、ならびに配列番号１の５３番目のチロシンに相当する
アミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換；
（Ｚ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換、
配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の
１３番目、２２番目、３８番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残
基のアルギニンへの置換、配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基
のアルギニンへの置換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロ
イシンへの置換、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパ
ラギン酸への置換、配列番号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するアミ
ノ酸残基のチロシンへの置換、配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸
残基のアスパラギン酸への置換、ならびに配列番号１の５３番目のチロシンに相当するア
ミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換；
（ＡＡ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換
、配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、配列番号１
の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の１３番目、
２２番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置
換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンへの置換、配
列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号
１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、配列番
号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置
換、配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への
置換、ならびに配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基のフェニルアラ
ニンへの置換；
（ＡＢ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換
、配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、配列番号１
の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の１３番目、
２２番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置
換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンへの置換、配
列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号
１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、配列番
号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置
換、配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のバリンへの置換、配
列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換なら
びに配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換；
（ＡＣ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換
、配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、配列番号１
の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の１３番目、
２２番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置
換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンへの置換、配
列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号
１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、配列番
号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置
換、配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置
換ならびに配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換。
［７］
配列番号１７９、１８６、１９９、２２４、２４０、２７１および２７５のいずれかに
記載のアミノ酸配列を含む、［１］から［６］のいずれかに記載のタンパク質。
［８］
［１］から［７］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［９］
［８］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１０］
以下の（Ａ）または（Ｂ）を含む、遺伝子組換え宿主：
（Ａ）［１］から［７］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（Ｂ）［１］から［７］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを
含む発現ベクター。
［１１］
宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、［１０］に
記載の遺伝子組換え宿主。
［１２］
［１］から［７］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む
遺伝子組換え宿主または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む遺伝子組換え宿主
を培養し該タンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを
含む、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質の製造方法。
［１３］
宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、［１２］に
記載の製造方法。
［１４］
不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した［１］から［７］のいずれかに記載のタン
パク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤。
［１５］
［１３］に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免
疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを
溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。
本発明のタンパク質は、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属由来のプロテインＬの免疫グロブリン
結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、アルカリ安定性
が向上したアミノ酸置換を少なくとも一つ有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するこ
とを特徴としている。不溶性担体と当該不溶性担体に固定化した本発明のタンパク質とを
含む本発明の免疫グロブリン吸着剤は、従来の免疫グロブリン吸着剤と比較し、高いアル
カリ安定性により、繰返し利用回数が増加するため、同免疫グロブリン吸着剤を利用すれ
ば従来と比べ低コストで免疫グロブリンを生産できる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のタンパク質は、特定の免疫グロブリン結合性タンパク質である。本明細書にお
いて「免疫グロブリン結合性タンパク質」とは、免疫グロブリンに対する結合性を有する
タンパク質を意味する。すなわち、本発明のタンパク質は、特定の免疫グロブリンに対す
る結合性を有する。本発明のタンパク質は、具体的には、免疫グロブリンのκ軽鎖に対す
る結合性を有するものであってもよい。本明細書では、免疫グロブリンに対する結合性を
、「免疫グロブリン結合活性」または「抗体結合活性」ともいう。免疫グロブリン結合活
性は、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ
Ａｓｓａｙ）法で測定できる。ＥＬＩＳＡ法は、例えば、実施例に記載の条件で実施で
きる。
本発明のタンパク質は、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ（「Ｆｐ
Ｌ」ともいう）の免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ
酸配列において、特定位置におけるアミノ酸置換を有したタンパク質である。以降、本明
細書において、ＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列であって、特定位置
におけるアミノ酸置換を有さないものを「非改変型アミノ酸配列」ともいい、ＦｐＬの免
疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列であって、特定位置におけるアミノ酸置換を有
するものを「改変型アミノ酸配列」ともいう。すなわち、改変型アミノ酸配列は、特定位
置におけるアミノ酸置換を有すること以外は非改変型アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列
であってよい。また、本発明のタンパク質は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換を
有すること以外は非改変型アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であって
よい。また、本発明のタンパク質は、例えば、改変型アミノ酸配列を含むタンパク質であ
ってよい。非改変型アミノ酸配列は、天然に見出されるアミノ酸配列であってもよく、そ
うでなくてもよい。非改変型アミノ酸配列は、例えば、所望の性質を有するように改変さ
れていてもよい。非改変型アミノ酸配列は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換以外
のアミノ酸置換を有していてもよい。
ＦｐＬの由来であるＦｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌としては、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍ
ａｇｎａが挙げられる。Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌの免
疫グロブリン結合ドメインとしては、
ドメインＢ１（配列番号２０９（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ２５６１２）の１０４番
目から１７３番目までのアミノ酸残基）、
ドメインＢ２（配列番号２０９の１７６番目から２４５番目までのアミノ酸残基）、
ドメインＢ３（配列番号２０９の２４８番目から３１７番目までのアミノ酸残基）、
ドメインＢ４（配列番号２０９の３２０番目から３８９番目までのアミノ酸残基）、
ドメインＢ５（配列番号２０９の３９３番目から４６２番目までのアミノ酸残基）、
ドメインＣ１（配列番号２１０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ６７５０３）の２４９番
目から３１７番目までのアミノ酸残基：配列番号１１２）、
ドメインＣ２（配列番号２１０の３２０番目から３８９番目までのアミノ酸残基：配列番
号１１３）、
ドメインＣ３（配列番号２１０の３９４番目から４６３番目までのアミノ酸残基：配列番
号１）、および
ドメインＣ４（配列番号２１０の４６８番目から５３７番目までのアミノ酸残基：配列番
号１８）があげられる。
本明細書において非改変型アミノ酸配列とは、
（ｉ）前述したＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインの全アミノ酸配列であってもよく、
（ｉｉ）免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、前記ドメインの部分アミノ酸配
列であってもよい。
なお、前記（ｉｉ）に関して、ＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインは四つのβシート
と一つのαヘリックス、それらをつなぐループ部分とＮ末端ループ領域で構成されている
が、Ｎ末端ループ領域など、免疫グロブリンへの結合とは無関係の領域のアミノ酸残基は
欠損してもよい。具体例として、ＦｐＬのドメインＣ３（配列番号１）のＮ末端ループ領
域に相当する、１番目のグルタミン酸から９番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基を欠
損させても免疫グロブリン結合能を有していることが知られている（Ｈｏｕｓｄｅｎ Ｎ
．Ｇ．ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ
，２００３，３１，７１６－７１８）。すなわち、前記（ｉｉ）における部分アミノ酸配
列は、少なくとも免疫グロブリンへの結合部位のアミノ酸配列を含んでいればよいといえ
る。すなわち、前記（ｉｉ）における部分アミノ酸配列としては、免疫グロブリンへの結
合部位のアミノ酸配列を含む部分配列があげられる。
本明細書における改変型アミノ酸配列として、具体的には、配列番号１に記載のアミノ
酸配列など、前述した免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列において特定位置にお
けるアミノ酸置換を有するアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明のタンパク質と
して、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列など、前述した免疫グロブリン結合
ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、特定位置におけるア
ミノ酸置換を有するタンパク質が挙げられる。言い換えると、本発明のタンパク質は、例
えば、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は配列番号１に記載のアミノ酸配
列など、前述した免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含
むタンパク質であってよい。
本明細書において、タンパク質がアミノ酸配列を含むことを、「タンパク質がアミノ酸
配列からなるアミノ酸残基を含む」ともいい、タンパク質またはアミノ酸配列がアミノ酸
置換を有することを、「タンパク質またはアミノ酸配列においてアミノ酸置換が生じる」
ともいう。またタンパク質またはアミノ酸配列を構成するアミノ酸を、「アミノ酸残基」
ともいう。
本発明のタンパク質は、アルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質で
あってよい。本発明のタンパク質は、具体的には、改変型アミノ酸配列を有しない（例え
ば非改変型アミノ酸配列からなる）免疫グロブリン結合性タンパク質と比較してアルカリ
安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質であってよい。本発明のタンパク質は
、具体的には、特定位置におけるアミノ酸置換を有しない免疫グロブリン結合性タンパク
質と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質であってよい。
言い換えると、本発明のタンパク質は、特定位置におけるアミノ酸置換を有することによ
りアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質であってよい。また、言い
換えると、特定位置におけるアミノ酸置換は、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカ
リ安定性を向上させるものであってよい。
「アルカリ安定性」とは、アルカリ条件における失活に対する耐性を意味してよい。ア
ルカリ安定性の向上は、例えば、アルカリ処理後の残存活性の向上として測定できる。こ
こでいう「活性」とは、免疫グロブリン結合活性を意味する。アルカリ処理は、例えば、
実施例に記載の条件で実施できる。
前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ（この表記は、
配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換されてい
ることを表す；以下、他のアミノ酸置換についても同様に解釈するものとする）、Ｇｌｕ
１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ１Ｖａｌ、Ｐｒｏ３Ｓｅｒ、Ｇｌｕ４Ｌｙｓ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ
５Ｖａｌ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ８Ｇｌｙ、Ｇｌｕ９Ｖａｌ、Ｉｌｅ１７Ｐｈｅ、Ｇｌ
ｙ２１Ａｒｇ、Ｇｌｕ２７Ｇｌｙ、Ｇｌｕ２７Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｐｒｏ、Ｔｈｒ３１Ｌ
ｅｕ、Ｔｈｒ３６Ａｌａ、Ａｌａ４１Ｔｈｒ、Ａｓｎ４４Ｓｅｒ、Ａｓｎ４４Ｇｌｙ、Ｇ
ｌｕ４９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ４９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５０Ｌｙｓ、Ａｓｎ５０
Ａｓｐ、Ｇｌｙ５１Ｖａｌ、Ｇｌｕ５２Ｖａｌ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、
Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｔｈｒ５４Ｉｌｅ、Ｔｈｒ５４Ｍｅｔ、Ａｓｎ６２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６
２Ａｒｇ、Ａｓｎ６２Ｌｅｕ、Ａｓｎ６２Ｍｅｔ、Ａｓｎ６２Ｔｒｐ、Ａｓｎ６５Ｔｙｒ
、Ａｌａ６９Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２Ｓｅｒ、Ｔｈｒ２Ｐｒｏ、Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ５Ｌｙ
ｓ、Ｇｌｕ５Ａｒｇ、Ｇｌｕ２７Ｖａｌ、Ｇｌｕ２７Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２７Ｉｌｅ、Ｐｈｅ
３２Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３８Ａｌａ、Ａｓｎ４４Ｉｌｅ、Ａｌａ４７Ｔｈｒ、Ａｌａ４７Ａｒ
ｇ、Ｇｌｕ５２Ａｓｎ、Ｔｈｒ２Ａｌａ、Ｇｌｕ５Ａｓｐ、Ｐｒｏ６Ｌｅｕ、Ｐｒｏ６Ｔ
ｈｒ、Ｌｙｓ７Ｐｒｏ、Ｖａｌ１４Ａｌａ、Ｉｌｅ２３Ａｒｇ、Ｉｌｅ２３Ｖａｌ、Ｌｙ
ｓ２９Ｐｈｅ、Ｔｈｒ３１Ｍｅｔ、Ｇｌｕ３３Ａｓｐ、Ｇｌｕ３３Ｇｌｙ、Ｇｌｕ３３Ｖ
ａｌ、Ａｌａ３５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ３６Ｓｅｒ、Ａｌａ３７Ｔｈｒ、Ａｌａ４１Ｉｌｅ、Ａ
ｌａ４１Ｔｙｒ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｇｌｕ５２Ｌｅｕ、Ｇｌｕ５２
Ｔｙｒ、Ｇｌｙ６０Ａｒｇ、Ｉｌｅ６４Ｌｅｕ、Ｉｌｅ６６Ｖａｌ、Ａｌａ６９Ｌｅｕ、
Ａｌａ６９Ｖａｌから選ばれる少なくとも１以上のアミノ酸置換である。
言い換えると前記特定位置におけるアミノ酸置換は、少なくとも、
（１）Ａｓｎ５０Ｔｙｒ
（２）Ｇｌｕ１ＧｌｙまたはＧｌｕ１Ｖａｌ
（３）Ｐｒｏ３Ｓｅｒ
（４）Ｇｌｕ４ＬｙｓまたはＧｌｕ４Ｇｌｙ
（５）Ｇｌｕ５Ｖａｌ
（６）Ｌｙｓ７Ａｌａ
（７）Ｇｌｕ８Ｇｌｙ
（８）Ｇｌｕ９Ｖａｌ
（９）Ｉｌｅ１７Ｐｈｅ
（１０）Ｇｌｙ２１Ａｒｇ
（１１）Ｇｌｕ２７ＧｌｙまたはＧｌｕ２７Ａｒｇ
（１２）Ｌｙｓ２９Ｐｒｏ
（１３）Ｔｈｒ３１Ｌｅｕ
（１４）Ｔｈｒ３６Ａｌａ
（１５）Ａｌａ４１Ｔｈｒ
（１６）Ａｓｎ４４ＳｅｒまたはＡｓｎ４４Ｇｌｙ
（１７）Ｇｌｕ４９ＴｈｒまたはＧｌｕ４９Ｉｌｅ
（１８）Ａｓｎ５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５０ＬｙｓおよびＡｓｎ５０Ａｓｐのいずれか
（１９）Ｇｌｙ５１Ｖａｌ
（２０）Ｇｌｕ５２Ｖａｌ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＧｌｕ５２Ａｓｐのいずれか
（２１）Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ
（２２）Ｔｈｒ５４ＩｌｅまたはＴｈｒ５４Ｍｅｔ
（２３）Ａｓｎ６２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２Ａｒｇ、Ａｓｎ６２Ｌｅｕ、Ａｓｎ６２Ｍｅｔお
よびＡｓｎ６２Ｔｒｐのいずれか
（２４）Ａｓｎ６５Ｔｙｒ
（２５）Ａｌａ６９Ｔｈｒ
（２６）Ｔｈｒ２ＳｅｒまたはＴｈｒ２Ｐｒｏ
（２７）Ｐｒｏ３Ａｒｇ
（２８）Ｇｌｕ５ＬｙｓまたはＧｌｕ５Ａｒｇ
（２９）Ｇｌｕ２７Ｖａｌ、Ｇｌｕ２７ＬｙｓおよびＧｌｕ２７Ｉｌｅのいずれか
（３０）Ｐｈｅ３２Ｌｅｕ
（３１）Ｌｙｓ３８Ａｌａ
（３２）Ａｓｎ４４Ｉｌｅ
（３３）Ａｌａ４７ＴｈｒおよびＡｌａ４７Ａｒｇ
（３４）Ｇｌｕ５２Ａｓｎ
（３５）Ｔｈｒ２Ａｌａ
（３６）Ｇｌｕ５Ａｓｐ
（３７）Ｐｒｏ６ＬｅｕまたはＰｒｏ６Ｔｈｒ
（３８）Ｌｙｓ７Ｐｒｏ
（３９）Ｖａｌ１４Ａｌａ
（４０）Ｉｌｅ２３ＡｒｇまたはＩｌｅ２３Ｖａｌ
（４１）Ｌｙｓ２９Ｐｈｅ
（４２）Ｔｈｒ３１Ｍｅｔ
（４３）Ｇｌｕ３３Ａｓｐ、Ｇｌｕ３３ＧｌｙおよびＧｌｕ３３Ｖａｌのいずれか
（４４）Ａｌａ３５Ｔｈｒ
（４５）Ｔｈｒ３６Ｓｅｒ
（４６）Ａｌａ３７Ｔｈｒ
（４７）Ａｌａ４１ＩｌｅまたはＡｌａ４１Ｔｙｒ
（４８）Ａｓｎ４４ＨｉｓまたはＡｓｎ４４Ａｒｇ
（４９）Ｇｌｕ５２ＬｅｕまたはＧｌｕ５２Ｔｙｒ
（５０）Ｇｌｙ６０Ａｒｇ
（５１）Ｉｌｅ６４Ｌｅｕ
（５２）Ｉｌｅ６６Ｖａｌ
（５３）Ａｌａ６９ＬｅｕまたはＡｌａ６９Ｖａｌ
より選択される１つ以上のアミノ酸置換である。本発明のタンパク質は、例えば、これら
のアミノ酸置換から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは
９つのアミノ酸置換を有してよいし、１０個以上のアミノ酸置換を有してもよい。中でも
（１）Ａｓｎ５０Ｔｙｒは、アルカリに対する安定性が特に向上したアミノ酸置換である
。そのため、Ａｓｎ５０Ｔｙｒのアミノ酸置換を少なくとも有する免疫グロブリン結合性
タンパク質は、本発明のタンパク質の好ましい例である。すなわち、本発明のタンパク質
は、例えば、少なくとも（１）のアミノ酸置換（Ａｓｎ５０Ｔｙｒ）を有していてよい。
本発明のタンパク質は、具体的には、例えば、（１）～（５３）のアミノ酸置換の内、（
１）のアミノ酸置換（Ａｓｎ５０Ｔｙｒ）のみを有していていてもよく、（１）のアミノ
酸置換（Ａｓｎ５０Ｔｙｒ）と（２）～（５３）のアミノ酸置換から選択される１つ以上
のアミノ酸置換との組み合わせを有していてもよい。
なお、（１）～（５３）のアミノ酸置換の内、同位置のアミノ酸置換は同時には選択さ
れない。例えば、（３）のアミノ酸置換と（２７）のアミノ酸置換は同時には選択されな
い。
一態様において、前記特定位置におけるアミノ酸置換は、前記（１）～（５３）より選
択される１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてよい。
本発明のタンパク質が２つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する場合、それらアミノ
酸置換の組み合わせは特に制限されない。
アミノ酸置換の組み合わせの一態様として、
Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ酸置換；
Ｉｌｅ１７ＰｈｅおよびＡｓｎ５０Ｓｅｒのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ８ＧｌｙおよびＧｌｕ５２Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ２７Ｇｌｙ、Ａｌａ４１Ｔｈｒ、Ａｓｎ５０ＬｙｓおよびＡｓｎ６５Ｔｙｒのアミ
ノ酸置換；
Ｐｒｏ３Ｓｅｒ、Ａｓｎ５０ＡｓｐおよびＴｈｒ５４Ｉｌｅのアミノ酸置換；
Ａｓｎ４４Ｓｅｒ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ酸置換；
Ａｓｎ４４ＳｅｒおよびＡｓｎ５０Ｔｙｒのアミノ酸置換；
Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ａｓｎ４４Ｇｌｙ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ａｓｎ４４Ｇｌｙ、Ａｓｎ５０ＳｅｒおよびＧｌｕ５２Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７ＡｌａおよびＧｌｙ２１Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ
酸置換；
Ｇｌｕ１Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ酸
置換；
Ｇｌｕ１Ｖａｌ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ酸
置換；
Ｇｌｕ４Ｌｙｓ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ酸
置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ２７Ａｒｇ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ
酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｔｈｒ３６Ａｌａ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ
酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ９Ｖａｌ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ酸
置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ
酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＴｈｒ５４Ｍｅｔのアミノ
酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＡｌａ６９Ｔｈｒのアミノ
酸置換；
Ｇｌｕ１Ｖａｌ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＴｙｒ５
３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＴｙｒ５
３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＴｙｒ
５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ
酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５
３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ
酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ３８Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｐｈｅ３２Ｌｅｕ、Ａｌａ４７Ｔｈｒ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｔｈｒ２Ｓｅｒ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓ
ｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ２７Ｌｙｓ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｔｈｒ２Ｐｒｏ、Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ９Ｖａｌ、
Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｎおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ２７Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ４４Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ５Ｌｙｓ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ４４Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙ
ｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓ
ｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ５Ｌｙｓ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓ
ｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ２７Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ５Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓ
ｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ２７Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｌａ４７Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｐｈｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ８Ｇｌｙ、Ｇｌｕ３３Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔｙ
ｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｉｌｅ２３Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｌａ４１Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｌａ４１Ｔｙｒ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＬｅｕおよびＴｙｒ５
３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＶａｌおよびＴｙｒ５
３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｖａｌ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｌｅｕ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６
９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈ
ｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈ
ｅ、Ｉｌｅ６６ＶａｌおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｔｈｒ３１Ｍｅｔ、Ａｓｎ５０Ｔｙ
ｒ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ｌｅｕ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈ
ｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｌａ３５Ｔｈｒ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ３３Ｇｌｙ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ５Ａｓｐ、Ｐｒｏ６Ｌｅｕ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ
、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６
９Ｌｅｕのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｌａ３７Ｔｈｒ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ３３Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇ
ｌｙ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｔｈｒ２Ａｌａ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ｐｒｏ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈ
ｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｉｌｅ２３Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ｔｈｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈ
ｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｔｈｒ３６Ｓｅｒ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｖａｌ１４Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｇｌｙ６０Ａ
ｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉｌｅ６４Ｌ
ｅｕおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
があげられる。
またアミノ酸置換の組み合わせの別態様として、少なくとも前記（１）から（５３）よ
り選択される１以上のアミノ酸置換と、少なくとも以下の（Ｉ）から（ＶＩＩ）より選択
される１つ以上のリジン（Ｌｙｓ）残基のリジン以外の塩基性アミノ酸（アルギニン（Ａ
ｒｇ）もしくはヒスチジン（Ｈｉｓ））またはヒドロキシ基を有するアミノ酸（セリン（
Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）もしくはチロシン（Ｔｙｒ））への置換との組み合わせ
があげられる。
（Ｉ）配列番号１の７番目に相当するリジン残基
（ＩＩ）配列番号１の１３番目に相当するリジン残基
（ＩＩＩ）配列番号１の２２番目に相当するリジン残基
（ＩＶ）配列番号１の２９番目に相当するリジン残基
（Ｖ）配列番号１の３８番目に相当するリジン残基
（ＶＩ）配列番号１の４８番目に相当するリジン残基
（ＶＩＩ）配列番号１の６７番目に相当するリジン残基
本発明のタンパク質は、前記リジン残基の置換を１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ
または７つ有してよい。ただし、
前記（Ｉ）のアミノ酸置換を選択した場合は（６）Ｌｙｓ７Ａｌａおよび（３８）Ｌｙｓ
７Ｐｒｏのアミノ酸置換が前記（Ｉ）のリジン残基の置換で、
前記（ＩＶ）のアミノ酸置換を選択した場合は（１２）Ｌｙｓ２９Ｐｒｏおよび（４１）
Ｌｙｓ２９Ｐｈｅのアミノ酸置換が前記（ＩＶ）のリジン残基の置換で、
前記（Ｖ）のアミノ酸置換を選択した場合は（３１）Ｌｙｓ３８Ａｌａのアミノ酸置換が
前記（Ｖ）のリジン残基の置換で、
それぞれ上書きされる。
あるいは、前記（Ｉ）から（ＶＩＩ）のアミノ酸置換の内、前記（１）から（５３）よ
り選択される１以上のアミノ酸置換と同位置のアミノ酸置換は選択されなくてもよい。す
なわち、例えば、前記（１）から（５３）のアミノ酸置換から少なくとも（６）Ｌｙｓ７
Ａｌａまたは（３８）Ｌｙｓ７Ｐｒｏのアミノ酸置換を選択した場合は、前記（Ｉ）のア
ミノ酸置換は選択されなくてもよい。また、アミノ酸置換の組み合わせは、少なくとも前
記（１）から（５３）より選択される１以上のアミノ酸置換が残存するように選択される
。すなわち、例えば、前記（１）から（５３）のアミノ酸置換から（６）Ｌｙｓ７Ａｌａ
または（３８）Ｌｙｓ７Ｐｒｏのアミノ酸置換を単独で選択した場合は、前記（Ｉ）のア
ミノ酸置換は選択できない。
なお、塩基性アミノ酸またはヒドロキシ基を有するアミノ酸に置換されたリジン残基以
外のリジン残基（すなわち、前記（Ｉ）～（ＶＩＩ）のリジン残基の内の選択されなかっ
たもの）については、未置換（リジン残基）のままでもよいし、塩基性アミノ酸およびヒ
ドロキシ基を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されてもよい。後者の例としては、リ
ジン残基のグルタミンまたはイソロイシンへの置換や、前述した（６）Ｌｙｓ７Ａｌａ、
（１２）Ｌｙｓ２９Ｐｒｏ、（３１）Ｌｙｓ３８Ａｌａ、（３８）Ｌｙｓ７Ｐｒｏおよび
（４１）Ｌｙｓ２９Ｐｈｅのアミノ酸置換があげられる。
アミノ酸置換の組み合わせの別態様の具体例として、
Ｌｙｓ７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９
Ａｒｇ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８ＡｒｇおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ａｒｇ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｙ５１ＶａｌおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ａｒｇ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＬｙｓ６７Ａｒ
ｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９
Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８ＡｒｇおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＬｙｓ６７Ａｒ
ｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９
Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ１Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ１Ｖａｌ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＬｙｓ６７Ａｒ
ｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｌｙｓ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｔｈｒ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＬｙｓ６７Ａｒ
ｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２７Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９
Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３６
Ａｌａ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ９Ｖａｌ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＬｙｓ６７Ａｒ
ｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｈｒ５４Ｍｅｔお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｌｙｓ６７Ａｒｇお
よびＡｌａ６９Ｔｈｒのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｈｒ５４Ｍｅｔお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ１Ｖａｌ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９
Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、
Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｌａ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｐｈｅ３２Ｌｅｕ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ａｌａ４７Ｔｈｒ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａ
ｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ
酸置換；
Ｔｈｒ２Ｓｅｒ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌ
ｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｇｌｕ２７Ｌ
ｙｓ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇ
ｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｔｈｒ２Ｐｒｏ、Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ９Ｖａｌ、
Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４
８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｎ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａ
ｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｇｌｕ２７Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇ
ｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ａｓｎ４４Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇ
ｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ５Ｌｙｓ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ａｓｎ４４Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓ
ｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸
置換；
Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌ
ｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ５Ｌｙｓ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌ
ｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｇｌｕ２７Ｖ
ａｌ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇ
ｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ５Ａｒｇ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌ
ｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｇｌｕ２７Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇ
ｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ａｌａ４７Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇ
ｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｐ
ｈｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ８Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３３Ｖａｌ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌ
ｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｉｌｅ２３Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｌａ４１Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｌａ４１Ｔｙｒ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｌｅｕ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｖａｌ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｖａｌ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｌｅｕ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ６７Ａｒｇおよ
びＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙ
ｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙ
ｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉｌ
ｒ６６Ｖａｌ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｔｈｒ３１Ｍｅｔ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙ
ｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ｌｅｕ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙ
ｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｌａ３５Ｔｈｒ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｇｌｕ３３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ５Ａｓｐ、Ｐｒｏ６Ｌｅｕ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ
、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ
５３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ６７Ａｒｇおよ
びＡｌａ６９Ｌｅｕのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｌａ３７Ｔｈｒ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｇｌｕ３３Ａｓｐ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔ
ｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｔｈｒ２Ａｌａ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙ
ｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｉｌｅ２３Ｖ
ａｌ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ｔｈｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙ
ｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｔｈｒ３６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｖａｌ１４Ａｌａ、Ｌｙｓ２２Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｇｌｙ６０Ａｒｇ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉｌｅ６４Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
があげられる。
アミノ酸置換の組み合わせの別態様の具体例として、特に
