CN107592867A - 抗FcRn抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及对FcRn具有特异性的抗体融合蛋白、包含其的制剂、各自在治疗法中的用途、表达和任选配制所述抗体的方法、编码所述抗体的DNA，和包含所述DNA的宿主。

Description

抗FcRn抗体
本公开内容涉及对FcRn具有特异性的抗体、包含其的制剂、各自在治疗法中的用途、表达和任选配制所述抗体的方法、编码所述抗体的DNA和包含所述DNA的宿主。
FcRn是膜蛋白FcRnα链和β2微球蛋白(β2M)的非共价复合物。在成年哺乳动物中，FcRn通过用作结合和补救IgG同种型的抗体的受体在维持血清抗体水平中起关键作用。IgG分子由内皮细胞内吞，并且如果其结合至FcRn，则被再循环胞吞转运出去，进入例如循环系统。相比之下，不结合至FcRn的IgG分子进入细胞且被靶向至溶酶体途径，在那里被降解。其中His435突变成丙氨酸的变体IgG1引起FcRn结合的选择性损失和显著减少的血清半衰期(Firan等人，2001,International Immunology 13：993)。
假设FcRn是至少部分由自体抗体引起的某些自身免疫病症的潜在治疗靶标。某些这样的病症的当前治疗包括血浆去除术。有时采用血浆去除术联同免疫抑制疗法用于长期管控疾病。血浆更换提供对移除有害自体抗体的最快短期响应。然而，还期望例如通过使用药剂(例如普赖松(prednisone)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环孢素(cyclosporine)、麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)、利妥昔单抗(rituximab)或这样的混合物)阻抑免疫系统中自体抗体的产生。
可利用血浆去除术治疗的疾病的实例包括：格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)；慢性发炎性去髓鞘型多发性神经病变；古巴士德氏综合征(Goodpasture’ssyndrome)；高粘稠度综合征；冷凝球蛋白血症；副蛋白血症；华氏巨球蛋白血症( macroglobulinemia)；重症肌无力；血栓性血小板减少性紫癜(TTP)/溶血性尿毒综合征；韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)；朗-伊综合征(Lambert-Eaton Syndrome)；抗磷脂抗体综合征(APS或APLS)；显微镜下多血管炎；移植肾中的复发性病灶和节段性肾小球硬化；HELLP综合征；PANDAS综合征；雷夫苏姆病(Refsumdisease)；贝切特综合征(Behcet syndrome)；HIV相关神经病变；婴儿和新生儿中的格雷夫氏病(Graves’disease)；寻常天疱疮；多发性硬化、横纹肌溶解和同种免疫疾病。
血浆去除术有时用作移除含有Fc的治疗剂的补救治疗法，例如用于减少严重副作用的紧急情况中。
尽管血浆去除术有助于某些医学病况，但存在与治疗法相关的潜在风险和并发症。插入相当大的静脉内导管可导致出血、肺穿刺(取决于导管插入的位点)，并且如果导管留置过长，则其可导致静脉感染和/或损害，从而使重复程序机会有限。
该程序具有与其相关的其他并发症，例如在患者的血液在体外穿过血浆去除术仪器时，血液具有凝结的趋势。为降低此趋势，在一个常见方案中，在血液流经回路时，输注柠檬酸盐。柠檬酸盐结合至血液中的钙，钙对于血液凝结是必需的。柠檬酸盐在防止血液凝结中非常有效；然而，其使用可导致威胁生命的低钙水平。这可使用Chvostek体征或Trousseau体征检测。为预防此并发症，在患者经历血浆去除术的同时静脉内输注钙；另外，还可经口给予钙补充。
该程序的其他并发症包括：低血压；潜在暴露于血液产品(具有输血反应或输血传播性疾病的风险)，阻抑患者的免疫系统和从针位置的出血或血肿。
另外，提供血浆去除术的设备有限且程序非常昂贵。
血浆去除术的替代方案是静脉内免疫球蛋白(IVIG)，其是从1000个以上血液供体的血浆提取的含有汇集的多克隆IgG的血液产品。该治疗法通过静脉内施用且持续约2周至3个月。
IVIG治疗的并发症包括头痛、皮肤炎、来自治疗产品污染的病毒感染(例如HIV或肝炎)、肺水肿、过敏反应、急性肾衰竭、静脉血栓形成和无菌性脑膜炎。
因此，存在用于自身免疫病症的治疗法的显著未满足的需要，这样的治疗法侵袭性较小且将患者暴露于较少的医学并发症。
因此，存在用于免疫病症和/或自身免疫病症的治疗法的显著未满足的需要，这样的治疗法侵袭性较小且将患者暴露于较少的医学并发症。
因此，阻断或减少IgG与FcRn结合的药剂可用于治疗或预防这样的自身免疫和炎性疾病。抗FcRn抗体先前已描述于WO2009/131702、WO2007/087289、WO2006/118772、WO2014/019727和WO2014/204280中。
发明概述
本发明提供了包含直接或经由接头连接至scFv的Fab片段的抗FcRn抗体融合蛋白，其中Fab片段结合FcRn且scFv结合血清载体蛋白，例如白蛋白。在一个实例中，scFv是二硫键稳定的scFv(dsscFv)。
因此，在一个方面中，提供了包含直接或经由接头连接至scFv的Fab片段的抗FcRn抗体融合蛋白，其中Fab片段包含重链和轻链，其中重链的可变区包含3个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：1中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：2中给出的序列，且CDR H3具有SEQID NO：3中给出的序列，且轻链的可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：4中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中给出的序列且CDR L3具有SEQ ID NO：6中给出的序列。
具体而言，提供了抗FcRn抗体融合蛋白，其中scFv或dsscFv结合白蛋白且包括包含3个CDR的重链可变结构域，其中CDR H1具有SEQ ID NO：85中给出的序列，CDR H2具有SEQID NO：86中给出的序列，且CDR H3具有SEQ ID NO：87中给出的序列，和包含3个CDR的轻链可变结构域，其中CDR L1具有SEQ ID NO：88中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO：89或SEQID NO：7中给出的序列且CDR L3具有SEQ ID NO：90中给出的序列。
具体而言，提供了抗FcRn抗体融合蛋白，其中scFv是二硫键稳定的，所述融合蛋白包含具有SEQ ID NO：12中给出的序列的重链和具有SEQ ID NO：10中给出的序列的轻链。
本公开内容的抗体阻断IgG与FcRn的结合且认为可用于降低FcRn的一个或多个生物功能，包括降低循环抗体的半衰期。此有益之处可在于其容许患者更快速清除抗体，例如自体抗体。因此，本公开内容的抗体减少IgG与FcRn的结合。
重要的是，本发明抗体能够例如在pH6和pH7.4以可比较的和高的结合亲和力结合人FcRn。因此，有利地，甚至在内吞体内，抗体能够继续结合FcRn，由此最大化FcRn与IgG结合的阻断。
在一个实施方案中，本发明的抗体和结合片段阻断人IgG与人FcRn的结合。
在一个实施方案中，本发明的抗体和结合片段不结合β2微球蛋白。
在一个实施方案中，本发明的抗体和结合片段不结合人β2微球蛋白。
在一个实例中，本发明的抗体和结合片段将循环白蛋白水平减少不超过50％、优选不超过25％。
在一个实例中，本发明的抗体和结合片段不减少循环白蛋白水平。
本公开内容还扩展至编码如本文所述的抗体或片段的多核苷酸，例如DNA，例如所述DNA被并入载体中。
还提供了包含所述多核苷酸的宿主细胞。
本文中提供了表达抗体或片段的方法，还提供了使抗体或片段缀合至聚合物(例如PEG)的方法。
本发明还涉及包含这样的抗体和片段的药物组合物。
在一个实施方案中，提供了治疗方法，其包括施用治疗有效量的如本文所述的抗体、片段或组合物。
本发明还扩展至本发明的抗体、片段或组合物，其用于治疗，具体而言用于治疗免疫和/或自身免疫病症。
因此，本发明提供了抗体、其片段和移除病原性IgG的方法，其通过加速身体的用于分解代谢IgG的自然机制来实现。
本质上，本公开内容的抗体和片段阻断使IgG在体内再循环的系统。
本发明的治疗法可能提供了用于某些疾病(其中血浆去除术是对患者有利的治疗法或IVIg治疗法)的替代或补充。
附图说明
图1显示1735h5.hFab-scFv.768抑制MDCK II克隆7细胞中的IgG再循环。
图2显示1735h5.hFab-scFv.768对人FcRn-转基因小鼠的血清中的人IVIg的浓度的效应。
图3显示1735h5.hFab-scFv.768对人FcRn-转基因小鼠中的血清白蛋白的浓度的效应。
图4显示正常小鼠中的1735h5.hFab-scFv.768的药物动力学。
图5显示人FcRn-转基因小鼠中的1735h5.hFab-scFv.768的药物动力学。
图6显示1735h5.hFab-scFv.768(Fab-scFv)与母体Fab和等效Fab-Fv相比的热稳定性。
图7显示本发明的Fab-scFv和Fab-dsscFv片段形式。
图8本发明的抗体序列。
图9a抗体1638.g49的人源化。
图9b抗体1638.g49的人源化。
发明详述
如本文中所用的FcRn是指人IgG受体α链(还称作新生Fc受体，其氨基酸序列在UniProt中是在编号P55899下，其细胞外结构域提供于图8中(SEQ ID NO：21))以及人β2微球蛋白(β2M)(其氨基酸序列在UniProt中是在编号P61769下(在本文中提供了有信号肽(SEQ ID NO：23)、无信号肽(SEQ ID NO：24))的非共价复合物。
如本文中所用的抗体分子是指抗体或其结合片段，其包括抗体融合蛋白。
如本文中所用术语“抗体”通常是指完整(整个)抗体，即包含两个重链和两个轻链的元件。抗体可包含其他额外结合结构域，例如依照如WO 2007/024715中揭示的分子DVD-Ig、或WO2011/030107中所述的所谓(FabFv)2Fc。因此，如本文中所用的抗体包括二价、三价或四价全长抗体。
抗体的结合片段包括单链抗体(即全长重链和轻链)；Fab、经修饰Fab、Fab’、经修饰Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、单一结构域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、dsscFv、二价、三价或四价抗体、双-scFv、二体(diabody)、三体(tribody)、三链抗体(triabody)、四体(tetrabody)和上述任一个的表位结合片段(例如，参见Holliger和Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug DesignReviews-Online 2(3),209-217)。生成和制造这样的抗体片段的方法为本领域所熟知(例如，参见Verma等人，1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。Fab-Fv形式和其二硫键稳定的形式首先公开于WO2009/040562中，Fab-dsFv首先公开于WO2010/035012中。用于本发明中的其他抗体片段包括描述于国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中的Fab和Fab’片段。多价抗体可包含多重特异性(例如双特异性)或可为单特异性(例如，参见WO92/22583和WO05/113605)。后者的一个实例是如WO92/22583中所述的Tri-Fab(或TFM)。
抗体片段还包括Fab-scFv片段和Fab-dsscFv片段，例如如WO2013/068571的实施例4和本发明实施例中所述的和如本文图7中所图解说明的。这样的片段在本文中还称作“抗体融合蛋白”。
在一个实例中，本发明提供了抗FcRn抗体融合蛋白，其包含直接或经由接头连接至dsscFv的Fab片段，其中所述Fab片段结合FcRn并且所述dsscFv结合血清载体蛋白例如靶蛋白。因此，本发明的抗体融合蛋白对于FcRn是单价的。将认识到，Fab片段可以源自任何适当的抗-FcRn抗体分子，dsscFv可以源自任何适当的白蛋白结合性抗体分子。
因此，在一个方面中，提供了抗FcRn Fab-scFv或Fab-dsscFv抗体片段或抗体融合蛋白，其包含直接或经由接头连接至scFv的Fab片段，其中Fab片段包含重链和轻链，其中重链的可变区包含3个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：1中给出的序列，CDR H2具有SEQ IDNO：2中给出的序列，且CDR H3具有SEQ ID NO：3中给出的序列，且轻链的可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：4中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中给出的序列且CDR L3具有SEQ ID NO：6中给出的序列
用于本发明中的典型Fab分子包含重链和轻链对，其中重链包含可变区VH和恒定结构域CH1，其可以以链间半胱氨酸为末端，且轻链包含可变区VL和恒定结构域CL。
应理解，可对由本发明提供的CDR或其他序列(例如可变结构域)进行一个或多个(例如1、2、3或4个)氨基酸取代、添加和/或缺失，而并不显著改变抗体结合FcRn的能力。任何氨基酸取代、添加和/或缺失的效应可由本领域技术人员例如通过使用本文、具体而言实施例中所述的方法以测定FcRn结合/阻断来容易地测试。
在一个实例中，可对由本发明提供的抗体或片段中所用的框架区进行一个或多个(例如1、2、3或4个)氨基酸取代、添加和/或缺失且其中保持或增加对FcRn的结合亲和力。
抗体可变结构域中的残基通常根据由Kabat等人设计的系统编号。此系统描述于Kabat等人，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Departmentof Health and Human Services,NIH,USA(下文称为“Kabat等人(同上)”)。除非另有说明，本说明书中使用此编号系统。
Kabat残基名称并非总是直接对应于氨基酸残基的线性编号。实际线性氨基酸序列可含有比严格Kabat编号中更少或额外的氨基酸，其对应于基本可变结构域结构的结构组分(框架或互补决定区(CDR))的缩短或插入。可通过用“标准”Kabat编号的序列比对抗体序列中的同源残基来确定给定抗体的残基的正确Kabat编号。
根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)、残基50-65(CDR-H2)和残基95-102(CDR-H3)处。然而，根据Chothia(Chothia,C.and Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等效于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此，除非另有指示，否则如本文中所用的“CDR-H1”欲指残基26至35，如通过Kabat编号系统和Chothia的拓扑环定义的组合所述的。
根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)、残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)处。
本发明的抗体和片段阻断FcRn且由此可阻止其在IgG的再循环中起作用。如本文中所用的阻断是指物理阻断，例如堵塞受体，但还将包括抗体或片段结合的表位而引起例如构象变化(此意味着天然配体与受体不再结合)的情况。本发明的抗体分子结合FcRn且由此减少或防止(例如抑制)FcRn结合IgG恒定区。
在一个实施方案中，抗体或其片段相对于IgG竞争性结合FcRn。
在一个实例中，本发明的抗体融合蛋白用作结合人IgG的人FcRn的竞争性抑制剂。在一个实例中，抗体融合蛋白结合FcRn上的IgG结合位点。在一个实例中，抗体融合蛋白阻断IgG结合位点。在一个实例中，抗体融合蛋白不结合β2M。
用于本发明中的抗体可使用本领域熟知的任一合适方法来获得。FcRn多肽/蛋白质(包括融合蛋白)、(重组或天然)表达多肽的细胞(例如成纤维细胞)可单独或与β2M组合用于产生特异性识别FcRn的抗体。多肽可为“成熟”多肽或其生物活性片段或衍生物。人蛋白质于Swiss-Prot中登记于编号P55899下。人FcRnα链的细胞外结构域提供于SEQ ID NO：21中。成熟人β2M的序列提供于SEQ ID NO：24中。
在一个实施方案中，抗原是FcRn的突变体形式，其经改造以在细胞表面上呈现FcRn，使得存在较少的或没有其中FcRn被内化于细胞中的动态处理，例如这可通过在FcRnα链的胞质尾中进行突变来实现，其中二-亮氨酸被突变成二-丙氨酸，如Ober等人，2001Int.Immunol.13,1551-1559中所述。
用于对宿主进行免疫的多肽可通过本领域熟知的方法从经遗传改造的包含表达系统的宿主细胞来制备或其可从天然生物来源回收。在本申请中，术语“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。除非另外规定，否则这样的术语可互换使用。在一些情况下，FcRn多肽可为较大的蛋白质，例如融合至亲和力标签或相似物的融合蛋白。
可通过使用熟知的常规方案向动物(优选非人)动物施用多肽以获得针对FcRn多肽生成的抗体，其中动物的免疫是必需的，例如，参见Handbook of ExperimentalImmunology,D.M.Weir(编辑)，第4卷，Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986)。可对许多温血动物(例如兔、小鼠、大鼠、绵羊、牛、骆驼或猪)进行免疫。然而，小鼠、兔、猪和大鼠通常最合适。
单克隆抗体可通过本领域已知的任一方法来制备，例如杂交瘤技术(Kohler和Milstein,1975,Nature,256：495-497)、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983,Immunology Today,4：72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，第77-96页，Alan R Liss,Inc.,1985)。
用于本发明中的抗体还可使用单一淋巴细胞抗体方法通过克隆并表达从单一淋巴细胞生成的免疫球蛋白可变区cDNA来生成，这样的单一淋巴细胞通过例如以下中所述的方法针对特异性抗体的产生来选择：Babcook,J.等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15)：7843-78481；WO92/02551；WO2004/051268和国际专利申请WO2004/106377。
抗体的筛选可使用用于测量与人FcRn的结合的测定和/或用于测量阻断IgG结合受体的能力的测定来实施。结合测定的实例是ELISA，具体而言使用固定于板上的人FcRn和人Fc的融合蛋白并采用第二抗体来检测结合融合蛋白的抗FcRn抗体。下文描述了合适的拮抗和阻断测定的实例。
如本文中所用的特异性欲指仅识别其特异于的抗原的抗体或与非特异于的抗原的结合相比对其特异于的抗原具有显著较高的结合亲和力(例如至少5、6、7、8、9、10倍结合亲和力)的抗体。结合亲和力可通过诸如如下文所述的BIAcore等技术来测量。在一个实例中，本发明的抗体不结合β2微球蛋白(β2M)。在一个实例中，本发明的抗体结合食蟹猴FcRn。在一个实例中，本发明的抗体分子不结合大鼠或小鼠FcRn。
提供了本发明的某些抗体分子的氨基酸序列和多核苷酸序列且其构成本发明的方面。
在一个实施方案中，本发明的抗体或结合片段是完全人的，例如从噬菌体文库或相似物制得。
在一个实施方案中，本公开内容的抗体或片段经人源化。
人源化抗体(其包含CDR移植抗体)是具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的抗体分子(参见例如US 5,585,089；WO91/09967)。应理解，可仅需要转移CDR的特异性决定残基而非整个CDR(参见例如Kashmiri等人，2005,Methods,36,25-34)。人源化抗体可任选进一步包含一个或多个衍生自衍生CDR的非人物种的框架残基。后者通常称作供体残基。
因此，在一个实施方案中，如本文中所用的术语“人源化抗体分子”是指抗体分子，其中重链和/或轻链含有一个或多个来自供体抗体(例如非人抗体，例如鼠类单克隆抗体)的CDR(如果期望，包括一个或多个经修饰CDR)，这样的CDR移植至受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架中，所述可变区框架任选进一步包含一个或多个衍生自衍生这样的CDR的非人物种的框架残基(供体残基)。关于综述，参见Vaughan等人，NatureBiotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方案中，并不转移整个CDR，仅将来自上文所述CDR中的任一个的一个或多个特异性决定残基转移至人抗体框架(参见例如Kashmiri等人，2005,Methods,36,25-34)。在一个实施方案中，仅将上文所述CDR中的一或多者的特异性决定残基转移至人抗体框架。在另一实施方案中，仅将上文所述CDR中的每一个的特异性决定残基转移至人抗体框架。
在移植CDR或特异性决定残基时，考虑到衍生CDR的供体抗体的种类/类型，可使用任何适当的受体可变区框架序列，包括小鼠、灵长类动物和人框架区。
合适地，本发明的人源化抗体具有包含人受体框架区以及本文中特别提供的CDR中的一个或多个的可变结构域。因此，在一个实施方案中，提供了阻断人源化抗体，其结合人FcRn，其中可变结构域包含人受体框架区和非人供体CDR。
可用于本发明中的人框架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，同上)。举例而言，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链且EU、LAY和POM可用于重链和轻链二者。或者，可使用人种系序列；这样的序列可在http：//www.imgt.org/处获得。
在本发明的人源化抗体中，受体重链和轻链无需衍生自相同抗体，并且如果期望，可包含具有衍生自不同链的框架区的复合链。
本发明的人源化抗体的重链的一个这样的合适框架区衍生自人亚组VH3序列IGHV3-7以及JH3，在一个实例中，抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO：20中给出的序列。
