JP2021525786A - 抗ｃｄ９９ダイアボディ又はｉｇｇ抗体及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトタンパク質ＣＤ９９を認識及び結合することができる多価、好ましくは二価の抗体複合体、より好ましくはダイアボディ、すなわち二価のｓｃＦｖ、前記複合体を含む組成物、並びに白血病及び／又は骨髄異形成症候群の診断目的及び／又は治療及び／又はフォローアップのためのその使用に関する。さらに、本発明は、ヒトタンパク質ＣＤ９９を認識して結合することができる免疫グロブリンＧグループタイプの抗体、好ましくはモノクローナル抗体、特に癌、好ましくはＣＤ９９及び／又は白血病及び／又は骨髄異形成症候群を発現する固形腫瘍の治療及び／又はフォローアップのための、前記免疫グロブリンを含む組成物及びその医学的使用に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、ヒトタンパク質ＣＤ９９を認識及び結合することができる多価、好ましくは二価の抗体複合体、より好ましくはダイアボディ、すなわち二価のｓｃＦｖ、前記複合体を含む組成物、並びに白血病及び／又は骨髄異形成症候群の診断目的及び／又は治療及び／又はフォローアップのためのその使用に関する。

さらに、本発明は、ヒトタンパク質ＣＤ９９を認識して結合することができる免疫グロブリンＧグループタイプの抗体、好ましくはモノクローナル抗体、特に癌、好ましくはＣＤ９９及び／又は白血病及び／又は骨髄異形成症候群を発現する固形腫瘍の治療及び／又はフォローアップのための、前記免疫グロブリンを含む組成物及びその医学的使用に関する。

癌が世界中の主な死因の１つであることは周知である。さらに、癌は全ての国の社会生活及び健康コストに多大な影響を及ぼしている。癌を緩和又は治癒することが可能な治療法を見出すための努力は相当なものであり、あらゆる方向に由来する。

白血病は、最も一般的な癌の形態の１つである。

白血病は、造血幹細胞の腫瘍性増殖を特徴とする一連の悪性疾患、様々な種類の癌又は腫瘍を示す用語であり、異常な白血球の数が多くなる。これらの白血球は完全には発達しておらず、芽球又は白血病細胞と称される。

赤い骨髄に見られる造血幹細胞は、２つの細胞株を生成する：
−赤血球、数種類の白血球（顆粒球及び単球）、及び血小板が由来する骨髄系、並びに
−リンパ球（別の種類の白血球）が由来するリンパ系。

白血病クローンが進化する細胞株に応じて、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）について説明する。

病態の確かな原因は依然として不明である。喫煙、電離放射線又は一部の化学物質（ベンゼンなど）への曝露、以前の化学療法治療、及びダウン症など、遺伝的及び環境的両方の様々な要因が危険因子である可能性があると考えられている。

骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、骨髄の欠陥を特徴とする血液疾患のグループであり、赤血球、白血球、及び血小板などのいくつかの血液細胞株を充分な数で産生することができなくなる。ＭＤＳは、時間経過と共に急性型の白血病に発展する可能性があるため、前白血病状態とも称される。

診断は通常、血液検査又は骨髄生検により明確に説明される。

白血病の治療には、化学療法、放射線療法、標的療法、及び骨髄移植の組み合わせに加えて、支持療法並びに場合によっては緩和治療を伴う。高用量の化学療法又は放射線療法で破壊された病変細胞を、適合するドナー、多くの場合同胞又は家族、時には他人からの健康な細胞に置き換えるための造血幹細胞の移植は、一部の症例、特に若い患者において永久的疾患を治癒することができ、化学療法に反応しなくなった病態に用いられる。

免疫系を刺激して白血病細胞を認識して破壊する治療法もある。いくつかの種類の白血病では、例えば、腫瘍細胞の増殖を遅らせるためにインターフェロンが使用される。

白血病の標的療法の先駆者は、ＣＭＬ及びＡＬＬの治療に使用され、いわゆるフィラデルフィア（Ｐｈ＋）染色体に起因する染色体転座の結果として生成される異常なＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質の存在を特徴とするチロシンキナーゼ阻害剤であるイマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）である。治療は非常に効果的であるが、何年にもわたってある種の耐性が生じる場合がある。

白血病の新しい治療法の開発における最近の進歩にもかかわらず、米国の平均５年生存率は５７％である。１５歳未満の子供では、５年生存率は種類に応じて６０％及び８５％より高くなる。

したがって、一般的な腫瘍及び特に白血病の治療のために、個別に、又は現在利用可能な治療法と組み合わせて使用される改良された又は代替の治療法／分子を特定する必要性が強く感じられる。

最近の研究では、膜タンパク質が白血病造血細胞で発現が変化する可能性があることが示されている。

特に、Ｐａｓｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｊ． Ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ （２０１８） １２：５５−６８では、膜糖タンパク質ＣＤ９９が白血病を含む様々な種類の腫瘍で過剰発現していることを説明している。

国際公開第２０１６１４９６８２号パンフレットは、抗ＣＤ９９抗体について説明し、細胞死の誘導が必ずしも抗原−抗体結合に続くとは限らないことを示している。

国際公開第２０１１０５８５１７号パンフレットは、抗ＣＤ９９ｓｃＦＶについて記載している。同じｓｃＦｖの単量体ユニットは、ユーイング肉腫の治療に効果的であることが示されている。ただし、ＪＵＲＫＡＴ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＬ−６０、及びＭＯＬＴ−４などの白血病細胞を認識して結合することはできない。

本発明者らは、上記の必要性に対する解決策として、ヒトタンパク質ＣＤ９９を認識して結合することができる多価抗体複合体の使用を見出した。特に、本発明者らは、ＣＤ９９指向性のダイアボディ、すなわち一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の２つのユニットが、白血病及び／又は骨髄異形成症候群の治療及び／又はフォローアップに特に効果的であることを見出した。

さらに、本発明者らは、驚くべきことに、ヒトタンパク質ＣＤ９９を認識して結合することができる免疫グロブリンＧグループタイプの抗体、好ましくはモノクローナル抗体は、様々な種類の癌、特にＣＤ９９を発現する固形腫瘍、白血病及び／又は骨髄異形成症候群の治療法に有効であることも見出した。クラスＩｇＧ４及びＩｇＧ１モノクローナル抗体は特に効果的であることが示されている。

実際、本発明者らは、白血病細胞が、本明細書に記載の抗体複合体のダイアボディ及び／又はＩｇＧ形態との結合後に死滅することを見出した。特に、共焦点顕微鏡法によって、本発明者らは、白血病細胞が本明細書に記載の抗体複合体を内部移行可能であることを見出した。この後者のデータは、抗体−薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）の場合のように、抗体の内部移行を必要とする適用で複合体を使用できるため、特に興味深く有利である。

本発明のさらなる利点は、以下の詳細な説明及び添付の図（特に下記）から明らかになるであろう。
図１は、本発明の抗体複合体（ダイアボディ）の例示的な実施形態での処理後の白血病細胞株の細胞蛍光分析の結果を示す図である。 図２は、本発明の抗体複合体（ダイアボディ）の例示的な実施形態で処理された白血病細胞の蛍光顕微鏡分析を示す図である。 図３は、急性骨髄性白血病の細胞株を用いた本発明の抗体複合体（ダイアボディ）のいくつかの例示的な実施形態の反応性分析の結果を示す図である。濃い線で描かれたピークは、二次抗体のみでマークされた細胞のピークを表し、薄い灰色の線で描かれたピークは、前記複合体のダイアボディ型でマークされた細胞を表す。 図４は、急性骨髄性白血病及びリンパ性白血病の細胞株に対する単量体ｓｃＦｖＣ７の反応性の分析結果を示す図である。濃い線で描かれたピークは、二次抗体のみでマークされた細胞のピークを表し、薄い灰色の線で描かれたピークは、単量体ｓｃＦｖＣ７でマークされた細胞を表す。 図５は、細胞蛍光測定によって測定された、本発明の抗体複合体（ダイアボディ）のいくつかの例示的な実施形態によって誘発された白血病細胞死の分析の結果を示す図である。 図６は、細胞蛍光測定によって測定された、本発明の抗体複合体（ダイアボディ）のいくつかの例示的な実施形態によって誘発された白血病細胞死の分析の結果を示す図である。 図７は、以下の細胞株で得られた本発明の抗体複合体（ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の形態の抗体、すなわちＣ７ＩｇＧ１及びＣ７ＩｇＧ４）のいくつかの例示的な実施形態の反応性の細胞蛍光分析の結果を示す図である：Ｔ−ＡＬＬ：ＡＬＬ−ＳＩＬ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、並びにＡＭＬ：ＭＶ４−１１、ＴＨＰ−１、及びＭＯＮＯ−ＭＡＣ−６。 図８は、以下の細胞株で得られた本発明の抗体複合体（ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の形態の抗体、すなわちＣ７ＩｇＧ１及びＣ７ＩｇＧ４）のいくつかの例示的な実施形態の反応性の細胞蛍光分析の結果を示す図である：Ｔ−ＡＬＬ：ＡＬＬ−ＳＩＬ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、並びにＡＭＬ：ＭＶ４−１１、ＴＨＰ−１、及びＭＯＮＯ−ＭＡＣ−６。 図９は、白血病細胞において本発明の抗体複合体（ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の形態の抗体、すなわち、Ｃ７ＩｇＧ１及びＣ７ＩｇＧ４）のいくつかの例示的な実施形態によって誘導される白血病細胞死の分析の結果を示す図である。 図１０は、白血病細胞において本発明の抗体複合体（ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の形態の抗体、すなわち、Ｃ７ＩｇＧ１及びＣ７ＩｇＧ４）のいくつかの例示的な実施形態によって誘導される白血病細胞死の分析の結果を示す図である。 図１１は、ＣＤ９９との結合後に本発明の抗体複合体をダイアボディ形態で内部移行する白血病細胞の能力に関する共焦点顕微鏡法の結果を示す図である。 図１２は、（Ａ）ヒト、カニクイザル、ミドリザル、及びマウスＣＤ９９の細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメント（同一の残基はアスタリスク（＊）でマークされているが、２つの点（：）は保存的置換を示し、１つの点（．）は半保存的置換を示す）、並びに（Ｂ）ｓｃＦｖＣ７のエピトープのアミノ酸配列のアラインメント、を示す図である。 図１３は、ＥＬＩＳＡアッセイによって得られた、異なる種のＣＤ９９に対するダイアボディ形態の本発明の抗体複合体の反応性に関する結果を示す図である。 図１４は、本発明の抗体複合体の様々な形態、特にＩｇＧ形態並びにダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ形態の図表を示す図である。 図１５は、精製Ｃ７ＩｇＧ４、Ｃ７ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ、及びＣ７ＩｇＧ１に対して非還元条件下で実施したウエスタンブロット分析を示す図である。シグナルは、抗ウサギＨＲＰによって明らかにされた抗Ｃ７Ａｂによって与えられる。パネルＡ、Ｂ、及びＣは、抗体Ｃ７ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐの３つの異なる産生を示している。 図１６は、共焦点顕微鏡で分析したダイアボディを内部移行する白血病細胞株ＭＯＬＭ１３の能力を示す図である。 図１７は、共焦点顕微鏡で分析したＩｇＧ４を内部移行する白血病細胞株ＭＯＬＭ１３の能力を示す図である。 図１８は、ＡＬＬ白血病患者の脊髄細胞でのアポトーシスの誘導における本発明によるダイアボディ及びＩｇＧ４の有効性を示す図である。（Ａ）ＦＩＴＣでマークされた抗体と結合後の細胞の蛍光強度、（Ｂ）抗体の結合に陽性の細胞の割合（％）、（Ｃ）生細胞（黒）、アポトーシス細胞（灰色）、壊死細胞（白）の割合（％）。 図１９は、共焦点顕微鏡で分析したＡＬＬ患者の細胞におけるダイアボディ及びＩｇＧ４の内部移行を示す図である。（Ａ）１時間のインキュベーション後のダイアボディ、（Ｂ）２時間のインキュベーション後のダイアボディ、（Ｃ）１時間のインキュベーション後のＩｇＧ４、（Ｄ）２時間のインキュベーション後のＩｇＧ４。 図２０は、ＡＭＬ白血病患者の末梢血細胞でのアポトーシスの誘導における本発明によるダイアボディ及びＩｇＧ４の有効性を示す図である。（Ａ）ＦＩＴＣでマークされた抗体と結合後の細胞の蛍光強度、（Ｂ）抗体の結合に陽性の細胞の割合（％）、（Ｃ）アネキシンＶ＋ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でマーキングすることによるアポトーシスの細胞蛍光測定：生細胞（黒）、アポトーシス細胞（灰色）、壊死細胞（白）の割合（％）。 図２１は、ＡＭＬ患者のＣＤ３４＋細胞でダイアボディを使用して得られた結果を示す図である。（Ａ）共焦点顕微鏡、（Ｂ）抗体の結合に陽性の細胞の割合（％）、（Ｃ）アネキシンＶ＋ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でのマーキングによるアポトーシスの細胞蛍光測定による量子化。 図２２は、ＡＭＬ患者のＣＤ３４＋細胞でＩｇＧ４を使用して得られた結果を示す図である。（Ａ）共焦点顕微鏡、（Ｂ）抗体の結合に陽性の細胞の割合（％）、（Ｃ）アネキシンＶ＋ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でのマーキングによるアポトーシスの細胞蛍光測定による量子化。 図２３は、健康なドナーのＣＤ３４＋細胞でＩｇＧ４を使用して得られた結果を示す図である。（Ａ）抗体の結合に陽性の細胞の蛍光強度及び割合（％）（抗ＣＤ９９モノクローナル抗体クローン０６６２を陽性対照として使用した）、（Ｂ）アポトーシスの量子化、（Ｃ）共焦点顕微鏡。 図２４は、ダイアボディ又はＩｇＧ４とインキュベートした末梢血細胞の集団の細胞蛍光分析を示す図である。抗ＣＤ９９モノクローナル抗体クローン０６６２を陽性対照として使用した。 図２５は、図２４の実験に従って処理した末梢血細胞におけるアネキシンＶ／ＰＩアッセイで測定されたアポトーシスの割合（％）を示す図である 図２６は、ＩｇＧ４ｗｔ及び変異型ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐで得られた結果の比較を示す図である。（Ａ）ＥＬＩＳＡアッセイによって評価された組換えＣＤ９９に対する反応性（Ｂ）ＡＭＬ細胞株ＭＯＬＭ１３の共焦点顕微鏡。（Ｃ）アポトーシスの量子化。

