WO2015041303A1 - Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた抗体の精製方法および識別方法 - Google Patents

Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた抗体の精製方法および識別方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015041303A1
WO2015041303A1 PCT/JP2014/074739 JP2014074739W WO2015041303A1 WO 2015041303 A1 WO2015041303 A1 WO 2015041303A1 JP 2014074739 W JP2014074739 W JP 2014074739W WO 2015041303 A1 WO2015041303 A1 WO 2015041303A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
amino acid
replaced
binding protein
antibody
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/074739
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
義晴 朝岡
田中　亨
井出　輝彦
Original Assignee
東ソー株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2014166884A external-priority patent/JP2015083558A/ja
Priority claimed from JP2014166883A external-priority patent/JP6507522B2/ja
Application filed by 東ソー株式会社 filed Critical 東ソー株式会社
Priority to EP14846295.5A priority Critical patent/EP3048112B1/en
Priority to CN201480051782.XA priority patent/CN105555801B/zh
Priority to US15/022,130 priority patent/US10611817B2/en
Publication of WO2015041303A1 publication Critical patent/WO2015041303A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof

Definitions

  • the present invention relates to an Fc-binding protein having affinity for immunoglobulin, an antibody adsorbent using the protein, and a method for purifying and identifying an antibody using the adsorbent. More specifically, the present invention relates to an Fc-binding protein having higher stability against heat and acid than wild type, a method for producing the protein, and an antibody adsorbent obtained by immobilizing the protein on an insoluble carrier. In particular, the present invention relates to an adsorbent capable of specifically adsorbing an antibody having a sugar chain among antibodies, a method for purifying an antibody having a sugar chain using the adsorbent, and whether or not a sugar chain is added to the antibody. It relates to a method for identifying.
  • Fc receptors are a group of molecules that bind to the Fc region of immunoglobulin molecules. Individual molecules recognize a single or the same group of immunoglobulin isotypes by a recognition domain on the Fc receptor by a recognition domain belonging to the immunoglobulin superfamily. This determines which accessory cells are driven in the immune response. Fc receptors can be further classified into several subtypes, such as Fc ⁇ receptors that are receptors for IgG (immunoglobulin G), Fc ⁇ receptors that bind to the Fc region of IgE, Fc ⁇ receptors that bind to the Fc region of IgA, etc. There is.
  • Fc ⁇ receptors have been reported to have Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RIIa, Fc ⁇ RIIb, Fc ⁇ RIIIa, and Fc ⁇ RIIIb (Non-patent Document 1: Takai. T., Jpn. J. Clin. Immunol. , 28, 318-326, 2005).
  • Fc ⁇ RIIIa is present on the surface of natural killer cells (NK cells) and macrophages, and is an important receptor involved in ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) activity, which is important in the human immune system. It is.
  • NK cells natural killer cells
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the structure of human Fc ⁇ RIIIa.
  • the amino acid numbers in FIG. 1 correspond to the amino acid numbers described in SEQ ID NO: 1. That is, the signal sequence (S) is from the first methionine (Met) to the 16th alanine (Ala) in SEQ ID NO: 1, and the extracellular region is from the 17th glycine (Gly) to the 208th glutamine (Gln).
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity activity
  • a medicine using the specificity of a monoclonal antibody
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • ADCC activity is known to change depending on the difference in the N-type sugar chain added to the 297th asparagine residue in the Fc region. It has been reported that ADCC activity is improved by an antibody from which fucose is removed (Non-patent Document 3: Shinkawa. T., J. Biol. Chem., 278, 3466-3473, 2003). That is, in antibody medicine, the sugar chain structure possessed by an antibody has an important meaning.
  • antibody drugs are usually produced using gene recombination techniques using animal cells as hosts, and it is difficult to control the sugar chains added to the antibodies in the host. In addition, it takes a lot of time and effort to analyze the sugar chain of the produced antibody.
  • the first object of the present invention is to provide an Fc-binding protein having improved stability to heat and acid, a method for producing the protein, and an antibody adsorbent using the protein. Furthermore, the second object of the present invention is to provide a method capable of identifying the presence or absence of sugar chain addition to an antibody and a material used in the method.
  • the present inventors have identified an amino acid residue involved in improving stability in human Fc ⁇ RIIIa, and substituted the amino acid residue with another amino acid residue.
  • the body was found to have excellent stability to heat and acid, and the present invention was completed.
  • the present inventors have used an adsorbent obtained by immobilizing Fc ⁇ RIIIa, which is one of the receptors for IgG (Fc ⁇ receptor), on an insoluble carrier, and thus the antibody
  • Fc ⁇ receptor one of the receptors for IgG
  • the present inventors have found that the presence or absence of sugar chain addition to can be identified, and have completed the present invention.
  • the present application includes the embodiments described in the following (A) to (Z): (A) Of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the amino acid residues from the 17th to the 192nd are included, and the amino acid residues from the 17th to the 192nd are the following (1) to (40) An Fc binding protein wherein at least one amino acid substitution has occurred.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 comprises the 17th to 192nd amino acid residues, and at least the 35th tyrosine of SEQ ID NO: 1 is asparagine in the 17th to 192nd amino acid residues.
  • the Fc-binding protein according to (A) which is substituted with any of acid, glycine, lysine, leucine, asparagine, proline, serine, threonine, and histidine.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 comprises the 17th to 192nd amino acid residues, and at least the 35th tyrosine of SEQ ID NO: 1 is asparagine in the 17th to 192nd amino acid residues.
  • (F) The Fc-binding protein according to any one of (A) to (C), further comprising at least one amino acid substitution among the following (41) to (44).
  • (41) The 66th leucine in SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine or arginine (42)
  • the 147th glycine of SEQ ID NO: 1 is replaced with aspartic acid (43)
  • the 158th tyrosine of SEQ ID NO: 1 is replaced with histidine (44 )
  • (M) A polynucleotide encoding the Fc-binding protein according to any one of (A) to (F).
  • (T) human Fc ⁇ RIIIa contains at least amino acid residues from the 17th glycine to the 192nd glutamine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and at least one of the amino acid residues is a residue of another amino acid.
  • Human Fc ⁇ RIIIa contains at least amino acid residues from the 17th glycine to the 192nd glutamine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and the following amino acid residues from the 17th to the 192nd (
  • the Fc-binding protein of the present invention is a protein having a binding property to the Fc region of an antibody, and at least of the extracellular region (EC region of FIG. 1) of human Fc ⁇ RIIIa comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid substitution at the specific position is specifically Met18Arg in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (this notation indicates that the 18th methionine of SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine, and so on.
  • substitution of any of Tyr35Asp, Tyr35Gly, Tyr35Lys, Tyr35Leu, Tyr35Asn, Tyr35Pro, Tyr35Ser, Tyr35Thr, Tyr35His, and Glu121Gly is preferable because thermal stability is improved.
  • wild-type human Fc ⁇ RIIIa is known to have a mutant in which substitution of Leu66His, Leu66Arg, Gly147Asp, Tyr158His or Val176Phe has occurred, but may contain these amino acid substitutions in addition to the amino acid substitution at the specific position. .
  • the amino acid residue at a specific position may be substituted with an amino acid other than those described above as long as it has antibody binding activity.
  • One example is a conservative substitution that substitutes between amino acids whose physical and / or chemical properties of both amino acids are similar. Conservative substitutions are not limited to Fc-binding proteins, and are generally known to those skilled in the art to maintain protein function between those with substitutions and those without substitutions. Examples of conservative substitutions include substitutions that occur between glycine and alanine, between aspartic acid and glutamic acid, between serine and proline, or between glutamic acid and alanine (protein structure and function, Medical Science International, 9 , 2005).
  • the number of amino acids to be substituted is not particularly limited.
  • Fc-binding proteins shown in the following (a) to (h) can be mentioned. These Fc-binding proteins are preferable in terms of improving heat and acid stability.
  • (A) The amino acid substitution of Val27Glu and Tyr35Asn occurs in the amino acid residues from 17th to 192th in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and from the 17th to 192nd amino acid residues.
  • Fc binding protein (Fc binding protein containing the amino acid sequence from the 33rd position to the 208th position in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27) (b) From the 17th position to the 192nd position in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1
  • Fc-binding protein comprising a column
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 comprises amino acid residues 17 to 192, and in the amino acid residues 17 to 192, Val27Glu, Fc binding protein (Fc binding protein containing the amino acid sequence from the 33rd to the 208th of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 33) in which amino acid substitution of Tyr35Asn, Phe75Leu and Glu121Gly occurs (d) in SEQ ID NO: 1 Amino acid substitution of Val27Glu, Tyr35Asn, Phe75Leu, Asn92Ser, and Glu121Gly is included in the amino acid residues from the 17th to the 192nd in the described amino acid sequence and the 17th to the 192nd amino acid residues Resulting Fc-binding protein (Fc-binding protein containing amino acid sequences from 33 to 208 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 37) (e) From 17 in the amino acid sequence
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the structure of human Fc ⁇ RIIIa.
  • the amino acid numbers in FIG. 1 correspond to the amino acid numbers described in SEQ ID NO: 1.
  • the signal sequence (S) is from the first methionine (Met) to the 16th alanine (Ala) in SEQ ID NO: 1, and the extracellular region is from the 17th glycine (Gly) to the 208th glutamine (Gln).
  • EC from the 209th valine (Val) to the 229th valine (Val) is the transmembrane region (TM) and from the 230th lysine (Lys) to the 254th lysine (Lys) is the intracellular region (C ).
  • the human Fc ⁇ RIIIa used as a ligand in the adsorbent of the present invention does not necessarily need to use the full length of human Fc ⁇ RIIIa (SEQ ID NO: 1), and at least the 192nd to 192nd glycine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. Any polypeptide containing amino acid residues up to glutamine may be used.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 contains at least amino acid residues from the 17th glycine to the 192nd glutamine, and one or more of the amino acid residues are substituted with other amino acid residues, Even an inserted or deleted polypeptide is included in human Fc ⁇ RIIIa used as a ligand in the adsorbent of the present invention.
  • the 66th leucine (Leu) is histidine (His) or arginine (Arg)
  • the 147th glycine (Gly) is aspartic acid (Asp)
  • the 158th tyrosine (Tyr) is included in human Fc ⁇ RIIIa used as a ligand in the adsorbent of the present invention.
  • the 66th leucine (Leu) is histidine (His) or arginine (Arg)
  • the 147th glycine (Gly) is aspartic acid (Asp)
  • His histidine
  • Val 176th valine
  • Phe phenylalanine
  • Human Fc ⁇ RIIIa which is a ligand of the Fc-binding protein or adsorbent of the present invention, may further be added with an oligopeptide useful for separation from a solution in the presence of contaminants on the N-terminal side or C-terminal side thereof.
  • the oligopeptide include polyhistidine, polylysine, polyarginine, polyglutamic acid, polyaspartic acid and the like.
  • cysteine-containing oligopeptide useful for immobilizing human Fc ⁇ RIIIa which is the ligand of the Fc-binding protein or adsorbent of the present invention, on a solid phase such as a chromatographic support, It may be further added to the N-terminal side or C-terminal side of human Fc ⁇ RIIIa which is a ligand of protein or adsorbent.
  • the length of the oligopeptide added to the N-terminal side or C-terminal side of human Fc ⁇ RIIIa which is a ligand of Fc-binding protein or adsorbent is the IgG binding of human Fc ⁇ RIIIa which is the ligand of Fc-binding protein or adsorbent of the present invention.
  • a polynucleotide encoding the oligopeptide is prepared and then genetic engineering is performed using methods well known to those skilled in the art.
  • oligopeptide may be added to the N-terminal side or C-terminal side of Fc-binding protein of the present invention or human Fc ⁇ RIIIa. It may be added chemically bonded to the side.
  • a signal peptide for promoting efficient expression in the host may be added to the N-terminal side of human Fc ⁇ RIIIa which is a ligand of the Fc-binding protein or adsorbent of the present invention.
  • Examples of the signal peptide in the case where the host is Escherichia coli include PelB, DsbA, MalE (uniprot No. P0AEX9 amino acid sequence from the first to the 26th region), and the periplasm such as TorT.
  • a signal peptide can be exemplified (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-097898).
  • an amino acid sequence of human Fc ⁇ RIIIa which is a ligand of the Fc-binding protein or adsorbent of the present invention, is converted into a nucleotide sequence, and a polynucleotide containing the nucleotide sequence is artificially converted.
  • DNA amplification method such as PCR method from directly synthetically,
  • a method of ligating the prepared polynucleotide with an appropriate method is an appropriate method.
  • the conversion when converting from an amino acid sequence to a nucleotide sequence, the conversion is preferably performed in consideration of the frequency of codon usage in the host to be transformed.
  • the host is Escherichia coli
  • AGA / AGG / CGG / CGA is used for arginine (Arg)
  • ATA is used for isoleucine (Ile)
  • CTA is used for leucine (Leu)
  • GGA is used for glycine (Gly).
  • CCC is less frequently used in proline (Pro) (because it is a so-called rare codon)
  • it may be converted so as to avoid those codons.
  • Analysis of codon usage frequency can also be performed by using a public database (for example, Codon Usage Database on the homepage of Kazusa DNA Research Institute).
  • an error-prone PCR method can be used.
  • the reaction conditions in the error-prone PCR method are not particularly limited as long as a desired mutation can be introduced into a polynucleotide encoding human Fc ⁇ RI (or Fc-binding protein).
  • deoxynucleotides which are substrates
  • polynucleotides by making the concentration of dATP / dTTP / dCTP / dGTP polynucleotides by making the concentration of dATP / dTTP / dCTP / dGTP
  • MnCl 2 polynucleotides by making the concentration of dATP / dTTP / dCTP / dGTP
  • Mutations can be introduced.
  • a polynucleotide containing a whole or partial sequence of human Fc ⁇ RI is contacted / acted with a mutagen agent or irradiated with ultraviolet rays to mutate the polynucleotide.
  • the method of producing by introducing is mentioned.
  • a drug used as a mutagen in this method a mutagenic drug commonly used by those skilled in the art such as hydroxylamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfite, hydrazine may be used. .
  • the polynucleotide of the present invention When transforming a host using the polynucleotide of the present invention, the polynucleotide of the present invention itself may be used, but an expression vector (for example, bacteriophage, cosmid, or the like commonly used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells) may be used. It is more preferable to use a plasmid or the like in which the polynucleotide of the present invention is inserted at an appropriate position.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is stably present in the host to be transformed and can be replicated.
  • pET plasmid vector When Escherichia coli is used as a host, pET plasmid vector, pUC plasmid vector, pTrc plasmid vector, pCDF plasmid vector A pBBR plasmid vector can be exemplified.
  • the appropriate position means a position where the replication function of the expression vector, a desired antibiotic marker, and a region related to transmissibility are not destroyed.
  • promoter examples include trp promoter, tac promoter, trc promoter, lac promoter, T7 promoter, recA promoter, lpp promoter, ⁇ phage ⁇ PL promoter, ⁇ PR promoter and the like when the host is Escherichia coli.
  • the expression vector of the present invention In order to transform a host using the expression vector inserted with the polynucleotide of the present invention (hereinafter referred to as the expression vector of the present invention) produced by the above-described method, a person skilled in the art may carry out the method.
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia E. coli JM109 strain, E. coli BL21 (DE3) strain, E. coli W3110 strain, etc.
  • known literature eg, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 256, 1992. And the like.
  • a transformant capable of expressing the Fc-binding protein of the present invention (hereinafter referred to as the transformant of the present invention). ) Can be obtained.
  • the host which expresses human FcgammaRIIIa which is the ligand of Fc binding protein or adsorption agent of this invention As an example, an animal cell (CHO cell, HEK cell, Hela cell, COS cell etc.), yeast (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces octosporus, such as Schizosaccharomyces pombe), insect cells (Sf9, Sf21, etc.), E.
  • an alkaline extraction method or a QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by Qiagen) is commercially available from the culture obtained by culturing the transformant of the present invention.
  • the extraction kit may be used.
  • the Fc-binding protein of the present invention can be produced by culturing the transformant of the present invention and recovering the Fc-binding protein of the present invention from the obtained culture.
  • the culture includes not only the cultured cells of the transformant of the present invention itself but also a medium used for the culture.
  • the transformant used in the protein production method of the present invention may be cultured in a medium suitable for culturing the target host.
  • an LB (Luria-Bertani) medium supplemented with necessary nutrient sources is preferable.
  • An example of the medium is given.
  • a drug corresponding to the drug resistance gene contained in the vector it is preferable to add to the medium and culture.