本发明的人源化抗体的轻链的合适框架区衍生自人亚组VK1序列IGKV1-27序列以及JK4，在一个实例中，抗体分子的轻链可变结构域包含SEQ ID NO：19中给出的序列。
在本发明的人源化抗体中，框架区无需具有与受体抗体的序列精确相同的序列。举例而言，可将不常见的残基改变为该受体链种类或类型的更通常存在的残基。或者，可改变受体框架区中的选择残基，以使其对应于在供体抗体中的相同位置处发现的残基(参见Reichmann等人，1998,Nature,332,323-324)。这样的变化应保持至恢复供体抗体的亲和力所需的最小值。选择受体框架区中可能需要改变的残基的方案描述于WO91/09967。
因此，在一个实施方案中，框架中的1、2、3、4或5个残基被替代氨基酸残基置换。
因此，在一个实例中，提供了人源化抗体，其中至少重链的可变结构域的位置48和78中的每一个处的残基(Kabat编号)是供体残基，例如，参见SEQ ID NO：9中给出的序列。
在一个实施方案中，重链可变结构域的残基48被替代氨基酸(例如缬氨酸)置换。
在一个实施方案中，重链可变结构域的残基78被替代氨基酸(例如亮氨酸)置换。
在一个实施方案中，在本发明的人源化重链可变区中，残基48是缬氨酸且残基78是亮氨酸。
因此，在一个实例中，提供了人源化抗体，其中至少轻链的可变结构域的位置70和71中的每一个处的残基(Kabat编号)是供体残基，例如，参见SEQ ID NO：8中给出的序列。
在一个实施方案中，轻链可变结构域的残基70被替代氨基酸(例如天冬氨酸)置换。
在一个实施方案中，轻链可变结构域的残基71被替代氨基酸(例如苯丙氨酸)置换。
在一个实施方案中，在本发明的人源化轻链可变区中，残基70是天冬氨酸且残基71是苯丙氨酸。
在一个实施方案中，本公开内容提供了与本文公开的序列80％相似或同一、例如相对于相关序列(例如可变结构域序列、CDR序列或不包括CDR的可变结构域序列)的部分或全部85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％96％、97％、98％或99％相似或同一的抗体序列。在一个实施方案中，相关序列是SEQ ID NO：8或9。在一个实施方案中，相关序列是SEQID NO：10或12或14。
在一个实施方案中，本发明提供了结合包含重链的人FcRn的抗体分子，其中重链的可变结构域包含与本文中的序列(例如SEQ ID NO：9中给出的序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了结合包含轻链的人FcRn的抗体分子，其中轻链的可变结构域包含与SEQ ID NO：8中给出的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％96％、97％、98％或99％同一性或相似性的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了结合人FcRn的抗体分子，其中抗体具有与本文给出的序列(例如SEQ ID NO：9中给出的序列)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％96％、97％、98％或99％相似或同一的重链可变结构域，但其中抗体分子对于CDR-H1具有SEQ IDNO：1中给出的序列、对于CDR-H2具有SEQ ID NO：2中给出的序列和对于CDR-H3具有SEQ IDNO：3中给出的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了结合人FcRn的抗体分子，其中抗体具有与本文给出的序列(例如SEQ ID NO：8中的序列)至少90％,91％,92％,93％,94％,95％96％,97％,98％或99％相似或同一的轻链可变结构域，但其中抗体分子具有对于CDR-L1的SEQID NO：4中给出的序列、对于CDR-L2的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中给出的序列和对于CDR-L3的SEQ ID NO：6中给出的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了结合人FcRn的抗体分子，其中抗体具有与本文给出的序列(例如SEQ ID NO：12中给出的序列)至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％96％、97％、98％或99％相似或同一的重链和与本文给出的序列(例如SEQ IDNO：10中给出的序列)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％96％、97％、98％或99％相似或同一的轻链。
在一个实施方案中，本发明提供了结合人FcRn的抗体分子，其中抗体具有与本文给出的序列(例如SEQ ID NO：12中给出的序列)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％96％、97％、98％或99％相似或同一的重链和与本文给出的序列(例如SEQ ID NO：10中给出的序列)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％96％、97％、98％或99％相似或同一的轻链，但其中抗体分子的Fab部分对于CDR-H1具有SEQ ID NO：1中给出的序列、对于CDR-H2具有SEQ ID NO：2中给出的序列、对于CDR-H3具有SEQ ID NO：3中给出的序列、对于CDR-L1具有SEQ ID NO：4中给出的序列、对于CDR-L2具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中给出的序列和对于CDR-L3具有SEQ ID NO：6中给出的序列。
在一个实施方式中，本发明提供了结合人FcRn的抗体分子，其中所述抗体具有重链和轻链，所述重链与序列例如SEQ ID NO:12中所示的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似或同一，所述轻链与序列例如SEQ ID NO:10中所示的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似或同一，抗体分子的dsscFv部分具有SEQ ID NO:85所示的CDR-H1，SEQ ID NO:86所示的CDR-H2，SEQ IDNO:87所示的CDR-H3，SEQ ID NO:88所示的CDR-L1，SEQ ID NO:89所示的CDR-L2，和SEQ IDNO:90所示的CDR-L3。
在一个实施方式中，本发明提供了结合人FcRn的抗体分子，其中所述抗体具有重链和轻链，所述重链与序列例如SEQ ID NO:12中所示的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似或同一，所述轻链与序列例如SEQ ID NO:10中所示的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似或同一，抗体分子的Fab部分具有SEQ ID NO:1所示的CDR-H1，SEQ ID NO:2所示的CDR-H2，SEQ ID NO:3所示的CDR-H3，SEQ ID NO:4所示的CDR-L1，SEQ ID NO:5或7所示的CDR-L2，和SEQ ID NO:6所示的CDR-L3，并且抗体分子的dsscFv部分具有SEQ ID NO:85所示的CDR-H1，SEQ ID NO:86所示的CDR-H2，SEQ ID NO:87所示的CDR-H3，SEQ ID NO:88所示的CDR-L1，SEQ ID NO:89所示的CDR-L2，和SEQ ID NO:90所示的CDR-L3。
如本文中所用的“同一性”指示在比对序列中的任何特定位置处，氨基酸残基在序列之间相同。如本文中所用的“相似性”指示在比对序列中的任何特定位置处，氨基酸残基在序列之属于相似类型。举例而言，可用亮氨酸取代异亮氨酸或缬氨酸。经常可彼此取代的氨基酸包括(但不限于)：
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸盐和谷氨酸盐(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。同一性和相似性程度可容易地计算(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编辑，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data，第1部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysisin Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987,Sequence AnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑，M Stockton Press,New York,1991，可自NCBI获得的BLASTTM软件(Altschul,S.F.等人，1990,J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.和States,D.J.1993,Nature Genet.3：266-272.Madden,T.L.等人，1996,Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，1997,Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.和Madden,T.L.1997,Genome Res.7：649-656)。
应理解，本发明的抗体融合蛋白的Fab-片段组分可从任何合适抗FcRn抗体或抗体片段衍生或构建。
在一个实例中，本发明的抗体分子包括包含SEQ ID NO：26和28(例如分别对于轻链和重链)中所示的序列的抗体Fab片段。
在一个实例中，本发明的抗体分子包括包含SEQ ID NO：92和94(例如分别对于轻链和重链)中所示的序列的抗体Fab片段。
在一个实例中，本发明的抗体分子包括包含的SEQ ID NO：10和14(例如分别对于轻链和重链)中所示的序列的抗体Fab片段。在一个实施方案中，分子的抗体Fab片段部分具有包含SEQ ID NO：10中给出的序列的轻链和包含SEQ ID NO：14中给出的序列的重链。
本发明的Fab片段直接或经由接头连接至scFv。在一个实例中，scFv是二硫键稳定的。通常，scFv是二硫键稳定的。Fab片段的键联可为化学缀合，但最优选是翻译融合，即其中每一序列由表达载体依序编码的遗传融合。接头因此通常是如本文所述的氨基酸接头。
通常，scFv或dsscFv结合血清载体蛋白以延长抗体融合蛋白的体内半衰期。以此方式延长半衰期不依赖于FcRn结合且可为有利的。
如本文中所用的“血清载体蛋白”是指scFv可结合的任何合适血浆载体蛋白，在一个实例中，血清载体蛋白选自甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白、α1-酸糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白或其任何的片段。
通常，scFv或dsscFv结合白蛋白、优选人血清白蛋白。
结合scFv或dsscFv的任何合适白蛋白可并入本发明的抗体融合蛋白中。本领域先前已描述合适的白蛋白结合结构域。
如本文中所用的“单链可变片段”或“scFv”是指在VH与VL可变结构域之间由肽接头稳定的单链可变片段。
如本文中所用的“二硫键稳定的单链可变片段”或“dsscFv”是指在VH与VL可变结构域之间由肽接头稳定且在VH与VL之间还包括结构域间二硫键的单链可变片段。
在一个实施方案中，dsscFv的可变结构域VH与VL之间的二硫键介于下文所列举的残基中的两者之间(除非上下文另有指示，否则下文列表中采用Kabat编号)。只要提及Kabat编号，相关参考文献为Kabat等人，1987,in Sequences of Proteins ofImmunological Interest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA。
在一个实施方案中，二硫键是在选自包含以下的位置中：
·VH37+VL95C，例如参见Protein Science 6,781-788 Zhu等人(1997)；
·VH44+VL100，例如参见Biochemistry 33 5451-5459 Reiter等人(1994)；或Journal of Biological Chemistry，第269卷，第28期，第18327-18331页，Reiter等人(1994)；或Protein Engineering，第10卷，第12期，第1453-1459页，Rajagopal等人(1997)；
·VH44+VL105，例如参见J Biochem.118,825-831 Luo等人(1995)；
·VH45+VL87，例如参见Protein Science 6,781-788 Zhu等人(1997)；
·VH55+VL101，例如参见FEBS Letters 377 135-139 Young等人(1995)；
·VH100+VL50，例如参见Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber等人(1990)；
·VH100b+VL49；
·VH98+VL 46，例如参见Protein Science 6,781-788 Zhu等人(1997)；
·VH101+VL46；
·VH105+VL43，例如参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷，第7538-7542页，Brinkmann等人(1993)；或Proteins 19,35-47 Jung等人(1994)，
·VH106+VL57，例如参见FEBS Letters 377 135-139 Young等人(1995)
和在位于分子中的可变区对中与其对应的一个或多个位置。
在一个实施方案中，在位置VH44与VL100之间形成二硫键。
上文列举的氨基酸对处于有助于被半胱氨酸置换的位置中，使得可形成二硫键。可通过已知技术将半胱氨酸改造至这样的期望位置中。因此，在一个实施方案中，本公开内容的经改造的半胱氨酸是指给定氨基酸位置处的天然存在残基已被半胱氨酸残基置换。
经改造的半胱氨酸的引入可使用本领域已知的任一方法来实施。这样的方法包括(但不限于)PCR延伸重叠诱变、定点诱变或盒诱变(通常参见Sambrook等人，MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold SpringHarbour,NY,1989；Ausbel等人，Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing&Wiley-Interscience,NY,1993)。定点诱变试剂盒是市售可得的，例如定点诱变试剂盒(Stratagen,La Jolla,CA)。盒诱变可基于Wells等人，1985,Gene,34：315-323来实施。或者，可通过退火、连接和PCR扩增和重叠寡核苷酸的克隆进行总基因合成来制得突变体。
因此，在一个实施方案中，dsscFv的可变结构域VH和VL可通过两个半胱氨酸残基之间的二硫键连接，其中半胱氨酸残基对的位置选自包含以下或由以下组成的组：VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH100b和VL49、VH98和VL46、VH101和VL46、VH105和VL43和VH106和VL57。
在一个实施方案中，dsscFv的可变结构域VH和VL可通过两个半胱氨酸残基之间的二硫键连接，一个残基在VH中且一个在VL中，其在CDR外部，例如其中半胱氨酸残基对的位置选自由以下组成的组：VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH98和VL46、VH105和VL43和VH106和VL57。
在一个实施方案中，dsscFv的可变结构域VH和VL通过两个经改造的半胱氨酸残基之间的二硫键连接，一个残基在位置VH44处且另一个在VL100处。
在一个实施方案中，dsscFv的可变结构域VH和VL通过两个经改造的半胱氨酸残基之间的二硫键连接，一个残基在位置VH44处且另一个在VL100处。
在一个实例中，scFv或dsscFv包含重链可变结构域和轻链可变结构域，重链可变结构域包含3个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：85中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：86中给出的序列，且CDR H3具有SEQ ID NO：87中给出的序列，且轻链可变结构域包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：88中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO：89中给出的序列且CDR L3具有SEQ ID NO：90中给出的序列。
在一个实例中，本发明的dsscFv的VH结构域具有SEQ ID NO：15中给出的序列且本发明的dsscFv的VL结构域具有SEQ ID NO：16中给出的序列。
本发明的scFv和dsscFv中的VH和VL经由合适的接头通常以重-轻(HL)定向彼此连接，其实例提供于下文中。在本发明的抗体融合蛋白中，scFv或dsscFv直接或经由接头连接至Fab片段的C-端。
在一个实施方案中，dsscFv的重链可变结构域附接至Fab片段的重链的C端或dsscFv的轻链可变结构域附接至Fab片段的重链的C端。
在一个实施方案中，dsscFv的重链可变结构域附接至Fab片段的轻链的C端或dsscFv的轻链可变结构域附接至Fab片段的轻链的C-端。
在一个实施方案中，dsscFv的VH结构域经由接头附接至Fab片段的CH1的C-端。在一个实施方案中，dsscFv的VH结构域附接至CL的C-端。
在一个实施方案中，接头是任何合适的接头，例如将CH1或CL的C-末端部分连接至dsscFv的VH的合适肽。
在一个实施方案中，用于本发明中的肽接头的长度为50个氨基酸或更少，例如20个氨基酸或更少，例如19、10、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。
在一个实施方案中，接头基于G4S的重复单元(即GGGGS SEQ ID NO：29)，例如其1、2、3、4或5个单元，例如GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：30)或SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：31)。在一个实施方案中，本发明构建体中采用的接头具有序列SGGGGSGGGGTGGGGS(SEQ ID NO：32)。另外，这样的接头可用于连接scFv或dsscFv的VH和VL。在一个实施方案中，接头选自本文所示的序列。在一个实施方案中，VH和VL由具有SEQ IDNO：30中给出的序列的接头连接。在一个实施方案中，Fab的CH1的C-端与dsscFv的VH的N-端之间的接头具有序列SGGGGTGGGGS(SEQ ID NO：33)。
表1.铰链接头序列
表2.柔性接头序列
(S)在序列45至49中是任选的。
刚性接头的实例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO：83)、PPPP(SEQ ID NO：84)和PPP。
在一个实施方案中，本发明的Fab-dsscFv片段或融合蛋白包括包含SEQ ID NO：12中给出的序列或由其组成的重链和包含SEQ ID NO：10中给出的序列或由其组成的轻链。
CA170_01638g49和1638.g49在本文中互换使用且用于指抗体可变区的具体对，其可以以多种不同形式使用。这样的可变区是SEQ ID NO：9中给出的重链序列gH33和SEQ IDNO：8中给出的轻链序列gL7。
CA170_01638g28和1638.g28在本文中互换使用且用于指抗体可变区的具体对，其可以以多种不同形式使用。这样的可变区是SEQ ID NO：27中给出的重链序列和SEQ ID NO：25中给出的轻链序列。
在一个实施方案中，抗体Fab重链包含CH1结构域且抗体轻链包含CL结构域，κ或λ。
在一个实施方案中，Fab组分的轻链具有SEQ ID NO：10中给出的序列且Fab组分的重链具有SEQ ID NO：14中给出的序列。
在一个实施方案中，Fab组分的轻链具有SEQ ID NO：26中给出的序列且Fab组分的重链具有SEQ ID NO：28中给出的序列。
在一个实施方案中，Fab组分的轻链具有SEQ ID NO：92中给出的序列且Fab组分的重链具有SEQ ID NO：94中给出的序列。
生物分子(例如抗体或片段)含有酸性和/或碱性官能团，由此给予分子净正电荷或负电荷。整体“观察到”的电荷的量将取决于实体的绝对氨基酸序列、3D结构中带电基团的局部环境和分子的环境条件。等电点(pI)是特定分子或其溶剂可及表面不携带净电荷的pH。在一个实例中，本发明的FcRn抗体和片段可经改造以具有适当等电点。此可产生具有更稳健性质(特别是合适溶解性和/或稳定性性质和/或改良的纯化特性)的抗体和/或片段。
因此，在一个方面中，本发明提供了经改造以具有不同于初始鉴别抗体的等电点的人源化FcRn抗体。所述抗体可例如通过置换氨基酸残基(例如用一个或多个碱性氨基酸残基置换酸性氨基酸残基)来改造。或者，可引入碱性氨基酸残基或可移除酸性氨基酸残基。或者，如果分子具有不可接受的高pI值，则如果需要，可引入酸性残基以降低pI。重要的是在操纵pI时，必须小心以保留抗体或片段的期望活性。因此，在一个实施方案中，经改造的抗体或片段具有与“未经修饰”抗体或片段相同或实质上相同的活性。
可使用程序，诸如**ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html和http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html，以预测抗体或片段的等电点。或者或另外地，可使用任何合适标准实验室技术测量pI。
