IT201800005991A1 - Complesso anticorpale ed usi derivati - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo

“Complesso anticorpale ed usi derivati”

La presente invenzione si riferisce ad un complesso anticorpale multivalente, preferibilmente bivalente, più preferibilmente un diabody ovvero un scFv bivalente, in grado di riconoscere e legare la proteina umana CD99, ad una composizione comprendente detto complesso ed il loro uso a scopi diagnostici e/o per il trattamento e/o il follow-up delle leucemie e/o sindromi mielodisplastiche.

Inoltre, la presente invenzione si riferisce ad anticorpi, preferibilmente monoclonali, di tipo immunoglobuline del gruppo G in grado di riconoscere e legare la proteina umana CD99, una composizione comprendente dette immunoglobuline ed il loro uso medico, in particolare per il trattamento e/o il follow-up del cancro, preferibilmente i tumori solidi esprimenti CD99 e/o leucemie e/o sindromi mielodisplastiche.

STATO DELLA TECNICA

E’ ben noto che il cancro rappresenta una delle principali cause di morte al mondo. Inoltre, esso ha un grosso impatto sulla vita sociale e sui costi sanitari di ogni paese. Gli sforzi per cercare terapie in grado di alleviare o curare il cancro sono notevoli e provenienti da tutte le direzioni.

Le leucemie sono tra le forme di cancro più comuni.

La leucemia è un termine con il quale si indica un insieme di malattie maligne, vari tipi di cancro o tumori, caratterizzati dalla proliferazione neoplastica di una cellula staminale emopoietica e si traduce in un numero elevato di globuli bianchi anormali. Queste cellule bianche del sangue non sono pienamente sviluppate e sono chiamate blasti o cellule leucemiche. Le cellule staminali emopoietiche, che si trovano nel midollo osseo rosso, danno origine a due linee cellulari:

- La linea mieloide, da cui originano i globuli rossi, alcuni tipi di globuli bianchi (granulociti e monociti) e le piastrine;

- La linea linfoide, da cui originano i linfociti (un altro tipo di globuli bianchi).

A seconda della linea cellulare verso cui evolve il clone leucemico si parla di leucemia linfoblastica acuta (LLA), leucemia mieloide acuta (LMA), leucemia linfatica cronica (LLC) e leucemia mieloide cronica (LMC).

La causa esatta della condizione è ancora sconosciuta. Diversi fattori, sia genetici che ambientali, sono ritenuti come possibili fattori di rischio come il fumo, l'esposizione alle radiazioni ionizzanti o ad alcune sostanze chimiche (come il benzene), una precedente cura chemioterapica e la sindrome di Down.

Le sindromi mielodisplastiche (SMD) sono un gruppo di malattie del sangue caratterizzate da un difetto nel midollo osseo, che non riesce più a produrre in numero sufficiente di alcune linee cellulari del sangue come globuli rossi, globuli bianchi e piastrine. Le SMD sono anche chiamate malattie pre-leucemiche perché possono evolvere, con il tempo, in leucemia in forma acuta.

La diagnosi viene solitamente formulata grazie ad analisi del sangue o tramite una biopsia del midollo osseo.

Il trattamento delle leucemie comporta la combinazione tra chemioterapia, radioterapia, terapia mirata, e trapianto di midollo osseo, in aggiunta alla terapia di supporto e alle eventuali cure palliative. Il trapianto di cellule staminali emopoietiche per sostituire le cellule malate distrutte con alte dosi di chemio o radioterapia con quelle sane di un donatore compatibile, spesso un fratello o un familiare, ma a volte anche uno sconosciuto, riesce in alcuni casi, soprattutto nei pazienti più giovani, a curare definitivamente la malattia e può essere utilizzato per le forme che non rispondono più alla chemioterapia.

Vi sono poi le terapie che stimolano il sistema immunitario a riconoscere e a distruggere le cellule leucemiche. In alcune leucemie si utilizza per esempio l'interferone per rallentare la crescita delle cellule tumorali.

Il capostipite delle terapie mirate per le leucemie è l’Imatinib, un’inibitore tirosin chinasico utilizzato per il trattamento della LMC e delle LLA caratterizzate dalla presenza della proteina anomala Bcr-Abl prodotta a causa di una traslocazione cromosomica che origina il cosiddetto cromosoma Philadelphia (Ph+). La terapia è molto efficace anche se con gli anni può insorgere una forma di resistenza.

Nonostante i recenti progressi nello sviluppo di nuovi trattamenti per le leucemie il tasso di sopravvivenza media negli Stati Uniti a cinque anni è del 57%. Nei bambini sotto i 15 anni, la sopravvivenza a cinque anni è superiore al 60% e all'85%, a seconda del tipo.

Pertanto, è fortemente sentita la necessità di individuare terapie/molecole migliorative o alternative da utilizzare, singolarmente o anche in combinazione con le terapie attualmente disponibili, per il trattamento dei tumori in generale e delle leucemie in particolare.

