CN110573621B - 稳定型Fc结合性蛋白质、所述蛋白质的制造方法和使用了所述蛋白质的抗体吸附剂 - Google Patents

稳定型Fc结合性蛋白质、所述蛋白质的制造方法和使用了所述蛋白质的抗体吸附剂 Download PDF

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Abstract

本发明解决了提供具有对热和酸的改进的稳定性的FcRn、生产所述FcRn的方法、使用所述FcRn的抗体吸附剂、和使用所述吸附剂的抗体分离方法的问题。通过用另一种特定氨基酸取代人FcRnα链的细胞外区和/或人FcRnβ链的β2微球蛋白区中特定位置的氨基酸残基，解决了上述问题。

Description

稳定型Fc结合性蛋白质、所述蛋白质的制造方法和使用了所 述蛋白质的抗体吸附剂
技术领域
本发明涉及具有对免疫球蛋白的亲和性的Fc结合性蛋白质。更具体地，一种与野生型相比具有对热或酸的增强的稳定性的人新生儿Fc受体(FcRn)，编码所述受体的多聚核苷酸，利用所述多聚核苷酸制造人FcRn的方法，以及通过将所述受体固定化于不溶性载体获得的抗体吸附剂。
背景技术
Fc受体是结合免疫球蛋白分子的Fc区的一组分子。单个的分子通过属于免疫球蛋白超家族的识别结构域来识别单一的免疫球蛋白同种型，或通过Fc受体上的识别结构域识别同一组的免疫球蛋白同种型。因而，它决定了在免疫应答中将征募哪种辅助细胞。Fc受体可以进一步分为几种亚型，包括作为IgG(免疫球蛋白G)的受体的Fcγ受体；结合IgE的Fc区的Fcε受体；结合IgA的Fc区的Fcα受体，等等。此外，各受体还更细地分类，对于Fcγ受体而言，报道了存在FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和FcγRIIIb(非专利文献1)。
另一方面，人新生儿Fc受体(FcRn)是I类主要组织相容性复合体(MHC)相关分子，其不同于属于免疫球蛋白超家族的人Fcγ受体，由重链(α链)和β2微球蛋白(β链)组成(非专利文献2)。FcRn参与再循环IgG的机制，用于抑制IgG的降解。此外，FcRn取决于pH值而结合IgG，在6.5以下的pH值下结合(非专利文献3)。
人FcRn的α链的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)在公众数据库例如UniProt(登录号：P55899)中公开。此外，β链的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)在UniProt(登录号：P61769)中公开。进一步地，类似地公开了人FcRn的结构功能结构域、用于穿透细胞膜的信号肽序列、以及跨膜区的位置。图1说明了人FcRn的α链的示意性结构图，图2说明了β链的示意性结构图。注意的是，图1中的氨基酸编号相应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸编号。换句话说，在SEQID NO：1中，第1位的甲硫氨酸(Met)到第23位的甘氨酸(Gly)的区域分配给信号序列(S)；第24位的丙氨酸(Ala)到第297位的丝氨酸(Ser)的区域分配给细胞外区(EC)；第298位的缬氨酸(Val)到第321位的色氨酸(Trp)的区域分配给跨膜区(TM)；第322位的精氨酸(Arg)到第365位的丙氨酸(Ala)的区域分配给细胞内区(C)。在图2中，氨基酸编号相应于SEQ ID NO：2中列出的氨基酸编号。换句话说，在SEQ ID NO：2中，第1位的甲硫氨酸(Met)到第20位的丙氨酸(Ala)分配给信号序列(S)；第21位的异亮氨酸(Ile)到第119位的甲硫氨酸(Met)分配给β2微球蛋白(B2M)。
[引文列表]
[非专利文献]
[非专利文献1]Takai.T.，Jpn.J.Clin.Immunol.，28，318-326，2005
[非专利文献2]N.E.Simister等，Nature，337，184-187，1989
[非专利文献3]M.Raghavan等，Biochemistry，34，14649-14657，1995
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目标是提供具有增强的稳定性、特别是对于热或酸的增强的稳定性的FcRn，以及提供所述FcRn的制造方法。
用于解决问题的方案
本发明人进行了深入的研究来解决上述问题。结果，本发明人确定了人FcRn中涉及增强稳定性的氨基酸残基，发现了该氨基酸残基被其他氨基酸取代的突变体具有对于热和酸的优异的稳定性。由此他们获得了本发明。
换句话说，本申请涵盖根据以下<1>至<15>的方面：
<1>一种Fc结合性蛋白质，其包含SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的第24位的丙氨酸到第297位的丝氨酸的氨基酸残基，和SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列的第21位的异亮氨酸到第119位的甲硫氨酸的氨基酸残基，条件是所述Fc结合性蛋白质包括所述氨基酸残基中的至少任一个以下突变(1)至(39)：
(1)SEQ ID NO：1中第49位的缬氨酸被丙氨酸取代的突变；
(2)SEQ ID NO：1中第62位的天冬酰胺被苏氨酸取代的突变；
(3)SEQ ID NO：1中第71位的半胱氨酸被精氨酸取代的突变；
(4)SEQ ID NO：1中第78位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
(5)SEQ ID NO：1中第79位的谷氨酰胺被组氨酸取代的突变；
(6)SEQ ID NO：1中第80位的缬氨酸被天冬氨酸取代的突变；
(7)SEQ ID NO：1中第96位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变；
(8)SEQ ID NO：1中第103位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变；
(9)SEQ ID NO：1中第125位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
(10)SEQ ID NO：1中第127位的丝氨酸被脯氨酸取代的突变；
(11)SEQ ID NO：1中第151位的甘氨酸被天冬氨酸取代的突变；
(12)SEQ ID NO：1中第172位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
(13)SEQ ID NO：1中第173位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变；
(14)SEQ ID NO：1中第180位的苯丙氨酸被酪氨酸取代的突变；
(15)SEQ ID NO：1中第192位的精氨酸被亮氨酸取代的突变；
(16)SEQ ID NO：1中第193位的甘氨酸被天冬氨酸取代的突变；
(17)SEQ ID NO：1中第196位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
(18)SEQ ID NO：1中第206位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变；
(19)SEQ ID NO：1中第210位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变；
(20)SEQ ID NO：1中第219位的亮氨酸被组氨酸取代的突变；
(21)SEQ ID NO：1中第220位的苏氨酸被丙氨酸取代的突变；
(22)SEQ ID NO：1中第226位的苯丙氨酸被丝氨酸取代的突变；
(23)SEQ ID NO：1中第232位的谷氨酰胺被亮氨酸取代的突变；
(24)SEQ ID NO：1中第233位的亮氨酸被脯氨酸取代的突变；
(25)SEQ ID NO：1中第255位的甘氨酸被丝氨酸取代的突变；
(26)SEQ ID NO：1中第256位的丝氨酸被脯氨酸取代的突变；
(27)SEQ ID NO：1中第261位的丝氨酸被脯氨酸取代的突变；
(28)SEQ ID NO：1中第262位的丝氨酸被半胱氨酸取代的突变；
(29)SEQ ID NO：1中第263位的亮氨酸被脯氨酸取代的突变；
(30)SEQ ID NO：1中第266位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变；
(31)SEQ ID NO：1中第267位的丝氨酸被脯氨酸取代的突变；
(32)SEQ ID NO：1中第273位的酪氨酸被组氨酸取代的突变；
(33)SEQ ID NO：1中第282位的亮氨酸被组氨酸取代的突变；
(34)SEQ ID NO：1中第286位的亮氨酸被组氨酸取代的突变；
(35)SEQ ID NO：1中第295位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变；
(36)SEQ ID NO：2中第32位的精氨酸被组氨酸取代的突变；
(37)SEQ ID NO：2中第42位的苯丙氨酸被异亮氨酸或酪氨酸取代的突变；
(38)SEQ ID NO：2中第68位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变；
(39)SEQ ID NO：2中第87位的酪氨酸被组氨酸取代的突变。
<2>根据<1>的Fc结合性蛋白质，其包含由SEQ ID NO：3中列出的氨基酸序列组成的氨基酸残基，条件是所述Fc结合性蛋白质包括所述氨基酸残基中的至少任一个以下突变(1)到(45)：
(1)SEQ ID NO：3中第152位的缬氨酸被丙氨酸取代的突变；
(2)SEQ ID NO：3中第165位的天冬酰胺被苏氨酸取代的突变；
(3)SEQ ID NO：3中第174位的半胱氨酸被精氨酸取代的突变；
(4)SEQ ID NO：3中第181位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
(5)SEQ ID NO：3中第182位的谷氨酰胺被组氨酸取代的突变；
(6)SEQ ID NO：3中第183位的缬氨酸被天冬氨酸取代的突变；
(7)SEQ ID NO：3中第199位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变；
(8)SEQ ID NO：3中第206位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变；
(9)SEQ ID NO：3中第228位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
(10)SEQ ID NO：3中第230位的丝氨酸被脯氨酸取代的突变；
(11)SEQ ID NO：3中第254位的甘氨酸被天冬氨酸取代的突变；
(12)SEQ ID NO：3中第275位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
(13)SEQ ID NO：3中第276位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变；
(14)SEQ ID NO：3中第283位的苯丙氨酸被酪氨酸取代的突变；
(15)SEQ ID NO：3中第295位的精氨酸被亮氨酸取代的突变；
(16)SEQ ID NO：3中第296位的甘氨酸被天冬氨酸取代的突变；
(17)SEQ ID NO：3中第299位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
(18)SEQ ID NO：3中第309位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变；
(19)SEQ ID NO：3中第313位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变；
