TW201706302A - 抗ＦｃＲｎ抗體 - Google Patents

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Abstract

本揭示係關於對FcRn具有特異性之抗體融合蛋白、包含其之調配物、各於療法中之用途、表現及視情況調配該抗體之方法、編碼該等抗體之DNA，及包含該DNA之宿主。

Description

抗FcRn抗體
本揭示內容係關於對FcRn具有特異性之抗體、包含其之調配物、各自於療法中之用途、表現及視情況調配該抗體之方法、編碼該等抗體之DNA及包含該DNA之宿主。
FcRn係膜蛋白FcRn α鏈及β2微球蛋白(β2M)之非共價複合物。在成年哺乳動物中，FcRn藉由用作結合並補救IgG同型之抗體之受體在維持血清抗體含量中起關鍵作用。IgG分子由內皮細胞內吞，且若其結合至FcRn，則再循環胞吞轉運出進入(例如)循環。相比之下，不結合至FcRn之IgG分子進入細胞且經靶向至其降解之溶酶體途徑。His435突變成丙胺酸之變體IgG1引起FcRn結合選擇性損失及血清半衰期顯著減少(Firan等人，2001,International Immunology 13：993)。
假設FcRn係至少部分由自體抗體引起之某些自體免疫病症之潛在治療靶標。某些該等病症之當前治療包括血漿去除術。有時採用血漿去除術以及免疫抑制療法以供長期管控疾病。血漿更換提供對移除有害自體抗體之最快短期響應。然而，亦可期望藉由免疫系統、例如藉由使用藥劑(例如普賴松(prednisone)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、環孢素(cyclosporine)、麥考酚酸嗎乙酯(mycophenolate mofetil)、利妥昔單抗(rituximab)或該等之混合物)阻抑自體抗體之產生。
可利用血漿去除術治療之疾病之實例包括：格林-巴利症候群 (Guillain-Barré syndrome)；慢性發炎性去髓鞘型多發性神經病變；古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)；過黏稠度症候群；冷凝球蛋白血症；副蛋白血症；華氏巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia)；重症肌無力；血栓性血小板減少紫斑症(TTP)/溶血性尿毒癥候群；韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)；朗-伊症候群(Lambert-Eaton Syndrome)；抗磷脂抗體症候群(APS或APLS)；顯微鏡下多血管炎；移植腎中之復發性局灶及節段性腎小球硬化；HELLP症候群；PANDAS症候群；雷夫蘇姆病(Refsum disease)；貝切特症候群(Behcet syndrome)；HIV相關神經病變；嬰兒及新生兒中之格雷夫氏病(Graves' disease)；尋常天皰瘡；多發性硬化、橫紋肌溶解及同種免疫疾病。
血漿去除術有時用作移除含有Fc之治療劑之補救療法，例如用於減少嚴重副作用之緊急情況中。
儘管血漿去除術有助於某些醫學病況，但存在與療法相關之潛在風險及併發症。插入相當大之靜脈內導管可導致出血、肺穿刺(端視導管插入之位點而定)，且若導管留置過長，則其可導致靜脈感染及/或損害，從而產生重複程序之有限機會。
該程序具有與其相關之其他併發症，例如在患者之血液穿過血漿去除術儀器在體外時，血液具有凝塊之趨勢。為降低此趨勢，在一個常見方案中，在血液流經循環時，輸注檸檬酸鹽。檸檬酸鹽結合至血液中之鈣，鈣對於血液凝塊係必需的。檸檬酸鹽在防止血液凝塊中極有效；然而，其使用可導致威脅生命之低鈣含量。此可使用Chvostek體徵或Trousseau體徵檢測。為預防此併發症，在患者經歷血漿去除術的同時靜脈內輸注鈣；另外，亦可經口給予鈣補充。
該程序之其他併發症包括：低血壓；潛在暴露於血液產品(具有輸血反應或輸血傳播性疾病之風險)，阻抑患者之免疫系統及自針放 置出血或血腫。
另外，提供血漿去除術之設備有限且程序極昂貴。
血漿去除術之替代方案係靜脈內免疫球蛋白(IVIG)，其係自1000以上血液供體之血漿提取之含有彙集多株IgG之血液產品。該療法係藉由靜脈內投與且持續約2週至3個月。
IVIG治療之併發症包括頭痛、皮膚炎、自治療產品污染之病毒感染(例如HIV或肝炎)、肺水腫、過敏反應、急性腎衰竭、靜脈血栓形成及無菌腦膜炎。
因此，存在自體免疫病症之療法之顯著未滿足需要，該等療法侵襲性較小且將環狀暴露於較少醫學併發症。
因此，存在免疫病症及/或自體免疫病症之療法之顯著未滿足需要，該等療法侵襲性較小且將環狀暴露於較少醫學併發症。
因此，阻斷或減少IgG與FcRn結合之藥劑可用於治療或預防該等自體免疫及發炎性疾病。抗FcRn抗體先前已闡述於WO2009/131702、WO2007/087289、WO2006/118772及WO2014/204280中。
本發明提供包含直接或經由連接體連接至scFv之Fab片段的抗FcRn抗體融合蛋白，其中Fab片段結合至FcRn且scFv結合至血清載體蛋白，例如白蛋白。在一個實例中，scFv係二硫鍵穩定之scFv(dsscFv)。
因此，在一個態樣中，提供包含直接或經由連接體連接至scFv之Fab片段的抗FcRn抗體融合蛋白，其中Fab片段包含重鏈及輕鏈，其中重鏈之可變區包含3個CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：1中給出之序列，CDR H2具有SEQ ID NO：2中給出之序列，且CDR H3具有SEQ ID NO：3中給出之序列，且輕鏈之可變區包含3個CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：4中給出之序列，CDR L2具有SEQ ID NO：5 或SEQ ID NO：7中給出之序列且CDR L3具有SEQ ID NO：6中給出之序列。
具體而言，提供抗FcRn抗體融合蛋白，其中scFv或dsscFv結合白蛋白且包括包含3個CDR之重鏈可變結構域，其中CDR H1具有SEQ ID NO：85中給出之序列，CDR H2具有SEQ ID NO：86中給出之序列，且CDR H3具有SEQ ID NO：87中給出之序列，及包含3個CDR之輕鏈可變結構域，其中CDR L1具有SEQ ID NO：88中給出之序列，CDR L2具有SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：7中給出之序列且CDR L3具有SEQ ID NO：90中給出之序列。
具體而言，提供抗FcRn抗體融合蛋白，其中scFv係二硫鍵穩定，該融合蛋白包含具有SEQ ID NO：12中給出之序列之重鏈及具有SEQ ID NO：10中給出之序列之輕鏈。
本揭示內容之抗體阻斷IgG與FcRn之結合且認為可用於降低FcRn之一或多個生物功能，包括降低循環抗體之半衰期。此有益之處可在於其容許患者更快速清除抗體，例如自體抗體。因此，本揭示內容之抗體減少IgG與FcRn之結合。
重要的是，本發明抗體能夠(例如)於pH6及pH7.4二者下以相當及高之結合親和力結合人類FcRn。因此，有利地，甚至在胞內體內，抗體能夠繼續結合FcRn，藉此最大化FcRn與IgG結合之阻斷。
在一個實施例中，本發明之抗體及結合片段阻斷人類IgG與人類FcRn之結合。
在一個實施例中，本發明之抗體及結合片段不結合β2微球蛋白。
在一個實施例中，本發明之抗體及結合片段不結合人類β2微球蛋白。
在一個實例中，本發明之抗體及結合片段將循環白蛋白含量減 少不超過50%、較佳不超過25%。
在一個實例中，本發明之抗體及結合片段不減少循環白蛋白含量。
本揭示內容亦擴展至編碼如本文所述抗體或片段之多核苷酸，例如DNA，例如該DNA納入載體中。
亦提供包含該多核苷酸之宿主細胞。
本文中提供表現抗體或片段之方法，亦提供使抗體或片段偶聯至聚合物(例如PEG)之方法。
本發明亦係關於包含該等抗體及片段之醫藥組合物。
在一個實施例中，提供治療之方法，其包含投與治療有效量之如本文所述抗體、片段或組合物。
本發明亦擴展至本發明之抗體、片段或組合物，其用於治療中，具體而言用於治療免疫及/或自體免疫病症。
因此，本發明提供抗體、其片段及移除病原性IgG之方法，其係藉由加速身體之自然機制用於分解代謝IgG來達成。
本質上，本揭示內容之抗體及片段阻斷使IgG在體內再循環之系統。
本發明療法可能提供用於某些疾病之替代或補充，其中血漿去除術係對患者有利之療法或IVIg療法。
圖1 顯示1735h5.hFab-scFv.768抑制MDCK II純系7細胞中之IgG再循環。
圖2 顯示1735h5.hFab-scFv.768對人類FcRn-轉基因小鼠之血清中之人類IVIg之濃度的效應。
圖3 顯示1735h5.hFab-scFv.768對人類FcRn-轉基因小鼠中之血清白蛋白之濃度的效應。
圖4 顯示正常小鼠中之1735h5.hFab-scFv.768之藥物動力學。
圖5 顯示人類FcRn-轉基因小鼠中之1735h5.hFab-scFv.768之藥物動力學。
圖6 顯示1735h5.hFab-scFv.768(Fab-scFv)與母體Fab及等效Fab-Fv相比之熱穩定性。
圖7 顯示本發明之Fab-scFv及Fab-dsscFv片段格式。
圖8 本發明之抗體序列。
圖9a 抗體1638.g49之人類化。
圖9b 抗體1638.g49之人類化。
如本文中所採用之FcRn係指人類IgG受體α鏈(亦稱作新生Fc受體，其胺基酸序列在UniProt中係在編號P55899下，其細胞外結構域提供於圖8中(SEQ ID NO：21))以及人類β2微球蛋白(β2M)(其胺基酸序列在UniProt中係在編號P61769下(在本文中提供有信號肽(SEQ ID NO：23)、無信號肽(SEQ ID NO：24))的非共價複合物。
如本文中所採用之抗體分子係指抗體或其結合片段，其包括抗體融合蛋白。
如本文中所用術語「抗體」通常係指完整(整個)抗體，即包含兩個重鏈及兩個輕鏈之要素。抗體可包含其他額外結合結構域，例如依照如WO 2007/024715中揭示之分子DVD-Ig、或WO2011/030107中所述之所謂(FabFv)2Fc。因此，如本文中所採用之抗體包括二價、三價或四價全長抗體。
抗體之結合片段包括單鏈抗體(即全長重鏈及輕鏈)；Fab、經修飾Fab、Fab’、經修飾Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、單一結構域抗體(例如VH或VL或VHH)、scFv、dsscFv、二價、三價或四價抗體、雙-scFv、雙價抗體、三體、三價抗體、四價抗體及上述任一 者之表位結合片段(例如，參見Holliger及Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair及Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。生成及製造該等抗體片段之方法為業內所熟知(例如，參見Verma等人，1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。Fab-Fv格式及其二硫鍵穩定之型式首先揭示於WO2009/040562中，Fab-dsFv首先揭示於WO2010/035012中。用於本發明中之其他抗體片段包括闡述於國際專利申請案WO2005/003169、WO2005/003170及WO2005/003171中之Fab及Fab’片段。多價抗體可包含多重特異性(例如雙特異性)或可為單特異性(例如，參見WO92/22583及WO05/113605)。後者之一個此實例係如WO92/22583中所述之Tri-Fab(或TFM)。
抗體片段亦包括Fab-scFv片段及Fab-dsscFv片段，例如如WO2013/068571之實例4及本發明實例中所述及如本文圖7中所圖解說明。該等片段在本文中亦稱作「抗體融合蛋白」。
因此，在一個態樣中，提供抗FcRn Fab-scFv或Fab-dsscFv抗體片段或抗體融合蛋白，其包含直接或經由連接體連接至scFv之Fab片段，其中Fab片段包含重鏈及輕鏈，其中重鏈之可變區包含3個CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：1中給出之序列，CDR H2具有SEQ ID NO：2中給出之序列，且CDR H3具有SEQ ID NO：3中給出之序列，且輕鏈之可變區包含3個CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：4中給出之序列，CDR L2具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中給出之序列且CDR L3具有SEQ ID NO：6中給出之序列
用於本發明中之典型Fab分子包含重鏈及輕鏈對，其中重鏈包含可變區VH及恆定結構域CH1，其可以鏈間半胱胺酸為末端，且輕鏈包含可變區VL及恆定結構域CL。
應瞭解，可對由本發明提供之CDR或其他序列(例如可變結構域) 進行一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加及/或缺失，而並不顯著改變抗體結合至FcRn之能力。任何胺基酸取代、添加及/或缺失之效應可由熟習此項技術者、例如藉由使用本文、具體而言實例中所述方法以測定FcRn結合/阻斷來容易地測試。
在一個實例中，可對由本發明提供之抗體或片段中所用之框架區進行一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加及/或缺失且其中保持或增加對FcRn之結合親和力。
抗體可變結構域中之殘基通常係根據由Kabat等人設計之系統編號。此系統闡述於Kabat等人，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA(下文「Kabat等人(上文文獻)」)。本說明書中使用此編號系統，另有指示除外。。
Kabat殘基名稱並非總是直接對應於胺基酸殘基之線性編號。實際線性胺基酸序列可含有較嚴格Kabat編號中少或額外之胺基酸，其對應於基本可變結構域結構之結構組份(框架或互補決定區(CDR))之縮短或插入。可藉由用「標準」Kabat經編號序列比對抗體序列中之同源殘基來確定給定抗體殘基之正確Kabat編號。
根據Kabat編號系統，重鏈可變結構域之CDR位於殘基31-35(CDR-H1)、殘基50-65(CDR-H2)及殘基95-102(CDR-H3)處。然而，根據Chothia(Chothia,C.及Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等效於CDR-H1之環自殘基26延伸至殘基32。因此，除非另有指示，否則如本文中所採用之「CDR-H1」欲指殘基26至35，如藉由Kabat編號系統及Chothia之拓撲環定義之組合所述。
根據Kabat編號系統，輕鏈可變結構域之CDR位於殘基24-34(CDR-L1)、殘基50-56(CDR-L2)及殘基89-97(CDR-L3)處。
本發明之抗體及片段阻斷FcRn且藉此可阻止其在IgG之再循環中 起作用。如本文中所採用之阻斷係指物理阻斷，例如阻隔受體，但亦將包括抗體或片段結合之表位而引起(例如)構象變化(此意味著天然配體與受體不再結合)之情況。本發明之抗體分子結合至FcRn且藉此減少或防止(例如抑制)FcRn結合至IgG恆定區。
在一個實施例中，抗體或其片段關於IgG競爭性結合FcRn。
在一個實例中，本發明之抗體融合蛋白用作結合至人類IgG之人類FcRn之競爭性抑制劑。在一個實例中，抗體融合蛋白結合至FcRn上之IgG結合位點。在一個實例中，抗體融合蛋白阻斷IgG結合位點。在一個實例中，抗體融合蛋白不結合β2M。
用於本發明中之抗體可使用業內熟知之任一適宜方法來獲得。FcRn多肽/蛋白質(包括融合蛋白)、(重組或天然)表現多肽之細胞(例如纖維母細胞)可單獨或與β2M組合用於產生特異性識別FcRn之抗體。多肽可為「成熟」多肽或其生物活性片段或衍生物。人類蛋白質於Swiss-Prot中登記於編號P55899下。人類FcRn α鏈之細胞外結構域提供於SEQ ID NO：21中。成熟人類β2M之序列提供於SEQ ID NO：24中。
在一個實施例中，抗原係FcRn之突變體形式，其經改造以在細胞表面上呈遞FcRn，使得存在較少或無動態處理，其中FcRn內化於細胞中，例如此可藉由在FcRn α鏈之細胞質尾部中進行突變來達成，其中二-白胺酸突變成二-丙胺酸，如Ober等人，2001 Int.Immunol.13,1551-1559中所述。
用於對宿主進行免疫之多肽可藉由業內熟知之方法自經遺傳改造之包含表現系統之宿主細胞來製備或其可自天然生物來源回收。在本申請案中，術語「多肽」包括肽、多肽及蛋白質。除非另外規定，否則該等術語可互換使用。在一些情況下，FcRn多肽可為較大蛋白質，例如(例如)融合至親和力標籤或相似物之融合蛋白。
