JP5931730B2 - ジスルフィドで安定化された多価抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、新しい二重特異性抗体融合タンパク質に関する。そのような抗体は、そのｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期を延長させるために使用する、１つの対象抗原に対する第１の特異性、及び第２の対象抗原、たとえば血清担体タンパク質に対する第２の特異性を含む。また、そのような分子及びそれらを含む医薬組成物を生成する方法も提供される。
抗体の高い特異性及び親和性により、これらが、特にタンパク質：タンパク質の相互作用を変調させるための理想的な診断剤及び治療剤となる。組換え抗体技術の分野における進歩により、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片並びに他の抗体断片などの抗体断片の生成がもたらされた。これらのより小さな分子は、完全抗体の抗原結合活性を保持しており、完全免疫グロブリン分子と比較して改善された組織透過及び薬物動態学の特性も示すことができる。実際、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）及びＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）などの製品の最近の成功によって見られるように、抗体断片は多用途の治療剤であることが証明されつつある。そのような断片は完全免疫グロブリンを超えるいくつかの利点を示すように見える一方で、これらは、ｉｎ ｖｉｖｏでの長い寿命を与えるＦｃドメインを欠くため、増加した血清クリアランス速度の欠点もある（Ｍｅｄａｓａｎら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：２２１１〜２２１７）。
二重特異性を有する、すなわち２つの異なる抗原と結合する抗体が、以前に記載されている（総説には、Ｓｅｇａｌら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１：５５８〜５６２、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ及びＰａｃｋ、１９９７、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：８３〜１０５、Ｆｉｓｃｈｅｒ及びＬｅｇｅｒ、２００７、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ、７４、３〜１４を参照）。また、二重特異性抗体は、ＷＯ０２／０２７７３号、ＵＳ２００７０６５４４０号、ＵＳ２００６２５７４０６号、ＵＳ２００６１０６２０３号及びＵＳ２００６２８０７３４号にも記載されている。ヘテロ二重特異性抗体に基づく分子を作製するための以前の手法では、一般に、化学的架橋結合又はタンパク質工学技法が用いられてきた。化学的架橋結合は、ヘテロ及びホモ二量体の形成の収率不良並びにそれに続くクロマトグラフィー分離の必要性を欠点とする。タンパク質工学手法は、非常に精巧であったか（たとえば、ノブ−イン−ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）工学、Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、９（７）：６１７〜６２１）、又は不適切な安定性の特徴を有する分子を使用していた（たとえばジアボディー、ｓｃＦｖ）。一部の事例では、二重特異性抗体は、両方の抗原がそれぞれの抗体アームに同時に結合することができないという立体障害の問題の欠点を有する場合もある。
単一ドメイン抗体又はｄＡｂとしても知られる単一可変ドメイン抗体は、抗体の重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応する。マウス単一ドメイン抗体はＷａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４〜５４６によって記載されている。また、ヒト及び「ラクダ化」ヒト単一ドメイン抗体も記載されている（Ｈｏｌｔら、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１、４８４〜４９０）。また、単一ドメイン抗体は、ラクダ科（ラクダ及びラマ）並びに軟骨魚類（テンジクザメ（ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ）及びコモリザメ（ｎｕｒｓｅ ｓｈａｒｋ））からも得られている。これらの生物は、その免疫系の不可欠且つ重大な構成要素としてＦｃに等価の定常ドメインフレームワーク上に搭載されている、進化した高い親和性の単一のＶ様ドメインを有する（ラクダ科ではＶｈＨと呼ばれ、サメではＶ−ＮＡＲと呼ばれる）（総説には、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３（９）：１１２６〜１１３６を参照）。
単一ドメイン抗体−酵素の融合体は、ＥＰ０３６８６８４号に記載されている。また、単一ドメイン−エフェクター群融合体もＷＯ２００４／０５８８２０号に記載されており、これは単一可変ドメインを含む。二重可変ドメイン免疫グロブリンはＷＯ２００７／０２４７１５号に記載されている。二重特異的リガンドは、異なる特異性を有する２つの単一ドメイン抗体を含み、ＥＰ１５１７９２１号に記載されている。
Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及び他の抗体断片などの抗体断片の半減期を改善させる手段が知られている。一手法は、断片をポリマー分子にコンジュゲートさせることである。したがって、動物におけるＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２断片の短い循環半減期は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコンジュゲーションによって改善されている（たとえば、ＷＯ９８／２５７９１号、ＷＯ９９／６４４６０号及びＷＯ９８／３７２００号を参照）。別の手法は、ＦｃＲｎ受容体と相互作用する薬剤とのコンジュゲーションによって抗体断片を修飾することである（たとえばＷＯ９７／３４６３１号を参照）。半減期を延長させるためのさらに別の手法は、血清アルブミンと結合するポリペプチドを使用することである（たとえば、Ｓｍｉｔｈら、２００１、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１２：７５０〜７５６、ＥＰ０４８６５２５号、ＵＳ６２６７９６４号、ＷＯ０４／００１０６４号、ＷＯ０２／０７６４８９号、及びＷＯ０１／４５７４６号を参照）。しかし、ＦｃＲｎ受容体と相互することが原因で長い半減期を有するものの代替物として、ＰＥＧとのコンジュゲーションによって修飾されずに、又はヒト血清アルブミンにコンジュゲートされずに、長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する抗原結合免疫グロブリンタンパク質を生成する必要性が依然として残る。
様々なタンパク質が血漿中に存在し、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン及びアルブミン、又はその任意のものの断片が含まれる。血清担体タンパク質は体内を循環し、半減期は日単位で測定され、たとえば、チロキシン結合タンパク質では５日間、又はトランスサイレチンでは２日間（Ｂａｒｔａｌｅｎａ及びＲｏｂｂｉｎｓ、１９９３、Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、１３：５８３〜５９８）、又はヨウ素化α１−酸糖タンパク質の代謝回転の第２期では６５時間（Ｂｒｅｅら、１９８６、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．、１１：３３６〜３４２）である。Ｇｉｔｌｉｎら（１９６４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０：１９３８〜１９５１）からのデータでは、妊娠女性では、α１−酸糖タンパク質の半減期は３．８日間であり、トランスフェリンは１２日間であり、フィブリノーゲンは２．５日間であることが示唆されている。血清アルブミンは、血管及び血管外の区画のどちらにおいても豊富なタンパク質であり、人における半減期は約１９日間である（Ｐｅｔｅｒｓ、１９８５、Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．、３７：１６１〜２４５）。これは、約２１日間であるＩｇＧ１の半減期に類似している（Ｗａｌｄｅｍａｎ及びＳｔｒｏｂｅｒ、１９６９、Ｐｒｏｇｒ．Ａｌｌｅｒｇｙ、１３：１〜１１０）。
本発明は、組換えによって生成することができ、２つの抗原、具体的には２つの別個の／異なる抗原と同時に結合することができる、改善された二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
したがって、本発明は、１つの対象抗原に対する第１の特異性を有する免疫グロブリン部分、たとえばＦａｂ又はＦａｂ’断片を含み、第２の対象抗原に対する特異性を有する単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）をさらに含み、具体的には第１の抗原及び第２の抗原が異なる実体である、二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
本明細書中で用いる単一ドメイン抗体とは、単鎖Ｆｖに言及するものではない。単鎖Ｆｖは、互いに連結されていることによって独立した実体を形成する、又はその中の可変ドメインの１つのみを介して別の実体に連結されている、２つの可変ドメインによって特徴づけられている。
本明細書中で用いる多価とは、２つ以上の結合部位、たとえば２つ又は３つの結合部位、たとえば２つの結合部位を有する実体をいうことを意図する。それぞれの結合部位は、同じエピトープ若しくは同じ抗原上の異なるエピトープと結合し得るか、又は異なる（別個の）抗原と結合し得る。
また、本発明は、１つの対象抗原に対する第１の特異性を有する免疫グロブリン部分、たとえばＦａｂ又はＦａｂ’断片を含み、第２の対象抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体をさらに含む、二重特異性抗体融合タンパク質も提供する。
本発明の二重特異性抗体融合体は、２つの対象抗原と選択的に結合することができる。
一実施形態では、第１及び第２の抗原は同じ抗原である。
一実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片によって結合される対象抗原は、細胞会合タンパク質、たとえば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞若しくは腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質であり得るか、又は可溶性タンパク質であり得る。また、対象抗原は、疾患又は感染中にアップレギュレーションされるタンパク質などの、任意の医学的に関連性のあるタンパク質、たとえば受容体及び／又はその対応するリガンドであり得る。細胞表面タンパク質の特定の例には、接着分子、たとえばβ１インテグリンなどのインテグリン、たとえば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、デュデュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＶＥＧＦ、並びに適切な場合はその受容体が含まれる。
可溶性抗原には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７などのインターロイキン、たとえば呼吸器合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原などのウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α、ＰＤＧＦ−βなどの血小板由来成長因子、並びに適切な場合はその受容体が含まれる。他の抗原には、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、ウイルス、たとえば、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣ、バイオテロ剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモの毒液及び毒素が含まれる。
一実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質は、対象抗原の活性を機能的に変更させるために使用し得る。たとえば、抗体融合タンパク質は、前記抗原の活性を直接又は間接的に中和、拮抗又は刺激し得る。
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質中の単一ドメイン抗体（単数又は複数）によって結合される第２の対象抗原は、細胞会合タンパク質、たとえば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞若しくは腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質であり得るか、又は可溶性タンパク質であり得る。また、対象抗原は、疾患又は感染中にアップレギュレーションされるタンパク質などの、任意の医学的に関連性のあるタンパク質、たとえば受容体及び／又はその対応するリガンドであり得る。細胞表面タンパク質の特定の例には、接着分子、たとえばβ１インテグリンなどのインテグリン、たとえば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、デュデュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＶＥＧＦ、並びに適切な場合はその受容体が含まれる。
可溶性抗原には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７などのインターロイキン、たとえば呼吸器合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原などのウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α、ＰＤＧＦ−βなどの血小板由来成長因子、並びに適切な場合はその受容体が含まれる。他の抗原には、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、ウイルス、たとえば、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣ、バイオテロ剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモの毒液及び毒素が含まれる。
単一ドメイン抗体（単数又は複数）によって結合され得る他の抗原には、血清担体タンパク質、細胞媒介性のエフェクター機能の動員を可能にするポリペプチド及び核種キレートタンパク質が含まれる。
したがって、一例では、本発明は、１つの対象抗原に対する第１の特異性を有する免疫グロブリン部分を含み、第２のタンパク質に対する特異性を有する単一ドメイン抗体をさらに含み、後者が補体経路の活性化及び／又はエフェクター細胞の動員などのエフェクター機能を動員する能力をもたらす、二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。さらに、本発明の融合タンパク質は、核種キレートタンパク質と結合する単一ドメイン抗体によって放射性核種をキレート化するために使用し得る。そのような融合タンパク質は、治療用のイメージング又は放射性核種標的化手法において有用である。
したがって、一例では、対象抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、前記断片は動員ポリペプチドに対する特異性を有する少なくとも１つのｄＡｂと融合されており、前記ｄＡｂは、前記動員ポリペプチドと結合することによって細胞媒介性エフェクター機能（単数又は複数）を直接又は間接的に動員する能力をもたらす、単離した二重特異性抗体融合タンパク質が提供される。
エフェクター機能の動員は、エフェクター機能が、その表面上に動員分子を保有している細胞に関連しているという点で、直接であり得る。間接的な動員は、ｄＡｂと動員分子との結合が、たとえば、立ち代ってエフェクター機能を直接若しくは間接的に動員し得る因子の放出を引き起こす場合に起こり得るか、又はシグナル伝達経路の活性化を介したものであり得る。例には、ＴＮＦα、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１７、ＩＦＮγ、ヒスタミン、Ｃ１ｑ、オプソニン、並びにＣ２、Ｃ４、Ｃ３−転換酵素、及びＣ５〜Ｃ９などの古典的及び副補体活性化カスケードの他のメンバーが含まれる。
本明細書中で使用する「動員ポリペプチド」には、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃγＲ、それだけには限定されないがＣ１ｑ及びＣ３などの補体経路タンパク質、それだけには限定されないが、ＣＤ６８、ＣＤ１１５、ＣＤ１６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ２２などのＣＤマーカータンパク質（表面抗原分類マーカー）が含まれる。ＣＤマーカータンパク質であるさらなる動員ポリペプチドには、ＣＤ１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、Ｄ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０６、ＣＤ１１４、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１２０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ１６９、ＣＤ１８４、ＣＤ２０６、ＣＤ２０９、ＣＤ２５７、ＣＤ２７８、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３及びＣＤ３０４、又は細胞媒介性エフェクター機能を直接若しくは間接的に動員する能力を保持しているその任意のものの断片が含まれる。また、動員ポリペプチドには、エフェクター機能を保有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ及びＩｇＡなどの免疫グロブリン分子も含まれる。
一実施形態では、ｄＡｂが特異性を有する第２のタンパク質は補体経路タンパク質であり、Ｃ１ｑが特に好ましい。
好ましい実施形態では、ｄＡｂが特異性を有する第２のタンパク質はＣＤマーカータンパク質であり、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１６及びＣＤ３５が特に好ましい。
したがって、対象抗原に対する特異性を有する抗体断片を含み、前記断片が、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１６及びＣＤ３５からなる群から選択されるＣＤ分子に対する特異性を有する少なくとも１つのｄＡｂと融合されている、単離した二重特異性抗体融合タンパク質も提供される。
一実施形態では、単一ドメイン抗体（単数又は複数）は、第１の特異性を有する免疫グロブリン部分に延長された半減期をもたらす。
したがって、一実施形態では、対象抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、前記断片が、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と融合されており、前記単一ドメイン抗体が、前記血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子又はＣＤ３５／ＣＲ１と結合することによって、前記対象抗原に対する特異性を有する抗体断片に延長された半減期をもたらす、二重特異性抗体融合タンパク質が提供される。
一実施形態では、対象抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、前記断片が、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と融合されており、前記単一ドメイン抗体が、前記血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子又はＣＤ３５／ＣＲ１と結合することによって、前記対象抗原に対する特異性を有する抗体断片に延長された半減期をもたらす、単離した二重特異性抗体融合タンパク質が提供される。
本明細書中で使用する「血清担体タンパク質」には、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン及びアルブミン、又はその任意のものの断片が含まれる。
本明細書中で使用する「循環免疫グロブリン分子」には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＤ、又はその任意のものの断片が含まれる。
ＣＤ３５／ＣＲ１とは、赤血球上に存在し、３６日間の半減期を有するタンパク質である（正常な範囲は２８〜４７日間、Ｌａｎａｒｏら、１９７１、Ｃａｎｃｅｒ、２８（３）：６５８〜６６１）。
好ましい実施形態では、ｄＡｂが特異性を有する第２のタンパク質は血清担体タンパク質であり、ヒト血清担体タンパク質が特に好ましい。最も好ましい実施形態では、血清担体タンパク質はヒト血清アルブミンである。
したがって、対象抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、前記断片が、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と融合されている、二重特異性抗体融合タンパク質が提供される。
一実施形態では、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、前記断片が、ヒト血清アルブミンに対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と融合されている、単離した二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
一実施形態では、対象抗原に対する特異性を有する抗体断片はＦａｂ断片である。別の実施形態では、対象抗原に対する特異性を有する抗体断片はＦａｂ’断片である。
したがって、最も好ましい一実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質は、翻訳融合タンパク質、すなわち遺伝子融合体であり、そのそれぞれの配列は発現ベクターによってコードされている。或いは、抗体融合タンパク質構成要素は、化学的手段を使用して、すなわち、化学的コンジュゲーション又は化学的架橋結合によって融合されている。そのような化学的手段は当分野で知られている。
一例では、抗体断片は、ネイティブ又は改変されたヒンジ領域を保有するＦａｂ’断片である。本発明の二重特異性抗体融合タンパク質を調製するために使用する抗体断片がＦａｂ’断片である場合、前記断片は、一般に、重鎖のＣ末端で１つ又は複数のアミノ酸によって延長される。したがって、本発明の抗体融合体は、直接又はリンカーを介してｄＡｂに翻訳融合（又は化学的融合）されたＦａｂ’断片を含むことができる。さらに、適切な抗体Ｆａｂ’断片の例には、ＷＯ２００５００３１７０号及びＷＯ２００５００３１７１号に記載されているものが含まれる。
別の例では、抗体断片はＦａｂ断片である。したがって、本発明の抗体融合体は、リンカー配列に翻訳融合（又は化学的融合）されており、立ち代ってそれがｄＡｂに翻訳融合（又は化学的融合）されている、Ｆａｂ断片を含むことができる。好ましくは、Ｆａｂ断片は、ＷＯ２００５／００３１６９号に記載されているように、鎖間システインで終結するＦａｂ断片である。したがって、一例では、Ｆａｂ断片は、ＩｇＧ１の位置２３３で終結する。
本発明において有用な抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片は、任意の種からのものであることができるが、好ましくは、モノクローナル抗体、ヒト抗体に由来するか、又はヒト化断片である。本発明において使用するための抗体断片は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ若しくはＩｇＡ）又はサブクラスに由来することができ、たとえば、マウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含めた任意の種から得られ得る。
一実施形態では、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片は、モノクローナル、完全ヒト、ヒト化又はキメラ抗体断片である。一実施形態では、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片は、完全にヒトであるか、又はヒト化されたものである。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６、４９５〜４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、１９８３、４、７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら、「モノクローナル抗体及び癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ページ７７〜９６、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）などの、当分野で知られている任意の方法によって調製し得る。
また、本発明において使用するための抗体は、たとえば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６、９３（１５）、７８４３〜７８４８、ＷＯ９２／０２５５１号、ＷＯ２００４／０５１２６８号及びＷＯ２００４／１０６３７７号によって記載されている方法によって、特定の抗体の産生について選択された単一のリンパ球から作製された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニング及び発現させることによって、単一リンパ球抗体方法を使用しても、作製し得る。
ヒト化抗体とは、非ヒト種からの１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する、非ヒト種からの抗体分子である（たとえばＵＳ５，５８５，０８９号を参照）。
また、本発明において使用するための抗体は、当分野で知られている様々なファージディスプレイ方法を使用して作製することもでき、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２、４１〜５０、Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４、１７７〜１８６、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、２４、９５２〜９５８、Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１９９７、１８７、９〜１８、及びＢｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７、１９１〜２８０、ＷＯ９０／０２８０９号、ＷＯ９１／１０７３７号、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／１８６１９号、ＷＯ９３／１１２３６号、ＷＯ９５／１５９８２号、及びＷＯ９５／２０４０１号、並びにＵＳ５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３、及び第５，９６９，１０８号によって記載されているものが含まれる。また、トランスジェニックのマウス又は他の哺乳動物を含めた他の生物を使用しても、ヒト化抗体を作製し得る。
完全ヒト抗体とは、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が、必ずしも同じ抗体からのものではないが、すべてヒト起源である、又はヒト起源の配列と実質的に同一である抗体である。完全ヒト抗体の例には、たとえば、一般的にＥＰ０５４６０７３ Ｂ１号、ＵＳ５，５４５，８０６号、ＵＳ５，５６９，８２５号、ＵＳ５，６２５，１２６号、ＵＳ５，６３３，４２５号、ＵＳ５，６６１，０１６号、ＵＳ５，７７０，４２９号、ＥＰ０４３８４７４ Ｂ１号及びＥＰ０４６３１５１ Ｂ１号に記載されているように、たとえば上述のファージディスプレイ方法によって産生された抗体、並びにマウス免疫グロブリンの可変及び／又は定常領域の遺伝子がそのヒト対応物によって置き換えられているマウスによって産生された抗体が含まれ得る。
