KR102367488B1 - 단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법 - Google Patents

단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 (1) 단일사슬항체-알부민을 준비하는 단계; (2) LC-MS를 사용하여 상기 단일사슬항체-알부민의 분자량을 확인하는 단계; (3) 상기 단일사슬항체-알부민에 약물이 결합된 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 준비하는 단계; (4) 상기 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 전처리하는 단계; 및 (5) 상기 전처리된 약물 복합체를 LC-MS/MS로 분석하여, 상기 약물이 결합하는 위치의 단일사슬항체-알부민의 아미노산 서열을 확인하는 단계;를 포함하는 단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법에 관한 것이다.

Description

단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법{A analysis method of single chain antibody fragment(scFv)-albumin drug conjugate}
본 발명은 단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 (1) 단일사슬항체-알부민을 준비하는 단계; (2) LC-MS를 사용하여 상기 단일사슬항체-알부민의 분자량을 확인하는 단계; (3) 상기 단일사슬항체-알부민에 약물이 결합된 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 준비하는 단계; (4) 상기 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 전처리하는 단계; 및 (5) 상기 전처리된 약물 복합체를 LC-MS/MS로 분석하여, 상기 약물이 결합하는 위치의 단일사슬항체-알부민의 아미노산 서열을 확인하는 단계;를 포함하는 단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법에 관한 것이다.
전통적인 항암제는 세포독성 약물로서 세포 내에 존재하는 DNA 또는 미세소관(microtubule) 등을 표적하여 치료 효과를 나타내지만 암세포에 대한 선택성이 없기 때문에 정상 세포에도 악영향을 주는 부작용이 있다.
이에 대한 대안으로 표적지향 약물전달시스템(targeted drug delivery system)에 대한 기술개발이 활발히 진행되고 있으며, 이러한 기술개발의 예로는 암세포에 특이적으로 발현하는 항원에 결합하는 항체를 이용하여 약물(payload)을 전달하는 ADC(항체 약물 복합체)와, 암세포에 과다 발현되는 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드에 약물을 결합시킨 SMDC(small molecule drug conjugate) 등이 있다.
한편 단일사슬항체-알부민(scFv-Albumin) 융합 단백질은 scFv(single chain antibody fragment)를 통해 항원에 특이적으로 결합하고, 알부민을 통하여 인체에서 우수한 반감기(19일)를 가짐으로써, 기존의 항체 역할을 그대로 할 수 있고, 효모에서 대량생산이 가능해 항체에 비해 높은 생산성과 단순한 공정으로 제조 단가를 낮추며 상대적으로 작은 사이즈로 인하여 암세포까지 보다 효과적으로 도달할 수 있다.
또한 이미 개발된 고유의 링커 및 약물(payload)을 그대로 적용하여 알부민의 특정 site에 선별적으로 링커 약물을 결합시켜 약물 복합체의 시료 균질성을 높이고, 자가 희생기(SIG, self-immolative group)를 가진 링커를 통해 세포 내 라이소좀(Lysosome)에 존재하는 가수분해 효소에 의해 약물만 효율적이고 안전하게 해리시켜 암세포를 효율적이고 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
그러나 단일사슬항체-알부민 약물 복합체는 항체와는 달리 정확한 분석법이 확립되지 않아 제조된 약물 복합체의 구조를 확인하기 어렵고, 이로 인해 상기 약물 복합체를 활용한 연구개발에 어려움이 있다.
따라서 조직 침투력이 뛰어나면서도 안전하고 우수한 효능을 보이는 신개념의 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 정확하고 간편하게 분석할 수 있는 분석방법이 요구된다.