可藉由使用熟知之常規方案向動物(較佳非人類)動物投與多肽獲得針對FcRn多肽生成之抗體，其中動物之免疫係必需的，，例如，參見Handbook of Experimental Immunology,D.M.Weir(編輯)，第4卷，Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986)。可對許多溫血動物(例如兔、小鼠、大鼠、綿羊、牛、駱駝或豬)進行免疫。然而，小鼠、兔、豬及大鼠通常最適宜。
單株抗體可藉由業內已知之任一方法來製備，例如雜交瘤技術(Kohler及Milstein,1975,Nature,256：495-497)、三源雜交瘤技術、人類B細胞雜交瘤技術(Kozbor等人，1983,Immunology Today,4：72)及EBV-雜交瘤技術(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，第77-96頁，Alan R Liss,Inc.,1985)。
用於本發明中之抗體亦可使用單一淋巴球抗體方法藉由選殖並表現自單一淋巴球生成之免疫球蛋白可變區cDNA來生成，該等單一淋巴球係藉由(例如)以下中所述之方法針對特異性抗體之產生來選擇：Babcook,J.等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15)：7843-78481；WO92/02551；WO2004/051268及國際專利申請案第WO2004/106377號。
抗體之篩選可使用用以量測與人類FcRn之結合之分析及/或用以量測阻斷IgG結合至受體之能力之分析來實施。結合分析之實例係ELISA，具體而言使用固定於板上之人類FcRn及人類Fc之融合蛋白並採用二級抗體以檢測結合至融合蛋白之抗FcRn抗體。下文闡述適宜拮抗性及阻斷分析之實例。
如本文中所採用之特異性欲指僅識別對抗原具有特異性之抗體或與無特異性之抗原之結合相比對具有特異性之抗原具有顯著較高之結合親和力的抗體，例如至少5、6、7、8、9、10倍結合親和力。結合親和力可藉由諸如如下文所述BIAcore等技術來量測。在一個實例 中，本發明抗體不結合β2微球蛋白(β2M)。在一個實例中，本發明抗體結合食蟹猴FcRn。在一個實例中，本發明之抗體分子不結合大鼠或小鼠FcRn。
提供本發明之某些抗體分子之胺基酸序列及多核苷酸序列且其構成本發明之態樣。
在一個實施例中，本發明之抗體或結合片段係全人類的，例如自噬菌體文庫或相似物製得。
在一個實施例中，本揭示內容之抗體或片段經人類化。
人類化抗體(其包括CDR移植抗體)係具有來自非人類物種之一或多個互補決定區(CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之框架區的抗體分子(參見(例如)US 5,585,089；WO91/09967)。應瞭解，可僅需要轉移CDR之特異性決定殘基而非整個CDR(參見(例如)Kashmiri等人，2005,Methods,36,25-34)。人類化抗體可視情況進一步包含一或多個衍生自衍生CDR之非人類物種之框架殘基。後者通常稱作供體殘基。
因此，在一個實施例中，如本文中所用術語「人類化抗體分子」係指抗體分子，其中重鏈及/或輕鏈含有一或多個來自供體抗體(例如非人類抗體，例如鼠類單株抗體)之CDR(若期望，包括一或多個經修飾CDR)，該等CDR移植至受體抗體(例如人類抗體)之重鏈及/或輕鏈可變區框架中，該可變區框架視情況進一步包含一或多個衍生自衍生該等CDR之非人類物種之框架殘基(供體殘基)。關於綜述，參見Vaughan等人，Nature Biotechnology,16,535-539,1998。在一個實施例中，並不轉移整個CDR，僅將來自上文所述CDR中之任一者之一或多個特異性決定殘基轉移至人類抗體框架(參見(例如)Kashmiri等人，2005,Methods,36,25-34)。在一個實施例中，僅將上文所述CDR中之一或多者之特異性決定殘基轉移至人類抗體框架。在另一實施例中，僅將上文所述CDR中之每一者之特異性決定殘基轉移至人類抗體 框架。
在移植CDR或特異性決定殘基時，考慮到衍生CDR之供體抗體之種類/類型，可使用任何適當受體可變區框架序列，包括小鼠、靈長類動物及人類框架區。
適宜地，本發明之人類化抗體具有包含人類受體框架區以及本文中特別提供之CDR中之一或多者的可變結構域。因此，在一個實施例中，提供阻斷人類化抗體，其結合人類FcRn，其中可變結構域包含人類受體框架區及非人類供體CDR。
可用於本發明中之人類框架之實例係KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及POM(Kabat等人，上文文獻)。舉例而言，KOL及NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈且EU、LAY及POM可用於重鏈及輕鏈二者。或者，可使用人類種系序列；該等序列可在http：//www.imgt.org/處獲得。
在本發明之人類化抗體中，受體重鏈及輕鏈無需衍生自相同抗體，且若期望，可包含具有衍生自不同鏈之框架區之複雜鏈。
本發明之人類化抗體之重鏈的一個此適宜框架區係衍生自人類亞組VH3序列IGHV3-7以及JH3，在一個實例中，抗體之重鏈可變結構域包含SEQ ID NO：20中給出之序列。
本發明之人類化抗體之輕鏈之適宜框架區係衍生自人類亞組VK1序列IGKV1-27序列以及JK4，在一個實例中，抗體分子之輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO：19中給出之序列。
在本發明之人類化抗體中，框架區無需具有與受體抗體之序列精確相同之序列。舉例而言，可將不常見殘基變為該受體鏈種類或類型之更通常存在之殘基。或者，可改變受體框架區中之選擇殘基，以使其對應於在供體抗體中之相同位置處發現之殘基(參見Reichmann等人，1998,Nature,332,323-324)。該等變化應保持至恢復供體抗體之 親和力所需之最小值。選擇受體框架區中可能需要改變之殘基之方案闡述於WO91/09967。
因此，在一個實施例中，框架中之1、2、3、4或5個殘基經替代胺基酸殘基置換。
因此，在一個實例中，提供人類化抗體，其中至少重鏈之可變結構域之位置48及78中之每一者處之殘基(Kabat編號)係供體殘基，例如，參見SEQ ID NO：9中給出之序列。
在一個實施例中，重鏈可變結構域之殘基48經替代胺基酸(例如纈胺酸)置換。
在一個實施例中，重鏈可變結構域之殘基78經替代胺基酸(例如白胺酸)置換。
在一個實施例中，在本發明之人類化重鏈可變區中，殘基48係纈胺酸且殘基78係白胺酸。
因此，在一個實例中，提供人類化抗體，其中至少輕鏈之可變結構域之位置70及71中之每一者處之殘基(Kabat編號)係供體殘基，例如，參見SEQ ID NO：8中給出之序列。
在一個實施例中，輕鏈可變結構域之殘基70經替代胺基酸(例如天冬胺酸)置換。
在一個實施例中，輕鏈可變結構域之殘基71經替代胺基酸(例如苯丙胺酸)置換。
在一個實施例中，在本發明之人類化輕鏈可變區中，殘基70係天冬胺酸且殘基71係苯丙胺酸。
在一個實施例中，本揭示內容提供與本文揭示之序列80%相似或一致、例如相對於相關序列(例如可變結構域序列、CDR序列或不包括CDR之可變結構域序列)之部分或全部85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%或99%相似或一致的抗體序列。在 一個實施例中，相關序列係SEQ ID NO：8或9。在一個實施例中，相關序列係SEQ ID NO：10或12或14。
在一個實施例中，本發明提供結合包含重鏈之人類FcRn之抗體分子，其中重鏈之可變結構域包含與本文中之序列(例如SEQ ID NO：9中給出之序列)具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列。
在一個實施例中，本發明提供結合包含輕鏈之人類FcRn之抗體分子，其中輕鏈之可變結構域包含與SEQ ID NO：8中給出之序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%或99%一致性或相似性的序列。
在一個實施例中，本發明提供結合人類FcRn之抗體分子，其中抗體具有與本文給出之序列(例如SEQ ID NO：9中給出之序列)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%或99%相似或一致的重鏈可變結構域，但其中抗體分子對於CDR-H1具有SEQ ID NO：1中給出之序列、對於CDR-H2具有SEQ ID NO：2中給出之序列及對於CDR-H3具有SEQ ID NO：3中給出之序列。
在一個實施例中，本發明提供結合人類FcRn之抗體分子，其中抗體具有與本文給出之序列(例如SEQ ID NO：8中之序列)至少90%,91%,92%,93%,94%,95% 96%,97%,98%或99%相似或一致的輕鏈可變結構域，但其中抗體分子具有對於CDR-L1之SEQ ID NO：4中給出之序列、對於CDR-L2之SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中給出之序列及對於CDR-L3之SEQ ID NO：6中給出之序列。
在一個實施例中，本發明提供結合人類FcRn之抗體分子，其中抗體具有與本文給出之序列(例如SEQ ID NO：12中給出之序列)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%或99%相似或一致的重鏈及與本文給出之序列(例如SEQ ID NO：10中 給出之序列)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%或99%相似或一致的輕鏈。
在一個實施例中，本發明提供結合人類FcRn之抗體分子，其中抗體具有與本文給出之序列(例如SEQ ID NO：12中給出之序列)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%或99%相似或一致的重鏈及與本文給出之序列(例如SEQ ID NO：10中給出之序列)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%或99%相似或一致的輕鏈，但其中抗體分子之Fab部分對於CDR-H1具有SEQ ID NO：1中給出之序列、對於CDR-H2具有SEQ ID NO：2中給出之序列、對於CDR-H3具有SEQ ID NO：3中給出之序列、對於CDR-L1具有SEQ ID NO：4中給出之序列、對於CDR-L2具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中給出之序列及對於CDR-L3具有SEQ ID NO：6中給出之序列。
如本文中所用「一致性」指示在比對序列中之任何特定位置處，胺基酸殘基在序列之間一致。如本文中所用「相似性」指示在比對序列中之任何特定位置處，胺基酸殘基在序列之間屬相似類型。舉例而言，可用白胺酸取代異白胺酸或纈胺酸。經常可彼此取代之胺基酸包括(但不限於)：-苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸(具有芳香族側鏈之胺基酸)；-離胺酸、精胺酸及組胺酸(具有鹼性側鏈之胺基酸)；-天冬胺酸鹽及麩胺酸鹽(具有酸性側鏈之胺基酸)；-天冬醯胺及麩醯胺酸(具有醯胺側鏈之胺基酸)；及-半胱胺酸及甲硫胺酸(具有含硫側鏈之胺基酸)。一致性及相似性程度可容易地計算(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編輯，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編輯，Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data，第1部分， Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編輯，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987,Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.編輯，M Stockton Press,New York,1991，可自NCBI獲得之BLASTTM軟體(Altschul,S.F.等人，1990,J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.及States,D.J.1993,Nature Genet.3：266-272.Madden,T.L.等人，1996,Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，1997,Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.及Madden,T.L.1997,Genome Res.7：649-656)。
應瞭解，本發明之抗體融合蛋白之Fab-片段組份可自任何適宜抗FcRn抗體或抗體片段衍生而來或構築而成。
在一個實例中，本發明之抗體分子包括包含分別(例如)輕鏈及重鏈之SEQ ID NO：26及28中所示之序列的抗體Fab片段。
在一個實例中，本發明之抗體分子包括包含分別(例如)輕鏈及重鏈之SEQ ID NO：92及94中所示之序列的抗體Fab片段。
在一個實例中，本發明之抗體分子包括包含分別(例如)輕鏈及重鏈之SEQ ID NO：10及14中所示之序列的抗體Fab片段。在一個實施例中，分子之抗體Fab片段部分具有包含SEQ ID NO：10中給出之序列之輕鏈及包含SEQ ID NO：14中給出之序列之重鏈。
本發明之Fab片段直接或經由連接體連接至scFv。在一個實例中，scFv係二硫鍵穩定的。通常，scFv係二硫鍵穩定的。Fab片段之鏈接可為化學偶聯，但最佳係轉譯融合，即每一之序列由表現載體依序編碼之遺傳融合。
通常，scFv或dsscFv結合至血清載體蛋白以延長抗體融合蛋白之活體內半衰期。以此方式延長半衰期依賴於FcRn結合且可為有利的。
如本文中所採用之「血清載體蛋白」係指scFv可結合之任何適宜血漿載體蛋白，在一個實例中，血清載體蛋白選自甲狀腺素結合蛋白、轉甲狀腺素蛋白、α1-酸糖蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原及白蛋白或其任何之片段。
通常，scFv或dsscFv結合至白蛋白、較佳人類血清白蛋白。
結合scFv或dsscFv之任何適宜白蛋白可納入本發明之抗體融合蛋白中。業內先前已闡述適宜白蛋白結合結構域。
如本文中所採用之「單鏈可變片段」或「scFv」係指在VH與VL可變結構域之間由肽連接體穩定之單鏈可變片段。
如本文中所採用之「二硫鍵穩定之單鏈可變片段」或「dsscFv」係指在VH與VL可變結構域之間由肽連接體穩定且在VH與VL之間亦包括結構域間二硫鍵的單鏈可變片段。
在一個實施例中，dsscFv之可變結構域VH與VL之間之二硫鍵介於下文所列舉之殘基中之兩者之間(除非上下文另有指示，否則下文列表中採用Kabat編號)。只要提及Kabat編號，相關參考文獻係Kabat等人，1987,in Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA。
在一個實施例中，二硫鍵係在選自包含以下之群之位置中：‧VH37+VL95C，例如參見Protein Science 6,781-788 Zhu等人(1997)；‧VH44+VL100，例如參見Biochemistry 33 5451-5459 Reiter等人(1994)；或Journal of Biological Chemistry，第269卷，第28期，第18327-18331頁，Reiter等人(1994)；或Protein Engineering，第10卷，第12期，第1453-1459頁，Rajagopal等人(1997)；‧VH44+VL105，例如參見J Biochem.118,825-831 Luo等人(1995)； ‧VH45+VL87，例如參見Protein Science 6,781-788 Zhu等人(1997)；‧VH55+VL101，例如參見FEBS Letters 377 135-139 Young等人(1995)；‧VH100+VL50，例如參見Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber等人(1990)；‧VH100b+VL49；‧VH98+VL 46，例如參見Protein Science 6,781-788 Zhu等人(1997)；‧VH101+VL46；‧VH105+VL43，例如參見Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷，第7538-7542頁，Brinkmann等人(1993)；或Proteins 19,35-47 Jung等人(1994)，‧VH106+VL57，例如參見FEBS Letters 377 135-139 Young等人(1995)
