JP7518771B2 - 抗cd99ダイアボディ又はigg抗体及びそれらの使用 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒトタンパク質CD99を認識及び結合することができる多価、好ましくは二価の抗体複合体、より好ましくはダイアボディ、すなわち二価のscFv、前記複合体を含む組成物、並びに白血病及び/又は骨髄異形成症候群の診断目的及び/又は治療及び/又はフォローアップのためのその使用に関する。
さらに、本発明は、ヒトタンパク質CD99を認識して結合することができる免疫グロブリンGグループタイプの抗体、好ましくはモノクローナル抗体、特に癌、好ましくはCD99及び/又は白血病及び/又は骨髄異形成症候群を発現する固形腫瘍の治療及び/又はフォローアップのための、前記免疫グロブリンを含む組成物及びその医学的使用に関する。
癌が世界中の主な死因の1つであることは周知である。さらに、癌は全ての国の社会生活及び健康コストに多大な影響を及ぼしている。癌を緩和又は治癒することが可能な治療法を見出すための努力は相当なものであり、あらゆる方向に由来する。
白血病は、最も一般的な癌の形態の1つである。
白血病は、造血幹細胞の腫瘍性増殖を特徴とする一連の悪性疾患、様々な種類の癌又は腫瘍を示す用語であり、異常な白血球の数が多くなる。これらの白血球は完全には発達しておらず、芽球又は白血病細胞と称される。
赤い骨髄に見られる造血幹細胞は、2つの細胞株を生成する:
-赤血球、数種類の白血球(顆粒球及び単球)、及び血小板が由来する骨髄系、並びに
-リンパ球(別の種類の白血球)が由来するリンパ系。
-赤血球、数種類の白血球(顆粒球及び単球)、及び血小板が由来する骨髄系、並びに
-リンパ球(別の種類の白血球)が由来するリンパ系。
白血病クローンが進化する細胞株に応じて、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、及び慢性骨髄性白血病(CML)について説明する。
病態の確かな原因は依然として不明である。喫煙、電離放射線又は一部の化学物質(ベンゼンなど)への曝露、以前の化学療法治療、及びダウン症など、遺伝的及び環境的両方の様々な要因が危険因子である可能性があると考えられている。
骨髄異形成症候群(MDS)は、骨髄の欠陥を特徴とする血液疾患のグループであり、赤血球、白血球、及び血小板などのいくつかの血液細胞株を充分な数で産生することができなくなる。MDSは、時間経過と共に急性型の白血病に発展する可能性があるため、前白血病状態とも称される。
診断は通常、血液検査又は骨髄生検により明確に説明される。
白血病の治療には、化学療法、放射線療法、標的療法、及び骨髄移植の組み合わせに加えて、支持療法並びに場合によっては緩和治療を伴う。高用量の化学療法又は放射線療法で破壊された病変細胞を、適合するドナー、多くの場合同胞又は家族、時には他人からの健康な細胞に置き換えるための造血幹細胞の移植は、一部の症例、特に若い患者において永久的疾患を治癒することができ、化学療法に反応しなくなった病態に用いられる。
免疫系を刺激して白血病細胞を認識して破壊する治療法もある。いくつかの種類の白血病では、例えば、腫瘍細胞の増殖を遅らせるためにインターフェロンが使用される。
白血病の標的療法の先駆者は、CML及びALLの治療に使用され、いわゆるフィラデルフィア(Ph+)染色体に起因する染色体転座の結果として生成される異常なBcr-Ablタンパク質の存在を特徴とするチロシンキナーゼ阻害剤であるイマチニブ(Imatinib)である。治療は非常に効果的であるが、何年にもわたってある種の耐性が生じる場合がある。
白血病の新しい治療法の開発における最近の進歩にもかかわらず、米国の平均5年生存率は57%である。15歳未満の子供では、5年生存率は種類に応じて60%及び85%より高くなる。
したがって、一般的な腫瘍及び特に白血病の治療のために、個別に、又は現在利用可能な治療法と組み合わせて使用される改良された又は代替の治療法/分子を特定する必要性が強く感じられる。
最近の研究では、膜タンパク質が白血病造血細胞で発現が変化する可能性があることが示されている。
特に、Pasello et al., in J. Of Cell Communication and Signaling (2018) 12:55-68では、膜糖タンパク質CD99が白血病を含む様々な種類の腫瘍で過剰発現していることを説明している。
国際公開第2016149682号パンフレットは、抗CD99抗体について説明し、細胞死の誘導が必ずしも抗原-抗体結合に続くとは限らないことを示している。
国際公開第2011058517号パンフレットは、抗CD99scFVについて記載している。同じscFvの単量体ユニットは、ユーイング肉腫の治療に効果的であることが示されている。ただし、JURKAT、CCRF-CEM、HL-60、及びMOLT-4などの白血病細胞を認識して結合することはできない。
本発明者らは、上記の必要性に対する解決策として、ヒトタンパク質CD99を認識して結合することができる多価抗体複合体の使用を見出した。特に、本発明者らは、CD99指向性のダイアボディ、すなわち一本鎖可変断片(scFv)の2つのユニットが、白血病及び/又は骨髄異形成症候群の治療及び/又はフォローアップに特に効果的であることを見出した。
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、ヒトタンパク質CD99を認識して結合することができる免疫グロブリンGグループタイプの抗体、好ましくはモノクローナル抗体は、様々な種類の癌、特にCD99を発現する固形腫瘍、白血病及び/又は骨髄異形成症候群の治療法に有効であることも見出した。クラスIgG4及びIgG1モノクローナル抗体は特に効果的であることが示されている。
実際、本発明者らは、白血病細胞が、本明細書に記載の抗体複合体のダイアボディ及び/又はIgG形態との結合後に死滅することを見出した。特に、共焦点顕微鏡法によって、本発明者らは、白血病細胞が本明細書に記載の抗体複合体を内部移行可能であることを見出した。この後者のデータは、抗体-薬物複合体(Antibody-Drug Conjugate、ADC)の場合のように、抗体の内部移行を必要とする適用で複合体を使用できるため、特に興味深く有利である。
本発明のさらなる利点は、以下の詳細な説明及び添付の図(特に下記)から明らかになるであろう。
図1は、本発明の抗体複合体(ダイアボディ)の例示的な実施形態での処理後の白血病細胞株の細胞蛍光分析の結果を示す図である。
図2は、本発明の抗体複合体(ダイアボディ)の例示的な実施形態で処理された白血病細胞の蛍光顕微鏡分析を示す図である。
図3は、急性骨髄性白血病の細胞株を用いた本発明の抗体複合体(ダイアボディ)のいくつかの例示的な実施形態の反応性分析の結果を示す図である。濃い線で描かれたピークは、二次抗体のみでマークされた細胞のピークを表し、薄い灰色の線で描かれたピークは、前記複合体のダイアボディ型でマークされた細胞を表す。
図4は、急性骨髄性白血病及びリンパ性白血病の細胞株に対する単量体scFvC7の反応性の分析結果を示す図である。濃い線で描かれたピークは、二次抗体のみでマークされた細胞のピークを表し、薄い灰色の線で描かれたピークは、単量体scFvC7でマークされた細胞を表す。
図5は、細胞蛍光測定によって測定された、本発明の抗体複合体(ダイアボディ)のいくつかの例示的な実施形態によって誘発された白血病細胞死の分析の結果を示す図である。
図6は、細胞蛍光測定によって測定された、本発明の抗体複合体(ダイアボディ)のいくつかの例示的な実施形態によって誘発された白血病細胞死の分析の結果を示す図である。
図7は、以下の細胞株で得られた本発明の抗体複合体(IgG1及びIgG4の形態の抗体、すなわちC7IgG1及びC7IgG4)のいくつかの例示的な実施形態の反応性の細胞蛍光分析の結果を示す図である:T-ALL:ALL-SIL、CCRF-CEM、並びにAML:MV4-11、THP-1、及びMONO-MAC-6。
図8は、以下の細胞株で得られた本発明の抗体複合体(IgG1及びIgG4の形態の抗体、すなわちC7IgG1及びC7IgG4)のいくつかの例示的な実施形態の反応性の細胞蛍光分析の結果を示す図である:T-ALL:ALL-SIL、CCRF-CEM、並びにAML:MV4-11、THP-1、及びMONO-MAC-6。
図9は、白血病細胞において本発明の抗体複合体(IgG1及びIgG4の形態の抗体、すなわち、C7IgG1及びC7IgG4)のいくつかの例示的な実施形態によって誘導される白血病細胞死の分析の結果を示す図である。
図10は、白血病細胞において本発明の抗体複合体(IgG1及びIgG4の形態の抗体、すなわち、C7IgG1及びC7IgG4)のいくつかの例示的な実施形態によって誘導される白血病細胞死の分析の結果を示す図である。
図11は、CD99との結合後に本発明の抗体複合体をダイアボディ形態で内部移行する白血病細胞の能力に関する共焦点顕微鏡法の結果を示す図である。
図12は、(A)ヒト、カニクイザル、ミドリザル、及びマウスCD99の細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメント(同一の残基はアスタリスク(*)でマークされているが、2つの点(:)は保存的置換を示し、1つの点(.)は半保存的置換を示す)、並びに(B)scFvC7のエピトープのアミノ酸配列のアラインメント、を示す図である。
図13は、ELISAアッセイによって得られた、異なる種のCD99に対するダイアボディ形態の本発明の抗体複合体の反応性に関する結果を示す図である。
図14は、本発明の抗体複合体の様々な形態、特にIgG形態並びにダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ形態の図表を示す図である。
図15は、精製C7IgG4、C7IgG4S228P、及びC7IgG1に対して非還元条件下で実施したウエスタンブロット分析を示す図である。シグナルは、抗ウサギHRPによって明らかにされた抗C7Abによって与えられる。パネルA、B、及びCは、抗体C7IgG4S228Pの3つの異なる産生を示している。
図16は、共焦点顕微鏡で分析したダイアボディを内部移行する白血病細胞株MOLM13の能力を示す図である。
図17は、共焦点顕微鏡で分析したIgG4を内部移行する白血病細胞株MOLM13の能力を示す図である。
図18は、ALL白血病患者の脊髄細胞でのアポトーシスの誘導における本発明によるダイアボディ及びIgG4の有効性を示す図である。(A)FITCでマークされた抗体と結合後の細胞の蛍光強度、(B)抗体の結合に陽性の細胞の割合(%)、(C)生細胞(黒)、アポトーシス細胞(灰色)、壊死細胞(白)の割合(%)。
図19は、共焦点顕微鏡で分析したALL患者の細胞におけるダイアボディ及びIgG4の内部移行を示す図である。(A)1時間のインキュベーション後のダイアボディ、(B)2時間のインキュベーション後のダイアボディ、(C)1時間のインキュベーション後のIgG4、(D)2時間のインキュベーション後のIgG4。
図20は、AML白血病患者の末梢血細胞でのアポトーシスの誘導における本発明によるダイアボディ及びIgG4の有効性を示す図である。(A)FITCでマークされた抗体と結合後の細胞の蛍光強度、(B)抗体の結合に陽性の細胞の割合(%)、(C)アネキシンV+ヨウ化プロピジウム(PI)でマーキングすることによるアポトーシスの細胞蛍光測定:生細胞(黒)、アポトーシス細胞(灰色)、壊死細胞(白)の割合(%)。
図21は、AML患者のCD34+細胞でダイアボディを使用して得られた結果を示す図である。(A)共焦点顕微鏡、(B)抗体の結合に陽性の細胞の割合(%)、(C)アネキシンV+ヨウ化プロピジウム(PI)でのマーキングによるアポトーシスの細胞蛍光測定による量子化。
図22は、AML患者のCD34+細胞でIgG4を使用して得られた結果を示す図である。(A)共焦点顕微鏡、(B)抗体の結合に陽性の細胞の割合(%)、(C)アネキシンV+ヨウ化プロピジウム(PI)でのマーキングによるアポトーシスの細胞蛍光測定による量子化。
図23は、健康なドナーのCD34+細胞でIgG4を使用して得られた結果を示す図である。(A)抗体の結合に陽性の細胞の蛍光強度及び割合(%)(抗CD99モノクローナル抗体クローン0662を陽性対照として使用した)、(B)アポトーシスの量子化、(C)共焦点顕微鏡。
図24は、ダイアボディ又はIgG4とインキュベートした末梢血細胞の集団の細胞蛍光分析を示す図である。抗CD99モノクローナル抗体クローン0662を陽性対照として使用した。
図25は、図24の実験に従って処理した末梢血細胞におけるアネキシンV/PIアッセイで測定されたアポトーシスの割合(%)を示す図である
図26は、IgG4wt及び変異型IgG4S228Pで得られた結果の比較を示す図である。(A)ELISAアッセイによって評価された組換えCD99に対する反応性(B)AML細胞株MOLM13の共焦点顕微鏡。(C)アポトーシスの量子化。
これに関連して、「一本鎖可変断片」(scFv)は、例えば、ファージディスプレイ技術によって得られる特定のタイプの抗体断片を意味する。
この分子は、免疫グロブリンの軽鎖(VL)及び重鎖(VH)の可変領域の融合体であり、リンカーによって互いに結合されている。すなわち、scFvは、リンカー、すなわち、VH-VL鎖が機能的な単量体ユニットとして正しい構造をとることを可能にする様々な長さの柔軟なペプチド、によって互いに結合された免疫グロブリンのVH及びVLからなるFvタイプの抗体断片である。
scFvは、ダイアボディ(dAbd)すなわち二価scFvなどの抗体複合体を形成するように操作可能であり、あるいは、それぞれ2、3、又は4つのscFvを結合するトリアボディ又はテトラボディ、換言すると、scFvを操作して多価複合体、すなわち多価scFvを形成することも可能である。培養哺乳類細胞で産生されることが多いモノクローナル抗体とは異なり、一価及び多価scFvは、大腸菌(Escherichia coli)などの細菌の細胞でしばしば産生される。