これに関連して、「一本鎖可変断片」（ｓｃＦｖ）は、例えば、ファージディスプレイ技術によって得られる特定のタイプの抗体断片を意味する。

この分子は、免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の可変領域の融合体であり、リンカーによって互いに結合されている。すなわち、ｓｃＦｖは、リンカー、すなわち、ＶＨ−ＶＬ鎖が機能的な単量体ユニットとして正しい構造をとることを可能にする様々な長さの柔軟なペプチド、によって互いに結合された免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬからなるＦｖタイプの抗体断片である。

ｓｃＦｖは、ダイアボディ（ｄＡｂｄ）すなわち二価ｓｃＦｖなどの抗体複合体を形成するように操作可能であり、あるいは、それぞれ２、３、又は４つのｓｃＦｖを結合するトリアボディ又はテトラボディ、換言すると、ｓｃＦｖを操作して多価複合体、すなわち多価ｓｃＦｖを形成することも可能である。培養哺乳類細胞で産生されることが多いモノクローナル抗体とは異なり、一価及び多価ｓｃＦｖは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌の細胞でしばしば産生される。

これに関連して、抗体又はより正確には免疫グロブリンは、抗原と呼ばれる相補的構造に非常に特異的な方法で結合することができる特定の「Ｙ」字型のモジュール式四次構造を有するタンパク質を意味する。

抗体では２つの基本的な成分を区別できる。
・抗体と補体又は自然免疫細胞との相互作用を媒介する定常領域（Ｃ）（「Ｆｃ」部分）。
・抗原との結合部位を含み、したがって、所与の抗原に対する抗体の特異性に従って変化する可変領域（Ｖ）（「Ｆａｂ」部分）。

これらの成分は、互いに同一の２つの重鎖（Ｈ）及び同様に互いに同一の２つの軽鎖（Ｌ）である４つの糖タンパク質鎖から構成される四量体タイプのタンパク質複合体を形成するように構造化されている。

さらに、各鎖は、アミノ末端に位置する可変ドメイン（重鎖の場合はＶＨ、軽鎖の場合はＶＬ）及びカルボキシ末端にある１又は複数の定常ドメインからなる。最後に、各可変ドメインの抗原結合部位には、いわゆるフレームワーク領域が点在する３つの超可変領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、そして最後に、ＣＤＲ３からなる最も可変な部分）がある。構造レベルでは、超可変領域は、フレームワーク領域から派生したベータシートの複雑な構造内に３つの近接したループを形成するように編成されている。

ヒト免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの５つの主要なクラスに分類される。

重鎖はγ型であり、免疫グロブリンの各クラスに特異的であり、それぞれが可変Ｉｇドメイン（ＶＨ又はＶγ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１／２／３又はＣγ１／２／３）を含む。ＩｇＧの場合、γ鎖は４つの異なるサブタイプ（γ１、γ２、γ３、及びγ４）で生成され得る。したがって、免疫グロブリンＧは、対応する数のサブファミリー（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に区別され、すべて同様の構造と機能を備えている。

モノクローナル抗体は、以下を含むさまざまな手順に従って取得できる：
―所与の抗原によるマウスの免疫化及びマウス抗体を分泌するハイブリドーマの産生を提供する従来のシステム。マウス抗体の臨床使用は、その固有の免疫原性によって最初から条件付けられていた。しかしながら、分子技術の利用可能性のおかげで、可変領域又はマウスＣＤＲの特異性を保持するが、定常部分及びフレームワーク領域にヒト配列を用いるキメラ又はヒト化抗体を構築することによって免疫原性を低下させることが可能となった。
―ヒト抗体を産生可能なトランスジェニックマウスの使用。
―完全にヒトの組換え抗体断片及び抗原に対して高い親和性を有する抗体を選択するために現在最も広く使用されている方法である、ファージディスプレイ技術。

これに関連して、ＣＤ９９は膜貫通型糖タンパク質であり、ヒトでは他の公知のタンパク質（Ｘｇａを除く）との相同性を示さない。ＣＤ９９の分子量は３２ｋＤａで、細胞接着、アポトーシス、Ｔ細胞及び胸腺細胞の分化、単球の遊走、並びにリンパ球と内皮細胞と間の細胞内接着などの重要な生理学的機能に関与している。ヒトでは、ＭＩＣ２遺伝子は選択的スプライシングのプロセスに従って２つの異なるタンパク質をコードする：完全長ＣＤ９９又はタイプ１（ＣＤ９９ｗｔ）及びＣＤ９９タイプＩＩ（ＣＤ９９ｓｈ）と呼ばれる細胞質ドメインが短い短縮型。２つのＣＤ９９アイソフォームは細胞特異的に発現し、異なる機能的役割を果たす。ＣＤ９９は、単量体及びホモ二量体の両方として細胞表面に見られ、ＣＤ９９の２つの分子が細胞外ドメインを介して相互作用する。これらの二量体は、全長アイソフォームと短縮型アイソフォームとの間でも形成され得る。さらに、相互作用は、異なる細胞の表面に発現するＣＤ９９の２つの分子間でも生じる場合がある。

特に関連するのは、本明細書に記載の分子によって認識及び結合されるＣＤ９９タンパク質の細胞外ドメインである。ＣＤ９９の細胞外ドメインのアミノ酸配列及びコード化ヌクレオチド配列（ＣＤＳ）は、それぞれ配列番号２１及び２２である。特に、本明細書に記載の分子が向けられているＣＤ９９の特定のエピトープの配列は、ＣＤ９９の細胞外ドメインの５０番目〜７４番目のアミノ酸、すなわち配列番号２３を含む。

本発明の第１の態様は、白血病及び骨髄異形成症候群の診断及び／又は治療及び／又はフォローアップに使用するための、ＣＤ９９ヒトタンパク質ＣＤ９９を認識して結合することができる少なくとも２つの可変領域を含む抗体複合体であって、前記少なくとも２つの可変領域のそれぞれは、免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン／部分（ＶＬ）及び重鎖の可変ドメイン／部分（ＶＨ）を含む、前記抗体複合体に関する。換言すると、本発明が参照する抗体複合体は、免疫グロブリンの軽鎖の少なくとも２つの可変領域（ＶＬ）及び重鎖の少なくとも２つの可変領域（ＶＨ）を含む。

好ましい実施形態によれば、前記抗体複合体は、図１４に示すように、前述のように定義され、軽鎖の可変ドメイン／部分（ＶＬ）と重鎖の可変ドメイン／部分（ＶＨ）を有する２、３、及び４つの可変領域をそれぞれ特徴とする、ダイアボディ（ｄＡｂｄ）すなわち二価ｓｃＦｖ、あるいはトリアボディ又はテトラボディである。

好ましい実施形態によれば、前記抗体複合体は、ＩｇＧフォーマットの抗体、好ましくはクラス１及び／又は４のＩｇＧである。この場合も、ダイアボディの場合と同様に、ＩｇＧは、ヒトタンパク質ＣＤ９９を認識して結合できる少なくとも２つの可変領域を有し、前記少なくとも２つの可変領域のそれぞれは、軽鎖の可変ドメイン／部分（ＶＬ）及び重鎖の可変ドメイン／部分（ＶＨ）を含む。

ＩｇＧ型の場合、明らかにリンカーは存在せず、リンカーは、対照的に、多価ｓｃＦｖに存在し、個々の単量体単位をまとめるように働く。

抗原結合部位では、各ＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、周知の通り、いわゆるフレームワーク領域が点在するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として定義される３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは「Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ」の略で、ＣＤＲ３は最も変化しやすい領域である。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記抗体複合体のＶＨ鎖の少なくとも１つは、配列番号１を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。前記抗体複合体の前記少なくとも２つのＶＨ鎖は、好ましくは、それぞれが、配列番号１を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。すなわち、両方のＶＨ鎖は、配列番号１を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。

これに関連して、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、問題のアミノ酸又はヌクレオチド配列が、同定された配列であるか、又は同定された配列に本質的に対応することも意味する。

前記多価、好ましくは二価（ダイアボディ）、三価（トリアボディ）、又は四価（テトラボディ）のｓｃＦｖは、好ましくは、配列番号１を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む少なくとも１つのＶＨ鎖を有する。好ましくは、ダイアボディは少なくとも２つのＶＨ鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号１を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。トリアボディは３つのＶＨ鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号１を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。テトラボディは４つのＶＨ鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号１を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。

前記ＩｇＧ、より好ましくは前記ＩｇＧ１及び／又は前記ＩｇＧ４は、好ましくは、配列番号１を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む少なくとも１つのＶＨ鎖を含む。前記ＩｇＧ、より好ましくは前記ＩｇＧ１及び／又は前記ＩｇＧ４は、好ましくは少なくとも２つのＶＨ鎖を含み、各鎖は、それぞれ、配列番号１を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記抗体複合体のＶＬ鎖の少なくとも２つは、配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。前記抗体複合体の前記少なくとも２つのＶＬ鎖は、好ましくは、それぞれが、配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。すなわち、両方のＶＬ鎖は、配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。

前記多価、好ましくは二価（ダイアボディ）、三価（トリアボディ）、又は四価（テトラボディ）のｓｃＦｖは、好ましくは、配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む少なくとも２つのＶＬ鎖を有する。好ましくは、ダイアボディは少なくとも２つのＶＬ鎖を有し、それぞれが配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。トリアボディは３つのＶＬ鎖を有し、それぞれが配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。テトラボディは４つのＶＬ鎖を有し、それぞれが配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。