  • the vector contains a kanamycin resistance gene, kanamycin may be added to the medium.
  • an appropriate nutrient source may be added to the medium, and if desired, the medium is selected from the group consisting of glutathione, cysteine, cystamine, thioglycolate and dithiothreitol.
  • One or more reducing agents may be included.
  • a reagent that promotes protein secretion from the transformant to the culture solution such as glycine may be added.
  • glycine is contained in the medium at 2% (w / v) or less. Addition is preferred.
  • the culture temperature is generally 10 ° C. to 40 ° C., preferably 20 ° C.
  • the pH of the medium is pH 6.8 to pH 7.4, preferably around pH 7.0.
  • an inducible promoter included in the vector of the present invention, it is preferable that the induction be performed under conditions that allow the Fc-binding protein of the present invention to be expressed well. Examples of the inducer include IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside).
  • the turbidity (absorbance at 600 nm) of the culture solution is measured, and when it reaches about 0.5 to 1.0, an appropriate amount of IPTG is added, followed by further culturing, thereby allowing Fc binding. Protein expression can be induced.
  • the addition concentration of IPTG may be appropriately selected from the range of 0.005 to 1.0 mM, but is preferably in the range of 0.01 to 0.5 mM.
  • Various conditions relating to the IPTG induction may be performed under conditions well known in the art.
  • the Fc-binding protein of the present invention may be recovered by separating / purifying from the culture. For example, when expressed in the culture supernatant, the cells are separated by centrifugation, and the Fc-binding protein of the present invention may be purified from the obtained culture supernatant. In addition, when expressed in cells (including periplasm), after collecting the cells by centrifugation, the cells are disrupted by adding an enzyme treatment agent, a surfactant or the like, and the Fc of the present invention.
  • Liquid chromatography includes ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, and the like. By performing a purification operation by combining these chromatography, the Fc binding property of the present invention can be obtained. Proteins can be prepared with high purity.
  • the binding activity to IgG is measured using the Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (hereinafter referred to as ELISA) method or the surface plasmon resonance method.
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • the IgG used for the measurement of the binding activity is preferably human IgG, and human IgG1 and human IgG3 are particularly preferable.
  • the adsorbent of the present invention can be produced by binding the Fc-binding protein of the present invention or human Fc ⁇ RIIIa to an insoluble carrier.
  • the insoluble carrier is not particularly limited, and carriers made from polysaccharides such as agarose, alginate (alginate), carrageenan, chitin, cellulose, dextrin, dextran, starch, polyvinyl alcohol, polymethacrylate, poly (2- Examples thereof include a carrier made of a synthetic polymer such as hydroxyethyl methacrylate and polyurethane, and a carrier made of ceramics such as silica. Of these, carriers made from polysaccharides and carriers made from synthetic polymers are preferred as insoluble carriers.
  • the preferred carrier examples include polymethacrylate gels introduced with hydroxyl groups such as Toyopearl (manufactured by Tosoh Corporation), agarose gels such as Sepharose (manufactured by GE Healthcare), and cellulose gels such as Cellufine (manufactured by JNC). .
  • the shape of the insoluble carrier is not particularly limited, and may be granular or non-particulate, porous or non-porous.
  • N-hydroxysuccinimide (NHS) activated ester group epoxy group, carboxyl group, maleimide group, haloacetyl group, tresyl group, formyl group
  • An active group such as a group haloacetamide may be imparted and immobilized by covalently binding a human Fc-binding protein and an insoluble carrier via the active group.
  • the carrier provided with the active group may be a commercially available carrier as it is, or may be prepared by introducing an active group on the surface of the carrier under appropriate reaction conditions.
  • TOYOPEARL AF-Epoxy-650M TOYOPEARL AF-Tresyl-650M (both manufactured by Tosoh Corporation), HiTrap NHS-activated HP Columns, NHS-activated SepharoseFast-Effects4 Examples include 6B (both manufactured by GE Healthcare) and SulfoLink Coupling Resin (manufactured by Thermo Scientific).
  • examples of the method for introducing an active group on the surface of the carrier include a method in which one of compounds having two or more active sites reacts with a hydroxyl group, an epoxy group, a carboxyl group, an amino group, etc. present on the surface of the carrier. it can.
  • examples of the compound that introduces an epoxy group into the hydroxyl group or amino group on the surface of the carrier include epichlorohydrin, ethanediol diglycidyl ether, butanediol diglycidyl ether, and hexanediol diglycidyl ether.
  • Examples of the compound that introduces an epoxy group on the carrier surface with the compound and then introduces a carboxyl group on the carrier surface include 2-mercaptoacetic acid, 3-mercaptopropionic acid, 4-mercaptobutyric acid, 6-mercaptobutyric acid, glycine, 3- Examples thereof include aminopropionic acid, 4-aminobutyric acid, and 6-aminohexanoic acid.
  • Examples of the compound that introduces a maleimide group into the hydroxyl group, epoxy group, carboxyl group or amino group present on the surface of the carrier include N- ( ⁇ -maleimidocaproic acid) hydrazide, N- ( ⁇ -maleimidopropionic acid) hydrazide, 4- [ 4-N-maleimidophenyl] acetic acid hydrazide, 2-aminomaleimide, 3-aminomaleimide, 4-aminomaleimide, 6-aminomaleimide, 1- (4-aminophenyl) maleimide, 1- (3-aminophenyl) maleimide, 4- (maleimido) phenyl isocyanate, 2-maleimidoacetic acid, 3-maleimidopropionic acid, 4-maleimidobutyric acid, 6-maleimidohexanoic acid, (N- [ ⁇ -maleimidoacetoxy] succinimide ester), (m-maleimidobenzoyl) N-hydroxys
  • Compounds that introduce a haloacetyl group into the hydroxyl group or amino group present on the surface of the carrier include chloroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, chloroacetic acid chloride, bromoacetic acid chloride, bromoacetic acid bromide, chloroacetic acid anhydride, bromoacetic acid anhydride, Iodoacetic anhydride, 2- (iodoacetamido) acetic acid-N-hydroxysuccinimide ester, 3- (bromoacetamido) propionic acid-N-hydroxysuccinimide ester, 4- (iodoacetyl) aminobenzoic acid-N-hydroxysuccinimide ester It can be illustrated.
  • An example is a method in which ⁇ -alkenyl alkanglycidyl ether is reacted with a hydroxyl group or amino group present on the surface of the carrier, and then the ⁇ -alkenyl moiety is halogenated with a halogenating agent to activate.
  • ⁇ -alkenyl alkanglycidyl ethers include allyl glycidyl ether, 3-butenyl glycidyl ether, and 4-pentenyl glycidyl ether.
  • halogenating agents include N-chlorosuccinimide, N-bromosuccinimide, and N-iodosuccinimide. it can.
  • the method for introducing an active group on the surface of the carrier there is a method for introducing an activating group into the carboxyl group present on the surface of the carrier using a condensing agent and an additive.
  • the condensing agent include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), dicyclohexylcarbodiimide, and carbonyldiimidazole.
  • the additive include N-hydroxysuccinimide (NHS), 4-nitrophenol, and 1-hydroxybenzotriazole.
  • Buffers used when immobilizing the Fc-binding protein or human Fc ⁇ RIIIa of the present invention on an insoluble carrier include acetate buffer, phosphate buffer, MES (2-Morpholine ethansulfonic acid) buffer, HEPES (2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid) buffer, Tris buffer, borate buffer.
  • the reaction temperature for immobilization may be appropriately set in the temperature range from 5 ° C. to 50 ° C. in consideration of the reactivity of the active group and the stability of the Fc-binding protein of the present invention or human Fc ⁇ RIIIa. It is preferably in the range of 10 ° C to 35 ° C.
  • the adsorbent of the present invention In order to purify an antibody having a sugar chain using the adsorbent of the present invention obtained by immobilizing the Fc-binding protein of the present invention or human Fc ⁇ RIIIa on an insoluble carrier, for example, the adsorbent of the present invention is packed.
  • a buffer solution containing an antibody having a sugar chain on a column is added using a liquid feeding means such as a pump to specifically adsorb the antibody having a sugar chain to the adsorbent of the present invention,
  • the antibody having a sugar chain may be eluted by adding the eluate to the column.
  • An antibody having a sugar chain that can be purified by the adsorbent of the present invention is an antibody that has at least the Fc region of an antibody having a sugar chain that has affinity for an Fc receptor such as Fc-binding protein or Fc ⁇ RIIIa. I just need it. Examples include chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and amino acid substitutions thereof that are generally used as antibodies used in antibody pharmaceuticals. In addition, bispecific antibodies (bispecific antibodies), Fc regions of antibodies with sugar chains and fusion proteins of other proteins, Fc regions of antibodies with sugar chains and drugs (ADC), etc. Even an antibody whose structure has been artificially modified can be purified with the adsorbent of the present invention.
  • the buffer solution include a buffer solution containing an inorganic salt as a component, such as a phosphate buffer solution, and the pH of the buffer solution is pH 3 to 10, preferably pH 5 to 8.
  • the interaction between the antibody having a sugar chain and a ligand may be weakened.
  • a ligand Fc-binding protein of the present invention or human Fc ⁇ RIIIa
  • pH change by buffer solution, counter peptide, temperature change, salt concentration change can be exemplified.
  • the eluate for eluting the antibody having a sugar chain adsorbed to the adsorbent of the present invention it is more acidic than the solution used for adsorbing the antibody having a sugar chain to the adsorbent of the present invention.
  • Side buffer As a specific example of the eluate for eluting the antibody having a sugar chain adsorbed to the adsorbent of the present invention, it is more acidic than the solution used for adsorbing the antibody having a sugar chain to the adsorbent of the present invention.
  • the buffer solution examples include a citrate buffer solution, a glycine hydrochloride buffer solution, and an acetate buffer solution having a buffer capacity on the acidic side.
  • the pH of the buffer may be set within a range that does not impair the function of the antibody, preferably pH 2.5 to 6.0, more preferably pH 3.0 to 5.0, still more preferably pH 3.3 to 4. 0.
  • the elution position (elution fraction) of the antibody varies depending on the sugar chain structure of the antibody. Therefore, by separating the antibody using the adsorbent of the present invention, the difference in the sugar chain structure of the antibody can be identified.
  • the structure of the glycans There are no particular limitations on the structure of the glycans that can be identified.
  • the adsorbent of the present invention can be separated based on the difference in the sugar chain structure of the antibody, it can also be used for separation of the sugar chain itself.
  • the adsorbent of the present invention can identify the difference in the sugar chain structure of the antibody.
  • an Fc receptor other than Fc ⁇ RIIIa Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RIIa, Fc ⁇ RIIb, Fc ⁇ RIIIb, FcRn
  • Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RIIa, Fc ⁇ RIIb, Fc ⁇ RIIIb, FcRn an Fc receptor other than Fc ⁇ RIIIa
  • the Fc-binding protein of the present invention is a protein in which an amino acid residue at a specific position in the extracellular region of human Fc ⁇ RIIIa is substituted with another amino acid residue.
  • the Fc binding protein of the present invention has improved heat and acid stability compared to wild type human Fc ⁇ RIIIa. Therefore, the Fc binding protein of the present invention is useful as a ligand of an adsorbent for separating immunoglobulin.
  • the present invention also relates to an invention related to an adsorbent obtained by immobilizing human Fc ⁇ RIIIa on an insoluble carrier, and the adsorbent specifically adsorbs an antibody having a sugar chain among antibodies.
  • the presence or absence of sugar chain addition to the antibody, which has been difficult until now, can be easily identified.
  • the antibody having a sugar chain can be specifically purified by using the adsorbent of the present invention, it is possible to efficiently produce an antibody having a sugar chain.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of human Fc ⁇ RIIIa.
  • the numbers in the figure indicate the amino acid sequence numbers described in SEQ ID NO: 1.
  • S represents a signal sequence
  • EC represents an extracellular region
  • TM represents a transmembrane region
  • C represents an intracellular region.
  • S represents a signal sequence
  • EC represents an extracellular region
  • TM represents a transmembrane region
  • C represents an intracellular region.
  • S represents a signal sequence
  • EC represents an extracellular region
  • TM represents a transmembrane region
  • C represents an intracellular region.
  • the wild type in the figure indicates an Fc binding protein without amino acid substitution.
  • the wild type in the figure indicates an Fc binding protein without amino acid substitution.
  • FIG. 5 is a diagram (SDS-PAGE) showing the results of antibody purification using FcR5a-immobilized gel.
  • A shows the purification result of human IgG1
  • B shows the purification result of human IgG3.
  • FIG. 3 is a diagram comparing the molecular weights of human IgG1 having a sugar chain (human IgG1 with a sugar chain) and human IgG1 having a sugar chain removed (sugar chain-removed human IgG1) by SDS-PAGE.
  • Lane (1) in the figure is a human IgG1 with a sugar chain
  • lane (2) is a human IgG1 with a sugar chain removed. It is the figure which compared the binding property of human Fc ⁇ RIIIa and protein A to human IgG1 with sugar chain and human IgG1 with sugar chain removed.
  • (A) shows the results for human Fc ⁇ RIIIa
  • (B) shows the results for protein A.
  • Example 1 Preparation of Fc Binding Protein or Human Fc ⁇ RIIIa Expression Vector
  • SEQ ID NO: 1 the amino acid sequence from the 17th glycine (Gly) to the 192nd glutamine (Gln) Based on the DNAworks method (Nucleic Acids Res., 30, e43, 2002), a nucleotide sequence in which a codon was converted from a human type to an E. coli type was designed. The designed nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the DNA mix in Table 1 means a solution obtained by sampling a predetermined amount of each of 18 types of oligonucleotides having the sequences described in SEQ ID NOs: 3 to 20 and mixing them.
  • the second-stage PCR uses FcRp1 synthesized in (2-1) as a template, SEQ ID NO: 21 (5′-TAGCCATGGGCATGCCGTACGAGAATCTGCCCGAAAGCTCTGTGGATGTCCCTGTGGGTAATCTGTG An oligonucleotide consisting of the sequence described in 1 was used as a PCR primer.
  • a reaction solution having the composition shown in Table 2 was prepared, and the reaction solution was heat-treated at 98 ° C. for 5 minutes, then the first step at 98 ° C. for 10 seconds, the second step at 62 ° C. for 5 seconds, 72 The reaction was carried out by repeating 30 cycles of the third step of 1.5 minutes at ° C. for 30 cycles.
  • the polynucleotide obtained in (2) is purified, digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and then ligated to an expression vector pETmalE (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046) previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII.
  • Escherichia coli BL21 strain (DE3) was transformed with the ligation product.
  • the obtained transformant was cultured in an LB medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, and then the expression vector pET-eFcR was extracted using QIAprep Spin Miniprep kit (manufactured by Qiagen).
  • the Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (manufactured by Life Technologies) based on the chain terminator method for the polynucleotide encoding human Fc ⁇ RIIIa and its surrounding region in the expression vector pET-eFcR prepared in (4)
  • the nucleotide sequence was analyzed with a fully automatic DNA sequencer ABI Prism 3700 DNA analyzer (manufactured by Life Technologies).
  • an oligonucleotide having the sequence described in SEQ ID NO: 23 (5′-TAATACGACTCACTATAGGGG ′) or SEQ ID NO: 24 (5′-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3 ′) was used as a sequencing primer.
  • the amino acid sequence of the polypeptide expressed by the expression vector pET-eFcR is shown in SEQ ID NO: 25, and the sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide is shown in SEQ ID NO: 26, respectively.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th lysine (Lys) to the 32nd methionine (Met) are linker sequences.
  • Example 2 Mutation Introduction to Fc Binding Protein and Library Preparation Of the Fc binding protein expression vector pER-eFcR prepared in Example 1, the polynucleotide portion encoding the Fc binding protein was subjected to error-prone PCR. Mutation was randomly introduced. (1) Error prone PCR was performed using pET-eFcR prepared in Example 1 as a template. In error-prone PCR, after preparing a reaction solution having the composition shown in Table 3, the reaction solution is heat-treated at 95 ° C. for 2 minutes, the first step at 95 ° C. for 30 seconds, the second step at 60 ° C.
  • the PCR product obtained in (1) was purified, digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and ligated into an expression vector pETmalE (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046) previously digested with the same restriction enzymes.
  • the reaction solution was introduced into E. coli BL21 (DE3) strain by electroporation, cultured in LB plate medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin (18 hours at 37 ° C.), and then placed on the plate. The formed colonies were used as a random mutant library.
  • Example 3 Screening of heat-stabilized Fc binding protein (1)
  • the random mutant library (transformant) prepared in Example 2 was subjected to 2YT liquid medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin (peptone 16 g / L, yeast).
  • (Extract 10 g / L, sodium chloride 5 g / L) was inoculated into 200 ⁇ L, and cultured with shaking at 30 ° C. overnight using a 96-well deep well plate.
  • Blocking was performed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing SKIM MILK (BD) of% (w / v) and 150 mM sodium chloride. (4-2) Fc for evaluating antibody binding activity after washing with a washing buffer (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.05% [w / v] Tween 20, 150 mM NaCl) A solution containing a binding protein was added to react the Fc binding protein with the immobilized gamma globulin (1 hour at 30 ° C.).
  • Table 4 summarizes the amino acid substitution position and the remaining activity (%) after heat treatment of the Fc binding protein expressed by the transformant selected in (5) with respect to the wild type (without amino acid substitution) Fc binding protein.