本発明において使用するための抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の出発物質は、任意の適切な酵素切断及び／又は消化技法を使用して、たとえばペプシンを用いた処理によって、任意の完全抗体、特に完全モノクローナル抗体から得られ得る。或いは、又はそれに加えて、抗体の出発物質は、抗体の可変及び／又は定常領域をコードしているＤＮＡの操作及び再発現を含む組換えＤＮＡ技法の使用によって調製し得る。標準の分子生物学的技法を使用して、アミノ酸又はドメインを所望に応じて修飾、付加、又は欠失させ得る。可変又は定常領域へ任意の変更を行っても、それらは依然として本明細書中で使用する用語「可変」及び「定常」領域によって包含される。
抗体断片の出発物質は、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含めた任意の種から得られ得る。抗体断片の部分を複数の種から得てもよく、たとえば抗体断片はキメラであり得る。一例では、定常領域が１つの種からのものであり、可変領域が別の種からのものである。また、抗体断片の出発物質は改変されていてもよい。別の例では、抗体断片の可変領域は、組換えＤＮＡ操作技法を用いて作製されている。そのような操作されたバージョンには、たとえば、天然抗体の可変領域から、天然抗体のアミノ酸配列への又はそれ中の、挿入、欠失又は変化によって作製されたものが含まれる。この種類の特定の例には、少なくとも１つのＣＤＲを含有し、任意選択で、１つの抗体からの１つ又は複数のフレームワークのアミノ酸を含有し、可変領域ドメインの残りの部分が第２の抗体からのものである、操作された可変領域ドメインが含まれる。これらの抗体断片を作製及び製造する方法は当分野で周知である（たとえば、Ｂｏｓｓら、ＵＳ４，８１６，３９７号、Ｃａｂｉｌｌｙら、ＵＳ６，３３１，４１５号、Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１号、Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４、Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、３８３３、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２、３２３、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３、Ｑｕｅｅｎら、ＵＳ５，５８５，０８９号、Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７号、Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０、１〜１４２、Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１を参照）。
本発明では、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片と融合されたそれぞれの単一ドメイン抗体は、直接又はリンカーを介して連結されていてよい。
本明細書中で用いる、直接連結されているとは、Ｆａｂ又はＦａｂ’の「最後」のアミノ酸が、ペプチド結合によって、単一ドメイン抗体の「最初」のアミノ酸と結合していることをいうことを意図する（又は実際にはその逆）。
ｄＡｂをＦａｂ又はＦａｂ’と連結させるための適切なリンカー領域の例には、それだけには限定されないが、柔軟なリンカー配列及び強固なリンカー配列が含まれる。柔軟なリンカー配列には、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、ＰＮＡＳ、８５：５８７９〜５８８３、Ｗｒｉｇｈｔ及びＤｅｏｎａｒａｉｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００７、４４（１１）：２８６０〜２８６９、Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１９９５、８（７）：７２５〜７３１、Ｌｕｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５、１１８（４）：８２５〜８３１、Ｔａｎｇら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１（２６）：１５６８２〜１５６８６、並びにＴｕｒｎｅｒら、１９９７、ＪＩＭＭ、２０５、４２〜５４に開示されているものが含まれる（代表的な例には表１を参照）。
Figure 0005931730
配列３及び４５〜４８中のＳ）は任意選択である。
したがって、一実施形態では、リンカーは配列
Figure 0005931730
を有する。一実施形態では、リンカーは配列
Figure 0005931730
を有する。
強固なリンカーの例には、ペプチド配列
Figure 0005931730
が含まれる。
他のリンカーには、
Figure 0005931730
が含まれる。
一実施形態では、ペプチドリンカーはアルブミン結合ペプチドである。アルブミン結合ペプチドの例はＷＯ２００７／１０６１２０号中に提供されており、以下のものが含まれる。
Figure 0005931730
一実施形態では、本発明の分子は、アルブミン結合ペプチドリンカーに加えた、又はそれに代わる位置にある、アルブミン結合ペプチドを含む。ペプチドはｉｎ ｖｉｖｏでアルブミンと結合し、これにより分子の半減期が増加される。
アルブミン結合ペプチドは、１つ又は複数の可変領域（たとえばＦａｂ中及び／又はドメイン抗体（単数若しくは複数）中）、ヒンジ、リンカー、分子のＮ末端又はＣ末端、又はその組合せ、或いは分子の抗原結合特性を妨害しない任意の位置に付加されていてよい。
一実施形態では、抗体のヒンジ配列又はその一部、たとえば上部ヒンジ配列をリンカーとして使用する。典型的には、本発明において使用するための抗体Ｆａｂ’断片は、ネイティブ又は改変されたヒンジ領域を保有する。そのようなヒンジ領域は、ｄＡｂ部分に対する天然リンカーとして使用される。ネイティブヒンジ領域とは、通常は抗体分子のＣＨ１ドメインと会合しているヒンジ領域である。改変されたヒンジ領域とは、長さ及び／又は組成がネイティブヒンジ領域とは異なる任意のヒンジである。そのようなヒンジには、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ又はヤギのヒンジ領域などの、任意の他の種からのヒンジ領域が含まれ得る。他の改変されたヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全ヒンジ領域を含み得る。したがって、たとえば、クラスγ１のＣＨ１ドメインは、クラスγ４のヒンジ領域に付着していてもよい。或いは、改変されたヒンジ領域は、天然ヒンジの一部、又は反復中のそれぞれの単位が天然ヒンジ領域に由来する反復単位を含み得る。さらなる代替では、天然ヒンジ領域は、１つ若しくは複数のシステイン若しくは他の残基をアラニンなどの中性残基に変換することによって、又は適切に配置された残基をシステイン残基に変換することによって、変更し得る。そのような手段によって、ヒンジ領域中のシステイン残基の数を増加又は減少させ得る。さらに、ヒンジのシステイン（単数又は複数）と軽鎖の鎖間システインとの間の距離、ヒンジのシステイン間の距離、及び柔軟性などのヒンジの特性に影響を与え得るヒンジ中の他のアミノ酸の組成等の、ヒンジの他の特徴を制御することができ、たとえば、回転の柔軟性を増加させるためにグリシンをヒンジ内に取り込ませてもよく、又は柔軟性を減少させるためにプロリンを取り込ませてもよい。或いは、荷電又は疎水性の残基の組合せをヒンジ内に取り込ませて多量体化の特性を与えてもよく、たとえば、荷電又はイオン性テイル、たとえばリンカーとしての酸性テイルの使用にはＲｉｃｈｔｅｒら、２００１、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１４（１０）：７７５〜７８３、及びロイシンジッパー配列にはＫｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５（１）：１５４７〜１５５３を参照されたい。他の改変されたヒンジ領域は完全に合成であってよく、長さ、組成及び柔軟性などの所望の特性を保有するように設計し得る。
いくつかの改変されたヒンジ領域が、たとえば、ＵＳ５，６７７，４２５号、ＵＳ６６４２３５６号、ＷＯ９９１５５４９号、ＷＯ２００５００３１７０号、ＷＯ２００５００３１６９号、ＷＯ２００５００３１７０号、ＷＯ９８２５９７１号及びＷＯ２００５００３１７１号に既に記載されており、これらは本明細書中に参考として組み込まれている。そのようなヒンジは、一般にＣＨ１領域の後に続くが、軽鎖カッパ又はラムダ断片の定常領域の末端上に取り込まれていてもよい。たとえば表３を参照されたい。
Figure 0005931730
本発明において使用するための、単一ドメイン抗体又はｄＡｂとしても知られる単一可変ドメインは、当分野で知られている方法を使用して作製することができ、ＷＯ２００５１１８６４２号、Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４〜５４６及びＨｏｌｔら、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１、４８４〜４９０に開示されているものが含まれる。一実施形態では、本発明において使用するための単一ドメイン抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又は軽鎖ドメイン（ＶＬ）である。それぞれの軽鎖ドメインは、カッパ又はラムダ部分群のどちらかであり得る。ＶＨ及びＶＬドメインを単離する方法は当分野で記載されており、たとえば、ＥＰ０３６８６８４号及びＷａｒｄら、上記を参照されたい。そのようなドメインは、任意の適切な種又は抗体出発物質に由来し得る。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、げっ歯類、ヒト又は他の種に由来し得る。一実施形態では、単一ドメイン抗体はヒト化されている。
一実施形態では、単一ドメイン抗体は、たとえば、ＷＯ２００５／１１８６４２号、Ｊｅｓｐｅｒｓら、２００４、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２、１１６１〜１１６５及びＨｏｌｔら、２００３、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１、４８４〜４９０に記載の方法を使用して、ファージディスプレイライブラリから導く。好ましくは、そのような単一ドメイン抗体は完全にヒトであるが、他の種に由来していてもよい。一実施形態では、単一可変ドメインは、フレームワークがヒト又は実質的にヒトの起源であり、ＣＤＲ（単数又は複数）が非ヒト起源のものであるという点で、キメラである。Ｈｏｌｔら、上記に記載のように、単一ドメイン抗体の配列は、単離された後、単一ドメイン抗体の特徴、たとえば溶解度を改善させるために改変し得ることを理解されたい。
本明細書中で用いる実質的にヒトとは、元の材料の免疫原性に関連し得るヒト特徴が保持されていることをいうことを意図する。実質的にヒトの材料には、フレームワーク配列中の１つのアミノ酸が別のアミノ酸によって付加、欠失又は置き換えられているものが含まれる。
一実施形態では、ｄＡｂは、ｓｃＦｖファージディスプレイから、或いはトランスジェニックＨｕｍｏｕｓｅ（商標）若しくはＶｅｌｏｃｉｍｏｕｓｅ（商標）又はヒト化したげっ歯類から得られたヒト配列である。
一実施形態では、ｄＡｂは、ヒト若しくはヒト化したげっ歯類、ラクダ科又はサメから得られる。そのようなｄＡｂは好ましくはヒト化されたものである。一例では、単一ドメイン抗体は、ＥＰ０６５６９４６号に記載のように、ラクダ科免疫グロブリンに基づくＶＨＨドメインである。一例では、ラクダ又はラマを対象抗原で免疫化し、力価が適切となった際に血液を収集する。ｄＡｂをコードしている遺伝子を単一細胞ＰＣＲによってクローニングし得るか、又は、ｄＡｂをコードしているＢ細胞（単数又は複数）を、ＥＢＶ形質転換によって、若しくは不死化細胞系との融合によって不死化させ得る。
本明細書中で上述したように、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含み、前記断片が、直接又はリンカーを介して、第２の対象抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と融合されている、二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
したがって、一実施形態では、抗体断片、たとえばＦａｂ又はＦａｂ’断片は、重鎖又は軽鎖の可変領域のＮ末端で、直接又はリンカーを介してｄＡｂと融合されている。或いは、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片は、重鎖又は軽鎖のＣ末端で、直接又はリンカーを介してｄＡｂと融合されている。別の実施形態では、抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖及び軽鎖は、それぞれＣ末端で、直接又はリンカーを介してｄＡｂと融合されている。連結は化学的コンジュゲーションであることができるが、最も好ましくは翻訳融合、すなわち、それぞれの配列が発現ベクターによって順にコードされている遺伝子融合である。
典型的には、単一ドメイン抗体のＮ末端は、直接又はリンカーを介してＦａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖又は軽鎖のＣ末端と融合させ、単一ドメイン抗体がＦａｂ又はＦａｂ’のＮ末端と融合されている場合は、これはそのＣ末端を介して、任意選択でリンカーを介して融合される。
一実施形態では、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含む又はそれからなっており、前記断片が、重鎖又は軽鎖のＮ末端で、第２の対象抗原に対する特異性を有する単一ドメイン抗体と融合されている、二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
一実施形態では、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含む又はそれからなっており、前記断片が、重鎖又は軽鎖のＣ末端で、第２の対象抗原に対する特異性を有する単一ドメイン抗体と融合されている、二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
一実施形態では、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含む又はそれからなっており、前記断片が、重鎖又は軽鎖のＣ末端で、第２の対象抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの単一ドメイン抗体と融合されている、二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
一実施形態では、本発明は、対象抗原に対する特異性を有する抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含む又はそれからなっており、前記断片が、一方の単一ドメイン抗体がＦａｂ又はＦａｂ’断片の軽鎖のＣ末端と融合されており、他方の単一ドメイン抗体がＦａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖のＣ末端と融合されている、２つの単一ドメイン抗体と融合されており、前記単一ドメイン抗体が第２の対象抗原に対する特異性を有する、二重特異性抗体融合タンパク質を提供する。
Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖及び軽鎖がそれぞれＣ末端で単一ドメイン抗体を含む一実施形態では、２つの単一ドメイン抗体は同一である、すなわち、同じ抗原に対する同じ結合特異性を有する。一例では、これらは、同じ抗原上の同じエピトープと結合する。たとえば、単一ドメイン抗体は、どちらも同じＶＨ ｄＡｂ、同じＶＨＨ ｄＡｂ又は同じＶＬ ｄＡｂであり得る。
好ましくは、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖及び軽鎖がそれぞれＣ末端で単一ドメイン抗体を含む場合、２つの単一ドメイン抗体は、抗原と協同的に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対である、すなわち、これらは同じ結合特異性を有する相補的ＶＨ／ＶＬ対である。一例では、ＶＨ／ＶＬ対は単一特異性である。典型的には、これらは同じ抗体に由来するＶＨ／ＶＬ対である。一例では、ＶＨ／ＶＬ対は、Ｆａｂファージディスプレイライブラリなどの「対のライブラリ」から対として単離された可変ドメインの対である。
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、相補的ＶＨ／ＶＬ対である２つの単一ドメイン抗体を含み、ＶＨ単一ドメイン抗体は重鎖定常領域（ＣＨ１）のＣ末端と融合されており、ＶＬ単一ドメイン抗体は軽鎖定常領域（Ｃカッパ又はＣラムダ）のＣ末端と融合されている。本発明の二重特異性抗体融合タンパク質が相補的ＶＨ／ＶＬ対である２つの単一ドメイン抗体を含む一実施形態では、ＶＬ単一ドメイン抗体は重鎖定常領域（ＣＨ１）のＣ末端と融合されており、ＶＨ単一ドメイン抗体は軽鎖定常領域（Ｃカッパ又はＣラムダ）のＣ末端と融合されている。
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、相補的ＶＨ／ＶＬ対である２つの単一ドメイン抗体を含み、ＶＨ単一ドメイン抗体は重鎖のＮ末端と融合されており、ＶＬ単一ドメイン抗体は軽鎖のＮ末端と融合されている。本発明の二重特異性抗体融合タンパク質が相補的ＶＨ／ＶＬ対である２つの単一ドメイン抗体を含む一実施形態では、ＶＬ単一ドメイン抗体は重鎖のＮ末端と融合されており）、ＶＨ単一ドメイン抗体は軽鎖のＮ末端と融合されている。本発明の二重特異性抗体融合タンパク質が、１つ又は複数のジスルフィド結合によって連結されている２つの単一ドメイン抗体、たとえば、１つ又は複数（たとえば１又は２つ）のジスルフィド結合によって連結されている相補的ＶＨ／ＶＬ対である２つの単一ドメイン抗体を含む一実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は重鎖定常領域（ＣＨ１）のＣ末端と融合されており、ＶＬ単一ドメイン抗体は軽鎖定常領域（Ｃカッパ又はＣラムダ）のＣ末端と融合されており、前記ＶＨ／ＶＬ対間のジスルフィド結合の存在によって特徴づけられている。或いは、ＶＬ単一ドメイン抗体は重鎖定常領域（ＣＨ１）のＣ末端と融合されており、ＶＨ単一ドメイン抗体は軽鎖定常領域（Ｃカッパ又はＣラムダ）のＣ末端と融合されており、前記ＶＨ／ＶＬ対間のジスルフィド結合の存在によって特徴づけられている。
一実施形態では、ＶＨ単一ドメイン抗体は重鎖のＮ末端と融合されており、ＶＬ単一ドメイン抗体は軽鎖のＮ末端と融合されており、前記ＶＨ／ＶＬ対間のジスルフィド結合の存在によって特徴づけられている。或いは、ＶＬ単一ドメイン抗体は重鎖のＮ末端と融合されており、ＶＨ単一ドメイン抗体は軽鎖のＮ末端と融合されており、前記ＶＨ／ＶＬ対間のジスルフィド結合の存在によって特徴づけられている。
一実施形態では、本発明は、１つの対象抗原に対する第１の特異性を有するＦａｂ又はＦａｂ’断片を含み、第２の対象抗原に対する特異性を有するＶＨ／ＶＬ対をさらに含み、ＶＨ／ＶＬ対が、ＶＨ中に１つ及びＶＬ中に１つの２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されている、多価抗体融合タンパク質を提供する。
ジスルフィド結合は構築体にさらなる安定化をもたらすと考えられており、これは有利であり得る。好ましくは、ＶＨ／ＶＬ対は単一のジスルフィド結合によって連結されている。
典型的には、ＶＨ／ＶＬ対は、ＶＨ中に１つ及びＶＬ中に１つの、２つの操作されたシステイン間の単一のジスルフィド結合によって互いに連結される。
操作されたシステインを導入するための適切な位置は当分野で知られており、その一部を以下に記載する。他の適切な位置が存在し得ることを理解されたい。
一実施形態では、ジスルフィド結合は、
・ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ、たとえばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６、７８１〜７８８、Ｚｈｕら（１９９７）を参照、
・ＶＨ４４＋ＶＬ１００、たとえば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３、５４５１〜５４５９、Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４）、又はＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６９巻、第２８号、ページ１８３２７〜１８３３１、Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４）、又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１０巻、第１２号、ページ１４５３〜１４５９、Ｒａｊａｇｏｐａｌら（１９９７）を参照、
・ＶＨ４４＋ＶＬ１０５、たとえばＪ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８、８２５〜８３１、Ｌｕｏら（１９９５）を参照、
・ＶＨ４５＋ＶＬ８７、たとえばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６、７８１〜７８８、Ｚｈｕら（１９９７）を参照、
・ＶＨ５５＋ＶＬ１０１、たとえばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３７７、１３５〜１３９、Ｙｏｕｎｇら（１９９５）を参照、
・ＶＨ１００＋ＶＬ５０、たとえばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、１３６２〜１３６７、Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（１９９０）を参照、
・ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９、
・ＶＨ９８＋ＶＬ４６、たとえばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６、７８１〜７８８、Ｚｈｕら（１９９７）を参照、
・ＶＨ１０１＋ＶＬ４６又は
・ＶＨ１０５＋ＶＬ４３、たとえば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻、ページ７５３８〜７５４２、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（１９９３）、若しくはＰｒｏｔｅｉｎｓ、１９、３５〜４７、Ｊｕｎｇら（１９９４）を参照、
・ＶＨ１０６＋ＶＬ５７、たとえばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３７７、１３５〜１３９、Ｙｏｕｎｇら（１９９５）を参照
の間である（内容によりそうでないと指示されない限りは、上記リストではＫａｂａｔ付番（Ｋａｂａｔら、１９８７、免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、米国保健社会福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ、米国）を用いる）。
上述のアミノ酸対は、ジスルフィド結合が形成されることができるように、システインによる置換えを助長する位置にある。システインは、既知の技法によってこれらの位置内に操作することができる。
したがって、一実施形態では、可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、ＶＨ中に１つ及びＶＬ中に１つの、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されており、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ１００ｂ及びＶＬ４９、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０１及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。
一実施形態では、可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、ＶＨ中に１つ及びＶＬ中に１つの、ＣＤＲの外である２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されており、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。
一実施形態では、可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、ＶＨ中に１つ及びＶＬ中に１つの、ＣＤＲの外である２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されており、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。
一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されており、ＶＨのシステイン残基は位置４４であり、ＶＬのシステイン残基は位置１００である。
典型的には、システイン対はこれらの位置内に操作され、したがって、一実施形態では、可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、ＶＨ中に１つ及びＶＬ中に１つの２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されており、操作されたシステイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ１００ｂ及びＶＬ４９、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０１及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。
一実施形態では、可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、ＶＨ中に１つ及びＶＬ中に１つの、ＣＤＲの外である２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されており、操作されたシステイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。
一実施形態では、可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、ＶＨ中に１つ及びＶＬ中に１つの、ＣＤＲの外である２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されており、操作されたシステイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。
一実施形態では、可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されており、ＶＨの操作されたシステイン残基は位置４４であり、ＶＬの操作されたシステイン残基は位置１００である。
したがって、一実施形態では、本発明は、１つの対象抗原に対する第１の特異性を有するＦａｂ又はＦａｂ’断片を含み、第２の対象抗原に対する特異性を有するＶＨ／ＶＬ対である２つの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）をさらに含み、２つの単一ドメイン抗体が、ＶＨ中に１つ及びＶＬ中に１つの２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されており、システイン残基の対の位置が、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ１００ｂ及びＶＬ４９、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０１及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される、多価抗体融合タンパク質を提供する。
一実施形態では、本発明は、１つの対象抗原に対する第１の特異性を有するＦａｂ又はＦａｂ’断片を含み、第２の対象抗原に対する特異性を有するＶＨ／ＶＬ対をさらに含み、ＶＨ／ＶＬ対が、ＶＨ中に１つ及びＶＬ中に１つの２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されており、システイン残基の対の位置が、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ１００ｂ及びＶＬ４９、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０１及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される、多価抗体融合タンパク質を提供する。