Recenti studi hanno evidenziato che proteine di membrana possono avere un’espressione alterata in cellule ematopoietiche leucemiche.

In particolare, la glicoproteina di membrana CD99 risulta over espressa in diversi tipi di leucemia, come la leucemia linfoide acuta e mieloide acuta e nelle sindromi mielodisplastiche.

Gli autori della presente invenzione hanno trovato come soluzioni alle esigenze sopra riportate l’uso di un complesso anticorpale multivalente in grado di riconoscere e legare la proteina umana CD99. In particolare, essi hanno trovato che un diabody, ovvero due unità di single-chain variable fragment (scFv), diretto contro CD99 risulta particolarmente efficace nel trattamento e/o follow-up delle leucemie e/o sindromi mielodisplastiche. Questo dato è risultato sorprendente dal momento che, risultati precedenti condotti dallo stesso gruppo, indicavano che le unità monomeriche dello stesso scFv risultavano efficaci per trattare il sarcoma di Ewing ma non le leucemie.

Inoltre, gli autori della presente invenzione hanno anche sorprendentemente trovato che anticorpi, preferibilmente monoclonali, di tipo immunoglobuline del gruppo G in grado di riconoscere e legare la proteina umana CD99, sono efficaci per il trattamento terapeutico di varie tipologie di cancro, in particolare i tumori solidi esprimenti CD99, le leucemie e/o le sindromi mielodisplastiche. Particolarmente efficaci sono risultati anticorpi monoclonali di classe IgG4 e IgG1.

Infatti, gli autori hanno trovato che in seguito al legame con le forme diabody e/o IgG del complesso anticorpale qui descritto, le cellule leucemiche vanno incontro alla morte. In particolare, tramite microscopia confocale, gli autori della presente invenzione hanno trovato che le cellule leucemiche sono in grado di internalizzare il complesso anticorpale qui descritto. Quest’ultimo dato è particolarmente interessante e vantaggioso perché consente l’uso del complesso in applicazioni che richiedono l’internalizzazione dell’anticorpo, come nel caso degli Antibody-drug conjugates (ADCs).

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Ulteriori vantaggi della presente invenzione saranno evidenti nella seguente descrizione dettagliata e dalle annesse figure, in particolare: - La Figura 1 mostra i risultati di un’analisi citofluorimetrica di linee cellulari leucemiche in seguito al trattamento con forme esemplificative del complesso anticorpale dell’invenzione (diabody).

- La Figura 2 mostra un’analisi di microscopia in fluorescenza di cellule leucemiche trattate con forme esemplificative del complesso anticorpale dell’invenzione (diabody).

- La Figura 3 mostra i risultati di analisi di reattività di alcune forme esemplificative del complesso anticorpale dell’invenzione (diabody) con linee cellulari di leucemia mieloide acuta. Il picco delineato dalla linea scura rappresenta quello delle cellule marcate soltanto con anticorpo secondario mentre il picco delineato dalla linea grigio chiaro rappresenta le cellule marcate con la forma diabody del complesso.

- La Figura 4 mostra i risultati di analisi di reattività del monomero scFv C7 con linee cellulari di leucemia mieloide e linfoide acuta. Il picco delineato dalla linea scura rappresenta quello delle cellule marcate soltanto con anticorpo secondario mentre il picco delineato dalla linea grigio chiaro rappresenta le cellule marcate con il monomero scFv C7.

- La Figura 5 mostra i risultati di analisi di morte di cellule leucemiche indotta da alcune forme esemplificative del complesso anticorpale dell’invenzione (diabody) misurata mediante citofluorimetria.

- La Figura 6 mostra i risultati di analisi di morte di cellule leucemiche indotta da alcune forme esemplificative del complesso anticorpale dell’invenzione (diabody) misurata mediante citofluorimetria.

- Le Figure 7 e 8 mostrano i risultati di analisi di reattività in citofluorimetria di alcune forme esemplificative del complesso anticorpale dell’invenzione (anticorpi in forma IgG1 e IgG4, ovvero C7IgG1 e C7IgG4) ottenuti sulle seguenti linee cellulari: T-ALL: ALL-SIL, CCRF-CEM e di AML : MV4-11, THP-1 e MONO-MAC-6.

- Le Figure 9 e 10 i risultati di analisi di morte di cellule leucemiche indotta da alcune forme esemplificative del complesso anticorpale dell’invenzione (anticorpi in forma IgG1 e IgG4, ovvero C7IgG1 e C7IgG4) in cellule leucemiche.

- La Figura 11 mostra i risultati in microscopia confocale della capacità delle cellule leucemiche di internalizzare il complesso anticorpale dell’invenzione in forma diabody in seguito al legame con CD99.

