JPH09502862A

JPH09502862A - 結合特異性を有する組換ジスルフィド安定化ポリペプチドフラグメント

Info

Publication number: JPH09502862A
Application number: JP7502172A
Authority: JP
Inventors: エイチ．パスタン，イラ; リー，ビュングクック; ジュン，スン−ヒー; ブリンクマン，ウルリッヒ
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1993-06-14
Filing date: 1994-06-14
Publication date: 1997-03-25
Anticipated expiration: 2018-12-08
Also published as: US6147203A; CA2164984A1; AU682705B2; AU7246494A; DE69412614T2; US5747654A; DE69412614D1; ATE169932T1; US6558672B1; ES2124419T3; DK0703926T3; WO1994029350A3; EP0703926A1; JP3474574B2; CA2164984C; EP0703926B1; WO1994029350A2

Abstract

(57)【要約】本発明はジスルフィド安定化された組換ポリペプチド分子であって別のポリペプチドに対する結合能力及び特異性を有する分子、例えば抗体分子の可変領域に関する。かかる分子及びかかる分子をコードする配列の製造方法も述べる。詳しくは、本発明はFvフラグメントのＶ_H及びＶ_L領域を連結するジスルフィド結合により安定化されたFv抗体フラグメントを開示する。Ｔ細胞レセプターのα及びβ鎖は本発明に記載の手段により同様に安定化されうる。

Description

【発明の詳細な説明】結合特異性を有する組換ジスルフィド安定化ポリペプチドフラグメント発明の背景発明の分野本発明は、ジスルフィド−安定化された（ds）組換ポリペプチド分子、例えば別のペプチドに対する結合能力及び特異性を有する抗体分子の可変領域に関する。これらの分子及びその分子をコードする核酸配列を製造する方法も説明する。背景抗体は特定の同系抗原を認識且つそれに結合する分子である。臨床診断、処置及び基礎科学研究において利用するためのハイブリドーマ生産化モノクローナル抗体の莫大な数の用途が述べられている。モノクローナル抗体を利用する癌、ウィルス及び微生物感染、Ｂ細胞免疫不全並びに免疫系のその他の病気及び障害の臨床処置が有望のようである。イムノグロブリンのFvフラグメントは抗原の高親和性結合にとって必要とされる抗体の最小の機能成分であると考えられている。それらの小さなサイズは、腫瘍をイメージ化する及び腫瘍に組換免疫毒素を誘導する等の臨床用途に関して完全抗体よりも能力的に一層有用なものとし、その理由は、サイズは腫瘍及び組織への浸透力に大きく影響するからである。 Fvフラグメントは可変重鎖ドメイン（Ｖ_H）及び可変軽鎖ドメイン（Ｖ_L）のヘテロダイマーである。完全 IgGの中にある重鎖及び軽鎖ドメインのヘテロダイマーは、例えば、ジスルフィド結合により連結されている。これらのFvフラグメントはではなく、それ故Fvは単独では不安定である。 Glockshuberら、Biochemistry 29：1362-1367 (1990)。ペプチドリンカーにより連結されているＶ_H及びＶ_Lを有する組換Fvは一般に安定である。例えば、Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 85：5879-5883 (1988)及びBirdら、Science 242：423-426 (1988)を参照のこと。これらは一本鎖Fvであり、特異性及び親和性を維持していることが認められており、そして腫瘍をイメージ化する及び例えば腫瘍療法のための組換免疫毒素を作るのに有用であることが示されている。しかしながら、研究者は、一部の一本鎖Fvは抗原に対する弱い親和力を有し、そしてペプチドリンカーが結合を妨害することを見い出している。 Fvを安定化せしめる別の手法は Glockshuberら前掲により試されている。構造が既知である抗体の相補性決定領域(CDR) の中にジスルフィド結合を、リガンド結合に対して限られた影響しか及ぼさない又は全く影響を及ぼさないように設ける。この手法は未知の構造を有する他のFvを安定化するためには問題を抱えており、その理由は各々の CDR領域の構造が抗体間で異なるから、及び CDR同志を架橋するジスルフィド結合は抗原結合を妨害しがちであるからである。それ故、標的抗原に対する親和力を維持するであろうような、注目の抗体のFv領域を安定化する別の手段が所望されるであろう。発明の概要本発明はリガンドに特異的に結合するポリペプチドに関連し、ここでこのポリペプチドはリガンド結合成分の第一可変領域を含んで成り、その第一可変領域はこのリガンド結合成分の第二の別の可変領域にジスルフィド結合を介して結合しており、この結合はこの第一及び第二可変領域のフレームワーク領域を連結している。このポリペプチドは例えばラジオアイソトープ、酵素、毒素もしくは薬剤にコンジュゲートさせるか、又は毒素、酵素もしくは薬剤に組換融合させてよい。このポリペプチド及びそれを含む薬理組成物をコードする核酸配列も開示する。このポリペプチドは、その第一可変領域が抗体の軽鎖可変領域であり、そして第二可変領域が抗体の重鎖可変領域であるものであることが好ましい。このポリペプチドはまた、その第一可変領域がＴ細胞レセプターのα可変鎖領域であり、そしてその第二可変領域がＴ細胞レセプターのβ可変領域であるものである。２つの可変領域を有するリガンド結合性成分のジスルフィド安定化ポリペプチドを製造するための方法は下記の工程を含んで成る：（ａ）この第一可変領域に関する核酸を、42，43，44，45又は46位においてシステインをコードするように突然変異させ、そしてこの第二可変領域に関する核酸を、103，104，105又は 106位においてシステインをコードするように突然変異させる（かかる位置はKabat and Wuにより公開された番号付け法に従い、抗体の軽鎖及び重鎖領域のそれぞれに対応して決定される）；又は（ｂ）この第一可変領域に関する核酸を、43，44，45，46又は47位においてシステインをコードするように突然変異させ、そしてこの第二可変領域に関する核酸を、98，99，100又は 101位においてシステインをコードするように突然変異させる（かかる位置はKabat and Wuにより公開された番号付け法に従い、抗体の重鎖又は軽鎖のそれぞれに対応して決定される）；次いで（ｃ）発現系においてこの第一可変領域に関する核酸及びこの第二可変領域に関する核酸を発現させる；そして（ｄ）抗原に対する結合親和性を有する前記ポリペプチドを回収する。本発明はペプチドリンカーにより連結されているＶ_H及びＶ_Lを有する組換Fvに至る別の手段を提供する。かかる組換一本鎖Fvは一般には安定であり、且つ特異的であるが、一部のものは抗原に対して弱まった親和力を有し、そしてペプチドリンカーが結合を妨害しうる。Fvフラグメントの保存領域の中に位置するジスルフィド結合により安定化された組換Fvポリペプチドを製造するための手段及びこれらを含む組成物、例えば免疫毒素も記述する。本発明の臨床投与は、大きめのフラグメント又は抗体分子全体の利用に勝るいくつかの利点を提供する。好適な形態における本発明のポリペプチドは、追加のジスルフィド結合に基づきより強い安定性を有する。それらのサイズの小ささに基づき、それらは循環するタンパク質分解酵素の解裂部位の数を減らし、より強い安定性をもたらす。それらは標的組織に一層速く到達し、そして身体から一層速く浄化される。それらは免疫原性も低まっている。更に、そのサイズの小ささは、薬剤ターゲッティング及びイメージング用途における他の分子への特異的な複合を助長する。本発明はまた、Ｖドメインのα及びβ鎖を鎖間ジスルフィド結合により連結することによってＴ細胞レセプターの抗原結合性部分（Ｖドメイン）を安定化する手段を提供する。Ｖドメインのかかる安定化は可溶性形態のこのフラグメントの単離及び精製に役立つであろう。この分子は従って他のFvのそれと似たような用途において利用できうる。これらは腫瘍細胞についての診断アッセイ又は自己免疫疾患及びAIDSの如くの免疫を基礎とする疾患の検査において利用できうる。それらはまた腫瘍細胞にとっての標的として、又は自己免疫疾患もしくはその他の免疫を基礎とする疾患における望ましくない免疫応答を阻止するための手段としての治療的用途も有しうる。図面の簡単説明図１：MAb B3（第一列）及びMAb McPC603(第二列) の重鎖及び軽鎖可変領域の配列対比。２本の配列間の実線及び点線はそれぞれ同一性及び類似性を示す。フレームワーク（FR）と相補性決定(CDR) 領域との間にはスペースを挿入しており、それらは配列の下に表示している。好適な鎖間ジスルフィド結合についての C ysへと変更できる残基を枠で囲った。配列の上のＸ印は10個毎の残基を示している。V_H 95Ser から Tyrに至る突然変異部位及び軽鎖におけるその擬対称性(pseu do-symmetry)関連 Tyr残基はその上のチェックマーク（レ）により表示している。配列表において、MAb B3の重鎖は Seq．ID No.１、MAb McPC603の重鎖は Seq ．ID No.２、MAb B3の軽鎖は Seq．ID No.３、そして MAb McPC603の軽鎖は Seq ．ID No.４である。フレームワーク(FR1-4) 及び相補決定領域（CDR1-3）の表示は Kabatら前掲による。図２：B3(dsFv)−免疫毒素の発現用プラスミド。pUL128の一本鎖ウラシル含有 DNAを、Kunkel突然変異誘発によるB3(V_H) の arg44及びB3(V_L) のser105を cys に突然変異するための鋳型とした。B3(V_H cys44)についての発現プラスミド pYR 38-2を、VL-PE38KDELをコードするEcoRＩ−フラグメントの欠失により作った。p ULI39をコードするB3(V_L cys105)-PE38KDELは、V_L-cys105 含有 PstＩ−HindIII フラグメントをB3(V_L )-PE38KDELをコードするpULI21にサブクローニングすることにより構築した。図３：様々な癌腫細胞系に対する B3(dsFv)-PE38KDEL及び B3(Fv)-PEKDELの特異的細胞障害能。（ａ）Ｂ３抗原発現性A431細胞及びＢ３−陰性HUT-1002細胞に対する B3(Fv)-PE38KDEL及び B3(dsFv)-PE38KDELの細胞障害能の対比；（ｂ）様々な細胞系に対する B3(dsFv)-PE38KDELの細胞障害能；（ｃ）過剰のMAb B3の添加によるA431 細胞に対する細胞障害能の競合。A431細胞には結合するが別の抗原（トランスフェリンレセプター）には結合しない等量のアイソタイプ−対合コントロールMAb HB21の添加は競合しないことに注意。図４：MAb（モノクローナル抗体）McPC603（「603」）、MAb B3（「B3」）、M Ab e23（「e23」）及びMAb aTac（「aTac」）の重鎖及び軽鎖フレームワーク領域（FR2及びFR4のそれぞれ）のアミノ酸配列対比。詳細な説明本発明は、リガンドに特異的に結合することができ、且つ２つの可変領域（例えば軽鎖及び重鎖可変領域）であって各可変領域のフレームワーク領域にあるジスルフィド結合を介して互いと結合し合っている領域を有する安定なポリペプチドを開示する。これらのポリペプチドは高安定性であり、そして高結合性親和力を有する。これらは各領域に関する核酸配列をこのポリペプチドのフレームワークにおける特定の位置においてシステインがコードされるように突然変異させることにより作られる。一般的なイムノグロブリン構造イムノグロブリンファミリーのメンバーは全て一式のアンチパラレルβ鎖をイムノグロブリン様フォールドへと安定化する中心に位置するジスルフィド結合を特徴とするイムノグロブリン様ドメインを共有する。ファミリーのメンバー（例えはMHCクラスＩ、クラスII分子、抗体及びＴ細胞レセプター）はイムノグロブリンの可変又は定常ドメインのいづれかと相同性を共有しうる。抗体の重鎖又は軽鎖はＮ末端(NH₂) 可変領域（Ｖ）及びＣ末端（−COOH）定常領域（Ｃ）を有する。この重鎖可変領域はＶ_Hと称され、そして軽鎖可変領域はＶ_Lと称される。Ｖ_H 及びＶ_Lフラグメントは結合して「 Fv」と称される。この可変領域は分子の抗体が認識する抗原に結合する部分であり、一方、定常領域は抗体のエフェクター機能（例えば補体の固定、オプソニン化）を決定する。全長イムノグロブリン又は抗体「軽鎖」（一般に約25キロダルトン（kd）、約214個のアミノ酸）はＮ末端側（一般に約１１０個のアミノ酸）において可変領域遺伝子により、そしてCOOH末端側において定常領域遺伝子によりコードされる。