KR102048382B1 - 알부민 결합 항체 및 이의 결합 단편 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및/또는 서열 번호 3 또는 서열 번호 4에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 혈청 알부민 결합 항체 또는 이의 단편, 구체적으로는 서열 번호 1 및 서열 번호 3에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 또는 서열 번호 2 및 서열 번호 4에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 혈청 알부민 결합 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 및 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 숙주 세포로 확장된다. 본 발명은 추가로 항체 또는 단편을 포함하는 약학 조성물 및 항체 또는 단편 중 어느 하나를 사용하는 치료제를 포함한다.

Description

알부민 결합 항체 및 이의 결합 단편{ALBUMIN BINDING ANTIBODIES AND BINDING FRAGMENTS THEREOF}
본 발명은 신규 알부민 결합 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 상기 항체는, 예를 들어 약물 또는 이에 접합된 단백질의 시험관내 혈청 반감기를 연장시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 분자의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물 또한 제공된다.
항체는 그의 고 특이성 및 친화력으로 인해 구체적으로는 단백질:단백질 상호작용을 조절하는 데 이상적인 진단상 및 치료상 제제이다. 재조합 항체 기법 분야의 발달로 항체 단편, 예컨대 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편 및 기타 항체 단편이 제조되었다. 이러한 소형 분자는 전체 항체의 항원 결합 활성을 보유하고 또한 전체 면역글로불린 분자와 비교하였을 때 향상된 조직 침투 및 약동학적 특성을 나타낼 수 있다. 실제로, 항체 단편은, 최근 ReoPro® 및 Lucentis®와 같은 제품의 성공에서 확인된 바와 같이, 다목적 치료제임을 알 수 있다. 이러한 단편은 전체 면역글로불린보다 다수의 장점을 제시하는 것으로 여겨지지만, 이들은 또한 시험관내 장기간의 수명을 부여하는 Fc 도메인이 결핍되어 있기 때문에 혈청으로부터의 제거율이 증가된다(Medasan et al., 1997, J. Immunol. 158:2211-2217).
항체 단편, 예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 및 기타 항체 단편의 반감기를 향상시키는 수단은 공지되어 있다. 한가지 접근법으로는 단편을 중합체 분자에 접합시키는 것이 있다. 이렇게 하여, 동물에서 Fab', F(ab')2 단편의 짧은 순환 반감기는 폴리에틸렌 글리콜에의 접합에 의해 향상되었다(PEG; 예를 들어, WO98/25791, WO99/64460 및 WO98/37200 참조). 또다른 접근법으로는 FcRn 수용체와 상호작용하는 제제에의 접합에 의해 항체 단편을 변형시키는 것이 있다(예, WO97/34631 참조). 반감기를 연장하는 또다른 접근법으로는 혈청 알부민에 결합되는 폴리펩티드를 사용하는 것이 있다(예, 문헌[Smith et al., 2001, Bioconjugate Chem. 12:750-756]; EP0486525; US6267964; WO04/001064; WO02/076489; 및 WO01/45746 참조). 혈청 알부민은 인간에서 약 19일의 반감기를 갖는 혈관 및 혈관외 구획 모두에 풍부한 단백질이다(Peters, 1985, Adv Protein Chem. 37:161-245). 이는 약 21일인 IgG1의 반감기와 유사하다(Waldeman & Strober, 1969, Progr. Allergy, 13:1-110).
항-혈청 알부민 결합 단일 가변 도메인은 접합체로서의 이의 용도와 함께 NCE (화학적 실체) 약물, 단백질 및 펩티드를 비롯한 약물의 반감기를 증가시키는 것에 대해 기술된 바 있으며, 예를 들어 문헌[Holt et al., Protein Engineering, Design & Selection, vol 21, 5, pp283-288], WO04003019, WO2008/096158, WO05118642, WO2006/0591056 및 WO2011/006915를 참조한다. 기타 항-혈청 알부민 항체 및 다특이적 항체 포맷에서의 이의 용도는 WO2009/040562, WO2010/035012 및 WO2011/086091에 기술되어 있다. 구체적으로는, 본원에서 서열 번호 9 및 서열 번호 10에 제시된 서열을 갖는 645gH1 및 645gL1로 공지된 2개의 가변 도메인은 이미 기술된 바 있다.
본 발명은 이러한 서열로부터 유래된 향상된 알부민 결합 항체를 제공한다. 유리하게도, 본 발명의 항체는 출발 항체와 유사한 친화력을 가지며 게다가 치료 제품에 사용하기에 적당하도록 하는 하나 이상의 특성, 예컨대 감소된 면역원성, 증가된 안정성, 향상된 발현 등을 가질 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 혈청 알부민에 결합된다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체는 사이노몰구스(cynomolgus) 혈청 알부민, 쥐과동물 혈청 알부민 및/또는 래트 혈청 알부민에 결합된다.
일 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 알부민 결합 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 알부민 결합 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 3 또는 서열 번호 4에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 알부민 결합 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
일 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 중쇄의 위치 44에 시스테인을 갖고 서열 번호 2에 제시된 서열을 갖는다.
일 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 경쇄의 위치 100에 시스테인을 갖고 서열 번호 4에 제시된 서열을 갖는다.
본 발명의 항체 가변 영역은 임의의 적당한 항체 포맷 내에 혼입될 수 있다. 이러한 항체는 전체 항체 및 이의 기능적 활성 단편 또는 유도체를 포함한다. 따라서, 이러한 알부민 결합 항체는 전장 중쇄 및 경쇄 또는 이의 단편을 갖는 완전한 항체 분자를 포함할 수 있고 비제한적 예로서 Fab, 변형된 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 가변 도메인 항체, scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, Bis-scFv, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 트리바디(tribody), DVD-Ig, DART, BiTE 및 상기 중 어느 하나의 에피토프-결합 단편일 수 있다(예, 문헌[Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136]; [Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참조). 상기 항체 단편을 생성 및 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다(예, 문헌[Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조). 다가 항체는 다중 특이성을 포함할 수 있거나 또는 단일특이성일 수 있다(예, WO 92/22853, WO 99/37791 및 WO05/113605 참조). 다른 다가/다특이적 포맷은 본원에서 각각 도 1a 및 1b에 도시된 Fab-Fv 및 Fab-dsFv를 비롯하여 WO2009/040562, WO2010/035012 및 WO2011/086091에 기술된 것을 포함한다.
본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은, 존재하는 경우, 항체 분자의 제안된 기능, 및 특히 필요할 수 있는 이펙터 기능과 관련하여 갖도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 항체 이펙터 기능이 필요한 경우 특히 IgG1 및 IgG3 이소타입의 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우 IgG2 및 IgG4 이소타입이 사용될 수 있다. 당업자라면 이러한 불변 영역 도메인의 서열 변이체 또한 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들면, 문헌[Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108]에 기술된 바와 같이, 위치 241에서 세린이 프롤린으로 변경된 IgG4 분자가 사용될 수 있다. 또한 당업자라면 항체에 여러 가지 번역후 변형이 일어날 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 변형의 유형 및 정도는 종종 배양 조건뿐만 아니라 항체를 발현하는 데 사용되는 숙주 세포주에 따라 달라진다. 이러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변형예를 포함할 수 있다. (문헌[Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995]에 기술된 바와 같이) 빈번한 변형은 카르복시펩티다아제의 작용으로 인한 카르복시-말단 염기성 잔기(예, 리신 또는 아르기닌)의 손실이다.
일 구체예에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고 항체 경쇄는 CL 도메인, 카파 또는 람다를 포함한다.
당업자라면 상기 알부민 결합 항체 또는 이의 단편은 필요에 따라 임의의 다른 항체 또는 이의 단편, 다른 단백질, 예컨대 효소, 호르몬, 사이토카인, 펩티드 또는 다른 분자 또는 약물에 접합될 수 있다는 것을 알 것이다. 본 발명의 알부민 결합 항체는 이에 접합된 상기 실체의 혈청 반감기를 연장시키는 데 특히 유용하다.
일 구체예에서, 본 발명의 알부민 결합 항체는 선택된 치료적 또는 진단적 화합물에 공유 또는 비공유 결합된다. 적당한 치료적 화합물은, 예를 들면 수용체 작용제 또는 길항제, 효소 억제제, 금속 킬레이터, 항-바이러스 제제, 항-진균제, 심혈관 약물 및 화학요법 약물을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 알부민 결합 항체 또는 이의 단편은 관심 항원에 결합되는 제2 항체 또는 이의 단편에 융합되거나 접합된다.
일 구체예에서, 제2 항체 또는 항체 단편에 의해 결합된 관심 항원은 박테리아 세포, 이스트 세포, T-세포, 내피 세포 또는 종양 세포와 같은 세포 상의 세포 연관성 단백질, 예컨대 세포 표면 단백질일 수 있거나, 또는 가용성 단백질일 수 있다. 관심 항원은 또한 임의의 의학적 관련 단백질, 예컨대 질병 또는 감염 동안 상향조절되는 단백질, 예컨대 수용체 및/또는 이와 상응한 리간드일 수 있다. 세포 표면 단백질의 구체적 예는 부착 분자, 예컨대 β1 인테그린과 같은 인테그린, 예컨대 VLA-4, E-셀렉틴, P 셀렉틴 또는 L-셀렉틴, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, DPCR1, DPCR1, 두둘린2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, 넥틴-유사2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, 암배아성 항원(CEA), 인간 유지 글로불린(HMFG1 및 2), MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 항원, 및 VEGF, 및 적절한 경우, 이의 수용체를 포함한다.
