JP2013505923A - ジスルフィドで安定化された多価抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
・VH37+VL95C、たとえばProtein Science、6、781〜788、Zhuら(1997)を参照、
・VH44+VL100、たとえば、Biochemistry、33、5451〜5459、Reiterら(1994)、又はJournal of Biological Chemistry、第269巻、第28号、ページ18327〜18331、Reiterら(1994)、又はProtein Engineering、第10巻、第12号、ページ1453〜1459、Rajagopalら(1997)を参照、
・VH44+VL105、たとえばJ Biochem.、118、825〜831、Luoら(1995)を参照、
・VH45+VL87、たとえばProtein Science、6、781〜788、Zhuら(1997)を参照、
・VH55+VL101、たとえばFEBS Letters、377、135〜139、Youngら(1995)を参照、
・VH100+VL50、たとえばBiochemistry、29、1362〜1367、Glockshuberら(1990)を参照、
・VH100b+VL49、
・VH98+VL46、たとえばProtein Science、6、781〜788、Zhuら(1997)を参照、
・VH101+VL46又は
・VH105+VL43、たとえば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第90巻、ページ7538〜7542、Brinkmannら(1993)、若しくはProteins、19、35〜47、Jungら(1994)を参照、
・VH106+VL57、たとえばFEBS Letters、377、135〜139、Youngら(1995)を参照
の間である(内容によりそうでないと指示されない限りは、上記リストではKabat付番(Kabatら、1987、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、米国保健社会福祉省(US Department of Health and Human Services)、NIH、米国)を用いる)。
−645Fvは、didAbL1及びH1と同等とみなす(別段に指摘しない限りは、それぞれのdABに使用するリンカーは同じである)。
648Fvは、didAbL2及びH2と同等とみなす(別段に指摘しない限りは、それぞれのdABに使用するリンカーは同じである)。
−645dsFvは、didAbL1及びH1と同等とみなし(別段に指摘しない限りは、それぞれのdABに使用するリンカーは同じである)、L1及びH1はジスルフィド結合によって安定化されている。
−648dsFvは、didAbL2及びH2と同等とみなし(別段に指摘しない限りは、それぞれのdABに使用するリンカーは同じである)、L2及びH3はジスルフィド結合によって安定化されている。
FabΔとは、鎖間システイン結合(CHとCL又はCKとの間)を欠くFabである。
ヒト血清アルブミンに特異的なdAbの生成
ヒト血清アルブミンに対する特異性を有するdAbをコードしている、インフレームのDNAにコードされた転写単位を、組換えDNA技術を使用して生成した。
抗体断片の産生
dAbと軽鎖のC末端との融合には、ヒトカッパ軽鎖定常領域(カッパ定常領域のKm3アロタイプを有する)、ペプチドリンカー及びdAbをコードしているDNAを合成し、SacI−PvuII制限断片として、ヒトガンマ−1のCH1定常領域をコードしているDNAを含有する、UCB−Celltechのインハウス発現ベクターpTTOD(Fab)(pTTO−1の誘導体、Popplewellら、Methods Mol.Biol.、2005、308:17〜30に記載)内にクローニングした。これにより、どちらもtacプロモーターの制御下にある、リンカーを介してdAbと融合されたヒト化軽鎖の遺伝子、次いでヒト化重鎖Fab断片の遺伝子からなる、2シストロン性の遺伝子配置が生じた。また、Gly4Serリンカーの上流の独特なBspE1部位、又はAla−Proに富んだリンカーの上流のAscI部位もコードされている。
以下の例では、dAbを融合させる抗体鎖は、cカッパ軽鎖はCK又はLC、重鎖定常ドメインCH1はCH1又はHCとして示す。
Fab−dAb融合タンパク質は、dAbL3又はdAbH4を、FabAの軽鎖又は重鎖のどちらかの定常領域のC末端と融合させることによって構築した。柔軟な
又は強固な
リンカーを使用してdAbをcカッパ領域(配列番号75)と連結させた一方で、リンカー
を使用してdAbをCHI領域(配列番号76)と連結させた。インハウスのpTTODベクターのFabA配列内へのサブクローニングを可能にするために、定常領域−dAbの融合体をコードしているDNA配列を、断片として合成により製造した。
又は強固な
リンカーのどちらかを介してdAbL3又はdAbH4のどちらかと融合されているC末端のcカッパをコードしている、合成した遺伝子のSacI−ApaI断片を、FabAを発現することができるプラスミドの対応する部位内にサブクローニングすることによって構築した。
軽鎖及び重鎖の両方上にdAbL3又はdAbH4を有するFabA−didAbは、CH1−dAbの融合体をコードしているApaI−EcoRI断片を、既存のFab−dAbプラスミド内にサブクローニングすることによって構築し、ここでdAbは柔軟なリンカーを介して軽鎖と融合されている。
FabB−dAb、FabB−dAbH1(CH1−G4S×2)、FabB−dAbH2(CH1−G4S×2)、FabB−dAbL1(CH1−G4S×2)、FabB−dAbL2(CH1−G4S×2)はすべて、PCRによってアセンブルし、その後、HCMV−MIEプロモーター及びSV40EポリA配列の制御下にある哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。これらは、哺乳動物細胞中で発現させるために、FabB軽鎖を含有する類似のベクターと対にした(以下を参照)。
Invitrogenの293fectin形質移入試薬を使用して、製造者の指示に従って、HEK293細胞を、重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて形質移入した。手短に述べると、2μgの重鎖プラスミド+2μgの軽鎖プラスミドを、10μlの293fectin+340μlのOptimem培地と共に、20分間、室温でインキュベーションした。その後、混合物を懸濁液中の5×106個のHEK293細胞に加え、4日間、振盪しながら37℃でインキュベーションした。
Fab−dAb構築体の相互作用の結合親和性及び動力学的パラメータは、CM5センサーチップ及びHBS−EP(10mMのHEPES(pH7.4)、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%v/vの界面活性剤P20)ランニング緩衝液を用いてBiacore T100で実施した表面プラズモン共鳴(SPR)によって決定した。Fab−dAb試料は、ヒトF(ab’)2に特異的なヤギFab(Jackson ImmunoResearch、109−006−097)又はインハウスで作製した抗ヒトCH1モノクローナル抗体のどちらかを使用して、センサーチップ表面に捕捉させた。捕捉抗体の共有的固定は標準のアミンカップリング化学によって達成した。
ペリプラズム抽出
ペリプラズム内にFab−dAbを含有する大腸菌ペレットを、100mMのトリス/HCl、10mMのEDTA、pH7.4を用いて、元の培養体積に再懸濁させた。その後、これらの懸濁液を4℃で16時間、250rpmでインキュベーションした。再懸濁させたペレットを10000×gで1時間、4℃で遠心分離した。上清を除去し、0.45μmを濾過した。
Fab−dAbを濾過した上清からタンパク質Gクロマトグラフィーによって捕捉した。手短に述べると、20分間の滞留時間を用いて、上清を、20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.1で平衡化したGammabind Plus Sepharose(GE Healthcare)カラムに適用した。カラムを20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.1で洗浄し、結合した材料を0.1Mのグリシン/HCl、pH2.8で溶出させた。溶出ピークを収集し、1Mの酢酸ナトリウムを用いてpHを約pH5に調節した。pHを調節した溶出液を濃縮し、10kのMWCO膜を使用して、50mMの酢酸ナトリウム、pH4.5中にダイアフィルトレーションした。
