KR20180002747A - 항-fcrn 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 FcRn에 특이적인 항체 융합 단백질, 이러한 항체 융합 단백질을 포함하는 제형, 치료법에서의 이들 각각의 용도, 상기 항체를 발현시키고 선택적으로 제형화하는 방법, 이러한 항체를 코딩하는 DNA, 및 상기 DNA를 포함하는 숙주에 관한 것이다.

Description

항-FCRN 항체
본 발명은 FcRn에 특이적인 항체, 이러한 항체를 포함하는 제형, 치료법에서의 이들 각각의 용도, 상기 항체를 발현시키고 선택적으로 제형화하는 방법, 이러한 항체를 코딩하는 DNA, 및 상기 DNA를 포함하는 숙주에 관한 것이다.
FcRn은 막 단백질 FcRn α 사슬과 β2 마이크로글로불린(β2M)의 비공유 복합체이다. 성인 포유류에서, FcRn은 IgG 아이소타입의 항체에 결합하고 보유(salvage)하는 수용체로서 작용함으로써 혈청 항체 수준을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. IgG 분자는 내피 세포에 의해 세포내이입되며, 만약 IgG 분자가 FcRn에 결합한다면 통과세포외배출(transcytosed)되어 예를 들어 순환 내로 재순환된다. 이와는 대조적으로, FcRn에 결합하지 않은 IgG 분자는 세포 내로 들어가, 이러한 IgG 분자가 분해되는 리소좀 경로로 표적화된다. His435가 알라닌으로 돌연변이화된 변이체 IgG1은 FcRn 결합을 선택적으로 상실하여, 혈청 반감기가 상당히 감소된다(문헌[Firan et al. 2001, International Immunology 13:993]).
FcRn은, 적어도 부분적으로는 자가항체에 의해 유발되는 소정의 자가면역 장애에 대한 잠재적인 치료 표적인 것으로 가정된다. 소정의 이러한 장애에 대한 현재의 치료는 혈장사혈(plasmapheresis)을 포함한다. 이따금 혈장사혈은 이러한 질병의 장기간 관리를 위해 면역억제 치료법과 함께 이용된다. 혈장 교환은 유해 자가항체의 제거를 위한 가장 신속한 단기 해결안을 제공한다. 그러나, 프레드니손, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸, 리툭시맙 또는 이들의 혼합물과 같은 약제의 사용에 의해, 면역계에 의한 자가항체의 생성을 억제하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
혈장사혈에 의해 치료될 수 있는 질병의 예로는, 길랭-바레 증후군; 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증; 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome); 과다점성 증후군(hyperviscosity syndrome); 한랭글로불린혈증; 파라단백혈증; 발텐스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia); 중증 근무력증; 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP)/용혈성 요독성 증후군; 베게너 육아종증; 람베르트-이튼 증후군; 항인지질 항체 증후군(APS 또는 APLS); 현미경적 다발혈관염; 이식된 신장에서 재발한 초점성 및 분절성 사구체경화증; HELLP 증후군; PANDAS 증후군; 레프섬병; 베체트 증후군; HIV-관련 신경병증; 영유아 및 신생아에서의 그레이브스병; 심상성 천포창; 다발성 경화증, 횡문근융해 및 동종면역 질병(alloimune disease) 등이 있다.
이따금 혈장사혈은 예를 들어 중증 부작용을 감소시키기려는 응급 상황에서 Fc-함유 치료제의 제거를 위한 구제 치료법(rescue therapy)으로서 사용된다.
혈장사혈이 소정의 의학적 조건에서 유익하다고 하더라도, 이러한 치료법과 연관된 잠재적인 위험 및 합병증이 존재한다. 꽤 큰 정맥내 카테터의 삽입은 출혈, (카테터의 삽입 부위에 따라) 폐 천공을 초래할 수 있으며, 카테터가 너무 길게 남겨지는 경우 감염 및/또는 정맥에의 손상을 초래하여, 시술의 반복 기회를 제한할 수 있다.
이러한 시술은 이와 연관된 추가의 합병증을 가지는데, 예를 들어 환자의 혈액이 신체의 외부에서 혈장사혈 장치를 통과하는 경우, 혈액이 응고하는 경향이 있다. 이러한 경향을 감소시키기 위해, 하나의 보편적인 프로토콜에서, 혈액이 회로(circuit)를 통해 진행되는 동안 시트레이트를 주입한다. 시트레이트는 혈액 내 칼슘에 결합하며, 칼슘은 혈액 응고에 필수적이다. 시트레이트가 혈액 응고를 방지하는 데 매우 효과적이지만; 이의 사용은 생명을 위협할 정도로 낮은 칼슘 수준을 초래할 수 있다. 이는 크보스테크 징후(Chvostek's sign) 또는 트루소 징후(Trousseau's sign)를 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 합병증을 방지하기 위해, 환자가 혈장사혈을 받는 동안 칼슘을 정맥 내로 주입하고; 또한, 입을 통해 칼슘 보충제를 제공할 수도 있다.
이러한 시술의 다른 합병증으로는, 저혈압; 수혈 반응 또는 수혈에 의해 전파되는 질병의 위험이 있는 혈액 생성물에의 잠재적인 노출, 환자의 면역계의 억제, 및 주사 바늘 배치로 인한 출혈 또는 혈종 등이 있다.
부가적으로, 혈장사혈을 제공하는 설비가 제한되고, 시술이 매우 비싸다.
혈장사혈에 대한 대안으로는 정맥내 면역글로불린(IVIG)이 있으며, 이는 1,000명이 넘는 혈액 공여자들의 혈장으로부터 추출된 풀링된(pooled) 폴리클로날 IgG를 함유하는 혈액 생성물이다. 이 치료법은 정맥내로 투여되고, 2주 내지 3개월 동안 지속된다.
IVIG 치료의 합병증으로는, 두통, 피부염, 치료 생성물의 오염으로 인한 바이러스 감염, 예를 들어 HIV 또는 간염, 폐부종, 알레르기 반응, 급성 신부전, 정맥 혈전증 및 무균 수막염 등이 있다.
따라서, 침습성이 낮으며 환자를 더 적은 의학적 합병증에 노출시키는, 자가면역 장애 치료법에 대한 충족되지 않은 요망이 상당히 존재한다.
따라서, 침습성이 낮으며 환자를 더 적은 의학적 합병증에 노출시키는, 면역학적 장애 및/또는 자가면역 장애 치료법에 대한 충족되지 않은 요망이 상당히 존재한다.
이에, IgG가 FcRn에 결합하는 것을 차단하거나 감소시키는 제제가 이러한 자가면역 및 염증성 질병의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 항-FcRn 항체는 WO2009/131702, WO2007/087289, WO2006/118772, WO2014/019727 및 WO2014/204280에 이미 기재되어 있다.
본 발명은 직접적으로 또는 링커를 통해 scFv에 연결된 Fab 단편을 포함하는 항-FcRn 항체 융합 단백질을 제공하며, 여기서, Fab 단편은 FcRn에 결합하고, scFv는 혈청 담체 단백질, 예컨대 알부민에 결합한다. 일례에서, scFv는 이황화 안정화된 scFv(dsscFv)이다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 직접적으로 또는 링커를 통해 scFv에 연결된 Fab 단편을 포함하는 항-FcRn 항체 융합 단백질을 제공하며, 여기서, Fab 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 중쇄의 가변 영역은 3개의 CDR을 포함하고, CDR H1은 서열 번호 1에 제시된 서열을 가지며, CDR H2는 서열 번호 2에 제시된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호 3에 제시된 서열을 가지고, 경쇄의 가변 영역은 3개의 CDR을 포함하며, CDR L1은 서열 번호 4에 제시된 서열을 가지며, CDR L2는 서열 번호 5 또는 서열 번호 7에 제시된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호 6에 제시된 서열을 가진다.
특히, 본 발명은, scFv 또는 dsscFv가 알부민에 결합하고, 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-FcRn 항체 융합 단백질을 제공하며, 여기서, CDR H1은 서열 번호 85에 제시된 서열을 가지며, CDR H2는 서열 번호 86에 제시된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호 87에 제시된 서열을 가지고, CDR L1은 서열 번호 88에 제시된 서열을 가지며, CDR L2는 서열 번호 89 또는 서열 번호 7에 제시된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호 90에 제시된 서열을 가진다.
특히, 본 발명은 scFv가 이황화 안정화되어 있는 항-FcRn 항체 융합 단백질을 제공하며, 상기 융합 단백질은 서열 번호 12에 제시된 서열을 가진 중쇄 및 서열 번호 10에 제시된 서열을 가진 경쇄를 포함한다.
본 발명의 항체는 IgG가 FcRn에 결합하는 것을 차단하고, 순환중인 항체의 반감기를 감소시키는 것을 포함하여 FcRn의 하나 이상의 생물학적 기능을 감소시키는 데 유용한 것으로 생각된다. 이는 환자로부터 항체, 예컨대 자가항체가 보다 신속하게 제거될 수 있게 한다는 점에서 유익할 수 있다. 이에, 본 발명의 항체는 IgG가 FcRn에 결합하는 것을 감소시킨다.
중요하게는, 본 발명의 항체는 인간 FcRn에, 예를 들어 pH6 및 pH7.4 둘 다에서 유사하면서도 높은 결합 친화성으로 결합할 수 있다. 따라서, 유리하게는 본 항체는 엔도좀 내에서조차 FcRn에 계속 결합할 수 있어서, IgG에의 FcRn 결합의 차단을 최대화한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 결합 단편은 인간 IgG가 인간 FcRn에 결합하는 것을 차단한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 결합 단편은 β2 마이크로글로불린에 결합하지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 결합 단편은 인간 β2 마이크로글로불린에 결합하지 않는다.
일례에서, 본 발명의 항체 및 결합 단편은 순환중인 알부민 수준을 50% 초과만큼, 바람직하게는 25% 이하만큼 감소시키지 않는다.
일례에서, 본 발명의 항체 및 결합 단편은 순환중인 알부민 수준을 감소시키지 않는다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 DNA까지 확장되며, 예를 들어 DNA는 벡터 내로 혼입된다.
본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 항체 또는 단편의 발현 방법을 제공하며, 항체 또는 단편을 중합체, 예컨대 PEG에 컨쥬게이션시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 및 단편을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체, 단편 또는 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 치료, 특히 면역학적 및/또는 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 항체, 단편 또는 조성물까지 확장된다.
따라서, 본 발명은 병원성 IgG의 제거를 위한 항체, 이의 단편 및 방법을 제공하며, 이러한 제거는 IgG를 이화작용시키는 신체의 자연적인 메커니즘을 가속화함으로써 달성된다.
본질적으로, 본 발명에 따른 항체 및 단편은 신체에서 IgG을 재순환시키는 시스템을 차단한다.
본 발명의 치료법은, 혈장사혈이 치료법 또는 IVIg 치료법인 소정의 질병에 대한 대체안 또는 보충안을 제공하는 것으로 보이며, 이는 환자에게 유리하다.
도 1은, 1735h5.hFab-scFv.768이 MDCK II 클론 7 세포에서 IgG 재순환을 저해함을 보여준다.
도 2는 인간 FcRn-유전자 도입 마우스의 혈청에서 인간 IVIg의 농도에 미치는 1735h5.hFab-scFv.768의 효과를 보여준다.
도 3은 인간 FcRn-유전자 도입 마우스에서 혈청 알부민의 농도에 미치는 1735h5.hFab-scFv.768의 효과를 보여준다.
도 4는 정상 마우스에서 1735h5.hFab-scFv.768의 약물 동력학을 보여준다.
도 5는 인간 FcRn-유전자 도입 마우스에서 1735h5.hFab-scFv.768의 약물 동력학을 보여준다.
도 6은 부모 Fab 및 동등한 Fab-Fv와 비교하여, 1735h5.hFab-scFv.768(Fab-scFv)의 열적 안정성을 보여준다.
도 7은 본 발명의 Fab-scFv 및 Fab-dsscFv 단편 포맷을 보여준다.
도 8은 본 발명에 따른 항체 서열을 보여준다.
도 9a는 항체 1638.g49의 인간화를 보여준다.
도 9b는 항체 1638.g49의 인간화를 보여준다.
본원에 이용된 바와 같은 FcRn은 신생아(neonatal) Fc 수용체로도 알려져 있는 인간 IgG 수용체 알파 사슬들 사이의 비공유 복합체를 지칭하며, 이의 아미노산 서열은 UniProt에서 번호 P55899 하에 존재하며, 이의 세포외 도메인(서열 번호21)은 도 8에서 인간 β2 마이크로글로불린(β2M)과 함께 제공되어 있으며, 이러한 β2M의 아미노산 서열은 UniProt에서 번호 P61769 하에 존재한다(본원에서 신호 펩타이드와 함께 제공되며(서열 번호23), 또는 신호 펩타이드 없이 제공됨(서열 번호24)).
본원에 이용된 바와 같은 항체 분자는 항체 또는 이의 결합 단편을 지칭하며, 이는 항체 융합 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 '항체'는 일반적으로, 온전한(전체) 항체, 즉 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 요소들을 포함하는 항체에 관한 것이다. 항체는 예를 들어 WO 2007/024715에 개시된 바와 같이 분자 DVD-Ig에 따라 추가의 부가적인 결합 도메인 또는 WO2011/030107에 기재된 소위 (FabFv)2Fc를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 이용된 바와 같은 항체는 2가, 3가 또는 4가 전장 항체를 포함한다.
항체의 결합 단편은 단일 사슬 항체(즉, 전장 중쇄 및 경쇄); Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, 단일 도메인 항체(예를 들어 VH, VL 또는 VHH), scFv, dsscFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, Bis-scFv, 다이아바디(diabody), 트리바디, 트리아바디(triabody), 테트라바디 및 상기들 중 임의의 에피토프-결합 단편을 포함한다(예를 들어 문헌[Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136]; [Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참조). 이들 항체 단편의 형성 및 제작 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어 문헌[Verma et al., 1998, Journal of Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조). Fab-Fv 포맷은 처음에 WO2009/040562에서 개시되었으며, 이의 이황화 안정화된 버전인 Fab-dsFv는 처음에 WO2010/035012에서 개시되었다. 본 발명에 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 출원 WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성, 예를 들어 이중 특이성을 포함할 수 있거나 단일특이성일 수 있다(예를 들어 WO92/22583 및 WO05/113605 참조). 단일특이성 항체의 이러한 일례는 WO92/22583에 기재된 바와 같이 트리-Fab(또는 TFM)이다.
항체 단편은 또한, 예를 들어 WO2013/068571의 실시예 4 및 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같고 본원의 도 7에 예시된 바와 같이 Fab-scFv 단편 및 Fab-dsscFv 단편을 포함한다. 이러한 단편 또한, 본원에서 '항체 융합 단백질'로 지칭된다.
일례에서, 본 발명은 직접적으로 또는 링커를 통해 dsscFv에 연결된 Fab 단편을 포함하는 항-FcRn 항체 융합 단백질을 제공하며, 여기서, Fab 단편은 FcRn에 결합하고, dsscFv는 혈청 담체 단백질, 예컨대 알부민에 결합한다. 이에, 본 발명의 항체 융합 단백질은 FcRn에 대해 1가이다. Fab 단편은 임의의 적합한 항-FcRn 항체 분자로부터 유래될 수 있고, dsscFv는 임의의 적합한 알부민 결합 항체 분자로부터 유래될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 직접적으로 또는 링커를 통해 scFv에 연결된 Fab 단편을 포함하는 항-FcRn Fab-scFv 또는 Fab-dsscFv 항체 단편 또는 항체 융합 단백질을 제공하며, 여기서, Fab 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 중쇄의 가변 영역은 3개의 CDR을 포함하고, CDR H1은 서열 번호 1에 제시된 서열을 가지며, CDR H2는 서열 번호 2에 제시된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호 3에 제시된 서열을 가지고, 경쇄의 가변 영역은 3개의 CDR을 포함하고, CDR L1은 서열 번호 4에 제시된 서열을 가지며, CDR L2는 서열 번호 5 또는 서열 번호 7에 제시된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호 6에 제시된 서열을 가진다.
본 발명에 사용하기 위한 전형적인 Fab 분자는 중쇄 및 경쇄 쌍을 포함하며, 여기서, 중쇄는 가변 영역 VH 및 불변 도메인 CH1을 포함하며, 이는 사슬간 시스테인에서 종료될 수 있고, 경쇄는 가변 영역 VL 및 불변 도메인 CL을 포함한다.
하나 이상의(예를 들어 1개, 2개, 3개 또는 4개의) 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실이, FcRn에의 항체의 결합 능력을 유의하게 변경시키지 않으면서, 본 발명에 의해 제공되는 CDR 또는 다른 서열(예를 들어 가변 도메인)에 수행될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 임의의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실의 효과는 FcRn 결합/차단을 확인하기 위해, 예를 들어 본원, 특히 실시예에 기재된 방법을 사용하여 당업자에 의해 쉽게 시험될 수 있다.
일례에서, 하나 이상의(예를 들어 1개, 2개, 3개 또는 4개의) 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실은 본 발명에 의해 제공되는 항체 또는 단편에 이용되는 프레임워크 영역에 수행될 수 있고, 여기서, FcRn에의 결합 친화성은 유지되거나 증가된다.
항체 가변 도메인 내 잔기는 통상, Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 넘버링된다. 이 시스템은 문헌[Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA(이하 "Kabat 등(상기)")]에 나타나 있다. 이러한 넘버링 시스템은 다르게 지시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된다.
Kabat 잔기 지정이 항상, 아미노산 잔기의 선형 넘버링과 직접 상응하는 것은 아니다. 실제 선형 아미노산 서열은 엄격한 Kabat 넘버링에서보다 더 적은 수의 아미노산 또는 부가적인 아미노산을 함유할 수 있으며, 이는 기본 가변 도메인 구조의 구조 구성성분이 프레임워크 또는 상보성 결정 영역(CDR)이든지 간에 이러한 구성성분의 단축 또는 구성성분 내로의 삽입에 상응한다. 잔기의 올바른 Kabat 넘버링은 제시된 항체에 대해, 상기 항체의 서열에서의 상동성 잔기를 "표준" Kabat 넘버링된 서열과 함께 정렬함으로써 확인될 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따르면 잔기 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 위치한다. 그러나, Chothia(문헌[Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)])에 따르면, CDR-H1에 동등한 루프는 잔기 26으로부터 잔기 32까지 이어진다. 따라서, 다르게 지시되지 않는 한, 본원에 이용된 바와 같이 'CDR-H1'은 Kabat 넘버링 시스템과Chothia의 위상적 루프 정의(topological loop definition)의 조합에 의해 기재된 바와 같이 잔기 26 내지 35를 지칭하고자 한다.
경쇄 가변 도메인의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 잔기 24-34(CDR-L1), 잔기 50-56(CDR-L2) 및 잔기 89-97(CDR-L3)에 위치한다.
본 발명의 항체 및 단편은 FcRn을 차단하고, 이로써 FcRn이 IgG의 재순환에 작용하는 것을 방지할 수 있다. 본원에 이용된 바와 같이 차단은 수용체를 폐쇄시키는 것과 같은 물리적 차단을 지칭하지만, 항체 또는 단편이 에피토프에 결합하여 예를 들어 구조적 변화를 유발하는 것을 또한 포함할 것이며, 이는 수용체에 대한 천연 리간드가 더 이상 결합하지 못함을 의미한다. 본 발명의 항체 분자는 FcRn에 결합하고, 이로써 FcRn이 IgG 불변 영역에 결합하는 것을 감소시키거나 방지한다(예를 들어 저해한다).
일 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 IgG와 경쟁적으로 FcRn에 결합한다.
일례에서, 본 발명의 항체 융합 단백질은 인간 FcRn이 인간 IgG에 결합하는 것에 대해 경쟁적 저해제로서 작용한다. 일례에서, 항체 융합 단백질은 FcRn 상의 IgG 결합 부위에 결합한다. 일례에서, 항체 융합 단백질은 IgG 결합 부위를 차단한다. 일례에서, 항체 융합 단백질은 β2M에 결합하지 않는다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 수득될 수 있다. FcRn 폴리펩타이드/단백질을 포함하는 융합 단백질, 이러한 폴리펩타이드를 (재조합적으로 또는 자연적으로) 발현하는 세포(예컨대 섬유아세포)가, 단독으로 또는 β2M과 조합하여 FcRn을 특이적으로 인지하는 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드는 '성숙한' 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편 또는 유도체일 수 있다. 인간 단백질은 Swiss-Prot에서 번호 P55899 하에 등록되어 있다. 인간 FcRn 알파 사슬의 세포외 도메인은 서열 번호 21로 제공된다. 성숙한 인간 β2M의 서열은 서열 번호 24로 제공된다.