これに関連して、抗体又はより正確には免疫グロブリンは、抗原と呼ばれる相補的構造に非常に特異的な方法で結合することができる特定の「Y」字型のモジュール式四次構造を有するタンパク質を意味する。
抗体では2つの基本的な成分を区別できる。
・抗体と補体又は自然免疫細胞との相互作用を媒介する定常領域(C)(「Fc」部分)。
・抗原との結合部位を含み、したがって、所与の抗原に対する抗体の特異性に従って変化する可変領域(V)(「Fab」部分)。
・抗体と補体又は自然免疫細胞との相互作用を媒介する定常領域(C)(「Fc」部分)。
・抗原との結合部位を含み、したがって、所与の抗原に対する抗体の特異性に従って変化する可変領域(V)(「Fab」部分)。
これらの成分は、互いに同一の2つの重鎖(H)及び同様に互いに同一の2つの軽鎖(L)である4つの糖タンパク質鎖から構成される四量体タイプのタンパク質複合体を形成するように構造化されている。
さらに、各鎖は、アミノ末端に位置する可変ドメイン(重鎖の場合はVH、軽鎖の場合はVL)及びカルボキシ末端にある1又は複数の定常ドメインからなる。最後に、各可変ドメインの抗原結合部位には、いわゆるフレームワーク領域が点在する3つの超可変領域(CDR1、CDR2、そして最後に、CDR3からなる最も可変な部分)がある。構造レベルでは、超可変領域は、フレームワーク領域から派生したベータシートの複雑な構造内に3つの近接したループを形成するように編成されている。
ヒト免疫グロブリンは、IgG、IgA、IgM、IgD、及びIgEの5つの主要なクラスに分類される。
重鎖はγ型であり、免疫グロブリンの各クラスに特異的であり、それぞれが可変Igドメイン(VH又はVγ)及び3つの定常ドメイン(CH1/2/3又はCγ1/2/3)を含む。IgGの場合、γ鎖は4つの異なるサブタイプ(γ1、γ2、γ3、及びγ4)で生成され得る。したがって、免疫グロブリンGは、対応する数のサブファミリー(IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4)に区別され、すべて同様の構造と機能を備えている。
モノクローナル抗体は、以下を含むさまざまな手順に従って取得できる:
―所与の抗原によるマウスの免疫化及びマウス抗体を分泌するハイブリドーマの産生を提供する従来のシステム。マウス抗体の臨床使用は、その固有の免疫原性によって最初から条件付けられていた。しかしながら、分子技術の利用可能性のおかげで、可変領域又はマウスCDRの特異性を保持するが、定常部分及びフレームワーク領域にヒト配列を用いるキメラ又はヒト化抗体を構築することによって免疫原性を低下させることが可能となった。
―ヒト抗体を産生可能なトランスジェニックマウスの使用。
―完全にヒトの組換え抗体断片及び抗原に対して高い親和性を有する抗体を選択するために現在最も広く使用されている方法である、ファージディスプレイ技術。
―所与の抗原によるマウスの免疫化及びマウス抗体を分泌するハイブリドーマの産生を提供する従来のシステム。マウス抗体の臨床使用は、その固有の免疫原性によって最初から条件付けられていた。しかしながら、分子技術の利用可能性のおかげで、可変領域又はマウスCDRの特異性を保持するが、定常部分及びフレームワーク領域にヒト配列を用いるキメラ又はヒト化抗体を構築することによって免疫原性を低下させることが可能となった。
―ヒト抗体を産生可能なトランスジェニックマウスの使用。
―完全にヒトの組換え抗体断片及び抗原に対して高い親和性を有する抗体を選択するために現在最も広く使用されている方法である、ファージディスプレイ技術。
これに関連して、CD99は膜貫通型糖タンパク質であり、ヒトでは他の公知のタンパク質(Xgaを除く)との相同性を示さない。CD99の分子量は32kDaで、細胞接着、アポトーシス、T細胞及び胸腺細胞の分化、単球の遊走、並びにリンパ球と内皮細胞と間の細胞内接着などの重要な生理学的機能に関与している。ヒトでは、MIC2遺伝子は選択的スプライシングのプロセスに従って2つの異なるタンパク質をコードする:完全長CD99又はタイプ1(CD99wt)及びCD99タイプII(CD99sh)と呼ばれる細胞質ドメインが短い短縮型。2つのCD99アイソフォームは細胞特異的に発現し、異なる機能的役割を果たす。CD99は、単量体及びホモ二量体の両方として細胞表面に見られ、CD99の2つの分子が細胞外ドメインを介して相互作用する。これらの二量体は、全長アイソフォームと短縮型アイソフォームとの間でも形成され得る。さらに、相互作用は、異なる細胞の表面に発現するCD99の2つの分子間でも生じる場合がある。
特に関連するのは、本明細書に記載の分子によって認識及び結合されるCD99タンパク質の細胞外ドメインである。CD99の細胞外ドメインのアミノ酸配列及びコード化ヌクレオチド配列(CDS)は、それぞれ配列番号21及び22である。特に、本明細書に記載の分子が向けられているCD99の特定のエピトープの配列は、CD99の細胞外ドメインの50番目~74番目のアミノ酸、すなわち配列番号23を含む。
本発明の第1の態様は、白血病及び骨髄異形成症候群の診断及び/又は治療及び/又はフォローアップに使用するための、CD99ヒトタンパク質CD99を認識して結合することができる少なくとも2つの可変領域を含む抗体複合体であって、前記少なくとも2つの可変領域のそれぞれは、免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン/部分(VL)及び重鎖の可変ドメイン/部分(VH)を含む、前記抗体複合体に関する。換言すると、本発明が参照する抗体複合体は、免疫グロブリンの軽鎖の少なくとも2つの可変領域(VL)及び重鎖の少なくとも2つの可変領域(VH)を含む。
好ましい実施形態によれば、前記抗体複合体は、図14に示すように、前述のように定義され、軽鎖の可変ドメイン/部分(VL)と重鎖の可変ドメイン/部分(VH)を有する2、3、及び4つの可変領域をそれぞれ特徴とする、ダイアボディ(dAbd)すなわち二価scFv、あるいはトリアボディ又はテトラボディである。
好ましい実施形態によれば、前記抗体複合体は、IgGフォーマットの抗体、好ましくはクラス1及び/又は4のIgGである。この場合も、ダイアボディの場合と同様に、IgGは、ヒトタンパク質CD99を認識して結合できる少なくとも2つの可変領域を有し、前記少なくとも2つの可変領域のそれぞれは、軽鎖の可変ドメイン/部分(VL)及び重鎖の可変ドメイン/部分(VH)を含む。
IgG型の場合、明らかにリンカーは存在せず、リンカーは、対照的に、多価scFvに存在し、個々の単量体単位をまとめるように働く。
抗原結合部位では、各VH鎖及びVL鎖は、周知の通り、いわゆるフレームワーク領域が点在するCDR1、CDR2、及びCDR3として定義される3つの超可変領域を含む。CDRは「Complementarity-Determining Region」の略で、CDR3は最も変化しやすい領域である。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記抗体複合体のVH鎖の少なくとも1つは、配列番号1を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。前記抗体複合体の前記少なくとも2つのVH鎖は、好ましくは、それぞれが、配列番号1を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。すなわち、両方のVH鎖は、配列番号1を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。
これに関連して、「含む」(comprise、comprising)は、問題のアミノ酸又はヌクレオチド配列が、同定された配列であるか、又は同定された配列に本質的に対応することも意味する。
前記多価、好ましくは二価(ダイアボディ)、三価(トリアボディ)、又は四価(テトラボディ)のscFvは、好ましくは、配列番号1を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む少なくとも1つのVH鎖を有する。好ましくは、ダイアボディは少なくとも2つのVH鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号1を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。トリアボディは3つのVH鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号1を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。テトラボディは4つのVH鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号1を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。
前記IgG、より好ましくは前記IgG1及び/又は前記IgG4は、好ましくは、配列番号1を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む少なくとも1つのVH鎖を含む。前記IgG、より好ましくは前記IgG1及び/又は前記IgG4は、好ましくは少なくとも2つのVH鎖を含み、各鎖は、それぞれ、配列番号1を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記抗体複合体のVL鎖の少なくとも2つは、配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。前記抗体複合体の前記少なくとも2つのVL鎖は、好ましくは、それぞれが、配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。すなわち、両方のVL鎖は、配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。
前記多価、好ましくは二価(ダイアボディ)、三価(トリアボディ)、又は四価(テトラボディ)のscFvは、好ましくは、配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む少なくとも2つのVL鎖を有する。好ましくは、ダイアボディは少なくとも2つのVL鎖を有し、それぞれが配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。トリアボディは3つのVL鎖を有し、それぞれが配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。テトラボディは4つのVL鎖を有し、それぞれが配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。
前記IgG、より好ましくは前記IgG1及び/又は前記IgG4は、好ましくは、配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む少なくとも1つのVL鎖を含む。前記IgG、より好ましくは前記IgG1及び/又は前記IgG4は、好ましくは少なくとも2つのVL鎖を含み、各鎖は、それぞれ、配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。
前記多価、好ましくは二価(ダイアボディ)、三価(トリアボディ)、又は四価(テトラボディ)のscFvは、好ましくは少なくとも1つのVH鎖及び1つのVL鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号1及び配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。ダイアボディは、好ましくは、少なくとも2つのVH鎖及び2つのVL鎖を有し、各VH鎖及びVL鎖は、それぞれ、配列番号1及び配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。トリアボディは、好ましくは、3つのVH鎖及び3つのVL鎖を有し、各VH鎖及びVL鎖は、それぞれ、配列番号1及び配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。テトラボディは、好ましくは、4つのVH鎖及び4つのVL鎖を有し、各VH鎖及びVL鎖は、それぞれ、配列番号1及び配列番号2を含むアミノ酸配列によって特徴付けられるCDR3を含む。
前記IgG、より好ましくは前記IgG1及び/又は前記IgG4は、好ましくは少なくとも1つのVH鎖及び1つのVL鎖を含み、各VH鎖及びVL鎖は、それぞれ、配列番号1及び配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。前記IgG、より好ましくは前記IgG1及び/又は前記IgG4は、好ましくは少なくとも2つのVH鎖及び少なくとも2つのVL鎖を含み、各VH鎖及びVL鎖は、それぞれ、配列番号1及び配列番号2を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR3を含む。
好ましい実施形態では、上記の抗体変異体、好ましくは前記多価scFv、より好ましくは前記二価(ダイアボディ)及び/又は三価(トリアボディ)及び/又は四価(テトラボディ)のscFv、又は前記IgG、好ましくはIgG1及び/又はIgG4は、配列番号3(CDR1)及び配列番号4(CDR2)を含むアミノ酸配列を特徴とするVH鎖の少なくとも1つのCDR1及び/又はCDR2を含む。前記バリアントのVH鎖の全てのCDR1及び/又はCDR2は、好ましくは、配列番号3(CDR1)及び配列番号4(CDR2)を含むアミノ酸配列を特徴とする。