Fab−dAbを、pH4.5でNaClの溶出勾配を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。手短に述べると、ダイアフィルトレーションしたタンパク質Gの溶出液を、50mMの酢酸ナトリウム、pH4.5で平衡化したSource15S(GE Healthcare)カラムに適用した。カラムを50mMの酢酸ナトリウム、pH4.5で洗浄し、結合した材料を、20倍カラム体積の、50mMの酢酸ナトリウム、pH4.5中の0〜1MのNaClの直線勾配を用いて溶出させた。3番目のカラム体積の画分を、勾配全体にわたって収集した。画分をA280及びSDS−PAGEによって分析し、関連する画分をプールした。
必要な場合は、Fab−dAbをゲル濾過によってさらに精製した。手短に述べると、FabA−dAbL3(CK−SG4SE)のプールしたイオン交換溶出画分を、50mMの酢酸ナトリウム、125mMのNaCl、pH5.0で平衡化したSuperdex200(GE Healthcare)カラムに適用し、50mMの酢酸ナトリウム、125mMのNaCl、pH5.0の均一濃度勾配で溶出させた。1/120倍カラム体積の画分を、勾配全体にわたって収集した。画分をA280及びSDS−PAGEによって分析し、関連する画分をプールした。ゲル濾過を受けなかったFab−dAbでは、プールしたイオン交換溶出画分を濃縮し、10kのMWCO膜を使用して、50mMの酢酸ナトリウム、125mMのNaCl、pH5.0中にダイアフィルトレーションした。
必要な場合は試料を水で希釈し、その後、10μlに、10μLの2×試料ランニング緩衝液を加えた。非還元試料には、2μLの100mMのNEMをこの時点で加え、還元試料には、2μLの10×還元剤を加えた。試料を渦撹拌し、85℃で5分間インキュベーションし、冷却し、12500rpmで30秒間遠心分離した。調製した試料を4〜20%のアクリルアミントリス/グリシンSDSゲル上に載せ、100分間、125Vで流した。ゲルをウエスタンブロッティングのためにPVDF膜上に移したか、又はクマシーブルータンパク質染色で染色した。
ゲルを、12mMのトリス、96mMのグリシン、pH8.3中で、16時間、150mAでPVDF膜に移した。PVDF膜を1時間、PBS+0.1%のTween20(遮断緩衝液)中の2%のMarvel(商標)で遮断した。
HRP−ウサギ抗ヒトカッパ軽鎖、遮断緩衝液中の1/5000の希釈液で1時間。
マウス抗ヒト重鎖、遮断緩衝液中の1/7000の希釈液で1時間。次いで、HRP−ヤギ抗マウス、遮断緩衝液中の1/2000の希釈液で1時間。
ウサギ抗His6、遮断緩衝液中の1/1000の希釈液で1時間。次いで、HRP−ヤギ抗ウサギIgG、遮断緩衝液中の1/1000の希釈液で1時間。
試料(2μg)は、2.1mmのC8 Poroshellカラム上、80℃で、2ml/分の流速及び18〜38%のBの勾配を用いて、4分間にわたって分析した。A=H2O中の0.1%のTFA、B=80:20のIPA:MeOH中の0.065%のTFA。検出は214nmでの吸収によるものである。
Fab−dAbの収率はサンドイッチELISAを用いて測定した。手短に述べると、Fab−dAbを抗CH1抗体で捕捉し、その後、抗カッパ−HRPを用いて表示させた。
試料(mFabD−didAb)を5μg/mlのFITC(フルオレセインイソチオシアネート)で標識したHSAと共に45分間インキュベーションした。その後、試料/HSA−FITCのインキュベーションを活性化したマウスCD4+T細胞に加え、さらに45分間インキュベーションした。細胞をPBSで洗浄し、細胞に関連する蛍光をFACS(蛍光活性化細胞分取)によって測定した。
抗アルブミン抗体の作製
1/2ロップウサギを組換えchromapureヒト血清アルブミン(Jacksonから購入)で免疫化した。ウサギには100ugのHSAタンパク質の3回の免疫化を皮下で与え、最初の免疫化は完全フロイントアジュバント中、続く免疫化は不完全フロイント中であった。ヒト、マウス及びラットの血清アルブミンと結合する抗体1及び2、646、647、並びに649は、WO04/051268号に記載の方法を使用して単離した。抗体1及び2の重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)の遺伝子を単離し、逆転写PCRによるクローニングの後に配列決定した。
ヒトV領域アクセプターフレームワーク及びフレームワーク領域中のドナー残基を使用して、ヒト化したVL及びVH領域を設計した。1つの移植したVL領域(L1(配列番号53)及びL2(配列番号55))並びに1つのVH領域(H1(配列番号52)及びH2(配列番号54))を、抗体1及び2のそれぞれについてそれぞれ設計し、遺伝子はオリゴヌクレオチドのアセンブル及びPCR突然変異誘発によって構築した。移植したドメイン抗体及びそのCDRを図5に示す。
哺乳動物細胞中で発現させたFabB−dAbの分析
方法に記載されているようにFabB−dAb構築体を産生し、FabB−dAbを含有する形質移入したHEK293細胞からの上清をBIAcoreで直接試験した。
哺乳動物細胞中で発現させたFabB−didAbの分析
方法に記載されているようにFabB−didAb構築体を産生させ、didAbを含有する形質移入したHEK293細胞からの上清をBIAcoreで直接試験した。
精製したFabA−dAbの分析
大腸菌中でFab−dAb、Fab’A−dAbL3(CK−SG4SE)、Fab’A−dAbL3(CK−G[APAPA]2)を発現させるためのプラスミドを、方法に記載されているように構築した。Fab−dAbは大腸菌のペリプラズム内に発現され、方法に記載されているように均質となるまで精製した。Fab−dAbの純度は、高温逆相HPLC、SDS−PAGE及びウエスタンブロッティングによって評価した。また、Fab−dAbは、Biacoreによって抗原結合についても評価した。
方法に記載されているように行った高温逆相HPLCにより、FabA−dAbL3(CK−SG4SE)及びFabA−dAbL3(CK−G[APAPA]2)中に含有されるすべての種の定量分析が与えられた。存在するそれぞれの種の百分率を表4に示す。
Fab−dAb試料を非還元及び還元条件下で調製し、方法に記載されているようにゲル上に流した。ゲルをクマシー染色した。両方のFab−dAb試料、すなわちFab’A−dAbL3(CK−SG4SE)及びFab’A−dAbL3(CK−G[APAPA]2)のバンドプロフィールは、高温逆相HPLCによって観察されたプロフィールに良好に対応する(図3)。
方法に記載されているように、Fab−dAb試料を非還元SDS−PAGE、次いで抗軽鎖及び抗重鎖抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した。これにより、dAbはFabの軽鎖上にあり、どちらの試料中でも重鎖は改変されていなかったことが確認された(図4)。また、これは、クマシー染色した非還元SDS PAGEによって検出されたすべてのバンドがFab−dAb関連の産物であることも実証している。
方法に記載されているように、SPRによる動力学的分析を使用して、ヒト血清アルブミンとFab’A−dAbL3(CK−SG4SE)及びFab’A−dAbL3(CK−G[APAPA]2)との結合を評価した。表5の結果は、どちらの構築体も約1μMの同様の親和性(KD)でヒト血清アルブミンと結合できることを実証している。
FabA didAb
大腸菌でのFabA−didAbの発現
C末端のヒスチジンタグ(HIS6タグ)で終結するFabA−dAb及びFabA−didAbの融合体を大腸菌(Escherichia coli)中で発現させた。ペリプラズム抽出後、dAb融合タンパク質を、C末端のHis6タグを介して精製した。Fab発現は、抗CH1及び抗cカッパ抗体を用いた非還元ゲルのウエスタンブロッティングによって分析した。FabA−dAb及びFabA−didAbは完全長タンパク質として発現されており、どちらの抗体検出試薬とも反応することが示された。
さらなる分析を実施して、HSAと1つ又は複数のdAbを融合させたFabA構築体との結合を特徴づけた。結合アッセイを、dAbL3又はdAbH4がFabAの軽鎖又は重鎖のどちらかと融合されている様々な構築体で行った(構築体の詳細及び結合データの要約には表8を参照)。軽鎖又は重鎖のどちらか上にdAbH4のみを保有する構築体は、比較的乏しい親和性でHSAと結合することが見られたが(それぞれ≒9μM及び3μM)、dAbL3を、単一の融合体(軽鎖若しくは重鎖のどちらか上)として、又は反対の鎖上の第2のdAb(dAbL3若しくはdAbH4)と組んで保有する構築体では、より高い親和性の結合が観察された。
FabB−didAbの発現及び精製
哺乳動物発現
形質移入の前に、CHO−XE細胞をアール(Earls)バランス塩溶液(EBSS)で洗浄し、ペレット化し、2×108個の細胞/mlでEBSSに再懸濁させた。重鎖及び軽鎖プラスミドを400ugの合計濃度で細胞に加えた。形質移入には、800μlの細胞/DNA混合物の最適化した電気パラメータをインハウスの電気穿孔器上で使用した。形質移入した細胞を、glutamax、HT及び抗真菌抗生物質溶液を添加した1LのCD−CHO培地に直接移した。細胞をインキュベーションし、37℃で24時間振盪し、その後、32℃に移行させた。3mMの酪酸ナトリウムを4日目に加えた。上清を14日目に1500×gでの遠心分離によって回収して、細胞を除去した。発現レベルはELISAによって決定した。