일 실시형태에서, 항원은 FcRn의 돌연변이체 형태로서, FcRn이 세포 내에 내재화되어 있는 경우 동적인 가공이 거의 없거나 또는 전혀 없도록 FcRn을 세포의 표면 상에 제시하도록 조작되어 있으며, 예를 들어 이는 FcRn 알파 사슬의 세포질 꼬리에 돌연변이를 형성함으로써 달성될 수 있으며, 여기서 다이-루신은 문헌[Ober et al 2001 Int. Immunol. 13, 1551-1559]에 기재된 바와 같이 다이-알라닌으로 돌연변이화된다.
숙주의 면역화에 사용하기 위한 폴리펩타이드는, 발현 시스템을 포함하는 유전자 조작된 숙주 세포로부터 당업계에 잘 알려진 공정에 의해 제조될 수 있거나, 이러한 폴리펩타이드는 천연 생물학적 공급원으로부터 회수될 수 있다. 본 출원에서, 용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포함한다. 이들 용어는 다르게 명시되지 않는 한, 상호호환적으로 사용된다. 일부 경우에, FcRn 폴리펩타이드는, 예를 들어 친화성 태그 또는 이와 유사한 것에 융합된 융합 단백질과 같은 더 큰 단백질의 일부일 수 있다.
FcRn 폴리펩타이드를 잘 알려지고 일상적인 프로토콜을 사용하여 동물, 바람직하게는 비-인간 동물에게 투여함으로써 이러한 FcRn 폴리펩타이드에 대해 발생된 항체가 수득될 수 있으며, 이때 동물의 면역화가 필수적이고, 예를 들어 문헌[Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986)]을 참조한다. 많은 온혈 동물, 예컨대 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지가 면역화될 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 일반적으로 가장 적합하다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 기술(문헌[Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]), 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(문헌[Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72]) 및 EBV-하이브리도마 기술(문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985])과 같은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 또한, 예를 들어 문헌[Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848]; WO92/02551; WO2004/051268 및 국제 특허 출원 번호 WO2004/106377에 기재된 방법에 의해 특이적인 항체의 생성을 위해 선별된 단일 림프구로부터 발생된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현시킴으로써 단일 림프구 항체 방법을 사용하여 발생될 수 있다.
항체의 스크리닝은, 인간 FcRn에의 결합을 측정하기 위한 검정법 및/또는 수용체에의 IgG 결합을 차단하는 능력을 측정하기 위한 검정법을 사용하여 수행될 수 있다. 결합 검정법의 일례는 ELISA로서, 특히 플레이트 상에 고정화된 인간 FcRn과 인간 Fc의 융합 단백질을 사용하고, 상기 융합 단백질에 결합된 항-FcRn 항체를 검출하기 위해 2차 항체를 이용하는 ELISA이다. 적합한 길항적(antagonistic) 및 차단 검정법의 예는 본원 하기에 기재되어 있다.
본원에 이용된 바와 같이 특이적이라는 것은, 특이적인 항원만을 인지하는 항체, 또는 비-특이적인 항원에 결합하는 것과 비교하여, 특이적인 항원에 상당히 더 높은 결합 친화성, 예를 들어 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10배의 더 높은 결합 친화성을 가진 항체를 지칭하고자 한다. 결합 친화성은 본원 하기에 기재된 바와 같은 BIAcore와 같은 기술에 의해 측정될 수 있다. 일례에서, 본 발명의 항체는 β2 마이크로글로불린(β2M)에 결합하지 않는다. 일례에서, 본 발명의 항체는 시노몰구스(cynomolgus) FcRn에 결합한다. 일례에서, 본 발명의 항체 분자는 래트 또는 마우스 FcRn에 결합하지 않는다.
본 발명에 따른 소정의 항체 분자의 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오타이드 서열이 제공되며, 본 발명의 일 양태를 형성한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 결합 단편은 완전히(fully) 인간 항체 또는 결합 단편이며, 예를 들어 파지 라이브러리 또는 유사한 방법에 의해 제조된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 인간화된 것이다.
인간화된 항체(CDR-그래프팅된 항체를 포함함)는 비-인간 종 유래의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR), 및 인간 면역글로불린 분자 유래의 프레임워크 영역을 갖는 항체 분자이다(예를 들어 US 5,585,089; WO91/09967 참조). 전체 CDR보다는 CDR의 특이성 결정 잔기를 전달하는 것만이 필요할 수 있음을 이해할 것이다(예를 들어 문헌[Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 인간화된 항체는, CDR이 유래된 비-인간 종 유래의 하나 이상의 프레임워크 잔기를 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 이러한 프레임워크 잔기는 종종 공여자 잔기로 지칭된다.
따라서, 일 실시형태에서, 본원에 사용된 바와 같이 용어 '인간화된 항체 분자'는, 중쇄 및/또는 경쇄가 수여자 항체(예를 들어 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크 내로 그래프팅된 공여자 항체(예를 들어 비-인간 항체, 예컨대 뮤린 모노클로날 항체) 유래의 하나 이상의 CDR(요망되는 경우, 하나 이상의 변형된 CDR을 포함함)을 함유하고, CDR이 유래된 비-인간 종 유래의 하나 이상의 프레임워크 잔기(공여자 잔기)를 선택적으로 추가로 포함하는, 항체 분자를 지칭한다. 리뷰를 위해, 문헌[Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998]을 참조한다. 일 실시형태에서, 전체 CDR이 전달되기보다는, 본원 상기에 기재된 CDR 중 임의의 CDR 유래의 특이성 결정 잔기들 중 하나 이상만이 인간 항체 프레임워크에 전달된다(예를 들어 문헌[Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 일 실시형태에서, 본원 상기에 기재된 하나 이상의 CDR 유래의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크에 전달된다. 또 다른 실시형태에서, 본원 상기에 기재된 각각의 CDR 유래의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크에 전달된다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 그래프팅되는 경우, 임의의 적절한 수여자 가변 영역 프레임워크 서열이, 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 포함하여 CDR이 유래된 공여자 항체의 부류(class)/유형과 관련하여 사용될 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 따른 인간화된 항체는 인간 수여자 프레임워크 영역뿐만 아니라 본원에서 구체적으로 제공된 하나 이상의 CDR을 포함하는 가변 도메인을 가진다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 차단성 인간화된 항체를 제공하며, 여기서, 가변 도메인은 인간 수여자 프레임워크 영역 및 비-인간 공여자 CDR을 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 인간 프레임워크의 예로는, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM(상기 Kabat 등)이 있다. 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 사용될 수 있으며, REI는 경쇄에 사용될 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘 다에 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 생식선(germline) 서열이 사용될 수 있으며; 이들은 http://www.imgt.org/에서 입수 가능하다.
본 발명의 인간화된 항체에서, 수여자 중쇄 및 경쇄는 본질적으로, 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없으며, 요망되는 경우, 상이한 사슬들로부터 유래된 프레임워크 영역들을 가진 복합적인 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 인간화된 항체의 중쇄에 적합한 이러한 하나의 프레임워크 영역은 JH3과 함께 인간 하위그룹 VH3 서열 IGHV3-7로부터 유래되고, 일례에서, 이러한 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 20에 제시된 서열을 포함한다.
본 발명의 인간화된 항체의 경쇄에 적합한 프레임워크 영역은 JK4와 함께 인간 하위그룹 VK1 서열 IGKV1-27 서열로부터 유래되고, 일례에서, 이러한 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 19에 제시된 서열을 포함한다.
본 발명의 인간화된 항체에서, 프레임워크 영역은 수여자 항체의 서열과 정확하게 동일한 서열을 가질 필요는 없다. 예를 들어, 비통상적인 잔기는 해당 수여자 사슬 부류 또는 유형에 대해 보다 빈번하게 발생하는 잔기로 변할 수 있다. 대안적으로, 수여자 프레임워크 영역 내의 선별된 잔기는, 이러한 잔기가 공여자 항체 내의 동일한 위치에서 발견되는 잔기에 상응하도록 변할 수 있다(문헌[Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324] 참조). 이러한 변화는 공여자 항체의 친화성을 회복하는 데 필요한 정도로 최소로 유지되어야 한다. 변할 필요가 있을 수 있는 수여자 프레임워크 영역 내의 잔기를 선별하기 위한 프로토콜은 WO91/09967에 나타나 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 프레임워크에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 잔기는 대안적인 아미노산 잔기로 대체된다.
이에, 일례에서, 본 발명은 인간화된 항체를 제공하며, 여기서, 적어도 중쇄(Kabat 넘버링)의 가변 도메인의 위치 48 및 위치 78 각각에서의 잔기는 공여자 잔기이며, 예를 들어 서열 번호 9에 제시된 서열을 참조한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인의 잔기 48은 대안적인 아미노산, 예를 들어 발린으로 대체된다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인의 잔기 78은 대안적인 아미노산, 예를 들어 루신으로 대체된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 인간화된 중쇄 가변 영역에서 잔기 48은 발린이고, 잔기 78은 루신이다.
이에, 일례에서, 본 발명은 인간화된 항체를 제공하며, 여기서, 적어도 경쇄(Kabat 넘버링)의 가변 도메인의 위치 70 및 위치 71 각각에서의 잔기는 공여자 잔기이며, 예를 들어 서열 번호 8에 제시된 서열을 참조한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 70은 대안적인 아미노산, 예를 들어 아스파르트산으로 대체된다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 71은 대안적인 아미노산, 예를 들어 페닐알라닌으로 대체된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 인간화된 경쇄 가변 영역에서 잔기 70은 아스파르트산이고, 잔기 71은 페닐알라닌이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 개시된 서열과 80% 유사하거나 동일한 항체 서열, 예를 들어 관련 서열의 일부 또는 전체, 예를 들어 가변 도메인 서열, CDR 서열, 또는 CDR을 제외한 가변 도메인 서열에 걸쳐 예를 들어 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 항체 서열을 제공한다. 일 실시형태에서, 관련 서열은 서열 번호 8 또는 서열 번호 9이다. 일 실시형태에서, 관련 서열은 서열 번호 10, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 중쇄를 포함하는 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 중쇄의 가변 도메인은 본원의 서열, 예를 들어 서열 번호 9에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 가진 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 경쇄를 포함하는 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 경쇄의 가변 도메인은 본원의 서열, 예를 들어 서열 번호 8에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 가진 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 항체는 본원에 제시된 서열, 예를 들어 서열 번호 9에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 갖지만, 항체 분자는 CDR-H1에 대해 서열 번호 1에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열 번호 2에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열 번호 3에 제시된 서열을 가진다.
일 실시형태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 항체는 본원에 제시된 서열, 예를 들어 서열 번호 8에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 갖지만, 항체 분자는 CDR-L1에 대해 서열 번호 4에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열 번호 5 또는 서열 번호 7에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열 번호 6에 제시된 서열을 가진다.
일 실시형태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 항체는 본원에 제시된 서열, 예를 들어 서열 번호 12에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 중쇄, 및 본원에 제시된 서열, 예를 들어 서열 번호 10에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 경쇄를 가진다.
일 실시형태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 항체는 본원에 제시된 서열, 예를 들어 서열 번호 12에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 중쇄, 및 본원에 제시된 서열, 예를 들어 서열 번호 10에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 경쇄를 갖지만, 항체 분자의 Fab 부분은 CDR-H1에 대해 서열 번호 1에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열 번호 2에 제시된 서열, CDR-H3에 대해 서열 번호 3에 제시된 서열, CDR-L1에 대해 서열 번호 4에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열 번호 5 또는 서열 번호 7에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열 번호 6에 제시된 서열을 가진다.
일 실시형태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 항체는 본원에 제시된 서열, 예를 들어 서열 번호 12에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 중쇄, 및 본원에 제시된 서열, 예를 들어 서열 번호 10에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 경쇄를 갖지만, 항체 분자의 dsscFv 부분은 CDR-H1에 대해 서열 번호 85에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열 번호 86에 제시된 서열, CDR-H3에 대해 서열 번호 87에 제시된 서열, CDR-L1에 대해 서열 번호 88에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열 번호 89에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열 번호 90에 제시된 서열을 가진다.
일 실시형태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 항체는 본원에 제시된 서열, 예를 들어 서열 번호 12에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 중쇄, 및 본원에 제시된 서열, 예를 들어 서열 번호 10에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 경쇄를 갖지만, 항체 분자의 Fab 부분은 CDR-H1에 대해 서열 번호 1에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열 번호 2에 제시된 서열, CDR-H3에 대해 서열 번호 3에 제시된 서열, CDR-L1에 대해 서열 번호 4에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열 번호 5 또는 서열 번호 7에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열 번호 6에 제시된 서열을 가지고, 항체 분자의 dsscFv 부분은 CDR-H1에 대해 서열 번호 85에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열 번호 86에 제시된 서열, CDR-H3에 대해 서열 번호 87에 제시된 서열, CDR-L1에 대해 서열 번호 88에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열 번호 89에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열 번호 90에 제시된 서열을 가진다.
본원에 사용된 바와 같이 "동일성"은, 정렬된 서열 내 임의의 특정한 위치에서, 아미노산 잔기가 서열들 사이에서 동일함을 가리킨다. 본원에 사용된 바와 같이 "유사성"은, 정렬된 서열 내 임의의 특정한 위치에서, 아미노산 잔기가 서열들 사이에서 유사한 유형임을 가리킨다. 예를 들어, 이소루신 또는 발린이 루신으로 치환될 수 있다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산으로는,
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 가진 아미노산);
- 라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 가진 아미노산);
- 아스파테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 가진 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 가진 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황-함유 측쇄를 가진 아미노산)
등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 동일성 및 유사성의 정도는 NCBI로부터 이용 가능한 BLAST™ 소프트웨어(문헌[Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]; [Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141]; [Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; [Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656])로부터 쉽게 계산될 수 있다(문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; [Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]).
본 발명의 항체 융합 단백질의 Fab-단편 구성성분은 임의의 적합한 항-FcRn 항체 또는 항체 단편으로부터 유래되거나 구축될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
일례에서, 본 개시내용의 항체 분자는 예를 들어 경쇄 및 중쇄 각각에 대해 서열 번호 26 및 서열 번호 28로 표시된 서열을 포함하는 항체 Fab 단편을 포함한다.
일례에서, 본 개시내용의 항체 분자는 예를 들어 경쇄 및 중쇄 각각에 대해 서열 번호 92 및 서열 번호 94로 표시된 서열을 포함하는 항체 Fab 단편을 포함한다.
일례에서, 본 개시내용의 항체 분자는 예를 들어 경쇄 및 중쇄 각각에 대해 서열 번호 10 및 서열 번호 14로 표시된 서열을 포함하는 항체 Fab 단편을 포함한다. 일 실시형태에서, 분자의 항체 Fab 단편 부분은 서열 번호 10에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 14에 제시된 서열을 포함하는 중쇄를 가진다.
본 발명의 Fab 단편은 직접적으로 또는 링커를 통해 scFv에 연결된다. 일례에서, scFv는 이황화 안정화된다. 전형적으로 scFv는 이황화 안정화된다. Fab 단편에의 연결은 화학적 컨쥬게이션일 수 있으나, 가장 바람직하게는 번역 융합, 즉, 각각의 서열이 발현 벡터에 의해 서열 내에 코딩되는 유전적 유합일 수 있다. 따라서, 링커는 전형적으로, 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 링커이다.
전형적으로, scFv 또는 dsscFv는, 생체내에서 항체 융합 단백질의 반감기를 연장시키기 위해, 혈청 담체 단백질에 결합한다. 이러한 방식으로 반감기를 연장하는 것은 FcRn 결합과는 무관하고, 유리할 수 있다.
본원에 이용된 바와 같이, "혈청 담체 단백질"은 scFv가 결합할 수 있는 임의의 적합한 혈장 담체 단백질을 지칭하며, 일례에서, 혈청 담체 단백질은 티록신-결합 단백질, 트랜스티레틴(transthyretin), α1-산 당단백질, 트랜스페린, 피브리노겐 및 알부민, 또는 이들 중 임의의 단편으로부터 선택된다.
전형적으로, scFv 또는 dsscFv는 알부민, 바람직하게는 인간 혈청 알부민에 결합한다.
임의의 적합한 알부민-결합 scFv 또는 dsscFv는 본 발명의 항체 융합 단백질 내에 혼입될 수 있다. 적합한 알부민 결합 도메인은 당업계에서 이전에 기재된 바 있다.
본원에 이용된 바와 같이, "단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 VH 가변 도메인과 VL 가변 도메인 사이에서 펩타이드 링커에 의해 안정화된 단일 사슬 가변 단편을 지칭한다.
본원에 이용된 바와 같이, "이황화-안정화된 단일 사슬 가변 단편" 또는 "dsscFv"는 VH 가변 도메인과 VL 가변 도메인 사이에서 펩타이드 링커에 의해 안정화되고, 또한 VH와 VL 사이에 도메인간(inter-domain) 이황화 결합을 포함하는 단일 사슬 가변 단편을 지칭한다.
일 실시형태에서, dsscFv의 가변 도메인 VH와 VL 사이의 이황화 결합은 하기 열거된 잔기들 중 2개 사이에 존재한다(문맥상 다르게 가리키지 않는 한, Kabat 넘버링이 하기 목록에 이용됨). Kabat 넘버링을 참조할 때마다, 관련 참조는 문헌[Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA]이다.
일 실시형태에서, 이황화 결합은
· VH37 + VL95C, 예를 들어 문헌[Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)] 참조;
· VH44 + VL100, 예를 들어 문헌[Biochemistry 33 5451-5459 Reiter et al (1994)]; [Journal of Biological Chemistry Vol. 269 No. 28 pp.18327-18331 Reiter et al (1994)]; 또는 [Protein Engineering, vol.10 no.12 pp.1453-1459 Rajagopal et al (1997)] 참조;
· VH44 + VL105, 예를 들어 문헌[J Biochem. 118, 825-831 Luo et al (1995)] 참조;
· VH45 + VL87, 예를 들어 문헌[단백질 Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)] 참조;
· VH55 + VL101, 예를 들어 문헌[FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)] 참조;
· VH100 + VL50, 예를 들어 문헌[Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990)] 참조;
· VH100b + VL49;
· VH98 + VL 46, 예를 들어 문헌[Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)] 참조;
· VH101 + VL46;
· VH105 + VL43, 예를 들어 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp.7538-7542 Brinkmann et al (1993)]; 또는 [Proteins 19, 35-47 Jung et al (1994)] 참조,
· VH106 + VL57, 예를 들어 문헌[FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)] 참조
및 분자 내에 위치한 가변 영역 쌍 내의 위치 또는 이에 상응하는 위치
로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 존재한다.
일 실시형태에서, 이황화 결합은 위치 VH44와 VL100 사이에 형성된다.
상기 열거된 아미노산 쌍들은, 이황화 결합이 형성될 수 있도록 시스테인에 의해 대체되기 좋은 위치에 존재한다. 시스테인은 공지된 기술에 의해 이들 요망되는 위치 내로 조작될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 조작된 시스테인은 제시된 아미노산 위치에서 자연 발생적인 잔기가 시스테인 잔기로 대체된 것을 지칭한다.
조작된 시스테인의 도입은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이들 방법으로는, PCR 연장 오버랩 돌연변이생성, 부위-특이적 돌연변이생성 또는 카세트 돌연변이생성 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다(일반적으로, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989]; [Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993] 참조). QuikChange® 부위-특이적 돌연변이생성 키트(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 Stratagen)와 같은 부위-특이적 돌연변이생성 키트는 상업적으로 입수 가능하다. 카세트 돌연변이생성은 문헌[Wells et al., 1985, Gene, 34:315-323]을 기반으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 돌연변이체는 오버랩핑(overlapping) 올리고뉴클레오타이드의 어닐링, 연결 및 PCR 증폭 및 클로닝에 의한 총 유전자 합성에 의해 제조될 수 있다.
이에, 일 실시형태에서, dsscFv의 가변 도메인 VH 및 VL은 2개의 시스테인 잔기들 사이에서 이황화 결합에 의해 연결될 수 있으며, 여기서, 시스테인 잔기의 쌍의 위치는 VH37 및 VL95, VH44 및 VL100, VH44 및 VL105, VH45 및 VL87, VH100 및 VL50, VH100b 및 VL49, VH98 및 VL46, VH101 및 VL46, VH105 및 VL43, 및 VH106 및 VL57을 포함하거나 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, dsscFv의 가변 도메인 VH 및 VL은 CDR의 외부에 존재하는 2개의 시스테인 잔기들 사이, 즉 VH에서 1개와 VL에서 1개 사이에서 이황화 결합에 의해 연결될 수 있으며, 예를 들어 여기서, 시스테인 잔기의 쌍의 위치는 VH37 및 VL95, VH44 및 VL100, VH44 및 VL105, VH45 및 VL87, VH100 및 VL50, VH98 및 VL46, VH105 및 VL43, 및 VH106 및 VL57로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, dsscFv의 가변 도메인 VH 및 VL은 2개의 조작된 시스테인 잔기들 사이, 즉 위치 VH44에서의 1개와 VL100에서의 나머지 1개 사이에서 이황화 결합에 의해 연결된다.