全長イムノグロブリン又は抗体の「重鎖」（一般に約50kd、約 446個のアミノ酸）は可変領域（一般に約116アミノ酸をコードする）及び定常領域遺伝子の一つ（約 330個のアミノ酸をコードする）により同様にしてコードされる。一般に、「Ｖ_L」はＶ_L及びＪ_L（Ｊ又は連結領域）遺伝子セグメントによりコードされる軽鎖部分を含み、そして「Ｖ_H」はＶ_H並びにＤ_H（Ｄ又は変化領域）及びＪ_H遺伝子セグメントによりコードされる重鎖部分を含むであろう。一般的には、Roittら、Immunology，Chapter 6(第２版 1989)及びPaul，Fundame ntal Immunology；Raven Press(第２版 1989)を参照のこと（共に引用することで本明細書に組入れる）。イムノグロブリンの軽鎖又は重鎖の可変領域は、４つの比較的保存されているフレームワーク領域又はFrが隣接している相補性決定領域又は CDRとも呼ばれている３つの超可変領域を含んで成る。数多くのフレームワーク領域及び CDRが並べられている（引用することで本明細書に組入れる「Sequences of Proteins of Immunological Interest」E.Kabat ら米国政府印刷局、NIH公開No．91-3242(19 91) 〔Kabat and Wu〕を参照のこと）。様々な軽鎖又は重鎖間のフレームワークの配列は比較的保存されている。この CDR及びFRポリペプチドセグメントは現存の抗体のFv領域又はそれらをコードする DNAの配列分析を実験的に基礎として命名されている。課題の抗体配列とKabat and Wu他に公開されているものとの整合により、課題の抗体又はその他のリガンド結合性成分についてのフレームワーク領域及び CDRが決定できうる。構成的な軽鎖及び重鎖の組合せたフレームワーク領域は CDRを配置及び整列することを担う。 CDRは抗原のエピトープに対する結合を主に司り、そして一般にCDR1，CDR2及びCDR3（可変領域鎖のＮ末端から出発して順に番号付け）と称されている。Ｔ細胞レセプター遺伝子の一般的な順列は抗体の重鎖のそれと似ている。Ｔ細胞レセプター(TCR) は可変ドメイン（Ｖ）及び定常ドメイン（Ｃ）の両方を有する。Ｖドメインは抗原との結合に役立つ。抗体のフレームワーク CDR領域と相同性の領域がＶドメインの中にある。イムノグロブリンＶ領域に対する相同性は整合によって決定できうる。 TCRのＶ領域は抗体のFvとの高いアミノ酸配列相同性を有する。引用することで本明細書に組入れる Hedrickら Nature (London) 308 ：153-158 (1984)。本明細書において用いる語 CDRは、天然イムノグロブリン結合性部位の天然可変結合性領域（例えばFv）、Ｔ細胞レセプター（例えばＶα及びＶβ）の結合親和性及び特異性、又はかかる機能を擬態する合成ポリペプチドの結合親和性及び特異性を規定するアミノ酸配列を意味する。本明細書において用いる語「フレームワーク領域」又は「FR」はCDRの中にあるアミノ酸配列を意味する。ここで言及している「リガンド結合性成分」は特定のリガンド又は抗原に特異的に結合するあるいはそれらを認識することのできる可変ドメインを有する分子である。特に注目される成分には、抗体及びＴ細胞レセプター、並びにFv，Fab ，F(ab′)₂等の如くのものの合成又は組換結合性フラグメントが含まれる。適切な可変領域にはＶ_H，Ｖ_L，Ｖα及びＶβ等が含まれる。本発明の実施は好ましくは抗体のFv部又は TCRのＶ部のみを利用する。天然イムノグロブリンタンパク質構造のその他のセクション、例えばＣ_H及びＣ_Lは存在している必要はなく、そして通常は本発明のポリペプチドから意識的に排除される。しかしながら、本発明のポリペプチドは、下記に説明の通り、生物活性領域を規定する更なるポリペプチド領域、例えば毒素もしくは酵素を含んで成るか、又は毒素もしくは遠隔的に検出可能な物質が結合することのできうる部位を含んで成りうる。Fvフラグメントの調製注目のFv抗体フラグメント又はその他のリガンド結合性成分に関する情報が、所望のジスルフィド安定化フラグメント、例えばFvフラグメント（dsFv）を安定化するようにジスルフィド結合を適正に配置するために、必要とされる。注目の可変領域のアミノ酸配列を、Kabat and Wu 前掲による公開物における類似の配列との整合により比較し、所望のポリペプチドフラグメントのフレームワーク領域の中にジスルフィド結合を供するため、どの配列を突然変異させれば重鎖及び軽鎖の可変領域の適正な位置においてシステインがコードされることができるかを決定する。システイン残基は共有ジスルフィド結合を供するのに必要である。例えば、ジスルフィド結合を設けて、Ｖ_LのFR４とＶ_HのFR２とを連結する；又はＶ_LのFR２とＶ_HのFR４とを連結する；ことができる。配列を整合させた後、Kabat and Wuにより利用される番号付け系における下記の位置と整合する注目の配列におけるアミノ酸の位置が同定される：重鎖可変領域の43，44，45，46及び47位（グループ１）並びに 103，104，105及び 106位（グループ２）；並びに軽鎖可変領域の42，43，44，45及び46位（グループ３）並びに98，99，100及び 101位（グループ４）。あるケースにおいて、これらの位置の一部は欠失しており、整合におけるすき間を示している。次に、このように同定した位置のうちの２つにあるアミノ酸をコードする核酸配列を、それらの２つのアミノ酸がシステイン残基に突然変異されるように変える。選択すべきアミノ酸のペアーは好ましい順に下記の通りである： V_H 44-V_L 100, V_H 105 -V_L 43, V_H 105 -V_L 42, V_H 44-V_L 101, V_H 106 -V_L 43, V_H 104 -V_L 43, V_H 44-V_L 99, V_H 45-V_L 98, V_H 46-V_L 98, V_H 103 -V_L 43, V_H 103 -V_L 44, V_H 103 -V_L 45。最も好ましくは、システインの置換は次の位置において施す： V_H 44-V_L 100；又は V_H 105 -V_L 43。（表示 V_H 44-V_L 100 は、例えば、44位においてシステイン、そして 100位においてシステインを有するポリペプチドを意味する；その位置はKabat and Wuにより付与される番号付けに従う）。 Kabat and Wuに従う位置の表示に関し、位置の番号付けは規定の保存残基を意味し、そして所定の抗体における実際のアミノ酸位置ではないことに注目すべきである。例えば、下記の実施例に記載のds(Fv)B3を作るのに用いるCysL100(Kaba t and Wu) は実際にはB3(V _L ) の 105位に相当する。Ｔ細胞レセプターのＶα及びＶβの場合において、Ｔ細胞レセプターに関してもKabat and Wuにおける番号付け系を参照することができる。システインの置換はＶαの41，42，43，44もしくは45位及びＶβの106，107，108，109もしくは 1 10位において施すか；又はＶαの104，105，106，107，108もしくは 109位において及びＶβの41，42，43，44もしくは45位において施してよく、かかる位置は TCRについてのKabat and Wuの番号付け系に従う。このような参照を行ったとき、最も好適なシステイン置換は Vα42-Vβ110 及び Vα108 -Vβ42である。Ｖβ 位106，107及びＶα位104，105は CDRの位置であるか、それらはジスルフィド結合が安定的に配置されうる位置でもある。 Kabat and Wuの番号付け系の参照によるシステイン置換についてのアミノ酸の位置を同定する別の方法として、注目の配列を図１に示すモノクローナル抗体 ( MAb)B3（下記の参照）についての配列と整合させることができる。グループ１について上記したKabat and WuのＶ_H位に対応するＢ３のアミノ酸の位置はそれぞれ43，44，45，46及び47である。グループ２についてはそれぞれ109，110，111 及び 112である。グループ３について上記したKabat and WuのＶ_L位に対応するＢ３のアミノ酸の位置はそれぞれ47，48，49，50及び51である；グループ４についてはそれぞれ103，104，105及び 106である。あるいは、システイン残基にする突然変異部位は以下に例示する注目すべき実際の抗体又はモデル抗体のいづれかを参考にすることにより同定できうる。抗体の如くのタンパク質のモデルを作り上げるためのコンピュータープログラムは一般に入手でき、そして当業者に公知である（Kabat and Wu；Loewら、Int.J.Quan t.Chem.，Qu ant.Biol.Symp.，15：55-66 (1988)；Bruccoleriら Nature，335：564-568 (198 8)； Chothiaら、Science，233：755-758 (1986)を参照のこと；全て引用することで本明細書に組入れる）。市販のコンピュータープログラムを、コンピューターモニター上でこれらのモデルを表示するのに、原子間の距離を計算するのに、及び種々のアミノ酸の相互作用の性質を評価するのに利用できる（Ferrinら、J. Mol.Graphics，6：13-27 (1988)を参照のこと、引用することで本明細書に組入れる）。例えば、コンピューターモデルはアクセス可能であり、且つ結合に関与する帯電アミノ酸残基を推定せしめることができ、これによりコンホメーション的に制約された有機分子を合成することができる。例えば、Saragoviら、Scienc e，253：792 (1991)を参照のこと（引用することで本明細書に組入れる）。他のケースにおいて、実験的に決定した抗体の実際の構造を得ることができうる。適切なアミノ酸残基のペアーは（１）８Å以下、好ましくは 6.5Å以下の２個の残基間の距離（Brookhaven Protein Data Bank由来のものの如くの入手可能な抗体の結晶構造体より決定）を有する；且つ（２）可能な限り CDR領域から離れている；べきである。一旦同定できたら、それらをシステインで置換することができる。上記のものと相同性の位置にあるモデル化Ｂ３における残基ペアー間のＣα−Ｃα距離を以下の表１に示す。一ペアーのシステイン置換の導入がほとんどの用途にとって十分であろう。追加の置換があるケースにおいて有用且つ所望されうる。標的地点においてシステインをコードするようにする遺伝子の改良は公知の技術、例えば部位特異的突然変異誘発（Gillman and Smith，Gene，8：81-97 (197 9)及び Roberts，S.ら、Nature，328： 731-734 (1987)を参照のこと；共に引用することで本明細書に組入れる）により、引用することで本明細書に組入れるKunkelのProc.Natl.Acad.Sci．USA 82：48 8-492 (1985)に記載の方法により、又は任意のその他の公知手段により容易に成し遂げることができうる。所望のＶ_H及びＶ_L配列（又はその他の相同性Ｖ配列）に関する配列を有する独立ベクターを突然変異せしめたプラスミドより作ることができうる。重鎖領域及び軽鎖領域をコードする配列は、下記に記載のガイドラインを除き、当業界に公知又は記載の任意の方法で独立の培養物において生産及び発現される。発現ポリペプチドの中に別の配列、例えば毒素に関する配列を組込むとき、それはＶ_H又はＶ_L配列にＮ末端もしくはＣ末端において連結するか、又は別のタンパク質配列の中に適当な位置において挿入してよい。例えば、シュードモナス外毒素（PE ）由来の融合タンパク質に関しては、Ｖ_H又はＶ_Lのいづれかをその毒素のＮ−末端に連結するか、又はThenerら、J.Urology 149 (1993)(引用することで本明細書に組入れる)における TGFαの如くのように、PEのドメインIIIの中に挿入してよい。ジフテリア毒素由来の免疫毒素に関しては、Ｖ_H又はＶ_Lは毒素のＣ末端に連結するのが好ましい。組換一本鎖抗体の発現において使用するものの如くのペプチドリンカーを、所望するならば２つの可変領域（Ｖ_H及びＶ_L、Ｖα及びＶβ）を連結するのに採用してよく、そしてある種の分子においては安定性を積極的に高めることができうる。本発明の二価又は多価ジスルフィド安定化ポリペプチドは下記の実施例に記載の通り、２以上の好ましくは同一のＶ_H領域をペプチドリンカーで連結し、次いでＶ_Lを付加することにより構築することができる。ペプチドリンカー及びその用途は当業界に公知である。例えば、引用することで本明細書に組入れるHust onら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 前掲；Birdら、Science前掲； Glockshuberら、前掲；米国特許第 4,946,778号、米国特許第 5,132,405号、及び最近の Stemmerら、Biotechniques 14：256-265 (1 993)を参照のこと。