WO2019163919A1 - 酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤 - Google Patents

酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤 Download PDF

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陽介 寺尾
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Definitions

  • the present invention relates to an Fc-binding protein having binding affinity for immunoglobulin G (IgG). More specifically, the present invention relates to an Fc having improved acid stability compared to natural human Fc ⁇ receptor IIa by substituting or deleting an amino acid residue at a specific position of human Fc ⁇ receptor IIa with another amino acid residue.
  • the present invention relates to a binding protein, a method for producing the protein, and an antibody adsorbent obtained by immobilizing the protein on an insoluble carrier.
  • the Fc receptor is a receptor protein that binds to the Fc region of an immunoglobulin molecule, and binds to an immune complex of an antigen and an immunoglobulin to signal inside the cell (Non-patent Document 1).
  • Fc ⁇ receptors (Fc ⁇ R) that bind to particularly important immunoglobulin G (IgG) are Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RIIa (CD32a), Fc ⁇ RIIb (CD32b), Fc ⁇ RIIc (CD32c), Fc ⁇ RIIIa (CD16a) and Fc ⁇ RIIIb (CD16b) It can be classified into types (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • the binding between the IgG immune complex and Fc ⁇ R occurs when Fc ⁇ R binds to the Fc region of IgG.
  • Each Fc ⁇ R molecular species has an Fc region recognition domain of IgG and recognizes a single species or IgG belonging to the same subtype. This determines which accessory cells are mobilized in each immune response (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Fc ⁇ RIIa exists on the surface of cells such as macrophages and neutrophils, and is involved in ADCC (antibody-dependent cell phagocytosis) activity, which is important in human immune mechanisms (Non-patent Document 3).
  • the amino acid sequence of human Fc ⁇ RIIa (SEQ ID NO: 1) is registered in a public database such as UniProt (Accession Number: P12318).
  • the structural functional domain of human Fc ⁇ RIIa, the signal peptide sequence for penetrating the cell membrane, and the position of the cell membrane penetrating region are also published.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the structure of human Fc ⁇ RIIa. The amino acid numbers in FIG.
  • S the signal sequence (S) from the first methionine to the 33rd serine in SEQ ID NO: 1, the extracellular region (EC) from the 34th glutamine to the 217th glycine, the 240th to the 240th isoleucine.
  • the region up to tyrosine is the transmembrane region (TM) and the region from 241st cysteine to 317th asparagine is the intracellular region (C).
  • Fc ⁇ RIIa In order to industrially apply Fc ⁇ RIIa, it is preferable that it has high acid stability from the viewpoint of use and storage. However, there has been no attempt to improve the stability of human Fc ⁇ RIIa to acids.
  • An object of the present invention is to provide an Fc-binding protein having improved acid stability relative to natural human Fc ⁇ RIIa, a method for producing the protein, and an antibody adsorbent using the protein.
  • the present inventors have identified an amino acid residue involved in improving acid stability in human Fc ⁇ RIIa and substituted or deleted the amino acid residue with another amino acid residue. It was found that the lost mutant had excellent stability to acids, and the present invention was completed.
  • Fc-binding protein selected from the following (I) to (IV):
  • the (1 ) To (12) at least one of the amino acid substitutions or deletions shown in (1) to (12), and in addition to the amino acid substitutions or deletions shown in (1) to (12), Or an Fc-binding protein further having any one or more of substitution, deletion, insertion and addition of several amino acid residues and having antibody binding activity;
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 contains at least amino acid residues from the 29th glutamine to the 201st glutamine, but 70% or more of the amino acid sequence from the 29th to the 201st amino acid sequence
  • the Fc-binding protein according to any one of [1] to [3], which is selected from the following (vii) to (ix): (Vii) an Fc-binding protein comprising at least amino acid residues from the 29th glutamine to the 200th glutamine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 35; (Viii) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 contains at least amino acid residues from the 29th glutamine to the 200th glutamine, provided that in the 29th to 200th amino acid residues, the amino acid sequence is In addition to amino acid substitutions and deletions having one or more of any one or more of substitution, deletion, insertion and addition of one or several amino acid residues at one or several positions, and antibody binding activity
  • An Fc binding protein having: (Ix) At least amino acid residues from the 29th glutamine to the 200th glutamine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 35, but
  • the Fc-binding protein according to any one of [1] to [3], selected from the following (x) to (xii): (X) an Fc-binding protein comprising at least amino acid residues from the 29th glutamine to the 196th glutamine of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43; (Xi) Of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43, it comprises at least amino acid residues from the 29th glutamine to the 196th glutamine, provided that in the 29th to 196th amino acid residues, the amino acid sequence is In addition to amino acid substitutions and deletions having one or more of any one or more of substitution, deletion, insertion and addition of one or several amino acid residues at one or several positions, and antibody binding activity An Fc binding protein having: (Xii) at least amino acid residues from the 29th glutamine to the 196th glutamine of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43, but 70% or more of the amino acid sequence from the 29th to the 196th amino acid
  • [7] A polynucleotide encoding the Fc-binding protein according to any one of [1] to [6].
  • [8] An expression vector comprising the polynucleotide according to [7].
  • [9] A transformant capable of producing an Fc-binding protein obtained by transforming a host with the recombinant vector according to [8].
  • a method for producing an Fc-binding protein is
  • [12] An antibody adsorbent obtained by immobilizing the Fc-binding protein according to any one of [1] to [6] on an insoluble carrier. [13] A step of adding a solution containing an antibody to the column packed with the adsorbent according to [12] to adsorb the antibody to the adsorbent, and eluting the antibody adsorbed on the adsorbent using an eluent And separating the antibody.
  • the Fc-binding protein of the present invention is a protein having a binding property to an Fc region of an antibody, and is at least 29th of a polypeptide containing an extracellular region of a natural human Fc ⁇ RIIa consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the 1st to 26th sequences are the sequence of the MalE signal peptide (oligopeptide consisting of the first to 26th amino acid residues of UniProt No.
  • the 27th methionine and the 28th Glycine is a linker sequence
  • the 29th to 201st are the extracellular region of Fc ⁇ RIIa (ie, the region from 34th to 206th of SEQ ID NO: 1)
  • the 202nd to 203rd are glycine linkers, from the 204th
  • the 209th is a histidine tag. Therefore, the Fc-binding protein of the present invention may include all or part of the signal peptide region on the N-terminal side of the extracellular region, or the transmembrane region and extracellular region on the C-terminal side of the extracellular region. May be included in whole or in part.
  • the amino acid substitution or deletion at the specific position is specifically Pro42Gln (this notation indicates that the 42nd proline of SEQ ID NO: 2 (47th in SEQ ID NO: 1) is substituted with glutamine, and the same shall apply hereinafter) , Pro63Leu, Asn75Ser, Leu163His, Asp179Val, Leu190Ser, Ile198Val, Ile45Thr, Gln69Leu, Pro83Leu, Thr123Pro, and Ser62.
  • Leu190Ser is an amino acid substitution with particularly improved acid stability, and thus an Fc-binding protein containing at least the amino acid substitution of Leu190Ser can be said to be a preferred embodiment of the Fc-binding protein of the present invention.
  • the Fc-binding protein of the present invention only needs to have at least one or more amino acid substitutions or deletions at the specific positions described above, and in addition to the amino acid substitutions at the specific positions described above, as long as it has antibody binding activity, Any one or more of residue substitution, deletion, insertion and addition may be further included.
  • Specific examples of the embodiment include Fc-binding proteins having antibody binding activity shown in the following (i) to (v). When amino acid residues are deleted, it is preferable to delete the amino acid residues so that the loop region in the protein secondary structure is removed (Manandez-Alias and P. Argos, J. Mol. Biol.,). 206, 1989).
  • an Fc binding protein further comprising amino acid substitutions of Ile68Val, His80Gln, Ser84Thr, Asn90Thr, Asn91Ser and His125Arg in addition to the amino acid substitutions and / or deletions at the specific positions described above
  • Fc binding protein further having any one or more of substitution, deletion, insertion and addition of one or several amino acid residues at one or several positions in addition to the deletion (iii) )
  • amino acid substitutions and / or deletions at the specific positions described above and amino acid substitutions of Ile68Val, His80Gln, Ser84Thr, Asn90Thr, Asn91Ser and His125Arg one at one or several positions
  • Fc-binding protein iv) further having any one or more of substitution, deletion, insertion and addition of several amino acid residues (iv) having amino acid substitution and / or deletion at the specific position described above
  • An Fc-binding protein having an amino acid sequence having 70% or more homology to the amino acid sequence of the polypeptide and
  • the Fc-binding protein of the present invention having at least one amino acid substitution at the specific position described above further has the six amino acid substitutions (Ile68Val, His80Gln, Ser84Thr, Asn90Thr, Asn91Ser, and His125Arg), As a result, an Fc-binding protein having improved acid stability as compared to natural Fc ⁇ RIIa, and improved heat stability and productivity by a genetic recombinant is obtained.
  • “one or several” differs depending on the position of amino acid residues and the type of amino acid residues in the three-dimensional structure of the protein. For example, 1 to 50, 1 to 40 1 to 30, 1 to 20, or 1 to 10.
  • “any one or more of substitution, deletion, insertion and addition” described in (ii) and (iii) above is a natural one based on individual differences, species differences, etc. of the microorganism from which the gene is derived. Also included are mutations that can occur (mutant or variant).
  • the homology of the amino acid sequences in the above (iv) and (v) may be 70% or more, and has a higher homology (for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more or 95% or more) May be.
  • the Fc-binding protein of the present invention may further have a conservative substitution that substitutes between amino acids in which both amino acids have similar physical properties and / or chemical properties.
  • Conservative substitutions are not limited to Fc-binding proteins, and are generally known to those skilled in the art to maintain protein function between those with substitutions and those without substitutions. Examples of conservative substitutions include substitutions that occur between glycine and alanine, between aspartic acid and glutamic acid, between serine and proline, or between glutamic acid and alanine (protein structure and function, Medical Science International, 9 2005).
  • the Fc-binding protein of the present invention may further be added with an oligopeptide useful for separation from a solution in the presence of a contaminant substance on the N-terminal side or C-terminal side.
  • the oligopeptide include polyhistidine, polylysine, polyarginine, polyglutamic acid, polyaspartic acid and the like.
  • an oligopeptide containing cysteine useful for immobilizing the Fc-binding protein of the present invention on a solid phase such as a support for chromatography is used as an N-terminal side or C-terminal side of the Fc-binding protein of the present invention. It may be further added to.
  • the length of the oligopeptide added to the N-terminal side or C-terminal side of the Fc binding protein is not particularly limited as long as the IgG binding property and stability of the Fc binding protein of the present invention are not impaired.
  • a polynucleotide encoding the oligopeptide is prepared, and then the N-terminus of the Fc-binding protein is genetically engineered using a method well known to those skilled in the art.
  • the oligopeptide synthesized chemically may be added to the N-terminal side or the C-terminal side of the Fc-binding protein of the present invention.
  • a signal peptide for promoting efficient expression in the host may be added to the N-terminal side of the Fc binding protein of the present invention.
  • Examples of the signal peptide in the case where the host is Escherichia coli include PelB, DsbA, MalE (uniprot No. P0AEX9 amino acid sequence from the first to the 26th region), and the periplasm such as TorT.
  • An example is a signal peptide (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-097898).
  • a preferred embodiment of the Fc binding protein of the present invention includes an Fc binding protein containing at least a polypeptide having the amino acid sequence shown in the following (a) to (i). These Fc-binding proteins are preferable in terms of improving acid stability (acid resistance).
  • (A) Fc ⁇ RIIa-m7 (29th to 201st amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5) Of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, the amino acid residues from the 29th glutamine to the 201st glutamine, provided that in the 29th to 201st amino acid residues, Ile68Val, His80Gln, Ser84Thr, Asn90Thr, A polypeptide having the amino acid substitutions Asn91Ser, His125Arg and Leu190Ser.
  • (B) Fc ⁇ RIIa-m1 (29th to 201st amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7) Among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2, the amino acid residues from the 29th glutamine to the 201st glutamine, provided that the 29th to 201st amino acid residues have a Leu190Ser amino acid substitution. peptide.
  • (C) Fc ⁇ RIIa-m8B (29th to 201st amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13) Of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, the amino acid residues from the 29th glutamine to the 201st glutamine, provided that in the 29th to 201st amino acid residues, Ile68Val, Gln69Leu, His80Gln, Ser84Thr, A polypeptide having the amino acid substitutions Asn90Thr, Asn91Ser, His125Arg and Leu190Ser.
  • (D) Fc ⁇ RIIa-m8D (amino acid residues from the 29th position to the 201st position in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17)
  • the amino acid residues from the 29th glutamine to the 201st glutamine provided that in the 29th to 201st amino acid residues, Ile68Val, His80Gln, Ser84Thr, Asn90Thr, A polypeptide having an amino acid substitution of Asn91Ser, Thr123Pro, His125Arg and Leu190Ser.
  • (E) Fc ⁇ RIIa-m10A (29th to 201st amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19) Of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, the amino acid residues from the 29th glutamine to the 201st glutamine, provided that in the 29th to 201st amino acid residues, Ile45Thr, Ile68Val, Gln69Leu, His80Gln, A polypeptide having an amino acid substitution of Ser84Thr, Asn90Thr, Asn91Ser, Thr123Pro, His125Arg and Leu190Ser.