及在位於分子中之可變區對中與其對應之一或多個位置。
在一個實施例中，在位置VH44與VL100之間形成二硫鍵。
上文列舉之胺基酸對在有助於由半胱胺酸置換之位置中，使得可形成二硫鍵。可藉由已知技術將半胱胺酸改造至該等期望位置中。在一個實施例中，因此，本發明之經改造半胱胺酸係指給定胺基酸位置處之天然殘基經半胱胺酸殘基置換。
經改造半胱胺酸之引入可使用業內已知之任一方法來實施。該等方法包括(但不限於)PCR延伸重疊誘變、定點誘變或盒誘變(通常參見Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,NY,1989；Ausbel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing & Wiley-Interscience,NY,1993)。定點誘變套組有市售，例如QuikChange®定點誘變套組(Stratagen,La Jolla,CA)。盒誘變可基於Wells等人，1985,Gene,34：315-323來實施。或者，可藉由退火、接合及PCR擴增及重疊寡核苷酸之選殖進行總基因合成來製得突變體。
因此，在一個實施例中，dsscFv之可變結構域VH及VL可藉由兩個半胱胺酸殘基之間之二硫鍵連接，其中半胱胺酸殘基對之位置選自包含或由以下組成之群：VH37及VL95、VH44及VL100、VH44及VL105、VH45及VL87、VH100及VL50、VH100b及VL49、VH98及VL46、VH101及VL46、VH105及VL43及VH106及VL57。
在一個實施例中，dsscFv之可變結構域VH及VL可藉由兩個半胱胺酸殘基之間之二硫鍵連接，一個殘基在VH中且一個在VL中，其在CDR外部，例如其中半胱胺酸殘基對之位置選自由以下組成之群：VH37及VL95、VH44及VL100、VH44及VL105、VH45及VL87、VH100及VL50、VH98及VL46、VH105及VL43及VH106及VL57。
在一個實施例中，dsscFv之可變結構域VH及VL藉由兩個經改造半胱胺酸殘基之間之二硫鍵連接，一個殘基在位置VH44處且另一者在VL100處。
在一個實施例中，dsscFv之可變結構域VH及VL藉由兩個經改造半胱胺酸殘基之間之二硫鍵連接，一個殘基在位置VH44處且另一者在VL100處。
在一個實例中，scFv或dsscFv包含包括3個CDR之重鏈可變結構域，其中CDR H1具有SEQ ID NO：85中給出之序列，CDR H2具有SEQ ID NO：86中給出之序列，且CDR H3具有SEQ ID NO：87中給出之序列且輕鏈可變結構域包含3個CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：88中給出之序列，CDR L2具有SEQ ID NO：89中給出之序列且CDR L3具有SEQ ID NO：90中給出之序列。
在一個實例中，本發明之dsscFv之VH結構域具有SEQ ID NO：15中給出之序列且本發明之dsscFv之VL結構域具有SEQ ID NO：16中給出之序列。
本發明之scFv及dsscFv中之VH及VL經由適宜連接體通常以重-輕(HL)定向彼此連接，其實例提供於下文中。在本發明之抗體融合蛋白中，scFv或dsscFv直接或經由連接體連接至Fab片段之C-端。
在一個實施例中，dsscFv之重鏈可變結構域附接至Fab片段之重鏈之C端或dsscFv之輕鏈可變結構域附接至Fab片段之重鏈之C端。
在一個實施例中，dsscFv之重鏈可變結構域附接至Fab片段之輕鏈之C端或dsscFv之輕鏈可變結構域附接至Fab片段之輕鏈之C-端。
在一個實施例中，dsscFv之VH結構域經由連接體附接至Fab片段之CH1之C-端。在一個實施例中，dsscFv之VH結構域附接至CL之C-端。
在一個實施例中，連接體係任一適宜連接體，例如將CH1或CL之C-末端部分連接至dsscFv之VH的適宜肽。
在一個實施例中，用於本發明中之肽連接體之長度係50個胺基酸或更少，例如20個胺基酸或更少，例如19、10、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸。
在一個實施例中，連接體係基於G4S之重複單元(即GGGGS SEQ ID NO：29)，例如其1、2、3、4或5個單元，例如GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：30)或SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：31)。在一個實施例中，本發明構築體中採用之連接體具有序列SGGGGSGGGGTGGGGS(SEQ ID NO：32)。另外，該等連接體可用於連接scFv或dsscFv之VH及VL。在一個實施例中，連接體選自本文所示序列。在一個實施例中，VH 及VL由具有SEQ ID NO：30中給出之序列之連接體連接。在一個實施例中，Fab之CH1之C-端與dsscFv之VH之N-端之間之連接體具有序列SGGGGTGGGGS(SEQ ID NO：33)。
(S)在序列45至49中係可選的。
剛性連接體之實例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO：83)、PPPP(SEQ ID NO：84)及PPP。
在一個實施例中，本發明之Fab-dsscFv片段或融合蛋白包括包含SEQ ID NO：12中給出之序列或由其組成之重鏈及包含SEQ ID NO：10中給出之序列或由其組成之輕鏈。
CA170_01638g49及1638.g49在本文中互換使用且用於指抗體可變區之具體對，其可以多種不同格式使用。該等可變區係SEQ ID NO：9中給出之重鏈序列gH33及SEQ ID NO：8中給出之輕鏈序列gL7。
CA170_01638g28及1638.g28在本文中互換使用且用於指抗體可變區之具體對，其可以多種不同格式使用。該等可變區係SEQ ID NO：27中給出之重鏈序列及SEQ ID NO：25中給出之輕鏈序列。
在一個實施例中，抗體Fab重鏈包含CH1結構域且抗體輕鏈包含CL結構域，κ或λ。
在一個實施例中，Fab組份之輕鏈具有SEQ ID NO：10中給出之序列且Fab組份之重鏈具有SEQ ID NO：14中給出之序列。
在一個實施例中，Fab組份之輕鏈具有SEQ ID NO：26中給出之序列且Fab組份之重鏈具有SEQ ID NO：28中給出之序列。
在一個實施例中，Fab組份之輕鏈具有SEQ ID NO：92中給出之序列且Fab組份之重鏈具有SEQ ID NO：94中給出之序列。
生物分子(例如抗體或片段)含有酸性及/或鹼性官能基，藉此給予分子淨正電荷或負電荷。整體「觀察」電荷之量將取決於實體之絕對胺基酸序列、3D結構中帶電基團之局部環境及分子之環境條件。等電點(pI)係特定分子或其溶劑可及表面不攜帶淨電荷之pH。在一個實例中，本發明之FcRn抗體及片段可經改造以具有適當等電點。此 可產生具有更穩健性質(特別是適宜溶解性及/或穩定性性質及/或改良純化特性)之抗體及/或片段。
因此，在一個態樣中，本發明提供經改造以具有不同於初始鑑別抗體之等電點的人類化FcRn抗體。該抗體可例如藉由置換胺基酸殘基、例如用一或多個鹼性胺基酸殘基置換酸性胺基酸殘基經改造。或者，可引入鹼性胺基酸殘基或可移除酸性胺基酸殘基。或者，若分子具有不可接受之高pI值，則若需要，可引入酸性殘基以降低pI。重要的是在操縱pI時，必須小心以保留抗體或片段之合意活性。因此，在一個實施例中，經改造抗體或片段具有與「未經修飾」抗體或片段相同或實質上相同之活性。
可使用程式，諸如** ExPASY http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html及http：//www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html，以預測抗體或片段之等電點。或者或另外，可使用任何適宜標準實驗室技術量測pI。
本發明之抗體分子適宜地具有高結合親和力，特別是在奈莫耳濃度(nanomolar)範圍內。親和力可使用業內已知之任何適宜方法(包括BIAcore，如本文實例中所述)使用分離之天然或重組FcRn或適宜融合蛋白/多肽來量測。在一個實例中，親和力係使用如本文實例中所述之重組人類FcRn細胞外結構域(SEQ ID NO：21)量測。在一個實例中，親和力係使用重組人類FcRn α鏈細胞外結構域(SEQ ID NO：21)聯合人類β2微球蛋白(β2M)(SEQ ID NO：24)來量測。適宜地，本發明之抗體分子對於分離之人類FcRn具有約1nM或更低之結合親和力。在一個實施例中，本發明之抗體分子具有約500pM或更低之結合親和力(即較高親和力)。在一個實施例中，本發明之抗體分子具有約250pM或更低之結合親和力。在一個實施例中，本發明之抗體分子具有約200pM或更低之結合親和力。在一個實施例中，本發明之抗體分子具有約160pM或更低之結合親和力。
在一個實施例中，本發明之抗體分子能夠於pH6或更低pH(具體而言pH 6)及pH7.4或更高pH(具體而言pH7.4)二者下以相當結合親和力結合人類FcRn。因此，有利地，甚至在胞內體內，抗體能繼續結合FcRn，藉此最大化FcRn與IgG結合之阻斷。
在一個實施例中，本發明之抗體分子能夠以於pH6及pH7.4下量測時200pM或更低或160pM或更低之結合親和力結合人類FcRn。在一個實施例中，本發明之抗體能夠以於pH6及pH7.4下量測時130pM或更低之結合親和力結合人類FcRn。在一個實施例中，本發明之抗體能夠以於pH6下量測時160pM或更低之結合親和力及於pH7.4下量測時50pM或更低之結合親和力結合人類FcRn。
本發明抗體或結合片段之親和力、以及結合試劑(例如抗體)抑制結合之程度可由熟習此項技術者使用習用技術(例如由Scatchard等人(Ann.KY.Acad.Sci.51：660-672(1949))所述之彼等)或藉由表面電漿共振(SPR)使用諸如BIAcore等系統來測定。對於表面電漿共振，將靶分子固定於固相上並暴露於在沿流動槽運行之移動相中之配體。若發生配體結合至固定靶標，則局部折射率改變，從而引起SPR角改變，此可藉由檢測反射光之強度變化實時監測。可分析SPR信號之變化速率以產生結合反應之締合及解離相之表觀速率常數。該等值之比率產生表觀平衡常數(親和力)(例如，參見Wolff等人，Cancer Res.53：2560-65(1993))。
在本發明中，通常如下使用SPR測定測試抗體分子之親和力。將測試抗體分子捕獲於固相上，並使與人類β2M非共價複合之人類FcRn α鏈細胞外結構域流經移動相中之捕獲抗體並測定測試抗體分子對人類FcRn之親和力。可使用任何適當方法(例如使用抗Fc或抗Fab’特異性捕獲試劑)將測試抗體分子捕獲於固相晶片表面上。在一個實例中，親和力係於pH6下測定。在一個實例中，親和力係於pH7.4下測 定。
應瞭解，可使用業內已知之任何適宜方法改變由本發明提供之抗體之親和力。因此，本發明亦係關於本發明抗體分子之變體，其具有對於FcRn改良之親和力。該等變體可藉由多種親和力成熟方案(包括使CDR突變(Yang等人，J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、鏈改組(Marks等人，Bio/Technology,10,779-783,1992)、使用大腸桿菌(E.coli)之突變菌株(Low等人，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改組(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌體展示(Thompson等人，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)及有性PCR(Crameri等人，Nature,391,288-291,1998)來獲得。Vaughan等人(上文文獻)論述親和力成熟之該等方法。
在一個實施例中，本發明之抗體分子阻斷人類FcRn活性。適於測定抗體阻斷FcRn之能力之分析闡述於本文實例中。下文闡述用於測定抗體分子阻斷IgG在活體外再循環之能力的適宜分析。
若期望，用於本發明中之抗體分子可偶聯至一或多個效應物分子。應瞭解，效應物分子可包含單一效應物分子或兩個或更多個如此連接以形成可附接至本發明抗體之單一部分之該分子。若期望獲得連接至效應物分子之抗體片段，則此可藉由標準化學或重組DNA程序來製備，其中抗體片段直接或經由偶合試劑連接至效應物分子。用於該等將效應物分子偶聯至抗體之技術已為業內所熟知(參見Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人編輯，1987，第623-53頁；Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.,62：119-58及Dubowchik等人，1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。特定化學程序包括(例如)闡述於WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476及WO 03/031581中之彼等。或者，若效應物分子係蛋白質或多肽，則可使用重組DNA程序(例如)如WO 86/01533及EP0392745 中所述獲得鏈接。
如本文中所用術語效應物分子包括(例如)抗瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白質(例如酶)、其他抗體或抗體片段、合成或天然聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核種(具體而言放射性碘化物)、放射性同位素、螯合金屬、奈米粒子及報告基團(例如螢光化合物或可藉由NMR或ESR光譜檢測之化合物)。
效應物分子之實例可包括細胞毒素或包括任何對細胞有害(例如殺死)之試劑之細胞毒性劑。實例包括考布他汀(combrestatin)、多拉司他汀(dolastatin)、埃博黴素(epothilone)、星形孢菌素(staurosporin)、類美登素(maytansinoid)、海綿抑制素(spongistatin)、利索新(rhizoxin)、軟海綿素(halichondrins)、根黴素(roridins)、哈米特林(hemiasterlins)、紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短桿菌素D(gramicidin D)、溴化乙錠、依米丁(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。
效應物分子亦包括(但不限於)抗代謝物(例如胺甲喋呤(methotrexate)、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(decarbazine))、烷基化劑(例如甲基二氯乙基胺、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)及洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺、白消安 (busulfan)、二溴甘露醇、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)及順式-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環類(例如道諾黴素(daunorubicin)(先前稱作道諾黴素(daunomycin))及多柔比星)、抗生素(例如放線菌素(dactinomycin)(先前稱作放線菌素actinomycin)、博來黴素、光輝黴素、安麯黴素(anthramycin)(AMC)、卡奇黴素(calicheamicin)或多卡米星(duocarmycin))及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。
其他效應物分子可包括螯合放射性核種，例如111In及90Y、Lu177、鉍213、鉲252、銥192及鎢188/錸188；或藥物，例如但不限於烷基磷酸膽鹼、拓撲異構酶I抑制劑、類紫杉醇(taxoid)及蘇拉明(suramin)。