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＬｙｓ６７Ａｒ
ｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｇｌｕ２７Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇ
ｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｖａｌ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ６７Ａｒｇおよ
びＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
があげられる。
なお、本発明のタンパク質は、少なくとも１つのその他のアミノ酸置換をさらに有して
もよい。他のアミノ酸置換としては、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ａｓｎ４４Ａ
ｓｐ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ６２Ｔｙｒ、Ｉｌｅ２３Ｔｈｒ、Ａｌａ４１Ａｒｇがあ
げられる。他のアミノ酸置換は、例えば、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安
定性を向上させるものであってよい。例えば、Ａｓｎ４４Ａｓｐ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａ
ｓｎ６２Ｔｙｒ、Ｉｌｅ２３Ｔｈｒ、およびＡｌａ４１Ａｒｇのアミノ酸置換は、いずれ
も、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性を向上させるものであり得る。本
発明のタンパク質は、例えば、前記他のアミノ酸置換を１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、
または６つ有してよい。ただし、Ｇｌｕ４９Ａｓｐのアミノ酸置換を選択した場合は（１
７）のアミノ酸置換（Ｇｌｕ４９ＴｈｒまたはＧｌｕ４９Ｉｌｅ）がＧｌｕ４９Ａｓｐの
アミノ酸置換で、Ｐｒｏ６Ｓｅｒのアミノ酸置換を選択した場合は（３７）のアミノ酸置
換（Ｐｒｏ６ＬｅｕおよびＰｒｏ６Ｔｈｒのいずれか）がＰｒｏ６Ｓｅｒのアミノ酸置換
で、Ａｓｎ４４Ａｓｐのアミノ酸置換を選択した場合は（１６）のアミノ酸置換（Ａｓｎ
４４ＳｅｒまたはＡｓｎ４４Ｇｌｙ）、（３２）のアミノ酸置換（Ａｓｎ４４Ｉｌｅ）お
よび（４８）のアミノ酸置換（Ａｓｎ４４ＨｉｓまたはＡｓｎ４４Ａｒｇ）がＡｓｎ４４
Ａｓｐのアミノ酸置換で、Ｇｌｕ４９Ｖａｌのアミノ酸置換を選択した場合は（１７）の
アミノ酸置換（Ｇｌｕ４９ＴｈｒまたはＧｌｕ４９Ｉｌｅ）がＧｌｕ４９Ｖａｌのアミノ
酸置換で、Ａｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を選択した場合は（２３）のアミノ酸置換（
Ａｓｎ６２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２Ａｒｇ、Ａｓｎ６２Ｌｅｕ、Ａｓｎ６２ＭｅｔおよびＡｓ
ｎ６２Ｔｒｐのいずれか）がＡｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換で、Ｉｌｅ２３Ｔｈｒのア
ミノ酸置換を選択した場合は（４０）のアミノ酸置換（Ｉｌｅ２３ＡｒｇまたはＩｌｅ２
３Ｖａｌ）がＩｌｅ２３Ｔｈｒのアミノ酸置換で、Ａｌａ４１Ａｒｇのアミノ酸置換を選
択した場合は（１５）のアミノ酸置換（Ａｌａ４１Ｔｈｒ）および（４７）のアミノ酸置
換（Ａｌａ４１ＩｌｅまたはＡｌａ４１Ｔｙｒ）がＡｌａ４１Ａｒｇのアミノ酸置換で、
それぞれ上書きされる。あるいは、他のアミノ酸置換の内、前記（１）から（５３）より
選択される１以上のアミノ酸置換と同位置のアミノ酸置換は選択されなくてもよい。すな
わち、例えば、前記（１）から（５３）のアミノ酸置換から少なくとも（１７）のアミノ
酸置換（Ｇｌｕ４９ＴｈｒまたはＧｌｕ４９Ｉｌｅ）を選択した場合は、Ｇｌｕ４９Ａｓ
ｐおよびＧｌｕ４９Ｖａｌのアミノ酸置換は選択されなくてもよい。また、アミノ酸置換
の組み合わせは、少なくとも前記（１）から（５３）より選択される１以上のアミノ酸置
換が残存するように選択される。すなわち、例えば、前記（１）から（５３）のアミノ酸
置換から（１７）のアミノ酸置換（Ｇｌｕ４９ＴｈｒまたはＧｌｕ４９Ｉｌｅ）を単独で
選択した場合は、Ｇｌｕ４９ＡｓｐおよびＧｌｕ４９Ｖａｌのアミノ酸置換は選択できな
い。すなわち、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例え
ば配列番号１に記載のアミノ酸配列）において前記特定位置におけるアミノ酸置換および
Ｇｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列も挙げら
れる。すなわち、本発明のタンパク質としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例
えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列において、前記
特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ
酸置換を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明のタンパク質は、例えば
、前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他の
アミノ酸置換を有すること以外は上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１
に記載のアミノ酸配列）と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
前記他のアミノ酸置換を含むアミノ酸置換の組み合わせとしては、上記例示したアミノ
酸置換の組み合わせにおいてさらに前記他のアミノ酸置換を１つ、２つ、３つ、４つ、５
つ、または６つ含む組み合わせが挙げられる。前記他のアミノ酸置換を含むアミノ酸置換
の組み合わせとしては、特に、上記例示したアミノ酸置換の組み合わせにおいてさらに少
なくともＡｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を含む組み合わせが挙げられる。
前記他のアミノ酸置換をさらに有した、本発明のタンパク質の一例として、以下のタン
パク質が挙げられる。これらのタンパク質はアルカリ安定性が向上し、かつｓｕｂｇｒｏ
ｕｐに関係なく免疫グロブリンのκ軽鎖に結合できる点で好ましい。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、Ｌｙｓ７Ａ
ｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌ
ｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ａｓｎ６２
ＴｙｒおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質
（配列番号１７９に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、Ｌｙｓ７Ａ
ｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌ
ｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｙｒ５３
Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２ＴｙｒおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換を有する免疫グロブリ
ン結合性タンパク質（配列番号１８６に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性
タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、Ｇｌｕ４Ｇ
ｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙ
ｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２ＴｙｒおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換を有
する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１９９に記載のアミノ酸配列を含む免疫
グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、Ｇｌｕ４Ｇ
ｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｇｌｕ２７Ａｒｇ、Ｌｙ
ｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２ＴｙｒおよびＬｙｓ６７Ａｒｇ
のアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２２４に記載のアミ
ノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、Ｇｌｕ４Ｇ
ｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ
２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙ
ｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２ＴｙｒおよびＬｙｓ６７Ａｒｇの
アミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２４０に記載のアミノ
酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、Ｇｌｕ４Ｇ
ｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ
２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙ
ｒ、Ｇｌｕ５２Ｖａｌ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ６７Ａｒｇおよび
Ａｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２
７１に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、Ｇｌｕ４Ｇ
ｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ
２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙ
ｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌの
アミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号２７５に記載のアミノ
酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）。
言い換えると、本発明のタンパク質が有するアミノ酸置換の一例として、以下のものが
挙げられる：
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、
Ａｓｎ６２ＴｙｒおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、
Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２ＴｙｒおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇ
ｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２ＴｙｒおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ
酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｇｌｕ２７Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａ
ｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２ＴｙｒおよびＬｙｓ
６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓ
ｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２ＴｙｒおよびＬｙｓ６
７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓ
ｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｖａｌ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ６７Ａ
ｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓ
ｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６
９Ｖａｌのアミノ酸置換。
本明細書では、配列番号１に記載のアミノ酸配列において上記例示したアミノ酸置換（
すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓ
ｅｒなど他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を、「配列番号１由来置換アミノ酸配
列」ともいう。配列番号１由来置換アミノ酸配列は、言い換えると、上記例示したアミノ
酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰ
ｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換）が生じた配列番号１に記載のアミノ酸配列である。
また、配列番号１由来置換アミノ酸配列は、言い換えると、上記例示したアミノ酸置換（
すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓ
ｅｒなど他のアミノ酸置換）を有すること以外は配列番号１に記載のアミノ酸配列と同一
のアミノ酸配列である。配列番号１由来置換アミノ酸配列は、本明細書における改変型ア
ミノ酸配列の一例である。
本明細書における改変型アミノ酸配列としては、上記例示した改変型アミノ酸配列（例
えば配列番号１由来置換アミノ酸配列）のバリアント（ｖａｒｉａｎｔ）配列も挙げられ
る。すなわち、本発明のタンパク質としては、上記例示した改変型アミノ酸配列（例えば
配列番号１由来置換アミノ酸配列）のバリアント配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合
活性を有するタンパク質も挙げられる。以下、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリア
ント配列の場合を例示して説明するが、当該説明は任意の改変型アミノ酸配列のバリアン
ト配列にも準用できる。
配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、前記特定位置におけるアミノ酸
置換が残存するように（すなわち、本発明のタンパク質が前記特定位置におけるアミノ酸
置換を有するように）設定されるものとする。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列の
バリアント配列は、Ｇｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換が残存する
ように（すなわち、本発明のタンパク質がＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のア
ミノ酸置換を有するように）設定されてもよい。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列
のバリアント配列は、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけ
るアミノ酸置換および任意のＧｌｕ４９Ａｓｐなど他のアミノ酸置換）から選択される、
配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を追加的に有してい
てもよい。例えば、配列番号１由来置換アミノ酸配列がＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅ
ｒなど他のアミノ酸置換を有さない場合に、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアン
ト配列が前記他のアミノ酸置換を有していてもよい。
配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１由来置換アミ
ノ酸配列において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明のタ
ンパク質は、免疫グロブリン結合活性を有する限り、上記例示したアミノ酸置換（すなわ
ち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒな
ど他のアミノ酸置換）に加えて、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１
もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／ま
たは付加を含んでいてもよい。すなわち、本発明のタンパク質としては、配列番号１に記
載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、上記例示したアミノ酸置換
（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６
Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換）を有し、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個
のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ、免疫グロブリン
結合活性を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明のタンパク質は、例え
ば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意
のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換）を有し、さらに１もしくは
数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加
を含むこと以外は配列番号１と同一のアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活
性を有するタンパク質であってもよい。なお、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、
および／または付加は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように選択される
ものとする。すなわち、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は
、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入、および／または付加は、前記他のアミノ酸置換が残存するように選択されても
よい。すなわち、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例え
ば、前記他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。また、上記のアミノ酸残基の置換
、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択され
る、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を含んでいても
よい。前記「１もしくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置
やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１から２０個、１から
１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、
１から３個、１から２個、１個のいずれかを意味する。上記のアミノ酸残基の置換の一例
としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保
守的置換が挙げられる。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じ
ていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている
。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグル
タミン酸とアラニン間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サ
イエンス・インターナショナル社，９，２００５）。また、上記のアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入、および／または付加には、例えば、タンパク質またはそれをコードする遺伝
子が由来する微生物の個体差や種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ミュータ
ント（ｍｕｔａｎｔ）またはバリアント）によって生じるものも含まれる。
また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１由来置
換アミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発
明のタンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において上記例示したアミノ
酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｕ４９ＡｓｐやＰ
ｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列に対して高い相同性を有する
アミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。
なお、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、前記特定位置におけるアミ
ノ酸置換が残存するように選択されるものとする。すなわち、上記のような相同性の範囲
でのアミノ酸配列の変化は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記
のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、他のアミノ酸置換が残存するように選
択されてもよい。すなわち、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例え
ば、他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。また、上記のような相同性の範囲での
アミノ酸配列の変化は、例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される、配列番号１
由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。前記「相
同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味
してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列に対する相同性」とは、アミノ
酸配列全体に対する相同性を意味する。前記「高い相同性」とは、７０％以上、８０％以
上、９０％以上、または９５％以上の相同性を意味してよい。アミノ酸配列間の「同一性
」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（
実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列間の「
類似性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖
の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学 ２０１３年２月号
Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。側鎖の性質が類似したアミノ酸残基については上述
の通りである。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉ
ｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（
ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。
また改変型アミノ酸配列としては、上記例示したバリアント配列において、さらに、上
記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌ
ｕ４９Ａｓｐなど他のアミノ酸置換）から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有するア
ミノ酸配列も挙げられる。例えば、改変型アミノ酸配列は、少なくとも前記特定位置にお
けるアミノ酸置換を有するバリアント配列において、さらに他のアミノ酸置換を有するア
ミノ酸配列であってよい。
また非改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列
番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列も挙げられる。すなわち、改変型アミノ
酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ
酸配列）のバリアント配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置
におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸
置換）を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明のタンパク質としては、上
記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアン
ト配列を含み、ただし当該バリアント配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわ
ち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒな
ど他のアミノ酸置換）を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げら
れる。言い換えると本発明のタンパク質は、例えば、上記例示したアミノ酸置換を有する
こと以外は上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列
）のバリアント配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。なお、上記
例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント
配列は、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌において実際に存在していてもよく、いなくてもよ
い。すなわち、「Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌの免疫グロブリン
結合ドメインのアミノ酸配列（ＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列）」
とは、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌に実際に存在するＰｒｏｔｅｉｎ Ｌの免疫グロブリ
ン結合ドメインのアミノ酸配列に限られず、同アミノ酸配列のバリアント配列であってＦ
ｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌に実際に存在しない（すなわち仮想の）アミノ酸配列も包含す
る。以下、配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列の場合を例示して説明する
が、当該説明は任意の非改変型アミノ酸配列のバリアント配列にも準用できる。
配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明のタ
ンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列に
おいて、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、
および／または付加を含み、さらに上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置に
おけるアミノ酸置換および任意でＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置
換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。上記のア
ミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、前記特定位置以外の位
置に生じてよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は
、例えば、他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。
配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明のタ
ンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ
酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い
相同性を有するアミノ酸配列）において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定
位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなどの他のア
ミノ酸置換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。
上記のような相同性の範囲でのアミノ酸残基の変化は、例えば、前記特定位置以外の位置
に生じてよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸残基の変化は、例えば、他
のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。
その他、配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列については、配列番号１由
来置換アミノ酸配列のバリアント配列についての記載を準用できる。
本明細書において「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸」とは
、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端から数えてＸ位の位置に存在するアミノ酸を
意味する。特定のアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番
目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、当該特定のアミノ酸配列におけるアミノ酸
残基であって、当該特定のアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアライメント（
ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）において配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸
と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。例えば、Ａｓｎ５０Ｔｙｒのアミノ
酸置換の場合、特定のアミノ酸配列における「配列番号１の５０番目のアスパラギンに相
当するアミノ酸残基」とは、当該特定のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当
該特定のアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアライメントにおいて配列番号１
に示すアミノ酸配列における５０番目のアスパラギンと同一の位置に配列されるアミノ酸
残基を意味する。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列における「配列番号１に記載の
アミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号１に記
載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸そのものを意味する。すなわち、上記例示し
たアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意で他のアミノ酸
置換）の位置は、必ずしも本発明のタンパク質における絶対的な位置を示すものではなく
、配列番号１に記載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。すなわち、
例えば、本発明のタンパク質が、上記例示したアミノ酸置換の位置よりもＮ末端側にアミ
ノ酸残基の挿入、欠失、または付加を含む場合、それに応じて当該アミノ酸置換の絶対的
な位置は変動し得る。本発明のタンパク質における上記例示したアミノ酸置換の位置は、
例えば、本発明のタンパク質のアミノ酸配列と配列番号１に記載のアミノ酸配列とのアラ
イメントで特定できる。前記アライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のアラ
イメントプログラムを利用して実施できる。配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアン
ト配列等の任意のアミノ酸配列における上記例示したアミノ酸置換の位置についても同様
である。また、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換
および任意でＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換）の置換前のアミ
ノ酸残基は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における置換前のアミノ酸残基の種類を示
すものであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列以外の非改変型アミノ酸配列において
は保存されていてもよく、いなくてもよい。
本発明のタンパク質は、改変型アミノ酸配列を１個のみ含んでいてもよく、改変型アミ
ノ酸配列を複数個含んでいてもよい。本発明のタンパク質は、例えば、改変型アミノ酸配
列を２個以上、３個以上、４個以上、または５個以上含んでいてもよく、１０個以下、７
個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下含んでいてもよく、それらの矛
盾しない組み合わせの個数含んでいてもよい。本発明のタンパク質が複数個の改変型アミ
ノ酸配列を含む場合、それら複数個の改変型アミノ酸配列のアミノ酸配列は同一であって
もよく、そうでなくてもよい。それら複数個の改変型アミノ酸配列は、直接連結（直結）
させた態様であってもよいし、適切なリンカー（例えば、５以上２５以下のアミノ酸残基
からなるオリゴペプチド）を介して連結させた態様であってもよい。
本発明のタンパク質は、改変型アミノ酸配列からなるものであってもよく、他のアミノ
酸配列をさらに含んでいてもよい。すなわち、本発明のタンパク質は、例えば、そのＮ末
端側またはＣ末端側に他のアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。言い換えると、本発
明のタンパク質においては、例えば、改変型アミノ酸配列のＮ末端側またはＣ末端側に、
他のアミノ酸配列が付加されていてもよい。他のアミノ酸配列としては、オリゴペプチド
があげられる。他のアミノ酸配列として用いられるオリゴペプチドとしては、前記リンカ
ー以外のオリゴペプチドがあげられる。他のアミノ酸配列は、本発明のタンパク質の免疫
グロブリン結合活性や安定性を損なわない限り、特に制限されない。例えば、他のアミノ
酸配列の種類や長さは、本発明のタンパク質の免疫グロブリン結合性や安定性を損なわな
い限り、特に制限されない。
本発明のタンパク質は、例えば、選択した免疫グロブリン結合ドメインに加えて、他の
免疫グロブリン結合ドメインの一部を含んでいてもよい。例えば、本発明のタンパク質が
ＦｐＬのドメインＣ３の改変型アミノ酸配列を含む場合、本発明のタンパク質は、さらに
、ＦｐＬのドメインＣ３のＮ末端側領域（ドメインＣ１、ドメインＣ２）の一部を含んで
いてもよく、ＦｐＬのドメインＣ３のＣ末端側領域（ドメインＣ４）の一部を含んでいて
もよい。
本発明のタンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に、目的物を特異的に検
出または分離する目的で有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。そのようなオリゴペ
プチドとしては、ポリヒスチジンやポリアルギニンが挙げられる。また本発明のタンパク
質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に、本発明のタンパク質をクロマトグラフィ
ー用の支持体等の固相に固定化する際に有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。その
ようなオリゴペプチドとしては、リジンやシステインを含むオリゴペプチドが挙げられる
。
本発明のタンパク質が上記のような他のアミノ酸配列を含む場合、本発明のタンパク質
は、例えば、あらかじめ他のアミノ酸配列を含む形態で製造されてもよいし、別途製造さ
れた上記のような他のアミノ酸配列が付加されてもよい。本発明のタンパク質が上記のよ
うな他のアミノ酸配列を含む場合、典型的には、本発明のタンパク質は、上記のような他
のアミノ酸配列を含む本発明のタンパク質の全長アミノ酸配列をコードするポリヌクレオ
チドから発現させることで製造できる。すなわち、例えば、他のアミノ酸配列をコードす
るポリヌクレオチドと本発明のタンパク質（例えば他のアミノ酸配列を含まないもの）を
コードするポリヌクレオチドとを、他のアミノ酸配列が本発明のタンパク質のＮ末端側ま
たはＣ末端側に付加されるように連結し、本発明のタンパク質を発現させてもよい。また
例えば、化学的に合成した他のアミノ酸配列を本発明のタンパク質（例えば他のアミノ酸
配列を含まないもの）のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させてもよい。
本発明のタンパク質は、例えば、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドか
ら発現させることで製造できる。本明細書では、本発明のタンパク質をコードするポリヌ
クレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」ともいう。本発明のポリヌクレオチドは、
具体的には、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
であってよい。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法やＰＣＲ法等によるＤＮＡ増幅法で
取得できる。ＤＮＡ増幅法は、例えば、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配
列といった、増幅すべきヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを鋳型とし実施できる
。鋳型とするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質を発現する生物のゲノムＤＮＡ、
本発明のタンパク質のｃＤＮＡ、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが例示できる
。
本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、例えば、本発明のタンパク質のアミ
ノ酸配列からの変換で設計できる。アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際には
、標準のコドンテーブルを使用できるが、本発明のポリヌクレオチドで形質転換する宿主
におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主がＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／Ａ
ＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）で
はＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それ
ぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避ける
ように変換してよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮ
Ａ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用
することでも可能である。
本発明のポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの全長を一括取得してもよく、当
該ポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドを取得後連結することで取得し
てもよい。上記のような本発明のポリヌクレオチドを取得する手法についての説明は、そ
の全長配列を一括して取得する場合に限られず、その部分配列を取得する場合にも準用で
きる。
なお、本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする
ポリヌクレオチドと連結し、融合型アミノ酸配列をコードするように設計してもよい。
本発明のタンパク質は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え宿主（
以下、単に「本発明の遺伝子組換え宿主」ともいう）を培養し前記タンパク質を発現させ
た後、発現した前記タンパク質を回収することで製造できる。本発明の遺伝子組換え宿主
は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換することで得られる。宿
主は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換されることで本発明のタンパク質を発現可能
なものであれば特に制限されない。宿主の例として、動物細胞、昆虫細胞、微生物が挙げ
られる。このうち動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔ
ｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞が、昆虫
細胞としては、Ｓｆ９細胞、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞が、微生物としては、酵母や
細菌が、それぞれ例示できる。さらに酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ等のＰｉｃｈｉａ属酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ等
のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母が、細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌が挙げられる。大腸菌と
しては、ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。なお、酵母や大腸菌を宿主
として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。
本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、発現可能に保持さ
れていればよい。具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、前記宿主で機能するプロモ
ーターの制御下で発現するように保持されていればよい。前記宿主が大腸菌の場合、宿主
で機能するプロモーターの一例として、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒ
ｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐ
ｐプロモーターが挙げられる。
また本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ
外で自律複製するベクター上に存在していてよい。すなわち、本発明のポリヌクレオチド
を含む発現ベクター（以下、単に「本発明の発現ベクター」ともいう）で宿主を形質転換
して本発明の遺伝子組換え宿主を作製してもよい。本発明の発現ベクターは、例えば、発
現ベクターの適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入して得られる。なお、発現ベ
クターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限されない
。前記宿主が大腸菌の場合、発現ベクターとしては、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣ
プラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクターが例示できる。なお、本発明の発現ベ
クターは、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを備えていてよい。また、前記適切な位
置とは、発現ベクターの複製機能、選択マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置
を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要
なプロモーター等の機能性ポリヌクレオチドに連結された状態で挿入すると好ましい。
また本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ
上に導入されてもよい。ゲノムＤＮＡへの本発明のポリヌクレオチドの導入は、例えば、
相同組み換えによる遺伝子導入法を利用して実施できる。相同組み換えによる遺伝子導入
法としては、Ｒｅｄ－ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ
．Ａ，ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ．，９７：６６４０－６６４５（２０００））等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感
受性複製起点を含むベクターを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないベクタ
ーを用いる方法、ファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法が例示できる。
本発明の発現ベクター等のポリヌクレオチドを用いた宿主の形質転換は、例えば、当業
者が通常用いる方法で実施できる。例えば、宿主として大腸菌を選択した場合は、コンピ
テントセル法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等で形質転換すればよい。
形質転換後に適切な方法で本発明のポリヌクレオチドを含む宿主をスクリーニングするこ
とで、本発明の遺伝子組換え宿主を取得できる。
なお、各種微生物において利用可能な発現ベクターやプロモーター等の遺伝子工学的手
法に関する情報は、例えば「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版、１９８７年」
などの公知文献を利用し、取得すればよい。
本発明の遺伝子組換え宿主が本発明の発現ベクターを含む場合、本発明の遺伝子組換え
宿主から本発明の発現ベクターを調製できる。例えば、本発明の遺伝子組換え宿主を培養
して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒ
ｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の市販の抽出キットを用いて本発明の発現ベクター
を調製できる。
本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明のタンパク質を発現できる。また
、本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明のタンパク質を発現させ、発現し
た前記タンパク質を回収することで、本発明のタンパク質を製造できる。すなわち、本明
細書は、本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで本発明のタンパク質を発現させる工
程と、発現された前記タンパク質を回収する工程とを含む、本発明のタンパク質の製造方
法を開示する。培地組成や培養条件は、宿主の種類や本発明のタンパク質の特性等の諸条
件に応じて適宜設定すればよい。培地組成や培養条件は、例えば、宿主が増殖でき、かつ
、本発明のタンパク質を発現可能な条件に設定すればよい。培地は、例えば、炭素源、窒
素源、無機塩、その他の各種有機成分や無機成分を適宜含む培地を使用できる。具体的に
は、宿主が大腸菌の場合、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培
地（トリプトン１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣ
ｌ）が好ましい培地の一例として挙げられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無
により、本発明の遺伝子組換え宿主を選択的に増殖させるために、培地に当該発現ベクタ
ーに含まれる抗生物質耐性遺伝子に対応した抗生物質を添加して培養すると好ましい。例
えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は培地にカナマイシ
ンを添加すればよい。本発明のポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ上に導入されている場合
も同様である。また、培地は、グルタチオン、システイン、シスタチン、チオグリコレー
トおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでいて
もよい。また培地は、グリシン等の前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す
試薬を含んでいてもよい。例えば、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（
ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は、例えば、宿主が大腸菌の場合、一般に
１０℃以上４０℃以下、好ましくは２０℃以上３７℃以下、より好ましくは２５℃前後で
ある。培地のｐＨは、例えば、宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８以上ｐＨ７．４以下、好
ましくはｐＨ７．０前後である。また、本発明のタンパク質を誘導性のプロモーターの制
御下で発現する場合は、本発明のタンパク質が良好に発現できるように誘導をかけると好
ましい。発現誘導には、例えば、プロモーターの種類に応じた誘導剤を用いることができ
る。誘導剤としては、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏ
ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示できる。宿主が大腸菌の場合、例えば、培養液の濁度（６
００ｎｍにおける吸光度）が約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加
し、引き続き培養することで、本発明のタンパク質の発現を誘導できる。ＩＰＴＧの添加
濃度は、例えば、０．００５ｍＭ以上１．０ｍＭ以下、好ましくは０．０１ｍＭ以上０．
５ｍＭ以下である。ＩＰＴＧ誘導等の発現誘導は、例えば、当該技術分野において周知の
条件で行なえる。
本発明のタンパク質は、その発現形態に適した方法で培養物から分離し回収すればよい
。なお、本明細書において「培養物」とは、培養で得られた培養液の全体またはその一部
を意味する。当該一部は、本発明のタンパク質を含む部分であれば特に制限されない。当
該一部としては、培養された本発明の形質転換体の細胞や培養後の培地（すなわち培養上
清）などが挙げられる。例えば、本発明のタンパク質が培養上清に蓄積する場合、細胞を
遠心分離操作で分離し、得られる培養上清から本発明のタンパク質を回収すればよい。ま
た、本発明のタンパク質が細胞内（ペリプラズムを含む）に蓄積する場合、細胞を遠心分
離操作で回収後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加して細胞を破砕し、当該破砕物から本
発明のタンパク質を回収すればよい。前述した培養上清や細胞破砕物からの、本発明のタ
ンパク質の回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法で実施できる
。前記回収方法の一例として、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点
沈殿が挙げられる。
本発明のタンパク質は、例えば、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析に使用でき
る。前記目的で使用する際は、例えば、不溶性担体と当該不溶性担体に固定化した本発明
のタンパク質とを含む免疫グロブリン吸着剤（以下、単に「本発明の免疫グロブリン吸着
剤」ともいう）の態様で使用できる。なお、本明細書において、「免疫グロブリンの分離
」とは、夾雑物質共存下の溶液からの免疫グロブリンの分離に限らず、構造、性質、また
は活性等に基づく免疫グロブリン間の分離も含む。不溶性担体は、水溶液に対して不溶性
の担体であれば特に制限されない。不溶性担体としては、アガロース、アルギネート（ア
ルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプ
ン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２
－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や
、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした
担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一
例として、トヨパール（東ソー社製）等のヒドロキシ基を導入したポリメタクリレートゲ
ル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｃｙｔｉｖａ社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮ
Ｃ社製）等のセルロースゲルが挙げられる。不溶性担体の形状は特に制限されない。不溶
性担体は、例えば、カラムに充填できる形状であってよい。不溶性担体は、例えば、粒状
物または非粒状物であってよい。また、不溶性担体は、例えば、多孔性または非多孔性で
あってもよい。
本発明における分離または分析対象の免疫グロブリン（抗体）は、本発明のタンパク質
が結合性を有するものであれば、特に制限されない。免疫グロブリンは、具体的には、κ
軽鎖を有するものであってよい。免疫グロブリンは、κ軽鎖に加えて、Ｆｃ領域等の他の
領域を含んでいてもよく、いなくてもよい。免疫グロブリンは、例えば、シングルチェー
ンＦｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＡ、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴ
Ｅ）抗体等の、Ｆｃ領域を有しないものであってもよい。免疫グロブリンは、モノクロー
ナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。免疫グロブリンは、例え
ば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのいずれであってもよい。ＩｇＧは
、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれであってもよい。免
疫グロブリンの由来は、特に制限されない。免疫グロブリンは、単一の生物に由来するも
のであってもよく、２種またはそれ以上の生物の組み合わせに由来するものであってもよ
い。免疫グロブリンとしては、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらのバリアント
（例えばアミノ酸置換体）があげられる。また、免疫グロブリンとしては、二重特異性抗
体（バイスペシフィック抗体）、κ軽鎖と他のタンパク質との融合抗体、κ軽鎖と薬物と
の複合体（ＡＤＣ）等の人工的に構造改変した抗体もあげられる。なお、「免疫グロブリ
ン」には、抗体医薬も包含される。
本発明のタンパク質は、例えば、共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。具体
例として、不溶性担体が有する活性基を介して、本発明のタンパク質と不溶性担体とを共
有結合させることで、不溶性担体に前記タンパク質を固定化できる。すなわち、前記不溶
性担体は、その表面などに活性基を有していてよい。前記活性基の一例として、Ｎ－ヒド
ロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシ基、マレイ
ミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミドが挙げられる。活
性基を有する不溶性担体としては、例えば、活性基を有する市販の不溶性担体をそのまま
用いてもよいし、不溶性担体に活性基を導入して用いてもよい。活性基を有する市販の担
体としては、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ
ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
６Ｂ（いずれもＣｙｔｉｖａ社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｒｅｓｉ
ｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が例示できる。
担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキ
シ基、カルボキシ基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反
応させる方法が例示できる。
担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、
エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジ
ルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルを例示できる。
また、担体表面に存在するエポキシ基にカルボキシ基を導入する化合物としては、２－
メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪
酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示
できる。
また、担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基にマレ
イミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ
－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酢
酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、
６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェ
ニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、
３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（
α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ
－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シ
クロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（
マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ
－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシス
クシンイミドエステルを例示できる。
また、担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物
としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロ
リド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、
２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロ
モアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨード
アセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
また、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基や
アミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤で
ω－アルケニル部位をハロゲン化することで活性化する方法も例示できる。ω－アルケニ
ルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリ
シジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示できる。ハロゲン化剤として
は、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド
を例示できる。
また、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するカルボキシ基に
対して縮合剤と添加剤を用いて活性基を導入する方法も例示できる。縮合剤としては、１
－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘ
キシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。添加剤としては、Ｎ－
ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズト
リアゾールを例示できる。
本発明のタンパク質の不溶性担体への固定化は、例えば、緩衝液中で実施できる。緩衝
液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎ
ｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈ
ｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、
トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、活
性基の反応性や本発明のタンパク質の安定性等の諸条件に応じて適宜設定できる。固定化
させるときの反応温度は、例えば、５℃以上５０℃以下であってよく、好ましくは１０℃
以上３５℃以下である。
本発明の免疫グロブリン吸着剤は、例えば、前記吸着剤を充填したカラムの態様にする
ことで、免疫グロブリン（抗体）の分離に使用できる。例えば、本発明の免疫グロブリン
吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前
記吸着剤に吸着させ、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させることで、免疫グ
ロブリンを分離できる。すなわち、本明細書は、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填し
たカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着
させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶
液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法を開示する。免疫グロブリンを含む溶液は、例
えば、ポンプ等の送液手段を用いてカラムに添加できる。なお、免疫グロブリンを含む溶
液は、カラムに添加する前に予め適切な緩衝液を用いて溶媒置換してよい。また、免疫グ
ロブリンを含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化して
よい。カラムの平衡化により、例えば、免疫グロブリンをより高純度に分離できると期待
される。溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ
緩衝液が例示できる。そのような緩衝液には、例えば、さらに、１ｍＭ以上１０００ｍＭ
以下の塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。溶媒置換に用いる緩衝液と平衡化に
用いる緩衝液は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。また、免疫グロブリンを含
む溶液のカラムへの通液後に夾雑物質等の免疫グロブリン以外の成分がカラムに残存して
いる場合、免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出する前に、そのような
成分をカラムから除去してよい。免疫グロブリン以外の成分は、例えば、適切な緩衝液を
用いてカラムから除去できる。免疫グロブリン以外の成分の除去に用いる緩衝液について
は、例えば、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液についての記載を準用できる。免疫グロブ
リン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンとリガンド（本発明の
タンパク質）との相互作用を弱めることで溶出できる。免疫グロブリンとリガンド（本発
明のタンパク質）との相互作用を弱める手段としては、ｐＨ変化、カウンターペプチドの
添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。免疫グロブリンとリガンド（本発明のタンパ
ク質）との相互作用を弱める手段としては、特に、ｐＨ変化が例示できる。すなわち、前
記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程としては、特に、前記吸着剤に吸着
した免疫グロブリンをｐＨ変化で溶出させる工程が例示できる。ｐＨ変化としては、ｐＨ
の低下が例示できる。ｐＨの低下としては、緩衝液によるｐＨの低下が例示できる。免疫
グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、具体的には、例えば、適切な溶出液を用
いて溶出できる。溶出液としては、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液よりも酸性側の緩衝
液が挙げられる。前記酸性側の緩衝液としては、クエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、
酢酸緩衝液を例示できる。すなわち、前記酸性側の緩衝液を利用することで、ｐＨを低下
させることができる。溶出液のｐＨは、例えば、免疫グロブリンの機能（抗原への結合性
等）を損なわない範囲で設定できる。溶出液のｐＨは、例えば、２以上、２．１以上、２
．２以上、２．３以上、２．４以上、２．５以上、２．６以上、２．７以上、２．８以上
、２．９以上、３以上、３．１以上、または３．２以上であってもよく、４以下、３．５
以下、３．２以下、３．１以下、３以下、２．９以下、２．８以下、２．７以下、２．６
以下、または２．５以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい
。溶出液のｐＨは、具体的には、例えば、２以上４以下、２．２以上４以下、または２．
４以上４以下であってもよい。
なお、免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンの溶出を緩衝液によるｐＨの低
下で行なう場合、本発明の免疫グロブリン吸着剤の構成要素である本発明のタンパク質が
、少なくともＧｌｙ２１Ａｒｇ、Ｇｌｙ５１Ｖａｌ、ならびにＡｓｎ６２Ｈｉｓ、Ａｓｎ
６２ＡｒｇおよびＡｓｎ６２Ｔｒｐのいずれか、より選択される１以上のアミノ酸置換を
有していると、不溶性担体と当該不溶性担体に固定化した非改変型アミノ酸配列からなる
免疫グロブリン結合性タンパク質とを含む免疫グロブリン吸着剤よりも、溶出液のｐＨを
高くする（すなわち、よりｐＨの高い（中性に近い）条件で免疫グロブリンを溶出する）
ことができる。すなわち、免疫グロブリン吸着剤の構成要素である免疫グロブリン結合性
タンパク質として、少なくともＧｌｙ２１Ａｒｇ、Ｇｌｙ５１Ｖａｌ、ならびにＡｓｎ６
２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２ＡｒｇおよびＡｓｎ６２Ｔｒｐのいずれか、より選択される１以上
のアミノ酸置換を有した本発明のタンパク質を用いることで、非改変型アミノ酸配列から
なる免疫グロブリン結合性タンパク質を用いたときよりも、より温和なｐＨ条件（すなわ
ち中性に近い条件）で免疫グロブリンを溶出できる。この場合の溶出液のｐＨは、例えば
、上記例示した溶出液のｐＨの範囲であってよい。また、溶出液のｐＨは、例えば、２．
５以上、２．６以上、２．７以上、２．８以上、２．９以上、２．９５以上、３以上、３
．０５以上、３．１以上、３．１５以上、または３．２以上であってもよく、４以下、３
．５以下、３．３以下、３．２以下、３．１以下、または３以下であってもよく、それら
の矛盾しない組み合わせであってもよい。溶出液のｐＨは、具体的には、例えば、２．５
以上４以下、２．８以上４以下、２．９５以上４以下、３以上４以下、または３．０５以
上４以下であってもよい。
前述した方法で免疫グロブリン（抗体）を分離することで、分離された免疫グロブリン
が得られる。すなわち、免疫グロブリンの分離方法は、その一態様において、免疫グロブ
リンの製造方法であってよく、具体的には、分離された免疫グロブリンの製造方法であっ
てよい。免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンを含む溶出画分として得られる。す
なわち、溶出された免疫グロブリンを含む画分を分取できる。画分の分取は、例えば、常
法により行なえばよい。画分を分取する方法としては、一定の時間ごとや、一定の容量ご
とに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換
える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等で画分を分取する方法
が挙げられる。さらに、免疫グロブリンを含む画分から免疫グロブリンを回収することも
できる。免疫グロブリンを含む画分からの免疫グロブリンの回収は、例えば、タンパク質
の分離精製に用いられる公知の方法により行なえばよい。
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に限定され
るものではない。なお、参考例は本発明を構成しない。
実施例１ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ免疫グロブリン結合ドメインＣ３発現ベクターの作製
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＦｉｎｅｇｏｌｄｉａ属菌（Ｆｉｎｅ
ｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）由来のＰｒｏｔｅｉｎ Ｌ（以下、ＦｐＬ）の免疫グロブリ
ン結合ドメインＣ３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ６７５０３（配列番号２１０）の３
９４番目から４６３番目までのアミノ酸残基、以下「ＦｐＬ＿Ｃ３」とも表記）のアミノ
酸配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）を合成した。なお、合成する際、５
’末端側には制限酵素ＮｃｏＩの認識配列（５’－ＣＣＡＴＧＧ－３’）を、３’末端側
にはヒスチジン６残基をコードするヌクレオチド配列（５’－ＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴ
ＣＡＣＣＡＣ－３’；配列番号２３２）、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認
識配列（５’－ＡＡＧＣＴＴ－３’）を、それぞれ付加している。
（２）合成により得た配列番号２を含むポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩで処理後、アガロースゲル電気泳動により目的物のサイズのバンドを確認し
た。目的バンドを切り出したのち、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりポリヌクレオチドを精製した。
（３）（２）で得たポリヌクレオチドと、予め制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消
化したプラスミドｐＥＴ－２６ｂをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社
製）を用いてライゲーションを行なった。当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２
１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ－
Ｂｅｒｔａｎｉ）プレート培地で培養（３７℃、１６時間）した。
（４）（３）で取得した形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）を選択し、５０μｇ／ｍＬ
のカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅ
ｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）による精製で、ＦｐＬ＿Ｃ３を発現可能なベクター（ｐ
ＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３と命名）を取得した。
（５）（４）で取得した発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３のうち、ＦｐＬ＿Ｃ３をコ
ードするポリヌクレオチドおよびその周辺領域について、チェーンターミネータ法に基づ
くＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａ
ｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用
いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ
３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製
）にてヌクレオチド配列を解析した。なお、当該解析の際、配列番号３（５’－ＴＡＡＴ
ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）または配列番号４（５’－ＴＡＴＧＣＴＡＧ
ＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエン
ス用プライマーとして使用した。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３に、配列番号２に記載の配列から
なるポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。
実施例２ ＦｐＬ＿Ｃ３への変異導入およびライブラリ作製（その１）
実施例１で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３のうち、免疫グロブリン結合性
タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号２）にエラープローンＰＣＲに
よりランダムに変異を導入した。
（１）実施例１で作製したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３を鋳型ＤＮＡとして用い、エラープロ
ーンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは表１に示す組成の反応液を調製後、当該
反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間
の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイク
ル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲ
によりＦｐＬ＿Ｃ３をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）に良好に変異が導入さ
れ、その平均変異導入率は１．６％であった。
Figure 2023064059000001
（２）得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あ
らかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴ－２６ｂにラ
イゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質
転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時
間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリとした。
実施例３ ＦｐＬ＿Ｃ３アミノ酸置換体のスクリーニング（その１）
（１）実施例２で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）または実施例１で
作製したＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）を発現する形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイ
シンを含む２×ＹＴ液体培地（トリプトン １．６％（ｗ／ｖ）、酵母エキス １％（ｗ
／ｖ）、塩化ナトリウム ０．５％（ｗ／ｖ））２５０μＬに接種し、９６ディープウェ
ルプレートを用いて３７℃で終夜振とう培養した。
（２）培養後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシン、およ
び０．０１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙ
ｒａｎｏｓｉｄｅ）を含む２×ＹＴ液体培地５００μＬに（１）の培養液５μＬを植え継
ぎ、９６ディープウェルプレートを用いてさらに２０℃で終夜振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作によって得られた培養上清と１．０Ｍ ＮａＯＨとを等量混合
し、３８℃で１５分間アルカリ処理を行なった。
（４）アルカリ処理を行なった時の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を
下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、（３）のアルカリ処理を行なった時の免疫グロブリ
ン結合性タンパク質の抗体結合活性を、（３）のアルカリ処理を行わなかった時の免疫グ
ロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。
（４－１）Ｔｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を用いて１０μｇ／ｍ
Ｌに調製したヒト抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）を９６ウェル
マイクロプレートの各ウェルに分注し固定化した（４℃、１６時間）。固定化後、ＴＢＳ
を用いて２％（ｗ／ｖ）に調製したスキムミルク（ベクトン・ディッキンソン社製）を用
いてブロッキングした。
（４－２）洗浄緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ
２０（商品名）を含む０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５））で９６ウェルマイク
ロプレートの各ウェルを洗浄後、抗体結合活性を評価する免疫グロブリン結合性タンパク
質を含む溶液を添加し、免疫グロブリン結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを
反応させた（３０℃、１時間）。
（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ
－６－Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＥＴＨＹＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を１
００μＬ／ｗｅｌｌ添加し反応させた（３０℃、１時間）。
（４－４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕ
ｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。次に１Ｍリン酸を５０
μＬ／ｗｅｌｌ添加することで反応を停止し、マイクロプレートリーダー（テカン社製）
にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５）約１６００株の形質転換体を評価し、その中から天然型（アミノ酸置換がない）
ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性
タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
（６）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（７）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を、実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列
を解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
（８）（５）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を、そ
れぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２×ＹＴ液体培地に接種し、３７℃
で終夜、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（９）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２×ＹＴ液体培地に前培養
液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（１０）培養開始から２時間後、培養温度を２０℃に変更し、終濃度０．０１ｍＭとな
るようＩＰＴＧを添加し、２０℃で終夜、好気的に振とう培養した。
（１１）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を用いてタンパク質抽出液を調製
した。
（１２）（１１）で調製したタンパク質抽出液中の免疫グロブリン結合性タンパク質の
抗体結合活性を、（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（１３）各タンパク質の濃度が等しくなるよう、ＴＢＳを用いて希釈した。希釈液を二
等分し、一方には０．２Ｍ ＮａＯＨ（アルカリ処理）を、もう一方にはＴＢＳ（アルカ
リ未処理）を、それぞれ等量添加し混合後、２５℃で５時間静置した。
（１４）１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えた後、アルカリ処理（終濃度０
．１Ｍ ＮａＯＨで２５℃、５時間処理）およびアルカリ未処理のタンパク質溶液の抗体
結合活性を、（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。アルカリ処理した免疫グロ
ブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ未処理の免疫グロブリン結合性タン
パク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表２に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列において、少なくともＰｒｏ３Ｓ
ｅｒ（この表記は配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
されていることを表す、以下同様）、Ｇｌｕ５Ｖａｌ、Ｇｌｕ８Ｇｌｙ、Ｉｌｅ１７Ｐｈ
ｅ、Ｇｌｕ２７Ｇｌｙ、Ａｌａ４１Ｔｈｒ、Ａｓｎ４４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓ
ｎ５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ａｓｎ５０Ｌｙｓ、Ａｓｎ５０Ａｓｐ、Ｇｌｕ５２Ｖ
ａｌ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｈｒ５４Ｉｌｅ、Ａｓｎ６２ＴｙｒおよびＡｓｎ６５Ｔｙｒ
より選択される１以上のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然
型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
中でもＡｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ酸置換を有した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質（配列番号１１、ＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａと命名）は、顕著なアルカリ安
定性向上を確認した（天然型ＦｐＬ＿Ｃ３：４０％、ＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａ：９４％）。Ｇ
ｌｕ５２Ｇｌｙ単独のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号
１６）でのアルカリ安定性向上が顕著ではないことから（天然型ＦｐＬ＿Ｃ３：４０％、
配列番号１６：４８％）、顕著なアルカリ安定性の向上をもたらすアミノ酸置換はＡｓｎ
５０Ｔｙｒのほうであることが推測される。
Figure 2023064059000002
実施例４ ＦｐＬ免疫グロブリン結合ドメインＣ４発現ベクターの作製
（１）配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメイ
ンＣ４（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ６７５０３（配列番号２１０）の４６８番目から
５３７番目までのアミノ酸残基、以下「ＦｐＬ＿Ｃ４」とも表記）のアミノ酸配列をコー
ドするポリヌクレオチド（配列番号１９）を合成した。なお、合成する際、５’末端側に
は制限酵素ＮｃｏＩの認識配列（５’－ＣＣＡＴＧＧ－３’）を、３’末端側にヒスチジ
ン６残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号２３２）、終止コドンおよび制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－ＡＡＧＣＴＴ－３’）を、それぞれ付加している。
（２）実施例１（２）と同様の方法で、（１）で合成した配列番号１９を含むポリヌク
レオチドを精製した。
（３）実施例１（３）と同様な方法で、（２）で得たポリヌクレオチドと予め制限酵素
ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＥＴ－２６ｂとをライゲーション後、
当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、培養した。
（４）（３）で取得した形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）を選択後、実施例１（４）
と同様な方法で培養およびプラスミド精製を行ない、ＦｐＬ＿Ｃ４を発現可能なベクター
（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４と命名）を取得した。
（５）（４）で取得した発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４のうち、配列番号１９に記
載のＦｐＬ＿Ｃ４をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺領域について、実施例１
（５）と同様な方法で配列解析を行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４に、配列番号１９に記載の配列か
らなるポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。
実施例５ ＦｐＬ＿Ｃ４への変異導入およびライブラリ作製
実施例４で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４のうち、免疫グロブリン結合性
タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号１９）に、実施例２と同様の方
法でエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入し、ライブラリを作製した。変異
導入率は、３．５％であった。
実施例６ ＦｐＬ＿Ｃ４アミノ酸置換体のスクリーニング
（１）実施例５で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）または実施例４で
作製したＦｐＬ＿Ｃ４（配列番号１８）を発現する形質転換体を、実施例３（１）から（
２）と同様な方法で培養した。
（２）培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１．０Ｍ ＮａＯＨと等量混合し
４２℃で１５分間アルカリ処理を行なった。
（３）実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて残存活性を算出した。
（４）約６００株の形質転換体を評価し、その中から天然型（アミノ酸置換がない）Ｆ
ｐＬ＿Ｃ４（配列番号１８）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性
タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
（５）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（６）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を
解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
（７）（４）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を、実
施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）に記載の方法でタン
パク質抽出液を調製した。
（８）（７）で調製したタンパク質抽出液中の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体
結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（９）処理時間を１５時間にした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理
後、実施例３（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表３に示す。配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、少なくともＧｌｕ１
ＧｌｙおよびＡｓｎ５０Ａｓｐより選択される１以上のアミノ酸置換を有した免疫グロブ
リン結合性タンパク質は、天然型のＦｐＬ＿Ｃ４（配列番号１８）と比較しアルカリ安定
性が向上しているといえる。
Figure 2023064059000003
実施例７ ＦｐＬ＿Ｃ３アミノ酸置換集積体の作製（その１）
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３アミノ酸置換集積体の設計
実施例３で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に
関与するアミノ酸置換をＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）に対し集積することで、更なるアル
カリ安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）から（ｌ）に示す１２種類の免疫
グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＡｓｎ６２Ｔｙ
ｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２３、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ａと命名）
（ｂ）ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌ
ｙのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２７、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｂと命名）
（ｃ）ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ａｓｎ４４Ｓｅｒ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌ
ｙのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号３０、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｃと命名）
（ｄ）ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ａｓｎ４４Ａｓｐ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌ
ｙのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号３３、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｄと命名）
（ｅ）ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ａｓｎ６２Ｔｙｒの
アミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号３６、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｅと命名）
（ｆ）ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ａｓｎ４４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、
Ａｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号３８、ＦｐＬ＿Ｃ３
４ａと命名）
（ｇ）ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ａｓｎ４４Ａｓｐ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、
Ａｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号４０、ＦｐＬ＿Ｃ３
４ｂと命名）
（ｈ）ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙお
よびＡｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号４２、ＦｐＬ＿Ｃ
３ ４ｃと命名）
（ｉ）ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ａｓｎ４４Ｓｅｒ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙお
よびＡｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号４４、ＦｐＬ＿Ｃ
３ ４ｄと命名）
（ｊ）ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ａｓｎ４４Ａｓｐ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒお
よびＡｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号４６、ＦｐＬ４ｅ
と命名）
（ｋ）ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ａｓｎ４４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、
Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＡｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番
号４８、ＦｐＬ＿Ｃ３ ５ａと命名）
（ｌ）ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ａｓｎ４４Ａｓｐ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、
Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＡｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番
号５０、ＦｐＬ＿Ｃ３ ５ｂと命名）
（２）ＦｐＬ＿Ｃ３アミノ酸置換集積体の作製
以下、前記（ａ）から（ｌ）に示す１２種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作製
方法について説明する。
（ａ）ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ａ
本タンパク質は、実施例３で判明したアルカリ安定性が向上するアミノ酸置換の中から
Ａｓｎ６２Ｔｙｒを選択し、当該アミノ酸置換をＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａ（配列番号１１）に
導入することで作製した。
（ａ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ａ（配列番号
２３）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバースＰ
ＣＲは、ＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａをコードするポリヌクレオチド（配列番号２４）を含む発現
ベクター（以下、「ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａ」とも表記する）を鋳型ＤＮＡとし、配
列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉ
ｍｅｒとし、配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲ Ｒｅｖｅ
ｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして、表４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で
２分間熱処理し、９５℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７