  • (F) Fc ⁇ RIIa-m10C (amino acid residues from the 29th position to the 201st position in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 23)
  • the amino acid residues from the 29th glutamine to the 201st glutamine provided that in the 29th to 201st amino acid residues, Ile68Val, Gln69Leu, His80Gln, Pro83Leu, A polypeptide having an amino acid substitution of Ser84Thr, Asn90Thr, Asn91Ser, Thr123Pro, His125Arg and Leu190Ser.
  • (G) Fc ⁇ RIIa-m11 (amino acid residues from the 29th position to the 201st position in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25)
  • the amino acid residues from the 29th glutamine to the 201st glutamine provided that in the 29th to 201st amino acid residues, Ile45Thr, Ile68Val, Gln69Leu, His80Gln, A polypeptide having an amino acid substitution of Pro83Leu, Ser84Thr, Asn90Thr, Asn91Ser, Thr123Pro, His125Arg and Leu190Ser.
  • (H) Fc ⁇ RIIa-m11-Del1 (amino acid residues from the 29th position to the 200th position in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 35)
  • the amino acid residues from the 29th glutamine to the 200th glutamine provided that in the 29th to 200th amino acid residues, Ile45Thr, Ile68Val, Gln69Leu, His80Gln, A polypeptide having an amino acid substitution of Pro83Leu, Ser84Thr, Asn90Thr, Asn91Ser, Thr123Pro, His125Arg and Leu190Ser and a deletion of Ser62.
  • the 1st methionine to the 26th alanine are MalE signal peptides
  • the glycine is the linker sequence
  • the 29th glutamine to 201st glutamine can bind to the Fc region of the antibody (Fc ⁇ RIIa-m7 (SEQ ID NO: 5), Fc ⁇ RIIa-m1 (SEQ ID NO: 7), Fc ⁇ RIIa) -M8b (SEQ ID NO: 13), Fc ⁇ RIIa-m8d (SEQ ID NO: 17), Fc ⁇ RIIa-m10a (SEQ ID NO: 19), Fc ⁇ RIIa-m10c (SEQ ID NO: 23) or Fc ⁇ RIIa-m11 (SEQ ID NO: 25)) 202nd and 203rd glycine
  • histidine from 204 th to 209 th are tag sequence.
  • the first methionine to the 26th alanine are MalE signal peptides
  • the 27th methionine and the 28th glycine are linker sequences
  • the 29th The amino acid sequence of the polypeptide (Fc ⁇ RIIa-m11-Del1) capable of binding to the Fc region of the antibody from glutamine to the 200th glutamine is the linker sequence
  • the 201st and 202nd glycines are the linker sequences
  • from the 203rd to the 208th The histidine is a tag sequence.
  • the first methionine to the 26th alanine are MalE signal peptides
  • the 27th methionine and the 28th glycine are linker sequences
  • the 29th The amino acid sequence of the polypeptide (Fc ⁇ RIIa-m11-Del5) that can bind to the Fc region of the antibody is from glutamine to the 196th glutamine
  • the 197th and 198th glycines are linker sequences
  • the histidine is a tag sequence.
  • a method for producing a polynucleotide encoding the Fc-binding protein of the present invention (hereinafter also simply referred to as the polynucleotide of the present invention)
  • (2) A polynucleotide containing the whole or a partial sequence of an Fc-binding protein is prepared artificially or from a cDNA of an Fc-binding protein using a DNA amplification method such as PCR, and the prepared polynucleotide is appropriately used.
  • the method of connecting by various methods can be illustrated.
  • the method (1) when converting from an amino acid sequence to a nucleotide sequence, it is preferable to perform conversion in consideration of the frequency of codon usage in the host to be transformed.
  • the host is Escherichia coli
  • AGA / AGG / CGG / CGA is used for arginine (Arg)
  • ATA is used for isoleucine (Ile)
  • CTA is used for leucine (Leu)
  • GGA is used for glycine (Gly).
  • CCC is less frequently used in proline (Pro) (because it is a so-called rare codon)
  • the analysis of codon usage frequency can also be performed using a public database (for example, Codon Usage Database on the website of Kazusa DNA Research Institute).
  • an error-prone PCR method can be used.
  • the reaction conditions in the error-prone PCR method are not particularly limited as long as a desired mutation can be introduced into a polynucleotide encoding human Fc ⁇ RIIa (or Fc-binding protein).
  • four types of deoxynucleotides (substrates) polynucleotides by making the concentration of dATP / dTTP / dCTP / dGTP) non-uniform and performing PCR by adding MnCl 2 to the PCR reaction solution at a concentration of 0.01 to 10 mM (preferably 0.1 to 1 mM). Mutations can be introduced.
  • the polynucleotide containing the entire or partial sequence of human Fc ⁇ RIIa is contacted / acted with a mutagen agent or irradiated with ultraviolet rays to mutate the polynucleotide.
  • a mutagen agent or irradiated with ultraviolet rays to mutate the polynucleotide.
  • the method of producing by introducing is mentioned.
  • a drug used as a mutagen in this method a mutagenic drug commonly used by those skilled in the art such as hydroxylamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfite, hydrazine may be used. .
  • the polynucleotide of the present invention When transforming a host using the polynucleotide of the present invention, the polynucleotide of the present invention itself may be used, but an expression vector (for example, bacteriophage, cosmid, or the like commonly used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells) may be used. It is more preferable to use a plasmid or the like in which the polynucleotide of the present invention is inserted at an appropriate position.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is stably present in the host to be transformed and can be replicated.
  • pET plasmid vector When Escherichia coli is used as a host, pET plasmid vector, pUC plasmid vector, pTrc plasmid vector, pCDF plasmid vector And pBBR plasmid vectors.
  • the appropriate position means a position where the replication function of the expression vector, a desired antibiotic marker, and a region related to transmissibility are not destroyed.
  • a functional polynucleotide such as a promoter required for expression.
  • the promoter include trp promoter, tac promoter, trc promoter, lac promoter, T7 promoter, recA promoter, lpp promoter, ⁇ phage ⁇ PL promoter, ⁇ PR promoter and the like when the host is Escherichia coli.
  • the expression vector of the present invention In order to transform a host using the expression vector inserted with the polynucleotide of the present invention (hereinafter referred to as the expression vector of the present invention) produced by the above-described method, a person skilled in the art may carry out the method.
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia E. coli JM109 strain, E. coli BL21 (DE3) strain, E. coli W3110 strain, etc.
  • known literature eg, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 256, 1992. And the like.
  • a transformant capable of expressing the Fc-binding protein of the present invention (hereinafter referred to as the transformant of the present invention). ) Can be obtained.
  • the host that expresses the Fc-binding protein of the present invention is not particularly limited, and examples include animal cells (CHO (Chinese Hamster Oval) cells, HEK cells, Hela cells, COS cells, etc.), yeast (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe, etc.
  • Strain E, E. Use of animal cells or Escherichia coli as a host is preferable in terms of productivity, and more preferable when Escherichia coli is used as a host.
  • an alkaline extraction method or a QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by Qiagen) is commercially available from the culture obtained by culturing the transformant of the present invention.
  • the extraction kit may be used.
  • the Fc-binding protein of the present invention can be produced.
  • the culture includes not only the cultured cells of the transformant of the present invention itself but also a medium used for the culture.
  • the transformant used in the protein production method of the present invention may be cultured in a medium suitable for culturing the target host.
  • an LB (Luria-Bertani) medium supplemented with necessary nutrient sources is preferable.
  • An example of the medium is given.
  • a drug corresponding to the drug resistance gene contained in the vector it is preferable to add to the medium and culture.
  • the vector contains a kanamycin resistance gene, kanamycin may be added to the medium.
  • an appropriate nutrient source may be added to the medium, and if desired, the medium is selected from the group consisting of glutathione, cysteine, cystamine, thioglycolate and dithiothreitol.
  • One or more reducing agents may be included.
  • a reagent that promotes protein secretion from the transformant to the culture solution such as glycine may be added.
  • glycine is contained in the medium at 2% (w / v) or less. Addition is preferred.
  • the culture temperature is generally 10 ° C. to 40 ° C., preferably 20 ° C.
  • the pH of the medium is pH 6.8 to pH 7.4, preferably around pH 7.0.
  • an inducible promoter is contained in the vector of the present invention, it is preferable that the induction be performed under conditions that allow the Fc binding protein of the present invention to be expressed well. Examples of the inducer include IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside).
  • the turbidity (absorbance at 600 nm) of the culture solution is measured, and when it reaches about 0.5 to 1.0, an appropriate amount of IPTG is added, followed by further culturing, thereby allowing Fc binding. Protein expression can be induced.
  • the addition concentration of IPTG may be appropriately selected from the range of 0.005 to 1.0 mM, but is preferably in the range of 0.01 to 0.5 mM.
  • Various conditions relating to the IPTG induction may be performed under conditions well known in the art.
  • the Fc-binding protein of the present invention may be recovered by separating / purifying from the culture. For example, when expressed in the culture supernatant, the cells are separated by centrifugation, and the Fc-binding protein of the present invention may be purified from the obtained culture supernatant. In addition, when expressed in cells (including periplasm), after collecting the cells by centrifugation, the cells are disrupted by adding an enzyme treatment agent, a surfactant or the like, and the Fc of the present invention.
  • the binding activity to IgG is measured using the Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (hereinafter referred to as ELISA) method or the surface plasmon resonance method.
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • the IgG used for measuring the binding activity is preferably human IgG, and any of human IgG1, human IgG2, human IgG3, and human IgG4 may be used.
  • the adsorbent of the present invention can be produced by binding the Fc binding protein of the present invention to an insoluble carrier.
  • the insoluble carrier is not particularly limited, and carriers made from polysaccharides such as agarose, alginate (alginate), carrageenan, chitin, cellulose, dextrin, dextran, starch, polyvinyl alcohol, polymethacrylate, poly (2- Examples thereof include a carrier made of a synthetic polymer such as hydroxyethyl methacrylate and polyurethane, and a carrier made of ceramics such as silica. Of these, carriers made from polysaccharides and carriers made from synthetic polymers are preferred as insoluble carriers.
  • the preferred carrier examples include polymethacrylate gels introduced with hydroxyl groups such as Toyopearl (manufactured by Tosoh Corporation), agarose gels such as Sepharose (manufactured by GE Healthcare), and cellulose gels such as Cellufine (manufactured by JNC). .
  • the shape of the insoluble carrier is not particularly limited, and may be granular or non-particulate, porous or non-porous.
  • N-hydroxysuccinimide (NHS) activated ester group epoxy group, carboxyl group, maleimide group, haloacetyl group, tresyl group, formyl group haloacetamide And the like, and a human Fc-binding protein and an insoluble carrier may be covalently bonded via the active group.
  • the carrier provided with the active group may be a commercially available carrier as it is, or may be prepared by introducing an active group on the surface of the carrier under appropriate reaction conditions.
  • TOYOPEARL AF-Epoxy-650M TOYOPEARL AF-Tresyl-650M (both manufactured by Tosoh Corporation), HiTrap NHS-activated HP Columns, NHS-activated SepharoseFast-Effects4 Examples include 6B (both manufactured by GE Healthcare) and SulfoLink Coupling Resin (manufactured by Thermo Scientific).
  • examples of the method for introducing an active group on the surface of the carrier include a method in which one of compounds having two or more active sites reacts with a hydroxyl group, an epoxy group, a carboxyl group, an amino group, etc. present on the surface of the carrier. it can.
  • examples of the compound that introduces an epoxy group into the hydroxyl group or amino group on the surface of the carrier include epichlorohydrin, ethanediol diglycidyl ether, butanediol diglycidyl ether, and hexanediol diglycidyl ether.
  • Examples of the compound that introduces an epoxy group on the carrier surface with the compound and then introduces a carboxyl group on the carrier surface include 2-mercaptoacetic acid, 3-mercaptopropionic acid, 4-mercaptobutyric acid, 6-mercaptobutyric acid, glycine, 3- Examples thereof include aminopropionic acid, 4-aminobutyric acid, and 6-aminohexanoic acid.
  • Examples of the compound that introduces a maleimide group into the hydroxyl group, epoxy group, carboxyl group, or amino group present on the surface of the carrier include N- ( ⁇ -maleimidocaproic acid) hydrazide, N- ( ⁇ -maleimidopropionic acid) hydrazide, 4- ( 4-N-maleimidophenyl) acetic acid hydrazide, 2-aminomaleimide, 3-aminomaleimide, 4-aminomaleimide, 6-aminomaleimide, 1- (4-aminophenyl) maleimide, 1- (3-aminophenyl) maleimide, 4- (maleimido) phenyl isocyanate, 2-maleimidoacetic acid, 3-maleimidopropionic acid, 4-maleimidobutyric acid, 6-maleimidohexanoic acid, N- ( ⁇ -maleimidoacetoxy) succinimide ester, (m-maleimidobenzoyl) N— Hydroxy
  • Compounds that introduce a haloacetyl group into the hydroxyl group or amino group present on the surface of the carrier include chloroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, chloroacetic acid chloride, bromoacetic acid chloride, bromoacetic acid bromide, chloroacetic acid anhydride, bromoacetic acid anhydride, Iodoacetic anhydride, 2- (iodoacetamido) acetic acid-N-hydroxysuccinimide ester, 3- (bromoacetamido) propionic acid-N-hydroxysuccinimide ester, 4- (iodoacetyl) aminobenzoic acid-N-hydroxysuccinimide ester It can be illustrated.