其他效應物分子包括蛋白質、肽及酶。目標酶包括(但不限於)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、異構酶、轉移酶。目標蛋白質、多肽及肽包括(但不限於)免疫球蛋白、毒素(例如相思子素(abrin)、蓖麻毒蛋白A(ricin A)、假單胞菌屬(pseudomonas)外毒素或白喉(diphtheria)毒素)、蛋白質(例如胰島素)、腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板源生長因子或組織血纖維蛋白溶酶原活化劑、血栓劑或抗血管生成劑(例如血管抑素或內皮抑素)、或生物反應調節劑(例如淋巴因子、介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、神經生長因子(NGF)或他生長因子及免疫球蛋白)。
其他效應物分子可包括可用於(例如)診斷之可檢測之物質。可檢測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料、放射性核種、正電子發射金屬(用於正電子發射斷層攝影術)及非放射性順磁性金屬離子。關於可偶聯至抗體用作診斷之金屬離子，通常參見美國專利第4,741,900號。適宜酶包括辣根過氧化物酶、鹼性磷 酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯基膽鹼酯酶；適宜輔基包括鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白及生物素；適宜螢光材料包括傘形酮(umbelliferone)、螢光黃(fluorescein)、螢光黃異硫氰酸酯、玫瑰紅(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光黃、丹磺醯氯(dansyl chloride)及藻紅素(phycoerythrin)；適宜發光材料包括發光胺(luminol)；適宜生物發光材料包括螢光素酶、螢光素及水母素(aequorin)；且適宜放射性核種包括125I、131I、111In及99Tc。
在另一實例中，效應物分子可增加抗體之活體內半衰期，及/或降低抗體之免疫原性及/或增強抗體橫跨上皮障壁至免疫系統之遞送。此類型之適宜效應物分子之實例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結合蛋白或白蛋白結合化合物，例如闡述於WO05/117984中之彼等。
在一個實施例中，由獨立於FcRn之效應物分子提供之半衰期係有利的。
若效應物分子係聚合物，則其通常可為合成或天然聚合物，例如視情況經取代之直鏈或具支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧化烯聚合物或具支鏈或無支鏈多醣(例如均-或雜-多醣)。
可存於上文所提及合成聚合物上之具體可選取代基包括一或多個羥基、甲基或甲氧基。
合成聚合物之具體實例包括視情況經取代之直鏈或具支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其視情況經取代之聚(乙二醇)，例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
具體天然聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、聚葡萄糖、肝醣或其衍生物。
在一個實施例中，聚合物係白蛋白或其片段，例如人類血清白蛋白或其片段。
如本文中所用「衍生物」意欲包括反應性衍生物，例如硫醇選 擇性反應基團，例如馬來醯亞胺及諸如此類。反應基團可直接或經由連接體區段連接至聚合物。應瞭解，在一些情況下，此基團之殘基作為抗體片段與聚合物之間之連接基團形成產物之部分。
可視需要改變聚合物之大小，但其通常將在500Da至50000Da、例如5000Da至40000Da、例如20000Da至40000Da之平均分子量範圍內。具體而言，可基於產物之預期用途(例如定位至某些組織(例如腫瘤)或延長循環半衰期之能力)選擇聚合物大小(關於綜述，參見Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，例如，若產物意欲離開循環並穿透組織(例如)用於治療腫瘤，則可有利地使用例如具有約5000Da之分子量之小分子量聚合物。對於產物保留在循環中之應用，可有利地使用例如具有20000Da至40000Da範圍內之分子量之較高分子量聚合物。
適宜聚合物包括聚伸烷基聚合物，例如聚(乙二醇)或尤其甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其分子量在約15000Da至約40000Da範圍內。
在一個實例中，用於本發明中之抗體附接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一個特定實例中，抗體係抗體片段且PEG分子可經由位於抗體片段中之任何可用胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基附接，例如任何游離胺基、亞胺基、硫醇、羥基或羧基。該等胺基酸可在抗體片段中天然存在或可使用重組DNA方法經改造至片段中(例如，參見US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971、WO2008/038024)。在一個實例中，本發明之抗體分子係經修飾Fab片段，其中修飾係向其重鏈之C-末端添加一或多個胺基酸以容許附接效應物分子。適宜地，額外胺基酸形成含有效應物分子可附接之一或多個半胱胺酸殘基的經修飾鉸鏈區。可使用多個位點以附接兩個或更多個PEG分子。
適宜地，PEG分子經由至少一個位於抗體片段中之半胱胺酸殘基之硫醇基團共價連接。附接至經修飾抗體片段之各聚合物分子可共價 連接至位於片段中之半胱胺酸殘基之硫原子。共價鏈接通常將為二硫鍵或具體而言硫-碳鍵。若使用硫醇基團作為附接點，則可使用適當活化之效應物分子(例如硫醇選擇性衍生物，例如馬來醯亞胺及半胱胺酸衍生物)。活化之聚合物可在如上文所述聚合物修飾之抗體片段之製備中用作起始材料。活化之聚合物可為含有硫醇反應基團(例如α-鹵基羧酸或酯(例如碘乙醯胺)、醯亞胺(例如馬來醯亞胺)、乙烯基碸或二硫化物)之任何聚合物。該等起始材料可商業獲得(例如來自Nektar，先前稱作Shearwater Polymers Inc.,Huntsville,AL,USA)或可自市售起始材料使用習用化學程序來製備。特定PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可自Nektar(先前稱作Shearwater)、Rapp Polymere及SunBio獲得)及M-PEG-SPA(可自Nektar(先前稱作Shearwater)獲得)。
在一個實施例中，抗體係經修飾Fab片段、Fab’片段或diFab，例如根據EP 0948544或EP1090037中揭示之方法，其經聚乙二醇化，即具有共價附接至其之PEG(聚(乙二醇))[亦參見「Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and Biomedical Applications」,1992,J.Milton Harris(編輯),Plenum Press,New York,「Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications」,1997,J.Milton Harris及S.Zalipsky(編輯),American Chemical Society,Washington DC and 「Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences」,1998,M.Aslam及A.Dent,Grove Publishers,New York；Chapman,A.2002,Advanced Drug Delivery Reviews 2002,54：531-545]。在一個實例中，PEG附接至鉸鏈區中之半胱胺酸。在一個實例中，PEG修飾之Fab片段具有共價連接至經修飾鉸鏈區中之單一硫醇基團的馬來醯亞胺基團。離胺酸殘基可共價連接至馬來醯亞胺基團且具有約20,000Da之分子量之甲氧基聚(乙二醇)聚合物可附接至離胺酸殘基上之胺基團中之每一者。因此，附接至Fab片段之PEG之總分子 量可為約40,000Da。
特定PEG分子包括N,N’-雙(甲氧基聚(乙二醇)MW 20,000)經修飾離胺酸(亦稱作PEG2MAL40K(可自Nektar(先前稱作Shearwater)獲得))之2-[3-(N-馬來醯亞胺基)丙醯胺基]乙基醯胺。
PEG連接體之替代來源包括NOF，其供應GL2-400MA3(其中下文結構中之m係5)及GL2-400MA(其中m係2)且n係約450：
亦即，每一PEG係約20,000Da。
因此，在一個實施例中，PEG係2,3-雙(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-{[3-(6-馬來醯亞胺基-1-側氧基己基)胺基]丙基氧基}己烷(2臂具支鏈PEG，-CH2)3NHCO(CH2)5-MAL，Mw 40,000，稱作SUNBRIGHT GL2-400MA3。
以下類型之其他替代PEG效應物分子：
可自Dr Reddy、NOF及Jenkem獲得。
在一個實施例中，抗體或片段偶聯至澱粉分子以例如增加半衰期。偶聯澱粉至蛋白質之方法係如US 8,017,739中所述，其以引用方式併入本文中。
在一個實施例中，提供抗FcRn結合分子(即抗體或其結合片段)，其：‧引起血漿IgG濃度降低50-85%、例如降低70%，‧血漿白蛋白濃度降低不超過25%或20%，及/或‧具有重複投藥之可能以長期維持低血漿IgG濃度。
本發明亦提供編碼本發明之抗體分子之重鏈及/或輕鏈之經分離DNA序列。適宜地，DNA序列編碼本發明之抗體分子之重鏈或輕鏈。本發明之DNA序列可包含例如藉由化學處理產生之合成DNA、cDNA、基因體DNA或其任一組合。
編碼本發明之抗體分子之DNA序列可藉由熟習此項技術者熟知之方法獲得。舉例而言，若期望，編碼抗體重鏈及輕鏈之部分或全部之DNA序列可自測定DNA序列合成或基於相應胺基酸序列合成。
熟習此項技術者可廣泛獲得編碼受體框架序列之DNA且該DNA可基於其已知胺基酸序列容易地合成。
分子生物之標準技術可用於製備編碼本發明之抗體分子之DNA序列。期望DNA序列可完全或部分使用寡核苷酸合成技術合成。若適當，可使用定點誘變及聚合酶鏈式反應(PCR)技術。
本文提供適宜DNA序列之實例。
因此，在一個實例中，本發明提供編碼本發明之抗體Fab-dsscFv之重鏈(其包含SEQ ID NO：13中給出之序列)的經分離DNA序列。亦提供編碼本發明之抗體Fab-dsscFv之輕鏈(其包含SEQ ID NO：11中給出之序列)的經分離DNA序列。
本發明亦係關於包含本發明之一或多個DNA序列之選殖或表現載體。因此，提供包含一或多個編碼本發明抗體之DNA序列的選殖或表現載體。適宜地，選殖或表現載體包含兩個分別編碼本發明之抗體分子之輕鏈及重鏈的DNA序列及適宜信號序列。在一個實例中，載體 包含重鏈與輕鏈之間之基因間序列(參見WO03/048208)。
可構築載體之一般方法、轉染方法及培養方法已為熟習此項技術者熟知。就此而言，參照「Current Protocols in Molecular Biology」,1999,F.M.Ausubel(編輯),Wiley Interscience,New York及由Cold Spring Harbor Publishing出版之Maniatis Manual。
亦提供包含一或多種選殖或表現載體之宿主細胞，該等載體包含一或多個編碼本發明之抗體分子之DNA序列。因此，本發明亦提供用於本發明之抗體分子之表現之宿主細胞，其包含：i)編碼該抗體之重鏈之DNA序列，及ii)編碼該抗體之輕鏈之DNA序列。
其中該等DNA序列提供於一或多種選殖或表現載體中。
任何適宜宿主細胞/載體系統可用於編碼本發明之抗體分子之DNA序列的表現。可使用細菌(例如大腸桿菌)及其他微生物系統(尤其用於表現抗體片段)或亦可使用真核(例如哺乳動物)宿主細胞表現系統(尤其用於表現全長抗體)。適宜哺乳動物宿主細胞包括CHO、骨髓瘤或雜交瘤細胞。
用於本發明中之適宜類型之中國倉鼠卵巢(CHO細胞)可包括CHO及CHO-K1細胞，包括可與DHFR可選標記物一起使用之dhfr-CHO細胞(例如CHO-DG44細胞及CHO-DXB11細胞)或可與麩醯胺酸合成酶可選標記物一起使用之CHOK1-SV細胞。用於表現抗體之其他細胞類型包括淋巴球細胞系，例如NSO骨髓瘤細胞及SP2細胞、COS細胞。
本發明亦提供產生本發明之抗體分子之方法，其包含在適於引起自編碼本發明之抗體分子之DNA之蛋白質表現之條件下培養含有本發明之一或多各載體之宿主細胞及分離抗體分子。
抗體分子包含重鏈及輕鏈二者且可將細胞系轉染至兩個載體中，即編碼輕鏈多肽之第一載體及編碼重鏈多肽之第二載體。或者， 可使用單一載體，該載體包括編碼輕鏈及重鏈多肽之序列。
本發明之抗體及片段係以良好程度自宿主細胞表現。因此，抗體及/或片段之性質有助於商業處理。
因此，提供培養宿主細胞及表現抗體或其片段、分離後者及視情況純化其以提供經分離抗體或片段之方法。在一個實施例中，該方法進一步包含將效應物分子偶聯至經分離抗體或片段(例如偶聯至具體而言如本文所述PEG聚合物)之步驟。
在一個實施例中，提供純化抗體(具體而言本發明之抗體或片段)之方法，其包含以下步驟：以非結合模式實施離子交換層析使得雜質保留於管柱上並溶析抗體。
在一個實施例中，純化採用在FcRn管柱上親和力捕獲。
在一個實施例中，純化採用辛巴藍(cibacron blue)或相似物用於純化白蛋白融合或偶聯分子。
適用於該方法中之離子交換樹脂包括Q.FF樹脂(由GE-Healthcare供應)。該步驟可(例如)於pH約8下實施。
該方法可進一步包含採用於(例如)約4至5(例如4.5)之pH下實施之陽離子交換層析的初始捕獲步驟。陽離子交換層析可(例如)採用樹脂，例如CaptoS樹脂或SP瓊脂糖FF(由GE-Healthcare供應)。隨後可採用離子鹽溶液(例如氯化鈉)以(例如)200mM之濃度自樹脂溶析抗體或片段。
因此，若適當，一或多個層析步驟可包括一或多個洗滌步驟。
純化製程亦可包含一或多個過濾步驟，例如滲濾步驟。
因此，在一個實施例中，提供呈實質上純化形式、特別是不含或實質上不含內毒素及/或宿主細胞蛋白質或DNA之純化抗FcRn抗體或片段，例如人類化抗體或片段，特別是本發明之抗體或片段。
如上文使用之純化形式欲指至少90%純度，例如91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% w/w或更純。。
實質上不含內毒素通常欲指內毒素含量為1EU/mg抗體產物或更小，例如0.5或0.1EU/mg產物。
實質上不含宿主細胞蛋白質或DNA通常欲指宿主細胞蛋白質及/或DNA含量為400μg/mg抗體產物或更小，例如100μg/mg或更小，具體而言20μg per mg(若適當)。
本發明之抗體分子亦可用於診斷，例如涉及FcRn之疾病狀態之活體內診斷及成像。
由於本發明之抗體可用於治療及/或預防病理狀況，故本發明亦提供包含本發明之抗體分子以及一或多種醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑的醫藥或診斷組合物。因此，提供本發明之抗體分子之用途，其用於製造藥劑。該組合物通常將作為無菌醫藥組合物之部分供應，該組合物通常將包括醫藥上可接受之載劑。本發明之醫藥組合物可另外包含醫藥上可接受之賦形劑。
本發明亦提供製備醫藥或診斷組合物之方法，其包含將本發明之抗體分子與一或多種醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑一起添加並混合。
抗體分子可為醫藥或診斷組合物中之唯一活性成份或可伴隨有其他活性成份，包括其他抗體成份或非抗體成份，例如類固醇或其他藥物分子，具體而言半衰期獨立於FcRn結合之藥物分子。
醫藥組合物適宜地包含治療有效量之本發明之抗體。如本文中所用術語「治療有效量」係指治療、改善或預防靶向疾病或病況或展現可檢測之治療或預防效應所需之治療劑之量。對於任何抗體分子，可最初在細胞培養分析中或在動物模型中、通常在齧齒類動物、兔、狗、豬或靈長類動物中估計治療有效量。動物模型亦可用於測定適當濃度範圍及投與途徑。隨後可使用此等資訊來確定人類中之可用投與 劑量及途徑。
人類個體之精確治療有效量將取決於疾病狀態之嚴重程度、個體之一般健康狀況、個體之年齡、重量及性別、飲食，投與時間及頻率、藥物組合、反應敏感性及對療法之耐受性/反應。此量可藉由常規實驗測定且在臨床醫師之判斷內。通常，治療有效量將自0.01mg/kg至500mg/kg，例如0.1mg/kg至200mg/kg，例如100mg/Kg。
醫藥組合物可以每劑量含有預定量之本發明之活性試劑之單位劑型便捷地呈現。
本發明之抗體之治療劑量在活體內不顯示表觀毒性效應。