本発明のタンパク質はＥ．コリ、他の細菌宿主、酵母並び様々な高等真核細胞、例えばCOS，CHO及びHela細胞系及びミエローマ細胞系等の様々な宿主細胞において発現されうる。この組換タンパク質遺伝子は各宿主にとって適切な発現コントロール配列に作動連結されているであろう。Ｅ．コリに関しては、これにはプロモーター、例えば T7，trp，tac，lac又はラムダプロモーター、リボソーム結合性部位、及び好ましくは転写終止シグナルが含まれる。真核細胞に関しては、このコントロール配列にはプロモーター、そして好ましくはイムノグロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウィルス等に由来するエンハンサー、並びにポリアデニル化配列が含まれ、そしてスプライスドナー及びアクセプター配列が含まれうる。本発明のプラスミドは特定の宿主細胞の中に公知の方法、例えばＥ．コリに関しては塩化カルシウム形質転換法、そして哺乳動物細胞に関してはリン酸カルシウム処理もしくはエレクトロポレーションにより移入することができうる。これらのプラスミドにより形質転換した細胞はプラスミド上に含まれている遺伝子、amp，gpt，neo及び hyg遺伝子により付与される抗生物質耐性により選択されうる。Ｅ．コリの如くの細菌からの一本鎖抗体の発現及び／又は適切に折りたたまれた形態へのリフォルディングのための方法は記述され、且つ公知であり、そして本発明のポリペプチドに応用できる。Buchnerら、Analytical Biochemistry 205 ：263-270 (1992)；Pluckthun，Biotechnology，9 ：545 (1991)；Huseら、Scie nce，246：1275 (1989) 及びWardら、Nature，341：544 (1988)を参照のこと（全て、引用することで本明細書に組入れる）。往々にして、Ｅ．コリ又はその他の細菌由来の機能性タンパク質は封入体から作られるものであり、従って強力な変性剤を用いるタンパク質の可溶化及び事後リフォルディングを必要とする。可溶化工程においては、ジスルフィド結合を溶解するために還元剤が存在していなければならず、それは当業界に公知である。還元剤を有する典型的なバッファーは：0.1Ｍのトリス、pH８、６Ｍのグアニジン、２mMのEDTA、0.3ＭのDTE(ジチオスレイトール) である。タンパク質ジスルフィド結合の再酸化は還元型及び酸化型の低分子量チオール試薬の存在下で有効に触媒されうる。これは引用することで本明細書に組入れるSaxenaら、Biochemi stry 9：5015-5021 (1970)に、特に BuchnerらAnal.Biochem.，前掲（1992）に記載されている。再生は一般に変性及び還元されたタンパク質をリフォルディングバッファーの中に希釈（例えば100倍）することにより成し遂げられる。典型的なバッファーは 0.1Ｍのトリス、pH 8.0、0.5ＭのＬ−アルギニン、８mMの酸化グルタチオン（GSSG）及び２mMのEDTAである。一本鎖抗体プロトコールについての必須の改良として、重鎖及び軽鎖領域を別々に可溶化及び還元させ、次いでリフォルディング溶液の中で結合させる。これらの２種のタンパク質を、一方のタンパク質のモル過剰量が他方より５倍の過剰量を超えないモル比で混合したときに好適な収量が得られる。過剰の酸化グルタチオン又はその他の酸化性低分子量化合物を、レドックスシャフリングを完了した後にこのリフォルディング溶液に加えることが所望されうる。ポリペプチドの精製一旦発現させたら、この組換タンパク質は当業界の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー等に従って精製できる（一般には、R.Scopes，Protein Purification，Spri nger-Verlag，N.Y. (1982)を参照のこと）。少なくとも約90〜95％の均質性の実質的に純粋な組成物が好ましくは、そして薬理学的用途にとっては98〜99％又はそれより高い均質性が最も好ましい。所望通りに部分的又は均質に至るまで精製できたら、これらのポリペプチドは薬理学的目的のために外毒素を実質的に除去すべきであり、これにより治療用に利用できうる。様々なdsFvフラグメント分子上記のdsFvペプチドの説明は全ての種（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ヒト）のキメラペプチド、ヒト型抗体等の抗体の全てのクラス／グループを抱括しうるものと解されるべきである。「キメラ抗体」又は「キメラペプチド」は抗体又は抗体ペプチドであって、そのペプチドの一部が第一の遺伝子源に由来する抗体もしくはペプチドにおける対応の配列に由来するもしくはそれに相同性であるアミノ酸配列を有し、同時にその鎖の残りのセグメントが別の遺伝子源の対応の配列と相同性であるものを意味する。例えば、キメラ抗体は、フレームワーク及び相補性決定領域が別の起源に由来している抗体を含みうる。例えば、非ヒト CDRをヒト定常領域に連結されたヒトフレームワーク領域に組込んで「ヒト型抗体」にすることができる。例えば、PCT出願公開番号 WO 87／02671、米国特許第 4,816 ,567号、EP特許出願第 0,173,494号、Jonesら、Nature，321：522-525 (1986)及び Verhoeyenら、Science，239：1534-1536 (1988)を参照のこと（これらは全て引用することで本明細書に組入れる）。同様に、Ｖ_Hの起源はＶ_Lの起源と異なっていてよい。課題のポリペプチドは免疫毒素の如くの融合タンパク質を作るのに利用できうる。免疫毒素は２つの機能的な成分を特徴とし、そしてインビトロ又はインビボで特定の細胞を殺傷するのに極めて有用である。一の機能的な成分は、細胞に付着又は吸着したときに細胞にとって致死的な細胞障害剤である。「搬送ビヒクル」として公知の第二の機能的な成分は、毒性試薬を癌腫を含んで成る細胞の如くの特殊な細胞タイプへと運ぶための手段を司る。これらの２つの成分はPastanら、Ann.Rev.Biochem．（1992）後掲に記載の如くのペプチドリンカーを介して互いと組換融合させることができうる。これらの２つの成分は任意の様々な公知の化学手段によって互いと化学結合させることもできる。例えば、細胞障害剤がタンパク質であり、そして第二の成分が完全イムノグロブリンであるとき、その連結はヘテロ二価架橋剤、例えばSPDP、カルボジイミド等を介してよい。様々な免疫毒素の製造が当業界において公知であり、そして例えば「Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates：Aiming the Magic Bullet」Tho rpeら、Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine，Academic Press、頁168 -190 (1982)及びWaldmann，Science，252：1657（1991）において見い出せる（共に引用することで本明細書に組入れる）。様々な細胞障害剤が免疫毒素における利用にとって適当である。細胞障害剤には、放射性核種、例えばヨウ素−131、イットリウム−90、レニウム−188及びビスマス−212；いくつかの化学治療剤、例えばビンデシン、メトトレキセート、アドリアマイシン及びシスプラチン；並びに細胞障害性タンパク質、例えばリボソーム障害タンパク質、例えばポークウィード抗ウィルスタンパク質、シュードモナス外毒素Ａ、リシン、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖、ゲロニン等、又は細胞表層において活性な試薬、例えばホスホリパーゼ酵素（例えばホスホリパーゼＣ）を含みうる。（一般には、Pastanら、「Recombinant Toxins as Novel Therap entic Agents」 Ann.Rev. Biochem．61：331-354 (1992)；「Chimeric Toxins」Olsnes and Phil，Pharmac .Ther.，25：355-381 (1982)及び「Monoclonal Antibodies for Cancer Detecti on and Therapy」編 Baldwin and Byers、頁159-179，224-266，Academic Press （1985）を参照のこと；これらは引用することで本明細書に組入れる）。これらのポリペプチドは薬剤、酵素、ホルモン、アイソトープと結合できるキレート化剤、触媒性抗体及び病気の診断又は処置にとって有用なその他のタンパク質の如くの、上記のものの他の様々な薬剤にコンジュゲート又は組換融合させることができる。診断の目的のため、これらのポリペプチドはラベル化又は非ラベル化のものであってよい。多種多様なラベル、例えば放射性核種、蛍光物質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、リガンド（特にハプテン）等を採用してよい。多種多様なイムノアッセイが有用であり、そして当業者に周知である。抗体Fvドメインに類似の分子−Ｔ細胞レセプター本発明は抗体Fvドメインと高度の相同性を示す分子、例えばＴ細胞レセプター (TCR) のリガンド特異的Ｖ領域に適用できうる。かかる用途の例を以下に概略する。TCR分子の抗原特異的Ｖ領域の配列2B4(Beckerら、Nature（London）317：43 0-434 (1985))を、標準の配列整列パッケージを用いて２種類の抗体分子、McPC6 03（以下参照）及びJ539（Protein Data Bank entry 2FBJ）のFvドメインに対して整合させた。2B4のＶα配列をこれら２種類の抗体のＶ_H配列に対して整合させたとき、Ｂ３の V_H 44に対応するＳ１部位残基はVα43S であると同定でき (Kab at and Wuの番号付け系においてはTCR42)、そしてＢ３の V_H 111 に対応するＳ２部位残基は Vα104Qであると同定できた（Kabat and Wuの番号付け系においてはTCR108）。このＶα配列を２種類の抗体のＶ_L配列に対して整合させたとき、同じ残基である Vα43S 及び Vα104Qが同定できた。この時はＢ３の V_L 48 及び V_L 105 のそれぞれに対応する残基と整合させた。同様にして、2B4残基 V β42E 及び Vβ107P(Kabatらの番号付け系において TCR42及び110)をＢ３の V_H 44及び V_H 111、そして同時にＢ３の V_L 48及び V_L 105 に対応する抗体残基と整合させることができる。従って、この TCRにおけるこの２種類の最も好ましい鎖間ジスルフィド結合部位は Vα43-Vβ107 及び Vα104 -Vβ42である。これらの残基のペアーのうちの一組における２個の残基のシステインへの突然変異はこの分子のα及びβ鎖間にジスルフィド結合を導入するであろう。このジスルフィド結合に由来する安定化は、これらの分子を大量に単離・精製することを可能にするであろう。dsFvポリペプチドの結合親和性本発明のポリペプチドはリガンドに特異的に結合することができる。本発明にとって、リガンドに特異的に結合するポリペプチドとは一般に抗原あるいは標的細胞上のレセプターと反応する又はそれを認識もしくはそれと結合することのできる分子を意味する。抗体又はその他のポリペプチドは、もしその抗体又はペプチドが、標準の抗体−抗原又はリガンド−レセプターアッセイ、例えば競合アッセイ、飽和アッセイ、又は ELISAもしくは RIAの如くの標準イムノアッセイによる測定又は決定に従い、リガンドに結合する又はリガンドと結合できるなら、リガンドに対する結合親和性を有する又は特異的であると言える。この特異性の定義は、単独で又は組合せでリガンドと結合できるなら、リガンドに特異的な一本鎖の重鎖及び／もしくは軽鎖、CDR、融合タンパク質、又は重鎖及び／もしくは軽鎖のフラグメントに適用できる。競合アッセイにおいて、リガンドに結合する抗体又はペプチドフラグメントの能力は、ペプチドが、リガンドに結合することのわかっている化合物の結合力と競合するそのペプチドの能力を検定することにより決定できる。多種多様な競合アッセイが知られ、そして本明細書に述べられている。他方、インヒビター抜きでの試験化合物の結合能を測定するアッセイも利用してよい。例えば、リガンドと結合する分子又はその他の化合物の能力は課題の分子をラベルすることにより検出するか、又はその分子をラベルせず、様々なサンドイッチアッセイ方式を利用して間接的に検出することができる。多種多様な結合アッセイ、例えば競合結合アッセイが知られている（例えば、米国特許第 3,376,110、4,01 6,043号及び Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Sprin g Harbor Publications，N.Y．