  • An example is a method in which ⁇ -alkenyl alkanglycidyl ether is reacted with a hydroxyl group or amino group present on the surface of the carrier, and then the ⁇ -alkenyl moiety is halogenated with a halogenating agent to activate.
  • ⁇ -alkenyl alkanglycidyl ethers include allyl glycidyl ether, 3-butenyl glycidyl ether, and 4-pentenyl glycidyl ether.
  • halogenating agents include N-chlorosuccinimide, N-bromosuccinimide, and N-iodosuccinimide. it can.
  • the method for introducing an active group on the surface of the carrier there is a method for introducing an activating group into the carboxyl group present on the surface of the carrier using a condensing agent and an additive.
  • the condensing agent include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), dicyclohexylcarbodiamide, and carbonyldiimidazole.
  • the additive include N-hydroxysuccinimide (NHS), 4-nitrophenol, and 1-hydroxybenztriazole.
  • Buffers used when immobilizing the Fc-binding protein of the present invention on an insoluble carrier include acetate buffer, phosphate buffer, MES (2-Morpholine ethersic acid) buffer, HEPES (2- [4- (2- Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid) buffer, Tris buffer, borate buffer.
  • the reaction temperature at the time of immobilization may be appropriately set in consideration of the reactivity of the active group and the stability of the Fc-binding protein of the present invention from the temperature range from 5 ° C. to 50 ° C., preferably It is in the range of 10 ° C to 35 ° C.
  • a column containing the adsorbent of the present invention is pumped with a buffer containing the antibody.
  • the antibody may be eluted by adding an appropriate eluate to the column after specifically adsorbing the antibody to the adsorbent of the present invention by adding using a liquid feeding means such as the above.
  • the antibody that can be purified with the adsorbent of the present invention may be any antibody that contains at least the Fc region of an antibody having affinity for an Fc-binding protein.
  • Examples include chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and amino acid substitutions thereof that are generally used as antibodies used in antibody pharmaceuticals. Artificial structurally modified antibodies such as bispecific antibodies (bispecific antibodies), fusion antibodies between antibody Fc regions and other proteins, and antibody Fc region-drug complexes (ADC) Can also be purified with the adsorbent of the present invention.
  • the buffer solution include a buffer solution containing an inorganic salt as a component, such as a phosphate buffer solution, and the pH of the buffer solution is pH 3.0 to 10.0, preferably pH 5.0 to 8.0.
  • a specific example of the eluate for eluting the antibody adsorbed on the adsorbent of the present invention is a buffer solution on the acidic side of the solution used when the antibody is adsorbed on the adsorbent of the present invention.
  • the buffer solution include a citrate buffer solution, a glycine hydrochloride buffer solution, and an acetate buffer solution having a buffer capacity on the acidic side.
  • the pH of the buffer may be set within a range that does not impair the function of the antibody, preferably pH 2.5 to 6.0, more preferably pH 3.0 to 5.0, still more preferably pH 3.3 to 4. 0.
  • the Fc-binding protein of the present invention is a protein in which an amino acid residue at a specific position in the extracellular region of natural human Fc ⁇ RIIa is substituted or deleted with another amino acid residue.
  • the Fc-binding protein of the present invention has improved acid stability compared to native human Fc ⁇ RIIa. Therefore, the Fc binding protein of the present invention is useful as a ligand of an adsorbent for separating an antibody (immunoglobulin).
  • FIG. 1 is a schematic diagram of human Fc ⁇ RIIa.
  • the numbers in the figure indicate the positions of the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 1.
  • S represents a signal sequence
  • EC represents an extracellular region
  • TM represents a transmembrane region
  • C represents an intracellular region.
  • Control which shows the result of having evaluated the acid resistance of the Fc binding protein which carried out the amino acid substitution of one place or two places with respect to Fc binding protein (Control) which consists of an amino acid sequence of sequence number 3.
  • Example 1 Mutation Introduction to Fc Binding Protein and Library Preparation Among the expression vectors pET-Am6 that express Fc binding protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, poly encoding the Fc binding protein The nucleotide part (SEQ ID NO: 4) was subjected to random mutagenesis by error-prone PCR.
  • the Fc binding protein consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 3 has the following six amino acid substitutions on the Fc binding protein consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 2 and including the extracellular region of natural human Fc ⁇ RIIa. It has been introduced.
  • Error-prone PCR was performed using the above-described pET-Am6 as a template DNA.
  • the reaction solution was heat-treated at 95 ° C. for 2 minutes, The reaction was carried out by performing 35 cycles of the step, the second step at 60 ° C. for 30 seconds and the third step at 72 ° C. for 90 seconds for one cycle, and finally heat treatment at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the PCR product obtained in (1) was purified, digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and ligated into an expression vector pETmalE (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046) previously digested with the same restriction enzymes.
  • the reaction solution was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) strain by the heat shock method and cultured on LB plate medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin (18 hours at 37 ° C.) and then formed on the plate. The obtained colonies were used as a random mutant library.
  • Example 2 Screening of Acid-Resistant Fc Binding Proteins (1)
  • the random mutant library (transformant) prepared in Example 1 was subjected to 2YT liquid medium (pepton 16 g / L, yeast extract) containing 50 ⁇ g / mL kanamycin. 10 g / L, sodium chloride 5 g / L) was inoculated into 200 ⁇ L, and cultured with shaking at 30 ° C. overnight using a 96-well deep well plate.
  • 2YT liquid medium pepton 16 g / L, yeast extract
  • 10 g / L, sodium chloride 5 g / L was inoculated into 200 ⁇ L, and cultured with shaking at 30 ° C. overnight using a 96-well deep well plate.
  • the antibody binding activity of the Fc binding protein when the acid treatment of (3) is performed and the antibody binding activity of the Fc binding protein when the acid treatment of (3) is not performed are shown below.
  • the residual activity is calculated by dividing the antibody binding activity of the Fc binding protein when acid treatment is performed by the ELISA method and the antibody binding activity of the Fc binding protein when acid treatment is not performed. did.
  • a gamma globulin preparation (manufactured by Chemistry and Serum Therapy Laboratories), which is a human antibody, was fixed to a well of a 96-well microplate at 1 ⁇ g / well (18 hours at 4 ° C.). Blocking was performed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing SKIM MILK (BD) of% (w / v) and 150 mM sodium chloride.
  • TMB Peroxidase Substrate manufactured by KPL
  • Color development was stopped by adding 1 M phosphoric acid at 50 ⁇ L / well, and absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader (manufactured by Tecan).
  • the acid stability is improved by having at least one of the 11 amino acid substitutions in the extracellular region of human Fc ⁇ RIIa.
  • Leu190Ser has the highest residual activity, and thus it can be seen that, in the extracellular region of human Fc ⁇ RIIa, the Fc binding protein having at least the amino acid substitution of Leu190Ser has particularly improved acid stability (acid resistance).
  • the amino acid sequence of the Fc-binding protein having the amino acid substitution of Leu190Ser is shown in SEQ ID NO: 5, and the sequence of the polynucleotide encoding the protein is shown in They are shown in SEQ ID NO: 6, respectively.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th methionine (Met) and the 28th glycine (Gly) are linker sequences.
  • the 209 th to 209 th histidine (His) is a tag sequence.
  • Fc ⁇ RIIa-m7 is an amino acid residue from the 29th glutamine to the 201st glutamine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, provided that in the 29th to 201st amino acid residues, Ile68Val, A polypeptide having amino acid substitutions of His80Gln, Ser84Thr, Asn90Thr, Asn91Ser, His125Arg and Leu190Ser.
  • Example 3 Introduction of further amino acid substitution (part 1) By further introducing an amino acid substitution involved in improving the acid stability of the Fc binding protein found in Example 2 into Fc ⁇ RIIa-m7, the acid stability was further improved. Introduction (accumulation) of amino acid substitutions was mainly performed using PCR, and four types of polypeptides shown in the following (a) to (d) were prepared.
  • A A polypeptide in which an amino acid substitution of Ile45Thr is further introduced into Fc ⁇ RIIa-m7 (named as Fc ⁇ RIIa-m8A)
  • B A polypeptide in which an amino acid substitution of Gln69Leu is further introduced into Fc ⁇ RIIa-m7 (named as Fc ⁇ RIIa-m8B)
  • C Polypeptide obtained by further introducing an amino acid substitution of Pro83Leu into Fc ⁇ RIIa-m7 (named as Fc ⁇ RIIa-m8C)
  • D Polypeptide obtained by further introducing an amino acid substitution of Thr123Pro into Fc ⁇ RIIa-m7 (named as Fc ⁇ RIIa-m8D)
  • Fc ⁇ RIIa-m8A Ile45Thr was selected from among the amino acid substitutions involved in the improvement of acid stability revealed in Example 2, and Fc ⁇ RIIa-m8A accumulated in Fc ⁇ RIIa-m7 was prepared. Specifically, Fc ⁇ RIIa-m8A was produced by introducing a mutation that caused Ile45Thr to the polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m7 obtained in Example 2.
  • A-1) Oligo consisting of the sequences described in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 27, using the polynucleotide (SEQ ID NO: 6) encoding Fc-binding protein containing Fc ⁇ RIIa-m7 obtained in Example 2 as a template PCR was performed using nucleotides as PCR primers.
  • the reaction solution was heat-treated at 98 ° C. for 5 minutes, first step at 98 ° C. for 10 seconds, second step at 55 ° C. for 5 seconds, 1 at 72 ° C.
  • the reaction with the third step of 1 minute as one cycle was performed for 30 cycles, and finally heat-treated at 72 ° C. for 5 minutes.
  • the amplified PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and purified from the gel using a QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by Qiagen).
  • the purified PCR product was named m8A-F.
  • A-2) A method similar to (a-1), except that the same polynucleotide as (a-1) is used as a template and an oligonucleotide having the sequences of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 9 is used as a PCR primer.
  • the PCR and the PCR product were purified.
  • the purified PCR product was named m8A-S.
  • A-3) Two types of PCR products (m8A-F, m8A-S) obtained in (a-1) and (a-2) were mixed to prepare a reaction solution having the composition shown in Table 3.
  • the reaction solution is heat-treated at 98 ° C. for 5 minutes, followed by 5 cycles of reaction in which the first step is 98 ° C.
  • PCR was performed to obtain a PCR product m8A-FL in which m8A-F and m8A-R were linked.
  • (A-4) PCR was performed using the PCR product m8A-FL obtained in (a-3) as a template and oligonucleotides having the sequences described in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 as PCR primers.
  • the reaction solution was heat-treated at 98 ° C. for 5 minutes, first step at 98 ° C. for 10 seconds, second step at 55 ° C. for 5 seconds, 1 at 72 ° C.
  • the reaction with the third step of 1 minute as one cycle was performed 30 cycles. This produced a polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m8A.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th methionine (Met) to the 28th glycine (Gly) are linker sequences.
  • the amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m8A corresponding to the region from 34th to 206th of SEQ ID NO: 1
  • 202th and 203rd glycine ( Gly) is a linker sequence
  • Histidines (His) from 204th to 209th are tag sequences.
  • Fc ⁇ RIIa-m8B Gln69Leu was selected from among the amino acid substitutions involved in the improvement of acid stability revealed in Example 2, and Fc ⁇ RIIa-m8B accumulated in Fc ⁇ RIIa-m7 was prepared. Specifically, Fc ⁇ RIIa-m8B was prepared by introducing a mutation that caused Gln69Leu into the polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m7 obtained in Example 2.
  • (B-1) Oligo consisting of the sequences described in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 29, using the polynucleotide (SEQ ID NO: 6) encoding Fc-binding protein containing Fc ⁇ RIIa-m7 obtained in Example 2 as a template PCR and PCR products were purified in the same manner as (a-1) except that nucleotides were used as PCR primers.
  • the purified PCR product was named m8B-F.
  • (B-2) The same method as (a-1), except that the same polynucleotide as (b-1) was used as a template and the oligonucleotide consisting of the sequences of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 9 was used as a PCR primer.
  • the PCR and the PCR product were purified.
  • the purified PCR product was named m8B-S.
  • (B-3) PCR was performed in the same manner as (a-3) except that m8B-F obtained in (b-1) and m8B-S obtained in (b-2) were used as PCR products. Then, a PCR product m8B-FL in which m8B-F and m8B-S were ligated was obtained.
  • the amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m8B added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 13, and the sequence of the polynucleotide encoding the Fc ⁇ RIIa-m8B is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th methionine (Met) to the 28th glycine (Gly) are linker sequences.
  • the amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m8B (corresponding to the region from 34th to 206th in SEQ ID NO: 1) from the 29th glutamine (Gln) to the 201st glutamine (Gln), 202th and 203rd glycines ( Gly) is a linker sequence, and histidines (His) from 204th to 209th are tag sequences.
  • Fc ⁇ RIIa-m8C Pro83Leu was selected from among the amino acid substitutions involved in the improvement of acid stability revealed in Example 2, and Fc ⁇ RIIa-m8C accumulated in Fc ⁇ RIIa-m7 was prepared. Specifically, Fc ⁇ RIIa-m8C was prepared by introducing a mutation that causes Pro83Leu to the polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m7 obtained in Example 2.
  • (C-1) Oligo consisting of the sequences described in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 31 using the polynucleotide (SEQ ID NO: 6) encoding Fc-binding protein containing Fc ⁇ RIIa-m7 obtained in Example 2 as a template PCR and PCR products were purified in the same manner as (a-1) except that nucleotides were used as PCR primers.