さらに好ましい実施形態において、上記の抗体バリアント、好ましくは前記多価scFv、より好ましくは前記二価(ダイアボディ)及び/又は三価(トリアボディ)及び/又は四価(テトラボディ)のscFv、又は前記IgG、好ましくはIgG1及び/又はIgG4は、配列番号5(CDR1)及び配列番号6(CDR2)を含むアミノ酸配列を特徴とするVL鎖の少なくとも1つのCDR1及び/又はCDR2を含む。前記バリアントのVL鎖の全てのCDR1及び/又はCDR2は、好ましくは、配列番号5(CDR1)及び配列番号6(CDR2)を含むアミノ酸配列を特徴とする。
本発明の一実施形態によれば、前記抗体複合体のVH鎖及びVL鎖は、それぞれ、配列番号7及び配列番号8を含むアミノ酸配列を有する。前記多価、好ましくは二価(ダイアボディ)、三価(トリアボディ)、又は四価(テトラボディ)のscFvは、好ましくは、配列番号7及び配列番号8を含むアミノ酸配列をそれぞれ特徴とする少なくとも1つのVH鎖及び1つのVL鎖を有する。ダイアボディは、好ましくは、少なくとも2つのVH鎖及び2つのVL鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号7及び配列番号8を含むアミノ酸配列を特徴とする。トリアボディは、好ましくは、3つのVH鎖及び3つのVL鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号7及び配列番号8を含むアミノ酸配列を特徴とする。テトラボディは、好ましくは、4つのVH鎖及び4つのVL鎖を有し、各鎖は、それぞれ、配列番号7及び配列番号8を含むアミノ酸配列を特徴とする。
前記IgG、より好ましくは前記IgG1及び/又は前記IgG4は、好ましくは少なくとも1つのVH鎖及び1つのVL鎖を含み、各VH鎖及びVL鎖は、それぞれ、配列番号7及び配列番号8を含むアミノ酸配列を特徴とする。前記IgG、より好ましくは前記IgG1及び/又は前記IgG4は、好ましくは少なくとも2つのVH鎖及び少なくとも2つのVL鎖を含み、各VH鎖及びVL鎖は、それぞれ、配列番号7及び配列番号8を含むアミノ酸配列を特徴とする。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記IgG4の各重鎖のアミノ酸配列は、配列番号34を含み、及び/又は前記IgG4の各軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号35を含む。前記IgG4は、好ましくは、配列番号34を含むアミノ酸配列を特徴とする2つの重鎖及び/又は配列番号35を含むアミノ酸配列を特徴とする2つの軽鎖を含む。
配列番号34は、配列番号7(すなわち、重鎖の可変部分(VH))及びIgG4の重鎖の定常部分(CH1/ヒンジ/CH2/CH3)を含む。
配列番号35は、配列番号8(すなわち、軽鎖の可変部分(VL))及び軽鎖の定常部分(CL)を含む。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記IgG1の各重鎖のアミノ酸配列は、配列番号38を含み、及び/又は前記IgG1の各軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号39を含む。前記IgG1は、好ましくは、配列番号38を含むアミノ酸配列を特徴とする2つの重鎖及び/又は配列番号39を含むアミノ酸配列を特徴とする2つの軽鎖を含む。
配列番号38は、配列番号7(すなわち、重鎖の可変部分(VH))及びIgG1の重鎖の定常部分(CH1/ヒンジ/CH2/CH3)を含む。
配列番号39は、配列番号8(すなわち、軽鎖の可変部分(VL))及び軽鎖の定常部分(CL)を含む。
本発明の一実施形態によれば、
―VH鎖のCDR3のヌクレオチド配列は、配列番号11を含む、
―VL鎖のCDR3のヌクレオチド配列は、配列番号12を含む、
―VH鎖のCDR1及びCDR2のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号13及び配列番号14を含む、
―VL鎖のCDR1及びCDR2のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号15及び配列番号16を含む、
―VH鎖のヌクレオチド配列は、配列番号17を含む、
―VL鎖のヌクレオチド配列は、配列番号18を含む、
―前記IgG4の重鎖のヌクレオチド配列は、配列番号36を含む、
―前記IgG4の軽鎖のヌクレオチド配列は、配列番号37を含む、
―前記IgG1の重鎖のヌクレオチド配列は、配列番号40を含む、
―前記IgG1の軽鎖のヌクレオチド配列は、配列番号41を含む。
―VH鎖のCDR3のヌクレオチド配列は、配列番号11を含む、
―VL鎖のCDR3のヌクレオチド配列は、配列番号12を含む、
―VH鎖のCDR1及びCDR2のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号13及び配列番号14を含む、
―VL鎖のCDR1及びCDR2のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号15及び配列番号16を含む、
―VH鎖のヌクレオチド配列は、配列番号17を含む、
―VL鎖のヌクレオチド配列は、配列番号18を含む、
―前記IgG4の重鎖のヌクレオチド配列は、配列番号36を含む、
―前記IgG4の軽鎖のヌクレオチド配列は、配列番号37を含む、
―前記IgG1の重鎖のヌクレオチド配列は、配列番号40を含む、
―前記IgG1の軽鎖のヌクレオチド配列は、配列番号41を含む。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記複合体は、CD99の細胞外ドメインに対して向けられた少なくとも2つの可変領域を含み、それらは、好ましくは、配列番号21のアミノ酸配列に対して向けられている。これに関連して、「対して向けられた」とは、言及される抗体複合体が、好ましくは上記のように、CD99の細胞外ドメイン、すなわち配列番号21を認識及び結合することができることを意味する。これはいわゆるエピトープであり、好ましくはCD99の細胞外画分の50番目~74番目のアミノ酸の配列、すなわち配列番号23を含む。
好ましい実施形態によれば、多価scFv分子の全てのscFvユニット、より好ましくは二価(ダイアボディ)及び/又は三価(トリアボディ)及び/又は四価(テトラボディ)のscFvは、配列番号10を含むアミノ酸配列を有する。灰色でマークされた配列はリンカーであり、いくつかの実施形態では、2回以上繰り返されてもよい。多価scFv分子の全てのscFvユニットのヌクレオチド配列は、配列番号20を含む。
多価scFv分子の各断片scFvは、上記のように、軽鎖の可変部分(VL)及び重鎖の可変部分(VH)を含む。各scFvのVH鎖及びVL鎖は、そのアミノ酸配列が配列番号9の少なくとも1つのコピー(配列番号10の灰色の部分)、好ましくは1つのコピーを含むリンカーによって互いに結合される。
前記リンカーのヌクレオチド配列は、遺伝子コードの変性の結果として、配列番号19の少なくとも1つのコピー又はそれに由来するヌクレオチド配列、好ましくは1つ、2つ、又は3つのユニットを含む。
本発明の第2の態様は、上記で詳述した抗体複合体を含む組成物、好ましくは前記多価、より好ましくは二価(ダイアボディ)、三価(トリアボディ)、若しくは四価(テトラボディ)のscFv、又はIgG抗体形態、好ましくはクラスIgG1及び/又はIgG4を含む組成物に関する。
前記組成物は、好ましくは、アジュバント、送達剤、緩衝剤、塩、抗酸化剤、保存剤、界面活性剤、ポリオール、二糖、多糖、アミノ酸、及びそれらの組み合わせから選択される、薬理学的に許容される担体をさらに含み得る。
薬理学的に許容される担体は、通常使用される投与量及び濃度でそれらを投与される人にとって無毒である。緩衝剤は、好ましくは、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、他の有機酸、及びそれらの組み合わせの中から選択される。抗酸化剤は、好ましくは、アスコルビン酸及びメチオニンから選択される。塩は、好ましくは、塩化ナトリウムから選択される。保存剤は、好ましくは、以下から選択される:オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール。界面活性剤は、好ましくは、ポリソルベート80(Tween(登録商標)80)、ポリソルベート20(Tween(登録商標)20)、ポロキサマー188、及びそれらの組み合わせから選択される。ポリオールは、好ましくは、マンニトール及びソルビトールから選択され、二糖及び多糖は、好ましくは、スクロース、トレハロース、デキストラン、デキストラン40、及びそれらの組み合わせから選択される。アミノ酸は、好ましくは、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、リジン、グルタミン、アスパラギン、及びそれらの組み合わせから選択される。タンパク質は、好ましくは、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン、及びそれらの組み合わせから選択される。親水性ポリマーは、好ましくは、ポリビニルピロリドン及び/又はポリエチレングリコール(PEG)から選択される。キレート剤は好ましくはEDTAである。金属錯体は、好ましくは、亜鉛タンパク質複合体である。
本明細書によれば、上記の抗体バリアント及び上記の組成物は、白血病および骨髄異形成症候群の診断の目的で、及び/又は治療及び/又はフォローアップにおいて効果的に使用することができる。
実際、上記の抗体形態は、白血病及び骨髄異形成症候群に対する治療可能性を示している。上記で一部検討したように、CD99の同じエピトープに対して向けられた一価のscFv分子はそのような可能性を示さなかったので、これは驚くべきことであった。このエピトープの認識の少なくとも2つの部位が抗体複合体上に存在する場合にのみ、本明細書に記載及び特許請求される治療上の利点が観察され得る。前記多価、より好ましくは二価(ダイアボディ)、三価(トリアボディ)、若しくは四価(テトラボディ)のscFv、又はIgG抗体形態、好ましくはクラスIgG1及び/又はIgG4が、特に効果的である。本明細書に記載の目的のために最もよく機能する分子は、ダイアボディ及び/又はIgG1及び/又はIgG4、好ましくは、エピトープを認識して結合するより大きな能力、並びに改善された生物学的/治療作用(とりわけ、CD99を発現する白血病細胞、すなわちCD99陽性(+)細胞の死を特異的に誘導する能力による)を示すIgG4である。
実際、実験の部分で詳細に示されているように、IgG抗体は、いくつかの治療用途でかなりの利点を示す。すなわち、(i)前記抗体は、単量体及びダイアボディscFvよりもCD99に対して高い親和性を示す、(ii)特に、クラスIgG4は、scFvよりもゆうに2桁低い解離定数(Kd)を示す、(iii)前記抗体はscFv断片よりも優れた薬物動態を有する、(iv)前記抗体はscFvよりも長い半減期を有し、7日~21日の範囲内である、(v)前記抗体は、抗体依存性細胞傷害、抗体依存性細胞食作用、補体依存性細胞傷害などのエフェクター機能を有し、特定の治療用途に有用である。
本発明が参照する白血病は、好ましくは、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、及び骨髄異形成症候群(MDS)から選択される。急性白血病が特に好ましく、より好ましくはALL、又はAMLである。
さらに、IgG抗体形態、好ましくはクラスIgG1及びIgG4は、白血病以外のタイプの腫瘍に対して、すなわち、CD99を発現する固形腫瘍に対しても治療効果を示した。
したがって、本発明のさらなる態様は、CD99に関連する病状の治療法及び/又はフォローアップのための、好ましくは発現の変化、好ましくはCD99の過剰発現によって引き起こされるか又は関連する病状における、IgG抗体形態及びその誘導体、好ましくは上記で詳述されるクラスIgG1及びIgG4に関する。前記病状は、好ましくは、ユーイング肉腫及び軟部組織肉腫(滑膜肉腫、間葉性軟骨肉腫、及び横紋筋肉腫)、消化器癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、精巣癌、卵巣癌、神経内分泌腫瘍、黒色腫、悪性神経膠腫及び星状細胞腫、リンパ腫、白血病、及び骨髄異形成症候群を含む、固形腫瘍及び血液癌並びに肉腫である。
本明細書に記載のIgG抗体形態の誘導体は、そのIgG抗体形態に由来する断片であり、前記断片は、好ましくは、F(ab’)2、断片F(ab)、VH、VHH、VL、VLL、及びそれらの組み合わせから選択される。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記IgG4の各重鎖のアミノ酸配列は、配列番号34を含み、及び/又は前記IgG4の各軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号35を含む。前記IgG4は、好ましくは、配列番号34を含むアミノ酸配列を特徴とする2つの重鎖及び/又は配列番号35を含むアミノ酸配列を特徴とする2つの軽鎖を含む。
配列番号34は、配列番号7(すなわち、重鎖の可変部分(VH))及びIgG4の重鎖の定常部分(CH1/ヒンジ/CH3)を含む。
配列番号35は、配列番号8(すなわち、軽鎖の可変部分(VL))及び軽鎖の定常部分(CL)を含む。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記IgG1の各重鎖のアミノ酸配列は、配列番号38を含み、及び/又は前記IgG1の各軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号39を含む。前記IgG1は、好ましくは、配列番号38を含むアミノ酸配列を特徴とする2つの重鎖及び/又は配列番号39を含むアミノ酸配列を特徴とする2つの軽鎖を含む。