在本發明之抗體或片段之一個實施例中，單一劑量可提供循環IgG量減少高達70%。在本發明之抗體或片段之一個實施例中，單一劑量可提供循環IgG量減少高達80%。在本發明之抗體或片段之一個實施例中，單一劑量可提供循環IgG量減少大於80%。
可在投與相關治療劑量後約1週觀察循環IgG之最大治療性減少。若未遞送其他治療劑量，則IgG之量可在投藥後數週內恢復。如本文中所採用之恢復係指量返回至與在開始初始投藥之前觀察之彼等相似之量。
有利地，可藉由投與本揭示內容之抗體或片段之依序劑量將活體內IgG之量維持於適當低量下。
組合物可個別地投與患者或可與其他藥劑、藥物或激素組合(例如，同時、依序或分開)投與。
如本文中所採用之藥劑係指在投與時具有生理效應之實體。
如本文中所採用之藥物係指治療劑量具有適當生理效應之化學實體。
在一個實施例中，本發明之抗體或片段係與免疫抑制劑療法(例如類固醇，具體而言普賴松)一起使用。
在一個實施例中，本發明之抗體或片段係與利妥昔單抗或其他B細胞療法一起使用。
在一個實施例中，本發明之抗體或片段係與任何B細胞或T細胞調節劑或免疫調節劑一起使用。實例包括胺甲喋呤、麥考酚酯(mycophenolate)及硫唑嘌呤。
所投與本發明之抗體分子之劑量取決於欲治療之病況之性質、所存在發炎之程度及抗體分子係預防性使用或用於治療現存病況。
投藥頻率將取決於抗體之半衰期、其靶標介導之配置、其效應之持續時間及抗藥物抗體之存在。若抗體具有短半衰期(幾小時)或限制活性，及/或若期望遞送小體積之藥物(例如對於皮下注射)，可能需要頻繁、與每天一次或更多次一樣頻繁地投藥。或者，若抗體具有長半衰期、具有活性之長持續時間，或可以大體積(例如藉由輸注)投藥，則投藥可不頻繁，每天、或每幾天、幾週或幾個月一次。在一個實施例中，在劑量之間容許足夠時間以容許抗藥物抗體量下降。
如本文中所採用之半衰期欲指分子於循環中、例如血清/血漿中之持續時間。
如本文中所採用之藥效學係指本發明之分子之生物作用之特性及具體而言持續時間。
醫藥上可接受之載劑自身不應誘發對接受組合物之個體有害之抗體之產生且不應有毒。適宜載劑可為大的、緩慢代謝之大分子，例如蛋白質、多肽、脂質體、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物及無活性病毒粒子。
可使用醫藥上可接受之鹽，例如礦物酸鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽及硫酸鹽)或有機酸之鹽(例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽及苯甲酸鹽)。
治療組合物中之醫藥上可接受之載劑可另外含有液體，例如 水、鹽水、甘油及乙醇。另外，該等組合物中可存在輔助物質(例如潤濕或乳化劑或pH緩衝物質)。該等載劑使得能夠將醫藥組合物調配成錠劑、丸劑、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液及懸浮液以用於由患者攝入。
適於投與之形式包括適於非經腸投與、例如藉由注射或輸注、例如藉由濃注注射或連續輸注之形式。若產物用於注射或輸注，則其可採用油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液形式且其可含有調配劑，例如懸浮劑、防腐劑、穩定劑及/或分散劑。或者，抗體分子可呈乾燥形式，其用於在與適當無菌液體一起使用之前重構。
一旦調配，可將本發明之組合物直接投與個體。欲治療之個體可為動物。然而，在一或多個實施例中，組合物適於投與至人類個體。
適宜地，在本發明之調配物中，最終調配物之pH與抗體或片段之等電點之值並不相似，例如若蛋白質之pI在8-9或更高範圍內，則7之調配物pH可適當。儘管不希望受限於理論，但據信此可最終提供具有改良穩定性之最終調配物，例如抗體或片段保留於溶液中。
在一個實例中，pH在4.0至7.0範圍內之醫藥調配物包含：1mg/mL至200mg/mL之本發明之抗體分子、1mM至100mM之緩衝液、0.001%至1%之表面活性劑、a)10mM至500mM之穩定劑、b)10mM至500mM之穩定劑及5mM至500mM之張力劑、或c)5mM至500mM之張力劑。
本發明之醫藥組合物可藉由任何多種途徑投與，包括但不限於經口、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、室內、經皮、透皮(例如，參見WO98/20734)、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。亦可使用皮下注射器以投與本發明之醫藥組合物。通常，治療組合物可製備為可注射物，呈液體溶液或懸浮液形 式。亦可製備適於在注射之前在液體媒劑中製成溶液或懸浮液之固體形式。
組合物之直接遞送通常將藉由注射、皮下、腹膜內、靜脈內或肌內完成，或遞送至組織之間質間隙。組合物亦可投與至病灶中。劑量治療可為單一劑量時間表或多個劑量時間表。
應瞭解，組合物中之活性成份將為抗體分子。因此，其將在胃腸道中易於降解。因此，若組合物欲藉由使用胃腸道之途徑投與，則組合物將需要含有保護抗體免於降解但在自胃腸道吸收後釋放抗體之試劑。
醫藥上可接受之載劑之全面論述可見於Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)中。
在一個實施例中，調配物以用於局部投與(包括吸入)之調配物形式提供。
適宜可吸入製劑包括可吸入粉末、含有推進劑氣體之計量氣溶膠或不含推進劑氣體之可吸入溶液。含有活性物質之本揭示內容之可吸入粉末可僅由上文所提及活性物質組成，或由上文所提及活性物質與生理學上可接受之賦形劑之混合物組成。
該等可吸入粉末可包括單醣(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二醣(例如乳糖、蔗糖、麥芽糖)、寡醣及多醣(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨醇、甘露醇、木糖醇)、鹽(例如氯化鈉、碳酸鈣)或該等物質與另一物質之混合物。適宜地使用單醣或二醣，使用乳糖或葡萄糖，具體而言(但並非排他性的)呈其水合物形式。
沈積於肺中之粒子要求粒徑小於10微米，例如1-9微米，例如1μm至5μm。活性成份(例如抗體或片段)之粒徑具有頭等重要性。
可用於製備可吸入氣溶膠之推進劑氣體已為業內所知。適宜推進劑氣體係選自烴(例如正丙烷、正丁烷或異丁烷)及鹵代烴(例如甲 烷、乙烷、丙烷、丁烷、環丙烷或環丁烷之氯化及/或氟化衍生物)。上文提及之推進劑氣體可單獨或以其混合物使用。
尤其適宜之推進劑氣體係選自TG11、TG 12、TG 134a及TG227之鹵化烷烴衍生物。在上文所提及鹵化烴中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)及TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物尤其適宜。
含有推進劑氣體之可吸入氣溶膠亦可含有其他成份，例如共溶劑、穩定劑、表面活性劑(surface-active agents或surfactant)、抗氧化劑、潤滑劑及用於調節pH之試劑。所有該等成份均為業內所知。
本發明含有推進劑氣體之可吸入氣溶膠可含有高達5重量%之活性物質。本發明之氣溶膠含有(例如)0.002重量%至5重量%、0.01重量%至3重量%、0.015重量%至2重量%、0.1重量%至2重量%、0.5重量%至2重量%或0.5重量%至1重量%之活性成份。
或者，局部投與至肺亦可藉由投與液體溶液或懸浮液調配物(例如)採用裝置(例如霧化器，例如連接至壓縮器之霧化器，例如連接至Pari Master(R)壓縮器之Pari LC-Jet Plus(R)霧化器，由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.製造)來完成。
本發明之抗體可(例如)以溶液或懸浮液形式遞送、分散於溶劑中。其可懸浮於適當生理溶液(例如，鹽水或其他藥理上可接受之溶劑或緩衝溶液)中。業內已知之緩衝溶液之實例可含有0.05mg至0.15mg依地酸二鈉(disodium edetate)、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg無水檸檬酸及0.45mg至0.55mg檸檬酸鈉/1ml水，以便獲得約4.0至5.0之pH。懸浮液可採用(例如)凍乾抗體。
治療性懸浮液或溶液調配物亦可含有一或多種賦形劑。賦形劑為業內熟知且包括緩衝液(例如，檸檬酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液及碳酸氫鹽緩衝液)、胺基酸、尿素、醇、抗壞血酸、 磷脂、蛋白質(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化鈉、脂質體、甘露醇、山梨醇及甘油。溶液或懸浮液可囊封於脂質體或生物可降解微球體中。調配物通常將採用無菌製造方法以實質上無菌形式來提供。
此可包括藉由彼等熟習此項技術者熟悉之方法進行以下產生及滅菌：過濾用於調配之經緩衝溶劑/溶液，將抗體無菌懸浮於無菌緩衝溶劑之溶液中，及將調配物分配至無菌貯器中。
本發明之可噴霧調配物可以(例如)包裝於箔包封中之單一劑量單元(例如，密封塑膠容器或小瓶)形式提供。每一小瓶含有(例如)2mL之體積之溶劑/溶液緩衝液之單位劑量。
本文揭示之抗體可適於經由噴霧遞送。
亦設想本發明之抗體可藉由使用基因療法投與。為達成此，將在適當DNA組份控制下編碼抗體分子之重鏈及輕鏈之DNA序列引入患者中，使得抗體鏈自DNA序列表現並原位裝配。
本發明亦提供用於控制以下疾病之抗體分子(或包含其之組合物)：自體免疫疾病，例如急性播散性腦脊髓炎(ADEM)、急性壞死性出血性腦白質炎、阿狄森氏病(Addison's disease)、無γ球蛋白血症、斑禿、類澱粉變性、ANCA相關之血管炎、強直性脊柱炎、抗-GBM/抗-TBM腎炎、抗磷脂症候群(APS)、自體免疫血管性水腫、自體免疫再生不良性貧血、自體免疫自主神經機能障礙、自體免疫肝炎、自體免疫血內脂質過多、自體免疫免疫缺陷、自體免疫內耳疾病(AIED)、自體免疫心肌炎、自體免疫胰臟炎、自體免疫視網膜病變、自體免疫血小板減少性紫癜(ATP)、自體免疫甲狀腺疾病、自體免疫蕁麻疹、軸突及神經元神經病變、巴婁病(Balo disease)、貝切特氏病(Behcet’s disease)、大水皰性類天孢瘡病、心肌病、卡斯特雷曼病(Castleman disease)、腹瀉疾病、查加斯氏病(Chagas disease)、慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病變(CIDP)、慢性復發性多病灶骨髓炎(CRMO)、丘-施 氏症候群(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性類天皰瘡/良性黏膜性類天皰瘡病、克隆氏病(Crohn’s disease)、柯剛氏症候群(Cogans syndrome)、冷凝集素疾病、先天性心臟傳導阻滯、柯薩奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST疾病、原發性混合型冷球蛋白血症、脫髓鞘神經病變、皰疹樣皮炎、皮肌炎、德維克氏病(Devic’s disease)(視神經脊髓炎)、擴張型心肌病、盤狀狼瘡、德雷斯勒氏症候群(Dressler’s syndrome)、子宮內膜異位症、嗜酸性球性血管中心性纖維化、嗜酸性球性筋膜炎、結節性紅斑、實驗性過敏性腦脊髓炎、伊文恩症候群(Evans syndrome)、纖維化肺泡炎、巨細胞動脈炎(顳動脈炎)、腎小球腎炎、古巴士德氏症候群(Goodpasture’s syndrome)、伴隨多血管炎之肉芽腫病(Granulomatosis with Polyangiitis)(GPA)(參見韋格納氏病(Wegener’s))、格雷夫氏病、格林-巴利症候群、橋本氏腦炎(Hashimoto's encephalitis)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性貧血、亨諾-許蘭氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、妊娠皰疹、低γ球蛋白血症、特發性血補體過少之小管間質性腎炎、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病、IgG4相關性疾病、IgG4相關性硬化性疾病、免疫調節性脂蛋白病、發炎性主動脈瘤、發炎性假性腫瘤、包涵體肌炎、胰島素依賴性糖尿病(1型)、間質性膀胱炎、青少年關節炎、青少年糖尿病、川崎症候群(Kawasaki syndrome)、庫特納腫瘤(Kuttner’s tumour)、朗-伊症候群、白血球破碎性血管炎、扁平苔蘚、硬化性苔癬、木樣結膜炎、線狀IgA疾病(LAD)、狼瘡(SLE)、萊姆病(Lyme disease)、慢性縱隔纖維變性、梅尼爾氏病(Meniere’s disease)、顯微鏡下多血管炎、米庫利奇氏症候群(Mikulicz’s syndrome)、混合性結締組織病(MCTD)、莫倫氏潰瘍(Mooren’s ulcer)、穆-哈病(Mucha-Habermann disease)、多灶性纖維硬化、多發性硬化、重症肌無力、肌炎、發作性睡病、視神經脊髓炎 (德維克氏病)、嗜中性白血球減少、眼部瘢痕性類天皰瘡病、視神經炎、奧蒙德氏病(Ormond’s disease)(腹膜後纖維化)、復發性風濕病、PANDAS(與鏈球菌相關之小兒自體免疫神經精神病症)、副腫瘤性小腦變性、副蛋白血症多發性神經病、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、帕羅症候群(Parry Romberg syndrome)、帕-特症候群(Parsonnage-Turner syndrome)、睫狀體扁平部炎(周邊眼色素層炎)、尋常天皰瘡、主動脈周圍炎、動脈周圍炎、周邊神經病變、靜脈周邊性腦脊髓炎、惡性貧血、POEMS症候群、結節性多發性動脈炎、I型、II型及III型自體免疫多腺症候群、風濕性多肌痛、多發性肌炎、心肌梗塞後症候群、心包切開術後症候群、黃體酮性皮炎、原發性膽汁性硬化、原發性硬化性膽管炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、特發性肺纖維化、壞疽性膿皮病、純紅血球再生不良、雷諾現象(Raynauds phenomenon)、反射性交感神經失養症、賴特氏症候群(Reiter’s syndrome)、復發性多軟骨炎、不寧腿症候群、腹膜後纖維化(奧蒙德氏病)、風濕熱、類風濕性關節炎、裡德耳甲狀腺炎(Riedel’s thyroiditis)、類肉瘤病、施密特症候群(Schmidt syndrome)、鞏膜炎、硬皮病、薛格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、精子及睪丸自體免疫性、僵直人症候群(Stiff person syndrome)、亞急性細菌性心內膜炎(SBE)、蘇薩克氏症候群(Susac's syndrome)、交感性眼炎、高安動脈炎(Takayasu’s arteritis)、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、妥洛沙-韓特症候群(Tolosa-Hunt syndrome)、橫貫性脊髓炎、潰瘍性結腸炎、未分化結締組織病(UCTD)、眼色素層炎、血管炎、囊泡形皮膚炎、白斑病、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom Macroglobulinaemia)、溫特發性溶血性貧血及韋格納氏內芽腫病(現在稱為伴隨多血管炎之肉芽腫病(GPA))。
另外適應症亦可包括過黏稠度症候群；冷凝球蛋白血症；移植 腎中之復發性局灶及節段性腎小球硬化；HELLP症候群；雷夫蘇姆病；HIV相關神經病變；橫紋肌溶解及同種免疫疾病。
在一個實施例中，本揭示之抗體或片段用於治療或預防癲癇或癲癇發作。
在一個實施例中，本揭示之抗體或片段用於治療或預防多發性硬化。
在實施例中，本揭示之抗體及片段用於同種免疫疾病/適應症中，其包括：
‧由於抗HLA抗體之移植供體失配
‧胎兒及新生兒同種免疫血小板減少症FNAIT(或新生兒同種免疫血小板減少症NAITP或NAIT或NAT，或胎兒母源性同種免疫血小板減少症FMAITP或FMAIT)。
另外適應症包括：含有Fc之生物醫藥藥物自人類患者快速清除及抗FcRn療法與其他療法IVIg、利妥昔單抗(Rituxan)、血漿去除術之組合。舉例而言，可在利妥昔單抗療法後採用抗FcRn療法。另外，抗FcRn療法可用於快速清除成像劑，例如成像腫瘤中所用之放射標記之抗體。
在實施例中，本揭示之抗體及片段用於神經病症，例如：
‧慢性發炎性去髓鞘型多發性神經病變(CIDP)
‧格林-巴利症候群