  • the amino acid residues from the 17th glycine to the 192nd glutamine and the 17th to 192nd amino acid residues are Met18Arg (this notation is SEQ ID NO: 1 represents that 18th methionine of 1 is substituted with arginine, the same applies below), Val27Glu, Phe29Leu, Phe29Ser, Leu30Gln, Tyr35Asn, Tyr35Asp, Tyr35Sr, Tyr35His, Lys46Thr, Lys46Thr, Lys46Thr, , Glu54Asp, Glu54Gly, Asn56Thr, Gln59Arg, Phe61Tyr, Glu64Asp, Ser6 Arg, Ala71Asp, Phe75Le
  • FcR2 the Fc-binding protein with the highest residual activity of Val27Glu and Tyr35Asn in which the amino acid substitution occurred was named FcR2 and includes a polynucleotide encoding FcR2.
  • the expression vector was named pET-FcR2.
  • the amino acid sequence of FcR2 is shown in SEQ ID NO: 27, and the sequence of the polynucleotide encoding FcR2 is shown in SEQ ID NO: 28.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th lysine (Lys) to the 32nd methionine (Met) are linker sequences.
  • the amino acid sequence of FcR2 corresponding to the 17th to 192nd region of SEQ ID NO: 1
  • the 209th to 210th glycine (Gly) Is a linker sequence
  • histidines (His) from 211 to 216 are tag sequences.
  • glutamic acid of Val27Glu is present at the 43rd position
  • asparagine of Tyr35Asn is present at the 51st position.
  • Example 4 Production of Amino Acid-Substituted Fc Binding Protein The stability was further improved by accumulating amino acid substitutions that were found in Example 3 and involved in improving the thermal stability of the Fc binding protein. Accumulation of substituted amino acids was mainly performed using PCR, and seven types of Fc binding proteins shown in (a) to (g) below were prepared.
  • B FcR4 obtained by further performing amino acid substitution of Phe75Leu and Glu121Gly on FcR2.
  • FcR3 Val27Glu, Tyr35Asn and Phe75Leu were selected from the amino acid substitutions involved in the improvement of thermal stability, which were revealed in Example 3, and these substitutions were accumulated in the wild-type Fc-binding protein.
  • FcR3 was produced by introducing a mutation causing Phe75Leu into a polynucleotide encoding FcR2.
  • A-1) PCR was performed using pET-FcR2 obtained in Example 3 as a template.
  • primers for the PCR oligonucleotides having the sequences described in SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 29 (5′-AGCCAGGCGAGCAGCTACCCTTTATTGATGCG-3 ′) were used.
  • PCR In PCR, after preparing a reaction solution having the composition shown in Table 5, the reaction solution was heat-treated at 98 ° C. for 5 minutes, first step at 98 ° C. for 10 seconds, second step at 55 ° C. for 5 seconds, and at 72 ° C. 30 cycles of the reaction in which the third step for 1 minute was set to 1 cycle were performed by heat treatment at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the amplified PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and purified from the gel using a QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen). The purified PCR product was designated as m3F.
  • A-2) Except that pET-FcR2 obtained in Example 3 was used as a template, and an oligonucleotide having the sequences described in SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 30 (5′-CCACCGTCGCCCGCATCAATAAGGTTAGCTGC-3 ′) was used as a PCR primer. , (A-1).
  • the purified PCR product was designated as m3R.
  • A-3) Two types of PCR products (m3F and m3R) obtained in (a-1) and (a-2) were mixed to prepare a reaction solution having the composition shown in Table 6. The reaction solution is heat-treated at 98 ° C. for 5 minutes, followed by 5 cycles of reaction in which the first step is 98 ° C. for 10 seconds, the second step is 55 ° C. for 5 seconds, and the third step is 72 ° C. for 1 minute. PCR was performed, and a PCR product m3p in which m3F and m3R were linked was obtained.
  • (A-4) PCR was performed using the PCR product m3p obtained in (a-3) as a template and oligonucleotides having the sequences described in SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 as PCR primers.
  • the reaction solution was heat-treated at 98 ° C. for 5 minutes, first step at 98 ° C. for 10 seconds, second step at 55 ° C. for 5 seconds, and at 72 ° C.
  • the reaction with the third step of 1 minute as one cycle was performed 30 cycles.
  • a polynucleotide encoding FcR3 in which an amino acid substitution at one site was introduced into FcR2 was prepared.
  • the amino acid sequence of FcR3 added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 31, and the sequence of the polynucleotide encoding the FcR3 is shown in SEQ ID NO: 32.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th lysine (Lys) to the 32nd methionine (Met) are linker sequences.
  • the amino acid sequence of FcR3 (corresponding to the 17th to 192nd region of SEQ ID NO: 1), the 209th to 210th glycine (Gly) Is a linker sequence, and histidines (His) from 211 to 216 are tag sequences.
  • glutamic acid of Val27Glu is present at the 43rd position, asparagine of Tyr35Asn is present at the 51st position, and leucine of Phe75Leu is present at the 91st position.
  • FcR4 Val27Glu, Tyr35Asn, Phe75Leu, and Glu121Gly were selected from the amino acid substitutions involved in improving the stability of the Fc-binding protein revealed in Example 3, and these substitutions were determined as wild-type Fc binding properties.
  • FcR4 accumulated in protein was produced. Specifically, FcR4 was produced by introducing a mutation that causes Phe75Leu and Glu121Gly to the polynucleotide encoding FcR2.
  • B-1) A PCR product m3F was obtained in the same manner as (a-1).
  • oligonucleotide comprising the sequences described in SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 29, which was obtained in Example 3, using the plasmid expressing Fc-binding protein (Table 4) containing amino acid substitutions of Ala71Asp, Phe75Leu and Glu121Gly as a template.
  • PCR product m4R was obtained by PCR in the same manner as in (a-1) using as a PCR primer.
  • B-2) After mixing the two types of PCR products (m3F, m4R) obtained in (b-1), PCR was performed in the same manner as in (a-3) to link m3F and m4R.
  • the obtained PCR product was designated as m4p.
  • (B-3) A method similar to (a-4), using the PCR product m4p obtained in (b-2) as a template and an oligonucleotide comprising the sequences described in SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 as PCR primers PCR was performed. This produced a polynucleotide encoding FcR4.
  • (B-4) After purification of the polynucleotide obtained in (b-3), digestion with restriction enzymes NcoI and HindIII and expression vector pETmalE previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046) And ligated to E. coli E. coli. E. coli BL21 (DE3) strain was transformed.
  • the amino acid sequence of FcR4 added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 33, and the sequence of a polynucleotide encoding the FcR4 is shown in SEQ ID NO: 34.
  • SEQ ID NO: 33 the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides, and the 27th lysine (Lys) to the 32nd methionine (Met) are linker sequences.
  • FcR5a Val27Glu, Tyr35Asn, Phe75Leu, Asn92Ser, and Glu121Gly were selected from among the amino acid substitutions involved in improving the stability of the Fc-binding protein revealed in Example 3, and these substitutions were selected as wild-type Fc.
  • FcR5a accumulated in the binding protein was produced. Specifically, FcR5a was prepared by introducing a mutation that caused Asn92Ser to the polynucleotide encoding FcR4 prepared in (b).
  • C-2 except that pET-FcR4 prepared in (b) was used as a template, and an oligonucleotide having the sequence described in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 36 (5′-GATCGCTCCAGGGTGCTCAGGCTGGTTCTGGC-3 ′) was used as a PCR primer, PCR was performed in the same manner as (a-1). The purified PCR product was designated as m5aR.
  • C-3 After mixing the two kinds of PCR products (m5aF, m5aR) obtained in (c-1) and (c-2), PCR was performed in the same manner as in (a-3), and m5aF And m5aR were ligated.
  • the obtained PCR product was designated as m5ap.
  • C-4 A method similar to (a-4), using the PCR product m5ap obtained in (c-3) as a template and an oligonucleotide comprising the sequences shown in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 as PCR primers PCR was performed. This produced a polynucleotide encoding FcR5a.
  • C-5 After purifying the polynucleotide obtained in (c-4), digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046) And ligated to E. coli E. coli. E.
  • coli BL21 (DE3) strain was transformed.
  • C-6 The obtained transformant was cultured in LB medium supplemented with 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • C-7) The nucleotide sequence of pET-FcR5a was analyzed in the same manner as in Example 1 (5).
  • the amino acid sequence of FcR5a added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 37, and the sequence of the polynucleotide encoding the FcR5a is shown in SEQ ID NO: 38.
  • SEQ ID NO: 37 the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides, and the 27th lysine (Lys) to the 32nd methionine (Met) are linker sequences.
  • FcR5b Val27Glu, Tyr35Asn, Glu54Asp, Phe75Leu, and Glu121Gly were selected from the amino acid substitutions involved in improving the stability of the Fc-binding protein revealed in Example 3, and these substitutions were selected as wild-type Fc.
  • FcR5b accumulated in the binding protein was produced. Specifically, FcR5b was prepared by introducing a mutation that produces Glu54Asp into the polynucleotide encoding FcR4 prepared in (b).
  • (D-2) Except that pET-FcR4 prepared in (b) was used as a template, and an oligonucleotide having the sequences described in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 40 (5′-CACTGGGGTCGTTTATCATCCGGGCTATAC-3 ′) was used as a PCR primer, PCR was performed in the same manner as (a-1). The purified PCR product was designated as m5bR. (D-3) After mixing the two types of PCR products (m5bF, m5bR) obtained in (d-1) and (d-2), PCR was performed in the same manner as in (a-3), and m5bF and m5bR was ligated.
  • the obtained PCR product was designated as m5 bp.
  • D-4 A method similar to (a-4), using the PCR product m5bp obtained in (d-3) as a template and an oligonucleotide consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 as PCR primers PCR was performed. This produced a polynucleotide encoding FcR5b.
  • D-5 After purifying the polynucleotide obtained in (d-4), digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046) And ligated to E. coli E. coli.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed.
  • D-6 The obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • a plasmid pET-FcR5b containing a polynucleotide encoding FcR5b which is a polypeptide obtained by substituting amino acids at five positions with respect to the wild-type Fc-binding protein, is obtained. It was.
  • D--7 The nucleotide sequence of pET-FcR5b was analyzed in the same manner as in Example 1 (5).
  • the amino acid sequence of FcR5b added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 41, and the sequence of the polynucleotide encoding the FcR5b is shown in SEQ ID NO: 42.
  • SEQ ID NO: 41 the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides, and the 27th lysine (Lys) to the 32nd methionine (Met) are linker sequences.
  • FcR6a From the amino acid substitutions involved in improving the stability of the Fc-binding protein revealed in Example 3, Val27Glu, Tyr35Asn, Glu54Asp, Phe75Leu, Asn92Ser and Glu121Gly are selected, and these substitutions are wild-type. FcR6a accumulated in the Fc-binding protein was prepared. Specifically, FcR6a was prepared by introducing a mutation that produces Glu54Asp into the polynucleotide encoding FcR5a prepared in (c).
  • E-1 The same method as (a-1), except that pET-FcR5a prepared in (c) was used as a template, and an oligonucleotide consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 39 was used as a PCR primer. PCR was performed. The purified PCR product was designated as m6aF.
  • E-2 The same method as (a-1) except that pET-FcR4 prepared in (b) was used as a template, and an oligonucleotide consisting of the sequences of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 40 was used as a PCR primer. PCR was performed. The purified PCR product was designated as m6aR.
  • E-3) After mixing the two kinds of PCR products (m6aF, m6aR) obtained in (e-1) and (e-2), PCR was performed in the same manner as in (a-3), and m6aF and m6aR was ligated. The obtained PCR product was designated as m6ap.
  • E-4) A method similar to (a-4), using the PCR product m6ap obtained in (e-3) as a template and an oligonucleotide comprising the sequences described in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 as PCR primers PCR was performed. This produced a polynucleotide encoding FcR6a.
  • E-5 After purifying the polynucleotide obtained in (e-4), digested with restriction enzymes NcoI and HindIII and previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046) And ligated to E. coli E. coli.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed.
  • E-6 The obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • the amino acid sequence of FcR6a to which a signal sequence and a polyhistidine tag are added is shown in SEQ ID NO: 43, and the sequence of the polynucleotide encoding the FcR6a is shown in SEQ ID NO: 44.
  • the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides
  • the 27th lysine (Lys) to the 32nd methionine (Met) are linker sequences.
  • FcR6a There is an amino acid sequence of FcR6a from the 33rd glycine (Gly) to the 208th glutamine (Gln) (corresponding to the 17th to 192nd region of SEQ ID NO: 1), and the 209th to 210th glycine (Gly). ) Is a linker sequence, and 211 to 216th histidine (His) is a tag sequence.
  • glutamic acid of Val27Glu is position 43
  • asparagine of Tyr35Asn is position 51
  • aspartic acid of Glu54Asp is position 70
  • leucine of Phe75Leu is position 91
  • serine of Asn92Ser is position 108
  • glycine of Glu121Gly is position 137.
  • FcR6b From the amino acid substitutions involved in improving the stability of the Fc-binding protein revealed in Example 3, Val27Glu, Tyr35Asn, Glu54Asp, Phe75Leu, Glu120Val and Glu121Gly are selected, and these substitutions are wild-type. FcR6b accumulated in the Fc-binding protein was prepared. Specifically, FcR6b was prepared by introducing a mutation that produces Glu120Val into the polynucleotide encoding FcR5b prepared in (d).
  • the obtained PCR product was set to m6 bp.
  • F-4 (a-4) except that the PCR product m6bp obtained in (f-3) was used as a template, and an oligonucleotide consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 was used as a PCR primer. PCR was performed in the same manner. This produced a polynucleotide encoding FcR6b.
  • F-5 After purifying the polynucleotide obtained in (f-4), digested with restriction enzymes NcoI and HindIII and previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-206046) And ligated to E.
  • the amino acid sequence of FcR6b added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 47, and the sequence of the polynucleotide encoding the FcR6b is shown in SEQ ID NO: 48.
  • SEQ ID NO: 47 the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides, and the 27th lysine (Lys) to the 32nd methionine (Met) are linker sequences.
  • FcR6b There is an amino acid sequence of FcR6b from the 33rd glycine (Gly) to the 208th glutamine (Gln) (corresponding to the 17th to 192nd region of SEQ ID NO: 1), the 209th to 210th glycine (Gly) ) Is a linker sequence, and 211 to 216th histidine (His) is a tag sequence.
  • glutamic acid of Val27Glu is position 43
  • aspartic acid of Tyr35Asn is position 51
  • aspartic acid of Glu54Asp is position 70
  • leucine of Phe75Leu is position 91
  • valine of Glu120Val is position 136
  • glycine of Glu121Gly is position 137.
  • FcR7 From the amino acid substitutions involved in improving the stability of the Fc-binding protein revealed in Example 3, Val27Glu, Tyr35Asn, Glu54Asp, Phe75Leu, Asn92Ser, Glu120Val and Glu121Gly are selected and the substitutions are performed. FcR7 accumulated in the wild type Fc binding protein was produced. Specifically, FcR7 was prepared by introducing a mutation that produces Glu120Val into the polynucleotide encoding FcR6a prepared in (e).
  • (G-1) The same method as (a-1) except that pET-FcR6a prepared in (e) was used as a template, and an oligonucleotide having the sequences shown in SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 45 was used as a PCR primer. PCR was performed. The purified PCR product was designated as m7F.
  • (G-2) The same method as (a-1) except that pET-FcR6a prepared in (e) was used as a template, and an oligonucleotide having the sequences described in SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 46 was used as a PCR primer. PCR was performed. The purified PCR product was designated as m7R.
  • the amino acid sequence of FcR7 added with a signal sequence and a polyhistidine tag is shown in SEQ ID NO: 49, and the sequence of the polynucleotide encoding the FcR7 is shown in SEQ ID NO: 50.
  • SEQ ID NO: 49 the first methionine (Met) to the 26th alanine (Ala) are MalE signal peptides, and the 27th lysine (Lys) to the 32nd methionine (Met) are linker sequences.
  • glutamic acid of Val27Glu is 43rd
  • aspartic acid of Tyr35Asn is 51st
  • aspartic acid of Glu54Asp is 70th
  • leucine of Phe75Leu is 91st
  • serine of Asn92Ser is 108th
  • valine of Glu120Val is 136th
  • Glu121Gly Glycine exists at the 137th position.
  • Example 5 Thermal Stability Evaluation of Improved Fc Binding Protein
  • Wild-type Fc binding protein prepared in Example 1, mutant Fc binding protein selected in Example 3 (FcR2), and Example 4 Transformants expressing the mutant Fc-binding proteins (FcR3, FcR4, FcR5a, FcR5b, FcR6a, FcR6b, FcR7) prepared in (1) above were inoculated into 3 mL of 2YT liquid medium each containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, Pre-culture was performed by aerobically shaking culture at 37 ° C. overnight.
  • the antibody binding activity of the wild-type Fc-binding protein and the mutant Fc-binding protein in the protein extract prepared in (4) was measured using the ELISA method described in Example 3 (4). .
  • a calibration curve was prepared using the extracellular region of commercially available Fc ⁇ RIIIa (R & D Systems: 4325-FC-050), and the concentration was measured.
  • the protein was diluted with 20 mM Tris buffer (pH 7.4) containing 150 mM sodium chloride so that the concentration of each protein was 5 ⁇ g / mL. This was divided into equal amounts, and one was heat-treated at 45 ° C. for 10 minutes using a thermal cycler (Eppendorf), and the other was not heat-treated.
  • the antibody binding activity of the protein after the heat treatment or non-heat treatment was measured by the ELISA method described in Example 3 (4), and the antibody binding activity when the heat treatment was performed was the antibody binding activity when the heat treatment was not performed.
  • the residual activity was calculated by dividing by.
  • the results are shown in Table 8.
  • the mutant Fc-binding proteins evaluated this time (FcR2, FcR3, FcR4, FcR5a, FcR5b, FcR6a, FcR6b, FcR7) have higher residual activity compared to the wild-type Fc-binding protein, and the mutant type It was confirmed that the thermal stability of the Fc-binding protein was improved.
  • Example 6 Evaluation of Acid Stability of Improved Fc Binding Protein
  • Improved Fc binding protein was prepared in the same manner as in Examples 5 (1) to (5).
  • the protein was diluted with 20 mM Tris buffer (pH 7.4) containing 150 mM sodium chloride so that the concentration of each protein was 30 ⁇ g / mL.