가용성 항원은 인터류킨, 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16 또는 IL-17, 바이러스 항원, 예컨대 호흡기 합포체 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 항원, 면역글로불린, 예컨대 IgE, 인터페론, 예를 들어 인터페론 α, 인터페론 β 또는 인터페론 γ, 종양 괴사 인자-α, 종양 괴사 인자-β, 콜로니 자극 인자, 예컨대 G-CSF 또는 GM-CSF, 및 혈소판 유래 증식 인자, 예컨대 PDGF-α, 및 PDGF-β 및 적절한 경우 이의 수용체를 포함한다. 다른 항원은 박테리아 세포 표면 항원, 박테리아 독소, 바이러스, 예컨대 인플루엔자, EBV, HepA, B 및 C, 생물테러 제제, 방사성핵종 및 중금속, 및 사독 및 거미독 및 독소를 포함한다.
일 구체예에서, 항체 또는 이의 단편은 관심 항원의 활성을 기능적으로 변경하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 상기 항원의 활성을 중화, 상쇄 또는 작동시킬 수 있다.
본 발명의 알부민 결합 항체에 접합된 항체 또는 이의 단편은 임의의 종으로부터 유도될 수 있지만 바람직하게는 단클론 항체, 완전 인간 항체 또는 인간화된 항체로부터 유도된다. 본 발명에 사용하기 위한 항체 단편은 면역글로불린 분자의 임의의 클래스(예, IgG, IgE, IgM, IgD 또는 IgA) 또는 서브클래스로부터 유도될 수 있고, 예를 들어 마우스, 래트, 상어, 토끼, 돼지, 햄스터, 낙타, 라마, 염소 또는 인간을 포함하는 임의의 종으로부터 수득될 수 있다.
일 구체예에서, 항체는 단클론, 완전 인간, 인간화된 또는 키메라 항체 단편인 Fab 또는 Fab' 단편이다. 일 구체예에서, 항체 Fab 또는 Fab' 단편은 완전 인간 또는 인간화된 것이다.
단클론 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 하이브리도마 기법(Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497), 트리오마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72) 및 EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 또한 예를 들어 문헌[Babcook, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93(15), 7843-7848], WO 92/02551, WO2004/051268 및 WO2004/106377에 의해 기술된 방법에 의해, 특이적 항체의 제조에 선택되는 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝 및 발현시킴으로써 단일 림프구 항체 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
인간화된 항체는 비인간 종 유래의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자 유래의 골격 영역을 갖는 비인간 종으로부터의 항체 분자이다(예, US 5,585,089 참조).
본 발명에 사용하기 위한 항체는 또한 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있고 문헌[Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 1995, 182, 41-50]; [Ames et al., J. Immunol. Methods, 1995, 184, 177-186]; [Kettleborough et al. Eur. J. Immunol., 1994, 24, 952-958]; [Persic et al., Gene, 1997 187, 9-18]; 및 [Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57, 191-280]; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; 및 WO 95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 및 5,969,108에 개시된 것을 포함한다. 또한, 형질전환 마우스, 또는 다른 포유동물을 비롯한 다른 유기체는 인간화된 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
완전 인간 항체는 중쇄 및 경쇄 둘다의 가변 영역 및 불변 영역이 (존재하는 경우) 전부 인간 기원이거나, 또는 동일한 항체로부터는 아니지만 실질적으로 인간 기원의 서열과 동일한 항체이다. 완전 인간 항체의 예는 예를 들어 상기 기술된 파지 디스플레이 방법에 의해 생성된 항체 및 마우스에 의해 생성된 항체를 포함할 수 있으며, 여기서 예를 들어 일반적으로 EP0546073 B1, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US5,770,429, EP 0438474 B1 및 EP0463151 B1에 기술된 바와 같이 쥐과동물 면역글로불린 가변 및/또는 불변 영역 유전자가 이의 인간 대응부로 대체된다.
본 발명에 사용하기 위한 항체 단편, 예컨대 Fab 또는 Fab' 출발 재료는, 예를 들어 펩신을 처리함으로써 임의의 적당한 효소 분할 및/또는 소화 기법을 사용하여 임의의 전체 항체, 특히 전체 단클론 항체로부터 수득할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로 항체 출발 재료는 항체 가변 및/또는 불변 영역을 코딩하는 DNA의 조작 및 재발현을 비롯한 재조합 DNA 기법의 사용에 의해 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학적 기법은 아미노산 또는 도메인을 원하는대로 변형, 부가 또는 결실시키는 데 사용될 수 있다. 가변 또는 불변 영역에 대한 임의의 변경은 여전히 본원에 사용된 용어 '가변' 및 '불변' 영역에 의해 포함된다.
항체 단편 출발 재료는 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 낙타, 라마, 염소 또는 인간을 비롯한 임의의 종으로부터 수득할 수 있다. 항체 단편 부분은 하나 이상의 종으로부터 수득할 수 있으며, 예를 들어 항체 단편은 키메라일 수 있다. 일례에서, 불변 영역은 하나의 종 유래이고 가변 영역은 또다른 종 유래이다. 항체 단편 출발 재료는 또한 변형될 수 있다. 또다른 예에서, 항체 단편의 가변 영역은 재조합 DNA 엔지니어링 기법을 사용하여 생성되었다. 이러한 엔지니어링된 버젼은 예를 들어 천연 항체의 아미노산 서열에서의 또는 이 서열에 대한 삽입, 결실 또는 변화에 의해 천연 항체 가변 영역으로부터 생성된 것을 포함한다. 이러한 유형의 특정한 예로는 하나 이상의 CDR 및 경우에 따라 하나의 항체 유래의 하나 이상의 골격 아미노산을 함유하는 엔지니어링된 가변 영역 도메인 및 제2 항체 유래의 가변 영역 도메인의 나머지를 포함한다. 이러한 항체 단편의 생성 및 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다(예, Boss et al., US 4,816,397; Cabilly et al., US 6,331,415; Shrader et al., WO 92/02551; 문헌[Ward et al., 1989, Nature, 341, 544]; [Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, 3833]; [Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323]; [Bird et al, 1988, Science, 242, 423]; Queen et al., US 5,585,089; Adair, WO91/09967; [Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10, 1-142]; [Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181]).
일례에서, 본 발명의 알부민 결합 가변 도메인은 단일 도메인 항체 또는 dAb에 융합된다. 본 발명에 사용하기 위한 단일 도메인 항체 또는 dAb로도 공지된 단일 가변 도메인은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있고 WO2005118642, 문헌[Ward et al., 1989, Nature, 341, 544-546] 및 [Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490]에 개시된 것을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명에 사용하기 위한 단일 도메인 항체는 중쇄 가변 도메인(VH) 또는 경쇄 도메인(VL)이다. 각 경쇄 도메인은 카파 또는 람다 서브그룹일 수 있다. VH 및 VL 도메인의 단리 방법은 당업계에 기술된 바 있으며, 예를 들면 EP0368684 및 상기 Ward 등의 문헌을 참조한다. 이러한 도메인은 임의의 적당한 종 또는 항체 출발 재료로부터 유도될 수 있다. 일 구체예에서, 단일 도메인 항체는 설치류, 인간 또는 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 일 구체예에서, 단일 도메인 항체는 인간화된다.
일 구체예에서, 단일 도메인 항체는, 예를 들면 WO2005/118642, 문헌[Jespers et al., 2004, Nature Biotechnology, 22, 1161-1165] 및 [Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490]에 기술된 방법을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유도된다. 바람직하게는, 상기 단일 도메인 항체는 완전 인간이지만 또한 다른 종으로부터 유도될 수도 있다. 일 구체예에서, 단일 가변 도메인은 골격이 인간 또는 기원에 있어어 실질적으로 인간이고 CDR(들)이 비인간 기원의 것이라는 점에서 키메라이다. 당업자라면 일단 단리된 단일 도메인 항체의 서열을 변형시켜 상기 Holt 등의 문헌에서 기술된 바와 같이 단일 도메인 항체의 특징, 예컨대 용해도를 향상시킬 수 있다는 것을 알 것이다.
본원에 사용된 "실질적으로 인간"이란 면역원성에 관련될 수 있는 원래 재료의 인간 특성이 보유되어 있는 것을 의미한다. 실질적인 인간 재료는 골격 서열에서 1개의 아미노산을 첨가, 결실시키거나 또는 또다른 아미노산으로 대체한 것을 포함한다.
일 구체예에서, dAb는 scFv 파지-디스플레이로부터 또는 형질전환 Humouse™ 또는 Velocimouse™ 또는 인간화된 설치류로부터 수득한 인간 서열이다. 일 구체예에서, dAb는 인간 또는 인간화된 설치류, 낙타과 또는 상어로부터 수득된다. 이러한 dAb는 인간화되는 것이 바람직하다. 일 구체예에서, 단일 도메인 항체는 EP0656946에 기술된 바와 같이 낙타과 면역글로불린을 기반으로 하는 VHH 도메인이다. 일례에서, 낙타 또는 라마는 관심 항원에 의해 면역화되고 역가가 적절한 경우 혈액 채취된다. dAb를 코딩하는 유전자는 단일 세포 PCR에 의해 클로닝될 수 있거나, 또는 dAb를 코딩하는 B 세포(들)는 EBV 형질변환에 의해 또는 불멸화 세포주에의 융합에 의해 불멸화될 수 있다.
일례에서, 본 발명의 항체 가변 도메인 중 하나 이상은 WO2009/040562, WO2010/035012 또는 WO2011/086091에 기술된 바와 같이 다가 항체 포맷 내에 혼입된다. 이러한 포맷은 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적일 수 있다. 이에 따라, 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 항체 융합 단백질은 번역 융합 단백질, 즉 유전적 융합체이며, 이의 각 서열은 발현 벡터에 의해 코딩된다. 대안적으로, 항체 융합 단백질 성분은 화학적 수단에 의해, 즉 화학적 접합 또는 화학적 가교결합에 의해 융합될 수 있다. 이러한 화학적 수단은 당업계에 공지되어 있다.