（1988）を参照のこと：引用することで本明細書に組入れる）。競合アッセイではなく、単独で一の成分に対する試験化合物の結合能を測定するためのアッセイも有用である。例えば、リガンドの存在を同定するのにイムノグロブリンポリペプチドを使用してよい。モノクローナル抗体アッセイ、例えば ELISAについての標準的手順を利用してよい(Harlow and Lane、前掲を参照のこと）。利用できうる様々なシグナル生成系については、引用することで本明細書に組入れる）。以下の実施例は例示の目的のために提供し、そして本発明を限定するものではない。実施例モノクローナル抗体(MAb)B3 及び MAb e23のＶ_H及びＶ_Lの保存フレームワーク領域における抗原の結合能を損うことなくシステインへと突然変異させることができ、且つジスルフィド安定化Fvを形成せしめることのできる残基のモデル化及び同定を開示する。Ｂ３は数多くのヒトの癌の上に存在する特異的な炭水化物と反応する（Pastanら、Ca ncer Res．51：3781-3787 (1991)；引用することで本明細書に組入れる）。MAb e23は数多くのヒトの癌腫上に存在する erbB2抗原と特異的に反応する。かかるジスルフィド安定化Fvを含む活性免疫毒素も説明する。Ｉ．結合部位の構造に影響を及ぼすことのない MAbのＶ_H及びＶ_L間のジスルフィド結合のデザインＡ．デザイン手法 MAb B3の三次構造は知られていないため、我々は適当なアミノ酸を交換又は欠失させることにより、MAb McPC603（以下参照）の構造からB3(Fv)のモデルを作製した。MAb McPC603を選定し、なぜならそれは公開されている全てのマウス抗体構造間で最高の総合的（Ｌ＋Ｈ）な配列同一性及び類似性を有するからである。McPC603のＶ_H及びＶ_Lドメインのそれぞれ全部で44個（２個の欠失を含む）及び40個（１個の欠失を含む）のアミノ酸を変更した。挿入は必要としなかった。この構造を次にCHARMM（以下参照）を用いて段階的にエネルギー的に小さくしていった：まず水素原子のみ、次いで欠失領域、次いで全ての突然変異残基、そして最後に分子全体を変えた。Ｖ_HとＶLとの間のジスルフィド連結に関して可能な位置を選定するのに三つの基準を利用した。（ｉ）このジスルフィドはＶ_H及びＶ_Lの構造的に保存されているフレームワーク領域におけるアミノ酸を、ジスルフィド安定化がB3(Fv)にとってのみならず、そのFv同志にとっても有効となるように、連結すべきである。（ ii）Ｖ_HとＶ_L間の距離はFv構造上に歪みを及ぼすことなくジスルフィドの形成を可能にするほど小さいべきである。（iii）ジスルフィドは抗原結合の妨害を回避するに足りるほど CDRから十分に離れているべきである。これらの基準は以下の２つの潜在的なジスルフィド架橋により満たされうるが、しかし表１に示すようにこれら２つの部位のまわりにも他の潜在的な部位がある。一の可能性はB3(V_H) の arg44及びB3(V_L) のser105をシステインに置き換えてこれらの位置の間にジスルフィドを設けることにある。他は、B3(V_H) のgln111及びB3(V_L) の ser48をシステインに変えることにある（図１参照のこと）。これらの２組のペアーはＶ_H及びＶ_L構造にほぼ近い擬二つ折り対称性により互いと関係し合っている。各ケースにおいて、推定のジスルフィド結合(V_H 11 1，V_L 105)に関与する残基の一方は両側には、ジスルフィド結合の導入により生ずる構造の局所的な歪の吸収を助けることのできる高保存性 Gly残基が隣接している。我々は、両方のジスルフィド結合が存在している両方の可能性及び一方の可能性についてのモデルをエネルギー最小限化した。更なる研究のために V_H 44 -V_L 105 連結を選び、その理由はこの連結を有するエネルギー精密化モデル構造は V_H 111 -V_L 48連結を有するものよりも若干優れたジスルフィド結合幾何学を有するからである。いくつかのその他の抗体に関しては、後者の連結の方が前者よりも好適であり得た。Ｂ．コンピューターモデル化 B3(Fv)構造の初期モデルを、GEMMとして知られるイン・ハウス分子グラフィックを用い、適当な残基を欠失及び突然変異させることにより、McPC603の可変ドメインの構造(Satowら、J.Mol.Biol．190：593-604 (1986))から、Brookhaven P rotein Data Bank（Brookhaven National Laboratory，Upton，Long Island，Ne w York）エントリー１MCP（Abolaら、Crystallographic Databases-Information Content，Software Systems，Scientific Applications pp.107-132 (1987))により獲得した。このモデルの構造及び様々な突然変異体の構造をモレキュラー・ダイナミック・シミュレーション・プログラムCHAR MM（Brooksら、J.Comp.Chem．4：187-217(1983)(引用することで本明細書に組入れる))バージョン22を用いるadopted basis set Newton Ralphson (ABNR)エネルギー最小化手順により精密化した。この手順の詳細は以下の通りである：１．エネルギー最小化全ての構造精密化を、モレキュラー・ダイナミック・シミュレーション・プログラムCHARMM（Brooksら、前掲）を用いるABNR (adopted basis set Newton Ral phson)エネルギー最小化手順により行った。−Ｈパラメーターセットの全てを利用した。非結合カットオフ距離を13.0Åとし、スイッチング関数（switching fu nction）を Lennard-Jones電位に適用し、そして静電相互作用に対するシフティング関数(shifting function) は10〜12Åとした。溶媒は含ませなかった。最後のランを除く全ての精密化のために１の誘電率を利用し、最後のランは距離依存性誘電率を利用した。２．野生型 B3 Fvモデルの構築まず B3 Fv構造のモデルを、モレキュラー・グラフィックプログラムGEMMを用い、適当な残基を欠失及び突然変異させることによって、McPC603のFvドメインの構造(Satowら、前掲；Protein Data Bank entry IMCP，Abolaら、前掲）から獲得した。対応の残基を見つけるために用いた配列整列法はKabat and Wu（前掲、図１）のそれとした。他の公知のマウス Fab構造（例えばJ539及び R19.9；それぞれProtein Data Bank エントリー2FBJ及び2F19）から McPC603構造を選定し、その理由はそのFv部がアミノ酸配列においてＢ３のそれと最高の総合的同一性及び類似性を有しているからである。McPC603のＶ_H及びＶ_Lドメインのそれぞれ全部で44（２個の欠失を含む）及び40（１個の欠失を含む）個のアミノ酸を変えたが、挿入は必要としなかった。この一次構造を次に以下のプロトコールに従って精密化した：（１）水素原子（極性及び非極性の両者）をCHARMMを利用して付加し、そしてその位置を重量原子を固定しておいて50段エネルギー最小化により精密化した。（２）欠失領域のまわりのＣ−Ｎ結合の長さを短くするため、20kcal／mol／Åのマス重量ハーモニック力（mass-weighted harmonic force）で拘束しておいた３つの欠失領域 ( Ｖ_L：28−37，Ｖ_H：50−59，99−108)のそれぞれのまわりの10個のアミノ酸を除く全ての原子を固定して20段エネルギー最小化を行った。この最小化は20段各々について、15，10、次いで５kcal／mol／Åのハーモニック拘束力で繰り返した。（３）全ての突然変異アミノ酸及びその欠失領域のまわりの30個のアミノ酸を含ませるように、様々なアミノ酸の拡張リストを用いて段階（２）の拘束最小化と同セットを繰り返した。（４）最後に、拘束最小化と同セットをその構造中の全ての原子を精密化するために繰り返した。この一連の精密化を経て得られた構造をＶ_H及びＶ_Lドメイン間のジスルフィド結合の導入及び Serから Tyrに至る突然変異のための出発構造を担う（以下参照）。野生型 B3 Fvの最終構造を距離依存性誘電率を用い、更なる２式のエネルギー最小化を経て得た（以下参照）。３． Tyr突然変異モデルの構築 B3 Fvの新たに構築した構造の調査の際、V_H 99位にある Ser側鎖(Kabat and W u 前掲においてはV_H 91) 付近において、B3 Fvモデル構造のFRコアのＶ_H−Ｖ_L接触面領域において空洞の凹空間があることに注目した。Fabのその他の結晶構造は対応の位置において Tyr又は Pheのいづれかを有する。Kabatら（前掲）における配列データーは、その位置は Tyr又は Pheのいづれかによってたいてい占められていることも示す。即ち、Ｂ３におけるこの位置にある Serは異常のようである。更に、目視調査より、この位置の Tyrの側鎖は構造の残りの全てにほとんど変化を与えることなく非常に好適にその付近の空洞空間を占める、並びにこのことは疎水性及びファン・デル・ワールス相互作用を高めることによってＶ_H−Ｖ_L会合を助長するであろうこと、が明らかとなった。従って、我々は Tyr 突然変異構造を構築してエネルギー精密化した。 Tyr突然変異モデルを構築するのに用いたプロトコールは B3 Fvモデルを構築するのに用いたものと同じようなものとした：（１）Ｖ_Hの Ser残基をGEMMを用いて Tyrに置き換えた。（２）水素原子を20段エネルギー最小化により、他の全ての原子を固定しておいて、CHARMMを用いて付加及びその位置を精密化した。（３）新たな Tyr残基の全ての原子を、他の原子を全て固定しておいて次の20段最小化の際に変更させた。（４）最後に、この構造の全ての原子を４連続セットの 20段最小化により段階的に緩和させ、各セットにおいて20，15，10、次いで５kc al／mol／Åのマス重量ハーモニック拘束力を用いた。４．Ｖ_HとＶ_Lドメインとの間の可能なジスルフィド結合の位置の選択Ｖ_H及びＶ_Lドメインの間にジスルフィド結合を導入するための可能な突然変異部位をまず一分子グラフィックプログラムGEMMを用い、Ｂ３の一次モデルの目視調査により一次的に同定した。選定基準は（１） Cysへと突然変異すべき残基ペアーの両者が分子のFR−領域の中にあり、少なくとも一方の残基は一次配列において CDRから遠く離れており、そして（２）２つの残基の間のＣα−Ｃα距離が 6.5Å以下である；ものとした。２つのペアーを同定できた：V_H 44R -V_L 105S 及び V_H 111Q-V_L 48S。Ｂ３モデル構造を完全に精密化した後、Ｃα−Ｃα距離が特定した値より小さいものであるＶ_H及びＶ_LドメインのFR領域間の全て残基ペアーについて系統的に調査するためにプログラムCH ARMMを用いた。この調査の結果を表１にまとめ、それはＣα−Ｃα距離がＢ３の一次モデルで同定された２つの部位において最短であることを示しているが、存在しているその他の部位も潜在的な候補である。Ｖ_H位置 43，101及び 102、並びにＶ_L位置96及び97は CDR領域内にあるが、システインで置換されたときに結合特異性を維持しながら安定なds結合を生み出すことがない。５．ジスルフィド−結合化 B3 Fvモデルの構築これらの潜在的なジスルフィド結合部位を同定できたら、６つのジスルフィド結合モデルを作り上げた。これらのうちの３つは「ｓ44」(V_H 44R 及び V_L 105Sが Cysに変えられ、且つジスルフィド結合を有するB3 Fv)、「s111 」(V_H 111Q及び V_L 48S が Cysに変えられ、且つジスルフィド結合を有するB3 F v)、並びに「s44，111」(両方のジスルフィド結合を有するB3 Fv)とした。その他の３つは Tyr突然変異B3 yFvの対応のジスルフィド結合型である。これらを y 44，y111及びy44，111と表示した。この６つのモデル構造全てを同一のプロトコールを用いてエネルギー最小化により精密化した。これは、（１）GEMMを用いる適当な残基の突然変異、（２）水素原子の付加、（３）Cys残基を緩和させ、そして隣りの２つの Gly残基を、他の全ての原子は固定しておいて 100段エネルギー最小化することによりジスルフィド結合を形成する、（４）４連続セットの20 段エネルギー最小化によりこの構造の全ての原子を精密化する（ここで、マス重量ハーモニック拘束力は20，15，10、次いで５kcal／mol／Åとした）。その後、全ての構造を以下の通りに最終精密化に委ねた。６． B3 Fvの野生型及び様々な変異体の最終モデルの作製 B3 Fv及びその全ての変異体の構築モデルを更なる 500段最小化、それに続く別の 500段手順に、総エネルギー変化が0.01kcal／mol 以下となったらexit基準がランを停止させるようにして、委ねた。