  • 60 ⁇ L of each diluted Fc-binding protein and 120 ⁇ L of 0.1 M glycine hydrochloride buffer (pH 3.0) were mixed and allowed to stand at 30 ° C. for 2 hours.
  • the results are shown in Table 9.
  • the mutant Fc-binding proteins evaluated this time (FcR2, FcR3, FcR4, FcR5a, FcR5b, FcR6a, FcR6b, FcR7) have higher residual activity compared to the wild-type Fc-binding protein, and the mutant type It was confirmed that the acid stability of the Fc-binding protein of 1 was improved.
  • Example 7 Preparation of Fc-binding protein with amino acid substitution at one position Among the amino acid substitutions involved in improving the stability of the Fc-binding protein revealed in Example 3, the 27th valine (Val) of SEQ ID NO: 1, Regarding the 35th tyrosine (Tyr) and the 121st glutamic acid (Glu), Fc binding proteins substituted with other amino acids were prepared by the following methods, respectively.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 4 (a-1).
  • the purified PCR product was 27 pR.
  • A-3) After mixing the two PCR products (27pF, 27pR) obtained in (A-1) and (A-2), PCR was performed in the same manner as in Example 4 (a-3). 27pF and 27pR were ligated. The obtained PCR product was designated as 27p.
  • Example 4 (a-4) and the PCR product 27p obtained in (A-3) as a template and oligonucleotides having the sequences shown in SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 as PCR primers PCR was performed in the same manner.
  • a polynucleotide encoding an Fc-binding protein in which the 27th valine of SEQ ID NO: 1 was substituted with an arbitrary amino acid was prepared.
  • A-5) After purifying the polynucleotide obtained in (A-4), it is digested with restriction enzymes NcoI and HindIII and previously digested with restriction enzymes NcoI and HindIII (Japanese Patent Laid-Open No.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed.
  • A-6 The obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • a plasmid was extracted from the collected microbial cells (transformants), and nucleotide sequence analysis was performed in the same manner as in Example 1 (5).
  • PCR was performed in the same manner as in Example 4 (a-1).
  • the purified PCR product was 35 pR.
  • B-3 After mixing the two types of PCR products (35pF, 35pR) obtained in (B-1) and (B-2), PCR was performed in the same manner as in Example 4 (a-3). And 35 pF and 35 pR were ligated. The obtained PCR product was 35p.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed.
  • B-6 The obtained transformant was cultured in an LB medium supplemented with 50 ⁇ g / mL kanamycin.
  • a plasmid was extracted from the collected microbial cells (transformants), and nucleotide sequence analysis was performed in the same manner as in Example 1 (5).
  • Tyr35Cys (Y35C), Tyr35Asp (Y35D), Tyr35Phe (Y35F), Tyr35Gly (Y35G), Tyr35Lys (Y35K), Tyr35Leu (Y35L), Tyr35Asn (Y35N), Tyr35Tr35Yr, YrN ), Tyr35Thr (Y35T), Tyr35Val (Y35V), or Tyr35Trp (Y35W), a polynucleotide encoding an Fc-binding protein in which an amino acid substitution occurred was obtained.
  • Example 2 Except that pET-eFcR prepared in Example 1 was used as a template, and an oligonucleotide having the sequences described in SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 56 (5′-AATCGGATCMNNCTCTTTGAACACCCCACCG-3 ′) was used as a PCR primer, PCR was performed in the same manner as in Example 4 (a-1). The purified PCR product was 121 pR. (C-3) After mixing the two kinds of PCR products (121pF, 121pR) obtained by (C-1) and (C-2), PCR was performed in the same manner as in Example 4 (a-3). In practice, 121pF and 121pR were ligated.
  • the obtained PCR product was designated as 121p.
  • C-4 The same as in Example 4 (a-4), using the PCR product 121p obtained in (C-3) as a template and the oligonucleotide consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 as PCR primers PCR was performed.
  • a polynucleotide encoding an Fc binding protein in which the 121st glutamic acid of SEQ ID NO: 1 was substituted with an arbitrary amino acid was prepared.
  • Example 8 Evaluation of Antibody Binding Activity of 1 Amino Acid-Substituted Fc Binding Protein (1) Expression of wild-type Fc binding protein prepared in Example 1 and Fc binding protein substituted with one amino acid prepared in Example 7 The transformant was cultured in the same manner as in Example 3 (1) and (2), and wild type Fc binding protein and Fc binding protein substituted with 1 amino acid were expressed. (2) The binding activity of the expressed Fc binding protein substituted with one amino acid to the antibody was examined by the ELISA method described in Example 3 (4).
  • the 35th tyrosine of SEQ ID NO: 1 is converted to aspartic acid (Y35D), phenylalanine (Y35F), glycine (Y35G), lysine (Y35K), leucine (Y35L), asparagine (Y35N), proline (Y35P), serine (Y35S).
  • Y35D aspartic acid
  • Y35F phenylalanine
  • Y35G glycine
  • Y35K lysine
  • leucine Y35L
  • asparagine Y35N
  • proline Y35P
  • serine Y35S
  • Y35D, Y35G, Y35K, Y35L, Y35N, Y35P, Y35S, Y35T, and Y35W have significantly improved antibody binding activity compared to the wild-type Fc-binding protein.
  • the 35th tyrosine of SEQ ID NO: 1 was substituted with cysteine (Y35C) or arginine (Y35R), the antibody binding activity was almost equivalent to that of the wild type Fc binding protein.
  • E121G By replacing the 121st glutamic acid of SEQ ID NO: 1 with lysine (E121K), arginine (E121R), glycine (E121G), and histidine (E121H), the antibody binding activity was improved compared to the wild-type Fc-binding protein. . Among them, E121G showed significantly improved antibody binding activity as compared with wild-type Fc binding protein. On the other hand, when the glutamic acid at position 121 of SEQ ID NO: 1 was substituted with valine (E121V), the antibody-binding activity was almost equivalent to that of wild-type Fc binding protein, and when substituted with proline (E121P), wild-type Fc binding Antibody binding activity was reduced compared to the sex protein.
  • E121K lysine
  • E121R arginine
  • E121G glycine
  • E121H histidine
  • Example 9 Thermal Stability Evaluation of 1 Amino Acid Substituted Fc Binding Protein
  • heat treatment was performed in the same manner as in Example 3 (3). (45 ° C., 10 minutes), and the residual activity was calculated.
  • the 35th tyrosine of SEQ ID NO: 1 is aspartic acid (Y35D), glycine (Y35G), lysine (Y35K), leucine (Y35L), asparagine (Y35N), proline (Y35P), serine (Y35S), threonine (Y35T).
  • the Fc binding protein in which the 121st glutamic acid of SEQ ID NO: 1 was replaced with glycine (E121G) were significantly improved in thermal stability as compared to the wild type Fc binding protein. .
  • Y35N and Y35P have greatly improved thermal stability compared to the wild type Fc binding protein.
  • Example 10 Large-scale preparation of FcR5a (1) A transformant expressing FcR5a prepared in Example 4 (c) was added to 400 mL of 2YT liquid medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin (2 g of peptone 16 g / mL) in a 2 L baffle flask. L, yeast extract 10 g / L, sodium chloride 5 g / L), and precultured by aerobic shaking culture at 37 ° C. overnight.
  • Glucose 10 g / L, yeast extract 20 g / L, trisodium phosphate dodecahydrate 3 g / L, disodium hydrogen phosphate dodecahydrate 9 g / L, ammonium chloride 1 g / L and kanamycin sulfate 50 mg 180 L of the culture medium (1) was inoculated into 1.8 L of a liquid medium containing / L, and main culture was performed using a 3 L fermenter (manufactured by Biot). The main culture was started under the conditions of a temperature of 30 ° C., a pH of 6.9 to 7.1, an aeration rate of 1 VVM, and a dissolved oxygen concentration of 30% saturation.
  • the pH was controlled by using 50% phosphoric acid as the acid and 14% ammonia water as the alkali.
  • the dissolved oxygen was controlled by changing the stirring speed, and the stirring speed was set at the lower limit of 500 rpm and the upper limit of 1000 rpm. .
  • fed-batch medium glucose 248.9 g / L, yeast extract 83.3 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 7.2 g / L
  • DO dissolved oxygen
  • the cells were crushed with an output of about 150 W at 4 ° C. for about 10 minutes using an apparatus (Insonator 201M (trade name), manufactured by Kubota Corporation).
  • the cell disruption solution was centrifuged twice at 10,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected.
  • (6) After adding imidazole to the disrupted solution obtained in (5) to a final concentration of 20 mM, equilibrate with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM sodium chloride and 20 mM imidazole in advance.
  • XK 26/20 column GE Healthcare
  • Ni Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare
  • FcR5a was eluted using 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM sodium chloride and 0.5 M imidazole.
  • FcR5a was eluted with 0.1 M glycine hydrochloride buffer (pH 3.0). The eluate was brought back to near neutrality by adding 1/4 volume of 1M Tris-HCl buffer (pH 7.0).
  • Example 11 Preparation of FcR5a-immobilized gel
  • FcR5a prepared in Example 10 was concentrated and buffer exchanged using an ultrafiltration membrane (Millipore: Amicon Ultra-15) to obtain 150 mM sodium chloride. The solution was concentrated to a concentration of 8.37 mg / mL in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4).
  • An epoxy toyopearl gel was prepared by reacting 1,6-hexanediol diglycidyl ether with the hydroxyl group of a hydrophilic vinyl polymer (Tosoh Corporation: Toyopearl) as a carrier.
  • a hydrophilic vinyl polymer Tosoh Corporation: Toyopearl
  • the concentration of the protein contained in the solution collected in (5) and the washing solution was measured, and the amount of FcR5a immobilized on the gel was calculated to calculate the immobilization rate. As a result, 33.7% of the added FcR5a was obtained. Was immobilized on the gel.
  • Example 12 Separation of antibody using FcR5a-immobilized gel
  • 0.5 mL of FcR5a-immobilized gel prepared in Example 11 was packed in an HR16 / 5 column (manufactured by GE Healthcare) and AKTAprime plus (GE Healthcare) Made). Thereafter, equilibration was performed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM sodium chloride.
  • 20 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.4) containing 150 mM sodium chloride was flowed at a flow rate of 0.1 mL, and 1 mg with a 20 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.4) containing 150 mM sodium chloride.
  • fraction A fraction 13
  • fraction B fraction B
  • Example 13 Sugar chain structure analysis of isolated antibody (1) The human IgG1 and elution fractions (FrA, FrB) before purification used in Example 12 were denatured by heat treatment at 100 ° C. for 10 minutes, and then glycoamidase A / pepsin and After sequentially treating with pronase, a sugar chain fraction was obtained through purification by gel filtration. (2) After concentrating and drying the sugar chain obtained in (1) with an evaporator, 2-aminopyridine and then dimethylamine borane are successively acted on in an acetic acid solvent to form a fluorescent labeled sugar chain. Purified.
  • the fluorescence-labeled sugar chain obtained in (2) is monosialylated with a neutral sugar chain fraction on an anion exchange column (TSKgel DEAE-5PW, ⁇ 7.5 mm ⁇ 7.5 cm: manufactured by Tosoh Corporation). Separated into sugar chain fractions.
  • the neutral sugar chain fraction and monosialylated sugar chain fraction obtained in (3) were isolated into individual sugar chains using an ODS column. After obtaining the molecular weight information of the sugar chain isolated by MALDI-TOF-MS analysis, the sugar chain structure was assigned in comparison with the retention time of the ODS column chromatograph.
  • Table 10 shows the composition ratio of neutral sugar chains
  • Table 11 shows the composition ratio of monosialylated sugar chains.
  • the assigned sugar chain structures (N1 to N8 and M1 and M2) are shown in FIG. From the results shown in Table 10, antibodies having sugar chain structures N2 and N7 were detected before purification and with FrB, but not with FrA. That is, the antibodies having the two sugar chain structures (N2 and N7 in FIG. 5) were not detected in FrA, which was a fraction that eluted earlier, but were detected in FrB, which was a fraction that was eluted later. It was shown to bind strongly to FcR5a-immobilized gel as compared with the antibody having the sugar chain structure of. From the above results, it was found that the FcR5a-immobilized gel, which is one embodiment of the adsorbent of the present invention, can separate antibodies by the difference in sugar chain structure of the antibodies.
  • Example 14 Antibody Purification with FcR5a Immobilized Gel Human IgG1 and human IgG3 were purified using the FcR5a immobilized gel prepared in Example 11.
  • FIG. 6 shows the results of SDS-PAGE analysis of elution fractions containing human IgG1 or human IgG3.
  • the elution fraction containing human IgG1 obtained by purifying the simulated culture solution added with human IgG1 shows the same position as human IgG1 added to the simulated culture solution, and the albumin found in the simulated culture solution Since no band is seen, it can be confirmed that human IgG1 is purified with high purity (FIG. 6A).
  • the elution fraction containing human IgG3 obtained by purifying the simulated culture solution added with human IgG3 also shows the same position as human IgG3 added to the simulated culture solution, and is found in the simulated culture solution.
  • Example 15 Preparation of sugar chain-removed human IgG1 N-type sugar chains were removed from human IgG1 by the method shown below.
  • (1) It was diluted with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM sodium chloride so that the concentration of human IgG1 (Fitzgerald: 31-AI17) was 3 mg / mL.
  • (2) 100 ⁇ L of 1 M Tris-HCl buffer (pH 8.6) was added to 100 ⁇ L of the diluted solution of (1), 10 ⁇ L of N-glycosidase F (500 mU / ⁇ L (Takara Bio Inc .: 4450) was added, and then 37 ° C.
  • the N-type sugar chain of IgG1 was removed by allowing to stand for 24 hours.
  • Human IgG1 from which the type sugar chain was removed (hereinafter simply referred to as human IgG1 from which the sugar chain was removed) was purified. The eluate was neutralized by adding 1/4 volume of 1M Tris-HCl buffer (pH 8.0). (5) Equal amounts of sample buffer (2 (w / v)% sodium dodecyl sulfate, 6 (w / v)% ⁇ -mercaptoethanol, (W / v)% glycerin and 0.005 (w / v)% bromophenol blue-containing 50 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8)) and heat-treated, thereby removing human IgG1 from which sugar chains were removed. Reduced.
  • sample buffer (2 (w / v)% sodium dodecyl sulfate, 6 (w / v)% ⁇ -mercaptoethanol, (W / v)% glycerin and 0.005 (w / v)% bromophenol blue
  • Human IgG1 was separated by electrophoresis using a 5 to 20% gradient SDS-PAGE gel (Ato). For comparison, an aqueous solution (concentration: 0.5 mg / mL) of human IgG1 that has not been subjected to a sugar chain treatment (hereinafter referred to as human IgG1 with a sugar chain) was subjected to the same reduction treatment as described in (5), and SDS- Separated by PAGE.
  • Example 16 Large-scale preparation of human Fc ⁇ RIIIa (1) A transformant capable of expressing human Fc ⁇ RIIIa obtained in Example 1 was added to a 400 mL 2YT liquid medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin (16 g of peptone) in a 2 L baffle flask. / L, yeast extract 10 g / L, sodium chloride 5 g / L), and precultured by aerobic shaking culture at 37 ° C. overnight.
  • the pH was controlled by using 50% phosphoric acid as the acid and 14% ammonia water as the alkali.
  • the dissolved oxygen was controlled by changing the stirring speed, and the stirring speed was set at the lower limit of 500 rpm and the upper limit of 1000 rpm. .
  • fed-batch medium glucose 248.9 g / L, yeast extract 83.3 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 7.2 g / L
  • DO dissolved oxygen
  • the cells were crushed with a power of about 150 W at 4 ° C. for about 10 minutes using a netter 201M (trade name, manufactured by Kubota Corporation).
  • the cell disruption solution was centrifuged twice at 10,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected.
  • (6) After adding imidazole to the disrupted solution obtained in (5) to a final concentration of 20 mM, equilibrate with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM sodium chloride and 20 mM imidazole in advance.
  • XK 26/20 column GE Healthcare
  • Ni Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare
  • human Fc ⁇ RIIIa was eluted using 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM sodium chloride and 0.5 M imidazole.
  • human Fc ⁇ RIIIa was eluted with 0.1 M glycine hydrochloride buffer (pH 3.0). The eluate was returned to near neutrality by adding 1/4 volume of 1M Tris-HCl buffer (pH 8.0).
  • Example 17 Measurement of binding of human Fc ⁇ RIIIa to antibody (1)
  • Human Fc ⁇ RIIIa prepared in Example 16 was treated with phosphate buffer (137 mM NaCl, 8.1 M Na 2 HPO 4, 2.68 mM KCl and 1.47 mM KH 2 PO 4.
  • the buffer solution was exchanged by dialysis against a buffer solution (pH 7.4 containing pH 7.4), and the concentration of human Fc ⁇ RIIIa was measured from the absorbance at 280 nm.
  • protein A manufactured by Protenova
  • CM5 manufactured by GE Healthcare
  • Example 18 Preparation of human Fc ⁇ RIIIa-immobilized gel
  • Human Fc ⁇ RIIIa prepared in Example 16 was concentrated and buffer exchanged using an ultrafiltration membrane (Millipore: Amicon Ultra-15). The solution was concentrated to a concentration of 2.6 mg / mL in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing sodium chloride.
  • An epoxy toyopearl gel was prepared by reacting 1,6-hexanediol diglycidyl ether with the hydroxyl group of a hydrophilic vinyl polymer (Tosoh Corporation: Toyopearl) as a carrier.
  • Example 19 Antibody Separation Using Human Fc ⁇ RIIIa Immobilized Gel
  • the human Fc ⁇ RIIIa immobilized gel prepared in Example 18 was packed into an HR16 / 5 column (manufactured by GE Healthcare), and the column was subjected to liquid chromatography. It connected to AKTAprime (made by GE Healthcare).
  • (2) The column prepared in (1) was equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 150 mM sodium chloride, and prepared with human IgG1 (Fitzgerald: 31-AI17) or Example 2.
  • 0.1 mL of the sugar chain-removed human IgG1 (the solution concentration was 1 mg / mL) was added at a flow rate of 0.1 mL / min. After washing with the buffer used for equilibration, elution was performed with 0.1 M glycine hydrochloride buffer (pH 3.5).
  • the adsorbent obtained by immobilizing human Fc ⁇ RIIIa on an insoluble carrier has the ability to specifically adsorb an antibody having a sugar chain, and this ability can be used to add a sugar chain to the antibody. It can be seen that the presence or absence can be identified.
  • the adsorbent of the present invention specifically adsorbs an antibody having a sugar chain, the antibody having a sugar chain can be separated and purified with high purity. Therefore, the adsorbent of the present invention can be used for antibody drug production and quality control.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　Ｆｃ結合性タンパク質の安定性、特に熱や酸に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤を提供することを第一の課題とする。さらに抗体への糖鎖付加の有無を識別可能な方法および当該方法で用いる材料を提供することを第二の課題とする。ヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、細胞外領域中の特定位置にあるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸に置換することで、熱や酸に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤により、第一の課題を解決する。さらにヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる、糖鎖を有した抗体を特異的に吸着可能な吸着剤を用いることで、第二の課題を解決する。