ELISAによって評価して約55μg/mlのFabB−didAbを含有する哺乳動物上清を、10kDaの分子量カットオフのポリエーテルスルホン(PES)膜を装着したMinisette濃縮機を使用して、1.8Lから200mlまで濃縮した。
濃縮した上清を、20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.1で平衡化したGammabind Plus Sepharose(GE Healthcare)カラムに適用した。カラムを20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.1で洗浄し、結合した材料を0.1Mのグリシン/HCl、pH2.7で溶出させた。溶出ピークを収集し、2Mのトリス/HCl、pH8.8を用いてpHを約pH7に調節した。10kDの分子量カットオフのPES膜を使用して、pHを調節した溶出液を1mg/mlまで濃縮し、20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.1中にダイアフィルトレーションした。
必要な場合は試料を水で希釈し、その後、26μlに、10μLの4×LDS試料ランニング緩衝液を加えた。非還元試料には、4μLの100mMのNEMを加え、還元試料には、4μLの10×還元剤を加えた。試料を渦撹拌し、85℃で5分間インキュベーションし、冷却し、12500rpmで30秒間遠心分離した。調製した試料を4〜20%のアクリルアミントリス/グリシンSDSゲル上に載せ、110分間、125Vで流した。ゲルをクマシーブルータンパク質染色で染色した。
Fab−didAbの収率はサンドイッチELISAを用いて測定した。手短に述べると、Fab−didAbを抗CH1抗体で捕捉し、その後、抗カッパ−HRPを用いて表示させた。
FabB及びFabB−didAb試料を非還元及び還元条件下で調製し、方法に記載されているようにゲル上で分離し、染色した。図9を参照されたい。
FabB−Fvに対するThermofluor熱安定性アッセイ
試料(1μlの約1mg/mlの試料、8μlのPBS及び1μlの30×ストックのSypro orange蛍光色素)を四つ組で384ウェルプレートに流した。7900HT高速リアルタイムPCRシステムを使用してプレートを20から99℃まで加熱し、蛍光(490nmでの励起、530nmでの発光)を測定した。結果を表D及び図10に示す。
FabB−Fvの凝集安定性アッセイ
PBS中の1mg/mlの試料を、1400rpmで渦撹拌しながら25℃でインキュベーションした。吸光度を595nmで測定する。この吸光度は粒子によって散乱された光が原因であり、試料の凝集と相関させることができる。FabB−645Fv(G4S×2)及びFabB−648Fv(G4S×2)はどちらも、FabB単独と同等に凝集に対して耐性がある。これらはすべて、IgG対照よりも凝集に対して耐性がある。(図12)
Fab−FvとHSAとの結合のpH依存性
Fab−Fv構築体とHSAとの相互作用の結合親和性は、40mMのクエン酸、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%v/vの界面活性剤P20及び80mMのリン酸水素二ナトリウム、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%v/vの界面活性剤P20を混合することによってpH5.0、5.5、6.0及び7.0のランニング緩衝液を作製して所望のpHを与えた以外は、方法に記載されているように決定した。
FabB−Fvのin vivoマウスPK
雄のBALB/cマウスにおけるFabB−645Fv(G4S×2)及びFabB−648Fv(G4S×2)の薬物動態学を、皮下(sc)又は静脈内(iv)のどちらかでの10mg/kgの単一の投与後に決定した。6匹のマウスに、それぞれの構築体及び投与経路について投薬した。皮下投与の1、4、8、24、48、72、102及び168時間後並びに静脈内投与の30分間、1、8、24、48、72、96及び168時間後の時点で、一連の血液試料(30μL)を尾部静脈から収集した。収集した血液を、血清分離のために凝血活性化剤を含むSarstedt microvette CB300Z内に分注し、室温で少なくとも20分間静置した。その後、microvetteを20℃、10,000rpmで5分間遠心分離した。血清を除去し、凍結して保管した後に分析した。血清試料中のFabB−645Fv(G4S×2)又はFabB−648Fv(G4S×2)の濃度はELISAによって評価した。手短に述べると、Nunc Maxisorb ImmunomoduleプレートをPBS中のhOX40−Fcでコーティングし、PBS中の1%のBSAで遮断した。血清試料及び標準物質をPBS中の1%のBSAに希釈し、プレートに1時間施用した。プレートをPBSで洗浄し、ヤギ抗ヒトカッパHRPのコンジュゲートを表示させる抗体をPBS中の1%のBSA中で1時間施用した。プレートを洗浄し、その後、TMB基質で展開させ、次いで2.5Mの硫酸で停止させた。630nmでの洗浄液の吸光度を測定し、濃度を検量線から決定した。
FabB−Fvのin vivo有効性研究
FabB−645Fv及びFabB−648Fvがin vivoで有効であるかを調査するための研究を行った。手短に述べると、これはHuSCIDマウスにおける定常状態の投薬を含み、読取りはT細胞生着の防止であった。
アルブミンに対する645Fvの親和性を変化させるためのFabB−645Fvの突然変異
突然変異誘発PCRによって、点突然変異をFabB−645dsFv(S3×G4S)の645Fv部分の重鎖のCDR中の選択された残基内に導入した。たとえば、I50Aは、Ile50をAlaで置き換えたものである。様々な突然変異を以下の表11に示す。ヒトアルブミンに対するFab−645Fv突然変異体の親和性は、方法に記載されているようにBIAcoreによって評価した。すべての突然変異は、ヒトアルブミンに対して変化していない又は低下した親和性を有していた。
FabとFvとの間の1〜5Gly4Serのリンカー長
哺乳動物細胞中で発現させるためのFabB−645Fv融合プラスミドの構築
FabのC末端とFvのN末端との間に
リンカーのいずれかを有するFabB−645Fv’をPCRによってアセンブルし、その後、HCMV−MIEプロモーター及びSV40EポリA配列の制御下にある哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。関連する重鎖及び軽鎖プラスミドを、哺乳動物細胞中で発現させるために対合させた。
Invitrogenの293fectin形質移入試薬を使用して、製造者の指示に従って、HEK293細胞を、重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて形質移入した。手短に述べると、24μgの重鎖プラスミド+24μgの軽鎖プラスミドを、120μlの293fectin+4080μlのOptimem培地と共に、20分間、室温でインキュベートした。その後、混合物を60mLの懸濁液中の60×106個のHEK293細胞に加え、4日間、振盪しながら37℃でインキュベーションした。すべての構築体は、同等に良好に発現された。
哺乳動物発現の懸濁液を遠心分離によって清澄にし、10kDaの分子量カットオフの遠心分離濃縮機を使用して上清を約1.8mLまで濃縮した。濃縮した上清を16000×gで10分間遠心分離してすべての沈殿物を除去し、その後、1.5mLを1mlのHiTrapタンパク質Gカラム(GE Healthcare)に1ml/分で載せた。カラムを20mMのホスフェート、40mMのNaCl、pH7.4で洗浄し、結合した材料を0.1Mのグリシン/HCl、pH2.7で溶出させた。溶出ピーク(2mL)を収集し、250μLの1Mの酢酸ナトリウムを用いてpHを約pH5に調節した。pHを調節した溶出液を、10kDaの分子量カットオフの遠心分離濃縮機を使用して、20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.1中にダイアフィルトレーションし、約250μLまで濃縮した。すべての構築体は同様の精製プロフィールを有しており、最終濃度は0.5〜1.1mg/mlであった。
ヒト及びマウスのアルブミンに対する精製したFabB−645Fv(1〜5×G4S)構築体の親和性は、方法に記載されているように決定した。FabのC末端とFvのN末端との間の1〜5×Gly4SerのFvの様々なリンカー長は、ヒト又はマウスのアルブミンのどちらに対する645Fvの親和性にも影響を与えなかった。