이황화 결합을 포함 및 불포함한 이러한 번역 융합 단백질의 예는 도 1a 및 1b에 도시되어 있다.
따라서, 일 구체예에서, 관심 항원에 대한 특이성이 있는 항체 Fab 또는 Fab' 단편을 포함하는 다중 특이적 항체 융합 단백질을 제공하며, 상기 단편은 서열 번호 1, 2, 3 또는 4에 제시된 서열을 갖는 인간 혈청 알부민에 대해 특이성을 갖는 하나 이상의 단일 가변 도메인 서열에 융합된다.
일례에서, 본 발명의 알부민 결합 항체 가변 도메인은 천연 또는 변형된 힌지(hinge) 영역을 보유하는 항체 단편, 예컨대 Fab' 단편에 융합된다. 본 발명의 그러한 융합 단백질을 제조하는 데 사용되는 항체 단편이 Fab' 단편인 경우, 상기 단편은 일반적으로 하나 이상의 아미노산에 의해 중쇄의 C-말단에서 연장된다. 따라서, 본 발명의 항체 융합체는 직접적으로 또는 링커를 통해 알부민 결합 가변 영역에 융합된 (또는 화학적으로 융합된) Fab' 단편 번역을 포함할 수 있다. 추가적으로, 적당한 항체 Fab' 단편의 예는 WO2005003170 및 WO2005003171에 기술된 것을 포함한다.
또다른 예에서, 항체 단편은 Fab 단편이다. 따라서, 본 발명의 항체 융합체는 결과적으로 하나 이상의 알부민 결합 가변 영역에 융합되는 (또는 화학적으로 융합되는) 번역인 링커 서열에 융합된 (또는 화학적으로 융합된) Fab 단편 번역을 포함할 수 있다. 바람직하게는, Fab 단편은 WO2005/003169에 기술된 바와 같이, 쇄간 시스테인에서 종결되는 Fab 단편이다.
본 발명에서, Fab 또는 Fab' 단편에 융합되는 각 항-알부민 가변 도메인은 직접적으로 또는 링커를 통해 연결될 수 있다.
본원에 사용된 직접적인 연결이란 Fab 또는 Fab'의 "마지막" 아미노산이 펩티드 결합에 의해 본 발명의 알부민 결합 항체의 단일 가변 도메인의 "첫번째" 아미노산에 연결되는 사실을 지칭한다 (또는 실제로 그 반대도 해당한다).
Fab 또는 Fab'에 가변 도메인을 연결하는 적당한 링커 영역의 비제한적 예는 플렉시블(flexible) 링커 서열 및 리지드(rigid) 링커 서열을 포함한다. 플렉시블 링커 서열은 문헌[Huston et al.,1988, PNAS 85:5879-5883]; [Wright & Deonarain, Mol. Immunol., 2007, 44(11):2860-2869]; [Alfthan et al., Prot. Eng., 1995, 8(7):725-731]; [Luo et al., J. Biochem., 1995, 118(4):825-831]; [Tang et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(26):15682-15686]; 및 [Turner et al., 1997, JIMM 205, 42-54(대표예에 대한 표 1 참조)]에 개시된 것을 포함한다.
Figure 112014054037648-pct00001
일 구체예에서, 항체 힌지 서열 또는 이의 일부, 예컨대 상부 힌지 서열은 링커로서 사용된다. 통상, 본 발명에 사용하기 위한 항체 Fab' 단편은 천연 또는 변형 힌지 영역을 보유한다. 이러한 힌지 영역은 알부민 결합 가변 도메인 부분에 대해 천연 링커로서 사용된다. 천연 힌지 영역은 통상 항체 분자의 CH1 도메인과 관련된 힌지 영역이다. 변형 힌지 영역은 천연 힌지 영역과 길이 및/또는 조성이 상이한 임의의 힌지이다. 상기 힌지는 임의의 다른 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 낙타, 라마 또는 염소 힌지 영역으로부터의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 변형 힌지 영역은 CH1 도메인의 것과 상이한 클래스 또는 서브클래스의 항체로부터 유도된 완전한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 클래스 γ1의 CH1 도메인은 클래스 γ4의 힌지 영역에 결합될 수 있다. 대안적으로, 변형 힌지 영역은 천연 힌지의 일부 또는 반복 단위를 포함할 수 있고 이때 반복되는 각 단위는 천연 힌지 영역으로부터 유도된다. 추가의 대안예에서, 천연 힌지 영역은 하나 이상의 시스테인 또는 다른 잔기를 중성 잔기, 예컨대 알라닌으로 전환시킴으로써, 또는 적당하게 배치된 잔기를 시스테인 잔기로 전환시킴으로써 변경될 수 있다. 이러한 수단에 의해 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수는 증가 또는 감소될 수 있다. 추가적으로, 힌지의 다른 특징, 예컨대 경쇄 쇄간 시스테인으로부터 힌지 시스테인(들)의 거리, 힌지의 시스테인들 간의 거리, 및 플렉시빌리티(flexibility)와 같은 힌지의 특성에 영향을 미칠 수 있는 힌지 내 다른 아미노산의 조성은 조절될 수 있는데, 예를 들면 글리신은 힌지 내에 혼입되어 순환성 플렉시빌리티를 증가시킬 수 있거나 또는 프롤린은 혼입되어 플렉시빌리티를 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 하전된 또는 소수성 잔기의 조합은 힌지 내에 혼입되어 다합체화(multimerisation) 특성을 부여할 수 있고, 예를 들면 링커로서 하전된 또는 이온성 테일, 예컨대 산성 테일의 용도에 대한 문헌[Richter et al., 2001, Prot. Eng. 14(10):775-783] 및 류신 지퍼 서열에 대한 [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 5(1):1547-1553]을 참조한다. 다른 변형 힌지 영역은 완전히 합성될 수 있고 길이, 조성 및 플렉시빌리티와 같은 원하는 특성을 보유하도록 고안될 수 있다.
다수의 변형 힌지 영역은, 예를 들면 US5,677,425, US6642356, WO9915549, WO2005003170, WO2005003169, WO2005003170, WO9825971 및 WO2005003171에 이미 기술된 바 있으며 본원에 참고 인용된다. 이러한 힌지는 일반적으로 CH1 영역으로부터 유도되지만, 경쇄 카파 또는 람다 단편의 불변 영역의 말단에 혼입될 수도 있고; 예를 들면 하기 표 3을 참조한다.
Figure 112014054037648-pct00002
본 발명의 항체 가변 도메인은 협력하여 항원에 결합되는 상보성 VH/VL 쌍이며, 즉 이들은 동일한 결합 특이성을 갖는 상보성 VH/VL 쌍이다. 이들은 사실상 동일한 항체로부터 유도된 VH/VL 쌍이다.
일 구체예에서, VH 도메인은 중쇄 불변 영역(CH1)의 C-말단에 융합되고 VL 도메인은 경쇄 불변 영역(C 카파 또는 C 람다)의 C-말단에 융합된다.
일 구체예에서, VH 및 VL은 구성체에 추가의 안정을 제공하는 것으로 여겨지고, 유리할 수 있는 이황화 결합에 의해 연결된다.
하나 이상의 구체예에서, 예를 들어 Fab에서 중쇄 및 경쇄 불변 영역 사이, 예컨대 CH 도메인과 CL 또는 CK 도메인 사이의 이황화 결합은 존재하지 않는데, 그 이유는 예를 들어 상기 결합을 형성하는 하나 이상의 시스테인이 대체되기 때문이다. 상기 하나 이상의 시스테인은 세린 등에 의해 대체될 수 있다.
하나 이상의 구체예에서, 중쇄와 경쇄 사이 및 CH 도메인과 CL 또는 CK 도메인 사이의 쇄간 이황화 결합이 존재한다.
일 구체예에서, 본 발명은
N-말단으로부터 순서대로, 제1 중쇄 가변 도메인(VH1), CH1 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인(VH2)을 포함하는 중쇄,
N-말단으로부터 순서대로, 제1 경쇄 가변 도메인(VL1), CL 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함하는 경쇄
를 포함하는 이중특이적 항체 융합 단백질로서,
여기서 상기 중쇄 및 경쇄는 VH1 및 VL1이 제1 항원 결합 부위를 형성하고 VH2 및 VL2가 제2 항원 결합 부위를 형성하도록 정렬되고,
제2 항원 결합 부위에 의해 결합된 항원은 인간 혈청 알부민이고 제2 중쇄 가변 도메인(VH2)은 서열 번호 1에 제시된 서열을 갖고 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 서열 번호 3에 제시된 서열을 갖는 것인 이중특이적 항체 융합 단백질을 제공한다.
일 구체예에서, 알부민 결합 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 이황화 결합에 의해 연결된다. 따라서, 일례에서, 본 발명은
N-말단으로부터 순서대로, 제1 중쇄 가변 도메인(VH1), CH1 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인(VH2)을 포함하는 중쇄,
N-말단으로부터 순서대로, 제1 경쇄 가변 도메인(VL1), CL 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함하는 경쇄
를 포함하는 이중특이적 항체 융합 단백질로서,
여기서 상기 중쇄 및 경쇄는 VH1 및 VL1이 제1 항원 결합 부위를 형성하고 VH2 및 VL2가 제2 항원 결합 부위를 형성하도록 정렬되고,
제2 항원 결합 부위에 의해 결합된 항원은 인간 혈청 알부민이며,
제2 중쇄 가변 도메인(VH2)은 서열 번호 2에 제시된 서열을 갖고 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 서열 번호 4에 제시된 서열을 갖고
제2 중쇄 가변 도메인(VH2) 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 이황화 결합에 의해 연결되는 것인 이중특이적 항체 융합 단백질을 제공한다.