Description

Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた抗体の精製方法および識別方法
　本発明は、免疫グロブリンに親和性のあるＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた抗体の精製方法および識別方法に関する。より詳しくは、本発明は、熱や酸に対する安定性が野生型よりも高いＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤に関する。特に本発明は、抗体のうち糖鎖を有した抗体を特異的に吸着可能な吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた、糖鎖を有した抗体の精製方法および抗体への糖鎖付加の有無を識別する方法に関する。
　Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これによって、免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる。Ｆｃレセプターは、さらにいくつかのサブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある。また各レセプターは更に細かく分類されており、Ｆｃγレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１：Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８－３２６，２００５）。
　Ｆｃγレセプターの中でも、ＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要なレセプターである。このＦｃγＲＩＩＩａとヒトＩｇＧとの親和性は結合の強さを示す結合定数（ＫＡ）が１０7Ｍ-1以下であることが報告されている（非特許文献２：Ｊ．Ｇａｌｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８－１９３２，１９９７）。ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なおＦｃγＲＩＩＩａはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるヒトＩｇＧサブクラスのうち、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３に対し強く結合する一方、ＩｇＧ２とＩｇＧ４に対する結合は弱いことが知られている。
　一方、近年、モノクローナル抗体が有する特異性を利用した医薬（抗体医薬）の開発が進められている。抗体医薬で用いるヒトＩｇＧのうち、Ｆｃ領域の２９７番目のアスパラギン残基に付加するＮ型糖鎖の違いによりＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性が変化することが知られており、特に糖鎖の一種であるフコースを除去した抗体でＡＤＣＣ活性が向上することが報告されている（非特許文献３：Ｓｈｉｎｋａｗａ．Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６－３４７３，２００３）。つまり抗体医薬において、抗体が有する糖鎖構造には重要な意味がある。しかしながら、抗体医薬は通常、動物細胞を宿主とした遺伝子組換え技術を用いて製造しており、宿主内で抗体に付加される糖鎖を制御することは困難である。また製造した抗体の糖鎖を分析するには多くの時間と労力が必要である。
Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８－３２６，２００５ Ｊ．Ｇａｌｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８－１９３２，１９９７ Ｓｈｉｎｋａｗａ．Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６－３４７３，２００３
　本発明の第一の課題は、特に熱や酸に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤を提供することにある。さらに、本発明の第二の課題は、抗体への糖鎖付加の有無を識別可能な方法および当該方法で用いる材料を提供することにある。
　本発明者らは上記の第一の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトＦｃγＲＩＩＩａにおける安定性向上に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異体が、熱や酸に対して優れた安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明者らは上記の第二の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＩｇＧに対するレセプター（Ｆｃγレセプター）の一つであるＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いることで、抗体への糖鎖付加の有無を識別できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本願は以下の（Ａ）から（Ｚ）に記載の態様を包含する：
　（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質。
（１）配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換
（６）配列番号１の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（７）配列番号１の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
（８）配列番号１の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
（１０）配列番号１の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１）配列番号１の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１２）配列番号１の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１７）配列番号１の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１８）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２０）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２１）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２２）配列番号１の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２３）配列番号１の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２４）配列番号１の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号１の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２６）配列番号１の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２７）配列番号１の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（２８）配列番号１の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２９）配列番号１の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３０）配列番号１の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３１）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（３２）配列番号１の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３３）配列番号１の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号１の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（３５）配列番号１の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（３６）配列番号１の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（３７）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３８）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（３９）配列番号１の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
　(Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において少なくとも配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換した、（Ａ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
　（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において少なくとも配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギンまたはプロリンに置換した、（Ｂ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
　（Ｄ）配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含む、（Ｃ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
　（Ｅ）配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、（Ｄ）に記載のＦｃ結合性タンパク質。
　（Ｆ）さらに、以下の（４１）から（４４）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、（Ａ）から（Ｃ）のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質。
（４１）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（４２）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（４３）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（４４）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
　（Ｇ）（Ａ）から（Ｆ）のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、吸着剤。
　（Ｈ）（Ｇ）に記載の吸着剤を用いた抗体の精製方法。
　（Ｉ）（Ｇ）に記載の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別する方法。
　（Ｊ）（Ｈ）に記載の精製方法で得られる抗体。
　（Ｋ）（Ｇ）に記載の吸着剤を用いた糖鎖の分離方法。
　（Ｌ）（Ｋ）に記載の分離方法で得られる糖鎖。
　（Ｍ）（Ａ）から（Ｆ）のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　（Ｎ）（Ｍ）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
　（Ｏ）（Ｎ）に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
　（Ｐ）宿主が大腸菌である、（Ｏ）に記載の形質転換体。
　（Ｑ）（Ｏ）または（Ｐ）に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を発現させ、その培養物から発現されたＦｃ結合性タンパク質を回収する、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
　（Ｒ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる、糖鎖を有した抗体の吸着剤。
　（Ｓ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチドである、（Ｒ）に記載の吸着剤。
　（Ｔ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したポリペプチドである、（Ｒ）に記載の吸着剤。
　（Ｕ）ヒトＦｃγＲＩＩＩａが配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（ｉ）から（ｉｖ）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである、（Ｔ）に記載の吸着剤。
（ｉ）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（ｉｉ）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（ｉｉｉ）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（ｉｖ）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
　（Ｖ）糖鎖を有した抗体を含む溶液を（Ｒ）から（Ｕ）のいずれかに記載の吸着剤に添加して当該吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した糖鎖を有した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、糖鎖を有した抗体の精製方法。
　（Ｗ）（Ｖ）に記載の精製方法で得られる抗体。
　（Ｘ）（Ｒ）から（Ｕ）のいずれかに記載の吸着剤を用いて、抗体への糖鎖付加の有無を識別する方法。
　（Ｙ）（Ｒ）から（Ｕ）のいずれかに記載の吸着剤を用いた糖鎖の分離方法。
　（Ｚ）（Ｙ）に記載の分離方法で得られる糖鎖。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域に結合性を持つタンパク質であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（図１のＥＣの領域）のうち、少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質であって、当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において特定位置におけるアミノ酸置換が生じたタンパク質である。したがって、本発明のＦｃ結合性タンパク質は、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭ）および細胞外領域（図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、Ｍｅｔ１８Ａｒｇ（この表記は、配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９Ｓｅｒ、Ｌｅｕ３０Ｇｌｎ、Ｔｙｒ３５Ａｓｐ、Ｔｙｒ３５Ｇｌｙ、Ｔｙｒ３５Ｌｙｓ、Ｔｙｒ３５Ｌｅｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｔｙｒ３５Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ｓｅｒ、Ｔｙｒ３５Ｔｈｒ、Ｔｙｒ３５Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４６Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ４８Ｈｉｓ、Ｇｌｎ４８Ｌｅｕ、Ａｌａ５０Ｈｉｓ、Ｔｙｒ５１Ａｓｐ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｇｌｕ５４Ｇｌｙ、Ａｓｎ５６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ５９Ａｒｇ、Ｐｈｅ６１Ｔｙｒ、Ｇｌｕ６４Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ａｌａ７１Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｐｈｅ７５Ｓｅｒ、Ｐｈｅ７５Ｔｙｒ、Ａｓｐ７７Ａｓｎ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ａｓｐ８２Ｖａｌ、Ｇｌｎ９０Ａｒｇ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｌｅｕ９３Ａｒｇ、Ｌｅｕ９３Ｍｅｔ、Ｔｈｒ９５Ａｌａ、Ｔｈｒ９５Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１１０Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１５Ｇｌｎ、Ｔｒｐ１１６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ１１８Ｔｙｒ、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ａｓｐ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１５１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ１５１Ｔｙｒ、Ｓｅｒ１５５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１６３Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１６７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１６９Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１７１Ｔｙｒ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ａｓｎ１８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１８０Ｉｌｅ、Ｔｈｒ１８５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１９２Ｌｙｓのうち、少なくともいずれかの１つの置換である。中でも、Ｔｙｒ３５Ａｓｐ、Ｔｙｒ３５Ｇｌｙ、Ｔｙｒ３５Ｌｙｓ、Ｔｙｒ３５Ｌｅｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｔｙｒ３５Ｐｒｏ、Ｔｙｒ３５Ｓｅｒ、Ｔｙｒ３５Ｔｈｒ、Ｔｙｒ３５Ｈｉｓ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのうちいずれかの置換が生じていると、熱安定性が向上するため好ましい。また、野生型ヒトＦｃγＲＩＩＩａには、Ｌｅｕ６６Ｈｉｓ、Ｌｅｕ６６Ａｒｇ、Ｇｌｙ１４７Ａｓｐ、Ｔｙｒ１５８ＨｉｓまたはＶａｌ１７６Ｐｈｅの置換が生じた変異体が知られているが、前記特定位置におけるアミノ酸置換以外にこれらのアミノ酸置換を含んでいてもよい。
　なおアミノ酸置換を行なうことで本発明のＦｃ結合性タンパク質を作製する際、特定位置のアミノ酸残基については、抗体結合活性を有する限り前述したアミノ酸以外のアミノ酸に置換してもよい。その一例として、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられる。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質において、置換するアミノ酸の数に特に制限はない。一例として、以下の（ａ）から（ｈ）に示すＦｃ結合性タンパク質があげられる。これらのＦｃ結合性タンパク質は熱および酸に対する安定性が向上する点で好ましい。（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７ＧｌｕおよびＴｙｒ３５Ａｓｎのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５ＡｓｎおよびＰｈｅ７５Ｌｅｕのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号３１に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号３３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）（ｄ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号３７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）（ｅ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４１に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）（ｆ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）（ｇ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１２０ＶａｌおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４７に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）（ｈ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１２０ＶａｌおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換が生じているＦｃ結合性タンパク質（配列番号４９に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）。
　本発明の吸着剤においてリガンドとして用いる、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）は、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なお、本発明の吸着剤においてリガンドとして用いるヒトＦｃγＲＩＩＩａは、必ずしもヒトＦｃγＲＩＩＩａの全長（配列番号１）を用いる必要はなく、少なくとも配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むポリペプチドであればよい。さらに配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したポリペプチドであっても、本発明の吸着剤でリガンドとして用いるヒトＦｃγＲＩＩＩａに含まれる。また、天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａには、６６番目のロイシン（Ｌｅｕ）がヒスチジン（Ｈｉｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）に、１４７番目のグリシン（Ｇｌｙ）がアスパラギン酸（Ａｓｐ）に、１５８番目のチロシン（Ｔｙｒ）がヒスチジン（Ｈｉｓ）に、または１７６番目のバリン（Ｖａｌ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換された変異体が知られているが、これらのアミノ酸置換が少なくともいずれか１つ生じたポリペプチドであっても本発明の吸着剤のリガンドとして用いるヒトＦｃγＲＩＩＩａに含まれる。　
　本発明のＦｃ結合性タンパク質または吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａは、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＦｃ結合性タンパク質または吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａをクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質または吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質または吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明のＦｃ結合性タンパク質または吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａのＩｇＧ結合性や安定性を損なわない限り特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質または吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａに付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質またはヒトＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質またはヒトＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質または吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａのＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１－０９７８９８号公報）。
　本発明のポリヌクレオチドの作製方法の一例として、（Ｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質または吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、（ＩＩ）Ｆｃ結合性タンパク質またはヒトＦｃγＲＩＩＩａの全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、あるいはＦｃ結合性タンパク質またはヒトＦｃγＲＩＩＩａのｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。前記（Ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ　Ｕｓａｇｅ　Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
　本発明のポリヌクレオチドへ変異を導入する場合、エラープローンＰＣＲ法を用いることができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ヒトＦｃγＲＩ（またはＦｃ結合性タンパク質）をコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ2を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、ヒトＦｃγＲＩの全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。
　本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等があげられる。
　前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする）を用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする）を取得することができる。なお、本発明のＦｃ結合性タンパク質または吸着剤のリガンドであるヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現させる宿主には特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。なお動物細胞や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。
　本発明の形質転換体から、本発明の発現ベクターを調製するには、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質を製造することができる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明のベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらにグリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
　本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収するには、本発明の形質転換体における本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕して本発明のＦｃ結合性タンパク質を抽出した後、精製すればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製することができる。得られた本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１やヒトＩｇＧ３が特に好ましい。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質またはヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に結合させることで、本発明の吸着剤を製造することができる。前記不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
　Ｆｃ結合性タンパク質またはヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化するには、不溶性担体にＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してヒトＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ　Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｒｅｓｉｎ（サーモサイエンティフィック社製）が例示できる。
　一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。
　担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－［４－Ｎ－マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、（Ｎ－［α―マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル）、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（スクシンイミジル－４－［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１－カルボニル－［６－アミノヘキサン酸］）、（スクシンイミジル－４－［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１－カルボン酸）、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。
　担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。
　担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンゾトリアゾールを例示できる。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質またはヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性や本発明のＦｃ結合性タンパク質またはヒトＦｃγＲＩＩＩａの安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質またはヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる本発明の吸着剤を用いて、糖鎖を有した抗体を精製するには、例えば、本発明の吸着剤を充填したカラムに糖鎖を有した抗体を含む緩衝液をポンプ等の送液手段を用いて添加することで、糖鎖を有した抗体を本発明の吸着剤に特異的に吸着させた後、適切な溶出液をカラムに添加することで、糖鎖を有した抗体を溶出すればよい。なお本発明の吸着剤で精製可能な、糖鎖を有した抗体は、Ｆｃ結合性タンパク質またはＦｃγＲＩＩＩａなどのＦｃレセプターと親和性を有する、糖鎖を有した抗体のＦｃ領域を少なくとも含んだ抗体であればよい。一例として、抗体医薬に用いる抗体として一般的に用いられているキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体やそれらのアミノ酸置換体があげられる。また二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）、糖鎖を有した抗体のＦｃ領域と他のタンパク質との融合抗体、糖鎖を有した抗体のＦｃ領域と薬物との複合体（ＡＤＣ）などの人工的に構造改変した抗体であっても、本発明の吸着剤で精製することができる。また糖鎖を有した抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、糖鎖を有した抗体をより高純度に精製できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示することができ、緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ５から８である。
　本発明の吸着剤に吸着した、糖鎖を有した抗体を溶出させるには、糖鎖を有した抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質またはヒトＦｃγＲＩＩＩａ）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化、塩濃度変化が例示できる。本発明の吸着剤に吸着した、糖鎖を有した抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、本発明の吸着剤に糖鎖を有した抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０、さらに好ましくはｐＨ３．３から４．０である。
　なお糖鎖を有した抗体を含む溶液から、本発明の吸着剤を用いて前記抗体を精製する際、前記抗体が有する糖鎖構造の違いにより、抗体の溶出位置（溶出フラクション）が異なる。従って、本発明の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別することができる。識別可能な糖鎖の構造に特に限定はなく、一例として、ＣＨＯ細胞といった動物由来の細胞や、ピキア酵母やサッカロミセス酵母といった酵母を宿主として抗体を発現させたときに付加される糖鎖や、ヒト抗体が有する糖鎖や、化学合成法で抗体に付加した糖鎖があげられる。また本発明の吸着剤は、抗体が有する糖鎖構造の違いに基づき分離できることから、糖鎖そのものの分離にも利用できる。
　なお本発明の吸着剤により抗体の糖鎖構造の違いを識別できると前述したが、当該吸着剤に用いるリガンドタンパク質として、ＦｃγＲＩＩＩａ以外のＦｃレセプター（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃＲｎ）を用いた場合でも同様に糖鎖構造の違いを識別できる。
　本発明のＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域中の特定位置におけるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したタンパク質である。本発明のＦｃ結合性タンパク質は野生型ヒトＦｃγＲＩＩＩａと比較し、熱および酸に対する安定性が向上している。そのため、本発明のＦｃ結合性タンパク質はイムノグロブリンを分離するための吸着剤のリガンドとして有用である。
　また、本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤に係る発明にも関しており、前記吸着剤は、抗体のうち、糖鎖を有した抗体を特異的に吸着するため、これまで困難であった、抗体への糖鎖付加の有無を簡便に識別することができる。また本発明の吸着剤を用いることで、糖鎖を有した抗体を特異的に精製することができるため、糖鎖を有した抗体を効率的に製造することが可能となる。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。 １アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を評価した結果を示す図である。図中の野生型はアミノ酸置換の無いＦｃ結合性タンパク質を示している。 １アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質の熱安定性を評価した結果を示す図である。図中の野生型はアミノ酸置換の無いＦｃ結合性タンパク質を示している。 ＦｃＲ５ａ固定化ゲルを用いた抗体の溶出を示したクロマトチャートである。図中のＦｒは回収したフラクションの位置を示している。 抗体に付加した糖鎖構造の一覧を示した図である。図中のＮ１からＮ８は表１０のＮ１からＮ８に対応し、Ｍ１およびＭ２は表１１のＭ１およびＭ２に対応している。 ＦｃＲ５ａ固定化ゲルを用いた抗体精製の結果を示した図（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）である。（Ａ）はヒトＩｇＧ１の精製結果を、（Ｂ）はヒトＩｇＧ３の精製結果を、それぞれ示している。 糖鎖を有したヒトＩｇＧ１（糖鎖ありヒトＩｇＧ１）と糖鎖を除去したヒトＩｇＧ１（糖鎖除去ヒトＩｇＧ１）とでＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分子量を比較した図である。図中のレーン（１）は糖鎖ありヒトＩｇＧ１、レーン（２）は糖鎖除去ヒトＩｇＧ１である。 糖鎖ありヒトＩｇＧ１および糖鎖除去ヒトＩｇＧ１に対するヒトＦｃγＲＩＩＩａならびにプロテインＡの結合性を比較した図である。（Ａ）はヒトＦｃγＲＩＩＩａの結果であり、（Ｂ）はプロテインＡの結果である。 糖鎖ありヒトＩｇＧ１および糖鎖除去ヒトＩｇＧ１を本発明の吸着剤で分離した結果である。（１）は糖鎖ありヒトＩｇＧ１の結果であり、（２）は糖鎖除去ヒトＩｇＧ１の結果である。
　以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
　実施例１　Ｆｃ結合性タンパク質またはヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現ベクターの作製