‧副蛋白血症多發性神經病變
‧視神經脊髓炎(NMO、NMO系列病症或NMO系列疾病)，及
‧重症肌無力。
在實施例中，本揭示之抗體及片段用於皮膚病症，例如：
‧大皰性類天皰瘡
‧尋常天皰瘡
‧ANCA相關之血管炎
‧擴張型心肌病
在實施例中，本揭示之抗體及片段用於免疫、血液病症，例如：
‧特發性血小板減少紫斑症(ITP)
‧血栓性血小板減少紫斑症(TTP)
‧溫特發性溶血性貧血
‧古巴士德氏症候群
‧由於抗HLA抗體之移植供體失配
在一個實施例中，病症選自重症肌無力、視神經脊髓炎、CIDP、格林-巴利症候群、副蛋白血症多發性神經病、難治性癲癇、ITP/TTP、溶血性貧血、古巴士德氏症候群、ABO失配、狼瘡性腎炎、腎血管炎、硬皮病、纖維化肺泡炎、擴張型心肌病、格雷氏病、1型糖尿病、自體免疫糖尿病、天皰瘡、硬皮病、狼瘡、ANCA血管炎、皮肌炎、薛格連氏病及類風濕性關節炎。
在一個實施例中，病症選自自體免疫多內分泌症候群1型(APECED或惠特克氏症候群(Whitaker’s Syndrome))及2型(施密特氏症候群(Schmidt’s Syndrome))；普禿；肌無力危象；甲狀腺危象；甲狀腺相關之眼病；甲狀腺眼病；自體免疫糖尿病；自體抗體相關之腦炎及/或腦病；落葉型天皰瘡；大皰性表皮松解；皰疹樣皮炎；席登罕氏舞蹈症(Sydenham’s chorea)；急性運動軸突神經病變(AMAN)；米勒費雪症候群(Miller-Fisher syndrome)；多灶性運動神經病(MMN)；斜視性眼陣攣；發炎性肌病；艾薩克氏症候群(Isaac’s syndrome)(自體免疫神經性肌強直)、腫瘤伴生症候群及邊緣葉腦炎。
本發明之抗體及片段可用於治療或預防中。
本發明亦提供降低個體中不期望抗體之濃度的方法，其包含向 個體投與治療有效劑量之本文所述抗FcRn抗體融合蛋白的步驟。
本發明進一步提供本發明之抗體分子之用途，其用於製造用以治療及/或預防本文所述病理病症(例如自體免疫疾病)之藥劑。
在一個實施例中，本發明包含抗體或其片段之用途，其用作診斷之試劑，例如偶聯至報導基因分子。因此，提供經標記之本揭示內容之抗體或片段。在一個態樣中，提供包含本揭示內容之抗體或片段之管柱。
因此，提供用作用於諸如以下等用途之試劑之抗FcRn抗體或結合片段：
1)純化FcRn蛋白質(或其片段)-偶聯至基質且用作親和力管柱，或(呈抗FcRn之經修飾形式)作為沈澱劑(例如用由另一分子識別之結構域修飾的形式，該另一分子可藉由添加Fc來修飾(或產生為全長IgG)，其視情況由抗Fc試劑沈澱)
2)檢測及/或量化活細胞或固定細胞(組織或細胞切片中之活體外或活體內細胞)上或該等細胞中的FcRn。用於此之用途可包括以生物標記形式量化FcRn以追蹤抗FcRn治療之效應。出於該等目的，候選者可以經修飾形式使用(例如藉由添加Fc結構域(呈全長IgG)或一些其他部分(呈遺傳性融合蛋白或化學偶聯物)，例如添加用於檢測目的之螢光標籤)。
3)純化或分選藉由結合至藉由(1)及(2)中例示之方式修飾之候選者標記的帶有FcRn之細胞。
本發明亦提供適於評價測試分子(例如抗體分子)阻斷FcRn活性之能力且特別是細胞再循環IgG之能力的分析。此分析可用於鑑別FcRn活性之抑制劑，例如抗體分子或小分子，且因此亦可用作分批釋放分析用於產生此抑制劑。該分析先前闡述於WO2014/019727中。
本說明書上下文中之包含欲指包括。
若技術上適當，則可組合本發明之實施例。
實施例在本文中闡述為包含某些特徵/要素。本揭示內容亦擴展至由該等特徵/要素組成或基本上由其組成之單獨實施例。
技術參考文獻(例如專利及申請案)以引用方式併入本文中。
在以下示例中僅以闡釋方式進一步闡述本發明，其參照附圖，其中：
圖1 顯示1735h5.hFab-scFv.768抑制MDCK II純系7細胞中之IgG再循環
圖2 顯示1735h5.hFab-scFv.768對人類FcRn-轉基因小鼠之血清中之人類IVIg之濃度之效應
圖3 顯示1735h5.hFab-scFv.768對人類FcRn-轉基因小鼠中之血清白蛋白之濃度之效應。
圖4 顯示正常小鼠中之1735h5.hFab-scFv.768之藥物動力學。
圖5 顯示人類FcRn-轉基因小鼠中之1735h5.hFab-scFv.768之藥物動力學。
圖6 顯示1735h5.hFab-scFv.768(Fab-scFv)與母體Fab及等效Fab-Fv相比之熱穩定性。
圖7 顯示本發明之Fab-scFv及Fab-dsscFv片段格式
圖8 本發明之抗體序列
圖9a 抗體1638.g49之人類化
圖9b 抗體1638.g49之人類化
實例 縮寫
℃ 溫度，攝氏度。
ATR FTIR 衰減全反射傅立葉(Fourier)轉換紅外光譜
CH2 恆定重鏈區2
cIEF 毛細管等電聚焦
DSC 差示掃描量熱法
G0F 岩藻糖基化半乳糖基二分枝聚醣
H chain 重鏈
HPLC 高效液相層析
IgG 免疫球蛋白G
L chain 輕鏈
nLCMS 奈米-液相層析質譜
PBS 磷酸鹽緩衝鹽水緩衝液
pI 等電點
SD 標准偏差
SEC 粒徑篩析層析
ToF 飛行時間
Tm 熔融溫度
TCEP 參(2-羧基乙基)膦
THP 參(羥基丙基)膦
Tris 參(羥甲基)胺基甲烷
實施以下免疫以生成用於B細胞培養物及抗體篩選之材料：用共表現突變人類FcRn(L320A；L321A)(Ober等人，2001 Int.Immunol.13,1551-1559)及小鼠β2M之NIH3T3小鼠纖維母細胞之三次注射及人類FcRn細胞外結構域之第四次最終加強對Sprague Dawley大鼠進行免疫。
監測血清與HEK-293細胞上之突變FcRn之結合及其防止Alexafluor 488-標記之人類IgG之結合的能力。兩種方法均係藉由流式細胞術實施。對於結合，使用藻紅素(PE)標記之抗小鼠或大鼠Fc特異性二級試劑以揭示血清中之IgG之結合。
使用類似於由Zubler等人(1985)所述之方法之方法製備B細胞培養物。簡言之，於37℃下在5% CO2氣氛中將B細胞以約5000個細胞/孔之密度在具有200μl/孔之RPMI 1640培養基(Gibco BRL)之條形編碼96孔組織培養板中培養7天，該培養基補充有10% FCS(PAA laboratories ltd)、2% HEPES(Sigma Aldrich)、1% L-麩醯胺酸(Gibco BRL)、1%青黴素/鏈黴素溶液(Gibco BRL)、0.1% β-巰基乙醇(Gibco BRL)、2-5%活化兔脾細胞培養上清液及γ輻照之EL-4-B5鼠類胸腺瘤細胞(5×104/孔)。
使用基於均相螢光之結合分析使用經突變FcRn(表面穩定)瞬時轉染之HEK-293細胞作為靶抗原之來源確定B細胞培養上清液中FcRn特異性抗體之存在。使用Matrix Platemate液體處置器將10μl上清液自條形編碼之96孔組織培養板轉移至每個孔含有5000個經轉染HEK-293細胞之條形編碼之384孔黑壁分析板。利用山羊抗大鼠或小鼠IgG Fcγ特異性Cy-5偶聯物(Jackson)揭示結合。在Applied Biosystems 8200細胞檢測系統上對板進行讀數。自3800×96孔培養板(代表38種不同經免疫動物)鑑別9800種抗人類FcRn黏合劑。估計此代表約25億B細胞之篩選。
在主要篩選後，使用Aviso Onyx碰撞-拾取機器人將正性上清液固結至96孔條形編碼之主板上並將細胞培養板中之B細胞於-80℃下冷凍。隨後在Biacore分析中篩選主板以鑑別含義高親和力抗體及抑制人類IgG與FcRn結合之彼等之孔(參見下文)。
在BIAcore T200系統(GE Healthcare)上實施使用表面電漿共振技術(SPR)之生物分子相互作用分析。使用HBS-EP+作為運行緩衝液經由與約19500個反應單元(RU)之捕獲量之胺偶合化學將10mM NaAc(pH 5緩衝液)中之山羊抗大鼠IgG、Fc γ(Chemicon International Inc.)固定於CM5感測器晶片上。使用50mM磷酸鹽pH6+150mM NaCl作為 用於親和力及阻斷分析之運行緩衝液。將B細胞培養上清液在200mM磷酸鹽pH6+150mM NaCl中以1：5稀釋。5μl/min下之經稀釋B細胞上清液之600s注射用於由固定抗大鼠IgG、Fc之捕獲。在經捕獲B細胞培養上清液上以30μl/min注射100nM之人類FcRn達180s，之後360s解離。以30μl/min注射人類IgG(Jackson ImmunoResearch)達60s並180s解離。
使用T200評估軟體(1.0版)分析數據以測定抗體之親和力常數(KD)並測定阻斷IgG結合之彼等。
作為替代分析，亦在基於細胞之人類IgG阻斷分析中篩選主板上清液。向96孔U形底聚丙烯板中添加25ul來自主板之B細胞培養上清液。隨後向每一孔中添加突變hFcRn轉染之HEK-293細胞(50,000個細胞/孔，於25ul PBS pH6/1% FCS中)並於4℃下培育1小時。將細胞用150ul PBS介質洗滌兩次。隨後將細胞以7.5ug/ml再懸浮於50ul/孔之含有經Alexafluor488或649標記之人類IgG的PBS/FCS介質中並於4℃下培育1小時。隨後將細胞用150ul介質洗滌兩次並隨後再懸浮於35ul/孔之含有1%甲醛作為固定劑之PBS/FCS介質中。隨後在FACS Canto 2流式細胞計數器上對板進行讀數。
為容許自目標孔之選擇回收抗體可變區基因，必須實施反褶積步驟以使得能夠鑑別含有B細胞之異相群體之給定孔中之抗原特異性B細胞。此係使用螢光焦點方法來達成。簡言之，將來自陽性孔之分泌免疫球蛋白之B細胞與經生物素化人類FcRn及山羊抗大鼠或小鼠Fcγ片段特異性FITC偶聯物(Jackson)之1：1200最終稀釋物塗佈之鏈黴抗生物素蛋白珠粒(New England Biolabs)混合。於37℃下靜態培育1小時後，抗原特異性B細胞可由於在該B細胞周圍存在螢光鹵基來鑑別。隨後利用Eppendorf顯微操作器拾取使用Olympus顯微鏡鑑別之該等個別B細胞並將其沈積於PCR管中。螢光焦點係自268個選擇孔生 成。
藉由反轉錄聚合酶鏈式反應(RT)-PCR使用重鏈及輕鏈可變區特異性引子自單一細胞回收抗體可變區基因。在Aviso Onyx液體操作機器人上實施兩輪PCR，其中巢式2° PCR在3’及5’端納入限制位點，從而容許可變區選殖至小鼠γ1 IgG(VH)或小鼠κ(VL)哺乳動物表現載體中。使用Fectin 293(Invitrogen)將成對重鏈及輕鏈構築體共轉染至HEK-293細胞中並在48孔板中以1ml之體積培養。在5-7天表現後，收穫上清液且抗體經受進一步篩選。
PCR自156個選擇孔之單一B細胞成功地回收重鏈及輕鏈同源對。經選殖可變區基因之DNA序列分析鑑別重組抗體之多個獨特家族。在表現後，在人類IgG FACS阻斷(上文所述)及IgG再循環分析中訊問瞬時上清液。在一些情形下，產生並測定純化小鼠γ1 IgG(相應地標記數據)。
再循環分析使用過表現人類FcRn及β 2微球蛋白且以25,000個細胞/96孔板之孔平鋪之MDCK II細胞。將該等細胞於37℃、5% CO2下培育過夜。將細胞用HBSS+ Ca/Mg pH 7.2+1% BSA洗滌且隨後於37℃、5% CO2下與50μl不同濃度之HEK-293瞬時上清液或純化抗體一起培育1小時。移出上清液並向細胞中添加50μl HBSS+ Ca/Mg pH 5.9+1%BSA中之500ng/ml生物素化人類IgG(Jackson)並於37℃、5% CO2下培育1小時。隨後將細胞在HBSS+ Ca/Mg pH 5.9中洗滌三次並向細胞中添加100μl HBSS+ Ca/Mg pH 7.2並於37℃、5% CO2下培育2小時。自細胞移出上清液並使用利用抗人類IgG捕獲抗體(Jackson)及鏈黴抗生物素蛋白-磺基標籤揭示抗體(MSD)之MSD分析分析總IgG。藉由非線性回歸分析抑制曲線以測定IC50值。
基於該等分析中之性能，選擇包含SEQ ID NO 1至6中給出之6個CDR的抗體家族。抗體CA170_01638具有最佳活性且選擇用於人類 化，如WO2015/071330中先前所述。
實例1 人類化方法及Fab-dsscFv構築
藉由將大鼠抗體V區之CDR移植至人類種系抗體V區框架人類化抗體CA170_01638。為恢復抗體之活性，亦在人類化序列中保留大鼠V區之多個框架殘基。該等殘基係使用如下概述之方案選擇：Adair等人(1991)(人類化抗體WO91/09967)。大鼠抗體(供體)V區序列與人類種系(受體)V區序列之比對與經設計人類化序列一起示於圖9A及B中。自供體移植至受體序列之CDR係如由Kabat(Kabat等人，1987)所定義，只是使用組合之Chothia/Kabat定義之CDR-H1除外(參見Adair等人，1991 Humanised antibodies.WO91/09967)。選擇人類V區IGKV1-27加上JK4 J區(http：//www.imgt.org/)作為用於輕鏈CDR之受體。選擇人類V區IGHV3-7加上JH3 J區(http：//www.imgt.org/)作為用於重鏈CDR之受體。
藉由Entelechon GmbH之自動化合成方法設計並構築編碼多個變體重鏈及輕鏈V區序列之基因。藉由藉由寡核苷酸引導之誘變修飾VH及VK基因來生成重鏈及輕鏈V區二者之其他變體。將該等基因選殖至多個載體中以使得能夠分別表現大腸桿菌及哺乳動物細胞中之人類化1638 Fab或1735h5.hFab-scFv.768。評價變體鏈及其組合相對於親代抗體之其功效、其生物物理性質及用於下游處理之適合性，此可選擇gL7輕鏈移植物及gH33重鏈移植物。最終選擇之gL7及gH33移植序列分別示於圖9A及B及SEQ ID NO：8及9中。此V區配對稱作1638.g49。
移植物gL7中之輕鏈框架殘基皆來自人類種系基因，只是殘基70及71(Kabat編號)除外，其中分別保留供體殘基組胺酸(H70)及酪胺酸(Y71)。該兩個殘基之保留對於人類化抗體或Fab之完全功效係重要的。gL7移植物之CDRL2中之殘基56係自天冬胺酸(D56)突變成麩胺酸(E56)殘基，由此自gL7序列移除潛在天冬胺酸異構化位點。移植物 gH33中之重鏈框架殘基皆來自人類種系基因，只是殘基48及78(Kabat編號)除外，其中分別保留供體殘基白胺酸(L48)及丙胺酸(A78)。該兩個殘基之保留對於人類化1638.g49 Fab或1735h5.hFab-scFv.768之完全功效係至關重要的。
亦生成另一較早移植物1638.g28且此在重鏈(gH2)中含有較1638.g49移植物多之供體殘基(F24、L48、K71、T73、A78及V93)。此抗體(gL2)之輕鏈亦含有SEQ ID NO：5中給出之未經修飾之CDRL2而非用於1638.g49中之SEQ ID NO：7之經修飾之CDRL2。兩組抗體之序列於圖8中給出。
對於大腸桿菌中1638.g49 Fab之表現，將人類化重鏈及輕鏈V區基因選殖至UCB表現載體pMXE811中，其含有編碼人類C-κ恆定區(K1m3異型)、具有經截短鉸鏈之人類γ-1 CH1恆定區(G1m17異型)及大腸桿菌伴護蛋白蛋白質FkpA及DsbC之DNA。
包含1638.g49可變結構域之Fab-dsscFv融合蛋白係基本上如WO2013/068571之實例4中所述使用分別圖8之SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：10中給出之重鏈及輕鏈序列來構築並表現。對於哺乳動物細胞中Fab-dsscFv融合蛋白(稱作1735h5.hFab-scFv.768)之表現，將人類化輕鏈V區基因接合至編碼人類C-κ恆定區(K1m3異型)之DNA序列以生成鄰接1735h5.hFab-scFv.768輕鏈基因。將人類化重鏈V區基因接合至編碼人類γ-1 CH1恆定區結構域之DNA序列。將重鏈恆定區接合至編碼4×GGGGS連接體及結合dsscfv 645 gH5 gL4之白蛋白之DNA序列以生成鄰接1735h5.hFab-scFv.768重鏈基因。將重鏈及輕鏈基因選殖至哺乳動物雙重基因表現載體pMXE755中以生成1735h5.hFab-scFv.768。隨後將載體轉染至哺乳動物CHO細胞系中並使1735h5.hFab-scFv.768表現。
實例2 1735h5.hFab-scFv.768之製備