１つ又は複数の実施形態では、ＣＨドメインとＣＬ又はＣＫドメインとの間などの重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合は、たとえば結合を形成する１つ又は複数のシステインが置き換えられているために存在しない。前記１つ又は複数のシステインは、たとえばセリンによって置き換えられていてよい。
１つ又は複数の実施形態では、ＣＨドメインとＣＬ又はＣＫドメインとの間の重鎖と軽鎖との間の鎖間ジスルフィド結合が存在する。
一実施形態では、１、２、３又は４つの単一ドメイン抗体、たとえば、同じ又は異なる抗原に向けられていてよい２つの別々のＶＨ／ＶＬ対を含む、Ｆ（ａｂ）２断片が提供される。
一実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質はＦｃドメインを含まない。一実施形態では、本発明の抗体融合タンパク質は、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインを含まない。
本発明の二重特異性融合タンパク質では、単一ドメイン抗体（単数又は複数）は、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の構成要素によって結合されるものとは異なる第２の抗原と結合する。
一例では、本発明において使用するためのｄＡｂは、補体経路タンパク質、ＣＤマーカータンパク質又はＦｃγＲに対する特異性を示す。この場合、ｄＡｂは好ましくはＣＤ分子に対して特異的である。最も好ましくは、ｄＡｂは、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１６及びＣＤ３５からなる群から選択されるＣＤ分子に対する特異性を示す。
好ましい例では、本発明において使用するためのｄＡｂは、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する特異性を示し、血清担体タンパク質は、好ましくは、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン又は血清アルブミンなどのヒト血清担体タンパク質である。最も好ましくは、ｄＡｂはヒト血清アルブミンに対する特異性を示す。したがって、一例では、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ又はラマを、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１（たとえばヒト血清アルブミン）で免疫化、力価が適切となった際に血液を収集する。ｄＡｂをコードしている遺伝子を単一細胞ＰＣＲによってクローニングし得るか、又は、ｄＡｂをコードしているＢ細胞（単数又は複数）を、ＥＢＶ形質転換によって、若しくは不死化細胞系との融合によって不死化させ得る。或いは、単一ドメイン抗体は、本明細書中で上述したようにファージディスプレイによって得てもよい。
一実施形態では、単一ドメイン抗体（単数又は複数）はヒト血清アルブミンと結合する。一実施形態では、単一ドメイン抗体（単数又は複数）は、ヒト血清アルブミン、マウス血清アルブミン及びラット血清アルブミンと結合する。
一実施形態では、血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＷＯ２００５／１１８６４２号（たとえば図１ｃ及び１ｄを参照）中に提供されているｄＡｂ、又はＷＯ２００４／０４１８６２号中に提供されているＶＨＨ、又はたとえばＷＯ２００６／１２２７８７号の表ＩＩＩに記載されているヒト化ナノボディである。
一実施形態では、本発明において使用するためのヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、図５（ｅ）の配列番号５６又は図５（ｋ）の配列番号６２に示す、ＣＤＲ−Ｈ１の配列を有するＣＤＲと、図５（ｆ）の配列番号５７又は図５（ｌ）の配列番号６３に示す、ＣＤＲ−Ｈ２の配列を有するＣＤＲと、図５（ｇ）の配列番号５８又は図５（ｍ）の配列番号６４に示す、ＣＤＲ−Ｈ３の配列とを有するＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む、重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体である。
別の実施形態では、本発明において使用するためのヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも２つが、配列番号５６又は配列番号６２に示す、ＣＤＲ−Ｈ１の配列、配列番号５７又は配列番号６３に示す、ＣＤＲ−Ｈ２の配列、及び配列番号５８又は配列番号６４に示す、ＣＤＲ−Ｈ３の配列から選択される、重鎖ＶＨ抗体である。たとえば、単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号５６に示す配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号５７に示す配列を有するＶＨドメインを含み得る。或いは、単一ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号５６に示す配列を有し、ＣＤＲ−Ｈ３が配列番号５８に示す配列を有するＶＨドメインを含み得る。疑念を回避するために、すべての順列が含まれることを理解されたい。
別の実施形態では、本発明において使用するためのヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＶＨドメインが配列番号５６に示す、ＣＤＲ−Ｈ１の配列と、配列番号５７に示す、ＣＤＲ−Ｈ２の配列と、配列番号５８に示す、ＣＤＲ−Ｈ３の配列とを含む、重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体である。
別の実施形態では、本発明において使用するためのヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＶＨドメインが配列番号６２に示す、ＣＤＲ−Ｈ１の配列と、配列番号６３に示す、ＣＤＲ−Ｈ２の配列と、配列番号６４に示す、ＣＤＲ−Ｈ３の配列とを含む、重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体である。
一実施形態では、本発明において使用するためのヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、図５（ａ）に示す配列（配列番号５２）を有するヒト化重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体、ｄＡｂＨ１である。Ｇ４Ｓリンカーを含む適切なＣＨ１−ｄＡｂＨ１融合体の一例を図６に示す（配列番号６８）。
一実施形態では、本発明において使用するためのヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、図５（ｃ）に示す配列（配列番号５４）を有するヒト化重鎖ＶＨ単一ドメイン抗体、ｄＡｂＨ２である。Ｇ４Ｓリンカーを含む適切なＣＨ１−ｄＡｂＨ２融合体の一例を図６に示す（配列番号６９）。
抗体可変ドメイン中の残基は、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って慣習的に付番される。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７、免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、米国保健社会福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ、米国（本明細書中以降、「Ｋａｂａｔら（上記）」）に記載されている。別段に指定した場合以外は、この付番システムを本明細書において使用する。
Ｋａｂａｔ残基の指定は、必ずしもアミノ酸残基の直線的付番と直接対応するわけではない。実際の直線的アミノ酸配列は、厳密なＫａｂａｔ付番よりも少ない又はそれに追加のアミノ酸を含有していてよく、これは、基本的可変ドメイン構造の、フレームワークであるか相補性決定領域（ＣＤＲ）であるかにかかわらない構造的構成要素の短縮又はそれ内への挿入に対応する。残基の正しいＫａｂａｔ付番は、所与の抗体について、抗体の配列中の相同残基を「標準の」Ｋａｂａｔ付番配列とアラインメントすることによって決定し得る。
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番システムに従って、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置している。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６、９０１〜９１７（１９８７））によれば、ＣＤＲ−Ｈ１に等価なループが残基２６から残基３２まで延びる。したがって、本明細書中で使用する「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ付番システム及びＣｈｏｔｈｉａの位相的ループ定義の組合せによって記載されているように、残基２６〜３５を含む。
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番システムに従って、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置している。
一実施形態では、本発明において使用するためのヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、図５（ｈ）の配列番号５９又は図５（ｎ）の配列番号６５に示す、ＣＤＲ−Ｌ１の配列を有するＣＤＲ、図５（ｉ）の配列番号６０又は図５（ｏ）の配列番号６６に示す、ＣＤＲ−Ｌ２の配列を有するＣＤＲ、及び図５（ｊ）の配列番号６１又は図５（ｐ）の配列番号６７に示す、ＣＤＲ−Ｌ３の配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む、軽鎖ＶＬ単一ドメイン抗体である。
別の実施形態では、本発明において使用するためのヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＶＬドメインのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つが、配列番号５９又は配列番号６５に示す、ＣＤＲ−Ｌ１の配列、配列番号６０又は配列番号６６に示す、ＣＤＲ−Ｌ２の配列、及び配列番号６１又は配列番号６７に示す、ＣＤＲ−Ｌ３の配列から選択される、軽鎖ＶＬ抗体である。たとえば、ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号５９に示す配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号６０に示す配列を有するＶＬドメインを含み得る。或いは、ドメイン抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号５９に示す配列を有し、ＣＤＲ−Ｌ３が配列番号６１に示す配列を有するＶＬドメインを含み得る。疑念を回避するために、すべての順列が含まれることを理解されたい。
別の実施形態では、本発明において使用するためのヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＶＬドメインが、配列番号５９に示す、ＣＤＲ−Ｌ１の配列と、配列番号６０に示すＣＤＲ−Ｌ２の配列と、配列番号６１に示すＣＤＲ−Ｌ３の配列とを含む、軽鎖ＶＬドメイン抗体である。
別の実施形態では、本発明において使用するためのヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、ＶＬドメインが、配列番号６５に示す、ＣＤＲ−Ｌ１の配列と、配列番号６６に示す、ＣＤＲ−Ｌ２の配列と、配列番号６７に示す、ＣＤＲ−Ｌ３の配列とを含む、軽鎖ＶＬドメイン抗体である。
一実施形態では、本発明において使用するためのヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、図５（ｂ）に示す配列（配列番号５３）を有するヒト化軽鎖ＶＬ単一ドメイン抗体、ｄＡｂＬ１である。どちらもＧ４Ｓリンカーを含む適切なＣＨ１−ｄＡｂＬ１融合体及びＣｋ１−ｄＡｂＬ１融合体の一例を図６に示す（配列番号７０及び配列番号７２）。
一実施形態では、本発明において使用するためのヒト血清アルブミンと結合する単一ドメイン抗体は、図５（ｄ）に示す配列（配列番号５５）を有するヒト化軽鎖ＶＬ単一ドメイン抗体、ｄＡｂＬ２である。どちらもＧ４Ｓリンカーを含む適切なＣＨ１−ｄＡｂＬ２融合体及びＣｋ１−ｄＡｂＬ２融合体の一例を図６に示す（配列番号７１及び配列番号７３）。
Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖及び軽鎖がそれぞれＣ末端で単一ドメイン抗体を含み、２つの単一ドメイン抗体は、本明細書中で上述したように抗原と協同的に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対である一実施形態では、ＶＨ ｄＡｂはｄＡｂＨ１（配列番号５２）であり、ＶＬ ｄＡｂはｄＡｂＬ１（配列番号５３）である。
Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖及び軽鎖がそれぞれＣ末端で単一ドメイン抗体を含む一実施形態では、２つの単一ドメイン抗体は、本明細書中で上述したように抗原と協同的に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対であり、ＶＨ ｄＡｂはｄＡｂＨ２（配列番号５４）であり、ＶＬ ｄＡｂはｄＡｂＬ２（配列番号５５）である。
Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖及び軽鎖がそれぞれＣ末端で単一ドメイン抗体を含み、２つの単一ドメイン抗体が本明細書中で上述したように抗原と協同的に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対である一実施形態では、ＶＨ ｄＡｂは配列番号２０２に示す配列を有し、ＶＬ ｄＡｂは配列番号２０３に示す配列を有する。
Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖及び軽鎖がそれぞれＣ末端で単一ドメイン抗体を含む一実施形態では、２つの単一ドメイン抗体が本明細書中で上述したように抗原と協同的に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対であり、ＶＨ ｄＡｂは配列番号２０４に示す配列を有し、ＶＬ ｄＡｂは配列番号２０５に示す配列を有する。
Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖及び軽鎖がそれぞれＮ末端で単一ドメイン抗体を含み、２つの単一ドメイン抗体が本明細書中で上述したように抗原と協同的に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対である一実施形態では、ＶＨ ｄＡｂは配列番号２０２に示す配列を有し、ＶＬ ｄＡｂは配列番号２０３に示す配列を有する。
Ｆａｂ又はＦａｂ’断片の重鎖及び軽鎖がそれぞれＮ末端で単一ドメイン抗体を含む一実施形態では、２つの単一ドメイン抗体が本明細書中で上述したように抗原と協同的に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対であり、ＶＨ ｄＡｂは配列番号２０４に示す配列を有し、ＶＬ ｄＡｂは配列番号２０５に示す配列を有する。
別の態様では、本発明は、本明細書中上記、及び図５（ｅ〜ｐ）中に提供するＣＤＲのうちの１つ又は複数を含有する、具体的には、配列番号５６に示す配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号５７に示す配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号５８に示す配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号５９に示す配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号６０に示す配列を有するＣＤＲＬ２、及び／又は配列番号６１に示す配列を有するＣＤＲＬ３を含む、アルブミン結合抗体又はその断片を提供する。一実施形態では、アルブミン結合抗体又は断片は、配列番号６２に示す配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号６３に示す配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号６４に示す配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号６５に示す配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号６６に示す配列を有するＣＤＲＬ２、及び／又は配列番号６７に示す配列を有するＣＤＲＬ３を含む。前記ＣＤＲは、任意の適切な抗体フレームワーク内及び任意の適切な抗体様式内に取り込ませ得る。そのような抗体には、それだけには限定されないが、モノクローナル、ヒト化、完全ヒト又はキメラ抗体であり得る、完全抗体及び機能的に活性のある断片又はその誘導体が含まれる。したがって、そのようなアルブミン結合抗体は、完全長の重鎖及び軽鎖又はその断片を有する完全抗体分子を含んでいてよく、それだけには限定されないが、Ｆａｂ、改変されたＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、ジアボディー、トリアボディー、トリボディー、テトラボディー、及び上記のうちの任意のもののエピトープ結合断片であり得る（たとえば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３（９）：１１２６〜１１３６、Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ、２（３）、２０９〜２１７を参照）。これらの抗体断片を作製及び製造する方法は当分野で周知である（たとえばＶｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１を参照）。多価抗体は、複数の特異性を含み得るか、又は単一特異性であり得る（たとえばＷＯ９２／２２８５３号及びＷＯ０５／１１３６０５号を参照）。本発明のこの態様は、これらのアルブミン結合抗体の変異体までも拡張されることを理解されたい。
そのようなアルブミン結合抗体、具体的には単一ドメイン抗体は、所望に応じて又は任意の他の適切なコンテキストで使用されるように、任意の他の抗体若しくはタンパク質又は他の分子とコンジュゲートさせ得ることを理解されたい。一例では、上述し、且つ図５（ａ〜ｄ）及び図２４に示した単一ドメイン抗体、ｄＡｂＨ１、ｄＡｂＬ１、ｄＡｂＨ２、ｄＡｂＬ２は、任意の適切な抗体様式内に取り込ませ得る、又は、任意の適切なコンテキストにおいて、融合体若しくはコンジュゲートなどとして、単一ドメイン抗体として使用し得る。
一実施形態では、本発明のこの態様の抗体は、図５（ｅ）に示す、ＣＤＲ−Ｈ１の配列と、図５（ｆ）に示す、ＣＤＲ−Ｈ２の配列と、図５（ｇ）に示す、ＣＤＲ−Ｈ３の配列とを含む。
一実施形態では、本発明のこの態様の抗体は、図５（ｋ）に示す、ＣＤＲ−Ｈ１の配列と、図５（ｌ）に示す、ＣＤＲ−Ｈ２の配列と、図５（ｍ）に示す、ＣＤＲ−Ｈ３の配列とを含む。
一実施形態では、本発明のこの態様の抗体は、図５（ｈ）に示す、ＣＤＲ−Ｌ１の配列と、図５（ｉ）に示す、ＣＤＲ−Ｌ２の配列と、図５（ｊ）に示す、ＣＤＲ−Ｌ３の配列とを含む。
一実施形態では、本発明のこの態様の抗体は、図５（ｎ）に示す、ＣＤＲ−Ｌ１の配列と、図５（ｏ）に示す、ＣＤＲ−Ｌ２の配列と、図５（ｐ）に示す、ＣＤＲ−Ｌ３の配列とを含む。
一実施形態では、本発明は、図５（ａ）〜（ｄ）又は図２４に示す配列を有するＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含むＦｖ又はｓｃＦｖを提供する。一実施形態では、Ｆｖ又はｓｃＦｖは、配列番号２０２に示す配列を有するＶＨ及び配列番号２０３に示す配列を有するＶＨを含む。一実施形態では、Ｆｖ又はｓｃＦｖは、配列番号２０４に示す配列を有するＶＨ及び配列番号２０５に示す配列を有するＶＬを含む。
一実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬはＶＨＶＬの配向である（ＮからＣ末端）。一実施形態では、ＶＨ及びＶＬはＶＬＶＨの配向である（ＮからＣ末端）。
上述のように、ｓｃＦｖ又はＦｖ断片は、任意の適切な抗体様式内にさらに取り込ませ得る。たとえば、これらを１つ又は複数の他の抗体断片と融合又はコンジュゲートさせ得る。
以下の抗体様式では、本明細書中の配列表からの配列のそれぞれは、天然の位置又は天然でない位置に対応する位置に配置されていてもよい。天然の位置は、ＣＤＲＨ１の位置Ｈ１と表示したリスト中の関連する配列、ＣＤＲＨ２の位置Ｈ２と表示したリスト中の関連する配列、ＣＤＲＨ３の位置Ｈ３と表示したリスト中の関連する配列、ＣＤＲＬ１の位置Ｌ１と表示したリスト中の関連する配列、ＣＤＲＬ２の位置Ｌ２と表示したリスト中の関連する配列、及びＣＤＲＬ３の位置Ｌ３と表示したリスト中の関連する配列のものである。また、Ｈ１及びＨ２、Ｈ１及びＨ３、Ｈ１及びＬ１、Ｈ１及びＬ２、Ｈ１及びＬ３、Ｈ２及びＬ１、Ｈ２及びＬ２、Ｈ２及びＬ３、Ｈ２及びＨ３、Ｈ３及びＬ１、Ｈ３及びＬ２、Ｈ３及びＬ３、Ｈ１及びＨ２及びＨ３、Ｈ１及びＨ２及びＬ１、Ｈ１及びＨ２及びＬ２、Ｈ１及びＨ２及びＬ３、Ｈ２及びＨ３及びＬ１、Ｈ２及びＨ３及びＬ２、Ｈ２及びＨ３及びＬ３、Ｈ３及びＬ１及びＬ２、Ｈ３及びＬ１及びＬ３、Ｈ３及びＬ２及びＬ３、Ｌ１及びＬ２及びＬ３、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ１、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ２、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ３、Ｈ２及びＨ３及びＬ１及びＬ２、Ｈ２及びＨ３及びＬ１及びＬ３、及びＨ２及びＨ３及びＬ２及びＬ３、Ｈ３及びＬ１及びＬ２及びＬ３、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ１及びＬ２、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ２及びＬ３、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ１及びＬ３、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＨ１及びＨ２、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＨ１及びＨ３、Ｌ１及びＬ２及びＬ３及びＨ２及びＨ３、Ｈ１及びＨ２及びＨ３及びＬ１及びＬ２及びＬ３などの、その組合せも想定される。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２２２、２２３、９０〜９３から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号９４〜９９から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１００〜１０５から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１０６〜１１１から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１１２〜１１７から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１１８〜１２３から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１２４〜１２９から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１３０〜１３５から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１３６〜１４１から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１４２〜１４７から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１４８〜１５３から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１５４〜１５９から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１６０〜１６５から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１６６〜１７１から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１７２〜１７７から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１７８〜１８３から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１８４〜１８９から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１９０〜１９５から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号１９６〜２０１から選択される１、２、３、４、５又は６個の配列などの配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０２を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０３を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０２及び２０３を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０４を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０５を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０４及び２０５を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０６を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０７を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、配列番号２０６及び２０７を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、位置８４のＡがＤによって置換されている、配列番号２０２に示す配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗体融合タンパク質は、位置８４のＡがＤによって置換されている、配列番号２０４に示す配列を含む。
本発明の二重特異性融合タンパク質の単一ドメイン抗体（単数又は複数）がアルブミンと結合する場合、アルブミンに対する単一ドメイン抗体の結合親和性は、Ｆａｂ又はＦａｂ’のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長させるために十分である。２．５μＭ以下の親和性であるアルブミンに対する親和性がｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長させることが報告されている（Ｎｇｕｙｅｎ，Ａ．ら（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、１９（７）、２９１〜２９７）。本発明の単一ドメイン抗体分子は、好ましくは、それらの目的及びそれらが結合する抗原に適した結合親和性を有する。一例では、単一ドメイン抗体は、高い、たとえばピコモーラーの結合親和性を有する。一例では、単一ドメイン抗体は、ナノモーラー又はマイクロモーラーである抗原に対する結合親和性を有する。親和性は、天然又は組換えの抗原を使用した、本明細書中の実施例中に記載されているＢＩＡｃｏｒｅを含めた、当分野で知られている任意の適切な方法を使用して測定し得る。