（１）配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列を基に、ＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２）を用いて、コドンをヒト型から大腸菌型に変換したヌクレオチド配列を設計した。設計したヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
（２）配列番号２に記載の配列を含むポリヌクレオチドを作製するために、配列番号３から２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し、前記オリゴヌクレオチドを用いて、下記に示す二段階ＰＣＲを行なった。
（２－１）一段階目のＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を１０サイクル繰り返すことでポリヌクレオチドを合成し、これをＦｃＲｐ１とした。なお表１中のＤＮＡミックスとは、配列番号３から２０に記載の配列からなる１８種類のオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 （２－２）二段階目のＰＣＲは、（２－１）で合成したＦｃＲｐ１を鋳型とし、配列番号２１（５’－ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣ－３’）および配列番号２２（５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして実施した。具体的には、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１．５分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 （３）（２）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ－ｅＦｃＲを抽出した。
（５）（４）で作製した発現ベクターｐＥＴ－ｅＦｃＲのうち、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００　ＤＮＡ　ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２３（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）または配列番号２４（５’－ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
　発現ベクターｐＥＴ－ｅＦｃＲで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２６に、それぞれ示す。なお配列番号２５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域）であり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
　実施例２　Ｆｃ結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
　実施例１で作製したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターｐＥＲ－ｅＦｃＲのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲによりランダムに変異導入を施した。
（１）鋳型として実施例１で作製したｐＥＴ－ｅＦｃＲを用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲによりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入され、その平均変異導入率は１．２６％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 （２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションした。
（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃で１８時間）後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
　実施例３　熱安定化Ｆｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例２で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３０℃で一晩振とう培養した。
（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、０．３％のグリシンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２倍に希釈した。希釈した溶液を４５℃で１０分間熱処理を行なった。
（４）（３）の熱処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（３）の熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、それぞれ下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、熱処理を行なった時のＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、熱処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
（４－１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ　ＭＩＬＫ（ＢＤ社製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（４－２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ　２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。
（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４－４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５）（４）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中から野生型（アミノ酸置換のない）Ｆｃ結合性タンパク質と比較して熱安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて発現ベクターを調製した。
（６）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例１（５）の記載と同様の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
　（５）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、野生型（アミノ酸置換のない）Ｆｃ結合性タンパク質に対するアミノ酸置換位置および熱処理後の残存活性（％）をまとめたものを表４に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｍｅｔ１８Ａｒｇ（この表記は、配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｌｅｕ、Ｐｈｅ２９Ｓｅｒ、Ｌｅｕ３０Ｇｌｎ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｔｙｒ３５Ａｓｐ、Ｔｙｒ３５Ｓｅｒ、Ｔｙｒ３５Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４６Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ４８Ｈｉｓ、Ｇｌｎ４８Ｌｅｕ、Ａｌａ５０Ｈｉｓ、Ｔｙｒ５１Ａｓｐ、Ｔｙｒ５１Ｈｉｓ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｇｌｕ５４Ｇｌｙ、Ａｓｎ５６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ５９Ａｒｇ、Ｐｈｅ６１Ｔｙｒ、Ｇｌｕ６４Ａｓｐ、Ｓｅｒ６５Ａｒｇ、Ａｌａ７１Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｐｈｅ７５Ｓｅｒ、Ｐｈｅ７５Ｔｙｒ、Ａｓｐ７７Ａｓｎ、Ａｌａ７８Ｓｅｒ、Ａｓｐ８２Ｇｌｕ、Ａｓｐ８２Ｖａｌ、Ｇｌｎ９０Ａｒｇ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｌｅｕ９３Ａｒｇ、Ｌｅｕ９３Ｍｅｔ、Ｔｈｒ９５Ａｌａ、Ｔｈｒ９５Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１１０Ｇｌｎ、Ａｒｇ１１５Ｇｌｎ、Ｔｒｐ１１６Ｌｅｕ、Ｐｈｅ１１８Ｔｙｒ、Ｌｙｓ１１９Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌ、Ｇｌｕ１２１Ａｓｐ、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１５１Ｓｅｒ、Ｐｈｅ１５１Ｔｙｒ、Ｓｅｒ１５５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１６３Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１６７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１６９Ｇｌｙ、Ｐｈｅ１７１Ｔｙｒ、Ａｓｎ１８０Ｌｙｓ、Ａｓｎ１８０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１８０Ｉｌｅ、Ｔｈｒ１８５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１９２Ｌｙｓのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、野生型のＦｃ結合性タンパク質と比較し熱安定性が向上しているといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　表４に示した、アミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質のうち、最も残存活性の高い、Ｖａｌ２７ＧｌｕおよびＴｙｒ３５Ａｓｎのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をＦｃＲ２と命名し、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴ－ＦｃＲ２と命名した。ＦｃＲ２のアミノ酸配列を配列番号２７に、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２８に示す。なお配列番号２７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ２のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号２７において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目の位置にそれぞれ存在する。
　実施例４　アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の作製
　実施例３で判明した、Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換を集積することで、さらなる安定性向上を図った。置換アミノ酸の集積は、主にＰＣＲを用いて行ない、以下の（ａ）から（ｇ）に示す７種類のＦｃ結合性タンパク質を作製した。
（ａ）ＦｃＲ２に対し、さらにＰｈｅ７５Ｌｅｕのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ３
（ｂ）ＦｃＲ２に対し、さらにＰｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ４
（ｃ）ＦｃＲ４に対し、さらにＡｓｎ９２Ｓｅｒのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ５ａ
（ｄ）ＦｃＲ４に対し、さらにＧｌｕ５４Ａｓｐのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ５ｂ
（ｅ）ＦｃＲ５ａに対し、さらにＧｌｕ５４Ａｓｐのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ６ａ
（ｆ）ＦｃＲ５ｂに対し、さらにＧｌｕ１２０Ｖａｌのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ６ｂ
（ｇ）ＦｃＲ６ａに対し、さらにＧｌｕ１２０Ｖａｌのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ７以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
　（ａ）ＦｃＲ３　実施例３で明らかになった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５ＡｓｎおよびＰｈｅ７５Ｌｅｕを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ３を作製した。具体的には、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドに対してＰｈｅ７５Ｌｅｕを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ３を作製した。
（ａ－１）実施例３で取得した、ｐＥＴ－ＦｃＲ２を鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号２４および配列番号２９（５’－ＡＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ３Ｆとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 （ａ－２）実施例３で取得した、ｐＥＴ－ＦｃＲ２を鋳型とし、配列番号２３および配列番号３０（５’－ＣＣＡＣＣＧＴＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＧＴＡＧＣＴＧＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様に行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ３Ｒとした。
（ａ－３）（ａ－１）および（ａ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ３Ｆ、ｍ３Ｒ）を混合し、表６に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ３Ｆとｍ３Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ３ｐを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 （ａ－４）（ａ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ３ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ２に１箇所アミノ酸置換を導入したＦｃＲ３をコードするポリヌクレオチドを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 （ａ－５）（ａ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して３箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ３をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ３を得た。
（ａ－７）ｐＥＴ－ＦｃＲ３のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ３のアミノ酸配列を配列番号３１に、前記ＦｃＲ３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３２に示す。なお配列番号３１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ３のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３１において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目の位置にそれぞれ存在する。
　（ｂ）ＦｃＲ４　実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ４を作製した。具体的には、ＦｃＲ２をコードするポリヌクレオチドに対してＰｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ４を作製した。
（ｂ－１）（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲ産物ｍ３Ｆを得た。また実施例３で取得した、Ａｌａ７１Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙのアミノ酸置換を含んだＦｃ結合性タンパク質（表４）を発現するプラスミドを鋳型とし、配列番号２４および配列番号２９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なうことでＰＣＲ産物ｍ４Ｒを得た。
（ｂ－２）（ｂ－１）により得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ３Ｆ、ｍ４Ｒ）を混合後、（ａ－３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ３Ｆとｍ４Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ４ｐとした。
（ｂ－３）（ｂ－２）で得られたＰＣＲ産物ｍ４ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ－４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｂ－４）（ｂ－３）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ－５）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して４箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ４を得た。
（ｂ－６）ｐＥＴ－ＦｃＲ４のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ４のアミノ酸配列を配列番号３３に、前記ＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３４に示す。なお、配列番号３３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ４のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３３において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
　（ｃ）ＦｃＲ５ａ　実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ５ａを作製した。具体的には、（ｂ）で作製したＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドに対してＡｓｎ９２Ｓｅｒを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ５ａを作製した。
（ｃ－１）（ｂ）で作製した、ｐＥＴ－ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２２および配列番号３５（５’－ＧＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ａＦとした。
（ｃ－２）（ｂ）で作製したｐＥＴ－ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２１および配列番号３６（５’－ＧＡＴＣＧＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ａＲとした。
（ｃ－３）（ｃ－１）および（ｃ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ５ａＦ、ｍ５ａＲ）を混合後、（ａ－３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ５ａＦとｍ５ａＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ａｐとした。
（ｃ－４）（ｃ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ５ａｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ－４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｃ－５）（ｃ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ５ａを得た。
（ｃ－７）ｐＥＴ－ＦｃＲ５ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ５ａのアミノ酸配列を配列番号３７に、前記ＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３８に示す。なお、配列番号３７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ５ａのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号３７において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
　（ｄ）ＦｃＲ５ｂ　実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５ＬｅｕおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ５ｂを作製した。具体的には、（ｂ）で作製したＦｃＲ４をコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｕ５４Ａｓｐを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ５ｂを作製した。
（ｄ－１）（ｂ）で作製した、ｐＥＴ－ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２２および配列番号３９（５’－ＣＡＧＧＧＣＧＣＧＴＡＴＡＧＣＣＣＧＧＡＴＧＡＴＡＡＣＡＧＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ｂＦとした。
（ｄ－２）（ｂ）で作製したｐＥＴ－ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２１および配列番号４０（５’－ＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＴＧＴＴＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＣＴＡＴＡＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ５ｂＲとした。
（ｄ－３）（ｄ－１）および（ｄ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ５ｂＦ、ｍ５ｂＲ）を混合後、（ａ－３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ５ｂＦとｍ５ｂＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ５ｂｐとした。
（ｄ－４）（ｄ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ５ｂｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ－４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ５ｂをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｄ－５）（ｄ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｄ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して５箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ５ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ５ｂを得た。
（ｄ－７）ｐＥＴ－ＦｃＲ５ｂのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ５ｂのアミノ酸配列を配列番号４１に、前記ＦｃＲ５ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４２に示す。なお、配列番号４１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ５ｂのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４１において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
　（ｅ）ＦｃＲ６ａ　実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２ＳｅｒおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ６ａを作製した。具体的には、（ｃ）で作製したＦｃＲ５ａをコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｕ５４Ａｓｐを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ６ａを作製した。
（ｅ－１）（ｃ）で作製したｐＥＴ－ＦｃＲ５ａを鋳型とし、配列番号２２および配列番号３９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６ａＦとした。
（ｅ－２）（ｂ）で作製したｐＥＴ－ＦｃＲ４を鋳型とし、配列番号２１および配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６ａＲとした。
（ｅ－３）（ｅ－１）および（ｅ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ６ａＦ、ｍ６ａＲ）を混合後、（ａ－３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ６ａＦとｍ６ａＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ６ａｐとした。
（ｅ－４）（ｅ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ６ａｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ａ－４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ６ａをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｅ－５）（ｅ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｅ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ６ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ６ａを得た。
（ｅ－７）ｐＥＴ－ＦｃＲ６ａのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ６ａのアミノ酸配列を配列番号４３に、前記ＦｃＲ６ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４４に示す。なお、配列番号４３において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ６ａのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４３において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
　（ｆ）ＦｃＲ６ｂ　実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ１２０ＶａｌおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ６ｂを作製した。具体的には、（ｄ）で作製したＦｃＲ５ｂをコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｕ１２０Ｖａｌを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ６ｂを作製した。
（ｆ－１）（ｄ）で作製したｐＥＴ－ＦｃＲ５ｂを鋳型とし、配列番号２２および配列番号４５（５’－ＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６ｂＦとした。
（ｆ－２）（ｄ）で作製したｐＥＴ－ＦｃＲ５ｂを鋳型とし、配列番号２１および配列番号４６（５’－ＡＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＣＴＴＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ６ｂＲとした。
（ｆ－３）（ｆ－１）および（ｆ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ６ｂＦ、ｍ６ｂＲ）を混合後、（ａ－３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、ｍ６ｂＦとｍ６ｂＲを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ６ｂｐとした。
（ｆ－４）（ｆ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ６ｂｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ６ｂをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｆ－５）（ｆ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｆ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して６箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ６ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ６ｂを得た。
（ｆ－７）ｐＥＴ－ＦｃＲ６ｂのヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ６ｂのアミノ酸配列を配列番号４７に、前記ＦｃＲ６ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４８に示す。なお、配列番号４７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ６ｂのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４７において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌのバリンは１３６番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
　（ｇ）ＦｃＲ７　実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｕ５４Ａｓｐ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｇｌｕ１２０ＶａｌおよびＧｌｕ１２１Ｇｌｙを選択し、それらの置換を野生型のＦｃ結合性タンパク質に集積したＦｃＲ７を作製した。具体的には、（ｅ）で作製したＦｃＲ６ａをコードするポリヌクレオチドに対してＧｌｕ１２０Ｖａｌを生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ７を作製した。
（ｇ－１）（ｅ）で作製したｐＥＴ－ＦｃＲ６ａを鋳型とし、配列番号２２および配列番号４５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ７Ｆとした。
（ｇ－２）（ｅ）で作製したｐＥＴ－ＦｃＲ６ａを鋳型とし、配列番号２１および配列番号４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ７Ｒとした。
（ｇ－３）（ｇ－１）および（ｇ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ７Ｆ、ｍ７Ｒ）を混合後、（ａ－３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ７Ｆとｍ７Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ７ｐとした。
（ｇ－４）（ｇ－３）で得られたＰＣＲ産物ｍ７ｐを鋳型とし、配列番号２１および配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－４）と同様のＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ７をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（ｇ－５）（ｇ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｇ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して７箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ７をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ７を得た。
（ｇ－７）ｐＥＴ－ＦｃＲ７のヌクレオチド配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法で行なった。
　シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ７のアミノ酸配列を配列番号４９に、前記ＦｃＲ７をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５０に示す。なお、配列番号４９において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ７のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また配列番号４９において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕのグルタミン酸は４３番目、Ｔｙｒ３５Ａｓｎのアスパラギンは５１番目、Ｇｌｕ５４Ａｓｐのアスパラギン酸は７０番目、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕのロイシンは９１番目、Ａｓｎ９２Ｓｅｒのセリンは１０８番目、Ｇｌｕ１２０Ｖａｌのバリンは１３６番目、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙのグリシンは１３７番目の位置にそれぞれ存在する。
　実施例５　改良Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性評価
（１）実施例１で作製した野生型Ｆｃ結合性タンパク質、実施例３で選択した変異型のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ２）、および実施例４で作製した変異型のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ３、ＦｃＲ４、ＦｃＲ５ａ、ＦｃＲ５ｂ、ＦｃＲ６ａ、ＦｃＲ６ｂ、ＦｃＲ７）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中の野生型Ｆｃ結合性タンパク質および変異型のＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。この時、市販のＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社：４３２５－ＦＣ－０５０）を用いて検量線を作製し、濃度測定を行なった。
（６）各タンパク質の濃度が５μｇ／ｍＬになるよう１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。これを等量に分け、一方はサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて４５℃で１０分間加熱処理を行ない、もう一方は熱処理をしなかった。前記熱処理後、または非熱処理のタンパク質の抗体結合活性を実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定し、熱処理を行なった場合の抗体結合活性を、熱処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
　結果を表８に示す。今回評価した変異型のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ２、ＦｃＲ３、ＦｃＲ４、ＦｃＲ５ａ、ＦｃＲ５ｂ、ＦｃＲ６ａ、ＦｃＲ６ｂ、ＦｃＲ７）は、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し、残存活性が高くなっており、当該変異型のＦｃ結合性タンパク質の熱安定性が向上していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　実施例６　改良Ｆｃ結合性タンパク質の酸安定性評価
（１）実施例５（１）から（５）と同様の方法で改良Ｆｃ結合性タンパク質を調製した。
（２）各タンパク質の濃度が３０μｇ／ｍＬになるよう１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。希釈した各Ｆｃ結合性タンパク質６０μＬと０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）１２０μＬを混合し、３０℃で２時間静置した。