本发明的抗体分子合适地具有高结合亲和力，特别是在纳摩尔范围内。亲和力可使用本领域已知的任何合适方法(包括BIAcore，如本文实施例中所述)使用分离的天然或重组FcRn或合适融合蛋白/多肽来测量。在一个实例中，亲和力使用如本文实施例中所述的重组人FcRn细胞外结构域(SEQ ID NO：21)测量。在一个实例中，亲和力使用重组人FcRnα链细胞外结构域(SEQ ID NO：21)联合人β2微球蛋白(β2M)(SEQ ID NO：24)来测量。合适地，本发明的抗体分子对于分离的人FcRn具有约1nM或更低的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约500pM或更低的结合亲和力(即较高亲和力)。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约250pM或更低的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约200pM或更低的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约160pM或更低的结合亲和力。
在一个实施方案中，本发明的抗体分子能够于pH6或更低pH(特别是pH 6)和pH7.4或更高pH(特别是pH7.4)以可比较的结合亲和力结合人FcRn。因此，有利地，甚至在内吞体内，抗体能继续结合FcRn，由此最大化FcRn与IgG结合的阻断。
在一个实施方案中，本发明的抗体分子能够以在pH6和pH7.4测量时200pM或更低或160pM或更低的结合亲和力结合人FcRn。在一个实施方案中，本发明的抗体能够以在pH6和pH7.4测量时130pM或更低的结合亲和力结合人FcRn。在一个实施方案中，本发明的抗体能够以在pH6测量时160pM或更低的结合亲和力和在pH7.4测量时50pM或更低的结合亲和力结合人FcRn。
本发明的抗体或结合片段的亲和力、以及结合试剂(例如抗体)抑制结合的程度可由本领域技术人员使用常规技术(例如由Scatchard等人(Ann.KY.Acad.Sci.51：660-672(1949))所述的那些)或通过表面等离子体共振(SPR)使用诸如BIAcore的系统来测定。对于表面等离子体共振，将靶分子固定于固相上并暴露于在沿流动池运行的移动相中的配体。如果发生配体结合至固定的靶标，则局部折射率改变，从而引起SPR角改变，此可通过检测反射光的强度变化实时监测。可分析SPR信号的变化速率以产生结合反应的缔合和解离相的表观速率常数。这样的值的比率产生表观平衡常数(亲和力)(例如，参见Wolff等人，Cancer Res.53：2560-65(1993))。
在本发明中，通常如下使用SPR测定测试抗体分子的亲和力。将测试抗体分子捕获于固相上，并使与人β2M非共价复合的人FcRnα链细胞外结构域流经移动相中的捕获的抗体并测定测试抗体分子对人FcRn的亲和力。可使用任何适当方法(例如使用抗Fc或抗Fab’特异性捕获试剂)将测试抗体分子捕获于固相芯片表面上。在一个实例中，亲和力在pH6下测定。在一个实例中，亲和力在pH7.4下测定。
应理解，可使用本领域已知的任何合适方法改变由本发明提供的抗体的亲和力。因此，本发明还涉及本发明抗体分子的变体，其具有改良的针对FcRn的亲和力。这样的变体可通过多种亲和力成熟方案(包括使CDR突变(Yang等人，J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、链改组(Marks等人，Bio/Technology,10,779-783,1992)、使用大肠杆菌(E.coli)的突变菌株(Low等人，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改组(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等人，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等人，Nature,391,288-291,1998)来获得。Vaughan等人(同上)讨论了亲和力成熟的这样的方法。
在一个实施方案中，本发明的抗体分子阻断人FcRn活性。适于测定抗体阻断FcRn的能力的测定描述于本文实施例中。下文描述了用于测定抗体分子体外阻断IgG再循环的能力的合适测定。
如果期望，用于本发明中的抗体分子可缀合至一个或多个效应物分子。应理解，效应物分子可包含单一效应物分子或两个或更多个如此连接以形成可附接至本发明抗体的单一部分的这样的分子。如果期望获得连接至效应物分子的抗体片段，则此可通过标准化学或重组DNA程序来制备，其中抗体片段直接或经由偶合试剂连接至效应物分子。用于将这样的将效应物分子缀合至抗体的技术已为本领域所熟知(参见Hellstrom等人，ControlledDrug Delivery，第2版，Robinson等人编辑，1987，第623-53页；Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.,62：119-58和Dubowchik等人，1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。特定化学程序包括例如描述于WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476和WO 03/031581中的那些。或者，如果效应物分子是蛋白质或多肽，则可使用重组DNA程序(例如如WO 86/01533和EP0392745中所述的)获得连接。
如本文中所用的术语效应物分子包括例如抗瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白质(例如酶)、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸和其片段(例如DNA、RNA和其片段)、放射性核素(特别是放射性碘化物)、放射性同位素、螯合金属、纳米粒子和报告基团(例如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱检测的化合物)。
效应物分子的实例可包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何试剂。实例包括考布他汀(combrestatin)、多拉司他汀(dolastatin)、埃博霉素(epothilone)、星形孢菌素(staurosporin)、类美登素(maytansinoid)、海绵抑制素(spongistatin)、利索新(rhizoxin)、软海绵素(halichondrins)、根霉素(roridins)、哈米特林(hemiasterlins)、紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌素D(gramicidin D)、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睪固酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、和嘌呤霉素(puromycin)和其类似物或同系物。
效应物分子还包括(但不限于)抗代谢物(例如氨甲喋呤(methotrexate)、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(decarbazine))、烷基化剂(例如甲基二氯乙基胺、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链佐霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如道诺霉素(daunorubicin)(先前称作道诺霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素(dactinomycin)(先前称作放线菌素actinomycin)、博来霉素、光辉霉素、安曲霉素(anthramycin)(AMC)、卡奇霉素(calicheamicin)或多卡米星(duocarmycin))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
其他效应物分子可包括螯合放射性核素，例如111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或药物，例如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、类紫杉醇(taxoid)和苏拉明(suramin)。
其他效应物分子包括蛋白质、肽和酶。感兴趣的酶包括(但不限于)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。感兴趣的蛋白质、多肽和肽包括(但不限于)免疫球蛋白、毒素(例如相思子素(abrin)、蓖麻毒蛋白A(ricin A)、假单胞菌属(pseudomonas)外毒素或白喉(diphtheria)毒素)、蛋白质(例如胰岛素)、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板源生长因子或组织血纤维蛋白溶酶原活化剂、血栓剂或抗血管生成剂(例如血管抑素或内皮抑素)、或生物反应调节剂例如淋巴因子、介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、颗粒球巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、颗粒球群落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其他生长因子和免疫球蛋白。
其他效应物分子可包括可用于例如诊断的可检测的物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层摄影术)和非放射性顺磁性金属离子。关于可缀合至抗体用作诊断的金属离子，通常参见美国专利号4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰基胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮(umbelliferone)、荧光黄(fluorescein)、荧光黄异硫氰酸酯、玫瑰红(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光黄、丹磺酰氯(dansyl chloride)和藻红素(phycoerythrin)；合适发光材料包括发光胺(luminol)；合适的生物发光材料包括荧光素酶、荧光素和水母素(aequorin)；且合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。
在另一实例中，效应物分子可增加抗体的体内半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体横跨上皮障壁至免疫系统的递送。此类型的合适效应物分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，例如描述于WO05/117984中的那些。
在一个实施方案中，由独立于FcRn的效应物分子提供的半衰期是有利的。
如果效应物分子是聚合物，则其通常可为合成或天然存在的聚合物，例如任选经取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物或具支链或无支链多糖(例如均-或杂-多糖)。
可存在于上文所提及的合成聚合物上的具体可选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
合成聚合物的具体实例包括任选经取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其任选经取代的聚(乙二醇)，例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、聚葡萄糖、肝糖或其衍生物。
在一个实施方案中，聚合物是白蛋白或其片段，例如人血清白蛋白或其片段。
如本文中所用“衍生物”意欲包括反应性衍生物，例如硫醇选择性反应基团，例如马来酰亚胺和诸如此类。反应基团可直接或经由接头区段连接至聚合物。应理解，在一些情况下，这样的基团的残基作为抗体片段与聚合物之间的连接基团形成产物的部分。
可视需要改变聚合物的大小，但其通常将在500Da至50000Da、例如5000Da至40000Da、例如20000Da至40000Da的平均分子量范围内。具体而言，可基于产物的预期用途(例如定位至某些组织(例如肿瘤)或延长循环半衰期的能力)选择聚合物大小(关于综述，参见Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，例如，如果产物意欲离开循环并穿透组织例如用于治疗肿瘤，则可有利地使用例如具有约5000Da的分子量的小分子量聚合物。对于产物保留在循环中的应用，可有利地使用例如具有20000Da至40000Da范围内的分子量的较高分子量聚合物。
合适聚合物包括聚亚烷基聚合物，例如聚(乙二醇)或特别是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且特别是分子量在约15000Da至约40000Da范围内。
在一个实例中，用于本发明中的抗体附接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一个特定实例中，抗体是抗体片段且PEG分子可经由位于抗体片段中的任何可用氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何游离氨基、亚氨基、硫醇、羟基或羧基)附接。这样的氨基酸可在抗体片段中天然存在或可使用重组DNA方法经改造至片段中(例如，参见US5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971、WO2008/038024)。在一个实例中，本发明的抗体分子是经修饰Fab片段，其中修饰是向其重链的C-末端添加一个或多个氨基酸以允许附接效应物分子。合适地，另外的氨基酸形成含有效应物分子可附接的一个或多个半胱氨酸残基的经修饰的铰链区。可使用多个位点以附接两个或更多个PEG分子。
合适地，PEG分子经由至少一个位于抗体片段中的半胱氨酸残基的硫醇基团共价连接。附接至经修饰的抗体片段的各聚合物分子可共价连接至位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价键联通常将为二硫键或特别是硫-碳键。如果使用硫醇基团作为附接点，则可使用适当活化的效应物分子(例如硫醇选择性衍生物，例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物)。活化的聚合物可在如上文所述的聚合物修饰的抗体片段的制备中用作起始材料。活化的聚合物可为含有硫醇反应基团(例如α-卤基羧酸或酯(例如碘乙酰胺)、酰亚胺(例如马来酰亚胺)、乙烯基砜或二硫化物)的任何聚合物。这样的起始材料可商业获得(例如来自Nektar，先前称作Shearwater Polymers Inc.,Huntsville,AL,USA)或可从市售起始材料使用常规化学程序来制备。特定的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可从Nektar(先前称作Shearwater)、Rapp Polymere和SunBio获得)和M-PEG-SPA(可从Nektar(先前称作Shearwater)获得)。
在一个实施方案中，抗体是经修饰Fab片段、Fab’片段或diFab，其是经聚乙二醇化的，即具有共价附接至其的PEG(聚(乙二醇))，例如根据EP 0948544或EP1090037中公开的方法[还参见"Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and BiomedicalApplications",1992,J.Milton Harris(ed),Plenum Press,New York,"Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications",1997,J.Milton Harrisand S.Zalipsky(eds),American Chemical Society,Washington DC and"Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences",1998,M.Aslam and A.Dent,Grove Publishers,New York；Chapman,A.2002,Advanced DrugDelivery Reviews 2002,54:531-545]。在一个实例中，PEG附接至铰链区中的半胱氨酸。在一个实例中，PEG修饰的Fab片段具有共价连接至经修饰的铰链区中的单一硫醇基团的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可共价连接至马来酰亚胺基团且具有约20,000Da的分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物可附接至赖氨酸残基上的胺基团中的每一个。因此，附接至Fab片段的PEG的总分子量可为约40,000Da。
特定的PEG分子包括N,N’-双(甲氧基聚(乙二醇)MW 20,000)修饰的赖氨酸(还称作PEG2MAL40K(可从Nektar(先前称作Shearwater)获得))的2-[3-(N-马来酰亚胺基)丙酰胺基]乙基酰胺。
PEG接头的替代来源包括NOF，其供应GL2-400MA3(其中下文结构中的m是5)和GL2-400MA(其中m是2)且n是约450：
即，每个PEG为约20,000Da。
因此，在一个实施方案中，PEG是2,3-双(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-{[3-(6-马来酰亚胺基-1-侧氧基己基)氨基]丙基氧基}己烷(2臂支链PEG，-CH2)3NHCO(CH2)5-MAL，Mw 40,000，称作SUNBRIGHT GL2-400MA3。
以下类型的其他替代PEG效应物分子可才Dr Reddy、NOF和Jenkem获得：
在一个实施方案中，抗体或片段缀合至淀粉分子以例如增加半衰期。缀合淀粉至蛋白质的方法如US 8,017,739中所述，其以引用方式并入本文中。
在一个实施方案中，提供了抗FcRn结合分子(即抗体或其结合片段)，其：
·引起血浆IgG浓度降低50-85％、例如降低70％，
·血浆白蛋白浓度降低不超过25％或20％，和/或
·具有重复给药的可能性以长期维持低血浆IgG浓度。
本发明还提供了编码本发明的抗体分子的重链和/或轻链的经分离的DNA序列。合适地，DNA序列编码本发明的抗体分子的重链或轻链。本发明的DNA序列可包含例如通过化学处理产生的合成DNA、cDNA、基因体DNA或其任何组合。
编码本发明的抗体分子的DNA序列可通过本领域技术人员熟知的方法获得。举例而言，如果期望，编码抗体重链和轻链的部分或全部的DNA序列可从测定的DNA序列合成或基于相应的氨基酸序列合成。
本领域技术人员可容易获得编码受体框架序列的DNA且该DNA可基于其已知的氨基酸序列容易地合成。
分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明的抗体分子的DNA序列。期望DNA序列可完全或部分使用寡核苷酸合成技术合成。如果适当，可使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。
本文提供了合适DNA序列的实例。
因此，在一个实例中，本发明提供了编码本发明的抗体Fab-dsscFv的重链(其包含SEQ ID NO：13中给出的序列)的经分离的DNA序列。还提供了编码本发明的抗体Fab-dsscFv的轻链(其包含SEQ ID NO：11中给出的序列)的经分离的DNA序列。
本发明还涉及包含本发明的一个或多个DNA序列的克隆或表达载体。因此，提供了包含一个或多个编码本发明抗体的DNA序列的克隆或表达载体。合适地，克隆或表达载体包含两个分别编码本发明的抗体分子的轻链和重链的DNA序列和合适的信号序列。在一个实例中，载体包含重链与轻链之间的基因间序列(参见WO03/048208)。
可构建载体的一般方法、转染方法和培养方法已为本领域技术人员所熟知。就此而言，参照“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(编辑),Wiley Interscience,New York和由Cold Spring Harbor Publishing出版的ManiatisManual。
还提供了包含一种或多种克隆或表达载体的宿主细胞，这样的载体包含一个或多个编码本发明的抗体分子的DNA序列。因此，本发明还提供了用于本发明的抗体分子的表达的宿主细胞，其包含：i)编码所述抗体的重链的DNA序列，和ii)编码所述抗体的轻链的DNA序列，
其中DNA序列提供于一种或多种克隆或表达载体中。
任何合适的宿主细胞/载体系统可用于编码本发明的抗体分子的DNA序列的表达。可使用细菌(例如大肠杆菌)和其他微生物系统(尤其用于表达抗体片段)或还可使用真核(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统(尤其用于表达全长抗体)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
用于本发明中的合适类型的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)可包括CHO和CHO-K1细胞，包括可与DHFR选择标记物一起使用的dhfr-CHO细胞(例如CHO-DG44细胞和CHO-DXB11细胞)或可与谷氨酰胺合成酶选择标记物一起使用的CHOK1-SV细胞。用于表达抗体的其他细胞类型包括淋巴细胞细胞系，例如NSO骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞。
本发明还提供了产生本发明的抗体分子的方法，其包括在适于引起来自编码本发明的抗体分子的DNA的蛋白质表达的条件下培养含有本发明的一个或多个载体的宿主细胞和分离抗体分子。
抗体分子包含重链和轻链且可用两个载体转染细胞系，即编码轻链多肽的第一载体和编码重链多肽的第二载体。或者，可使用单一载体，所述载体包含编码轻链和重链多肽的序列。
本发明的抗体和片段以良好水平从宿主细胞表达。因此，抗体和/或片段的性质有助于商业处理。
因此，提供了培养宿主细胞和表达抗体或其片段、分离后者和任选纯化其以提供经分离的抗体或片段的方法。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将效应物分子缀合至经分离的抗体或片段(例如缀合至特别是如本文所述的PEG聚合物)的步骤。
在一个实施方案中，提供了纯化抗体(特别是本发明的抗体或片段)的方法，其包括以下步骤：以非结合模式实施离子交换层析使得杂质保留于柱子上并洗脱抗体。
在一个实施方案中，纯化采用在FcRn柱子上的亲和力捕获。
在一个实施方案中，纯化采用辛巴蓝(cibacron blue)或相似物用于纯化白蛋白融合或缀合分子。