(20)SEQ ID NO：3中第322位的亮氨酸被组氨酸取代的突变；
(21)SEQ ID NO：3中第323位的苏氨酸被丙氨酸取代的突变；
(22)SEQ ID NO：3中第329位的苯丙氨酸被丝氨酸取代的突变；
(23)SEQ ID NO：3中第335位的谷氨酰胺被亮氨酸取代的突变；
(24)SEQ ID NO：3中第336位的亮氨酸被脯氨酸取代的突变；
(25)SEQ ID NO：3中第358位的甘氨酸被丝氨酸取代的突变；
(26)SEQ ID NO：3中第359位的丝氨酸被脯氨酸取代的突变；
(27)SEQ ID NO：3中第364位的丝氨酸被脯氨酸取代的突变；
(28)SEQ ID NO：3中第365位的丝氨酸被半胱氨酸取代的突变；
(29)SEQ ID NO：3中第366位的亮氨酸被脯氨酸取代的突变；
(30)SEQ ID NO：3中第369位的赖氨酸被谷氨酸或精氨酸取代的突变；
(31)SEQ ID NO：3中第370位的丝氨酸被脯氨酸取代的突变；
(32)SEQ ID NO：3中第376位的酪氨酸被组氨酸取代的突变；
(33)SEQ ID NO：3中第385位的亮氨酸被组氨酸取代的突变；
(34)SEQ ID NO：3中第389位的亮氨酸被组氨酸取代的突变；
(35)SEQ ID NO：3中第398位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变；
(36)SEQ ID NO：3中第14位的精氨酸被组氨酸取代的突变；
(37)SEQ ID NO：3中第24位的苯丙氨酸被异亮氨酸或酪氨酸取代的突变；
(38)SEQ ID NO：3中第50位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变；
(39)SEQ ID NO：3中第69位的酪氨酸被组氨酸取代的突变；
(40)SEQ ID NO：3中第107位的甘氨酸被天冬氨酸取代的突变；
(41)SEQ ID NO：3中第114位的甘氨酸被天冬氨酸取代的突变；
(42)SEQ ID NO：3中第117位的甘氨酸被丝氨酸取代的突变；
(43)SEQ ID NO：3中第123位的甘氨酸被丝氨酸或天冬氨酸取代的突变；
(44)SEQ ID NO：3中第125位的甘氨酸被天冬氨酸取代的突变；
(45)SEQ ID NO：3中第126位的丝氨酸被天冬酰胺取代的突变。
<3>根据<2>的Fc结合性蛋白质，其包括以下示出的至少四个突变：
(3)SEQ ID NO：3中第174位的半胱氨酸被精氨酸取代的突变；
(4)SEQ ID NO：3中第181位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
(15)SEQ ID NO：3中第295位的精氨酸被亮氨酸取代的突变；
(23)SEQ ID NO：3中第335位的谷氨酰胺被亮氨酸取代的突变。
<4>根据<3>的Fc结合性蛋白质，其进一步包括以下突变：
(11)SEQ ID NO：3中第254位的甘氨酸被天冬氨酸取代的突变。
<5>根据<4>的Fc结合性蛋白质，其进一步包括以下突变：
(17)SEQ ID NO：3中第299位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变。
<6>根据<5>的Fc结合性蛋白质，其进一步包括以下突变：
(35)SEQ ID NO：3中第398位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变。
<7>根据<6>的Fc结合性蛋白质，其进一步包括以下示出的至少一个突变：
(1)SEQ ID NO：3中第152位的缬氨酸被丙氨酸取代的突变；
(12)SEQ ID NO：3中第275位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
(19)SEQ ID NO：3中第313位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变；
(26)SEQ ID NO：3中第359位的丝氨酸被脯氨酸取代的突变。
<8>根据<3>的Fc结合性蛋白质，其包含由SEQ ID NO：5至7的任一个中列出的序列组成的氨基酸残基。
<9>一种多聚核苷酸，其编码根据<1>至<8>的任一项的Fc结合性蛋白质。
<10>一种表达载体，其含有根据<9>的多聚核苷酸。
<11>一种转化体，其通过用根据<10>的表达载体转化宿主获得。
<12>根据<11>的转化体，其中所述宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)。
<13>一种生产Fc结合性蛋白质的方法，其包括：
(A)通过培养根据<11>或<12>的转化体来表达Fc结合性蛋白质的步骤；和
(B)从培养物回收表达的Fc结合性蛋白质的步骤。
<14>一种吸附剂，其通过将根据<1>至<8>的任一项的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体来获得。
<15>一种分离抗体的方法，其包括使根据<14>的吸附剂与含有所述抗体的溶液接触的步骤。
以下将详细解释本发明。
本发明的Fc结合性蛋白质是具有对抗体的Fc区的结合性的蛋白质，其至少包含以下(I)和(II)中示出的氨基酸残基，条件是所述Fc结合性蛋白质包括在所述氨基酸残基中特定位置的氨基酸取代：
(I)从第24位的丙氨酸到第297位的丝氨酸的氨基酸残基，其相应于由SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列组成的人FcRnα链的细胞外区(图1中的EC区)；
(II)从第21位的异亮氨酸到第119位的甲硫氨酸的氨基酸残基，其相应于由SEQID NO：2中列出的氨基酸序列组成的人FcRnβ链的β2微球蛋白区(图2中的B2M区)。
因而，本发明的Fc结合性蛋白质可以含有位于人FcRnα链的细胞外区(图1中的EC区)或人FcRnβ链的β2微球蛋白区(图2中的B2M区)的N-末端侧的全部或部分信号肽区(图1和图2中的S区)，或可以含有位于人FcRnα链的细胞外区(图1中的EC区)的C-末端侧的跨膜区(图1中的TM区)和细胞外区(图1中的C区)的全部或部分。
在本说明书中，至少包含上述(I)和上述(II)中示出的氨基酸残基的Fc结合性蛋白质是可接受的，只要它在所述蛋白质的氨基酸序列中至少包含上述(I)中示出的氨基酸序列和上述(II)中示出的氨基酸序列即可，并且可以是一方面其中上述(I)中示出的氨基酸残基与上述(II)中示出的氨基酸残基直接连接，或一方面其中上述(I)中示出的氨基酸残基与上述(II)中示出的氨基酸残基通过已知的接头例如GS接头(由GGGS的重复顺序组成的接头)连接。
在本说明书中，“野生型FcRn”不仅包括天然发生的FcRn，还包括至少包含上述(I)和上述(II)中示出的氨基酸残基的FcRn，并且在上述(I)和上述(II)中示出的氨基酸残基中没有突变(氨基酸的取代、删除、插入或添加)。具体地，实例包括包含其中上述(I)和上述(II)中示出的氨基酸残基通过接头序列连接的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：3)的FcRn等。
至少包含上述(I)和上述(II)中示出的氨基酸残基的Fc结合性蛋白质的优选的方面包括，包含由SEQ ID NO：3中列出的序列组成的氨基酸残基的Fc结合性蛋白质。在SEQ IDNO：3中，从第3位的异亮氨酸到第101位的甲硫氨酸的区域相应于人FcRnβ链的β2微球蛋白区(SEQ ID NO：2中从第21位的异亮氨酸到第119位的甲硫氨酸的区域)，从第102位的甘氨酸到第126位的丝氨酸的区域相应于GS接头，从第127位的丙氨酸到第400位的丝氨酸的区域相应于人FcRnα链的细胞外区(SEQ ID NO：1中从第24位的丙氨酸到第297位的丝氨酸的区域)。
具体地，当至少包含上述(I)和上述(II)中示出的氨基酸残基的Fc结合性蛋白质是由SEQ ID NO：3中列出的序列组成的Fc结合性蛋白质时，上述特定位置处的氨基酸取代是至少任一个以下的取代：Arg14His(该表述表示SEQ ID NO：3中第14位的精氨酸被组氨酸取代，下同)，Phe24Ile、Phe24Tyr、Lys50Glu、Tyr69His、Gly107Asp、Gly114Asp、Gly117Ser、Gly123Ser、Gly123Asp、Gly125Asp、Ser126Asn、Val152Ala、Asn165Thr、Cys174Arg、Asn181Asp、Gln182His、Val183Asp、Lys199Glu、Lys206Glu、Asn228Asp、Ser230Pro、Gly254Asp、Asn275Asp、Lys276Glu、Phe283Tyr、Arg295Leu、Gly296Asp、Asn299Asp、Arg309Cys、Arg313Cys、Leu322His、Thr323Ala、Phe329Ser、Gln335Leu、Leu336Pro、Gly358Ser、Ser359Pro、Ser364Pro、Ser365Cys、Leu366Pro、Lys369Glu、Lys369Arg、Ser370Pro、Tyr376His、Leu385His、Leu389His、和Lys398Glu。注意的是，SEQ ID NO：1和2中上述氨基酸取代的氨基酸残基位置在表1中示出。
[表1]
当通过氨基酸取代产生本发明的Fc结合性蛋白质时，与上述特定位置不同位置处的氨基酸残基可以用与上述那些不同的氨基酸取代，只要它具有抗体亲合力即可。实例包括氨基酸之间产生的保守性取代，其中两个氨基酸的物理性质和/或化学性质两者或之一是彼此相似的。本领域技术人员已知的是，在保守性取代中，不限于Fc结合性蛋白质，一般而言，在不具有所产生的取代的蛋白质和具有所产生的取代的蛋白质之间维持了蛋白质的功能。保守性取代的实例包括甘氨酸和丙氨酸之间、天冬氨酸和谷氨酸之间、丝氨酸和脯氨酸之间、或谷氨酸和丙氨酸之间产生的取代(Structure and Function of Protein，MEDICAL SCIENCES INTERNATIONAL，LTD.，9，2005)。
在本发明的Fc结合性蛋白质中，氨基酸的数目没有特别的限制。实例包括以下(a)至(c)中示出的Fc结合性蛋白质。这些Fc结合性蛋白质因为对于热或酸的稳定性增强而是优选的。
(a)Fc结合性蛋白质，其包含由SEQ ID NO：3中列出的序列组成的氨基酸残基，条件是所述Fc结合性蛋白质在所述氨基酸残基中包括Cys174Arg、Asn181Asp、Arg295Leu和Gln335Leu的取代(包含由SEQ ID NO：5中列出的序列组成的氨基酸残基的Fc结合性蛋白质)。
(b)Fc结合性蛋白质，其包含由SEQ ID NO：3中列出的序列组成的氨基酸残基，条件是所述Fc结合性蛋白质在所述氨基酸残基中包括Cys174Arg、Asn181Asp、Gly254Asp、Arg295Leu、Asn299Asp、Gln335Leu和Lys398Glu的取代(包含由SEQ ID NO：6中列出的序列组成的氨基酸残基的Fc结合性蛋白质)。
(c)Fc结合性蛋白质，其包含由SEQ ID NO：3中列出的序列组成的氨基酸残基，条件是所述Fc结合性蛋白质在所述氨基酸残基中包括Val152Ala、Cys174Arg、Asn181Asp、Gly254Asp、Arg295Leu、Asn299Asp、Gln335Leu和Lys398Glu的取代(包含由SEQ ID NO：7中列出的序列组成的氨基酸残基的Fc结合性蛋白质)。