일례에서, 본 발명은
N-말단으로부터 순서대로, 제1 중쇄 가변 도메인(VH1), CH1 도메인, 제2 중쇄 가변 도메인(VH2) 및 제3 중쇄 가변 도메인(VH3)을 포함하는 중쇄,
N-말단으로부터 순서대로, 제1 경쇄 가변 도메인(VL1), CL 도메인, 제2 경쇄 가변 도메인(VL2) 및 제3 경쇄 가변 도메인(VL3)을 포함하는 경쇄
를 포함하는 다특이적 항체 융합 단백질로서,
여기서 상기 중쇄 및 경쇄는 VH1 및 VL1이 제1 항원 결합 부위를 형성하고 VH2 및 VL2가 제2 항원 결합 부위를 형성하며 VH3 및 VL3이 제3 항원 결합 부위를 형성하도록 정렬되고,
제2 또는 제3 항원 결합 부위에 의해 결합되는 항원은 인간 혈청 알부민이며
제2 또는 제3 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 제시된 서열을 갖고 제2 또는 제3 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4에 제시된 서열을 갖는 것인 다특이적 항체 융합 단백질을 제공한다.
당업자라면 상기 나열된 도메인 중 하나 이상의 사이에 링커가 있을 수 있다는 것을 알 것이다. 특히, CL과 VL2 및 CH1과 VH2 사이에 그리고 존재하는 경우 VL2와 VL3 및 VH2와 VH3 사이에 링커가 존재할 수 있다. 적당한 링커는 상기 본원에 이미 기술된 바 있다. 추가의 링커는 도 2 (e) 및 (f), 서열 번호 5 및 6에 제공된다.
일 구체예에서, 항체는 scFv이다. 일 구체예에서, 항체는 가변 도메인(VH 및 VL)이 서열 번호 17에 제시된 링커에 의해 연결되는 경우 scFv이다.
본 발명의 항체 가변 도메인은 시험관내 접합체, 예컨대 Fab 또는 Fab'의 반감기를 연장시키기에 충분한 결합 친화력을 지닌 알부민에 결합된다. 친화력이 2.5 ㎛ 이하인 알부민의 친화력은 시험관내 반감기를 연장시키는 것으로 보고된 바 있다(Nguyen, A. et al (2006) Protein Engineering, Design & Selection, 19(7), 291-297). 일 구체예에서, 본 발명의 가변 도메인 항체 쌍은 높은 결합 친화력, 예컨대 3 nM 나노몰을 갖는다. 일 구체예에서, 단일 도메인 항체는 나노몰 또는 마이크로몰인 항원의 결합 친화력을 갖는다. 친화력은 천연 또는 재조합 혈청 알부민을 사용하는 표면 플라스몬 공명을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 알부민 결합 항체는 약 1 ㎛ 이상의 인간 혈청 알부민에 대한 결합 친화력을 갖는다. 일 구체예에서, 항체는 약 500 M 이하의 결합 친화력를 갖는다. 일 구체예에서, 항체는 약 200 nM 이하의 결합 친화력을 갖는다. 일 구체예에서, 항체는 약 100 nM 이하의 결합 친화력을 갖는다. 일 구체예에서, 항체는 약 50 nM 이하의 결합 친화력을 갖는다. 일 구체예에서, 항체는 약 20 nM 이하의 결합 친화력을 갖는다. 일 구체예에서, 항체는 약 10 nM 이하의 결합 친화력을 갖는다. 일 구체예에서, 항체는 약 5 nM 이하의 결합 친화력을 갖는다. 일 구체예에서, 항체는 약 2 nM 이하의 결합 친화력을 갖는다. 일 구체예에서, 항체는 약 1 nM 이하의 결합 친화력을 갖는다. 당업자라면 본 발명에 의해 제공된 항체의 친화력이 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법을 사용하여 변경될 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 알부민에 대해 향상된 친화력을 갖는 본 발명의 항체 분자의 변이체에 관한 것이다. 이러한 변이체는 CDR의 돌연변이화(Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 쇄 셔플링(Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), 이.콜라이(E. coli)의 돌연변이 유발유전자 세포주의 사용(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링(Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 생식 PCR(Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998)을 포함하는 다수의 친화력 성숙화 프로토콜에 의해 수득할 수 있다. Vaughan 등(상기)은 이러한 친화력 성숙화의 방법을 논의하고 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 알부민 결합 항체 또는 융합 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다. 본 발명의 DNA 서열은 예를 들어 화학적 가공에 의해 제조된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 이중 특이성 항체 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 수득할 수 있다. 예를 들면, 항체 단편, 링커 및/또는 dAb의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열은 확인된 DNA 서열로부터 원하는 바에 따라 또는 상응한 아미노산 서열을 기반으로 합성될 수 있다.
분자 생물학의 표준 기법은 본 발명의 이중 특이성 항체 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 제조하는 데 사용될 수 있다. 원하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기법을 사용하여 전부 또는 일부 합성될 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법이 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 이중 특이성 항체 융합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터이 제공된다. 바람직한 일 구체예에서, 클로닝 또는 발현 벡터는 전체 이중 특이성 항체 융합 단백질을 코딩하는 단일 DNA 서열을 포함한다. 따라서, 클로닝 또는 발현 벡터는 번역 융합 단백질이 생성되도록 하는 서열에서 전사 단위를 코딩하는 DNA를 포함한다.
실제로, 당업자라면 본 발명의 융합 단백질은 N-말단 또는 C-말단에서 알부민 결합 가변 도메인을 가질 수 있고, 이렇게 하여 알부민 결합 DNA 코딩된 전사 단위는 처음으로 또는 마지막으로, 각각, 번역 융합체를 코딩하는 DNA 서열 내에 있게 된다는 것을 이해할 것이다. 이와 같이, 번역 융합체는 N-말단 가변 도메인 및 C-말단 Fab 또는 Fab'를 포함할 수 있다. 더하여, 번역 융합체는 N-말단 Fab 또는 Fab' 및 C-말단 알부민 결합 가변 도메인을 포함할 수 있다.
당업자라면 항체 또는 이의 단편의 중쇄 및 경쇄는 동일한 또는 상이한 벡터 내에 혼입될 수 있다는 것을 알 것이다. 일 구체예에서, 하나의 벡터는 중쇄를 포함하는 번역 융합체를 포함할 수 있고 또다른 벡터는 경쇄를 포함하는 번역 융합체를 포함할 수 있다.
본 발명의 번역 융합체 내에 포함된 항체 단편을 위한 DNA 코드는 당업자에게 공지된 구성의 전사 단위로서 벡터 내에 혼입될 수 있고, 예를 들어 전사 단위는 경쇄를 위한 코드 다음에 중쇄 코드가 오고, 또는 그 반대의 경우를 포함할 수 있고; 특히 문헌[Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26:309-320]을 참조한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터는 적절한 리더 서열, 예컨대 항체 리더 서열을 포함한다. 이러한 리더 서열은 당업계에 잘 공지되어 있다.
벡터가 구성될 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 및 형질변환 방법 및 배양 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 관점에서, 문헌["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing]을 참조한다.
또한, 본 발명의 이중 특이성 항체 융합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 임의의 적당한 숙주 세포/벡터 시스템은 이중 특이성 항체 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 발현에 사용될 수 있다. 박테리아, 예컨대 이.콜라이, 및 다른 미생물 시스템이 사용될 수 있거나 또는 진핵세포, 예컨대 포유류, 숙주 세포 발현 시스템이 또한 사용될 수 있다. 적당한 포유류 숙주 세포는 NS0, CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 이.콜라이에서 발현된다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 포유류 세포에서 발현된다.
본 발명은 또한 상기 알부민 결합 항체를 코딩하는 DNA 서열로부터 단백질을 발현하기에 적당한 조건 하에서 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 알부민 결합 항체 또는 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 알부민 결합 항체를 단리하는 방법을 제공한다.
제조시, 본 발명의 알부민 결합 항체는 필요에 따라 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 비제한적 예로서, 크로마토그래픽 기법, 예컨대 이온 교환, 크기별 배제, 단백질 G 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피가 사용될 수 있다.
항체 또는 항체 융합 단백질의 크기는 당업계에 공지된 일반적인 방법, 예컨대 크기별 배제 크로마토그래피 및 환원제 불포함 SDS-PAGE에 의해 확인될 수 있다. 이러한 기법은, 예를 들어 단백질이 이량체화되지 않았다는 것 및/또는 부분 결손을 갖지 않는다는 것을 확인하는 데 사용될 수 있다. 이량체가 검출되고 상동 단량체 생성물이 필요한 경우 단량체 항체 융합 단백질은 상기 기술된 통상의 크로마토그래피 기법을 사용하여 이량체 종으로부터 정제될 수 있다. 본 발명에서, 서열 번호 1 내지 4에서 제공된 향상된 가변 영역은 더 많은 단량체가 생성되도록 한다.
본 발명의 항체, 접합체 및 융합 단백질은 염증성 질병 및 질환, 면역 질병 및 질환, 섬유증 질환 및 암을 비롯한 질병 또는 질환의 치료에 유용하다.
용어 "염증성 질병" 또는 "질환" 및 "면역 질병 또는 질환"은 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 스틸병, Muckle Wells 질병, 건선, 크론병, 궤양성 대장염, SLE(전신 홍반성 루프스), 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 다발성 경화증, 맥관염, 제1형 당뇨병, 이식 및 그래프트-대-숙주 질병을 포함한다.