适用于所述方法中的离子交换树脂包括Q.FF树脂(由GE-Healthcare供应)。所述步骤可例如在pH约8下实施。
所述方法可进一步包括采用在例如约4至5(例如4.5)的pH下实施的阳离子交换层析的初始捕获步骤。阳离子交换层析可例如采用树脂，例如CaptoS树脂或SP琼脂糖FF(由GE-Healthcare供应)。随后可采用离子盐溶液(例如氯化钠)以例如200mM的浓度从树脂洗脱抗体或片段。
因此，如果适当，一个或多个层析步骤可包括一个或多个洗涤步骤。
纯化过程还可包括一个或多个过滤步骤，例如渗滤步骤。
因此，在一个实施方案中，提供了呈实质上纯化形式、特别是不含或实质上不含内毒素和/或宿主细胞蛋白质或DNA的纯化的抗FcRn抗体或片段，例如人源化抗体或片段，特别是本发明的抗体或片段。
如上文使用的纯化形式欲指至少90％纯度，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％w/w或更纯。
实质上不含内毒素通常欲指内毒素水平为1EU/mg抗体产物或更小，例如0.5或0.1EU/mg产物。
实质上不含宿主细胞蛋白质或DNA通常欲指宿主细胞蛋白质和/或DNA水平为400μg/mg抗体产物或更小，例如100μg/mg或更小，特别是20μg/mg(如果适当)。
本发明的抗体分子还可用于诊断，例如涉及FcRn的疾病状态的体内诊断和成像。
由于本发明的抗体可用于治疗和/或预防病理状况，故本发明还提供了包含本发明的抗体分子以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的医药或诊断组合物。因此，提供了本发明的抗体分子的用途，其用于制造药剂。所述组合物通常将作为无菌药物组合物的部分供应，所述组合物通常将包含药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可另外包含药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供了制备医药或诊断组合物的方法，其包括将本发明的抗体分子与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起添加并混合。
抗体分子可为医药或诊断组合物中的唯一活性成分或可伴随有其他活性成分，包括其他抗体成分或非抗体成分，例如类固醇或其他药物分子，特别是半衰期独立于FcRn结合的药物分子。
药物组合物合适地包含治疗有效量的本发明的抗体。如本文中所用术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防靶向的疾病或病况或展现可检测的治疗或预防效应所需的治疗剂的量。对于任何抗体分子，可最初在细胞培养分析中或在动物模型中、通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中估计治疗有效量。动物模型还可用于测定适当浓度范围和施用途径。随后可使用此等信息来确定人中的可用施用剂量和途径。
人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、重量和性别、饮食，施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗法的耐受性/反应。这样的量可通过常规实验测定且在临床医师的判断内。通常，治疗有效量将为0.01mg/kg至500mg/kg，例如0.1mg/kg至200mg/kg，例如100mg/Kg。
药物组合物可以以每剂量含有预定量的本发明的活性试剂的单位剂型方便地呈现。
本发明的抗体的治疗剂量在体内不显示表观毒性效应。
在本发明的抗体或片段的一个实施方案中，单一剂量可提供循环IgG水平减少高达70％。在本发明的抗体或片段的一个实施方案中，单一剂量可提供循环IgG水平减少高达80％。在本发明的抗体或片段的一个实施方案中，单一剂量可提供循环IgG水平减少大于80％。
可在施用相关治疗剂量后约1周观察循环IgG的最大治疗性减少。如果未递送其他治疗剂量，则IgG的水平可在给药后数周内恢复。如本文中所用的恢复是指水平返回至与在开始初始给药之前观察的那些相似的水平。
有利地，可通过施用本公开内容的抗体或片段的连续剂量将体内IgG的水平维持于适当低水平下。
组合物可单独地施用至患者或可与其他药剂、药物或激素组合(例如，同时、依序或分开)施用。
如本文中所用的药剂是指在施用时具有生理效应的实体。
如本文中所用的药物是指治疗剂量具有适当生理效应的化学实体。
在一个实施方案中，本发明的抗体或片段与免疫抑制剂治疗法(例如类固醇，特别是普赖松)一起使用。
在一个实施方案中，本发明的抗体或片段与利妥昔单抗或其他B细胞治疗法一起使用。
在一个实施方案中，本发明的抗体或片段与任何B细胞或T细胞调节剂或免疫调节剂一起使用。实例包括氨甲喋呤、麦考酚酯(microphenyolate)和硫唑嘌呤。
施用本发明的抗体分子的剂量取决于欲治疗的病况的性质、所存在的发炎的程度和抗体分子是预防性使用或用于治疗现有病况。
给药频率将取决于抗体的半衰期、其靶标介导的处置、其效应的持续时间和抗药物抗体的存在。如果抗体具有短半衰期(几小时)或有限的活性，和/或如果期望递送小体积的药物(例如对于皮下注射)，可能需要频繁地(频繁至每天一次或更多次)给药。或者，如果抗体具有长半衰期、具有活性的长持续时间，或可以以大体积(例如通过输注)给药，则给药可不频繁，每天、或每几天、几周或几个月一次。在一个实施方案中，在剂量之间允许足够时间以允许抗药物抗体水平下降。
如本文中所用的半衰期欲指分子在循环中、例如血清/血浆中的持续时间。
如本文中所用的药效动力学是指本发明的分子的生物作用的特性和特别是持续时间。
药学上可接受的载体自身不应诱发对接受组合物的受试者有害的抗体的产生且不应有毒。合适载体可为大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒粒子。
可使用药学上可接受的盐，例如矿物酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐)或有机酸盐(例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐)。
治疗组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这样的组合物中可存在辅助物质(例如润湿或乳化剂或pH缓冲物质)。这样的载体使得能够将药物组合物配制成锭剂、丸剂、糖衣锭、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液以用于由患者摄入。
适于施用的形式包括适于肠胃外施用、例如通过注射或输注、例如通过推注注射或连续输注的形式。如果产物用于注射或输注，则其可采用油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液形式且其可含有制剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体分子可呈干燥形式，其用于在使用之前用适当无菌液体重构。
一旦配制，可将本发明的组合物直接施用至受试者。待治疗的受试者可为动物。然而，在一个或多个实施方案中，组合物适于施用至人受试者。
合适地，在本发明的制剂中，最终制剂的pH与抗体或片段的等电点的值并不相似，例如如果蛋白质的pI在8-9或更高范围内，则7的制剂pH可为适当的。尽管不希望受限于理论，但据信此可最终提供具有改良稳定性的最终制剂，例如抗体或片段保留于溶液中。
在一个实例中，pH在4.0至7.0范围内的医药制剂包含：1mg/mL至200mg/mL的本发明的抗体分子、1mM至100mM的缓冲液、0.001％至1％的表面活性剂、a)10mM至500mM的稳定剂、b)10mM至500mM的稳定剂和5mM至500mM的张力剂、或c)5mM至500mM的张力剂。
本发明的药物组合物可通过任何多种途径施用，包括但不限于经口、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、室内、经皮、透皮(例如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。还可使用皮下注射器以施用本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可制备为可注射物，呈液体溶液或悬浮液形式。还可制备适于在注射之前在液体媒剂中制成溶液或悬浮液的固体形式。
组合物的直接递送通常将通过注射、皮下、腹膜内、静脉内或肌内完成，或递送至组织之间质间隙。组合物还可施用至病灶中。剂量治疗可为单一剂量时间表或多个剂量时间表。
应理解，组合物中的活性成分将为抗体分子。因此，其将在胃肠道中易于降解。因此，如果组合物欲通过使用胃肠道的途径施用，则组合物将需要含有保护抗体免于降解但在自胃肠道吸收后释放抗体的试剂。
药学上可接受的载体的全面论述可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)中。
在一个实施方案中，制剂以用于局部施用(包括吸入)的制剂形式提供。
合适的可吸入制剂包括可吸入粉末、含有推进剂气体的计量气溶胶或不含推进剂气体的可吸入溶液。含有活性物质的本公开内容的可吸入粉末可仅由上文所提及活性物质组成，或由上文所提及活性物质与生理学上可接受的赋形剂的混合物组成。
这样的可吸入粉末可包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨醇、甘露醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或这样的物质与另一物质的混合物。合适地使用单糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，特别是(但并非排他性的)呈其水合物形式。
沉积于肺中的粒子要求粒径小于10微米，例如1-9微米，例如1μm至5μm。活性成分(例如抗体或片段)的粒径具有首要的重要性。
可用于制备可吸入气溶胶的推进剂气体已为本领域所知。合适的推进剂气体选自烃(例如正丙烷、正丁烷或异丁烷)和卤代烃(例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物)。上文提及的推进剂气体可单独使用或以其混合物使用。
尤其合适的推进剂气体选自TG11、TG 12、TG 134a和TG227的卤化烷烃衍生物。在上文所提及的卤化烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)和其混合物尤其合适。
含有推进剂气体的可吸入气溶胶还可含有其他成分，例如共溶剂、稳定剂、表面活性剂、抗氧化剂、润滑剂和用于调节pH的试剂。所有这样的成分均为本领域所知。
本发明含有推进剂气体的可吸入气溶胶可含有高达5重量％的活性物质。本发明的气溶胶含有例如0.002重量％至5重量％、0.01重量％至3重量％、0.015重量％至2重量％、0.1重量％至2重量％、0.5重量％至2重量％或0.5重量％至1重量％的活性成分。
或者，局部施用至肺还可通过施用液体溶液或悬浮液制剂例如采用装置(例如雾化器，例如连接至压缩器的雾化器，例如连接至Pari Master(R)压缩器的Pari LC-JetPlus(R)雾化器，由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造)来完成。
本发明的抗体可例如以溶液或悬浮液形式递送、分散于溶剂中。其可悬浮于适当生理溶液(例如，盐水或其他药理上可接受的溶剂或缓冲溶液)中。本领域已知的缓冲溶液的实例可含有0.05mg至0.15mg依地酸二钠(disodium edetate)、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠/1ml水，以便获得约4.0至5.0的pH。悬浮液可采用例如冻干抗体。
治疗性悬浮液或溶液制剂还可含有一种或多种赋形剂。赋形剂为本领域熟知且包括缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。溶液或悬浮液可囊封于脂质体或生物可降解微球体中。制剂通常将采用无菌制造方法以实质上无菌形式来提供。
此可包括通过本领域技术人员熟悉的那些方法进行以下过程来产生和灭菌：过滤用于配制的经缓冲的溶剂/溶液，将抗体无菌悬浮于无菌缓冲溶剂的溶液中，和将制剂分配至无菌贮器中。
本发明的可喷雾制剂可以以例如包装于箔包封中的单一剂量单元(例如，密封塑料容器或小瓶)形式提供。每一小瓶含有例如2mL的体积的溶剂/溶液缓冲液的单位剂量。
本文公开的抗体可适于经由喷雾递送。
还设想本发明的抗体可通过使用基因治疗法施用。为实现此，将在适当DNA组分控制下编码抗体分子的重链和轻链的DNA序列引入患者中，使得抗体链从DNA序列表达并原位装配。
本发明还提供了用于控制以下疾病的抗体分子(或包含其的组合物)：自身免疫疾病，例如急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性脑白质炎、阿狄森氏病(Addison’sdisease)、无γ球蛋白血症、斑秃、类淀粉变性、ANCA相关的血管炎、强直性脊柱炎、抗-GBM/抗-TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫血管性水肿、自身免疫再生不良性贫血、自身免疫自主神经机能障碍、自身免疫肝炎、自身免疫血内脂质过多、自身免疫免疫缺陷、自身免疫内耳疾病(AIED)、自身免疫心肌炎、自身免疫胰脏炎、自身免疫视网膜病变、自身免疫血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫甲状腺疾病、自身免疫荨麻疹、轴突和神经元神经病变、巴娄病(Balo disease)、贝切特氏病(Behcet’s disease)、大水疱性类天孢疮病、心肌病、卡斯特雷曼病(Castleman disease)、腹泻疾病、查加斯氏病(Chagas disease)、慢性发炎性脱髓鞘多发性神经病变(CIDP)、慢性复发性多病灶骨髓炎(CRMO)、丘-施氏综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜性类天疱疮病、克隆氏病(Crohn’sdisease)、柯刚氏综合征(Cogans syndrome)、冷凝集素疾病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST疾病、原发性混合型冷球蛋白血症、脱髓鞘神经病变、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(Devic’s disease)(视神经脊髓炎)、扩张型心肌病、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征(Dressler’s syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性球性血管中心性纤维化、嗜酸性球性筋膜炎、结节性红斑、实验性过敏性脑脊髓炎、伊文恩综合征(Evans syndrome)、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、肾小球肾炎、古巴士德氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、伴随多血管炎的肉芽肿病(Granulomatosis withPolyangiitis)(GPA)(参见韦格纳氏病(Wegener’s))、格雷夫氏病、格林-巴利综合征、桥本氏脑炎(Hashimoto’s encephalitis)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性贫血、亨诺-许兰氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、妊娠疱疹、低γ球蛋白血症、特发性血补体过少的小管间质性肾炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关性疾病、IgG4相关性硬化性疾病、免疫调节性脂蛋白病、发炎性主动脉瘤、发炎性假性肿瘤、包涵体肌炎、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、间质性膀胱炎、青少年关节炎、青少年糖尿病、川崎综合征(Kawasaki syndrome)、库特纳肿瘤(Kuttner’s tumour)、朗-伊综合征、白血球破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎、线状IgA疾病(LAD)、狼疮(SLE)、莱姆病(Lymedisease)、慢性纵隔纤维变性、梅尼尔氏病(Meniere’s disease)、显微镜下多血管炎、米库利奇氏综合征(Mikulicz’s syndrome)、混合性结缔组织病(MCTD)、莫伦氏溃疡(Mooren’sulcer)、穆-哈病(Mucha-Habermann disease)、多灶性纤维硬化、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(德维克氏病)、嗜中性白血球减少、眼部瘢痕性类天疱疮病、视神经炎、奥蒙德氏病(Ormond’s disease)(腹膜后纤维化)、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫神经精神病症)、副肿瘤性小脑变性、副蛋白血症多发性神经病、阵发性夜间血红素尿症(PNH)、帕罗综合征(Parry Romberg syndrome)、帕-特综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、睫状体扁平部炎(周边眼色素层炎)、寻常天疱疮、主动脉周围炎、动脉周围炎、周边神经病变、静脉周边性脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多发性动脉炎、I型、II型和III型自身免疫多腺综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、黄体酮性皮炎、原发性胆汁性硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红血球再生不良、雷诺现象(Raynauds phenomenon)、反射性交感神经失养症、赖特氏综合征(Reiter’s syndrome)、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化(奥蒙德氏病)、风湿热、类风湿性关节炎、里德耳甲状腺炎(Riedel’s thyroiditis)、类肉瘤病、施密特综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、薛格连氏综合征(Sjogren’s syndrome)、精子和睪丸自身免疫性、僵直人综合征(Stiff person syndrome)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac’ssyndrome)、交感性眼炎、高安动脉炎(Takayasu’s arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、妥洛沙-韩特综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、眼色素层炎、血管炎、囊泡形皮肤炎、白斑病、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom Macroglobulinaemia)、温特发性溶血性贫血和韦格纳氏内芽肿病(现在称为伴随多血管炎的肉芽肿病(GPA))。
另外的适应症还可包括高粘稠度综合征；冷凝球蛋白血症；移植肾中的复发性病灶和节段性肾小球硬化；HELLP综合征；雷夫苏姆病；HIV相关神经病变；横纹肌溶解和同种免疫疾病。
在一个实施方案中，本公开内容的抗体或片段用于治疗或预防癫痫或癫痫发作。
在一个实施方案中，本公开内容的抗体或片段用于治疗或预防多发性硬化。
在实施方案中，本公开内容的抗体和片段用于同种免疫疾病/适应症，其包括：
·由于抗HLA抗体的移植供体错配
·胎儿和新生儿同种免疫血小板减少症FNAIT(或新生儿同种免疫血小板减少症NAITP或NAIT或NAT，或胎儿母源性同种免疫血小板减少症FMAITP或FMAIT)。
另外的适应症包括：含有Fc的生物医药药物从人患者的快速清除和抗FcRn治疗法与其他治疗法(IVIg、利妥昔单抗(Rituxan)、血浆去除术)的组合。举例而言，可在利妥昔单抗治疗法后采用抗FcRn治疗法。另外，抗FcRn治疗法可用于快速清除成像剂，例如成像肿瘤中所用的放射标记的抗体。
在一个实施方案中，本公开内容的抗体和片段用于神经病症，例如：
·慢性发炎性去髓鞘型多发性神经病变(CIDP)
·格林-巴利综合征
·副蛋白血症多发性神经病变
·视神经脊髓炎(NMO、NMO谱系病症或NMO谱系疾病)，和
·重症肌无力。
在一个实施方案中，本公开内容的抗体和片段用于皮肤病症，例如：
·大疱性类天疱疮
·寻常天疱疮
·ANCA相关的血管炎
·扩张型心肌病
在一个实施方案中，本公开内容的抗体和片段用于免疫、血液病症，例如：
·特发性血小板减少紫癜(ITP)
·血栓性血小板减少性紫癜(TTP)
·温特发性溶血性贫血
·古巴士德氏综合征
·由于抗HLA抗体的移植供体错配
在一个实施方案中，病症选自重症肌无力、视神经脊髓炎、CIDP、格林-巴利综合征、副蛋白血症多发性神经病、难治性癫痫、ITP/TTP、溶血性贫血、古巴士德氏综合征、ABO错配、狼疮性肾炎、肾血管炎、硬皮病、纤维化肺泡炎、扩张型心肌病、格雷氏病、1型糖尿病、自身免疫糖尿病、天疱疮、硬皮病、狼疮、ANCA血管炎、皮肌炎、薛格连氏病和类风湿性关节炎。
在一个实施方案中，病症选自自身免疫多内分泌综合征1型(APECED或惠特克氏综合征(Whitaker’s Syndrome))和2型(施密特氏综合征(Schmidt’s Syndrome))；普秃；肌无力危象；甲状腺危象；甲状腺相关的眼病；甲状腺眼病；自身免疫糖尿病；自体抗体相关的脑炎和/或脑病；落叶型天疱疮；大疱性表皮松解；疱疹样皮炎；席登罕氏舞蹈症(Sydenham’schorea)；急性运动轴突神经病变(AMAN)；米勒费雪综合征(Miller-Fisher syndrome)；多灶性运动神经病(MMN)；斜视性眼阵挛；发炎性肌病；艾萨克氏综合征(Isaac’s syndrome)(自身免疫神经性肌强直)、肿瘤伴生综合征和边缘叶脑炎。
本发明的抗体和片段可用于治疗或预防。
本发明还提供了降低受试者中不期望的抗体的浓度的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的本文所述的抗FcRn抗体融合蛋白的步骤。
本发明进一步提供了本发明的抗体分子的用途，其用于制造用于治疗和/或预防本文所述病理病症(例如自身免疫疾病)的药剂。