（３）実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって、グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）による酸処理を行なった後のタンパク質の抗体結合活性と、前記酸処理を行なわなかったときのタンパク質の抗体結合活性を測定した。その後、酸処理を行なった場合の抗体結合活性を、酸処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
　結果を表９に示す。今回評価した変異型のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ２、ＦｃＲ３、ＦｃＲ４、ＦｃＲ５ａ、ＦｃＲ５ｂ、ＦｃＲ６ａ、ＦｃＲ６ｂ、ＦｃＲ７）は、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し、残存活性が高くなっており、当該変異型のＦｃ結合性タンパク質の酸安定性が向上していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　実施例７　１箇所アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質の作製
　実施例３で明らかになったＦｃ結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換のうち、配列番号１の２７番目のバリン（Ｖａｌ）、３５番目のチロシン（Ｔｙｒ）および１２１番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）について、他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質を、それぞれ下記の方法で作製した。
　（Ａ）配列番号１の２７番目のバリン（Ｖａｌ）を他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質の作製
（Ａ－１）実施例１で作製したｐＥＴ－ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２４および配列番号５１（５’－ＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣＧＮＮＫＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＣＣＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を２７ｐＦとした。
（Ａ－２）実施例１で作製したｐＥＴ－ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２３および配列番号５２（５’－ＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＭＮＮＣＧＣＴＴＴＣＧＧＣＡＧＡＴＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を２７ｐＲとした。
（Ａ－３）（Ａ－１）および（Ａ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（２７ｐＦ、２７ｐＲ）を混合後、実施例４（ａ－３）と同様の方法でＰＣＲを行ない、２７ｐＦと２７ｐＲを連結した。得られたＰＣＲ産物を２７ｐとした。
（Ａ－４）（Ａ－３）で得られたＰＣＲ産物２７ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、実施例４（ａ－４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これにより配列番号１の２７番目のバリンを任意のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（Ａ－５）（Ａ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（Ａ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出し、実施例１（５）と同様の方法でヌクレオチド配列解析を行なった。
　結果、Ｖａｌ２７Ｇｌｙ（Ｖ２７Ｇ）、Ｖａｌ２７Ｌｙｓ（Ｖ２７Ｋ）、Ｖａｌ２７Ｔｈｒ（Ｖ２７Ｔ）、Ｖａｌ２７Ａｌａ（Ｖ２７Ａ）、Ｖａｌ２７Ｔｒｐ（Ｖ２７Ｗ）、またはＶａｌ２７Ａｒｇ（Ｖ２７Ｒ）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。
　（Ｂ）配列番号１の３５番目のチロシン（Ｔｙｒ）を他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質の作製
（Ｂ－１）実施例１で作製したｐＥＴ－ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２４および配列番号５３（５’－ＡＡＣＣＧＣＡＧＴＧＧＮＮＫＣＧＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を３５ｐＦとした。
（Ｂ－２）実施例１で作製したｐＥＴ－ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２３および配列番号５４（５’－ＡＧＣＡＣＧＣＧＭＮＮＣＣＡＣＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を３５ｐＲとした。
（Ｂ－３）（Ｂ－１）および（Ｂ－２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（３５ｐＦ、３５ｐＲ）を混合後、実施例４（ａ－３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、３５ｐＦと３５ｐＲを連結した。得られたＰＣＲ産物を３５ｐとした。
（Ｂ－４）（Ｂ－３）で得られたＰＣＲ産物３５ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、実施例４（ａ－４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これにより配列番号１の３５番目のチロシンを任意のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（Ｂ－５）（Ｂ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（Ｂ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出し、実施例１（５）と同様の方法でヌクレオチド配列解析を行なった。
　結果、Ｔｙｒ３５Ｃｙｓ（Ｙ３５Ｃ）、Ｔｙｒ３５Ａｓｐ（Ｙ３５Ｄ）、Ｔｙｒ３５Ｐｈｅ（Ｙ３５Ｆ）、Ｔｙｒ３５Ｇｌｙ（Ｙ３５Ｇ）、Ｔｙｒ３５Ｌｙｓ（Ｙ３５Ｋ）、Ｔｙｒ３５Ｌｅｕ（Ｙ３５Ｌ）、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ（Ｙ３５Ｎ）、Ｔｙｒ３５Ｐｒｏ（Ｙ３５Ｐ）、Ｔｙｒ３５Ａｒｇ（Ｙ３５Ｒ）、Ｔｙｒ３５Ｓｅｒ（Ｙ３５Ｓ）、Ｔｙｒ３５Ｔｈｒ（Ｙ３５Ｔ）、Ｔｙｒ３５Ｖａｌ（Ｙ３５Ｖ）、またはＴｙｒ３５Ｔｒｐ（Ｙ３５Ｗ）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。
　（Ｃ）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）を他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質の作製
（Ｃ－１）実施例１で作製したｐＥＴ－ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２４および配列番号５５（５’－ＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧＡＧＮＮＫＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を１２１ｐＦとした。
（Ｃ－２）実施例１で作製したｐＥＴ－ｅＦｃＲを鋳型とし、配列番号２３および配列番号５６（５’－ＡＡＴＣＧＧＡＴＣＭＮＮＣＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例４の（ａ－１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物を１２１ｐＲとした。
（Ｃ－３）（Ｃ－１）および（Ｃ－２）により得られた２種類のＰＣＲ産物（１２１ｐＦ、１２１ｐＲ）を混合後、実施例４（ａ－３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、１２１ｐＦと１２１ｐＲを連結した。得られたＰＣＲ産物を１２１ｐとした。
（Ｃ－４）（Ｃ－３）で得られたＰＣＲ産物１２１ｐを鋳型とし、配列番号２３および配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして実施例４（ａ－４）と同様のＰＣＲを行なった。これにより配列番号１の１２１番目のグルタミン酸が任意のアミノ酸に置換されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（Ｃ－５）（Ｃ－４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（Ｃ－６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出し、実施例１（５）と同様の方法でヌクレオチド配列解析を行なった。
　結果、Ｇｌｕ１２１Ｌｙｓ（Ｅ１２１Ｋ）、Ｇｌｕ１２１Ｐｒｏ（Ｅ１２１Ｐ）、Ｇｌｕ１２１Ａｒｇ（Ｅ１２１Ｒ）、Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ（Ｅ１２１Ｇ）、Ｇｌｕ１２１Ｈｉｓ（Ｅ１２１Ｈ）、またはＧｌｕ１２１Ｖａｌ（Ｅ１２１Ｖ）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。
　実施例８　１アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性評価
（１）実施例１で作製した野生型Ｆｃ結合性タンパク質、および実施例７で作製した１箇所アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を、実施例３（１）および（２）と同様の方法でそれぞれ培養を行ない、野生型Ｆｃ結合性タンパク質および１アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質を発現させた。
（２）発現した１アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質を実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて抗体との結合活性を調べた。
　結果を図２に示す。配列番号１の２７番目のバリンをグリシン（Ｖ２７Ｇ）、リジン（Ｖ２７Ｋ）、スレオニン（Ｖ２７Ｔ）、アラニン（Ｖ２７Ａ）、アルギニン（Ｖ２７Ｒ）、に置換することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が向上した一方、配列番号１の２７番目のＶａｌがトリプトファン（Ｖ２７Ｗ）へ置換すると、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が低下した。
　配列番号１の３５番目のチロシンを、アスパラギン酸（Ｙ３５Ｄ）、フェニルアラニン（Ｙ３５Ｆ）、グリシン（Ｙ３５Ｇ）、リジン（Ｙ３５Ｋ）、ロイシン（Ｙ３５Ｌ）、アスパラギン（Ｙ３５Ｎ）、プロリン（Ｙ３５Ｐ）、セリン（Ｙ３５Ｓ）、スレオニン（Ｙ３５Ｔ）、バリン（Ｙ３５Ｖ）、トリプトファン（Ｙ３５Ｗ）に置換することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が向上した。中でもＹ３５Ｄ、Ｙ３５Ｇ、Ｙ３５Ｋ、Ｙ３５Ｌ、Ｙ３５Ｎ、Ｙ３５Ｐ、Ｙ３５Ｓ、Ｙ３５Ｔ、Ｙ３５Ｗは、野生型Ｆｃ結合性タンパク質に比較し大幅に抗体結合活性が向上した。一方、配列番号１の３５番目のチロシンを、システイン（Ｙ３５Ｃ）、アルギニン（Ｙ３５Ｒ）に置換した場合は、野生型Ｆｃ結合性タンパク質とほぼ同等の抗体結合活性であった。
　配列番号１の１２１番目のグルタミン酸を、リジン（Ｅ１２１Ｋ）、アルギニン（Ｅ１２１Ｒ）、グリシン（Ｅ１２１Ｇ）、ヒスチジン（Ｅ１２１Ｈ）に置換することで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が向上した。中でもＥ１２１Ｇは、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し大幅に抗体結合活性が向上した。一方、配列番号１の１２１番目のグルタミン酸を、バリン（Ｅ１２１Ｖ）に置換した場合は野生型Ｆｃ結合性タンパク質とほぼ同等の抗体結合活性であり、プロリン（Ｅ１２１Ｐ）に置換した場合は野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し抗体結合活性が低下した。
　実施例９　１アミノ酸置換Ｆｃ結合性タンパク質の熱安定性評価
　実施例８で評価した１アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質の熱安定性を比較するため、実施例３（３）と同様の方法で熱処理を行ない（４５℃、１０分間）、残存活性を算出した。
　結果を図３に示す。配列番号１の３５番目のチロシンを、アスパラギン酸（Ｙ３５Ｄ）、グリシン（Ｙ３５Ｇ）、リジン（Ｙ３５Ｋ）、ロイシン（Ｙ３５Ｌ）、アスパラギン（Ｙ３５Ｎ）、プロリン（Ｙ３５Ｐ）、セリン（Ｙ３５Ｓ）、スレオニン（Ｙ３５Ｔ）にそれぞれ置換したＦｃ結合性タンパク質、ならびに配列番号１の１２１番目のグルタミン酸を、グリシン（Ｅ１２１Ｇ）に置換したＦｃ結合性タンパク質は、野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し大幅に熱安定性が向上した。中でもＹ３５Ｎ、Ｙ３５Ｐは野生型Ｆｃ結合性タンパク質と比較し大幅に熱安定性が向上した。
　実施例１０　ＦｃＲ５ａの大量調製
（１）実施例４（ｃ）で作製したＦｃＲ５ａを発現する形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよび硫酸カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット社製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ600nm）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。
（５）（４）で回収した菌体の一部を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、１００００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
（６）（５）で得られた破砕液に終濃度で２０ｍＭとなるようイミダゾールを添加後、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび２０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＮｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）５０ｍＬを充填したＸＫ　２６／２０カラム（ＧＥヘルスケア社製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび０．５Ｍのイミダゾールを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてＦｃＲ５ａを溶出した。
（７）（６）で得られた溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア社製）３０ｍＬを充填したＨＲ　１６／１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）でＦｃＲ５ａを溶出した。なお溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。
　実施例１１　ＦｃＲ５ａ固定化ゲルの作製
（１）実施例１０で調製したＦｃＲ５ａを、限外ろ過膜（ミリポア社製：アミコンウルトラ－１５）を用いて濃縮・緩衝液交換を行ない、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に８．３７ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。
（２）担体である親水性ビニルポリマー（東ソー社製：トヨパール）の水酸基に１，６－ヘキサンジオールジグリシジルエーテルを反応させてエポキシトヨパールゲルを調製した。
（３）（２）で調製したエポキシトヨパールゲル１００μＬを入れたスピンカラム（バイオラッド社製）を５本用意し、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．５ｍＬで３回洗浄した。
（４）（１）で調製したＦｃＲ５ａ溶液０．３ｍＬと０．５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．４５ｍＬとを混合した溶液を、（３）に記載のゲルを充填したスピンカラムにそれぞれ添加し、３５℃で３時間振とうした。
（５）ゲルに加えたＦｃＲ５ａ溶液と０．５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ０．１Ｍのホウ酸緩衝液の混合溶液を回収した後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）０．２ｍＬで３回洗浄した。その後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬで３回洗浄することでｐＨを中性付近に戻し、ＦｃＲ５ａ固定化ゲル０．５ｍＬを調製した。
　（５）で回収した溶液、および洗浄液中に含まれるタンパク質濃度を測定し、ゲルに固定化されたＦｃＲ５ａの量を算出することで固定化率を計算したところ、添加したＦｃＲ５ａの３３．７％がゲルに固定化していた。
　実施例１２　ＦｃＲ５ａ固定化ゲルでの抗体分離
（１）実施例１１で作製したＦｃＲ５ａ固定化ゲル０．５ｍＬをＨＲ１６／５カラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）につなげた。その後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した。
（２）１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍＬの流速で流し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１ｍｇ／ｍＬに調製したヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ社製：Ｉ５１５４－１ＭＧ）溶液０．５ｍＬをアプライし、ヒトＩｇＧ１をＦｃＲ５ａ固定化ゲルに吸着させた。その後、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を流すことで平衡化し、２０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）によるｐＨグラジエントで、吸着したヒトＩｇＧ１を溶出した。溶出したヒトＩｇＧ１は０．５ｍＬごとにフラクションを回収した。
　ヒトＩｇＧ１の溶出パターンと回収したフラクションを図４に示す。回収した溶出フラクションのうち、フラクション１３（Ｆｒ１３）およびフラクション１４（Ｆｒ１４）を混合したものをフラクションＡ（ＦｒＡ）とし、フラクション１６（Ｆｒ１６）およびフラクション１７（Ｆｒ１７）を混合したものをフラクションＢ（ＦｒＢ）とした。
　実施例１３　分離抗体の糖鎖構造解析
（１）実施例１２で使用した精製前のヒトＩｇＧ１および溶出フラクション（ＦｒＡ、ＦｒＢ）を１００℃、１０分の熱処理により変性後、グリコアミダーゼＡ／ペプシンおよびプロナーゼで順次処理し、ゲルろ過法による精製操作を経て糖鎖画分を取得した。
（２）（１）で得られた糖鎖をエバポレーターにて濃縮・乾燥後、酢酸溶媒下、２－アミノピリジン、次いでジメチルアミンボランを順次作用させて蛍光ラベル化糖鎖とし、ゲルろ過法により精製した。
（３）（２）で得られた蛍光ラベル化糖鎖を陰イオン交換カラム（ＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ－５ＰＷ、φ７．５ｍｍ×７．５ｃｍ：東ソー社製）にて、中性糖鎖画分とモノシアリル化糖鎖画分に分離した。
（４）（３）で得られた中性糖鎖画分とモノシアリル化糖鎖画分をＯＤＳカラムを用いて、個々の糖鎖に単離した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析により単離した糖鎖の分子量情報を取得後、ＯＤＳカラムクロマトグラフのリテンションタイムと照らし合わせて糖鎖構造を帰属した。
　中性糖鎖の組成比を表１０に、モノシアリル化糖鎖の組成比を表１１に示す。また、帰属した糖鎖構造（Ｎ１からＮ８ならびにＭ１およびＭ２）を図５に示す。表１０に示した結果より、糖鎖構造Ｎ２およびＮ７を有した抗体は精製前およびＦｒＢで検出されたが、ＦｒＡから検出されなかった。すなわち、前記２種の糖鎖構造（図５のＮ２およびＮ７）を持つ抗体は、早く溶出したフラクションであるＦｒＡには検出せず、遅く溶出したフラクションであるＦｒＢで検出されたことから、他の糖鎖構造を有した抗体と比較しＦｃＲ５ａ固定化ゲルへ強く結合することが示された。以上の結果から、本発明の吸着剤の一態様である、ＦｃＲ５ａ固定化ゲルは、抗体が有する糖鎖構造の違いにより抗体を分離できることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　実施例１４　ＦｃＲ５ａ固定化ゲルでの抗体精製
　実施例１１で作製したＦｃＲ５ａ固定化ゲルを用いて、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３の精製を行なった。
（１）実施例１１と同様の方法でＦｃＲ５ａ固定化ゲル０．２ｍＬを作製した。作製したＦｃＲ５ａ固定化ゲル０．１ｍＬをスピンカラムに充填した。
（２）（１）で作製したＦｃＲ５ａ固定化ゲルを充填したカラムを１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬで３回洗浄した。
（３）動物細胞用の培地であるＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ライフテクノロジー社製）に１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した培地に対し、ヒトＩｇＧ１（シグマ社製：Ｉ５１５４－１ＭＧ）またはヒトＩｇＧ３（シグマ社製：Ｉ４６３９－１ＭＧ）を０．３ｍｇ／ｍＬとなるように添加することで模擬培養液を調製した。
（４）（２）で洗浄したカラムに（３）で調製した模擬培養液を０．４ｍＬ加え、２５℃で２時間振とうした。
（５）模擬培養液を取り除き、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬで４回洗浄後、５００μＬの０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出し、１００μＬごとにフラクションを回収した。
（６）模擬培養液、溶出フラクションをそれぞれ２×サンプルバッファー（２（ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウム、６（ｗ／ｖ）％β－メルカプトエタノール、１０（ｗ／ｖ）％グリセリンおよび０．００５（ｗ／ｖ）％ブロモフェノールブルーを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８））を添加し加熱処理した。その後、処理したサンプルを５から２０％のグラジエントＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル（アトー社製）を用いた電気泳動にて分離した。なお比較として、模擬培養液に添加したヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３（濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ）についても同様の処理を行ない、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
　ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ３を含む溶出フラクションのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析結果を図６に示す。ヒトＩｇＧ１を添加した模擬培養液を精製して得られた、ヒトＩｇＧ１を含む溶出フラクションは、模擬培養液に添加したヒトＩｇＧ１と同様の位置を示しており、かつ模擬培養液に見られるアルブミンのバンドも見られないことからヒトＩｇＧ１を高純度に精製していることが確認できる（図６（Ａ））。また、ヒトＩｇＧ３を添加した模擬培養液を精製して得られた、ヒトＩｇＧ３を含む溶出フラクションも、模擬培養液に添加したヒトＩｇＧ３と同様の位置を示しており、かつ模擬培養液に見られるアルブミンのバンドが見られないことからヒトＩｇＧ３を高純度に精製していることが確認できる（図６（Ｂ））。これらの結果から、本発明の吸着剤の一態様である、ＦｃＲ５ａ固定化ゲルは、動物細胞用の培養液からヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３が精製できることが示された。
　実施例１５　糖鎖除去ヒトＩｇＧ１の調製
　以下に示す方法で、ヒトＩｇＧ１からＮ型糖鎖の除去を行なった。
（１）ヒトＩｇＧ１（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製：３１－ＡＩ１７）の濃度が３ｍｇ／ｍＬとなるよう、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。
（２）（１）の希釈液１００μＬに１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）を１００μＬ加え、Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ　Ｆ（５００ｍＵ／μＬ（タカラバイオ社製：４４５０）を１０μＬ加えた後、３７℃で２４時間静置することでＩｇＧ１のＮ型糖鎖を除去した。
（３）あらかじめ１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ－６５０Ｆ（東ソー社製：２２８０３）を１００μＬ充填したオープンカラム（バイオラッド社製）に、（２）の処理液をアプライした。
（４）５００μＬの１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄後、１００μＬの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で７回溶出することで、Ｎ型糖鎖を除去したヒトＩｇＧ１（以下単に、糖鎖除去したヒトＩｇＧ１という）を精製した。なお当該溶出液は、１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を溶出液の１／４量加えることで中和した。
（５）（４）で得られた糖鎖除去したヒトＩｇＧ１溶液に対し、等量のサンプルバッファー（２（ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウム、６（ｗ／ｖ）％β－メルカプトエタノール、１０（ｗ／ｖ）％グリセリンおよび０．００５（ｗ／ｖ）％ブロモフェノールブルーを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８））を添加し加熱処理することで、糖鎖除去したヒトＩｇＧ１を還元処理した。
（６）５から２０％のグラジエントＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル（アトー社製）を用いた電気泳動にてヒトＩｇＧ１を分離した。なお比較として、糖鎖処理をしていないヒトＩｇＧ１（以下、糖鎖ありヒトＩｇＧ１という）水溶液（濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）についても（５）の記載と同様な還元処理を行ない、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。
　結果を図７に示す。糖鎖除去ヒトＩｇＧ１の重鎖はＮ型糖鎖が除去されているため、糖鎖ありヒトＩｇＧ１の重鎖と比較し低分子量となるが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりそのことが確認できた（図７のレーン（２）参照）。つまり本実施例の方法で、Ｎ型糖鎖を除去したヒトＩｇＧ１が調製できることが確認できた。　
　実施例１６　ヒトＦｃγＲＩＩＩａの大量調製
（１）実施例１で得られたヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現可能な形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよび硫酸カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。
（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。
（５）（４）で回収した菌体を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、１００００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
（６）（５）で得られた破砕液に終濃度で２０ｍＭとなるようイミダゾールを添加後、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび２０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＮｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）５０ｍＬを充填したＸＫ　２６／２０カラム（ＧＥヘルスケア社製）にアプライした。
（７）平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび０．５Ｍのイミダゾールを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてヒトＦｃγＲＩＩＩａを溶出した。
（８）（７）で得られた溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＩｇＧセファロース（ＧＥヘルスケア社製）１０ｍＬを充填したＨＲ　１６／１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）でヒトＦｃγＲＩＩＩａを溶出した。なお溶出液は、溶出液量の１／４量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることでｐＨを中性付近に戻した。
　実施例１７　ヒトＦｃγＲＩＩＩａの抗体への結合性測定
（１）実施例１６で調製したヒトＦｃγＲＩＩＩａをリン酸緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、８．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍＭのＫＣｌおよび１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４を含むｐＨ７．４の緩衝液）にて透析することで緩衝液交換を行ない、２８０ｎｍの吸光度からヒトＦｃγＲＩＩＩａの濃度を測定した。
（２）（１）で濃度を測定したヒトＦｃγＲＩＩＩａを２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で１０μｇ／ｍＬに希釈後、アミンカップリングキット（ＧＥヘルスケア社製）を用いてセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）に固定化し、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ－１００（ＧＥヘルスケア社製）を用いてヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化量を測定した。結果、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの固定化量は４８８．２ＲＵ（１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ２）であった。またプロテインＡ（プロテノバ社製）についても同様に、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、ＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）に固定化した。Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ－１００で固定化量を測定した結果、固定化量は２９０．０ＲＵであった。
（３）糖鎖ありヒトＩｇＧ１および実施例１５で調製した糖鎖除去ヒトＩｇＧ１をＨＢＳ－ＥＰ（＋）（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡおよび０．００５（ｖ／ｖ）％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐ２０（ＧＥヘルスケア社製）を含む、ｐＨ７．４の溶液）にて１２８μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬに希釈した。
（４）（２）で作製したタンパク質固定化チップのうち、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化チップの場合は４μｇ／ｍＬから１２８μｇ／ｍＬの糖鎖ありヒトＩｇＧ１または糖鎖除去ヒトＩｇＧ１を流速３０μＬ／分で流し、プロテインＡ固定化チップの場合は１μｇ／ｍＬから１６μｇ／ｍＬの糖鎖ありヒトＩｇＧ１または糖鎖除去ヒトＩｇＧ１を流速３０μＬ／分で流して、ヒトＩｇＧ１とチップに固定化したタンパク質とを結合させた後、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ－１００にて接触時間２１０秒、解離時間４００秒の条件で測定することで、ヒトＩｇＧ１とチップに固定化したタンパク質との結合性を測定した。
　測定結果を図８に示す。ヒトＦｃγＲＩＩＩａは、糖鎖ありヒトＩｇＧ１に対しては結合性を有するが、糖鎖除去ヒトＩｇＧ１に対しては非常に結合しにくいことがわかる（図８（Ａ）参照）。つまり、この結果からヒトＦｃγＲＩＩＩａは抗体への糖鎖付加による違いを認識していることがわかる。一方、プロテインＡは、糖鎖あり／なしにかかわらずヒトＩｇＧ１に対して同様の結合性を有していることがわかる（図８（Ｂ）参照）。
　実施例１８　ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化ゲルの作製
（１）実施例１６で調製したヒトＦｃγＲＩＩＩａを、限外ろ過膜（ミリポア社製：アミコンウルトラ－１５）を用いて濃縮・緩衝液交換を行ない、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に２．６ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。
（２）担体である親水性ビニルポリマー（東ソー社製：トヨパール）の水酸基に１，６－ヘキサンジオールジグリシジルエーテルを反応させてエポキシトヨパールゲルを調製した。
（３）（２）で調製したエポキシトヨパールゲル７０μＬをスピンカラム（バイオラッド）に入れ、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．５ｍＬで３回洗浄した。
（４）（１）で調製したヒトＦｃγＲＩＩＩａ溶液０．４ｍＬと０．５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．６ｍＬとを混合した溶液を、（２）のゲルに添加し、３５℃で３時間振とうした。
（５）（４）で調製したゲルを０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）０．２ｍＬで３回洗浄した後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬで３回洗浄することでｐＨを中性付近に戻し、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化ゲル０．２ｍＬを調製した。
（６）（２）のゲルに添加した溶液および洗浄液中に含まれるタンパク質濃度を測定し、ゲルに固定化されたヒトＦｃγＲＩＩＩａ量を算出することで固定化率を計算したところ、添加したヒトＦｃγＲＩＩＩａの８４％がゲルに固定化されていた。
　実施例１９　ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化ゲルを用いた抗体分離
（１）実施例１８で作製したヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化ゲルをＨＲ１６／５カラム（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、当該カラムを液体クロマトグラフィー装置ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社製）に接続した。
（２）（１）で作製したカラムを１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化し、ヒトＩｇＧ１（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製：３１－ＡＩ１７）または実施例２で調製した糖鎖除去ヒトＩｇＧ１（溶液濃度はともに１ｍｇ／ｍＬ）を、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで０．１ｍＬ添加した。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出した。　
　結果を図９に示す。同量のＩｇＧ１を流しているにもかかわらず、糖鎖除去ヒトＩｇＧ１（図９（２）参照）は、糖鎖ありヒトＩｇＧ１（図９（１）参照）と比較し、ゲルに吸着せずに通過する抗体の量が多いことが確認できる。また糖鎖ありヒトＩｇＧ１では０．１Ｍのグリシン－塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）を添加した時、抗体が溶出された（図９（１）参照）が、糖鎖除去ヒトＩｇＧ１ではゲルにほとんど吸着しなかったため抗体が溶出されなかった（図９（２）参照）。つまり、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤は、糖鎖を有した抗体を特異的に吸着できる性能を有しており、この性能を利用することで抗体への糖鎖付加の有無を識別できることがわかる。
　本発明の吸着剤は、糖鎖を有した抗体を特異的に吸着するため、糖鎖を有した抗体を高純度に分離・精製できる。したがって本発明の吸着剤は、抗体医薬製造および品質管理に利用することができる。