- La Figura 12 mostra (A) l’allineamento delle sequenze amminoacidiche del dominio extracellulare di CD99 di uomo, cynomolgus monkey, green monkey e topo (i residui identici sono marcati con un asterisco (*) mentre i due punti (:) indicano le sostituzioni conservative e i punti (.) quelle semiconservate); (B) l’allineamento delle sequenze amminoacidiche dell’epitopo di scFvC7.

- La Figura 13 mostra i risultati di reattività del complesso anticorpale dell’invenzione in forma diabody per CD99 di diverse specie mediante saggi ELISA.

- La Figura 14 mostra uno schema delle varie forme del complesso anticorpale della presente invenzione, in particolare la forma IgG e le forme diabody, triabody e tetrabody.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA

In questo contesto, “single-chain variable fragment” (scFv) o in italiano “frammento di regione variabile a singola catena” significa un particolare tipo di frammento anticorpale ottenuto per esempio, tramite la tecnica del phage display.

Questa molecola è una fusione delle regioni variabili della catena leggera (VL) e della catena pesante (VH) delle immunoglobuline, tenute insieme da un linker, ovvero l’scFv è un frammento anticorpale di tipo Fv costituito da una VH e da una VL di una immunoglobulina uniti da un linker, ovvero un peptide flessibile di lunghezza variabile che consente alle catene VH-VL di assumere la corretta struttura come unità monomerica funzionale. L’scFv può essere ingegnerizzato per formare complessi anticorpali come diabody (dAbd) o scFv-bivalente, oppure un triabody od un tetrabody che legano insieme rispettivamente due, tre o quattro scFv, in altre parole l’scFv può essere ingegnerizzato a formare complessi multivalenti, ovvero scFv multivalenti. Diversamente dagli anticorpi monoclonali che sono spesso prodotti nelle cellule di mammifero in coltura, gli scFv mono e multivalenti sono spesso prodotti in cellule batteriche, come Escherichia coli.

In questo contesto, un anticorpo, o più propriamente un’immunoglobulina, significa una proteina con una peculiare struttura quaternaria modulare a forma di "Y”, in grado di legarsi in modo altamente specifico a strutture complementari denominate antigeni.

In un anticorpo possono essere distinte due componenti fondamentali • una regione costante (C), che media l’interazione dell’anticorpo con il complemento o con cellule dell’immunità innata (porzione "Fc").

• una regione variabile (V), che contiene il sito di combinazione con l'antigene e che è quindi variabile a seconda della specificità dell'anticorpo per un dato antigene (porzione "Fab").

Tali componenti si strutturano a formare un complesso proteico di tipo tetramerico che si compone di quattro catene glicoproteiche, due catene pesanti (H) uguali fra di loro e due catene leggere (L) anch'esse uguali fra di loro.

Ogni catena è poi costituita da un dominio variabile (VH per la catena pesante, VL per la catena leggera) posto all’estremità ammino-terminale e da uno o più domini costanti all’estremità carbossi-terminale. Infine, in ciascun dominio variabile, in corrispondenza con il sito di legame con l’antigene, sono presenti 3 regioni ipervariabili (CDR1, CDR2 ed in fine la porzione più variabile costituita da CDR3) intervallate dalle cosiddette regioni cornice. A livello strutturale, le regioni ipervariabili si organizzano a formare tre anse ravvicinate all’interno di una complessa struttura di foglietti beta derivata dalle regioni cornice.

Le immunoglobuline umane sono suddivise in 5 classi principali: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE.

Le catene pesanti sono di tipo , peculiari di ciascuna classe di immunoglobuline, e contengono ognuna un dominio Ig variabile (VH o V ) e tre domini costanti (CH1/2/3 o C 1/2/3). Per le IgG, le catene , possono essere prodotte in quattro sottotipi diversi: 1, 2, 3 e 4. Perciò, le immunoglobuline G si distinguono in altrettante sottofamiglie, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, tutte con struttura e funzioni simili.

Gli anticorpi monoclonali possono essere ottenuti ricorrendo a diverse procedure che includono:

- Il sistema convenzionale che prevede l’immunizzazione di topi con un determinato antigene e produzione di ibridomi che secernano l’anticorpo murino. L’impiego clinico di anticorpi murini è risultato sin da subito condizionato dalla loro intrinseca immunogenicità ma grazie alla disponibilità di tecniche molecolari è stato possibile ridurre l’immunogenicità costruendo anticorpi chimerici o umanizzati che conservano la specificità delle regioni variabili o delle CDRs murine ma utilizzano sequenze umane per la parte costante e per le regioni cornice.

- L’uso di topi transgenici in grado di produrre anticorpi umani.

- La tecnologia del phage-display che è attualmente il metodo più diffuso per selezionare anticorpi e frammenti anticorpali ricombinanti completamente umani con elevata affinità per l’antigene.