  • the purified PCR product was named m8C-F.
  • (C-2) The same method as (a-1), except that the same polynucleotide as (c-1) was used as a template, and an oligonucleotide consisting of the sequences of SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 9 was used as a PCR primer.
  • the PCR and the PCR product were purified.
  • the purified PCR product was named m8C-S.
  • (C-3) PCR was carried out in the same manner as (a-3) except that m8C-F obtained in (c-1) and m8C-S obtained in (c-2) were used as PCR products.
  • the PCR product m8C-FL in which m8C-F and m8C-S were linked was obtained.
  • C-4) (a-4) except that the PCR product m8C-FL obtained in (c-3) was used as a template, and an oligonucleotide consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 was used as a PCR primer.
  • PCR was carried out in the same manner as in (1). This produced a polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m8C.
  • C-5 After purifying the polynucleotide obtained in (c-4), digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII (Japanese Patent Laid-Open No.
  • the amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m8C added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 15, and the sequence of the polynucleotide encoding the Fc ⁇ RIIa-m8C is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th methionine (Met) to the 28th glycine (Gly) are linker sequences.
  • Gly From 29th glutamine (Gln) to 201st glutamine (Gln) amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m8C (corresponding to the region from 34th to 206th of SEQ ID NO: 1), 202th and 203rd glycine ( Gly) is a linker sequence, and histidines (His) from 204th to 209th are tag sequences.
  • Fc ⁇ RIIa-m8D Thr123Pro was selected from the amino acid substitutions involved in improving acid stability, which was revealed in Example 2, to produce Fc ⁇ RIIa-m8D accumulated in Fc ⁇ RIIa-m7. Specifically, Fc ⁇ RIIa-m8D was produced by introducing a mutation that causes Thr123Pro to the polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m7 obtained in Example 2.
  • (D-1) Oligo consisting of the sequences described in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 33, using the polynucleotide (SEQ ID NO: 6) encoding Fc-binding protein containing Fc ⁇ RIIa-m7 obtained in Example 2 as a template PCR and PCR products were purified in the same manner as (a-1) except that nucleotides were used as PCR primers.
  • the purified PCR product was named m8D-F.
  • (D-2) A method similar to (a-1), except that the same polynucleotide as (d-1) is used as a template and an oligonucleotide having the sequences of SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 9 is used as a PCR primer.
  • the PCR and the PCR product were purified.
  • the purified PCR product was named m8D-S.
  • D-3) PCR was performed in the same manner as (a-3) except that m8C-F obtained in (d-1) and m8C-S obtained in (d-2) were used as PCR products.
  • the PCR product m8D-FL in which m8D-F and m8D-S were ligated was obtained.
  • D-4) (a-4) except that the PCR product m8D-FL obtained in (d-3) was used as a template, and an oligonucleotide consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 was used as a PCR primer.
  • PCR was carried out in the same manner as in (1). This produced a polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m8D.
  • D-5 After purifying the polynucleotide obtained in (d-4), digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046) Was used to transform Escherichia coli BL21 (DE3) strain.
  • D-6 The obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • Plasmid pET-Fc ⁇ RIIa- containing a polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m8D, which is a polypeptide further substituted with one amino acid for Fc ⁇ RIIa-m7 by extracting a plasmid from the collected bacterial cells (transformants) m8D was obtained.
  • D-7) The nucleotide sequence of pET-Fc ⁇ RIIa-m8D was analyzed in the same manner as in Example 2 (6).
  • the amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m8D added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 17, and the sequence of the polynucleotide encoding the Fc ⁇ RIIa-m8D is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th methionine (Met) to the 28th glycine (Gly) are linker sequences.
  • the amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m8D (corresponding to the region from the 34th to the 206th region of SEQ ID NO: 1) from the 29th glutamine (Gln) to the 201st glutamine (Gln), the 202nd and 203rd glycines ( Gly) is a linker sequence, and histidines (His) from 204th to 209th are tag sequences.
  • Example 4 Evaluation of acid stability of Fc-binding protein (Part 1) (1) 3 mL of 2YT liquid medium containing Fc ⁇ RIIa-m6 and transformants expressing Fc ⁇ RIIa-m8A, Fc ⁇ RIIa-m8B, Fc ⁇ RIIa-m8C and Fc ⁇ RIIa-m8D prepared in Example 3, each containing 50 ⁇ g / mL kanamycin (Peptone 16 g / L, yeast extract 10 g / L, sodium chloride 5 g / L) was inoculated, and precultured by aerobic shaking culture at 37 ° C. overnight.
  • kanamycin Peptone 16 g / L, yeast extract 10 g / L, sodium chloride 5 g / L
  • Residual activity was calculated by dividing the antibody binding activity when acid treatment was performed by the antibody binding activity when acid treatment was not performed, and acid stability was evaluated. The results are shown in Table 5.
  • Fc ⁇ RIIa-m8B and Fc ⁇ RIIa-m8D have higher residual activity than Fc ⁇ RIIa-m6, and therefore have improved acid stability compared to Fc ⁇ RIIa-m6. was confirmed.
  • Example 5 Introduction of further amino acid substitution (part 2) By further introducing an amino acid substitution involved in improving the acid stability of the Fc-binding protein found in Example 2 into Fc ⁇ RIIa-m8D, the acid stability was further improved.
  • the introduction (accumulation) of amino acid substitution was mainly performed using PCR, and three types of polypeptides shown in the following (a) to (c) were prepared.
  • a polypeptide obtained by further introducing Ile45Thr and Gln69Leu amino acid substitutions into Fc ⁇ RIIa-m8D (named as Fc ⁇ RIIa-m10A)
  • Fc ⁇ RIIa-m10A Ile45Thr and Gln69Leu were selected from among the amino acid substitutions involved in improving the acid stability revealed in Example 2, and Fc ⁇ RIIa-m10A accumulated in Fc ⁇ RIIa-m8D was prepared. Specifically, Fc ⁇ RIIa-m10A was prepared by introducing a mutation that caused Ile45Thr and Gln69Leu to the polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m8D obtained in Example 3 (d).
  • Example 3 (a-1) except that the same polynucleotide as (a-1) was used as a template, and an oligonucleotide consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 29 was used as a PCR primer. PCR and PCR product purification were performed in the same manner.
  • the purified PCR product was named m10A-S.
  • A-3) Example 3 (a-1) except that the same polynucleotide as (a-1) was used as a template and an oligonucleotide consisting of the sequences of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 9 was used as a PCR primer. PCR and PCR product purification were performed in the same manner.
  • the purified PCR product was named m10A-T.
  • A-4 m10A-F obtained in (a-1), m10A-S obtained in (a-2) and m10A-T obtained in (a-3) were used as PCR products.
  • PCR was carried out in the same manner as in Example 3 (a-3) to obtain a PCR product m10A-FL in which m10A-F, m10A-S and m10A-T were linked.
  • A-8 The nucleotide sequence of pET-Fc ⁇ RIIa-m10A was analyzed in the same manner as in Example 2 (6).
  • the amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m10A added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 19, and the sequence of the polynucleotide encoding the Fc ⁇ RIIa-m10A is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th methionine (Met) to the 28th glycine (Gly) are linker sequences.
  • the 29th glutamine (Gln) to the 201st glutamine (Gln) are amino acid sequences of Fc ⁇ RIIa-m10A (corresponding to the region from the 34th to the 206th region of SEQ ID NO: 1), the 202nd and 203rd glycines ( Gly) is a linker sequence, and histidines (His) from 204th to 209th are tag sequences.
  • Fc ⁇ RIIa-m10B Ile45Thr and Pro83Leu were selected from among the amino acid substitutions involved in the improvement of acid stability revealed in Example 2, and Fc ⁇ RIIa-m10B accumulated in Fc ⁇ RIIa-m8D was prepared. Specifically, Fc ⁇ RIIa-m10B was prepared by introducing a mutation that caused Ile45Thr and Pro83Leu into the polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m8D obtained in Example 3 (d).
  • the purified PCR product was named m10B-S.
  • the purified PCR product was named m10B-T.
  • B-4 m10B-F obtained in (b-1), m10B-S obtained in (b-2) and m10B-T obtained in (b-3) were used as PCR products.
  • PCR was carried out in the same manner as in Example 3 (a-3) to obtain a PCR product m10B-FL in which m10B-F, m10B-S and m10B-T were linked.
  • B-8 The nucleotide sequence of pET-Fc ⁇ RIIa-m10B was analyzed in the same manner as in Example 2 (6).
  • the amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m10B added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 21, and the sequence of the polynucleotide encoding the Fc ⁇ RIIa-m10B is shown in SEQ ID NO: 20.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th methionine (Met) to the 28th glycine (Gly) are linker sequences.
  • Gly From 29th glutamine (Gln) to 201st glutamine (Gln) amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m10B (corresponding to the region from 34th to 206th of SEQ ID NO: 1), 202th and 203rd glycine ( Gly) is a linker sequence, and histidines (His) from 204th to 209th are tag sequences.
  • Fc ⁇ RIIa-m10C Gln69Leu and Pro83Leu were selected from the amino acid substitutions involved in the improvement of acid stability revealed in Example 2, and Fc ⁇ RIIa-m10C accumulated in Fc ⁇ RIIa-m8D was prepared. Specifically, Fc ⁇ RIIa-m10C was prepared by introducing a mutation that causes Gln69Leu and Pro83Leu to the polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m8D obtained in Example 3 (d).
  • Example 3 (C-1) Using the polynucleotide (SEQ ID NO: 16) encoding Fc-binding protein containing Fc ⁇ RIIa-m8D obtained in Example 3 (d) as a template, the sequences described in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 29 PCR and PCR products were purified in the same manner as in Example 3 (a-1) except that the oligonucleotide consisting of was used as a PCR primer. The purified PCR product was named m10C-F.
  • the purified PCR product was named m10C-S.
  • the purified PCR product was named m10C-T.
  • C-4 m10C-F obtained in (c-1), m10C-S obtained in (c-2) and m10C-T obtained in (c-3) were used as PCR products. Then, PCR was performed in the same manner as in Example 3 (a-3) to obtain a PCR product m10C-FL in which m10C-F, m10C-S, and m10C-T were linked.
  • C-8 The nucleotide sequence of pET-Fc ⁇ RIIa-m10C was analyzed in the same manner as in Example 2 (6).
  • the amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m10C added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 23, and the sequence of the polynucleotide encoding the Fc ⁇ RIIa-m10C is shown in SEQ ID NO: 22.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th methionine (Met) to the 28th glycine (Gly) are linker sequences.
  • the 29th glutamine (Gln) to the 201st glutamine (Gln) are amino acid sequences of Fc ⁇ RIIa-m10C (corresponding to the region from the 34th to the 206th region of SEQ ID NO: 1), the 202nd and 203rd glycines ( Gly) is a linker sequence, and histidines (His) from 204th to 209th are tag sequences.
  • Example 6 Introduction of further amino acid substitution (part 3) By selecting Ile45Thr, Gln69Leu, and Pro83Leu from among the amino acid substitutions involved in improving the acid stability of the Fc-binding protein found in Example 2, the acid stability is further improved by further introducing it into Fc ⁇ RIIa-m8D. It was. Specifically, the polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m10A obtained in Example 5 (a) was prepared by introducing a mutation that causes Pro83Leu (named as Fc ⁇ RIIa-m11). Hereinafter, a method for producing Fc ⁇ RIIa-m11 will be described in detail.
  • polynucleotide (SEQ ID NO: 18) encoding Fc-binding protein containing Fc ⁇ RIIa-m10A obtained in Example 5 (a) is used as a template, and consists of the sequences shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 31 PCR and PCR products were purified in the same manner as in Example 3 (a-1) except that oligonucleotides were used as PCR primers.
  • the purified PCR product was named m11-F.
  • Example 3 (a-1) In the same manner as in Example 3 (a-1), except that the same polynucleotide as (1) was used as a template and the oligonucleotide consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 9 was used as a PCR primer. PCR and PCR product purification was performed. The purified PCR product was named m11-S. (3) PCR was carried out in the same manner as in Example 3 (a-3) except that m11-F obtained in (1) and m11-S obtained in (2) were used as PCR products. A PCR product m11-FL in which -F and m11-S were linked was obtained.
  • Example 3 (a-4) except that the PCR product m11-FL obtained in (3) was used as a template, and an oligonucleotide consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 was used as a PCR primer. PCR was performed in the same manner as described above. This produced a polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m11. (5) After purification of the polynucleotide obtained in (4), digestion with restriction enzymes NcoI and HindIII, ligation to an expression vector pETmalE (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046) previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, This was used to transform E. coli BL21 (DE3) strain.
  • pETmalE Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046
  • the obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • Plasmid pET-Fc ⁇ RIIa- containing a polynucleotide encoding Fc ⁇ RIIa-m11, which is a polypeptide obtained by further substituting Fc ⁇ RIIa-m7 with four amino acids by extracting a plasmid from the collected bacterial cells (transformants) m11 was obtained.
  • the nucleotide sequence of pET-Fc ⁇ RIIa-m11 was analyzed in the same manner as in Example 2 (6).
  • the amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m11 added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 25, and the sequence of the polynucleotide encoding the Fc ⁇ RIIa-m11 is shown in SEQ ID NO: 24.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th methionine (Met) to the 28th glycine (Gly) are linker sequences.