Claims (19)

  1. 　配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質。
    （１）配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
    （２）配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
    （３）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
    （４）配列番号１の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
    （５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換
    （６）配列番号１の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
    （７）配列番号１の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
    （８）配列番号１の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
    （９）配列番号１の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
    （１０）配列番号１の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
    （１１）配列番号１の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
    （１２）配列番号１の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
    （１３）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
    （１４）配列番号１の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
    （１５）配列番号１の６５番目のセリンがアルギニンに置換
    （１６）配列番号１の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
    （１７）配列番号１の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
    （１８）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
    （１９）配列番号１の７８番目のアラニンがセリンに置換
    （２０）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
    （２１）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
    （２２）配列番号１の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
    （２３）配列番号１の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
    （２４）配列番号１の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
    （２５）配列番号１の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
    （２６）配列番号１の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
    （２７）配列番号１の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
    （２８）配列番号１の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
    （２９）配列番号１の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
    （３０）配列番号１の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
    （３１）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
    （３２）配列番号１の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
    （３３）配列番号１の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
    （３４）配列番号１の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
    （３５）配列番号１の１６７番目のセリンがグリシンに置換
    （３６）配列番号１の１６９番目のセリンがグリシンに置換
    （３７）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
    （３８）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
    （３９）配列番号１の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
    （４０）配列番号１の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
  2. 　配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において少なくとも配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換した、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質。
  3. 　配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において少なくとも配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギンまたはプロリンに置換した、請求項２に記載のＦｃ結合性タンパク質。
  4. 　配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において少なくとも２７番目のバリンがグルタミン酸に、３５番目のチロシンがアスパラギンにそれぞれ置換した、請求項３に記載のＦｃ結合性タンパク質。
  5. 　配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９のいずれかに記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含む、請求項４に記載のＦｃ結合性タンパク質。
  6. 　配列番号２７、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４７、配列番号４９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、請求項５に記載のＦｃ結合性タンパク質。
  7. 　さらに、以下の（４１）から（４４）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、請求項１から６のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質。（４１）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換（４２）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換（４３）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換（４４）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
  8. 　請求項１から７のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤。
  9. 　請求項８に記載の吸着剤を用いた抗体の精製方法。
  10. 　糖鎖を有した抗体を含む溶液を請求項８に記載の吸着剤に添加して当該吸着剤に吸着させる工程と、
    前記吸着剤に吸着した糖鎖を有した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程
    とを含む、糖鎖を有した抗体の精製方法。
  11. 　請求項８に記載の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別する方法。
  12. 　請求項９又は１０に記載の精製方法で得られる抗体。
  13. 　請求項８に記載の吸着剤を用いた糖鎖の分離方法。
  14. 　請求項１３に記載の分離方法で得られる糖鎖。
  15. 　請求項１から７のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  16. 　請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  17. 　請求項１６に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
  18. 　宿主が大腸菌である、請求項１７に記載の形質転換体。
  19. 　請求項１７または１８に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を発現させ、その培養物から発現されたＦｃ結合性タンパク質を回収する、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
PCT/JP2014/074739 2013-09-18 2014-09-18 Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた抗体の精製方法および識別方法 WO2015041303A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14846295.5A EP3048112B1 (en) 2013-09-18 2014-09-18 Fc-BINDING PROTEIN, METHOD FOR PRODUCING SAID PROTEIN, AND ANTIBODY ADSORBENT USING SAID PROTEIN, AND METHODS FOR PURIFYING AND IDENTIFYING ANTIBODY USING SAID ADSORBENT
CN201480051782.XA CN105555801B (zh) 2013-09-18 2014-09-18 Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法和使用了该蛋白质的抗体吸附剂、以及使用了该吸附剂的抗体的纯化方法及识别方法
US15/022,130 US10611817B2 (en) 2013-09-18 2014-09-18 Fc-binding protein, method for producing said protein, and antibody adsorbent using said protein, and methods for purifying and identifying antibody using said adsorbent

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013192931 2013-09-18
JP2013-192931 2013-09-18
JP2013202245 2013-09-27
JP2013-202245 2013-09-27
JP2014166884A JP2015083558A (ja) 2013-09-18 2014-08-19 抗体吸着剤ならびにそれを用いた抗体の精製方法および識別方法
JP2014-166884 2014-08-19
JP2014-166883 2014-08-19
JP2014166883A JP6507522B2 (ja) 2013-09-27 2014-08-19 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015041303A1 true WO2015041303A1 (ja) 2015-03-26

Family

ID=52688950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/074739 WO2015041303A1 (ja) 2013-09-18 2014-09-18 Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた抗体の精製方法および識別方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2015041303A1 (ja)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015199154A1 (ja) * 2014-06-27 2015-12-30 東ソー株式会社 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該吸着剤を用いた抗体の分離方法
JP2016023151A (ja) * 2014-07-17 2016-02-08 東ソー株式会社 抗体の分離方法
JP2017083349A (ja) * 2015-10-29 2017-05-18 東ソー株式会社 抗体依存性細胞傷害活性に基づく抗体の分析方法
WO2017218897A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel 1gg binding peptides and multifunctional antigen-binding proteins comprising the same
EP3140322A4 (en) * 2014-05-09 2017-12-27 One Lambda, Inc. Modified fc gamma receptor type iii (fc iii, hna-1) polypeptides and the uses thereof
JP2018016552A (ja) * 2016-07-25 2018-02-01 東ソー株式会社 Ｆｃ結合性タンパク質を用いたＩｇＧ１の精製方法
EP3162895A4 (en) * 2014-06-27 2018-02-14 Tosoh Corporation Improved fc-binding protein, method for producing said protein, antibody adsorbent using said protein, and method for separating antibody using said adsorbent
WO2019083048A1 (ja) * 2017-10-27 2019-05-02 東ソー株式会社 アルカリ耐性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該抗体吸着剤を用いて抗体を分離する方法
WO2019163919A1 (ja) * 2018-02-22 2019-08-29 東ソー株式会社 酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
CN110312734A (zh) * 2017-02-20 2019-10-08 东曹株式会社 抗体分离能力改善的Fc结合性蛋白质及使用其的抗体的分离方法
JP2020028285A (ja) * 2018-02-22 2020-02-27 東ソー株式会社 酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
CN112334768A (zh) * 2018-06-20 2021-02-05 东曹株式会社 抗体的分离方法和疾病的检查方法
WO2021140981A1 (ja) * 2020-01-10 2021-07-15 国立研究開発法人理化学研究所 左右非対称の糖鎖を有する抗体を均一に含む抗体集団、及びその製造方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996034953A2 (en) * 1995-05-03 1996-11-07 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Cd16-ii variants
WO2000032767A1 (en) * 1998-12-03 2000-06-08 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. RECOMBINANT SOLUBLE Fc RECEPTORS
JP2011097898A (ja) 2009-11-09 2011-05-19 Sagami Chemical Research Institute 組換えＦｃ受容体およびそれの製造方法
JP2011206046A (ja) 2010-03-10 2011-10-20 Sagami Chemical Research Institute 改良Ｆｃ受容体およびその製造方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996034953A2 (en) * 1995-05-03 1996-11-07 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Cd16-ii variants
WO2000032767A1 (en) * 1998-12-03 2000-06-08 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. RECOMBINANT SOLUBLE Fc RECEPTORS
JP2011097898A (ja) 2009-11-09 2011-05-19 Sagami Chemical Research Institute 組換えＦｃ受容体およびそれの製造方法
JP2011206046A (ja) 2010-03-10 2011-10-20 Sagami Chemical Research Institute 改良Ｆｃ受容体およびその製造方法

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Molecular Cloning", 1992, COLD SPRING HARBOR LABORATORY, pages: 256
"Structure and Function of Protein", vol. 9, 2005, MEDICAL SCIENCE INTERNATIONAL, INC.
ELLSWORTH, J.L. ET AL.: "Generation of a high- affinity Fcgamma receptor by Ig-domain swapping between human CD 64A and CD 16A.", PROTEIN ENG. DES. SEL., vol. 23, no. 4, April 2010 (2010-04-01), pages 299 - 309, XP055332310 *
FERRARA, C. ET AL.: "The carbohydrate at FcgammaRIIIa Asn-162. An element required for high affinity binding to non-fucosylated IgG glycoforms.", J. BIOL. CHEM., vol. 281, no. 8, 24 February 2006 (2006-02-24), pages 5032 - 5036, XP002430982 *
J. GALON ET AL., EUR. J. IMMUNOL., vol. 27, 1997, pages 1928 - 1932
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 30, 2002, pages E43
ROGERS, K.A. ET AL.: "IgG Fc receptor III homologues in nonhuman primate species: genetic characterization and ligand interactions.", J. IMMUNOL., vol. 177, no. 6, 15 September 2006 (2006-09-15), pages 3848 - 3856, XP055248767 *
See also references of EP3048112A4 *
SHIBATA-KOYAMA, M. ET AL.: "The N-linked oligosaccharide at Fc gamma RIIIa Asn-45: an inhibitory element for high Fc gamma RIIIa binding affinity to IgG glycoforms lacking core fucosylation.", GLYCOBIOLOGY, vol. 19, no. 2, February 2009 (2009-02-01), pages 126 - 134, XP055332309 *
SHINKAWA, T., J. BIOL. CHEM., vol. 278, 2003, pages 3466 - 3473
TAKAI, T., JPN. J. CLIN. IMMUNOL., vol. 28, 2005, pages 318 - 326
TAKAI.T., JPN. J. CLIN. IMMUNOL., vol. 28, 2005, pages 318 - 326
ZOU, G. ET AL.: "Chemoenzymatic synthesis and Fcy receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcyIIIa receptor.", J. AM. CHEM. SOC., vol. 133, no. 46, 23 November 2011 (2011-11-23), pages 18975 - 18991, XP055061687 *

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3140322A4 (en) * 2014-05-09 2017-12-27 One Lambda, Inc. Modified fc gamma receptor type iii (fc iii, hna-1) polypeptides and the uses thereof
US10815289B2 (en) 2014-06-27 2020-10-27 Tosoh Corporation Fc-binding protein, method for producing said protein, antibody adsorbent using said protein, and method for separating antibody using said adsorbent
EP3162895A4 (en) * 2014-06-27 2018-02-14 Tosoh Corporation Improved fc-binding protein, method for producing said protein, antibody adsorbent using said protein, and method for separating antibody using said adsorbent
WO2015199154A1 (ja) * 2014-06-27 2015-12-30 東ソー株式会社 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該吸着剤を用いた抗体の分離方法
JP2016023151A (ja) * 2014-07-17 2016-02-08 東ソー株式会社 抗体の分離方法
JP2017083349A (ja) * 2015-10-29 2017-05-18 東ソー株式会社 抗体依存性細胞傷害活性に基づく抗体の分析方法
WO2017218897A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel 1gg binding peptides and multifunctional antigen-binding proteins comprising the same
CN109641066A (zh) * 2016-06-17 2019-04-16 宾夕法尼亚大学理事会 新的IgG结合肽和含有该肽的多功能抗原结合蛋白
CN109641066B (zh) * 2016-06-17 2022-06-21 宾夕法尼亚大学理事会 新的IgG结合肽和含有该肽的多功能抗原结合蛋白
US11312784B2 (en) 2016-06-17 2022-04-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania IgG binding peptides and multifunctional antigen-binding proteins comprising the same
JP2018016552A (ja) * 2016-07-25 2018-02-01 東ソー株式会社 Ｆｃ結合性タンパク質を用いたＩｇＧ１の精製方法
CN110312734A (zh) * 2017-02-20 2019-10-08 东曹株式会社 抗体分离能力改善的Fc结合性蛋白质及使用其的抗体的分离方法
CN110312734B (zh) * 2017-02-20 2023-10-10 东曹株式会社 抗体分离能力改善的Fc结合性蛋白质及使用其的抗体的分离方法
WO2019083048A1 (ja) * 2017-10-27 2019-05-02 東ソー株式会社 アルカリ耐性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該抗体吸着剤を用いて抗体を分離する方法
US11603548B2 (en) 2017-10-27 2023-03-14 Tosoh Corporation Fc-binding protein exhibiting improved alkaline resistance, method for producing said protein, antibody adsorbent using said protein, and method for separating antibody using said antibody adsorbent
JP2020028285A (ja) * 2018-02-22 2020-02-27 東ソー株式会社 酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
EP3757216A4 (en) * 2018-02-22 2022-03-23 Tosoh Corporation FC BINDING PROTEIN HAVING IMPROVED ACID STABILITY, METHOD FOR PRODUCING THE SAME PROTEIN AND ANTIBODY ADSORPTION AGENT USING THE SAME PROTEIN
WO2019163919A1 (ja) * 2018-02-22 2019-08-29 東ソー株式会社 酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
JP7293657B2 (ja) 2018-02-22 2023-06-20 東ソー株式会社 酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
CN112334768A (zh) * 2018-06-20 2021-02-05 东曹株式会社 抗体的分离方法和疾病的检查方法
CN112334768B (zh) * 2018-06-20 2024-03-05 东曹株式会社 抗体的分离方法和疾病的检查方法
WO2021140981A1 (ja) * 2020-01-10 2021-07-15 国立研究開発法人理化学研究所 左右非対称の糖鎖を有する抗体を均一に含む抗体集団、及びその製造方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2015041303A1 (ja) Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤、ならびに当該吸着剤を用いた抗体の精製方法および識別方法
JP6507522B2 (ja) 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
US10611817B2 (en) Fc-binding protein, method for producing said protein, and antibody adsorbent using said protein, and methods for purifying and identifying antibody using said adsorbent
WO2015199154A1 (ja) 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該吸着剤を用いた抗体の分離方法
US10815289B2 (en) Fc-binding protein, method for producing said protein, antibody adsorbent using said protein, and method for separating antibody using said adsorbent
JP6932923B2 (ja) 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
JP7306270B2 (ja) 免疫グロブリン結合性タンパク質
JP6699096B2 (ja) 改良Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
US11603548B2 (en) Fc-binding protein exhibiting improved alkaline resistance, method for producing said protein, antibody adsorbent using said protein, and method for separating antibody using said antibody adsorbent
EP3517609B1 (en) Improved recombinant fc gamma rii
JP2015083558A (ja) 抗体吸着剤ならびにそれを用いた抗体の精製方法および識別方法
JP7047425B2 (ja) 抗体の分離能が向上したＦｃ結合性タンパク質およびそれを用いた抗体の分離方法
WO2019163919A1 (ja) 酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
JP6848241B2 (ja) Ｆｃ結合性タンパク質を用いたＩｇＧ１の精製方法
JP7009913B2 (ja) アミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質
WO2018198817A1 (ja) 安定型Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
JP7310142B2 (ja) アルカリ耐性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該抗体吸着剤を用いて抗体を分離する方法
JP7293657B2 (ja) 酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
JP2021136967A (ja) 熱に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
JP2022076998A (ja) 酸に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
JP2021073877A (ja) 酸安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201480051782.X

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14846295

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15022130

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014846295

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014846295

Country of ref document: EP