配列番号38は、配列番号7(すなわち、重鎖の可変部分(VH))及びIgG1の重鎖の定常部分(CH1/ヒンジ/CH2/CH3)を含む。
配列番号39は、配列番号8(すなわち、軽鎖の可変部分(VL))及び軽鎖の定常部分(CL)を含む。
本発明の対象はまた、例えば、遺伝暗号の変性の結果として、表Iに示されるヌクレオチド配列に由来する全てのヌクレオチド配列に関する。
本発明の配列は、国際標準WIPO ST.25に従って注釈が付けられ、その記載は、Patent-In3.5プログラムで開発された。配列の記載を本明細書に追加する。
表I及び本出願に添付された配列の記載において同定された配列は、本発明に含まれる。表Iに含まれる配列と80~99.9%の範囲内の同一性を有する全ての配列は、本明細書に含まれると見なされる。
以下の表Iは、全てのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列並びに対応する「配列識別子(Sequence Identifier)」を示す。
下線付きのアミノ酸は、最も変動しやすいアミノ酸である。
本発明のさらなる態様において、上記の抗体複合体又は組成物は、個別に、又は他の従来の治療法と組み合わせて、すなわち他の化学療法剤及び/又は手術及び/又は免疫療法及び/又は放射線療法及び/又は標的療法と組み合わせて使用される。
組み合わせて使用し得る化学療法剤は、シタラビン(cytarabine)、ダウノルビシン(daunorubicin)、イダルビシン(idarubicin)、アザシチジン(azacytidine)、デシタビン(decitabine)、ドキソルビシン(doxorubicin)、及びそれらの組み合わせから選択される。組み合わせて使用できる標的薬は、プロテインキナーゼ及びチロシンキナーゼ阻害剤、ミドスタウリン(midostaurin)及びイマチニブ(imatinib)を含むFLT3阻害剤、エナシデニブ(enasidenib)及び他のエピジェネティック薬を含む酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-1又は2(IDH2)の阻害剤、Bcl-2阻害剤から選択される。組み合わせて使用し得る抗体及び免疫療法剤は、CD33、CD44、CD37、CD123、免疫複合体(ADC)、BiTe、DART、CAR-T細胞、TCR-T細胞、免疫チェックポイント阻害剤、及びワクチンに対する抗体から選択される。
本発明のさらなる局面において、前記抗体複合体又は組成物は、腫瘍細胞、好ましくは白血病細胞、好ましくはCD99を過剰発現する白血病細胞を他のタイプの腫瘍又は正常細胞から同定及び区別するために診断目的で使用される。より好ましくは、腫瘍細胞の分類(タイピング)は、CD99のメッセンジャーRNA発現を決定するために、細胞蛍光測定又は免疫組織化学的研究によって、又は免疫蛍光法及び分子生物学によって行われる。
本発明の特定の実施形態によれば、前記抗体複合体または組成物を使用して、以下を腫瘍細胞、好ましくはCD99を発現する白血病細胞に送達する:カリケアマイシンクラスの薬剤、DM1などの微小管阻害剤を含む、好ましくは抗腫瘍作用を有する細胞毒性化合物、モノメチルアウリスタチンE(monomethyl auristatin E、MMAE)などの有糸分裂阻害剤など。
実際、本発明の抗体複合体は、細胞毒性化合物、例えば、金属、微生物又は植物起源の毒素、放射性同位元素、酵素、及びその目的のために通常使用される化合物と結合させてもよい。
前記抗体複合体、好ましくは前記多価、より好ましくは二価(ダイアボディ)、三価(トリアボディ)、若しくは四価(テトラボディ)のscFv、又はIgG抗体形態、好ましくはクラスIgG1及び/又はIgG4を、好ましくは、PEGを添加して修飾して、前記抗体複合体を投与される人の血流中の保持時間を増加させてもよい。
あるいは、例えば、画像化技術で検出可能なマーカー/トレーサーと結合させてもよい。あるいは、固体培地上に固定化し、及び/又は異種化合物と結合させてもよい。
本発明の一実施形態によれば、上記で詳述された抗体複合体は、1又は複数のさらなる抗原、好ましくは癌に対する治療の標的として公知の抗原に対して二重特異性又は多重特異性反応性であり得る。
本発明の好ましい実施形態によれば、上記で詳述された抗体複合体はまた、CD99を発現する腫瘍細胞に対して向けられたキメラ抗原受容体(CAR-T細胞)を有するTリンパ球の産生において使用され得る。
本発明はまた、上記で詳述した抗体複合体を含むヒトタンパク質CD99、特にCD99の細胞外ドメイン、好ましくは50番目~74番目であるエピトープを認識するための免疫診断キットであって、好ましくは前記多価、より好ましくは二価(ダイアボディ)、三価(トリアボディ)、若しくは四価(テトラボディ)のscFv、又はIgG抗体形態、好ましくはクラスIgG1及び/又はIgG4を含む、前記免疫診断キットに関する。
前記免疫診断キットは、好ましくは腫瘍診断に、好ましくはCD99の発現、好ましくはCD99の過剰発現を特徴とする病状を診断するために使用され、前記病状は好ましくは、白血病、骨髄異形成症候群、及びCD99を発現する固形腫瘍、好ましくはユーイング肉腫及び軟部組織肉腫(滑膜肉腫、間葉性軟骨肉腫、及び横紋筋肉腫)を含む肉腫、消化器癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部癌、腎臓癌、精巣癌、卵巣癌、神経内分泌腫瘍、黒色腫、悪性神経膠腫、星状細胞腫、及びリンパ腫から選択される。
前記キットには、診断手順を実施するための使い捨て滅菌材料も含まれる。
本発明のさらなる態様は、タンパク質CD99を発現する白血病、特にタンパク質CD99を過剰発現する形態の白血病の予防及び/又は治療及び/又はフォローアップのための方法に関する。
前記方法は、白血病の鑑別診断又はCD99を発現する白血病の治療を必要とする患者に、本発明の抗体複合体及び/又は前記複合体を含む組成物又は本発明の抗CD99抗体の少なくとも1つの治療有効量を投与する工程を含む。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、所望の治療結果を得るのに充分であるか、又は望ましくない症状に影響を与えるのに充分であるが、通常有害な副作用を引き起こすには不充分である量を指す。
投与は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下、又は坐薬投与であり得る。
C7dAbd
C7ダイアボディ(C7dAbd)は、scFv C7の二量体誘導体であり、scFvC7の重鎖の可変領域(VH)と軽鎖の可変領域(VL)との間のリンカーの長さが15個から5個のアミノ酸に短縮されていることを特徴とする。ヒト接着分子CD99の細胞外ドメインに特異的なscFvC7は、国際公開第2011/058517号特許出願に記載されているように、パニング用のCD99抗原を使用してヒト合成ファージ抗体ライブラリーから単離された。
C7ダイアボディ(C7dAbd)は、scFv C7の二量体誘導体であり、scFvC7の重鎖の可変領域(VH)と軽鎖の可変領域(VL)との間のリンカーの長さが15個から5個のアミノ酸に短縮されていることを特徴とする。ヒト接着分子CD99の細胞外ドメインに特異的なscFvC7は、国際公開第2011/058517号特許出願に記載されているように、パニング用のCD99抗原を使用してヒト合成ファージ抗体ライブラリーから単離された。
CD99抗原に対するC7dAbd及びC7IgGの親和性の評価
CD99抗原の細胞外ドメインに対するscFv、dAbd、IgG4、及びIgG1フォーマットにおけるC7の親和性は、Rath S et al. 1988に記載されているELISA法を若干変更し、CD99ecd/GST抗原を標的として使用して評価した。
CD99抗原の細胞外ドメインに対するscFv、dAbd、IgG4、及びIgG1フォーマットにおけるC7の親和性は、Rath S et al. 1988に記載されているELISA法を若干変更し、CD99ecd/GST抗原を標的として使用して評価した。
結果を表IIに示す。scFv及びダイアボディ間で類似した解離定数(kd)として表される見かけの親和性を示しているが、C7IgG4の親和性は驚くほど高く、IgG1の親和性は代わりに低くなっている。この場合、IgG4バリアントは、元のscFvC7よりもゆうに2桁低い解離定数(Kd)を示す。これは、C7IgG1の場合のように、scFv断片をIgGに変換した後の親和性の喪失、又はIgGバリアントがそれらが由来するscFvと同じ親和性を維持することが報告されていることから、驚くべきことである。
白血病腫瘍細胞に対する反応性の評価
scFvC7(すなわち、単量体scFv)は、国際公開第2011/058517号特許出願に記載されているように、CD99を発現する細胞に対するその特異性を特徴とした。これらの研究の結果は、scFvC7がユーイング肉腫の細胞及び組織に特異的に結合できることを示しているが、これらの研究によれば、CD99を発現する他の種類の腫瘍細胞では反応性を示していない。
scFvC7(すなわち、単量体scFv)は、国際公開第2011/058517号特許出願に記載されているように、CD99を発現する細胞に対するその特異性を特徴とした。これらの研究の結果は、scFvC7がユーイング肉腫の細胞及び組織に特異的に結合できることを示しているが、これらの研究によれば、CD99を発現する他の種類の腫瘍細胞では反応性を示していない。
予想外に、急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)の細胞株のパネルの細胞蛍光分析では、scFvC7と同様のCD99に対する親和性を有するダイアボディフォーマットの同じC7抗体が、scFvとの結合に対して陰性であったものを含む試験した9/9細胞株で反応性を示した(図1A~図1L)。
蛍光強度レベル(平均蛍光強度、MFI)は、試験した細胞株によって異なる。
scFvC7及びC7dAbdが同じVH及びVL配列を共有し、CD99に対して同様の親和性を示すことを考慮すると、これは予想外の結果である。
同様の結果が蛍光顕微鏡分析でも得られ、C7dAbは分析したT-ALLのすべての細胞株と反応することが示された(図2)。
次に、白血病細胞に対するC7dAbdの反応性の細胞蛍光分析を、急性骨髄性白血病(AML)の細胞株まで広げた。この場合も、細胞はC7ダイアボディとの結合に高い陽性であることが示された(図3)。
CD99を発現する白血病細胞に対するscFvフォーマットのC7とダイアボディフォーマットのC7との間の異なる特異性のさらなる確認として、T-ALLのMOLT-16細胞株とAMLのTHP-1細胞株を、scFvC7に対する反応性について細胞蛍光測定で試験した。両方の細胞株は、C7dAbdとの結合に対して高い陽性を示し(図1G及び図3A)、同じ使用濃度でのscFvとの結合に対して完全に陰性であることが実証された(図4)。
白血病細胞に対するscFvとダイアボディとの異なる特異性は、おそらく抗原に対する異なる親和性によって決定されるのではなく、2つの分子の異なる物理化学的及び構造的特徴に結びつく可能性がある。ScFvはダイアボディ(50kDa)よりもサイズが小さく(25kDa)、抗原結合部位が1つしかないため、ユーイング肉腫細胞でより到達可能なCD99エピトープを認識でき、白血病細胞ではマスクされるか、ユーイング肉腫及び白血病でCD99の立体構造が異なる可能性がある。
関連する抗体との結合によって誘導される細胞応答、特に細胞死を調査する目的で、アネキシンV及びヨウ化プロピジウムを用いて細胞蛍光測定を実施した。T-ALLの7細胞株のパネルを、様々な濃度のC7dAbdで処理した。図5に示す結果は、分析した全ての細胞が、強度のレベルは異なるものの、C7dAbによって誘導される細胞死の影響を受けやすいことを示している。
別の一連の実験では、高い陽性を示すが、C7dAbdとの結合(それぞれ図1F及び図1B)及び細胞死の誘導(図5)に対して低い陽性を示すALL-SILL及びCCRF-CEMの2つのT-ALL細胞株、並びにC7dAbdとの結合に高い陽性を示すAMLのTHP-1細胞株(図3)を、異なるインキュベーション時間で100μg/mLの固定濃度のC7dAbdで処理した。この場合も、テストしたすべての細胞株が抗体による処理の影響を受けやすく、1時間のインキュベーション後にすでに明らかであり、2時間後に最大に達した有効性が示された(図6)。ALL-SILL細胞株、特にAMLのTHP-1株は、C7dAbdによって誘導される細胞死に非常に感受性が高いことが確認された。
C7IgG
scFvなどの抗体断片は、血流中の半減期が数時間であることを特徴とするのに対し、IgG抗体の半減期は7日~21日である。IgGフォーマットの抗体は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、補体依存性細胞傷害(CDC)などのエフェクター機能も示し、これらは、恒常的な断片(Fc)の存在及びFcの様々な受容体との結合に依存し、特定の治療用途に役立ち得る(Kellner C 2017)。
scFvなどの抗体断片は、血流中の半減期が数時間であることを特徴とするのに対し、IgG抗体の半減期は7日~21日である。IgGフォーマットの抗体は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、補体依存性細胞傷害(CDC)などのエフェクター機能も示し、これらは、恒常的な断片(Fc)の存在及びFcの様々な受容体との結合に依存し、特定の治療用途に役立ち得る(Kellner C 2017)。
scFv C7の2つのIgG誘導体を作成した。1つ目はサブクラスIgG4に属し、2つ目はサブクラスIgG1に属する。