２℃で６分の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃
で７分間熱処理することで行なった。
Figure 2023064059000004
（ａ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該処理
産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ－３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培
養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用
いて発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ａと命名）を抽出した。
（ａ－４）ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）
と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ａにＦｐＬ＿Ｃ３ ３ａ（配
列番号２３）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。
（ｂ）ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｂ
本タンパク質は、実施例３で判明したアルカリ安定性が向上するアミノ酸置換の中から
Ｇｌｕ４９Ｖａｌを選択し、当該アミノ酸置換をＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａ（配列番号１１）に
導入することで作製した。
（ｂ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｂ（配列番号
２７）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバースＰ
ＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａを、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐ
ｒｉｍｅｒとして配列番号２８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒ
ｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチ
ドを、それぞれ用いた他は（ａ－１）と同様な方法で行なった。
（ｂ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該処理
産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ－３）得られた形質転換体を（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベクター（
ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｂと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターのヌクレオチド
配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｂにＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｂ（配
列番号２７）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。
（ｃ）ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｃ
本タンパク質は、実施例３で判明したアルカリ安定性が向上するアミノ酸置換の中から
Ａｓｎ４４Ｓｅｒを選択し、当該アミノ酸置換をＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａ（配列番号１１）に
導入することで作製した。
（ｃ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｃ（配列番号
３０）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバースＰ
ＣＲは、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号３１に記載の配列からな
るオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号３２に
記載のオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は（ａ－１）と同様な方法で行なった。
（ｃ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該処理
産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ－３）得られた形質転換体を（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベクター（
ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｃと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターのヌクレオチド
配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｃにＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｃ（配
列番号３０）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。
（ｄ）ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｄ
本タンパク質は、実施例３で判明したアルカリ安定性が向上するアミノ酸置換の中から
Ａｓｎ４４Ａｓｐを選択し、当該アミノ酸置換をＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａ（配列番号１１）に
導入することで作製した。
（ｄ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｄ（配列番号
３３）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバースＰ
ＣＲは、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号３４に記載の配列からな
るオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号３５に
記載のオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は（ａ－１）と同様な方法で行なった。
（ｄ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該処理
産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｄ－３）得られた形質転換体を（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベクター（
ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｄと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターのヌクレオチド
配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｄにＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｄ（配
列番号３３）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。
（ｅ）ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｅ
（ｅ－１）ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｅ（配列番号３６）をコードするポリヌクレオチド（配列
番号３７）を合成した。なお、合成する際、５’末端側には制限酵素ＮｃｏＩの認識配列
（５’－ＣＣＡＴＧＧ－３’）を、３’末端側にはヒスチジン６残基をコードするヌクレ
オチド配列（５’－ＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣ－３’；配列番号２３２）、
終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－ＡＡＧＣＴＴ－３’）を、
それぞれ付加している。
（ｅ－２）実施例１（２）と同様の方法で、（ｅ－１）で合成したポリヌクレオチドを
精製した。
（ｅ－３）実施例１（３）と同様な方法で、（ｅ－２）で得たポリヌクレオチドと予め
制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＥＴ－２６ｂとをライゲーシ
ョン後、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、培
養した。
（ｅ－４）得られた形質転換体を、実施例１（４）と同様な方法で培養およびプラスミ
ド精製を行ない、発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｅと命名）を取得後、当該発
現ベクターのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｅにＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｅ（配
列番号３６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３７）が挿入されていることを確
認した。
（ｆ）ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ａ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
４ａ（配列番号３８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３９）を用いた他は、
（ｅ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ａと命
名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ａのヌクレオチド配列解析の結
果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ａにＦｐＬ＿Ｃ３ ４ａ（配列番号３８）をコードするポ
リヌクレオチド（配列番号３９）が挿入されていることを確認した。
（ｇ）ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｂ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
４ｂ（配列番号４０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４１）を用いた他は、
（ｅ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｂと命
名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｂのヌクレオチド配列解析の結
果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｂにＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｂ（配列番号４０）をコードするポ
リヌクレオチド（配列番号４１）が挿入されていることを確認した。
（ｈ）ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｃ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
４ｃ（配列番号４２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４３）を用いた他は、
（ｅ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｃと命
名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｃのヌクレオチド配列解析の結
果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｃにＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｃ（配列番号４２）をコードするポ
リヌクレオチド（配列番号４３）が挿入されていることを確認した。
（ｉ）ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｄ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
４ｄ（配列番号４４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４５）を用いた他は、
（ｅ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｄと命
名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｄのヌクレオチド配列解析の結
果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｄにＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｄ（配列番号４４）をコードするポ
リヌクレオチド（配列番号４５）が挿入されていることを確認した。
（ｊ）ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｅ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
４ｅ（配列番号４６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４７）を用いた他は、
（ｅ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｅと命
名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｅのヌクレオチド配列解析の結
果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｅにＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｅ（配列番号４６）をコードするポ
リヌクレオチド（配列番号４７）が挿入されていることを確認した。
（ｋ）ＦｐＬ＿Ｃ３ ５ａ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
５ａ（配列番号４８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４９）を用いた他は、
（ｅ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ５ａと命
名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ５ａのヌクレオチド配列解析の結
果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ５ａにＦｐＬ＿Ｃ３ ５ａ（配列番号４８）をコードするポ
リヌクレオチド（配列番号４９）が挿入されていることを確認した。
（ｌ）ＦｐＬ＿Ｃ３ ５ｂ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
５ｂ（配列番号５０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５１）を用いた他は、
（ｅ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ５ｂと命
名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ５ｂのヌクレオチド配列解析の結
果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ ５ｂにＦｐＬ＿Ｃ３ ５ｂ（配列番号５０）をコードするポ
リヌクレオチド（配列番号５１）が挿入されていることを確認した。
実施例８ ＦｐＬ＿Ｃ３アミノ酸置換集積体のアルカリ安定性評価
（１）実施例１で作製した天然型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）、実施例３で取得した変
異型（アミノ酸置換した）免疫グロブリン結合性タンパク質ＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａ（配列番
号１１）、ならびに実施例７で作製した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質ＦｐＬ＿
Ｃ３ ３ａ（配列番号２３）、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｂ（配列番号２７）、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３
ｃ（配列番号３０）、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｄ（配列番号３３）、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｅ（配列
番号３６）、ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ａ（配列番号３８）、ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｂ（配列番号４０
）、ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｃ（配列番号４２）、ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｄ（配列番号４４）、Ｆｐ
Ｌ＿Ｃ３ ４ｅ（配列番号４６）、ＦｐＬ＿Ｃ３ ５ａ（配列番号４８）およびＦｐＬ＿
Ｃ３ ５ｂ（配列番号５０）のいずれかを発現する形質転換体を、実施例３（８）から（
１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）に記載の方法でタンパク質抽出液を調製
した。
（２）（１）で調製したタンパク質抽出液中の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体
結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（３）処理に用いたＮａＯＨの濃度を０．４Ｍ（終濃度０．２Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表５に示す。本実施例で評価した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質はいず
れも、天然型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）と比較し、残存活性が高くなっており、これら
変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上していることが確認され
た。また、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ａ（配列番号２３）、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｂ（配列番号２７）
、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｃ（配列番号３０）、ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ｄ（配列番号３３）およびＦ
ｐＬ＿Ｃ３ ３ｅ（配列番号３６）の結果を比較したところ、Ａｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ
酸置換を有した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ ３ａおよびＦｐ
Ｌ＿Ｃ３ ３ｅ）で特にアルカリ安定性が向上していたことから、Ａｓｎ６２Ｔｙｒのア
ミノ酸置換が免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性の向上に大きく寄与する
ことがわかる。
Figure 2023064059000005
実施例９ ＦｐＬ＿Ｃ３への変異導入およびライブラリ作製（その２）
実施例３の結果を踏まえ、変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のうち、特定位置の
アミノ酸残基が複数の選択肢を持つように混合塩基を含んだオリゴヌクレオチドを設計し
、それらを連結することで変異体ライブラリを作製した。以下詳細を具体的に述べる。
（１）配列番号２に記載の配列からなる天然型ＦｐＬ＿Ｃ３をコードするポリヌクレオ
チドを５分割し、４４番目のアミノ酸残基、４９番目のアミノ酸残基、５０番目のアミノ
酸残基、５２番目のアミノ酸残基および６２番目のアミノ酸残基が複数の選択肢を持つよ
う、オリゴヌクレオチドを設計した（配列番号５２から６１）。なお、設計したオリゴヌ
クレオチドの内容は以下の通りである。
［配列番号５２］
１番目から２４番目まで：ｐＥＴ２６ｂとの連結部
２８番目から８０番目まで：配列番号２の１番目から５３番目までに相当する領域
５７番目から８０番目まで：配列番号５４との連結部
［配列番号５３］配列番号５２の相補配列
［配列番号５４］
１番目から７５番目まで：配列番号２の３０番目から１０４番目までに相当する領域
１番目から２４番目まで：配列番号５２との連結部
５１番目から７５番目まで：配列番号５６との連結部
［配列番号５５］配列番号５４の相補配列
［配列番号５６］
１番目から７５番目まで：配列番号２の８０番目から１５６番目までに相当する領域
１番目から２５番目まで：配列番号５４との連結部
５１番目から７７番目まで：配列番号５８との連結部
［配列番号５７］配列番号５６の相補配列
［配列番号５８］
１番目から７６番目まで：配列番号２の１３０番目から２０５番目までに相当する領域
１番目から２７番目まで：配列番号５６との連結部
４７番目から７６番目まで：配列番号６０との連結部
［配列番号５９］配列番号５８の相補配列
［配列番号６０］
１番目から３５番目まで：配列番号２の１７６番目から２１０番目までに相当する領域
１番目から３０番目まで：配列番号５８との連結部
３６番目から５３番目まで：ヒスチジン６残基をコードする領域
５４番目から５６番目まで：終止コドンをコードする領域
５７番目から８０番目まで：ｐＥＴ２６ｂとの連結部
［配列番号６１］配列番号６０の相補配列
なお、配列番号５６の５１番目から５３番目は配列番号１の４４番目に相当するアミノ
酸がＡｓｎ（アスパラギン）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｓｅｒ（セリン）またはＧｌ
ｙ（グリシン）になるように、６６番目から６８番目は配列番号１の４９番目に相当する
アミノ酸がＧｌｕ（グルタミン酸）またはＶａｌ（バリン）になるように、６９番目から
７１番目は配列番号１の５０番目に相当するアミノ酸がＡｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＣ
ｙｓ（システイン）になるように、７５番目から７７番目は配列番号１の５２番目に相当
するアミノ酸がＧｌｙまたはＶａｌになるように、それぞれ混合塩基を導入している。
また、配列番号５８の５５番目から５７番目は配列番号１の６２番目に相当するアミノ
酸がＡｓｎまたはＴｙｒ（チロシン）になるように混合塩基を導入している。
（２）合成したポリヌクレオチド（配列番号５２から６１）を０．０５ｐｍｏｌに希釈
後、予め制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴ－２６ｂにＮ
ＥＢＢｕｉｌｄｅｒ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用いて連結した。
（３）反応終了後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μ
ｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時間）後、プレー
ト上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリとした。
実施例１０ ＦｐＬ＿Ｃ３アミノ酸置換体のスクリーニング（その２）
（１）実施例３で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａおよび実施例９で作製した変異体ライブ
ラリ（形質転換体）を、実施例３（１）から（２）と同様な方法で培養した。
（２）培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１．０Ｍ ＮａＯＨと等量混合し
４３℃で１５分間アルカリ処理を行なった。
（３）実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて残存活性を算出した。
（４）約５４０株の形質転換体を評価し、その中からＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａ（配列番号１
１）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形
質転換体を選択した。
（５）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（６）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を
解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
（７）（４）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体、実施
例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）を発現する形質転換体および実施例３で取得
したＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａ（配列番号１１）を発現する形質転換体のいずれかを、実施例３
（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法でタンパク質
抽出液を調製した。
（８）（７）で調製したタンパク質抽出液中の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体
結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（９）処理時間を１５時間にした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理
後、実施例３（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
（４）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１
）に対するアミノ酸置換位置、アルカリ処理したときの残存活性［％］およびアルカリ未
処理のタンパク質溶液の抗体結合活性（吸光度）をまとめた結果を表６に示す。本スクリ
ーニングでは、
ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ａｓｎ４４Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＶａｌおよびＡ
ｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｆと命名、配列
番号６２）、
ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ａｓｎ４４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ
５２ＶａｌおよびＡｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３
５ｃと命名、配列番号６３）、
ＦｐＬ＿Ｃ３に対し、Ａｓｎ４４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｓｅｒ、Ｇｌｕ
５２ＶａｌおよびＡｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３
５ｄと命名、配列番号６４）、
の３つの変異型免疫グロブリン結合性タンパク質を取得した。
上記３つの変異型免疫グロブリン結合性タンパク質は、いずれもＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａに
対しアルカリ安定性が向上していた。このことから配列番号１に記載のアミノ酸配列にお
いて、少なくともＡｓｎ４４Ａｓｐ、Ａｓｎ４４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ５０
Ｓｅｒ、Ｇｌｕ５２ＶａｌおよびＡｓｎ６２Ｔｙｒより選択される１以上のアミノ酸置換
を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、アルカリ安定性が向上しているといえる。
ただし、Ａｓｎ５０Ｓｅｒのアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質（Ｆ
ｐＬ＿Ｃ３ ５ｄ）は、Ａｓｎ５０Ｔｙｒのアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性
タンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ ２ａ、ＦｐＬ＿Ｃ３ ４ｆおよびＦｐＬ＿Ｃ３ ５ｃ）と比
較し、アルカリ未処理のタンパク質溶液の抗体結合活性が大きく低下していた。
Figure 2023064059000006
実施例１１ ＦｐＬ＿Ｃ３への変異導入およびライブラリ作製（その３）
（１）実施例１で作製したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３を鋳型として、２１番目、２２番目、
３１番目、４９番目、５１番目および６２番目のアミノ酸残基に対する飽和置換体ライブ
ラリを作製した。プライマーは、２２ｃ－Ｔｒｉｃｋ法（Ｓａｂｒｉｎａ Ｋｉｌｌｅ
ｅｔ．ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，２，８３－９
２）に倣い、変異導入箇所に適切な混合塩基を配置し、変異導入箇所を中心としたインバ
ースＰＣＲができるように設計した（配列番号６５から１００）。これらのプライマーを
一箇所の置換につき６本一組として、表７および表８の組成で混合し、ＰＣＲ Ｐｒｉｍ
ｅｒ混合液（Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ）を調製した。
Figure 2023064059000007
Figure 2023064059000008
（２）実施例１で作製したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３を鋳型ＤＮＡとしてインバースＰＣＲ
による部位特異的変異導入を行なった。インバースＰＣＲは表９に示す組成の反応液を調
製後、当該反応液を９８℃で２分間熱処理し、９５℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃
で５秒間の第２ステップ、７２℃で６分の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サ
イクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
Figure 2023064059000009
（３）得られたＰＣＲ産物を精製後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形
質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６
時間）した後、プレート上に形成したコロニーを部位特異的変異体ライブラリとした。
実施例１２ ＦｐＬ＿Ｃ３アミノ酸置換体のスクリーニング（その３）
（１）実施例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ３を発現可能な形質転換体、および実施例１１で
作製した部位特異的アミノ酸置換体ライブラリ（形質転換体）を、実施例３（１）から（
２）と同様な方法で培養した。
（２）培養後、遠心操作によって得られた培養上清に対し、実施例３（３）と同様な方
法でアルカリ処理を行ない、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて残存活性を算
出した。
（３）約５００株の形質転換体を評価し、その中から天然型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１
）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質
転換体を選択した。
（４）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を
解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
（６）（３）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体または
実施例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）を発現する形質転換体を、実施例３（８
）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法でタンパク質抽出
液を調製した。
（７）（６）で調製したタンパク質抽出液中の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体
結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（８）実施例３（１３）に記載の方法でアルカリ処理後、実施例３（１４）と同様な方
法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
（３）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１
）に対するアミノ酸置換位置およびアルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結
果を表１０に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列において、少なくともＧｌｙ２１Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２２Ｔｈｒ、Ｔｈｒ３１Ｌｅｕ、Ｇｌｕ４９Ｔｈｒ、Ｇｌｕ４９Ｉｌｅ、Ｇ
ｌｙ５１Ｖａｌ、Ａｓｎ６２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２Ａｒｇ、Ａｓｎ６２Ｌｅｕ、Ａｓｎ６２
Ｍｅｔ、Ａｓｎ６２ＴｙｒおよびＡｓｎ６２Ｔｒｐより選択される１以上のアミノ酸置換
を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然型のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）と比
較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
表１０より、配列番号１の６２番目のアスパラギン（Ａｓｎ６２）を、ヒスチジン（Ｈ
ｉｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、チロシン
（Ｔｙｒ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）といった、比較的嵩高いアミノ酸に置換する
ことでアルカリ安定性が向上することがわかる。中でも、Ａｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置
換（配列番号５）が最もアルカリ安定性が向上（天然型ＦｐＬ＿Ｃ３：４６％、Ａｓｎ６
２Ｔｙｒ：６６％）していることがわかる。Ａｓｎ６２以外の箇所については、Ｇｌｙ２
１Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９ＴｈｒおよびＧｌｙ５１Ｖａｌのアミノ酸置換でアルカリ安定性が
特に向上していた。
Figure 2023064059000010
参考例１
（１）免疫グロブリン結合性タンパク質（リジン置換体）の設計
ＷＯ２０１７／０６９１５８号は、ＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインが有するリジ
ン残基を、リジン以外の他の塩基性アミノ酸またはヒドロキシ基を有するアミノ酸に置換
することでアルカリ安定性が向上した、免疫グロブリン結合性タンパク質を開示している
。そこで、前記文献による効果を確認すべく、ＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインが有
するリジン残基をリジン以外の他の塩基性アミノ酸であるアルギニン残基に置換した、免
疫グロブリン結合性タンパク質を作製した。具体的には、以下の（α）から（δ）に示す
４種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計した。
（α）ＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ６７５
０３の２４９番目から３１７番目までのアミノ酸残基、配列番号１１２、以下「ＦｐＬ＿
Ｃ１」とも表記）が有する全てのリジン残基（具体的には配列番号１１２の１２番目、２
８番目、３３番目、４６番目、４７番目、５９番目および６６番目のリジン残基）をアル
ギニン残基に置換した免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１１４、以下「ＦｐＬ
＿Ｃ１ＫＲ」とも表記）。
（β）ＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ６７５
０３の３２０番目から３８９番目までのアミノ酸残基、配列番号１１３、以下「ＦｐＬ＿
Ｃ２」とも表記）が有する全てのリジン残基（具体的には配列番号１１３の２番目、７番
目、１３番目、２２番目、２９番目、３８番目、４８番目および６７番目のリジン残基）
をアルギニン残基に置換した免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１１５、以下「
ＦｐＬ＿Ｃ２ＫＲ」とも表記）。
（γ）ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）の全てのリジン残基（具体的には配列番号１の７番目
、１３番目、２２番目、２９番目、３８番目、４８番目および６７番目のリジン残基）を
アルギニン残基に置換した免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１１６、以下「Ｆ
ｐＬ＿Ｃ３ＫＲ」とも表記）
（δ）ＦｐＬ＿Ｃ４（配列番号１８）の全てのリジン残基（具体的には配列番号１８の７
番目、１３番目、２２番目、２９番目、４８番目および６７番目のリジン残基）をアルギ
ニン残基に置換した免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１１７、以下「ＦｐＬ＿
Ｃ４ＫＲ」とも表記）
（２）免疫グロブリン結合性タンパク質（リジン置換体）の作製
（α）ＦｐＬ＿Ｃ１ＫＲ
（α－１）ＦｐＬ＿Ｃ１ＫＲ（配列番号１１４）をコードするポリヌクレオチド（配列
番号１２０）を合成した。なお、合成する際、５’末端側には制限酵素ＮｃｏＩの認識配
列（５’－ＣＣＡＴＧＧ－３’）を、３’末端側にはヒスチジン６残基をコードするヌク
レオチド配列（５’－ＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣ－３’；配列番号２３２）
、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－ＴＡＡＧＣＴＴ－３’）
を、それぞれ付加している。
（α－２）実施例１（２）と同様の方法で、（α－１）で合成したポリヌクレオチドを
精製した。
（α－３）実施例１（３）と同様な方法で、（α－２）で得たポリヌクレオチドと予め
制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＥＴ－２６ｂとをライゲーシ
ョン後、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、培
養した。
（α－４）得られた形質転換体を、実施例１（４）と同様な方法で培養およびプラスミ
ド精製を行ない、発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ１ＫＲと命名）を取得後、当該発現
ベクターのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列解
析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ１ＫＲに、ＦｐＬ＿Ｃ１ＫＲ（配列番号１１
４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２０）が挿入されていることを確認した
。
（β）ＦｐＬ＿Ｃ２ＫＲ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ２
ＫＲ（配列番号１１５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２１）を用いた他は
、（α）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ２ＫＲと命
名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ２ＫＲのヌクレオチド配列解析の結果
、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ２ＫＲにＦｐＬ＿Ｃ２ＫＲ（配列番号１１５）をコードするポリヌ
クレオチド（配列番号１２１）が挿入されていることを確認した。
（γ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＲ（配列番号１１６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２２）を用いた他は
、（α）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲと命
名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲのヌクレオチド配列解析の結果
、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ（配列番号１１６）をコードするポリヌ
クレオチド（配列番号１２２）が挿入されていることを確認した。
（δ）ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ４
ＫＲ（配列番号１１７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２３）を用いた他は
、（α）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲと命
名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲのヌクレオチド配列解析の結果
、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲにＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号１１７）をコードするポリヌ
クレオチド（配列番号１２３）が挿入されていることを確認した。
（３）免疫グロブリン結合性タンパク質（天然型）の作製
（ε）ＦｐＬ＿Ｃ１
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ１
（配列番号１１２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１８）を用いた他は、（
α）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ１と命名）を取
得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ１のヌクレオチド配列解析の結果、ｐＥＴ－Ｆ
ｐＬ＿Ｃ１にＦｐＬ＿Ｃ１（配列番号１１２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号
１１８）が挿入されていることを確認した。
（ζ）ＦｐＬ＿Ｃ２
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ２
（配列番号１１３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１９）を用いた他は、（
α）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ２と命名）を取
得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ２のヌクレオチド配列解析の結果、ｐＥＴ－Ｆ
ｐＬ＿Ｃ１にＦｐＬ＿Ｃ１（配列番号１１３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号
１１９）が挿入されていることを確認した。
参考例２
（１）実施例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）、実施例４で作製したＦｐＬ＿
Ｃ４（配列番号１８）、ならびに参考例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ１（配列番号１１２）、
ＦｐＬ＿Ｃ２（配列番号１１３）、ＦｐＬ＿Ｃ１ＫＲ（配列番号１１４）、ＦｐＬ＿Ｃ２
ＫＲ（配列番号１１５）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ（配列番号１１６）およびＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ
（配列番号１１７）のいずれかを発現する形質転換体を、実施例３（８）から（１０）と
同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法でタンパク質抽出液を調製した。前
記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し、清澄化した。
（２）あらかじめ０．５ＭのＮａＣｌと０．０２Ｍイミダゾールとを含む０．０５Ｍト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、洗浄緩衝液と表記）で平衡化したＮｉ－ＮＴＡ Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ社製）を充填したカラムに、（
１）で清澄化した上清を添加し、前記カラムに充填した担体の１０倍量の洗浄緩衝液で洗
浄後、０．５ＭのＮａＣｌと０．５Ｍイミダゾールとを含む０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）を通液することで、免疫グロブリン結合性タンパク質に相当する画分を回収し
た。
（３）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電
気泳動）も実施し、前記タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（４）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理温度を４２
℃に、処理時間を１５分に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカ
リ処理後、実施例３（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価し
た。
結果を表１１に示す。ＦｐＬ＿Ｃ２（配列番号１１３）、ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）
およびＦｐＬ＿Ｃ４（配列番号１８）はリジン残基の全てをアルギニン残基に置換（Ｆｐ
Ｌ＿Ｃ２ＫＲ（配列番号１１５）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ（配列番号１１６）およびＦｐＬ＿
Ｃ４ＫＲ（配列番号１１７））することで、アルカリ安定性が向上した。
Figure 2023064059000011
実施例１３ ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲへの変異導入およびライブラリ作製
（１）参考例１（δ）で取得した、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲを鋳型として、７番目お
よび２９番目のアミノ酸残基に対する飽和置換体ライブラリを作製した。プライマーは、
実施例１１（１）と同様、２２ｃ－Ｔｒｉｃｋ法に倣い、変異導入箇所に適切な混合塩基
を配置し、変異導入箇所を中心としたインバースＰＣＲができるように設計した（配列番
号１２４から１３５）。これらのプライマーを一箇所の置換につき６本一組として、表７
および表１２の組成で混合し、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ混合液（Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅ
ｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ）を調製した。
Figure 2023064059000012
（２）ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲを鋳型ＤＮＡとした他は、実施例１１（２）と同様な
方法でインバースＰＣＲによる部位特異的変異導入を行なった。
（３）得られたＰＣＲ産物を精製後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形
質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６
時間）した後、プレート上に形成したコロニーを部位特異的変異体ライブラリとした。
実施例１４ ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲアミノ酸置換体のスクリーニング
（１）参考例１（δ）で作製したＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号１１７）を発現する形質
転換体および実施例１３で作製した部位特異的アミノ酸置換体ライブラリ（形質転換体）
を実施例３（１）から（２）と同様な方法で培養した。