將來自微型池4D4之澄清細胞培養上清液經0.22μm無菌過濾並如下純化。將經過濾上清液以<18ml/min裝載至450ml在PBS pH7.4(Sigma Aldrich Chemicals)中平衡之GammabindPlus Sepharose XK50管柱(GE Healthcare)上。在裝載後，將管柱用PBS pH7.4洗滌且隨後用0.1M甘胺酸/HCl.pH2.7溶析。溶析之後係280nm處之吸光度，收集溶析峰，且隨後用2M Tris/HCl pH8.5中和。使用具有10kDa分子量截止膜之Vivaflow 50 Casette(Sartorious)濃縮經中和試樣。藉由粒徑篩析層析在TSK凝膠G3000SWXL上分析等份試樣；5μm，7.8×300mm管柱，利用0.2M磷酸鹽pH7.0之等度梯度以1ml/min顯影，且藉由280nm處之吸光度檢測。單體%經測定為90%。將大部分濃縮試樣施加至在PBS pH7.4中平衡之XK50/60 Superdex200管柱(GE Healthcare)。利用PBS pH7.4之等度梯度以10ml/min使管柱顯影。收集各部分並藉由粒徑篩析層析在TSK凝膠G3000SWXL上分析；5μm,7.8×300mm管柱，利用0.2M磷酸鹽pH7.0之等度梯度以1ml/min顯影，且藉由280nm處之吸光度檢測。彙集所選單體部分並使用具有10kDa分子量截止膜之Amicon Ultra-15濃縮器濃縮至>20mg/ml並在甩平式轉子中以4000xg離心。分析最終試樣；對於濃縮，藉由A280掃描UV-可見分光光度計(Cary 50Bio)；對於單體%，藉由粒徑篩析層析在TSK凝膠G3000SWXL上，5μm，7.8×300mm管柱，利用0.2M磷酸鹽pH7.0之等度梯度以1ml/min顯影，且藉由280nm處之吸光度檢測；藉由在4-20% Tris-甘胺酸1.5mm凝膠(Novex)上於50mA(每凝膠)下運行還原及非還原SDS-PAGE53分鐘；及對於內毒素，藉由具有鱟變形細胞溶解物(LAL)測試柱之Charles River’s EndoSafe®便攜式測試系統。
實例3
使用固定於Fab位置中之替代抗FcRn V區設計額外Fab-dsscFv抗體，該等區係WO2014/019727中先前所述及分別對於輕鏈及重鏈結構 域於本文中SEQ ID NO：92及94中提供之1519.g57 V區。此Fab連接至結合dsscFv 645 gH5 gL4(在HL定向上(dsHL))之白蛋白，如實例1中所述。如表3中所示，該等分子構築為重鏈(HC)Fab-dsscFv或輕鏈(LC)Fab-dsscFv。對於HC Fab-dsscFv，HC之CH1區之C-端經由基於G4S之連接體(11個胺基酸)連接至dsscFv，且此HC與1519輕cκ鏈(LC)配對；類似地，對於LC Fab-dsscFv，LC之cκ區之C-端經由基於G4S之連接體(11個胺基酸)連接至dsscFv，且此與1519 CH1 HC(無鉸鏈)配對。使用1519 Fab無鉸鏈(nh)作為對照。
在hCMV啟動子控制下將基因選殖至專利哺乳動物表現載體中並使用CD CHO介質(Life Technologies)及2mM glutamax轉染至CHO-S XE細胞系(UCB)中用於瞬時表現。將培養物於37℃、8.0% CO2、140rpm下在Kuhner振盪器中培育，且在細胞達到>2×105個細胞/ml時(約24h)，T℃降低至32℃。在轉染後第3天，向每一燒瓶中無菌添加3mM丁酸鈉(Sigma-Aldrich)/L轉染。將培養物培育總共14天。藉由於4℃下以4000rpm將培養物離心1h收集上清液且經由0.2μm過濾器無菌過濾。藉由蛋白質G HPLC使用1ml GE HiTrap蛋白質G管柱(GE Healthcare)定量表現效價且Fab標準品內部產生。如表4中所示，在與LC Fab-scFv比較時，觀察到HC Fab-scFv之表現效價增加約1.5倍。
藉由蛋白質G親和力層析純化抗體蛋白質。簡言之，將上清液裝載於HiTrap蛋白質G(GE Healthcare)上且隨後用PBS pH 7.4洗滌。將結合材料用0.1M甘胺酸pH 2.7溶析，且用2M Tris-HCl(pH 8.5)中和，之後將緩衝液更換為PBS pH 7.4。藉由280nm處之吸光度定量所溶析蛋白質並儲存於4℃下用於進一步分析。
使用粒徑篩析層析(SE HPLC)以測定抗體之單體狀態。將純化蛋白質試樣(約20μg)裝載至TSKgel G3000SW、10μm、7.5mm ID×300mm管柱(Tosoh)上並利用0.2M磷酸鹽pH 7之等度梯度以1mL/min顯影。藉由280nm處之吸光度連續檢測。每一蛋白質之單體產率於表5中給出。
對於十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，試樣係藉由向約2μg 1519 Fab或Fab-scFv之純化蛋白質中添加4×Novex NuPAGE LDS試樣緩衝液(Life Technologies)及10×NuPAGE試樣還原劑(Life Technologies)或100mM N-乙基馬來醯亞胺(Sigma-Aldrich)來製備，且將其加熱至100℃持續3min。將試樣裝載至15孔Novex 4-20% Tris-甘胺酸SDS-聚丙烯醯胺凝膠(Life Technologies)上並在Tris-甘胺酸SDS運行緩衝液(Life Technologies)中於125V之恆定電壓下分離110min。使用Novex Mark12寬範圍蛋白質標準品(Life Technologies)作為標準品。將凝膠利用考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)(Sigma-Aldrich)在10%甲醇、7.5%乙酸中1h染色並利用若干次更換蒸餾水脫色。顯示具有約47kDa之理論分子量(MW)之 1519 Fab在非還原SDS-PAGE上具有較寬移動性，而觀察到非還原凝膠上之Fab-dsscFv較其各別理論MW(表6)遷移緩慢。此並非完全意外的，係先前於文獻中報導且可歸因於蛋白質之差異SDS結合及緻密三級結構的觀察。與蛋白質何時經還原無關，所有蛋白質皆以接近其各別理論MW(表6)之移動速率遷移。
實例4 1735h5.hFab-scFv.768之生物物理性質
使1735h5.hFab-scFv.768分子經受一系列生物化學及生物物理分析以篩選用於研發之分子之穩健性及投與穩定性。分析包括用於確認完整質量及二硫化物佈置、熱穩定性(Tm)(在打開之中點處之熔融溫度)；實驗等電點(pI)及電荷變體、於空氣-液體界面處之聚集穩定性(模擬製造中之剪切應力)及高濃度及黏度穩定性的質譜。比較1735h5.hFab-scFv.768之特徵與等效Fab、FabFv及IgG4分子，若可能，其包含與1735h5.hFab-scFv.768之Fab部分相同可變區序列。
質譜分析.
(i)藉由使用具有C8富集管柱晶片之Agilent 6510 Q-Tof之質譜獲 得純化1735h5.hFab-scFv.768之完整及減少質量。藉由將試樣用98%水(18.2兆歐)、2%超級甲醇、0.3%甲酸稀釋至0.15mg/mL獲得完整質量。藉由最初於37℃下將100μl試樣以1mg/mL與10mM TCEP一起培育45分鐘、之後用98%水(18.2兆歐)、2%超級甲醇、0.3%甲酸稀釋至0.15mg/mL來獲得減少質量。移動相A係水(18.2兆歐)中之0.1%甲酸；移動相B係80%異丙醇、20%乙腈、0.1%甲酸。使用Agilent’s MassHunter反褶積軟體實施數據處理。完整及減少質量與理論值一致
(ii)藉由在非還原條件下之酶促消化、之後質譜分析確認二硫化物配對。藉由於37℃下將2μL純化1735h5.hFab-scFv.768(10mg/mL)與18μL 6M胍鹽酸鹽中之50mM碘乙醯胺一起培育45分鐘、之後添加40μL 25mM參(羥基甲基)胺基甲烷(Tris)pH 7.5加上1μL 0.5mg/mL LysC(於提供之懸浮液緩衝液中)來實施消化。將此混合物於37℃下進一步培育70分鐘且隨後用100μL 1mM氯化鈣稀釋。添加胰凝乳蛋白酶(1μL，於0.5mg/mL下，於1mM鹽酸)中並將反應混合物於室溫下培育過夜。隨後藉由添加16μL10%甲酸驟冷反應。隨後將試樣以20uL/min並於55℃下使用Acquity uPLC及Fusion Orbitrap質譜儀施加至經95%溶劑A：5%溶劑B(1：1 MeCN：1-丙醇/0.1%甲酸)平衡之1×150mm C18反相管柱。在溶析期間以+ve-離子模式於15000解析度下在700-4000m/z範圍內收集Orbitrap MS數據。使用Thermo PepFinder 軟體處理數據。
觀察1735h5.hFab-scFv.768分子之所有預測二硫鍵，其確認正確完整二硫化物配對。
熱穩定性量測(Tm)
使用差示掃描量熱法(DSC)使用Micro-Cal VP-Cap(GE Healthcare)在杜貝克氏(Dulbecco’s)磷酸鹽緩衝鹽水緩衝液(PBS)pH 7.4中量測熔融溫度且與先前闡述於WO2015/071330中之Fab及Fab-Fv分子比較。使用PBS pH 7.4將分子調節至1mg/ml且使用280nm處之吸光度使用Varian Cary 50-Bio分光光度計確認最終濃度。使用機器人附件自96孔板取樣抗體分子及緩衝液空白。實施具有緩衝液空白之兩次掃描用於基線減除。分析係自20℃至110℃以1℃/分鐘之掃描速率使用被動反饋模式實施且使用Origin 7.0.(Microcal分析軟體2.0版)來分析。
觀察兩個打開結構域(參見圖6)。於78.9℃下之第一打開事件對應於scFv結構域且於下84.8℃之第二打開事件對應於Fab結構域。發現scFv之熔融溫度較相應Fv高5.5℃，因此，scFv賦予1735h5.hFab-scFv.768格式較大穩定性。賦予分子之分子穩定性之Fab結構域的高熔融溫度與對於母體Fab分子獲得者相當，且因此，該格式不引起Fab結構域之熱不穩定性。
實驗pI及電荷變體之分析
使用全毛細管成像cIEF ICE3系統(ProteinSimple)量測實驗pI。藉由混合以下五種製備試樣：30μL試樣(來自HPLC級水中之1mg/mL儲存液)、35μL 1%甲基纖維素溶液(Protein Simple)、4μL pH3-10兩性電解質(Pharmalyte)、0.5μL 4.65及0.5μL 9.77合成pI標記(ProteinSimple)、12.5μL 8M尿素溶液(Sigma-Aldrich)。使用HPLC級水以構成至100μL之最終體積。在分析之前將混合物短暫地渦旋以確 保完全混合並以10,000rpm離心3分鐘以移除空氣泡。將試樣於1.5kV下聚焦1分鐘，之後於3kV下聚焦5分鐘，且使用ProteinSimple軟體獲取毛細管之A280影像。首先使用iCE3軟體分析所得電泳圖且分配pI值(pI標記之間具有線性關係)。隨後使用Empower軟體(Waters)對經校準電泳圖進行積分。發現pI較高，為9.11，且類似於母體Fab分子(9.22)。酸性/鹼性物質之百分比較低且與母體Fab分子相當。
於空氣-液體界面處之聚集傾向
於25℃下在1.5mL eppendorfs中使用Eppendorf Mixmate將PBS pH 7.4中之1mg/mL之1735h5.hFab-scFv.768之純化試樣(3×250μl等份試樣)以1400rpm渦旋。藉由使用分光光度計(Varian)獲得595nm處之吸光度針對渦旋後不同時間段時之濁度生成來分析試樣。針對時間繪製平均值595nm之曲線。發現直至48h渦旋，聚集傾向較低且等效於母體Fab。此顯示此格式經由包含剪切應力(超濾)之製造步驟可展現與等效Fab分子類似之聚集穩定性。與等效IgG4格式相比，1735h5.hFab-scFv.768及母體Fab展示較慢聚集速率。
濃度及黏度之效應
為確定1735h5.hFab-scFv.768是否可濃縮至>200mg/mL，使用Amicon超離心過濾器單元Ultra-4(分子量截止值10kDa)以3500g達45分鐘將PBS pH 7.40中之4mL 21.5mg/mL之純化材料濃縮至218.6mg/mL。過濾後，藉由用於檢測可溶性聚集物或片段之粒徑篩析UPLC(2×Acquity BEH200 1.7μm，4.6mm×150mm串聯管柱，0.3mL/分鐘，等度，0.2M磷酸鹽緩衝液pH 7.0)、用於檢測不可溶性顆粒材料之動態光散射(Malvern Nano ZS)及用於聚集片段化改變之SDS PAGE(使用4-20% Tris甘胺酸凝膠、125mV恆定電壓之非還原劑還原條件)分析試樣。不存在由於濃度而聚集或片段化之證據。使用TA儀器DHR-1發現混合流變儀(Discovery Hybrid Rheometer)以218.6mg/mL 量測黏度。發現於PBS pH 7.4緩衝液(非優化預調配緩衝液)中之無限速率黏度(infinite rate viscosity)為9.9±0.46cP，此低於其選擇調配緩衝液中之等效Fab分子(其係17.1±0.9cP)。已展現，1735h5.hFab-scFv.768可以低黏度濃縮至高濃度。
總之，1735h5.hFab-scFv.768分子展現與母體Fab相當之良好生物物理特徵。
實例5 1735h5.hFab-scFv.768對hFcRn結合之親和力
在Biacore T200系統(GE Healthcare)上實施使用表面電漿共振技術(SPR)之生物分子相互作用分析且測定與人類FcRn細胞外結構域之結合。提供人類FcRn細胞外結構域作為人類FcRn α鏈細胞外結構域(SEQ ID NO：21)與β2微球蛋白(β2M)(SEQ ID NO：23)之間之非共價複合物。使用HBS-EP+(GE Healthcare)作為運行緩衝液經由胺偶合化學將10mM NaAc pH 5緩衝液中之50μg/ml之F(ab’)2特異性Affinipure F(ab’)2片段山羊抗人類IgG(Jackson ImmunoResearch Lab,Inc.)固定於CM5感測器晶片上至介於4000-5000個反應單元(RU)之捕獲程度。
使用50mM磷酸鹽pH6+150mM NaCl+0.05%P20或HBS-P+ pH7.4(GE Healthcare)作為運行緩衝液用於親和力分析。將抗體1735h5.hFab-scFv.768在運行緩衝液中稀釋至0.25μg/ml並使用10μl/min之注射60s進行由固定之抗人類F(ab’)2之捕獲。將人類FcRn細胞外結構域在捕獲1735h5.hFab-scFv.768上以30μl/min自20nM滴定至1.25nM達300s，之後600s解離。以10μl/min對於pH6下之運行緩衝液藉由2×60s 50mM HCl或對於pH7.4下之運行緩衝液藉由60s 40mM HCl及30s 10mM NaOH再生表面。
使用Biacore T200評估軟體(1.0版)使用具有局部Rmax之1：1結合模型分析數據。
表8 於pH6.0及pH7.4下對抗hFcRn 1735h5.hFab-scFv.768之親和
因此，1735h5.hFab-seFv.768對人類FcRn之親和力經測定於pH 6.0下係160pM且於pH7.4下係46pM。
實例6 基於功能細胞之分析
FcRn表現主要係在細胞內(Borvak J等人1998,Int.Immunol.,10(9)1289-98及Cauza K等人2005,J.Invest.Dermatol.,124(1),132-139)，且與內體及溶酶體膜相關。於酸性pH(<6.5)下而非於中性生理pH(7.4)下，IgG之Fc部分結合至FcRn(Rhagavan M等人1995)且此pH依賴性促進IgG之再循環。
結合至FcRn之IgG在藉由胞飲作用被吸收並進入酸性胞內體後，其將與FcRn一起再循環至細胞表面，而於生理中性pH下，將釋放IgG。(Ober RJ等人2004,The Journal of Immunology,172,2021-2029)。未結合至FcRn之任何IgG將進入溶酶體降解路徑。
建立活體外分析以檢查1735h5.hFab-scFv.768抑制FeRn之IgG再循環能力的能力。簡言之，將MDCK II純系7細胞與生物素化人類IgG在1735h5.hFab-scFv.768存在及不存在下在酸性緩衝液(pH 5.9)中一起培育以容許結合至FcRn。移除所有過量抗體並將細胞在中性pH緩衝液(pH 7.2)中培育，該緩衝液容許表面暴露、結合及內化IgG釋放至上清 液中。使用MSD分析遵循FcRn之抑制以檢測再循環且因此釋放至上清液中之IgG之量。
圖1顯示1735h5.hFab-scFv.768抑制MDCK II純系7細胞中之IgG再循環。將MDCK II純系7細胞以25,000個細胞/孔平鋪於96孔板中並於37℃、5% CO2下培育過夜。次日，將細胞用HBSS+(Ca/Mg)pH 7.2+1% BSA洗滌一次。於37℃、5% CO2下在1735h5.hFab-scFv.768存在及不存在下在HBSS+(Ca/Mg)pH 5.9+1% BSA中將細胞培育1小時，之後於37℃、5% CO2下與1μg/ml(500ng/ml最終濃度)之生物素化人類IgG(Jackson)一起培育1小時。將細胞用HBSS+ pH 5.9洗滌，隨後於37℃、5% CO2下在HBSS+ pH 7.2中培育2小時。自細胞移出上清液並使用MSD分析(使用抗人類IgG捕獲抗體(Jackson)及鏈黴抗生物素蛋白-磺基標籤揭示抗體(MSD))分析總IgG。如圖1(其係代表性濃度反應曲線)中所示，4 1735h5.hFab-scFv.768以濃度依賴性方式以7.2nM之平均EC50值(n=5)抑制IgG再循環。
實例7 1735h5.hFab-scFv.768與非人類靈長類動物FcRn之交叉反應性.