일 실시형태에서, dsscFv의 가변 도메인 VH 및 VL은 2개의 조작된 시스테인 잔기들 사이, 즉 위치 VH44에서의 1개와 VL100에서의 나머지 1개 사이에서 이황화 결합에 의해 연결된다.
일례에서, scFv 또는 dsscFv는 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서, CDR H1은 서열 번호 85에 제시된 서열을 가지며, CDR H2는 서열 번호 86에 제시된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호 87에 제시된 서열을 가지고, CDR L1은 서열 번호 88에 제시된 서열을 가지며, CDR L2는 서열 번호 89에 제시된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호 90에 제시된 서열을 가진다.
일례에서, 본 발명의 dsscFv의 VH 도메인은 서열 번호 15에 제시된 서열을 가지고, 본 발명의 dsscFv의 VL 도메인은 서열 번호 16에 제시된 서열을 가진다.
본 발명의 scFv 및 dsscFv에서 VH 및 VL은 적합한 링커를 통해 전형적으로 중쇄-경쇄(HL) 배향으로 서로 연결되며, 이의 예들은 본원 하기에 제공된다. 본 발명의 항체 융합 단백질에서, scFv 또는 dsscFv는 직접적으로 또는 링커를 통해 Fab 단편의 C-말단에 연결된다.
일 실시형태에서, dsscFv의 중쇄 가변 도메인은 Fab 단편의 중쇄의 C-말단에 부착되거나, dsscFv의 경쇄 가변 도메인은 Fab 단편의 중쇄의 C-말단에 부착된다.
일 실시형태에서, dsscFv의 중쇄 가변 도메인은 Fab 단편의 경쇄의 C-말단에 부착되거나, dsscFv의 경쇄 가변 도메인은 Fab 단편의 경쇄의 C-말단에 부착된다.
일 실시형태에서, dsscFv의 VH 도메인은 링커를 통해 Fab 단편의 CH1의 C-말단에 부착된다. 일 실시형태에서, dsscFv의 VH 도메인은 CL의 C-말단에 부착된다.
일 실시형태에서, 링커는 임의의 적합한 링커, 예를 들어 CH1 또는 CL의 C-말단 일부를 dsscFv의 VH에 연결하기에 적합한 펩타이드이다.
일 실시형태에서, 본 발명에 사용하기 위한 펩타이드 링커는 길이가 50개 이하인 아미노산, 예를 들어 20개 이하인 아미노산, 예컨대 19, 10, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산이다.
일 실시형태에서, 링커는 G4S(즉, GGGGS 서열 번호 29)의 반복 단위, 예를 들어 이의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 단위, 예컨대 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호30) 또는 SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호31)를 기반으로 한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 구축물에 이용되는 링커는 서열 SGGGGSGGGGTGGGGS(서열 번호32)를 가진다. 또한, 이러한 링커는 scFv 또는 dsscFv의 VH 및 VL을 연결하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 링커는 본원에 나타낸 서열로부터 선택된다. 일 실시형태에서, VH 및 VL은 서열 번호 30에 제시된 서열을 가진 서열에 의해 연결된다. 일 실시형태에서, Fab의 CH1의 C-말단과 dsscFv의 VH의 N-말단 사이의 링커는 서열 SGGGGTGGGGS(서열 번호 33)를 가진다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
(S)는 서열 45 내지 49에서 선택적이다.
강성(rigid) 링커의 예로는, 펩타이드 서열 GAPAPAAPAPA(서열 번호 83), PPPP(서열 번호 84) 및 PPP가 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 Fab-dsscFv 단편 또는 융합 단백질은 서열 번호 12에 제시된 서열을 포함하거나 이루어진 중쇄 및 서열 번호 10에 제시된 서열을 포함하거나 이루어진 경쇄를 포함한다.
CA170_01638g49 및 1638.g49는 본원에서 상호호환적으로 이용되고, 수많은 상이한 포맷들에서 사용될 수 있는 항체 가변 영역의 특정한 쌍을 지칭하는 데 사용된다. 이들 가변 영역은 서열 번호 9에 제시된 중쇄 서열 gH33 및 서열 번호 8에 제시된 경쇄 서열 gL7이다.
CA170_01638g28 및 1638.g28은 본원에서 상호호환적으로 이용되고, 수많은 상이한 포맷들에서 사용될 수 있는 항체 가변 영역의 특정한 쌍을 지칭하는 데 사용된다. 이들 가변 영역은 서열 번호 27에 제시된 중쇄 서열 및 서열 번호 25에 제시된 경쇄 서열이다.
일 실시형태에서, 항체 Fab 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고, 항체 경쇄는 카파 또는 람다 CL 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, Fab 구성성분의 경쇄는 서열 번호 10에 제시된 서열을 가지고, Fab 구성성분의 중쇄는 서열 번호 14에 제시된 서열을 가진다.
일 실시형태에서, Fab 구성성분의 경쇄는 서열 번호 26에 제시된 서열을 가지고, Fab 구성성분의 중쇄는 서열 번호 28에 제시된 서열을 가진다.
일 실시형태에서, Fab 구성성분의 경쇄는 서열 번호 92에 제시된 서열을 가지고, Fab 구성성분의 중쇄는 서열 번호 94에 제시된 서열을 가진다.
생물학적 분자, 예컨대 항체 또는 단편은 산성 및/또는 염기성 관능기를 함유하여, 이러한 분자에 알짜(net) 양성 또는 음성 전하를 제공한다. "관찰된" 총 전하의 양은 엔터티(entity)의 절대 아미노산 서열, 3D 구조에서 하전된 기의 국지적 환경, 및 분자의 환경적 조건에 따라 다를 것이다. 등전점(pI)은, 특정 분자 또는 이의 용매 접근 가능한 표면이 알짜 전하를 운반하지 않는 pH이다. 일례에서, 본 발명의 FcRn 항체 및 단편은 적절한 등전점을 갖도록 조작될 수 있다. 이는 보다 강력한 특성, 특히 적합한 용해성 및/또는 안정성 프로파일 및/또는 개선된 정제 특징을 가진 항체 및/또는 단편을 초래할 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 본래 동정된 항체의 등전점과 상이한 등전점을 갖도록 조작된 인간화된 FcRn 항체를 제공한다. 항체는 예를 들어, 아미노산 잔기를 대체함으로써, 예컨대 산성 아미노산 잔기를 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 대체함으로써 조작될 수 있다. 대안적으로, 염기성 아미노산 잔기가 도입될 수 있거나, 산성 아미노산 잔기가 제거될 수 있다. 대안적으로, 분자가 허용 불가능할 정도로 높은 pI 값을 가진 경우, 필요에 따라 산성 잔기가 도입되어, pI를 낮출 수 있다. pI 조작 시, 항체 또는 단편의 바람직한 활성을 유지시키도록 주의를 기울여야 하는 것이 중요하다. 따라서, 일 실시형태에서, 조작된 항체 또는 단편은 "비변형된" 항체 또는 단편과 동일하거나 실질적으로 동일한 활성을 가진다.
** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html , 및 http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html과 같은 프로그램을 사용하여, 항체 또는 단편의 등전점을 예측할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, pI는 임의의 적합한 표준 실험실 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 적합하게는, 높은 결합 친화성을 특히 나노몰 범위로 가진다. 친화성은 본원 실시예에 기재된 바와 같이 BIAcore를 포함하여 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여, 단리된 천연 또는 재조합 FcRn 또는 적합한 융합 단백질/폴리펩타이드를 사용하여 측정될 수 있다. 일례에서, 친화성은 본원 실시예에 기재된 바와 같이 재조합 인간 FcRn 세포외 도메인(서열 번호 21)을 사용하여 측정된다. 일례에서, 친화성은 재조합 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 도메인(서열 번호 21)을 인간 β2 마이크로글로불린(β2M)(서열 번호 24)과 함께 사용하여 측정된다. 적합하게는, 본 발명의 항체 분자는 단리된 인간 FcRn에 대한 결합 친화성을 약 1 nM 이하로 가진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 약 500 pM 이하의 결합 친화성을 가진다(즉 더 높은 친화성). 일 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 약 250 pM 이하의 결합 친화성을 가진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 약 200 pM 이하의 결합 친화성을 가진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 약 160 pM 이하의 결합 친화성을 가진다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 pH6 또는 더 낮은 pH(특히 pH 6) 및 pH7.4 또는 더 높은 pH(특히 pH7.4) 둘 다에서 유사한 결합 친화성으로 인간 FcRn에 결합할 수 있다. 따라서, 유리하게는 항체는 심지어 엔도좀 내에서 FcRn과 계속 결합할 수 있어서, IgG에의 FcRn 결합의 차단을 최대화한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 pH6 및 pH7.4에서 측정되는 경우 200 pM 이하 또는 160 pM 이하의 결합 친화성으로 인간 FcRn에 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 pH6 및 pH7.4에서 측정되는 경우 130 pM 이하의 결합 친화성으로 인간 FcRn에 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 pH6에서 측정되는 경우 160 pM 이하의 결합 친화성으로 인간 FcRn에 결합할 수 있고, pH7.4에서 측정되는 경우 50 pM 이하의 결합 친화성으로 인간 FcRn에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 결합 단편의 친화성, 뿐만 아니라 결합제(예컨대 항체)가 결합을 저해하는 범위는 당업자에 의해 종래의 기술, 예를 들어 Scatchard 등(문헌[Ann. KY. Acad. Sci. 51:660-672 (1949)])에 기재된 기술을 사용하거나 BIAcore와 같은 시스템을 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 확인될 수 있다. 표면 플라즈몬 공명을 위해, 표적 분자를 고체상 상에 고정하고, 유동 세포를 따라 진행되는 이동상 내의 리간드에 노출시킨다. 고정된 표적에 리간드가 결합하면, 국소 굴절률이 변하여, SPR 각도가 변하며, 이러한 변화는 반사된 광의 강도의 변화를 검출함으로써 실시간으로 모니터링될 수 있다. SPR 신호의 변화 속도를 분석하여, 결합 반응의 결합상 및 해리상에 대한 겉보기 속도 상수(apparent rate constant)를 수득할 수 있다. 이들 값의 비율은 겉보기 평형 상수(apparent equilibrium constant)(친화성)를 제공한다(예를 들어 문헌[Wolff et al, Cancer Res. 53:2560-65 (1993)] 참조).
본 발명에서, 시험 항체 분자의 친화성은 전형적으로, 하기와 같이 SPR을 상용하여 확인된다. 시험 항체 분자는 고정상 상에 포착되고, 인간 β2M과 비공유 복합체를 이룬 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 도메인은 이동상 내에서 포착된 항체에 걸쳐 진행되고, 인간 FcRn에 대한 시험 항체 분자의 친화성이 확인된다. 시험 항체 분자는 임의의 적절한 방법을 사용하여, 예를 들어 항-Fc 또는 항-Fab' 특이적 포착제를 사용하여, 고체상 칩 표면 상에 포착될 수 있다. 일례에서, 친화성은 pH6에서 확인된다. 일례에서, 친화성은 pH7.4에서 확인된다.
본 발명에 의해 제공되는 항체의 친화성은 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 변경될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 항체 분자의 변이체에 관한 것이며, 이러한 변이체는 FcRn에 대해 개선된 친화성을 가진다. 이러한 변이체는 CDR의 돌연변이화(문헌[Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995]), 사슬 셔플링(문헌[Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992]), 이. 콜라이의 돌연변이 유발 유전자(mutator) 균주의 사용(문헌[Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996]), DNA 셔플링(문헌[Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997]), 파지 디스플레이(문헌[Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996]) 및 유성(sexual) PCR(문헌[Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998])을 포함하여, 다수의 친화성 성숙 프로토콜에 의해 수득될 수 있다. Vaughan 등(상기)은 이들 친화성 성숙 방법을 고찰하고 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 분자는 인간 FcRn 활성을 차단한다. FcRn을 차단하는 항체의 능력을 확인하는 데 적합한 검정법은 본원 실시예에 기재되어 있다. IgG 재순환을 차단하는 항체 분자의 능력을 확인하는 데 적합한 검정법은 본원 하기에 기재되어 있다.
요망되는 경우, 본 발명에 사용하기 위한 항체 분자는 하나 이상의 효과기 분자(들)에 컨쥬게이션될 수 있다. 효과기 분자는, 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 연결되는 단일 효과기 분자 또는 2개 이상의 이러한 분자들을 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 효과기 분자에 연결된 항체 단편을 수득하는 것이 요망되는 경우, 이는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조될 수 있으며, 여기서, 항체 단편은 직접적으로 또는 커플링제를 통해 효과기 분자에 연결된다. 이러한 효과기 분자를 항체에 컨쥬게이션하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(문헌[Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53]; [Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev., 62:119-58] 및 [Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123] 참조). 특정 화학적 절차로는, 예를 들어 WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 및 WO 03/031581에 기재된 것들이 있다. 대안적으로, 효과기 분자가 단백질 또는 폴리펩타이드인 경우, 연결은 예를 들어 WO 86/01533 및 EP0392745에 기재된 바와 같이 재조합 DNA 절차를 사용하여 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 효과기 분자로는 예를 들어, 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 자연 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들어 DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성 핵종, 특히 방사성 요오다이드, 방사성 동위 원소, 킬레이트화된 금속, 나노입자 및 리포터 기, 예컨대 형광 화합물, 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물 등이 있다.
효과기 분자의 예로는, 세포에 유해한(예를 들어 세포를 살해하는) 임의의 제제를 포함하여 세포독소 또는 세포독성제 등이 있을 수 있다. 예로는, 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탄시노이드, 스폰지스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스테를린, 택솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 다이하이드록시 안트라신 다이온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이들의 아날로그 또는 호모로그 등이 있다.
효과기 분자로는 또한, 대사 길항 물질(예를 들어 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부술판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 cis-다이클로로다이아민 플래티늄(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어 닥티노마이신(이전에는 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리케아미신 또는 두오카마이신) 및 항-유사분열 제제(예를 들어 빈크리스틴 및 빈블라스틴) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
다른 효과기 분자는 킬레이트화된 방사성 핵종, 예컨대 111In 및 90Y, Lu177, 비스무트213, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188; 또는 비제한적으로 알킬포스포콜린, 토포이성질화효소(topoisomerase) I 저해제, 탁소이드 및 수라민과 같은 약물을 포함할 수 있다.
다른 효과기 분자로는, 단백질, 펩타이드 및 효소가 있다. 관심 효소로는, 단백질 분해 효소, 가수 분해 효소, 리아제, 이성질화 효소, 전이 효소 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 관심 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드로는, 면역글로불린, 독소, 예컨대 아브린(abrin), 리신 A, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소 또는 디프테리아 독소, 단백질, 예컨대 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 혈전제 또는 항-혈관신생제, 예를 들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴 또는 생물학적 반응 변형제, 예컨대 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
다른 효과기 분자는 예를 들어 진단에 유용한 검출 가능한 성분을 포함할 수 있다. 검출 가능한 성분의 예로는, 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 핵종, (양전자 방출 단층촬영에 사용하기 위한) 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온 등이 있다. 일반적으로, 진단제로서 사용하기 위한 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 4,741,900을 참조한다. 적합한 효소로는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제 등이 있으며; 적합한 보결 분자단으로는 스트렙타비딘, 아비딘 및 비오틴 등이 있으며; 적합한 형광 물질로는 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 다이클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린 등이 있으며; 적합한 발광 물질로는 루미놀이 있으며; 적합한 생물발광 물질로는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿼린 등이 있고; 적합한 방사성 핵종으로는 125I, 131I, 111In 및 99Tc 등이 있다.
또 다른 예에서, 효과기 분자는 생체내에서 항체의 반감기를 증가시키고/거나 항체의 면역원성을 감소시키고/거나 상피 장벽을 가로질러 면역계로의 항체의 전달을 증강시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 효과기 분자의 예로는, 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예컨대 WO05/117984에 기재된 것들 등이 있다.
일 실시형태에서, FcRn과 독립적인 효과기 분자에 의해 제공되는 반감기가 유리하다.
효과기 분자가 중합체인 경우, 이는 일반적으로, 합성 또는 자연 발생 중합체, 예를 들어 선택적으로 치환된 직선형 또는 분지형 사슬 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리알키닐렌 중합체, 또는 분지형 또는 비분지형 다당류, 예를 들어 호모- 또는 헤테로- 다당류일 수 있다.
상기 언급된 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 구체적인 선택적인 치환기로는, 하나 이상의 하이드록시기, 메틸기 또는 메톡시기 등이 있다.
합성 중합체의 구체적인 예로는, 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알코올) 또는 이들의 유도체, 특히 선택적으로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이들의 유도체 등이 있다.
구체적인 자연 발생 중합체로는, 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체 등이 있다.
일 실시형태에서, 중합체는 알부민 또는 이의 단편, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편이다.
본원에 사용된 바와 같이, "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어 티올-선택적 반응성 기, 예컨대 말레이미드 등을 포함하고자 한다. 반응성 기는 직접적으로 또는 링커 분절을 통해 중합체에 연결될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 기의 잔기가, 항체 단편과 중합체 사이에서 연결기로서 생성물의 일부를 형성할 것으로 이해될 것이다.
중합체의 크기는 요망되는 대로 다양할 수 있으나, 일반적으로 500 Da 내지 50,000 Da, 예를 들어 5,000 Da 내지 40,000 Da, 예컨대 20,000 Da 내지 40,000 Da의 평균 분자량 범위에 존재할 것이다. 중합체 크기는 특히, 생성물의 의도되는 용도, 예를 들어 종양과 같은 소정의 조직으로 국소화시키거나 순환중인 반감기를 연장하는 능력을 기반으로 선택될 수 있다(리뷰를 위해 문헌[Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545] 참조). 따라서, 예를 들어 종양 치료에 사용되기 위해 생성물이 순환을 떠나 조직에 침투되고자 하는 경우, 저분자량 중합체, 예를 들어 분자량이 약 5,000 Da인 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 순환에 남아 있는 적용에 대해서는, 보다 고분자량의 중합체, 예를 들어 분자량의 범위가 20,000 Da 내지 40,000 Da 범위인 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
적합한 중합체로는, 폴리알킬렌 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜) 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체 등이 있고, 특히 분자량의 범위가 약 15,000 Da 내지 약 40,000 Da인 것이 있다.
일례에서, 본 발명에 사용하기 위한 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 특정한 일례에서, 항체는 항체 단편이고, PEG 분자는 항체 단편 내에 위치한 임의의 이용 가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 관능기, 예를 들어 임의의 유리 아미노기, 이미노기, 티올기, 하이드록실기 또는 카르복실기를 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편에서 자연 발생할 수 있거나, 재조합 DNA 방법을 사용하여 단편 내로 조작될 수 있다(예를 들어 US 5,219,996; US 5,667,425; WO98/25971, WO2008/038024 참조). 일례에서, 본 발명의 항체 분자는 변형된 Fab 단편이며, 여기서, 이러한 변형은 효과기 분자의 부착을 허용하기 위해 이러한 항체 분자의 중쇄의 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 첨가하는 것이다. 적합하게는, 부가적인 아미노산은 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성하며, 이러한 영역에 효과기 분자가 부착될 수 있다. 2개 이상의 PEG 분자들을 부착시키기 위해 다수의 부위들이 사용될 수 있다.
적합하게는 PEG 분자는 항체 단편에 위치한 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올기를 통해 공유 연결된다. 변형된 항체 단편에 부착되는 각각의 중합체 분자는 이러한 단편에 위치한 시스테인 잔기의 황 원자에 공유 연결될 수 있다. 공유 연결은 일반적으로, 이황화 결합 또는 특히 황-탄소 결합일 것이다. 티올기가 부착점으로서 사용되는 경우, 적절하게 활성화된 효과기 분자, 예를 들어 티올 선택적 유도체, 예컨대 말레이미드 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기 기재된 바와 같이 중합체-변형된 항체 단편의 제조에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 반응성 기, 예컨대 α-할로카르복실산 또는 에스테르, 예를 들어 요오도아세타미드, 이미드, 예를 들어 말레이미드, 비닐 설폰 또는 다이설파이드를 함유하는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 출발 물질은 상업적으로 수득될 수 있거나(예를 들어 Nektar, 이전에 Shearwater Polymers Inc., 미국 앨라배마주 헌츠빌 소재) 상업적으로 입수 가능한 출발 물질로부터 종래의 화학적 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 특정한 PEG 분자로는 20K 메톡시-PEG-아민(Nektar, 이전에 Shearwater; Rapp Polymere; 및 SunBio사로부터 수득 가능함) 및 M-PEG-SPA(Nektar, 이전에 Shearwater사로부터 수득 가능함)가 있다.