これらの最終計算は拘束抜きで、そして距離依存性誘電率を利用して実施した。表２に報告する値はこれらの計算の最後のサイクルに由来する。７． B3 Fvフラグメントのモデル B3 Fv構造の精密化モデルを McPC603の（未精密化）結晶構造（図示せず）と比較することができる。欠失残基を除くこれら２つの構造のＣα原子間の rms 偏り(deviation) は、FR−領域、CDR−領域及び全分子のそれぞれについて0.75 ，1.18及び0.91Åであった。ほとんどの相違は分子のループ並びにＣ及びＮ末端にある。これらの構造間の相違の一部はおそらくは、一方がエネルギー精密化されているのに対し、他方がそうでないことにも基づく。McPC603構造は精密化しておらず、その理由はエネルギー最小化構造が、特に精密化を溶媒の水抜きで実施したときに、結晶構造ほど常に信頼できないからである。８． B3 Fvの Tyr突然変異体（B3 yFv）上記した通り、我々は V_H 95にある Ser残基を Tyr残基に置き換えた B3 Fvの突然変異体を構築した。Fvの安定性に対するこの突然変異の効果は定量的にコンピューター計算することができず、その理由は解離してほどけたFvの形態の構造についての情報のなさにある。構造精密化中に自然に得られた数字はこの分子の折りたたまれた形態の様々なエネルギー値を表わす。Ser側鎖を Tyrのそれと置き換えたとき、突然変異残基とこのタンパク質の残りとの Lennard-Jones電位エネルギーは、精密化前は1.79kcal／mol であり、水素原子のみの20段最小化を経ると0.05kcal／mol となり、そして全ての原子の完全精密化を経ると−20kcal／ mol となった。これらの数字は、モデル化した B3 Fv構造が、重大な立体的重複抜きでその位置において Tyr残基を許容しうることを示す。全ての原子の完全な精密化後の様々なエネルギー値を表２に示す。Tyr突然変異は、野生型及び全ての Cys突然変異体の両者において、常にその Ser対応物より低いエネルギーを有することがわかった。B3 FvとB3 yFvの主鎖原子間の rms偏差は0.15Åであった。９．ジスルフィド結合化 B3 Fvフラグメントのモデル潜在的な鎖間ジスルフィド結合形成のために選んだ２つの部位は V_H 44R -V_L 105Sにある部位Ｓ１及び V_H 111Q-V_L 48S にあるＳ２（それぞれ、Kabatら前掲の番号付け系に従うと、V_H 44-V_L 100及び V_H 105 -V_L 43）とする。これらの部位はFR領域の中にあり、最も近い CDR領域から２残基以上離れている。鎖間Ｃα −Ｃα距離は未精密化モデルにおいて最短であり、そしてそれは精密化モデルにおいて最短であった（表１）。各ペアーにおける一方の残基V_L 105 及び V_H 111 には、高保存 Gly残基が両側に隣接していることにも注目すべきである。これらの Gly残基は中央の残基に柔軟性を与え、そしてジスルフィド結合が形成されるときに生じうる歪の一部を吸収するものと考えた。我々は単一及び二重ジスルフィド結合型モデルの両方を構築した。それぞれは V_H 95において Serから Tyrに至る突然変異を有するか又は有さない。ジスルフィド結合の導入に基づく構造的変化は、残基当りの平均としてコンピューター計算すると小さい−ジスルフィド結合変異体の主鎖原子とその親分子のそれとの間の rms偏りは0.2〜0.3Åであった。しかしながら、突然変異部位での有意な変化が必然的に起こり、なぜならＣα−Ｃα距離は0.5〜1.0Å減少するはずであるからである（表１及び３を参照のこと）。しかしながら、大きな変化は鎖のほんのわずかな距離しか伝わらないようであり、そして全て数残基内で消失するか、又はFR領域の最初のループを経て消失するようである。 10．ジスルフィド結合化モデルのエネルギーどの突然変異体の安定性も評価するのが難しく、その理由は対応のほどけ形態の構造的情報の欠如による。完全に精密化したモデルの様々なエネルギー値を表２に示す。これらのエネルギー値を考慮するうえで、正確な値は経験的なポテンシャルエネルギー及び溶媒を無視することによってもたらされる誤差に関係する固有の不確定性に委ねられる。これらの数値は定性的な考察のみのために用いられるものである。種 B3 FvとB3 yFvの部位Ｓ１及びＳ２のエネルギーをまず比較すると、突然変異前はＳ１部位はＳ２部位よりも実質的に低いエネルギーを有することがわかりうる。このことは、もし突然変異体が同一のエネルギーを有するなら、Ｓ１部位を突然変異させることのほうがＳ２部位を突然変異させることよりも多くのエネルギーを費すことを意味する。しかしながら、これらのエネルギー値は極めて信頼性のないものであり、その理由は、突然変異前に関与している残基は全てが極性の高いArg，Ser及び Glnであり、そしてそのエネルギー値は溶媒のなさにより敏感に影響されるであろうからである。他方、突然変異後にＳ１に存在するシステイン残基の内部エネルギーはＳ２にあるものよりも約６kcal／mol 低い（単一及び二重ジスルフィド結合種の両方において）。これは V_H 95が Serであろうと Tyrであろうと事実である。これは小さなエネルギー差にすぎないが、この計算値の信頼性は高く、なぜならそれは形式電荷をもたない一の共有結合成分を含むからである。このエネルギーの差の詳細な構成の調査は、そのほとんどが３〜４kcal／moleに相当する結合角エネルギーの差及び１〜２kcal／moleに相当する捩り角のエネルギーの差に由来することを示唆する。このことは、Ｓ２のジスルフィド結合がＳ１のそれより若干歪んでいることを示唆する。分子の残りとの相互作用エネルギーは部位Ｓ１については約40kcal／mole、そして部位Ｓ２については約30kcal／mole生じ、Ｓ２が好適である。この分子のＳ１及びＳ２以外部位の残りの部分のエネルギーにおいてはるかに大きい変化があり、これはこの分子のこの部分においてコンホメーション変化が生ずることを意味している。しかしながら、この構造変化及びエネルギー成分の詳細な調査は、これらの相違のほんの一部のみしかジスルフィド結合の導入の直接的な結果であると追跡することができないことを示唆する。この相違の大半は、露出したループにある分子の自然の柔軟性と、コンピューター計算したエネルギー値が帯電した柔軟性側鎖原子の位置における小さな変化に対して感受性であるという事実との組合せに基づくようである。しかしながら、一般に、分子のエネルギーはジスルフィド結合の導入により高まる及びそれは２つのジスルフィド結合が形成されたときに一層比例的に上昇する、ことが明らかである。ジスルフィド結合当りの上昇度はＳ１部位のそれに匹敵する。即ち、エネルギーは Arg及び Serを２つ Cysに変換させることにより変化する。Ｖ_H −Ｖ_L相互作用エネルギーは、一般に V_H 95にある Tyr突然変異により、その度合いが上昇することもわかりうる。 11．ジスルフィド結合モデルの幾何学ジスルフィド結合は全て右まわりであることが（right-handed）見い出せる（表３）。部位Ｓ１において形成されたシステイン残基は、分子の偽二つ折り対称性により、部位Ｓ２において形成されたものとほぼ関係している。しかしながら、その詳細な幾何学（表３）はそれらが２つのタイプに属することを示唆する。８つのシステイン残基のうちの２つを除く全てが一方のタイプ（タイプＡ）であり、残りの２つは種s111及びs44，111におけるＳ２にあるものが異なるタイプ（タイプＢ）のものである。引用することで本明細書に組入れるKatzらJ.Biol.Che m．261：15480-15485 (1986)は公知のタンパク質結晶構造におけるシステイン残基を概説しており、そして右まわり形態を６つの異なるクラスに分類している。我々のモデルにおいて見い出せた２つのタイプはこれらのクラスのいづれにもぴたりとは収まらない。モデル化した幾何学に最も良く収まる２つのクラスの二面角の値も表３の中に含ませている。クラス６は、例８と共に、その他のタンパク質構造の中に見い出せる右まわりシステイン残基についての最も一般的な幾何学を表わしている。むしろ部位Ｓ１にあるジスルフィド結合の内部二面角がこのクラスのそれに近い。他方、部位Ｓ２にあるジスルフィド結合はそれが最も近いクラス（y111及びy44，111種におけるタイプＡ結合についてのクラス６、並びにs111及びs44，1 11種におけるタイプＢ結合についてのクラス３）からかなり偏っている内部二面角を有する。他のジスルフィド結合からのタイプＢ幾何学の大きな偏りはおそらくは、一番下が V_H 95セリン残基であるB3(Fv)におけるＳ２部位付近のキャビティーの存在に関係する。この新たなジスルフィド結合はこのキャビティーの側面にあり、そして V_H 48残基のＣβ原子はこのキャビティーに向って引っ張られている。クラス３におけるその他のものからのタイプＢのＣα−Ｃβ−Ｓ−Ｓ′とＣβ−Ｓ− Ｓ′−Ｃβ二面角の大きな偏りは、主鎖のこの歪みに関係する。V_H 95にある Ty r突然変異は、このキャビティーを Tyr側鎖で埋め、そして主鎖の歪みを復帰させ、且つシステイン残基の幾何学をタイプＢからタイプＡへと変化させるようである。しかしながら、突然変異後でさえも、Ｓ２部位にあるジスルフィド結合の幾何学はＳ１部位よりもクラス６幾何学から一層偏るものである。この主鎖二面角の値（表４）は、Ｓ１での突然変異がＳ２の主鎖の幾何学に何ら影響を及ぼさない、及びその逆も真であることを示唆する。大きな角変化は重鎖における突然変異残基に限定される。唯一の例外はs111及びs44，111種についての V_H 110 のΨ角における30°の変化であり、それはこれらの種におけるＳ２付近のキャビティーの存在におそらく関連する特徴である。V_H 95における Tyr突然変異はこれ及びＳ２にあるその他の主鎖二面角を変える(V_H 110 及び V_H 111 の V_L 48の Φ及びΨ並びに V_H 110のΨ）。 12．モデル化の所見 Fvフラグメントの重鎖及び軽鎖のそれぞれは、９ストランドのベーターバレルを形成する、並びに分子の中心にある重鎖と軽鎖との間の接触面もバレル型であることがよく知られている（Richardson Adv.Prot.Chem．34：167-339 (1981)）。この中央バレルの片面は重鎖由来の４本のストランドより成り、一方、他の面は軽鎖由来の４本のストランドより成る。これら２つの面は互いとそのバレルのまわりで２つの部位において連結されており、それらはそのバレルの軸に沿って走るほぼ二つ折りの対称性により関係し合っている（Daviesら、Ann.Rev.Bioche m．44：639-667 (1975)）。各部位において、一の鎖(B3 Fvに関しての V_H 44-47 又は V_L 48-51)のβ４ストランドのストレッチは、別の鎖(B3 Fvに関しては V_L 105-101 又は V_H 111-107)のβ９ストランドのストレッチの隣りで逆平行に走る。B3 Fvのモデル化構造において、そしておそらくは全てのイムノグロブリンのFvにおいて、FR領域における主鎖原子間の最も近い鎖間接触はこれらのストレッチ内又はこれらのストレッチの中間フリンジ内のいづれかに認められる（表１）。公知のタンパク質構造におけるシステイン残基のＣα−Ｃα距離は 4.2〜6. 6 Åに範囲するため（Katzら、J.Biol.Chem．261：15480-15485 (1986)）、鎖間ジスルフィド結合がFR領域においてこれらの部位以外で、その分子に強い損傷性歪みを導入することなく形成されることは不可能である。この報告において研究した２つの可能なジスルフィド結合性部位はこれらの部位各々における最短の接触点である（表１）。V_H 44 -V_L 106，V_H 112 -V_L 48及び V_L 111 -V_L 47にあるジスルフィド結合も良好な部位である。短いＣα−Ｃα距離を有するその他のペアーはあまり好ましくなく、その理由はそれらは三次元構造において CDRループに近く、そしてそれ故分子の抗原結合機能を損いがちであるからである。しかしながら、McPC603のために彼らが用いた両方の部位 V_H 108 -V_L 55及び V_H 106 -V_L 56は CDR領域内の残基を包括しており、そして明らかに我々が同定した２つの部位とは異なる。これらの部位はＢ３の V_H 105 -V_L 54及び V_H 103 -V_L 55に相当し、そしてβ４／β９ストランドの CDRの最端であり、その対立端は V_H 111 -V_L 48のＳ２部位に属している。この相違は少なくともある程度は、潜在的なジスルフィド結合部位を探すために用いた異なる手法に由来する。彼らはいづれも Proでない鎖間残基ペアーについて探しており、そしてその主鎖原子の全てを、公知のタンパク質構造におけるかかる残基の全てのリストにおけるシステイン残基のそれに幾何学的に類似して(rmsにおいて２Å以内) アレンジしている。