好ましくは、アルブミンと結合する本発明の単一ドメイン抗体分子は、約２μＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体分子は、約１μＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体分子は、約５００ｎＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体分子は、約２００ｎＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明のドメイン抗体分子は、約１ｎＭ以上の結合親和性を有する。本発明によって提供される、及び当分野で知られている単一ドメイン抗体の親和性は、当分野で知られている任意の適切な方法を使用して変更し得ることを理解されたい。したがって、本発明は、アルブミンに対して改善された親和性を有する、本発明のドメイン抗体分子の変異体にも関する。そのような変異体は、ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４、３９２〜４０３、１９９５）、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３、１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０、３５９〜３６８、１９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８、７２４〜７３３、１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６、７７〜８８、１９９６）及び性的（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、２８８〜２９１、１９９８）を含めたいくつかの親和性成熟プロトコルによって得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上記）が、これらの親和性成熟の方法を記述している。
二重特異性融合タンパク質の単一ドメイン抗体（単数又は複数）は、所要に応じて単量体、二量体又は三量体として提供し得る。所望の生成物は、材料を供する下流の処理ステップを調節することによって得られ得る。一実施形態では、処理された材料は実質的に均質な単量体として提供される。一実施形態では、処理された材料は実質的に均質な二量体として提供される。一実施形態では、処理された材料は実質的に均質な三量体として提供される。
また、本発明は、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードしている単離したＤＮＡ配列も提供する。本発明のＤＮＡ配列は、たとえば化学的プロセッシング、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はその任意の組合せによって生成された合成ＤＮＡを含み得る。
本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、当業者に周知の方法によって得ることができる。たとえば、抗体断片、リンカー及び／又はｄＡｂの一部又は全体をコードしているＤＮＡ配列を、決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて、所望に応じて合成し得る。
標準の分子生物学の技法を使用して、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を調製し得る。オリゴヌクレオチド合成技法を使用して、所望のＤＮＡ配列を完全に又は部分的に合成し得る。必要に応じて部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用し得る。
本発明はさらに、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターに関する。したがって、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードしている１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターが提供される。好ましい一実施形態では、クローニング又は発現ベクターは、二重特異性抗体融合タンパク質全体をコードしている単一のＤＮＡ配列を含む。したがって、クローニング又は発現ベクターは、ＤＮＡにコードされた転写単位を、翻訳融合タンパク質が産生されるような順序で含む。
実際、当業者には、本発明の融合タンパク質はＮ末端又はＣ末端にｄＡｂを有することができ、したがって、ｄＡｂのＤＮＡにコードされた転写単位は、翻訳融合体をコードしているＤＮＡ配列内でそれぞれ最初又は最後となることを理解されよう。したがって、翻訳融合体は、Ｎ末端のｄＡｂ及びＣ末端のＦａｂ又はＦａｂ’を含み得る。さらに、翻訳融合体は、Ｎ末端のＦａｂ又はＦａｂ’及びＣ末端のｄＡｂを含み得る。
Ｆａｂ又はＦａｂ’の重鎖及び軽鎖を同じ又は異なるベクター内に取り込ませ得ることを理解されたい。一実施形態では、１つのベクターがＦａｂ又はＦａｂ’の重鎖及びＣ末端のｄＡｂを含む翻訳融合体を含んでいてよく、別のベクターがＦａｂ又はＦａｂ’の軽鎖及びＣ末端のｄＡｂを含む翻訳融合体を含んでいてよい。
たとえば、抗体断片のＮ末端にｄＡｂ部分を有する二重特異性抗体融合タンパク質を産生することが所望される場合、ベクターは、ＤＮＡ転写単位を、ｄＡｂ部分をコードしているＤＮＡ転写単位、任意選択でリンカー配列をコードしているＤＮＡ転写単位、及び抗体断片をコードしているＤＮＡ転写単位の順に含む。抗体断片のＣ末端にｄＡｂ部分を有する二重特異性抗体融合タンパク質を産生することが所望される場合、ベクターは、ＤＮＡ転写単位を、抗体断片をコードしているＤＮＡ転写単位、任意選択でリンカー配列をコードしているＤＮＡ転写単位、及び血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１、たとえばヒト血清アルブミンに対する特異性を有する、ｄＡｂ部分をコードしているＤＮＡ転写単位の順に含む。したがって、本発明の翻訳融合体は、たとえば、それだけには限定されないが、ｄＡｂ−リンカー−Ｆａｂ、Ｆａｂ−リンカー−ｄＡｂ、ｄＡｂ−Ｆａｂ、Ｆａｂ−ｄＡｂ、Ｆａｂ’−ｄＡｂ、ｄＡｂ−Ｆａｂ’、ｄＡｂ−リンカーＦａｂ’、Ｆａｂ’−リンカー−ｄＡｂを含めた、様々な立体配置であることができる。２つのベクターを使用する場合は、たとえば、第１のベクターはｄＡｂと融合されているＦａｂ又はＦａｂ’の重鎖を含んでいてよく、第２のベクターはｄＡｂと融合されているＦａｂ又はＦａｂ’の軽鎖を含んでいてよい。
本発明の翻訳融合体内に含まれる抗体断片のＤＮＡコードは、ベクター内に転写単位として当業者に知られている立体配置で取り込ませることができ、たとえば、転写単位は、軽鎖のコード、次いで重鎖のコード、又はその逆を含むことができる。具体的には、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２６：３０９〜３２０を参照されたい。
好ましくは、本発明によるベクターは、抗体リーダー配列などの適切なリーダー配列を含む。そのようなリーダー配列は当分野で周知である。
ベクターを構築し得る一般的な方法、形質移入及び形質転換の方法、並びに培養方法は、当業者に周知である。これに関しては、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって出版されたＭａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌを参照されたい。
また、１つ又は複数の本発明の二重特異性抗体融合タンパク質をコードしている１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、二重特異性抗体融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列の発現に使用し得る。細菌、たとえば大腸菌及び他の微生物系を使用し得るか、又は真核、たとえば哺乳動物の宿主細胞発現系も使用し得る。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＮＳ０、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が含まれる。したがって、一実施形態では、本発明の融合タンパク質は大腸菌中で発現させる。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は哺乳動物細胞中で発現させる。
また、本発明は、二重特異性抗体融合タンパク質を産生する方法であって、本発明のベクターを含む宿主細胞を、前記二重特異性抗体融合タンパク質をコードしているＤＮＡ配列からのタンパク質の発現に適した条件下で培養することを含む方法も提供する。本発明は、二重特異性抗体融合タンパク質を単離する方法をさらに提供する。
産生時に、必要な場合は、本発明の二重特異性抗体融合タンパク質を、当分野で知られている任意の適切な方法を使用して精製し得る。たとえば、それだけには限定されないが、イオン交換、サイズ排除、タンパク質Ｇ又は疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技法を使用し得る。
二重特異性抗体融合タンパク質の大きさは、サイズ排除クロマトグラフィー及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの、当分野で知られている慣用の方法によって確認し得る。そのような技法は、たとえば、タンパク質が二量体化していないこと及び／又はその一部分、たとえばｄＡｂ部分が失われていないことを確認するために使用することができる。二量体が検出され、均質な単量体の生成物が必要な場合は、単量体の二重特異性抗体融合タンパク質を、上述のように慣用のクロマトグラフィー技法を使用して、二量体種から精製して取り出し得る。
本発明の二重特異性抗体融合タンパク質は、炎症性疾患及び障害、免疫疾患及び障害、線維性障害並びに癌を含めた疾患及び障害の処置において有用である。
用語「炎症性疾患」又は「障害」及び「免疫疾患又は障害」には、関節リウマチ、乾癬性関節炎、スチル病、マックルウェルズ病、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、Ｉ型真性糖尿病、移植及び移植片対宿主病が含まれる。
用語「線維性障害」には、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、全身性硬化症（又は強皮症）、腎臓線維症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、高血圧、末期腎臓病、腹膜線維症（持続的携行式腹膜透析）、肝硬変、加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、網膜症、心反応性線維症、瘢痕、ケロイド、熱傷、皮膚潰瘍、血管形成術、冠血管バイパス手術、関節形成術及び白内障手術が含まれる。
用語「癌」には、皮膚中、又はより一般的には身体の臓器、たとえば、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱若しくは腸の内壁に見つかる、上皮から生じる悪性の新成長が含まれる。癌は、隣接組織に浸潤し、遠位臓器、たとえば、骨、肝臓、肺又は脳へと拡大（転移）する傾向がある。
したがって、本発明のさらなる態様によれば、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と会合した本発明の抗体融合体を含む医薬組成物が提供される。また、疾患又は障害を処置する医薬品を製造するための、本発明の抗体融合タンパク質の使用も提供される。最も好ましくは、疾患又は障害は炎症性疾患又は障害である。
本発明による医薬組成物は、経口、頬側、非経口、皮下、経鼻、局所、眼若しくは直腸の投与に適した形態、又は吸入若しくはガス注入による投与に適した形態をとり得る。
適切な場合は、たとえば抗体融合タンパク質の単一ドメイン抗体（単数又は複数）がアルブミンと結合する場合は、二重特異性融合タンパク質を、ヒト又は組換え血清アルブミンを用いて、当分野で知られている任意の適切な方法を使用して事前に配合することが望ましい場合がある。
医薬配合物が液体、たとえば溶液又は懸濁液である場合は、配合物は、アルブミン、たとえばヒト血清アルブミン、具体的には組換えヒト血清アルブミンなどの組換えアルブミンをさらに含み得る。適切な量は、全配合物の２％ｗ／ｗ未満、具体的には１、０．５、又は０．１％ｗ／ｗ未満の範囲であり得る。これは、配合物中の抗体構成要素の安定化を支援し得る。医薬組成物は、後に水性溶媒を用いて再構成するために凍結乾燥し得る。
一実施形態では、本発明による凍結乾燥した「抗体」を含む、バイアルなどの単位用量容器が提供される。
経口投与には、医薬組成物は、たとえば、慣用の手段によって、結合剤（たとえば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（たとえば、ラクトース、結晶セルロース若しくはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク若しくはシリカ）、崩壊剤（たとえば、ジャガイモデンプン若しくはグリコール酸（ｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）ナトリウム）、又は湿潤剤（たとえばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて調製した、錠剤、ロゼンジ又はカプセルの形態をとり得る。錠剤は、当分野で周知の方法によってコーティングし得る。経口投与のための液体調製物は、たとえば、液剤、シロップ若しくは懸濁液の形態をとり得るか、又は、使用前に水若しくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として提供し得る。そのような液体調製物は、慣用の手段によって、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル又は保存料などの薬学的に許容される添加剤を用いて調製し得る。また、調製物は、必要に応じて、緩衝塩、香味料、着色剤又は甘味剤も含有し得る。
経口投与のための調製物は、活性化合物の徐放性を与えるために適切に配合し得る。
頬側投与には、組成物は、慣用の様式で配合した錠剤又はロゼンジの形態をとり得る。
本発明の二重特異性抗体は、たとえばボーラス注射又は輸液による、注射による非経口投与のために配合し得る。注射用の配合物は、単位剤形で、たとえばガラスアンプル又は複数用量容器、たとえばガラスバイアル中で提供し得る。注射用の組成物は油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液などの形態をとってよく、懸濁剤、安定化剤、保存料及び／又は分散剤などの配合剤を含有し得る。或いは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、たとえば無菌的な発熱物質非含有水で構成するための粉末形態であり得る。
上述の配合物に加えて、本発明の二重特異性抗体はデポー調製物としても配合し得る。そのような長時間作用性配合物は、植込み又は筋肉内注射によって投与し得る。
経鼻投与又は吸入による投与には、本発明による化合物は、加圧パック又は噴霧器のためのエアロゾルスプレー提示の形態で、適切な噴霧剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、フルオロトリクロロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガス若しくはガスの混合物を使用して、好都合に送達し得る。
所望する場合は、組成物は、活性成分を含有する１つ又は複数の単位剤形を含有し得るパック又は分注装置中で提示し得る。パック又は分注装置には、投与のための指示が添付されていてもよい。
局所投与には、本発明による化合物は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体中に懸濁又は溶解させた活性構成要素を含有する適切な軟膏中で好都合に配合し得る。具体的な担体には、たとえば、鉱物油、液体石油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、乳化ワックス及び水が含まれる。或いは、本発明による化合物は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体に懸濁又は溶解させた活性構成要素を含有する適切なローション中で適切に配合し得る。具体的な担体には、たとえば、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、ベンジルアルコール、２−オクチルドデカノール及び水が含まれる。
一実施形態では、配合物は、吸入を含めた局所投与のための配合物として提供される。
適切な吸入用調製物には、吸入用粉末、噴霧用ガスを含有する計量エアロゾル又は噴霧用ガスを含まない吸入用溶液が含まれる。活性物質を含有する、本開示による吸入用粉末は、上述の活性物質のみから、又は上述の活性物質と生理的に許容される賦形剤との混合物からなり得る。
これらの吸入用粉末には、単糖（たとえば、グルコース若しくはアラビノース）、二糖（たとえば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（たとえばデキストラン）、ポリアルコール（たとえば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（たとえば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらの互いとの混合物が含まれ得る。単糖又は二糖、すなわち、ラクトース又はグルコースの、排他的ではないが特にその水和物の形態の使用が適切に使用される。
肺中に堆積させるための粒子は、１０ミクロン未満、たとえば１〜９ミクロン、たとえば０．１〜５μｍ、具体的には１〜５μｍの粒子径を必要とする。活性成分（抗体又は断片など）の粒子径は非常に重要である。
吸入用エアロゾルを調製するために使用することができる噴霧用ガスは、当分野で知られている。適切な噴霧用ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンなどの炭化水素並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンなどの塩素化及び／又はフッ素誘導体等のハロ炭化水素から、とりわけ選択される。上述の噴霧用ガスは、それ自体で又はその混合物中で使用し得る。
特に適した噴霧用ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７からとりわけ選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにその混合物が特に適している。
また、噴霧用ガスを含有する吸入用エアロゾルは、共溶媒、安定化剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤及びｐＨを調節する手段などの、他の成分も含有し得る。これらの成分はすべて当分野で知られている。
本発明による噴霧用ガスを含有する吸入用エアロゾルは、５重量％までの活性物質を含有し得る。本発明によるエアロゾルは、たとえば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％又は０．５〜１重量％の活性成分を含有する。
或いは、肺への局所投与は、たとえば、噴霧器、たとえばコンプレッサーに接続された噴霧器（たとえば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、バージニア州Ｒｉｃｈｍｏｎｄによって製造された、Ｐａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）コンプレッサーに接続されたＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）などの装置を用いた、液体の溶液又は懸濁液の配合物の投与によるものであり得る。
本発明の抗体様式は、溶媒中に分散させて、たとえば、溶液又は懸濁液の形態で送達することができる。これは、適切な生理溶液、たとえば、生理食塩水又は他の薬理学的に許容される溶媒若しくは緩衝溶液中に懸濁させることができる。当分野で知られている緩衝溶液は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するために、１ｍｌの水あたり、０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有し得る。懸濁液では、たとえば凍結乾燥した抗体を用いることができる。
また、治療用の懸濁液又は溶液の配合物は、１つ又は複数の賦形剤も含有することができる。賦形剤は当分野で周知であり、緩衝液（たとえば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び炭酸水素緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（たとえば血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、並びにグリセロールが含まれる。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェア中にカプセル封入することができる。配合物は、一般に、無菌的な製造プロセスを用いて実質的に無菌的な形態で提供される。
これには、当業者が精通した方法による、配合物に使用する緩衝溶媒／溶液の生成及び濾過による滅菌、無菌的緩衝溶媒溶液中への抗体の無菌的懸濁、並びに無菌的容器内への配合物の分注が含まれ得る。
本開示による噴霧用配合物は、たとえば、箔の包みで梱包した単一用量単位（たとえば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供し得る。それぞれのバイアルは、一定体積、たとえば２ｍｌの溶媒／溶液緩衝液中に１つの単位用量を含有する。
本開示の抗体様式は、噴霧化を介した送達に適していると考えられている。
眼の投与には、本発明による化合物は、殺菌剤又は殺真菌剤、たとえば、硝酸フェニル水銀、塩化ベンジルアルコニウム又は酢酸クロルヘキシジンなどの保存料を用いて又は用いない、等張なｐＨ調節した無菌的な生理食塩水中の微小イオン化された懸濁液として、好都合に配合し得る。或いは、眼への投与には、化合物はペトロラタムなどの軟膏中で配合し得る。
直腸投与には、本発明による化合物は、坐薬として好都合に配合し得る。これらは、活性構成要素を、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸内で融けて活性構成要素を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって、調製することができる。そのような材料には、たとえば、カカオ脂、蜜蝋及びポリエチレングリコールが含まれる。
特定の状態の予防又は処置に必要な本発明の化合物の量は、選択した化合物及び処置する患者の状態に応じて変動する。しかし、一般に、１日用量は、経口又は頬側の投与には、体重１ｋｇあたり約１０ｎｇ〜１０００ｍｇ、典型的には１００ｎｇ〜１００ｍｇ、たとえば約０．０１ｍｇ〜４０ｍｇ、非経口投与には体重１ｋｇあたり約１０ｎｇ〜５０ｍｇ、経鼻投与又は吸入若しくはガス注入による投与には、約０．０５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、たとえば約０．５ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲であり得る。
本発明のそれぞれの実施形態の好ましい特長は、必要な変更を加えて、他の実施形態のそれぞれと同様である。それだけには限定されないが本明細書中で引用された特許及び特許出願を含めたすべての出版物は、それぞれの個々の出版物が具体的且つ個々に本明細書中に参考として組み込まれていると示されていると記載されたごとく、本明細書中に参考として組み込まれている。
本明細書のコンテキストにおける含むとは、含まれることを意味することを意図する。
技術的に適切な場合は、本発明の実施形態を組み合わせ得る。
実施形態は、特定の特長／要素を含むものとして本明細書中に記載されている。また、本開示は、前記特長／要素からなる、又はから本質的になる個別の実施形態までにも拡張される。
以下、本発明を以下の実施例を参照して記載するが、これらは単なる例示であり、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
ｄＡｂがＣ末端にあるＦａｂ−ｄＡｂの図表示である。 Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂの図表示である。 ｄＡｂ間に追加のジスルフィド安定化を有するＦａｂ−ｄｉｄＡｂの図表示である。 ＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）（１）及びＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］２）（２）のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。 ＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）（１）及びＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］２）（２）のウエスタンブロット分析を示す図である。 ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す図である。 レーンＭ＝ＳｅｅＢｌｕｅマーカー レーン１及び２＝ＩｇＧ対照 レーン３＝ＦａｂＢ レーン４＝ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２） レーン５＝ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２） ドメイン抗体ｄＡｂＨ１、ｄＡｂＨ２、ｄＡｂＬ１及びｄＡｂＬ２並びにこれらの抗体のそれぞれに由来するＣＤＲの配列を示す図である。 ドメイン抗体と融合されているＦａｂＢの重鎖又は軽鎖可変ドメインを含むＦａｂＢ−ｄＡｂ構築体を示す図である。 Ｆａｂ’Ａ重鎖及び軽鎖の配列及びＦａｂＡ重鎖の配列を示す図である。 様々なマウスｄＡｂにおけるＣＤＲのアミノ酸配列を示す図である。図８ａ、８ｂ及び８ｃは、マウス化Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂのアミノ酸配列を示す。 ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である。図８ａ、８ｂ及び８ｃは、マウス化Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂのアミノ酸配列を示す。 ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２） ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２） ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及び ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２） ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂのアミノ酸配列を示す図である。図８ａ、８ｂ及び８ｃは、マウス化Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂのアミノ酸配列を示す。 ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及び ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）ｍＦａｂＣ−ｍｄＡｂＨ１ ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及び ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２ ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂのＳＤＳ ＰＡＧＥを示す図である： レーン１及び４はＦａｂ’Ｂであり、 レーン２及び５は、ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及び−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）であり、 レーン３及び６は、ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及び−ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）である。 Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ熱安定性アッセイを示す図表示である。 活性化したマウスＴ細胞と結合した、ＨＡＳ−ＦＩＴＣシグナル／ＨＡＳ−ＦＩＴＣ混合物のプロットを示す図である。 凝集安定性アッセイのプロットを示す図である。 皮下及び静脈内投薬後の経時的なｉｎ ｖｉｖｏ濃度プロフィールを示す図である。 特定のＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の読取値を示す図である。 特定のＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の読取値を示す図である。 特定のＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の読取値を示す図である。 ＦａｂＢ−６４５ＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 ＦａｂＢ−６４５Ｆｖのサイズ排除分析を示す図である。 様々なリンカー長を有するＦａｂＢ−６４５Ｆｖの温度記録を示す図である。 特定のＦａｂＢ構築体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 様々なＦａｂＢ−６４５Ｆｖ構築体のサイズ排除分析を示す図である。 特定の様式の配列を示す図である。 特定の様式の配列を示す図である。 特定の様式の配列を示す図である。 特定の様式の配列を示す図である。 特定の様式の配列を示す図である。 ＶＨ／ＶＬ対がＦａｂのＣ末端に位置しており、ジスルフィド安定化されている、構築体Ｆａｂ−６４５ｄｓＦＶのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。 図２５の構築体のサイズ排除分析を示す図である。 本開示による構築体のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ分析を示す図である。 Ｔｍ対ｐＨのプロットを示す図である。 ヒトＰＣＭＢ上でのヒトＯＸ４０リガンド結合の阻害に基づいた、本開示による構築体のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを示す図である。 本開示による構築体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性、具体的にはＣＤ４＋及びＣＤ８＋、血液に対する効果を示す図である。 本開示による構築体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性、具体的にはＣＤ４＋及びＣＤ８＋、腹膜に対する効果を示す図である。 本開示による構築体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性、具体的にはＣＤ４＋及びＣＤ８＋、脾臓細胞に対する効果を示す図である。 本開示による構築体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性、具体的にはＣＤ４＋及びＣＤ８＋、脾臓細胞に対する効果を示す図である。 本開示による特定の様式の配列を示す図である。 本開示による特定の様式の配列を示す図である。 本開示による特定の様式の配列を示す図である。 本開示による特定の様式の配列を示す図である。 特定の構築体の発現データを示す図である。 特定の構築体の結合データを示す図である。 特定の構築体の結合データを示す図である。 特定の構築体の結合データを示す図である。