  • the amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m11 (corresponding to the region from 34th to 206th of SEQ ID NO: 1), 202th and 203rd glycine ( Gly) is a linker sequence, and histidines (His) from 204th to 209th are tag sequences.
  • Example 7 Evaluation of acid stability of Fc-binding protein (Part 2) (1) Transformants expressing Fc ⁇ RIIa-m6, Fc ⁇ RIIa-m10A, Fc ⁇ RIIa-m10B and Fc ⁇ RIIa-m10C prepared in Example 5 and Fc ⁇ IIa-m11 prepared in Example 6 were obtained from Example 4 (1). These proteins were prepared by culturing and extracting in the same manner as in (4). (2) The antibody binding activities of Fc ⁇ RIIa-m6, three types of Fc ⁇ RIIa-m10, and Fc ⁇ RIIa-m11 in the protein extract prepared in (1) were measured by the ELISA method described in Example 2 (4).
  • a calibration curve was prepared using purified and quantified Fc ⁇ RIIa-m6, and protein concentration was measured.
  • (3) After dilution with pure water so that the concentration of each Fc-binding protein becomes 10 ⁇ g / mL, 50 ⁇ L of the diluted solution and 50 ⁇ L of 20 mM glycine hydrochloride buffer (pH 3.0) solution are mixed, and 24 ° C. at 24 ° C. The acid treatment was performed by allowing to stand for a period of time. Thereafter, the solution was neutralized by adding 4 volumes of 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0), and the antibody binding activity of the Fc binding protein was measured by the ELISA method described in Example 2 (4).
  • Fc ⁇ RIIa-m10A, Fc ⁇ RIIa-m10C, and Fc ⁇ RIIa-m11 have higher residual activity than Fc ⁇ RIIa-m6, it was confirmed that the acid stability was improved compared to Fc ⁇ RIIa-m6.
  • Fc ⁇ RIIa-m11 has a high residual activity of 95.3% and can be said to be an Fc-binding protein with particularly improved acid stability.
  • Example 8 Deletion of amino acid residue in loop region Based on the knowledge of crystal structure data of Fc ⁇ RIIa (PDB ID: 1FCG) registered in a known database for further acid stability improvement, it is located in the loop region in Fc ⁇ RIIa.
  • the amino acid residue is deleted.
  • the loop region region from 58th glutamine to 67th serine of SEQ ID NO: 25
  • Fc ⁇ RIIa-m11 an Fc-binding protein lacking the 62nd serine (named as Fc ⁇ RIIa-m11-Del1)
  • B Among Fc ⁇ RIIa-m11, an Fc-binding protein in which the 62nd serine and 64th glutamic acid are deleted (named as Fc ⁇ RIIa-m11-Del2)
  • C An Fc-binding protein in which amino acid residues from the 62nd serine to the 64th glutamic acid in Fc ⁇ RIIa-m11 are deleted (named as Fc ⁇ RIIa-m11-Del3)
  • D Among Fc ⁇ RIIa-m11, an Fc-binding protein in which amino acid residues from the 61st arginine to the 64th glutamic acid are deleted (named as Fc ⁇ RIIa-m11-Del4)
  • E Fc-binding protein in which amino acid residues from 61st arginine to 65th se
  • the amino acid sequence of (a) Fc ⁇ RIIa-m11-Del1 added with a signal sequence and a polyhistidine tag is SEQ ID NO: 35
  • the amino acid sequence of (b) Fc ⁇ RIIa-m11-Del2 added with a signal sequence and a polyhistidine tag is SEQ ID NO: 37
  • the amino acid sequence of Fc ⁇ RIIa-m11-Del3 to which a signal sequence and a polyhistidine tag are added is SEQ ID NO: 39
  • the amino acid sequence of (e) Fc ⁇ RIIa-m11-Del5 with a signal sequence and a polyhistidine tag added to No. 41 is the amino acid sequence of (e) Fc ⁇ RIIa-m11-Del5 added with the signal sequence and the polyhistidine tag.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th methionine (Met) to the 28th glycine (Gly) are linker sequences
  • 7th and 8th glycines (Gly) from the C-terminus are linker sequences, and other regions can be bound to the Fc region.
  • Example 9 Evaluation of acid stability of Fc-binding protein (Part 3)
  • a protein was prepared by culturing and extracting the transformant expressing Fc ⁇ RIIa-m11 prepared in Example 6 in the same manner as in Examples 4 (1) to (4).
  • the antibody binding activity in the protein extract prepared in (1) and Example 8 was measured by the ELISA method described in Example 2 (4).
  • a calibration curve was prepared using purified and quantified Fc ⁇ RIIa-m6, and protein concentration was measured. Note that the protein concentration of Fc ⁇ RIIa-m11-Del8, Del9 and Del10 could not be measured due to insufficient protein expression.

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Abstract

天然型ヒトＦｃγＲＩＩａに対して酸に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤を提供すること。　天然型のヒトＦｃγＲＩＩａのアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ１２３１８）のうち細胞外領域のアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該領域のアミノ酸残基において少なくとも特定箇所のアミノ酸置換または欠失を有したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤により、前記課題を解決する。

Description

酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
　本発明は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対し結合親和性を有するＦｃ結合性タンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、ヒトＦｃγレセプターＩＩａの特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換または欠失させることで、天然型ヒトＦｃγレセプターＩＩａよりも酸に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤に関する。
　Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する受容体タンパク質であり、抗原と免疫グロブリンとの免疫複合体に結合して細胞内にシグナル伝達を行なう（非特許文献１）。特に重要な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に結合するＦｃγレセプター（ＦｃγＲ）は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）のサブタイプに分類できる（非特許文献１および２）。ＩｇＧ免疫複合体とＦｃγＲの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域にＦｃγＲが結合することで起こる。個々のＦｃγＲ分子種は、ＩｇＧのＦｃ領域認識ドメインを有し、単一種の、または同じサブタイプに属するＩｇＧを認識する。これによって個々の免疫応答において、どのアクセサリー細胞が動員されるかが決定される（非特許文献１および２）。
　ＦｃγＲの中でもＦｃγＲＩＩａはマクロファージや好中球などの細胞表面に存在しており、ヒトの免疫機構の中でも重要なＡＤＣＰ（抗体依存性細胞貪食）活性に関与している（非特許文献３）。ヒトＦｃγＲＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｓｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１８）などの公的データベースに登録されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は、配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニンから３３番目のセリンまでがシグナル配列（Ｓ）、３４番目のグルタミンから２１７番目のグリシンまでが細胞外領域（ＥＣ）、２１８番目のイソロイシンから２４０番目のチロシンまでが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２４１番目のシステインから３１７番目のアスパラギンまでが細胞内領域（Ｃ）とされている。
　ＦｃγＲＩＩａを産業応用するためには、使用や保存などの観点から酸に対して安定性が高いことが好ましい。しかしながら、これまでにヒトＦｃγＲＩＩａの酸に対する安定性を向上させる試みはなかった。
Ｔａｋａｉ　Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８－３２６，２００５ Ｊ．Ｇａｌｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８－１９３２，１９９７ Ｊ．Ｏ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒ．，７，２５１７－２５２７，２００８
　本発明の課題は、天然型ヒトＦｃγＲＩＩａに対して酸に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤を提供することにある。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ヒトＦｃγＲＩＩａにおける酸安定性向上に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換または欠失させた変異体が、酸に対して優れた安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本願は以下の［１］から［１３］に記載の態様を包含する。
　［１］以下の（Ｉ）～（ＩＶ）から選択されるＦｃ結合性タンパク質：
（Ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、以下の（１）から（１２）に示すいずれかのアミノ酸置換または欠失を少なくとも１つ以上有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（１）配列番号２の１９０番目のロイシンのセリンへの置換
（２）配列番号２の４５番目のイソロイシンのスレオニンへの置換
（３）配列番号２の６９番目のグルタミンのロイシンへの置換
（４）配列番号２の８３番目のプロリンのロイシンへの置換
（５）配列番号２の１２３番目のスレオニンのプロリンへの置換
（６）配列番号２の４２番目のプロリンのグルタミンへの置換
（７）配列番号２の６３番目のプロリンのロイシンへの置換
（８）配列番号２の７５番目のアスパラギンのセリンへの置換
（９）配列番号２の１６３番目のロイシンのヒスチジンへの置換
（１０）配列番号２の１７９番目のアスパラギン酸のバリンへの置換
（１１）配列番号２の１９８番目のイソロイシンのバリンへの置換
（１２）配列番号２の６２番目のセリンの欠失
（ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、前記（１）から（１２）に示すいずれかのアミノ酸置換または欠失を少なくとも１つ以上有し、さらに前記（１）から（１２）に示すアミノ酸置換または欠失以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質；
（ＩＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ前記（１）から（１２）に示すいずれかのアミノ酸置換または欠失を少なくとも１つ以上有し、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
（ＩＶ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において前記（１）から（１２）に示すいずれか１以上のアミノ酸置換または欠失を有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失が残存したアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
　［２］以下の（１）に示すアミノ酸置換を少なくとも有する、［１］に記載のＦｃ結合性タンパク質。
（１）配列番号２の１９０番目のロイシンのセリンへの置換
　［３］さらに以下に示す６箇所のアミノ酸置換を少なくとも有する、［１］または［２］に記載のＦｃ結合性タンパク質。
配列番号２の６８番目のイソロイシンのバリンへの置換
配列番号２の８０番目のヒスチジンのグルタミンへの置換
配列番号２の８４番目のセリンのスレオニンへの置換
配列番号２の９０番目のアスパラギンのスレオニンへの置換
配列番号２の９１番目のアスパラギンのセリンへの置換
配列番号２の１２５番目のヒスチジンのアルギニンへの置換
　［４］以下の（ｉｖ）～（ｖｉ）から選択される、［１］または［２］に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（ｉｖ）配列番号５、７、１３、１７、１９、２３および２５のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｖ）配列番号５、７、１３、１７、１９、２３および２５のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｖｉ）配列番号５、７、１３、１７、１９、２３および２５のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換が残存し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質。
　［５］以下の（ｖｉｉ）～（ｉｘ）から選択される、［１］から［３］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質：
（ｖｉｉ）配列番号３５に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２００番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｖｉｉｉ）配列番号３５に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２００番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２００番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換および欠失以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｉｘ）配列番号３５に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２００番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２００番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質。
　［６］以下の（ｘ）～（ｘｉｉ）から選択される、［１］から［３］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質：
（ｘ）配列番号４３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから１９６番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｘｉ）配列番号４３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから１９６番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から１９６番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換および欠失以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｘｉｉ）配列番号４３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから１９６番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から１９６番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換が残存し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質。
　［７］［１］から［６］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　［８］［７］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
　［９］［８］に記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
　［１０］宿主が大腸菌である、［９］に記載の形質転換体。
　［１１］［９］または［１０］に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記Ｆｃ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
　［１２］［１］から［６］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、抗体吸着剤。
　［１３］［１２］に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域に結合性をもつタンパク質であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる天然型ヒトＦｃγＲＩＩａの細胞外領域を含むポリペプチドのうち、少なくとも２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において特定位置におけるアミノ酸置換または欠失を少なくとも有するタンパク質である。なお配列番号２のうち、１番目から２６番目はＭａｌＥシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチド）の配列であり、２７番目のメチオニンおよび２８番目のグリシンはリンカー配列であり、２９番目から２０１番目はＦｃγＲＩＩａの細胞外領域（すなわち配列番号１の３４番目から２０６番目までの領域）であり、２０２番目から２０３番目はグリシンリンカーであり、２０４番目から２０９番目はヒスチジンタグである。したがって、本発明のＦｃ結合性タンパク質は、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域および細胞外領域の全てまたは一部を含んでもよい。
　前記特定位置におけるアミノ酸置換または欠失は具体的には、Ｐｒｏ４２Ｇｌｎ（この表記は配列番号２の４２番目（配列番号１では４７番目）のプロリンがグルタミンに置換されていることを表す、以下同じ）、Ｐｒｏ６３Ｌｅｕ、Ａｓｎ７５Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１６３Ｈｉｓ、Ａｓｐ１７９Ｖａｌ、Ｌｅｕ１９０Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１９８Ｖａｌ、Ｉｌｅ４５Ｔｈｒ、Ｇｌｎ６９Ｌｅｕ、Ｐｒｏ８３Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１２３ＰｒｏおよびＳｅｒ６２の欠失のうち、少なくともいずれか１つ以上である。中でもＬｅｕ１９０Ｓｅｒは、酸に対する安定性が特に向上したアミノ酸置換であることから、Ｌｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換を少なくとも含むＦｃ結合性タンパク質は、本発明のＦｃ結合性タンパク質の好ましい態様といえる。
　なお本発明のＦｃ結合性タンパク質は、前述した特定位置におけるアミノ酸置換または欠失を少なくとも１つ以上有していればよく、抗体結合活性を有する限り、前述した特定位置のアミノ酸置換以外に、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上、さらに有してもよい。前記態様の具体例として、以下の（ｉ）から（ｖ）に示す、抗体結合活性を有したＦｃ結合性タンパク質があげられる。なおアミノ酸残基を欠失させる場合、タンパク質二次構造におけるループ領域が取り除かれるよう欠失させると、耐熱性が向上する点で好ましい（Ｍａｎａｎｄｅｚ－Ａｌｉａｓ　ａｎｄ　Ｐ．　Ａｒｇｏｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０６，１９８９）。
（ｉ）前述した特定位置におけるアミノ酸置換および／または欠失に、Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１ＳｅｒおよびＨｉｓ１２５Ａｒｇのアミノ酸置換をさらに有したＦｃ結合性タンパク質
（ｉｉ）前述した特定位置におけるアミノ酸置換および／または欠失に加え、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有したＦｃ結合性タンパク質
（ｉｉｉ）前述した特定位置におけるアミノ酸置換および／または欠失ならびにＩｌｅ６８Ｖａｌ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１ＳｅｒおよびＨｉｓ１２５Ａｒｇのアミノ酸置換に加え、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有したＦｃ結合性タンパク質
（ｉｖ）前述した特定位置におけるアミノ酸置換および／または欠失を有したポリペプチドのアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＦｃ結合性タンパク質であって、かつ前述した定位置におけるアミノ酸置換および／または欠失が残存したＦｃ結合性タンパク質
（ｖ）前述した特定位置におけるアミノ酸置換および／または欠失ならびにＩｌｅ６８Ｖａｌ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１ＳｅｒおよびＨｉｓ１２５Ａｒｇのアミノ酸置換を有したポリペプチドのアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＦｃ結合性タンパク質であって、かつ前述した定位置におけるアミノ酸置換および／または欠失ならびにＩｌｅ６８Ｖａｌ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１ＳｅｒおよびＨｉｓ１２５Ａｒｇのアミノ酸置換が残存したＦｃ結合性タンパク質
　前記（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）に記載のＩｌｅ６８Ｖａｌ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１ＳｅｒおよびＨｉｓ１２５Ａｒｇのアミノ酸置換は、熱安定性および遺伝子組換体による生産性を向上させるアミノ酸置換である（ＷＯ２０１８／０５６３７４号）。したがって、前述した特定位置におけるアミノ酸置換を少なくとも１つ以上有した本発明のＦｃ結合性タンパク質に、前記６箇所のアミノ酸置換（Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１ＳｅｒおよびＨｉｓ１２５Ａｒｇ）をさらに有することで、天然型ＦｃγＲＩＩａよりも酸に対する安定性が向上し、かつ熱安定性および遺伝子組換体による生産性も向上したＦｃ結合性タンパク質が得られる。
　前記（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において「１もしくは数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１から５０個、１から４０個、１から３０個、１から２０個、１から１０個のいずれかを意味する。また前記（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に記載の「置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上」には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いなどに基づく、天然にも生じ得る変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
　前記（ｉｖ）および（ｖ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上であればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質は、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換をさらに有してもよい。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。
　また本発明のＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧ結合性や安定性を損なわない限り特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際には、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作成後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示できる（特開２０１１－０９７８９８号公報）。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質の好ましい態様として、以下の（ａ）から（ｉ）に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを少なくとも含むＦｃ結合性タンパク質があげられる。これらのＦｃ結合性タンパク質は酸に対する安定性（耐酸性）が向上する点で好ましい。