한국공개특허 제10-2016-0094550호 한국공개특허 제10-2018-0050261호
본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 조직 침투력이 뛰어나면서도 안전하고 우수한 효능을 보이는 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 정확하고 간편하게 분석할 수 있는 분석방법을 개발하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1) 단일사슬항체-알부민을 준비하는 단계; (2) LC-MS를 사용하여 상기 단일사슬항체-알부민의 분자량을 확인하는 단계; (3) 상기 단일사슬항체-알부민에 약물이 결합된 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 준비하는 단계; (4) 상기 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 전처리하는 단계; 및 (5) 상기 전처리된 약물 복합체를 LC-MS/MS로 분석하여, 상기 약물이 결합하는 위치의 단일사슬항체-알부민의 아미노산 서열을 확인하는 단계;를 포함하는 단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 (2)의 LC-MS 분석 조건은, LC의 이동상으로 물과 포름산의 부피비가 100:0.1~0.5인 제1용액; 및 아세토니트릴과 포름산의 부피비가 100:0.1~0.5인 제2용액을 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 (2)의 이동상의 로딩 조건은, 시작부터 3분까지는 제1용액 및 제2용액의 부피비가 90~98:2~10 인 용액을 사용하고, 3분부터 35분까지는 제2용액만을 사용하며, 35분부터 45분까지는 제1용액 및 제2용액의 부피비가 90~98:2~10 인 용액을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 (4)의 전처리하는 단계는, 상기 약물 복합체 및 메탄올을 혼합한 후 원심분리하여 단백질 침전물을 수득하는 단계; 상기 단백질 침전물에 아세톤 용액을 첨가하여 혼합한 후 원심분리하여 단백질 침전물을 수득하는 단계; 상기 수득한 단백질 침전물을 건조하는 단계; 상기 건조된 단백질 침전물에 우레아 용액을 첨가하여 혼합한 후, 버퍼 용액을 첨가하여 혼합하는 단계; 및 상기 혼합된 용액에 트립신 용액을 첨가하여 배양한 후, 가열하여 효소의 활성을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 (5)의 LC-MS/MS 분석 조건은, LC의 이동상으로 물과 포름산의 부피비가 100:0.1~0.5인 제1용액; 및 아세토니트릴과 포름산의 부피비가 100:0.1~0.5인 제2용액을 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 조직 침투력이 뛰어나면서도 안전하고 우수한 효능을 보이는 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 정확하고 간편하게 분석할 수 있는 분석방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 단일사슬항체-알부민(scFv-Albumin) 융합 단백질을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 단일사슬항체-알부민의 분석 결과를 나타낸다(3a: C009, 3b: ITC-432a).
도 4는 Standard 물질로 기존에 알려진 Drug 부분의 MS-spectrum 및 MS/MS-spectrum 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 약물 복합체의 Drug 부분의 LC-MS Chromatogram(Extracted Ion chromatogram)을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 약물 복합체(C009)의 Drug 부분의 MS-spectrum 및 MS/MS-spectrum 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 약물 복합체(ITC-432a)의 Drug 부분의 MS-spectrum 및 MS/MS-spectrum 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 단일사슬항체-알부민(ITC-432a)을 비교예 1의 방법으로 분석한 분석 결과를 나타낸다.
이하 실시예를 바탕으로 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명에 사용된 용어, 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고 통상의 기술자의 이해를 돕기 위하여 예시된 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 권리범위 등이 이에 한정되어 해석되어서는 안 된다.
본 발명에 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 다른 정의가 없다면 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 나타낸다.
본 발명은 (1) 단일사슬항체-알부민을 준비하는 단계; (2) LC-MS를 사용하여 상기 단일사슬항체-알부민의 분자량을 확인하는 단계; (3) 상기 단일사슬항체-알부민에 약물이 결합된 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 준비하는 단계; (4) 상기 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 전처리하는 단계; 및 (5) 상기 전처리된 약물 복합체를 LC-MS/MS로 분석하여, 상기 약물이 결합하는 위치의 단일사슬항체-알부민의 아미노산 서열을 확인하는 단계;를 포함하는 단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법에 관한 것이다.
본 발명의 단일사슬항체-알부민 융합 단백질은 scFv(single chain antibody fragment)를 통해 항원에 특이적으로 결합하고, 알부민을 통하여 인체에서 우수한 반감기(19일)를 가짐으로써, 기존의 항체 역할을 그대로 할 수 있고, 효모에서 대량생산이 가능해 항체에 비해 높은 생산성과 단순한 공정으로 제조 단가를 낮추며 상대적으로 작은 사이즈로 인하여 암세포까지 보다 효과적으로 도달할 수 있다(도 1).
또한 이미 개발된 고유의 링커 및 약물(payload)을 그대로 적용하여 알부민의 특정 site에 선별적으로 링커 약물을 결합시켜 약물 복합체의 시료 균질성을 높이고, 자가 희생기(SIG, self-immolative group)를 가진 링커를 통해 세포 내 라이소좀(Lysosome)에 존재하는 가수분해 효소에 의해 약물만 효율적이고 안전하게 해리시켜 암세포를 효율적이고 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 단일사슬항체-알부민 약물 복합체(scFv-albumin drug conjugate)는 다음과 같이 네 부분으로 이루어진다(도 2).