In questo contesto, CD99 è una glicoproteina transmembrana che, nell’uomo, non mostra omologie con altre proteine conosciute (eccetto Xga). CD99 ha una massa molecolare di 32 kDa ed è coinvolta in importanti funzioni fisiologiche che includono l’adesione cellulare, l’apoptosi, il differenziamento delle cellule T e dei timociti, la migrazione dei monociti e l’adesione intracellulare tra linfociti e cellule endoteliali. Nell'uomo il gene MIC2 codifica due distinte proteine a seguito di un processo di splicing alternativo: un CD99 full length o di tipo 1 (CD99wt) e una forma troncata detta CD99 di tipo II (CD99sh) con un dominio citoplasmatico più corto. Le due isoforme di CD99 sono espresse in maniera cellulo-specifica e hanno un diverso ruolo funzionale. CD99 si può trovare sulla superficie cellulare sia come monomero che come omodimero dove due molecole di CD99 interagiscono tramite il dominio extracellulare. Questi dimeri possono essere formati anche tra l’isoforma full lenght e troncata. Inoltre l’interazione può anche avvenire tra due molecole di CD99 espresse sulla superficie di cellule diverse.

Particolarmente rilevante in questo contesto è il dominio extracellulare della proteina CD99 riconosciuto e legato dalle molecole qui descritte. La sequenza amminoacidica e la sequenza nucleotidica codificante (CDS) del dominio extracellulare di CD99 sono rispettivamente SEQ ID NO: 21 e 22. In particolare, la sequenza dell’epitopo specifico di CD99 contro cui sono dirette le molecole qui descritte comprende gli aminoacidi 50-74 del dominio extracellulare di CD99, ovvero SEQ ID NO: 23.

Un primo aspetto della presente invenzione si riferisce ad un complesso anticorpale comprendente almeno due regioni variabili in grado di riconoscere e legare la proteina umana CD99, per l’uso nella diagnosi e/o nel trattamento e/o nel follow-up delle leucemie e delle sindromi mielodisplastiche, dove ciascuna di dette almeno due regioni variabili comprende una porzione/dominio variabile della catena leggera (VL) e una porzione/dominio variabile della catena pesante (VH) di un'immunoglobulina. In altre parole il complesso anticorpale a cui la presente invenzione fa riferimento comprende almeno due regioni variabili della catena leggera (VL) ed almeno due regioni variabili della catena pesante (VH) di un’immunoglobulina.

Secondo una forma di realizzazione preferita, detto complesso anticorpale è un diabody (dAbd) o scFv-bivalente, oppure un triabody od un tetrabody come prima definiti e caratterizzati rispettivamente da due, tre e quattro regioni variabili ciascuna avente una porzione/dominio variabile della catena leggera (VL) e una porzione/dominio variabile della catena pesante (VH) come riportato nella Figura 14.

Secondo una forma di realizzazione preferita, detto complesso anticorpale è un anticorpo in formato IgG, preferibilmente una IgG della classe 1 e/o 4. Anche in questo caso come per il diabody, le IgG hanno almeno due regioni variabili in grado di riconoscere e legare la proteina umana CD99 ciascuna di dette almeno due regioni variabili comprende una porzione/dominio variabile della catena leggera (VL) e una porzione/dominio variabile della catena pesante (VH).

Nel caso delle forme IgG ovviamente non c’è alcun linker che invece esiste negli scFv multivamenti e serve per tenere assieme le singole unità monomeriche.

Ciascuna catena VH e VL in corrispondenza con il sito di legame con l’antigene, comprende 3 regioni ipervariabili definite notoriamente CDR1, CDR2 e CDR3 intervallate dalle cosiddette regioni cornice. CDR sta per Complementarity-Determining Region, ovvero Regione Determinante la Complementarietà e CDR3 è la regione più variabile.

Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, almeno una delle catene VH del complesso anticorpale comprende una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 1. Preferibilmente dette almeno due catene VH del complesso anticorpale comprendono ciascuna una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 1. Ovvero entrambe le catene VH comprendono una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 1.

Nel contesto della presente “comprende, comprendente” significa anche che la sequenza amminoacidica o nucleotidica in oggetto è, ovvero corrisponde essenzialmente alla sequenza identificata.

Preferibilmente detto scFv multivalente, preferibilmente bivalente (diabody), o trivalente (triabody) o quadrivalente (tetrabody) ha almeno una catena VH comprendete una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 1, preferibilmente il diabody ha almeno due catene VH ciascuna comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 1, il triabody ha tre catene VH ciascuna comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 1, il tetrabody ha quattro catene VH ciascuna comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 1.

Preferibilmente detta IgG, più preferibilmente detta IgG1 e/o detta IgG4 comprende almeno una catena VH comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 1, preferibilmente detta IgG, più preferibilmente detta IgG1 e/o detta IgG4 comprende almeno due catene VH ciascuna comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 1.

Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, almeno una delle catene VL del complesso anticorpale comprende una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 2. Preferibilmente dette almeno due catene VL del complesso anticorpale comprendono ciascuna una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 2. Ovvero entrambe le catene VL comprende una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 2.

Preferibilmente detto scFv multivalente, preferibilmente bivalente (diabody), o trivalente (triabody) o quadrivalente (tetrabody) ha almeno una catena VL comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 2, preferibilmente il diabody ha almeno due catene VL ciascuna comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 2, il triabody ha tre catene VL ciascuna comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 2, il tetrabody ha quattro catene VL ciascuna comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 2.

Preferibilmente detta IgG, più preferibilmente detta IgG1 e/o detta IgG4 comprende almeno una catena VL comprendete una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 2, preferibilmente detta IgG, più preferibilmente detta IgG1 e/o detta IgG4 comprende almeno due catene VL ciascuna comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 2.

Preferibilmente detto scFv multivalente, preferibilmente bivalente (diabody), o trivalente (triabody) o quadrivalente (tetrabody) hanno almeno una catena VH ed una catena VL ciascuna catena comprendete una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Preferibilmente il diabody ha almeno due catene VH e due catene VL ciascuna catena VH e VL comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Preferibilmente il triabody ha tre catene VH e tre catene VL ciascuna catena VH e VL comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Preferibilmente il tetrabody ha quattro catene VH e quattro catene VL ciascuna catena VH e VL comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

Preferibilmente detta IgG, più preferibilmente detta IgG1 e/o detta IgG4 comprende almeno una catena VH e una catena VL ciascuna catena VH e catena VL comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, preferibilmente detta IgG, più preferibilmente IgG1 e/o IgG4 comprende almeno due catene VH e almeno due catene VL ciascuna catena VH e VL comprendente una CDR3 caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

In una forma di realizzazione preferita le varianti anticorpali come sopra descritte, preferibilmente detto scFv multivalente, più preferibilmente detto scFv bivalente (diabody) e/o trivalente (triabody) e/o quadrivalente (tetrabody), o detta IgG, preferibilmente IgG1 e/o IgG4, comprendono almeno una CDR1 e/o CDR2 della catena VH caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 3 (CDR1) e SEQ ID NO: 4 (CDR2). Preferibilmente tutte le CDR1 e/o le CDR2 della catena VH di dette varianti sono caratterizzate da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 3 (CDR1) e SEQ ID NO: 4 (CDR2).

In una ulteriore forma di realizzazione preferita le varianti anticorpali come sopra descritte, preferibilmente detto scFv multivalente, più preferibilmente detto scFv bivalente (diabody) e/o trivalente (triabody) e/o quadrivalente (tetrabody), o detta IgG, preferibilmente IgG1 e/o IgG4, comprendono almeno una CDR1 e/o CDR2 della catena VL caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 5 (CDR1) e SEQ ID NO: 6 (CDR2). Preferibilmente tutte le CDR1 e/o le CDR2 della catena VL di dette varianti sono caratterizzate da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 5 (CDR1) e SEQ ID NO: 6 (CDR2).

Secondo una forma di realizzazione dell’invenzione la catena VH e la catena VL di detto complesso anticorpale ha una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8. Preferibilmente detto scFv multivalente, preferibilmente bivalente (diabody), o trivalente (triabody) o quadrivalente (tetrabody) hanno almeno una catena VH ed una catena VL caratterizzate rispettivamente da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO:8. Preferibilmente il diabody ha almeno due catene VH e due catene VL ciascuna catena essendo caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO:8. Preferibilmente il triabody ha tre catene VH e tre catene VL ciascuna catena essendo caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO:8. Preferibilmente il tetrabody ha quattro catene VH e quattro catene VL ciascuna catena essendo caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO:8.

Preferibilmente detta IgG, più preferibilmente detta IgG1 e/o detta IgG4 comprende almeno una catena VH e una catena VL ciascuna catena VH e catena VL essendo caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 preferibilmente detta IgG, più preferibilmente IgG1 e/o IgG4 comprende almeno due catene VH e almeno due catene VL ciascuna catena VH e VL essendo caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, la sequenza amminoacidica di ciascuna catena pesante di detta IgG4 comprende SEQ ID NO: 34 e/o la sequenza amminoacidica di ciascuna catena leggera di detta IgG4 comprende SEQ ID NO: 35. Preferibilmente detta IgG4 comprende due catene pensanti caratterizzate da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 34 e/o due catene leggere caratterizzate da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 35.

SEQ ID NO: 34 comprende SEQ ID NO: 7 - ovvero la porzione variabile della catena pesante (VH) - e la porzione costante della catena pesante (CH1cernieraCH2CH3) delle IgG4.

SEQ ID NO: 35 comprende SEQ ID NO: 8 - ovvero la porzione variabile della catena leggera (VL) - e la porzione costante della catena leggera (CL).

Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, la sequenza amminoacidica di ciascuna catena pesante di detta IgG1 comprende SEQ ID NO: 38 e/o la sequenza amminoacidica di ciascuna catena leggera di detta IgG1 comprende SEQ ID NO: 39. Preferibilmente detta IgG1 comprende due catene pensanti caratterizzate da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 38 e/o due catene leggere caratterizzate da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 39.

SEQ ID NO: 38 comprende SEQ ID NO: 7 - ovvero la porzione variabile della catena pesante (VH) - e la porzione costante della catena pesante delle IgG1 (CH1cernieraCH2CH3).

SEQ ID NO: 39 comprende SEQ ID NO: 8 - ovvero la porzione variabile della catena leggera (VL) - e la porzione costante della catena leggera (CL).

Secondo una forma di realizzazione dell’invenzione:

- la sequenza nucleotidica della CDR3 della catena VH comprende SEQ ID NO: 11;

- la sequenza nucleotidica della CDR3 della catena VL comprende SEQ ID NO: 12.

- le sequenze nucleotidiche della CDR1 e CDR2 della catena VH comprendono rispettivamente SEQ ID NO: 13 e 14;

- le sequenze nucleotidiche della CDR1 e CDR2 della catena VL comprendono rispettivamente SEQ ID NO: 15 e 16.

- la sequenza nucleotidica della catena VH comprende SEQ ID NO: 17; - la sequenza nucleotidica della catena VL comprende SEQ ID NO: 18; - la sequenza nucleotidica della catena pesante di detta IgG4 comprende SEQ ID NO: 36;

- la sequenza nucleotidica della catena leggera di detta IgG4 comprende SEQ ID NO: 37;

- la sequenza nucleotidica della catena pesante di detta IgG1 comprende SEQ ID NO: 40;

- la sequenza nucleotidica della catena leggera di detta IgG1 comprende SEQ ID NO: 41.

Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, detto complesso comprende almeno due regioni variabili dirette contro il dominio extracellulare del CD99, preferibilmente sono dirette contro la sequenza amminoacidica SEQ ID NO: 21. Essere dirette contro significa in questo contesto che il complesso anticorpale a cui ci si riferisce, preferibilmente come descritti sopra, sono in grado di riconoscere e legare il dominio extracellulare di CD99, ovvero SEQ ID NO: 21. Si tratta del c.d. epitopo che preferibilmente comprende la sequenza amminoacidica 50-74 della frazione extracellulare del CD99, ovvero SEQ ID NO: 23.

Secondo una forma di realizzazione preferita, ogni unità scFv della molecola scFv multivalente, più preferibilmente di scFv bivalente (diabody) e/o trivalente (triabody) e/o quadrivalente (tetrabody) ha una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 10. La sequenza marcata grigio è il linker ed essa in alcune forme realizzative può essere ripetuta più di una volta. La sequenza nucleotidica di ogni unità scFv della molecola scFv multivalente comprende SEQ ID NO: 20.

Ciascun frammento scFv della molecola scFv multivalente comprende una porzione variabile della catena leggera (VL) e una porzione variabile della catena pesante (VH) come sopra descritte. Le catene VH e VL di ciascun scFv sono tra loro unite da un linker la cui sequenza amminoacidica comprende almeno una copia di SEQ ID NO: 9 (la porzione in grigio in SEQ ID NO: 10), preferibilmente una copia.

La sequenza nucleotidica di detto linker comprende almeno una copia di SEQ ID NO: 19 o sequenze nucleotidiche da essa derivata come risultato della degenerazione del codice genetico, e preferibilmente una, due o tre unità

Un secondo aspetto dell’invenzione riguarda una composizione comprendente il complesso anticorpale come sopra dettagliatamente descritto, preferibilmente comprendente detti scFv, multivalenti, più preferibilmente bivalente (diabody), trivalente (triabody), quadrivalente (tetrabody), o le forme anticorpali IgG, preferibilmente le classi IgG1 e/o IgG4.

Detta composizione può inoltre comprendere un vettore farmacologicamente accettabile, preferibilmente scelto tra: un adiuvante, un veicolante, un tampone, un sale, un antiossidante, un conservante, un surfactante, un poliolo, un disaccaride un polisaccaride, amminoacidi e loro combinazioni.