前記ＩｇＧ、より好ましくは前記ＩｇＧ１及び／又は前記ＩｇＧ４は、好ましくは、配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む少なくとも１つのＶＬ鎖を含む。前記ＩｇＧ、より好ましくは前記ＩｇＧ１及び／又は前記ＩｇＧ４は、好ましくは少なくとも２つのＶＬ鎖を含み、各鎖は、それぞれ、配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。

前記多価、好ましくは二価（ダイアボディ）、三価（トリアボディ）、又は四価（テトラボディ）のｓｃＦｖは、好ましくは少なくとも１つのＶＨ鎖及び１つのＶＬ鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号１及び配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。ダイアボディは、好ましくは、少なくとも２つのＶＨ鎖及び２つのＶＬ鎖を有し、各ＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、それぞれ、配列番号１及び配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。トリアボディは、好ましくは、３つのＶＨ鎖及び３つのＶＬ鎖を有し、各ＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、それぞれ、配列番号１及び配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。テトラボディは、好ましくは、４つのＶＨ鎖及び４つのＶＬ鎖を有し、各ＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、それぞれ、配列番号１及び配列番号２を含むアミノ酸配列によって特徴付けられるＣＤＲ３を含む。

前記ＩｇＧ、より好ましくは前記ＩｇＧ１及び／又は前記ＩｇＧ４は、好ましくは少なくとも１つのＶＨ鎖及び１つのＶＬ鎖を含み、各ＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、それぞれ、配列番号１及び配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。前記ＩｇＧ、より好ましくは前記ＩｇＧ１及び／又は前記ＩｇＧ４は、好ましくは少なくとも２つのＶＨ鎖及び少なくとも２つのＶＬ鎖を含み、各ＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、それぞれ、配列番号１及び配列番号２を含むアミノ酸配列を特徴とするＣＤＲ３を含む。

好ましい実施形態では、上記の抗体変異体、好ましくは前記多価ｓｃＦｖ、より好ましくは前記二価（ダイアボディ）及び／又は三価（トリアボディ）及び／又は四価（テトラボディ）のｓｃＦｖ、又は前記ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ４は、配列番号３（ＣＤＲ１）及び配列番号４（ＣＤＲ２）を含むアミノ酸配列を特徴とするＶＨ鎖の少なくとも１つのＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２を含む。前記バリアントのＶＨ鎖の全てのＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２は、好ましくは、配列番号３（ＣＤＲ１）及び配列番号４（ＣＤＲ２）を含むアミノ酸配列を特徴とする。

さらに好ましい実施形態において、上記の抗体バリアント、好ましくは前記多価ｓｃＦｖ、より好ましくは前記二価（ダイアボディ）及び／又は三価（トリアボディ）及び／又は四価（テトラボディ）のｓｃＦｖ、又は前記ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ４は、配列番号５（ＣＤＲ１）及び配列番号６（ＣＤＲ２）を含むアミノ酸配列を特徴とするＶＬ鎖の少なくとも１つのＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２を含む。前記バリアントのＶＬ鎖の全てのＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２は、好ましくは、配列番号５（ＣＤＲ１）及び配列番号６（ＣＤＲ２）を含むアミノ酸配列を特徴とする。

本発明の一実施形態によれば、前記抗体複合体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、それぞれ、配列番号７及び配列番号８を含むアミノ酸配列を有する。前記多価、好ましくは二価（ダイアボディ）、三価（トリアボディ）、又は四価（テトラボディ）のｓｃＦｖは、好ましくは、配列番号７及び配列番号８を含むアミノ酸配列をそれぞれ特徴とする少なくとも１つのＶＨ鎖及び１つのＶＬ鎖を有する。ダイアボディは、好ましくは、少なくとも２つのＶＨ鎖及び２つのＶＬ鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号７及び配列番号８を含むアミノ酸配列を特徴とする。トリアボディは、好ましくは、３つのＶＨ鎖及び３つのＶＬ鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号７及び配列番号８を含むアミノ酸配列を特徴とする。テトラボディは、好ましくは、４つのＶＨ鎖及び４つのＶＬ鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号７及び配列番号８を含むアミノ酸配列を特徴とする。

前記ＩｇＧ、より好ましくは前記ＩｇＧ１及び／又は前記ＩｇＧ４は、好ましくは少なくとも１つのＶＨ鎖及び１つのＶＬ鎖を含み、各ＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、それぞれ、配列番号７及び配列番号８を含むアミノ酸配列を特徴とする。前記ＩｇＧ、より好ましくは前記ＩｇＧ１及び／又は前記ＩｇＧ４は、好ましくは少なくとも２つのＶＨ鎖及び少なくとも２つのＶＬ鎖を含み、各ＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、それぞれ、配列番号７及び配列番号８を含むアミノ酸配列を特徴とする。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記ＩｇＧ４の各重鎖のアミノ酸配列は、配列番号３４を含み、及び／又は前記ＩｇＧ４の各軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３５を含む。前記ＩｇＧ４は、好ましくは、配列番号３４を含むアミノ酸配列を特徴とする２つの重鎖及び／又は配列番号３５を含むアミノ酸配列を特徴とする２つの軽鎖を含む。

配列番号３４は、配列番号７（すなわち、重鎖の可変部分（ＶＨ））及びＩｇＧ４の重鎖の定常部分（ＣＨ１／ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３）を含む。

配列番号３５は、配列番号８（すなわち、軽鎖の可変部分（ＶＬ））及び軽鎖の定常部分（ＣＬ）を含む。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記ＩｇＧ１の各重鎖のアミノ酸配列は、配列番号３８を含み、及び／又は前記ＩｇＧ１の各軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３９を含む。前記ＩｇＧ１は、好ましくは、配列番号３８を含むアミノ酸配列を特徴とする２つの重鎖及び／又は配列番号３９を含むアミノ酸配列を特徴とする２つの軽鎖を含む。

配列番号３８は、配列番号７（すなわち、重鎖の可変部分（ＶＨ））及びＩｇＧ１の重鎖の定常部分（ＣＨ１／ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３）を含む。

配列番号３９は、配列番号８（すなわち、軽鎖の可変部分（ＶＬ））及び軽鎖の定常部分（ＣＬ）を含む。

本発明の一実施形態によれば、
―ＶＨ鎖のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列番号１１を含む、
―ＶＬ鎖のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は、配列番号１２を含む、
―ＶＨ鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１３及び配列番号１４を含む、
―ＶＬ鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１５及び配列番号１６を含む、
―ＶＨ鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１７を含む、
―ＶＬ鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１８を含む、
―前記ＩｇＧ４の重鎖のヌクレオチド配列は、配列番号３６を含む、
―前記ＩｇＧ４の軽鎖のヌクレオチド配列は、配列番号３７を含む、
―前記ＩｇＧ１の重鎖のヌクレオチド配列は、配列番号４０を含む、
―前記ＩｇＧ１の軽鎖のヌクレオチド配列は、配列番号４１を含む。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記複合体は、ＣＤ９９の細胞外ドメインに対して向けられた少なくとも２つの可変領域を含み、それらは、好ましくは、配列番号２１のアミノ酸配列に対して向けられている。これに関連して、「対して向けられた」とは、言及される抗体複合体が、好ましくは上記のように、ＣＤ９９の細胞外ドメイン、すなわち配列番号２１を認識及び結合することができることを意味する。これはいわゆるエピトープであり、好ましくはＣＤ９９の細胞外画分の５０番目〜７４番目のアミノ酸の配列、すなわち配列番号２３を含む。

好ましい実施形態によれば、多価ｓｃＦｖ分子の全てのｓｃＦｖユニット、より好ましくは二価（ダイアボディ）及び／又は三価（トリアボディ）及び／又は四価（テトラボディ）のｓｃＦｖは、配列番号１０を含むアミノ酸配列を有する。灰色でマークされた配列はリンカーであり、いくつかの実施形態では、２回以上繰り返されてもよい。多価ｓｃＦｖ分子の全てのｓｃＦｖユニットのヌクレオチド配列は、配列番号２０を含む。

多価ｓｃＦｖ分子の各断片ｓｃＦｖは、上記のように、軽鎖の可変部分（ＶＬ）及び重鎖の可変部分（ＶＨ）を含む。各ｓｃＦｖのＶＨ鎖及びＶＬ鎖は、そのアミノ酸配列が配列番号９の少なくとも１つのコピー（配列番号１０の灰色の部分）、好ましくは１つのコピーを含むリンカーによって互いに結合される。

前記リンカーのヌクレオチド配列は、遺伝子コードの変性の結果として、配列番号１９の少なくとも１つのコピー又はそれに由来するヌクレオチド配列、好ましくは１つ、２つ、又は３つのユニットを含む。

本発明の第２の態様は、上記で詳述した抗体複合体を含む組成物、好ましくは前記多価、より好ましくは二価（ダイアボディ）、三価（トリアボディ）、若しくは四価（テトラボディ）のｓｃＦｖ、又はＩｇＧ抗体形態、好ましくはクラスＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ４を含む組成物に関する。

前記組成物は、好ましくは、アジュバント、送達剤、緩衝剤、塩、抗酸化剤、保存剤、界面活性剤、ポリオール、二糖、多糖、アミノ酸、及びそれらの組み合わせから選択される、薬理学的に許容される担体をさらに含み得る。

薬理学的に許容される担体は、通常使用される投与量及び濃度でそれらを投与される人にとって無毒である。緩衝剤は、好ましくは、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、他の有機酸、及びそれらの組み合わせの中から選択される。抗酸化剤は、好ましくは、アスコルビン酸及びメチオニンから選択される。塩は、好ましくは、塩化ナトリウムから選択される。保存剤は、好ましくは、以下から選択される：オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール。界面活性剤は、好ましくは、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、ポロキサマー１８８、及びそれらの組み合わせから選択される。ポリオールは、好ましくは、マンニトール及びソルビトールから選択され、二糖及び多糖は、好ましくは、スクロース、トレハロース、デキストラン、デキストラン４０、及びそれらの組み合わせから選択される。アミノ酸は、好ましくは、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、グルタミン、アスパラギン、及びそれらの組み合わせから選択される。タンパク質は、好ましくは、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン、及びそれらの組み合わせから選択される。親水性ポリマーは、好ましくは、ポリビニルピロリドン及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される。キレート剤は好ましくはＥＤＴＡである。金属錯体は、好ましくは、亜鉛タンパク質複合体である。

本明細書によれば、上記の抗体バリアント及び上記の組成物は、白血病および骨髄異形成症候群の診断の目的で、及び／又は治療及び／又はフォローアップにおいて効果的に使用することができる。

実際、上記の抗体形態は、白血病及び骨髄異形成症候群に対する治療可能性を示している。上記で一部検討したように、ＣＤ９９の同じエピトープに対して向けられた一価のｓｃＦｖ分子はそのような可能性を示さなかったので、これは驚くべきことであった。このエピトープの認識の少なくとも２つの部位が抗体複合体上に存在する場合にのみ、本明細書に記載及び特許請求される治療上の利点が観察され得る。前記多価、より好ましくは二価（ダイアボディ）、三価（トリアボディ）、若しくは四価（テトラボディ）のｓｃＦｖ、又はＩｇＧ抗体形態、好ましくはクラスＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ４が、特に効果的である。本明細書に記載の目的のために最もよく機能する分子は、ダイアボディ及び／又はＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ４、好ましくは、エピトープを認識して結合するより大きな能力、並びに改善された生物学的／治療作用（とりわけ、ＣＤ９９を発現する白血病細胞、すなわちＣＤ９９陽性（＋）細胞の死を特異的に誘導する能力による）を示すＩｇＧ４である。