(1) 운반체 단백질(알부민; HSA; human serum albumin)은 FcRn과 결합을 통해 혈중 반감기를 높이고, 약물 복합체의 용해도 및 혈액내 안정성을 향상시킬 수 있다.
(2) 표적 단백질(scFv)은 암세포 특이적인 항원에 결합하여 약물이 암세포로 선택적으로 전달되도록 한다.
(3) 링커는 알부민의 특정 사이트(Cysteine 기의 free thiol 부분)에 conjugation 시킬 수 있는 handle 부분과 라이소좀에서 분해되어 약물을 해리시키는 SIG 부분으로 이루어진다.
(4) 약물은 강력한 암세포 사멸 능력(IC50 <10pM)을 나타낸다.
본 발명의 약물 복합체는 scFv 부분을 통해 암세포에 targeting 되면, 수용체를 매개로 하여 세포내로 들어가 endosome을 형성하고, lysosome으로 이동하여 가수분해효소에 의해 링커부분이 잘리게 되며, 약물이 해리되어 표적 암세포를 선별적으로 사멸시킬 수 있다.
상기 단계 (2)의 LC-MS 분석 조건은, LC의 이동상으로 물과 포름산의 부피비가 100:0.1~0.5인 제1용액; 및 아세토니트릴과 포름산의 부피비가 100:0.1~0.5인 제2용액을 혼합하여 사용할 수 있다.
일실시예로, 상기 단계 (2)의 이동상의 로딩 조건은, 시작부터 3분까지는 제1용액 및 제2용액의 부피비가 90~98:2~10 인 용액을 사용하고, 3분부터 35분까지는 제2용액만을 사용하며, 35분부터 45분까지는 제1용액 및 제2용액의 부피비가 90~98:2~10 인 용액을 사용할 수 있다.
상기 단계 (4)의 전처리하는 단계는, 상기 약물 복합체 및 메탄올을 혼합한 후 원심분리하여 단백질 침전물을 수득하는 단계; 상기 단백질 침전물에 아세톤 용액을 첨가하여 혼합한 후 원심분리하여 단백질 침전물을 수득하는 단계; 상기 수득한 단백질 침전물을 건조하는 단계; 상기 건조된 단백질 침전물에 우레아 용액을 첨가하여 혼합한 후, 버퍼 용액을 첨가하여 혼합하는 단계; 상기 혼합된 용액에 트립신 용액을 첨가하여 배양한 후, 가열하여 효소의 활성을 제거하는 단계; 효소 활성이 제거된 용액에 DTT(Dithiothreitol)를 첨가한 후 배양하는 단계; 및 상기 배양된 용액에 IAA(Iodoacetamide)를 혼합한 후 빛이 차단된 상온에서 보관하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 (5)의 LC-MS/MS 분석 조건은, LC의 이동상으로 물과 포름산의 부피비가 100:0.1~0.5인 제1용액; 및 아세토니트릴과 포름산의 부피비가 100:0.1~0.5인 제2용액을 혼합하여 사용할 수 있다.
일실시예로, 상기 단계 (5)의 이동상의 로딩 조건은, 시작부터 5분까지는 제1용액 및 제2용액의 부피비가 90~99:1~10 인 용액을 사용하고, 5분부터 7분까지는 제1용액 및 제2용액의 부피비가 80~95:5~20 인 용액을 사용하며, 7분부터 48분까지는 제1용액 및 제2용액의 부피비가 60~80:20~40 인 용액을 사용하고, 48분부터 75분까지는 제1용액 및 제2용액의 부피비가 2~10:90~98 인 용액을 사용하고, 75분부터 81분까지는 제1용액 및 제2용액의 부피비가 90~99:1~10 인 용액을 사용할 수 있다.
이하 실시예 및 비교예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 실시를 위하여 예시된 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
아래 표 1의 LC-MS 분석 조건에 따라 단일사슬항체-알부민을 분석하였다.