キー
−６４５Ｆｖは、ｄｉｄＡｂＬ１及びＨ１と同等とみなす（別段に指摘しない限りは、それぞれのｄＡＢに使用するリンカーは同じである）。
６４８Ｆｖは、ｄｉｄＡｂＬ２及びＨ２と同等とみなす（別段に指摘しない限りは、それぞれのｄＡＢに使用するリンカーは同じである）。
−６４５ｄｓＦｖは、ｄｉｄＡｂＬ１及びＨ１と同等とみなし（別段に指摘しない限りは、それぞれのｄＡＢに使用するリンカーは同じである）、Ｌ１及びＨ１はジスルフィド結合によって安定化されている。
−６４８ｄｓＦｖは、ｄｉｄＡｂＬ２及びＨ２と同等とみなし（別段に指摘しない限りは、それぞれのｄＡＢに使用するリンカーは同じである）、Ｌ２及びＨ３はジスルフィド結合によって安定化されている。
ＦａｂΔとは、鎖間システイン結合（ＣＨとＣＬ又はＣＫとの間）を欠くＦａｂである。
略記：内容によりそうでないと指示されない限りは、接頭字としての「ｍ」は、マウスをいうことを意図する。
内容によりそうでないと指示されない限りは、接頭字としての「ｈ」は、ヒトをいうことを意図する。Ｆａｂ Ａ、Ｆａｂ Ｂ、Ｆａｂ Ｃ及びＦａｂ Ｄの構成要素を、以下に様々な様式で提供し得る。
（例１）
ヒト血清アルブミンに特異的なｄＡｂの生成
ヒト血清アルブミンに対する特異性を有するｄＡｂをコードしている、インフレームのＤＮＡにコードされた転写単位を、組換えＤＮＡ技術を使用して生成した。
所望する場合は、動員タンパク質に対する特異性を有するｄＡｂをコードしている、インフレームのＤＮＡにコードされた転写単位を、組換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる。
（例２）
抗体断片の産生
ｄＡｂと軽鎖のＣ末端との融合には、ヒトカッパ軽鎖定常領域（カッパ定常領域のＫｍ３アロタイプを有する）、ペプチドリンカー及びｄＡｂをコードしているＤＮＡを合成し、ＳａｃＩ−ＰｖｕＩＩ制限断片として、ヒトガンマ−１のＣＨ１定常領域をコードしているＤＮＡを含有する、ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈのインハウス発現ベクターｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ）（ｐＴＴＯ−１の誘導体、Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００５、３０８：１７〜３０に記載）内にクローニングした。これにより、どちらもｔａｃプロモーターの制御下にある、リンカーを介してｄＡｂと融合されたヒト化軽鎖の遺伝子、次いでヒト化重鎖Ｆａｂ断片の遺伝子からなる、２シストロン性の遺伝子配置が生じた。また、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーの上流の独特なＢｓｐＥ１部位、又はＡｌａ−Ｐｒｏに富んだリンカーの上流のＡｓｃＩ部位もコードされている。
ｄＡｂと重鎖のＣ末端との融合には、ヒトＣＨ１断片（γ１アイソタイプのもの）、次いでリンカーのコード配列及びｄＡｂをコードしているＤＮＡを合成した。これを、ＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ制限断片として、ヒトガンマ−１のＣＨ１定常領域をコードしているＤＮＡを含有する、ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈのインハウス発現ベクターｐＴＴＯＤ（Ｆａｂ）（ｐＴＴＯ−１の誘導体、Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌら、上記に記載）内にサブクローニングした。これにより、どちらもｔａｃプロモーターの制御下にある、ヒト化軽鎖の遺伝子、非コード遺伝子間配列、次いでリンカーを介してｄＡｂと融合された重鎖からなる、２シストロン性の遺伝子配置が生じた。組換え発現プラスミドを大腸菌株Ｗ３１１０内に形質転換させ、それ中での発現はＩＰＴＧを加えることによって誘導した。発現実験は、最初は小スケール（５ｍｌの培養体積）で行い、２００ｕＭのＩＰＴＧを約０．５のＯＤ（６００ｎｍ）で加え、細胞を誘導の２時間後に回収し、終夜、３０℃トリス／ＥＤＴＡ中で抽出した。清澄にした抽出液は、Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性分析に使用した。有望な発現収率及び活性を与える構築体を発酵用に選択した。
以下の例に適用可能な方法
以下の例では、ｄＡｂを融合させる抗体鎖は、ｃカッパ軽鎖はＣＫ又はＬＣ、重鎖定常ドメインＣＨ１はＣＨ１又はＨＣとして示す。
大腸菌中で発現させるためのＦａｂＡ−ｄＡｂ融合プラスミドの構築
Ｆａｂ−ｄＡｂ融合タンパク質は、ｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４を、ＦａｂＡの軽鎖又は重鎖のどちらかの定常領域のＣ末端と融合させることによって構築した。柔軟な
Figure 0005931730
又は強固な
Figure 0005931730
リンカーを使用してｄＡｂをｃカッパ領域（配列番号７５）と連結させた一方で、リンカー
Figure 0005931730
を使用してｄＡｂをＣＨＩ領域（配列番号７６）と連結させた。インハウスのｐＴＴＯＤベクターのＦａｂＡ配列内へのサブクローニングを可能にするために、定常領域−ｄＡｂの融合体をコードしているＤＮＡ配列を、断片として合成により製造した。
軽鎖−ｄＡｂの融合体は、
Figure 0005931730
又は強固な
Figure 0005931730
リンカーのどちらかを介してｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４のどちらかと融合されているＣ末端のｃカッパをコードしている、合成した遺伝子のＳａｃＩ−ＡｐａＩ断片を、ＦａｂＡを発現することができるプラスミドの対応する部位内にサブクローニングすることによって構築した。
重鎖−ｄＡｂの融合体は、ＤＫＴＨＴＳリンカーを介してｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４のどちらかと融合されているＣ末端のＣＨＩをコードしている、合成した遺伝子のＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ＦａｂＡを発現することができるプラスミドの対応する部位内にサブクローニングすることによって構築した。
Ｆａｂ’ＡはＩＬ−１ベータ結合抗体に由来し、その重鎖及び軽鎖配列は、図７に示すようにそれぞれ配列番号７４及び７５中に提供する。軽鎖にｄＡｂが付着しているＦａｂ’Ａでは、重鎖にｄＡｂが付着していない場合でも、重鎖のヒンジをＤＫＴＨＴＳに変更した（配列番号７６）。
ＦａｂＡは、同じ軽鎖配列（配列番号７５）及び鎖間システインで終結する切断された重鎖配列（配列番号７７）を含む。ｄＡｂＬ３及びｄＡｂＨ４はそれぞれ、ヒト血清アルブミンと結合する軽鎖及び重鎖ドメイン抗体である。
大腸菌中で発現させるためのＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂ融合プラスミドの構築
軽鎖及び重鎖の両方上にｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４を有するＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂは、ＣＨ１−ｄＡｂの融合体をコードしているＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、既存のＦａｂ−ｄＡｂプラスミド内にサブクローニングすることによって構築し、ここでｄＡｂは柔軟なリンカーを介して軽鎖と融合されている。
哺乳動物細胞中で発現させるためのＦａｂＢ−ｄＡｂ融合プラスミドの構築
ＦａｂＢ−ｄＡｂ、ＦａｂＢ−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）、ＦａｂＢ−ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）、ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）、ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）はすべて、ＰＣＲによってアセンブルし、その後、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下にある哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。これらは、哺乳動物細胞中で発現させるために、ＦａｂＢ軽鎖を含有する類似のベクターと対にした（以下を参照）。
ＦａｂＢは、細胞表面共刺激分子と結合する抗体に由来する。ｄＡｂＨ１、ｄＡｂＨ２、ｄＡｂＬ１及びｄＡｂＬ２は、例３に記載のように得られた。
ＦａｂＢ−ｄＡｂ及びｄｉｄＡｂの哺乳動物発現
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎ形質移入試薬を使用して、製造者の指示に従って、ＨＥＫ２９３細胞を、重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて形質移入した。手短に述べると、２μｇの重鎖プラスミド＋２μｇの軽鎖プラスミドを、１０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ＋３４０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地と共に、２０分間、室温でインキュベーションした。その後、混合物を懸濁液中の５×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に加え、４日間、振盪しながら３７℃でインキュベーションした。
Ｂｉａｃｏｒｅ
Ｆａｂ−ｄＡｂ構築体の相互作用の結合親和性及び動力学的パラメータは、ＣＭ５センサーチップ及びＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０）ランニング緩衝液を用いてＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００で実施した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。Ｆａｂ−ｄＡｂ試料は、ヒトＦ（ａｂ’）２に特異的なヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００６−０９７）又はインハウスで作製した抗ヒトＣＨ１モノクローナル抗体のどちらかを使用して、センサーチップ表面に捕捉させた。捕捉抗体の共有的固定は標準のアミンカップリング化学によって達成した。
それぞれのアッセイサイクルは、最初に１分間の注入を使用したＦａｂ−ｄＡｂの捕捉、次いで３分間の抗原の注入からなる会合段階からなり、その後、解離を５分間監視した。それぞれのサイクルの後、捕捉表面を、２×１分間の４０ｍＭのＨＣｌの注入、次いで３０秒間の５ｍＭのＮａＯＨの注入を用いて再生した。使用した流速は、捕捉には１０μｌ／分、会合及び解離段階には３０μｌ／分、並びに再生には１０μｌ／分であった。
動力学的アッセイでは、抗原の滴定（ヒトの血清アルブミンでは典型的には６２．５ｎＭ〜２μＭであり、ＩＬ−１βでは１．２５〜４０ｎＭである）を行い、ブランクのフローセルを参照の減算に使用し、機器のノイズ及びドリフトを減算するために緩衝液ブランクの注入を含めた。
動力学的パラメータは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアを使用して、生じたセンサーグラムを、標準の１：１結合モデルに、同時に総合的に当てはめることによって決定した。
同時結合について試験するために、別個の５μＭのＨＳＡ若しくは１００ｎＭのＩＬ−１β、又は５μＭのＨＳＡ及び１００ｎＭのＩＬ−１βの混合溶液のどちらかの３分間の注入を、捕捉されたＦａｂ−ｄＡｂの上に注入した。
大腸菌からのＦａｂ−ｄＡｂの精製
ペリプラズム抽出
ペリプラズム内にＦａｂ−ｄＡｂを含有する大腸菌ペレットを、１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を用いて、元の培養体積に再懸濁させた。その後、これらの懸濁液を４℃で１６時間、２５０ｒｐｍでインキュベーションした。再懸濁させたペレットを１００００×ｇで１時間、４℃で遠心分離した。上清を除去し、０．４５μｍを濾過した。
タンパク質Ｇの捕捉
Ｆａｂ−ｄＡｂを濾過した上清からタンパク質Ｇクロマトグラフィーによって捕捉した。手短に述べると、２０分間の滞留時間を用いて、上清を、２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１で平衡化したＧａｍｍａｂｉｎｄ Ｐｌｕｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに適用した。カラムを２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１で洗浄し、結合した材料を０．１Ｍのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．８で溶出させた。溶出ピークを収集し、１Ｍの酢酸ナトリウムを用いてｐＨを約ｐＨ５に調節した。ｐＨを調節した溶出液を濃縮し、１０ｋのＭＷＣＯ膜を使用して、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中にダイアフィルトレーションした。
イオン交換
Ｆａｂ−ｄＡｂを、ｐＨ４．５でＮａＣｌの溶出勾配を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。手短に述べると、ダイアフィルトレーションしたタンパク質Ｇの溶出液を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５で平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに適用した。カラムを５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５で洗浄し、結合した材料を、２０倍カラム体積の、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中の０〜１ＭのＮａＣｌの直線勾配を用いて溶出させた。３番目のカラム体積の画分を、勾配全体にわたって収集した。画分をＡ２８０及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、関連する画分をプールした。
ゲル濾過
必要な場合は、Ｆａｂ−ｄＡｂをゲル濾過によってさらに精製した。手短に述べると、ＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）のプールしたイオン交換溶出画分を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに適用し、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０の均一濃度勾配で溶出させた。１／１２０倍カラム体積の画分を、勾配全体にわたって収集した。画分をＡ２８０及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、関連する画分をプールした。ゲル濾過を受けなかったＦａｂ−ｄＡｂでは、プールしたイオン交換溶出画分を濃縮し、１０ｋのＭＷＣＯ膜を使用して、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０中にダイアフィルトレーションした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
必要な場合は試料を水で希釈し、その後、１０μｌに、１０μＬの２×試料ランニング緩衝液を加えた。非還元試料には、２μＬの１００ｍＭのＮＥＭをこの時点で加え、還元試料には、２μＬの１０×還元剤を加えた。試料を渦撹拌し、８５℃で５分間インキュベーションし、冷却し、１２５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。調製した試料を４〜２０％のアクリルアミントリス／グリシンＳＤＳゲル上に載せ、１００分間、１２５Ｖで流した。ゲルをウエスタンブロッティングのためにＰＶＤＦ膜上に移したか、又はクマシーブルータンパク質染色で染色した。
ウエスタンブロッティング
ゲルを、１２ｍＭのトリス、９６ｍＭのグリシン、ｐＨ８．３中で、１６時間、１５０ｍＡでＰＶＤＦ膜に移した。ＰＶＤＦ膜を１時間、ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０（遮断緩衝液）中の２％のＭａｒｖｅｌ（商標）で遮断した。
抗軽鎖
ＨＲＰ−ウサギ抗ヒトカッパ軽鎖、遮断緩衝液中の１／５０００の希釈液で１時間。
抗重鎖
マウス抗ヒト重鎖、遮断緩衝液中の１／７０００の希釈液で１時間。次いで、ＨＲＰ−ヤギ抗マウス、遮断緩衝液中の１／２０００の希釈液で１時間。
抗Ｈｉｓタグ
ウサギ抗Ｈｉｓ６、遮断緩衝液中の１／１０００の希釈液で１時間。次いで、ＨＲＰ−ヤギ抗ウサギＩｇＧ、遮断緩衝液中の１／１０００の希釈液で１時間。
すべてのブロットを、１００ｍｌのＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０を用いて、１回の洗浄あたり１０分間で６回洗浄した。ブロットは、ＥＣＬ試薬で１分間展開させた後にＡｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍに曝露させたか、又は金属増感ＤＡＢ試薬で２０〜３０分間、次いで水で展開させた。
高温逆相ＨＰＬＣ
試料（２μｇ）は、２．１ｍｍのＣ８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌカラム上、８０℃で、２ｍｌ／分の流速及び１８〜３８％のＢの勾配を用いて、４分間にわたって分析した。Ａ＝Ｈ２Ｏ中の０．１％のＴＦＡ、Ｂ＝８０：２０のＩＰＡ：ＭｅＯＨ中の０．０６５％のＴＦＡ。検出は２１４ｎｍでの吸収によるものである。
ＥＬＩＳＡ
Ｆａｂ−ｄＡｂの収率はサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。手短に述べると、Ｆａｂ−ｄＡｂを抗ＣＨ１抗体で捕捉し、その後、抗カッパ−ＨＲＰを用いて表示させた。
ＦＡＣＳ
試料（ｍＦａｂＤ−ｄｉｄＡｂ）を５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で標識したＨＳＡと共に４５分間インキュベーションした。その後、試料／ＨＳＡ−ＦＩＴＣのインキュベーションを活性化したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞に加え、さらに４５分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞に関連する蛍光をＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）によって測定した。
（例３）
抗アルブミン抗体の作製
１／２ロップウサギを組換えｃｈｒｏｍａｐｕｒｅヒト血清アルブミン（Ｊａｃｋｓｏｎから購入）で免疫化した。ウサギには１００ｕｇのＨＳＡタンパク質の３回の免疫化を皮下で与え、最初の免疫化は完全フロイントアジュバント中、続く免疫化は不完全フロイント中であった。ヒト、マウス及びラットの血清アルブミンと結合する抗体１及び２、６４６、６４７、並びに６４９は、ＷＯ０４／０５１２６８号に記載の方法を使用して単離した。抗体１及び２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の遺伝子を単離し、逆転写ＰＣＲによるクローニングの後に配列決定した。
軽鎖を移植した配列を、ウサギＣ−カッパ定常領域をコードしているＤＮＡを含有するウサギ軽鎖発現ベクターｐＶＲｂｃＫ内にサブクローニングした。重鎖を移植した配列を、ウサギＦａｂ’重鎖定常領域をコードしているＤＮＡを含有するウサギ重鎖発現ベクターｐＶＲｂＨＦａｂ内にサブクローニングした。プラスミドをＣＨＯ細胞内に同時形質移入し、産生された抗体をアルブミン結合及び親和性についてスクリーニングした（表１）。ＣＨＯ細胞の形質移入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００手順を使用して、製造者の指示（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８）に従って行った。
ヒト化ドメイン抗体ｄＡｂＬ１、ｄＡｂＨ１、ｄＡｂＬ２及びｄＡｂＨ２の作製
ヒトＶ領域アクセプターフレームワーク及びフレームワーク領域中のドナー残基を使用して、ヒト化したＶＬ及びＶＨ領域を設計した。１つの移植したＶＬ領域（Ｌ１（配列番号５３）及びＬ２（配列番号５５））並びに１つのＶＨ領域（Ｈ１（配列番号５２）及びＨ２（配列番号５４））を、抗体１及び２のそれぞれについてそれぞれ設計し、遺伝子はオリゴヌクレオチドのアセンブル及びＰＣＲ突然変異誘発によって構築した。移植したドメイン抗体及びそのＣＤＲを図５に示す。
Figure 0005931730
（例４）
哺乳動物細胞中で発現させたＦａｂＢ−ｄＡｂの分析
方法に記載されているようにＦａｂＢ−ｄＡｂ構築体を産生し、ＦａｂＢ−ｄＡｂを含有する形質移入したＨＥＫ２９３細胞からの上清をＢＩＡｃｏｒｅで直接試験した。
動力学的分析を実施して、ＨＳＡとＦａｂＢ−ｄＡｂ構築体との相互作用を評価した。これらは、ＦａｂＢのＣＨ１のＣ末端と融合されているｄＡｂＬ１、ｄＡｂＨ２又はｄＡｂＬ３のいずれかからなっていた（図６を参照）。ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ１は、ＨＳＡに対する親和性、ＫＤ＝１７０ｎＭが、ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ３、ＫＤ＝３９２ｎＭよりも高かった。ＦａｂＢ−ｄＡｂＨ２は、ＨＳＡに対して最も乏しい親和性を保有することが示された、ＫＤ＝１０７４ｎＭ、表２を参照されたい。
Figure 0005931730
親和性及び動力学的パラメータを、ＨＳＡと、ｄＡｂＬ１、ｄＡｂＨ２又はｄＡｂＬ３と融合されているＦａｂＢとの結合について決定した。示したデータは平均値±ＳＥＭである。（ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ１及びＦａｂＢ−ｄＡｂＨ２ではｎ＝４。ＦａｂＢ−ｄＡｂＬ３ではｎ＝２）。
ＦａｂＢ−ｄＡｂタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより、産生されたＦａｂＢ−ｄＡｂは予測された大きさであったことが確認された。
（例５）
哺乳動物細胞中で発現させたＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂの分析
方法に記載されているようにＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ構築体を産生させ、ｄｉｄＡｂを含有する形質移入したＨＥＫ２９３細胞からの上清をＢＩＡｃｏｒｅで直接試験した。
単一のｄＡｂがＦａｂの重鎖及び軽鎖のＣ末端のどちらとも融合されているｄｉｄＡｂ構築体を使用して、さらなる分析を行った。ｄｉｄＡｂが天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの対合に由来していた構築体は、単一のｄＡｂ単独と比較して顕著な親和性の改善を示した（表２及び３）。２つの同一のｄＡｂＬ１からなるｄｉｄＡｂ融合体では、単一のｄＡｂＬ１で見られるものを超える親和性の改善は示されなかった（データ示さず）。
Figure 0005931730
親和性及び動力学的パラメータを、ＨＳＡと、ｄＡｂＬ１及びｄＡｂＨ１又はｄＡｂＬ２及びｄＡｂＨ２の両方と融合されているＦａｂＢとの結合について決定した。
ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂは良好に発現され、予測された大きさであったことが確認された（図４ａを参照）。このＳＤＳ ＰＡＧＥゲルは細胞によって発現された全タンパク質であることに注意されたい。
（例６）
精製したＦａｂＡ−ｄＡｂの分析
大腸菌中でＦａｂ−ｄＡｂ、Ｆａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）、Ｆａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］２）を発現させるためのプラスミドを、方法に記載されているように構築した。Ｆａｂ−ｄＡｂは大腸菌のペリプラズム内に発現され、方法に記載されているように均質となるまで精製した。Ｆａｂ−ｄＡｂの純度は、高温逆相ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングによって評価した。また、Ｆａｂ−ｄＡｂは、Ｂｉａｃｏｒｅによって抗原結合についても評価した。
高温逆相ＨＰＬＣ
方法に記載されているように行った高温逆相ＨＰＬＣにより、ＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）及びＦａｂＡ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］２）中に含有されるすべての種の定量分析が与えられた。存在するそれぞれの種の百分率を表４に示す。
Figure 0005931730
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Ｆａｂ−ｄＡｂ試料を非還元及び還元条件下で調製し、方法に記載されているようにゲル上に流した。ゲルをクマシー染色した。両方のＦａｂ−ｄＡｂ試料、すなわちＦａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）及びＦａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］２）のバンドプロフィールは、高温逆相ＨＰＬＣによって観察されたプロフィールに良好に対応する（図３）。
ウエスタンブロット
方法に記載されているように、Ｆａｂ−ｄＡｂ試料を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで抗軽鎖及び抗重鎖抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した。これにより、ｄＡｂはＦａｂの軽鎖上にあり、どちらの試料中でも重鎖は改変されていなかったことが確認された（図４）。また、これは、クマシー染色した非還元ＳＤＳ ＰＡＧＥによって検出されたすべてのバンドがＦａｂ−ｄＡｂ関連の産物であることも実証している。
Ｂｉａｃｏｒｅ