FabB−645Fv(1〜5×G4S)試料を非還元及び還元条件下で調製し、方法に記載されているようにゲル上で分離し、染色した。図15を参照されたい。
FabB−645Fv(1〜5×G4S)試料を、均一濃度勾配の20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.4を1ml/分で用いて展開させたSuperdex200 10/300GL Tricornカラム(GE Healthcare)上で、大きさについて分析した。
試料(1μlの約1mg/mlの試料、8μlのPBS及び1μlの30×ストックのSypro orange蛍光色素)を四つ組で384ウェルプレートに流した。7900HT高速リアルタイムPCRシステムを使用してプレートを20から99℃まで加熱し、蛍光(490nmでの励起、530nmでの発光)を測定した。結果を表14及び図17に示す。
Fab−Fv中のFvのジスルフィド安定化
哺乳動物細胞中で発現させるためのFabB−645dsFv(2×G4S)、FabB−648dsFv(2×G4S)、FabΔB−645dsFv(2×G4S)及びFabΔB−648dsFv(2×G4S)融合プラスミド
突然変異誘発PCRによって、点突然変異を、FabB−645Fv(2×G4S)及びFabB−648Fv(2×G4S)DNA配列内に、Fvの重鎖及び軽鎖の両方のフレームワーク領域中の選択された残基で導入した。Fvの重鎖と軽鎖との間に鎖間ジスルフィド結合を作製するために導入された突然変異は、重鎖のG44C及び軽鎖のG100Cであった。Fv中に鎖間ジスルフィド結合を作製するためにシステインを付加することに加えて、Fabの重鎖と軽鎖との間の天然の鎖間ジスルフィドを、突然変異誘発PCRによって、システインをセリンに変化させることによって除去した。鎖間ジスルフィド結合を含有するFvはdsFvと呼び、鎖間ジスルフィド結合を欠くFabはFabΔと呼ぶ。その後、これらすべての構築体のDNAをHCMV−MIEプロモーター及びSV40EポリA配列の制御下にある哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。関連する重鎖及び軽鎖プラスミドを、哺乳動物細胞中で発現させるために対合させた。
Invitrogenの293fectin形質移入試薬を使用して、製造者の指示に従って、HEK293細胞を、重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて形質移入した。手短に述べると、24μgの重鎖プラスミド+24μgの軽鎖プラスミドを、120μlの293fectin+4080μlのOptimem培地と共に、20分間、室温でインキュベートした。その後、混合物を60mLの懸濁液中の60×106個のHEK293細胞に加え、4日間、振盪しながら37℃でインキュベーションした。すべての構築体は、同等に良好に発現された。
哺乳動物発現の懸濁液を遠心分離によって清澄にし、10kDaの分子量カットオフの遠心分離濃縮機を使用して上清を約1.8mLまで濃縮した。濃縮した上清を16000×gで10分間遠心分離してすべての沈殿物を除去し、その後、1.5mLを1mlのHiTrapタンパク質Gカラム(GE Healthcare)に1ml/分で載せた。カラムを20mMのホスフェート、40mMのNaCl、pH7.4で洗浄し、結合した材料を0.1Mのグリシン/HCl、pH2.7で溶出させた。溶出ピーク(2mL)を収集し、250μLの1Mの酢酸ナトリウムを用いてpHを約pH5に調節した。pHを調節した溶出液を、10kDaの分子量カットオフの遠心分離濃縮機を使用して、20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.1中にダイアフィルトレーションし、約250μLまで濃縮した。すべての構築体は同様の精製プロフィールを有しており、最終濃度は0.5〜0.8mg/mlであった。
ヒト及びマウスのアルブミンに対する、精製したFabB−645dsFv(2×G4S)、FabB−648dsFv(2×G4S)、FabΔB−645dsFv(2×G4S)、FabΔB−648dsFv(2×G4S)構築体の親和性は、方法に記載されているように決定した。Fvのジスルフィド安定化は、ヒト又はマウスのアルブミンのどちらに対するFvの親和性にも影響を与えなかったか、又はそれをわずかに増加させた。
精製したFabB−645dsFv(2×G4S)、FabB−648dsFv(2×G4S)、FabΔB−645dsFv(2×G4S)、FabΔB−648dsFv(2×G4S)試料を非還元及び還元条件下で調製し、方法に記載されているようにゲル上で分離し、染色した。図18を参照されたい。
精製したFabB−645dsFv(2×G4S)、FabB−648dsFv(2×G4S)、FabΔB−645dsFv(2×G4S)、FabΔB−648dsFv(2×G4S)試料を、均一濃度勾配の20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.4を1ml/分で用いて展開させたSuperdex200 10/300GL Tricornカラム(GE Healthcare)上で、大きさについて分析した。
試料(1μlの約1mg/mlの試料、8μlのPBS及び1μlの30×ストックのSypro orange蛍光色素)を四つ組で384ウェルプレートに流した。7900HT高速リアルタイムPCRシステムを使用してプレートを20から99℃まで加熱し、蛍光(490nmでの励起、530nmでの発光)を測定した。
Fab−dAbとFab−didAb構築体との相互作用の結合親和性及び動力学的パラメータは、CM5センサーチップ及びHBS−EP(10mMのHEPES(pH7.4)、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%v/vの界面活性剤P20)ランニング緩衝液を用いてBiacore T100で実施した表面プラズモン共鳴(SPR)によって決定した。ヒトFab試料は、ヒトF(ab’)2に特異的なヤギFab(Jackson ImmunoResearch、109−006−097)又はインハウスで作製した抗ヒトCH1モノクローナル抗体のどちらかを使用して、センサーチップ表面に捕捉させた。マウスFab試料は、マウスF(ab’)2に特異的なヤギFab(Jackson ImmunoResearch、115−006−072)を使用して捕捉した。捕捉抗体の共有的固定は標準のアミンカップリング化学によって達成した。
mFabC−mdidAb及びmFabD−mdidAbの哺乳動物発現
Invitrogenの293fectin形質移入試薬を使用して、製造者の指示に従って、HEK293細胞を、重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて形質移入した。手短に述べると、2μgの重鎖プラスミド+2μgの軽鎖プラスミドを、10μlの293fectin+340μlのOptimem培地と共に、20分間、室温でインキュベーションした。その後、混合物を懸濁液中の5×106個のHEK293細胞に加え、6日間、振盪しながら37℃でインキュベーションした。
さらなる動力学的分析を実施して、血清アルブミン及びヒトOX40と、精製したFabB−didAb、−dAbL1(CK−G4S×2)及び−dAbH1(CH1−G4S×2)の融合体並びにFabB−didAb、−dAbL2(CK−G4S×2)及び−dAbH2(CH1−G4S×2)の融合体との相互作用を評価した(表19)。FabB−didAb、−dAbL1(CK−G4S×2)及び−dAbH1(CH1−G4S×2)並びにFabB−didAb、−dAbL2(CK−G4S×2)及び−dAbH2(CH1−G4S×2)はどちらも、元のFabBのヒトOX40に対する親和性を保持していた(表20)。
さらなる動力学的分析を実施して、血清アルブミン及びマウス細胞表面受容体Dと、mFabD−mdidAb、−mdAbL1(CK−G4S×2)及びmdAbH1(CH1−G4S×2)並びにmFabD−mdidAb、−mdAbL2(CK−G4S×2)及びmdAbH2(CH1−G4S×2)との相互作用を評価した(表22)。どちらのmFabD−mdidAbも、HSAとの比較的高い親和性の結合を示した(それぞれKD=2.78nM及び8.97nM)。また、mFabD−mdidAb、−mdAbL2(CK−G4S×2)及びmdAbH2(CH1−G4S×2)は、同様の親和性(KD=22nM)でMSAとも結合したが、mFabD−mdidAb、−mdAbL1(CK−G4S×2)及びmdAbH1(CH1−G4S×2)では、MSAとの結合は見られなかった。どちらのmFabD−mdidAbも、元のmFabDのマウス細胞表面受容体Dに対する親和性を保持していた(表23)。