HPLC UltiMate 3000 system (Dionex, US)
Column ZORBAX 300SB-C8(2.1×50mm, 3.5㎛ , Agilent)
Mobile phase A: H2O/FA = 100/0.2 (v/v)
B: Acetonitrile/FA = 100/0.2 (v/v)
gradient
 Step Total Time (min) Flow Rate (㎕/min) A (%) B (%)
0 0 100 95 5
1 3 100 95 5
2 25 100 0 100
3 35 100 0 100
4 36 100 95 5
5 45 100 95 5
Flow rate 100 ㎕/min
Column temperature 60℃
Injection 10 ㎕
MS 기기 Micro Q-TOF III mass spectrometer (Bruker Daltonics, 255748 Germany)
Mode ESI+
Flow rate 100 ㎕/min
MS parameter 1. Source - Capillary Voltage: 4500, Nebulizer: 0.8, Dry Gas: 5.5, Dry Tem: 190℃
2. Transfer - Funnel 1RF: 400, Funnel 2RF: 600, ISCID energy: 50eV, Hexapole RF: 800
3. Quadruple - Ion Energy: 5.0eV, Low Mass: 300m/z
4. Collision Cell - Collision Energy: 12ev, Collision RF: 1400, Transfer Time: 150us, Pre Puls Storage 15us
Scan range m/z 500-3000
Rolling Average Summation Average Summation: 2 X 20000x
Source Temperature 190℃
도 3은 본 발명의 단일사슬항체-알부민의 분석 결과를 나타낸다(도 3a: C009, 도 3b: ITC-432a).
2개의 단일사슬항체-알부민(C009, ITC-432a) 모두 명확한 피크를 나타내어 분자량을 확인할 수 있으며, 일예로 ITC-432a의 경우 1,318g/mol의 분자량을 가짐을 확인할 수 있다.
본 발명은 상기 표 1의 LC-MS 분석조건을 사용함으로써, 단일사슬항체-알부민의 분자량 및 크기를 정확하고 간편하게 분석할 수 있다.
(실시예 2)
단일사슬항체-알부민 약물 복합체 30㎕(30㎍)에 메탄올 150㎕를 넣고 Ice에서 30분 보관한 다음, 13,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다.
Protein 침전물을 제외한 나머지 용액을 모두 제거한 후, 200㎕의 Cold Acetone 용액을 넣고 3분 동안 교반한 다음, 13,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다.
Protein 침전물을 제외한 나머지 용액을 모두 제거 후 상온에서 완전히 건조하였다.
5㎕의 5M 우레아를 건조된 Protein 침전물에 넣고 교반하면서 상온에서 1시간 보관하였다.
상기 침전물에 35㎕의 0.1M ABC Buffer(pH 7.8)를 넣고 교반하였다.
2㎍(20㎕)의 Trypsin Solution을 넣고 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, 95℃에서 3분 동안 가열하여 Enzyme의 활성을 제거하였다.
샘플을 30㎕(30㎍) 씩 나눠 절반은 보관하였다.
1㎕의 0.5M DTT를 넣고 56℃에서 30분 동안 배양한 후, 1㎕의 1M IAA를 넣고 빛이 차단된 상온에서 1시간 보관하였다.
아래 표 2의 LC-MS/MS 분석 조건에 따라 전처리된 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 분석하였다.
HPLC Vanquish (thermo)
Column Hypersil GOLD C8 (2.1×50 ㎜, 1.9㎛, Thermo)
Mobile phase A: H2O/FA = 100/0.2 (v/v)
B: Acetonitrile/FA = 100/0.2 (v/v)
gradient
 Step Total Time (min) Flow Rate (㎕/min) A (%) B (%)
0 0 100 98 2
1 5 100 98 2
2 7 100 90 10
3 48 100 70 30
4 65 100 5 95
5 75 100 5 95
6 76 100 98 2
7 81 100 98 2
Flow rate 100 ㎕/min
Column temperature 50℃
Injection 10 ㎕
MS/MS 기기 Q Exactive Plus (thermo)
Polarity Positive
Flow rate 100 ㎕/min
Scan type
(Full MS)		 1. Resolutiom : 70,000
2. AGC target : 3e6
3. Maximun IT : 100 ms
4. Scan range : 200 to 2000 m/z
Scan type
(dd-MS2)		 1. Resolutiom : 17,500
2. AGC target : 1e5
3. Maximun IT : 54 ms
4. Isolation windw 2 m/z
5. (N)CE / stepped nce : 25
상기 실시예 1에서 단일사슬항체-알부민의 물질 분석은 확인되었으나, Drug이 결합되는 Site를 확인하기 위해서는 약물 복합체의 전처리를 통한 LC-MS/MS 분석이 필요하다.