용어 "섬유증 질환"은 특발성 폐섬유증(IPF), 전신성 경화증 (또는 경피증), 신장 섬유증, 당뇨병성 신장증, IgA 신장해, 고혈압, 말기 신장 질병, 복막 섬유증(지속 복막 투석), 간경화증, 연령 관련 황반 퇴화(ARMD), 망막증, 심장 반응성 섬유증, 흉터, 켈로이드, 화상, 피부 궤양, 혈관형성술, 관상동맥 바이패스 수술, 관절성형술 및 백내장 수술을 포함한다.
용어 "암"은 피부 또는 더욱 일반적으로는 신체 기관, 예컨대 유방, 난소, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 위장, 방광 또는 창자의 내벽에서 발견되는 상피에서 발생하는 악성의 신규 증식을 포함한다. 암은 인접 조직 내에 침투하고 멀리 떨어진 장기에, 예컨대 뼈, 간, 폐 또는 뇌에 확산(전이)된다.
따라서, 본 발명의 추가 측면에 따라, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 본 발명의 항체, 항체 융합체 또는 접합체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 또한, 질병 또는 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 항체 융합 단백질의 용도가 제공된다. 가장 바람직하게는, 질병 또는 질환은 염증성 질병 또는 질환이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 경구, 협측, 비경구, 피하, 비내, 국부, 안구 또는 직장 투여에 적당한 형태, 또는 흡입 또는 통기에 의한 투여에 적당한 형태를 취할 수 있다.
적절한 경우, 예를 들어 항체 융합 단백질의 단일 도메인 항체(들)가 알부민에 결합되는 경우, 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법을 사용하여 인간 또는 재조합 혈청 알부민에 의해 이중 특이성 융합 단백질을 예비 제조하는 것이 바람직할 수 있다.
약학 조제물이 액체, 예컨대 용액 또는 현탁액인 경우 그 조제물은 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민, 특히 재조합 알부민, 예컨대 재조합 인간 혈청 알부민을 추가로 포함할 수 있다. 적당한 함량은 총 조제물의 2% w/w 미만, 특히 1, 0.5, 또는 0.1% w/w 미만의 범위 내에 있을 수 있다. 이는 조제물에서 항체 성분을 안정화시키는 데 도움을 줄 수 있다. 약학 조성물은 나중에 재구성을 위해 수성 용매에 의해 동결건조될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 동결건조된 "항체"를 포함하는 바이알과 같은 단위 용량 용기가 제공된다.
경구 투여의 경우, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대 결합제(예, 전호화분 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸 셀룰로즈); 충전제(예, 락토즈, 미정질 셀룰로즈 또는 칼슘 히드로겐포스페이트); 윤활제(예, 마그네슘 스테아레이트, 칼크 또는 실리카); 붕해제(예, 감자 전분 또는 나트륨 글리콜레이트); 또는 습윤제(예, 나트륨 라우릴 설페이트)를 갖는, 통상의 방법에 의해 제조된 예를 들어 정제, 로렌즈 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는, 예를 들어 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 또는 사용하기 전에 물 또는 다른 적당한 비히클에 의한 구성을 위해 건조 생성물로서 제시될 수 있다. 이러한 액체 제제는 약학적으로 허용가능한 첨가제, 예컨대 현탁제, 유화제, 비수성 비히클 또는 보존제에 의해 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 제제는 또한 적절한 경우 완충제 염, 향미제, 착색제 또는 감미제를 함유할 수 있다.
경구 투여용 제제는 활성 화합물을 조절된 방출하도록 적절하게 조제될 수 있다.
협측 투여의 경우, 조성물은 통상 방식으로 조제된 정제 또는 로렌즈의 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 항체, 융합체 및/또는 접합체는 볼루스 주사 또는 주입에 의한 것과 같은 주사에 의한 비경구 투여를 위해 조제될 수 있다. 주사용 조제물은 단위 제형, 예컨대 유리 앰플 또는 다회 용량 용기, 예컨대 유리 바이알로 제공될 수 있다. 주사용 조성물은 유성 또는 수성 비히클의 현탁액, 용액 또는 에멀션으로서의 형태를 취할 수 있고, 제형(formulatory) 제제, 예컨대 현탁제, 안정화제, 보존제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에, 적당한 비히클, 예컨대 멸균 주사용 증류수에 의한 구성을 위해 분말 형태일 수 있다.
상기 기술된 조제물 이외에, 본 발명의 항체는 또한 데포(depot) 조제물로서 조제될 수 있다. 이러한 장시간 작용하는 조제물은 피하주입에 의해 또는 근육내 주입에 의해 투여될 수 있다.
비내 투여 또는 흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따른 화합물은 적당한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 플루오로트리클로로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적당한 기체 또는 기체 혼합물을 사용하여 가압된 팩 또는 분무기의 에어로졸 스프레이 외양의 형태로 편리하게 전달될 수 있다.
조성물은, 필요에 따라, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 제형을 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 지시를 동반할 수 있다.
국부 투여의 경우, 본 발명에 따른 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 함유하는 적당한 연고로 편리하게 조제될 수 있다. 특정 담체는, 예를 들어 광유, 액화 석유, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 유화 왁스 및 물을 포함한다. 대안적으로, 본 발명에 따른 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 함유하는 적당한 로션으로 조제될 수 있다. 특정 담체는, 예를 들면 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 벤질 알콜, 2-옥틸도데칸올 및 물을 포함한다.
일 구체예에서, 흡입을 비롯한 국부 투여를 위한 제형으로서 조제물이 제공된다.
적당한 흡입가능 제제는 흡입가능 분말, 추진용 기체를 함유하는 계량 에어로졸 또는 추진용 기체가 없는 흡입가능 용액을 포함한다. 활성 물질을 함유하는 본 발명에 따른 흡입가능 분말은 언급된 활성 물질 단독으로 이루어지거나 또는 생리학적 허용가능한 부형제와 언급된 활성물질의 혼합물로 이루어질 수 있다.
이러한 흡입가능 분말은 단당류(예, 글루코스 또는 아라비노스), 이당류(예, 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고당류 및 다당류(예, 덱스트란), 폴리알콜(예, 소르비톨, 만니톨, 크실리톨), 염(예, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 서로와의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 이당류가 적당하게 사용되며, 전적으로는 아니지만 특히 수화물의 형태의 락토스 또는 글루코스가 사용된다.
폐 침착용 입자는 10 미크론 미만, 예컨대 1∼9 미크론, 예를 들어 0.1∼5 ㎛, 특히 1∼5 ㎛의 입도를 필요로 한다. 활성 성분(예, 항체 또는 단편)의 입도는 가장 중요하다.
흡입가능 에어로졸을 제조하는 데 사용될 수 있는 추친용 기체가 당업계에 공지되어 있다. 적당한 추친용 기체는 탄화수소, 예컨대 n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로탄화수소, 예를 들어 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 시클로프로판 또는 시클로부탄의 염소화된 및/또는 플루오르화된 유도체 중에서 선택된다. 언급된 추친용 기체는 그 자체로 또는 이의 혼합물로 사용될 수 있다.
특히 적당한 추친용 기체는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227 중에서 선택된 할로겐화된 알칸 유도체이다. 언급된 것 중 할로겐화된 탄화수소, TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이의 혼합물이 특히 적당하다.
추진용 기체 함유 흡입가능 에어로졸은 또한 다른 성분, 예컨대 공용매, 안정화제, 표면 활성제(계면활성제), 산화방지제, 윤활제 및 pH 조정 수단을 함유할 수도 있다. 이러한 모든 성분은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 추진용 기체 함유 흡입가능 에어로졸은 5 중량% 이하의 활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은, 예를 들어 0.002∼5 중량%, 0.01∼3 중량%, 0.015∼2 중량%, 0.1∼2 중량%, 0.5∼2 중량% 또는 0.5∼1 중량%의 활성 성분을 함유한다.
대안적으로, 폐로의 국부 투여는 또한 예를 들어 분무기, 예컨대 컴프레서에 연결된 분무기와 같은 장치(예, 미국 버지니아주 리치몬드 소재의 Pari Respiratory Equipment, Inc.에서 제조된 Pari Master(R) 컴프레서에 연결된 Pari LC-Jet Plus(R) 분무기)를 사용하여 액체 용액 또는 현탁 조제물의 투여에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체 포맷은 용매, 예컨대 용액 또는 현탁액의 형태로 분산되어 전달될 수 있다. 이것은 적절한 생리학적 용액, 예컨대 식염수 또는 다른 약리학적 허용가능한 용매 또는 완충 용액에 현탁될 수 있다. 당업계에 공지된 완충 용액은 약 4.0∼5.0의 pH를 실현하도록 물 1 ㎖ 당 0.05 mg∼0.15 mg의 이나트륨 에데테이트, 8.0 mg∼9.0 mg의 NaCl, 0.15 mg∼0.25 mg의 폴리소르베이트, 0.25 mg∼0.30 mg의 무수 시트르산, 및 0.45 mg∼0.55 mg의 나트륨 시트레이트를 함유할 수 있다. 현탁액은, 예를 들어 동결건조된 항체를 사용할 수 있다.
치료적 현탁액 또는 용액 제조물은 또한 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 당업계에 잘 공지되어 있고 완충제 (예, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제 및 비카르보네이트 완충제), 아미노산, 우레아, 알콜, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포솜, 만니톨, 소르비톨, 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포솜 또는 생분해가능한 마이크로스피어로 캡슐화될 수 있다. 조제물은 일반적으로 멸균 제조 공정을 이용하여 실질적인 멸균 형태로 제공된다.
이것은 조제물에 사용되는 완충 용매/용액의 여과에 의한 제조 및 살균, 멸균 완충 용매 용액에서의 항체의 무균성 현탁, 및 당업자에게 익숙한 방법에 의한 조제물의 멸균 그릇으로의 분배를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 분무가능한 조제물은, 예를 들면 호일 봉투에 패킹된 단일 용량 단위(예, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이알)로서 제공될 수 있다. 각 바이알은 2 ㎖ 등의 용매/용액 완충제 부피로 단위 용량을 함유한다.