일 실시형태에서, 항체는 예를 들어 EP 0948544 또는 EP1090037에 개시된 방법에 따라 PEG화된, 즉 PEG(폴리(에틸렌글리콜))가 공유 부착된 변형된 Fab 단편, Fab' 단편 또는 diFab이다(또한, 문헌["Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York], ["Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC] 및 ["Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York]; [Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545] 참조). 일례에서, PEG는 힌지 영역에서 시스테인에 부착된다. 일례에서, PEG 변형된 Fab 단편은, 변형된 힌지 영역에서 단일 티올기에 공유 연결된 말레이미드기를 가진다. 라이신 잔기는 말레이미드기에 공유 연결될 수 있고, 라이신 잔기 상의 각각의 아민기에 분자량이 대략 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 부착될 수 있다. 따라서, Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 약 40,000 Da일 수 있다.
특정한 PEG 분자는 N,N'-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 20,000) 변형된 라이신의 2-[3-(N-말레이미도)프로피온아미도]에틸 아미드를 포함하며, 이는 또한 PEG2MAL40K(Nektar, 이전에 Shearwater사로부터 수득 가능함)로 알려져 있다.
PEG 링커의 대안적인 공급원으로는, GL2-400MA3(여기서 하기 구조에서 m은 5임) 및 GL2-400MA(여기서 m은 2임)를 공급하는 NOF가 있으며, n은 약 450이다:
Figure pct00004
즉, 각각의 PEG는 약 20,000 Da이다.
따라서, 일 실시형태에서, PEG는 2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-{[3-(6-말레이미도-1-옥소헥실)아미노]프로필옥시} 헥산이다(2 암(arm) 분지형 PEG, -CH2)3NHCO(CH2)5-MAL, Mw 40,000, SUNBRIGHT GL2-400MA3로도 알려져 있음).
하기 유형의 추가의 대안적인 PEG 효과기 분자가 Dr Reddy, NOF 및 Jenkem으로부터 입수 가능하다:
Figure pct00005
.
일 실시형태에서, 항체 또는 단편은 예를 들어 반감기를 증가시키기 위해 전분 분자에 컨쥬게이션된다. US 8,017,739에 기재된 바와 같이 전분을 단백질에 컨쥬게이션시키는 방법은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 항-FcRn 결합 분자(즉, 항체 또는 이의 결합 단편)를 제공하며, 이러한 분자는:
· 혈장 IgG 농도의 50% 내지 85% 감소, 예컨대 70% 감소를 유발하며,
· 혈장 알부민 농도는 적어도 25% 또는 20% 감소시키고/거나,
· 낮은 혈장 IgG 농도를 장기간 유지시키기 위해 반복 투약의 가능성을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항체 분자의 중쇄 및/또는 경쇄(들)를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다. 적합하게는, DNA 서열은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄를 코딩한다. 본 발명의 DNA 서열은 합성 DNA, 예를 들어 화학적 가공에 의해 생성되는 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄의 일부 또는 모두를 코딩하는 DNA 서열은 확인된 DNA 서열로부터 또는 상응하는 아미노산 서열을 기반으로 요망되는 대로 합성될 수 있다.
수여자 프레임워크 서열을 코딩하는 DNA는 당업자에게 광범위하게 이용 가능하고, 이들의 공지된 아미노산 서열을 기반으로 쉽게 합성될 수 있다.
분자 생물학의 표준 기술을 사용하여, 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 요망되는 DNA 서열은 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 부위-특이적 돌연변이생성 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술이 적절하게 사용될 수 있다.
적합한 DNA 서열의 예들은 본원에 제공된다.
이에 일례에서, 본 발명은 서열 번호 13에 제시된 서열을 포함하는 본 발명의 항체 Fab-dsscFv의 중쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다. 본 발명은 또한, 서열 번호 11에 제시된 서열을 포함하는 본 발명의 항체 Fab-dsscFv의 경쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 이에, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다. 적합하게는, 클로닝 또는 발현 벡터는, 본 발명의 항체 분자의 경쇄 및 중쇄를 각각 코딩하는 2개의 DNA 서열들 및 적합한 신호 서열을 포함한다. 일례에서, 벡터는 중쇄와 경쇄 사이에 유전자간(intergenic) 서열을 포함한다(WO03/048208 참조).
벡터가 구축될 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 측면에서, 문헌["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing]을 참조한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이에, 본 발명은 또한,
i) 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 DNA 서열, 및
ii) 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 DNA 서열
을 포함하는 본 발명에 따른 항체 분자의 발현을 위한 숙주 세포를 제공하며,
여기서, DNA 서열은 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터에 제공된다.
임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템은 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열의 발현에 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이 및 다른 미생물 시스템이 (특히 항체 단편을 발현시키기 위해) 사용될 수 있거나, 진핵, 예를 들어 포유류 숙주 세포 발현 시스템이 또한, (특히 전장 항체를 발현시키기 위해) 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명에 사용되기에 적합한 유형의 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)로는, CHO 세포 및 dhfr- CHO 세포를 포함하여 CHO-K1 세포, 예컨대 DHFR 선별 마커와 함께 사용될 수 있는 CHO-DG44 세포 및 CHO-DXB11 세포, 또는 글루타민 합성효소 선별 마커와 함께 사용될 수 있는 CHOK1-SV 세포 등이 있을 수 있다. 항체를 발현시키는 데 사용되는 다른 세포 유형으로는, 림프구성 세포주, 예를 들어 NSO 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포 등이 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현을 초래하기에 적합한 조건 하에 본 발명의 벡터 또는 벡터들을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 항체 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 분자의 생성 방법을 제공한다.
항체 분자는 중쇄 및 경쇄 둘 다 포함하고, 세포주는 2개의 벡터로 형질감염될 수 있으며, 제1 벡터는 경쇄 폴리펩타이드를 코딩하고 제2 벡터는 중쇄 폴리펩타이드를 코딩한다. 대안적으로, 단일 벡터가 사용될 수 있으며, 이러한 벡터는 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 항체 및 단편은 숙주 세포로부터 양호한 수준에서 발현된다. 따라서, 항체 및/또는 단편의 특성은 상업적인 가공에 도움이 된다.
따라서, 본 발명은 숙주 세포를 배양하는 단계, 항체 또는 이의 단편을 발현시키는 단계, 상기 항체 또는 이의 단편을 단리하는 단계, 및 선택적으로 상기 항체 또는 이의 단편을 정제하여 단리된 항체 또는 단편을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 방법은 효과기 분자를 단리된 항체 또는 단편과 컨쥬게이션하는 단계, 예를 들어 특히 본원에 기재된 바와 같이 PEG 중합체에 컨쥬게이션하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 항체(특히 본 발명에 따른 항체 또는 단편)의 정제 방법을 제공하며, 이러한 정제 방법은: 불순물이 컬럼 상에 유지되고 항체가 용리되도록, 음이온 교환 크로마토그래피를 비결합 방식으로 수행하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 정제는 FcRn 컬럼 상에서의 친화성 포착을 이용한다.
일 실시형태에서, 정제는 알부민 융합 또는 컨쥬게이트 분자의 정제를 위해 시바크론 블루(cibacron blue) 또는 유사한 물질을 이용한다.
본 방법에 사용하기에 적합한 이온 교환 수지는 Q.FF 수지(GE-Healthcare사에 의해 공급됨)를 포함한다. 이러한 단계는 예를 들어 약 pH 8에서 수행될 수 있다.
본 공정은 추가로, 예를 들어 pH 약 4 내지 5, 예컨대 pH 4.5에서 수행되는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 초기 포착 단계를 포함할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피는 예를 들어 수지, 예컨대 CaptoS 수지 또는 SP 세파로스 FF(GE-Healthcare사에 의해 공급됨)를 이용할 수 있다. 그런 다음, 항체 또는 단편은 염화나트륨과 같은 이온성 염 용액을 예를 들어 200 mM의 농도에서 이용하여 상기 수지로부터 용리될 수 있다.
따라서, 크로마토그래프 단계 또는 단계들은 적절하다면, 하나 이상의 세척 단계를 포함할 수 있다.
정제 공정은 또한, 하나 이상의 여과 단계, 예컨대 정용여과(diafiltration) 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA로부터 실질적으로 정제된, 특히 이러한 것들이 없거나 실질적으로 없는, 정제된 항-FcRn 항체 또는 단편, 예를 들어 인간화된 항체 또는 단편, 특히 본 발명에 따른 항체 또는 단편을 제공한다.
상기 사용된 바와 같이 정제된 형태는 적어도 90% 순도, 예컨대 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% w/w 이상 순수한 것을 지칭하고자 한다.
내독소가 실질적으로 없다는 것은 일반적으로, 내독소 함량이 항체 생성물 1 mg 당 1 EU 이하, 예컨대 생성물 1 mg 당 0.5 EU 또는 0.1 EU인 것을 지칭하고자 한다.
숙주 세포 단백질 또는 DNA가 실질적으로 없다는 것은 일반적으로, 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함량이 항체 생성물 1 mg 당 400 ㎍ 이하, 예컨대 100 ㎍/mg 이하, 특히 적절하다면 20 ㎍/mg인 것을 지칭하고자 한다.
본 발명의 항체 분자는 또한, FcRn을 수반하는 질병 상태의 진단, 예를 들어 생체내 진단 및 이미징에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체가 병리학적 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하기 때문에, 본 발명은 또한, 본 발명의 항체 분자를 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하는 약제학적 또는 진단학적 조성물을 제공한다. 이에, 본 발명은 약제의 제조를 위한, 본 발명의 항체 분자의 용도를 제공한다. 본 조성물은 통상, 약학적으로 허용 가능한 담체를 통상적으로 포함할 멸균된 약학 조성물의 일부로서 공급될 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 부가적으로, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항체 분자를 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 첨가하고 혼합하는 단계를 포함하는, 약제학적 또는 진단학적 조성물의 제조 방법을 제공한다.
항체 분자는 약제학적 또는 진단학적 조성물에서 단독적인 활성 성분일 수 있거나, 다른 항체 성분 또는 비-항체 성분을 포함하여 다른 활성 성분, 예컨대 스테로이드 또는 다른 약물 분자, 특히 반감기가 FcRn 결합과 독립적인 약물 분자를 수반할 수 있다.
약학 조성물은 적합하게는, 본 발명의 항체를 치료적 유효량으로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 표적화된 질병 또는 질환을 치료하거나, 완화시키거나 예방하거나, 검출 가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 지칭한다. 임의의 항체 분자에 있어서, 치료적 유효량은 세포 배양 검정법 또는 동물 모델, 통상 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 초기에 추정될 수 있다. 동물 모델은 또한, 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 확인하는 데 사용될 수 있다. 그런 다음, 이러한 정보는 인간에서 유용한 투약량 및 경로를 확인하는 데 사용될 수 있다.
인간 피험자에 대한 정확한 치료적 유효량은 질병 상태의 중증도, 피험자의 일반적인 건강상태, 피험자의 연령, 체중 및 성별, 식이요법, 투여 시간 및 빈도, 약물 병용(들), 반응 민감성 및 치료법에 대한 관용성/반응성에 따라 다를 것이다. 이러한 양은 일상적인 실험에 의해 확인될 수 있고, 임상의의 판단에 달려 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg, 예를 들어 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 예컨대 100 mg/kg일 것이다.
약학 조성물은 통상적으로, 1개 투약량 당 본 발명의 활성제를 예정된 양으로 함유하는 단위 투약 형태로 제시될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 치료적 투약량은 생체내에서 가시적인 독성학적 효과를 나타내지 않는다.
본 발명에 따른 항체 또는 단편의 일 실시형태에서, 단일 투약량은 순환중인 IgG 수준에서 70% 이하의 감소를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 단편의 일례에서, 단일 투약량은 순환중인 IgG 수준에서 80% 이하의 감소를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 단편의 일례에서, 단일 투약량은 순환중인 IgG 수준에서 80% 초과의 감소를 제공할 수 있다.
순환중인 IgG의 최대 치료적 감소는 관련된 치료적 투약량의 투여 후 약 1주일째에 관찰될 수 있다. IgG의 수준은, 추가의 치료적 투약량이 전달되지 않는다면, 투약 후 수주에 걸쳐 회복될 수 있다. 본원에 이용된 바와 같이 회복은, 수준이, 초기 투약이 시행되기 전에 관찰된 것과 유사한 수준으로 되돌아가는 것을 지칭한다.
유리하게는, 생체내에서 IgG의 수준은 본 발명에 따른 항체 또는 단편의 순차적인 투약량의 투여에 의해 적절하게 낮은 수준에서 유지될 수 있다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나, 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 (예를 들어 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로) 병용하여 투여될 수 있다.
본원에 이용된 바와 같이, 제제는 투여된 경우 생리학적 효과를 갖는 엔터티를 지칭한다.
본원에 이용된 바와 같이, 약물은 치료적 투약량에서 적절한 생리학적 효과를 갖는 화학적 엔터티를 지칭한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 면역억제제 치료법, 예컨대 스테로이드, 특히 프레드니손과 함께 이용된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 리툭시맙 또는 다른 B 세포 치료법과 함께 이용된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 임의의 B 세포 또는 T 세포 조정제 또는 면역조정제와 함께 이용된다. 예로는, 메토트렉세이트, 마이크로페니올레이트(microphenyolate) 및 아자티오프린(azathioprine)이 있다.
본 발명의 항체 분자가 투여되는 투약량은 치료되는 질환의 성질, 존재하는 염증의 범위, 및 항체 분자가 예방적으로 사용되는지 또는 기존의 질환을 치료하기 위해 사용되는지의 여부에 따라 달라진다.
투약 빈도는 항체의 반감기, 이의 표적-매개 성향, 이의 효과 기간, 및 항-약물 항체의 존재에 따라 다를 것이다. 항체가 짧은 반감기(수 시간) 또는 제한된 활성을 가진 경우 및/또는 (예를 들어 피하 주사를 위해) 소(small) 부피의 약물을 전달하는 것이 바람직한 경우, 1일 1회 이상과 같이 빈번하게, 빈번하게 투약하는 것이 필요할 수 있다. 대안적으로, 항체가 긴 반감기를 가지거나, 긴 활성 기간을 가지거나 (예컨대 주입에 의해) 큰 부피로 투약될 수 있는 경우, 투약은 덜 빈번하게, 1일 1회, 또는 수일, 수주 또는 수개월마다 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 항-약물 항체 수준이 저하될 수 있도록 투약량들 사이에 충분한 시간이 허용된다.
본원에 이용된 바와 같이, 반감기는 순환중인, 예를 들어 혈청/혈장에서의 분자의 기간을 지칭하고자 한다.
본원에 이용된 바와 같이, 약력학은 본 발명에 따른 분자의 프로파일, 특히 생물학적 작용 기간을 지칭한다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 그 자체가, 조성물을 수여 받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 유도해서는 안 되고, 독성이어서는 안 된다. 적합한 담체는 크고, 느리게 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어 무기산 염, 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염 및 벤조산염이 사용될 수 있다.
치료적 조성물에서 약학적으로 허용 가능한 담체는 부가적으로 액체, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 함유할 수 있다. 부가적으로, 보조 성분, 예컨대 습윤제, 유화제 또는 pH 완충 성분이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약학 조성물을 환자에 의해 섭취될 정제, 알약, 당제(dragee), 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로서 제형화할 수 있다.
적합한 투여 형태로는, 비경구 투여, 예를 들어 주사 또는 주입, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 적합한 형태가 있다. 생성물이 주사 또는 주입용인 경우, 이러한 생성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 제형화 제제, 예컨대 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 사용 전에 적절한 멸균 액체를 이용하여 재구성되기 위한 건조 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 조성물은 일단 제형화되면, 피험자에게 직접 투여될 수 있다. 치료를 받는 피험자는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 실시형태에서, 조성물은 인간 피험자에게 투여되도록 개조된다.
적합하게는 본 발명에 따른 제형에서, 최종 제형의 pH는 항체 또는 단편의 등전점 값과 유사하지 않은데, 예를 들어 단백질의 pI가 8 내지 9의 범위이거나 그보다 높은 경우, pH 7의 제형이 적절할 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이는 궁극적으로 최종 제형에 개선된 안정성을 제공할 수 있으며, 예를 들어 항체 또는 단편이 용액 내에 잔존하는 것으로 생각된다.
일례에서, pH 4.0 내지 7.0의 범위에서 약제학적 제형은: 1 mg/mL 내지 200 mg/mL의 본 발명에 따른 항체 분자, 1 mM 내지 100 mM의 완충제, 0.001% 내지 1%의 계면활성제, a) 10 mM 내지 500 mM의 안정화제, b) 10 mM 내지 500 mM의 안정화제 및 5 mM 내지 500 mM의 긴장성 제제(tonicity agent), 또는 c) 5 mM 내지 500 mM의 긴장성 제제를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 비제한적으로, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내(intramedullary), 수막강내(intrathecal), 심실내(intraventricular), 경피(transdermal), 피부통과(transcutaneous)(예를 들어 WO98/20734 참조), 피하, 복강내, 비내, 장관(enteral), 국소, 설하(sublingual), 질내 또는 직장 경로를 포함하는 임의의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 투여하기 위해, 하이포스프레이(hypospray)가 또한 사용될 수 있다. 전형적으로, 치료적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사 가능하게 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 중 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로, 주사, 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내에 의해 달성되거나 조직의 간극 공간(interstitial space)으로 전달될 것이다. 조성물은 또한, 병변 내로 투여될 수 있다. 투약 치료는 단일 투약량 스케쥴 또는 다중 투약량 스케쥴일 수 있다.
조성물 내 활성 성분은 항체 분자일 것으로 이해될 것이다. 이와 같이, 이러한 활성 성분은 위장관에서 분해되기 쉬울 것이다. 따라서, 조성물이 위장관을 사용한 경로에 의해 투여되어야 하는 경우, 조성물은, 항체를 분해로부터 보호하지만 일단 조성물이 위장관으로부터 흡수된 경우 항체를 방출하는 제제를 함유할 필요가 있을 것이다.
약학적으로 허용 가능한 담체에 관한 철저한 고찰은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, N.J. 1991)]에서 이용 가능하다.
일 실시형태에서, 제형은 흡입을 포함한 국소 투여용 제형으로서 제공된다.
적합한 흡입용 조제물로는, 흡입용 분말, 압축가스를 함유하는 미터링 에어로졸(metering aerosol) 또는 압축가스를 함유하지 않는 흡입용 용액이 있다. 활성 성분을 함유하는 본 발명에 따른 흡입용 분말은 오로지 상기 언급된 활성 성분으로만 구성되거나 상기 언급된 활성 성분과 생리학적으로 허용 가능한 부형제의 혼합물로 구성될 수 있다.
이들 흡입용 분말은 단당류(예를 들어 글루코스 또는 아라비노스), 이당류(예를 들어 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고당류 및 다당류(예를 들어 덱스트란), 폴리알코올(예를 들어 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 염(예를 들어 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 이들 서로의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 이당류, 적합하게는 락토스 또는 글루코스가 사용되는 경우, 이들은 특히 그러나 배제적으로가 아닌, 이들의 수화물 형태로 사용된다.
폐에서 침착될 입자는 10 미크론 미만, 예컨대 1 미크론 내지 9 미크론, 예를 들어 1 ㎛ 내지 5 ㎛의 입자 크기를 필요로 한다. 활성 성분(예컨대 항체 또는 단편)의 입자 크기가 가장 중요하다.
흡입용 에어로졸의 제조에 사용될 수 있는 압축가스는 당업계에 알려져 있다. 적합한 압축가스는 탄화수소, 예컨대 n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로탄화수소, 예컨대 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 사이클로프로판 또는 사이클로부탄의 염화된 및/또는 플루오르화된 유도체로부터 선택된다. 상기 언급된 압축가스는 이들 자체로 사용되거나 이들의 혼합물로 사용될 수 있다.
특히 적합한 압축가스는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227로부터 선택되는 할로겐화된 알칸 유도체이다. 상기 언급된 할로겐화된 탄화수소 중에서, TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이들의 혼합물이 특히 적합하다.