本发明的Fc结合性蛋白质还可以在其N-末端侧或C-末端侧进一步附加当从杂质存在下的溶液中分离时有用的寡肽。前述寡肽的实例包括多聚组氨酸、多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚谷氨酸和多聚天冬氨酸等。进一步地，在将本发明的Fc结合性蛋白质固定化于固相例如用于色谱的支持体上时有用的、含有半胱氨酸的寡肽可以添加在本发明的Fc结合性蛋白质的N-末端侧或C-末端侧。在Fc结合性蛋白质的N-末端侧或C-末端侧添加的寡肽的长度没有特别的限制，只要不损害本发明的Fc结合性蛋白质的IgG结合性质或稳定性即可。构成所述寡肽的肽的数目可以是，例如，2个以上，优选地4个以上，更优选地6个以上。进一步地，其可以是20个以下，优选地15个以下，以及更优选地10个以下。当所述寡肽添加到本发明的Fc结合性蛋白质时，其可以在产生编码所述寡肽的多聚核苷酸之后使用本领域技术人员公知的方法以遗传工程化的方式添加到所述Fc结合性蛋白质的N-末端侧或C-末端侧。可选择地，化学合成的所述寡肽可以化学地键合或添加到本发明的Fc结合性蛋白质的N-末端侧或C-末端侧。进一步地，在本发明的Fc结合性蛋白质的N-末端侧，可以添加信号肽以促进在宿主中的有效表达。当宿主是大肠杆菌时，信号肽的实例可以包括信号肽例如PelB、DsbA、MalE(UniProt No.P0AEX9中列出的氨基酸序列的第1位至第26位的区域)、TorT，它们使蛋白质周质分泌(日本特开(Kokai)2011-097898号公报)。
产生本发明的多聚核苷酸的方法的实例包括：
(i)包括将本发明的Fc结合性蛋白质的氨基酸序列转换为核苷酸序列来人工地合成含有所述核苷酸序列的多聚核苷酸的方法；和
(ii)包括直接人工地制备含有Fc结合性蛋白质的全部或部分序列的多聚核苷酸，或利用DNA扩增法例如PCR法例如由所述Fc结合性蛋白质的cDNA制备，并通过适当的方法连接所制备的多聚核苷酸的方法。在所述方法(i)中，当氨基酸序列转换为核苷酸序列时，优选考虑要被转化的宿主中的密码子的使用频率来转换。举例来说，当宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)时，由于精氨酸(Arg)的AGA/AGG/CGG/CGA、异亮氨酸(Ile)的ATA、亮氨酸(Leu)的CTA、甘氨酸(Gly)的GGA和脯氨酸(Pro)的CCC是较少使用的(所谓的稀有密码子)，可以避免这些密码子而进行转换。还可以利用公共数据库来分析密码子使用频率(例如，Kazusa DNA研究所的网站可获得的密码子使用频率数据库)。在本发明的多聚核苷酸中，α链和β链可以分别地表达，或α链和β链可以通过接头连接。后者的实例包括由SEQ IDNO：4中列出的序列组成的多聚核苷酸，其是编码如下蛋白质的多聚核苷酸，所述蛋白质由SEQ ID NO：3中列出的序列组成，其是含有通过GS接头连接的人FcRnα链和β链的Fc结合性蛋白质。
在将突变导入本发明的多聚核苷酸时，可以使用易错PCR法。易错PCR法中的反应条件没有特别限制，只要期望的突变可以导入编码Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸中即可。例如，作为底物的4种脱氧核苷酸(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)的浓度可以构造为不同的，以0.01至10mM(优选地0.1至1mM)的浓度将MnCl2添加到PCR反应溶液中来进行PCR，从而向多聚核苷酸中导入突变。进一步地，易错PCR法以外的导入突变的方法的实例包括如下方法，其中含有Fc结合性蛋白质的全部或部分序列的多聚核苷酸与作为诱变剂的试剂接触并反应，或用UV光照射来向多聚核苷酸中导入突变用于生产。在所述方法中，作为用作诱变剂的试剂，可以使用本领域技术人员通常使用的诱变试剂，例如，羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼。
表达本发明的Fc结合性蛋白质的宿主没有特别的限制。实例包括，例如，动物细胞(CHO细胞、HEK细胞、Hela细胞、COS细胞，等)、酵母(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，等)、昆虫细胞(Sf9、Sf21，等)、大肠杆菌(JM109菌株、BL21(DE3)菌株、W3110菌株，等)和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。就生产率而言优选使用动物细胞或大肠杆菌作为宿主，更优选地使用大肠杆菌作为宿主。
当本发明的多聚核苷酸用于转化宿主时，可以使用本发明的多聚核苷酸本身，但是更优选地使用在适当的位置插入了本发明的多聚核苷酸的表达载体(例如，噬菌体、粘粒、质粒等，它们通常用于转化原核细胞或真核细胞)。所述表达载体没有特别的限制，只要其可以在待转化的宿主中稳定地存在和复制即可。当使用大肠杆菌作为宿主时，可以提及pET质粒载体、pUC质粒载体、pTrc质粒载体、pCDF质粒载体和pBBR质粒载体。适当的位置是指不破坏表达载体的复制功能、期望的抗生素标志物、涉及传递性的区域的位置。当本发明的多聚核苷酸插入表达载体中时，优选以与表达所需的功能性多聚核苷酸例如启动子相连的状态插入。当宿主是大肠杆菌时，启动子的实例包括trp启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、T7启动子、recA启动子和lpp启动子，还包括λ噬菌体的λPL启动子和λPR启动子；当宿主是动物细胞时，实例包括SV40启动子、CMV启动子、CAG启动子。
为了使用插入了通过所述方法产生的本发明的多聚核苷酸的表达载体(以下称为本发明的表达载体)转化宿主，可以使用本领域技术人员一般使用的方法。例如，当属于埃希氏杆菌属(Escherichia)的微生物(大肠杆菌JM109菌株、大肠杆菌BL21(DE3)菌株、大肠杆菌W3110菌株，等)选作宿主时，例如可以使用已知的参考文献(例如，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory，256，1992)中描述的方法进行转化。当宿主是动物细胞时，可以使用电穿孔或脂转染。通过使用上述方法转化获得的转化体可以通过适当的方法筛选来获得可以表达本发明的Fc结合性蛋白质的转化体(以下称为本发明的转化体)。
为了从本发明的转化体制备本发明的表达载体，可以通过适合于所述转化使用的宿主的方法，从本发明的转化体提取和制备本发明的表达载体。例如，当本发明的转化体的宿主是大肠杆菌时，可以使用碱提取方法或市售的提取试剂盒如QIAprep Spin Miniprep试剂盒(由Qiagen N.V.制造)等，从培养所述转化体获得的培养物中制备。
可以通过培养本发明的转化体、从培养物回收本发明的Fc结合性蛋白质来生产本发明的Fc结合性蛋白质。在本说明书中，所述培养物包括培养的本发明的转化体的细胞本身以及用于培养的培养基。生产本发明的蛋白质的方法中使用的转化体可以在适合于培养目标宿主的培养基中培养。当所述宿主是大肠杆菌时，优选的培养基的实例包括补充有营养物来源的LB(Luria-Bertani)培养基。为了基于所导入的本发明的表达载体的存在与否来选择性地增殖本发明的转化体，优选将与所述载体中含有的药物抗性基因相应的试剂添加到培养基进行培养。例如，当所述载体含有卡那霉素抗性基因时，卡那霉素可以添加到培养基中。此外，除了碳、氮和无机盐的来源之外，适合的营养物来源可以添加到培养基中，并且任选地可以包括选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐和二硫苏糖醇组成的组的一种或更多种还原剂。此外，可以添加试剂，例如甘氨酸，其可以促进蛋白质从转化体分泌到培养液中。具体地，当宿主是大肠杆菌时，优选以培养基的2％(w/v)以下的量添加甘氨酸。当宿主是大肠杆菌时培养温度一般是10℃至40℃，优选20℃至37℃，更优选约25℃，但是可以取决于要表达的蛋白质的性质进行选择。当宿主是大肠杆菌时，培养基的pH值是pH6.8至pH 7.4，优选约pH 7.0。进一步地，当本发明的载体中含有诱导型启动子时，优选在能够使本发明的Fc结合性蛋白质良好表达的条件下进行诱导。诱导物的实例可以包括IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。当宿主是大肠杆菌时，测量培养液的浊度(600nm下的吸光度)，当浊度达到约0.5至1.0时，添加适当量的IPTG，继续培养以诱导Fc结合性蛋白质的表达。添加的IPTG的浓度可以适当地选自0.005至1.0mM的范围，但优选0.01至0.5mM的范围。IPTG诱导的各种条件可以是本领域公知的。
为了从培养本发明的转化体获得的培养物中回收本发明的Fc结合性蛋白质，可以通过使用适合于本发明转化体中的本发明Fc结合性蛋白质的表达形式的方法从培养物中分离/纯化来回收本发明的Fc结合性蛋白质。例如，当在培养上清液中表达时，通过离心操作分离细菌细胞，可以从所得培养上清液中纯化本发明的Fc结合性蛋白质。进一步地，当在细胞(包括周质)中表达时，通过离心操作收集细菌细胞，然后通过例如添加酶处理剂或表面活性剂，或使用超声波或弗氏细胞压碎器破坏细菌细胞，可以提取本发明的Fc结合性蛋白质然后纯化。对于本发明的Fc结合性蛋白质的纯化，可以使用本领域已知的方法。实例包括使用液相色谱的分离/纯化。液相色谱的实例包括离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。通过组合使用这类色谱来进行纯化操作，可以以高纯度制备本发明的Fc结合性蛋白质。
为了测量所得本发明的Fc结合性蛋白质对IgG的亲合力，例如，对IgG的亲合力可以通过使用酶联免疫吸附分析(以下称为ELISA)方法或表面等离子体共振方法来测量。作为用于测量亲合力的IgG，人IgG是优选的，人IgG1和人IgG3是特别优选的。
本发明的吸附剂可以通过将本发明的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体来生产。所述不溶性载体没有特别的限制，实例包括产自多糖例如琼脂糖、藻酸盐(海藻酸盐)、角叉菜胶、几丁质、纤维素、糊精、葡聚糖、淀粉的载体；产自合成聚合物例如聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚氨基甲酸酯的载体；以及产自陶瓷例如二氧化硅的载体。其中，产自多糖和合成的高分子的载体作为不溶性载体是优选的。优选的载体的实例包括具有导入其中的羟基的聚甲基丙烯酸酯凝胶，例如Toyopearl(由TosohCorporation制造)，琼脂糖凝胶例如Sepharose(由GE Healthcare制造)和纤维素凝胶例如Cellfine(由JNC制造)。不溶性载体的形状没有特别的限制，可以是粒状物或非粒状物、多孔性或非多孔性的任一者。
为了将Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体上，对不溶性载体赋予活性基团例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的酯基、环氧基、羧基、马来酰亚胺基、卤代乙酰基、三氟代乙烷磺酰基(Tresyl)、甲酰基、或卤代乙酰胺，人Fc结合性蛋白质可以共价地键合，因而通过活性基团固定化于不溶性载体。作为赋予了活性基团的载体，可以按照原样使用市售的载体。可选择地，活性基团可以在适当的反应条件下导入载体的表面，以制备赋予了活性基团的载体。市售的赋予了活性基团的载体的实例包括TOYOPEARL AF-Epoxy-650M、TOYOPEARLAF-Tresyl-650M(都由Tosoh Corporation制造)、HiTrap NHS-活化的HP Columns、NHS-活化的Sepharose 4Fast Flow、Epoxy-活化的Sepharose6B(都由GE Healthcare制造)、SulfoLink Coupling Resin(由ThermoFisher Scientific制造)。
另一方面，向载体的表面导入活性基团的方法的实例可以包括其中化合物拥有的两个以上的活性部位之一与所述载体表面上存在的羟基、环氧基、羧基或氨基等反应的方法。在示例性化合物中，向载体表面的羟基或氨基中导入环氧基的化合物示例为表氯醇、乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚、和己二醇二缩水甘油醚。在通过所述化合物向载体的表面导入环氧基之后，向载体的表面导入羧基的化合物的实例可以包括2-巯基乙酸、3-巯基丙酸、4-巯基丁酸、6-巯基丁酸、甘氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸和6-氨基己酸。