I vettori farmacologicamente accettabili sono generalmente non tossici per i riceventi ai dosaggi e alle concentrazioni impiegate. I tamponi sono scelti preferibilmente tra: fosfato, citrato, acetato, altri acidi organici e loro combinazioni. Gli antiossidanti sono scelti preferibilmente tra: acido ascorbico e, metionina. I sali sono scelti preferibilmente tra: cloruro di sodio. I conservanti sono scelti preferibilmente tra: octadecildimetilbenzil ammonio cloruro; esametonio cloruro; benzalconio cloruro; benzetonio cloruro; fenolo, butile o alcool benzilico. I surfactanti sono scelti preferibilmente tra: polisorbato 80 (Tween 80), polisorbato 20 (Tween 20), polassamero 188 e loro combinazioni. I polioli sono scelti preferibilmente tra: mannitolo e sorbitolo, i disaccaridi e polisaccaridi sono scelti preferibilmente tra: saccarosio, trealosio, destrano, destrano 40 e loro combinazioni. Gli amminoacidi sono scelti preferibilmente tra: arginina, glicina, istidina, lisina, glutammina, asparagina e loro combinazioni. Le proteine sono scelte preferibilmente tra: albumina di siero, gelatina, immunoglobuline e loro combinazioni. I polimeri idrofili sono scelti preferibilmente tra: polivinilpirrolidone e/o Polietilenglicoli (PEG). L’agente chelante è preferibilmente EDTA. Il complesso metallico è preferibilmente un complesso di proteina Zn.

Secondo la presente descrizione, le varianti anticorpali come sopra descritte, e la composizione sopra descritta possono essere efficacemente utilizzate per scopo per la diagnosi e/o nel trattamento e/o nel follow-up delle leucemie e delle sindromi mielodisplastiche.

Infatti, le forme anticorpali sopra descritte hanno evidenziato questa capacità terapeutica nei confronti delle leucemie e delle sindromi mielodisplastiche. Ciò è stato sorprendente come già in parte riportato sopra, perché la molecola scFv monovalente diretta contro lo stesso epitopo di CD99 come sopra descritto non ha evidenziato queste capacità. Solo nel momento in cui almeno due siti di riconoscimento per questo epitopo sono presenti su un complesso anticorpale si osservano i vantaggi terapeutici qui descritti e rivendicati. Preferibilmente gli scFv, multivalenti, più preferibilmente bivalente (diabody), trivalente (triabody), quadrivalente (tetrabody), o le forme anticorpali IgG, preferibilmente le classi IgG1 e/o IgG4, sono particolarmente efficaci. Le molecole più performanti per gli scopi qui descritti sono il diabody e/o le IgG1 e/o le IgG4, preferibilmente le IgG4 che evidenziano capacità di riconoscimento e legame all’epitopo superiori, così come anche una migliorata attività biologica/terapeutica, soprattutto per la capacità di indurre specificamente la morte delle cellule leucemiche esprimenti CD99, ovvero CD99 positive (+).

Infatti, come mostrato dettagliatamente nella parte sperimentale, gli anticorpi IgG evidenziano dei vantaggi notevoli per alcune applicazioni terapeutiche tra cui: (i) mostrano un’affinità maggiore per CD99 rispetto al monomero e diabody scFv; (ii) in particolare la classe IgG4 mostra una costante di dissociazione (kd) di ben due ordini di grandezza inferiore rispetto a quella dell’scFv; (iii) hanno una migliore farmacocinetica rispetto ai frammenti scFv; (iv) hanno un’emivita maggiore rispetto a scFv, compresa tra 7 e 21 giorni; (v) hanno delle funzioni effettrici quali la citotossicità cellulare anticorpo-dipendente, la fagocitosi cellulare anticorpo-dipendente e la citotossicità mediata dal complemento utili in determinate applicazioni terapeutiche.

Le leucemie a cui la presente invenzione fa riferimento sono preferibilmente scelte tra: leucemia linfoblastica acuta (LLA), leucemia mieloide acuta (LMA), leucemia linfatica cronica (LLC), leucemia mieloide cronica (LMC) e sindrome mielodisplastica (SMD). Particolarmente preferita è la leucemia acuta, più preferibilmente la LLA, o la LMA.

Inoltre, le forme anticorpali IgG, preferibilmente le classi IgG1 e IgG4, hanno evidenziato efficacia terapeutica nei confronti di altre tipologie di tumori rispetto alle leucemie, ovvero anche nei confronti dei tumori solidi esprimenti CD99.

Quindi, un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda le forme anticorpali IgG e suoi derivati, preferibilmente le classi IgG1 e IgG4, come sopra dettagliatamente descritte per il trattamento terapeutico e/o il followup di patologie associate a CD99, preferibilmente in patologie causate o associate ad una espressione alterata, preferibilmente over-espressione, di CD99. Preferibilmente dette patologie sono: tumori solidi e tumori del sangue, i sarcomi tra cui sarcoma di Ewing e sarcomi dei tessuti molli (sarcoma sinoviale, condrosarcoma mesenchimale e rabdomiosarcoma),tumore gastrointestinale, tumore al fegato, tumore al polmone, tumore al seno, tumore alla prostata, tumore al pancreas, tumore testa collo, tumore renale, tumore ai testicoli, tumore alle ovaie, tumori neuroendocrini, melanoma, glioma maligni e astrocitoma, linfomi, leucemie e sindrome mielodisplastica.