実際、実験の部分で詳細に示されているように、ＩｇＧ抗体は、いくつかの治療用途でかなりの利点を示す。すなわち、（ｉ）前記抗体は、単量体及びダイアボディｓｃＦｖよりもＣＤ９９に対して高い親和性を示す、（ｉｉ）特に、クラスＩｇＧ４は、ｓｃＦｖよりもゆうに２桁低い解離定数（Ｋｄ）を示す、（ｉｉｉ）前記抗体はｓｃＦｖ断片よりも優れた薬物動態を有する、（ｉｖ）前記抗体はｓｃＦｖよりも長い半減期を有し、７日〜２１日の範囲内である、（ｖ）前記抗体は、抗体依存性細胞傷害、抗体依存性細胞食作用、補体依存性細胞傷害などのエフェクター機能を有し、特定の治療用途に有用である。

本発明が参照する白血病は、好ましくは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）から選択される。急性白血病が特に好ましく、より好ましくはＡＬＬ、又はＡＭＬである。

さらに、ＩｇＧ抗体形態、好ましくはクラスＩｇＧ１及びＩｇＧ４は、白血病以外のタイプの腫瘍に対して、すなわち、ＣＤ９９を発現する固形腫瘍に対しても治療効果を示した。

したがって、本発明のさらなる態様は、ＣＤ９９に関連する病状の治療法及び／又はフォローアップのための、好ましくは発現の変化、好ましくはＣＤ９９の過剰発現によって引き起こされるか又は関連する病状における、ＩｇＧ抗体形態及びその誘導体、好ましくは上記で詳述されるクラスＩｇＧ１及びＩｇＧ４に関する。前記病状は、好ましくは、ユーイング肉腫及び軟部組織肉腫（滑膜肉腫、間葉性軟骨肉腫、及び横紋筋肉腫）、消化器癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、精巣癌、卵巣癌、神経内分泌腫瘍、黒色腫、悪性神経膠腫及び星状細胞腫、リンパ腫、白血病、及び骨髄異形成症候群を含む、固形腫瘍及び血液癌並びに肉腫である。

本明細書に記載のＩｇＧ抗体形態の誘導体は、そのＩｇＧ抗体形態に由来する断片であり、前記断片は、好ましくは、Ｆ（ａｂ’）２、断片Ｆ（ａｂ）、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、ＶＬＬ、及びそれらの組み合わせから選択される。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記ＩｇＧ４の各重鎖のアミノ酸配列は、配列番号３４を含み、及び／又は前記ＩｇＧ４の各軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３５を含む。前記ＩｇＧ４は、好ましくは、配列番号３４を含むアミノ酸配列を特徴とする２つの重鎖及び／又は配列番号３５を含むアミノ酸配列を特徴とする２つの軽鎖を含む。

配列番号３４は、配列番号７（すなわち、重鎖の可変部分（ＶＨ））及びＩｇＧ４の重鎖の定常部分（ＣＨ１／ヒンジ／ＣＨ３）を含む。

配列番号３５は、配列番号８（すなわち、軽鎖の可変部分（ＶＬ））及び軽鎖の定常部分（ＣＬ）を含む。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記ＩｇＧ１の各重鎖のアミノ酸配列は、配列番号３８を含み、及び／又は前記ＩｇＧ１の各軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３９を含む。前記ＩｇＧ１は、好ましくは、配列番号３８を含むアミノ酸配列を特徴とする２つの重鎖及び／又は配列番号３９を含むアミノ酸配列を特徴とする２つの軽鎖を含む。

配列番号３８は、配列番号７（すなわち、重鎖の可変部分（ＶＨ））及びＩｇＧ１の重鎖の定常部分（ＣＨ１／ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３）を含む。

配列番号３９は、配列番号８（すなわち、軽鎖の可変部分（ＶＬ））及び軽鎖の定常部分（ＣＬ）を含む。

本発明の対象はまた、例えば、遺伝暗号の変性の結果として、表Ｉに示されるヌクレオチド配列に由来する全てのヌクレオチド配列に関する。

本発明の配列は、国際標準ＷＩＰＯ ＳＴ．２５に従って注釈が付けられ、その記載は、Ｐａｔｅｎｔ−Ｉｎ３．５プログラムで開発された。配列の記載を本明細書に追加する。

表Ｉ及び本出願に添付された配列の記載において同定された配列は、本発明に含まれる。表Ｉに含まれる配列と８０〜９９．９％の範囲内の同一性を有する全ての配列は、本明細書に含まれると見なされる。

以下の表Ｉは、全てのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列並びに対応する「配列識別子（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）」を示す。

下線付きのアミノ酸は、最も変動しやすいアミノ酸である。

本発明のさらなる態様において、上記の抗体複合体又は組成物は、個別に、又は他の従来の治療法と組み合わせて、すなわち他の化学療法剤及び／又は手術及び／又は免疫療法及び／又は放射線療法及び／又は標的療法と組み合わせて使用される。

組み合わせて使用し得る化学療法剤は、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、アザシチジン（ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、及びそれらの組み合わせから選択される。組み合わせて使用できる標的薬は、プロテインキナーゼ及びチロシンキナーゼ阻害剤、ミドスタウリン（ｍｉｄｏｓｔａｕｒｉｎ）及びイマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）を含むＦＬＴ３阻害剤、エナシデニブ（ｅｎａｓｉｄｅｎｉｂ）及び他のエピジェネティック薬を含む酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼ−１又は２（ＩＤＨ２）の阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤から選択される。組み合わせて使用し得る抗体及び免疫療法剤は、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ３７、ＣＤ１２３、免疫複合体（ＡＤＣ）、ＢｉＴｅ、ＤＡＲＴ、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、免疫チェックポイント阻害剤、及びワクチンに対する抗体から選択される。

本発明のさらなる局面において、前記抗体複合体又は組成物は、腫瘍細胞、好ましくは白血病細胞、好ましくはＣＤ９９を過剰発現する白血病細胞を他のタイプの腫瘍又は正常細胞から同定及び区別するために診断目的で使用される。より好ましくは、腫瘍細胞の分類（タイピング）は、ＣＤ９９のメッセンジャーＲＮＡ発現を決定するために、細胞蛍光測定又は免疫組織化学的研究によって、又は免疫蛍光法及び分子生物学によって行われる。

本発明の特定の実施形態によれば、前記抗体複合体または組成物を使用して、以下を腫瘍細胞、好ましくはＣＤ９９を発現する白血病細胞に送達する：カリケアマイシンクラスの薬剤、ＤＭ１などの微小管阻害剤を含む、好ましくは抗腫瘍作用を有する細胞毒性化合物、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、ＭＭＡＥ）などの有糸分裂阻害剤など。

実際、本発明の抗体複合体は、細胞毒性化合物、例えば、金属、微生物又は植物起源の毒素、放射性同位元素、酵素、及びその目的のために通常使用される化合物と結合させてもよい。

前記抗体複合体、好ましくは前記多価、より好ましくは二価（ダイアボディ）、三価（トリアボディ）、若しくは四価（テトラボディ）のｓｃＦｖ、又はＩｇＧ抗体形態、好ましくはクラスＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ４を、好ましくは、ＰＥＧを添加して修飾して、前記抗体複合体を投与される人の血流中の保持時間を増加させてもよい。

あるいは、例えば、画像化技術で検出可能なマーカー／トレーサーと結合させてもよい。あるいは、固体培地上に固定化し、及び／又は異種化合物と結合させてもよい。

本発明の一実施形態によれば、上記で詳述された抗体複合体は、１又は複数のさらなる抗原、好ましくは癌に対する治療の標的として公知の抗原に対して二重特異性又は多重特異性反応性であり得る。

本発明の好ましい実施形態によれば、上記で詳述された抗体複合体はまた、ＣＤ９９を発現する腫瘍細胞に対して向けられたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を有するＴリンパ球の産生において使用され得る。

本発明はまた、上記で詳述した抗体複合体を含むヒトタンパク質ＣＤ９９、特にＣＤ９９の細胞外ドメイン、好ましくは５０番目〜７４番目であるエピトープを認識するための免疫診断キットであって、好ましくは前記多価、より好ましくは二価（ダイアボディ）、三価（トリアボディ）、若しくは四価（テトラボディ）のｓｃＦｖ、又はＩｇＧ抗体形態、好ましくはクラスＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ４を含む、前記免疫診断キットに関する。

前記免疫診断キットは、好ましくは腫瘍診断に、好ましくはＣＤ９９の発現、好ましくはＣＤ９９の過剰発現を特徴とする病状を診断するために使用され、前記病状は好ましくは、白血病、骨髄異形成症候群、及びＣＤ９９を発現する固形腫瘍、好ましくはユーイング肉腫及び軟部組織肉腫（滑膜肉腫、間葉性軟骨肉腫、及び横紋筋肉腫）を含む肉腫、消化器癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、精巣癌、卵巣癌、神経内分泌腫瘍、黒色腫、悪性神経膠腫、星状細胞腫、及びリンパ腫から選択される。

前記キットには、診断手順を実施するための使い捨て滅菌材料も含まれる。

本発明のさらなる態様は、タンパク質ＣＤ９９を発現する白血病、特にタンパク質ＣＤ９９を過剰発現する形態の白血病の予防及び／又は治療及び／又はフォローアップのための方法に関する。

前記方法は、白血病の鑑別診断又はＣＤ９９を発現する白血病の治療を必要とする患者に、本発明の抗体複合体及び／又は前記複合体を含む組成物又は本発明の抗ＣＤ９９抗体の少なくとも１つの治療有効量を投与する工程を含む。

本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、所望の治療結果を得るのに充分であるか、又は望ましくない症状に影響を与えるのに充分であるが、通常有害な副作用を引き起こすには不充分である量を指す。

投与は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下、又は坐薬投与であり得る。

Ｃ７ｄＡｂｄ
Ｃ７ダイアボディ（Ｃ７ｄＡｂｄ）は、ｓｃＦｖ Ｃ７の二量体誘導体であり、ｓｃＦｖＣ７の重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ）との間のリンカーの長さが１５個から５個のアミノ酸に短縮されていることを特徴とする。ヒト接着分子ＣＤ９９の細胞外ドメインに特異的なｓｃＦｖＣ７は、国際公開第２０１１／０５８５１７号特許出願に記載されているように、パニング用のＣＤ９９抗原を使用してヒト合成ファージ抗体ライブラリーから単離された。

ＣＤ９９抗原に対するＣ７ｄＡｂｄ及びＣ７ＩｇＧの親和性の評価
ＣＤ９９抗原の細胞外ドメインに対するｓｃＦｖ、ｄＡｂｄ、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ１フォーマットにおけるＣ７の親和性は、Ｒａｔｈ Ｓ ｅｔ ａｌ． １９８８に記載されているＥＬＩＳＡ法を若干変更し、ＣＤ９９ｅｃｄ／ＧＳＴ抗原を標的として使用して評価した。

結果を表ＩＩに示す。ｓｃＦｖ及びダイアボディ間で類似した解離定数（ｋｄ）として表される見かけの親和性を示しているが、Ｃ７ＩｇＧ４の親和性は驚くほど高く、ＩｇＧ１の親和性は代わりに低くなっている。この場合、ＩｇＧ４バリアントは、元のｓｃＦｖＣ７よりもゆうに２桁低い解離定数（Ｋｄ）を示す。これは、Ｃ７ＩｇＧ１の場合のように、ｓｃＦｖ断片をＩｇＧに変換した後の親和性の喪失、又はＩｇＧバリアントがそれらが由来するｓｃＦｖと同じ親和性を維持することが報告されていることから、驚くべきことである。

白血病腫瘍細胞に対する反応性の評価
ｓｃＦｖＣ７（すなわち、単量体ｓｃＦｖ）は、国際公開第２０１１／０５８５１７号特許出願に記載されているように、ＣＤ９９を発現する細胞に対するその特異性を特徴とした。これらの研究の結果は、ｓｃＦｖＣ７がユーイング肉腫の細胞及び組織に特異的に結合できることを示しているが、これらの研究によれば、ＣＤ９９を発現する他の種類の腫瘍細胞では反応性を示していない。