C7IgG4は、scFvC7の軽鎖の可変領域(VL)の配列をヒトIgG4軽鎖の定常領域の配列に融合し、scFvC7の重鎖の可変領域(VH)の配列をヒトIgG4重鎖の定常領域の配列に融合することによって生成された。
IgG1は同じ方法で生成されたが、scFvC7のVL領域及びVH領域をヒトIgG1のそれぞれの定常配列に融合することによって生成された。
表IIに示すように、C7の2つのIgG誘導体を試験して、組換えCD99に対する親和性を評価した。それらの見かけの親和性は、IgG4変異体では驚くほど高く、IgG1では低いことが示された。
上記文献は、scFv断片のIgGへの変換後の親和性の喪失、又はIgGバリアントがそれらが由来するscFvと同じ親和性を維持することを実証しているが、本明細書に記載の試験されたIgG4変異体は、解離定数(Kd)が元のscFvC7よりもゆうに2桁低くなっている。次に、C7-IgG4及びC7-IgG1を、細胞蛍光測定アッセイによってT-ALL細胞及びAML細胞に対する反応性について分析した。
得られた結果は、ダイアボディフォーマットのC7の結果と類似している。この場合も、実際、IgG1、特にIgG4は白血病細胞で高い反応性を示した(図7及び図8)。C7IgG4に関しては、T-ALL ALL-SIL、AML THP-1、及びMV4-11の細胞内の反応性は、検討した最低濃度の6.25μg/mLまで高レベルのままである。
したがって、細胞蛍光測定アッセイは、T-ALL及びAMLの細胞株のパネルにおける細胞死の誘導を評価することによってC7IgG4の治療効果を分析するために、アネキシンV及びヨウ化プロピジウムを用いて実施した。細胞を50μg/mLの固定濃度で異なるインキュベーション時間でC7IgG4により処理した。図9に示す結果は、分析したすべての細胞がC7IgG4によって誘導される細胞死の影響を受けやすく、1時間のインキュベーション後にすでに明らかな有効性を示しているが、強度のレベルは異なっている。
同様に、IgG1は、様々な抗体濃度で1時間処理した後、AML THP-1細胞及びT-ALL CCRF-CEM細胞の死滅を誘導することができる(図10)。特に、dAbd、IgG4、及びIgG1結合に対してより反応性の高いTHP-1細胞は、治療に対して特に感受性が高いのに対し、CCRF-CEM細胞はより耐性がある。
C7IgG4S228P
IgG4分子のS228Pへの変異(EUナンバリングシステムによる)により安定化し、通常観察されるFabアーム交換を防ぐ。このために、C7IgG4の変異バージョンを作成した。この変異はヒンジ領域の228位(EUナンバリングシステム)にあり、安定化されている。
IgG4分子のS228Pへの変異(EUナンバリングシステムによる)により安定化し、通常観察されるFabアーム交換を防ぐ。このために、C7IgG4の変異バージョンを作成した。この変異はヒンジ領域の228位(EUナンバリングシステム)にあり、安定化されている。
C7IgG4の前記変異バージョンの重鎖は、以下の配列番号42のアミノ酸配列を有する:
EVQLVESGGGLVRPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSHKRFDYWGQGTLVTVSRASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK。
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前記変異は、ナイーブなセリン(S)をプロリン(P)で置換したことにある。
前記変異体は、ウエスタンブロット分析によって特徴付けられた。
精製した各C7IgG4、C7IgG4S228P、及びC7IgG1抗体の5μgを非還元条件下で10%SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。測定は、抗C7ポリクローナル抗体を使用して行い、次に抗ウサギHRPコンジュゲートを使用して行った。図15において、半分にした抗体のバンドを円で強調表示している。写真から、S228P変異を組み込むと、C7IgG4(円で強調表示)の半分の抗体の形成が無効になり、変異によって誘導された安定化が確認される。
C7ダイアボディ及びC7IgGの内部移行に関する研究
C7dAbdが細胞表面のCD99に結合した後に内部移行できるかどうかを評価するために、共焦点顕微鏡法によって研究を行った。実験はT-ALL細胞及びAML細胞で実施し、C7dAbdが細胞に浸透する能力を示している(図11)。特に、動態及び内部移行の速度は、C7dAbdによって誘導される細胞死の動態及び細胞死率を反映している(図6)。C7dAbdで処理した後、迅速かつ大規模に死滅するTHP-1細胞では、シグナルは30分後にすでに完全に内部にあるが、CCRF-CEM細胞では、動態が遅く、細胞死率が低く、シグナルは、1時間のインキュベーション後に一部の細胞内に見られる。この結果は、抗体の作用機序を理解するのに役立ち、抗体ー薬物複合体(ADC)の場合のように、抗体の内部移行を必要とする用途でC7dAbdを使用することもできる。
C7dAbdが細胞表面のCD99に結合した後に内部移行できるかどうかを評価するために、共焦点顕微鏡法によって研究を行った。実験はT-ALL細胞及びAML細胞で実施し、C7dAbdが細胞に浸透する能力を示している(図11)。特に、動態及び内部移行の速度は、C7dAbdによって誘導される細胞死の動態及び細胞死率を反映している(図6)。C7dAbdで処理した後、迅速かつ大規模に死滅するTHP-1細胞では、シグナルは30分後にすでに完全に内部にあるが、CCRF-CEM細胞では、動態が遅く、細胞死率が低く、シグナルは、1時間のインキュベーション後に一部の細胞内に見られる。この結果は、抗体の作用機序を理解するのに役立ち、抗体ー薬物複合体(ADC)の場合のように、抗体の内部移行を必要とする用途でC7dAbdを使用することもできる。
C7dAbdダイアボディ及びその内部移行は、FLT3-ITD変異を特徴とする白血病細胞株MOLM13でも検証された。図16のマージパネルは、フィールドに表示されているセル全体がC7dAbdダイアボディをどのように内部移行したかを示している。図17の写真に示すように、同じMOLM13細胞株がIgG4を内部移行する能力は、共焦点分析によって実証された。
エクス・ビボテスト
脊髄細胞を患者から入手し、C7dAbd-FITC(50μg/mL)又はC7IgG4S228P-FITC(25μg/mL)と反応させた。処理後、細胞蛍光分析を行った。
脊髄細胞を患者から入手し、C7dAbd-FITC(50μg/mL)又はC7IgG4S228P-FITC(25μg/mL)と反応させた。処理後、細胞蛍光分析を行った。
図18は、ALL患者の細胞で得られた結果を示している。前記細胞は、MFI(平均蛍光強度)を示すパネル(A)のグラフに示されるように、IgG4に対してより高い結合親和性で、本発明によるダイアボディ及びIgG4(S228P)に結合する。パネル(B)に示すように、結合割合(%)はダイアボディ及びIgG4の両方でほぼ合計である。結合とそれに続く内部移行の結果として、4時間のインキュベーションで、アネキシンV及びPI陰性と評価された生細胞の割合は、ダイアボディの存在下では最小であり、いずれの場合もパネル(C)ではIgG4の存在下では10%未満である。
ダイアボディ及びIgG4がALL患者の脊髄からの細胞にアポトーシス促進効果を発揮することの確認として、図19の写真に例示されている共焦点分析は、ほぼ完全な内部移行を示している。
図20は、FLT3-ITD変異を有するAML患者の細胞で得られた結果を示している。これらの細胞もまた、MFI(平均蛍光強度)を示すパネル(A)のグラフに示されるように、IgG4に対してより高い結合親和性で、本発明によるダイアボディ及びIgG4(S228P)に結合する。パネル(B)に示すように、結合割合(%)はダイアボディ及びIgG4の両方でほぼ合計である。結合とそれに続く内部移行の結果として、4時間のインキュベーションで、アネキシンV及びPI陰性と評価された生細胞の割合は、ダイアボディの存在下では約12%であり、パネル(C)ではIgG4の存在下では40%に達する。
割合(%)は、白血病細胞においてのみ結合及びアポトーシス誘導における本発明による抗体の特異性を示す。
AML患者の細胞でも、ダイアボディ及びIgG4の内部移行はほぼ完了している(データは示さず)。
次に、同じAML患者の骨髄からCD34+細胞を単離した。同じ細胞をダイアボディと共に2時間インキュベートし、次に細胞蛍光分析を行った。ダイアボディの蛍光マーキングは、CD34+細胞の約40%が蛍光性であることを示している。アネキシンV+PIアッセイにより、同等の割合の細胞がアポトーシスを起こすことが示された(図21)。共焦点分析は、この状況でも陽性細胞がダイアボディを内部移行することを示している(図21A)。結果は、混合細胞集団において、本発明によるダイアボディが、白血病細胞である可能性が高い細胞の40%のみに結合することができ、同様の割合(%)で死滅させることができることを示している点で特に重要である。
CD34+細胞をIgG4(S228P)に曝露してアッセイを繰り返し、同様の結果が得られた(図22A、図22B、図22C)。
次に、同じCD34+細胞を健康なドナーの骨髄から取得し、AML患者のCD34+細胞で実施したのと同様に、細胞をIgG4と共に2時間インキュベートした。結果を図23に示す。これらは、弱い結合能力を示している(共焦点顕微鏡(図23C)及び細胞蛍光測定(図23A))。弱い結合能力は、ほぼゼロであるアポトーシス(図23B)の誘導に関連している。
最後に、ダイアボディ及びC7IgG4S228Pを、健康なドナーからの末梢血細胞で試験した。図24に示す細胞蛍光分析の結果は、細胞が弱いながらも、とりわけリンパ球の集団に対して結合親和性を持っていることを示しているが、これはアポトーシスを誘導する能力とは関連していない(図25)。
IgG4(wt)及びIgG4(S228P)の比較
アネキシンV+PIアッセイを用いてMOLM13 AML細胞で評価した、CD99に対する反応性、内部移行及びアポトーシス誘導の能力を図26に示す。得られたデータは、C7IgG4(wt)及びC7IgG4(S228P)が同様の親和性でCD99を認識し、両方ともAML MOLM-13細胞に十分に内部移行され、AML細胞死を同程度に誘導できることを示している。
アネキシンV+PIアッセイを用いてMOLM13 AML細胞で評価した、CD99に対する反応性、内部移行及びアポトーシス誘導の能力を図26に示す。得られたデータは、C7IgG4(wt)及びC7IgG4(S228P)が同様の親和性でCD99を認識し、両方ともAML MOLM-13細胞に十分に内部移行され、AML細胞死を同程度に誘導できることを示している。
C7dAbdの前臨床安全性の評価に関連する種の選択
新しい生物療法剤を開発する過程で、その安全性を確立することを目的とした前臨床研究の設計において、関連する種の選択は基本的に重要である。「バイオテクノロジー由来医薬品の前臨床安全性評価に関するガイダンスに関するCHMPノート(CHMP Note for guidance on Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals)(ICH S6)(CHMP/ICH/302/95)」に記載されているように、関連する種は、モノクローナル抗体の場合は受容体又はエピトープの発現により試験物質が薬理学的に活性である種である。
新しい生物療法剤を開発する過程で、その安全性を確立することを目的とした前臨床研究の設計において、関連する種の選択は基本的に重要である。「バイオテクノロジー由来医薬品の前臨床安全性評価に関するガイダンスに関するCHMPノート(CHMP Note for guidance on Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals)(ICH S6)(CHMP/ICH/302/95)」に記載されているように、関連する種は、モノクローナル抗体の場合は受容体又はエピトープの発現により試験物質が薬理学的に活性である種である。
接着分子CD99は、高度にグリコシル化され、小さく(ヒトでは32kDa)、MIC2遺伝子によってコードされるI型膜貫通タンパク質であり、公知のタンパク質ファミリーには属していない。CD99は特有の構造を有しており、共通の祖先遺伝子に由来する可能性のあるCD99(CD99L2)と同様のパラログを除いて、ヒトゲノムの他の分子とはいずれも関係がない。MIC2遺伝子は、性染色体の偽常染色体領域X(Xp22.33-Xpter)及びY(Yp11-Ypter)にある。この遺伝子の長さは50kbで、10個の小さなエクソンが含まれている。cDNA又はシングルエクソンプローブを用いたクロスハイブリダイゼーション実験によるCD99ホモログの検索は、霊長類でのみ成功しており、進化の過程でこの遺伝子が高レベルで分岐していることを示している。ヒトでは、MIC2遺伝子は、選択的スプライシングプロセスに従って2つの異なるタンパク質をコードする:完全長又は1型CD99(CD99wt)及び細胞質ドメインが短いCD99 II型(CD99sh)の短縮型。両方のアイソフォームは霊長類に保存されている。4番染色体のC7-D1領域に位置するD4遺伝子は、ヒトCD99のマウスオルソログとして同定された。ゲノム構成の分析により、遺伝子には10個の推定エクソンが含まれているのに対し、cDNAはヒトCD99と46%の同一性を有するタンパク質をコードする9個のエクソンからなることが明らかになった。齧歯類のCD99の分子は、ヒトCD99タイプIIアイソフォームに見られるように、短い細胞質ドメインを有する。マウスCD99は、ヒトCD99と同様の生化学的特性、機能的相同性、及び発現モデルを示す。