在Biacore T200系統(GE Healthcare)上實施使用表面電漿共振技術(SPR)之生物分子相互作用分析並測定與食蟹猴FcRn細胞外結構域之結合。食蟹猴FcRn細胞外結構域提供為食蟹猴FcRn α鏈細胞外結構域(SEQ ID NO：17)與β2微球蛋白(β2M)(SEQ ID NO：18)之間之非共價複合物。使用HBS-EP+(GE Healthcare)作為運行緩衝液經由胺偶合化學將10mM NaAc pH 5緩衝液中之50μg/ml之F(ab’)2特異性Affinipure F(ab’)2片段山羊抗人類IgG(Jackson ImmunoResearch Lab,Inc.)固定於CM5感測器晶片上至介於4000-5000個反應單元(RU)之捕獲程度。
使用50mM磷酸鹽pH6+150mM NaCl+0.05%P20或HBS-P+ pH7.4(GE Healthcare)作為運行緩衝液用於親和力分析。將抗體1735h5.hFab-scFv.768在運行緩衝液中稀釋至0.5μg/ml並使用10μl/min 之注射60s進行由固定之抗人類F(ab’)2之捕獲。將食蟹猴FcRn細胞外結構域在捕獲1735h5.hFab-scFv.768上以30μl/min自20nM滴定至1.25nM達300s，之後600s解離。以10μl/min對於pH6下之運行緩衝液藉由2×60s 50mM HCl或對於pH7.4下之運行緩衝液藉由60s 40mM HCl及30s 10mM NaOH再生表面。
使用Biacore T200評估軟體(1.0版)使用具有局部Rmax之1：1結合模型分析數據。
因此，1735h5.hFab-scFv.768對食蟹猴FcRn之親和力經測定於pH 6.0下係158pM且於pH7.4下係45pM。
實例8 1735h5.hFab-scFv.768治療增強hFcRn轉基因小鼠中之hIgG之活體內清除率
在人類FcRn轉基因小鼠(B6.Cg-Fcgrt tm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ,JAX Mice)中測定1735h5.hFab-scFv.768對人類IVIG之清除率之效應。向小鼠靜脈內輸注500mg/kg人類IgG(人類IgI 10% Gamunex-c，Talecris Biotherapeutics)。24小時後，以單一劑量(100mg/kg)向動物靜脈內投用媒劑對照(PBS)或抗FcRn。相對於抗FcRn治療，在-1、8、24、48、72、96、144及192小時時取連續尾端血樣。藉由LC-MS/MS 測定hFcRn小鼠中之人類IgG之血清含量。圖2中提供之數據係平均值±SEM，其中5-6只小鼠/1735h5.hFab-scFv.768治療組且PBS媒劑對照有2只小鼠。藉由1735h5.hFab-scFv.768阻斷hFcRn可加速hIVIG之清除率，且與對照小鼠相比，觀察到較低濃度之總IgG。相對於對照小鼠，自24hr直至實驗結束，對於1735h5.hFab-scFv.768之所有劑量，該等降低之IgG濃度顯著不同(p<0.01)。藉由單向ANOVA及Tukeys後測試量測顯著性。
儘管小鼠IgG不結合至該等轉基因小鼠中存在之人類FcRn，但內源性小鼠白蛋白結合且由人類FcRn再循環。儘管在活體外分析中抗人類FcRn與人類FcRn之結合不阻斷白蛋白與FcRn之結合，但由於1735h5.hFab-scFv.768之白蛋白結合性質，評估對內源性小鼠白蛋白之清除率之效應。數據示於圖3中。由於血清中之白蛋白濃度稍微可變(在30只小鼠之組中自16.6mg/mL至59.9mg/mL，在注射抗FcRn藥物之前)以容許更容易地比較組之結果，故將白蛋白數據正規化並在圖3中以在時間0時血清白蛋白濃度之百分比給出。1735h5.hFab-scFv.768在72小時後於100mg/kg及30mg/kg劑量下對白蛋白濃度具有中等效應(其於約25%下最大)且於10mg/kg下顯示無效應。效應似乎可逆。
實例9. 1735h5.hFab-scFv.768治療顯示類似於IgG之藥物動力學且優於小鼠中之Fab片段之預計PK的藥物動力學
在正常小鼠中測定1735h5.hFab-scFv.768之PK。向12只雄性C57/B16小鼠投與1735h5.hFab-scFv.768之10mg/kg IV單次劑量(bolus dose)。以選擇間隔每個時間點自4只動物取血漿試樣.藉由LC/MS-MS分析針對1735h5.hFab-scFv.768之蛋白特異性肽測定1735h5.hFab-scFv.768之血漿濃度。使用非分室分析衍生血漿藥物動力學參數。圖4中之數據顯示，1735h5.hFab-scFv.768具有與小鼠中投用之典型人類 IgG之PK性質相當的PK性質。分佈體積類似於血漿體積(34mL/kg)，終末半衰期(t1/2)係4.1天且血漿清除率(CL)係14mL/天/kg。
亦在實例7中所述之研究中在人類FcRn轉基因小鼠中評估1735h5.hFab-scFv.768之PK(B6.Cg-Fcgrt tm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ，JAX小鼠，靜脈內輸注500mg/kg人類IgG並隨後投用1735h5.hFab-scFv.768)。相對於1735h5.hFab-scFv.768治療，在-24、8、24、48、72、96、144及192小時時取連續尾端血樣，且藉由LC-MS/MS測定1735h5.hFab-scFv.768之血清含量。圖5中提供之數據係來自5只小鼠/治療組之平均值±SEM，且顯示1735h5.hFab-scFv.768之PK性質至少與具有相當功效及親和力之整個IgG抗FcRn分子一樣好。
<110> 比利時商UCB生物製藥公司
<120> 抗FcRn抗體
<130> PF0022
<150> GB1508180.5
<151> 2015-05-13
<160> 94
<170> PatentIn version 3.5
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<223> 編碼gL7輕鏈之DNA
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<223> 編碼1638 gH33 Fab-dsscfv(1735h5.hFab-scFv.768)重鏈之DNA
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<223> 結合白蛋白之dsscFv輕鏈
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<223> 人類FcRn α鏈細胞外序列
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<223> 大鼠B2M
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<223> 包括信號序列之人類B2M
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<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類B2-微球蛋白
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<211> 107
<212> PRT
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<223> 1638 gL2輕鏈(V+恆定)
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<223> 1638 gH2 Fab重鏈(V+無鉸鏈之人類γ-1 CH1)
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<220>
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<223> Xaa可為任何天然胺基酸
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<223> Xaa可為任何天然胺基酸
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<223> Xaa可為任何天然胺基酸
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<212> PRT
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<213> 人工序列
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<223> 撓性連接體
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> 撓性連接體
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 撓性連接體
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<212> PRT
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<223> 撓性連接體
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<212> PRT
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<223> 撓性連接體
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 撓性連接體
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<212> PRT
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 撓性連接體
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<211> 18
<212> PRT
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<223> 撓性連接體
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 撓性連接體
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<220>
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 撓性連接體
<400> 72
<210> 73
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 撓性連接體
<400> 73
<210> 74
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 撓性連接體
<400> 74
<210> 75
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 撓性連接體
<400> 75
<210> 76
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 撓性連接體
<400> 76
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 撓性連接體
<400> 77
<210> 78
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 撓性連接體
<400> 78
<210> 79
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 撓性連接體
<400> 79
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 撓性連接體
<400> 80
<210> 81
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 撓性連接體
<400> 81
<210> 82
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 撓性連接體
<400> 82
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 83
<210> 84
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽序列
<400> 84
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645之CDRH1序列
<400> 85
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645之CDRH2序列
<400> 86
<210> 87
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645之CDRH3序列
<400> 87
<210> 88
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645之CDRL1序列
<400> 88
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645之CDRL2序列
<400> 89
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645之CDRL3序列
<400> 90
<210> 91
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1519 gL20 V區
<400> 91
<210> 92
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1519 gL20輕鏈(V+恆定)
<400> 92
<210> 93
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1519 gH20 V區
<400> 93
<210> 94
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1519gH20 Fab重鏈(V+無鉸鏈之人類γ-1 CH1)
<400> 94

Claims (26)

  1. 一種抗FcRn抗體融合蛋白，其包含直接或經由連接體連接至scFv之Fab片段，其中該Fab片段結合至FcRn且該scFv結合至血清載體蛋白。
  2. 一種抗FcRn抗體融合蛋白，其包含直接或經由連接體連接至scFv之Fab片段，其中該Fab片段包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈之可變區包含3個CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：1中給出之序列，CDR H2具有SEQ ID NO：2中給出之序列，且CDR H3具有SEQ ID NO：3中給出之序列，且該輕鏈之可變區包含3個CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：4中給出之序列，CDR L2具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中給出之序列且CDR L3具有SEQ ID NO：6中給出之序列。
  3. 如請求項2之抗FcRn抗體融合蛋白，其中該Fab片段之重鏈包含SEQ ID NO：9中給出之序列且該Fab片段之輕鏈包含SEQ ID NO：8中給出之序列。
  4. 如請求項2或3之抗FcRn抗體融合蛋白，其中該Fab片段之重鏈包含SEQ ID NO：14中給出之序列且該Fab片段之輕鏈包含SEQ ID NO：10中給出之序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗FcRn抗體融合蛋白，其中該scFv結合白蛋白。
  6. 如請求項5之抗FcRn抗體融合蛋白，其中該scFv結合人類血清白蛋白。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗FcRn抗體融合蛋白，其中該scFv之重鏈及輕鏈可變結構域由任何適宜連接體(例如SEQ ID NO：30中給出之連接體)連接。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗FcRn抗體融合蛋白，其中該scFv直接或經由連接體連接至該Fab片段之重鏈或輕鏈之C端。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗FcRn抗體融合蛋白，其中該scFv經由具有SEQ ID NO：33中給出之序列之連接體連接至該Fab片段之重鏈之C端。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗FcRn抗體融合蛋白，其中該scFv包含重鏈可變結構域，其包含3個CDR，其中CDR H1具有SEQ ID NO：85中給出之序列，CDR H2具有SEQ ID NO：86中給出之序列，且CDR H3具有SEQ ID NO：87中給出之序列，及包含輕鏈可變結構域，其包含3個CDR，其中CDR L1具有SEQ ID NO：88中給出之序列，CDR L2具有SEQ ID NO：89中給出之序列且CDR L3具有SEQ ID NO：90中給出之序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗FcRn抗體融合蛋白，其中該scFv係二硫鍵穩定之scFv(dsscFv)。
  12. 如請求項11之抗FcRn抗體融合蛋白，其中該dsscFv包含重鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：15中給出之序列，及輕鏈可變結構域，其包含SEQ ID NO：16中給出之序列。
  13. 如請求項12之抗FcRn抗體融合蛋白，其具有包含SEQ ID NO：12中給出之序列之重鏈及包含SEQ ID NO：10中給出之序列之輕鏈。
  14. 一種結合人類FcRn之抗FcRn抗體融合蛋白，其包含重鏈，其中該重鏈包含與SEQ ID NO：12中給出之序列具有至少80%一致性或相似性之序列，且其中該輕鏈包含與SEQ ID NO：10中給出之序列具有至少80%一致性或相似性之序列。
  15. 如請求項14之抗FcRn融合蛋白，其中該抗體Fab片段之CDR-H1具有SEQ ID NO：1中給出之序列、CDR-H2具有SEQ ID NO：2中 給出之序列、CDR-H3具有SEQ ID NO：3中給出之序列、CDR-L1具有SEQ ID NO：4中給出之序列、CDR-L2具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中給出之序列，且CDR-L3具有SEQ ID NO：6中給出之序列。
  16. 一種經分離之DNA序列，其編碼如請求項1至15中任一項之抗體融合蛋白之重鏈及/或輕鏈。
  17. 一種選殖或表現載體，其包含一或多個如請求項16之DNA序列。
  18. 如請求項17之載體，其中該載體包含SEQ ID NO：11中給出之序列及SEQ ID NO：13中給出之序列。
  19. 一種宿主細胞，其包含一或多個如請求項17或18之選殖或表現載體。
  20. 一種產生對人類FcRn具有結合特異性之抗體融合蛋白的方法，其包含培養如請求項19之宿主細胞及分離該抗體融合蛋白。
  21. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至15中任一項之抗FcRn抗體融合蛋白與一或多種醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑組合。
  22. 如請求項21之醫藥組合物，其包含其他活性成份。
  23. 如請求項1至15中任一項之抗體融合蛋白或如請求項21或22之組合物，其用於療法。
  24. 如請求項1至15中任一項之抗體融合蛋白或如請求項21或22之組合物，其用於治療自體免疫疾病，例如重症肌無力、尋常天皰瘡、視神經脊髓炎、格林-巴利症候群(Guillain-Barré syndrome)、狼瘡、特發性血小板減少紫斑症及血栓性血小板減少紫斑症。
  25. 一種治療患者之方法，其包含投與治療有效量之如請求項1至15 中任一項所定義之抗體或其結合片段或如請求項21或22之組合物。
  26. 如請求項25之方法，其中該治療係用於自體免疫疾病，例如重症肌無力、尋常天皰瘡、視神經脊髓炎、格林-巴利症候群、狼瘡、特發性血小板減少紫斑症及血栓性血小板減少紫斑症。
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