予想外に、急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）の細胞株のパネルの細胞蛍光分析では、ｓｃＦｖＣ７と同様のＣＤ９９に対する親和性を有するダイアボディフォーマットの同じＣ７抗体が、ｓｃＦｖとの結合に対して陰性であったものを含む試験した９／９細胞株で反応性を示した（図１Ａ〜図１Ｌ）。

蛍光強度レベル（平均蛍光強度、ＭＦＩ）は、試験した細胞株によって異なる。

ｓｃＦｖＣ７及びＣ７ｄＡｂｄが同じＶＨ及びＶＬ配列を共有し、ＣＤ９９に対して同様の親和性を示すことを考慮すると、これは予想外の結果である。

同様の結果が蛍光顕微鏡分析でも得られ、Ｃ７ｄＡｂは分析したＴ−ＡＬＬのすべての細胞株と反応することが示された（図２）。

次に、白血病細胞に対するＣ７ｄＡｂｄの反応性の細胞蛍光分析を、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の細胞株まで広げた。この場合も、細胞はＣ７ダイアボディとの結合に高い陽性であることが示された（図３）。

ＣＤ９９を発現する白血病細胞に対するｓｃＦｖフォーマットのＣ７とダイアボディフォーマットのＣ７との間の異なる特異性のさらなる確認として、Ｔ−ＡＬＬのＭＯＬＴ−１６細胞株とＡＭＬのＴＨＰ−１細胞株を、ｓｃＦｖＣ７に対する反応性について細胞蛍光測定で試験した。両方の細胞株は、Ｃ７ｄＡｂｄとの結合に対して高い陽性を示し（図１Ｇ及び図３Ａ）、同じ使用濃度でのｓｃＦｖとの結合に対して完全に陰性であることが実証された（図４）。

白血病細胞に対するｓｃＦｖとダイアボディとの異なる特異性は、おそらく抗原に対する異なる親和性によって決定されるのではなく、２つの分子の異なる物理化学的及び構造的特徴に結びつく可能性がある。ＳｃＦｖはダイアボディ（５０ｋＤａ）よりもサイズが小さく（２５ｋＤａ）、抗原結合部位が１つしかないため、ユーイング肉腫細胞でより到達可能なＣＤ９９エピトープを認識でき、白血病細胞ではマスクされるか、ユーイング肉腫及び白血病でＣＤ９９の立体構造が異なる可能性がある。

関連する抗体との結合によって誘導される細胞応答、特に細胞死を調査する目的で、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムを用いて細胞蛍光測定を実施した。Ｔ−ＡＬＬの７細胞株のパネルを、様々な濃度のＣ７ｄＡｂｄで処理した。図５に示す結果は、分析した全ての細胞が、強度のレベルは異なるものの、Ｃ７ｄＡｂによって誘導される細胞死の影響を受けやすいことを示している。

別の一連の実験では、高い陽性を示すが、Ｃ７ｄＡｂｄとの結合（それぞれ図１Ｆ及び図１Ｂ）及び細胞死の誘導（図５）に対して低い陽性を示すＡＬＬ−ＳＩＬＬ及びＣＣＲＦ−ＣＥＭの２つのＴ−ＡＬＬ細胞株、並びにＣ７ｄＡｂｄとの結合に高い陽性を示すＡＭＬのＴＨＰ−１細胞株（図３）を、異なるインキュベーション時間で１００μｇ／ｍＬの固定濃度のＣ７ｄＡｂｄで処理した。この場合も、テストしたすべての細胞株が抗体による処理の影響を受けやすく、１時間のインキュベーション後にすでに明らかであり、２時間後に最大に達した有効性が示された（図６）。ＡＬＬ−ＳＩＬＬ細胞株、特にＡＭＬのＴＨＰ−１株は、Ｃ７ｄＡｂｄによって誘導される細胞死に非常に感受性が高いことが確認された。

Ｃ７ＩｇＧ
ｓｃＦｖなどの抗体断片は、血流中の半減期が数時間であることを特徴とするのに対し、ＩｇＧ抗体の半減期は７日〜２１日である。ＩｇＧフォーマットの抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能も示し、これらは、恒常的な断片（Ｆｃ）の存在及びＦｃの様々な受容体との結合に依存し、特定の治療用途に役立ち得る（Ｋｅｌｌｎｅｒ Ｃ ２０１７）。

ｓｃＦｖ Ｃ７の２つのＩｇＧ誘導体を作成した。１つ目はサブクラスＩｇＧ４に属し、２つ目はサブクラスＩｇＧ１に属する。

Ｃ７ＩｇＧ４は、ｓｃＦｖＣ７の軽鎖の可変領域（ＶＬ）の配列をヒトＩｇＧ４軽鎖の定常領域の配列に融合し、ｓｃＦｖＣ７の重鎖の可変領域（ＶＨ）の配列をヒトＩｇＧ４重鎖の定常領域の配列に融合することによって生成された。

ＩｇＧ１は同じ方法で生成されたが、ｓｃＦｖＣ７のＶＬ領域及びＶＨ領域をヒトＩｇＧ１のそれぞれの定常配列に融合することによって生成された。

表ＩＩに示すように、Ｃ７の２つのＩｇＧ誘導体を試験して、組換えＣＤ９９に対する親和性を評価した。それらの見かけの親和性は、ＩｇＧ４変異体では驚くほど高く、ＩｇＧ１では低いことが示された。

上記文献は、ｓｃＦｖ断片のＩｇＧへの変換後の親和性の喪失、又はＩｇＧバリアントがそれらが由来するｓｃＦｖと同じ親和性を維持することを実証しているが、本明細書に記載の試験されたＩｇＧ４変異体は、解離定数（Ｋｄ）が元のｓｃＦｖＣ７よりもゆうに２桁低くなっている。次に、Ｃ７−ＩｇＧ４及びＣ７−ＩｇＧ１を、細胞蛍光測定アッセイによってＴ−ＡＬＬ細胞及びＡＭＬ細胞に対する反応性について分析した。

得られた結果は、ダイアボディフォーマットのＣ７の結果と類似している。この場合も、実際、ＩｇＧ１、特にＩｇＧ４は白血病細胞で高い反応性を示した（図７及び図８）。Ｃ７ＩｇＧ４に関しては、Ｔ−ＡＬＬ ＡＬＬ−ＳＩＬ、ＡＭＬ ＴＨＰ−１、及びＭＶ４−１１の細胞内の反応性は、検討した最低濃度の６．２５μｇ／ｍＬまで高レベルのままである。

したがって、細胞蛍光測定アッセイは、Ｔ−ＡＬＬ及びＡＭＬの細胞株のパネルにおける細胞死の誘導を評価することによってＣ７ＩｇＧ４の治療効果を分析するために、アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムを用いて実施した。細胞を５０μｇ／ｍＬの固定濃度で異なるインキュベーション時間でＣ７ＩｇＧ４により処理した。図９に示す結果は、分析したすべての細胞がＣ７ＩｇＧ４によって誘導される細胞死の影響を受けやすく、１時間のインキュベーション後にすでに明らかな有効性を示しているが、強度のレベルは異なっている。

同様に、ＩｇＧ１は、様々な抗体濃度で１時間処理した後、ＡＭＬ ＴＨＰ−１細胞及びＴ−ＡＬＬ ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の死滅を誘導することができる（図１０）。特に、ｄＡｂｄ、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ１結合に対してより反応性の高いＴＨＰ−１細胞は、治療に対して特に感受性が高いのに対し、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞はより耐性がある。

Ｃ７ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ
ＩｇＧ４分子のＳ２２８Ｐへの変異（ＥＵナンバリングシステムによる）により安定化し、通常観察されるＦａｂアーム交換を防ぐ。このために、Ｃ７ＩｇＧ４の変異バージョンを作成した。この変異はヒンジ領域の２２８位（ＥＵナンバリングシステム）にあり、安定化されている。

Ｃ７ＩｇＧ４の前記変異バージョンの重鎖は、以下の配列番号４２のアミノ酸配列を有する：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＨＫＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＲＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ。

前記変異は、ナイーブなセリン（Ｓ）をプロリン（Ｐ）で置換したことにある。

前記変異体は、ウエスタンブロット分析によって特徴付けられた。

精製した各Ｃ７ＩｇＧ４、Ｃ７ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ、及びＣ７ＩｇＧ１抗体の５μｇを非還元条件下で１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。測定は、抗Ｃ７ポリクローナル抗体を使用して行い、次に抗ウサギＨＲＰコンジュゲートを使用して行った。図１５において、半分にした抗体のバンドを円で強調表示している。写真から、Ｓ２２８Ｐ変異を組み込むと、Ｃ７ＩｇＧ４（円で強調表示）の半分の抗体の形成が無効になり、変異によって誘導された安定化が確認される。

Ｃ７ダイアボディ及びＣ７ＩｇＧの内部移行に関する研究
Ｃ７ｄＡｂｄが細胞表面のＣＤ９９に結合した後に内部移行できるかどうかを評価するために、共焦点顕微鏡法によって研究を行った。実験はＴ−ＡＬＬ細胞及びＡＭＬ細胞で実施し、Ｃ７ｄＡｂｄが細胞に浸透する能力を示している（図１１）。特に、動態及び内部移行の速度は、Ｃ７ｄＡｂｄによって誘導される細胞死の動態及び細胞死率を反映している（図６）。Ｃ７ｄＡｂｄで処理した後、迅速かつ大規模に死滅するＴＨＰ−１細胞では、シグナルは３０分後にすでに完全に内部にあるが、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞では、動態が遅く、細胞死率が低く、シグナルは、１時間のインキュベーション後に一部の細胞内に見られる。この結果は、抗体の作用機序を理解するのに役立ち、抗体ー薬物複合体（ＡＤＣ）の場合のように、抗体の内部移行を必要とする用途でＣ７ｄＡｂｄを使用することもできる。

Ｃ７ｄＡｂｄダイアボディ及びその内部移行は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を特徴とする白血病細胞株ＭＯＬＭ１３でも検証された。図１６のマージパネルは、フィールドに表示されているセル全体がＣ７ｄＡｂｄダイアボディをどのように内部移行したかを示している。図１７の写真に示すように、同じＭＯＬＭ１３細胞株がＩｇＧ４を内部移行する能力は、共焦点分析によって実証された。

エクス・ビボテスト
脊髄細胞を患者から入手し、Ｃ７ｄＡｂｄ−ＦＩＴＣ（５０μｇ／ｍＬ）又はＣ７ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ−ＦＩＴＣ（２５μｇ／ｍＬ）と反応させた。処理後、細胞蛍光分析を行った。

図１８は、ＡＬＬ患者の細胞で得られた結果を示している。前記細胞は、ＭＦＩ（平均蛍光強度）を示すパネル（Ａ）のグラフに示されるように、ＩｇＧ４に対してより高い結合親和性で、本発明によるダイアボディ及びＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）に結合する。パネル（Ｂ）に示すように、結合割合（％）はダイアボディ及びＩｇＧ４の両方でほぼ合計である。結合とそれに続く内部移行の結果として、４時間のインキュベーションで、アネキシンＶ及びＰＩ陰性と評価された生細胞の割合は、ダイアボディの存在下では最小であり、いずれの場合もパネル（Ｃ）ではＩｇＧ４の存在下では１０％未満である。

ダイアボディ及びＩｇＧ４がＡＬＬ患者の脊髄からの細胞にアポトーシス促進効果を発揮することの確認として、図１９の写真に例示されている共焦点分析は、ほぼ完全な内部移行を示している。

図２０は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するＡＭＬ患者の細胞で得られた結果を示している。これらの細胞もまた、ＭＦＩ（平均蛍光強度）を示すパネル（Ａ）のグラフに示されるように、ＩｇＧ４に対してより高い結合親和性で、本発明によるダイアボディ及びＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）に結合する。パネル（Ｂ）に示すように、結合割合（％）はダイアボディ及びＩｇＧ４の両方でほぼ合計である。結合とそれに続く内部移行の結果として、４時間のインキュベーションで、アネキシンＶ及びＰＩ陰性と評価された生細胞の割合は、ダイアボディの存在下では約１２％であり、パネル（Ｃ）ではＩｇＧ４の存在下では４０％に達する。