　（ａ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７（配列番号５に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基）
　配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１Ｓｅｒ、Ｈｉｓ１２５ＡｒｇおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。
　（ｂ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１（配列番号７に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基）
　配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、Ｌｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。
　（ｃ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂ（配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目
から２０１番目までのアミノ酸残基）
　配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｇｌｎ６９Ｌｅｕ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１Ｓｅｒ、Ｈｉｓ１２５ＡｒｇおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。
　（ｄ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄ（配列番号１７に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基）
　配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１２３Ｐｒｏ、Ｈｉｓ１２５ＡｒｇおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。
　（ｅ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａ（配列番号１９に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基）
　配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、Ｉｌｅ４５Ｔｈｒ、Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｇｌｎ６９Ｌｅｕ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１２３Ｐｒｏ、Ｈｉｓ１２５ＡｒｇおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。
　（ｆ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃ（配列番号２３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基）
　配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｇｌｎ６９Ｌｅｕ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｐｒｏ８３Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１２３Ｐｒｏ、Ｈｉｓ１２５ＡｒｇおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。
　（ｇ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１（配列番号２５に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基）
　配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、Ｉｌｅ４５Ｔｈｒ、Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｇｌｎ６９Ｌｅｕ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｐｒｏ８３Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１２３Ｐｒｏ、Ｈｉｓ１２５ＡｒｇおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。
　（ｈ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ１（配列番号３５に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から２００番目までのアミノ酸残基）
　配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２００番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から２００番目までのアミノ酸残基において、Ｉｌｅ４５Ｔｈｒ、Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｇｌｎ６９Ｌｅｕ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｐｒｏ８３Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１２３Ｐｒｏ、Ｈｉｓ１２５ＡｒｇおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換、ならびにＳｅｒ６２の欠失を有する、ポリペプチド。
　（ｉ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ５（配列番号４３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目から１９６番目までのアミノ酸残基）
　配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから１９６番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から１９６番目までのアミノ酸残基において、Ｉｌｅ４５Ｔｈｒ、Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｇｌｎ６９Ｌｅｕ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｐｒｏ８３Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１２３Ｐｒｏ、Ｈｉｓ１２５ＡｒｇおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換、ならびにＡｒｇ６１からＳｅｒ６５の欠失を有する、ポリペプチド。
　なお、配列番号５、７、１３、１７、１９、２３および２５に記載のＦｃ結合性タンパク質のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニンおよび２８番目のグリシンがリンカー配列であり、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでが抗体のＦｃ領域に結合可能なポリペプチド（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７（配列番号５）、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１（配列番号７）、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８ｂ（配列番号１３）、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８ｄ（配列番号１７）、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０ａ（配列番号１９）、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０ｃ（配列番号２３）またはＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１（配列番号２５））のアミノ酸配列であり、２０２番目および２０３番目のグリシンがリンカー配列であり、２０４番目から２０９番目までのヒスチジンがタグ配列である。
　また、配列番号３５に記載のＦｃ結合性タンパク質のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニンおよび２８番目のグリシンがリンカー配列であり、２９番目のグルタミンから２００番目のグルタミンまでが抗体のＦｃ領域に結合可能なポリペプチド（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ１）のアミノ酸配列であり、２０１番目および２０２番目のグリシンがリンカー配列であり、２０３番目から２０８番目までのヒスチジンがタグ配列である。
　また、配列番号４３に記載のＦｃ結合性タンパク質のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニンおよび２８番目のグリシンがリンカー配列であり、２９番目のグルタミンから１９６番目のグルタミンまでが抗体のＦｃ領域に結合可能なポリペプチド（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ５）のアミノ酸配列であり、１９７番目および１９８番目のグリシンがリンカー配列であり、１９９番目から２０４番目までのヒスチジンがタグ配列である。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドとも表記する）の作製方法の一例として、
（１）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（２）Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
　前記（１）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ　Ｕｓａｇｅ　Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
　本発明のポリヌクレオチドへ変異を導入する場合、エラープローンＰＣＲ法を用いることができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ヒトＦｃγＲＩＩａ（またはＦｃ結合性タンパク質）をコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入できる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、ヒトＦｃγＲＩＩａの全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。
　本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示できる。
　また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等があげられる。
　前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする）を用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする）を取得できる。なお、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現させる宿主には特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。なお動物細胞や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。
　本発明の形質転換体から、本発明の発現ベクターを調製するには、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質を製造できる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明のベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらにグリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示できる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導できる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
　本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収するには、本発明の形質転換体における本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕して本発明のＦｃ結合性タンパク質を抽出した後、精製すればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製できる。得られた本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４のいずれを用いてもよい。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に結合させることで、本発明の吸着剤を製造できる。前記不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
　Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化するには、不溶性担体にＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してヒトＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｒｅｓｉｎ（サーモサイエンティフィック社製）が例示できる。
　一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。
　担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（α―マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンー１－カルボニル－６－アミノヘキサン酸、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンー１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
　担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。
　担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性や本発明のＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる本発明の吸着剤を用いて抗体を精製するには、例えば、本発明の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む緩衝液をポンプ等の送液手段を用いて添加することで、抗体を本発明の吸着剤に特異的に吸着させた後、適切な溶出液をカラムに添加することで抗体を溶出すればよい。なお本発明の吸着剤で精製可能な抗体は、Ｆｃ結合性タンパク質と親和性を有する抗体のＦｃ領域を少なくとも含んだ抗体であればよい。一例として、抗体医薬に用いる抗体として一般的に用いられているキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体やそれらのアミノ酸置換体があげられる。また二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）、抗体のＦｃ領域と他のタンパク質との融合抗体、抗体のＦｃ領域と薬物との複合体（ＡＤＣ）などの人工的に構造改変した抗体であっても、本発明の吸着剤で精製できる。また抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に精製できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示でき、緩衝液のｐＨは、ｐＨ３．０から１０．０、好ましくはｐＨ５．０から８．０である。
　本発明の吸着剤に吸着した抗体を溶出させるには、抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化、塩濃度変化が例示できる。本発明の吸着剤に吸着した抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、本発明の吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０、さらに好ましくはｐＨ３．３から４．０である。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質は、天然型ヒトＦｃγＲＩＩａの細胞外領域中の特定位
置におけるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換または欠失させたタンパク質である。本発明のＦｃ結合性タンパク質は天然型ヒトＦｃγＲＩＩａと比較し、酸に対する安定性が向上している。そのため、本発明のＦｃ結合性タンパク質は抗体（イムノグロブリン）を分離するための吸着剤のリガンドとして有用である。
ヒトＦｃγＲＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。 配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対して１箇所または２箇所アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質の耐酸性を評価した結果を示す図である。
　以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　実施例１　Ｆｃ結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
　配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質を発現する発現ベクターｐＥＴ－Ａｍ６のうち、前記Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号４）に対し、エラープローンＰＣＲによるランダム変異導入を施した。なお配列番号３に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質は、配列番号２に記載の配列からなる、天然型ヒトＦｃγＲＩＩａの細胞外領域を含むＦｃ結合性タンパク質に以下に示す６箇所のアミノ酸置換を導入したものである。
配列番号２の６８番目（配列番号１では７３番目）のイソロイシンのバリンへの置換
配列番号２の８０番目（配列番号１では８５番目）のヒスチジンのグルタミンへの置換
配列番号２の８４番目（配列番号１では８９番目）のセリンのスレオニンへの置換
配列番号２の９０番目（配列番号１では９５番目）のアスパラギンのスレオニンへの置換
配列番号２の９１番目（配列番号１では９６番目）のアスパラギンのセリンへの置換
配列番号２の１２５番目（配列番号１では１３０番目）のヒスチジンのアルギニンへの置換
　（１）前述したｐＥＴ－Ａｍ６を鋳型ＤＮＡとして用い、エラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、配列番号８および９に記載のプライマーを用いて、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションした。
　（３）ライゲーション反応終了後、反応液をヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃で１８時間）後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
　実施例２　耐酸性Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
　（１）実施例１で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３０℃で一晩振とう培養した。
　（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
　（３）培養後、遠心操作によって得られた各Ｆｃ結合性タンパク質を含む培養上清２０μＬと０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）８０μＬを混合し、２５℃で２４時間静置した。
　（４）（３）の酸処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（３）の酸処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、それぞれ下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、酸処理を行なった時のＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、酸処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（４－１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ　ＭＩＬＫ（ＢＤ社製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（４－２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ　２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。
（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４－４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　（５）（４）の方法で約７００株の形質転換体を評価し、その中から配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質と比較して酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて発現ベクターを調製した。
　（６）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　ｒｅａｄ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００　ＤＮＡ　ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて塩基配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。なお当該解析の際、配列番号８または９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドのいずれかをシークエンス用プライマーとして使用した。
　（５）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対するアミノ酸置換位置および酸処理後の残存活性（％）をまとめたものを図２に示す。Ｐｒｏ４２Ｇｌｎ（この表記は配列番号２の４２番目（配列番号１では４７番目）のプロリンがグルタミンに置換されていることを表す、以下同じ）、Ｐｒｏ６３Ｌｅｕ、Ａｓｎ７５Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１６３Ｈｉｓ、Ａｓｐ１７９Ｖａｌ、Ｌｅｕ１９０Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１９８Ｖａｌ、Ｉｌｅ４５Ｔｈｒ、Ｇｌｎ６９Ｌｅｕ、Ｐｒｏ８３ＬｅｕまたはＴｈｒ１２３Ｐｒｏのアミノ酸置換を導入したＦｃ結合性タンパク質は、Ｃｏｎｔｒｏｌと比較し、酸安定性が向上していることがわかる。したがって、ヒトＦｃγＲＩＩａの細胞外領域において、前記１１箇所のアミノ酸置換のうち少なくともいずれか１つ以上有することで、酸安定性（耐酸性）が向上することがわかる。中でもＬｅｕ１９０Ｓｅｒは、残存活性が最も高いことから、ヒトＦｃγＲＩＩａの細胞外領域において、少なくともＬｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換を有したＦｃ結合性タンパク質は、酸安定性（耐酸性）が特に向上することがわかる。
　本実施例で取得した、酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質のうち、Ｌｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換を有したＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６に、それぞれ示す。なお、配列番号５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）および２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２０１番目の（Ｇｌｎ）までがＦｃ領域に結合可能なポリペプチド（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７）、２０２番目および２０３番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２０４番目から２０９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。またＦｃγＲＩＩａ－ｍ７は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、Ｉｌｅ６８Ｖａｌ、Ｈｉｓ８０Ｇｌｎ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ａｓｎ９０Ｔｈｒ、Ａｓｎ９１Ｓｅｒ、Ｈｉｓ１２５ＡｒｇおよびＬｅｕ１９０Ｓｅｒのアミノ酸置換を有する、ポリペプチドである。
　実施例３　さらなるアミノ酸置換の導入（その１）
　実施例２で判明したＦｃ結合性タンパク質の酸安定性向上に関与するアミノ酸置換を、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７にさらに導入することで、さらなる酸安定性向上を図った。アミノ酸置換の導入（集積）は主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）から（ｄ）に示す４種類のポリペプチドを作製した。
（ａ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に対し、さらにＩｌｅ４５Ｔｈｒのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ａと命名）
（ｂ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に対し、さらにＧｌｎ６９Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂと命名）
（ｃ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に対し、さらにＰｒｏ８３Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｃと命名）
（ｄ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に対し、さらにＴｈｒ１２３Ｐｒｏのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄと命名）
　以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
　（ａ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ａ
　実施例２で明らかとなった酸安定性向上に関与するアミノ酸置換の中からＩｌｅ４５Ｔｈｒを選択し、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に集積したＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ａを作製した。具体的には、実施例２で得られたＦｃγＲＩＩａ－ｍ７をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｉｌｅ４５Ｔｈｒを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ａを作製した。
（ａ－１）実施例２で取得した、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７を含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を鋳型とし、配列番号８および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ａ－Ｆと命名した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（ａ－２）（ａ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２６および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ａ－Ｓと命名した。