C7dAbdの前臨床研究に最も関連する種を特定する目的で、科学文献からのデータ及び公開配列データベース内の標的抗原の相同性の分析だけでなく、3つの異なる種(2つの霊長類と1つの齧歯類)の標的エピトープの認識に関する実験データも考慮した。
C7dAbdの非臨床試験に関連する種を見出すことを目的として、異なる種にわたるCD99配列及びscFvC7エピトープの相同性を分析した。最後に、C7dAbd結合親和性の分析のために選択された種の細胞外ドメインCD99をクローン化し、精製した。
異なる種におけるCD99の配列相同性
NCBIのBLASTプログラムを使用して、ヒトCD99と異なる種のCD99との間の相同性を研究した(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。分析は、モノクローナル抗体及びマウスCD99の相同性に関する前臨床研究で広く使用されている非ヒト霊長類(NHP)の2種である、カニクイザル(Macaca fascicularis)及びアフリカミドリザル(Chlorocebus aethiops)に焦点を当てた。配列アラインメント(表III及び図12)は、ヒトCD99が分析された種の相同体と55~93%の相同性を共有し、霊長類のタンパク質の最高値(92~93%)を共有することを示した。また、エピトープの全領域は霊長類ではよく保存されているが、マウスでは保存されていない(図12B)。
NCBIのBLASTプログラムを使用して、ヒトCD99と異なる種のCD99との間の相同性を研究した(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。分析は、モノクローナル抗体及びマウスCD99の相同性に関する前臨床研究で広く使用されている非ヒト霊長類(NHP)の2種である、カニクイザル(Macaca fascicularis)及びアフリカミドリザル(Chlorocebus aethiops)に焦点を当てた。配列アラインメント(表III及び図12)は、ヒトCD99が分析された種の相同体と55~93%の相同性を共有し、霊長類のタンパク質の最高値(92~93%)を共有することを示した。また、エピトープの全領域は霊長類ではよく保存されているが、マウスでは保存されていない(図12B)。
分析した種のCD99に関するC7dAbdの交差反応性及び結合力を決定する際に、カニクイザル、アフリカミドリザル、マウスCD99の細胞外ドメインを、それぞれの遺伝子及び大腸菌で発現した組換えタンパク質からクローニングして精製した。精製後、C7dAbdの反応性を評価するために、ELISAアッセイでタンパク質を標的抗原として使用した。結果を図13に示す。これらは、抗体が分析した3種全てのCD99と反応できるが、親和性が異なることを示している。特に、C7dAbdは、マウスCD99で観察されたものよりもはるかに高い、非常に類似した親和性でヒトCD99及び2つの霊長類のCD99を認識する。
結論として、C7dAbdの交差反応性、配列相同性、及び入手可能な情報で得られた結果は、カニクイザルやアフリカミドリザルなどのNHPは、C7dAbdの安全性を前臨床で決定するための最も適切な種と見なし得ることを強く示唆している。
C7dAbd、C7IgG4、及びC7IgG1の遺伝子構築物の調製
C7dAbd。C7dAbdの遺伝子構築物は、scFv C7の遺伝子構築物から始めて、VHとVLとの間のリンカーの長さを15個から5個のアミノ酸に短縮することによって作成した。クローニングに使用したプライマーを表Iに示す。最初のPCR工程では、scFvC7のVH配列を、配列番号24及び配列番号25のプライマー対を使用して増幅し、増幅産物の5’末端に酵素NcoIの切断部位を導入した。一方、VL配列はプライマー対の配列番号26及び配列番号27で増幅され(NcoI、NdeI、及びEcoRI制限部位はイタリック体、終止コドンは下線付き)、後者は終止コドンとそれに続く酵素EcoRIの切断部位を含む。配列番号25及び配列番号26のプライマーは、VHとVLとの間のリンカーを構成する5つの残基に対応する相互に重複する領域を含む。このようにして、増幅されたVH配列及びVL配列は、この重複領域を含み、PCR反応で拡張され得る。増幅されたVH配列及びVL配列をテンプレートとして使用し、配列番号24及び配列番号27のプライマー(増幅用)を使用して2回目のPCRで結合した。増幅産物を、pET22b(+)ベクター(Merck Millipore社)と共に、NcoI酵素及びEcoRI酵素(New England Biolabs社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ)と共に37℃で3時間消化した。消化産物を精製し、T4 DNAリガーゼ(Promega社、米国ウィスコンシン州マディソン)と4℃で一晩ライゲーションした。ライゲーション混合物を大腸菌BL21(DE3)株((F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3))で形質転換し、タンパク質の発現及び精製を可能にした。陽性クローンを分析して、配列決定により構築物が正しく挿入されていることを確認した。
C7IgG4及びC7IgG1。C7IgG4及びC7IgG1の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を、GenScript社(米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)で合成し、pcDNA3.1(-)ベクター(Invitrogen社、米国カリフォルニア州カールスバッド)に挿入した。特に、軽鎖の遺伝子構築物は、ヒトIgG4(C7IgG4の場合)又はIgG1(C7IgG1の場合)の定常領域の配列に融合したscFvC7のVL配列を含む。一方、重鎖の遺伝子構築物は、ヒトIgG4(C7IgG4の場合)又はIgG1(C7IgG1の場合)の定常領域の配列に融合したscFvC7のVH配列を含む。
C7dAbdの精製
C7dAbdの精製は、Moricoli D, 2015に記載の通りに実施した。簡潔には、C7dAbdの遺伝子構築物を含む大腸菌BL21(DE3)の細胞を、100μg/mLの濃度のアンピシリンを添加したLB培地で撹拌しながら37℃で一晩培養した。次に、培養物を、20Lバイオリアクター(Biostat C、Sartorius社)中の50μg/mLアンピシリンを添加した合成培地に接種した。細菌は、OD600が10に達するまでバイオリアクターで培養した。次に、C7dAbdの発現を、1mMイソプロピル-β-α-チオガラクトピラノシド(IPTG)及び40mMスクロースを培養物に添加することによって誘導した。誘導の3時間後、細胞培養物を遠心分離によって収集した。次に、細胞ペレットを以下を含む溶解緩衝液(L緩衝液)に再懸濁した:30mMスクロース、2mM EDTA、1mM DTT、及びpH7.0の20mMリン酸緩衝液。ホモジナイザー(GEA Niro Soavi社)を使用して680barで細胞を破壊し、8000rpmで4℃で60分間遠心分離した。上清を、自動クロマトグラフィーシステム、AKTAエクスプローラー100(GE-Healthcare社)によるC7dAbdの精製に使用した。最初のクロマトグラフィー工程は、L緩衝液で平衡化したSP Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare社)との陽イオン交換で構成される。試料のロードとその後の洗浄の後、タンパク質を、0.5M塩化ナトリウムを添加したL緩衝液で溶出した。2番目の最後の精製工程では、PBS(生理食塩水リン酸緩衝液)で平衡化したrProtein Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare社)を使用して、組換えプロテインAとの親和性をクロマトグラフィー分析する。SPレ樹脂の溶出液をカラムにロードし、洗浄後、C7dAbdを0.1Mクエン酸ナトリウム(pH3)及び0.05%(v/v)グリセロールを含む緩衝液で溶出し、1Mトリス緩衝液で直ちにpH7に中和した。最後に、C7dAbdをSartobind(登録商標)Qデバイス(Sartorius社)と0.22μmフィルターを使用してろ過し、アリコートで-80℃で保存した。タンパク質濃度は280nmでの吸収及びSDS-PAGEによる純度で測定した。
C7dAbdの精製は、Moricoli D, 2015に記載の通りに実施した。簡潔には、C7dAbdの遺伝子構築物を含む大腸菌BL21(DE3)の細胞を、100μg/mLの濃度のアンピシリンを添加したLB培地で撹拌しながら37℃で一晩培養した。次に、培養物を、20Lバイオリアクター(Biostat C、Sartorius社)中の50μg/mLアンピシリンを添加した合成培地に接種した。細菌は、OD600が10に達するまでバイオリアクターで培養した。次に、C7dAbdの発現を、1mMイソプロピル-β-α-チオガラクトピラノシド(IPTG)及び40mMスクロースを培養物に添加することによって誘導した。誘導の3時間後、細胞培養物を遠心分離によって収集した。次に、細胞ペレットを以下を含む溶解緩衝液(L緩衝液)に再懸濁した:30mMスクロース、2mM EDTA、1mM DTT、及びpH7.0の20mMリン酸緩衝液。ホモジナイザー(GEA Niro Soavi社)を使用して680barで細胞を破壊し、8000rpmで4℃で60分間遠心分離した。上清を、自動クロマトグラフィーシステム、AKTAエクスプローラー100(GE-Healthcare社)によるC7dAbdの精製に使用した。最初のクロマトグラフィー工程は、L緩衝液で平衡化したSP Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare社)との陽イオン交換で構成される。試料のロードとその後の洗浄の後、タンパク質を、0.5M塩化ナトリウムを添加したL緩衝液で溶出した。2番目の最後の精製工程では、PBS(生理食塩水リン酸緩衝液)で平衡化したrProtein Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare社)を使用して、組換えプロテインAとの親和性をクロマトグラフィー分析する。SPレ樹脂の溶出液をカラムにロードし、洗浄後、C7dAbdを0.1Mクエン酸ナトリウム(pH3)及び0.05%(v/v)グリセロールを含む緩衝液で溶出し、1Mトリス緩衝液で直ちにpH7に中和した。最後に、C7dAbdをSartobind(登録商標)Qデバイス(Sartorius社)と0.22μmフィルターを使用してろ過し、アリコートで-80℃で保存した。タンパク質濃度は280nmでの吸収及びSDS-PAGEによる純度で測定した。
C7IgG4及びC7IgG1の産生
C7IgG4及びC7IgG1の産生のために、C7IgG4又はC7IgG1の軽鎖及び重鎖を含むプラスミドを無血清Expi293TM発現培地(Thermo Fisher Scientific社)で培養したExpi293FTM細胞にコトランスフェクトした。細胞は、オービタルシェーカー(VWR Scientific社)内で8%CO2を使用して37℃の三角フラスコ(Corning Inc社)で維持した。トランスフェクションの前日、Corning(登録商標)三角フラスコに適切な密度で細胞を播種した。トランスフェクションの日に、DNA及びExpiFectamine(商標)293試薬(Thermo Fisher Scientific社)を混合し、細胞を入れたフラスコに加えた。トランスフェクションの16~18時間後、ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー1及びExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー2(Thermo Fisher Scientific社)を全てのフラスコに添加した。抗体を含む細胞培養物の上清をトランスフェクションの6日後に収集し、遠心分離し、濾過し、プロテインAでの精製に使用した。溶出後、プールをPBSで透析し、アリコートに分割して-80℃で保存した。タンパク質濃度は280nmでの吸収及びSDS-PAGEによる純度で測定した。
C7IgG4及びC7IgG1の産生のために、C7IgG4又はC7IgG1の軽鎖及び重鎖を含むプラスミドを無血清Expi293TM発現培地(Thermo Fisher Scientific社)で培養したExpi293FTM細胞にコトランスフェクトした。細胞は、オービタルシェーカー(VWR Scientific社)内で8%CO2を使用して37℃の三角フラスコ(Corning Inc社)で維持した。トランスフェクションの前日、Corning(登録商標)三角フラスコに適切な密度で細胞を播種した。トランスフェクションの日に、DNA及びExpiFectamine(商標)293試薬(Thermo Fisher Scientific社)を混合し、細胞を入れたフラスコに加えた。トランスフェクションの16~18時間後、ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー1及びExpiFectamine(商標)293トランスフェクションエンハンサー2(Thermo Fisher Scientific社)を全てのフラスコに添加した。抗体を含む細胞培養物の上清をトランスフェクションの6日後に収集し、遠心分離し、濾過し、プロテインAでの精製に使用した。溶出後、プールをPBSで透析し、アリコートに分割して-80℃で保存した。タンパク質濃度は280nmでの吸収及びSDS-PAGEによる純度で測定した。
ヒトCD99ecd/GSTのクローニング及び精製