さらなる分析を実施して、mFabD−mdidAb、−mdAbL1(CK−G4S×2)及びmdAbH1(CH1−G4S×2)又はmFabD−mdidAb、−mdAbL2(CK−G4S×2)及びmdAbH2(CH1−G4S×2)と、細胞表面上に発現された血清アルブミン及びマウス細胞表面受容体Dとの同時相互作用を評価した。どちらのmFabD−mdidAbも、活性化したマウスT細胞の細胞表面上に発現された、FITCで標識したHSA及び細胞表面受容体Xと同時に結合することができた(図11)。mFabDは、活性化したマウスT細胞の細胞表面上に発現された細胞表面受容体Xと結合することができたが(データ示さず)、FITCで標識したHSAとは結合しなかった。
FabB−645dsFv(3×G4S)の発現及び精製
哺乳動物発現
形質移入の前に、1.4×1010個のCHO−SV細胞をアール(Earls)バランス塩溶液(EBSS)で洗浄し、ペレット化した。7mgの重鎖及び7mgの軽鎖のプラスミドDNAを細胞に加えた。EBBS緩衝液は10mlの最終体積まで加える。最適化した電気パラメータをインハウスの電気穿孔器上で使用して、キュベット1個あたり800μlの上記を電気穿孔した。形質移入した細胞を、glutamax、HT及び抗真菌抗生物質溶液を添加した7×1LのCD−CHO培地に直接移した。細胞をインキュベーションし、37℃で24時間振盪し、その後、32℃に移行させた。3mMの酪酸ナトリウムを4日目に加えた。上清を10又は14日目に1500×gでの遠心分離によって回収して、細胞を除去した。発現レベルはタンパク質Gアッセイによって決定した。
15μg/mlのFabB−645dsFv(3×G4S)を含有するプールした哺乳動物上清を、2×10kDaの分子量カットオフのポリエーテルスルホン(PES)膜を装着したMinisette濃縮機を使用して、6.5Lから800mlまで濃縮した。
濃縮した上清を、135cm/時で、20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.4で平衡化した50mlのGammabind Plus Sepharose(GE Healthcare)カラムに施用した。カラムを20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.4で洗浄し、結合した材料を0.1Mのグリシン/HCl、pH2.7で溶出させた。溶出ピークを収集し、2Mのトリス/HCl、pH8.8を用いてpHを約pH7に調節した。10kDaの分子量カットオフの膜を備えたAmicon Ultra−15濃縮機及びスイングアウトローター中の4000×gでの遠心分離を使用して、pHを調節した溶出液を7mlまで濃縮し、20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.4中にダイアフィルトレーションした。
濃縮及びダイアフィルトレーションしたタンパク質G溶出液を、20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.4で平衡化したXK26/60Superdex200(GE Healthcare)カラムに適用した。均一濃度勾配の20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.4を用いて30cm/時でカラムを展開させた。5mlの画分を収集し、Superdex200 10/300GL Triconカラム(GE Healthcare)によって分析し、均一濃度勾配の20mMのホスフェート、150mMのNaCl、pH7.4を1ml/分で用いて展開させた。単量体のみを含有する画分をプールし、10kDaの分子量カットオフの膜を備えたAmicon Ultra−15濃縮機及びスイングアウトローター中の4000×gでの遠心分離を使用して、約10mg/mlまで濃縮した。
FabB−645dsFv(3×G4S)をPBSで0.32mg/mlまで希釈し、26μlに10μLの4×LDS(Invitrogen)試料ランニング緩衝液を加えた。非還元試料には、4μLの100mMのNEMを加え、還元試料には、4μLの10×還元剤(Invitrogen)を加えた。試料を渦撹拌し、100℃で3分間インキュベーションし、冷却し、12500rpmで30秒間遠心分離した。調製した試料を10μl/2μgで4〜20%のアクリルアミントリス/グリシンSDSゲル上に載せ、110分間、125Vで流した。ゲルをクマシーブルータンパク質染色で染色し、7.5%の酢酸で脱染色した。図25を参照されたい。還元及び非還元条件下のどちらにおいても、FabB−645dsFv(3×G4S)は本質的に1つのバンドである。非還元ゲル上の主バンドの上下の2つの副バンドは、鎖間ジスルフィド結合のうちのどちらか一方が形成されていないものである。還元ゲル上の主バンドの上の1つの副バンドは、還元不可能なFabB−645dsFv(3×G4S)である。図25を参照されたい。
FabB−645dsFv(3×G4S)をPBSで0.5mg/mlまで希釈した。100μlのこれをSuperdex200 10/300GL Triconカラム(GE Healthcare)上に注入し、均一濃度勾配のPBSを用いて1ml/分で展開させた。ピークは280nm及び214nmでの吸光度によって検出した。図26を参照されたい。クロマトグラム中に13.44メトリック分の保持時間を有する単一の対称ピークが存在する。同じ条件下で流したBioRadゲル濾過標準物質(151−1901)保持時間から作成した検量線を用いて、このピーク保持時間を見かけの分子量に変換した。FabB−645dsFv(3×G4S)の見かけの分子量は87kDaであった。
熱安定性を測定するために、FabB−645dsFv(3×G4S)をPBSで1mg/mlまで希釈した。四つ組で、1μlのこの希釈した試料に、8μlのPBS及び1μlの30×ストックのSypro orange蛍光色素を384ウェルプレート中で加えた。7900HT高速リアルタイムPCRシステムを使用してプレートを20から99℃まで加熱し、蛍光(490nmでの励起、530nmでの発光)を測定した。図27Aを参照されたい。FabB−645dsFv(3×G4S)は、70℃より高いTmを有する熱的に安定な分子である。
FabB−645dsFv(3×G4S)のin vitro有効性は、細胞に基づくOX40リガンド遮断アッセイによって評価した。手短に述べると、ヒトPBMCを単離し、5μg/mlのPHA−L(植物性赤血球凝集素−L)と共に24〜72時間、37℃/5%のCO2でインキュベーションすることによって活性化した。その後、細胞をPBS/0.09%のアジ化ナトリウムで洗浄し、96ウェルの培養プレートに0.25×106個の細胞/ウェルで播種した。FabB−645dsFv(3×G4S)の希釈液をPBS/5%のHSA中で調製した。また、4μg/mlのビオチン標識したCD252−CD8融合タンパク質の溶液もPBS/5%のHSA中で調製した。50μlのそれぞれのFabB−645dsFv(3×G4S)の希釈液を50μlのCD252−CD8融合タンパク質に加え、混合物を活性化したT細胞と共に30分間、4℃でインキュベーションした。このインキュベーションの後、細胞をPBS/0.09%のアジ化ナトリウムで洗浄した。その後、活性化したT細胞を100μlのPBS中のストレプトアビジン−PEと共に30分間、4℃でインキュベーションした。細胞をPBS/0.09%のアジ化ナトリウムで再度洗浄し、その後、緩衝液に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。FabB−645dsFv(3×G4S)は、OX40リガンドとヒトPBMCの表面上に発現されたOX40との結合を、約3.5nMのEC50で遮断することが示された。図28を参照されたい。
in vivoでの用量応答の関係性を研究するために、FabB−645dsFv(3×G4S)を用いた研究を行った。手短に述べると、これはHuSCIDマウスにおける0.3、3及び30μg/mlの定常状態の投薬を含み、T細胞生着の防止が読み取られた。
645Fv−652Fabの構築、発現及び抗原結合
645Fv−652Fabプラスミドの構築
645Fv−652Fab(L−3×G4S、H−3×G4S)、645Fv−652Fab(L−TVAAP、H−ASTKGP)、645dsFv−652Fab(L−3×G4S、H−3×G4S)、645dsFv−652Fab(L−TVAAP、H−ASTKGP)の全遺伝子合成は、第三者請負業者が行った(DNA2.0)。645Fv−652Fabのアミノ酸配列には図30A、B、C及びDを参照されたい。すべての遺伝子は、HCMV−MIEプロモーター及びSV40EポリA配列の制御下にある、UCBが所有権を有する哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。
Invitrogenの293fectin形質移入試薬を使用して、製造者の指示に従って、HEK293細胞を、重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて形質移入した。手短に述べると、2μgの重鎖プラスミド及び2μgの軽鎖プラスミドを、10μlの293fectin及び340μlのOptimem培地と共に、20分間、室温でインキュベートした。その後、混合物を懸濁液中の5×106個のHEK293細胞に加え、4日間、振盪しながら37℃でインキュベーションした。4日後、上清を1500×gでの遠心分離によって収集して細胞を除去し、その後、0.22μmで滅菌濾過した。