彼らはハプテン結合に直接関与はするが、他の点では CDR領域に属する残基を避けている。一方、我々はFR領域中の部位のみを調べ、同時にそのＣα間の距離が短くなることのみを必要とする幾何学に基づく拘束で緩和させている。突然変異部位にある歪みは必然的であり、そしてジスルフィド結合の形成の前の主鎖全体の類似性に基づく主張はおそらくは限定しすぎであると考える。計算した主鎖二面角の値（表４）は、ジスルフィド結合が、主鎖の内部幾何学における大きな変化を伴うことなくこれらの部位において形成されうることを示唆している。計算した主鎖二面角の値（表４）は、ジスルフィド結合が、主鎖の内部幾何学における大きな変化を伴うことなく形成されることを示唆している。特に、最初は歪みの一部を吸収するのに役立つものであろうと考えられていた隣りの Gly残基の主鎖二面角の変化は小さい。形成されたシステイン残基の内部幾何学（表３）はこれら２つの部位のうちの少なくとも一方において、公知のタンパク質構造におけるその他のシステイン残基の幾何学に近いようである。計算したエネルギー値は、利用する経験的に潜在する機能にかかわる固有の不正確さを理由に注意をもって利用せねばならない。なぜなら、計算において溶媒を含ませておらず、そしてその計算は折りたたまれた形質についてのみ可能であるからである（一方、必要であるのは折りたたまれた形態とほどけた形態との間の相違である）。にもかかわらず、その計算値は（表２）、この２つの部位にジスルフィド結合を導入するためのエネルギー消費は基本的に、タンパク質表層のこの２つの残基の価値の特徴を帯電から非極性へと変換するものであろう。これらは全て、これら２つの部位の一方においてのジスルフィド結合の導入が可能であることを示唆する。主鎖幾何学及びシステイン残基の内部幾何学、並びにＶ_H−Ｖ_L相互作用エネルギーは、V_H 95にある Serから Tyrへの突然変異が有利でありそうであることを示唆する。このエネルギー所見は、種ｙ44及びy111が二重ジスルフィド結合化種とほぼ同等に適当、且つ好適であろうことを示唆する。最後に、システイン残基の幾何学と公知のタンパク質構造におけるその他のそれとの対比は、y111に対してのｙ44種の若干の優勢さを供する。ここで見い出したジスルフィド結合が高保存型フレームワーク領域内にあることの事実は有意義である。これらの部位にある Cys突然変異は、フレームワーク領域の構造がタンパク質間で比較的類似している理由により有効であると予測される。この予測の部分的な試験として、我々は全ての公知のイムノグロブリンFv 領域についての結晶構造を利用してこれらの部位にあるＣα−Ｃα距離をコンピューター計算した。これらのデーター（表５）は、変動はあるにしても、Ｃα−Ｃα距離は、ヒト起源由来のものの一部を含むタンパク質の全てにおいて、これらの部位の少なくとも一方にあるジスルフィド結合の形成のために適切に短いのが事実である。これらの部位はコンピューターモデル化又は構造情報を必要とすることなく、単に配列整合により任意のイムノグロブリンについて見い出すことができうる。 II．B3(dsFv)免疫毒素の製造 B3(dsFv)-PE38KDELはシュードモナス外毒素（PE38KDEL）のトランケート形態に連結されたMAb B3のFv領域より成る組換免疫毒素であり、それにおいてＶ_H− Ｖ_Lはジスルフィド結合によって互いに結合し合い、且つ安定化されている。Ａ．B3(dsFv)−免疫毒素の発現のためのプラスミドの構築 V_H arg44 及び V_L ser105がシステインにより置き換えられているds(Fv)−免疫毒素の発現のためのプラスミドの作製のための親プラスミドは一本鎖の免疫毒素 B3(Fv)-PE38KDEL(tyrH95)をコードする。この分子において、MAb B3のＶ_H及びＶ_Lドメインは (gly4ser)³ ペプチドリンカーにより結合し合っており(B3 scF v) 、そしてシュードモナス外毒素 (PE) の転移（トランスロケーション）及び ADP−リボシル化要素をコードするPE38KDEL遺伝子(Brinkmannら、Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 89：5867-5871（1991）（Brinkmann Ｉ）；Hwangら Cell 48：129-13 6（1987）(共に引用することで本明細書に組入れる))に融合されている。B3(Fv) -PE38KDEL(tyrH95)は、B3(V_H) のセリン95(Kabatらに従うと位置 V_H 91)がチロシンに変わっていることを除き、B3(Fv)-PE38KDEL（Brinkmann Ｉ、前掲）と同じである。このチロシン残基はほとんどのネズミＶ_Hドメインのフレームワークにおいて保有されており、そしてＶ_H−Ｖ_L接触面におけるキャビティーを埋め、おそらくはＶ_H−Ｖ_Lドメイン相互作用に寄与している。我々は、B3(Fv)-PE38KDE L及び B3(Fv)-PE38KDEL(tyrH95)の、再生する能力、精製の際の挙動及び癌腫細胞系に対する細胞障害活性を含む特性を比較し、そしてそれらが区別可能であることを見い出した。 ds(Fv)−免疫毒素、B3(V_H cys44)及びB3(V_L cys105)-PE38KDELの成分の発現のためのプラスミドを、B3(V_H) における arg44及びB3(V_L) におけるser105をシステインへと突然変異させるための鋳型として、pULI28におけるＦ＋起点由来のウリジン含有一本鎖 DNAを用いる部位特異的突然変異誘発により作った(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492 (1985))。突然変異性オリゴヌクレオチドの配列については下記を参照のこと。B 3(V_H cys44)の発現のための最終プラスミド pYR38-2及びB3(V_L cys105)-PE38KDE LのためのpULI39を、突然変異させたプラスミドのサブクローニングにより作った。クローニング手法の詳細を図２に示す。プラスミドの構築：我々の発現プラスミドの中に存在しているＦ＋起点由来のウラシル含有一本鎖 DNAをＭ13ヘルパーとの同時トランスフェクションにより獲得し、そして従来述べられている通りにして(Kunkel，T.A., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492 (1985))部位特異的突然変異誘発のための鋳型として用いた。B3(Fv)の完全ヌクレオチド配列は先に述べられている通りである（Brinkmann Ｉ、前掲）。突然変異誘発用オリゴヌクレオチドは、 B3(V_H) の arg44を cysに変えるための５′-TATGCGACCCACTCGAGACACTTCTCTGGAGTCT-３′（Seq.ID No.5）、B3(V_L) のse r105を cysに置き換えるための TTTCCAGCTTTGTCCCACAGCCGAACGTGAATGG- ３′（Seq.ID No.6）、及びB3(V_H) 遺伝子の３′末端に、EcoRＩ部位が後続する停止コドンを導入するための５′-CCGCCACCACCGGATCCGCGAATTCATTAGGAGACAGTGACCAGAGTC-３′（Seq.ID No.7 ）とした。突然変異クローンの同定及びサブクローニングを助長するためのこれらのオリゴヌクレオチドに導入すべき制限部位(XhoＩ及びEcoRＩ) に下線を付した。オリゴヌクレオチド５′TCGGTTGGAAACTTTGCAGATCAGGAGCTTTGGAGAC ３′（Seq.ID No.8）、５′TCGGTTGGAAACGCAGTAGATCAGAAGCTTTGGAGAC ３′（Seq.ID No.9）、５′AGTAAGCAAACCAGGCGCACCAGGCCAGTCCTCTTGCGCAGTAATATATGGC３′(Seq.ID No.1 0)及び５′AGTAAGCAAAACAGGCTCCCCAGGCCAGTCCTCTTGCGCAGTAATATATGGC３′(Seq.ID No.1 1)をB3(Fv)の V_L 54，V_L 55，V_H 103 及び V_H 105にシステインを導入するために用い、それらは記載のジスルフィド安定化 McPC603Fvの V_L 55，V_L 56，V_H 10 6 及び V_H 108 位に相当する(Glockshuberら、前掲；表７参照のこと)。突然変異クローンは全て DNA配列決定により確認した。B3(V_L cys105) 突然変異を、引用することで本明細書に組入れるSambrookら、Molecular Cloning：A Laborator y Manual（第２版）、Vol 1〜3、Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に従う標準の技術によりB3(V_L) -PE38KDEL免疫毒素をコードするベクターにサブクローニングした。Ｂ．封入体における発現、リフォルディング及び精製 B3(Fv)-PE38KDEL，B3(Fv)cysH44L105-PE38KDEL，B3(V_L cys105)-PE38DEL 及びB3(V_H cys44)を本質的に記載の通りにして（Brinkmann Ｉ、前掲）、pUL19，p ULI37，pULI39又はpYR38-2をそれぞれ含む独立のＥ．コリBL21λDE3 培養物の中で製造した。組換B3(dsFv)−免疫毒素を製造するため、B3(V_H cys44)をコードするプラスミド pYR38-2又はB3(V_L cys105)-PE38KDELをコードするプラスミドpULI39のいづれかを含む独立のＥ．コリ BL21(λDE3)培養物をIPTGで誘導し、これにより細胞内封入体（IB）の中で全部で組換タンパク質が総タンパク質の20〜30％で蓄積した。IBを個別に単離し、溶解し、還元し、そしてレドックスシャフリング及び凝集防止剤を含む再生バッファー中でのリフォルディングを経て、活性免疫毒素が得られた。dsFvについてのリフォルディングは一本鎖免疫毒素の調製に関して既に述べられている通りにして(Buchnerら、Anal.Biochem．205：263-270 (1992)；引用することで本明細書に組入れる) 、２つの改良を伴って実施した：（ｉ）リフォルディング溶液に一種のみの可溶化、且つ還元化タンパク質（例えばB3(Fv) PE38KDEL）を加える代わりに、我々はIB含有 V_H cys44 又は VL Cys105毒素を別々に調製し、そしてそれらを２(V_H) ：１(V_L−毒素) のモル比でリフォルディングバッファー中で100μｇ／mlの最終総タンパク質濃度となるように混合した。我々は、Ｖ_L−毒素よりも２〜５倍過剰量のＶ_Hが最良の再生免疫毒素収量を供することを見い出した。再生溶液への等モル量のＶ_H及びＶ_L−毒素の添加又は＞５倍過剰量のＶ_Hは活性モノマー免疫毒素の収量の低下をもたらした；Ｖ_Hが多すぎると、我々は凝集の上昇を観察した。（ii）レドックスシャフリングの後にリフォルディング溶液に過剰量の酸化グルタチオンを加える「最終酸化」工程を完了した。この酸化は適正に折りたたまれた機能性タンパク質の収量を５倍以上高め、その理由はおそらくはＶ_HとＶ_Lとを接続するジスルフィド結合がFvの表層上で露出され、そしてそれがリフォルディングバッファー中の若干還元性の条件でアクセス可能となっており、そして「最終酸化」することなく還元状態であり続けるであろうことのためである。リフォルディングの後に活性免疫毒素を回収するため、我々はイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロース及びMono Qカラム）、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーである、scFv−免疫毒素について樹立された精製系（Brinkm ann Ｉ、前掲；引用することで本明細書に組入れるBrinkmannら、J.Immunol．15 0：2774-278 (1993)(Brinkmann)；Buchnerら、前掲）を応用した。適正に折りたたまれた(dsF v)−免疫毒素は凝集体から分離されるのみならず（これは容易に分離される）、 (dsFv)−免疫毒素に近いクロマトグラフィー挙動を有する「一本鎖ドメイン」Ｖ_L −毒素からも分離される（Brinkmann II 前掲）。B3(dsFv)-PE38KDELのリフォルディングの後、Mono Q「モノマーピーク」は２種のタンパク質を含む；dsFv− 免疫毒素はＶ_L−毒素よりも若干早く溶出する。我々はB3(dsFv)-PE38KDELをほぼ均質となるまで、クロマトグラフィーの連続サイクル、早期の画分のプール、ピーク画分の再クロマトグラフィー及び後期画分の廃棄により、精製した。