因此，本发明还提供了用于控制选自以下的自身免疫疾病的抗体分子(或包含其的组合物)：急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性脑白质炎、阿狄森氏病(Addison’s disease)、无γ球蛋白血症、斑秃、类淀粉变性、ANCA相关的血管炎、强直性脊柱炎、抗-GBM/抗-TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫血管性水肿、自身免疫再生不良性贫血、自身免疫自主神经机能障碍、自身免疫肝炎、自身免疫血内脂质过多、自身免疫免疫缺陷、自身免疫内耳疾病(AIED)、自身免疫心肌炎、自身免疫胰脏炎、自身免疫视网膜病变、自身免疫血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫甲状腺疾病、自身免疫荨麻疹、轴突和神经元神经病变、巴娄病(Balo disease)、贝切特氏病(Behcet’s disease)、大水疱性类天孢疮病、心肌病、卡斯特雷曼病(Castleman disease)、腹泻疾病、查加斯氏病(Chagasdisease)、慢性发炎性脱髓鞘多发性神经病变(CIDP)、慢性复发性多病灶骨髓炎(CRMO)、丘-施氏综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜性类天疱疮病、克隆氏病(Crohn’s disease)、柯刚氏综合征(Cogans syndrome)、冷凝集素疾病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST疾病、原发性混合型冷球蛋白血症、脱髓鞘神经病变、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(Devic’s disease)(视神经脊髓炎)、扩张型心肌病、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征(Dressler’s syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性球性血管中心性纤维化、嗜酸性球性筋膜炎、结节性红斑、实验性过敏性脑脊髓炎、伊文恩综合征(Evans syndrome)、纤维化肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、肾小球肾炎、古巴士德氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、伴随多血管炎的肉芽肿病(Granulomatosis with Polyangiitis)(GPA)(参见韦格纳氏病(Wegener’s))、格雷夫氏病、格林-巴利综合征、桥本氏脑炎(Hashimoto’s encephalitis)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性贫血、亨诺-许兰氏紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、妊娠疱疹、低γ球蛋白血症、特发性血补体过少的小管间质性肾炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关性疾病、IgG4相关性硬化性疾病、免疫调节性脂蛋白病、发炎性主动脉瘤、发炎性假性肿瘤、包涵体肌炎、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、间质性膀胱炎、青少年关节炎、青少年糖尿病、川崎综合征(Kawasaki syndrome)、库特纳肿瘤(Kuttner’s tumour)、朗-伊综合征、白血球破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎、线状IgA疾病(LAD)、狼疮(SLE)、莱姆病(Lyme disease)、慢性纵隔纤维变性、梅尼尔氏病(Meniere’s disease)、显微镜下多血管炎、米库利奇氏综合征(Mikulicz’ssyndrome)、混合性结缔组织病(MCTD)、莫伦氏溃疡(Mooren’s ulcer)、穆-哈病(Mucha-Habermann disease)、多灶性纤维硬化、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(德维克氏病)、嗜中性白血球减少、眼部瘢痕性类天疱疮病、视神经炎、奥蒙德氏病(Ormond’s disease)(腹膜后纤维化)、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫神经精神病症)、副肿瘤性小脑变性、副蛋白血症多发性神经病、阵发性夜间血红素尿症(PNH)、帕罗综合征(Parry Romberg syndrome)、帕-特综合征(Parsonnage-Turnersyndrome)、睫状体扁平部炎(周边眼色素层炎)、寻常天疱疮、主动脉周围炎、动脉周围炎、周边神经病变、静脉周边性脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多发性动脉炎、I型、II型和III型自身免疫多腺综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、黄体酮性皮炎、原发性胆汁性硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红血球再生不良、雷诺现象(Raynaudsphenomenon)、反射性交感神经失养症、赖特氏综合征(Reiter’s syndrome)、复发性多软骨炎、不宁腿综合征、腹膜后纤维化(奥蒙德氏病)、风湿热、类风湿性关节炎、里德耳甲状腺炎(Riedel’s thyroiditis)、类肉瘤病、施密特综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、薛格连氏综合征(Sjogren’s syndrome)、精子和睪丸自身免疫性、僵直人综合征(Stiffperson syndrome)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac’s syndrome)、交感性眼炎、高安动脉炎(Takayasu’s arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、妥洛沙-韩特综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、眼色素层炎、血管炎、囊泡形皮肤炎、白斑病、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom Macroglobulinaemia)、温特发性溶血性贫血和韦格纳氏内芽肿病(现在称为伴随多血管炎的肉芽肿病(GPA))。
在一个实施方案中，本发明包括抗体或其片段的用途，其用作用于诊断的试剂，例如缀合至报导分子。因此，提供了经标记的本公开内容的抗体或片段。在一个方面中，提供了包含本公开内容的抗体或片段的柱子。
因此，提供了用作用于诸如以下用途的试剂的抗FcRn抗体或结合片段：
1)纯化FcRn蛋白质(或其片段)-缀合至基质且用作亲和力柱子，或(呈抗FcRn的经修饰形式)作为沉淀剂(例如作为用由另一分子识别的结构域修饰的形式，所述另一分子可通过添加Fc来修饰(或产生为全长IgG)，其任选通过抗Fc试剂沉淀)
2)检测和/或量化活细胞或固定的细胞(组织或细胞切片中的体外或体内细胞)上或这样的细胞中的FcRn。用于此的用途可包括以生物标记形式量化FcRn以追踪抗FcRn治疗的效应。出于这样的目的，候选者可以以经修饰的形式使用(例如通过添加Fc结构域(作为全长IgG)或一些其他部分(作为遗传性融合蛋白或化学缀合物)，例如添加用于检测目的荧光标签)。
3)纯化或分选通过结合至通过(1)和(2)中例示的方式修饰的候选物标记的带有FcRn的细胞。
本发明还提供了适于评价测试分子(例如抗体分子)阻断FcRn活性的能力且特别是细胞再循环IgG的能力的测定。这样的测定可用于鉴别FcRn活性的抑制剂，例如抗体分子或小分子，且因此还可用作分批释放测定用于产生这样的抑制剂。所述测定先前描述于WO2014/019727中。
本说明书的上下文中的“包含”欲指包括。
如果技术上适当，则可组合本发明的实施方案。
实施方案在本文中描述为包含某些特征/元件。本公开内容还扩展至由这样的特征/元件组成或基本上由其组成的单独实施方案。
技术参考文献(例如专利和申请)以引用方式并入本文中。
在以下的实施例中仅以举例说明方式进一步描述本发明，其参照附图，其中：
图1显示1735h5.hFab-scFv.768抑制MDCK II克隆7细胞中的IgG再循环
图2显示1735h5.hFab-scFv.768对人FcRn-转基因小鼠的血清中的人IVIg的浓度的效应
图3显示1735h5.hFab-scFv.768对人FcRn-转基因小鼠中的血清白蛋白的浓度的效应。
图4显示正常小鼠中的1735h5.hFab-scFv.768的药物动力学。
图5显示人FcRn-转基因小鼠中的1735h5.hFab-scFv.768的药物动力学。
图6显示1735h5.hFab-scFv.768(Fab-scFv)与母体Fab和等效Fab-Fv相比的热稳定性。
图7显示本发明的Fab-scFv和Fab-dsscFv片段形式
图8本发明的抗体序列
图9a抗体1638.g49的人源化
图9b抗体1638.g49的人源化
实施例
缩写
℃ 温度，摄氏度。
ATR FTIR 衰减全反射傅立叶(Fourier)转换红外光谱
CH2 恒定重链区2
cIEF 毛细管等电聚焦
DSC 差示扫描量热法
G0F 岩藻糖基化半乳糖基二分枝聚糖
H chain 重链
HPLC 高效液相层析
IgG 免疫球蛋白G
L chain 轻链
nLCMS 纳米-液相层析质谱
PBS 磷酸缓冲盐水缓冲液
pI 等电点
SD 标准偏差
SEC 粒径筛析层析
ToF 飞行时间
Tm 熔融温度
TCEP 三(2-羧基乙基)膦
THP 三(羟基丙基)膦
Tris 三(羟甲基)氨基甲烷
实施以下免疫以生成用于B细胞培养物和抗体筛选的材料：
用共表达突变人FcRn(L320A；L321A)(Ober等人，2001Int.Immunol.13,1551-1559)和小鼠β2M的NIH3T3小鼠成纤维细胞的三次注射和人FcRn细胞外结构域的第四次最终加强对Sprague Dawley大鼠进行免疫。
监测血清与HEK-293细胞上的突变FcRn的结合和其防止Alexafluor 488-标记的人IgG的结合的能力。两种方法均通过流式细胞术实施。对于结合，使用藻红素(PE)标记的抗小鼠或大鼠Fc特异性第二试剂以揭示血清中的IgG的结合。
使用类似于由Zubler等人(1985)所述的方法的方法制备B细胞培养物。简言之，于37℃下在5％CO2气氛中将B细胞以约5000个细胞/孔的密度在具有200μl/孔的RPMI 1640培养基(Gibco BRL)的条形编码96孔组织培养板中培养7天，所述培养基补充有10％FCS(PAAlaboratories ltd)、2％HEPES(Sigma Aldrich)、1％L-谷氨酰胺(Gibco BRL)、1％青霉素/链霉素溶液(Gibco BRL)、0.1％β-巯基乙醇(Gibco BRL)、2-5％活化兔脾细胞培养上清液和γ辐照的EL-4-B5鼠类胸腺瘤细胞(5×104/孔)。
使用基于均相荧光的结合测定使用经突变FcRn(表面稳定的)瞬时转染的HEK-293细胞作为靶抗原的来源确定B细胞培养上清液中FcRn特异性抗体的存在。使用MatrixPlatemate液体处置器将10μl上清液从条形编码的96孔组织培养板转移至每个孔含有5000个经转染的HEK-293细胞的条形编码的384孔黑壁测定板。利用山羊抗大鼠或小鼠IgG Fcγ特异性Cy-5缀合物(Jackson)揭示结合。在Applied Biosystems 8200细胞检测系统上对板进行读数。从3800×96孔培养板(代表38种不同经免疫动物)鉴别9800种抗人FcRn粘合剂。估计这代表约25亿B细胞的筛选。
在主要筛选后，使用Aviso Onyx碰撞-拾取机器人将阳性上清液固结至96孔条形编码的主板上并将细胞培养板中的B细胞于-80℃下冷冻。随后在Biacore分析中筛选主板以鉴别含有高亲和力抗体和抑制人IgG与FcRn结合的抗体的孔(参见下文)。
在BIAcore T200系统(GE Healthcare)上实施使用表面等离子体共振技术(SPR)的生物分子相互作用分析。使用HBS-EP+作为运行缓冲液经由与约19500个反应单元(RU)的捕获量的胺偶合化学将10mM NaAc(pH 5)缓冲液中的山羊抗大鼠IgG、Fcγ(ChemiconInternational Inc.)固定于CM5传感器芯片上。使用50mM磷酸盐pH6+150mM NaCl作为用于亲和力和阻断测定的运行缓冲液。将B细胞培养上清液在200mM磷酸盐pH6+150mM NaCl中以1：5稀释。以5μl/min的经稀释B细胞上清液的600s注射用于通过固定的抗大鼠IgG,Fc的捕获。在经捕获的B细胞培养上清液上以30μl/min注射100nM的人FcRn达180s，之后进行360s的解离。以30μl/min注射人IgG(Jackson ImmunoResearch)达60s并进行180s的解离。
使用T200评估软件(1.0版)分析数据以测定抗体的亲和力常数(KD)并测定阻断IgG结合的那些抗体。
作为替代测定，还在基于细胞的人IgG阻断测定中筛选主板上清液。向96孔U形底聚丙烯板中添加25ul来自主板的B细胞培养上清液。随后向每一孔中添加突变hFcRn转染的HEK-293细胞(50,000个细胞/孔，于25ul PBS pH6/1％FCS中)并于4℃下孵育1小时。将细胞用150ul PBS培养基洗涤两次。随后将细胞以7.5ug/ml再悬浮于50ul/孔的含有经Alexafluor488或649标记的人IgG的PBS/FCS培养基中并于4℃下孵育1小时。随后将细胞用150ul培养基洗涤两次并随后再悬浮于35ul/孔的含有1％甲醛作为固定剂的PBS/FCS培养基中。随后在FACS Canto 2流式细胞计数器上对板进行读数。
为允许从目标孔的选择回收抗体可变区基因，必须实施解卷积步骤以使得能够鉴别含有B细胞的异质群体的给定孔中的抗原特异性B细胞。这使用荧光焦点方法来实现。简言之，将来自阳性孔的分泌免疫球蛋白的B细胞与经生物素化的人FcRn和山羊抗大鼠或小鼠Fcγ片段特异性FITC缀合物(Jackson)的1：1200最终稀释物涂布的链霉抗生物素蛋白珠粒(New England Biolabs)混合。于37℃下静态孵育1小时后，抗原特异性B细胞可由于在所述B细胞周围存在荧光卤基来鉴别。随后利用Eppendorf显微操作器拾取使用Olympus显微镜鉴别的这样的个别B细胞并将其沉积于PCR管中。荧光焦点从268个选择孔生成。
通过反转录聚合酶链式反应(RT)-PCR使用重链和轻链可变区特异性引物从单一细胞回收抗体可变区基因。在Aviso Onyx液体操作机器人上实施两轮PCR，其中巢式2°PCR在3’和5’端并入限制位点，从而允许可变区克隆至小鼠γ1IgG(VH)或小鼠κ(VL)哺乳动物表达载体中。使用Fectin 293(Invitrogen)将成对的重链和轻链构建体共转染至HEK-293细胞中并在48孔板中以1ml的体积培养。在5-7天表达后，收获上清液且抗体经受进一步筛选。
PCR从156个选择孔的单一B细胞成功地回收重链和轻链同源对。经克隆的可变区基因的DNA序列分析鉴别重组抗体的多个独特家族。在表达后，在人IgG FACS阻断(上文所述)和IgG再循环测定中讯问瞬时上清液。在一些情形下，产生并测定纯化小鼠γ1IgG(相应地标记数据)。
再循环测定使用过表达人FcRn和β2微球蛋白且以25,000个细胞/96孔板的孔平铺的MDCK II细胞。将这样的细胞于37℃、5％CO2下孵育过夜。将细胞用HBSS+Ca/Mg pH 7.2+1％BSA洗涤且随后于37℃、5％CO2下与50μl不同浓度的HEK-293瞬时上清液或纯化抗体一起孵育1小时。移出上清液并向细胞中添加50μl HBSS+Ca/Mg pH 5.9+1％BSA中的500ng/ml生物素化人IgG(Jackson)并于37℃、5％CO2下孵育1小时。随后将细胞在HBSS+Ca/Mg pH5.9中洗涤三次并向细胞中添加100μl HBSS+Ca/Mg pH 7.2并于37℃、5％CO2下孵育2小时。从细胞移出上清液并使用利用抗人IgG捕获抗体(Jackson)和链霉抗生物素蛋白-磺基标签揭示抗体(MSD)的MSD测定分析总IgG。通过非线性回归分析抑制曲线以测定IC50值。
基于这些测定中的性能，选择包含SEQ ID NO 1至6中给出的6个CDR的抗体家族。抗体CA170_01638具有最佳活性且选择用于人源化，如WO2015/071330中先前所述。
实施例1 人源化方法
通过将大鼠抗体V区的CDR移植至人种系抗体V区框架来人源化抗体CA170_01638。为恢复抗体的活性，还在人源化序列中保留大鼠V区的多个框架残基。这样的残基使用如下概述的方案选择：Adair等人(1991)(人源化抗体WO91/09967)。大鼠抗体(供体)V区序列与人种系(受体)V区序列的比对以及经设计的人源化序列一起示于图9A和B中。从供体移植至受体序列的CDR如由Kabat(Kabat等人，1987)所定义，只是使用组合的Chothia/Kabat定义的CDR-H1除外(参见Adair等人，1991Humanised antibodies.WO91/09967)。选择人V区IGKV1-27加上JK4 J区(http：//www.imgt.org/)作为用于轻链CDR的受体。选择人V区IGHV3-7加上JH3 J区(http：//www.imgt.org/)作为用于重链CDR的受体。
通过Entelechon GmbH的自动化合成方法设计并构建编码多个变体重链和轻链V区序列的基因。通过经由寡核苷酸引导的诱变修饰VH和VK基因来生成重链和轻链V区的其他变体。将这样的基因克隆至多个载体中以使得能够分别在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达人源化1638Fab或1735h5.hFab-scFv.768。评价变体链和其组合相对于亲代抗体的其功效、其生物物理性质和用于下游处理的适合性，这导致gL7轻链移植物和gH33重链移植物的选择。最终选择的gL7和gH33移植序列分别示于图9A和B和SEQ ID NO：8和9中。此V区配对被称作1638.g49。
移植物gL7中的轻链框架残基均来自人种系基因，只是残基70和71(Kabat编号)除外，其中分别保留供体残基组氨酸(H70)和酪氨酸(Y71)。该两个残基的保留对于人源化抗体或Fab的完全功效是重要的。gL7移植物的CDRL2中的残基56从天冬氨酸(D56)突变成谷氨酸(E56)残基，由此从gL7序列移除潜在天冬氨酸异构化位点。移植物gH33中的重链框架残基均来自人种系基因，只是残基48和78(Kabat编号)除外，其中分别保留供体残基亮氨酸(L48)和丙氨酸(A78)。该两个残基的保留对于人源化1638.g49Fab或1735h5.hFab-scFv.768的完全功效是至关重要的。
还生成另一较早移植物1638.g28且其在重链(gH2)中含有较1638.g49移植物多的供体残基(F24、L48、K71、T73、A78和V93)。此抗体(gL2)的轻链还含有SEQ ID NO：5中给出的未经修饰的CDRL2而不是用于1638.g49中的SEQ ID NO：7的经修饰的CDRL2。两组抗体的序列于图8中给出。
对于大肠杆菌中1638.g49Fab的表达，将人源化重链和轻链V区基因克隆至UCB表达载体pMXE811中，其含有编码人C-κ恒定区(K1m3异型)、具有经截短的铰链的人γ-1CH1恒定区(G1m17异型)和大肠杆菌伴侣蛋白FkpA和DsbC的DNA。
包含1638.g49可变结构域的Fab-dsscFv融合蛋白基本上如WO2013/068571的实施例4中所述使用分别图8的SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：10中给出的重链和轻链序列来构建并表达。对于哺乳动物细胞中Fab-dsscFv融合蛋白(称作1735h5.hFab-scFv.768)的表达，将人源化轻链V区基因连接至编码人C-κ恒定区(K1m3异型)的DNA序列以生成连续的1735h5.hFab-scFv.768轻链基因。将人源化重链V区基因连接至编码人γ-1CH1恒定区结构域的DNA序列。将重链恒定区连接至编码4×GGGGS接头和结合dsscfv 645gH5gL4的白蛋白的DNA序列以生成连续的1735h5.hFab-scFv.768重链基因。将重链和轻链基因克隆至哺乳动物双重基因表达载体pMXE755中以生成1735h5.hFab-scFv.768。
实施例2 1735h5.hFab-scFv.768的制备
在稳定的二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO DG44)中表达1735h5.hFab-scFv.768。使用Nuclefector(Lonza)按照制造商的说明用含有DHFR基因作为选择标记物和编码产物的基因的质粒载体转染细胞。在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中，在DHFR抑制剂氨甲喋呤的存在下，选择转染的细胞。在微型池培养至摇瓶阶段后，评估生长和生产力，并选择表达最高的克隆用于在补料分批摇瓶方法中进行评估。以0.3×106个活细胞/mL的起始密度接种8L培养物，并控制在36.8℃、5％CO2气氛下。从第3天至第12天添加营养饲料，并且当浓度低于5.8g/L时，作为快速添加剂添加葡萄糖。在第14天通过4000xg离心60分钟然后0.2μm过滤收获培养物。
将来自微型池4D4的澄清细胞培养上清液经0.22μm无菌过滤并如下纯化。将经过滤的上清液以<18ml/min装载至450ml在PBS pH7.4(Sigma Aldrich Chemicals)中平衡的GammabindPlus Sepharose XK50柱子(GE Healthcare)上。在装载后，将柱子用PBS pH7.4洗涤且随后用0.1M甘氨酸/HCl.pH2.7洗脱。洗脱之后是280nm处的吸光度测量，收集洗脱峰，且随后用2M Tris/HCl pH8.5中和。使用具有10kDa分子量截止膜的Vivaflow 50Casette(Sartorious)浓缩经中和的样品。通过粒径筛析层析在TSK凝胶G3000SWXL上分析等份样品；5μm的7.8×300mm柱子利用0.2M磷酸盐pH7.0的等度梯度以1ml/min显影，且通过280nm处的吸光度检测。单体％经测定为90％。将大部分浓缩样品施加至在PBS pH7.4中平衡的XK50/60Superdex200柱子(GE Healthcare)。利用PBS pH7.4的等度梯度以10ml/min使柱子显影。收集各部分并通过粒径筛析层析在TSK凝胶G3000SWXL上分析；5μm的7.8×300mm柱子利用0.2M磷酸盐pH7.0的等度梯度以1ml/min显影，且通过280nm处的吸光度检测。汇集所选单体部分并使用具有10kDa分子量截止膜的Amicon Ultra-15浓缩器浓缩至>20mg/ml并在甩平式转子中以4000xg离心。分析最终样品；对于浓缩，通过A280扫描UV-可见分光光度计(Cary 50Bio)；对于单体％，通过在TSK凝胶G3000SWXL上的粒径筛析层析，5μm的7.8×300mm柱子利用0.2M磷酸盐pH7.0的等度梯度以1ml/min显影，且通过280nm处的吸光度检测；通过在4-20％Tris-甘氨酸1.5mm凝胶(Novex)上于50mA(每凝胶)下运行还原和非还原SDS-PAGE 53分钟；和对于内毒素，通过具有鲎变形细胞裂解物(LAL)测试柱的CharlesRiver’s 便携式测试系统检测。