본 발명의 항체 포맷은 분무화를 통한 전달에 적당할 것으로 생각된다.
안구 투여의 경우 본 발명에 따른 화합물은 보존제, 예컨대 살균제 또는 살진균제, 예컨대 페닐제2수은 니트레이트, 벤질알코늄 클로라이드 또는 클로르헥시딘 아세테이트를 포함 또는 불포함하는 등장성, pH 조정된 멸균 식염수의 미세이온화된 현탁액으로서 편리하게 조제될 수 있다. 대안적으로, 안구 투여의 경우 화합물은 바셀린과 같은 연고로 조제될 수 있다.
직장 투여의 경우 본 발명에 따른 화합물은 좌제로서 편리하게 조제될 수 있다. 이들은 실온에서 고체이지만 직장내 온도에서는 액체이고 그래서 직장에서 용융되어 활성 성분을 방출하는 적당한 비자극성 부형제와 활성 성분을 혼합시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 재료는, 예를 들어 코코아 버터, 비즈왁스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다.
특정한 조건의 예방 또는 치료에 필요한 본 발명의 화합물의 함량은 선택된 화합물 및 치료할 환자의 병태에 따라 달라진다. 하지만, 일반적으로, 1일 투여량은 경구 또는 협측 투여의 경우 체중으로 대략 10 ng/kg∼1000 mg/kg, 통상 100 ng/kg∼100 mg/kg, 예를 들어 대략 0.01 mg/kg∼40 mg/kg, 비경구 투여의 경우 체중으로 대략 10 ng/kg∼50 mg/kg, 및 비내 투여 또는 흡입 또는 통기 투여의 경우 대략 0.05 mg∼대략 1000 mg, 예컨대 대략 0.5 mg∼대략 1000 mg의 범위일 수 있다.
본 발명의 각 구체예의 바람직한 특징은 각각 다른 구체예를 필요한 부분만 약간 수정한 것과 같다. 비제한적 예로서 본 명세서에 인용된 특허 및 특허 출원을 비롯하여 모든 문헌은, 각 개별 문헌이 본원에서 완전하게 제시된 것처럼 특별히 그리고 개별적으로 참고 인용된 것과 같이 본원에 참고 인용된다.
본 명세서의 문맥상 포함된 것은 포괄을 의미하는 것으로 간주된다.
기술적으로 적절한 본 발명의 구체예는 조합될 수 있다.
본원에서 구체예는 특정한 특징/요소를 포함하는 것으로서 기술된다. 본 발명은 또한 확장되어 상기 특징/요소로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 구체예를 분리시키게 된다.
이하, 본 발명은 단지 예시인 하기 구체예를 참조하여 기술되며, 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되서는 안된다.
도 1a: Fab-Fv의 도해
도 1b: Fab-dsFv의 도해
도 2 내지 5: 본 발명의 서열
도 6: AlexaFluor 488 표지화된 A26 Fab-dsFv의 활성화된 인간 CD4+OX40+ T 세포에의 결합을 도시함
도 7: HEK293 세포에서 일과성 발현에 의해 생성된 항체 구성체(ug/㎖)를 도시함
도 8: Fab 이황화 안정화된 scFv의 SDS-PAGE를 도시함.
도 9: 각종 구성체의 인간 혈청 알부민에 대한 결합 친화력과 관련된 통계표를 도시함
도 10: 각종 구성체의 친화력 Fab 결합 항원의 통계표를 도시함
도 11: CHO 세포에서 일과성 발현에 의해 생성된 항체 구성체(ug/㎖)를 도시함
도 12: 각종 구성체의 SDS-PAGE 분석을 도시함
도 13: CHO 세포에서 발현된 각종 구성체에 대한 열안정성 데이타를 도시함.
DNA 조작 및 일반 방법
형질변환 및 일상적인 배양 증식에 형질전환성 이.콜라이 균주를 사용하였다. Roche Diagnostics Ltd. 및 New England Biolabs으로부터 DNA 제한 및 변형 효소를 수득하였다. Maxi 플라스미드 정제 키트(QIAGEN, 카달로그 번호 12165)를 사용하여 플라스미드를 제조하였다. ABI Prism Big Dye 종결부위 시퀀싱 키트(카달로그 번호 4304149)를 사용하여 DNA 시퀀싱 반응을 수행하고 ABI 3100 자동화된 시퀀서(Applied Biosystems) 상에 러닝하였다. 프로그램 Sequencher(Genecodes)를 사용하여 데이타를 분석하였다. Sigma 또는 Invitrogen으로부터 올리고뉴클레오티드를 수득하였다. DNA2.0에 의한 자동화된 합성 접근법에 의해 초기 V-영역 서열을 코딩하는 유전자를 구성하고, 이를 변형시켜 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이유발에 의해 그래프트화된 버젼을 생성하였다. Fab-Fv의 농도를 단백질-G 기반 HPLC 방법에 의해 측정하였다.
실시예 1
A26Fab-645dsFv에서 645의 상이한 인간화 그래프트의 생성 및 분석
본 발명자들은 WO2010/035012에서 Fab-dsFv 항체 포맷(도 1b) 및 '645gH1gL1'로 공지된 인간화된 항-알부민 항체를 앞서 기술한 바 있다. 본 발명자들은 또한 WO2010096418에서 'A26'로 공지된 인간화된 길항제 항-OX40 항체의 생성을 앞서 기술한 바 있다. 여기서 본 발명자들은 645dsgH5gL4로 공지된 항체 '645'의 새로운 향상된 인간화된 그래프트의 생성 및 Fv 성분에 상기 그래프트 및 Fab 성분에 'A26' 가변 영역을 혼입시킨 Fab-dsFv 항체 분자의 생성을 기술하고 있다.
645gH1 및 gL1의 서열은 도 3 (a) 및 (b), 서열 번호 9 및 10에 제시된다.
A26Fab-645dsFv(gH1gL1) 및 A26Fab-645dsFv(gH5gL4) 플라스미드의 구성
A26Fab-645dsFv(gL1) 경쇄(서열 번호 12)의 전체 코딩 영역을 HCMV-MIE 프로모터 및 SV40E polyA 서열의 조절 하에서 UCB 포유류 발현 벡터로 클로닝하였다. 오버랩핑 PCR 방법에 의해 645dsFv(gL1)(서열 번호 10)의 경쇄 가변 영역을 645dsFv(gL4)(서열 번호 4)로 돌연변이시켰다. A26Fab-645dsFv(gH1) 중쇄(서열 번호 11)의 전체 코딩 영역을 HCMV-MIE 프로모터 및 SV40E polyA 서열의 조절 하에서 UCB 포유류 발현 벡터로 클로닝하였다. 오버랩핑 PCR 방법에 의해 645dsFv(gH1)(서열 번호 9)의 중쇄 가변 영역을 645dsFv(gH5)(서열 번호 2)로 돌연변이시켰다. 시퀀싱에 의해 상기 구성체를 확인하였다.
A26Fab-645dsFv(gH1gL1) 및 A26Fab-645dsFv(gH5gL4)의 포유류 발현
제조자의 지시에 따라 Invitrogen의 293fectin 형질감염 시약을 사용하여 중쇄 및 경쇄 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 요약하자면, 20분 동안 실온에서 100 ㎕ 293fectin 및 1700 ㎕ Optipro 배지로 25 ㎍ 중쇄 플라스미드 및 25 ㎍ 경쇄 플라스미드를 배양하였다. 그리고나서 이 혼합물을 50 ㎖ 현탁액 중 50x106 HEK293 세포에 첨가하고 37℃에서 진탕하면서 6일 동안 배양하였다. 6일 후 10분 동안 1500 xg에서 원심분리함으로써 상청액을 수집하여 세포를 제거하고난 후 0.22 ㎛ 멸균 여과하였다.
A26Fab-645dsFv(gH1gL1) 및 A26Fab-645dsFv(gH5gL4)의 단백질-G 정제
10 kDa 분자량 차단 멤브레인을 갖는 Amicon Ultra-15 농축기 및 스윙 아웃 로터에서 4000 xg로 원심분리를 사용하여 ∼50 ㎖의 0.22 ㎛ 여과된 상청액을 ∼2 ㎖로 농축하였다. 1 ㎖/분으로 1.8 ㎖의 농축 상청액을 20 mM 포스페이트, 40 mM NaCl pH 7.4로 평형화된 1 ㎖ Gammabind Plus Sepharose(GE Healthcare) 컬럼에 가하였다. 이 컬럼을 20 mM 포스페이트, 40 mM NaCl pH7.4로 세척하고 결합된 재료를 0.1 M 글리신/HCl pH 2.7로 용출하였다. 용출 피크를 수집하고 2 M Tris/HCl pH 8.5로 pH를 ∼pH 7로 조정하였다. pH 조정된 용출물을 농축시키고 10 kDa 분자량 차단 멤브레인을 지닌 Amicon Ultra-15 농축기를 사용하여 20 mM 포스페이트, 150 mM NaCl pH 7.4로 디아필터(diafilter)시키고 4000 xg의 스윙 아웃 로터에서 ∼0.3 ㎖의 최종 부피로 농축시켰다.