活性ds Fv−免疫毒素の有意な損失にもかかわらず（廃棄した「後期」画分がまだdsFv− タンパク質を含んでいた）、この手順は、１リットルづつの細菌Ｖ_H及びＶ_L−毒素培養物から＞８mgの純粋なdsFv−免疫毒素を獲得するのに十分に有効であり、そして我々は我々の精製条件を改良することによりこの収量を大いに高めることができるものと予測する。 III．Ｂ３抗原発現性癌腫細胞系に対するB3(dsFv)-PE38KDELの特異的な毒性癌腫細胞系に対する種々の免疫毒素の活性（ng／mlで示すIC₅₀）を表６及び７に記載の通りにして決定した。B3(scdsFv)-PE38KDEL分子は、(gly₄ser)₃リンカーに加えて、鎖間ジスルフィドを形成するようにＶ_H及びＶ_Lにシステインが導入されている一本鎖免疫毒素である。V_H 44-V_L 105はB3(dsFv)-PE38KDELに相当するが、ただしB3(dsFv)においてリンカーペプチドは欠失している。V_H 105-V_L 54 及びV_H 103 -V_L 55は、従来述べられている「カスタムメード」V_H 108 -V_L 55及びV_H 106 -V_L 56ジスルフィド結合 McPC603(Fv)(Glockshuberら、前掲) においてシステイン残基が導入されている位置である。細胞障害能アッセイは、従来記述されている通りにして(Brinkmannら、Proc.N atl.Acad.Sci.USA 88：8616-8620（1991）（Brinkmann Ｉ）；引用することで本明細書に組入れる) 細胞タンパク質への ³Ｈ−ロイシンの取り込み量を測定することにより行った。IC₅₀は免疫毒素との16時間のインキュベーションを経てタンパク質合成を50％阻害する免疫毒素の濃度である。一本鎖免疫毒素 B3(Fv)-PE38KDEL及び対応のジスルフィド安定化 B3(dsFv)-PE 38KDELのFv媒介型特異的細胞障害能の比較は、両タンパク質が同一の細胞スペクトルを認識し、そして同等の活性であることを示す（図３、表６及び７）。B3(d sFv)-PE38KDELは B3(Fv)-PE38KDELと同様に、Ｂ３−抗原発現性細胞に対してのみ細胞障害性であり、そしてMAb B3と結合しない細胞（例えばHUT102）に対しては何ら作用を有さない。ヒトトランスフェリンレセプターである過剰のHB21ではなく、過剰のMAb B3の添加は、この細胞障害能と競合でき、B3(dsFv)-PE38KDEL の活性はＢ３−抗原に対する特異的結合能に基づくことを確証せしめる（図３Ｃ）。この競合実験において、過剰のMAb B3又はHB21（１mg／mlの最終濃度に至るまで）を毒素の添加の15分前に加えた。高濃度のMAb B3が競合のために必要であり、その理由は癌腫細胞上に存在している大量のＢ３抗原にある（Brinkmann Ｉ、前掲；Brinkmann II、前掲；Paiら、P roc.Natl.Acad.Sci.USA 88：3358-3362 (1991)）。scFv−及びdsFv−免疫毒素の特異性及び活性は区別可能であることの発見は、結合性領域がジスルフィド安定化B3(Fv)及びリンカー安定化分子において同等に保存されていることを示唆する。 IV．ヒト血清中でのB3(Fv)及びB3(dsFv)-PE38KDELの安定性 dsFv−及びscFv−免疫毒素は培養癌腫細胞に対して同等の活性を有するため、 B3(dsFv)もそのscFv対応物 B3(Fv)-PE38KDELと同様に癌腫処置に有用であるはずである（Brinkmann Ｉ、前掲）。免疫毒素の治療的有用性に寄与する一の要因はその安定性にある。Fv−免疫毒素の安定性を、それらをヒト血清の中で37℃で10 μｇ／mlの濃度でインキュベートすることにより決定した。様々な長さのインキュベーションを経て残っている活性免疫毒素をA431細胞に対する細胞障害能アッセイにより決定した。表８はヒト血清中でのscFv−及びdsFv−免疫毒素の安定性の比較を示す。scFv−毒素 B3(Fv)-PE38KDELは１〜２時間安定であり、次いで失活し始める。驚くべきことにそれに反して、dsFv−毒素 B3(dsFv)-PE38KDELは24時間以上完全に細胞障害性であり続ける。各種の免疫毒素を10μｇにおいて、ヒト血清と、37℃で表示の時間インキュベートし、次いでA431細胞に対する細胞障害活性についてアッセイした。Ｖ．免疫毒素e23(Fvds)-PE38KDEL MAb e23は数多くのヒト癌腫上に存在している erbB2抗原に対して特異的な抗体である。e23(Fv)-PE40はｅ23の一本鎖Fvより成り、そのＶ_LはペプチドリンカーによってＶ_Hに連結されており、そしてＶ_Hはシュードモナス外毒素のトランケート形態に融合されている（PE40）。e23(Fv)PE40は癌の治療において潜在的に有用であることが示されている(Batraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5867-58 71 (1992))。e23(Fv)-PE38KDELはe23(Fv)-PE40の一本鎖誘導体であり、その免疫毒素の毒素部はPE40の代わりにPE38KDELであり、より良い活性がもたらされている。Ａ．ジスルフィドの位置ｅ23のFv領域は上記のB3(Fv)に記載と同じようにしてジスルフィド結合により安定化されうる。我々は免疫毒素e23(dsFv)-PE38KDELを作り、それは組成においてe23(scFv)-PE38KDELに相当するが、ただしＶ_LとＶ_Hとの間のペプチドリンカーが排除され、ジスルフィド結合に置き換えられている。ジスルフィドの導入のために我々が利用した位置は、Kabat and Wuに従って V_H 44-V_L100位に相当し、実際のｅ23配列においてV_H asn43 及びVL gly99 位に相当する（図４参照のこと）。Ｂ．プラスミドの構築システインによるフレームワーク残基の交換、リンカーペプチドの欠失及び e 23(dsFv)免疫毒素の成分の個々の発現のためのプラスミドの構築は、上記の標準突然変異誘発及びクローニング技術により行った。V_H asn43 及びV_L gly99 のシステインによる置換のために用いる突然変異誘発用オリゴヌクレオチドは５′-AGTCCAATCCACTCGAGGCACTTTCCATGGCTCTGC-３′（Seq.ID No.12）（Ｖ_H）及び５′-TATTTCCAGCTTGGACCCACATCCGAACGTGGGTGG-３′（Seq.ID No.13）（Ｖ_L）とし、Ｖ_Lの末端の停止コドンは次のプライマーにより導入した：５′-AGAAGATTTACCAGAACCAGGAATTCATTATTTTATTTCCAGCTTGGACC-３′(Seq.ID No.1 4)。プラスミドの構築の詳細を図５に示す。B3(Fv)−免疫毒素と異なり、e23(Fv)− 免疫毒素の毒素部、e23(scFv)及びe23(dsFv)-PE38KDELはＶ_Hに融合しており、Fv のＶ_Lドメインに融合しているのではないことに注目すべきである。Ｃ．e23(dsFv)-PE38KDELの製造 e23(V_L cys99)及び e23(V_H cys43)-PE38KDEL であるe23(dsFv)-PE38KDELの成分をＥ．コリにおいて個別に封入体で発現させ、上記の通りに単離及びリフォルディングした。活性タンパク質をイオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーにより、本質的に上記の通りにして単離した。ところで、我々はB3(dsFv)免疫毒素の精製と異なり、この調製品はさほど夾雑する「一本鎖ドメイン」免疫毒素を含まないことを見い出した。その理由は、B3(dsFv)−免疫毒素の例においては、その毒素はＶ_Lに融合しているが、e23dsFv免疫毒素においては、その毒素はＶ_H に融合しているからである。一本鎖Ｖ_L−毒素は、凝集しがちなＶ_H毒素よりもはるかに可溶性であることが述べられている。そのため、B3(dsFv)の例において、可溶性Ｖ_L毒素はdsFv−免疫毒素調製品をひどく汚染してしまうが、e23(dsFv)− 例においては夾雑するＶ_H毒素は凝集及び沈降し、それ故dsFv−免疫毒素から容易に辞去できうる。Ｄ．ｅ23のscFv及びdsFvの比較前述の通り、Fv免疫毒素の特異的細胞障害能は免疫毒素のFv部の特異的結合能を評価するのに利用できる。表層上にerbB2を有する細胞に対する MAb e23由来のscFv及びdsFv−免疫毒素の特異的細胞障害能の比較を表９に示す（プロトコールの詳細については表６及び関連の説明を参照のこと）。ｅ23のdsFv−免疫毒素はscFv対応物と少なくとも同等の活性であり、そして若干活性が強いことがありうる。それ故、erbB2に対するｅ23のdsFvの特異的結合能は e23(scFv)と同等又は優れている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年４月２１日【補正内容】請求の範囲１．リガンドに特異的に結合するポリペプチドであって、リガンド結合成分の第一可変領域を含んで成り、この第一可変領域がこのリガンド結合成分の第二の別の可変領域にジスルフィド結合を介して結合しており、この結合がこの第一可変領域と第二可変領域のフレームワーク領域を連結しており、更にこのリガンド結合成分はイムノグロブリン又はＴ細胞レセプターである、前記ポリペプチド。２．前記ポリペプチドが抗体の定常領域を実質的に含まない、請求項１記載のポリペプチド。３．前記ポリペプチドがラジオアイソトープ、酵素、毒素、キレート化剤又は薬剤にコンジュゲートされている、請求項１記載のポリペプチド。４．前記ポリペプチドが毒素、酵素又はその他の薬剤に組換的に融合されている、請求項１記載のポリペプチド。５．前記第一可変領域が 98，99，100又は 101位においてシステインを含み、そして前記第二可変領域が43，44，45，46又は47位においてシステインを含み、かかる位置はKabat and Wuの「Sequences of Proteins of Immunological Inter est」、米国政府印刷局、NIH公開番号91-3242 (1991)により公開された番号付け系に従って決定されたものであり、抗体の軽鎖及び重鎖に各々が相当する、請求項１記載のポリペプチド。６．前記第一可変領域が 100位においてシステインを含み、そして前記第二可変領域が44位においてシステインを含む、請求項５記載のポリペプチド。７．前記第一可変領域が42，43，44，45又は46位においてシステインを含み、そして前記第二可変領域が 103，104，105又は 106位においてシステインを含み、かかる位置はKabat and Wuの「Sequences of Prote ins of Immunological Interest」、米国政府印刷局、NIH公開番号91-3242 (199 1)により公開された番号付け系に従って決定されたものであり、抗体の軽鎖及び重鎖に各々が相当する、請求項１記載のポリペプチド。８．前記第一可変領域が43位においてシステインを含み、そして前記第二可変領域が 105位においてシステインを含む、請求項７記載のポリペプチド。９．前記第一可変領域が抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_L）であり、そして前記第二可変領域が抗体の重鎖可変領域（Ｖ_H）である、請求項１記載のポリペプチド。 10．前記第一可変領域がＴ細胞レセプターのα可変鎖領域であり、そして前記第二可変領域がＴ細胞レセプターのβ可変鎖領域である、請求項１記載のポリペプチド。 11．リガンドに特異的に結合するポリペプチドを製造する方法であって、ここでこのポリペプチドはリガンド結合成分の第一可変領域を含んで成り、この第一可変領域はこのリガンド結合成分の第二可変領域に、これら２つの可変領域のフレームワーク領域におけるジスルフィド結合を介して連結されており、ここでこの方法は：（ａ）この第一可変領域に関する核酸を、42，43，44，45又は46位においてシステインをコードするように突然変異させ、そしてこの第二可変領域に関する核酸を、103，104，105又は 106位においてシステインをコードするように突然変異させる、ここでかかる位置はKabat and Wuの「Sequences of Proteins of Imm unological Interest」、米国政府印刷局、NIH公開番号91-3242 (1991)により公開された番号付け法に従い、抗体の軽鎖及び重鎖領域のそれぞれに対応して決定されたものである；又は（ｂ）この第一可変領域に関する核酸を、43，44，45，46又は47位においてシステインをコードするように突然変異させ、そしてこの第二可変領域に関する核酸を、98，99，100又は101位においてシステインをコードするように突然変異させる、ここでかかる位置はKabat and Wuの「Sequences of Proteins of Immunol ogical Interest」、米国政府印刷局、NIH公開番号91-3242 (1991)により公開された番号付け法に従い、抗体の軽鎖又は重鎖のそれぞれに対応して決定されたものである；次いで（ｃ）発現系においてこの第一可変領域に関する核酸及びこの第二可変領域に関する核酸を発現させる；そして（ｄ）抗原に対する結合親和性を有する前記ポリペプチドを回収する；ことを含んで成る、方法。 