方法に記載されているように、ＳＰＲによる動力学的分析を使用して、ヒト血清アルブミンとＦａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−ＳＧ４ＳＥ）及びＦａｂ’Ａ−ｄＡｂＬ３（ＣＫ−Ｇ［ＡＰＡＰＡ］２）との結合を評価した。表５の結果は、どちらの構築体も約１μＭの同様の親和性（ＫＤ）でヒト血清アルブミンと結合できることを実証している。
Figure 0005931730
さらなる動力学的分析は、すべての融合構築体が元のＦａｂＡのＩＬ−１βに対する相互作用特徴を保持しており、表６、動力学及び親和性のパラメータに軽微な相違しか見られないことを実証した。
Figure 0005931730
それぞれの構築体がヒト血清アルブミン及びＩＬ−１β抗原の両方と同時に結合する潜在性は、それぞれの構築体をセンサーチップ表面に捕捉させた後に、５μＭのヒト血清アルブミン若しくは１００ｎＭのＩＬ−１β、又は５μＭのヒト血清アルブミン及び１００ｎＭのＩＬ−１βの両方の混合溶液の、別個の３分間の注入のどちらかを行うことによって評価した。それぞれのＦａｂ−ｄＡｂ構築体について、合わせたＨＳＡ／ＩＬ−１β溶液で見られた応答は、独立した注入の応答の合計とほぼ同一であった、表７を参照されたい。これは、Ｆａｂ−ｄＡｂはＩＬ−１β及びヒト血清アルブミンの両方と同時結合することができ、ＩＬ−１β又はヒト血清アルブミンのどちらかの結合は他方の相互作用を阻害しないことを示している。元のＦａｂＡはＩＬ−１βとのみ結合し、ヒト血清アルブミンとの結合は無視できる程度である。
Figure 0005931730
上記表は、ＨＳＡ若しくはＩＬ−１βの別個の注入、又は事前に混合したＨＳＡ及びＩＬ−１βの注入の後に、それぞれの構築体について見られる結合応答（ＲＵ）を示す。それぞれの場合で、最終濃度は、ＨＳＡは５μＭであり、ＩＬ−１βは１００ｎＭであった。個々のＨＳＡ及びＩＬ−１βの応答の合計を括弧内に示す。
（例７）
ＦａｂＡ ｄｉｄＡｂ
大腸菌でのＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂの発現
Ｃ末端のヒスチジンタグ（ＨＩＳ６タグ）で終結するＦａｂＡ−ｄＡｂ及びＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂの融合体を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で発現させた。ペリプラズム抽出後、ｄＡｂ融合タンパク質を、Ｃ末端のＨｉｓ６タグを介して精製した。Ｆａｂ発現は、抗ＣＨ１及び抗ｃカッパ抗体を用いた非還元ゲルのウエスタンブロッティングによって分析した。ＦａｂＡ−ｄＡｂ及びＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂは完全長タンパク質として発現されており、どちらの抗体検出試薬とも反応することが示された。
大腸菌中で発現させたＦａｂＡ−ｄｉｄＡｂの分析
さらなる分析を実施して、ＨＳＡと１つ又は複数のｄＡｂを融合させたＦａｂＡ構築体との結合を特徴づけた。結合アッセイを、ｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４がＦａｂＡの軽鎖又は重鎖のどちらかと融合されている様々な構築体で行った（構築体の詳細及び結合データの要約には表８を参照）。軽鎖又は重鎖のどちらか上にｄＡｂＨ４のみを保有する構築体は、比較的乏しい親和性でＨＳＡと結合することが見られたが（それぞれ≒９μＭ及び３μＭ）、ｄＡｂＬ３を、単一の融合体（軽鎖若しくは重鎖のどちらか上）として、又は反対の鎖上の第２のｄＡｂ（ｄＡｂＬ３若しくはｄＡｂＨ４）と組んで保有する構築体では、より高い親和性の結合が観察された。
Figure 0005931730
親和性及び動力学的パラメータを、ＨＳＡと、示したように軽鎖（ＬＣ）若しくは重鎖（ＨＣ）のどちらか又は両方上にｄＡｂＬ３又はｄＡｂＨ４を保有するＦａｂＡとの結合について決定した。ＨＳＡと元のＦａｂＡとの結合は検出されなかった（ｎｂ）。ＨＳＡと（ＨＣ上のｄＡｂＨ４）又は（ＬＣ上のｄＡｂＨ４）を有するＦａｂＡとの結合の相互作用の動力学は、決定するには速すぎ、したがって、親和性（ＫＤ）は定常状態の結合から決定した。
（例８）
ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂの発現及び精製
哺乳動物発現
形質移入の前に、ＣＨＯ−ＸＥ細胞をアール（Ｅａｒｌｓ）バランス塩溶液（ＥＢＳＳ）で洗浄し、ペレット化し、２×１０８個の細胞／ｍｌでＥＢＳＳに再懸濁させた。重鎖及び軽鎖プラスミドを４００ｕｇの合計濃度で細胞に加えた。形質移入には、８００μｌの細胞／ＤＮＡ混合物の最適化した電気パラメータをインハウスの電気穿孔器上で使用した。形質移入した細胞を、ｇｌｕｔａｍａｘ、ＨＴ及び抗真菌抗生物質溶液を添加した１ＬのＣＤ−ＣＨＯ培地に直接移した。細胞をインキュベーションし、３７℃で２４時間振盪し、その後、３２℃に移行させた。３ｍＭの酪酸ナトリウムを４日目に加えた。上清を１４日目に１５００×ｇでの遠心分離によって回収して、細胞を除去した。発現レベルはＥＬＩＳＡによって決定した。
哺乳動物発現の上清の濃度
ＥＬＩＳＡによって評価して約５５μｇ／ｍｌのＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂを含有する哺乳動物上清を、１０ｋＤａの分子量カットオフのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を装着したＭｉｎｉｓｅｔｔｅ濃縮機を使用して、１．８Ｌから２００ｍｌまで濃縮した。
タンパク質Ｇ精製
濃縮した上清を、２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１で平衡化したＧａｍｍａｂｉｎｄ Ｐｌｕｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに適用した。カラムを２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１で洗浄し、結合した材料を０．１Ｍのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．７で溶出させた。溶出ピークを収集し、２Ｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．８を用いてｐＨを約ｐＨ７に調節した。１０ｋＤの分子量カットオフのＰＥＳ膜を使用して、ｐＨを調節した溶出液を１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１中にダイアフィルトレーションした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
必要な場合は試料を水で希釈し、その後、２６μｌに、１０μＬの４×ＬＤＳ試料ランニング緩衝液を加えた。非還元試料には、４μＬの１００ｍＭのＮＥＭを加え、還元試料には、４μＬの１０×還元剤を加えた。試料を渦撹拌し、８５℃で５分間インキュベーションし、冷却し、１２５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。調製した試料を４〜２０％のアクリルアミントリス／グリシンＳＤＳゲル上に載せ、１１０分間、１２５Ｖで流した。ゲルをクマシーブルータンパク質染色で染色した。
ＥＬＩＳＡ
Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂの収率はサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。手短に述べると、Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂを抗ＣＨ１抗体で捕捉し、その後、抗カッパ−ＨＲＰを用いて表示させた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＦａｂＢ及びＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ試料を非還元及び還元条件下で調製し、方法に記載されているようにゲル上で分離し、染色した。図９を参照されたい。
（例９）
ＦａｂＢ−Ｆｖに対するＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ熱安定性アッセイ
試料（１μｌの約１ｍｇ／ｍｌの試料、８μｌのＰＢＳ及び１μｌの３０×ストックのＳｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅ蛍光色素）を四つ組で３８４ウェルプレートに流した。７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステムを使用してプレートを２０から９９℃まで加熱し、蛍光（４９０ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの発光）を測定した。結果を表Ｄ及び図１０に示す。
Figure 0005931730
（例１０）
ＦａｂＢ−Ｆｖの凝集安定性アッセイ
ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌの試料を、１４００ｒｐｍで渦撹拌しながら２５℃でインキュベーションした。吸光度を５９５ｎｍで測定する。この吸光度は粒子によって散乱された光が原因であり、試料の凝集と相関させることができる。ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（Ｇ４Ｓ×２）及びＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（Ｇ４Ｓ×２）はどちらも、ＦａｂＢ単独と同等に凝集に対して耐性がある。これらはすべて、ＩｇＧ対照よりも凝集に対して耐性がある。（図１２）
（例１１）
Ｆａｂ−ＦｖとＨＳＡとの結合のｐＨ依存性
Ｆａｂ−Ｆｖ構築体とＨＳＡとの相互作用の結合親和性は、４０ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０及び８０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０を混合することによってｐＨ５．０、５．５、６．０及び７．０のランニング緩衝液を作製して所望のｐＨを与えた以外は、方法に記載されているように決定した。
ＨＳＡに対するＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（Ｇ４Ｓ×２）の親和性は、７．４（標準のアッセイｐＨ）から５．０のｐＨによって影響を受けない。ＨＳＡに対するＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（Ｇ４Ｓ×２）の親和性はｐＨによって影響を受け、ｐＨ７．４とｐＨ５．０との間で約１０倍の親和性の損失が存在する。
Figure 0005931730
（例１２）
ＦａｂＢ−Ｆｖのｉｎ ｖｉｖｏマウスＰＫ
雄のＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（Ｇ４Ｓ×２）及びＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（Ｇ４Ｓ×２）の薬物動態学を、皮下（ｓｃ）又は静脈内（ｉｖ）のどちらかでの１０ｍｇ／ｋｇの単一の投与後に決定した。６匹のマウスに、それぞれの構築体及び投与経路について投薬した。皮下投与の１、４、８、２４、４８、７２、１０２及び１６８時間後並びに静脈内投与の３０分間、１、８、２４、４８、７２、９６及び１６８時間後の時点で、一連の血液試料（３０μＬ）を尾部静脈から収集した。収集した血液を、血清分離のために凝血活性化剤を含むＳａｒｓｔｅｄｔ ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ３００Ｚ内に分注し、室温で少なくとも２０分間静置した。その後、ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅを２０℃、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。血清を除去し、凍結して保管した後に分析した。血清試料中のＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（Ｇ４Ｓ×２）又はＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（Ｇ４Ｓ×２）の濃度はＥＬＩＳＡによって評価した。手短に述べると、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＩｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌｅプレートをＰＢＳ中のｈＯＸ４０−Ｆｃでコーティングし、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡで遮断した。血清試料及び標準物質をＰＢＳ中の１％のＢＳＡに希釈し、プレートに１時間施用した。プレートをＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗ヒトカッパＨＲＰのコンジュゲートを表示させる抗体をＰＢＳ中の１％のＢＳＡ中で１時間施用した。プレートを洗浄し、その後、ＴＭＢ基質で展開させ、次いで２．５Ｍの硫酸で停止させた。６３０ｎｍでの洗浄液の吸光度を測定し、濃度を検量線から決定した。
ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（Ｇ４Ｓ×２）及びＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（Ｇ４Ｓ×２）はどちらも血漿中で延長された半減期を有する。図１３。ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（Ｇ４Ｓ×２）の半減期はｓｃで７１時間及びｉｖで６２時間であり、ＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（Ｇ４Ｓ×２）の半減期はｓｃで２５時間及びｉｖで３０時間である。
（例１３）
ＦａｂＢ−Ｆｖのｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究
ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ及びＦａｂＢ−６４８Ｆｖがｉｎ ｖｉｖｏで有効であるかを調査するための研究を行った。手短に述べると、これはＨｕＳＣＩＤマウスにおける定常状態の投薬を含み、読取りはＴ細胞生着の防止であった。
ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスに、２．４７５ｍｇ／ｋｇのＦａｂＢ−６４５Ｆｖ又はＦａｂＢ−６４８Ｆｖ又はＦａｂＢ−ＰＥＧ４０ｋ又はＰＢＳの負荷用量を皮下で−２日目に投薬した。１０日目を含めた、その後のそれまでの毎日に、これらに０．７５ｍｇ／ｋｇのＦａｂＢ−６４５Ｆｖ又はＦａｂＢ−６４８Ｆｖ又はＦａｂＢ−ＰＥＧ４０ｋ又はＰＢＳの維持量を皮下で投薬した。それぞれの投薬群は９〜１０匹のマウスからなっていた。−１日目に、ナチュラルキラー細胞の活性を抑止するために、すべてのマウスを０．８７ｍｇ／マウスのラット抗マウスＴＭ−β１抗体で処置した。０日目に、すべてのマウスに８×１０６個のヒト末梢血単核球の腹膜間（ｉｎｔｅｒ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）注射を与えた。１４日目にマウスを屠殺し、血液、脾臓及び腹膜洗浄液を採取した。試料はＦＡＣＳによってＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞について分析した。データ組はダネット試験後比較を用いた一方向Ａｎｏｖａによって分析した。すべての試験構築体、ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ、ＦａｂＢ−６４８Ｆｖ及びＦａｂＢ−ＰＥＧ４０ｋは、試験したすべての区画、すなわち、血液、腹膜及び脾臓において同等に有効であった。図１４Ａ、Ｂ及びＣ。
（例１４）
アルブミンに対する６４５Ｆｖの親和性を変化させるためのＦａｂＢ−６４５Ｆｖの突然変異
突然変異誘発ＰＣＲによって、点突然変異をＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（Ｓ３×Ｇ４Ｓ）の６４５Ｆｖ部分の重鎖のＣＤＲ中の選択された残基内に導入した。たとえば、Ｉ５０Ａは、Ｉｌｅ５０をＡｌａで置き換えたものである。様々な突然変異を以下の表１１に示す。ヒトアルブミンに対するＦａｂ−６４５Ｆｖ突然変異体の親和性は、方法に記載されているようにＢＩＡｃｏｒｅによって評価した。すべての突然変異は、ヒトアルブミンに対して変化していない又は低下した親和性を有していた。
Figure 0005931730
（例１５）
ＦａｂとＦｖとの間の１〜５Ｇｌｙ４Ｓｅｒのリンカー長
哺乳動物細胞中で発現させるためのＦａｂＢ−６４５Ｆｖ融合プラスミドの構築
ＦａｂのＣ末端とＦｖのＮ末端との間に
Figure 0005931730
リンカーのいずれかを有するＦａｂＢ−６４５Ｆｖ’をＰＣＲによってアセンブルし、その後、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下にある哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。関連する重鎖及び軽鎖プラスミドを、哺乳動物細胞中で発現させるために対合させた。
ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１〜５×Ｇ４Ｓ）の哺乳動物発現
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎ形質移入試薬を使用して、製造者の指示に従って、ＨＥＫ２９３細胞を、重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて形質移入した。手短に述べると、２４μｇの重鎖プラスミド＋２４μｇの軽鎖プラスミドを、１２０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ＋４０８０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地と共に、２０分間、室温でインキュベートした。その後、混合物を６０ｍＬの懸濁液中の６０×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に加え、４日間、振盪しながら３７℃でインキュベーションした。すべての構築体は、同等に良好に発現された。
タンパク質Ｇ精製
哺乳動物発現の懸濁液を遠心分離によって清澄にし、１０ｋＤａの分子量カットオフの遠心分離濃縮機を使用して上清を約１．８ｍＬまで濃縮した。濃縮した上清を１６０００×ｇで１０分間遠心分離してすべての沈殿物を除去し、その後、１．５ｍＬを１ｍｌのＨｉＴｒａｐタンパク質Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１ｍｌ／分で載せた。カラムを２０ｍＭのホスフェート、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、結合した材料を０．１Ｍのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．７で溶出させた。溶出ピーク（２ｍＬ）を収集し、２５０μＬの１Ｍの酢酸ナトリウムを用いてｐＨを約ｐＨ５に調節した。ｐＨを調節した溶出液を、１０ｋＤａの分子量カットオフの遠心分離濃縮機を使用して、２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１中にダイアフィルトレーションし、約２５０μＬまで濃縮した。すべての構築体は同様の精製プロフィールを有しており、最終濃度は０．５〜１．１ｍｇ／ｍｌであった。
ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１〜５×Ｇ４Ｓ）のアルブミンに対する親和性
ヒト及びマウスのアルブミンに対する精製したＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１〜５×Ｇ４Ｓ）構築体の親和性は、方法に記載されているように決定した。ＦａｂのＣ末端とＦｖのＮ末端との間の１〜５×Ｇｌｙ４ＳｅｒのＦｖの様々なリンカー長は、ヒト又はマウスのアルブミンのどちらに対する６４５Ｆｖの親和性にも影響を与えなかった。
Figure 0005931730
精製したＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１〜５×Ｇ４Ｓ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１〜５×Ｇ４Ｓ）試料を非還元及び還元条件下で調製し、方法に記載されているようにゲル上で分離し、染色した。図１５を参照されたい。
精製したＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１〜５×Ｇ４Ｓ）のサイズ排除分析
ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１〜５×Ｇ４Ｓ）試料を、均一濃度勾配の２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を１ｍｌ／分で用いて展開させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、大きさについて分析した。
１×Ｇ４Ｓ又は２×Ｇ４Ｓのどちらかの、ＦａｂのＣ末端とＦｖのＮ末端との間のリンカー長は、単量体ＦａｂＢ−６４５Ｆｖの量を低下させる一方で、二量体及びより高次の多量体の量を増加させる。単量体の量は１×Ｇ４Ｓリンカー長で最も少ない。３×Ｇ４Ｓ、４×Ｇ４Ｓ又は５×Ｇ４Ｓのいずれかの、ＦａｂのＣ末端とＦｖのＮ末端との間のリンカー長は、単量体ＦａｂＢ−６４５Ｆｖの量を増加させた一方で、二量体及びより高次の多量体の量を減少させ、そのレベルは３つのリンカー長すべてで同様であった。図１６。
Figure 0005931730
精製したＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（１〜５×Ｇ４Ｓ）のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ熱安定性分析
試料（１μｌの約１ｍｇ／ｍｌの試料、８μｌのＰＢＳ及び１μｌの３０×ストックのＳｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅ蛍光色素）を四つ組で３８４ウェルプレートに流した。７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステムを使用してプレートを２０から９９℃まで加熱し、蛍光（４９０ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの発光）を測定した。結果を表１４及び図１７に示す。
Figure 0005931730
（例１６）
Ｆａｂ−Ｆｖ中のＦｖのジスルフィド安定化
哺乳動物細胞中で発現させるためのＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）融合プラスミド
突然変異誘発ＰＣＲによって、点突然変異を、ＦａｂＢ−６４５Ｆｖ（２×Ｇ４Ｓ）及びＦａｂＢ−６４８Ｆｖ（２×Ｇ４Ｓ）ＤＮＡ配列内に、Ｆｖの重鎖及び軽鎖の両方のフレームワーク領域中の選択された残基で導入した。Ｆｖの重鎖と軽鎖との間に鎖間ジスルフィド結合を作製するために導入された突然変異は、重鎖のＧ４４Ｃ及び軽鎖のＧ１００Ｃであった。Ｆｖ中に鎖間ジスルフィド結合を作製するためにシステインを付加することに加えて、Ｆａｂの重鎖と軽鎖との間の天然の鎖間ジスルフィドを、突然変異誘発ＰＣＲによって、システインをセリンに変化させることによって除去した。鎖間ジスルフィド結合を含有するＦｖはｄｓＦｖと呼び、鎖間ジスルフィド結合を欠くＦａｂはＦａｂΔと呼ぶ。その後、これらすべての構築体のＤＮＡをＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下にある哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。関連する重鎖及び軽鎖プラスミドを、哺乳動物細胞中で発現させるために対合させた。
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）の哺乳動物発現
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎ形質移入試薬を使用して、製造者の指示に従って、ＨＥＫ２９３細胞を、重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて形質移入した。手短に述べると、２４μｇの重鎖プラスミド＋２４μｇの軽鎖プラスミドを、１２０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ＋４０８０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地と共に、２０分間、室温でインキュベートした。その後、混合物を６０ｍＬの懸濁液中の６０×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に加え、４日間、振盪しながら３７℃でインキュベーションした。すべての構築体は、同等に良好に発現された。
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）のタンパク質Ｇ精製
哺乳動物発現の懸濁液を遠心分離によって清澄にし、１０ｋＤａの分子量カットオフの遠心分離濃縮機を使用して上清を約１．８ｍＬまで濃縮した。濃縮した上清を１６０００×ｇで１０分間遠心分離してすべての沈殿物を除去し、その後、１．５ｍＬを１ｍｌのＨｉＴｒａｐタンパク質Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１ｍｌ／分で載せた。カラムを２０ｍＭのホスフェート、４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、結合した材料を０．１Ｍのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．７で溶出させた。溶出ピーク（２ｍＬ）を収集し、２５０μＬの１Ｍの酢酸ナトリウムを用いてｐＨを約ｐＨ５に調節した。ｐＨを調節した溶出液を、１０ｋＤａの分子量カットオフの遠心分離濃縮機を使用して、２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１中にダイアフィルトレーションし、約２５０μＬまで濃縮した。すべての構築体は同様の精製プロフィールを有しており、最終濃度は０．５〜０．８ｍｇ／ｍｌであった。
アルブミンに対する、ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）の親和性
ヒト及びマウスのアルブミンに対する、精製したＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）構築体の親和性は、方法に記載されているように決定した。Ｆｖのジスルフィド安定化は、ヒト又はマウスのアルブミンのどちらに対するＦｖの親和性にも影響を与えなかったか、又はそれをわずかに増加させた。
Figure 0005931730
精製したＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
精製したＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）試料を非還元及び還元条件下で調製し、方法に記載されているようにゲル上で分離し、染色した。図１８を参照されたい。
精製したＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）のサイズ排除分析
精製したＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）試料を、均一濃度勾配の２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を１ｍｌ／分で用いて展開させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、大きさについて分析した。
鎖間ジスルフィド結合を６４５Ｆｖ又は６４８ＦｖのどちらかのＦｖ内に導入することで、Ｆｖが鎖間ジスルフィドを有さなかったＦａｂ−Ｆｖと比較して、単量体Ｆａｂ−Ｆｖ種の量が増加した。Ｆａｂ−ＦｖのＦａｂ部分からの天然の鎖間ジスルフィド結合の除去は、存在する単量体種の量に小さな影響しか与えなかった。図１９。
Figure 0005931730
精製したＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）、ＦａｂΔＢ−６４５ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）及びＦａｂΔＢ−６４８ｄｓＦｖ（２×Ｇ４Ｓ）のＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ熱安定性分析