哺乳動物上清中のFv−Fabの濃度はサンドイッチELISAを使用して測定した。試料中のFv−Fabを抗CH1抗体で捕捉し、抗カッパ−HRPのコンジュゲートで検出した。検出抗体をTMBで展開させ、未知の試料の濃度を検量線から計算した。すべての645Fv−652Fabは同様の発現レベルを有していたが、ジスルフィド安定化されたFvバージョンは、ジスルフィド安定化されていないバージョンのレベルの55%〜75%で発現された。図31を参照されたい。
Biacore方法
Fv−Fab構築体の相互作用の動力学的定数及び結合応答は、CM5センサーチップを用いたBiacore3000で実施した表面プラズモン共鳴(SPR)によって決定した。ランニング緩衝液であるHBS−EPは、10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%v/vの界面活性剤P20、pH7.4からなっていた。インハウスで作製した抗ヒトCH1モノクローナル抗体を使用して、試料をセンサーチップ表面上に捕捉させた。捕捉抗体の共有的固定は標準のアミンカップリング化学によって達成した。
動力学的分析を実施して、HSA及びhIL13と、645Fv−652Fab(L−3×G4S、H−3×G4S)、645Fv−652Fab(L−TVAAP、H−ASTKGP)、645dsFv−652Fab(L−3×G4S、H−3×G4S)及び645dsFv−652Fab(L−TVAAP、H−ASTKGP)との相互作用の親和性を評価した。図30A及び30Bを参照されたい。すべてのFv−Fabは等価な親和性及び結合レベルでHSAと結合した。
<223> リンカー
配列番号: 2
<223> リンカー
配列番号: 3
<223> リンカー
配列番号: 4
<223> リンカー
配列番号: 5
<223> リンカー
<222> (7)..(7)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号: 6
<223> リンカー
<222> (7)..(7)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号: 7
<223> リンカー
配列番号: 8
<223> リンカー
配列番号: 9
<223> リンカー
配列番号: 10
<223> リンカー
配列番号: 11
<223> リンカー
配列番号: 12
<223> リンカー
配列番号: 13
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配列番号: 14
<223> リンカー
配列番号: 15
<223> リンカー
配列番号: 16
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配列番号: 17
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配列番号: 18
<223> リンカー
配列番号: 19
<223> リンカー
配列番号: 20
<223> リンカー
配列番号: 21
<223> リンカー
配列番号: 22
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配列番号: 23
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配列番号: 24
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配列番号: 25
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配列番号: 26
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配列番号: 27
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配列番号: 28
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配列番号: 29
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配列番号: 30
<223> リンカー
配列番号: 31
<223> リンカー
配列番号: 32
<223> リンカー
配列番号: 33
<223> リンカー
配列番号: 34
<223> リンカー
配列番号: 35
<223> リンカー
配列番号: 36
<223> ヒンジ
配列番号: 37
<223> リンカー
配列番号: 38
<223> ヒンジ
配列番号: 39
<223> リンカー
配列番号: 40
<223> ヒンジ
配列番号: 41
<223> ヒンジ
配列番号: 42
<223> リンカー
配列番号: 43
<223> リンカー
配列番号: 44
<223> リンカー
配列番号: 45
<223> リンカー
配列番号: 46
<223> リンカー
配列番号: 47
<223> リンカー
配列番号: 48
<223> リンカー
配列番号: 49
<223> リンカー
<222> (7)..(7)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (12)..(12)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号: 50
<223> リンカー
<222> (7)..(7)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (12)..(12)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (17)..(17)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号: 51
<223> リンカー
<222> (7)..(7)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (12)..(12)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (17)..(17)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (22)..(22)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号: 52
<223> ドメイン抗体 H1
配列番号: 53
<223> ドメイン抗体 L1
配列番号: 54
<223> ドメイン抗体 H2
配列番号: 55
<223> ドメイン抗体 L2
配列番号: 56
<223> ドメイン抗体 H1 CDR-H1
配列番号: 57
<223> ドメイン抗体 H1 CDR-H2
配列番号: 58
<223> ドメイン抗体 H1 CDR-H3
配列番号: 59
<223> ドメイン抗体 L1 CDR-L1
配列番号: 60
<223> ドメイン抗体 L1 CDRL2
配列番号: 61
<223> ドメイン抗体 L1 CDR-L3
配列番号: 62
<223> ドメイン抗体 H2 CDR-H1
配列番号: 63
<223> ドメイン抗体 H2 CDR-H2
配列番号: 64
<223> ドメイン抗体 H2 CDR-H3
配列番号: 65
<223> ドメイン抗体 L2 CDR-L1
配列番号: 66
<223> ドメイン抗体 L2 CDR-L2
配列番号: 67
<223> ドメイン抗体 L2 CDR-L3
配列番号: 68
<223> Fab B-dAbH1 (CH1-G4S4)
配列番号: 69
<223> FabB-dAbH2 (CH1-G4Sx2)
配列番号: 70
<223> FabB dAbL1 (cCH1-G4Sx2)
配列番号: 71
<223> FabB dAbL2 (CH1-G4Sx2)
配列番号: 72
<223> FabB dABL1 (CK1 G4Sx2)
配列番号: 73
<223> FabB dAbL2 (CK1 G4Sx2)
配列番号: 74
<223> Fab'A 重鎖
配列番号: 75
<223> FabA 軽鎖
配列番号: 76
<223> Fab'A 重鎖 (修飾リンカー)
配列番号: 77
<223> FabA 重鎖
配列番号: 78
<223> mdAbH1
配列番号: 79
<223> mdAbL1
配列番号: 80
<223> mdAbH2
配列番号: 81
<223> mdAbL2
配列番号: 82
<223> mFabD-mdidAb dAbH1(CH1-G4Sx2)
配列番号: 83
<223> mFabD-mdidAb, -dAbL1(CK-G4Sx2)