（ａ－３）（ａ－１）および（ａ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ８Ａ－Ｆ、ｍ８Ａ－Ｓ）を混合し、表３に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ８Ａ－Ｆとｍ８Ａ－Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ８Ａ－ＦＬを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（ａ－４）（ａ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ８Ａ－ＦＬを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは表４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ａをコードするポリヌクレオチドを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（ａ－５）（ａ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に対してさらに一か所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ｍ８Ａを得た。
（ａ－７）ｐＥＴ－ｍ８のヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ａのアミノ酸配列を配列番号１１に、前記ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１０に示す。なお、配列番号１１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２０１番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ａのアミノ酸配列（配列番号１の３４番目から２０６番目までの領域に相当）、２０２番目および２０３番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２０４番目から２０９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
　（ｂ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂ
　実施例２で明らかとなった酸安定性向上に関与するアミノ酸置換の中からＧｌｎ６９Ｌｅｕを選択し、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に集積したＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂを作製した。具体的には、実施例２で得られたＦｃγＲＩＩａ－ｍ７をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｇｌｎ６９Ｌｅｕを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂを作製した。
（ｂ－１）実施例２で取得した、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７を含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を鋳型とし、配列番号８および配列番号２９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様な方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ｂ－Ｆと命名した。
（ｂ－２）（ｂ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ｂ－Ｓと命名した。
（ｂ－３）（ｂ－１）で得られたｍ８Ｂ－Ｆおよび（ｂ－２）で得られたｍ８Ｂ－ＳをＰＣＲ産物とした他は、（ａ－３）と同様な方法でＰＣＲを行ない、ｍ８Ｂ－Ｆとｍ８Ｂ－Ｓを連結したＰＣＲ産物ｍ８Ｂ－ＦＬを得た。
（ｂ－４）（ｂ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ８Ｂ－ＦＬを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－４）と同様な方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ－５）（ｂ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に対してさらに一か所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂを得た。
（ｂ－７）ｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂのヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂのアミノ酸配列を配列番号１３に、前記ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１２に示す。なお、配列番号１３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２０１番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂのアミノ酸配列（配列番号１の３４番目から２０６番目までの領域に相当）、２０２番目および２０３番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２０４番目から２０９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
　（ｃ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｃ
　実施例２で明らかとなった酸安定性向上に関与するアミノ酸置換の中からＰｒｏ８３Ｌｅｕを選択し、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に集積したＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｃを作製した。具体的には、実施例２で得られたＦｃγＲＩＩａ－ｍ７をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｐｒｏ８３Ｌｅｕを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｃを作製した。
（ｃ－１）実施例２で取得した、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７を含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を鋳型とし、配列番号８および配列番号３１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様な方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ｃ－Ｆと命名した。
（ｃ－２）（ｃ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号３０および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ｃ－Ｓと命名した。
（ｃ－３）（ｃ－１）で得られたｍ８Ｃ－Ｆおよび（ｃ－２）で得られたｍ８Ｃ－ＳをＰＣＲ産物とした他は、（ａ－３）と同様な方法でＰＣＲを行ない、ｍ８Ｃ－Ｆとｍ８Ｃ－Ｓを連結したＰＣＲ産物ｍ８Ｃ－ＦＬを得た。
（ｃ－４）（ｃ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ８Ｃ－ＦＬを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－４）と同様な方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｃをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｃ－５）（ｃ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に対してさらに一か所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｃをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｃを得た。
（ｃ－７）ｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｃのヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｃのアミノ酸配列を配列番号１５に、前記ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｃをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４に示す。なお、配列番号１５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２０１番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｃのアミノ酸配列（配列番号１の３４番目から２０６番目までの領域に相当）、２０２番目および２０３番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２０４番目から２０９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
　（ｄ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄ
　実施例２で明らかとなった酸安定性向上に関与するアミノ酸置換の中からＴｈｒ１２３Ｐｒｏを選択し、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に集積したＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄを作製した。具体的には、実施例２で得られたＦｃγＲＩＩａ－ｍ７をコードするポリヌクレオチドに対して、Ｔｈｒ１２３Ｐｒｏを生じさせる変異導入を行なうでＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄを作製した。
（ｄ－１）実施例２で取得した、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７を含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を鋳型とし、配列番号８および配列番号３３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様な方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ｄ－Ｆと命名した。
（ｄ－２）（ｄ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号３２および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ８Ｄ－Ｓと命名した。
（ｄ－３）（ｄ－１）で得られたｍ８Ｃ－Ｆおよび（ｄ－２）で得られたｍ８Ｃ－ＳをＰＣＲ産物とした他は、（ａ－３）と同様な方法でＰＣＲを行ない、ｍ８Ｄ－Ｆとｍ８Ｄ－Ｓを連結したＰＣＲ産物ｍ８Ｄ－ＦＬを得た。
（ｄ－４）（ｄ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ８Ｄ－ＦＬを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－４）と同様な方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｄ－５）（ｄ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｄ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に対してさらに一か所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄを得た。
（ｄ－７）ｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄのヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄのアミノ酸配列を配列番号１７に、前記ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１６に示す。なお、配列番号１７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２０１番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄのアミノ酸配列（配列番号１の３４番目から２０６番目までの領域に相当）、２０２番目および２０３番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２０４番目から２０９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
　実施例４　Ｆｃ結合性タンパク質の酸安定性評価（その１）
　（１）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ６、ならびに実施例３で作製したＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ａ、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂ、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８ＣおよびＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄを発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
　（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地に前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
　（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養を行なった。
　（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
　（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中のＦｃγＲＩＩａ－ｍ６、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ａ、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｂ、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８ＣおよびＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄの抗体結合活性を、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。このとき、精製し定量したＦｃγＲＩＩａ－ｍ６を用いて検量線を作製し、タンパク質濃度測定を行なった。
　（６）各Ｆｃ結合性タンパク質の濃度が１０μｇ／ｍＬとなるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液５０μＬと２０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）溶液５０μＬとを混合し、３０℃で２４時間静置することで酸処理を行なった。その後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和し、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。
　（７）酸処理を行なった場合の抗体結合活性を、酸処理を行わなかったときの抗体結合活性で除することによって、残存活性を算出し、酸安定性を評価した。
　結果を表５に示す。実施例３で作製したＦｃ結合性タンパク質のうち、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８ＢおよびＦｃγＲＩＩａ－ｍ８ＤはＦｃγＲＩＩａ－ｍ６と比較して残存活性が高いことから、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ６に比べて酸安定性が向上していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例５　さらなるアミノ酸置換の導入（その２）
　実施例２で判明したＦｃ結合性タンパク質の酸安定性向上に関与するアミノ酸置換を、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄにさらに導入することで、さらなる酸安定性向上を図った。アミノ酸置換の導入（集積）は、主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）から（ｃ）に示す３種類のポリペプチドを作製した。
（ａ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄに対し、さらにＩｌｅ４５ＴｈｒおよびＧｌｎ６９Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａと命名）
（ｂ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄに対し、さらにＩｌｅ４５ＴｈｒおよびＰｒｏ８３Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｂと命名）
（ｃ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄに対し、さらにＧｌｎ６９ＬｅｕおよびＰｒｏ８３Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したポリペプチド（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃと命名）
　以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
　（ａ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａ
　実施例２で明らかとなった酸安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｉｌｅ４５ＴｈｒおよびＧｌｎ６９Ｌｅｕを選択し、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄに集積したＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａを作製した。具体的には、実施例３（ｄ）で得られたＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄをコードするポリヌクレオチドに対して、Ｉｌｅ４５ＴｈｒおよびＧｌｎ６９Ｌｅｕを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａを作製した。
（ａ－１）実施例３（ｄ）で取得した、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄを含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６）を鋳型とし、配列番号８および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－１）と同様な方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ａ－Ｆと命名した。
（ａ－２）（ａ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２６および配列番号２９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ａ－Ｓと命名した。
（ａ－３）（ａ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ａ－Ｔと命名した。
（ａ－４）（ａ－１）で得られたｍ１０Ａ－Ｆ、（ａ－２）で得られたｍ１０Ａ－Ｓおよび（ａ－３）で得られたｍ１０Ａ－ＴをＰＣＲ産物とした他は、実施例３（ａ－３）と同様な方法でＰＣＲを行ない、ｍ１０Ａ－Ｆ、ｍ１０Ａ－Ｓおよびｍ１０Ａ－Ｔを連結したＰＣＲ産物ｍ１０Ａ－ＦＬを得た。
（ａ－５）（ａ－４）で得られたＰＣＲ産物ｍ１０Ａ－ＦＬを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－４）と同様な方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ａ－６）（ａ－５）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ－７）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に対してさらに三か所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａを得た。
（ａ－８）ｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａのアミノ酸配列を配列番号１９に、前記ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１８に示す。なお、配列番号１９において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２０１番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａのアミノ酸配列（配列番号１の３４番目から２０６番目までの領域に相当）、２０２番目および２０３番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２０４番目から２０９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
　（ｂ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｂ
　実施例２で明らかとなった酸安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｉｌｅ４５ＴｈｒおよびＰｒｏ８３Ｌｅｕを選択し、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄに集積したＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｂを作製した。具体的には、実施例３（ｄ）で得られたＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄをコードするポリヌクレオチドに対して、Ｉｌｅ４５ＴｈｒおよびＰｒｏ８３Ｌｅｕを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｂを作製した。
（ｂ－１）実施例３（ｄ）で取得した、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄを含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６）を鋳型とし、配列番号８および配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－１）と同様な方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ｂ－Ｆと命名した。
（ｂ－２）（ｂ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２６および配列番号３１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ｂ－Ｓと命名した。
（ｂ－３）（ｂ－２）と同じポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号３０および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ｂ－Ｔと命名した。
（ｂ－４）（ｂ－１）で得られたｍ１０Ｂ－Ｆ、（ｂ－２）で得られたｍ１０Ｂ－Ｓおよび（ｂ－３）で得られたｍ１０Ｂ－ＴをＰＣＲ産物とした他は、実施例３（ａ－３）と同様な方法でＰＣＲを行ない、ｍ１０Ｂ－Ｆ、ｍ１０Ｂ－Ｓおよびｍ１０Ｂ－Ｔを連結したＰＣＲ産物ｍ１０Ｂ－ＦＬを得た。
（ｂ－５）（ｂ－４）で得られたＰＣＲ産物ｍ１０Ｂ－ＦＬを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－４）と同様な方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｂをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ－６）（ｂ－５）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ－７）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に対してさらに三か所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｂを得た。
（ｂ－８）ｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｂのヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｂのアミノ酸配列を配列番号２１に、前記ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２０に示す。なお、配列番号２１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２０１番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｂのアミノ酸配列（配列番号１の３４番目から２０６番目までの領域に相当）、２０２番目および２０３番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２０４番目から２０９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
　（ｃ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃ
　実施例２で明らかとなった酸安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｎ６９ＬｅｕおよびＰｒｏ８３Ｌｅｕを選択し、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄに集積したＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃを作製した。具体的には、実施例３（ｄ）で得られたＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄをコードするポリヌクレオチドに対して、Ｇｌｎ６９ＬｅｕおよびＰｒｏ８３Ｌｅｕを生じさせる変異導入を行なうことでＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃを作製した。
（ｃ－１）実施例３（ｄ）で取得した、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄを含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６）を鋳型とし、配列番号８および配列番号２９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－１）と同様な方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ｃ－Ｆと命名した。
（ｃ－２）（ｃ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号２８および配列番号３１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ｃ－Ｓと命名した。
（ｃ－３）（ｃ－１）と同じポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号３０および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１０Ｃ－Ｔと命名した。
（ｃ－４）（ｃ－１）で得られたｍ１０Ｃ－Ｆ、（ｃ－２）で得られたｍ１０Ｃ－Ｓおよび（ｃ－３）で得られたｍ１０Ｃ－ＴをＰＣＲ産物とした他は、実施例３（ａ－３）と同様な方法でＰＣＲを行ない、ｍ１０Ｃ－Ｆとｍ１０Ｃ－Ｓ、およびｍ１０Ｃ－Ｔを連結したＰＣＲ産物ｍ１０Ｃ－ＦＬを得た。
（ｃ－５）（ｃ－４）で得られたＰＣＲ産物ｍ１０Ｃ－ＦＬを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－４）と同様な方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｃ－６）（ｃ－５）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ－７）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に対してさらに三か所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃを得た。