試料（１μｌの約１ｍｇ／ｍｌの試料、８μｌのＰＢＳ及び１μｌの３０×ストックのＳｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅ蛍光色素）を四つ組で３８４ウェルプレートに流した。７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステムを使用してプレートを２０から９９℃まで加熱し、蛍光（４９０ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの発光）を測定した。
鎖間ジスルフィド結合を６４５Ｆｖ又は６４８ＦｖのどちらかのＦａｂ−ＦｖのＦｖ部分内に導入することで、Ｆｖが鎖間ジスルフィドを有さなかったＦａｂ−Ｆｖと比較して、Ｆｖの熱安定性が増加した。Ｆａｂ−ＦｖのＦａｂ部分からの天然の鎖間ジスルフィド結合の除去は、Ｆａｂ−ＦｖのＦａｂ部分の熱安定性を減少させた。
Figure 0005931730
ＦａｂＤのＢｉａｃｏｒｅ方法
Ｆａｂ−ｄＡｂとＦａｂ−ｄｉｄＡｂ構築体との相互作用の結合親和性及び動力学的パラメータは、ＣＭ５センサーチップ及びＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０）ランニング緩衝液を用いてＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００で実施した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。ヒトＦａｂ試料は、ヒトＦ（ａｂ’）２に特異的なヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００６−０９７）又はインハウスで作製した抗ヒトＣＨ１モノクローナル抗体のどちらかを使用して、センサーチップ表面に捕捉させた。マウスＦａｂ試料は、マウスＦ（ａｂ’）２に特異的なヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５−００６−０７２）を使用して捕捉した。捕捉抗体の共有的固定は標準のアミンカップリング化学によって達成した。
それぞれのアッセイサイクルは、最初に１分間の注入を使用したＦａｂ−ｄＡｂ又はＦａｂ−ｄｉｄＡｂ構築体の捕捉、次いで３分間の抗原の注入からなる会合段階からなり、その後、解離を５分間監視した。それぞれのサイクルの後、捕捉表面を、２×１分間の４０ｍＭのＨＣｌの注入、次いで３０秒間の５ｍＭのＮａＯＨの注入を用いて再生した。使用した流速は、捕捉には１０μｌ／分、会合及び解離段階には３０μｌ／分、並びに再生には１０μｌ／分であった。
動力学的アッセイでは、抗原の滴定（ヒト又はマウスの血清アルブミンでは典型的には６２．５ｎＭ〜２μＭであり、ＩＬ−１βでは１．２５〜４０ｎＭであり、細胞表面受容体Ｄでは２０〜１．２５ｎＭである）を行い、ブランクのフローセルを参照の減算に使用し、機器のノイズ及びドリフトを減算するために緩衝液ブランクの注入を含めた。
動力学的パラメータは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアを使用して、生じたセンサーグラムを、標準の１：１結合モデルに、同時に総合的に当てはめることによって決定した。同時結合について試験するために、別個の５μＭのＨＳＡ若しくは１００ｎＭのＩＬ−１β、又は５μＭのＨＳＡ及び１００ｎＭのＩＬ−１βの混合溶液のどちらかの３分間の注入を、捕捉されたＦａｂ−ｄＡｂの上に注入した。アルブミン及び細胞表面受容体Ｄの同時結合は、２μＭのＨＳＡ若しくはＭＳＡ及び２０ｎＭのマウス細胞表面受容体Ｄの最終濃度を使用して、同じ様式で評価した。
（例１７）
ｍＦａｂＣ−ｍｄｉｄＡｂ及びｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂの哺乳動物発現
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎ形質移入試薬を使用して、製造者の指示に従って、ＨＥＫ２９３細胞を、重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて形質移入した。手短に述べると、２μｇの重鎖プラスミド＋２μｇの軽鎖プラスミドを、１０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ＋３４０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地と共に、２０分間、室温でインキュベーションした。その後、混合物を懸濁液中の５×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に加え、６日間、振盪しながら３７℃でインキュベーションした。
ＥＬＩＳＡ
ｍＦａｂ−ｍｄｉｄＡｂの収率はサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定した。手短に述べると、ｍＦａｂ−ｍｄｉｄＡｂを抗ＣＨ１抗体で捕捉し、その後、抗カッパ−ＨＲＰを用いて表示させた。
Figure 0005931730
（例１８）
さらなる動力学的分析を実施して、血清アルブミン及びヒトＯＸ４０と、精製したＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及び−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）の融合体並びにＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及び−ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）の融合体との相互作用を評価した（表１９）。ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及び−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）並びにＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及び−ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）はどちらも、元のＦａｂＢのヒトＯＸ４０に対する親和性を保持していた（表２０）。
ＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及び−ｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）並びにＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂ、−ｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及び−ｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）の構築体が、ヒト又はマウスの血清アルブミン及びヒトＯＸ４０の両方と同時に結合する潜在性は、それぞれのＦａｂ−ｄｉｄＡｂ構築体をセンサーチップ表面に捕捉させ、その後、別個の２μＭのアルブミン（ヒト若しくはマウス）又は５０ｎＭのヒトＯＸ４０、或いは２μＭのアルブミン及び５０ｎＭのＯＸ４０の両方の混合溶液の３分間の注入を行うことによって評価した。ＨＳＡ結合はどちらのＦａｂ−ｄｉｄＡｂ構築体でも見られた。それぞれのＦａｂ−ｄｉｄＡｂ構築体について、合わせたアルブミン／ＯＸ４０溶液で見られた応答は、独立した注入の応答の合計とほぼ同一であった（表２１中に要約）。これは、Ｆａｂ−ｄｉｄＡｂはＯＸ４０及び血清アルブミンの両方と同時結合することができることを示している。元のＦａｂＢはＯＸ４０のみと結合し、ヒト又はマウスのアルブミンのどちらとも有意な結合は存在しなかった。
Figure 0005931730
ＨＳＡ及びＭＳＡとＦａｂ−ｄｉｄＡｂの融合体との結合について決定された親和性及び動力学的パラメータ。
Figure 0005931730
ｈＯＸ４０−ＦｃとＦａｂＢ及びＦａｂＢ−ｄｉｄＡｂの融合体との結合の親和性及び動力学的パラメータ。
Figure 0005931730
上記表は、ＨＳＡ若しくはＭＳＡ又はｈＯＸ４０−Ｆｃの別個の注入、或いは事前に混合したアルブミン及びｈＯＸ４０−Ｆｃの注入の後に、それぞれの構築体について見られる結合応答（ＲＵ）を示す。それぞれの場合で、最終濃度は２μＭのアルブミンＨＳＡ及び５０ｎＭのｈＯＸ４０−Ｆｃであった。個々のアルブミン及びｈＯＸ４０−Ｆｃの応答の合計を括弧内に示す。
（例１９）
さらなる動力学的分析を実施して、血清アルブミン及びマウス細胞表面受容体Ｄと、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）並びにｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）との相互作用を評価した（表２２）。どちらのｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂも、ＨＳＡとの比較的高い親和性の結合を示した（それぞれＫＤ＝２．７８ｎＭ及び８．９７ｎＭ）。また、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）は、同様の親和性（ＫＤ＝２２ｎＭ）でＭＳＡとも結合したが、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）では、ＭＳＡとの結合は見られなかった。どちらのｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂも、元のｍＦａｂＤのマウス細胞表面受容体Ｄに対する親和性を保持していた（表２３）。
ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）並びにｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）が、ヒト又はマウスの血清アルブミン及びマウス細胞表面受容体Ｄと同時に結合する潜在性は、それぞれのｍＦａｂ−ｍｄｉｄＡｂ構築体をセンサーチップ表面に捕捉させ、その後、別個の２μＭのアルブミン（ヒト若しくはマウス）又は２０ｎＭのマウス細胞表面受容体Ｄ、或いは２μＭのアルブミン及び２０ｎＭの細胞表面受容体Ｄの両方の混合溶液の３分間の注入を行うことによって評価した。ここでも、ＨＳＡ結合はどちらのｍＦａｂ−ｍｄｉｄＡｂ構築体でも見られた一方で、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）のみがＭＳＡと結合した。それぞれのｍＦａｂ−ｍｄｉｄＡｂ構築体について、合わせたアルブミン／細胞表面受容体Ｄ溶液で見られた応答は、独立した注入の応答の合計とほぼ同一であった（表２４中に要約）。これは、ｍＦａｂ−ｍｄｉｄＡｂは細胞表面受容体Ｄ及び血清アルブミンの両方と同時結合することができることを示している。元のｍＦａｂＤは細胞表面受容体Ｄのみと結合し、ヒト又はマウスのアルブミンのどちらとも有意な結合は存在しなかった。
Figure 0005931730
ＨＳＡ及びＭＳＡと、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）並びにｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）との結合について決定された親和性及び動力学的パラメータ。
Figure 0005931730
マウス細胞表面受容体Ｄ−Ｆｃと、ｍＦａｂＤ、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）並びにｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）との結合の親和性及び動力学的パラメータ。
Figure 0005931730
上記表は、ＨＳＡ若しくはＭＳＡ又はマウス細胞表面受容体Ｄ−Ｆｃの別個の注入、或いは事前に混合したアルブミン及びマウス細胞表面受容体Ｄ−Ｆｃの注入の後に、それぞれの構築体について見られる結合応答（ＲＵ）を示す。それぞれの場合で、最終濃度は２μＭのアルブミンＨＳＡ及び２０ｎＭのマウス細胞表面受容体Ｄ−Ｆｃであった。個々のアルブミン及びマウス細胞表面受容体Ｄ−Ｆｃの応答の合計を括弧内に示す。
（例２０）
さらなる分析を実施して、ｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ１（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ１（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）又はｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂ、−ｍｄＡｂＬ２（ＣＫ−Ｇ４Ｓ×２）及びｍｄＡｂＨ２（ＣＨ１−Ｇ４Ｓ×２）と、細胞表面上に発現された血清アルブミン及びマウス細胞表面受容体Ｄとの同時相互作用を評価した。どちらのｍＦａｂＤ−ｍｄｉｄＡｂも、活性化したマウスＴ細胞の細胞表面上に発現された、ＦＩＴＣで標識したＨＳＡ及び細胞表面受容体Ｘと同時に結合することができた（図１１）。ｍＦａｂＤは、活性化したマウスＴ細胞の細胞表面上に発現された細胞表面受容体Ｘと結合することができたが（データ示さず）、ＦＩＴＣで標識したＨＳＡとは結合しなかった。
（例２１）
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）の発現及び精製
哺乳動物発現
形質移入の前に、１．４×１０１０個のＣＨＯ−ＳＶ細胞をアール（Ｅａｒｌｓ）バランス塩溶液（ＥＢＳＳ）で洗浄し、ペレット化した。７ｍｇの重鎖及び７ｍｇの軽鎖のプラスミドＤＮＡを細胞に加えた。ＥＢＢＳ緩衝液は１０ｍｌの最終体積まで加える。最適化した電気パラメータをインハウスの電気穿孔器上で使用して、キュベット１個あたり８００μｌの上記を電気穿孔した。形質移入した細胞を、ｇｌｕｔａｍａｘ、ＨＴ及び抗真菌抗生物質溶液を添加した７×１ＬのＣＤ−ＣＨＯ培地に直接移した。細胞をインキュベーションし、３７℃で２４時間振盪し、その後、３２℃に移行させた。３ｍＭの酪酸ナトリウムを４日目に加えた。上清を１０又は１４日目に１５００×ｇでの遠心分離によって回収して、細胞を除去した。発現レベルはタンパク質Ｇアッセイによって決定した。
哺乳動物上清の濃度
１５μｇ／ｍｌのＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）を含有するプールした哺乳動物上清を、２×１０ｋＤａの分子量カットオフのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を装着したＭｉｎｉｓｅｔｔｅ濃縮機を使用して、６．５Ｌから８００ｍｌまで濃縮した。
タンパク質Ｇ精製
濃縮した上清を、１３５ｃｍ／時で、２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化した５０ｍｌのＧａｍｍａｂｉｎｄ Ｐｌｕｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに施用した。カラムを２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、結合した材料を０．１Ｍのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．７で溶出させた。溶出ピークを収集し、２Ｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．８を用いてｐＨを約ｐＨ７に調節した。１０ｋＤａの分子量カットオフの膜を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５濃縮機及びスイングアウトローター中の４０００×ｇでの遠心分離を使用して、ｐＨを調節した溶出液を７ｍｌまで濃縮し、２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中にダイアフィルトレーションした。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００精製
濃縮及びダイアフィルトレーションしたタンパク質Ｇ溶出液を、２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化したＸＫ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに適用した。均一濃度勾配の２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて３０ｃｍ／時でカラムを展開させた。５ｍｌの画分を収集し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ Ｔｒｉｃｏｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって分析し、均一濃度勾配の２０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を１ｍｌ／分で用いて展開させた。単量体のみを含有する画分をプールし、１０ｋＤａの分子量カットオフの膜を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５濃縮機及びスイングアウトローター中の４０００×ｇでの遠心分離を使用して、約１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）をＰＢＳで０．３２ｍｇ／ｍｌまで希釈し、２６μｌに１０μＬの４×ＬＤＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試料ランニング緩衝液を加えた。非還元試料には、４μＬの１００ｍＭのＮＥＭを加え、還元試料には、４μＬの１０×還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。試料を渦撹拌し、１００℃で３分間インキュベーションし、冷却し、１２５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。調製した試料を１０μｌ／２μｇで４〜２０％のアクリルアミントリス／グリシンＳＤＳゲル上に載せ、１１０分間、１２５Ｖで流した。ゲルをクマシーブルータンパク質染色で染色し、７．５％の酢酸で脱染色した。図２５を参照されたい。還元及び非還元条件下のどちらにおいても、ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）は本質的に１つのバンドである。非還元ゲル上の主バンドの上下の２つの副バンドは、鎖間ジスルフィド結合のうちのどちらか一方が形成されていないものである。還元ゲル上の主バンドの上の１つの副バンドは、還元不可能なＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）である。図２５を参照されたい。
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）のサイズ排除分析
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。１００μｌのこれをＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ Ｔｒｉｃｏｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に注入し、均一濃度勾配のＰＢＳを用いて１ｍｌ／分で展開させた。ピークは２８０ｎｍ及び２１４ｎｍでの吸光度によって検出した。図２６を参照されたい。クロマトグラム中に１３．４４メトリック分の保持時間を有する単一の対称ピークが存在する。同じ条件下で流したＢｉｏＲａｄゲル濾過標準物質（１５１−１９０１）保持時間から作成した検量線を用いて、このピーク保持時間を見かけの分子量に変換した。ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）の見かけの分子量は８７ｋＤａであった。
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）の熱安定性分析
熱安定性を測定するために、ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）をＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。四つ組で、１μｌのこの希釈した試料に、８μｌのＰＢＳ及び１μｌの３０×ストックのＳｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅ蛍光色素を３８４ウェルプレート中で加えた。７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステムを使用してプレートを２０から９９℃まで加熱し、蛍光（４９０ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの発光）を測定した。図２７Ａを参照されたい。ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）は、７０℃より高いＴｍを有する熱的に安定な分子である。
一定範囲のｐＨにわたる熱安定性を測定するために、１０ｍｇ／ｍｌのＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）を、０．２ずつ増大するｐＨ２．２〜８．０の緩衝液で０．１１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。ｐＨ緩衝液は、０．１Ｍのクエン酸及び０．２Ｍのリン酸水素二ナトリウムを加え、イオン強度を同等化するためにＮａＣｌを加えることによって調製した。４５μｌのそれぞれのｐＨの希釈した試料に、５μｌの３０×ストックのＳｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅ蛍光色素を加えた。１０μｌのこれらのアリコートを、四つ組で、３８４ウェルプレート中で分析した。７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステムを使用してプレートを２０から９９℃まで加熱し、蛍光（４９０ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの発光）を測定した。その後、ＴｍをｐＨに対してプロットした。図２７Ｂを参照されたい。ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）のｇＡ２６Ｆａｂ及び６４５ｄｓＦｖドメインはどちらも、ｐＨ４．５〜８．０の範囲にわたって、ｐＨによって大きな影響を受けないＴｍを有する。ｐＨ４．５未満では、ｐＨ４．０で２つの別々のアンフォールディング事象が区別できなくなるまで、どちらのドメインのＴｍも減少し、この単一の事象は６５℃のＴｍを有する。この区別できない単一のアンフォールディング事象のＴｍは、ｐＨの減少に伴って減少し続けるが、それでもｐＨ２．２で５０℃より高い。
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性は、細胞に基づくＯＸ４０リガンド遮断アッセイによって評価した。手短に述べると、ヒトＰＢＭＣを単離し、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｌ（植物性赤血球凝集素−Ｌ）と共に２４〜７２時間、３７℃／５％のＣＯ２でインキュベーションすることによって活性化した。その後、細胞をＰＢＳ／０．０９％のアジ化ナトリウムで洗浄し、９６ウェルの培養プレートに０．２５×１０６個の細胞／ウェルで播種した。ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）の希釈液をＰＢＳ／５％のＨＳＡ中で調製した。また、４μｇ／ｍｌのビオチン標識したＣＤ２５２−ＣＤ８融合タンパク質の溶液もＰＢＳ／５％のＨＳＡ中で調製した。５０μｌのそれぞれのＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）の希釈液を５０μｌのＣＤ２５２−ＣＤ８融合タンパク質に加え、混合物を活性化したＴ細胞と共に３０分間、４℃でインキュベーションした。このインキュベーションの後、細胞をＰＢＳ／０．０９％のアジ化ナトリウムで洗浄した。その後、活性化したＴ細胞を１００μｌのＰＢＳ中のストレプトアビジン−ＰＥと共に３０分間、４℃でインキュベーションした。細胞をＰＢＳ／０．０９％のアジ化ナトリウムで再度洗浄し、その後、緩衝液に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）は、ＯＸ４０リガンドとヒトＰＢＭＣの表面上に発現されたＯＸ４０との結合を、約３．５ｎＭのＥＣ５０で遮断することが示された。図２８を参照されたい。
ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ｉｎ ｖｉｖｏでの用量応答の関係性を研究するために、ＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）を用いた研究を行った。手短に述べると、これはＨｕＳＣＩＤマウスにおける０．３、３及び３０μｇ／ｍｌの定常状態の投薬を含み、Ｔ細胞生着の防止が読み取られた。
ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスに、２．４７５ｍｇ／ｋｇ又は０．２４７５ｍｇ／ｋｇ又は０．０２４７５ｍｇ／ｋｇのＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）ＰＢＳの負荷用量を皮下で−２日目に投薬した。１４日目を含めた、その後のそれまでの毎日に、これらに０．７５ｍｇ／ｋｇ又は０．０７５ｍｇ／ｋｇ又は０．００７５ｍｇ／ｋｇのＦａｂＢ−６４５ｄｓＦｖ（３×Ｇ４Ｓ）又はＰＢＳの維持量を皮下で投薬した。それぞれの投薬群は９〜１０匹のマウスからなっていた。−１日目に、ナチュラルキラー細胞の活性を抑止するために、すべてのマウスを０．８７ｍｇ／マウスのラット抗マウスＴＭ−β１抗体で処置した。０日目に、すべてのマウスに８×１０６個のヒト末梢血単核球の腹膜間（ｉｎｔｅｒ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）注射を与えた。１４日目にマウスを屠殺し、血液、脾臓及び腹膜洗浄液を採取した。試料はＦＡＣＳによってＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞について分析した。データ組はダネット試験後比較を用いた一方向Ａｎｏｖａによって分析した。図２９Ａ、Ｂ及びＣを参照されたい。３０及び３μｇ／ｍｌの投薬はすべての区画において同等に有効であった一方で、０．３μｇ／ｍｌの投薬は血液及び脾臓中で統計的に有効であったが、３０及び３μｇ／ｍｌの投薬によって生じた最大レベルまでではなかった。
（例２２）
６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂの構築、発現及び抗原結合
６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂプラスミドの構築
６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−３×Ｇ４Ｓ、Ｈ−３×Ｇ４Ｓ）、６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−ＴＶＡＡＰ、Ｈ−ＡＳＴＫＧＰ）、６４５ｄｓＦｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−３×Ｇ４Ｓ、Ｈ−３×Ｇ４Ｓ）、６４５ｄｓＦｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−ＴＶＡＡＰ、Ｈ−ＡＳＴＫＧＰ）の全遺伝子合成は、第三者請負業者が行った（ＤＮＡ２．０）。６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂのアミノ酸配列には図３０Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを参照されたい。すべての遺伝子は、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下にある、ＵＣＢが所有権を有する哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。
６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂの哺乳動物発現
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎ形質移入試薬を使用して、製造者の指示に従って、ＨＥＫ２９３細胞を、重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて形質移入した。手短に述べると、２μｇの重鎖プラスミド及び２μｇの軽鎖プラスミドを、１０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ及び３４０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地と共に、２０分間、室温でインキュベートした。その後、混合物を懸濁液中の５×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に加え、４日間、振盪しながら３７℃でインキュベーションした。４日後、上清を１５００×ｇでの遠心分離によって収集して細胞を除去し、その後、０．２２μｍで滅菌濾過した。