实施例3
使用固定于Fab位置中的替代性抗FcRn V区设计额外Fab-dsscFv抗体，这样的区是WO2014/019727中先前所述的和分别对于轻链和重链结构域在本文的SEQ ID NO：92和94中提供的1519.g57V区。该Fab连接至结合dsscFv 645 gH5 gL4(在HL定向上(dsHL))的白蛋白，如实施例1中所述。如表3中所示，这些分子被构建为重链(HC)Fab-dsscFv或轻链(LC)Fab-dsscFv。对于HC Fab-dsscFv，HC的CH1区的C-端经由基于G4S的接头(11个氨基酸)连接至dsscFv，且该HC与1519轻cκ链(LC)配对；类似地，对于LC Fab-dsscFv，LC的cκ区的C-端经由基于G4S的接头(11个氨基酸)连接至dsscFv，且这与1519CH1HC(无铰链)配对。使用1519Fab无铰链(nh)作为对照。
表3：本研究中使用的质粒
在hCMV启动子控制下将基因克隆至专有的哺乳动物表达载体中并使用CD CHO培养基(Life Technologies)和2mM glutamax转染至CHO-S XE细胞系(UCB)中用于瞬时表达。将培养物于37℃、8.0％CO2、140rpm下在Kuhner振荡器中孵育，且在细胞达到>2×105个细胞/ml时(约24h)，T℃降低至32℃。在转染后第3天，向每一烧瓶中无菌添加3mM丁酸钠(Sigma-Aldrich)/L转染。将培养物孵育总共14天。通过于4℃下以4000rpm将培养物离心1h收集上清液且经由0.2μm过滤器无菌过滤。通过蛋白质G HPLC使用1ml GE HiTrap蛋白质G柱子(GE Healthcare)和内部产生的Fab标准品定量表达滴度。如表4中所示，在与LC Fab-scFv比较时，观察到HC Fab-scFv的表达滴度增加约1.5倍。
表4：来自CHO S-XE细胞系中的瞬时表达的表达滴度
通过蛋白质G亲和力层析纯化抗体蛋白质。简言之，将上清液装载于HiTrap蛋白质G(GE Healthcare)上且随后用PBS pH 7.4洗涤。将结合材料用0.1M甘氨酸pH 2.7洗脱，且用2M Tris-HCl(pH 8.5)中和，之后将缓冲液更换为PBS pH 7.4。通过280nm处的吸光度定量所洗脱的蛋白质并储存于4℃下用于进一步分析。
使用粒径筛析层析(SE HPLC)以测定抗体的单体状态。将纯化的蛋白质样品(约20μg)装载至TSKgel G3000SW、10μm、7.5mm ID×300mm柱子(Tosoh)上并利用pH 7的0.2M磷酸盐的等度梯度以1mL/min显影。通过280nm处的吸光度连进行续检测。每一蛋白质的单体产率于表5中给出。
表5：通过抗体的SE HPLC测定的％单体
抗体 ％单体
1519Fab 55
Fab-dsscFv 1 47
Fab-dsscFv 2 40
对于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，样品通过向约2μg1519Fab或Fab-scFv的纯化蛋白质中添加4×Novex NuPAGE LDS样品缓冲液(LifeTechnologies)和10×NuPAGE样品还原剂(Life Technologies)或100mM N-乙基马来酰亚胺(Sigma-Aldrich)来制备，且将其加热至100℃持续3min。将样品装载至15孔Novex 4-20％Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Life Technologies)上并在Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液(Life Technologies)中于125V的恒定电压下分离110min。使用Novex Mark12宽范围蛋白质标准品(Life Technologies)作为标准品。将凝胶利用考马斯亮蓝(Sigma-Aldrich)在10％甲醇、7.5％乙酸中染色1h并利用如果干次更换蒸馏水脱色。显示具有约47kDa的理论分子量(MW)的1519Fab在非还原SDS-PAGE上具有较快移动性，而观察到非还原凝胶上的Fab-dsscFv较其各自理论MW(表6)迁移缓慢。这不是完全意外的，是先前于文献中报导且可归因于蛋白质的差异SDS结合和致密三级结构的观察。与蛋白质何时被还原无关，所有蛋白质均以接近其各自理论MW(表6)的迁移率迁移。
表6：蛋白质的MW
使用Vector NTI软件(Life Technologies)中提供的算法从氨基酸序列计算理论MW。观察到的MW是从Mark 12蛋白质标准品针对MW的迁移率图计算出来的。
实施例4 1735h5.hFab-scFv.768的生物物理性质
使1735h5.hFab-scFv.768分子经受一系列生物化学和生物物理分析以筛选用于开发的分子的稳健性和施用稳定性。分析包括用于确认完整质量和二硫化物布置的质谱、热稳定性(Tm)(在解折叠的中点处的熔融温度)；实验等电点(pI)和电荷变体、在空气-液体界面处的聚集稳定性(模拟制造中的剪切应力)和高浓度和粘度稳定性。比较1735h5.hFab-scFv.768的特征与等效Fab、FabFv和IgG4分子(如果可能，其包含与1735h5.hFab-scFv.768的Fab部分相同可变区序列)。
质谱分析
(i)通过使用具有C8富集柱子芯片的Agilent 6510 Q-Tof的质谱获得纯化1735h5.hFab-scFv.768的完整和减少质量。通过将样品用98％水(18.2兆欧)、2％超品级甲醇、0.3％甲酸稀释至0.15mg/mL获得完整质量。通过最初于37℃下将100μl样品以1mg/mL与10mM TCEP一起孵育45分钟、之后用98％水(18.2兆欧)、2％超品级甲醇、0.3％甲酸稀释至0.15mg/mL来获得减少质量。移动相A是水(18.2兆欧)中的0.1％甲酸；移动相B是80％异丙醇、20％乙腈、0.1％甲酸。使用Agilent’s MassHunter解卷积软件实施数据处理。完整和减少质量与理论值一致(表7)
表7：通过质谱测量的1735h5.hFab-scFv.768的完整质量分析和减小质量分析。
(ii)通过在非还原条件下的酶促消化、之后质谱分析确认二硫化物配对。通过于37℃下将2μL纯化1735h5.hFab-scFv.768(10mg/mL)与18μL 6M胍盐酸盐中的50mM碘乙酰胺一起孵育45分钟、之后添加40μL 25mM三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)(pH 7.5)加上1μL0.5mg/mL LysC(于提供的悬浮液缓冲液中)来实施消化。将此混合物于37℃下进一步孵育70分钟且随后用100μL 1mM氯化钙稀释。添加胰凝乳蛋白酶(1μL，于0.5mg/mL下，于1mM盐酸)中并将反应混合物于室温下孵育过夜。随后通过添加16μL10％甲酸淬灭反应。随后将样品以20uL/min并于55℃下使用Acquity uPLC和Fusion Orbitrap质谱仪施加至经95％溶剂A：5％溶剂B(1：1MeCN：1-丙醇/0.1％甲酸)平衡的1×150mm C18反相柱子。在洗脱期间以+ve-离子模式于15000分辨率下在700-4000m/z范围内收集Orbitrap MS数据。使用ThermoPepFinder软件处理数据。
观察1735h5.hFab-scFv.768分子的所有预测二硫键，其确认正确完整二硫化物配对。
热稳定性测量(Tm)
使用差示扫描量热法(DSC)使用Micro-Cal VP-Cap(GE Healthcare)在杜贝克氏(Dulbecco’s)磷酸缓冲盐水缓冲液(PBS)pH 7.4中测量熔融温度且与先前描述于WO2015/071330中的Fab和Fab-Fv分子比较。使用PBS pH 7.4将分子调节至1mg/ml且使用280nm处的吸光度使用Varian Cary 50-Bio分光亮度计确认最终浓度。使用机器人附件从96孔板取样抗体分子和空白缓冲液。实施具有空白缓冲液的两次扫描用于基线减除。分析从20℃至110℃以1℃/分钟的扫描速率使用被动反馈模式实施且使用Origin 7.0.(Microcal分析软件2.0版)来分析。
观察两个解折叠的结构域(参见图6)。于78.9℃下的第一解折叠事件对应于scFv结构域且于下84.8℃的第二解折叠事件对应于Fab结构域。发现scFv的熔融温度比对应的Fv高5.5℃，因此，scFv赋予1735h5.hFab-scFv.768形式较大稳定性。赋予分子的分子稳定性的Fab结构域的高熔融温度与对于母体Fab分子获得的相当，且因此，该形式不引起Fab结构域的热不稳定性。
实验pI和电荷变体的测定
使用全毛细管成像cIEF ICE3系统(ProteinSimple)测量实验pI。通过混合以下来制备样品：30μL样品(来自HPLC级水中的1mg/mL储存液)、35μL 1％甲基纤维素溶液(Protein Simple)、4μL pH3-10两性电解质(Pharmalyte)、0.5μL 4.65和0.5μL 9.77合成pI标记(ProteinSimple)、12.5μL 8M尿素溶液(Sigma-Aldrich)。使用HPLC级水以构成至100μL的最终体积。在分析之前将混合物短暂地涡旋以确保完全混合并以10,000rpm离心3分钟以移除空气泡。将样品于1.5kV下聚焦1分钟，之后于3kV下聚焦5分钟，且使用ProteinSimple软件获取毛细管的A280影像。首先使用iCE3软件分析所得电泳图且分配pI值(pI标记之间具有线性关系)。随后使用Empower软件(Waters)对经校准的电泳图进行积分。发现pI较高，为9.11，且类似于母体Fab分子(9.22)。酸性/碱性物质的百分比较低且与母体Fab分子相当。
在空气-液体界面处的聚集倾向
于25℃下在1.5mL eppendorfs中使用Eppendorf Mixmate将PBS pH 7.4中的1mg/mL的1735h5.hFab-scFv.768的纯化样品(3×250μl等份样品)以1400rpm涡旋。通过使用分光亮度计(Varian)获得595nm处的吸光度针对涡旋后在不同时间点的浊度生成来分析样品。针对时间绘制平均值595nm的曲线。发现直至48h涡旋，聚集倾向较低且等价于母体Fab。这显示此形式经由包含剪切应力(超滤)的制造步骤可展现与等价Fab分子类似的聚集稳定性。与等价IgG4形式相比，1735h5.hFab-scFv.768和母体Fab展示较慢的聚集速率。
浓度和粘度的效应
为确定1735h5.hFab-scFv.768是否可浓缩至>200mg/mL，使用Amicon超离心过滤器单元Ultra-4(分子量截止值10kDa)以3500g达45分钟将PBS pH 7.40中的4mL 21.5mg/mL的纯化材料浓缩至218.6mg/mL。过滤后，通过用于检测可溶性聚集物或片段的粒径排阻UPLC(2×Acquity BEH200 1.7μm，4.6mm×150mm串联柱子，0.3mL/分钟，等度，0.2M磷酸盐缓冲液pH 7.0)、用于检测不可溶性颗粒材料的动态光散射(Malvern Nano ZS)和用于聚集和片段化改变的SDS PAGE(使用4-20％Tris甘氨酸凝胶、125mV恒定电压的非还原和还原条件)分析样品。不存在由于浓度而聚集或片段化的证据。使用TA仪器DHR-1DiscoveryHybrid Rheometer以218.6mg/mL测量粘度。发现在PBS pH 7.4缓冲液(非优化预配制缓冲液)中的无限速率粘度(infinite rate viscosity)为9.9±0.46cP，此低于其选择配制缓冲液中的等价Fab分子(其为17.1±0.9cP)。已显示，1735h5.hFab-scFv.768可以以低粘度浓缩至高浓度。
总之，1735h5.hFab-scFv.768分子展现与母体Fab相当的良好生物物理特征。
实施例5 1735h5.hFab-scFv.768对hFcRn结合的亲和力
在Biacore T200系统(GE Healthcare)上实施使用表面等离子体共振技术(SPR)的生物分子相互作用分析且测定与人FcRn细胞外结构域的结合。提供了人FcRn细胞外结构域作为人FcRnα链细胞外结构域(SEQ ID NO：21)与β2微球蛋白(β2M)(SEQ ID NO：23)之间的非共价复合物。使用HBS-EP+(GE Healthcare)作为运行缓冲液经由胺偶合化学将10mMNaAc pH 5缓冲液中的50μg/ml的F(ab’)2特异性Affinipure F(ab’)2片段山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch Lab,Inc.)固定于CM5传感器芯片上达到4000-5000个反应单元(RU)的捕获水平。
使用50mM磷酸盐pH6+150mM NaCl+0.05％P20或HBS-P+pH7.4(GE Healthcare)作为运行缓冲液用于亲和力分析。将抗体1735h5.hFab-scFv.768在运行缓冲液中稀释至0.25μg/ml并使用10μl/min的60s注射进行由固定的抗人F(ab’)2的捕获。将人FcRn细胞外结构域在捕获的1735h5.hFab-scFv.768上以30μl/min从20nM滴定至1.25nM持续300s，之后进行600s的解离。以10μl/min对于pH6下的运行缓冲液通过2×60s 50mM HCl或对于pH7.4下的运行缓冲液通过60s 40mM HCl和30s 10mM NaOH再生表面。
使用Biacore T200评估软件(1.0版)使用具有局部Rmax的1：1结合模型分析数据。
表8在pH6.0和pH7.4下针对抗hFcRn 1735h5.hFab-scFv.768的亲和力数据
因此，1735h5.hFab-scFv.768对人FcRn的亲和力经测定在pH 6.0下为160pM且在pH7.4下为46pM。
实施例6基于功能细胞的测定
FcRn表达主要是在细胞内(Borvak J等人1998,Int.Immunol.,10(9)1289-98和Cauza K等人2005,J.Invest.Dermatol.,124(1),132-139)，且与内体和溶酶体膜相关。在酸性pH(<6.5)下而非在中性生理pH(7.4)下，IgG的Fc部分结合至FcRn(Rhagavan M等人1995)并且此pH依赖性促进IgG的再循环。
结合至FcRn的IgG在通过胞饮作用被吸收并进入酸性内吞体后，其将与FcRn一起再循环至细胞表面，而在生理中性pH下，将释放IgG。(Ober RJ等人2004,The Journal ofImmunology,172,2021-2029)。未结合至FcRn的任何IgG将进入溶酶体降解路径。
建立体外分析以检查1735h5.hFab-scFv.768抑制FcRn的IgG再循环能力的能力。简言之，将MDCK II克隆7细胞与生物素化的人IgG在1735h5.hFab-scFv.768存在和不存在下在酸性缓冲液(pH 5.9)中一起孵育以允许结合至FcRn。移除所有过量抗体并将细胞在中性pH缓冲液(pH 7.2)中孵育，所述缓冲液允许表面暴露、结合和内化的IgG释放至上清液中。使用MSD测定跟踪FcRn的抑制以检测被再循环且因此释放至上清液中的IgG的量。
图1显示1735h5.hFab-scFv.768抑制MDCK II克隆7细胞中的IgG再循环。将MDCKII克隆7细胞以25,000个细胞/孔平铺于96孔板中并于37℃、5％CO2下孵育过夜。次日，将细胞用HBSS+(Ca/Mg)pH 7.2+1％BSA洗涤一次。于37℃、5％CO2下在1735h5.hFab-scFv.768存在和不存在下在HBSS+(Ca/Mg)pH 5.9+1％BSA中将细胞孵育1小时，之后于37℃、5％CO2下与1μg/ml(500ng/ml最终浓度)的生物素化人IgG(Jackson)一起孵育1小时。将细胞用HBSS+pH5.9洗涤，随后于37℃、5％CO2下在HBSS+pH 7.2中孵育2小时。从细胞移出上清液并使用MSD分析(使用抗人IgG捕获抗体(Jackson)和链霉抗生物素蛋白-磺基标签揭示抗体(MSD))分析总IgG。如图1(其为代表性浓度反应曲线)中所示，41735h5.hFab-scFv.768以浓度依赖性方式以7.2nM的平均EC50值(n＝5)抑制IgG再循环。
实施例7 1735h5.hFab-scFv.768与非人灵长类动物FcRn的交叉反应性
在Biacore T200系统(GE Healthcare)上实施使用表面等离子体共振技术(SPR)的生物分子相互作用分析并测定与食蟹猴FcRn细胞外结构域的结合。食蟹猴FcRn细胞外结构域被提供为食蟹猴FcRnα链细胞外结构域(SEQ ID NO：17)与β2微球蛋白(β2M)(SEQ IDNO：18)之间的非共价复合物。使用HBS-EP+(GE Healthcare)作为运行缓冲液经由胺偶合化学将10mM NaAc pH 5缓冲液中的50μg/ml的F(ab’)2特异性Affinipure F(ab’)2片段山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch Lab,Inc.)固定于CM5传感器芯片上达到4000-5000个反应单元(RU)的捕获水平。
使用50mM磷酸盐pH6+150mM NaCl+0.05％P20或HBS-P+pH7.4(GE Healthcare)作为运行缓冲液用于亲和力分析。将抗体1735h5.hFab-scFv.768在运行缓冲液中稀释至0.5μg/ml并使用10μl/min的60s注射进行由固定的抗人F(ab’)2的捕获。将食蟹猴FcRn细胞外结构域在捕获1735h5.hFab-scFv.768上以30μl/min自20nM滴定至1.25nM持续300s，之后进行解离的600s。以10μl/min对于pH6下的运行缓冲液通过2×60s 50mM HCl或对于pH7.4下的运行缓冲液通过60s 40mM HCl和30s 10mM NaOH再生表面。
使用Biacore T200评估软件(1.0版)使用具有局部Rmax的1：1结合模型分析数据。
表9：抗hFcRn1735h5.hFab-scFv.768针对食蟹猴FcRn的在pH6.0和pH7.4的亲和力数据
因此，1735h5.hFab-scFv.768对食蟹猴FcRn的亲和力经测定于pH 6.0下为158pM且于pH7.4下为45pM。
实施例8 1735h5.hFab-scFv.768治疗增强hFcRn转基因小鼠中的hIgG的体内清除率
在人FcRn转基因小鼠(B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ,JAX小鼠)中测定1735h5.hFab-scFv.768对人IVIG的清除率的效应。向小鼠静脉内输注500mg/kg人IgG(人IgI 10％Gamunex-c，Talecris Biotherapeutics)。24小时后，以单一剂量(100mg/kg)向动物静脉内施用媒剂对照(PBS)或抗FcRn。相对于抗FcRn治疗，在-1、8、24、48、72、96、144和192小时获取连续尾端血样。通过LC-MS/MS测定hFcRn小鼠中的人IgG的血清水平。图2中提供的数据是平均值±SEM，其中5-6只小鼠/1735h5.hFab-scFv.768治疗组且PBS媒剂对照有2只小鼠。通过1735h5.hFab-scFv.768阻断hFcRn可加速hIVIG的清除率，且与对照小鼠相比，观察到较低浓度的总IgG。相对于对照小鼠，从24hr直至实验结束，对于1735h5.hFab-scFv.768的所有剂量，这样的降低的IgG浓度显著不同(p<0.01)。通过单向ANOVA和Tukeys后测试测量显著性。
尽管小鼠IgG不结合这样的转基因小鼠中存在的人FcRn，但内源性小鼠白蛋白结合人FcRn且通过人FcRn再循环。尽管在体外测定中抗人FcRn与人FcRn的结合不阻断白蛋白与FcRn的结合，但由于1735h5.hFab-scFv.768的白蛋白结合性质，评估了对内源性小鼠白蛋白的清除率的效应。数据示于图3中。由于血清中的白蛋白浓度是稍微可变的(在30只小鼠的组中从16.6mg/mL至59.9mg/mL，在注射抗FcRn药物之前)，为了允许更容易地比较组的结果，将白蛋白数据标准化并在图3中以在时间0时血清白蛋白浓度的百分比给出。1735h5.hFab-scFv.768在72小时后于100mg/kg和30mg/kg剂量下对白蛋白浓度具有中等效应(其于约25％下最大)且于10mg/kg下显示无效应。效应似乎是可逆的。
实施例9.1735h5.hFab-scFv.768治疗显示类似于IgG的药物动力学且优于小鼠中的Fab片段的预期PK的药物动力学
在正常小鼠中测定1735h5.hFab-scFv.768的PK。向12只雄性C57/B16小鼠施用1735h5.hFab-scFv.768的10mg/kg IV推注剂量(bolus dose)。以选择的间隔在每个时间点从4只动物获取血浆样品。通过LC/MS-MS分析针对1735h5.hFab-scFv.768的蛋白特异性肽测定1735h5.hFab-scFv.768的血浆浓度。使用非分室分析导出血浆药物动力学参数。图4中的数据显示，1735h5.hFab-scFv.768具有与小鼠中施用的典型人IgG的PK性质相当的PK性质。分布体积类似于血浆体积(34mL/kg)，终末半衰期(t1/2)为4.1天且血浆清除率(CL)为14mL/天/kg。
还在实施例7中所述的研究中在人FcRn转基因小鼠中评估1735h5.hFab-scFv.768的PK(B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ,JAX小鼠，静脉内输注500mg/kg人IgG并随后施用1735h5.hFab-scFv.768)。相对于1735h5.hFab-scFv.768治疗，在-24、8、24、48、72、96、144和192小时获取连续尾端血样，且通过LC-MS/MS测定1735h5.hFab-scFv.768的血清水平。图5中提供的数据是来自5只小鼠/治疗组的平均值±SEM，且显示1735h5.hFab-scFv.768的PK性质至少与具有相当功效和亲和力的整个IgG抗FcRn分子一样好。
序列表
<110> UCB Biopharma SPRL
<120> 抗-FcRn抗体
<130> PF0022
<150> GB1508180.5