向载体的表面上存在的羟基、环氧基、羧基或氨基中导入马来酰亚胺基的化合物的实例包括，N-(ε-马来酰亚胺己酸)酰肼、N-(ε-马来酰亚胺丙酸)酰肼、4-(4-N-马来酰亚胺苯基)乙酸酰肼、2-氨基马来酰亚胺、3-氨基马来酰亚胺、4-氨基马来酰亚胺、6-氨基马来酰亚胺、1-(4-氨基苯基)马来酰亚胺、1-(3-氨基苯基)马来酰亚胺、4-(马来酰亚胺基)苯基异氰酸酯、2-马来酰亚胺乙酸、3-马来酰亚胺丙酸、4-马来酰亚胺丁酸、6-马来酰亚胺己酸、(N-[α-马来酰亚胺乙酰氧基])琥珀酰亚胺酯、(马来酰亚胺间苯甲酰)N-羟基琥珀酰亚胺酯、(琥珀酰亚胺基-4-[马来酰亚胺甲基])环己烷-1-羰基-[6-氨基己酸]、(琥珀酰亚胺基-4-[(马来酰亚胺甲基))环己烷-1-羧酸、(马来酰亚胺对苯甲酰)N-羟基琥珀酰亚胺酯、和(马来酰亚胺间苯甲酰)N-羟基琥珀酰亚胺酯。
向载体的表面上存在的羟基或氨基中导入卤代乙酰基的化合物的实例包括，氯乙酸、溴乙酸、碘乙酸、氯乙酸氯化物、溴乙酸氯化物、溴乙酸溴化物、氯乙酸酐、溴乙酸酐、碘乙酸酐、2-(碘乙酰胺)乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、3-(溴乙酰胺)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(碘乙酰基)氨基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。此外，可以提及其中载体的表面上存在的羟基或氨基与ω-烯基链烷缩水甘油醚反应、然后用卤化剂将ω-烯基部位卤化以活化的方法。ω-烯基链烷缩水甘油醚的实例包括烯丙基缩水甘油醚、3-丁烯基缩水甘油醚和4-戊烯基缩水甘油醚；卤化剂的实例包括N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺和N-碘代琥珀酰亚胺。
向载体的表面导入活性基团的方法的其他实例包括使用缩合剂和添加剂向载体的表面上存在的羧基导入活化基团的方法。缩合剂的实例可以包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和二环己基碳二酰胺、羰基二咪唑。添加剂的实例包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4-硝基苯酚和1-羟基苯并三唑。
用于将本发明的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体的缓冲液的实例包括乙酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、MES(2-吗啉乙烷磺酸)缓冲液、HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)缓冲液、Tris缓冲液和硼酸盐缓冲液。考虑活性基团的反应性和本发明的Fc结合性蛋白质的稳定性，从5℃至50℃的温度范围内适当地设置固定化的反应温度，优选为在10℃至35℃的范围内。
为了使用通过将本发明的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体获得的本发明的吸附剂分离抗体，例如，使用液体供应装置例如泵将含有抗体的缓冲液添加到填充有本发明的吸附剂的柱子上，使得缓冲液与本发明的吸附剂接触。从而，抗体特异性地吸附于本发明的吸附剂，然后向柱子添加适当的洗脱液来洗脱抗体。优选的是在含有抗体的缓冲液添加到柱子之前使用适当的缓冲液平衡柱子，这是因为可以分离具有更高纯度的抗体。缓冲液的实例包括含有无机盐作为成分的缓冲液，例如磷酸缓冲液。缓冲液的pH值是pH 3至10，优选pH 4至8，更优选pH 5至6。为了洗脱吸附于本发明吸附剂的抗体，具体地，通过例如用缓冲液改变pH值、对抗肽、温度的改变、以及盐浓度的改变，足够削弱抗体与配体(本发明的Fc结合性蛋白质)之间的相互作用。洗脱吸附到本发明吸附剂的抗体的洗脱液的具体实例包括，比用于将抗体吸附到本发明吸附剂的溶液更为酸性的缓冲液，以及具有约中性的pH值的缓冲液。缓冲液的类型的实例包括在酸性侧具有缓冲能力的那些，例如，柠檬酸盐缓冲液、甘氨酸-HCl缓冲液和乙酸盐缓冲液；以及在近中性的pH值下具有缓冲能力的那些，例如，磷酸缓冲液、HEPSE缓冲液和Tris-HCl缓冲液。可以设置缓冲液的pH值以不损害抗体的功能，优选pH 2.5至6.0，更优选pH 3.0至5.0，仍更优选pH 3.3至4.0，或对于近中性的pH值，优选pH 6.0至10.0，更优选pH 7.0至9.0，以及仍更优选pH 7.5至8.5。
在使用本发明的吸附剂从含有抗体的溶液分离抗体时，抗体的洗脱位置(洗脱级分)取决于例如抗体中含有的氨基酸序列的结构方面的差异而变化。因此，当使用本发明的吸附剂分离抗体时，可以区分抗体的结构方面的差异。可区分的结构没有特别的限制，举例来说，当使用作为宿主的衍生自动物的细胞如CHO细胞；或酵母例如毕赤氏酵母或酵母菌属酵母来表达抗体时，根据结构方面的差异，可以利用其用于分离。
先前描述了可以利用本发明的吸附剂区分抗体的结构差异。然而，即使在不同于FcRn的Fc受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb)用作用于吸附剂的Fc结合性蛋白质时，也可以类似地区分结构方面的差异。FcRn有助于血液中再循环抗体的机制，在抑制抗体的降解方面起到作用，并且对于对血液中的降解有抗性的抗体、也就是可以在血液中保持长时间有效的抗体具有高亲和性。因而，使用FcRn作为Fc受体分离抗体的方法适合长时间保持有效性的抗体的分析、分级和分离。
发明的效果
本发明的Fc结合性蛋白质是其中在人FcRnα链的细胞外区和/或人FcRnβ链的β2微球蛋白区的特定位置的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的蛋白质。与野生型人FcRn相比，本发明的Fc结合性蛋白质具有对于热和酸的增强的稳定性。当使用所述Fc结合性蛋白质作为亲和性配体进行抗体的分离时，所述Fc结合性蛋白质暴露于酸性洗脱液用于目标抗体的吸附/解吸和用于柱子的洗涤/再生。因而，酸稳定性增强可以确保长时间的稳定分离。此外，当工业地生产所述Fc结合性蛋白质时，含有编码所述Fc结合性蛋白质的碱基序列的表达载体转化到大肠杆菌中的生产方法是高效的，但是考虑到使用所述生产方法的培养和提取/纯化期间所述Fc结合性蛋白质的稳定性，希望的是抑制所述Fc结合性蛋白质的失活和变性。因而，由于耐热性增强，本发明的Fc结合性蛋白质可以应用于利用大肠杆菌的生产方法。因此，本发明的Fc结合性蛋白质作为吸附剂的配体来分离免疫球蛋白是有用的。
附图说明
图1是人FcRn的α-链的示意性结构图。图中的数字表示SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列编号。图中，S表示信号序列，EC表示细胞外区，TM表示跨膜区，C表示细胞内区。
图2是人FcRn的β-链的示意性结构图。图中的数字表示SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列编号。图中，S表示信号序列，B2M表示β2微球蛋白。
图3是说明人FcRn对实施例1中获得的转化体表达的人IgG的结合性质。
图4是说明使用实施例14中的Fc结合性蛋白质固定化分离树脂分离的单克隆抗体的分离模式的图。
具体实施方式
实施例
在下文中，将提供实施例来更详细地解释本发明，但是本发明不局限于所述实施例。
实施例1人FcRn表达载体的制备(大肠杆菌型密码子)
(1)基于SEQ ID NO：1中列出的人FcRn的α-链的氨基酸序列的第24位的丙氨酸到第297位的丝氨酸的氨基酸序列，以及由SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列组成的人FcRn的β-链的氨基酸序列的第21位的异亮氨酸到第119位的甲硫氨酸的氨基酸序列，使用DNAworks方法(Nucleic Acids Res.，30，e43，2002)将密码子从人型转化为大肠杆菌型，将编码GS接头的核苷酸序列插入到转化的核苷酸序列之间，设计SEQ ID NO：4中列出的核苷酸序列。
(2)人工合成由以下序列组成的多聚核苷酸，在所述序列中NcoI识别序列(CCATGG)添加到设计的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)的5'-末端侧，HindIII识别序列(AAGCTT)添加到3'-末端侧。
(3)在用限制酶NcoI和HindIII消化(2)中合成的多聚核苷酸之后，产物连接至预先用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开(Kokai)2011-206046号公报)，使用所得连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
(4)在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养所得转化体之后，使用QIAprepSpin Miniprep试剂盒(由Qiagen N.V.制造)提取作为野生型Fc结合性蛋白质的人FcRn的表达载体pET-eFcRn。
(5)对于(4)中制备的表达载体pET-eFcRn，基于链终止方法，使用Big DyeTerminator Cycle Sequencing FS read Reaction试剂盒(由ThermoFisher Scientific制造)，进行编码FcRn和其周围区域的多聚核苷酸的循环序列反应，使用全自动的DNA测序仪ABI Prism 3700DNA分析仪(由ThermoFisher Scientific制造)分析核苷酸序列。在该分析中，SEQ ID NO：8(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')或SEQ ID NO：9(5'-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3')用作测序引物。
分别地，表达载体pET-eFcRn表达的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：10，编码该多肽的多聚核苷酸的序列示于SEQ ID NO：11。在SEQ ID NO：10中，从第一位的甲硫氨酸(Met)到第26位的丙氨酸(Ala)的区域是MalE信号肽，从第27位的赖氨酸(Lys)到第33位的甘氨酸(Gly)的区域是接头序列，从第34位的异亮氨酸(Ile)到第132位的甲硫氨酸(Met)的区域是人FcRnβ链的β2微球蛋白区(SEQ ID NO：2中第21位到第119位的区域)，从第133位的甘氨酸(Gly)到第157位的丝氨酸(Ser)的区域是GS接头序列，从第158位的丙氨酸(Ala)到第431位的丝氨酸(Ser)的区域是人FcRnα链的细胞外区(SEQ ID NO：1中从第24位到第297位的区域)，从第432位到第437位的组氨酸(His)的区域是tag序列。
实施例2人FcRn的抗体结合活性的测量
(1)用实施例1获得的表达载体pET-eFcRn转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株接种在含有50μg/mL卡那霉素的4mL的2YT液体培养基(蛋白胨，16g/L；酵母提取物，10g/L；氯化钠，5g/L)中，随后在37℃下进行有氧振荡培养过夜以进行预培养。
(2)预培养的溶液(1)(150μL)接种在添加了50μg/mL卡那霉素的15mL2YT液体培养基中，在37℃下进行有氧振荡培养。
(3)开始培养之后150分钟，以0mM/0.1mM的浓度添加IPTG，在20℃下进行振荡培养4小时。
(4)培养完成之后，通过离心收集细菌细胞，使用超声发生器(由TOMY SEIKO CO.，LTD.制造)制备可溶级分中的蛋白质提取物。
(5)使用以下示出的ELISA方法测量(4)中制备的蛋白质提取物中含有的人FcRn的抗体亲合力。