압축가스-함유 흡입용 에어로졸은 또한, 다른 성분, 예컨대 공용매, 안정화제, 표면 활성제(계면활성제), 항산화제, 윤활제 및 pH 조정 수단을 함유할 수 있다. 이들 모든 성분들은 당업계에 알려져 있다.
본 발명에 따른 압축가스-함유 흡입용 에어로졸은 활성 성분을 5 중량% 이하로 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은 활성 성분을 예를 들어, 0.002 중량% 내지 5 중량%, 0.01 중량% 내지 3 중량%, 0.015 중량% 내지 2 중량%, 0.1 중량% 내지 2 중량%, 0.5 중량% 내지 2 중량%, 또는 0.5 중량% 내지 1 중량%로 함유한다.
대안적으로, 폐로의 국소 투여는 또한, 예를 들어 분무기(nebulizer), 예를 들어 압축기에 연결된 분무기(예를 들어, 미국 버지니아주 리치몬드 소재의 Pari Respiratory Equipment, Inc.사에 의해 제작된 Pari Master(R) 압축기에 연결된 Pari LC-Jet Plus(R) 분무기)와 같은 장치를 이용한 액체 용액 또는 현탁액 제형의 투여에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 용매, 예를 들어 용액 또는 현탁액 형태 내에 분산되어 전달될 수 있다. 항체는 적절한 생리학적 용액, 예를 들어 식염수 또는 다른 약물학적으로 허용 가능한 용매 또는 완충된 용액 내에 현탁될 수 있다. 당업계에 알려진 완충된 용액의 예는, pH 약 4.0 내지 5.0를 달성하기 위해 1 ml 물 당 0.05 mg 내지 0.15 mg 에데테이트 이나트륨, 8.0 mg 내지 9.0 mg NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg 폴리소르베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg 무수 시트르산, 및 0.45 mg 내지 0.55 mg 시트르산나트륨을 함유할 수 있다. 현탁액은 예를 들어 동결건조된 항체를 이용할 수 있다.
치료적 현탁액 또는 용액 제형은 또한, 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 당업계에 알려져 있고, 완충제(예를 들어 시트르산염 완충제, 인산염 완충제, 아세트산염 완충제 및 중탄산염 완충제), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들어 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생분해성 마이크로스피어 내에서 캡슐화될 수 있다. 제형은 일반적으로, 멸균 제작 공정을 이용하는 실질적으로 멸균 형태로 제공될 것이다.
이는 당업자에게 친숙한 방법에 의해, 제형에 사용되는 완충된 용매/용액의 여과, 멸균 완충된 용매 용액에서의 항체의 무균 현탁, 및 멸균 용기 내로의 제형의 분배에 의한 생성 및 멸균을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 분무 가능한 제형은 예를 들어, 호일 외피에 포장된 단일 투약량 단위(예를 들어 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이얼)로서 제공될 수 있다. 각각의 바이얼은 용매/용액완충제 부피, 예를 들어 2 mL 내에 단위 투약량을 함유한다.
본원에 개시된 항체는 분무를 통한 전달에 적합할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 유전자 치료법의 사용에 의해 투여될 수 있는 것으로 예상된다. 이를 달성하기 위해, 적절한 DNA 구성성분의 조절 하에 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열이 환자 내에 도입되어, 항체 사슬이 DNA 서열로부터 발현되고 인 시추에서 어셈블리된다.
본 발명은 또한, 자가면역 질병, 예를 들어 급성 산재성 뇌척수염(ADEM), 급성 괴사성 출혈성 백질뇌척수염, 애디슨병, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모, 아밀로이드증, ANCA-연관 혈관염, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신염, 휴즈 증후군(APS), 자가면역 혈관부종, 자가면역 무형성 빈혈, 자가면역 자율 신경 장애, 자가면역 간염, 자가면역 고지질혈증, 자가면역 면역 결핍증, 자가면역 내이 질병(AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막증, 자가면역 혈소판감소성 자반증(ATP), 자가면역 갑상선 질병, 자가면역 두드러기, 축삭 및 날 신경병증(Autoimmune uricarial, Axonal & nal neuropathies), 발로병, 베체트병, 물집유사천포창, 심근증, 캐슬만병, 소아 지방변증, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 만성 재발성 다발성 골수염(CRMO), 처그-스트라우스 증후군, 흉터유사천포창/양성 점막 유사천포창, 크론병, 코간 증후군, 저온 응집병, 선천성 심장 차단, 콕사키 심근염, CREST 질병, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 탈수초성 신경병증, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(시신경척수염), 확장성 심근증, 원판상 낭창, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산성 혈관중심 섬유증, 호산성 근막염, 결절성 홍반, 실험적 알레르기성 뇌척수염, 에반스 증후군, 섬유화 폐포염, 거대세포 동맥염(측두 동맥염), 사구체신염, 굿파스처 증후군, 육아종 다발혈관염(GPA), 베게너 참조, 그레이브스병, 길랭-바레 증후군, 하시모토 뇌염, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인 자반증, 임신 포진, 저감마글로불린혈증, 특발성 저보체혈성 간질성 신염, 특발성 혈소판감소성 자반증(ITP), IgA 신경병증, IgG4-관련 질병, IgG4-관련 경화성 질병, 면역조절 지질단백질, 염증성 대동맥류, 염증성 가성 종양, 봉입체 근염, 인슐린-의존성 당뇨병(유형 1), 간질성 방광염, 연소성 관절염, 연소성 당뇨병, 가와사키 증후군, 커트너 종양, 람베르트-이튼 증후군, 백혈구파괴성 맥관염, 편평태선, 경화성태선, 목질결막염, 선상 IgA 질병(LAD), 낭창(SLE), 라임병, 만성, 종격 섬유증, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염, 미클리츠 증후군, 혼합 결합 조직병(MCTD), 무렌 궤양, 무카-하베르만병, 다발성 섬유경화증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증, 시신경척수염(데빅병), 호중구감소증, 안 흉터유사천포창, 시신경염, 오르몬드 질병(후복막 섬유증), 재발성 류머티즘, PANDAS(스트렙토콕커스와 연관된 소아성 자가면역 신경정신 장애), 부종양성 소뇌 변성, 파라단백혈성 다발신경병증, 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH), 패리 롬베르그 증후군, 파르소니지-터너 증후군, 평면부염(주변 포도막염), 심상성 천포창, 대동맥주위염, 동맥주위염, 말초 신경병증, 정맥주위 뇌척수염, 악성 빈혈, POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, 유형 I, II 및 III 자가면역 다선 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발근육염, 심근경색후 증후군, 심막절개술후 증후군, 프로게스테론 피부염, 원발성 쓸개관 간경화증, 원발성 경화 담관염, 건선, 건선성 관절염 특발성 폐 섬유증, 괴저성 농피증, 순 적혈구 무형성증, 레이노 현상, 반사 교감신경 이상증, 라이터 증후군, 재발성 다발연골염, 하지 불안 증후군, 후복막 섬유증(오르몬드 질병), 류마티스 열, 류마티스성 관절염, 리델 갑상선염, 사르코이드증, 시미트 증후군, 공막염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 강직 인간 증후군, 아급성 세균성 심내막염(SBE), 수작 증후군, 교감성 안염, 타까야수 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP), 톨로사-헌트 증후군, 횡단 척수염, 궤양성 대장염, 미분화 결합 조직 질병(UCTD), 포도막염, 혈관염, 대수포성 피부염, 백반증, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 온형 특발성 용혈성 빈혈 및 베게너 육아종증(현재 육아종 다발혈관염(GPA)으로 지칭됨)의 조절에 사용되기 위한 항체 분자(또는 항체 분자를 포함하는 조성물)를 제공한다.
부가적인 적응증(indication)으로는 또한, 과다점성 증후군; 한랭글로불린혈증; 이식된 신장에서 재발한 초점성 및 분절성 사구체경화증; HELLP 증후군; 레프섬병; HIV-관련 신경병증; 횡문근융해 및 동종면역 질병 등이 있을 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 간질 또는 발작의 치료 또는 예방에 이용된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 다발성 경화증의 치료 또는 예방에 이용된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 단편은
· 항-HLA 항체로 인한 이식 공여자 미스매치
· 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증, FNAIT(또는 신생아 동종면역 혈소판감소증, NAITP 또는 NAIT 또는 NAT, 또는 태아-모성(foeto-maternal) 동종면역 혈소판감소증, FMAITP 또는 FMAIT).
를 포함하는 동종면역 질병/적응증에 이용된다.
부가적인 적응증은 인간 환자로부터의 Fc-함유 생물약제학적 약물의 신속한 청소, 및 항-FcRn 치료법과 다른 치료법 - IVIg, 리툭산, 혈장사혈의 병용을 포함한다. 예를 들어, 항-FcRn 치료법은 리툭산 치료법 후에 이용될 수 있다. 또한, 항-FcRn 치료법은 종양을 이미징하는 데 사용된 방사성표지 항체와 같은 이미징 제제를 신속하게 청소하는 데 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 단편은
· 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP)
· 길랭-바레 증후군
· 파라단백혈성 다발신경병증
· 시신경척수염(NMO, NMO 스펙트럼 장애 또는 NMO 스펙트럼 질병) 및
· 중증 근무력증
과 같은 신경학적 장애에 이용된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 단편은
· 물집유사천포창
· 심상성 천포창
· ANCA-연관 혈관염 및
· 확장성 심근증
과 같은 피부학적 장애에 이용된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체 및 단편은
· 특발성 혈소판감소성 자반증(ITP)
· 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP)
· 온형 특발성 용혈성 빈혈
· 굿파스처 증후군 및
· 항-HLA 항체로 인한 이식 공여자 미스매치
와 같은 면역학적, 혈액학적 장애에 이용된다.
일 실시형태에서, 장애는 중증 근무력증, 시신경척수염, CIDP, 길랭-바레 증후군, 파라단백혈성 다발신경병증, 불응성 간질, ITP/TTP, 용혈성 빈혈, 굿파스처 증후군, ABO 미스매치, 낭창 신염, 신장 혈관염, 경피증, 섬유화 폐포염, 확장성 심근증, 그레이브스병, 1형 당뇨병, 자가면역 당뇨병, 천포창, 경피증, 낭창, ANCA 혈관염, 피부근염, 쇼그렌병 및 류마티스성 관절염으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 장애는 자가면역 다내분비성 증후군 유형 1(APECED 또는 휘태커 증후군) 및 유형 2(시미트 증후군); 전신 탈모증; 근무력증 위기; 갑상선 위기; 갑상선 연관 안질환; 갑상선 안구병증; 자가면역 당뇨병; 자가항체 연관 뇌염 및/또는 뇌병증; 낙엽성천포창; 수포성 표피박리증; 포진성 피부염; 시드남 무도병; 급성 운동 축삭 신경병증(AMAN); 밀러-피셔 증후군; 다초점성 운동 신경병증(MMN); 안구간대경련; 염증성 근병증; 이삭 증후군(자가면역 신경근긴장증), 부신생물 증후군 및 변연계 뇌염으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 항체 및 단편은 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항-FcRn 항체 융합 단백질을 치료적 유효 투약량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 바람직하지 못한 항체의 농도의 감소 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 자가면역 질병과 같은 본원에 기재된 병리학적 장애의 치료 및/또는 예방용 약제의 제조에 있어서 본 발명에 따른 항체 분자의 용도를 제공한다.
이에, 본 발명은 또한, 급성 산재성 뇌척수염(ADEM), 급성 괴사성 출혈성 백질뇌척수염, 애디슨병, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모, 아밀로이드증, ANCA-연관 혈관염, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신염, 휴즈 증후군(APS), 자가면역 혈관부종, 자가면역 무형성 빈혈, 자가면역 자율 신경 장애, 자가면역 간염, 자가면역 고지질혈증, 자가면역 면역 결핍증, 자가면역 내이 질병(AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막증, 자가면역 혈소판감소성 자반증(ATP), 자가면역 갑상선 질병, 자가면역 두드러기, 축삭 및 날 신경병증, 발로병, 베체트병, 물집유사천포창, 심근증, 캐슬만병, 소아 지방변증, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 만성 재발성 다발성 골수염(CRMO), 처그-스트라우스 증후군, 흉터유사천포창/양성 점막 유사천포창, 크론병, 코간 증후군, 저온 응집병, 선천성 심장 차단, 콕사키 심근염, CREST 질병, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 탈수초성 신경병증, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(시신경척수염), 확장성 심근증, 원판상 낭창, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산성 혈관중심 섬유증, 호산성 근막염, 결절성 홍반, 실험적 알레르기성 뇌척수염, 에반스 증후군, 섬유화 폐포염, 거대세포 동맥염(측두 동맥염), 사구체신염, 굿파스처 증후군, 육아종 다발혈관염(GPA), 베게너병 참조, 그레이브스병, 길랭-바레 증후군, 하시모토 뇌염, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인 자반증, 임신 포진, 저감마글로불린혈증, 특발성 저보체혈성 간질성 신염, 특발성 혈소판감소성 자반증(ITP), IgA 신경병증, IgG4-관련 질병, IgG4-관련 경화성 질병, 면역조절 지질단백질, 염증성 대동맥류, 염증성 가성 종양, 봉입체 근염, 인슐린-의존성 당뇨병(유형 1), 간질성 방광염, 연소성 관절염, 연소성 당뇨병, 가와사키 증후군, 커트너 종양, 람베르트-이튼 증후군, 백혈구파괴성 맥관염, 편평태선, 경화성태선, 목질결막염, 선상 IgA 질병(LAD), 낭창(SLE), 라임병, 만성, 종격 섬유증, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염, 미클리츠 증후군, 혼합 결합 조직병(MCTD), 무렌 궤양, 무카-하베르만병, 다발성 섬유경화증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증, 시신경척수염(데빅병), 호중구감소증, 안 흉터유사천포창, 시신경염, 오르몬드 질병(후복막 섬유증), 재발성 류머티즘, PANDAS(스트렙트콕커스와 연관된 소아성 자가면역 신경정신 장애), 부종양성 소뇌 변성, 파라단백혈성 다발신경병증, 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH), 패리 롬베르그 증후군, 파르소니지-터너 증후군, 평면부염(주변 포도막염), 심상성 천포창, 대동맥주위염, 동맥주위염, 말초 신경병증, 정맥주위 뇌척수염, 악성 빈혈, POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, 유형 I, II 및 III 자가면역 다선 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발근육염, 심근경색후 증후군, 심막절개술후 증후군, 프로게스테론 피부염, 원발성 쓸개관 간경화증, 원발성 경화 담관염, 건선, 건선성 관절염, 특발성 폐 섬유증, 괴저성 농피증, 순 적혈구 무형성증, 레이노 현상, 반사 교감신경 이상증, 라이터 증후군, 재발성 다발연골염, 하지 불안 증후군, 후복막 섬유증(오르몬드 질병), 류마티스 열, 류마티스성 관절염, 리델 갑상선염, 사르코이드증, 시미트 증후군, 공막염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 강직 인간 증후군, 아급성 세균성 심내막염(SBE), 수작 증후군, 교감성 안염, 타까야수 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP), 톨로사-헌트 증후군, 횡단 척수염, 궤양성 대장염, 미분화 결합 조직 질병(UCTD), 포도막염, 혈관염, 대수포성 피부염, 백반증, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 온형 특발성 용혈성 빈혈 및 베게너 육아종증(현재 육아종 다발혈관염(GPA)으로 지칭됨)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역 질병의 조절에 사용되기 위한 항체 분자(또는 항체 분자를 포함하는 조성물)를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 예를 들어 리포터 분자에 컨쥬게이션된 진단용 시약으로서의 항체 또는 이의 단편의 용도를 포함한다. 따라서, 본 발명은 표지된 본 발명에 따른 항체 또는 단편을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 컬럼을 제공한다.
따라서, 본 발명은
1) FcRn 단백질(또는 이의 단편)의 정제 - 매트릭스에 컨쥬게이션되어 있으며 (항-FcRn의 변형된 형태로서) 친화성 컬럼으로서, 또는 침전 제제(precipitating agent)(예를 들어 선택적으로 항-Fc 시약에 의해 침전되는 Fc의 첨가에 의해 변형(또는 전장 IgG로서 생성)될 수 있는 또 다른 분자에 의해 인지되는 도메인을 이용하여 변형된 형태로서 사용된다.
2) 살아 있거나 고정된 세포 상에서 또는 세포(조직 또는 세포 절편에서 시험관내에서 또는 생체내에서의 세포) 내에서 FcRn의 검출 및/또는 정량화. 이를 위한 용도는 항-FcRn 치료의 효과를 알아보기 위해, 바이오마커로서 FcRn의 정량화를 포함할 수 있다. 이들 목적을 위해, 후보물질은 변형된 형태로 사용될 것이다(예를 들어 Fc 도메인의 첨가에 의해, 전장 IgG로서, 또는 일부 다른 모이어티로서, 유전적 융합 단백질 또는 화학적 컨쥬게이트로서, 예컨대 검출용으로 사용된 형광 태그의 첨가에 의해).
3) (1) 및 (2)에서 예시된 방식에 의해 변형된 후보물질에의 결합에 의해 표지된 FcRn-함유 세포의 정제 또는 소팅
과 같은 용도를 위한 시약으로서 사용되기 위한 항-FcRn 항체 또는 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 항체 분자와 같은 시험 분자가 FcRn 활성을 차단하는 능력, 특히 세포가 IgG를 재순환시키는 능력을 평가하는 데 적합한 검정법을 제공한다. 이러한 검정법은 FcRn 활성의 저해제, 예칸대 항체 분자 또는 저분자를 동정하는 데 유용할 수 있으며, 이와 같이 이러한 저해제의 생성에서 회분식 방출 검정법으로서 유용할 수도 있다. 이러한 검정법은 WO2014/019727에 이미 기재되었다.
본 명세서의 맥락에서 포함하는(comprising)이라는 표현은 수반하는(including)을 의미하고자 한다.
기술적으로 적절하다면, 본 발명의 실시형태들은 조합될 수 있다.
실시형태는 소정의 특징/요소들을 포함하는 것으로 본원에 기재되어 있다. 본 개시내용은 또한, 상기 특징/요소들로 구성되거나 본질적으로 구성된 개별 실시형태까지 확장된다.
특허 및 출원관 같은 기술적 참조들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
나아가, 본 발명은 첨부된 도면을 지칭하는 하기 실시예에 의해서 예시로만 기재되어 있으며, 도면에서:
도 1은, 1735h5.hFab-scFv.768이 MDCK II 클론 7 세포에서 IgG 재순환을 저해함을 보여준다.
도 2는 인간 FcRn-유전자 도입 마우스의 혈청에서 인간 IVIg의 농도에 미치는 1735h5.hFab-scFv.768의 효과를 보여준다.
도 3은 인간 FcRn-유전자 도입 마우스에서 혈청 알부민의 농도에 미치는 1735h5.hFab-scFv.768의 효과를 보여준다.
도 4는 정상 마우스에서 1735h5.hFab-scFv.768의 약물 동력학을 보여준다.
도 5는 인간 FcRn-유전자 도입 마우스에서 1735h5.hFab-scFv.768의 약물 동력학을 보여준다.
도 6은 부모 Fab 및 동등한 Fab-Fv와 비교하여, 1735h5.hFab-scFv.768(Fab-scFv)의 열적 안정성을 보여준다.
도 7은 본 발명의 Fab-scFv 및 Fab-dsscFv 단편 포맷을 보여준다.
도 8은 본 발명에 따른 항체 서열을 보여준다.
도 9a는 항체 1638.g49의 인간화를 보여준다.
도 9b는 항체 1638.g49의 인간화를 보여준다.
실시예
약어
℃ 온도, 섭씨 온도.
ATR FTIR 감쇠 전반사 푸리에 변환 적외선 분광법
CH2 중쇄 불변 영역 2
cIEF 모세관 등전점 집중
DSC 시차 주사 열량계
G0F 푸코실화된 아글락토실 비안테나리 글리칸
H 사슬 중쇄
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
IgG 면역글로불린 G
L 사슬 경쇄
nLCMS 나노-액체 크로마토그래피 질량 분광법
PBS 인산염-완충된 식염수 완충제
pI 등전점
SD 표준 편차
SEC 크기 배제 크로마토그래피
ToF 비행 시간(time of flight)
Tm 용융점
TCEP 트리스(2-카르복시에틸)포스핀
THP 트리스(하이드록시프로필)포스핀
Tris 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄
B 세포 배양 및 항체 스크리닝용 물질을 발생시키기 위해, 하기 면역화를 수행하였다:
스프라그 달리(Sprague Dawley) 래트에게 돌연변이체 인간 FcRn(L320A; L321A)(문헌[Ober et al., 2001 Int. Immunol. 13, 1551-1559]) 및 마우스 β2M을 공동발현하는 NIH3T3 마우스 섬유아세포를 3회 면역화하고, 4번째에는 인간 FcRn 세포외 도메인을 사용하여 마지막으로 부스팅하였다.