（２）培養後、遠心操作によって得られた培養上清に対し、実施例３（３）と同様な方
法でアルカリ処理を行ない、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて残存活性を算
出した。
（３）約２００株の形質転換体を評価し、その中からＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号１１
７）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形
質転換体を選択した。
（４）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を
解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
（６）（３）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体または
参考例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号１１７）を発現する形質転換体を、実施
例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法でタンパ
ク質抽出液を調製した。
（７）（６）で調製したタンパク質抽出液中の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体
結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（８）実施例３（１３）に記載の方法でアルカリ処理後、実施例３（１４）と同様な方
法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
（３）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１
１７）に対するアミノ酸置換位置およびアルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめ
た結果を表１３に示す。配列番号１１７に記載のアミノ酸配列において、少なくともＬｙ
ｓ（Ａｒｇ）７Ａｌａ（この表記は配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基
（配列番号１８では７番目のリジン）が一旦アルギニンに置換後、さらにアラニンに置換
されていることを表す、以下同様）および／またはＬｙｓ（Ａｒｇ）２９Ｐｒｏのアミノ
酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号１１７
）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure 2023064059000013
実施例１５ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲアミノ酸置換集積体の作製
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲアミノ酸置換集積体の設計
実施例８および実施例１２で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアル
カリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ（配列番号１１６）に対し集
積することで、更なる安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ｍ）から（ｐ）に示
す４種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ｍ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲに対し、Ｇｌｙ２１Ａｒｇのアミノ酸置換を導入したタンパク質
（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ａと命名）
（ｎ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲに対し、Ｇｌｙ５１Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質
（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｂと命名）
（ｏ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲに対し、Ａｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質
（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｃと命名）
（ｐ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲに対し、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＡｓｎ６２
Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ ３ａと命名）
（２）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲアミノ酸置換集積体の作製
以下、前記（ｍ）から（ｐ）に示す４種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作製方
法について説明する。
（ｍ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ａ
本タンパク質は、実施例１２で判明したアルカリ安定性が向上するアミノ酸置換の中か
らＧｌｙ２１Ａｒｇを選択し、当該アミノ酸残基をＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ（配列番号１１６）
に導入することで作製した。
（ｍ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ａ（配列
番号１３８）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバ
ースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲを、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ
Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、ＰＣ
Ｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１４７に記載の配列からなるオリゴヌ
クレオチドを、それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法で行なった。
（ｍ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制限
酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｍ－３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ａと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターの
ヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ａにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ
１ａ（配列番号１３８）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
（ｎ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｂ
本タンパク質は、実施例１２で判明したアルカリ安定性が向上するアミノ酸置換の中か
らＧｌｙ５１Ｖａｌを選択し、当該アミノ酸残基をＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ（配列番号１１６）
に導入することで作製した。
（ｎ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｂ（配列
番号１３９）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバ
ースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲを含んだポリヌクレオチドを
、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１４８に記載の配列からなるオ
リゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１４９に記
載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様
な方法で行なった。
（ｎ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制限
酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｎ－３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｂと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターの
ヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｂにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ
１ｂ（配列番号１３９）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
（ｏ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｃ
（ｏ－１）ｐＥＴ２６ｂおよびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｃ（配列番号１４０）をコードす
るポリヌクレオチド（配列番号１５０）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ
１ｃのヌクレオチド配列を設計し、以下の３領域に分割した。
第一領域：ｐＥＴ２６ｂのヌクレオチド配列、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｃの１番目から２０
番目までのアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号１５０の１番目から６
０番目までのヌクレオチド配列）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｃの５３番目から７０番目まで
のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号１５０の１５７番目から２１０
番目までのヌクレオチド配列）、ヒスチジン６残基をコードするヌクレオチド配列（配列
番号２３２）、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－ＴＡＡＧＣ
ＴＴ－３’）
第二領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｃの１６番目から３７番目までのアミノ酸残基をコード
するヌクレオチド配列（配列番号１５３［ｆｏｒｗａｒｄ］および１５４［ｒｅｖｅｒｓ
ｅ］に記載の配列からなるポリヌクレオチド）
第三領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ１ｃの３３番目から５７番目までのアミノ酸残基をコードす
るヌクレオチド配列（配列番号１５５［ｆｏｒｗａｒｄ］および１５６［ｒｅｖｅｒｓｅ
］に記載の配列からなるポリヌクレオチド）
（ｏ－２）インバースＰＣＲにより、前記第一領域のポリヌクレオチドを調製した。イ
ンバースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲを、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａ
ｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１５１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、
ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１５２に記載の配列からなるオリ
ゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法で行なった。イ
ンバースＰＣＲ後、前記第一領域を含むポリヌクレオチドを精製した。
（ｏ－３）（ｏ－２）で調製した前記第一領域のポリヌクレオチド、ならびに（ｏ－１
）で設計した前記第二領域および前記第三領域のポリヌクレオチド（直接化学合成で作製
）を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用いて連結した
。なお、前記三領域（ポリヌクレオチドとしては５種類）のポリヌクレオチドはそれぞれ
、反応液中に０．０５ｐｍｏｌ添加した。
（ｏ－４）連結したポリヌクレオチドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換
した。
（ｏ－５）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クターの抽出を行ない、当該発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と
同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｃにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ
１ｃ（配列番号１４０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５０）が挿入されて
いることを確認した。
（ｐ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ ３ａ
（ｐ－１）ｐＥＴ２６ｂおよびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ ３ａ（配列番号１４１）をコードす
るポリヌクレオチド（配列番号１５７）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ
３ａのヌクレオチド配列を設計し、以下の３領域に分割した。
第一領域：ｐＥＴ２６ｂのヌクレオチド配列、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ ３ａの１番目から２０
番目までのアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号１４１の１番目から６
０番目までのヌクレオチド配列）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ ３ａの５３番目から７０番目まで
のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号１４１の１５７番目から２１０
番目までのヌクレオチド配列）、ヒスチジン６残基をコードするヌクレオチド配列（配列
番号２３２）、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－ＴＡＡＧＣ
ＴＴ－３’）
第二領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ ３ａの１６番目から３７番目までのアミノ酸残基をコード
するヌクレオチド配列（配列番号１５３［ｆｏｒｗａｒｄ］および１５４［ｒｅｖｅｒｓ
ｅ］に記載の配列からなるポリヌクレオチド）
第三領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ ３ａの３３番目から５７番目までのアミノ酸残基をコード
するヌクレオチド配列（配列番号１５８［ｆｏｒｗａｒｄ］および１５９［ｒｅｖｅｒｓ
ｅ］に記載の配列からなるポリヌクレオチド）
（ｐ－２）（ｏ－２）に記載のインバースＰＣＲにより前記第一領域のポリヌクレオチ
ドを調製し、精製した。
（ｐ－３）（ｐ－２）で調製した前記第一領域のポリヌクレオチド、ならびに（ｐ－１
）で設計した前記第二領域および前記第三領域のポリヌクレオチド（直接化学合成で作製
）を（ｏ－３）と同様な方法で連結した。
（ｐ－４）連結したポリヌクレオチドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換
した。
（ｐ－５）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クターの抽出を行ない、当該発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と
同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ ３ａにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ
３ａ（配列番号１４１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５７）が挿入されて
いることを確認した。
実施例１６ ＦｐＬ＿Ｃ３アミノ酸置換集積体の作製（その２）
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３アミノ酸置換集積体の設計
ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ（配列番号１１６）において、リジン残基から置換したアルギニン残
基の一部を他のアミノ酸残基に置換した（具体的には、Ｌｙｓ（Ａｒｇ）７Ａｌａ、Ｌｙ
ｓ（Ａｒｇ）２２ＧｌｎおよびＬｙｓ（Ａｒｇ）２９Ｉｌｅのアミノ酸置換を有した）免
疫グロブリン結合性タンパク質ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ（配列番号１４２）を作製し、実施例８
および実施例１２で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性
向上に関与するアミノ酸置換をＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ（配列番号１４２）に対し集積した。具
体的には、以下の（ｑ）から（ｓ）に示す４種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設
計し、作製した。
（ｑ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸに対し、Ｇｌｙ２１Ａｒｇのアミノ酸置換を導入したタンパク質
（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ １ａと命名）
（ｒ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸに対し、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＡｓｎ６２
Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａと命名）
（ｓ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸに対し、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌ
ｙおよびＡｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４
ｇと命名）
（２）ＦｐＬ＿Ｃ３ ＫＸの作製
（２－１）ｐＥＴ２６ｂおよびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ（配列番号１４２）をコードするポリ
ヌクレオチド（配列番号１６１）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸのヌクレ
オチド配列を設計し、以下の３領域に分割した。
第一領域：ｐＥＴ２６ｂのヌクレオチド配列、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸの１番目から２０番目ま
でのアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６１の１番目から６０番目
までのヌクレオチド配列）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸの５３番目から７０番目までのアミノ酸残
基をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６１の１５７番目から２１０番目までのヌ
クレオチド配列）、ヒスチジン６残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号２３２）
、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－ＴＡＡＧＣＴＴ－３’）
第二領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸの１６番目から３７番目までのアミノ酸残基をコードするヌ
クレオチド配列（配列番号１６３［ｆｏｒｗａｒｄ］および１６４［ｒｅｖｅｒｓｅ］に
記載の配列からなるポリヌクレオチド）
第三領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸの３３番目から５７番目までのアミノ酸残基をコードするヌ
クレオチド配列（配列番号１５５［ｆｏｒｗａｒｄ］および１５６［ｒｅｖｅｒｓｅ］に
記載の配列からなるポリヌクレオチド）
（２－２）インバースＰＣＲにより、前記第一領域を含むポリヌクレオチドを調製した
。インバースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ Ｋ７Ａ（ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ
にＬｙｓ（Ａｒｇ）７Ａｌａのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質
、配列番号１３６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６０）を含む発現ベクタ
ーｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ Ｋ７Ａを、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして
配列番号１６２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１５２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞ
れ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法で行なった。インバースＰＣＲ後、前記第
一領域を含むポリヌクレオチドを精製した。
（２－３）（２－２）で調製した前記第一領域のポリヌクレオチド、ならびに（２－１
）で設計した前記第二領域および前記第三領域のポリヌクレオチド（直接化学合成で作製
）を実施例１５（ｏ－３）と同様な方法で連結した。
（２－４）連結したポリヌクレオチドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換
した。
（２－５）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クターの抽出を行ない、当該発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と
同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ（配列番
号１４２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６１）が挿入されていることを確
認した。
（３）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸアミノ酸置換集積体の作製
以下、前記（ｑ）から（ｓ）に示す３種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作製方
法について説明する。
（ｑ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ １ａ
（ｑ－１）ｐＥＴ２６ｂおよびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ １ａ（配列番号１４３）をコードす
るポリヌクレオチド（配列番号１６５）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
１ａのヌクレオチド配列を設計し、以下の３領域に分割した。
第一領域：ｐＥＴ２６ｂのヌクレオチド配列、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ １ａの１番目から２０
番目までのアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６５の１番目から６
０番目までのヌクレオチド配列）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ １ａの５３番目から７０番目まで
のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６５の１５７番目から２１０
番目までのヌクレオチド配列）、ヒスチジン６残基をコードするヌクレオチド配列（配列
番号２３２）、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－ＴＡＡＧＣ
ＴＴ－３’）
第二領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ １ａの１６番目から３７番目までのアミノ酸残基をコード
するヌクレオチド配列（配列番号１６６［ｆｏｒｗａｒｄ］および１６７［ｒｅｖｅｒｓ
ｅ］に記載の配列からなるポリヌクレオチド）
第三領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ １ａの３３番目から５７番目までのアミノ酸残基をコード
するヌクレオチド配列（配列番号１５５［ｆｏｒｗａｒｄ］および１５６［ｒｅｖｅｒｓ
ｅ］に記載の配列からなるポリヌクレオチド）
（ｑ－２）（２－２）に記載のインバースＰＣＲにより前記第一領域のポリヌクレオチ
ドを調製し、精製した。
（ｑ－３）（ｑ－２）で調製した前記第一領域のポリヌクレオチド、ならびに（ｑ－１
）で設計した前記第二領域および前記第三領域のポリヌクレオチド（直接化学合成で作製
）を実施例１５（ｏ－３）と同様な方法で連結した。
（ｑ－４）連結したポリヌクレオチドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換
した。
（ｑ－５）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ １ａと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターの
ヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ １ａにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
１ａ（配列番号１４３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６５）が挿入されて
いることを確認した。
（ｒ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａ
（ｒ－１）ｐＥＴ２６ｂおよびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａ（配列番号１４４）をコードす
るポリヌクレオチド（配列番号１６８）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
３ａのヌクレオチド配列を設計し、以下の３領域に分割した。
第一領域：ｐＥＴ２６ｂのヌクレオチド配列、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａの１番目から２０
番目までのアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６８の１番目から６
０番目までのヌクレオチド配列）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａの５３番目から７０番目まで
のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６８の１５７番目から２１０
番目までのヌクレオチド配列）、ヒスチジン６残基をコードするヌクレオチド配列（配列
番号２３２）、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－ＴＡＡＧＣ
ＴＴ－３’）
第二領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａの１６番目から３７番目までのアミノ酸残基をコード
するヌクレオチド配列（配列番号１６９［ｆｏｒｗａｒｄ］および１７０［ｒｅｖｅｒｓ
ｅ］に記載の配列からなるポリヌクレオチド）
第三領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａの３３番目から５７番目までのアミノ酸残基をコード
するヌクレオチド配列（配列番号１５８［ｆｏｒｗａｒｄ］および１５９［ｒｅｖｅｒｓ
ｅ］に記載の配列からなるポリヌクレオチド）
（ｒ－２）インバースＰＣＲにより、前記第一領域のポリヌクレオチドを調製した。イ
ンバースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ Ｋ７Ａを、ＰＣＲ Ｆ
ｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１５１に記載の配列からなるオリゴヌクレオ
チドを、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１５２に記載の配列から
なるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法で行な
った。インバースＰＣＲ後、前記第一領域を含むポリヌクレオチドを精製した。
（ｒ－３）（ｒ－２）で調製した前記第一領域のポリヌクレオチド、ならびに（ｒ－１
）で設計した前記第二領域および前記第三領域のポリヌクレオチド（直接化学合成で作製
）を実施例１５（ｏ－３）と同様な方法で連結した。
（ｒ－４）連結したポリヌクレオチドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換
した。
（ｒ－５）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クターの抽出を行ない、当該発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と
同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
３ａ（配列番号１４４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６８）が挿入されて
いることを確認した。
（ｓ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｇ
（ｓ－１）ｐＥＴ２６ｂおよびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｇ（配列番号１４５）をコードす
るポリヌクレオチド（配列番号１７１）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
４ｇのヌクレオチド配列を設計し、以下の３領域に分割した。
第一領域：ｐＥＴ２６ｂのヌクレオチド配列、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｇの１番目から２０
番目までのアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７１の１番目から６
０番目までのヌクレオチド配列）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｇの５３番目から７０番目まで
のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７１の１５７番目から２１０
番目までのヌクレオチド配列）、ヒスチジン６残基をコードするヌクレオチド配列（配列
番号２３２）、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－ＴＡＡＧＣ
ＴＴ－３’）
第二領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｇの１６番目から３７番目までのアミノ酸残基をコード
するヌクレオチド配列（配列番号１６６［ｆｏｒｗａｒｄ］および１６７［ｒｅｖｅｒｓ
ｅ］に記載の配列からなるポリヌクレオチド）
第三領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｇの３３番目から５７番目までのアミノ酸残基をコード
するヌクレオチド配列（配列番号１５８［ｆｏｒｗａｒｄ］および１５９［ｒｅｖｅｒｓ
ｅ］に記載の配列からなるポリヌクレオチド）
（ｓ－２）（ｒ－２）に記載のインバースＰＣＲにより前記第一領域のポリヌクレオチ
ドを調製し、精製した。
（ｓ－３）（ｓ－２）で調製した前記第一領域のポリヌクレオチド、ならびに（ｓ－１
）で設計した前記第二領域および前記第三領域のポリヌクレオチド（直接化学合成で作製
）を実施例１５（ｏ－５）と同様な方法で連結した。
（ｓ－４）連結したポリヌクレオチドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換
した。
（ｓ－５）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クターの抽出を行ない、当該発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と
同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｇにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
４ｇ（配列番号１４５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７１）が挿入されて
いることを確認した。
実施例１７ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸアミノ酸置換集積体のアルカリ安定性評価
（１）実施例１で作製した天然型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）、参考例１で作製した変
異型（アミノ酸置換した）免疫グロブリン結合性タンパク質ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ（配列番号
１１６）、実施例１５で作製した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｒ １ａ（配列番号１３８）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ １ｂ（配列番号１３９）、ＦｐＬ＿Ｃ
３ＫＲ １ｃ（配列番号１４０）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ ３ａ（配列番号１４１）、な
らびに実施例１６で作製した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ（
配列番号１４２）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ １ａ（配列番号１４３）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３
ａ（配列番号１４４）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｇ（配列番号１４５）のいずれかを発
現する形質転換体を、実施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１
１）に記載の方法でタンパク質抽出液を調製した。
（２）（１）で調製したタンパク質抽出液中の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体
結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（３）処理に用いたＮａＯＨの濃度を０．４Ｍ（終濃度０．２Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表１４に示す。少なくともＧｌｙ２１Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｙ５１Ｖ
ａｌ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＡｓｎ６２Ｔｙｒより選択される１以上のアミノ酸置換を
有することで、これらアミノ酸置換を導入しない免疫グロブリン結合性タンパク質（Ｆｐ
Ｌ＿Ｃ３ＫＲおよびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ）と比較し、アルカリ安定性が向上しているといえ
る。特に、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＡｓｎ６２Ｔｙｒの全てのアミノ
酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ ３ａおよびＦｐＬ
＿Ｃ３ＫＸ ３ａ）は、特にアルカリ安定性が向上しているといえる（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ
：５４％、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ ３ａ：８６％）（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ：１０％、ＦｐＬ＿Ｃ
３ＫＸ ３ａ：６９％）。
Figure 2023064059000014
実施例１８ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａへの変異導入およびライブラリ作製
実施例１６（ｒ）で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａのうち、免
疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号１６８）に
、実施例２と同様の方法でエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入し、ライブ
ラリを作製した。平均変異導入率は１．７％であった。
実施例１９ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａアミノ酸置換体のスクリーニング（その１）
（１）実施例１６（ｒ）で作製したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａ（形質転換体）と
実施例１８で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）を、実施例３（１）から
（２）と同様な方法で培養した。
（２）培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１．０Ｍ ＮａＯＨと等量混合し
４２℃で３０分間アルカリ処理を行なった。
（３）アルカリ処理を行なった時の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を
実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なった時の免疫グロ
ブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかった時の免疫グロブ
リン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。
（４）約９００株の形質転換体を評価し、その中からＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａ（配列番
号１４４）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現
する形質転換体を選択した。
（５）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（６）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を
解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（７）（４）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を、実
施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法でタン
パク質抽出液を調製した。
（８）（７）で調製したタンパク質抽出液中の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体
結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（９）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表１５に示す。配列番号１４４に記載のアミノ酸配列において、少なくともＧｌ
ｕ１ＧｌｙまたはＧｌｕ１Ｖａｌのアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク
質は、天然型のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ ３ａ（配列番号１４４）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure 2023064059000015
実施例２０ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａアミノ酸置換体のスクリーニング（その２）
（１）実施例１８で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）の中から、実施
例１９（１）から（３）に記載の方法で新たに約１４００株の形質転換体を評価し、その
中からアルカリ安定性向上免疫グロブリン結合性タンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａ）
と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転
換体を選択した。
（２）選択した形質転換体または実施例１６（ｒ）で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａ
（配列番号１４４）を発現する形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎ
ｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（３）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を
解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（４）（１）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を、実
施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法でタン
パク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体
結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（６）処理に用いたＮａＯＨの濃度を０．４Ｍ（終濃度０．２Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表１６に示す。配列番号１４４に記載のアミノ酸配列において、少なくともＧｌ
ｕ４Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２７ＡｒｇおよびＴｈｒ３６Ａｌａより選択される１以上のアミノ酸
置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然型のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）
よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａ（配列番号１４４）と比較しても
、アルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure 2023064059000016
実施例２１ 免疫グロブリン結合性タンパク質の免疫グロブリンκ軽鎖結合性評価（そ
の１）
変異型免疫グロブリン結合性タンパク質の免疫グロブリンκ軽鎖結合活性を下記に示す
ＥＬＩＳＡ法にて測定し、アミノ酸置換によるヒト免疫グロブリンκ軽鎖結合活性への影
響を評価した。
（１）参考例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ（配列番号１１６）およびＦｐＬ＿Ｃ４Ｋ
Ｒ（配列番号１１７）、実施例１６で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａ（配列番号１４４
）ならびに実施例２０で取得したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ３ａにＧｌｕ４９Ａｓｐのアミノ酸
置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号１７９、以下「ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ ４ｈ」とも表記）のいずれかを発現する形質転換体を、実施例３（８）から（１０
）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法でタンパク質抽出液を調製した
。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し、清澄化した。
（２）（１）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（３）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる各変異型免疫
グロブリン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、各変異型免疫
グロブリン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（４）変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のヒト免疫グロブリンκ軽鎖結合活性を
下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、アミノ酸置換によるヒト免疫グロブリンκ軽鎖結合
活性への影響を評価した。
（４－１）ＴＢＳを用いて１０μｇ／ｍＬに調製したポリクローナル抗体溶液を９６ウェ
ルマイクロプレートのウェルに分注し固定化した（４℃、１６時間）。使用したポリクロ
ーナル抗体は、
ヒトκ軽鎖ｓｕｂｇｒｏｕｐ １（Ｖκ１）を含むハーセプチン（中外製薬社製）、
ヒトκ軽鎖ｓｕｂｇｒｏｕｐ ３（Ｖκ３）を含むＨｕｍａｎ ＰＤＧＦ Ｒ ａｌｐｈ
ａ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
ヒトκ軽鎖ｓｕｂｇｒｏｕｐ ３（Ｖκ３）を含むＨｕｍａｎ ＣＴＬＡ４抗体（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）および、
ヒトκ軽鎖ｓｕｂｇｒｏｕｐ ４（Ｖκ４）を含むＨｕｍａｎ ＰＣＳＫ９抗体（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
のいずれかである。固定化後、ＴＢＳを用いて２％（ｗ／ｖ）に調製したスキムミルク（
ベクトン・ディッキンソン社製）を用いてブロッキングした。
（４－２）洗浄緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ
２０（商品名）を含む０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５））で９６ウェルマイク
ロプレートのウェルを洗浄後、５０μｇ／ｍＬに希釈した抗体結合活性を評価する免疫グ
ロブリン結合性タンパク質を含む溶液を添加し、免疫グロブリン結合性タンパク質と固定
化ポリクローナル抗体とを反応させた（３０℃、１時間）。
（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ
－６－Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＥＴＨＹＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を１
００μＬ／ｗｅｌｌ添加し反応させた（３０℃、１時間）。
（４－４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕ
ｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。次に１Ｍ リン酸を５
０μＬ／ｗｅｌｌ添加することで反応を停止し、マイクロプレートリーダー（テカン社製
）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（４－５）ポリクローナル抗体を固定化したウェルと固定化していないウェルとの吸光度
の差を計算し、当該計算した吸光度からポリクローナル抗体と変異型免疫グロブリン結合
性タンパク質との結合性を評価した。各ポリクローナル抗体間の吸光度の違いは異なるヒ
トκ軽鎖との結合性を示しており、この数値がポリクローナル抗体毎にバラツキが大きい
場合、特定のヒトκ軽鎖ｓｕｂｇｒｏｕｐとの結合性が低下していることが示される。
結果を表１７に示す。ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号１１７）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ＿
４ｈ（配列番号１７９）は各ポリクローナル抗体間のバラツキが少ないことから、ヒト免
疫グロブリンκ軽鎖とｓｕｂｇｒｏｕｐに関係なく結合できるといえる。一方でＦｐＬ＿