CD99の細胞外ドメインを、プライマーCD99BamHI Fw:5’-GGAACGGATCCGATGGTGGTTTCGAT-3’(配列番号28)及びCD99_EcoRI Rev:5’-GGCTGGAATTCCTAGTCGGCCTCTTCCC-3’(配列番号29)を使用してpQE30XaのCD99ecd遺伝子コンストラクトから増幅し、増幅産物の5’末端に酵素BamHIの切断部位、3’末端にEcoRIの部位を導入した。増幅産物をベクターpGEX-2T(GE Healthcare Life Sciences社)と共に消化することにより、目的の遺伝子をグルタチオン-S-トランスフェラーゼの遺伝子の下流で、BamHI酵素及びEcoRI酵素(New England Biolabs社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ)と37℃で3時間融合させた。消化した挿入断片及びベクターを精製し、T4DNAリガーゼ(Promega社、米国ウィスコンシン州マディソン)と4℃で一晩ライゲーションした。ライゲーション混合物を大腸菌BL21(DE3)株で形質転換し、タンパク質の発現及び精製を可能にした。構築物が正しく挿入されているかどうか配列決定により陽性クローンを分析した。
CD99の細胞外ドメインを、プライマーCD99BamHI Fw:5’-GGAACGGATCCGATGGTGGTTTCGAT-3’(配列番号28)及びCD99_EcoRI Rev:5’-GGCTGGAATTCCTAGTCGGCCTCTTCCC-3’(配列番号29)を使用してpQE30XaのCD99ecd遺伝子コンストラクトから増幅し、増幅産物の5’末端に酵素BamHIの切断部位、3’末端にEcoRIの部位を導入した。増幅産物をベクターpGEX-2T(GE Healthcare Life Sciences社)と共に消化することにより、目的の遺伝子をグルタチオン-S-トランスフェラーゼの遺伝子の下流で、BamHI酵素及びEcoRI酵素(New England Biolabs社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ)と37℃で3時間融合させた。消化した挿入断片及びベクターを精製し、T4DNAリガーゼ(Promega社、米国ウィスコンシン州マディソン)と4℃で一晩ライゲーションした。ライゲーション混合物を大腸菌BL21(DE3)株で形質転換し、タンパク質の発現及び精製を可能にした。構築物が正しく挿入されているかどうか配列決定により陽性クローンを分析した。
プラスミドpGEX+CD99ecd/GSTを含む大腸菌細胞を、オービタルシェーカー内のフラスコ内の100μg/mLアンピシリンを添加した1LのLB培地で、37℃でOD600が約0.6に達するまで培養した。その時点で、培養物に1mM IPTGを添加することによりタンパク質発現を誘導した。細胞増殖を37℃でさらに3時間振とうしながら維持し、その後、遠心分離によって細胞を収集した。細胞ペレットを100mLのPBSに再懸濁し、超音波処理により溶解した。細胞溶解物を10,200rpmで30分間4℃で遠心分離し、上清を収集し、濾過し、PBSであらかじめ平衡化したグルタチオンセファロース4B樹脂(GE Healthcare Life Sciences社)でのアフィニティークロマトグラフィーによるCD99ecd/GSTの精製のためにロードした。PBSで洗浄した後、目的のタンパク質を50mMのトリス塩酸緩衝液、10mMのGSHバッファー、pH8.0で溶出した。タンパク質濃度はブラッドフォード(Bradford)アッセイにより決定し、純度はSDS-PAGEにより決定した。プールを分割し、アリコートを-80℃に維持した。
ELISAによる解離定数(Kd)の決定
CD99に対するscFvC7、C7dAbd、C7IgG4、及びC7IgG1の解離定数(Kd)として表される結合親和性は、Rath S 1988に記載されている手順に若干変更を加えて、平衡状態での結合の飽和度を競合ELISAアッセイで分析することによって決定した。抗原への結合の50%を決定する抗体濃度(EC50)を決定するために、ELISAによって最初の滴定アッセイを実施した。この目的のために、96ウェルプレートを、0.5M炭酸緩衝液(pH9.6)で希釈した500ng/ウェルのCD99ecd/GSTを分配し、4℃でONでインキュベートすることにより感作した。0.05%V/VのTween(登録商標)20を添加したPBSで3回洗浄した後、プレートを1%w/vのBSAのPBS溶液(PBSB)で37℃(pH7.4)で60分間ブロックした。洗浄後、プレートを37℃で1時間、PBSBで希釈したC7の段階希釈液(200μg/mL~0.03μg/mLで3連で実施)でインキュベートし、分注した(100μL/ウェル)。プレートを37℃で90分間インキュベートした。PBSBで1:500に希釈したポリクローナル抗scFvの希釈液を洗浄した後、100μL/ウェルで分注し、37℃で60分間インキュベートした。洗浄後、PBSB中の抗ウサギHRPからなる検出抗体の1:1000v/vの希釈液を、100μL/ウェルの量で添加した。37℃で1時間インキュベートした後、プレートを再度洗浄し、ABTSからなる染色液を加えた。
CD99に対するscFvC7、C7dAbd、C7IgG4、及びC7IgG1の解離定数(Kd)として表される結合親和性は、Rath S 1988に記載されている手順に若干変更を加えて、平衡状態での結合の飽和度を競合ELISAアッセイで分析することによって決定した。抗原への結合の50%を決定する抗体濃度(EC50)を決定するために、ELISAによって最初の滴定アッセイを実施した。この目的のために、96ウェルプレートを、0.5M炭酸緩衝液(pH9.6)で希釈した500ng/ウェルのCD99ecd/GSTを分配し、4℃でONでインキュベートすることにより感作した。0.05%V/VのTween(登録商標)20を添加したPBSで3回洗浄した後、プレートを1%w/vのBSAのPBS溶液(PBSB)で37℃(pH7.4)で60分間ブロックした。洗浄後、プレートを37℃で1時間、PBSBで希釈したC7の段階希釈液(200μg/mL~0.03μg/mLで3連で実施)でインキュベートし、分注した(100μL/ウェル)。プレートを37℃で90分間インキュベートした。PBSBで1:500に希釈したポリクローナル抗scFvの希釈液を洗浄した後、100μL/ウェルで分注し、37℃で60分間インキュベートした。洗浄後、PBSB中の抗ウサギHRPからなる検出抗体の1:1000v/vの希釈液を、100μL/ウェルの量で添加した。37℃で1時間インキュベートした後、プレートを再度洗浄し、ABTSからなる染色液を加えた。
マイクロプレートリーダーを用いて405nmで染色強度を読み取った。
バックグラウンドの減算結果を使用して、EC50の値を確立するために、統計ソフトウェア(Graphpad 4)を使用してミカエリス・メンテン(Michaelis Menten)曲線を作成した。
次に、競合ELISAアッセイを設定した。この目的のために、0.5M炭酸緩衝液(pH9.6)で希釈したCD99ecd/GSTのコーティングを、ウェルあたり500ngで塗布し、4℃でONでインキュベートした。0.05%V/VのTween(登録商標)20を添加したPBSで3回洗浄した後、プレートをウェルあたり100μLの量で分注したPBSBの溶液でブロックし、37℃で60分間インキュベートした。洗浄後、以前の直接ELISAで計算されたEC50によって確立された量の抗体の存在下でPBSBで希釈した400μg/mL~0.015μg/mLまでのCD99ecd/GST抗原の段階希釈液をプレーティングした。scFvC7及びC7ダイアボディシグナルは、最初の工程で、scFvC7で免疫されたウサギで生成され、PBSBで1:500v/vに希釈されたポリクローナル抗scFv抗体、続いて1:1000v/vに希釈された抗ウサギHRPを分注することによって決定した。C7IgG4及びC7IgG1の検出は、1:1000v/vに希釈された抗ヒトIgGHRPを分注することによって実施した。インキュベーション及び洗浄後、発色基質としてABTSを添加することによりシグナルを強調した。405nmでの吸光度を読み取った後、GraphPadソフトウェアを使用して結果を計算し、単指数関数的減衰曲線を作成し、IC50、すなわちシグナルの50%阻害を提供するために必要な阻害剤の量(モル濃度)を定義した。
細胞株
白血病細胞株は、10%の脱補体化ウシ胎児血清(FBS)、2mMのL-グルタミン、及び1%v/vのペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI-1640(Carlo Erba社)培地で培養した。全ての細胞株を、5%CO2の加湿雰囲気下で37℃のインキュベーター内に保存した。
白血病細胞株は、10%の脱補体化ウシ胎児血清(FBS)、2mMのL-グルタミン、及び1%v/vのペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI-1640(Carlo Erba社)培地で培養した。全ての細胞株を、5%CO2の加湿雰囲気下で37℃のインキュベーター内に保存した。
免疫蛍光
細胞を層流フード下で処理し、無菌状態を維持し、生存率を顕微鏡下でモニタリングした。
細胞を層流フード下で処理し、無菌状態を維持し、生存率を顕微鏡下でモニタリングした。
前記細胞を37℃に予熱した培地で洗浄し、1600rpmで6分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを10mLのPBSに再懸濁し、この溶液で3回洗浄した。次に、トリパンブルーで染色した後、血球計算盤でカウントを行い、固定するために3.5×106個の細胞を収集した。
PBS中の4%ホルムアルデヒド(v/v)で固定を行い、遠心分離後、細胞を6mLのこの溶液に再懸濁し、濃度を5×105細胞/mLとした。この懸濁液を6ウェルプレートに播種し、1ウェルあたり1mLで、底にカバーガラスを配置した。固定相を室温で15分間維持し、続いて細胞を3mLのPBSで3回洗浄した。前記細胞を、37℃で溶解したPBS(1×)、1%w/vのBSA、及び0.05%w/vのゼラチンからなるブロッキング溶液で室温で60分間処理した。この時点で、PBSで希釈したC7dAbd抗体をウェルあたり1mLずつ加え、90分間インキュベートした。インキュベーション段階後、ウェルあたり3mLのPSB(1×)で3回の洗浄を行った。続いて、ブロッキング溶液で1:1000v/vに希釈したプロテインA-FITCを分注し、暗所で60分間インキュベートした。3回洗浄した後、PBS(1×)で1:10000v/vに希釈したDAPIを添加した。この溶液を前記細胞と接触させて1分間維持し、最後に、細胞を再度洗浄し、顕微鏡分析に供した。シグナルは、DC300FCCDデジタルカメラを備えたライカDMLB蛍光顕微鏡で視覚化した。
細胞蛍光測定による結合アッセイ
フラスコから細胞を取り出し、37℃に予熱した11mLの培地を入れた試験管に入れ、1600rpmで6分間遠心分離して沈殿させた。遠心分離後に上清を除去した。ペレットを3mLの培地に再懸濁し、トリパンブルーで染色した後、血球計算盤でカウントした。次に、培地を加えることにより、細胞密度を5×105細胞/mLとした。細胞蛍光測定用試験管は、試験管あたり1mLの細胞懸濁液を分注することによって調製した。
フラスコから細胞を取り出し、37℃に予熱した11mLの培地を入れた試験管に入れ、1600rpmで6分間遠心分離して沈殿させた。遠心分離後に上清を除去した。ペレットを3mLの培地に再懸濁し、トリパンブルーで染色した後、血球計算盤でカウントした。次に、培地を加えることにより、細胞密度を5×105細胞/mLとした。細胞蛍光測定用試験管は、試験管あたり1mLの細胞懸濁液を分注することによって調製した。
次に、1600rpmで6分間遠心分離することにより、細胞を4mLのPBS(1×)で2回洗浄した。上清は毎回除去した。続いて、細胞を、PBS(1×)及び1%w/vのBSAからなる200μLのブロッキング溶液に再懸濁し、この状態を室温で30分間維持した。この工程の後、抗体を、室温で60分間保持した200μLのブロッキング溶液に添加した。インキュベーション終了時に、各試験管を4mLのPBS(1×)で2回洗浄し、続いて1600rpmで6分間遠心分離し、毎回上清をデカントした。各細胞ペレットを、ブロッキング溶液で1:1000v/vに希釈したプロテインA-FITCからなる200μLの溶液に再懸濁し、インキュベーションを室温で60分間維持した。この工程の後、細胞を4mLのPBS(1×)で1回洗浄し、上記のように遠心分離した。ポンプで吸引して上清を除去し、全ての試験管に約500μLの洗浄液を残した。試料を、FacScan(Becton Dickinson社)を使用した細胞蛍光分析に供した。
アポトーシスの評価
白血病細胞のアポトーシスは、アネキシンV及び細胞蛍光測定技術を使用したヨウ化プロピジウム試験によって評価した。細胞を収集し、カウントし、50mLの試験管に移し、RPMI培地で5×105細胞/mLの濃度とした。続いて、細胞懸濁液を試験管あたり1mL(5×105細胞)で分注した。1600rpmで6分間遠心分離した後、細胞を抗体で処理した。試料は並行して調製し、プラセボで処理した。前記試料は37℃で4時間のインキュベーションで維持した。インキュベーションの最後に、細胞を1200rpmで8分間遠心分離し、上清を除去し、150μLのHuman Annexin V FITCキット(Valter Occhiena社)の結合緩衝液を全ての試験管に添加した。その後、再懸濁した細胞を細胞蛍光測定用試験管に移し、そこに3μLのアネキシンV-FITC及び3μLのヨウ化プロピジウムを加えた。前記試料を完全に混合した後、暗所で室温で20分間インキュベートした。インキュベーション後、1200rpmで8分間遠心分離し、上清をデカントすることにより、前記試料を4mLのPBSで洗浄し、200μLの結合緩衝液を全ての試験管に加え、前記試料を細胞蛍光測定で調べた。