（ｃ－８）ｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃのヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃのアミノ酸配列を配列番号２３に、前記ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２２に示す。なお、配列番号２３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２０１番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃのアミノ酸配列（配列番号１の３４番目から２０６番目までの領域に相当）、２０２番目および２０３番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２０４番目から２０９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
　実施例６　さらなるアミノ酸置換の導入（その３）
　実施例２で判明したＦｃ結合性タンパク質の酸安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｉｌｅ４５Ｔｈｒ、Ｇｌｎ６９ＬｅｕおよびＰｒｏ８３Ｌｅｕを選択し、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ８Ｄにさらに導入することで、さらなる酸安定性向上を図った。具体的には、実施例５（ａ）で得られたＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａをコードするポリヌクレオチドに対して、Ｐｒｏ８３Ｌｅｕを生じさせる変異導入を行なうことで作製した（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１と命名）。以下、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１の作製方法を詳細に説明する。
　（１）実施例５（ａ）で取得した、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａを含んだＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８）を鋳型とし、配列番号８および配列番号３１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－１）と同様な方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１１－Ｆと命名した。
　（２）（１）と同じポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号３０および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－１）と同様な方法でＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製を行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１１－Ｓと命名した。
　（３）（１）で得られたｍ１１－Ｆおよび（２）で得られたｍ１１－ＳをＰＣＲ産物とした他は、実施例３（ａ－３）と同様な方法でＰＣＲを行ない、ｍ１１－Ｆとｍ１１－Ｓを連結したＰＣＲ産物ｍ１１－ＦＬを得た。
　（４）（３）で得られたＰＣＲ産物ｍ１１－ＦＬを鋳型とし、配列番号８および配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例３（ａ－４）と同様な方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１をコードするポリヌクレオチドを作製した。
　（５）（４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
　（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ７に対してさらに四か所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１を得た。
　（７）ｐＥＴ－ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のヌクレオチド配列の解析を、実施例２（６）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のアミノ酸配列を配列番号２５に、前記ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２４に示す。なお、配列番号２５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、２９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２０１番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のアミノ酸配列（配列番号１の３４番目から２０６番目までの領域に相当）、２０２番目および２０３番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２０４番目から２０９番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
　実施例７　Ｆｃ結合性タンパク質の酸安定性評価（その２）
　（１）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ６、実施例５で作製したＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａ、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０ＢおよびＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ｃ、ならびに実施例６で作製したＦｃγＩＩａ－ｍ１１を発現する形質転換体を、実施例４（１）から（４）と同様な方法で培養し抽出することで、これらタンパク質を調製した。
　（２）（１）で調製したタンパク質抽出液中のＦｃγＲＩＩａ－ｍ６、３種類のＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０、およびＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１の抗体結合活性を、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。このとき、精製し定量したＦｃγＲＩＩａ－ｍ６を用いて検量線を作製し、タンパク質濃度測定を行なった。
　（３）各Ｆｃ結合性タンパク質の濃度が１０μｇ／ｍＬとなるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液５０μＬと２０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）溶液５０μＬとを混合し、３０℃で２４時間静置することで酸処理を行なった。その後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和し、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。
　（４）酸処理を行なった場合の抗体結合活性を、酸処理を行わなかったときの抗体結合活性で除することによって、残存活性を算出し、酸安定性を評価した。
　結果を表６に示す。ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０Ａ、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１０ＣおよびＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１はＦｃγＲＩＩａ－ｍ６と比較して残存活性が高いことから、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ６に比べて酸安定性が向上していることが確認された。中でもＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１は残存活性が９５．３％と高く、酸安定性が特に向上したＦｃ結合性タンパク質といえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　実施例８　ループ領域にあるアミノ酸残基の欠失
　さらなる酸安定性向上のため、公知データベースに登録されているＦｃγＲＩＩａの結晶構造データ（ＰＤＢ　ＩＤ：１ＦＣＧ）の知見に基づき、ＦｃγＲＩＩａにおけるループ領域に位置しているアミノ酸残基を欠失させた。具体的には、下記（ａ）から（ｊ）に示す、実施例６で得られたＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のうち、ループ領域（配列番号２５の５８番目のグルタミンから６７番目のセリンまでの領域）の一部または全てのアミノ酸残基を欠失させたＦｃ結合性タンパク質を下記の方法で作製した。
（ａ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のうち、６２番目のセリンを欠失させたＦｃ結合性タンパク質（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ１と命名）
（ｂ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のうち、６２番目のセリンおよび６４番目のグルタミン酸を欠失させたＦｃ結合性タンパク質（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ２と命名）
（ｃ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のうち、６２番目のセリンから６４番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基を欠失させたＦｃ結合性タンパク質（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ３と命名）
（ｄ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のうち、６１番目のアルギニンから６４番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基を欠失させたＦｃ結合性タンパク質（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ４と命名）
（ｅ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のうち、６１番目のアルギニンから６５番目のセリンまでのアミノ酸残基を欠失させたＦｃ結合性タンパク質（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ５と命名）
（ｆ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のうち、６０番目のアラニンから６５番目のセリンまでのアミノ酸残基を欠失させたＦｃ結合性タンパク質（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ６と命名）
（ｇ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のうち、５９番目のグリシンから６５番目のセリンまでのアミノ酸残基を欠失させたＦｃ結合性タンパク質（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ７と命名）
（ｈ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のうち、５９番目のグリシンから６６番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を欠失させたＦｃ結合性タンパク質（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ８と命名）
（ｉ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のうち、５９番目のグリシンから６７番目のセリンまでのアミノ酸残基を欠失させたＦｃ結合性タンパク質（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ９と命名）
（ｊ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１のうち、５８番目のグルタミンから６７番目のセリンまでのアミノ酸残基を欠失させたＦｃ結合性タンパク質（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ１０と命名）
　（１）前記１０種類のＦｃ結合性タンパク質欠失体を含んだポリヌクレオチド（（ａ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ１：配列番号３４、（ｂ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ２：配列番号３６、（ｃ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ３：配列番号３８、（ｄ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ４：配列番号４０、（ｅ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ５：配列番号４２、（ｆ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ６：配列番号４４、（ｇ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ７：配列番号４６、（ｈ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ８：配列番号４８、（ｉ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ９：配列番号５０、（ｊ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ１０：配列番号５２）を人工遺伝子合成により作製した（ファスマック社に依頼）。
　（２）（１）で作製したポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
　（３）得られた形質転換体を、実施例４（１）から（４）と同様な方法で培養し抽出することで、これらタンパク質を調製した。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加した（ａ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ１のアミノ酸配列を配列番号３５に、シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加した（ｂ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ２のアミノ酸配列を配列番号３７に、シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加した（ｃ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ３のアミノ酸配列を配列番号３９に、シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加した（ｄ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ４のアミノ酸配列を配列番号４１に、シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加した（ｅ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ５のアミノ酸配列を配列番号４３に、シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加した（ｆ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ６のアミノ酸配列を配列番号４５に、シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加した（ｇ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ７のアミノ酸配列を配列番号４７に、シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加した（ｈ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ８のアミノ酸配列を配列番号４９に、シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加した（ｉ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ９のアミノ酸配列を配列番号５１に、シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加した（ｊ）ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ１０のアミノ酸配列を配列番号５３に、それぞれ示す。なおこれら配列において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、Ｃ末端側ヒスチジン（Ｈｉｓ）６残基がタグ配列であり、Ｃ末端から７番目および８番目のグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、その他の領域がＦｃ領域に結合可能なポリペプチド（ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ１、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ２、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ３、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ４、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ５、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ６、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ７、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ８、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ９またはＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ１０）である。
　実施例９　Ｆｃ結合性タンパク質の酸安定性評価（その３）
　（１）実施例６で作製したＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１を発現する形質転換体を、実施例４（１）から（４）と同様な方法で培養し抽出することでタンパク質を調製した。
　（２）（１）および実施例８で調製したタンパク質抽出液中の抗体結合活性を、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。このとき、精製し定量したＦｃγＲＩＩａ－ｍ６を用いて検量線を作製し、タンパク質濃度測定を行なった。なお、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ８、同Ｄｅｌ９および同Ｄｅｌ１０は、タンパク質発現量が不十分のため、タンパク質濃度測定ができなかった。
　（３）各Ｆｃ結合性タンパク質の濃度が１０μｇ／ｍＬとなるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液５０μＬと２０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）溶液５０μＬとを混合し、３０℃で７２時間静置することで酸処理を行なった。その後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和し、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。
　（４）酸処理を行なった場合の抗体結合活性を、酸処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することにより、残存活性を算出し、酸安定性を評価した。
　結果を表７に示す。ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ１およびＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１－Ｄｅｌ５はＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１と比較して７２時間処理後の残存活性が高いことから、ＦｃγＲＩＩａ－ｍ１１に比べて長期間における酸安定性が向上していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　本発明を詳細に、また特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の本質と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
　なお、２０１８年２月２２日に出願された日本特許出願２０１８－０２９９９４号、２０１８年８月２０日に出願された日本特許出願２０１８－１５４００７号、２０１９年１月１１日に出願された日本特許出願２０１９－００３０３８号、の明細書、配列表、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (13)

  1. 以下の（Ｉ）～（ＩＶ）から選択されるＦｃ結合性タンパク質：
    （Ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、以下の（１）から（１２）に示すいずれかのアミノ酸置換または欠失を少なくとも１つ以上有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
    （１）配列番号２の１９０番目のロイシンのセリンへの置換
    （２）配列番号２の４５番目のイソロイシンのスレオニンへの置換
    （３）配列番号２の６９番目のグルタミンのロイシンへの置換
    （４）配列番号２の８３番目のプロリンのロイシンへの置換
    （５）配列番号２の１２３番目のスレオニンのプロリンへの置換
    （６）配列番号２の４２番目のプロリンのグルタミンへの置換
    （７）配列番号２の６３番目のプロリンのロイシンへの置換
    （８）配列番号２の７５番目のアスパラギンのセリンへの置換
    （９）配列番号２の１６３番目のロイシンのヒスチジンへの置換
    （１０）配列番号２の１７９番目のアスパラギン酸のバリンへの置換
    （１１）配列番号２の１９８番目のイソロイシンのバリンへの置換
    （１２）配列番号２の６２番目のセリンの欠失
    （ＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、前記（１）から（１２）に示すいずれかのアミノ酸置換または欠失を少なくとも１つ以上有し、さらに前記（１）から（１２）に示すアミノ酸置換または欠失以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質；
    （ＩＩＩ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ前記（１）から（１２）に示すいずれかのアミノ酸置換または欠失を少なくとも１つ以上有し、かつ抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
    （ＩＶ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において前記（１）から（１２）に示すいずれか１以上のアミノ酸置換または欠失を有するアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくとも１つのアミノ酸置換または欠失が残存したアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。
  2. 以下の（１）に示すアミノ酸置換を少なくとも有する、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質。
    （１）配列番号２の１９０番目のロイシンのセリンへの置換
  3. さらに以下に示す６箇所のアミノ酸置換を少なくとも有する、請求項１または２に記載のＦｃ結合性タンパク質。
    配列番号２の６８番目のイソロイシンのバリンへの置換
    配列番号２の８０番目のヒスチジンのグルタミンへの置換
    配列番号２の８４番目のセリンのスレオニンへの置換
    配列番号２の９０番目のアスパラギンのスレオニンへの置換
    配列番号２の９１番目のアスパラギンのセリンへの置換
    配列番号２の１２５番目のヒスチジンのアルギニンへの置換
  4. 以下の（ｉｖ）～（ｖｉ）から選択される、請求項１または２に記載のＦｃ結合性タンパク質：
    （ｉｖ）配列番号５、７、１３、１７、１９、２３および２５のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
    （ｖ）配列番号５、７、１３、１７、１９、２３および２５のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
    （ｖｉ）配列番号５、７、１３、１７、１９、２３および２５のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２０１番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２０１番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換が残存し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質。
  5. 以下の（ｖｉｉ）～（ｉｘ）から選択される、請求項１から３のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質：
    （ｖｉｉ）配列番号３５に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２００番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
    （ｖｉｉｉ）配列番号３５に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２００番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２００番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換および欠失以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
    （ｉｘ）配列番号３５に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから２００番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から２００番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質。
  6. 以下の（ｘ）～（ｘｉｉ）から選択される、請求項１から３のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質：
    （ｘ）配列番号４３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから１９６番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
    （ｘｉ）配列番号４３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから１９６番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から１９６番目までのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換および欠失以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
    （ｘｉｉ）配列番号４３に記載のアミノ酸配列のうち、２９番目のグルタミンから１９６番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２９番目から１９６番目までのアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換が残存し、かつ抗体結合活性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質。
  7. 　請求項１から６のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポヌクレオチド。
  8. 　請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  9. 　請求項８に記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
  10. 　宿主が大腸菌である、請求項９に記載の形質転換体。
  11. 　請求項９または１０に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記Ｆｃ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
  12. 　請求項１から６のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、抗体吸着剤。
  13. 　請求項１１に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。
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