<151> 2015-05-13
<160> 94
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1
<400> 1
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Val Gly Val Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2
<400> 2
Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn
1 5 10 15
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3
<400> 3
Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1
<400> 4
Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2
<400> 5
Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3
<400> 6
Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2变体
<400> 7
Val Ala Lys Thr Leu Gln Glu
1 5
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1638 gL7 V-区
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1638 gH33 V-区
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1638 gL7 轻链
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码gL7轻链的DNA
<400> 11
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60
attacctgtc gcactagcga ggacatctac accaacctgg cgtggtatca gcagaaacca 120
ggcaaagtgc cgaaactgct gatctacgtc gcgaaaaccc tccaggaagg tgtaccgtct 180
cgcttttccg gctctggtag cggtactcac tacaccctga ccatctcttc cctccagccg 240
gaagatgttg ctacctacta ttgcctccag ggcttcaaat tcccgtggac tttcggtggc 300
ggcacgaaag tggaaatcaa acggaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480
gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc 642
<210> 12
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1638 gH33 Fab-dsscFv (1735h5.hFab-scFv.768 ) 重链氨基酸序列
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
225 230 235 240
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
245 250 255
Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn
260 265 270
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile
275 280 285
Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe
290 295 300
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val
325 330 335
Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr
340 345 350
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
355 360 365
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
370 375 380
Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
385 390 395 400
Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln
405 410 415
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
435 440 445
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
450 455 460
Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr Phe Gly
465 470 475 480
Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
485 490
<210> 13
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码1638 gH33 Fab-dsscfv (1735h5.hFab-scFv.768 )重链的DNA
<400> 13
gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc 60
tcttgtgcag cgtccggctt ctctctgtct acctacggcg ttggtgttgg ttgggtacgt 120
caggctccag gtaaaggtct ggaatggctc gcaaacatct ggtgggacga cgataaacgc 180
tacaacccgt ccctggagaa ccgcttcacc attagccgtg ataacgcgaa aaactccgcg 240
tatctccaga tgaactccct gcgtgccgaa gacacggctg tgtactattg cgcgcgcact 300
ccggcgtact atggctctca cccaccgttt gattactggg gtcagggtac aatggttacc 360
gtctcgtctg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420
acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccagtg 480
acggtgtcgt ggaactcagg tgccctgacc agcggcgttc acaccttccc ggctgtccta 540
cagtcttcag gactctactc cctgagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt cgataagaaa 660
gttgagccca aatcttgtag tggaggtggg ggcaccggtg gaggtggcag cgaggttcaa 720
ctgcttgagt ctggaggagg cctagtccag cctggaggga gcctgcgtct ctcttgtgca 780
gtaagcggca tcgacctgag caattacgcc atcaactggg tgagacaagc tccggggaag 840
tgtttagaat ggatcggtat aatatgggcc agtgggacga ccttttatgc tacatgggcg 900
aaaggaaggt ttacaattag ccgggacaat agcaaaaaca ccgtgtatct ccaaatgaac 960
tccttgcgag cagaggacac ggcggtgtac tattgtgctc gcactgtccc aggttatagc 1020
actgcaccct acttcgatct gtggggacaa gggaccctgg tgactgtttc aagtggcgga 1080
gggggtagtg gagggggtgg ctctgggggt ggcggaagcg gtggcggggg ttctgacata 1140
caaatgactc agtctccttc atcggtatcc gcgtccgttg gcgatagggt gactattaca 1200
tgtcaaagct ctcctagcgt ctggagcaat tttctatcct ggtatcaaca gaaaccgggg 1260
aaggctccaa aacttctgat ttatgaagcc tcgaaactca ccagtggagt tccgtcaaga 1320
ttcagtggct ctggatcagg gacagacttc acgttgacaa tcagttcgct gcaaccagag 1380
gactttgcga cctactattg tggtggaggt tacagtagca taagtgatac gacatttggg 1440
tgcggtacta aggtggaaat caaacgtacc 1470
<210> 14
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1638 gH33 重链
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys
225
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合 dsscFv 重链
<400> 15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合 dsscFv 轻链
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 17
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cyno FcRnα链胞外序列
<400> 17
Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser
1 5 10 15
Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro
20 25 30
Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asp Ser Leu Arg Gly Gln Ala Glu Pro Cys
35 40 45
Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu
50 55 60
Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys
65 70 75 80
Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys
85 90 95
Glu Leu Ser Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu
100 105 110
Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly
115 120 125
Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln
130 135 140
Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro
145 150 155 160
His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp
165 170 175
Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn Pro Gly
180 185 190
Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu
195 200 205
Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Met Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly
210 215 220
Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu
225 230 235 240
Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His
245 250 255
Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Thr Pro Ala Lys
260 265 270
Ser Ser
<210> 18
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cyno B2-微球蛋白
<400> 18
Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu
1 5 10 15
Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro
20 25 30
Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Lys Met Gly Lys
35 40 45
Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu
50 55 60
Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Asn Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys
65 70 75 80
Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gly Pro Arg Thr Val Lys Trp Asp
85 90 95
Arg Asp Met
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IGKV1-27 JK4 受体框架
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IGHV3-7 JH3 受体框架
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 21
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人FcRn α链胞外序列
<400> 21
Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser
1 5 10 15
Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro
20 25 30
Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys
35 40 45
Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu
50 55 60
Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys
65 70 75 80
Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys
85 90 95
Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu
100 105 110
Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly
115 120 125
Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln
130 135 140
Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro
145 150 155 160
His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp
165 170 175
Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly
180 185 190
Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu
195 200 205
Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly
210 215 220
Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu
225 230 235 240
Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His
245 250 255
Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys
260 265 270
Ser Ser
<210> 22
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠B2M
<400> 22
Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu
1 5 10 15
Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gln Phe His Pro
20 25 30
Pro Gln Ile Glu Ile Glu Leu Leu Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Asn
35 40 45
Ile Glu Met Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile
50 55 60
Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp Val Tyr Ala Cys
65 70 75 80
Arg Val Lys His Val Thr Leu Lys Glu Pro Lys Thr Val Thr Trp Asp
85 90 95
Arg Asp Met
<210> 23
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含信号序列的人B2M
<400> 23
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg
20 25 30
His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser
35 40 45
Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu
50 55 60
Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp
65 70 75 80
Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp
85 90 95
Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile
100 105 110
Val Lys Trp Asp Arg Asp Met
115
<210> 24
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人B2-微球蛋白
<400> 24
Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu
1 5 10 15
Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro
20 25 30
Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys
35 40 45
Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu
50 55 60
Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys
65 70 75 80
Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp
85 90 95
Arg Asp Met
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1638gL2 V
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1638 gL2 轻链 (V + 恒定)
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 27
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1638gH2 V-区
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1638 gH2 Fab 重链 (V + 人γ-1 CH1 无铰链)
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys
225
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 31
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 32