HEK-293 세포 상의 돌연변이체 FcRn에의 결합, 및 Alexafluor 488-표지된 인간 IgG의 결합을 방지하는 능력 둘 다에 대해 혈청을 모니터링하였다. 두 방법 모두를 유세포분석에 의해 수행하였다. 결합을 위해, 피코에리트린(PE)-표지된 항마우스 또는 항래트 Fc 특이적 2차 시약을 사용하여, 혈청 중 IgG의 결합을 보여주었다.
B 세포 배양물을 Zubler 등(1985)에 의해 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 제조하였다. 간략하게는, 약 5,000개 세포/웰의 밀도의 B 세포를, 10% FCS(PAA laboratories ltd), 2% HEPES(Sigma Aldrich), 1% L-글루타민(Gibco BRL), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Gibco BRL), 0.1% β-머캅토에탄올(Gibco BRL), 2% 내지 5% 활성화된 토끼 비장세포 배양 상층액 및 감마-조사된 EL-4-B5 뮤린 흉선종 세포(5x104/웰)가 보충된 200 ㎕/웰 RPMI 1640 배지(Gibco BRL)가 든 바코디드(bar-coded) 96웰 조직 배양 플레이트에서 37℃, 5% CO2의 분위기에서 7일 동안 배양하였다.
B 세포 배양 상층액 중 FcRn-특이적 항체의 존재를, 돌연변이체 FcRn으로 일시적으로 형질감염된(표면-안정화된) HEK-293 세포를 표적 항원의 공급원으로서 사용하여 균질한 형광-기반 결합 검정법에 의해 확인하였다. 상층액 10 ㎕를, 바코디드 96웰 조직 배양 플레이트로부터 1개 웰 당 5,000개의 형질감염된 HEK-293 세포를 함유하는 바코디드 384웰 블랙-월드(black-walled) 검정법 플레이트 내로 매트릭스 플레이트메이트 액체 핸들러(Matrix Platemate liquid handler)를 사용하여 옮겼다. 결합을 염소 항-래트 또는 마우스 IgG Fcγ-특이적 Cy-5 컨쥬게이트(Jackson)를 이용하여 나타내었다. 플레이트를 Applied Biosystems 8200 세포 검출 시스템 상에서 판독하였다. 38마리의 상이한 면역화된 동물을 나타내는 3800 x 96웰 배양 플레이트로부터, 9800개의 항-인간 FcRn 결합제를 동정하였다. 이는 약 25억개의 B 세포의 스크리닝을 나타낸 것으로 추정되었다.
1차 스크리닝 후, 양성 상층액을 Aviso Onyx 히트-피킹 로봇(hit-picking robot)을 사용하여 96웰 바코디드 마스터 플레이트 상에 통합하고, 세포 배양 플레이트 내의 B 세포를 -80℃에서 냉동하였다. 그런 다음, 마스터 플레이트를 Biacore 검정법에서 스크리닝하여, 높은 친화성을 가진 항체, 및 인간 IgG가 FcRn에 결합하는 것을 저해한 항체를 함유하는 웰을 동정하였다(하기 참조).
표면 플라즈몬 공명 기술(SPR)을 사용한 생체분자 상호작용 분석을 BIAcore T200 시스템(GE Healthcare) 상에서 수행하였다. 10 mM NaAc, pH 5 완충제 중 염소 항-래트 IgG, Fc 감마(Chemicon International Inc.)를 아민 커플링 화학을 통해 CM5 센서 칩 상에, 진행 완충제(running buffer)로서 HBS-EP+를 사용하여 약 19,500개 반응 단위(RU)의 포착 수준까지 고정하였다. 50 mM 인산염, pH6 + 150 mM NaCl을 친화성 및 차단 검정법용 진행 완충제로서 사용하였다. B 세포 배양 상층액을 200 mM 인산염, pH6 +150 mM NaCl에서 1/5로 희석시켰다. 희석된 B 세포 상층액을 5 ㎕/min의 속도로 600초 동안 주사하는 것을, 고정화된 항-래트 IgG, Fc에 의한 포착에 사용하였다. 100 nM에서 인간 FcRn을 포착된 B 세포 배양 상층액에 걸쳐 30 ㎕/min의 속도로 180초 동안 주사하고, 후속해서 360초 동안 해리시켰다. 인간 IgG(Jackson ImmunoResearch)를 30 ㎕/min의 속도로 60초 동안 주사하고 180초 동안 해리시켰다.
데이터를 T200 평가 소프트웨어(버전 1.0)를 사용하여 분석하여, 항체의 친화성 상수(KD)를 확인하고, IgG 결합을 차단한 것을 확인하였다.
대안적인 검정법으로서, 마스터 플레이트 상층액을 또한, 세포-기반 인간 IgG 차단 검정법에서 스크리닝하였다. 마스터 플레이트 유래의 B 세포 배양 상층액 25 ㎕를 96웰 U-바닥 폴리프로필렌 플레이트에 첨가하였다. 그런 다음, 돌연변이체 hFcRn-형질감염된 HEK-293 세포(25 ㎕ PBS pH6/1% FCS 중 50,000개 세포/웰)를 각각의 웰에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 150 ㎕의 PBS 배지를 사용하여 2회 세척하였다. 그런 다음, 세포를, 7.5 ㎍/ml에서 Alexafluor 488 또는 649로 표지된 인간 IgG를 함유하는 50 ㎕/웰 PBS/FCS 배지에 재현탁하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 150 ㎕의 배지를 사용하여 2회 세척한 다음, 고정제로서 1% 포름알데하이드를 함유하는 PBS/FCS의 35 ㎕/웰로 재현탁하였다. 그런 다음, 플레이트를 FACS Canto 2 유세포분석기 상에서 판독하였다.
항체 가변 영역 유전자가 관심 웰의 선별로부터 회수될 수 있도록, 불균질한 B 세포 집단을 함유하는 주어진 웰에서 항원-특이적 B 세포의 동정을 가능하게 하기 위해 디콘볼루션(deconvolution) 단계를 수행해야 했다. 이를 형광 포사이(fluorescence foci) 방법을 사용하여 달성하였다. 간략하게는, 양성 웰 유래의 면역글로불린-분비 B 세포를, 비오틴화된 인간 FcRn으로 코팅된 스트렙타비딘 비드(New England Biolabs) 및 1:1200 최종 희석의 염소 항-래트 또는 마우스 Fcγ 단편-특이적 FITC 컨쥬게이트(Jackson)와 혼합하였다. 37℃에서 1시간 동안 정적 인큐베이션(static incubation)한 후, 항원-특이적 B 세포는 해당 B 세포 주변의 형광 할로(halo)의 존재로 인해 동정될 수 있었다. 그런 다음, Olympus 현미경을 사용하여 동정된 이들 개별 B 세포를 Eppendorf 마이크로매니퓰레이터를 이용하여 집은(picking) 다음, PCR 튜브 내에 넣었다. 형광 포사이가 268개의 선별된 웰로부터 발생되었다.
항체 가변 영역 유전자를, 중쇄 및 경쇄 가변 영역-특이적 프라이머를 사용하는 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT)-PCR에 의해 단일 세포로부터 회수하였다. Aviso Onyx 액체 핸들링 로봇 상에서 PCR을 2회 수행하였으며, 이때, 3' 및 5' 말단에 네스티드(nested) 2° PCR 혼입 제한 부위가 존재하여, 가변 영역이 마우스 γ1 IgG(VH) 또는 마우스 카파(VL) 포유류 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있게 하였다. 쌍으로 된 중쇄 및 경쇄 구축물을 Fectin 293(Invitrogen)을 사용하여 HEK-293 세포 내로 공동형질감염시키고, 48웰 플레이트에서 1 ml의 부피에서 배양하였다. 5일 내지 7일 동안 발현시킨 후, 상층액을 수합하고, 항체를 추가로 스크리닝 처리하였다.
PCR은 선별된 웰 중 156개의 단일 B 세포로부터 중쇄 및 경쇄 코그니트 쌍(cognate pair)을 성공적으로 회수하였다. 클로닝된 가변 영역 유전자의 DNA 서열 분석은 재조합 항체의 다수의 독특한 패밀리들을 동정하였다. 발현 후, 일시적인 상층액을 인간 IgG FACS 차단 검정법(상기 기재됨) 및 IgG 재순환 검정법 둘 다에서 조사하였다. 일부 경우, 정제된 마우스 γ1 IgG가 생성되었으며, 시험되었다(이에 맞게 표지된 데이터).
재순환 검정법은, 96웰 플레이트의 1개 웰 당 25,000개 세포로 평판배양된 인간 FcRn 및 베타 2 마이크로글로불린을 과발현하는 MDCK II 세포를 사용하였다. 이들을 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 HBSS+ Ca/Mg pH 7.2+1% BSA를 이용하여 세척한 다음, 다양한 농도의 HEK-293 일시적인 상층액 또는 정제된 항체 50 ㎕와 함께 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 제거하고, 50 ㎕의 HBSS+ Ca/Mg pH 5.9 +1%BSA 중 500 ng/ml의 비오틴화된 인간 IgG(Jackson)를 세포에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 HBSS+ Ca/Mg pH 5.9에서 3회 세척하고, HBSS+ Ca/Mg pH 7.2 100 ㎕를 세포에 첨가한 다음, 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 세포로부터 제거하고, 항-인간 IgG 포착 항체(Jackson) 및 스트렙타비딘-설포 태그 노출(reveal) 항체(MSD)를 이용하여 MSD 검정법에 의해 총 IgG에 대해 분석하였다. 저해 곡선을 비선형 회귀에 의해 분석하여, IC50 값을 확인하였다.
이들 검정법에서의 성능을 기반으로, 서열 번호 1 내지 서열 번호 6에 제시된 6개의 CDR을 포함하는 항체 패밀리를 선별하였다. 항체 CA170_01638이 최상의 활성을 가졌으며, 이전에 WO2015/071330에 기재된 바와 같이 인간화를 위해 선별되었다.
실시예 1 인간화 방법
래트 항체 V-영역 유래의 CDR을 인간 생식선 항체 V-영역 프레임워크 상으로 그래프팅함으로써 항체 CA170_01638을 인간화시켰다. 항체의 활성을 회복시키기 위해, 래트 V-영역 유래의 다수의 프레임워크 잔기들을 또한, 인간화된 서열에 유지시켰다. 이들 잔기를 Adair 등(1991)(인간화된 항체 WO91/09967)에 의해 기재된 프로토콜을 사용하여 선별하였다. 래트 항체(공여자) V-영역 서열과 인간 생식선(수여자) V-영역 서열의 정렬은 디자인된 인간화된 서열과 함께 도 9a 및 도 9b에 나타나 있다. 공여자로부터 수여자 서열로 그래프팅된 CDR은 Kabat(문헌[Kabat et al., 1987])에 의해 정의된 바와 같으며, 단, 조합된 Chothia/Kabat 정의가 사용된 CDR-H1은 예외였다(문헌[Adair et al., 1991 Humanised antibodies]. WO91/09967 참조). 인간 V-영역 IGKV1-27 + JK4 J-영역(http://www.imgt.org/)을 경쇄 CDR용 수여자로서 선택하였다. 인간 V-영역 IGHV3-7 + JH3 J-영역(http://www.imgt.org/)을 중쇄 CDR용 수여자로서 선택하였다.
다수의 변이체 경쇄 및 중쇄 V-영역 서열들을 코딩하는 유전자들을 디자인하고, Entelechon GmbH사에 의한 자동화된 합성 접근법에 의해 구축하였다. 중쇄 및 경쇄 V-영역 둘 다의 추가의 변이체들을, VH 및 VK 유전자를 올리고뉴클레오타이드-특이적 돌연변이생성에 의해 변형시킴으로써 제작하였다. 이들 유전자를 다수의 벡터 내로 클로닝하여, 이. 콜라이 및 포유류 세포에서 인간화된 1638 Fab 또는 1735h5.hFab-scFv.768을 각각 발현시킬 수 있었다. 변이체 사슬들 및 이들의 조합을 gL7 경쇄 그래프트 및 gH33 중쇄 그래프트의 선별을 초래하는, 부모 항체와 비교하여 이들의 효능, 이들의 생물물리학적 특성 및 다운스트림 가공에 대한 적합성에 대해 평가하였다. 최종 선별된 gL7 및 gH33 그래프트 서열들을 각각 도 9a 및 도 9b 및 서열 번호 8 및 서열 번호 9에 나타낸다. 이러한 V-영역 페어링을 1638.g49로 명명하였다.
그래프트 gL7 내의 경쇄 프레임워크 잔기들은 잔기 70 및 71(Kabat 넘버링)을 제외하고는 모두 인간 생식선 유전자 유래이며, 이때, 공여자 잔기 히스티딘(H70) 및 티로신(Y71)은 각각 유지되었다. 이들 2개 잔기의 체류는 인간화된 항체 또는 Fab의 총 효능에 중요하였다. gL7 그래프트의 CDRL2의 잔기 56은 아스파르트산(D56)으로부터 글루탐산(E56) 잔기로 돌연변이화되었으며, 따라서 잠재적인 아스파르트산 이성질화 부위를 gL7 서열로부터 제거하였다. 그래프트 gH33 내의 중쇄 프레임워크 잔기들은 잔기 48 및 78(Kabat 넘버링)을 제외하고는 모두 인간 생식선 유전자 유래이며, 이때, 공여자 잔기 루신(L48) 및 알라닌(A78)은 각각 유지되었다. 이들 2개 잔기의 체류는 인간화된 1638.g49 Fab 또는 1735h5.hFab-scFv.768의 총 효능에 필수적이었다.
또 다른 조기(earlier) 그래프트, 1638.g28이 또한 생성되었으며, 이는 1638.g49 그래프트(F24, L48, K71, T73, A78 및 V93)보다 중쇄(gH2)에 더 많은 공여자 잔기를 함유하였다. 또한, 이러한 항체의 경쇄(gL2)는, 1638.g49에 사용되는 서열 번호 7의 변형된 CDRL2보다는 서열 번호 5에 제시된 비변형된 CDRL2를 함유한다. 2개 세트의 항체의 서열들은 도 8에 주어져 있다.
이. 콜라이에서 1638.g49 Fab의 발현을 위해, 인간화된 중쇄 및 경쇄 V-영역 유전자를, 인간 C-카파 불변 영역(K1m3 알로타입(allotype)), 절단된 힌지와 함께 인간 감마-1 CH1 불변 영역(G1m17 알로타입), 및 이. 콜라이 샤페론 단백질 FkpA 및 DsbC를 코딩하는 DNA들을 함유하는 UCB 발현 벡터 pMXE811 내로 클로닝하였다.
1638.g49 가변 도메인을 포함하는 Fab-dsscFv 융합 단백질을, 도 8에서 각각 서열 번호 12 및 서열 번호 10에 제시된 중쇄 및 경쇄 서열을 사용하여 WO2013/068571의 실시예 4에 기재된 바와 같이 구축하였으며, 필수적으로 발현시켰다. 포유류 세포에서 1735h5.hFab-scFv.768로 지칭되는 Fab-dsscFv 융합 단백질의 발현을 위해, 인간화된 경쇄 V-영역 유전자를 인간 C-카파 불변 영역(K1m3 알로타입)을 코딩하는 DNA 서열에 접합시켜, 인접한(contiguous) 1735h5.hFab-scFv.768 경쇄 유전자를 제작하였다. 인간화된 중쇄 V-영역 유전자를 인간 감마-1 CH1 불변 영역 도메인을 코딩하는 DNA 서열에 접합시켰다. 중쇄 불변 영역을 4x GGGGS 링커 및 알부민 결합 dsscfv 645 gH5 gL4를 코딩하는 DNA 서열에 접합시켜, 인접한 1735h5.hFab-scFv.768 중쇄 유전자를 제작하였다. 중쇄 및 경쇄 유전자를 포유류 이중 유전자 발현 벡터 pMXE755 내로 클로닝하여, 1735h5.hFab-scFv.768을 제작하였다.
실시예 2 1735h5.hFab-scFv.768의 제조
1735h5.hFab-scFv.768을 안정한 디하이드로엽산 환원효소(DHFR; dihyrofolate reductase) 결핍 차이니즈 햄스터 난소 세포주(CHO DG44)에서 발현시켰다.　세포를 Nuclefector(Lonza)를 제조업체의 지시사항에 따라 사용하여, 선별 마커로서 DHFR용 유전자 및 생성물을 코딩하는 유전자를 둘 다 함유하는 플라스미드 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 하이포크산틴 및 티미딘이 결여된 배지에서 DHFR 저해제 메토트렉세이트의 존재 하에 선별하였다. 미니풀(minipool)을 쉐이커 플라스크 단계까지 배양한 후, 성장 및 생산성을 평가하고, 최고 발현 클론을 유가식(fed-batch) 쉐이크 플라스크 공정에서의 평가를 위해 선택하였다. 8 L의 배양물을 0.3x106 살아있는 세포/mL의 출발 밀도로 접종하고, 36.8℃, 5% CO2 분위기에서 조절하였다. 영양소 공급물을 제3일 내지 제12일에 첨가하고, 글루코스를 농도가 5.8 g/L 미만으로 하락했을 때 볼루스 첨가로서 첨가하였다. 배양물을 제14일에 4000 x g에서 60분 동안 원심분리를 통해 수합하고, 0.2 ㎛ 여과하였다.
미니풀 4D4 유래의 정제된 세포 배양 상층액을 0.22 ㎛ 멸균 여과시키고, 하기와 같이 정제하였다. 여과된 상층액을 18 ml/min 미만에서, PBS pH7.4(Sigma Aldrich Chemicals)에서 평형화된 450 ml GammabindPlus Sepharose XK50 컬럼(GE Healthcare) 상으로 로딩하였다. 로딩 후, 컬럼을 PBS pH7.4를 이용하여 세척한 다음, 0.1 M 글리신/HCl. pH2.7을 이용하여 용리하였다. 용리 후, 280 nm에서 흡광도에 의해 분석하고, 용리 피크를 수합한 다음, 2 M Tris/HCl pH8.5를 이용하여 중화시켰다. 중화된 시료를, 10 kDa 분자량 컷오프 막과 함께 Vivaflow 50 카세트(Sartorious)를 사용하여 농축시켰다. 분취물을 TSK 겔 G3000SWXL; 1 ml/min에서 0.2 M 인산염, pH7.0의 등용매 구배(isocratic gradient)를 이용하여 발색되며 280 nm에서의 흡광도에 의해 검출되는 5 ㎛, 7.8 X 300 mm 컬럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 단량체 %는 90%인 것으로 확인되었다. 농축된 시료의 벌크(bulk)를 PBS, pH7.4에서 평형화된 XK50/60 Superdex200 컬럼(GE Healthcare)에 적용하였다. 컬럼을 10 ml/min 속도로 PBS, pH7.4의 등용매 구배에 의해 발색시켰다. 분획을 수합하고, TSK 겔 G3000SWXL; 1 ml/min에서 0.2 M 인산염, pH7.0의 등용매 구배를 이용하여 발색되며 280 nm에서의 흡광도에 의해 검출되는 5 ㎛, 7.8 X 300 mm 컬럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 선별된 단량체 분획을 풀링하고, 10 kDa 분자량 컷오프 막과 함께 Amicon Ultra-15 농축기를 사용하여 20 mg/ml 미만까지 농축시키고, 스윙 아웃 로터(swing out rotor)에서 4000xg에서 원심분리하였다. 최종 시료를; 농도에 대해서는 A280 Scanning UV-가시광선 분광광도계(Cary 50Bio)에 의해; 단량체 %에 대해서는 TSK 겔 G3000SWXL; 1 ml/min에서 0.2 M 인산염, pH7.0의 등용매 구배를 이용하여 발색되며 280 nm에서의 흡광도에 의해 검출되는 5 ㎛, 7.8 X 300 mm 컬럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피에 의해; 4% 내지 20% Tris-글리신 1.5 mm 겔(Novex) 상에서 50 mA(1개 겔 당)에서 53분 동안 진행된 환원 및 비환원 SDS-PAGE에 의해; 및 내독소에 대해서는 Limulus Amebocyte Lysate(LAL) 시험 카트리지와 함께 Charles River's EndoSafe® 휴대용 시험 시스템에 의해 검정하였다.