６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂの定量
哺乳動物上清中のＦｖ−Ｆａｂの濃度はサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。試料中のＦｖ−Ｆａｂを抗ＣＨ１抗体で捕捉し、抗カッパ−ＨＲＰのコンジュゲートで検出した。検出抗体をＴＭＢで展開させ、未知の試料の濃度を検量線から計算した。すべての６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂは同様の発現レベルを有していたが、ジスルフィド安定化されたＦｖバージョンは、ジスルフィド安定化されていないバージョンのレベルの５５％〜７５％で発現された。図３１を参照されたい。
６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂの抗原結合
Ｂｉａｃｏｒｅ方法
Ｆｖ−Ｆａｂ構築体の相互作用の動力学的定数及び結合応答は、ＣＭ５センサーチップを用いたＢｉａｃｏｒｅ３０００で実施した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。ランニング緩衝液であるＨＢＳ−ＥＰは、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４からなっていた。インハウスで作製した抗ヒトＣＨ１モノクローナル抗体を使用して、試料をセンサーチップ表面上に捕捉させた。捕捉抗体の共有的固定は標準のアミンカップリング化学によって達成した。
アッセイサイクルは、１分間のＦｖ−Ｆａｂ構築体の捕捉、次いで会合段階（ＨＳＡでは３分間又はｈＩＬ１３では６分間）からなり、その後、解離を５分間（ＨＳＡ）又は２０分間（ｈＩＬ１３）監視した。それぞれのサイクルの後、捕捉表面を、２×１分間の４０ｍＭのＨＣｌの注入、次いで３０秒間の５ｍＭのＮａＯＨの注入を用いて再生した。使用した流速は、捕捉には１０μｌ／分、会合及び解離段階には３０μｌ／分、並びに再生には１０μｌ／分であった。
動力学的アッセイは抗原の滴定によって行った（ＨＳＡでは５０ｎＭ〜０．３１２５ｎＭの倍加希釈であり、ｈＩＬ１３では−２０ｎＭの単一の濃度である）。ブランクのフローセル及び緩衝液ブランクの注入により、データの二重参照が可能となった。
動力学的パラメータは、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、４．１評価ソフトウェアを使用して、生じたセンサーグラムを、標準の１：１結合モデルに、同時に総合的に当てはめることによって決定した。
同時結合について試験するために、別個の５０ｎＭのＨＳＡ若しくは２０ｎＭのｈＩＬ１３、又は５０ｎＭのＨＳＡ及び２０ｎＭのｈＩＬ１３の混合液の６分間の注入を、捕捉されたＦｖＦａｂの上に注入した。
Ｂｉａｃｏｒｅ親和性実験
動力学的分析を実施して、ＨＳＡ及びｈＩＬ１３と、６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−３×Ｇ４Ｓ、Ｈ−３×Ｇ４Ｓ）、６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−ＴＶＡＡＰ、Ｈ−ＡＳＴＫＧＰ）、６４５ｄｓＦｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−３×Ｇ４Ｓ、Ｈ−３×Ｇ４Ｓ）及び６４５ｄｓＦｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−ＴＶＡＡＰ、Ｈ−ＡＳＴＫＧＰ）との相互作用の親和性を評価した。図３０Ａ及び３０Ｂを参照されたい。すべてのＦｖ−Ｆａｂは等価な親和性及び結合レベルでＨＳＡと結合した。
６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−３×Ｇ４Ｓ、Ｈ−３×Ｇ４Ｓ）及び６４５ｄｓＦｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−３×Ｇ４Ｓ、Ｈ−３×Ｇ４Ｓ）は、約０．１ｎＭの親和性でｈＩＬ１３と結合する一方で、６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−ＴＶＡＡＰ、Ｈ−ＡＳＴＫＧＰ）及び６４５ｄｓＦｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−ＴＶＡＡＰ、Ｈ−ＡＳＴＫＧＰ）は、約０．６ｎＭの親和性で結合する。ＴＶＡＡＰ／ＡＳＴＫＧＰリンカーと比較して３×Ｇ４Ｓリンカーを有するＦｖ−Ｆａｂに対するｈＩＬ１３の親和性の相違は、主に会合速度である。ジスルフィド安定化された及びジスルフィド安定化されていないＦｖ−Ｆａｂに対するｈＩＬ１３及びＨＳＡの親和性は等価であった。また、すべての構築体に対するｈＩＬ１３の結合レベルも等価である。
Ｆｖ−Ｆａｂである６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−３×Ｇ４Ｓ、Ｈ−３×Ｇ４Ｓ）、６４５Ｆｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−ＴＶＡＡＰ、Ｈ−ＡＳＴＫＧＰ）、６４５ｄｓＦｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−３×Ｇ４Ｓ、Ｈ−３×Ｇ４Ｓ）及び６４５ｄｓＦｖ−６５２Ｆａｂ（Ｌ−ＴＶＡＡＰ、Ｈ−ＡＳＴＫＧＰ）と、ＨＳＡ及びｈＩＬ１３の両方との同時結合を評価した。それぞれのＦｖ−Ｆａｂ構築体をセンサーチップ表面に捕捉させ、次いで別個の５０ｎＭのＨＳＡ若しくは２０ｎＭのｈＩＬ１３、又は５０ｎＭのＨＳＡ及び２０ｎＭのｈＩＬ１３の両方の混合溶液の６分間の注入を行った。それぞれのＦｖ−Ｆａｂ構築体について、合わせたＨＳＡ／ｈＩＬ１３溶液の結合応答は独立した注入の応答の合計に等価であった。図３２Ｃを参照されたい。これは、Ｆｖ−Ｆａｂが、ｈＩＬ１３及びＨＳＡの両方と同時結合できることを実証している。
図３２Ｃは、ＨＳＡ若しくはｈＩＬ１３の別個の注入、又は事前に混合したＨＳＡ及びｈＩＬ１３の注入の後に、それぞれの構築体について見られる結合応答（ＲＵ）を示す。それぞれの場合で、最終濃度は５０ｎＭのＨＳＡ及び２０ｎＭのｈＩＬ１３であった。個々のＨＳＡ及びｈＩＬ１３の応答の合計を括弧内に示す。
配列番号： 1
<223> リンカー
配列番号： 2
<223> リンカー
配列番号： 3
<223> リンカー
配列番号： 4
<223> リンカー
配列番号： 5
<223> リンカー
<222> (7)..(7)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号： 6
<223> リンカー
<222> (7)..(7)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号： 7
<223> リンカー
配列番号： 8
<223> リンカー
配列番号： 9
<223> リンカー
配列番号： 10
<223> リンカー
配列番号： 11
<223> リンカー
配列番号： 12
<223> リンカー
配列番号： 13
<223> リンカー
配列番号： 14
<223> リンカー
配列番号： 15
<223> リンカー
配列番号： 16
<223> リンカー
配列番号： 17
<223> リンカー
配列番号： 18
<223> リンカー
配列番号： 19
<223> リンカー
配列番号： 20
<223> リンカー
配列番号： 21
<223> リンカー
配列番号： 22
<223> リンカー
配列番号： 23
<223> リンカー
配列番号： 24
<223> リンカー
配列番号： 25
<223> リンカー
配列番号： 26
<223> リンカー
配列番号： 27
<223> リンカー
配列番号： 28
<223> リンカー
配列番号： 29
<223> リンカー
配列番号： 30
<223> リンカー
配列番号： 31
<223> リンカー
配列番号： 32
<223> リンカー
配列番号： 33
<223> リンカー
配列番号： 34
<223> リンカー
配列番号： 35
<223> リンカー
配列番号： 36
<223> ヒンジ
配列番号： 37
<223> リンカー
配列番号： 38
<223> ヒンジ
配列番号： 39
<223> リンカー
配列番号： 40
<223> ヒンジ
配列番号： 41
<223> ヒンジ
配列番号： 42
<223> リンカー
配列番号： 43
<223> リンカー
配列番号： 44
<223> リンカー
配列番号： 45
<223> リンカー
配列番号： 46
<223> リンカー
配列番号： 47
<223> リンカー
配列番号： 48
<223> リンカー
配列番号： 49
<223> リンカー
<222> (7)..(7)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (12)..(12)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号： 50
<223> リンカー
<222> (7)..(7)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (12)..(12)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (17)..(17)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号： 51
<223> リンカー
<222> (7)..(7)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (12)..(12)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (17)..(17)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (22)..(22)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号： 52
<223> ドメイン抗体 H1
配列番号： 53
<223> ドメイン抗体 L1
配列番号： 54
<223> ドメイン抗体 H2
配列番号： 55
<223> ドメイン抗体 L2
配列番号： 56
<223> ドメイン抗体 H1 CDR-H1
配列番号： 57
<223> ドメイン抗体 H1 CDR-H2
配列番号： 58
<223> ドメイン抗体 H1 CDR-H3
配列番号： 59
<223> ドメイン抗体 L1 CDR-L1
配列番号： 60
<223> ドメイン抗体 L1 CDRL2
配列番号： 61
<223> ドメイン抗体 L1 CDR-L3
配列番号： 62
<223> ドメイン抗体 H2 CDR-H1
配列番号： 63
<223> ドメイン抗体 H2 CDR-H2
配列番号： 64
<223> ドメイン抗体 H2 CDR-H3
配列番号： 65
<223> ドメイン抗体 L2 CDR-L1
配列番号： 66
<223> ドメイン抗体 L2 CDR-L2
配列番号： 67
<223> ドメイン抗体 L2 CDR-L3
配列番号： 68
<223> Fab B-dAbH1 (CH1-G4S4)
配列番号： 69
<223> FabB-dAbH2 (CH1-G4Sx2)
配列番号： 70
<223> FabB dAbL1 (cCH1-G4Sx2)
配列番号： 71
<223> FabB dAbL2 (CH1-G4Sx2)
配列番号： 72
<223> FabB dABL1 (CK1 G4Sx2)
配列番号： 73
<223> FabB dAbL2 (CK1 G4Sx2)
配列番号： 74
<223> Fab'A 重鎖
配列番号： 75
<223> FabA 軽鎖
配列番号： 76
<223> Fab'A 重鎖 (修飾リンカー)
配列番号： 77
<223> FabA 重鎖
配列番号： 78
<223> mdAbH1
配列番号： 79
<223> mdAbL1
配列番号： 80
<223> mdAbH2
配列番号： 81
<223> mdAbL2
配列番号： 82
<223> mFabD-mdidAb dAbH1(CH1-G4Sx2)
配列番号： 83
<223> mFabD-mdidAb, -dAbL1(CK-G4Sx2)
配列番号： 84
<223> mFabD-mdidAb, -dAbH2(CH1-G4Sx2)
配列番号： 85
<223> mFabD-mdidAb, -dAbL2(CK-G4Sx2)
配列番号： 86
<223> dAbH1(CH1-G4Sx2)mFabC-mdAbH1
配列番号： 87
<223> mFabC-mdidAb, -dAbL1(CK-G4Sx2)
配列番号： 88
<223> mFabC-mdidAb dAbH2(CH1-G4Sx2)
配列番号： 89
<223> mFabC-mdidAb, -dAbL2(CK-G4Sx2)
配列番号： 90
<223> 646Fv CDRH3
配列番号： 91
<223> 646Fv CDRL1
配列番号： 92
<223> 646Fv CDRL2
配列番号： 93
<223> 646Fv CDRL3
配列番号： 94
<223> 647Fv CDRH1
配列番号： 95
<223> 647Fv CDRH2
配列番号： 96
<223> 647Fv CDRH3
配列番号： 97
<223> 647Fv QASQSLGNRLA
配列番号： 98
<223> 647Fv CDRL2
配列番号： 99
<223> 647Fv CDRL3
配列番号： 100
<223> 649Fv CDRH1
配列番号： 101
<223> 649Fv CDRH2
配列番号： 102
<223> 649Fv CDRH3
配列番号： 103
<223> 649Fv CDRL1
配列番号： 104
<223> 649Fv CDRL2
配列番号： 105
<223> 649Fv CDRL3
配列番号： 106
<223> 645重鎖I50AFv CDRH1
配列番号： 107
<223> 645重鎖I50AFv CDRH2
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配列番号： 109
<223> 645重鎖I50AFv CDRL1
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配列番号： 114
<223> 645重鎖T56AFv CDRL2
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<223> 645重鎖T95AFv CDRL1
配列番号： 122
<223> 645重鎖T95AFv CDRL2
配列番号： 123
<223> 645重鎖T95AFv CDRL3
配列番号： 124
<223> 645重鎖V96AFv CDRH1
配列番号： 125
<223> 645重鎖V96AFv CDRH2
配列番号： 126
<223> 645重鎖V96AFv CDRH3
配列番号： 127
<223> 645重鎖V96AFv CDRL1
配列番号： 128
<223> 645重鎖V96AFv CDRL2
配列番号： 129
<223> 645重鎖V96AFv CDRL3
配列番号： 130
<223> 645重鎖P97AFv CDRH1
配列番号： 131
<223> 645重鎖P97AFv CDRH2
配列番号： 132
<223> 645重鎖P97AFv CDRH3
配列番号： 133
<223> 645重鎖P97AFv CDRL1
配列番号： 134
<223> 645重鎖P97AFv CDRL2
配列番号： 135
<223> 645重鎖P97AFv CDRL3
配列番号： 136
<223> 645重鎖G98AFv CDRH1
配列番号： 137
<223> 645重鎖G98AFv CDRH2
配列番号： 138
<223> 645重鎖G98AFv CDRH3
配列番号： 139
<223> 645重鎖G98AFv CDRL1
配列番号： 140
<223> 645重鎖G98AFv CDRL2
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<223> 645重鎖G98AFv CDRL3
配列番号： 142
<223> 645重鎖Y99AFv CDRH1
配列番号： 143
<223> 645重鎖Y99AFv CDRH2
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<223> 645重鎖Y99AFv CDRH3
配列番号： 145
<223> 645重鎖Y99AFv CDRL1
配列番号： 146
<223> 645重鎖Y99AFv CDRL2
配列番号： 147
<223> 645重鎖Y99AFv CDRL3
配列番号： 148
<223> 645重鎖S100AFv CDRH1
配列番号： 149
<223> 645重鎖S100AFv CDRH2
配列番号： 150
<223> 645重鎖S100AFv CDRH3
配列番号： 151
<223> 645重鎖S100AFv CDRL1
配列番号： 152
<223> 645重鎖S100AFv CDRL2
配列番号： 153
<223> 645重鎖S100AFv CDRL3
配列番号： 154
<223> 645重鎖T100aAFv CDRH1
配列番号： 155
<223> 645重鎖T100aAFv CDRH2
配列番号： 156
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配列番号： 157
<223> 645重鎖T100aAFv CDRL1
配列番号： 158
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配列番号： 160
<223> 645重鎖P100cAFv CDRH1
配列番号： 161
<223> 645重鎖P100cAFv CDRH2
配列番号： 162
<223> 645重鎖P100cAFv CDRH3
配列番号： 163
<223> 645重鎖P100cAFv CDRL1
配列番号： 164
<223> 645重鎖P100cAFv CDRL2
配列番号： 165
<223> 645重鎖P100cAFv CDRL3
配列番号： 166
<223> 645重鎖I50A+T95AFv CDRH1
配列番号： 167
<223> 645重鎖I50A+T95AFv CDRH2
配列番号： 168
<223> 645重鎖I50A+T95AFv CDRH3
配列番号： 169
<223> 645重鎖I50A+T95AFv CDRL1
配列番号： 170
<223> 645重鎖I50A+T95AFv CDRL2
配列番号： 171
<223> 645重鎖I50A+T95AFv CDRL3
配列番号： 172
<223> 645重鎖I50A+G98AFv CDRH1
配列番号： 173
<223> 645重鎖I50A+G98AFv CDRH2
配列番号： 174
<223> 645重鎖I50A+G98AFv CDRH3
配列番号： 175
<223> 645重鎖I50A+G98AFv CDRL1
配列番号： 176
<223> 645重鎖I50A+G98AFv CDRL2
配列番号： 177
<223> 645重鎖I50A+G98AFv CDRL3
配列番号： 178
<223> 645重鎖I50A+Y99AFv CDRH1
配列番号： 179
<223> 645重鎖I50A+Y99AFv CDRH2
配列番号： 180
<223> 645重鎖I50A+Y99AFv CDRH3
配列番号： 181
<223> 645重鎖I50A+Y99AFv CDRL1
配列番号： 182
<223> 645重鎖I50A+Y99AFv CDRL2
配列番号： 183
<223> 645重鎖I50A+Y99AFv CDRL3
配列番号： 184
<223> 645重鎖T56A+T95AFv CDRH1
配列番号： 185
<223> 645重鎖T56A+T95AFv CDRH2
配列番号： 186
<223> 645重鎖T56A+T95AFv CDRH3
配列番号： 187
<223> 645重鎖T56A+T95AFv CDRL1
配列番号： 188
<223> 645重鎖T56A+T95AFv CDRL2
配列番号： 189
<223> 645重鎖T56A+T95AFv CDRL3
配列番号： 190
<223> 645重鎖T56A+G98AFv CDRH1
配列番号： 191
<223> 645重鎖T56A+G98AFv CDRH2
配列番号： 192
<223> 645重鎖T56A+G98AFv CDRH3
配列番号： 193
<223> 645重鎖T56A+G98AFv CDRL1
配列番号： 194
<223> 645重鎖T56A+G98AFv CDRL2
配列番号： 195
<223> 645重鎖T56A+G98AFv CDRL3
配列番号： 196
<223> 645重鎖T56A+Y99AFv CDRH1
配列番号： 197
<223> 645重鎖T56A+Y99AFv CDRH2
配列番号： 198
<223> 645重鎖T56A+Y99AFv CDRH3
配列番号： 199
<223> 645重鎖T56A+Y99AFv CDRL1
配列番号： 200
<223> 645重鎖T56A+Y99AFv CDRL2
配列番号： 201
<223> 645重鎖T56A+Y99AFv CDRL3
配列番号： 202
<223> 645dsFv 重鎖Fv
配列番号： 203
<223> 645dsFv 軽鎖Fv
配列番号： 204
<223> 648dsFv 重鎖Fv
配列番号： 205
<223> 648dsFv 軽鎖Fv
配列番号： 206
<223> 645Fvの重鎖
配列番号： 207
<223> 645Fvの軽鎖
配列番号： 208
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 209
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 210
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 211
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 212
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 213
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 214
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 215
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 216
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 217
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 218
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 219
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 220
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 221
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号： 222
<223> 646Fv CDRH1
配列番号： 223
<223> 646Fv CDRH2
配列番号： 224
<223> リンカー
配列番号： 225
<223> リンカー
配列番号： 226
<223> 652 VH ドメイン
<222> (26)..(35)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (50)..(65)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (98)..(109)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号： 227
<223> 652 VL ドメイン
<222> (24)..(34)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (50)..(56)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (89)..(97)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号： 228
<223> リンカー
配列番号： 229
<223> リンカー

Claims (15)

  1. １つの対象抗原に対する第１の特異性を有するＦａｂ又はＦａｂ’断片を含み、第２の対象抗原に対する特異性を有するＶＨ／ＶＬ対である２つの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）をさらに含み、２つの単一ドメイン抗体が、ＶＨ中に１つ及びＶＬ中に１つの２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されており、２つのシステイン残基の位置が、ＶＨ４４及びＶＬ１００である、多価抗体融合タンパク質であって、
    第２の抗原がアルブミンであり、
    前記ＶＨ単一ドメイン抗体が、図５（ｅ）の配列番号５６に示す、ＣＤＲ−Ｈ１の配列を有するＣＤＲと、図５（ｆ）の配列番号５７に示す、ＣＤＲ−Ｈ２の配列を有するＣＤＲと、図５（ｇ）の配列番号５８に示す、ＣＤＲ−Ｈ３の配列を有するＣＤＲとを含み、
    前記ＶＬ単一ドメイン抗体が、図５（ｈ）の配列番号５９に示す、ＣＤＲ−Ｌ１の配列を有するＣＤＲと、図５（ｉ）の配列番号６０に示す、ＣＤＲ−Ｌ２の配列を有するＣＤＲと、図５（ｊ）の配列番号６１に示す、ＣＤＲ−Ｌ３の配列を有するＣＤＲとを含む、
    上記多価抗体融合タンパク質。
  2. ２つの単一ドメイン抗体が、第２の抗原と協同的に結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対である、請求項１に記載の多価抗体融合タンパク質。
  3. 第１の抗原及び第２の抗原が異なるタンパク質である、請求項１又は２に記載の多価抗体融合タンパク質。
  4. ＶＨ ｄＡｂが、Ｆａｂ又はＦａｂ’の重鎖に直接又は間接的に接続されている、請求項１から３までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質。
  5. ＶＬ ｄＡｂが、Ｆａｂ又はＦａｂ’の軽鎖に直接又は間接的に接続されている、請求項１から４までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質。
  6. ＶＨ ｄＡｂが、Ｆａｂ又はＦａｂ’重鎖のＣ末端に直接又は間接的に接続されており、ＶＬ ｄＡｂが、Ｆａｂ又はＦａｂ’軽鎖のＣ末端に直接又は間接的に接続されている、請求項４又は請求項５に記載の多価抗体融合タンパク質。
  7. ＶＨ及び／又はＶＬドメインが、配列番号２２４又は配列番号２２５に示す配列を有するリンカーを介してＦａｂ又はＦａｂ’断片と連結されている、請求項１から６までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質。
  8. 第２の抗原がヒト血清アルブミンである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質。
  9. ＶＨ単一ドメイン抗体が配列番号２０２に示す配列を含み、ＶＬ単一ドメイン抗体が配列番号２０３に示す配列を含む、請求項１に記載の多価抗体融合タンパク質。
  10. 請求項１から９までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する単離したＤＮＡ。
  11. 請求項１０で定義されるヌクレオチド配列を含むクローニング又は発現ベクター。
  12. 請求項１１に記載の１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞。
  13. 請求項１２に記載の宿主細胞を培養する工程及び抗体融合タンパク質を単離する工程を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質を製造する方法。
  14. 請求項１から９までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質を１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
  15. 治療に使用するための、請求項１から９までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質又は請求項１４に記載の医薬組成物。
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