割合（％）は、白血病細胞においてのみ結合及びアポトーシス誘導における本発明による抗体の特異性を示す。

ＡＭＬ患者の細胞でも、ダイアボディ及びＩｇＧ４の内部移行はほぼ完了している（データは示さず）。

次に、同じＡＭＬ患者の骨髄からＣＤ３４＋細胞を単離した。同じ細胞をダイアボディと共に２時間インキュベートし、次に細胞蛍光分析を行った。ダイアボディの蛍光マーキングは、ＣＤ３４＋細胞の約４０％が蛍光性であることを示している。アネキシンＶ＋ＰＩアッセイにより、同等の割合の細胞がアポトーシスを起こすことが示された（図２１）。共焦点分析は、この状況でも陽性細胞がダイアボディを内部移行することを示している（図２１Ａ）。結果は、混合細胞集団において、本発明によるダイアボディが、白血病細胞である可能性が高い細胞の４０％のみに結合することができ、同様の割合（％）で死滅させることができることを示している点で特に重要である。

ＣＤ３４＋細胞をＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）に曝露してアッセイを繰り返し、同様の結果が得られた（図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃ）。

次に、同じＣＤ３４＋細胞を健康なドナーの骨髄から取得し、ＡＭＬ患者のＣＤ３４＋細胞で実施したのと同様に、細胞をＩｇＧ４と共に２時間インキュベートした。結果を図２３に示す。これらは、弱い結合能力を示している（共焦点顕微鏡（図２３Ｃ）及び細胞蛍光測定（図２３Ａ））。弱い結合能力は、ほぼゼロであるアポトーシス（図２３Ｂ）の誘導に関連している。

最後に、ダイアボディ及びＣ７ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐを、健康なドナーからの末梢血細胞で試験した。図２４に示す細胞蛍光分析の結果は、細胞が弱いながらも、とりわけリンパ球の集団に対して結合親和性を持っていることを示しているが、これはアポトーシスを誘導する能力とは関連していない（図２５）。

ＩｇＧ４（ｗｔ）及びＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）の比較
アネキシンＶ＋ＰＩアッセイを用いてＭＯＬＭ１３ ＡＭＬ細胞で評価した、ＣＤ９９に対する反応性、内部移行及びアポトーシス誘導の能力を図２６に示す。得られたデータは、Ｃ７ＩｇＧ４（ｗｔ）及びＣ７ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）が同様の親和性でＣＤ９９を認識し、両方ともＡＭＬ ＭＯＬＭ−１３細胞に十分に内部移行され、ＡＭＬ細胞死を同程度に誘導できることを示している。

Ｃ７ｄＡｂｄの前臨床安全性の評価に関連する種の選択
新しい生物療法剤を開発する過程で、その安全性を確立することを目的とした前臨床研究の設計において、関連する種の選択は基本的に重要である。「バイオテクノロジー由来医薬品の前臨床安全性評価に関するガイダンスに関するＣＨＭＰノート（ＣＨＭＰ Ｎｏｔｅ ｆｏｒ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＩＣＨ Ｓ６）（ＣＨＭＰ／ＩＣＨ／３０２／９５）」に記載されているように、関連する種は、モノクローナル抗体の場合は受容体又はエピトープの発現により試験物質が薬理学的に活性である種である。

接着分子ＣＤ９９は、高度にグリコシル化され、小さく（ヒトでは３２ｋＤａ）、ＭＩＣ２遺伝子によってコードされるＩ型膜貫通タンパク質であり、公知のタンパク質ファミリーには属していない。ＣＤ９９は特有の構造を有しており、共通の祖先遺伝子に由来する可能性のあるＣＤ９９（ＣＤ９９Ｌ２）と同様のパラログを除いて、ヒトゲノムの他の分子とはいずれも関係がない。ＭＩＣ２遺伝子は、性染色体の偽常染色体領域Ｘ（Ｘｐ２２．３３−Ｘｐｔｅｒ）及びＹ（Ｙｐ１１−Ｙｐｔｅｒ）にある。この遺伝子の長さは５０ｋｂで、１０個の小さなエクソンが含まれている。ｃＤＮＡ又はシングルエクソンプローブを用いたクロスハイブリダイゼーション実験によるＣＤ９９ホモログの検索は、霊長類でのみ成功しており、進化の過程でこの遺伝子が高レベルで分岐していることを示している。ヒトでは、ＭＩＣ２遺伝子は、選択的スプライシングプロセスに従って２つの異なるタンパク質をコードする：完全長又は１型ＣＤ９９（ＣＤ９９ｗｔ）及び細胞質ドメインが短いＣＤ９９ ＩＩ型（ＣＤ９９ｓｈ）の短縮型。両方のアイソフォームは霊長類に保存されている。４番染色体のＣ７−Ｄ１領域に位置するＤ４遺伝子は、ヒトＣＤ９９のマウスオルソログとして同定された。ゲノム構成の分析により、遺伝子には１０個の推定エクソンが含まれているのに対し、ｃＤＮＡはヒトＣＤ９９と４６％の同一性を有するタンパク質をコードする９個のエクソンからなることが明らかになった。齧歯類のＣＤ９９の分子は、ヒトＣＤ９９タイプＩＩアイソフォームに見られるように、短い細胞質ドメインを有する。マウスＣＤ９９は、ヒトＣＤ９９と同様の生化学的特性、機能的相同性、及び発現モデルを示す。

Ｃ７ｄＡｂｄの前臨床研究に最も関連する種を特定する目的で、科学文献からのデータ及び公開配列データベース内の標的抗原の相同性の分析だけでなく、３つの異なる種（２つの霊長類と１つの齧歯類）の標的エピトープの認識に関する実験データも考慮した。

Ｃ７ｄＡｂｄの非臨床試験に関連する種を見出すことを目的として、異なる種にわたるＣＤ９９配列及びｓｃＦｖＣ７エピトープの相同性を分析した。最後に、Ｃ７ｄＡｂｄ結合親和性の分析のために選択された種の細胞外ドメインＣＤ９９をクローン化し、精製した。

異なる種におけるＣＤ９９の配列相同性
ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムを使用して、ヒトＣＤ９９と異なる種のＣＤ９９との間の相同性を研究した（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）。分析は、モノクローナル抗体及びマウスＣＤ９９の相同性に関する前臨床研究で広く使用されている非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の２種である、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）及びアフリカミドリザル（Ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）に焦点を当てた。配列アラインメント（表ＩＩＩ及び図１２）は、ヒトＣＤ９９が分析された種の相同体と５５〜９３％の相同性を共有し、霊長類のタンパク質の最高値（９２〜９３％）を共有することを示した。また、エピトープの全領域は霊長類ではよく保存されているが、マウスでは保存されていない（図１２Ｂ）。

分析した種のＣＤ９９に関するＣ７ｄＡｂｄの交差反応性及び結合力を決定する際に、カニクイザル、アフリカミドリザル、マウスＣＤ９９の細胞外ドメインを、それぞれの遺伝子及び大腸菌で発現した組換えタンパク質からクローニングして精製した。精製後、Ｃ７ｄＡｂｄの反応性を評価するために、ＥＬＩＳＡアッセイでタンパク質を標的抗原として使用した。結果を図１３に示す。これらは、抗体が分析した３種全てのＣＤ９９と反応できるが、親和性が異なることを示している。特に、Ｃ７ｄＡｂｄは、マウスＣＤ９９で観察されたものよりもはるかに高い、非常に類似した親和性でヒトＣＤ９９及び２つの霊長類のＣＤ９９を認識する。

結論として、Ｃ７ｄＡｂｄの交差反応性、配列相同性、及び入手可能な情報で得られた結果は、カニクイザルやアフリカミドリザルなどのＮＨＰは、Ｃ７ｄＡｂｄの安全性を前臨床で決定するための最も適切な種と見なし得ることを強く示唆している。

Ｃ７ｄＡｂｄ、Ｃ７ＩｇＧ４、及びＣ７ＩｇＧ１の遺伝子構築物の調製

Ｃ７ｄＡｂｄ。Ｃ７ｄＡｂｄの遺伝子構築物は、ｓｃＦｖ Ｃ７の遺伝子構築物から始めて、ＶＨとＶＬとの間のリンカーの長さを１５個から５個のアミノ酸に短縮することによって作成した。クローニングに使用したプライマーを表Ｉに示す。最初のＰＣＲ工程では、ｓｃＦｖＣ７のＶＨ配列を、配列番号２４及び配列番号２５のプライマー対を使用して増幅し、増幅産物の５’末端に酵素ＮｃｏＩの切断部位を導入した。一方、ＶＬ配列はプライマー対の配列番号２６及び配列番号２７で増幅され（ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、及びＥｃｏＲＩ制限部位はイタリック体、終止コドンは下線付き）、後者は終止コドンとそれに続く酵素ＥｃｏＲＩの切断部位を含む。配列番号２５及び配列番号２６のプライマーは、ＶＨとＶＬとの間のリンカーを構成する５つの残基に対応する相互に重複する領域を含む。このようにして、増幅されたＶＨ配列及びＶＬ配列は、この重複領域を含み、ＰＣＲ反応で拡張され得る。増幅されたＶＨ配列及びＶＬ配列をテンプレートとして使用し、配列番号２４及び配列番号２７のプライマー（増幅用）を使用して２回目のＰＣＲで結合した。増幅産物を、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）と共に、ＮｃｏＩ酵素及びＥｃｏＲＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）と共に３７℃で３時間消化した。消化産物を精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国ウィスコンシン州マディソン）と４℃で一晩ライゲーションした。ライゲーション混合物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（（Ｆ−ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３））で形質転換し、タンパク質の発現及び精製を可能にした。陽性クローンを分析して、配列決定により構築物が正しく挿入されていることを確認した。

Ｃ７ＩｇＧ４及びＣ７ＩｇＧ１。Ｃ７ＩｇＧ４及びＣ７ＩｇＧ１の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）で合成し、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）に挿入した。特に、軽鎖の遺伝子構築物は、ヒトＩｇＧ４（Ｃ７ＩｇＧ４の場合）又はＩｇＧ１（Ｃ７ＩｇＧ１の場合）の定常領域の配列に融合したｓｃＦｖＣ７のＶＬ配列を含む。一方、重鎖の遺伝子構築物は、ヒトＩｇＧ４（Ｃ７ＩｇＧ４の場合）又はＩｇＧ１（Ｃ７ＩｇＧ１の場合）の定常領域の配列に融合したｓｃＦｖＣ７のＶＨ配列を含む。

Ｃ７ｄＡｂｄの精製
Ｃ７ｄＡｂｄの精製は、Ｍｏｒｉｃｏｌｉ Ｄ， ２０１５に記載の通りに実施した。簡潔には、Ｃ７ｄＡｂｄの遺伝子構築物を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の細胞を、１００μｇ／ｍＬの濃度のアンピシリンを添加したＬＢ培地で撹拌しながら３７℃で一晩培養した。次に、培養物を、２０Ｌバイオリアクター（Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）中の５０μｇ／ｍＬアンピシリンを添加した合成培地に接種した。細菌は、ＯＤ６００が１０に達するまでバイオリアクターで培養した。次に、Ｃ７ｄＡｂｄの発現を、１ｍＭイソプロピル−β−α−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）及び４０ｍＭスクロースを培養物に添加することによって誘導した。誘導の３時間後、細胞培養物を遠心分離によって収集した。次に、細胞ペレットを以下を含む溶解緩衝液（Ｌ緩衝液）に再懸濁した：３０ｍＭスクロース、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、及びｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸緩衝液。ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社）を使用して６８０ｂａｒで細胞を破壊し、８０００ｒｐｍで４℃で６０分間遠心分離した。上清を、自動クロマトグラフィーシステム、ＡＫＴＡエクスプローラー１００（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）によるＣ７ｄＡｂｄの精製に使用した。最初のクロマトグラフィー工程は、Ｌ緩衝液で平衡化したＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）との陽イオン交換で構成される。試料のロードとその後の洗浄の後、タンパク質を、０．５Ｍ塩化ナトリウムを添加したＬ緩衝液で溶出した。２番目の最後の精製工程では、ＰＢＳ（生理食塩水リン酸緩衝液）で平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して、組換えプロテインＡとの親和性をクロマトグラフィー分析する。ＳＰレ樹脂の溶出液をカラムにロードし、洗浄後、Ｃ７ｄＡｂｄを０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）及び０．０５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む緩衝液で溶出し、１Ｍトリス緩衝液で直ちにｐＨ７に中和した。最後に、Ｃ７ｄＡｂｄをＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑデバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）と０．２２μｍフィルターを使用してろ過し、アリコートで−８０℃で保存した。タンパク質濃度は２８０ｎｍでの吸収及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度で測定した。