12．前記方法が前記ポリペプチドを精製することを更に含んで成る、請求項11 記載の方法。 13．請求項１記載のポリペプチドをコードする核酸。 14．毒素又は薬剤をコードする核酸を更に含む、請求項13記載の核酸。 15．前記ポリペプチドに毒素もしくは薬剤又は毒性配列がペプチドリンカーによって連結されている、請求項14記載の核酸。 16．前記第一可変領域及び前記第二可変領域がそれぞれMAb B3のＶ_H及びＶ_Lに由来する、請求項１記載のポリペプチド。 17．前記Ｖ_H領域の44位のアルギニン及び前記Ｖ_L領域の 100位のセリンがシステインにより置き換えられており、ここでかかる位置はKabat and Wuの「Sequen ces of Proteins of Immunological Interest」、米国政府印刷局、NIH公開番号 91-3242 (1991)により公開された番号付け系に従って決定されたものである、請求項16記載のポリペプチド。 18．前記Ｖ_H領域の 105位のグルタミン及び前記Ｖ_L領域の43位のセリンがシステインに置き換えられており、ここでかかる位置はKabat and Wuの「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、米国政府印刷局、NIH公開番号91-3 242 (1991)により公開された番号付け系に従って決定されたものである、請求項 16記載のポリペプチド。 19．前記Ｖ_H領域の95位のセリンがチロシンに置き換えられている、請求項17 記載のポリペプチド。 20．前記Ｖ_H領域の95位のセリンがチロシンに置き換えられている、請求項16 記載のポリペプチド。 21．抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_L）をコードする核酸配列であって、ここでこのＶ_Lは 42，43，44，45，46，98，99，100又は 101位においてシステインを含んでおり、かかる位置はKabat and Wuの「Sequences of Proteins of Immunologic al Interest」、米国政府印刷局、NIH公開番号91-3242(1991)により公開された番号付け系に従って決定されたものである、前記核酸。 22．前記Ｖ_Lの 100位においてシステインをコードする、請求項21記載の核酸。 23．前記Ｖ_Lの43位においてシステインをコードする、請求項21記載の核酸。 24．抗体の重鎖可変領域（Ｖ_H）をコードする核酸配列であって、ここでこのＶ_Hは 43，44，45，46，47，103，104，105又は 106位においてシステインを含んでおり、かかる位置はKabat and Wuの「Sequences of Proteins of Immunolog ical Interest」、米国政府印刷局、NIH公開番号91-3242 (1991)により公開された番号付け系に従って決定されたものである、前記核酸。 25．前記Ｖ_Lの44位においてシステインをコードする、請求項24記載の核酸。 26．前記Ｖ_Lの 105位においてシステインをコードする、請求項22記載の核酸。 27．腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬理組成物であって、MAb B3に由来する 42，43，44，45，46，98，99又は 100位においてシステインを含む軽鎖可変領域（Ｖ_L）と、MAb B3に由来する 43，44，45，46，47，103，104，105又は 106位においてシステインを含む重鎖可変領域（Ｖ_H）とを有する、腫瘍細胞に特異的に結合するポリペプチドを含んで成り、ここでこのＶ_LとＶ_Hとはジスルフィド結合を介して連結されており、そして更にこのポリペプチドが毒素をも含んで成る、前記組成物。 28．前記Ｖ_LとＶ_Hとがペプチドリンカーにより更に連結されている、請求項９記載のポリペプチド。 29．前記第一可変領域及び前記第二可変領域が各々 MAb e23のＶ_L及びＶ_Hに由来する、請求項１記載のポリペプチド。 30．前記α可変領域が41，42，43，44，45，106，107，108又は 109位においてシステインを含み、そして前記β可変領域が108，109，110，111，41，42，43 ，44又は45位においてシステインを含み、かかる位置はKabat and Wuの「Sequen ces of Proteins of Immunological Interest」、米国政府印刷局、NIH公開番号 91-3242 (1991)により公開された番号付け系により決定されたものであり、そしてＴ細胞レセプターのα及びβ可変鎖領域に相当するものである、請求項10記載のポリペプチド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジュン，スン−ヒーアメリカ合衆国，メリーランド 20814, ベセスダ，プークスヒルロード３, アパートメント 812 (72)発明者ブリンクマン，ウルリッヒアメリカ合衆国，メリーランド 20895, ケンジントン，ブルックフィールドドライブ 4203

Claims

【特許請求の範囲】１．リガンドに特異的に結合するポリペプチドであって、リガンド結合成分の第一可変領域を含んで成り、この第一可変領域がこのリガンド結合成分の第二の別の可変領域にジスルフィド結合を介して結合しており、この結合がこの第一可変領域と第二可変領域のフレームワーク領域を連結している、前記ポリペプチド。２．前記ポリペプチドが抗体の定常領域を実質的に含まない、請求項１記載のポリペプチド。３．前記ポリペプチドがラジオアイソトープ、酵素、毒素、キレート化剤又は薬剤にコンジュゲートされている、請求項１記載のポリペプチド。４．前記ポリペプチドが毒素、酵素又はその他の薬剤に組換的に融合されている、請求項１記載のポリペプチド。５．前記第一可変領域が 98，99，100又は 101位においてシステインを含み、そして前記第二可変領域が43，44，45，46又は47位においてシステインを含み、かかる位置はKabat and Wuにより公開された番号付け系に従って決定されたものであり、抗体の軽鎖及び重鎖に各々が相当する、請求項１記載のポリペプチド。６．前記第一可変領域が100位においてシステインを含み、そして前記第二可変領域が44位においてシステインを含む、請求項５記載のポリペプチド。７．前記第一可変領域が42，43，44，45又は46位においてシステインを含み、そして前記第二可変領域が 103，104，105又は 106位においてシステインを含み、かかる位置はKabat and Wuにより公開された番号付け系に従って決定されたものであり、抗体の軽鎖及び重鎖に各々が相当する、請求項１記載のポリペプチド。８．前記第一可変領域が43位においてシステインを含み、そして前記第二可変領域が 105位においてシステインを含む、請求項７記載のポリペプチド。９．前記第一可変領域が抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_L）であり、そして前記第二可変領域が抗体の重鎖可変領域（Ｖ_H）である、請求項１記載のポリペプチド。 10．前記第一可変領域がＴ細胞レセプターのα可変鎖領域であり、そして前記第二可変領域がＴ細胞レセプターのβ可変鎖領域である、請求項１記載のポリペプチド。 11．リガンドに特異的に結合するポリペプチドを製造する方法であって、ここでこのポリペプチドはリガンド結合成分の第一可変領域を含んで成り、この第一可変領域はこのリガンド結合成分の第二可変領域に、これら２つの可変領域のフレームワーク領域におけるジスルフィド結合を介して連結されており、ここでこの方法は：（ａ）この第一可変領域に関する核酸を、42，43，44，45又は46位においてシステインをコードするように突然変異させ、そしてこの第二可変領域に関する核酸を、103，104，105又は 106位においてシステインをコードするように突然変異させる、ここでかかる位置はKabat and Wuにより公開された番号付け法に従い、抗体の軽鎖及び重鎖領域のそれぞれに対応して決定されたものである；又は（ｂ）この第一可変領域に関する核酸を、43，44，45，46又は47位においてシステインをコードするように突然変異させ、そしてこの第二可変領域に関する核酸を、98，99，100又は 101位においてシステインをコードするように突然変異させる、ここでかかる位置はKabat and Wuにより公開された番号付け法に従い、抗体の軽鎖又は重鎖のそれぞれに対応して決定されたものである；次いで（ｃ）発現系においてこの第一可変領域に関する核酸及びこの第二可変領域に関する核酸を発現させる；そして（ｄ）抗原に対する結合親和性を有する前記ポリペプチドを回収する；ことを含んで成る、方法。 12．前記方法が前記ポリペプチドを精製することを更に含んで成る、請求項11 記載の方法。 13．請求項１記載のポリペプチドをコードする核酸。 14．毒素又は薬剤をコードする核酸を更に含む、請求項13記載の核酸。 15．前記ポリペプチドに毒素もしくは薬剤又は毒性配列がペプチドリンカーによって連結されている、請求項14記載の核酸。 16．前記第一可変領域及び前記第二可変領域がそれぞれMAb B3のＶ_H及びＶ_Lに由来する、請求項１記載のポリペプチド。 17．前記Ｖ_H領域の44位のアルギニン及び前記Ｖ_L領域の 100位のセリンがシステインにより置き換えられており、ここでかかる位置はKabat and Wuにより公開された番号付け系に従って決定されたものである、請求項16記載のポリペプチド。 18．前記Ｖ_H領域の 105位のグルタミン及び前記Ｖ_L領域の43位のセリンがシステインに置き換えられており、ここでかかる位置はKabat and Wuにより公開された番号付け系に従って決定されたものである、請求項16記載のポリペプチド。 19．前記Ｖ_H領域の95位のセリンがチロシンに置き換えられている、請求項17 記載のポリペプチド。 20．前記Ｖ_H領域の95位のセリンがチロシンに置き換えられている、請求項16 記載のポリペプチド。 21．抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_L）をコードする核酸配列であって、ここでこのＶ_Lは 42，43，44，45，46，98，99，100又は 101位においてシステインを含んでおり、かかる位置はKabat and Wuにより公開された番号付け系に従って決定されたものである、前記核酸。 22．前記Ｖ_Lの 100位においてシステインをコードする、請求項21記載の核酸。 23．前記Ｖ_Lの43位においてシステインをコードする、請求項21記載の核酸。 24．抗体の重鎖可変領域（Ｖ_H）をコードする核酸配列であって、ここでこのＶ_Hは 43，44，45，46，47，103，104，105又は 106位においてシステインを含んでおり、かかる位置はKabat and Wuにより公開された番号付け系に従って決定されたものである、前記核酸。 25．前記Ｖ_Lの44位においてシステインをコードする、請求項24記載の核酸。 26．前記Ｖ_Lの 105位においてシステインをコードする、請求項22記載の核酸。 27．腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬理組成物であって、MAb B3に由来する 42，43，44，45，46，98，99又は 100位においてシステインを含む軽鎖可変領域（Ｖ_L）と、MAb B3に由来する 43，44，45，46，47，103，104，105又は 106位においてシステインを含む重鎖可変領域（Ｖ_H）とを有する、腫瘍細胞に特異的に結合するポリペプチドを含んで成り、ここでこのＶ_LとＶ_Hとはジスルフィド結合を介して連結されており、そして更にこのポリペプチドが毒素をも含んで成る、前記組成物。 28．前記Ｖ_LとＶ_Hとがペプチドリンカーにより更に連結されている、請求項９記載のポリペプチド。 29．前記第一可変領域及び前記第二可変領域が各々 MAb e23のＶ_L 及びＶ_Hに由来する、請求項１記載のポリペプチド。 30．前記α可変領域が41，42，43，44，45，106，107，108又は 109位においてシステインを含み、そして前記β可変領域が108，109，110，111，41，42，43 ，44又は45位においてシステインを含み、かかる位置はKabat and Wuにより公開された番号付け系により決定されたものであり、そしてＴ細胞レセプターのα及びβ可変鎖領域に相当するものである、請求項10記載のポリペプチド。