(5-1)作为人抗体的γ球蛋白制品(由The Chemo-Sero-Therapeutic ResearchInstitute制造)以10μg/孔固定在96孔微量培养板的反应孔上(4℃18小时)。固定化完成之后，使用含有2％(w/v)脱脂乳(由Becton，Dickinson and Company制造)和150mM氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)进行封闭。
(5-2)用洗涤缓冲液(含有150mM氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH 6.0))洗涤之后，含有(4)中制备的人FcRn的溶液与固定化的γ球蛋白反应(30℃1小时)。
(5-3)反应完成之后，以100μL/孔添加抗-6His抗体(由Bethyl Laboratories，Inc.制造)，所述抗体已用洗涤缓冲液洗涤并用封闭溶液稀释到100ng/mL。
(5-4)在30℃反应1小时并用洗涤缓冲液洗涤之后，以50μL/孔添加TMB过氧化物酶底物(由Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.制造)。通过以50μL/孔添加1M磷酸来停止显色，用微量培养板读取器(由Tecan Trading AG制造)测量450nm下的吸光度。
图3中示出概述了在添加含有(4)中制备的人FcRn的溶液时与抗体亲合力相当的吸光度(450nm)的关系的图。在图3中，pETMalE是类似地培养并提取没有插入FcRn基因的质粒获得的(阴性对照)。由于与没有插入FcRn基因的情况相比插入了FcRn时的吸光度提高，认识到的是，人FcRn以活性状态表达。
实施例3向Fc结合性蛋白质中的突变导入以及文库的制备
通过易错PCR，向实施例1中制备的Fc结合性蛋白质表达载体pET-eFcRn的、编码Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸中随机导入突变。
(1)使用实施例1中制备的pET-eFcRn作为模板进行易错PCR。在制备具有表2中示出的组成的反应溶液之后，通过将该反应溶液进行95℃2分钟的热处理，随后进行35个循环的反应，每个循环包括95℃30秒的第一步骤、60℃30秒的第二步骤和72℃90秒的第三步骤，最后进行72℃7分钟的热处理，来进行易错PCR。通过易错PCR将突变很好地导入编码Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸中，平均突变导入率是0.2％。
[表2]
组成 浓度/体积
模板DNA(pET-eFcRn) 0.1ng/μL
10μM PCR引物(SEQ ID NO：8) 4μL
10μM PCR引物(SEQ ID NO：9) 4μL
25mM MgCl2 12μL
10mM dATP 2μL
10mM dGTP 2μL
10mM dCTP 12μL
10mM dTTP 8μL
10mM MnCl2 0.5μL
10xEx Taq缓冲液(由Takara Bio Inc.制造) 10μL
GoTaq聚合酶(由Promega Corporation制造) 1μL
H2O 至100μL
(2)在纯化(1)中获得的PCR产物之后，所得物用限制酶NcoI和HindIII消化，连接至预先用相同的限制酶消化的表达载体pETMalE(日本特开(Kokai)2011-206046号公报)中。
(3)完成连接反应之后，通过电穿孔方法将反应溶液导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板培养基中培养(37℃18小时)之后，平板上形成的菌落作为随机突变文库。
实施例4热稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
(1)实施例3中制备的随机突变文库(转化体)接种在含有50μg/mL卡那霉素的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L)(200μL)中，使用96孔深孔平板在30℃下进行振荡培养过夜。
(2)培养之后，5μL的培养液在含有0.05mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、0.3％(w/v)甘氨酸和50μg/mL卡那霉素的500μL 2YT液体培养基中继代培养，在20℃下使用96孔深孔平板进一步进行振荡培养过夜。
(3)培养之后，通过离心操作获得的培养上清液用含有150mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)稀释两次。稀释的溶液在40℃下热处理10分钟。
(4)通过实施例2(5)中描述的ELISA方法测量热处理(3)的Fc结合性蛋白质的抗体亲合力和没有热处理(3)的Fc结合性蛋白质的抗体亲合力，通过热处理的Fc结合性蛋白质的抗体亲合力除以没有热处理的Fc结合性蛋白质的抗体亲合力来计算残留活性。
(5)通过(4)的方法评估约2700株转化体，从中选择表达与野生型(没有氨基酸取代)Fc结合性蛋白质相比具有增强的热稳定性的Fc结合性蛋白质的转化体。培养选出的转化体，使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(由Qiagen N.V.制造)制备表达载体。
(6)编码插入到所获得的表达载体中的Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸区域的序列通过与实施例1(5)中描述的类似的方法进行核苷酸序列分析，鉴定氨基酸的突变位点。
(5)中选出的转化体所表达的Fc结合性蛋白质相对于野生型(没有氨基酸取代)Fc结合性蛋白质的氨基酸取代位置以及热处理之后的残留活性(％)在表3中概述和显示。在SEQ ID NO：3中列出的氨基酸序列中，产生了至少任一个以下氨基酸取代的Fc结合性蛋白质与野生型Fc结合性蛋白质相比具有增强的热稳定性：Phe24Ile(这一表述表示SEQ IDNO：3中第24位的苯丙氨酸被异亮氨酸取代，下同)、Phe24Tyr、Gly114Asp、Gly117Ser、Gly123Ser、Gly123Asp、Cys174Arg、Asn181Asp、Val183Asp、Lys199Glu、Asn228Asp、Asn275Asp、Phe283Tyr、Arg295Leu、Arg309Cys、Leu322His、Thr323Ala、Phe329Ser、Gln335Leu、Ser365Cys、Leu366Pro、Tyr376His、Leu385His、Leu389His。
在所述氨基酸取代中，Phe24Ile和Phe24Tyr的取代相应于SEQ ID NO：2中第42位氨基酸的取代，Cys174Arg的取代相应于SEQ ID NO：1中第71位氨基酸残基的取代，Asn181Asp的取代相应于SEQ ID NO：1中第78位氨基酸残基的取代，Val183Asp的取代相应于SEQ ID NO：1中第80位氨基酸残基的取代，Lys199Glu的取代相应于SEQ ID NO：1中第96位氨基酸残基的取代，Asn228Asp的取代相应于SEQ ID NO：1中第125位氨基酸残基的取代，Asn275Asp的取代相应于SEQ ID NO：1中第172位氨基酸残基的取代，Phe283Tyr的取代相应于SEQ ID NO：1中第180位氨基酸残基的取代，Arg295Leu的取代相应于SEQ ID NO：1中第192位氨基酸残基的取代，Arg309Cys的取代相应于SEQ ID NO：1中第206位氨基酸残基的取代，Leu322His的取代相应于SEQ ID NO：1中第219位氨基酸残基的取代，Thr323Ala的取代相应于SEQ ID NO：1中第220位氨基酸残基的取代，Phe329Ser的取代相应于SEQ ID NO：1中第226位氨基酸残基的取代，Gln335Leu的取代相应于SEQ ID NO：1中第232位氨基酸残基的取代，Ser365Cys的取代相应于SEQ ID NO：1中第262位氨基酸残基的取代，Leu366Pro的取代相应于SEQ ID NO：1中第263位氨基酸残基的取代，Tyr376His的取代相应于SEQ ID NO：1中第273位氨基酸残基的取代，Leu385His的取代相应于SEQ ID NO：1中第282位氨基酸残基的取代，Leu389His的取代相应于SEQ ID NO：1中第286位氨基酸残基的取代。
[表3]
在具有表3中示出的氨基酸取代的Fc结合性蛋白质中，产生了具有最高残留活性的Asn181Asp氨基酸取代的Fc结合性蛋白质被命名为FcRn_m1，含有编码FcRn_m1的多聚核苷酸的表达载体被命名为pET-FcRn_m1。FcRn_m1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：12，编码FcRn_m1的多聚核苷酸的序列示于SEQ ID NO：13中。
实施例5氨基酸取代的Fc结合性蛋白质的制备
预期通过累积在实施例4中发现的涉及Fc结合性蛋白质热稳定性增强的氨基酸取代来进一步增强稳定性。取代氨基酸的累积主要使用PCR来进行，制备以下(a)至(c)所示的三种类型的Fc结合性蛋白质：
(a)通过对FcRn_m1进一步进行Cys174Arg的氨基酸取代而获得的FcRn_m2
(b)通过对FcRn_m2进一步进行Arg295Leu的氨基酸取代而获得的FcRn_m3
(c)通过对FcRn_m3进一步进行Gln335Leu的氨基酸取代而获得的FcRn_m4。
以下，将详细阐述各Fc结合性蛋白质的制备方法。
(a)FcRn_m2
在实施例4中明确的涉及热稳定性增强的氨基酸取代中，选择Cys174Arg和Asn181Asp，在野生型Fc结合性蛋白质中累积它们的取代来产生FcRn_m2。具体地，通过向编码FcRn_m1的多聚核苷酸中导入产生Cys174Arg的突变来制备FcRn_m2。
(a-1)实施例4中获得的pET-FcRn_m1用作模板进行PCR。作为PCR中的引物，使用由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：14(5'-CACGCACCGCGTGGTTCTGC-3')中列出的序列组成的寡核苷酸。通过制备具有表4中示出的组成的反应溶液，随后进行98℃5分钟的热处理，接着进行30个循环的反应，每个循环包括98℃10秒的第一步骤、55℃5秒的第二步骤和72℃1分钟的第三步骤，最后进行72℃7分钟的热处理，来进行PCR。扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction试剂盒(由Qiagen N.V.制造)从凝胶中纯化产物。纯化的PCR产物称为m2F。
[表4]
组成 浓度/体积
模板DNA 2μL
10μM正向引物 1μL
10μM反向引物 1μL
5xPrimeSTAR缓冲液(由Takara Bio Inc.制造) 4μL
2.5mM dNTPs 2μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(由Takara Bio Inc.制造) 0.5μL
H2O 至20μL
(a-2)除了将实施例4中获得的pET-FcRn_m1用作模板，由SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：15(5'-GCAGAACCACGCGGTGCGTG-3')中列出的序列组成的寡核苷酸用作PCR引物以外，重复(a-1)中的操作。纯化的PCR产物称为m2R。
(a-3)混合(a-1)和(a-2)中获得的两种PCR产物(m2F，m2R)来制备具有表5中示出的组成的反应溶液。反应溶液在98℃下热处理5分钟，进行包括5个反应循环的PCR，每个循环包括98℃10秒的第一步骤、55℃5秒的第二步骤和72℃1分钟的第三步骤，来获得其中m2F和m2R连接的PCR产物m2p。
[表5]
组成 浓度/体积
PCR产物 各1μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(由Takara Bio Inc.制造) 0.5μL
5xPrimeSTAR缓冲液(由Takara Bio Inc.制造) 4μL