Ｃ７ＩｇＧ４及びＣ７ＩｇＧ１の産生
Ｃ７ＩｇＧ４及びＣ７ＩｇＧ１の産生のために、Ｃ７ＩｇＧ４又はＣ７ＩｇＧ１の軽鎖及び重鎖を含むプラスミドを無血清Ｅｘｐｉ２９３ＴＭ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で培養したＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞にコトランスフェクトした。細胞は、オービタルシェーカー（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）内で８％ＣＯ₂を使用して３７℃の三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ社）で維持した。トランスフェクションの前日、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）三角フラスコに適切な密度で細胞を播種した。トランスフェクションの日に、ＤＮＡ及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を混合し、細胞を入れたフラスコに加えた。トランスフェクションの１６〜１８時間後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー１及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を全てのフラスコに添加した。抗体を含む細胞培養物の上清をトランスフェクションの６日後に収集し、遠心分離し、濾過し、プロテインＡでの精製に使用した。溶出後、プールをＰＢＳで透析し、アリコートに分割して−８０℃で保存した。タンパク質濃度は２８０ｎｍでの吸収及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度で測定した。

ヒトＣＤ９９ｅｃｄ／ＧＳＴのクローニング及び精製
ＣＤ９９の細胞外ドメインを、プライマーＣＤ９９ＢａｍＨＩ Ｆｗ：５’−ＧＧＡＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＧＴＧＧＴＴＴＣＧＡＴ−３’（配列番号２８）及びＣＤ９９＿ＥｃｏＲＩ Ｒｅｖ：５’−ＧＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣ−３’（配列番号２９）を使用してｐＱＥ３０ＸａのＣＤ９９ｅｃｄ遺伝子コンストラクトから増幅し、増幅産物の５’末端に酵素ＢａｍＨＩの切断部位、３’末端にＥｃｏＲＩの部位を導入した。増幅産物をベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と共に消化することにより、目的の遺伝子をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの遺伝子の下流で、ＢａｍＨＩ酵素及びＥｃｏＲＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）と３７℃で３時間融合させた。消化した挿入断片及びベクターを精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国ウィスコンシン州マディソン）と４℃で一晩ライゲーションした。ライゲーション混合物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株で形質転換し、タンパク質の発現及び精製を可能にした。構築物が正しく挿入されているかどうか配列決定により陽性クローンを分析した。

プラスミドｐＧＥＸ＋ＣＤ９９ｅｃｄ／ＧＳＴを含む大腸菌細胞を、オービタルシェーカー内のフラスコ内の１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加した１ＬのＬＢ培地で、３７℃でＯＤ６００が約０．６に達するまで培養した。その時点で、培養物に１ｍＭ ＩＰＴＧを添加することによりタンパク質発現を誘導した。細胞増殖を３７℃でさらに３時間振とうしながら維持し、その後、遠心分離によって細胞を収集した。細胞ペレットを１００ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、超音波処理により溶解した。細胞溶解物を１０，２００ｒｐｍで３０分間４℃で遠心分離し、上清を収集し、濾過し、ＰＢＳであらかじめ平衡化したグルタチオンセファロース４Ｂ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でのアフィニティークロマトグラフィーによるＣＤ９９ｅｃｄ／ＧＳＴの精製のためにロードした。ＰＢＳで洗浄した後、目的のタンパク質を５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液、１０ｍＭのＧＳＨバッファー、ｐＨ８．０で溶出した。タンパク質濃度はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイにより決定し、純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。プールを分割し、アリコートを−８０℃に維持した。

ＥＬＩＳＡによる解離定数（Ｋｄ）の決定
ＣＤ９９に対するｓｃＦｖＣ７、Ｃ７ｄＡｂｄ、Ｃ７ＩｇＧ４、及びＣ７ＩｇＧ１の解離定数（Ｋｄ）として表される結合親和性は、Ｒａｔｈ Ｓ １９８８に記載されている手順に若干変更を加えて、平衡状態での結合の飽和度を競合ＥＬＩＳＡアッセイで分析することによって決定した。抗原への結合の５０％を決定する抗体濃度（ＥＣ５０）を決定するために、ＥＬＩＳＡによって最初の滴定アッセイを実施した。この目的のために、９６ウェルプレートを、０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈した５００ｎｇ／ウェルのＣＤ９９ｅｃｄ／ＧＳＴを分配し、４℃でＯＮでインキュベートすることにより感作した。０．０５％Ｖ／ＶのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加したＰＢＳで３回洗浄した後、プレートを１％ｗ／ｖのＢＳＡのＰＢＳ溶液（ＰＢＳＢ）で３７℃（ｐＨ７．４）で６０分間ブロックした。洗浄後、プレートを３７℃で１時間、ＰＢＳＢで希釈したＣ７の段階希釈液（２００μｇ／ｍＬ〜０．０３μｇ／ｍＬで３連で実施）でインキュベートし、分注した（１００μＬ／ウェル）。プレートを３７℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳＢで１：５００に希釈したポリクローナル抗ｓｃＦｖの希釈液を洗浄した後、１００μＬ／ウェルで分注し、３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳＢ中の抗ウサギＨＲＰからなる検出抗体の１：１０００ｖ/ｖの希釈液を、１００μＬ／ウェルの量で添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを再度洗浄し、ＡＢＴＳからなる染色液を加えた。

マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍで染色強度を読み取った。

バックグラウンドの減算結果を使用して、ＥＣ５０の値を確立するために、統計ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ ４）を使用してミカエリス・メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ Ｍｅｎｔｅｎ）曲線を作成した。

次に、競合ＥＬＩＳＡアッセイを設定した。この目的のために、０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈したＣＤ９９ｅｃｄ／ＧＳＴのコーティングを、ウェルあたり５００ｎｇで塗布し、４℃でＯＮでインキュベートした。０．０５％Ｖ／ＶのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加したＰＢＳで３回洗浄した後、プレートをウェルあたり１００μＬの量で分注したＰＢＳＢの溶液でブロックし、３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、以前の直接ＥＬＩＳＡで計算されたＥＣ５０によって確立された量の抗体の存在下でＰＢＳＢで希釈した４００μｇ／ｍＬ〜０．０１５μｇ／ｍＬまでのＣＤ９９ｅｃｄ／ＧＳＴ抗原の段階希釈液をプレーティングした。ｓｃＦｖＣ７及びＣ７ダイアボディシグナルは、最初の工程で、ｓｃＦｖＣ７で免疫されたウサギで生成され、ＰＢＳＢで１：５００ｖ/ｖに希釈されたポリクローナル抗ｓｃＦｖ抗体、続いて１：１０００ｖ/ｖに希釈された抗ウサギＨＲＰを分注することによって決定した。Ｃ７ＩｇＧ４及びＣ７ＩｇＧ１の検出は、１：１０００ｖ/ｖに希釈された抗ヒトＩｇＧＨＲＰを分注することによって実施した。インキュベーション及び洗浄後、発色基質としてＡＢＴＳを添加することによりシグナルを強調した。４０５ｎｍでの吸光度を読み取った後、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して結果を計算し、単指数関数的減衰曲線を作成し、ＩＣ５０、すなわちシグナルの５０％阻害を提供するために必要な阻害剤の量（モル濃度）を定義した。

細胞株
白血病細胞株は、１０％の脱補体化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１％ｖ／ｖのペニシリン−ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ社）培地で培養した。全ての細胞株を、５％ＣＯ₂の加湿雰囲気下で３７℃のインキュベーター内に保存した。

免疫蛍光
細胞を層流フード下で処理し、無菌状態を維持し、生存率を顕微鏡下でモニタリングした。

前記細胞を３７℃に予熱した培地で洗浄し、１６００ｒｐｍで６分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを１０ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、この溶液で３回洗浄した。次に、トリパンブルーで染色した後、血球計算盤でカウントを行い、固定するために３．５×１０⁶個の細胞を収集した。

ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド（ｖ/ｖ）で固定を行い、遠心分離後、細胞を６ｍＬのこの溶液に再懸濁し、濃度を５×１０⁵細胞／ｍＬとした。この懸濁液を６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１ｍＬで、底にカバーガラスを配置した。固定相を室温で１５分間維持し、続いて細胞を３ｍＬのＰＢＳで３回洗浄した。前記細胞を、３７℃で溶解したＰＢＳ（１×）、１％ｗ／ｖのＢＳＡ、及び０．０５％ｗ／ｖのゼラチンからなるブロッキング溶液で室温で６０分間処理した。この時点で、ＰＢＳで希釈したＣ７ｄＡｂｄ抗体をウェルあたり１ｍＬずつ加え、９０分間インキュベートした。インキュベーション段階後、ウェルあたり３ｍＬのＰＳＢ（１×）で３回の洗浄を行った。続いて、ブロッキング溶液で１：１０００ｖ/ｖに希釈したプロテインＡ−ＦＩＴＣを分注し、暗所で６０分間インキュベートした。３回洗浄した後、ＰＢＳ（１×）で１：１００００ｖ/ｖに希釈したＤＡＰＩを添加した。この溶液を前記細胞と接触させて１分間維持し、最後に、細胞を再度洗浄し、顕微鏡分析に供した。シグナルは、ＤＣ３００ＦＣＣＤデジタルカメラを備えたライカＤＭＬＢ蛍光顕微鏡で視覚化した。

細胞蛍光測定による結合アッセイ
フラスコから細胞を取り出し、３７℃に予熱した１１ｍＬの培地を入れた試験管に入れ、１６００ｒｐｍで６分間遠心分離して沈殿させた。遠心分離後に上清を除去した。ペレットを３ｍＬの培地に再懸濁し、トリパンブルーで染色した後、血球計算盤でカウントした。次に、培地を加えることにより、細胞密度を５×１０⁵細胞／ｍＬとした。細胞蛍光測定用試験管は、試験管あたり１ｍＬの細胞懸濁液を分注することによって調製した。

次に、１６００ｒｐｍで６分間遠心分離することにより、細胞を４ｍＬのＰＢＳ（１×）で２回洗浄した。上清は毎回除去した。続いて、細胞を、ＰＢＳ（１×）及び１％ｗ／ｖのＢＳＡからなる２００μＬのブロッキング溶液に再懸濁し、この状態を室温で３０分間維持した。この工程の後、抗体を、室温で６０分間保持した２００μＬのブロッキング溶液に添加した。インキュベーション終了時に、各試験管を４ｍＬのＰＢＳ（１×）で２回洗浄し、続いて１６００ｒｐｍで６分間遠心分離し、毎回上清をデカントした。各細胞ペレットを、ブロッキング溶液で１：１０００ｖ/ｖに希釈したプロテインＡ−ＦＩＴＣからなる２００μＬの溶液に再懸濁し、インキュベーションを室温で６０分間維持した。この工程の後、細胞を４ｍＬのＰＢＳ（１×）で１回洗浄し、上記のように遠心分離した。ポンプで吸引して上清を除去し、全ての試験管に約５００μＬの洗浄液を残した。試料を、ＦａｃＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用した細胞蛍光分析に供した。