白血病細胞のアポトーシスは、アネキシンV及び細胞蛍光測定技術を使用したヨウ化プロピジウム試験によって評価した。細胞を収集し、カウントし、50mLの試験管に移し、RPMI培地で5×105細胞/mLの濃度とした。続いて、細胞懸濁液を試験管あたり1mL(5×105細胞)で分注した。1600rpmで6分間遠心分離した後、細胞を抗体で処理した。試料は並行して調製し、プラセボで処理した。前記試料は37℃で4時間のインキュベーションで維持した。インキュベーションの最後に、細胞を1200rpmで8分間遠心分離し、上清を除去し、150μLのHuman Annexin V FITCキット(Valter Occhiena社)の結合緩衝液を全ての試験管に添加した。その後、再懸濁した細胞を細胞蛍光測定用試験管に移し、そこに3μLのアネキシンV-FITC及び3μLのヨウ化プロピジウムを加えた。前記試料を完全に混合した後、暗所で室温で20分間インキュベートした。インキュベーション後、1200rpmで8分間遠心分離し、上清をデカントすることにより、前記試料を4mLのPBSで洗浄し、200μLの結合緩衝液を全ての試験管に加え、前記試料を細胞蛍光測定で調べた。
共焦点顕微鏡
フラスコから細胞を取り出し、37℃に予熱した11mLの培地を入れた試験管に入れた後、1600rpmで6分間遠心分離して沈殿させた。遠心分離後に上清を除去した。ペレットを3mLの培地に再懸濁し、トリパンブルーで染色した後、血球計算盤でカウントした。次に、培地を加えることにより、細胞密度を5×105細胞/mLとした。様々な条件を、試験管あたり1mLの細胞懸濁液を分注することによって調整した。
フラスコから細胞を取り出し、37℃に予熱した11mLの培地を入れた試験管に入れた後、1600rpmで6分間遠心分離して沈殿させた。遠心分離後に上清を除去した。ペレットを3mLの培地に再懸濁し、トリパンブルーで染色した後、血球計算盤でカウントした。次に、培地を加えることにより、細胞密度を5×105細胞/mLとした。様々な条件を、試験管あたり1mLの細胞懸濁液を分注することによって調整した。
次に、1600rpmで6分間遠心分離することにより、細胞を4mLのPBS(1×)で2回洗浄した。上清は毎回除去した。続いて、細胞を、PBS(1×)及び1%w/vのBSAからなる200μLのブロッキング溶液に再懸濁し、この状態を室温で30分間維持した。この工程の後、前もってFITCでマークしたC7dAbd抗体を、30分間、1時間、2時間、及び4時間維持された200μLのブロッキング溶液に添加した。各インキュベーション終了時に、各試験管を4mLのPBS(1×)で2回洗浄し、続いて1600rpmで6分間遠心分離し、毎回上清をデカントした。各細胞ペレットを200μLに再懸濁し、前記試料を共焦点分析に供した。
カニクイザル、アフリカミドリザル、及びマウスCD99ecd/GSTのクローニング並びに精製
カニクイザル(Macaca fascicolaris)及びアフリカミドリザル(Cercopithecus aethiops)のCD99の細胞外ドメインは、カニクイザルリンパ球のRNA又はアフリカミドリザルCOS-1細胞株由来のRNAから逆転写されたcDNAから前もって作製したpET45bにおけるそれぞれのCD99ecd遺伝子構築物から増幅した。
カニクイザル(Macaca fascicolaris)及びアフリカミドリザル(Cercopithecus aethiops)のCD99の細胞外ドメインは、カニクイザルリンパ球のRNA又はアフリカミドリザルCOS-1細胞株由来のRNAから逆転写されたcDNAから前もって作製したpET45bにおけるそれぞれのCD99ecd遺伝子構築物から増幅した。
AGM_CD99_BamHI_Fw:5’-GTCGCGGATCCGATGATGGTTTC-3’(配列番号30)フォワードプライマー及びAGM_CD99_EcoRI Rev:5’-ATCACGAATTCCTAGTCCGCCTCCTCCC-3’(配列番号31)リバースプライマーを用いて両方の種について増幅が得られた。マウスCD99の細胞外ドメインは、以下のプライマーを使用してCD99遺伝子を含むプラスミドから増幅した:mmCD99BamHI Fw2:5’-GGCGCGGATCCGACGACTTCAACCT-3’(配列番号32)及びmmCD99EcoRI Rev:5’-ACCACGAATTCCTACAAGCCCTGGGGCGT-3’(配列番号33)。使用したすべてのプライマーは、増幅産物の5’末端に酵素BamHIの切断部位を導入し、3’末端にEcoRIの部位を導入する。増幅産物をベクターpGEX-2T(GE Healthcare Life Sciences社)と共に消化することにより、目的の遺伝子をグルタチオン-S-トランスフェラーゼの遺伝子の下流で、BamHI酵素及びEcoRI酵素(New England Biolabs社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ)と37℃で3時間融合させた。消化した挿入断片及びベクターを精製し、T4DNAリガーゼ(Promega社、米国ウィスコンシン州マディソン)と4℃で一晩ライゲーションした。各ライゲーション混合物を大腸菌BL21(DE3)株で形質転換し、タンパク質の発現及び精製を可能にした。構築物が正しく挿入されているかどうか配列決定により陽性クローンを分析した。
ヒトCD99ecd/GSTについて記載したように、前記3つのタンパク質の精製を行った。
上記のように、C7dAbdの反応性を評価するために、異なる種のCD99ecd/GSTをELISA滴定アッセイで使用した。
Claims (17)
- ヒトタンパク質CD99の細胞外ドメインのエピトープを認識して結合することができる、IgGタイプ免疫グロブリンであって、前記免疫グロブリンは、配列番号21を含むアミノ酸配列を特徴とする、ヒトタンパク質CD99の細胞外ドメインのエピトープを認識して結合することができる少なくとも2つの可変領域を含み、前記少なくとも2つの可変領域は、それぞれ、
配列番号1を含むCDR3を特徴とする重可変鎖(VH)と、
配列番号2を含むCDR3を特徴とする軽可変鎖(VL)とを含み、ここで
(1)前記VH鎖は、それぞれ、配列番号3及び4を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR1領域及びCDR2領域を含む、及び
(2)前記VL鎖は、それぞれ、配列番号5及び6を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR1領域及びCDR2領域を含む、
前記IgGタイプ免疫グロブリン。 - 前記エピトープが、配列番号23を含むアミノ酸配列を特徴とする、請求項1に記載の免疫グロブリン。
- (1)前記VH鎖は、配列番号7を含むアミノ酸配列又は少なくとも95%の同一性を有する配列を特徴とする、及び
(2)前記VL鎖は、配列番号8を含むアミノ酸配列又は少なくとも95%の同一性を有する配列を特徴とする、
請求項1又は2に記載の免疫グロブリン。 - 前記免疫グロブリンは、IgG4タイプ免疫グロブリンであり、
前記IgG4の各重鎖のアミノ酸配列は、配列番号34又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含み、及び
前記IgG4の各軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号35又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含み、ここで
配列番号34は、配列番号7を含み、並びに配列番号35は、配列番号8を含む、
請求項1~3のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。 - 前記免疫グロブリンは、IgG1タイプ免疫グロブリンであり、
前記IgG1の各重鎖のアミノ酸配列は、配列番号38又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含み、及び
前記IgG1の各軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号39又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含み、ここで
配列番号38は、配列番号7を含み、並びに
配列番号39は、配列番号8を含む、
請求項1~3のいずれか一項に記載の免疫グロブリン。 - CD99を発現する病状の治療又は予防又はフォローアップに使用するための、請求項1~5のいずれか一項に記載の免疫グロブリンを含む組成物。
- 白血病又は骨髄異形成症候群の予防及び/又は治療及び/又はフォローアップにおける使用のための抗体を含む組成物であって、前記抗体は、請求項1~5のいずれか一項に記載のIgG免疫グロブリンであるか、又は前記抗体は、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディの中から選択される多価一本鎖可変領域(scFv)の断片であり、配列番号21を含むアミノ酸配列を特徴とする、ヒトタンパク質CD99の細胞外ドメインのエピトープを認識して結合することができる少なくとも2つの可変領域を含み、前記少なくとも2つの可変領域は、それぞれ、
配列番号1を含むCDR3を特徴とする重鎖可変領域(VH)と、
配列番号2を含むCDR3を特徴とする軽鎖可変領域(VL)とを含み、ここで
(1)前記VH鎖は、それぞれ、配列番号3及び4を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR1領域及びCDR2領域を含む、及び
(2)前記VL鎖は、それぞれ、配列番号5及び6を含むアミノ酸配列を特徴とするCDR1領域及びCDR2領域を含む、
前記使用のための組成物。 - 前記エピトープが、配列番号23を含むアミノ酸配列を特徴とする、請求項7に記載の使用のための組成物。
- (1)前記多価scFvのVH鎖は、配列番号7を含むアミノ酸配列又は少なくとも95%の同一性を有する配列を特徴とする、及び
(2)前記多価scFvのVL鎖は、配列番号8を含むアミノ酸配列又は少なくとも95%の同一性を有する配列を特徴とする、
請求項7又は8に記載の使用のための組成物。 - 前記多価scFvのscFvユニットは、配列番号9を含むアミノ酸配列又は少なくとも95%の同一性を有する配列を特徴とするリンカーによって互いに結合され、及び
前記多価scFvの各scFvユニットは、配列番号10を含むアミノ酸配列又は少なくとも95%の同一性を有する配列を特徴とする、
請求項7に記載の使用のための組成物。 - 前記抗体はダイアボディであるか、又はIgG4wt若しくはS228P変異を有するIgG4である、請求項7~10のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記白血病は、CD99を発現する白血病細胞を特徴とする、請求項7~11のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記病状は、CD99の過剰発現を特徴とする、又はCD99発現/過剰発現によって引き起こされる、請求項6に記載の使用のための組成物。
- 前記白血病は、CD99を過剰発現する白血病細胞を特徴とする、請求項12に記載の使用のための組成物。
- 前記白血病は、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、及び骨髄異形成症候群(MDS)の中から選択される、請求項12又は14に記載の使用のための組成物。
- さらなる化学療法剤と組み合わせた、及び/又は手術及び/又は免疫療法及び/又は放射線療法及び/又は標的療法と組み合わせた、請求項7~15のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
- 前記さらなる化学療法剤が、ダウノルビシン、イダルビシン、シタラビン、アザシチジン、デシタビン及びそれらの組み合わせの中から選択される、請求項16に記載の使用のための組成物。
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US20120282257A1 (en) | 2009-11-13 | 2012-11-08 | Piero Picci | Single-chain variable fragment (scfv) able to recognize and bind cd99 human protein |
US20160272720A1 (en) | 2013-11-06 | 2016-09-22 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Compositions and Methods for the Treatment of Acute Myeloid Leukemias and Myelodysplastic Syndromes |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120282257A1 (en) | 2009-11-13 | 2012-11-08 | Piero Picci | Single-chain variable fragment (scfv) able to recognize and bind cd99 human protein |
US20160272720A1 (en) | 2013-11-06 | 2016-09-22 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Compositions and Methods for the Treatment of Acute Myeloid Leukemias and Myelodysplastic Syndromes |
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