실시예 3
부가적인 Fab-dsscFv 항체를 Fab 위치에서 고정된 대안적인 항-FcRn V-영역을 사용하여 디자인하였으며, 이들은 WO2014/019727에 이전에 기재된 1519.g57 V 영역이었으며, 본원에서는 경쇄 및 중쇄 도메인에 대해 각각 서열 번호 92 및 서열 번호 94로 제공되었다. 이러한 Fab를 실시예 1에 기재된 바와 같이 알부민 결합 dsscFv 645 gH5 gL4에 (HL 배향(dsHL)으로) 연결하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 이들 분자를 중쇄(HC) Fab-dsscFv 또는 경쇄(LC) Fab-dsscFv로서 구축하였다. HC Fab-dsscFv에 대해, HC의 CH1 영역의 C-말단을 G4S-기반 링커(11개 아미노산)를 통해 dsscFv에 연결하고, 이러한 HC는 1519 경쇄 cKappa 사슬(LC)과 쌍을 이루고; 유사하게는 LC Fab-dsscFv에 대해, LC의 cKappa 영역의 C-말단을 G4S-기반 링커(11개 아미노산)를 통해 dsscFv에 연결하고, 이러한 LC는 1519 CH1 HC(힌지 없음)와 쌍을 이룬다. 힌지가 없는 1519 Fab(nh)를 대조군으로서 사용하였다.
Figure pct00006
유전자를 hCMV 프로모터의 조절 하에 등록된(proprietary) 포유류 발현 벡터 내로 클로닝하고, 일시적인 발현을 위해 CD CHO 배지(Life Technologies) 및 2 mM 글루타막스를 사용하여 CHO-S XE 세포주(UCB) 내로 형질감염시켰다. 배양물을 Kuhner 쉐이커 내에서 37℃, 8.0% CO2, 140 rpm에서 인큐베이션하고, 세포가 2 x 105 세포/ml 초과에 도달했을 때(약 24시간) 상기 T℃를 32℃까지 감소시켰다. 형질감염후 3일째에, 형질감염물 1 L 당 3 mM 부티르산나트륨(Sigma-Aldrich)을 각각의 플라스크에 무균 첨가하였다. 배양물을 총 14일 동안 인큐베이션하였다. 배양물을 4℃에서 4000 rpm에서 1시간 동안 원심분리함으로써 상층액을 수합하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과 멸균하였다. 발현 역가를, 1 ml GE HiTrap 단백질 G 컬럼(GE Healthcare) 및 인하우스 생성된 Fab 표준을 사용한 단백질 G HPLC에 의해 정량화하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, HC Fab-scFv의 발현 역가가 LC Fab-scFv와 비교하여 약 1.5배 증가한 것이 관찰되었다.
Figure pct00007
항체 단백질을 단백질 G 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 간략하게는, 상층액을 HiTrap 단백질 G(GE Healthcare) 상에 로딩한 다음, PBS pH 7.4로 세척하였다. 결합된 물질을 0.1 M 글리신 pH 2.7을 이용하여 용리하고, 2 M Tris-HCl(pH 8.5)을 이용하여 중화시킨 다음, PBS pH 7.4로 완충제를 교환하였다. 용리된 단백질을 280 nm에서 흡광도에 의해 정량화하고, 추가의 분석을 위해 4℃에서 저장하였다.
크기 배제 크로마토그래피(SE HPLC)를 사용하여, 항체의 단량체 상태를 확인하였다. 정제된 단백질 시료(약 20 ㎍)를 TSK 겔 G3000SW, 10 ㎛, 7.5 mm ID x 300 mm 컬럼(Tosoh) 상에 로딩하고, 1 mL/min에서 0.2 M 인산염 pH 7의 등용매 구배를 이용하여 발색시켰다. 연속적인 검출을 280 nm에서 흡광도에 의해 확인하였다. 각각의 단백질의 단량체 수율을 표 5에 제공한다.
Figure pct00008
소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석을 위해, 시료를, 4 x Novex NuPAGE LDS 시료 완충제(Life Technologies) 및 10X NuPAGE 시료 환원제(Life Technologies) 또는 100 mM N-에틸말레이미드(Sigma-Aldrich)를 1519 Fab 또는 Fab-scFv의 정제된 단백질 약 2 ㎍에 첨가함으로써 제조하고, 100℃까지 3분 동안 가열하였다. 시료를 15웰 Novex 4-20% Tris-글리신 SDS-폴리아크릴아미드 겔(Life Technologies) 상에 로딩하고, Tris-글리신 SDS 진행 완충제(Life Technologie) 내에서 125 V의 일정한 전압에서 110분 동안 분리하였다. Novex Mark12 광범위한 단백질 표준(Life Technologies)을 표준으로서 사용하였다. 겔을 10% 메탄올, 7.5% 아세트산 중 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)(Sigma-Aldrich)로 1시간 동안 염색하고, 증류수를 여러 번 교환하여 탈염시켰다. 이론학적 분자량(MW)이 약 47 kDa인 1519 Fab는 비환원성 SDS-PAGE 상에서 더 신속한 이동성을 가진 것으로 나타난 데 반해, 비환원된 겔 상에서의 Fab-dsscFv는 이들 각각의 이론학적 MW보다 더 느리게 이동하는 것으로 관찰되었다(표 6). 이는 전체적으로 예상치 못한 것이 아니며, 문헌에 이전에 기록된 관찰이고, 단백질의 구별되는 SDS 결합 및 치밀한 3차 구조에 기인할 수 있다. 단백질이 환원되었는지의 여부와는 상관없이, 모든 단백질들은 이들 각각의 이론학적 MW에 근접하는 이동 속도로 이동하였다(표 6).
Figure pct00009
실시예 4 1735h5.hFab-scFv.768의 생물물리학적 특성
발색 및 투여 안정성에 대한 분자의 강건성(robustness)을 스크리닝하기 위해, 1735h5.hFab-scFv.768 분자를 일련의 생화학적 및 생물물리학적 분석으로 처리하였다. 이러한 분석들은 온전한 질량 및 이황화 배열의 확인을 위한 질량 분광법, 열적 안정성(Tm)(언폴딩(unfolding)의 중간점에서의 용융점); 실험적 등전점(pI) 및 전하 변이체, 공기-액체 계면에서의 집적 안정성(제작 시 전단 응력을 모방함) 및 높은 농도 및 점도 안정성을 포함하였다. 1735h5.hFab-scFv.768의 특징을, 가능하다면 1735h5.hFab-scFv.768의 Fab 모이어티와 동일한 가변 영역 서열을 포함하는 동등한 Fab, FabFv 및 IgG4 분자와 비교하였다.
질량 분광법 분석
(i) 정제된 1735h5.hFab-scFv.768의 온전한 질량 및 환원된 질량 둘 다를, C8 농화 컬럼 칩을 구비한 Agilent 6510 Q-Tof을 사용하는 질량 분광법에 의해 수득하였다. 온전한 질량은, 시료를 98% 물(18.2 megohm), 2% 울트라 등급 메탄올, 0.3% 포름산을 이용하여 0.15 mg/mL까지 희석시킴으로써 수득하였다. 환원된 질량은, 처음에 1 mg/mL에서 시료 100 ㎕를 10 mM TCEP와 함께 37℃에서 45분 동안 인큐베이션한 다음, 98% 물(18.2 megohm), 2% 울트라 등급 메탄올, 0.3% 포름산을 이용하여 0.15 mg/mL까지 희석시킴으로써 수득하였다. 이동상 A는 수(18.2megohm) 중 0.1% 포름산이었으며; 이동상 B는 80% 이소프로판올, 20% 아세토니트릴, 0.1% 포름산이었다. 데이터 가공을 Agilent's MassHunter 디콘볼루션 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 온전한 질량 및 환원된 질량은 이론학적 값과 일치하였다(표 7).
Figure pct00010
(ii) 이황화 페어링을, 비환원 조건 하에서의 효소적 분해, 및 후속해서 질량 분광법 분석에 의해 확인하였다. 분해는, 정제된 1735h5.hFab-scFv.768(10 mg/mL) 2 ㎕를 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 중 50 mM 요오도아세타미드 18 ㎕와 함께 37℃에서 45분 동안 인큐베이션한 다음, 25 mM 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris) pH 7.5 40 ㎕ + 0.5 mg/mL LysC(제공된 현탁액 완충제 중) 1 ㎕를 첨가함으로써 수행하였다. 이러한 혼합물을 추가로, 37℃에서 70분 동안 인큐베이션한 다음, 1 mM 염화칼슘 100 ㎕로 희석시켰다. 키모트립신(1 mM 염산 중 0.5 mg/mL에서 1 ㎕)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, 10% 포름산 16 ㎕를 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 그런 다음, 시료를 95% 용매 A : 5% 용매 B(1:1 MeCN:1-프로판올/0.1% 포름산)로 평형화된 1 x 150 mm C18 역상 컬럼에 20 ㎕/min 및 55℃에서 Acquity uPLC 및 Fusion Orbitrap 질량 분광계를 사용하여 적용하였다. Orbitrap MS 데이터를, 용리 동안 700 m/z 내지 4000 m/z 범위에서 15,000 해상도에서 +ve-이온 방식에서 수합하였다. 데이터를 Thermo PepFinder 소프트웨어를 사용하여 가공하였다.
1735h5.hFab-scFv.768 분자에 대한 예측된 이황화 결합 모드를 모두 관찰하였으며, 이는 올바른 온전한 이황화 페어링을 확인시켜 주었다.
열적 안정성 측정(Tm)
용융점을 Dulbecco's 인산염-완충 식염수 완충제(PBS) pH 7.4에서 Micro-Cal VP-Cap(GE Healthcare)을 사용한 시차 주사 열량계(DSC)에 의해 측정하고, WO2015/071330에 이전에 기재된 Fab 및 Fab-Fv 분자와 비교하였다. 이러한 분자를 PBS pH 7.4를 사용하여 1 mg/ml까지 조정하고, 최종 농도를 Varian Cary 50-Bio 분광광도계를 사용하여 280 nm에서 확인하였다. 항체 분자 및 완충제 블랭크를 로보틱 부착(robotic attachment)을 사용하여 96웰 플레이트로부터 시료화하였다. 완충제 블랭크를 이용한 2개의 스캔은 기준선 배제(baseline subtraction)에 대해 확인하였다. 분석을 수동 피드백 방식을 사용하여 1℃/분의 속도에서 20℃로부터 110℃까지 수행하였으며, Origin 7.0(Microcal 분석 소프트웨어 버전 2.0)을 사용하여 분석하였다.
2개의 언폴딩 도메인을 관찰하였다(도 6 참조). 78.9℃에서의 제1 언폴딩 사건은 scFv 도메인에 상응하였으며, 84.8℃에서의 제2 언폴딩 사건은 Fab 도메인에 상응하였다. scFv의 용융점은 상응하는 Fv보다 5.5℃ 더 높은 것으로 확인되었으며, 따라서 scFv는 1735h5.hFab-scFv.768 포맷에 더 큰 안정성을 부여하였다. 분자의 분자적 안정성을 부여하는 Fab 도메인의 높은 용융점은 부모 Fab 분자에 대해 수득된 용융점과 유사하였으며, 따라서 상기 포맷은 Fab 도메인의 열적 불안정성을 초래하지 않았다.
실험적 pI 및 전하 변이체의 분석
실험적 pI를 전체-모세관 이미지화된 cIEF ICE3 시스템(ProteinSimple)을 사용하여 측정하였다. 시료는, 시료(HPLC 등급 수(water) 중 1 mg/mL 스탁 유래) 30 ㎕, 1% 메틸셀룰로스 용액(ProteinSimple) 35 ㎕, pH3-10 양쪽성 물질(Pharmalyte) 4 ㎕, 4.65 합성 pI 마커(ProteinSimple) 0.5 ㎕ 및 9.77 합성 pI 마커 (ProteinSimple) 0.5 ㎕, 및 8 M 우레아 용액(Sigma-Aldrich) 12.5 ㎕를 혼합함으로써 제조하였다. HPLC 등급 수를 사용하여, 최종 부피를 100 ㎕까지 만들었다. 혼합물을 간략하게 보텍싱(vortexing)하여 완전히 혼합되도록 한 다음, 10,000　rpm에서 3분 동안 원심분리하여, 공기 방울을 제거한 후, 분석하였다. 시료를 1.5　kV에서 1분 동안 포커싱(focusing)하고, 후속해서 3　kV에서 5분 동안 포커싱한 다음, 모세관의 A280 이미지를 ProteinSimple 소프트웨어를 사용하여 촬영하였다. 생성된 전기영동도를 우선, iCE3 소프트웨어를 사용하여 분석하고, pI 값을 지정하였다(pI 마커들 사이에서 선형 관계식). 그런 다음, 보정된(calibrated) 전기영동도를 Empower 소프트웨어(Waters)를 사용하여 통합하였다. pI는 9.11로 높은 것으로 확인되었으며, 이 pI는 부모 Fab 분자(9.22)와 유사하였다. 산성/염기성 화학종의 퍼센트는 낮았으며, 부모 Fab 분자와 유사하였다.
공기-액체 계면에서의 집적 경향
1 mg/mL에서 PBS pH 7.4 중 1735h5.hFab-scFv.768(3 x 250 ㎕ 분취물)의 정제된 시료를 25℃, 1,400 rpm에서 Mixmate를 사용하여 1.5 mL 에펜도르프에서 보텍싱하였다. 시료를, 보텍싱 후 다양한 시점에서 595 nm에서 분광광도계(Varian)를 사용하여 흡광도를 수득함으로써 혼탁도(turbidity) 발생에 대해 분석하였다. 값 595nm의 평균을 시간에 대해 플로팅하였다. 집적 경향은 48시간 이하 동안의 보텍싱에서는 낮으며, 부모 Fab와 동등한 것으로 확인되었다. 이는, 이러한 포맷이 전단 응력(한외 여과)을 포함하는 제작 단계를 통해 동등한 Fab 분자와 유사한 집적 안정성을 나타낼 것임을 보여준다. 1735h5.hFab-scFv.768 및 부모 Fab는 둘 다 동등한 IgG4 포맷과 비교하여 더 느린 집적 속도를 나타내었다.
농축의 효과 및 점도
1735h5.hFab-scFv.768이 200 mg/mL 초과까지 농축될 수 있는지 확인하기 위해, PBS pH 7.40 중 21.5 mg/mL에서 정제된 물질 4 mL을, Amicon Ultra 원심분리 여과 유닛 Ultra-4(분자량 컷오프 10　kDa)를 사용하여 3500 g에서 45분 동안 218.6 mg/mL까지 농축시켰다. 여과 후, 시료를, 가용성 집적물 또는 단편의 검출에 대해 크기 배제 UPLC(2 x Acquity BEH200 1.7 ㎛, 4.6 mm x 150 mm 컬럼 시리즈, 0.3 mL/분, 등용매, 0.2 M 인산염 완충제 pH 7.0); 불용성 미립자 물질의 검출에 대해 동적 광 산란(Malvern Nano ZS); 및 집적 및 단편화 변화에 대해 SDS PAGE(4% 내지 20% Tris 글리신 겔을 사용한 비환원 및 환원 조건, 125 mV 일정한 전압)에 의해 분석하였다. 농축의 결과로서 집적 또는 단편화에 대한 증거는 존재하지 않았다. 점도를 TA 장치 DHR-1 디스커버리 하이브리드 레오미터를 사용하여 218.6 mg/mL에서 측정하였다. 무한 속도 점도(infinite rate viscosity)는 PBS pH 7.4 완충제(비최적화된 예비제형 완충제)에서 9.9±0.46 cP인 것으로 확인되었으며, 이는 이의 선택된 제형 완충제 중 동등한 Fab 분자에서의 17.1±0.9 cP보다 더 낮았다. 1735h5.hFab-scFv.768은 저점도와 더불어 고농도까지 농축될 수 있는 것으로 나타났다.
전반적으로, 1735h5.hFab-scFv.768 분자는 부모 Fab와 유사한 양호한 생물물리학적 특성을 나타내었다.
실시예 5 hFcRn 결합에 대한 1735h5.hFab-scFv.768의 친화성
표면 플라즈몬 공명 기술(SPR)을 사용한 생체분자 상호작용 분석을 Biacore T200 시스템(GE Healthcare) 상에서 수행하고, 인간 FcRn 세포외 도메인에의 결합을 확인하였다. 인간 FcRn 세포외 도메인을, 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 도메인(서열 번호 21)과 β2 마이크로글로불린(β2M)(서열 번호 23) 사이에서 비공유 복합체로서 제공하였다. 10 mM NaAc, pH 5 완충제 중 50 ㎍/ml에서 Affinipure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, F(ab')2-특이적(Jackson ImmunoResearch Lab, Inc.)을 HBS-EP+(GE Healthcare)를 진행 완충제로서 사용하여 아민 커플링 화학을 통해 CM5 센서 칩 상에 4,000개 내지 5,000개 반응 단위(RU)의 포착 수준까지 고정하였다.
50 mM 인산염, pH6 + 150 mM NaCl + 0.05% P20 또는 HBS-P+, pH7.4(GE Healthcare)를 친화성 검정법용 진행 완충제로서 사용하였다. 항체, 1735h5.hFab-scFv.768을 진행 완충제에서 0.25 ㎍/ml까지 희석시키고, 10 ㎕/min에서 60초 동안 주사하여, 고정화된 항-인간 F(ab')2를 포착하였다. 인간 FcRn 세포외 도메인을 포착된 1735h5.hFab-scFv.768에 걸쳐 30 ㎕/min에서 300초 동안 20 nM로부터 1.25 nM까지 적정하고, 후속해서 600초 동안 해리시켰다. 표면을 10 ㎕/min에서, pH6에서 진행 완충제에 대해 2 x 60s 50 mM HCl만큼, 또는 pH7.4에서 진행 완충제에 대해 60s 40 mM HCl 및 30s 10 mM NaOH만큼 재생시켰다.
데이터를 국소 Rmax와 함께 1:1 결합 모델을 사용하여 Biacore T200 평가 소프트웨어(버전 1.0)에 의해 분석하였다.
Figure pct00011
따라서, 인간 FcRn에 대한 1735h5.hFab-scFv.768의 친화성은 pH 6.0에서 160 pM이고 pH7.4에서 46 pM인 것으로 확인되었다.
실시예 6 기능성 세포를 기반으로 하는 검정법
FcRn 발현은 본래 세포내에서이며(문헌[Borvak J et al. 1998, Int. Immunol., 10 (9) 1289-98] 및 [Cauza K et al. 2005, J. Invest. Dermatol., 124 (1), 132-139]), 엔도좀 막 및 리포좀 막과 연관이 있다. IgG의 Fc 부분은 산성 pH(6.5 초과)에서 FcRn에 결합하지만, 중성의 생리학적 pH(7.4)에서는 결합하지 않으며(문헌[Rhagavan M et al. 1995]), 이러한 pH 의존성은 IgG의 재순환을 촉진한다.
일단, FcRn에 결합된 IgG가 음세포 작용에 의해 흡수되어 산성 엔도좀 내로 들어가면, 이러한 FcRn에 결합된 IgG는 FcRn과 함께 세포 표면으로 재순환될 것인데 반해, 생리학적으로 중성인 pH에서는 IgG가 방출될 것이다(문헌[Ober RJ et al. 2004, The Journal of Immunology, 172, 2021-2029]). FcRn에 결합되지 않은 임의의 IgG는 리포좀 분해 경로에 들어가지 않을 것이다.
1735h5.hFab-scFv.768이, FcRn의 IgG 재순환 능력을 저해하는 능력을 검사하기 위해, 시험관내 검정법을 구축하였다. 간략하게는, MDCK II 클론 7 세포를 산성 완충제(pH 5.9) 중 1735h5.hFab-scFv.768의 존재 및 부재 하에 비오틴화된 인간 IgG와 함께 인큐베이션하여, FcRn에 결합시켰다. 모든 과량의 항체를 제거하고, 세포를 중성 pH 완충제(pH 7.2)에서 인큐베이션하여, 표면에 노출된, 결합된 및 내재화된 IgG를 상층액 내로 방출시킨다. FcRn의 저해 후 MSD 검정법을 사용하여, 재순환되어, 따라서 상층액 내로 방출된 IgG의 양을 검출하였다.