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 33
Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 34
Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala
1 5
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 35
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 36
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 36
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 37
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 37
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
20 25
<210> 38
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 38
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr Leu
1 5 10 15
Tyr Asn Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 39
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 39
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His
1 5 10 15
Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 40
Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
<210> 41
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 41
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp
1 5 10 15
Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
20 25
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 42
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 43
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 44
Asp Lys Thr His Thr Ser
1 5
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 46
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 47
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 47
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 48
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 48
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 49
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 49
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 50
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 51
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10 15
<210> 52
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 52
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Ala Ser
20
<210> 53
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 53
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25
<210> 54
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 54
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25 30
<210> 55
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 55
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 56
Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr
1 5 10 15
Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
20 25
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 57
Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr
1 5 10
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 58
Ala Thr Thr Thr Gly Ser
1 5
<210> 59
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 59
Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu
1 5 10 15
Ser His Lys Ser Pro
20
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 60
Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
1 5 10 15
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 61
Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 62
Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 63
Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 64
Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 65
Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 66
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 66
Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 67
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 67
Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val
1 5 10 15
Arg Pro
<210> 68
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 68
Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu
1 5 10 15
Thr Thr
<210> 69
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 69
Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr
1 5 10 15
Phe Asn
<210> 70
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 70
Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 71
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 71
Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile
1 5 10 15
Arg Thr
<210> 72
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 72
Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala
1 5 10 15
Phe Gly
<210> 73
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 73
Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu
1 5 10 15
Gly Ala
<210> 74
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 74
Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro
1 5 10 15
Asp Leu
<210> 75
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 75
Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro
1 5 10 15
Ser Leu
<210> 76
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 76
Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg
1 5 10 15
Ile Ser
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 77
Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Pro
<210> 78
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 78
Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 79
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 79
Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro
1 5 10 15
Pro Tyr
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 80
Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 81
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 81
Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 82
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 82
Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr
1 5 10 15
Phe Pro
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 83
Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 84
Pro Pro Pro Pro
1
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体645的CDRH1序列
<400> 85
Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体645的CDRH2序列
<400> 86
Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 87
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体645的CDRH3序列
<400> 87
Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 88
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体645的CDRL1序列
<400> 88
Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
1 5 10
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体645的CDRL2序列
<400> 89
Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser
1 5
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体645的CDRL3序列
<400> 90
Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr
1 5 10
<210> 91
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1519 gL20 V-区
<400> 91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val Gly Ala
20 25 30
Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 92
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1519 gL20 轻链 (V + 恒定)
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val Gly Ala
20 25 30
Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 93
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1519 gH20 V-区
<400> 93
Glu Val Pro Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Gly Ile Val Arg Pro Phe Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 94
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1519gH20 Fab 重链 (V + 人γ-1 CH1 无铰链)
<400> 94
Glu Val Pro Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Gly Ile Val Arg Pro Phe Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220

Claims (26)

1.一种抗FcRn抗体融合蛋白，其包含直接或经由接头连接至scFv的Fab片段，其中所述Fab片段结合FcRn且所述scFv结合血清载体蛋白。
2.一种抗FcRn抗体融合蛋白，其包含直接或经由接头连接至scFv的Fab片段，其中所述Fab片段包含重链和轻链，其中所述重链的可变区包含3个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：1中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：2中给出的序列，且CDR H3具有SEQ ID NO：3中给出的序列，且所述轻链的可变区包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：4中给出的序列，CDRL2具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中给出的序列且CDR L3具有SEQ ID NO：6中给出的序列。
3.权利要求2的抗FcRn抗体融合蛋白，其中所述Fab片段的重链包含SEQ ID NO：9中给出的序列且所述Fab片段的轻链包含SEQ ID NO：8中给出的序列。
4.权利要求2或3的抗FcRn抗体融合蛋白，其中所述Fab片段的重链包含SEQ ID NO：14中给出的序列且所述Fab片段的轻链包含SEQ ID NO：10中给出的序列。
5.权利要求1至4中任一项的抗FcRn抗体融合蛋白，其中所述scFv结合白蛋白。
6.权利要求5的抗FcRn抗体融合蛋白，其中所述scFv结合人血清白蛋白。
7.权利要求1至6中任一项的抗FcRn抗体融合蛋白，其中所述scFv的重链可变结构域和轻链可变结构域通过任何合适的接头例如SEQ ID NO：30中给出的接头连接。
8.权利要求1至7中任一项的抗FcRn抗体融合蛋白，其中所述scFv直接或经由接头连接至所述Fab片段的重链的C端或轻链的C端。
9.权利要求1至8中任一项的抗FcRn抗体融合蛋白，其中所述scFv经由具有SEQ ID NO：33中给出的序列的接头连接至所述Fab片段的重链的C端。
10.权利要求1至9中任一项的抗FcRn抗体融合蛋白，其中所述scFv包含重链可变结构域和包含轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含3个CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：85中给出的序列，CDR H2具有SEQ ID NO：86中给出的序列，且CDR H3具有SEQ ID NO：87中给出的序列，所述轻链可变结构域包含3个CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：88中给出的序列，CDR L2具有SEQ ID NO：89中给出的序列且CDR L3具有SEQ ID NO：90中给出的序列。
11.权利要求1至10中任一项的抗FcRn抗体融合蛋白，其中所述scFv是二硫键稳定的scFv(dsscFv)。
12.权利要求11的抗FcRn抗体融合蛋白，其中所述dsscFv包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO：15中给出的序列，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：16中给出的序列。
13.权利要求12的抗FcRn抗体融合蛋白，其具有包含SEQ ID NO：12中给出的序列的重链和包含SEQ ID NO：10中给出的序列的轻链。
14.一种结合人FcRn的抗FcRn抗体融合蛋白，其包含重链，其中所述重链包含与SEQ IDNO：12中给出的序列具有至少80％同一性或相似性的序列，且其中所述轻链包含与SEQ IDNO：10中给出的序列具有至少80％同一性或相似性的序列。
15.权利要求14的抗FcRn融合蛋白，其中所述抗体Fab片段的CDR-H1具有SEQ ID NO：1中给出的序列、CDR-H2具有SEQ ID NO：2中给出的序列、CDR-H3具有SEQ ID NO：3中给出的序列、CDR-L1具有SEQ ID NO：4中给出的序列、CDR-L2具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中给出的序列，且CDR-L3具有SEQ ID NO：6中给出的序列。
16.一种经分离的DNA序列，其编码权利要求1至15中任一项的抗体融合蛋白的重链和/或轻链。
17.一种克隆或表达载体，其包含一个或多个权利要求16的DNA序列。
18.权利要求17的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO：11中给出的序列和SEQ ID NO：13中给出的序列。
19.一种宿主细胞，其包含一个或多个权利要求17或18的克隆或表达载体。
20.一种产生对人FcRn具有结合特异性的抗体融合蛋白的方法，其包括培养权利要求19的宿主细胞和分离所述抗体融合蛋白。
21.一种药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的权利要求1至15中任一项的抗FcRn抗体融合蛋白。
22.权利要求21的药物组合物，其包含其他活性成分。
23.权利要求1至15中任一项的抗体融合蛋白或权利要求21或22的组合物，其用于治疗。
24.权利要求1至15中任一项的抗体融合蛋白或权利要求21或22的组合物，其用于治疗自身免疫疾病，例如重症肌无力、寻常天疱疮、视神经脊髓炎、格林-巴利综合征、狼疮、特发性血小板减少紫癜和血栓性血小板减少性紫癜。
25.一种治疗患者的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求1至15中任一项所定义的抗体或其结合片段或权利要求21或22所定义的组合物。
26.权利要求25的方法，其中所述治疗是用于自身免疫疾病，例如重症肌无力、寻常天疱疮、视神经脊髓炎、格林-巴利综合征、狼疮、特发性血小板减少紫癜和血栓性血小板减少性紫癜。
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