アポトーシスの評価
白血病細胞のアポトーシスは、アネキシンＶ及び細胞蛍光測定技術を使用したヨウ化プロピジウム試験によって評価した。細胞を収集し、カウントし、５０ｍＬの試験管に移し、ＲＰＭＩ培地で５×１０⁵細胞／ｍＬの濃度とした。続いて、細胞懸濁液を試験管あたり１ｍＬ（５×１０⁵細胞）で分注した。１６００ｒｐｍで６分間遠心分離した後、細胞を抗体で処理した。試料は並行して調製し、プラセボで処理した。前記試料は３７℃で４時間のインキュベーションで維持した。インキュベーションの最後に、細胞を１２００ｒｐｍで８分間遠心分離し、上清を除去し、１５０μＬのＨｕｍａｎ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＦＩＴＣキット（Ｖａｌｔｅｒ Ｏｃｃｈｉｅｎａ社）の結合緩衝液を全ての試験管に添加した。その後、再懸濁した細胞を細胞蛍光測定用試験管に移し、そこに３μＬのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及び３μＬのヨウ化プロピジウムを加えた。前記試料を完全に混合した後、暗所で室温で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、１２００ｒｐｍで８分間遠心分離し、上清をデカントすることにより、前記試料を４ｍＬのＰＢＳで洗浄し、２００μＬの結合緩衝液を全ての試験管に加え、前記試料を細胞蛍光測定で調べた。

共焦点顕微鏡
フラスコから細胞を取り出し、３７℃に予熱した１１ｍＬの培地を入れた試験管に入れた後、１６００ｒｐｍで６分間遠心分離して沈殿させた。遠心分離後に上清を除去した。ペレットを３ｍＬの培地に再懸濁し、トリパンブルーで染色した後、血球計算盤でカウントした。次に、培地を加えることにより、細胞密度を５×１０⁵細胞／ｍＬとした。様々な条件を、試験管あたり１ｍＬの細胞懸濁液を分注することによって調整した。

次に、１６００ｒｐｍで６分間遠心分離することにより、細胞を４ｍＬのＰＢＳ（１×）で２回洗浄した。上清は毎回除去した。続いて、細胞を、ＰＢＳ（１×）及び１％ｗ／ｖのＢＳＡからなる２００μＬのブロッキング溶液に再懸濁し、この状態を室温で３０分間維持した。この工程の後、前もってＦＩＴＣでマークしたＣ７ｄＡｂｄ抗体を、３０分間、１時間、２時間、及び４時間維持された２００μＬのブロッキング溶液に添加した。各インキュベーション終了時に、各試験管を４ｍＬのＰＢＳ（１×）で２回洗浄し、続いて１６００ｒｐｍで６分間遠心分離し、毎回上清をデカントした。各細胞ペレットを２００μＬに再懸濁し、前記試料を共焦点分析に供した。

カニクイザル、アフリカミドリザル、及びマウスＣＤ９９ｅｃｄ／ＧＳＴのクローニング並びに精製
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｏｌａｒｉｓ）及びアフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）のＣＤ９９の細胞外ドメインは、カニクイザルリンパ球のＲＮＡ又はアフリカミドリザルＣＯＳ−１細胞株由来のＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡから前もって作製したｐＥＴ４５ｂにおけるそれぞれのＣＤ９９ｅｃｄ遺伝子構築物から増幅した。

ＡＧＭ＿ＣＤ９９＿ＢａｍＨＩ＿Ｆｗ：５’−ＧＴＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号３０）フォワードプライマー及びＡＧＭ＿ＣＤ９９＿ＥｃｏＲＩ Ｒｅｖ：５’−ＡＴＣＡＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号３１）リバースプライマーを用いて両方の種について増幅が得られた。マウスＣＤ９９の細胞外ドメインは、以下のプライマーを使用してＣＤ９９遺伝子を含むプラスミドから増幅した：ｍｍＣＤ９９ＢａｍＨＩ Ｆｗ２：５’−ＧＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＣＴ−３’（配列番号３２）及びｍｍＣＤ９９ＥｃｏＲＩ Ｒｅｖ：５’−ＡＣＣＡＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧＧＧＣＧＴ−３’（配列番号３３）。使用したすべてのプライマーは、増幅産物の５’末端に酵素ＢａｍＨＩの切断部位を導入し、３’末端にＥｃｏＲＩの部位を導入する。増幅産物をベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と共に消化することにより、目的の遺伝子をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの遺伝子の下流で、ＢａｍＨＩ酵素及びＥｃｏＲＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）と３７℃で３時間融合させた。消化した挿入断片及びベクターを精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国ウィスコンシン州マディソン）と４℃で一晩ライゲーションした。各ライゲーション混合物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株で形質転換し、タンパク質の発現及び精製を可能にした。構築物が正しく挿入されているかどうか配列決定により陽性クローンを分析した。

ヒトＣＤ９９ｅｃｄ／ＧＳＴについて記載したように、前記３つのタンパク質の精製を行った。

上記のように、Ｃ７ｄＡｂｄの反応性を評価するために、異なる種のＣＤ９９ｅｃｄ／ＧＳＴをＥＬＩＳＡ滴定アッセイで使用した。

Claims (21)

1. 白血病又は骨髄異形成症候群の予防及び／又は治療及び／又はフォローアップにおける使用のための抗体又は前記抗体を含む組成物であって、前記抗体は、好ましくは配列番号２１を含むアミノ酸配列を特徴とする、ヒトタンパク質ＣＤ９９の細胞外ドメインのエピトープを認識して結合することができる少なくとも２つの可変領域を含み、前記少なくとも２つの可変領域は、それぞれ、
   配列番号１又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を特徴とする重可変鎖（ＶＨ）と、
   配列番号２又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を特徴とする軽可変鎖（ＶＬ）とを含む、前記使用のための抗体又は組成物。
2. 前記エピトープが、配列番号２３を含むアミノ酸配列を特徴とする、請求項１に記載の使用のための抗体又は組成物。
3. （１）前記ＶＨ鎖は、それぞれ、配列番号３及び４を含むアミノ酸配列又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を特徴とするＣＤＲ１領域及びＣＤＲ２領域を含む、及び／又は（２）前記ＶＬ鎖は、それぞれ、配列番号５及び６を含むアミノ酸配列又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を特徴とするＣＤＲ１領域及びＣＤＲ２領域を含む、請求項１又は２に記載の使用のための抗体又は組成物。
4. （１）前記ＶＨ鎖は、配列番号７を含むアミノ酸配列又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を特徴とする、及び／又は（２）前記ＶＬ鎖は、配列番号８を含むアミノ酸配列又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための抗体又は組成物。
5. 前記抗体は、多価一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）の断片であり、好ましくは、ダイアボディ、３価（トリアボディ）及び４価（テトラボディ）の中から選択され、あるいはＩｇＧ、好ましくはクラスＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ４のＩｇＧである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための抗体又は組成物。
6. 前記多価ｓｃＦｖ、好ましくはダイアボディのｓｃＦｖユニットは、好ましくは配列番号９を含むアミノ酸配列又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を特徴とするリンカーによって互いに結合される、請求項５に記載の使用のための抗体又は組成物。
7. 前記多価ｓｃＦｖの各ｓｃＦｖユニットが、配列番号１０を含むアミノ酸配列又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を特徴とする、請求項５又は６に記載の使用のための抗体又は組成物。
8. （１）前記ＩｇＧのＶＨ鎖は、それぞれ、配列番号７を含むアミノ酸配列又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を特徴とする及び／又は前記ＩｇＧのＶＬ鎖は、配列番号８を含むアミノ酸配列又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を特徴とする、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用のための抗体又は組成物。
9. 前記抗体はダイアボディであるか、又はＩｇＧ４ｗｔ若しくはＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための抗体又は組成物。
10. 前記白血病は、ＣＤ９９を発現する白血病細胞、好ましくはＣＤ９９を過剰発現する白血病細胞を含み、より好ましくは、前記白血病は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の中から選択され、好ましくは急性白血病、より好ましくはＡＬＬ又はＡＭＬである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための抗体又は組成物。
11. 好ましくはダウノルビシン、イダルビシン、シタラビン、アザシチジン、デシタビン及びそれらの組み合わせの中から選択されるさらなる化学療法剤と組み合わせた、及び／又は手術及び／又は免疫療法及び／又は放射線療法及び／又は標的療法と組み合わせた、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための抗体又は組成物。
12. 好ましくは配列番号２１を含むアミノ酸配列を特徴とする、ヒトタンパク質ＣＤ９９の細胞外ドメインのエピトープを認識して結合することができる、ＩｇＧタイプ免疫グロブリン、好ましくはクラスＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ４のＩｇＧタイプ免疫グロブリンであって、前記免疫グロブリンは、それぞれが２つの可変領域を定義する可変領域及び定常領域を特徴とする２つの重鎖及び２つの軽鎖を有し、前記２つの可変領域は、それぞれ、配列番号１又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を特徴とする重可変鎖（ＶＨ）及び配列番号２又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＤＲ３を特徴とする軽可変鎖（ＶＬ）を含む、前記免疫グロブリン。
13. 前記エピトープが、配列番号２３を含むアミノ酸配列を特徴とする、請求項１２に記載の免疫グロブリン。
14. （１）前記ＶＨ鎖は、それぞれ、配列番号３及び４を含むアミノ酸配列又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を特徴とするＣＤＲ１領域及びＣＤＲ２領域を含む、及び／又は（２）前記ＶＬ鎖は、それぞれ、配列番号５及び６を含むアミノ酸配列又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を特徴とするＣＤＲ１領域及びＣＤＲ２領域を含む、請求項１２又は１３に記載の免疫グロブリン。
15. （１）前記ＶＨ鎖は、配列番号７を含むアミノ酸配列又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を特徴とする、及び／又は（２）前記ＶＬ鎖は、配列番号８を含むアミノ酸配列又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。
16. 前記ＩｇＧ４の各重鎖のアミノ酸配列は、配列番号３４又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、及び／又は前記ＩｇＧ４の各軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３５又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、配列番号３４は、配列番号７（すなわち、重鎖の可変部分（ＶＨ））及びＩｇＧ４の重鎖の定常部分（ＣＨ１／ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３）を含み、並びに配列番号３５は、配列番号８（すなわち、軽鎖の可変部分（ＶＬ））及び軽鎖の定常部分（ＣＬ）を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。
17. 前記ＩｇＧ１の各重鎖のアミノ酸配列は、配列番号３８又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、及び／又は前記ＩｇＧ１の各軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３９又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、配列番号３８は、配列番号７（すなわち、重鎖の可変部分（ＶＨ））及びＩｇＧ１の重鎖の定常部分（ＣＨ１／ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３）を含み、並びに配列番号３９は、配列番号８（すなわち、軽鎖の可変部分（ＶＬ））及び軽鎖の定常部分（ＣＬ）を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。
18. 請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の免疫グロブリン及び少なくとも１つのさらなる薬学的に許容される成分を含む組成物。
19. 薬剤として使用するための、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の免疫グロブリン又は請求項１８に記載の組成物。
20. ＣＤ９９を発現する、好ましくは過剰発現する、又はＣＤ９９発現／過剰発現によって引き起こされる病状の治療及び／又は予防及び／又はフォローアップに使用するための、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の免疫グロブリン又は請求項１８に記載の組成物。
21. 前記病状が、ユーイング肉腫及び軟部組織肉腫（滑膜肉腫、間葉性軟骨肉腫、及び横紋筋肉腫）、消化器癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、精巣癌、卵巣癌、神経内分泌腫瘍、黒色腫、悪性神経膠腫及び星状細胞腫、リンパ腫、好ましくは急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の中から選択される白血病、急性白血病が特に好ましく、より好ましくはＡＬＬ又はＡＭＬ、並びに骨髄異形成症候群を含む、固形腫瘍及び血液癌、肉腫の中から選択される、請求項２０に記載の使用のための、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の免疫グロブリン又は請求項１８に記載の組成物。

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