도 4는 Standard 물질로 기존에 알려진 Drug 부분의 MS-spectrum 및 MS/MS-spectrum 결과를 나타내며, 상기 결과를 활용하여 본 발명의 약물 복합체(C009, ITC-432a)의 분석을 수행할 수 있다.
도 5는 본 발명의 약물 복합체의 Drug 부분의 LC-MS Chromatogram(Extracted Ion chromatogram)을 나타낸다.
본 발명의 2개의 약물 복합체(C009, ITC-432a)는 Drug과 결합되는 T25 Flag를 확인할 수 있다.
도 6 및 7은 본 발명의 약물 복합체(C009, ITC-432a)의 Drug 부분의 MS-spectrum 및 MS/MS-spectrum 결과를 나타낸다.
각각의 Peak별 MS-spectrum 및 MS/MS-spectrum을 통하여 Drug이 결합된 부분의 아미노산 서열을 정확하게 확인할 수 있다.
본 발명은 기존의 단일사슬항체-알부민 분석방법(SDS-PAGE, SEC)과 다른 방식을 사용함으로써, 단일사슬항체-알부민의 분자량 및 크기를 정확하게 알 수 있으며, 단일사슬항체-알부민 약물 복합체에서 Drug이 결합되는 아미노산 사이트의 구조를 정확하고 간편하게 분석할 수 있다.
(비교예 1)
LC의 이동상으로 물과 포름산의 부피비가 100:0.2인 용액을 사용하고, 시작부터 45분까지 상기 용액을 로딩한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 단일사슬항체-알부민을 분석하였다.
도 8은 본 발명의 단일사슬항체-알부민(ITC-432a)을 비교예 1의 방법으로 분석한 분석 결과를 나타낸다.
비교예 1의 방법으로 분석하는 경우, 단일사슬항체-알부민은 명확한 피크를 나타내지 않아 단일사슬항체-알부민의 크기 및 분자량을 확인할 수 없다.

Claims (5)

  1. (1) 단일사슬항체-알부민을 준비하는 단계;
    (2) LC-MS를 사용하여 상기 단일사슬항체-알부민의 분자량을 확인하는 단계;
    (3) 상기 단일사슬항체-알부민에 약물이 결합된 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 준비하는 단계;
    (4) 상기 단일사슬항체-알부민 약물 복합체를 전처리하는 단계; 및
    (5) 상기 전처리된 약물 복합체를 LC-MS/MS로 분석하여, 상기 약물이 결합하는 위치의 단일사슬항체-알부민의 아미노산 서열을 확인하는 단계;를 포함하는 단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법에 있어서,
    상기 단계 (2)의 LC-MS 분석 조건은,
    LC의 이동상으로 물과 포름산의 부피비가 100:0.1~0.5인 제1용액; 및 아세토니트릴과 포름산의 부피비가 100:0.1~0.5인 제2용액을 혼합하여 사용하고,
    상기 단계 (2)의 이동상의 로딩 조건은,
    시작부터 3분까지는 제1용액 및 제2용액의 부피비가 90~98:2~10 인 용액을 사용하고,
    3분부터 35분까지는 제2용액만을 사용하며,
    35분부터 45분까지는 제1용액 및 제2용액의 부피비가 90~98:2~10 인 용액을 사용하며,
    상기 단계 (4)의 전처리하는 단계는,
    상기 약물 복합체 및 메탄올을 혼합한 후 원심분리하여 단백질 침전물을 수득하는 단계;
    상기 단백질 침전물에 아세톤 용액을 첨가하여 혼합한 후 원심분리하여 단백질 침전물을 수득하는 단계;
    상기 수득한 단백질 침전물을 건조하는 단계;
    상기 건조된 단백질 침전물에 우레아 용액을 첨가하여 혼합한 후, 버퍼 용액을 첨가하여 혼합하는 단계; 및
    상기 혼합된 용액에 트립신 용액을 첨가하여 배양한 후, 가열하여 효소의 활성을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (5)의 LC-MS/MS 분석 조건은,
    LC의 이동상으로 물과 포름산의 부피비가 100:0.1~0.5인 제1용액; 및 아세토니트릴과 포름산의 부피비가 100:0.1~0.5인 제2용액을 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법.
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