Ｃ３ＫＲ（配列番号１１６）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａ（配列番号１４４）は、特にヒ
トＶκ３との結合力が低下していた。以上の結果から、Ｇｌｕ４９Ａｓｐのアミノ酸置換
を導入することで、Ｖκ３との結合力を付与できることがわかる。
Figure 2023064059000017
実施例２２ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｈへの変異導入およびライブラリ作製
実施例２０で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｈ（配列番号１７９）を発現するベクター
ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｈのうち、免疫グロブリン結合性タンパク質をコードする
ポリヌクレオチド部分（配列番号１８０）に、実施例２と同様の方法でエラープローンＰ
ＣＲによりランダムに変異を導入し、ライブラリを作製した。平均変異導入率は１．７％
であった。
実施例２３ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｈアミノ酸置換体のスクリーニング
（１）実施例２２で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）を、実施例３（
１）から（２）と同様な方法で培養後、遠心操作によって得られた培養上清に対し、実施
例１９（２）に記載のアルカリ処理を行なった。
（２）アルカリ処理を行なった時の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を
実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なった時の免疫グロ
ブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかった時の免疫グロブ
リン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。
（３）約９００株の形質転換体を評価し、その中からアルカリ安定性向上免疫グロブリ
ン結合性タンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｈ）と比較してアルカリ安定性が向上した免
疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
（４）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を
解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（６）（５）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体または
実施例２０で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｈ（配列番号１７９）を発現する形質転換体
を、実施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法
でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに
通し、清澄化した。
（７）（６）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（８）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（９）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表１８に示す。配列番号１７９に記載のアミノ酸配列において、少なくともＧｌ
ｕ９Ｖａｌ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｔｈｒ５４ＭｅｔおよびＡｌａ６９Ｔｈｒより選択され
る１以上のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然型のＦｐＬ＿
Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｈ（配列番号１
７９）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。
なお、２０ｍＬ培地で培養したときの精製収量を比較したところ、Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）２
２Ａｒｇのアミノ酸置換を導入することで、タンパク質精製収量が顕著に向上することを
確認した。以降、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｈにＬｙｓ（Ｇｌｎ）２２Ａｒｇのアミノ酸置換
を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質をＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｉ（配列番号１８２
）と命名する。
Figure 2023064059000018
実施例２４ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｉアミノ酸置換集積体の作製
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｉアミノ酸置換集積体の設計
実施例２３で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上
に関与するアミノ酸置換をＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｉ（配列番号１８２）に対し集積するこ
とで、更なる安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ｔ）および（ｕ）に示す２種
類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ｔ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｉに対し、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換を導入したタン
パク質（配列番号１８６、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅと命名）
（ｕ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｉに対し、Ｔｈｒ５４Ｍｅｔのアミノ酸置換を導入したタン
パク質（配列番号１８７、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｆと命名）
（２）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｉアミノ酸置換集積体の作製
以下、（ｔ）および（ｕ）に示す２種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作製方法
について説明する。
（ｔ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ
（ｔ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ（配列
番号１８６）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。鋳型Ｄ
ＮＡとしてインバースＰＣＲはＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｉ（配列番号１８２）をコードする
ポリヌクレオチド（配列番号１８８）を含む発現ベクター（以下、「ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ
３ＫＸ ４ｉ」とも表記）を、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１
８９に記載のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列
番号１９０に記載のオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同
様な方法で行なった。
（ｔ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制限
酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｔ－３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターの
ヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
５ｅ（配列番号１８６）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
（ｕ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｆ
（ｕ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｆ（配列
番号１８７）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバ
ースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｉを、ＰＣＲ Ｆｏｒｗ
ａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１９１に記載のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒ
ｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１９２に記載のオリゴヌクレオチドを、それ
ぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法で行なった。
（ｕ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制限
酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｕ－３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｆと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターの
ヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｆにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
５ｆ（配列番号１８７）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
実施例２５ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｈアミノ酸置換体のアルカリ安定性評価
（１）実施例２０で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｈ（配列番号１７９）、実施例２３
で取得したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｉ（配列番号１８２）ならびに実施例２４で作製したＦ
ｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ（配列番号１８６）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｆ（配列番号１８
７）のいずれかを発現する形質転換体を、実施例３（８）から（１０）と同様な方法で培
養し、実施例３（１１）と同様な方法でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心
分離し、得られた上清をフィルターに通し、清澄化した。
（２）（１）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（３）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（４）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理温度を５５
℃、処理時間を１５分に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ
処理後、実施例３（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した
。
結果を表１９に示す。実施例２４で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ（配列番号１８６
）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｆ（配列番号１８７）は天然型のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号
１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｈ（配列番号１７９）およびＦ
ｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｉ（配列番号１８２）と比較しても、アルカリ安定性が向上している
といえる。特に、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅにおいて顕著なアルカリ安定性向上を確認した
（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｈ：３４％、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ４ｉ：４８％、ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ ５ｅ：７３％）。
Figure 2023064059000019
実施例２６ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅへの変異導入およびライブラリ作製
実施例２４で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅのうち、免疫グロ
ブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号１９３）に、実施
例２と同様の方法でエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入し、ライブラリを
作製した。平均変異導入率は１．９％であった。
実施例２７ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅアミノ酸置換体のスクリーニング
（１）実施例２６で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）を実施例３（１
）から（２）と同様な方法で培養後、遠心操作によって得られた培養上清に対し、実施例
１９（２）に記載のアルカリ処理を行なった。
（２）アルカリ処理を行なった時の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を
実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なった時の免疫グロ
ブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかった時の免疫グロブ
リン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。
（３）約９００株の形質転換体を評価し、その中からアルカリ安定性向上免疫グロブリ
ン結合性タンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ）と比較してアルカリ安定性が向上した免
疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
（４）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を
解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（６）（３）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体または
実施例２４で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ（配列番号１８６）を発現する形質転換体
を、実施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法
でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに
通し、清澄化した。
（７）（６）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（８）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（９）処理に用いたＮａＯＨの濃度を２．０Ｍ（終濃度１．０Ｍ）に、処理時間を１７
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表２０に示す。配列番号１８６に記載のアミノ酸配列において、少なくともＧｌ
ｕ１Ｖａｌ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｇｌｙ２１ＡｒｇおよびＧｌｕ（Ｇｌｙ）５２Ａｓｐより
選択される１以上のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然型の
ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ（配
列番号１８６）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure 2023064059000020
実施例２８ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅアミノ酸置換集積体作製（その１）
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅアミノ酸置換集積体の設計
実施例２７で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上
に関与するアミノ酸置換をＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅに対し集積することで、更なる安定性
の向上を図った。具体的には、以下の（ｖ）から（ｘ）に示す３種類の免疫グロブリン結
合性タンパク質を設計し、作製した。
（ｖ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅに対し、Ｇｌｕ４ＧｌｙおよびＧｌｕ（Ｇｌｙ）５２Ａｓ
ｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号１９９、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａと命
名）
（ｗ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅに対し、Ｌｙｓ（Ａｌａ）７ＳｅｒおよびＧｌｕ（Ｇｌｙ
）５２Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２００、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
５ｇと命名）
（ｘ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅに対し、Ｇｌｕ４ＧｌｙおよびＬｙｓ（Ａｌａ）７Ｓｅｒ
のアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２０１、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｂと命名
）
（２）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅアミノ酸置換集積体の作製
以下、（ｖ）から（ｘ）に示す３種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作製方法に
ついて説明する。
（ｖ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ
（ｖ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａをコー
ドするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバースＰＣＲは、鋳型
ＤＮＡとしてＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ Ｅ５２Ｄ（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅにＧｌｕ（Ｇ
ｌｙ）５２Ａｓｐのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質、配列番号
１９８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２０２）を含む発現ベクターｐＥＴ－
ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ Ｅ５２Ｄを、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配
列番号２０３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐ
ｒｉｍｅｒとして配列番号２０４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ
用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法で行なった。
（ｖ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制限
酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｖ－３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターの
ヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
６ａ（配列番号１９９）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
（ｗ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｇ
（ｗ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｇをコー
ドするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバースＰＣＲは、鋳型
ＤＮＡとしてｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ Ｅ５２Ｄを、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ
Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２０５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２０６に記載の配列からなるオリゴヌク
レオチドを、それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法で行なった。
（ｗ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制限
酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｗ－３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｇと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターの
ヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｇにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
５ｇ（配列番号２００）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
（ｘ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｂ
（ｘ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｂをコー
ドするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバースＰＣＲは、鋳型
ＤＮＡとしてＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ Ｅ４Ｇ（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅにＧｌｕ４Ｇｌ
ｙのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質、配列番号１９５）をコー
ドするポリヌクレオチド（配列番号２０７）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ ５ｅ Ｅ４Ｇを、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２０５に記
載のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２０
８に記載のオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法
で行なった。
（ｘ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制限
酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｘ－３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｂと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターの
ヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｂにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
６ｂ（配列番号２０１）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
実施例２９ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅアミノ酸置換集積体のアルカリ安定性評価（その
１）
（１）実施例２４で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ（配列番号１８６）ならびに実施
例２８で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ（配列番号１９９）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｇ
（配列番号２００）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｂ（配列番号２０１）のいずれかを発現
する形質転換体を、実施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１
）と同様な方法でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清
をフィルターに通し、清澄化した。
（２）（１）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（３）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（４）処理に用いたＮａＯＨの濃度を２．０Ｍ（終濃度１．０Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表２１に示す。本実施例で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ（配列番号１９９）
、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｇ（配列番号２００）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｂ（配列番号
２０１）は、いずれも天然型のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上し
たＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ（配列番号１８６）と比較しても、アルカリ安定性が向上して
いるといえる。中でもＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａは最も優れたアルカリ安定性を示した（Ｆ
ｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ：５５％、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ：６２％）。
Figure 2023064059000021
実施例３０ 本発明のタンパク質の免疫グロブリン溶出ｐＨ評価
実施例１で作製した天然型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）、または実施例１２で取得した
変異型（アミノ酸置換した）免疫グロブリンタンパク質ＦｐＬ＿Ｃ３ Ｇ２１Ｒ（ＦｐＬ
＿Ｃ３にＧｌｙ２１Ａｒｇのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質、
配列番号１０１）、ＦｐＬ＿Ｃ３ Ｇ５１Ｖ（ＦｐＬ＿Ｃ３にＧｌｙ５１Ｖａｌのアミノ
酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質、配列番号１０６）、ＦｐＬ＿Ｃ３
Ｎ６２Ｈ（ＦｐＬ＿Ｃ３にＡｓｎ６２Ｈｉｓのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結
合性タンパク質、配列番号１０７）、ＦｐＬ＿Ｃ３ Ｎ６２Ｒ（ＦｐＬ＿Ｃ３にＡｓｎ６
２Ａｒｇのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質、配列番号１０８）
、ＦｐＬ＿Ｃ３ Ｎ６２Ｙ（ＦｐＬ＿Ｃ３にＡｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を導入した
免疫グロブリン結合性タンパク質、配列番号５）もしくはＦｐＬ＿Ｃ３ Ｎ６２Ｗ（Ｆｐ
Ｌ＿Ｃ３にＡｓｎ６２Ｔｒｐのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質
、配列番号１１１）に結合した免疫グロブリンを溶出可能なｐＨ（以下、単に「溶出ｐＨ
」とも表記）を以下の方法で測定した。
（１）免疫グロブリンを固定化した不溶性担体であるＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ社製）の５０％（ｗ／ｖ）水スラリーを調製し、当
該スラリー０．５ｍＬをＴｒｉｃｏｒｎ ５／５０カラム（内径５ｍｍ×長さ５０ｍｍ：
Ｃｙｔｉｖａ社製）に入れた後、ポンプで純水を送液することで、ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ充填カラムを作製した。
（２）（１）で作製したＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ充填カラムをＡＫＴＡ ＡＶＡＮ
Ｔ ２５（Ｃｙｔｉｖａ社製）に設置した。前記カラムを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）（以下Ａ液）で平衡化し、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ２．２）（以下Ｂ液）
で洗浄後、Ａ液で再度平衡化した。
（３）Ａ液で１ｇ／Ｌに調製した免疫グロブリン結合性タンパク質溶液１００μＬを、
ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ充填カラムにアプライし、Ａ液を５カラム体積分送液後、１
０分間でＢ液が０％から１００％となるリニアグラジエント溶出で免疫グロブリン結合性
タンパク質を溶出させた。得られたクロマトグラムを解析し、最も吸光度が高くなる溶出
位置でのｐＨを溶出ｐＨとした。
結果を表２２に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列において、少なくともＧｌｙ２
１Ａｒｇ、Ｇｌｙ５１Ｖａｌ、Ａｓｎ６２Ｈｉｓ、Ａｓｎ６２Ａｒｇ、Ａｓｎ６２Ｔｙｒ
およびＡｓｎ６２Ｔｒｐより選択される１以上のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結
合性タンパク質は、天然型ＦｐＬ＿Ｃ３と比較し溶出ｐＨが向上している、すなわち免疫
グロブリン結合性タンパク質に結合した免疫グロブリン（抗体）をより温和な条件で溶出
できる、といえる。
Figure 2023064059000022
実施例３１ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａへの変異導入およびライブラリ作製
実施例２８で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａのうち、免疫グロ
ブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号２１１）に、実施
例２と同様の方法でエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入し、ライブラリを
作製した。平均変異導入率は１．８％であった。
実施例３２ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａアミノ酸置換体のスクリーニング
（１）実施例３１で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）を実施例３（１
）から（２）と同様な方法で培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１．０Ｍ Ｎ
ａＯＨと等量混合し６２℃で３０分間アルカリ処理を行なった。
（２）アルカリ処理を行なった時の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を
実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なった時の免疫グロ
ブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかった時の免疫グロブ
リン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。
（３）約１８００株の形質転換体を評価し、その中からアルカリ安定性向上免疫グロブ
リン結合性タンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ）と比較してアルカリ安定性が向上した
免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
（４）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を
解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（６）（３）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体、実施
例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）を発現する形質転換体、参考例１で作製した
ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号１１７）を発現する形質転換体、および実施例２８で作製し
たＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ（配列番号１９９）を発現する形質転換体のいずれかを、実施
例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法でタンパ
ク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し、清
澄化した。
（７）（６）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（８）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（９）処理に用いたＮａＯＨの濃度を２．０Ｍ（終濃度１．０Ｍ）に、処理時間を１７
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表２３に示す。配列番号１９９に記載のアミノ酸配列において、少なくともＴｈ
ｒ２Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２Ｓｅｒ、Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ９Ｖａｌ、Ｇｌ
ｕ２７Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２７Ｉｌｅ、Ｇｌｕ２７Ｖａｌ、Ｐｈｅ３２Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（Ａｒ
ｇ）３８Ａｌａ、Ａｓｎ４４Ｉｌｅ、Ａｌａ４７ＴｈｒおよびＧｌｕ（Ａｓｐ）５２Ａｓ
ｎより選択される１以上のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天
然型のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６
ａ（配列番号１９９）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure 2023064059000023
実施例３３ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａアミノ酸置換体の溶出特性評価
（１）実施例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）または実施例３２で取得したＦ
ｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ Ｅ２７Ｖ（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａにおいてＧｌｕ２７Ｖａｌの
アミノ酸置換を導入したタンパク質、配列番号２２２）を発現する形質転換体を、実施例
３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法でタンパク
質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し、清澄
化した。
（２）（１）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（３）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる各変異型免疫
グロブリン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、各変異型免疫
グロブリン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（４）変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のヒト免疫グロブリンκ軽鎖からの酸溶
出特性を下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、アミノ酸置換による酸溶出特性への影響を
評価した。
（４－１）ＴＢＳを用いて１０μｇ／ｍＬに調製したハーセプチン（中外製薬社製）溶液
を９６ウェルマイクロプレートのウェルに分注し固定化した（４℃、１６時間）。固定化
後、ＴＢＳを用いて２％（ｗ／ｖ）に調製したスキムミルク（ベクトン・ディッキンソン
社製）を用いてブロッキングした。
（４－２）洗浄緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ
２０（商品名）を含む０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５））で９６ウェルマイク
ロプレートのウェルを洗浄後、２μｇ／ｍＬに希釈した抗体結合活性を評価する免疫グロ
ブリン結合性タンパク質を含む溶液を添加し、免疫グロブリン結合性タンパク質と固定化
モノクローナル抗体とを反応させた（３０℃、１時間）。
（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、一部のウェルに０．０５Ｍクエン酸溶
液（ｐＨ２．７）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し免疫グロブリン結合性タンパク質を解離
させた（２５℃、２分）
（４－４）前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６－Ｈｉｓ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＥＴＨＹＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を１００μＬ／ｗ
ｅｌｌ添加し反応させた（３０℃、１時間）。
（４－５）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕ
ｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。次に１Ｍリン酸を５０
μＬ／ｗｅｌｌ添加することで反応を停止し、マイクロプレートリーダー（テカン社製）
にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（４－６）（４－３）でクエン酸溶液により免疫グロブリン結合性タンパク質を解離させ
たウェルとさせていないウェルとの吸光度の割合から、モノクローナル抗体に対する変異
型免疫グロブリン結合性タンパク質の酸における溶出率（数値が高いほど酸溶出特性に優
れる）を評価した。
結果を表２４に示す。ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）と比較して、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６
ａ Ｅ２７Ｖ（配列番号２２２）は、より酸溶出がしやすいといえる。
Figure 2023064059000024
実施例３４ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａアルギニン置換体の作製
以下の（ｙ）から（ａａ）に示す３種類のＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａアルギニン置換体を
設計し、作製した。
（ｙ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａに対し、Ｇｌｕ５Ａｒｇのアミノ酸置換を導入したタンパ
ク質（配列番号２２３、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ａと命名）
（ｚ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａに対し、Ｇｌｕ２７Ａｒｇのアミノ酸置換を導入したタン
パク質（配列番号２２４、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｂと命名）
（ａａ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａに対し、Ａｌａ４７Ａｒｇのアミノ酸置換を導入したタ
ンパク質（配列番号２２５、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｃと命名）
以下、（ｙ）、（ｚ）および（ａａ）に示す３種類の免疫グロブリン結合性タンパク質
の作製方法について説明する。
（ｙ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ａ
（ｙ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ａ（配列
番号２２３）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。鋳型Ｄ
ＮＡとしてインバースＰＣＲはＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ（配列番号１９９）をコードする
ポリヌクレオチド（配列番号２１１）を含む発現ベクター（以下、「ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ
３ＫＸ ６ａ」とも表記）を、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２
２６に記載のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列
番号２２７に記載のオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同
様な方法で行なった。
（ｙ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制限
酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｙ－３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ａと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターの
ヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ａにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
７ａ（配列番号２２３）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
（ｚ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｂ
（ｚ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｂ（配列
番号２２４）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバ
ースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａを、ＰＣＲ Ｆｏｒｗ
ａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２２８に記載のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒ
ｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２２９に記載のオリゴヌクレオチドを、それ
ぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法で行なった。
（ｚ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制限
酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｚ－３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベ
クター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｂと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターの
ヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｂにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
７ｂ（配列番号２２４）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
（ａａ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｃ
（ａａ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｃ（配
列番号２２５）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。イン
バースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａを、ＰＣＲ Ｆｏｒ
ｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２３０に記載のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２３１に記載のオリゴヌクレオチドを、そ
れぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法で行なった。
（ａａ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制
限酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａａ－３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現
ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｃと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクター
のヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｃにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
７ｃ（配列番号２２５）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
実施例３５ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａアルギニン置換体のアルカリ安定性評価
（１）実施例２８で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ（配列番号１９９）、ならびに実