配列番号: 84
<223> mFabD-mdidAb, -dAbH2(CH1-G4Sx2)
配列番号: 85
<223> mFabD-mdidAb, -dAbL2(CK-G4Sx2)
配列番号: 86
<223> dAbH1(CH1-G4Sx2)mFabC-mdAbH1
配列番号: 87
<223> mFabC-mdidAb, -dAbL1(CK-G4Sx2)
配列番号: 88
<223> mFabC-mdidAb dAbH2(CH1-G4Sx2)
配列番号: 89
<223> mFabC-mdidAb, -dAbL2(CK-G4Sx2)
配列番号: 90
<223> 646Fv CDRH3
配列番号: 91
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配列番号: 96
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配列番号: 97
<223> 647Fv QASQSLGNRLA
配列番号: 98
<223> 647Fv CDRL2
配列番号: 99
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配列番号: 100
<223> 649Fv CDRH1
配列番号: 101
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<223> 649Fv CDRL3
配列番号: 106
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<223> 645重鎖I50AFv CDRL1
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配列番号: 111
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配列番号: 112
<223> 645重鎖T56AFv CDRH1
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配列番号: 114
<223> 645重鎖T56AFv CDRL2
配列番号: 115
<223> 645重鎖T56AFv CDRL1
配列番号: 116
<223> 645重鎖T56AFv CDRL2
配列番号: 117
<223> 645重鎖T56AFv CDRL3
配列番号: 118
<223> 645重鎖T95AFv CDRH1
配列番号: 119
<223> 645重鎖T95AFv CDRH2
配列番号: 120
<223> 645重鎖T95AFv CDRH3
配列番号: 121
<223> 645重鎖T95AFv CDRL1
配列番号: 122
<223> 645重鎖T95AFv CDRL2
配列番号: 123
<223> 645重鎖T95AFv CDRL3
配列番号: 124
<223> 645重鎖V96AFv CDRH1
配列番号: 125
<223> 645重鎖V96AFv CDRH2
配列番号: 126
<223> 645重鎖V96AFv CDRH3
配列番号: 127
<223> 645重鎖V96AFv CDRL1
配列番号: 128
<223> 645重鎖V96AFv CDRL2
配列番号: 129
<223> 645重鎖V96AFv CDRL3
配列番号: 130
<223> 645重鎖P97AFv CDRH1
配列番号: 131
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配列番号: 132
<223> 645重鎖P97AFv CDRH3
配列番号: 133
<223> 645重鎖P97AFv CDRL1
配列番号: 134
<223> 645重鎖P97AFv CDRL2
配列番号: 135
<223> 645重鎖P97AFv CDRL3
配列番号: 136
<223> 645重鎖G98AFv CDRH1
配列番号: 137
<223> 645重鎖G98AFv CDRH2
配列番号: 138
<223> 645重鎖G98AFv CDRH3
配列番号: 139
<223> 645重鎖G98AFv CDRL1
配列番号: 140
<223> 645重鎖G98AFv CDRL2
配列番号: 141
<223> 645重鎖G98AFv CDRL3
配列番号: 142
<223> 645重鎖Y99AFv CDRH1
配列番号: 143
<223> 645重鎖Y99AFv CDRH2
配列番号: 144
<223> 645重鎖Y99AFv CDRH3
配列番号: 145
<223> 645重鎖Y99AFv CDRL1
配列番号: 146
<223> 645重鎖Y99AFv CDRL2
配列番号: 147
<223> 645重鎖Y99AFv CDRL3
配列番号: 148
<223> 645重鎖S100AFv CDRH1
配列番号: 149
<223> 645重鎖S100AFv CDRH2
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配列番号: 151
<223> 645重鎖S100AFv CDRL1
配列番号: 152
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<223> 645重鎖S100AFv CDRL3
配列番号: 154
<223> 645重鎖T100aAFv CDRH1
配列番号: 155
<223> 645重鎖T100aAFv CDRH2
配列番号: 156
<223> 645重鎖T100aAFv CDRH3
配列番号: 157
<223> 645重鎖T100aAFv CDRL1
配列番号: 158
<223> 645重鎖T100aAFv CDRL2
配列番号: 159
<223> 645重鎖T100aAFv CDRL3
配列番号: 160
<223> 645重鎖P100cAFv CDRH1
配列番号: 161
<223> 645重鎖P100cAFv CDRH2
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<223> 645重鎖P100cAFv CDRH3
配列番号: 163
<223> 645重鎖P100cAFv CDRL1
配列番号: 164
<223> 645重鎖P100cAFv CDRL2
配列番号: 165
<223> 645重鎖P100cAFv CDRL3
配列番号: 166
<223> 645重鎖I50A+T95AFv CDRH1
配列番号: 167
<223> 645重鎖I50A+T95AFv CDRH2
配列番号: 168
<223> 645重鎖I50A+T95AFv CDRH3
配列番号: 169
<223> 645重鎖I50A+T95AFv CDRL1
配列番号: 170
<223> 645重鎖I50A+T95AFv CDRL2
配列番号: 171
<223> 645重鎖I50A+T95AFv CDRL3
配列番号: 172
<223> 645重鎖I50A+G98AFv CDRH1
配列番号: 173
<223> 645重鎖I50A+G98AFv CDRH2
配列番号: 174
<223> 645重鎖I50A+G98AFv CDRH3
配列番号: 175
<223> 645重鎖I50A+G98AFv CDRL1
配列番号: 176
<223> 645重鎖I50A+G98AFv CDRL2
配列番号: 177
<223> 645重鎖I50A+G98AFv CDRL3
配列番号: 178
<223> 645重鎖I50A+Y99AFv CDRH1
配列番号: 179
<223> 645重鎖I50A+Y99AFv CDRH2
配列番号: 180
<223> 645重鎖I50A+Y99AFv CDRH3
配列番号: 181
<223> 645重鎖I50A+Y99AFv CDRL1
配列番号: 182
<223> 645重鎖I50A+Y99AFv CDRL2
配列番号: 183
<223> 645重鎖I50A+Y99AFv CDRL3
配列番号: 184
<223> 645重鎖T56A+T95AFv CDRH1
配列番号: 185
<223> 645重鎖T56A+T95AFv CDRH2
配列番号: 186
<223> 645重鎖T56A+T95AFv CDRH3
配列番号: 187
<223> 645重鎖T56A+T95AFv CDRL1
配列番号: 188
<223> 645重鎖T56A+T95AFv CDRL2
配列番号: 189
<223> 645重鎖T56A+T95AFv CDRL3
配列番号: 190
<223> 645重鎖T56A+G98AFv CDRH1
配列番号: 191
<223> 645重鎖T56A+G98AFv CDRH2
配列番号: 192
<223> 645重鎖T56A+G98AFv CDRH3
配列番号: 193
<223> 645重鎖T56A+G98AFv CDRL1
配列番号: 194
<223> 645重鎖T56A+G98AFv CDRL2