2.5mM dNTPs 2μL
H2O 至20μL
(a-4)使用(a-3)中获得的PCR产物m2p作为模板、由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中列出的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物进行PCR。通过制备具有表6中示出的组成的反应溶液，随后将该反应溶液进行98℃5分钟的热处理，接着进行30个循环的反应，每个循环包括98℃10秒的第一步骤、55℃5秒的第二步骤和72℃1分钟的第三步骤，来进行PCR。这样，制备了编码FcRn_m2的多聚核苷酸，其是FcRn_m1中导入了一个氨基酸取代。
[表6]
组成 浓度/体积
PCR产物 2μL
10μM正向引物 2μL
10μM反向引物 2μL
5xPrimeSTAR缓冲液(由Takara Bio Inc.制造) 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
2.5U/μL PrimeSTAR HS(由Takara Bio Inc.制造) 1μL
H2O 至50μL
(a-5)在纯化(a-4)中获得的多聚核苷酸之后，用限制酶NcoI和HindIII消化，连接至预先用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开(Kokai)2011-206046号公报)，用于转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
(a-6)所得转化体在添加有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养。从收集的细菌细胞(转化体)中提取质粒，获得含有编码FcRn_m2的多聚核苷酸的质粒pET-FcRn_m2，FcRn_m2是通过相对于野生型Fc结合性蛋白质提供两个氨基酸取代而获得的多肽。
(a-7)按照实施例1(5)中的相同方式进行pET-FcRn_m2的核苷酸序列分析。
所制备的FcRn_m2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：16，编码FcRn_m2的多聚核苷酸的序列示于SEQ ID NO：17。
(b)FcRn_m3
在实施例4中明确的涉及Fc结合性蛋白质的热稳定性增强的氨基酸取代中，选择Cys174Arg、Asn181Asp和Arg295Leu，产生FcRn_m3，其是通过在野生型Fc结合性蛋白质中累积它们的取代获得的。具体地，通过向编码FcRn_m2的多聚核苷酸中导入产生Arg295Leu的突变来制备FcRn_m3。
(b-1)除了将pET-FcRn_m2用作模板，由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：18(5'-CACGACCAAGTTCGAGATGTTC-3')中列出的序列组成的寡核苷酸用作引物以外，按照(a-1)中相同的方式获得PCR产物m3F。
(b-2)除了将pET-FcRn_m2用作模板，由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：19(5'-GAACATCTCGAACTTGGTCGTG-3')中列出的序列组成的寡核苷酸用作引物以外，按照(a-2)中相同的方式获得PCR产物m3R。
(b-3)在混合获自(b-1)和(b-2)的两种PCR产物(m3F，m3R)之后，按照(a-3)中相同的方式进行PCR来连接m3F和m3R。所得PCR产物称为m3p。
(b-4)使用(b-3)中获得的PCR产物m3p作为模板、由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中列出的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，按照(a-4)中相同的方式进行PCR。这样，制备了编码FcRn_m3的多聚核苷酸。
(b-5)在纯化(b-4)中获得的多聚核苷酸之后，用限制酶NcoI和HindIII消化，连接至预先用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开(Kokai)2011-206046号公报)，用于转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
(b-6)所得转化体在添加有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养。从收集的细菌细胞(转化体)提取质粒来获得含有编码FcRn_m3的多聚核苷酸的质粒pET-FcRn_m3，FcRn_m3是通过相对于野生型Fc结合性蛋白质提供三个氨基酸取代而获得的多肽。
(b-7)按照实施例1(5)中的相同方式进行pET-FcRn_m3的核苷酸序列分析。
所制备的FcRn_m3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：20，编码FcRn_m3的多聚核苷酸的序列示于SEQ ID NO：21。
(c)FcRn_m4
在实施例4中明确的涉及Fc结合性蛋白质稳定性增强的氨基酸取代中，选择Cys174Arg、Asn181Asp、Arg295Leu和Gln335Leu，在野生型Fc结合性蛋白质中累积它们的取代来产生FcRn_m4。具体地，通过向(b)中得到的编码FcRn_m3的多聚核苷酸中导入产生Gln335Leu的突变来制备FcRn_m4。
(c-1)使用(b)中获得的pET-FcRn_m3作为模板，由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：22(5'-GCGCAGCAGGAGTTCTGGAGG-3')中列出的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，按照(a-1)中相同的方式进行PCR。纯化的PCR产物称为m4F。
(c-2)除了将(b)中所得pET-FcRn_m3用作模板，由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：23(5'-CCTCCAGAACTCCTGCTGCGC-3')中列出的序列组成的寡核苷酸用作PCR引物以外，按照(a-2)中相同的方式进行PCR。纯化的PCR产物称为m4R。
(c-3)在混合(c-1)和(c-2)中获得的两个PCR产物(m4F，m4R)之后，按照(a-3)中相同的方式进行PCR来连接m4F和m4R。所得PCR产物称为m4p。
(c-4)使用(c-3)中获得的PCR产物m4p作为模板、由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中列出的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，按照(a-4)中相同的方式进行PCR。这样，制备了编码FcRn_m4的多聚核苷酸。
(c-5)在纯化(c-4)中获得的多聚核苷酸之后，用限制酶NcoI和HindIII消化，连接至预先用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开(Kokai)2011-206046号公报)，用于转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
(c-6)所得转化体在添加有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养。从收集的细菌细胞(转化体)提取质粒来获得含有编码FcRn_m4的多聚核苷酸的质粒pET-FcRn_m4，FcRn_m4是通过相对于野生型Fc结合性蛋白质提供四个氨基酸取代而获得的多肽。
(c-7)按照实施例1(5)中的相同方式进行pET-FcRn_m4的核苷酸序列分析。
所制备的FcRn_m4的氨基酸序列示于SEQ ID NO：5，编码FcRn_m4的多聚核苷酸的序列示于SEQ ID NO：24。
实施例6向FcRn_m4中的突变导入以及文库的制备
通过易错PCR向实施例5(c)中得到的编码FcRn_m4的多聚核苷酸部分中随机导入突变。
(1)使用实施例5(c)中制备的表达载体pET-FcRn_m4作为模板进行易错PCR。除了将pET-FcRn_m4用作模板以外制备具有表2中示出的组成的反应溶液，随后将该反应溶液进行95℃2分钟的热处理，接着进行35个循环的反应，每个循环包括95℃30秒的第一步骤、60℃30秒的第二步骤和72℃90秒的第三步骤，最后进行72℃7分钟的热处理，来进行易错PCR。该反应顺利地向编码Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸中导入了突变。
(2)在纯化(1)中获得的PCR产物之后，所得物用限制酶NcoI和HindIII消化，连接至预先用相同的限制酶消化的表达载体pETMalE(日本特开(Kokai)2011-206046号公报)中。
(3)在连接反应完成之后，通过电穿孔方法将反应溶液导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板培养基中培养，平板上形成的菌落作为随机突变文库。
实施例7热稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
(1)除了在45℃的条件下进行热处理10分钟以外，按照实施例4(1)至(5)中的相同方式筛选实施例6中制备的随机突变文库，由此获得编码具有增强的稳定性的Fc结合性蛋白质的表达载体。
(2)编码插入到所获得的表达载体中的Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸区域的序列通过实施例1(5)中描述的方法进行核苷酸序列分析，从而鉴定氨基酸的突变位点。
由(1)中选择的转化体表达的Fc结合性蛋白质相对于FcRn_m4的氨基酸取代的位置以及热处理之后的残留活性(％)在表7中概述和显示。在SEQ ID NO：3中列出的氨基酸序列中，在氨基酸残基中具有至少任一个以下氨基酸取代的Fc结合性蛋白质被认为具有相比FcRn_m4增强的热稳定性：Arg14His、Lys50Glu、Tyr69His、Gly107Asp、Gly125Asp、Ser126Asn、Asn165Thr、Gln182His、Lys206Glu、Ser230Pro、Gly254Asp、Lys276Glu、Gly296Asp、Asn299Asp、Leu336Pro、Gly358Ser、Ser364Pro、Lys369Glu、Lys369Arg、Ser370Pro和Lys398Glu。
在所述氨基酸取代中，Arg14His的取代相应于SEQ ID NO：2中第32位氨基酸残基的取代，Lys50Glu的取代相应于SEQ ID NO：2中第68位氨基酸残基的取代，Tyr69His的取代相应于SEQ ID NO：2中第87位氨基酸残基的取代，Asn165Thr的取代相应于SEQ ID NO：1中第62位氨基酸残基的取代，Gln182His的取代相应于SEQ ID NO：1中第79位氨基酸残基的取代，Lys206Glu的取代相应于SEQ ID NO：1中第103位氨基酸残基的取代，Ser230Pro的取代相应于SEQ ID NO：1中第127位氨基酸残基的取代，Gly254Asp的取代相应于SEQ ID NO：1中第151位氨基酸残基的取代，Lys276Glu的取代相应于SEQ ID NO：1中第173位氨基酸残基的取代，Gly296Asp的取代相应于SEQ ID NO：1中第193位氨基酸残基的取代，Asn299Asp的取代相应于SEQ ID NO：1中第196位氨基酸残基的取代，Leu336Pro的取代相应于SEQ ID NO：1中第233位氨基酸残基的取代，Gly358Ser的取代相应于SEQ ID NO：1中第255位氨基酸残基的取代，Ser364Pro的取代相应于SEQ ID NO：1中第261位氨基酸残基的取代，Lys369Glu和Lys369Arg的取代相应于SEQ ID NO：1中第266位氨基酸残基的取代，Ser370Pro的取代相应于SEQ ID NO：1中第267位氨基酸残基的取代，Lys398Glu的取代相应于SEQ ID NO：1中第295位氨基酸残基的取代。