施例３４で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ａ（配列番号２２３）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７
ｂ（配列番号２２４）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｃ（配列番号２２５）のいずれかを発
現する形質転換体を、実施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１
１）と同様な方法でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上
清をフィルターに通し、清澄化した。
（２）（１）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（３）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（４）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理温度を２５
℃、処理時間を１４時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカ
リ処理後、実施例３（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価し
た。
結果を表２５に示す。ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ａ（配列番号２２３）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
７ｂ（配列番号２２４）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｃ（配列番号２２５）は天然型の
ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ（配
列番号１９９）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。特に、ＦｐＬ＿
Ｃ３ＫＸ ７ｂにおいて顕著なアルカリ安定性向上を確認した（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ
：５２％、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｂ：７０％）。
Figure 2023064059000025
 実施例３６ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａアルギニン置換体の溶出特性評価
（１）実施例２８で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ（配列番号１９９）、実施例３２
で取得したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａ Ｅ２７Ｖ（配列番号２２２）、ならびに実施例３４
で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｂ（配列番号２２４）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｃ（
配列番号２２５）のいずれかを発現する形質転換体を、実施例３（８）から（１０）と同
様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法でタンパク質抽出液を調製した。前記
抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し、清澄化した。
（２）（１）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（３）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる各変異型免疫
グロブリン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、各変異型免疫
グロブリン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（４）使用する０．０５Ｍクエン酸溶液のｐＨが２．４とした他は、実施例３３（４）
と同様の方法で、変異型免疫グロブリン結合性タンパク質の酸における溶出率を評価した
。
結果を表２６に示す。ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ａアルギニン置換体であるＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ ７ｂ（配列番号２２４）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｃ（配列番号２２５）は、天然
型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）と比較して酸溶出特性が向上したＦｐＬ＿ＫＸ６ａ Ｅ２
７Ｖ（配列番号２２２）と比較しても、酸溶出特性が向上していることがわかる。特に、
ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｂにおいて顕著な酸溶出特性向上を確認した（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
６ａ Ｅ２７Ｖ：５３％、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｂ：６１％）。
Figure 2023064059000026
実施例３７ 免疫グロブリン結合性タンパク質の免疫グロブリンκ軽鎖結合性評価（そ
の２）
Ｐｒｏ６Ｓｅｒのアミノ酸置換導入による、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖結合活性への影
響を評価した。具体的には、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ（配列番号１８６）に対しＰｒｏ６
Ｓｅｒのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質を作製し、評価した。
（１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ（配列番号
１８６）に対しＰｒｏ６Ｓｅｒのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク
質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ＿５ｅ＿Ｐ６Ｓと命名、配列番号２３６）をコードするヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてｐＥ
Ｔ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅを、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号
２３４に記載のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配
列番号２３５に記載のオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と
同様な方法で行なった。
（２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制限酵素
処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベクタ
ー（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ＿５ｅ＿Ｐ６Ｓと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクタ
ーのヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列解析の結果
、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ＿５ｅ＿Ｐ６ＳにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ＿５ｅ＿Ｐ
６Ｓ（配列番号２３６）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
（４）（２）で得られたＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ＿５ｅ＿Ｐ６Ｓ（配列番号２３６）、および
実施例２４で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ＿５ｅ（配列番号１８６）のいずれかを発現する
形質転換体を、実施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と
同様な方法でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフ
ィルターに通し、清澄化した。
（５）（４）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（６）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる各変異型免疫
グロブリン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、各変異型免疫
グロブリン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（７）免疫グロブリン結合性タンパク質のヒト免疫グロブリンκ軽鎖結合活性を、実施
例２１（４）と同様な方法で測定し、アミノ酸置換によるヒト免疫グロブリンκ軽鎖結合
活性への影響を評価した。ただし、結合活性評価に用いたポリクローナル抗体は、
ヒトκ軽鎖ｓｕｂｇｒｏｕｐ １（Ｖκ１）を含むハーセプチン（中外製薬社製）および
、
ヒトκ軽鎖ｓｕｂｇｒｏｕｐ ３（Ｖκ３）を含むＨｕｍａｎ ＣＴＬＡ４抗体（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、
のいずれかである。
参考例３
Ｌｙｓ３８Ｇｌｕのアミノ酸置換導入による、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖結合活性への
影響を評価した。具体的には、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ（配列番号１１６）に対しＬｙｓ（Ａｒ
ｇ）３８Ｇｌｕのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質を作製し、評
価した。
（１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ（配列番号１１６
）に対しＬｙｓ（Ａｒｇ）３８Ｇｌｕのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タ
ンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ＿Ｋ３８Ｅと命名、配列番号２３９）をコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてｐ
ＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲを、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２３
７に記載のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番
号２３８に記載のオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様
な方法で行なった。
（２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制限酵素
処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）（２）で得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発
現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ＿Ｋ３８Ｅと命名）の抽出を行ない、当該
発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。配列
解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ＿Ｋ３８ＥにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ＿Ｋ
３８Ｅ（配列番号２３９）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認し
た。
（４）（２）で得られたＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ＿Ｋ３８Ｅ（配列番号２３９）、および参考
例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＲ（配列番号１１６）のいずれかを発現する形質転換体を
、実施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法で
タンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通
し、清澄化した。
（５）（４）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（６）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる各変異型免疫
グロブリン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、各変異型免疫
グロブリン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（７）免疫グロブリン結合性タンパク質のヒト免疫グロブリンκ軽鎖結合活性を、実施
例３７（７）と同様な方法で測定し、アミノ酸置換によるヒト免疫グロブリンκ軽鎖結合
活性への影響を評価した。
実施例３７および比較例３の結果を合わせて表２７に示す。Ｐｒｏ６Ｓｅｒ（実施例３
７）またはＬｙｓ（Ａｒｇ）３８Ｇｌｕ（比較例３）のアミノ酸置換を導入することで、
Ｖκ３との結合力を付与できることがわかる。
Figure 2023064059000027
実施例３８ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅアミノ酸置換集積体作製（その２）
前述したＶκ３との結合力を付与するアミノ酸置換および実施例２７で明らかとなった
免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換をＦｐＬ
＿Ｃ３ＫＸ ５ｅに対し集積した。具体的には、以下の（ａｂ）に示す免疫グロブリン結
合性タンパク質を設計し、作成した。
（ａｂ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅに対し、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ（Ａｒｇ）３８Ｇｌ
ｕ、Ｇｌｕ（Ｇｌｙ）５２Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２４０
、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄと命名）
（ａｂ－１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（配列番号２４０）をコードするポリヌクレオチ
ド（配列番号２４１）を合成した。なお、合成する際、５’末端側には制限酵素ＮｃｏＩ
の認識配列（５’－ＣＣＡＴＧＧ－３’）を、３’末端側にはヒスチジン６残基をコード
するヌクレオチド配列（配列番号２３２）、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの
認識配列（５’－ＡＡＧＣＴＴ－３’）を、それぞれ付加している。
（ａｂ－２）実施例１（２）と同様の方法で、（ａｂ－１）で合成したポリヌクレオチ
ドを精製した。
（ａｂ－３）実施例１（３）と同様な方法で、（ａｂ－２）で得たポリヌクレオチドと
予め制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＥＴ－２６ｂとをライゲ
ーション後、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し
、培養した。
（ａｂ－４）得られた形質転換体を、実施例１（４）と同様な方法で培養およびプラス
ミド精製を行ない、発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄと命名）を取得後、
当該発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった
。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
７ｄ（配列番号２４０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２４１）が挿入されて
いることを確認した。
実施例３９ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅアミノ酸置換集積体のアルカリ安定性評価（その
２）
（１）実施例２４で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ５ｅ（配列番号１８６）および実施例
３８で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（配列番号２４０）のいずれかを発現する形質転
換体を、実施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）に記載の
方法でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルタ
ーに通し、清澄化した。
（２）（１）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（３）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（４）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表２８に示す。本実施例で評価したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（配列番号２４０）
は、天然型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりもアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ ５ｅ（配列番号１８６）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure 2023064059000028
実施例４０ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄへの変異導入およびライブラリ作製（その１）
実施例３８で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（配列番号２４０）を発現するベクター
ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄのうち、免疫グロブリン結合性タンパク質をコードする
ポリヌクレオチド部分（配列番号２４１）に、実施例２と同様の方法でエラープローンＰ
ＣＲによりランダムに変異を導入し、ライブラリを作製した。平均変異導入率は１．９％
であった。
実施例４１ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄアミノ酸置換体のスクリーニング（その１）
（１）実施例３８で作製したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（形質転換体）および実
施例４０で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）を、実施例３（１）から（
２）と同様な方法で培養した。
（２）培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１．０Ｍ ＮａＯＨと等量混合し
５８℃で３０分間アルカリ処理を行なった。
（３）アルカリ処理を行なった時の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を
実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なった時の免疫グロ
ブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかった時の免疫グロブ
リン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。
（４）約１０００株の形質転換体を評価し、その中からＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（配列
番号２４０）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発
現する形質転換体を選択した。
（５）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（６）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を
解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（７）（４）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体または
実施例３８で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（配列番号２４０）を発現する形質転換体
を、実施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法
でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離後、得られた上清をフィルターに
通し、清澄化した。
（８）（７）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（９）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（１０）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１
５時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例
３（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表２９に示す。配列番号２４０に記載のアミノ酸配列において、少なくともＧｌ
ｕ８Ｖａｌ、Ｌｙｓ（Ｉｌｅ）２９Ｐｈｅ、Ｇｌｕ３３ＶａｌおよびＡｌａ６９Ｖａｌよ
り選択される１以上のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然型
のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（
配列番号２４０）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure 2023064059000029
実施例４２ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ａへの変異導入およびライブラリ作製（その２）
（１）実施例３８で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄを鋳型とし
て、２３番目、４１番目および５２番目のアミノ酸残基に対する飽和置換体ライブラリを
作製した。プライマーは、実施例１１（１）と同様、２２ｃ－Ｔｒｉｃｋ法に倣い、変異
導入箇所に適切な混合塩基を配置し、変異導入箇所を中心としたインバースＰＣＲができ
るように設計した（配列番号２４５から２５０、２５２から２５７、ならびに２６０から
２６５）。これらのプライマーを一箇所の置換につき６本一組として、表７および表３０
の組成で混合し、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ混合液（Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒ
ｉｍｅｒ ｍｉｘ）を調製した。
Figure 2023064059000030
（２）ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄを鋳型ＤＮＡとした他は、実施例１１（２）と
同様な方法でインバースＰＣＲによる部位特異的変異導入を行なった。
（３）得られたＰＣＲ産物を精製後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形
質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６
時間）した後、プレート上に形成したコロニーを部位特異的変異体ライブラリとした。
実施例４３ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄアミノ酸置換体のスクリーニング（その２）
（１）実施例３８で作製したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（形質転換体）および実
施例４２で作製した部位特異的アミノ酸置換体ライブラリ（形質転換体）を、実施例３（
１）から（２）と同様な方法で培養後、遠心操作によって得られた培養上清に対し、実施
例４１（２）に記載のアルカリ処理を行なった。
（２）アルカリ処理を行なった時の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を
実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なった時の免疫グロ
ブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかった時の免疫グロブ
リン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。
（３）約３００株の形質転換体を評価し、その中からＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（配列番
号２４０）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現
する形質転換体を選択した。
（４）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を
解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（６）（３）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体または
実施例３８で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（配列番号２４０）を発現する形質転換体
を、実施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法
でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに
通し、清澄化した。
（７）（６）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（８）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（９）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表３１に示す。配列番号２４０に記載のアミノ酸配列において、少なくともＩｌ
ｅ２３Ａｒｇ、Ａｌａ４１Ｉｌｅ、Ａｌａ４１Ｔｙｒ、Ｇｌｕ（Ｇｌｙ，Ａｓｐ）５２Ｌ
ｅｕ（この表記は配列番号１の７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基が一旦グリ
シンに置換し、さらにアスパラギン酸に置換後、ロイシンに置換されたことを表す、以下
同様）およびＧｌｕ（Ｇｌｙ，Ａｓｐ）５２Ｖａｌのアミノ酸置換を有した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質は、天然型のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上
したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（配列番号２４０）と比較しても、アルカリ安定性が向上し
ているといえる。
Figure 2023064059000031
実施例４４ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄアミノ酸置換集積体の作製
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄアミノ酸置換集積体の設計
実施例４１および４３で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ
安定性向上に関与するアミノ酸置換をＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ（配列番号２４０）に対し
集積することで、更なるアルカリ安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａｃ）か
ら（ａｄ）に示す２種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａｃ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄに対し、Ｇｌｕ（Ｇｌｙ，Ａｓｐ）５２ＶａｌおよびＡ
ｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２７１、ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ ８ａと命名）
（ａｄ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄに対し、Ｇｌｕ（Ｇｌｙ，Ａｓｐ）５２ＬｅｕおよびＡ
ｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２７４、ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ ８ｂと命名）
（２）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄアミノ酸置換集積体の作製
以下、前記（ａｃ）から（ａｄ）に示す２種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作
製方法について説明する。
（ａｃ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ８ａ
（ａｃ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ８ａ（配
列番号２７１）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。イン
バースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ＿Ａ６９Ｖ（ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ ７ｄにＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質
、配列番号２４２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２６８）を含む発現ベクタ
ー（以下、「ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ＿Ａ６９Ｖ」とも表記）を、ＰＣＲ Ｆｏ
ｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２６９に記載のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２７０に記載のオリゴヌクレオチドを、
それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法で行なった。
（ａｃ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制
限酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａｃ－３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現
ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ８ａと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクター
のヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ８ａにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
８ａ（配列番号２７１）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
（ａｄ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ８ｂ
（ａｄ－１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ８ｂ（配
列番号２７４）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。鋳型
ＤＮＡとしてインバースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ａ＿Ａ
６９Ｖを、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２７２に記載のオリゴ
ヌクレオチドを、ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２７３記載のオ
リゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法で行なった。
（ａｄ－２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該制
限酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａｄ－３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現
ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ８ｂと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクター
のヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様の方法で行なった。
配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ８ｂにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
８ｂ（配列番号２７４）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。
実施例４５ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄアミノ酸置換集積体のアルカリ安定性評価
（１）実施例４２で取得したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ＿Ａ６９Ｖ（配列番号２４２）、
ならびに実施例４４で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ８ａ（配列番号２７１）およびＦｐＬ
＿Ｃ３ＫＸ９ｂ（配列番号２７４）のいずれかを発現する形質転換体を、実施例３（８）
から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）に記載の方法でタンパク質抽出液
を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し、清澄化した。
（２）（１）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（３）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（４）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表５に示す。ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ８ａ（配列番号２７１）およびＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ ８ｂ（配列番号２７４）は、天然型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性
が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｄ＿Ａ６９Ｖ（配列番号２４２）と比較しても、アルカ
リ安定性が向上しているといえる。
Figure 2023064059000032
実施例４６ 本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質への変異導入およびライブラリ
作製
配列番号２７５に記載のアミノ酸配列からなる本発明の免疫グロブリン結合性タンパク
質ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅをコードするポリヌクレオチド（配列番号２７６）に、実施例
２と同様の方法でエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入し、ライブラリを作
製した。平均変異導入率は１．０％であった。なおＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅは、天然型Ｆ
ｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）に対し、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、
Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ２９Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４
８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５２Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２Ｔｙｒ
、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結
合性タンパク質である。
実施例４７ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ｂアミノ酸置換体のスクリーニング
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅを発現可能な形質転換体および実施例４６で作製したラ
ンダム変異体ライブラリ（形質転換体）を、実施例３（１）から（２）と同様な方法で培
養後、遠心操作によって得られた培養上清に対し、実施例４１（２）に記載のアルカリ処
理を行なった。
（２）アルカリ処理を行なった時の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を
実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なった時の免疫グロ
ブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかった時の免疫グロブ
リン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。
（３）約１８００株の形質転換体を評価し、その中からＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ（配列
番号２７５）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発
現する形質転換体を選択した。
（４）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（５）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を
解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
（６）実施例４０で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ（配列番号２７５）を発現する形
質転換体または（４）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体
を、実施例３（８）から（１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）と同様な方法
でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに
通し、清澄化した。
（７）（６）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（８）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（９）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表３３に示す。配列番号２７５に記載のアミノ酸配列において、少なくともＴｈ
ｒ２Ａｌａ、Ｐｒｏ３Ａｒｇ、Ｇｌｕ５Ａｓｐ、Ｐｒｏ（Ｓｅｒ）６Ｌｅｕ、Ｐｒｏ（Ｓ
ｅｒ）６Ｔｈｒ、Ｌｙｓ（Ａｌａ）７Ｐｒｏ、Ｉｌｅ２３Ｖａｌ、Ｔｈｒ３１Ｍｅｔ、Ｇ
ｌｕ３３Ａｓｐ、Ｇｌｕ３３Ｇｌｙ、Ａｌａ３５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ３６Ｓｅｒ、Ａｌａ３７
Ｔｈｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｉｌｅ６６ＶａｌおよびＡｌａ（Ｖａｌ）６９Ｌｅｕより選
択される１以上のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然型のＦ
ｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ（配列
番号２７５）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure 2023064059000033
実施例４８ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅアミノ酸置換体の作製
側鎖の性質が異なるアミノ酸残基への置換、またはドメイン間でアミノ酸配列が異なる
位置における他のドメインのアミノ酸残基への置換を導入する方法で取得した、アルカリ
安定性が向上したアミノ酸置換である、Ｖａｌ１４Ａｌａ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｉｌｅ２
３Ｔｈｒ、Ａｌａ４１Ａｒｇ、Ａｓｎ４４Ａｓｐ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ
、Ｇｌｕ５２Ｔｙｒ、Ｇｌｙ６０ＡｒｇおよびＩｌｅ６４ＬｅｕのいずれかをＦｐＬ＿Ｃ
３ＫＸ ７ｅに対し集積した。
（１）鋳型ＤＮＡとしてＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ（配列番号２７５）をコードするポリ
ヌクレオチド（配列番号２７６）を含む発現ベクター（以下、「ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ ７ｅ」とも表記）を、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ ＰｒｉｍｅｒおよびＰＣＲ Ｒｅｖ
ｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒの組み合わせとして表３４の配列番号に記載の配列からなるオリ
ゴヌクレオチドの組み合わせを、それぞれ用いた他は実施例７（ａ－１）と同様な方法で
インバースＰＣＲを行なった。
Figure 2023064059000034
（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該
制限酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を実施例７（ａ－３）と同様な方法で培養および発現ベクタ
ーの抽出を行ない、当該発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を実施例１（５）と同様
の方法で行なった。結果、いずれの発現ベクターも（１）で得られたポリヌクレオチドが
挿入されていることを確認した。
実施例４９ ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅアミノ酸置換体のアルカリ安定性評価
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅおよび実施例４８で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅア
ミノ酸置換体（計１０種類）のいずれかを発現する形質転換体を、実施例３（８）から（
１０）と同様な方法で培養し、実施例３（１１）に記載の方法でタンパク質抽出液を調製
した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し、清澄化した。
（２）（１）で清澄化した上清を、参考例２（２）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。
（３）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。
（４）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、実施例３（１３）と同様な方法でアルカリ処理後、実施例３
（１４）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表３５に示す。本実施例で評価したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅアミノ酸置換体はい
ずれも天然型のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ８ｂ（配列番号２７５）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。
Figure 2023064059000035
実施例５０ 本発明のタンパク質の多量体化（その１）
本発明のタンパク質の一態様である、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ（配列番号２７５）の多
量体を、以下に示す方法で作製した。
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ多量体発現ベクターの作製
（１－１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ多量体として配列番号３２６に記載のアミノ酸配列
からなるポリペプチド（（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅ）４－ＩＴ－６Ｈ３Ｋと命名）を設計し
た。なお当該ポリペプチドはＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ（配列番号２７５）を４つ直結し、
かつそのＣ末端側に不溶性担体への固定化率を向上させるためのオリゴペプチド（ＷＯ２
０１７／０６９１５８号の配列番号３６の２９７番目から３１９番目までのアミノ酸配列
からなるオリゴペプチド、ＩＴ、配列番号３２４）、精製用タグであるヒスチジンタグ（
６Ｈ、配列番号３２５）、および不溶性担体への固定化率を向上させるためのリジン３残
基（３Ｋ、以下「リジンタグ」とも表記）を付加したポリペプチドである。
（１－２）（１－１）で設計した（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ）４－ＩＴ－６Ｈ３Ｋ（配
列番号３２６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３２７）を設計した。なお配列
番号３２７に記載の配列からなるポリヌクレオチドのうち、１番目から２１０番目まで、
２１１番目から４２０番目まで、４２１番目から６３０番目まで、および６３１番目から
８４０番目までが、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ（配列番号２７５）をコードするポリヌクレ
オチドであり、８４１番目から９０９番目までは配列番号３２４に記載のアミノ酸配列か
らなるオリゴペプチド（ＩＴ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号３２８）であり
、９１０番目から９２７番目まではヒスチジンタグ（６Ｈ、配列番号３２５）をコードす
るオリゴヌクレオチドであり、９２８番目から９３６番目まではリジンタグ（３Ｋ）をコ
ードするオリゴヌクレオチドであり、９３７番目から９３９番目は終止コドンである。ま
た配列番号３２７のうち、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ（配列番号２７５）をコードするポリ
ヌクレオチドの配列は原則配列番号２７６を用いているが、配列番号３２７の１８７番目
から２１０番目まで、４２１番目から４４４番目まで、および６０７番目から６３０番目
までは、クローニングのしやすさから、配列番号２７６とは異なるコドンを用いて配列番
号２７５から変換している。
（１－３）（１－２）で設計した、配列番号３２７に記載の配列からなるポリヌクレオ
チドを合成するためのプライマー（オリゴヌクレオチド）を設計し、合成した。具体的に
は、
ｐＥＴ２６ｂベクターのＮｃｏＩの制限酵素サイト（ＣＣＡＴＧＧ）および配列番号３２
７の１番目から２３１番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を作製するために配
列番号３２９および配列番号３３０に記載の配列からなるプライマーを、
配列番号３２７の１８７番目から４４４番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を
作製するために配列番号３３１および配列番号３３２に記載の配列からなるプライマーを
、