A26Fab-645dsFv(gH1gL1) 및 A26Fab-645dsFv(gH5gL4)의 크기별 배제 분석
단백질-G 정제된 샘플을 크기별 배제 HPLC로 분석하였다. 1 ㎖/분으로 PBS pH 7.4의 등용매 구배와 함께 진행되는 Superdex 200 10/300 GL Tricorn 컬럼(GE Healthcare) 상에서 샘플을 분리하였다. 피크 검출이 280 nm에서 이루어졌고 기지의 분자량 단백질 대 용출 부피의 표준 커브와 비교함으로써 분명한 분자량을 계산하였다. gH1gL1 유래의 645dsFv의 인간화 그래프트의 gH5gL4로의 변화는 dsFv의 열적 안정성에 있어서(데이타는 제시되지 않음) 또는 dsFv의 HSA에의 결합 친화력에 있어서(데이타는 제시되지 않음) 어떠한 변화도 일어나는 일 없이 발현된 A26Fab-645dsFv의 백분율 단량체의 59% 내지 71%, 즉 12%의 증가를 유도하였다.
실시예 2
2.1 OX40 결합 A26 Fab-dsFv(645gH5gL4)의 BIAcore 동역학
본 실시예 및 모든 후속 실시예에서, A26 Fab-dsFv 645gH5gL4는 서열 번호 7(도 2 (g))에 제시된 중쇄 서열 및 서열 번호 8(도 2(h))에 제시된 경쇄 서열을 가지며, 즉 중쇄는 서열 번호 5, 도 2 (e)에 제시된 G4S, G4T, G4S 링커를 함유하였다.
BIAcore T200(GE Healthcare)을 사용하여 BIA(Biamolecular 상호작용 분석)를 수행하였다. 아민 커플링 화학반응을 통해
Figure 112014054037648-pct00003
5000 반응 단위(RU)의 포집 수준으로 CM5 센서칩 상에 Affinipure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 단편 특이(Jackson ImmunoResearch)를 고정시켰다. 10 ㎕/분의 유속으로 러닝 완충제로서 HBS-EP 완충제(10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Surfactant P20, GE Healthcare)를 사용하였다. 고정된 항-인간 IgG-F(ab')2에 의한 포집을 위해 0.5 ㎍/㎖에서 A26 Fab' 또는 1 ㎍/㎖에서 A26Fab-dsFv의 10 ㎕ 주사를 사용하였다. 30 ㎕/분의 유속으로 각종 농도(25 nM 내지 1.5625 nM)의 포집된 A26 상에서 인간 OX40을 적정하였다. 10 ㎕/분의 유속으로 50 mM HCl의 2 x 10 ㎕ 주사, 이어서 5 mM NaOH의 5 ㎕ 주사로 표면을 재생하였다. T200 평가 소프트웨어(버젼 1.0) 이후 표준 절차를 사용하여 배경 제거 결합 커브를 분석하였다. 적합한 알고리즘으로부터 동역학 매개변수를 측정하였다.
Figure 112014054037648-pct00004
2.2. 알부민 결합 A26 Fab-dsFv(645gH5gL4)의 BIAcore 동역학
BIAcore T200(GE Healthcare)을 사용하여 BIA(Biamolecular 상호작용 분석)를 수행하였다. 아민 커플링 화학반응을 통해
Figure 112014054037648-pct00005
5000 반응 단위(RU)의 포집 수준으로 CM5 센서칩 상에 Affinipure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 단편 특이(Jackson ImmunoResearch)를 고정시켰다. 10 ㎕/분의 유속으로 러닝 완충제로서 HBS-EP 완충제(10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Surfactant P20, GE Healthcare)를 사용하였다. 고정된 항-인간 IgG-F(ab')2에 의한 포집을 위해 0.75 ㎍/㎖에서 Fab-Fv의 10 ㎍ 주사를 사용하였다. 30 ㎕/분의 유속으로 각종 농도(50 nM 내지 6.25 nM)의 포집된 Fab-Fv 상에서 인간 혈청 알부민(HSA), 마우스 혈청 알부민(MSA) 및 사이노몰구스 혈청 알부민(CSA)을 적정하였다. 10 ㎕/분의 유속으로 50 mM HCl의 2 x 10 ㎕ 주사, 이어서 5 mM NaOH의 5 ㎕ 주사로 표면을 재생하였다. T200 평가 소프트웨어(버젼 1.0) 이후 표준 절차를 사용하여 배경 제거 결합 커브를 분석하였다. 적합한 알고리즘으로부터 동역학 매개변수를 측정하였다.
Figure 112014054037648-pct00006
2.3 OX40 및 알부민 동시 결합 A26 Fab-dsFv(645gH5gL4)의 설명
인간 OX40 및 인간 혈청 알부민의 A26 Fab-dsFv에의 동시 결합을 평가하였다. A26 Fab-dsFv 알부민 결합에 대한 Biacore 동역학 방법에 언급된 바와 같이 센서칩 표면에 A26 Fab-dsFv 구성체를 포집하였다. 50 nM HAS, 25 nM OX40 또는 최종 농도가 50 nM HSA 및 25 nM OX40인 혼합된 용액을 포집된 A26 Fab-dsFv 상에서 별도로 적정하였다. 조합된 HSA/OX40 용액의 결합 반응은 독립적 주사의 반응 합계와 상응하였다. 이것은 Fab-dsFv가 인간 OX40 및 HSA 둘다에게 동시 결합할 수 있다는 것을 확인하여 준다.
Figure 112014054037648-pct00007
2.4 A26 Fab-dsFv(645gH5gL4)의 세포 기반 친화력
방법:
인간 활성화된 CD4 + OX40 + T 세포에 결합된 A26 Fab-Fv.
Ficoll 구배 상 분리에 의해 PBMC를 단리하고 3일 동안 37℃, 5% CO2, 100% 습도에서 4 ㎍/㎖ PHA-L로 활성화하였다. 자성 비드를 사용하는 음성 선택에 의해 CD4+ T 세포를 단리하였다(인간용 CD4+ T 세포 선택 키트 II; Miltenyi Biotec). 4℃의 Facs 완충제(PBS/0.2% BSA/0.09% NaN3) 또는 5% HSA 보충된 Facs 완충제 중 항체 존재 하에서 대략 1 x 105개의 세포를 배양하였다. 항체의 최종 농도는 48 nM 내지 0.0005 nM의 범위였다. 이 세포를 PBS로 세척한 후 FACScalibur(Becton Dickinson)를 사용하여 유동 세포 분석법으로 분석하였다. 두가지 완충제 조건, 즉 A26 Fab-dsFv에 의한 제1 조건 및 비특이적 결합을 측정하기 위한 무관한 대조군 Fab-Fv에 의한 제2 조건에서 2개의 적정 데이타 세트를 생성하였다. 상이하지만 공지되어 있는 형광 염료의 양이 포함된 비드의 사용에 의해 발생된 표준 커브로부터 내삽된 값을 사용함으로써 결합된 항체의 몰수를 계산하였다. 세포 및 비드의 유세포 계측 분석에서 기하학적 평균 형광 값을 확인하였다. A26 Fab-dsFv 값으로부터 비특이적 결합을 제거하고 이에 따라 생성된 특이적 결합 커브를, KD를 확인하는 1-부위 결합 방정식(Graphpad Prism®)을 사용하여 비선형 회귀로 분석하였다. 세포 표면 발현된 항원에 대한 A26 Fab-dsFv의 친화력을 측정하기 위해, 활성화된 CD4+OX40+ T 세포, 및 Alexa Fluor 488-표지화된 A26 Fab-dsFv를 사용하여 포화도 결합 실험을 수행하였다. 항체 농도의 범위에 걸친 평형에 있어서 수용체에 대한 항체의 특이적 결합은 KD를 확인하는데 사용되어, 결합 커브 상 임의의 지점에서 극소수의 항체 단편만이 수용체에 결합하였음이 추정되었다.
평형 결합은 하기 방정식을 사용하여 기술된다:
Figure 112014054037648-pct00008
평형에서, 회합 및 해리 비율은 동일하며 결합 등온선을 기술하는 방정식이 유도될 수 있고; 세미-로그 플롯 상에서 결합은 S자형이다. KD는 koff/kon으로 정의되며 반 최고 결합이 발생하는 농도로서 결합 커브로부터 계산될 수 있다.
5-로그 농도 범위에 걸쳐 유동 세포 분석법에 의해 AlexaFluor488-표지화된 A26 Fab-Fv의 활성화된 인간 CD4+OX40+ T 세포로의 결합을 측정하였다.
A26 Fab-Fv의 대표적인 결합 커브를 도 6에 도시하였다.
5개의 상이한 공여체로부터의 활성화된 세포 상에서 수득한 평균 KD 값은 145 pM였다.
실시예 3 scFv로서의 645gL4gH5의 발현
플라스미드 구성
2개의 밀접하게 관련된 UCB 변형 포유류 발현 플라스미드 중 하나로부터 scFv를 발현시키고; HL 배향에 있어서 scFv의 클로닝 및 발현에 pVKΔPvuII를 사용하는 반면, LH 배향에 있어서 scFv의 클로닝 및 발현에 pKHΔEcoRV를 사용하였다. 모든 scFv가 20개의 아미노산 링커 펩티드, (GGGGS)4(서열 번호 17) 및 C-말단 10xHis 태그를 함유하도록 고안되었다. scFv 수용체 플라스미드 362HL 및 240LH는 2 단계 결찰로 후속 scFv 가변 영역의 제한 클로닝을 할 수 있는 vH(PvuII 및 XhoI) 및 vL(EcoRV 및 BsiWI)의 FW1-FW4 경계에서 독특한 제한 부위를 코딩한다. 이황화-안정화된(ds) scFv의 발생을 위한 카바트(Kabat) 위치 vH44 및 vL100에서 시스테인 동요(wobble)에 의해, DNA2.0으로 645gH5 vH 및 645gL4 vL를 코딩하는 유전자를 합성하였다. PvuII 및 XhoI(vH) 또는 EcoRV 및 BsiWI(vL)를 사용하여 이러한 V-영역 유전자를 수용체 scFv 플라스미드에 클로닝하고 DNA 시퀀싱을 통해 성공적인 결찰을 확인하였다.