[表7]
在由FcRn_m4通过表7中示出的氨基酸取代获得的Fc结合性蛋白质中，其中产生Gly254Asp氨基酸取代的Fc结合性蛋白质命名为FcRn_m5，含有编码FcRn_m5的多聚核苷酸的表达载体命名为pET-FcRn_m5。FcRn_m5的氨基酸序列示于SEQ ID NO：25，编码FcRn_m5的多聚核苷酸的序列示于SEQ ID NO：26。
实施例8改良Fc结合性蛋白质的制备
预期通过累积在实施例7中明确的涉及Fc结合性蛋白质热稳定性增强的氨基酸取代来进一步增强稳定性。主要使用PCR进行取代氨基酸的累积，产生以下(a)和(b)中示出的两种Fc结合性蛋白质：(a)FcRn_m6，其是通过对FcRn_m5进行额外氨基酸取代Asn299Asp而获得的；
(b)FcRn_m7，其是通过对FcRn_m6进行额外氨基酸取代Lys398Glu而获得的。
各Fc结合性蛋白质的制备方法将在下文中详细解释。
各改良Fc结合性蛋白质的制备方法将在下文中详细解释。
(a)FcRn_m6
在实施例7中明确的涉及热稳定性增强的氨基酸取代中，选择Gly254Asp和Asn299Asp，产生FcRn_m6，其中它们的取代在FcRn_m4(实施例5)中累积。具体地，通过向编码FcRn_m5的多聚核苷酸中导入产生Asn299Asp的突变来制备FcRn_m6。
(a-1)实施例7中获得的pET-FcRn_m5用作模板进行PCR。作为PCR中的引物，使用由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：27(5'-CCTTCCATTCGAGGTCACCACGACCAAGTT-3')中列出的序列组成的寡核苷酸。通过制备具有表5中示出的组成的反应溶液，随后进行98℃5分钟的热处理，接着进行30个循环的反应，每个循环包括98℃10秒的第一步骤、55℃5秒的第二步骤和72℃1分钟的第三步骤，最后进行72℃5分钟的热处理，来进行PCR。扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction试剂盒(由Qiagen N.V.制造)从凝胶中纯化产物。纯化的PCR产物称为m6F。
(a-2)除了将实施例7中获得的pET-FcRn_m5用作模板，由SEQ ID NO：28(5'-AACTTGGTCGTGGTGACCTCGAATGGAAGG-3')和SEQ ID NO：9中列出的序列组成的寡核苷酸用作PCR引物以外，重复(a-1)中的操作。纯化的PCR产物称为m6R。
(a-3)混合(a-1)和(a-2)中获得的两种PCR产物(m6F，m6R)来制备具有表6中示出的组成的反应溶液。进行PCR，包括反应溶液在98℃下进行热处理5分钟，随后进行5个循环的反应，每个循环包括98℃10秒的第一步骤、55℃5秒的第二步骤和72℃1分钟的第三步骤，来获得其中m6F和m6R连接的PCR产物m6p。
(a-4)使用(a-3)中获得的PCR产物m6p作为模板、由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9列出的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物进行PCR。通过制备具有表7中示出的组成的反应溶液，随后将反应溶液进行98℃5分钟的热处理，接着进行30个循环的反应，每个循环包括98℃10秒的第一步骤、55℃5秒的第二步骤和72℃1分钟的第三步骤，来进行PCR。这样，制备了编码FcRn_m6的多聚核苷酸，其是FcRn_m5中导入了一个氨基酸取代。
(a-5)(a-4)中获得的多聚核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化，连接至预先用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开(Kokai)2011-206046号公报)，连接产物用于转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
(a-6)所得转化体在添加有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养。从收集的细菌细胞(转化体)中提取质粒来获得含有编码FcRn_m6的多聚核苷酸的质粒pET-FcRn_m6，FcRn_m6是相比FcRn_m5具有一个氨基酸取代(相比野生型Fc结合性蛋白质六个氨基酸取代)的多肽。
(a-7)按照实施例1(5)中的相同方式进行pET-FcRn_m6的核苷酸序列分析。
所制备FcRn_m6的氨基酸序列示于SEQ ID NO：29，编码FcRn_m6的多聚核苷酸的序列示于SEQ ID NO：30。
(b)FcRn_m7
在实施例7中明确的涉及热稳定性增强的氨基酸取代中，选择Gly254Asp、Asn299Asp和Lys398Glu，产生FcRn_m7，其中它们的取代在FcRn_m4(实施例5)中累积。具体地，通过向编码FcRn_m6的多聚核苷酸中导入产生Lys398Glu的突变来制备FcRn_m7。
(b-1)按照(a-1)中相同的方式，使用(a)中制备的pET-FcRn_m6作为模板和由SEQID NO：8和SEQ ID NO：31(5'-ATGAGAAGATTCGGCAGGGGATT-3')中列出的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物进行PCR。纯化的PCR产物称为m7F。
(b-2)除了将(a)中制备的pET-FcR8用作模板，由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：32(5'-AATCCCCTGCCGAATCTTCTCAT-3')中列出的序列组成的寡核苷酸用作PCR引物，按照(a-1)中相同的方式进行PCR。纯化的PCR产物称为m7R。
(b-3)在混合获自(b-1)和(b-2)的两种PCR产物(m7F，m7R)之后，按照(a-3)中相同的方式进行PCR来连接m7F和m7R。所得PCR产物称为m7p。
(b-4)使用(b-3)中获得的PCR产物m7p作为模板、由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9中列出的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，按照(a-4)中相同的方式进行PCR。这样，产生编码FcRn_m7的多聚核苷酸。
(b-5)在纯化(b-4)中获得的多聚核苷酸之后，用限制酶NcoI和HindIII消化，连接至预先用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开(Kokai)2011-206046号公报)，用于转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
(b-6)所得转化体在添加有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养。从收集的细菌细胞(转化体)中提取质粒来获得含有编码FcRn_m7的多聚核苷酸的质粒pET-FcRn_m7，FcRn_m7是相比FcRn_m5具有两个氨基酸取代(相比野生型Fc结合性蛋白质七个氨基酸取代)的多肽。
(b-7)按照实施例1(5)中的相同方式进行pET-FcRn_m7的核苷酸序列分析。
所制备的FcRn_m7的氨基酸序列示于SEQ ID NO：6，编码FcRn_m7的多聚核苷酸的序列示于SEQ ID NO：33。
实施例9向FcRn_m7中的突变导入以及文库的制备
通过易错PCR向实施例8(b)中制备的编码FcRn_m7的多聚核苷酸部分中随机导入突变。
(1)使用实施例8(b)中制备的表达载体pET-FcRn_m7作为模板进行易错PCR。除了将pET-FcRn_m7用作模板以外制备具有表2中示出的组成的反应溶液，随后将反应溶液进行95℃2分钟的热处理，接着进行35个循环的反应，每个循环包括95℃30秒的第一步骤、60℃30秒的第二步骤和72℃90秒的第三步骤，最后进行72℃7分钟的热处理，来进行易错PCR。该反应顺利地向编码Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸中导入了突变。
(2)纯化(1)中获得的PCR产物，然后用限制酶NcoI和HindIII消化，连接至预先用相同的限制酶消化的表达载体pETMalE(日本特开(Kokai)2011-206046号公报)中。
(3)完成连接反应之后，通过电穿孔方法将反应溶液导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板培养基中培养，平板上形成的菌落作为随机突变文库。
实施例10热稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
(1)除了在52℃的条件下进行热处理30分钟以外，按照实施例4(1)至(5)中的相同方式筛选实施例9中制备的随机突变文库，获得编码具有改进的稳定性的Fc结合性蛋白质的表达载体。
(2)编码插入到所获得的表达载体中的Fc结合性蛋白质的多聚核苷酸区域的序列通过实施例1(5)中描述的方法进行核苷酸序列分析，从而鉴定氨基酸的突变位点。
由(1)中选择的转化体表达的Fc结合性蛋白质相对于FcRn_m7的氨基酸取代的位置以及热处理之后的残留活性(％)在表8中概述和显示。在SEQ ID NO：3中列出的氨基酸序列中，在氨基酸残基中具有至少任一个以下氨基酸取代的Fc结合性蛋白质被认为具有相比FcRn_m7增强的热稳定性：Val152Ala、Asn275Asp、Arg313Cys和Ser359Pro。
在所述氨基酸取代中，Val152Ala的取代相应于SEQ ID NO：1中第49位氨基酸残基的取代，Asn275Asp的取代相应于SEQ ID NO：1中第172位氨基酸残基的取代，Arg313Cys的取代相应于SEQ ID NO：1中第210位氨基酸残基的取代，Ser359Pro的取代相应于SEQ IDNO：1中第256位氨基酸残基的取代。
[表8]
氨基酸取代 残留活性(％)
Val152Ala 65.7
Asn275Asp 62.4
Arg313Cys 51.2
Ser359Pro 54.9
FcRn_m7 36.6
在由FcRn_m7通过表8中示出的氨基酸取代而获得的Fc结合性蛋白质中，其中产生Val152Ala氨基酸取代的Fc结合性蛋白质命名为FcRn_m8，含有编码FcRn_m8的多聚核苷酸的表达载体命名为pET-FcRn_m8。FcRn_m8的氨基酸序列示于SEQ ID NO：7，编码FcRn_m8的多聚核苷酸的序列示于SEQ ID NO：34。
实施例11 Fc结合性蛋白质对酸的稳定性的评估
(1)表达野生型FcRn(SEQ ID NO：3)、FcRn_m4(SEQ ID NO：5)、FcRn_m7(SEQ IDNO：6)和FcRn_m8(SEQ ID NO：7)的转化体接种在含有50μg/mL卡那霉素的3mL 2YT液体培养基中，在37℃下进行有氧振荡培养过夜以进行预培养。
(2)将200μL的预培养溶液接种在添加有50μg/mL卡那霉素的20mL 2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)中，在37℃下进行有氧振荡培养。
(3)开始培养之后一个半小时，将培养温度改变为20℃，进行振荡培养30分钟。此后，添加IPTG达0.01mM的终浓度，随后在20℃进行有氧振荡培养过夜。
(4)培养完成之后，通过离心收集细菌，使用BugBuster蛋白质提取试剂盒(由Takara Bio Inc.制造)制备蛋白质提取物。
(5)使用实施例2(5)中描述的ELISA测量(4)中制备的蛋白质提取物中的野生型FcRn、FcRn_m4、FcRn_m7和FcRn_m8的抗体亲合力。此时，使用市售的FcRn和β2微球蛋白的异二聚体(由Cosmo Bio Co.，Ltd.制造：CI01)建立标准曲线，并测量浓度。