配列番号: 195
<223> 645重鎖T56A+G98AFv CDRL3
配列番号: 196
<223> 645重鎖T56A+Y99AFv CDRH1
配列番号: 197
<223> 645重鎖T56A+Y99AFv CDRH2
配列番号: 198
<223> 645重鎖T56A+Y99AFv CDRH3
配列番号: 199
<223> 645重鎖T56A+Y99AFv CDRL1
配列番号: 200
<223> 645重鎖T56A+Y99AFv CDRL2
配列番号: 201
<223> 645重鎖T56A+Y99AFv CDRL3
配列番号: 202
<223> 645dsFv 重鎖Fv
配列番号: 203
<223> 645dsFv 軽鎖Fv
配列番号: 204
<223> 648dsFv 重鎖Fv
配列番号: 205
<223> 648dsFv 軽鎖Fv
配列番号: 206
<223> 645Fvの重鎖
配列番号: 207
<223> 645Fvの軽鎖
配列番号: 208
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 209
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 210
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 211
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 212
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 213
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 214
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 215
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 216
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 217
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 218
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 219
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 220
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 221
<223> アルブミン結合ペプチド
配列番号: 222
<223> 646Fv CDRH1
配列番号: 223
<223> 646Fv CDRH2
配列番号: 224
<223> リンカー
配列番号: 225
<223> リンカー
配列番号: 226
<223> 652 VH ドメイン
<222> (26)..(35)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (50)..(65)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (98)..(109)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号: 227
<223> 652 VL ドメイン
<222> (24)..(34)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (50)..(56)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
<222> (89)..(97)
<223> Xaa はいずれの天然アミノ酸であることができる
配列番号: 228
<223> リンカー
配列番号: 229
<223> リンカー
Claims (20)
- 1つの対象抗原に対する第1の特異性を有するFab又はFab’断片を含み、第2の対象抗原に対する特異性を有するVH/VL対である2つの単一ドメイン抗体(dAb)をさらに含み、2つの単一ドメイン抗体が、VH中に1つ及びVL中に1つの2つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されており、2つのシステイン残基の位置が、VH37及びVL95、VH44及びVL100、VH44及びVL105、VH45及びVL87、VH100及びVL50、VH100b及びVL49、VH98及びVL46、VH101及びVL46、VH105及びVL43並びにVH106及びVL57からなる群から選択される、多価抗体融合タンパク質。
- VHのシステインが位置44であり、VLのシステインが位置100である、請求項1に記載の多価抗体融合タンパク質。
- 2つの単一ドメイン抗体が、第2の抗原と協同的に結合する相補的VH/VL対である、請求項1又は請求項2に記載の多価抗体融合タンパク質。
- 第1の抗原及び第2の抗原が異なる実体である、請求項1から3までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質。
- VH dAbが、Fab又はFab’の重鎖に直接又は間接的に接続されている、請求項1から4までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質。
- VL dAbが、Fab又はFab’の軽鎖重鎖に直接又は間接的に接続されている、請求項1から5までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質。
- VH dAbが、Fab又はFab’重鎖のC末端に直接又は間接的に接続されており、VL dAbが、Fab又はFab’軽鎖のC末端に直接又は間接的に接続されている、請求項5又は請求項6に記載の多価抗体融合タンパク質。
- VH dAbが、Fab又はFab’重鎖のN末端に直接又は間接的に接続されており、VL dAbが、Fab又はFab’軽鎖のN末端に直接又は間接的に接続されている、請求項5又は6に記載の多価抗体融合タンパク質。
- VH及び/又はVLドメインが、配列番号224又は配列番号225に示す配列を有するリンカーを介してFab又はFab’断片と連結されている、請求項1から8までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質。
- VH dAbが、配列番号228に示す配列を有するリンカーを介してFab又はFab’重鎖のN末端と連結されており、VL dAbが、配列番号229に示す配列を有するリンカーを介してFab又はFab’重鎖のN末端と連結されている、請求項8に記載の多価抗体融合タンパク質。
- 第2の抗原がアルブミンである、請求項1から10までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質。
- 第2の抗原がヒト血清アルブミンである、請求項1から11までのいずれか一項に記載の多価抗体融合タンパク質。
- 前記VH単一ドメイン抗体が、図5(e)の配列番号56又は図5(k)の配列番号62に示す、CDR−H1の配列を有するCDRと、図5(f)の配列番号57又は図5(l)の配列番号63に示す、CDR−H2の配列を有するCDRと、図5(g)の配列番号58又は図5(m)の配列番号64に示す、CDR−H3の配列を有するCDRとを含む、請求項12に記載の多価抗体融合タンパク質。
- 前記VL単一ドメイン抗体が、図5(h)の配列番号59又は図5(n)の配列番号65に示す、CDR−L1の配列を有するCDRと、図5(i)の配列番号60又は図5(o)の配列番号66に示す、CDR−L2の配列を有するCDRと、図5(j)の配列番号61又は図5(p)の配列番号67に示す、CDR−L3の配列を有するCDRとを含む、請求項12に記載の多価抗体融合タンパク質。
- VH単一ドメイン抗体が配列番号202に示す配列を含み、VL単一ドメイン抗体が配列番号203に示す配列を含む、請求項12に記載の多価抗体融合タンパク質。
- VH単一ドメイン抗体が配列番号204に示す配列を含み、VL単一ドメイン抗体が配列番号205に示す配列を含む、請求項12に記載の多価抗体融合タンパク質。
- 配列番号202に示す配列を有するVHドメインを含む、アルブミンと結合するFv又はscFv。
- 配列番号204に示す配列を有するVHドメインを含む、アルブミンと結合するFv又はscFv。
- 配列番号203に示す配列を有するVLドメインをさらに含む、請求項17に記載のアルブミンと結合するFv又はscFv。
- 配列番号205に示す配列を有するVLドメインをさらに含む、請求項18に記載のアルブミンと結合するFv又はscFv。
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