발현 및 정제
HEK293F 세포(106 세포/㎖로 50 ㎖ 배양)를 50 ㎍ 플라스미드 DNA로 형질감염시키고 37℃의 FreeStyle™ 배지에서 배양하였다. 형질감염후 6일에 상청액을 채취하고 뱃치식 Ni2+-NTA 정제에 의해 scFv를 정제하였다. 정제된 단백질을 농축시키고 후속 생물물리학적 특징을 위해 PBS로 완충제 교환하였다.
내열성 검정
정제된 분자의 열적 안정성을 평가하기 위해 Thermofluor 검정을 수행하였다. 정제된 단백질(0.1 mg/㎖)을 SYPRO® 오렌지 염료(Invitrogen)와 혼합시키고, 이 혼합물을 384 PCR 광학 웰 플레이트에 4회 분배하였다. 1.1℃/분의 램프 속도로, 20℃∼99℃ 범위 온도의 7900HT Fast Real-Time PCR System(Agilent Technologies)에서 샘플을 분석하였다. 온도에 대하여 웰 당 형광 강도 변화가 플롯팅되고 생성된 기울기의 감염 지점은 Tm을 생성하는 데 사용되었다.
크기별 배제 HPLC
Superdex 200 10/300 GL Tricorn 컬럼(GE Healthcare) 상에서 크기별 배제 HPLC에 의해 정제된 단백질(10 ㎍ 및 50 ㎍)을 분석하였다. 214 nm 및 280 nm의 UV 검출에 의해, 유속 1 ㎖/분에서 PBS pH 7.4의 등용매 구배를 사용하였다.
결과 요약
645gH5gL4 HLd는 97% 단량체 및 75.6℃의 Tm을 형성하였다.
645gH5gL4 HL은 86% 단량체 및 75.6℃의 Tm을 형성하였다.
실시예 4
FabA-dsscFv 융합체의 구성
포유류 세포에서 발현을 위한 플라스미드.
HL 배향에서 플렉시블 링커(서열 번호 17)를 통해 인간 혈청 알부민 결합 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 도메인(서열 번호 1 및 3 또는 2 및 4)을 연결함으로써 단일 쇄 Fv(scFv)를 구성하였다. Fv의 중쇄 및 경쇄 둘다의 골격 영역에 있어서 선택된 잔기의 DNA 서열 내에 지점 돌연변이를 도입시켰다. 돌연변이를 도입시켜 중쇄 G44C 및 경쇄 G100C인 Fv의 중쇄와 경쇄 사이에 쇄간 이황화 결합을 생성함으로써 이황화 연결된-scFv(dsscFv)를 형성하였다. 경쇄 영역(카파 불변 영역의 Km3 알로타입을 가짐), 또는 FabA의 중쇄(인간 감마-1 CH1 불변 영역, γ1 이소타입)의 불변 영역의 C-말단에 dsscFv를 융합시킴으로써 FabA-dsscFv 융합 단백질을 구성하였다. scFv를 각각 c카파 영역(서열 번호 19) 또는 CHI 영역(서열 번호 20)에 연결하는 데 플렉시블(서열 번호 18 및 5) 링커가 사용되었다. FabA-dsscFv(CL-dsscFv), FabA-dsscFv(CH1-dsscFv), FabA 경쇄 및 FabA 중쇄를 화학적으로 제조한 후 HCMV-MIE 프로모터 및 SV40E polyA 서열의 조절 하에서 포유류 발현 벡터로 클로닝하였다.
이러한 구성체를 위한 각종 데이타를 도 7 내지 13에 도시하였다. 구성체의 내열성 데이타는 각각 대략 82℃의 Tm을 형성하였다.
본 명세서의 문맥상 포함된 것은 포괄을 의미하는 것으로 간주된다.
기술적으로 적절한 본 발명의 구체예는 조합될 수 있다.
본원에서 구체예는 특정한 특징/요소를 포함하는 것으로서 기술된다. 본 발명은 또한 확장되어 상기 특징/요소로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 구체예를 분리시키게 된다.
물론, 당업자라면 본 발명은 예시로서만 기술되고 어떤 식으로든 제한하려는 의도가 아니며, 상세한 내용의 변형은 이하 청구범위의 범위 내에서 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 각 구체예의 바람직한 특징은 각각 다른 구체예를 필요한 부분만 약간 수정한 것과 같다. 비제한적 예로서 본 명세서에 인용된 특허 및 특허 출원을 비롯하여 모든 문헌은, 각 개별 문헌이 본원에서 완전하게 제시된 것처럼 특별히 그리고 개별적으로 참고 인용된 것과 같이 본원에 참고 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB Pharma S.A <120> Albumin Binding Antibodies and Binding Fragments Thereof <130> G0161-WO01 <150> US61/558,599 <151> 2011-11-11 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain variable domain of anti-albumin antibody (no ds) <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain variable domain of anti-albumin antibody (ds) <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain variable domain of anti-albumin antibody (no ds) <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn 20 25 30 Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile 85 90 95 Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain variable domain of anti-albumin antibody (ds) <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn 20 25 30 Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile 85 90 95 Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker 1 <400> 5 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker 2 <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A26 Fab Heavy-(G4S,G4T,G4S)-645dsFv(gH5) <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Pro Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gly Gly Glu Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala 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(22)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 32 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 20 25 30 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 33 Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser 1 5 10 <210> 34 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 34 Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr 1 5 10 15 Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr Pro Gly Gly Asn 20 25 30 Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser 35 40 45 Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr 50 55 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 35 Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr 1 5 10 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 36 Ala Thr Thr Thr Gly Ser 1 5 <210> 37 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 37 Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu 1 5 10 15 Ser His Lys Ser Pro 20 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 38 Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 39 Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 40 Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 41 Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 42 Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 43 Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly 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Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 Phe Gly <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 51 Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu 1 5 10 15 Gly Ala <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 52 Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro 1 5 10 15 Asp Leu <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 53 Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro 1 5 10 15 Ser Leu <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 54 Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg 1 5 10 15 Ile Ser <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 55 Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 Pro <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 56 Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe 1 5 10 15 Pro Pro <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 57 Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro 1 5 10 15 Pro Tyr <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 58 Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr 1 5 10 15 Pro <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 59 Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn 1 5 10 15 Leu Arg <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 60 Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr 1 5 10 15 Phe Pro <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 61 Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 <210> 62 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 62 Pro Pro Pro Pro 1 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 63 Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala 1 5 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 64 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 <210> 65 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 65 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala <210> 66 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 66 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 20 25 <210> 67 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 67 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr Leu 1 5 10 15 Tyr Asn Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr 20 25 30 <210> 68 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 68 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His 1 5 10 15 Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr 20 25 30 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 69 Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 <210> 70 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 70 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp 1 5 10 15 Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala 20 25 <210> 71 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 71 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro Ala 1 5 10

Claims (15)

  1. 서열 번호 1에 제시된 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 3에 제시된 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는 혈청 알부민 결합 항체 또는 이의 단편.
  2. 서열 번호 2에 제시된 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호 4에 제시된 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는 혈청 알부민 결합 항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 Fab, 변형된 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 가변 도메인 항체, scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, Bis-scFv, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 트리바디(tribody), DVD-Ig 및 BiTE로 이루어진 군에서 선택되는 혈청 알부민 결합 항체 또는 이의 단편.
  4. N-말단으로부터 순서대로, 제1 중쇄 가변 도메인(VH1), CH1 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인(VH2)을 포함하는 중쇄,
    N-말단으로부터 순서대로, 제1 경쇄 가변 도메인(VL1), CL 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 이중특이적 항체 융합 단백질로서,
    여기서 상기 중쇄 및 경쇄는 VH1 및 VL1이 제1 항원 결합 부위를 형성하고 VH2 및 VL2가 제2 항원 결합 부위를 형성하도록 정렬되고, 제2 항원 결합 부위에 의해 결합된 항원은 인간 혈청 알부민이고 제2 중쇄 가변 도메인(VH2)은 서열 번호 1에 제시된 서열로 이루어지고 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 서열 번호 3에 제시된 서열로 이루어지고, 제2 중쇄 가변 도메인(VH2) 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 이황화 결합에 의해 연결되지 않는 것인 이중특이적 항체 융합 단백질.
  5. N-말단으로부터 순서대로, 제1 중쇄 가변 도메인(VH1), CH1 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인(VH2)을 포함하는 중쇄,
    N-말단으로부터 순서대로, 제1 경쇄 가변 도메인(VL1), CL 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 이중특이적 항체 융합 단백질로서,
    여기서 상기 중쇄 및 경쇄는 VH1 및 VL1이 제1 항원 결합 부위를 형성하고 VH2 및 VL2가 제2 항원 결합 부위를 형성하도록 정렬되고, 제2 항원 결합 부위에 의해 결합된 항원은 인간 혈청 알부민이고 제2 중쇄 가변 도메인(VH2)은 서열 번호 2에 제시된 서열로 이루어지고 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 서열 번호 4에 제시된 서열로 이루어지고, 제2 중쇄 가변 도메인(VH2) 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 이황화 결합에 의해 연결되는 것인 이중특이적 항체 융합 단백질.
  6. 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 정의된 항체 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 정의된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  8. 제6항의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  9. 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 정의된 항체 또는 단편의 제조 방법으로서, 상기 항체 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포로부터 상기 항체 또는 단편을 발현시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 정의된 항체 또는 단편을 포함하는, 염증성 질병 및 질환, 면역 질병 및 질환, 섬유증 질환 또는 암을 치료하기 위한 약학 조제물.
  11. 약제의 제조에 사용하기 위한, 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 정의된 항체 또는 단편.
  12. 치료에 사용하기 위한 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 항체 또는 단편.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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