(6)用纯水稀释各Fc结合性蛋白质，使其浓度变为30μg/mL，混合100μL的稀释溶液与200μL的0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH 3.0)，在30℃下静置15分钟。
(7)使用实施例2(5)中描述的ELISA测量用甘氨酸-HCl缓冲液(pH 3.0)酸处理之后蛋白质的抗体亲合力、以及没有酸处理的蛋白质的抗体亲合力。随后，将酸处理的抗体亲合力除以没有酸处理的抗体亲合力，从而计算残留活性。
结果在表9中示出。与野生型FcRn相比，当前评估的具有氨基酸取代的Fc结合性蛋白质(FcRn_m4、FcRn_m7和FcRn_m8)具有更高的残留活性。因而，确认了与野生型相比，该改良Fc结合性蛋白质的酸稳定性增强。
[表9]
实施例12添加了半胱氨酸标签的FcRn_m7(FcRn_m7Cys)的制备
(1)使用实施例8(b)中制备的表达载体pET-FcRn_m7作为模板进行PCR。作为PCR中的引物，使用由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：35(5'-CCCAAGCTTATCCGCAGGTATCGTTGCGGCACCCAGAAGATTCGGC AGGGGATTCGAGC-3')中列出的序列组成的寡核苷酸。通过制备具有表4中示出的组成的反应溶液，然后将该反应溶液进行98℃5分钟的热处理，接着进行30个循环的反应，每个循环包括98℃10秒的第一步骤、55℃5秒的第二步骤和72℃1分钟的第三步骤，来进行PCR。
(2)纯化(1)中获得的多聚核苷酸，在用限制酶NcoI和HindIII消化之后，连接至预先用限制酶NcoI和HindIII连接的表达载体pETMalE(日本特开(Kokai)2011-206046号公报)中，然后使用连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
(3)获得的转化体在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，然后使用QIAprepSpin Miniprep试剂盒(由Qiagen N.V.制造)提取表达载体pET-FcRn_m7Cys。
(4)按照实施例1(5)中相同的方式进行pET-FcRn_m7Cys的核苷酸序列分析。由表达载体pET-FcRn_m7Cys表达的多肽的氨基酸序列以及编码该多肽的多聚核苷酸的序列分别示于SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37。
实施例13 FcRn_m7Cys的制备
(1)实施例12中制备的表达FcRn_m7Cys的转化体接种在2L挡板烧瓶(baffleflask)中的含有50μg/mL卡那霉素的400mL 2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)中，通过在37℃下有氧振荡培养过夜进行预培养。
(2)向含有10g/L葡萄糖、20g/L酵母提取物、3g/L十二水磷酸三钠、9g/L十二水磷酸氢二钠、1g/L氯化铵和50mg/L硫酸卡那霉素的1.8L液体培养基中接种180mL(1)的培养液，使用3L发酵器(由Biott Corporation制造)进行主培养。在设置为：温度30℃；pH值6.9至7.1；通气量1VVM；溶解氧浓度30％饱和浓度的条件下开始主培养。使用50％(w/v)磷酸作为酸和14％(w/v)氨水作为碱控制pH值，通过改变搅拌速度控制溶解氧，搅拌旋转设置在500rpm的最小值至1000rpm的最大值。在开始培养之后，当无法测量葡萄糖浓度时，添加给料培养基(葡萄糖，248.9g/L；酵母提取物，83.3g/L；七水硫酸镁，7.2g/L)，同时控制溶解氧(DO)。
(3)作为细菌细胞数量的度量，当600nm下的吸光度(OD 600nm)达到约150时，将培养温度降低至25℃，在确认达到设定温度之后，添加IPTG达0.5mM的终浓度，随后在25℃下继续培养。
(4)开始培养之后四十八小时，停止培养，培养液在4℃、8000rpm下离心20分钟收集细菌细胞。
(5)收集的细菌细胞悬浮在20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中达到5mL/1g细菌细胞，使用超声发生器(Insonator 201M(商品名)，由KUBOTA Corporation Co.，Ltd.制造)在约150W的输出下破坏细菌细胞约10分钟。破坏的细菌细胞在4℃8000rpm下离心20分钟两次以收集上清液。
(6)(5)中获得的上清液施加到预先用含有150mM氯化钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)平衡的、填有90mL IgG Sepharose(由GE Healthcare制造)的XK26/20柱(由GEHealthcare制造)上。在使用用于平衡的缓冲液洗涤之后，用0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH3.0)洗脱所得物。对于洗脱液，以洗脱量的约1/4量添加1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)来将pH值恢复到约中性。
纯化提供了约10mg高纯度的FcRn_m7Cys。
实施例14 FcRn_m7Cys固定化凝胶的生产和抗体分离
(1)2mL分离树脂用亲水性乙烯基聚合物(由Tosoh Corporation制造：Toyopearl)的表面上的羟基用碘乙酰基活化，然后与实施例13中制备的4mg FcRn_m7Cys反应，获得FcRn_m7Cys固定化凝胶。
(2)(1)中制备的FcRn_m7Cys固定化凝胶填充到的不锈钢柱中。
(3)填充有FcRn_m7Cys固定化凝胶的柱子连接至HPLC装置，用含有150mM氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH 5.8)平衡。
(4)用含有150mM氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH 5.8)稀释到0.5mg/mL的单克隆抗体(利妥昔单抗：由Zenyaku Kogyo Company,Limited制造，Rituxan，曲妥珠单抗，和贝伐珠单抗)(0.01mL)以0.6mL/分钟的流速施加。
(5)用平衡缓冲液即含有150mM氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH 5.8)保持0.6mL/分钟的流速洗涤10分钟之后，用含有150mM氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)通过pH梯度洗脱来洗脱吸附的单克隆抗体(梯度为含有150mM氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)在30分钟内变为100％)。
结果(洗脱模式)如图4所示。由于与FcRn_m7相互作用的程度取决于抗体的类型而不同，各抗体的洗脱峰具有不同的形状。
虽然已经详细地和参考具体实施方式描述了本发明，对于本领域技术人员显而易见的是，可以进行各种改变和修饰而不背离本发明的精神和范围。
2017年4月26日提交的日本特开(Kokai)2017-086808号公报的说明书、序列表、权利要求、附图和摘要通过引用以它们的整体合并在本文中。

Claims (14)

1.一种Fc结合性蛋白质，其由SEQ ID NO：3中列出的氨基酸序列组成，且产生任一个以下突变：
SEQ ID NO：3中第174位的半胱氨酸被精氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：3中第181位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：3中第295位的精氨酸被亮氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：3中第335位的谷氨酰胺被亮氨酸取代的突变。
2.一种Fc结合性蛋白质，其由SEQ ID NO：5中列出的氨基酸序列组成，且产生任一个以下突变：
SEQ ID NO：5中第254位的甘氨酸被天冬氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：5中第299位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：5中第398位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变。
3.一种Fc结合性蛋白质，其由SEQ ID NO：6中列出的氨基酸序列组成，且产生任一个以下突变：
SEQ ID NO：6中第152位的缬氨酸被丙氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：6中第275位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：6中第313位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：6中第359位的丝氨酸被脯氨酸取代的突变。
4.根据权利要求1所述的Fc结合性蛋白质，其由SEQ ID NO：3中列出的氨基酸序列组成，且产生以下示出的四个突变：
SEQ ID NO：3中第174位的半胱氨酸被精氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：3中第181位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：3中第295位的精氨酸被亮氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：3中第335位的谷氨酰胺被亮氨酸取代的突变。
5.根据权利要求4所述的Fc结合性蛋白质，其还产生以下突变：
SEQ ID NO：3中第254位的甘氨酸被天冬氨酸取代的突变。
6.根据权利要求5所述的Fc结合性蛋白质，其还产生以下突变：
SEQ ID NO：3中第299位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：3中第398位的赖氨酸被谷氨酸取代的突变。
7.根据权利要求6所述的Fc结合性蛋白质，其还产生以下示出的任一个突变：
SEQ ID NO：3中第152位的缬氨酸被丙氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：3中第275位的天冬酰胺被天冬氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：3中第313位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变；
SEQ ID NO：3中第359位的丝氨酸被脯氨酸取代的突变。
8.一种多聚核苷酸，其编码根据权利要求1至7任一项所述的Fc结合性蛋白质。
9.一种表达载体，其含有根据权利要求8所述的多聚核苷酸。
10.一种转化体，其通过用根据权利要求9所述的表达载体转化宿主来获得。
11.根据权利要求10所述的转化体，其中所述宿主是大肠杆菌。
12.一种Fc结合性蛋白质的制造方法，其包括：
(A)通过培养根据权利要求10或11所述的转化体来表达Fc结合性蛋白质的步骤；和
(B)从培养物回收表达的Fc结合性蛋白质的步骤。
13.一种吸附剂，其通过将根据权利要求1至7任一项所述的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性载体来获得。
14.一种分离抗体的方法，其包括使根据权利要求13所述的吸附剂与含有所述抗体的溶液接触的步骤。
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