配列番号３２７の４２１番目から６３０番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を
作製するために配列番号３３３および配列番号３３４に記載の配列からなるプライマーを
、
配列番号３２７の６０７番目から８９４番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を
作製するために配列番号３３５および配列番号３３６に記載の配列からなるプライマーを
、
配列番号３２７の８７１番目から９３６番目までの配列からなるポリヌクレオチド断片を
作製するために配列番号３３７および配列番号３３８に記載の配列からなるプライマーを
、
インバースＰＣＲ法により配列番号３２７の９１６番目から９３６番目およびｐＥＴ２６
ｂベクターのＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイト（ＡＡＧＧＴＴ）下流とｐＥＴ２６ｂのＮ
ｃｏＩの制限酵素サイトおよびその上流を含むｐＥＴ２６ｂベクターを作製するために配
列番号３３９および配列番号３４０に記載の配列からなるプライマーを、
それぞれ設計し、合成した。
（１－４）表３６に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で１０秒間
の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、６８℃で４０秒間の第３ステップを１
サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。なお表３６におけ
る、鋳型ＤＮＡ／Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ／Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒの組み
合わせは、表３７の＜１＞から＜５＞に示す組み合わせのいずれかである。
Figure 2023064059000036
Figure 2023064059000037
（１－５）前記＜１＞から＜５＞の組み合わせを用い、それぞれ得られたＰＣＲ産物（
ポリヌクレオチド）計５種類を精製後、各ポリヌクレオチドを０．０５ｐｍｏｌずつ含む
ＴＥ緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液）（ｐＨ８．０）を調製
した。さらに配列番号３３７および配列番号３３８に記載の配列からなるポリヌクレオチ
ドを０．０５ｐｍｏｌずつ添加後、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍ
ｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用いたギブ
ソンアッセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）反応により、これらポリヌクレオ
チドを連結させた。
（１－６）（１－５）の反応後の連結産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質
転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時
間）した。
（１－７）表３８に示す組成からなる反応液を調製後、（１－６）で得られた形質転換
体を添加し、（１－４）と同条件でコロニーＰＣＲを行なった。コロニーＰＣＲの結果、
１０００から１２００塩基対程度のＰＣＲ産物の増幅が確認できた形質転換体（遺伝子組
換え大腸菌）を選択し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩ
Ａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）による精製によ
り、免疫グロブリン結合性タンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ）４－ＩＴ－６Ｈ３Ｋ（
配列番号３２６）を発現可能なベクター（ｐＥＴ－（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ）４－ＩＴ
－６Ｈ３Ｋと命名）を取得した。
Figure 2023064059000038
（１－８）（１－７）で取得した発現ベクターｐＥＴ－（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ）４
－ＩＴ－６Ｈ３Ｋについて実施例１（５）と同様な方法でヌクレオチド配列を解析した。
配列解析の結果、前記発現ベクターに、配列番号３２７に記載の配列からなるポリヌクレ
オチドが挿入されていることを確認した。
（２）（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ）４－ＩＴ－６Ｈ３Ｋの調製
（２－１）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地（トリプトン１．６
％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ））２０ｍ
Ｌに、（１）で作製したｐＥＴ－（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ）４－ＩＴ－６Ｈ３Ｋを含む
遺伝子組換え大腸菌を接種し、前培養した（３０℃、１６時間）。
（２－２）前培養後の培養液１０ｍＬを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ
液体培地１Ｌに接種し３７℃で２時間から３時間培養後、０．５ＭのＩＰＴＧを２００μ
Ｌ添加し、さらに２０℃で終夜振とう培養した。
（２－３）培養後の培養液を遠心分離し、培養菌体を回収した（湿重量で８ｇ）。当該
培養菌体のうち湿重量で２ｇをＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉ
ｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（メルクミリポア社製）を用いて溶菌し、遠心分離により取得した
上清をフィルターに通し、清澄化した。
（２－４）あらかじめ０．５Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０２Ｍのイミダゾールを含
む０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、単に「平衡化液」とも表記）で平
衡化したＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ社製）を充
填したカラムに、（２－３）で清澄化した上清を添加し、前記カラムに充填した担体の１
０倍量の平衡化液で洗浄後、０．５Ｍの塩化ナトリウムおよび０．５Ｍのイミダゾールを
含む０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）を通液し、免疫グロブリン結合性タンパ
ク質に相当する画分を回収した。
（２－５）回収した画分の吸光度を分光光度計により測定し、当該画分に含まれるタン
パク質量を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、免疫グロブリン結合性タンパク質
が純度よく精製されていることを確認した。
実施例５１ 本発明のタンパク質の多量体化（その２）
本発明のタンパク質の別の態様である、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃ（配列番号３４１）の
多量体を、以下に示す方法で作製した。なおＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃのアミノ酸配列（配
列番号３４１）はＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅのアミノ酸配列（配列番号２７５）の５０番目
にあるチロシン残基を天然型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）のアミノ酸残基であるアスパラ
ギン残基に戻したアミノ酸配列である。
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃ多量体として配列番号３４３に記載のアミノ酸配列から
なるポリペプチド（（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃ）４－ＩＴ－６Ｈ３Ｋと命名）を設計した
。なお当該ポリペプチドはＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃ（配列番号３４１）を４つ直結し、か
つそのＣ末端側に不溶性担体への固定化率を向上させるためのオリゴペプチド（ＩＴ、配
列番号３２４）、精製用タグであるヒスチジンタグ（６Ｈ、配列番号３２５）、および不
溶性担体への固定化率を向上させるためのリジンタグ（３Ｋ）を付加したポリペプチドで
ある。
（２）実施例５０（１－２）と同様な方法で、（１）で設計した配列番号３４３に記載
のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計した（配列番
号３４４）。なおＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃ（配列番号３４１）をコードするポリヌクレオ
チドの配列は、原則配列番号３４２を用いている。
（３）鋳型ＤＮＡ／Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ／Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒの
組み合わせとして、表３９の＜５＞から＜９＞に示す組み合わせのいずれかを用いた他は
、実施例５０（１－４）と同様の方法でＰＣＲを実施した。
Figure 2023064059000039
（５）前記＜５＞から＜９＞の組み合わせを用い、それぞれ得られたＰＣＲ産物（ポリ
ヌクレオチド）５種類を精製後、実施例５０（１－５）と同様の方法でギブソンアッセン
ブリ反応を行ない、これらポリヌクレオチドの連結を行なった。
（６）（５）の反応後の連結産物を用いて実施例５０（１－６）と同様な方法で大腸菌
を形質転換し培養した。
（７）実施例５０（１－７）と同様な方法でコロニーＰＣＲ後、実施例５０（１－８）
と同様な方法で形質転換体の選択、当該選択した形質転換体の培養およびプラスミド抽出
を行ない、免疫グロブリン結合性タンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃ）４－ＩＴ－６Ｈ
３Ｋ（配列番号３４３）を発現可能なベクター（ｐＥＴ－（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃ）４
－ＩＴ－６Ｈ３Ｋと命名）を取得した。
（８）（７）で取得した発現ベクターｐＥＴ－（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃ）４－ＩＴ－
６Ｈ３Ｋについて実施例１（５）と同様な方法でヌクレオチド配列を解析した。配列解析
の結果、前記発現ベクターに、配列番号３４４に記載の配列からなるポリヌクレオチドが
挿入されていることを確認した。
実施例５２ 免疫グロブリン吸着剤の作製
（１）実施例５０で調製した（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ）４－ＩＴ－６Ｈ３Ｋ（配列番
号３２６）（配列番号３２６）を含む画分または実施例５１で調製した（ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ ６ｃ）４－ＩＴ－６Ｈ３Ｋ（配列番号３４３）を含む画分を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔ
ｒａ（メルクミリポア社製）により元の体積の１０分の１量まで濃縮後、当該濃縮溶液の
１０倍量のリン酸ナトリウム緩衝液を加えてＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（メルクミリポア
社製）により元の体積の１０分の１量まで濃縮することで、前記タンパク質溶液の濃縮お
よび緩衝液置換を行なった。
（２）活性基としてホルミル基を有した不溶性担体である、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＡＦ
－Ｆｏｒｍｙｌ－６５０（東ソー社製）を純水に置換後、５０％（ｖ／ｖ）スラリーを調
製した。調製した５０％（ｖ／ｖ）スラリーを、ミニバイオスピンカラム（ＢＩＯＲＡＤ
社製）に１００μＬ添加した。
（３）実施例５０で調製した（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ）４－ＩＴ－６Ｈ３Ｋの濃縮液
または実施例５１で調製した（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃ）４－ＩＴ－６Ｈ３Ｋ（配列番号
３４３）の濃縮液を、終濃度が１０ｇ／Ｌとなるよう、不溶性担体を添加したミニバイオ
スピンカラム（ＢＩＯＲＡＤ社製）に添加後、２５℃で振とうすることで、当該カラム内
に入っている不溶性担体とタンパク質とをシッフ塩基（Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ）形成に
より結合した。
（４）１Ｍ水素化ホウ素ナトリウム水溶液を適量加え、室温で２時間振とうすることで
、残存シッフ塩基を還元し、免疫グロブリン吸着剤を作製した。作製した吸着剤は水洗後
、２０％（ｖ／ｖ）エタノールに置換し保存した。
実施例５３ 免疫グロブリン吸着剤のアルカリ安定性評価
（１）実施例５２で作製した、免疫グロブリン吸着剤を充填したカラムに、０．１Ｍグ
リシン塩酸溶液（ｐＨ２．０）（以下、酸性溶液とも表記）を通液後、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、「洗浄緩衝液Ｃ」と
も表記）を通液することで、前記カラムを洗浄した。
（２）洗浄緩衝液Ｃで６０ｍｇ／ｍＬに希釈した免疫グロブリン溶液（日本血液製剤機
構社製）を洗浄後の前記カラムに添加後、恒温振とう培養機（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用い
て２５℃、１０００ｒｐｍで２時間振とうすることで、免疫グロブリンを不溶性担体に吸
着させた。
（３）洗浄緩衝液Ｃを通液することで未吸着の免疫グロブリンを洗浄後、酸性溶液を通
液し、吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させた。溶出液の吸光度（波長２８０ｎｍ
）を分光光度計で測定し、当該溶出液に含まれる免疫グロブリンの量から、吸着剤の静的
吸着量を算出した。
（４）洗浄緩衝液Ｃを通液し免疫グロブリン吸着剤を平衡化後、０．５Ｍの水酸化ナト
リウム溶液を通液し、２５℃で１７時間静置することでアルカリ処理を行なった。アルカ
リ処理後の免疫グロブリン吸着剤は洗浄緩衝液Ｃを通液し中和させた。
（５）（２）および（３）と同様の方法で吸着剤の静的吸着量を算出し、アルカリ処理
前後の吸着量の割合（残存活性）を算出しアルカリ安定性を評価した。
結果を表４０に示す。多量体を構成する本発明のタンパク質をＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ
（配列番号２７５）からＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃ（配列番号３４１）に替えるとアルカリ
安定性が大きく低下した（（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅ）４－ＩＴ－６Ｈ３Ｋ（配列番号３２
６）：６６％、（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃ）４－ＩＴ－６Ｈ３Ｋ（配列番号３４３）：１
５％）。ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅとＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃとのアミノ酸配列の違いは、
５０番目の位置のみ（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ７ｅ：チロシン残基、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ ６ｃ
：アスパラギン残基（天然型ＦｐＬ＿Ｃ３と同じ））であることから、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ
のアミノ酸置換がアルカリ安定性の向上に特に貢献していることがわかる。
Figure 2023064059000040

Claims (15)

  1. Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌの免疫グロブリン結合ドメインの
    アミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも以下の（１）から（
    ５３）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有
    するタンパク質：
    （１）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
    （２）配列番号１の１番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたはバリ
    ンに置換
    （３）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
    （４）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンまたはグリシ
    ンに置換
    （５）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
    （６）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
    （７）配列番号１の８番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
    （８）配列番号１の９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
    （９）配列番号１の１７番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン
    に置換
    （１０）配列番号１の２１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
    （１１）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたは
    アルギニンに置換
    （１２）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置換
    （１３）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
    （１４）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
    （１５）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
    （１６）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンまたはグ
    リシンに置換
    （１７）配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がスレオニンまた
    はイソロイシンに置換
    （１８）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリン、リジン
    およびアスパラギン酸のいずれかに置換
    （１９）配列番号１の５１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
    （２０）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、グリシ
    ンおよびアスパラギン酸のいずれかに置換
    （２１）配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに
    置換
    （２２）配列番号１の５４番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンまた
    はメチオニンに置換
    （２３）配列番号１の６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジン、ア
    ルギニン、ロイシン、メチオニンおよびトリプトファンのいずれかに置換
    （２４）配列番号１の６５番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
    （２５）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
    （２６）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンまたはプロリ
    ンに置換
    （２７）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
    （２８）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンまたはアル
    ギニンに置換
    （２９）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、リジン
    およびイソロイシンのいずれかに置換
    （３０）配列番号１の３２番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシンに
    置換
    （３１）配列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
    （３２）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに
    置換、
    （３３）配列番号１の４７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンまたはア
    ルギニンに置換
    （３４）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギンに
    置換
    （３５）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
    （３６）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に
    置換
    （３７）配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはスレオ
    ニンに置換
    （３８）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置換
    （３９）配列番号１の１４番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
    （４０）配列番号１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンまた
    はバリンに置換
    （４１）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置
    換
    （４２）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに置換
    （４３）配列番号１の３３番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸
    、グリシンおよびバリンのいずれかに置換
    （４４）配列番号１の３５番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
    （４５）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
    （４６）配列番号１の３７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
    （４７）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンまたは
    チロシンに置換
    （４８）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンまた
    はアルギニンに置換
    （４９）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がロイシンまたは
    チロシンに置換
    （５０）配列番号１の６０番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
    （５１）配列番号１の６４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
    （５２）配列番号１の６６番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
    （５３）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはバリ
    ンに置換。
  2. 以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、請求項１に記載のタン
    パク質：
    （ａ）配列番号１または１８に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列にお
    いて、少なくとも以下の（１）から（５３）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有
    し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質：
    （１）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
    （２）配列番号１の１番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたはバリ
    ンに置換
    （３）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
    （４）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンまたはグリシ
    ンに置換
    （５）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
    （６）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
    （７）配列番号１の８番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
    （８）配列番号１の９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
    （９）配列番号１の１７番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン
    に置換
    （１０）配列番号１の２１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
    （１１）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたは
    アルギニンに置換
    （１２）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置換
    （１３）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
    （１４）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
    （１５）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
    （１６）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンまたはグ
    リシンに置換
    （１７）配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がスレオニンまた
    はイソロイシンに置換
    （１８）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリン、リジン
    およびアスパラギン酸のいずれかに置換
    （１９）配列番号１の５１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
    （２０）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、グリシ
    ンおよびアスパラギン酸のいずれかに置換
    （２１）配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに
    置換
    （２２）配列番号１の５４番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンまた
    はメチオニンに置換
    （２３）配列番号１の６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジン、ア
    ルギニン、ロイシン、メチオニンおよびトリプトファンのいずれかに置換
    （２４）配列番号１の６５番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
    （２５）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
    （２６）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンまたはプロリ
    ンに置換
    （２７）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
    （２８）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンまたはアル
    ギニンに置換
    （２９）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、リジン
    およびイソロイシンのいずれかに置換
    （３０）配列番号１の３２番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシンに
    置換
    （３１）配列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
    （３２）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンに
    置換、
    （３３）配列番号１の４７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンまたはア
    ルギニンに置換
    （３４）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギンに
    置換
    （３５）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
    （３６）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸に
    置換
    （３７）配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはスレオ
    ニンに置換
    （３８）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置換
    （３９）配列番号１の１４番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
    （４０）配列番号１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンまた
    はバリンに置換
    （４１）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置
    換
    （４２）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに置換
    （４３）配列番号１の３３番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸
    、グリシンおよびバリンのいずれかに置換
    （４４）配列番号１の３５番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
    （４５）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
    （４６）配列番号１の３７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
    （４７）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシンまたは
    チロシンに置換
    （４８）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンまた
    はアルギニンに置換
    （４９）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がロイシンまたは
    チロシンに置換
    （５０）配列番号１の６０番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
    （５１）配列番号１の６４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
    （５２）配列番号１の６６番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
    （５３）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはバリ
    ンに置換；
    （ｂ）配列番号１または１８に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列にお
    いて、少なくとも前記（１）から（５３）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し
    、さらに前記（１）から（５３）以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミ
    ノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性
    を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号１または１８に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相
    同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも前記（
    １）から（５３）より選択される１以上のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合
    活性を有するタンパク質。
  3. 以下の（ｄ）から（ｆ）のいずれかに記載のタンパク質である、請求項２に記載のタン
    パク質：
    （ｄ）配列番号１または１８に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列にお
    いて、少なくとも以下の（１）のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有
    するタンパク質
    （１）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換；
    （ｅ）配列番号１または１８に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列にお
    いて、少なくとも前記（１）のアミノ酸置換を有し、さらに前記アミノ酸置換以外の１も
    しくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／また
    は付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質；
    （ｆ）配列番号１または１８に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相
    同性を有するアミノ酸配列を含み、ただし少なくとも前記（１）のアミノ酸置換を有し、
    かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質。
  4. さらに、少なくとも以下の（Ｉ）から（ＶＩＩ）より選択される１つ以上のリジン残基
    がリジン以外の塩基性アミノ酸またはヒドロキシ基を有するアミノ酸残基に置換した、請
    求項１に記載のタンパク質：
    （Ｉ）配列番号１の７番目に相当するリジン残基
    （ＩＩ）配列番号１の１３番目に相当するリジン残基
    （ＩＩＩ）配列番号１の２２番目に相当するリジン残基
    （ＩＶ）配列番号１の２９番目に相当するリジン残基
    （Ｖ）配列番号１の３８番目に相当するリジン残基
    （ＶＩ）配列番号１の４８番目に相当するリジン残基
    （ＶＩＩ）配列番号１の６７番目に相当するリジン残基。
  5. さらに、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン
    酸への置換、配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、
    配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換
    、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のバリンへの置換、配列
    番号１の６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置換、配列番号
    １の２３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、および
    配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換
    より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１に記載のタンパク質。
  6. 少なくとも以下の（Ｗ）、（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）、（ＡＡ）、（ＡＢ）および（ＡＣ
    ）のいずれかのアミノ酸置換を有する、請求項３に記載のタンパク質：
    （Ｗ）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番
    号１の１３番目、３８番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残基の
    アルギニンへの置換、配列番号１の２２番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミ
    ンへの置換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンへの
    置換、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸へ
    の置換、配列番号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基の
    チロシンへの置換、ならびに配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残
    基のグリシンへの置換；
    （Ｘ）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番
    号１の１３番目、２２番目、３８番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミ
    ノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基
    のイソロイシンへの置換、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基
    のアスパラギン酸への置換、配列番号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当
    するアミノ酸残基のチロシンへの置換、配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当する
    アミノ酸残基のグリシンへの置換、ならびに配列番号１の５３番目のチロシンに相当する
    アミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換；
    （Ｙ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換、
    配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の
    １３番目、２２番目、３８番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残
    基のアルギニンへの置換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソ
    ロイシンへの置換、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアス
    パラギン酸への置換、配列番号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するア
    ミノ酸残基のチロシンへの置換、配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ
    酸残基のアスパラギン酸への置換、ならびに配列番号１の５３番目のチロシンに相当する
    アミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換；
    （Ｚ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換、
    配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の
    １３番目、２２番目、３８番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残
    基のアルギニンへの置換、配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基
    のアルギニンへの置換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロ
    イシンへの置換、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパ
    ラギン酸への置換、配列番号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するアミ
    ノ酸残基のチロシンへの置換、配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸
    残基のアスパラギン酸への置換、ならびに配列番号１の５３番目のチロシンに相当するア
    ミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換；
    （ＡＡ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換
    、配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、配列番号１
    の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の１３番目、
    ２２番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置
    換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンへの置換、配
    列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号
    １の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、配列番
    号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置
    換、配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への
    置換、ならびに配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基のフェニルアラ
    ニンへの置換；
    （ＡＢ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換
    、配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、配列番号１
    の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の１３番目、
    ２２番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置
    換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンへの置換、配
    列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号
    １の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、配列番
    号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置
    換、配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のバリンへの置換、配
    列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換なら
    びに配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換；
    （ＡＣ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換
    、配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、配列番号１
    の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の１３番目、
    ２２番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置
    換、配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンへの置換、配
    列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号
    １の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、配列番
    号１の５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置
    換、配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置
    換ならびに配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換。
  7. 配列番号１７９、１８６、１９９、２２４、２４０、２７１および２７５のいずれかに
    記載のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のタンパク質。
  8. 請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  9. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  10. 以下の（Ａ）または（Ｂ）を含む、遺伝子組換え宿主：
    （Ａ）請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    ；
    （Ｂ）請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    を含む発現ベクター。
  11. 宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１０
    に記載の遺伝子組換え宿主。
  12. 請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含
    む遺伝子組換え宿主または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む遺伝子組換え宿
    主を培養し該タンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程と
    を含む、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質の製造方法。
  13. 宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１２
    に記載の製造方法。
  14. 不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した請求項１から７のいずれか１項に記載のタ
    ンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤。
  15. 請求項１４に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該
    免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリン
    を溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。
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