도 1은, 1735h5.hFab-scFv.768이 MDCK II 클론 7 세포에서 IgG 재순환을 저해함을 보여준다. MDCK II 클론 7 세포를 96웰 플레이트에서 25,000개 세포/웰로 평판배양하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 이튿날, 세포를 HBSS+(Ca/Mg) pH 7.2 + 1% BSA로 1회 세척하였다. 세포를 HBSS+(Ca/Mg) pH 5.9 + 1% BSA 중 1735h5.hFab-scFv.768의 존재 및 부재 하에 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 1 ㎍/ml(500 ng/ml 최종 농도)의 비오틴화된 인간 IgG(Jackson)와 함께 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 HBSS+ pH 5.9로 세척한 다음, HBSS+ pH 7.2 중 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 세포로부터 제거하고, 총 IgG에 대해 (항-인간 IgG 포착 항체(Jackson) 및 스트렙타비딘-설포 태그 노출 항체(MSD)를 사용하는) MSD 검정법을 사용하여 분석하였다. 대표적인 농도 반응 곡선인 도 1에 나타낸 바와 같이, 4 1735h5.hFab-scFv.768은 IgG 재순환을 농도 의존적인 방식으로 저해하며, 평균 EC50 값(n=5)은 7.2 nM이다.
실시예 7 1735h5.hFab-scFv.768과 비-인간 영장류 FcRn의 교차 반응성
표면 플라즈몬 공명 기술(SPR)을 사용한 생체분자 상호작용 분석을 Biacore T200 시스템(GE Healthcare) 상에서 수행하고, 시노몰구스 원숭이 FcRn 세포외 도메인에의 결합을 확인하였다. 시노몰구스 원숭이 FcRn 세포외 도메인을, 시노몰구스 원숭이 FcRn 알파 사슬 세포외 도메인(서열 번호 17)과 β2 마이크로글로불린(β2M)(서열 번호 18) 사이에서 비공유 복합체로서 제공하였다. 10 mM NaAc, pH 5 완충제 중 50 ㎍/ml에서 Affinipure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, F(ab')2-특이적(Jackson ImmunoResearch Lab, Inc.)을 HBS-EP+(GE Healthcare)를 진행 완충제로서 사용하여 아민 커플링 화학을 통해 CM5 센서 칩 상에 4,000개 내지 5,000개 반응 단위(RU)의 포착 수준까지 고정하였다.
50 mM 인산염, pH6 + 150 mM NaCl + 0.05% P20 또는 HBS-P+, pH7.4(GE Healthcare)를 친화성 검정법용 진행 완충제로서 사용하였다. 항체, 1735h5.hFab-scFv.768을 진행 완충제에서 0.5 ㎍/ml까지 희석시키고, 10 ㎕/min에서 60초 동안 주사하여, 고정화된 항-인간 F(ab')2를 포착하였다. 시노몰구스 원숭이 FcRn 세포외 도메인을 포착된 1735h5.hFab-scFv.768에 걸쳐 30 ㎕/min에서 300초 동안 20 nM로부터 1.25 nM까지 적정하고, 후속해서 600초 동안 해리시켰다. 표면을 10 ㎕/min에서, pH6에서 진행 완충제에 대해 2 x 60s 50 mM HCl만큼, 또는 pH7.4에서 진행 완충제에 대해 60s 40 mM HCl 및 30s 10 mM NaOH만큼 재생시켰다.
데이터를 국소 Rmax와 함께 1:1 결합 모델을 사용하여 Biacore T200 평가 소프트웨어(버전 1.0)에 의해 분석하였다.
Figure pct00012
따라서, 시노몰구스 원숭이 FcRn에 대한 1735h5.hFab-scFv.768의 친화성은 pH 6.0에서 158 pM이고 pH7.4에서 45 pM인 것으로 확인되었다.
실시예 8 1735h5.hFab-scFv.768 치료는 hFcRn 유전자 도입 마우스에서 생체내에서의 hIgG의 청소를 증강시킨다
인간 IVIG의 청소에 미치는 1735h5.hFab-scFv.768의 효과를 인간 FcRn 유전자 도입 마우스(B6.Cg-Fcgrt tm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ, JAX Mice)에서 확인하였다. 마우스에게 500 mg/kg 인간 IgG(인간 IgI 10% Gamunex-c, Talecris Biotherapeutics)를 정맥내 주입하였다. 24시간 후, 동물에게 비히클 대조군(PBS) 또는 항-FcRn을 정맥내로 단일 투약량(100 mg/kg)으로서 투약하였다. 일련의 꼬리끝(tail tip) 혈액 시료를 항-FcRn 치료와 비교하여 -1, 8, 24, 48, 72, 96, 144 및 192시간째에 채혈하였다. hFcRn 마우스에서 인간 IgG의 혈청 수준을 LC-MS/MS에 의해 확인하였다. 도 2에 제시된 데이터는 평균 ± SEM이며, 1735h5.hFab-scFv.768 치료군에는 5마리 내지 6마리의 마우스가 존재하고, PBS 비히클 대조군에는 2마리의 마우스가 존재하였다. 1735h5.hFab-scFv.768에 의한 hFcRn의 차단은 hIVIG의 청소율을 가속화하였으며, 대조군 마우스와 비교하여 더 낮은 농도의 총 IgG가 관찰되었다. 이들 감소된 IgG 농도는 24시간째부터 실험 종료 시까지 대조군 마우스와 비교하여 1735h5.hFab-scFv.768의 모든 투약량에 대해 유의하게 상이하였다(p<0.01). 유의성을 원 웨이 ANOVA 및 터키 포스트 테스트(Tukeys post test)에 의해 측정하였다.
마우스 IgG가 이들 유전자 도입 마우스에 존재하는 인간 FcRn에 결합하지 않긴 하였지만, 내인성 마우스 알부민은 결합하였으며, 인간 FcRn에 의해 재순환되었다. 인간 FcRn에의 항-인간 FcRn의 결합이 시험관내 검정법에서 FcRn에의 알부민의 결합을 차단하지 않긴 하지만, 단, 1735h5.hFab-scFv.768의 알부민-결합 특성인 내인성 마우스 알부민의 청소에 미치는 효과를 평가하였다. 데이터는 도 3에 나타나 있다. 혈청 내 알부민 농도가 다소 가변적이기 때문에(항-FcRn 약물의 주사 전, 30마리의 마우스로 구성된 그룹에서 16.6 mg/mL 내지 59.9 mg/mL), 그룹 결과를 보다 용이하게 비교하기 위해, 알부민 데이터를 정상화하였으며, 도 3에서 0시간에서의 혈청 알부민 농도의 퍼센트로서 제공하였다. 1735h5.hFab-scFv.768은 알부민 농도에 중간 정도의 효과를 가졌으며, 이는 72시간 후 100 mg/kg 및 30 mg/kg 투약량에서 약 25%에서 최대였으며, 10 mg/kg에서는 효과를 나타내지 않았다. 이러한 효과는 가역적인 것으로 나타났다.
실시예 9. 1735h5.hFab-scFv.768 치료는 마우스에서 IgG의 약물 동력학과 유사하고 Fab 단편의 예상된 PK보다 우수한 약물 동력학을 보여준다
1735h5.hFab-scFv.768의 PK를 정상 마우스에서 확인하였다. 1735h5.hFab-scFv.768의 10 mg/kg IV 볼루스 투약량을 12마리의 수컷 C57/Bl6 마우스에 투여하였다. 혈장 시료를 1개 시점 당 4마리의 동물로부터 선택된 간격에서 수집하였다. 1735h5.hFab-scFv.768의 혈장 농도를, 1735h5.hFab-scFv.768의 프로테오타입(proteotypic) 펩타이드에 대해 LC/MS-MS 검정법에 의해 확인하였다. 혈장 약물 동력학 파라미터를 비구획적(noncompartmental) 분석을 사용하여 유도하였다(derive). 도 4의 데이터는, 1735h5.hFab-scFv.768이 마우스에 투약된 전형적인 인간 IgG와 유사한 PK 특성을 가짐을 보여준다. 분포 부피는 혈장 부피(34 mL/kg)와 유사하며, 종결 반감기(t1/2)는 4.1일이고, 혈장 청소율(CL)은 14 mL/day/kg이다.
1735h5.hFab-scFv.768의 PK를 또한 실시예 7에 기재된 연구에서 인간 FcRn 유전자 도입 마우스에서 평가하였다(500 mg/kg 인간 IgG를 정맥내 주입하고 후속적으로 1735h5.hFab-scFv.768을 투약한 B6.Cg-Fcgrt tm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ, JAX Mice). 일련의 꼬리끝 혈액 시료를 1735h5.hFab-scFv.768 치료와 비교하여 -24, 8, 24, 48, 72, 96, 144 및 192시간째에 채혈하고, 1735h5.hFab-scFv.768의 혈청 수준을 LC-MS/MS에 의해 확인하였다. 도 5에 제시된 데이터는 1개 치료군 당 5마리의 마우스 유래의 평균 ± SEM이며, 1735h5.hFab-scFv.768의 PK 특성이 전체 IgG 항-FcRn 분자만큼 적어도 양호하고 유사한 효능 및 친화성을 가졌음을 보여주었다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB Biopharma SPRL <120> Anti-FcRn Antibodies <130> PF0022 <150> GB1508180.5 <151> 2015-05-13 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 1 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Val Gly Val Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 2 Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn 1 5 10 15 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 3 Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 4 Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 5 Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 6 Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 11 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding gL7 Light chain <400> 11 gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60 attacctgtc gcactagcga ggacatctac accaacctgg cgtggtatca gcagaaacca 120 ggcaaagtgc cgaaactgct gatctacgtc gcgaaaaccc tccaggaagg tgtaccgtct 180 cgcttttccg gctctggtag cggtactcac tacaccctga ccatctcttc cctccagccg 240 gaagatgttg ctacctacta ttgcctccag ggcttcaaat tcccgtggac tttcggtggc 300 ggcacgaaag tggaaatcaa acggaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 360 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420 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ccgtgtatct ccaaatgaac 960 tccttgcgag cagaggacac ggcggtgtac tattgtgctc gcactgtccc aggttatagc 1020 actgcaccct acttcgatct gtggggacaa gggaccctgg tgactgtttc aagtggcgga 1080 gggggtagtg gagggggtgg ctctgggggt ggcggaagcg gtggcggggg ttctgacata 1140 caaatgactc agtctccttc atcggtatcc gcgtccgttg gcgatagggt gactattaca 1200 tgtcaaagct ctcctagcgt ctggagcaat tttctatcct ggtatcaaca gaaaccgggg 1260 aaggctccaa aacttctgat ttatgaagcc tcgaaactca ccagtggagt tccgtcaaga 1320 ttcagtggct ctggatcagg gacagacttc acgttgacaa tcagttcgct gcaaccagag 1380 gactttgcga cctactattg tggtggaggt tacagtagca taagtgatac gacatttggg 1440 tgcggtacta aggtggaaat caaacgtacc 1470 <210> 14 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1638 gH33 Heavy chain <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg 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<221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 54 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 20 25 30 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 55 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 56 Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr 1 5 10 15 Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr 20 25 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 57 Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 65 Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 66 Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 67 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 67 Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val 1 5 10 15 Arg Pro <210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 68 Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu 1 5 10 15 Thr Thr <210> 69 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 69 Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr 1 5 10 15 Phe Asn <210> 70 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 70 Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu 1 5 10 15 Pro Ala <210> 71 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 71 Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile 1 5 10 15 Arg Thr <210> 72 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 72 Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Phe Gly <210> 73 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 73 Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu 1 5 10 15 Gly Ala <210> 74 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 74 Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro 1 5 10 15 Asp Leu <210> 75 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 75 Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro 1 5 10 15 Ser Leu <210> 76 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 76 Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg 1 5 10 15 Ile Ser <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 77 Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 Pro <210> 78 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 78 Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe 1 5 10 15 Pro Pro <210> 79 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 79 Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro 1 5 10 15 Pro Tyr <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 80 Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr 1 5 10 15 Pro <210> 81 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 81 Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn 1 5 10 15 Leu Arg <210> 82 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 82 Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr 1 5 10 15 Phe Pro <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence <400> 83 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 <210> 84 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide sequence <400> 84 Pro Pro Pro Pro 1 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 sequence of antibody 645 <400> 85 Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn 1 5 10 <210> 86 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 sequence of antibody 645 <400> 86 Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 87 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 sequences of antibody 645 <400> 87 Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 sequence of antibody 645 <400> 88 Gln Ser Ser Pro 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Sequence <220> <223> 1519 gL20 light chain (V + constant) <400> 92 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val Gly Ala 20 25 30 Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser Gly Ile Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 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Claims (26)

  1. 직접적으로 또는 링커를 통해 scFv에 연결된 Fab 단편을 포함하는 항-FcRn 항체 융합 단백질로서, 상기 Fab 단편은 FcRn에 결합하고 scFv는 혈청 담체 단백질에 결합하는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  2. 직접적으로 또는 링커를 통해 scFv에 연결된 Fab 단편을 포함하는 항-FcRn 항체 융합 단백질로서, 상기 Fab 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 중쇄의 가변 영역은 3개의 CDR을 포함하고, CDR H1은 서열 번호 1에 제시된 서열을 가지며, CDR H2는 서열 번호 2에 제시된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호 3에 제시된 서열을 가지고, 경쇄의 가변 영역은 3개의 CDR을 포함하고, CDR L1은 서열 번호 4에 제시된 서열을 가지며, CDR L2는 서열 번호 5 또는 서열 번호 7에 제시된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호 6에 제시된 서열을 가지는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, Fab 단편의 중쇄가 서열 번호 9에 제시된 서열을 포함하고, Fab 단편의 경쇄가 서열 번호 8에 제시된 서열을 포함하는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, Fab 단편의 중쇄가 서열 번호 14에 제시된 서열을 포함하고, Fab 단편의 경쇄가 서열 번호 10에 제시된 서열을 포함하는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, scFv가 알부민에 결합하는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, scFv가 인간 혈청 알부민에 결합하는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, scFv의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 서열 번호 30에 제시된 서열과 같은 임의의 적합한 링커에 의해 연결되는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, scFv가 직접적으로 또는 링커를 통해 Fab 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 연결되는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, scFv가 서열 번호 33에 제시된 서열을 가진 링커를 통해 Fab 단편의 중쇄의 C-말단에 연결되는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, scFv가 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, CDR H1이 서열 번호 85에 제시된 서열을 가지며, CDR H2가 서열 번호 86에 제시된 서열을 가지고, CDR H3이 서열 번호 87에 제시된 서열을 가지고, CDR L1이 서열 번호 88에 제시된 서열을 가지며, CDR L2가 서열 번호 89에 제시된 서열을 가지고, CDR L3이 서열 번호 90에 제시된 서열을 가지는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, scFv가 이황화 안정화된 scFv(dsscFv)인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, dsscFv가 서열 번호 15에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 16에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 서열 번호 12에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 10에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  14. 중쇄를 포함하는 인간 FcRn에 결합하는 항-FcRn 항체 융합 단백질로서, 상기 중쇄는 서열 번호 12에 제시된 서열과 적어도 80%의 동일성 또는 유사성을 가진 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 번호 10에 제시된 서열과 적어도 80%의 동일성 또는 유사성을 가진 서열을 포함하는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 항체 Fab 단편이 CDR-H1에 대해 서열 번호 1에 제시된 서열, CDR-H2에 대해 서열 번호 2에 제시된 서열, CDR-H3에 대해 서열 번호 3에 제시된 서열, CDR-L1에 대해 서열 번호 4에 제시된 서열, CDR-L2에 대해 서열 번호 5 또는 서열 번호 7에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대해 서열 번호 6에 제시된 서열을 가지는 것인 항-FcRn 항체 융합 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체 융합 단백질의 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)를 코딩하는 단리된 DNA 서열.
  17. 제16항에 따른 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 벡터가 서열 번호 11에 제시된 서열 및 서열 번호 13에 제시된 서열을 포함하는 것인 벡터.
  19. 제17항 또는 제18항에 따른 클로닝 또는 발현 벡터를 하나 이상 포함하는 숙주 세포.
  20. 인간 FcRn에 대한 결합 특이성을 가진 항체 융합 단백질의 제조 방법으로서, 제19항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 융합 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 것인 항체 융합 단백질의 제조 방법.
  21. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 항-FcRn 항체 융합 단백질을, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상과 조합하여 포함하는 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 다른 활성 성분을 포함하는 약학 조성물.
  23. 치료법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 항체 융합 단백질 또는 제21항 또는 제22항에 정의된 조성물.
  24. 자가면역 질병, 예컨대 중증 근무력증, 심상성 천포창, 시신경척수염, 길랭-바레 증후군, 낭창, 특발성 혈소판감소성 자반증 및 혈전성 혈소판감소성 자반증의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 항체 융합 단백질 또는 제21항 또는 제22항에 정의된 조성물.
  25. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 제21항 또는 제22항에 정의된 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 환자 치료 방법.
  26. 제25항에 있어서, 치료가 자가면역 질병, 예컨대 중증 근무력증, 심상성 천포창, 시신경척수염, 길랭-바레 증후군, 낭창, 특발성 혈소판감소성 자반증 및 혈전성 혈소판감소성 자반증을 위한 것인 치료 방법.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ722055A (en) 2013-12-24 2020-02-28 Univ Texas Fcrn antagonists and methods of use
GB201608323D0 (en) 2016-05-12 2016-06-29 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical compositions
JP6911490B2 (ja) * 2017-04-26 2021-07-28 東ソー株式会社 安定型Ｆｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤
GB201708655D0 (en) * 2017-05-31 2017-07-12 Ucb Biopharma Sprl Cell culture methods
WO2018229249A1 (en) * 2017-06-15 2018-12-20 Ucb Biopharma Sprl Method for the treatment of immune thrombocytopenia
SG11202003944WA (en) * 2017-12-08 2020-06-29 Argenx Bvba Use of fcrn antagonists for treatment of generalized myasthenia gravis
US20200047085A1 (en) * 2018-08-09 2020-02-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing binding affinity of an antibody variant to the neonatal fc receptor
KR20210089214A (ko) * 2018-11-06 2021-07-15 이뮤노반트 사이언시스 게엠베하 항-FcRn 항체를 이용한 그레이브스 안병증의 치료 방법
SG11202112010RA (en) 2019-06-07 2021-12-30 Argenx Bvba PHARMACEUTICAL FORMULATIONS OF FcRn INHIBITORS SUITABLE FOR SUBCUTANEOUS ADMINISTRATION
CN114478800B (zh) * 2021-02-05 2022-10-11 华南理工大学 基于血清白蛋白的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用
US11926669B2 (en) 2022-05-30 2024-03-12 Hanall Biopharma Co., Ltd. Anti-FcRn antibody or antigen binding fragment thereof with improved stability

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
FR2716640B1 (fr) 1994-02-28 1996-05-03 Procedes Machines Speciales Dispositif de centrage et de blocage d'une pièce en vue de son rodage à l'aide d'un rodoir à expansion.
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB9812545D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
GB0129105D0 (en) 2001-12-05 2002-01-23 Celltech R&D Ltd Expression control using variable intergenic sequences
AU2003285578B2 (en) 2002-12-03 2010-07-15 Ucb Pharma S.A. Assay for identifying antibody producing cells
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
SI1644412T2 (sl) 2003-07-01 2018-11-30 Ucb Biopharma Sprl Modificirani fab fragmenti protiteles
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
GB0411186D0 (en) 2004-05-19 2004-06-23 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0412181D0 (en) 2004-06-01 2004-06-30 Celltech R&D Ltd Biological products
US20100266530A1 (en) 2005-04-29 2010-10-21 The Jackson Laboratory FcRN ANTIBODIES AND USES THEREOF
BRPI0615026A8 (pt) 2005-08-19 2018-03-06 Abbott Lab imunoglobulina de domínio variável duplo e seus usos
WO2007087289A2 (en) 2006-01-25 2007-08-02 The Research Foundation Of State University Of New York Anti-fcrn antibodies for treatement of auto/allo immune conditions
GB0619291D0 (en) 2006-09-29 2006-11-08 Ucb Sa Altered antibodies
US8629246B2 (en) 2007-09-26 2014-01-14 Ucb Pharma S.A. Dual specificity antibody fusions
CA3131470A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Fc receptor binding proteins
BRPI0918947A2 (pt) 2008-09-26 2015-12-01 Ucb Pharma Sa proteína de fusão de anticorpo
WO2011030107A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Ucb Pharma S.A. Multivalent antibodies
KR102048382B1 (ko) 2011-11-11 2019-11-25 유씨비 바이오파마 에스피알엘 알부민 결합 항체 및 이의 결합 단편
GB201208370D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Antibodies
KR101815265B1 (ko) 2013-06-20 2018-01-04 한올바이오파마주식회사 FcRn 특이적 인간 항체 및 이를 포함하는 자가면역 질환 치료용 조성물
GB201320066D0 (en) 2013-11-13 2013-12-25 Ucb Pharma Sa Biological products

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