I derivati della forma anticorpale IgG qui descritta sono frammenti derivati da esso, preferibilmente detti frammenti sono scelti tra: F (ab') 2, frammento F (ab), VH, VHH, VL, VLL e loro combinazioni

Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, la sequenza amminoacidica di ciascuna catena pesante di detta IgG4 comprende SEQ ID NO: 34 e/o la sequenza amminoacidica di ciascuna catena leggera di detta IgG4 comprende SEQ ID NO: 35. Preferibilmente detta IgG4 comprende due catene pensanti caratterizzate da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 34 e/o due catene leggere caratterizzate da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 35.

SEQ ID NO: 34 comprende SEQ ID NO: 7 - ovvero la porzione variabile della catena pesante (VH) - e la porzione costante della catena pesante (CH1cernieraCH3) delle IgG4.

SEQ ID NO: 35 comprende SEQ ID NO: 8 - ovvero la porzione variabile della catena leggera (VL) - e la porzione costante della catena leggera (CL).

Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, la sequenza amminoacidica di ciascuna catena pesante di detta IgG1 comprende SEQ ID NO: 38 e/o la sequenza amminoacidica di ciascuna catena leggera di detta IgG1 comprende SEQ ID NO: 39. Preferibilmente detta IgG1 comprende due catene pensanti caratterizzate da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 38 e/o due catene leggere caratterizzate da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 39.

SEQ ID NO: 38 comprende SEQ ID NO: 7 - ovvero la porzione variabile della catena pesante (VH) - e la porzione costante della catena pesante delle IgG1 (CH1cernieraCH2CH3).

SEQ ID NO: 39 comprende SEQ ID NO: 8 - ovvero la porzione variabile della catena leggera (VL) - e la porzione costante della catena leggera (CL).

Formano oggetto dell'invenzione anche tutte le sequenze nucleotidiche derivate dalle sequenze nucleotidiche riportate nella Tabella I, per esempio, come risultato della degenerazione del codice genetico.

Le sequenze dell’invenzione sono annotate secondo lo standard Internazionale WIPO ST.25 e la loro descrizione è stata sviluppata con il programma Patent-In 3.5. In allegato si trova la descrizione delle sequenze.

Nella presente invenzione, sono comprese le sequenze identificate nella Tabella I e nella descrizione delle sequenze allegata alla presente domande. Tutte le sequenze aventi una identità variabile da 80 a 99,9% con le sequenze comprese in Tabella I sono da considerarsi comprese nella presente descrizione.

Nella Tabella I a seguire sono riportate tutte le sequenze amminoacidiche e nucleotidiche ed il corrispondente “Sequence Identifier”.

Gli amminoacidi sottolineati sono quelli soggetti a maggiore variabilità. Tabella I

In un ulteriore aspetto dell’invenzione, il complesso anticorpale o la composizione come sopra descritti sono utilizzati singolarmente od in combinazione con gli altri trattamenti terapeutici convenzionali, ovvero con altri chemioterapici e/o chirurgia e/o immunoterapia e/o radioterapia e/o terapia mirata.

Chemioterapici di possibile uso in combinazione sono scelti tra: citarabina daunorubicina, idarubicina, azacitidina, decitabina, doxorubicina e loro combinazioni. Farmaci mirati di possibile uso in combinazione sono scelti tra: inibitori protein-chinasici, tirosin-chinasici e inibitori di FLT3 tra cui midostaurina e Imatinib, inibitori dell'enzima 'isocitrato deidrogenasi-1 o 2 (IDH2) tra cui enasidenib e altri farmaci epigenetici; inibitori di Bcl-2. Anticorpi ed immunoterapici di possibile uso in combinazione sono scelti tra: anticorpi contro CD33, CD44, CD37, CD123, immunoconiugati (ADCs), BiTe, DARTs, cellule CAR-T, cellule TCR-T, immunocheckpoint inhibitors, vaccini.

In un ulteriore aspetto dell’invenzione, il complesso anticorpale o la composizione come sopra descritti è/sono utilizzato/i a scopo diagnostico, per individuare e distinguere le cellule tumorali, preferibilmente le cellule leucemiche, preferibilmente di leucemie che iper-esprimono CD99 da quelle di altri tipi di tumore o da cellule normali. Più preferibilmente la tipizzazione delle cellule tumorali avviene mediante studi citofluorimetrici, immunoistochimici o di immunofluorescenza e di biologia molecolare per la determinazione dell’espressione di RNA messaggeri per CD99.

Secondo una specifica forma di realizzazione della presente invenzione, il complesso anticorpale o la composizione come sopra descritti sono utilizzati per veicolare nelle cellule tumorali, preferibilmente nelle cellule leucemiche che esprimono CD99; composti citotossici, preferibilmente ad azione anti-tumorale, che includono agenti della classe delle Calichemicine, inibitori dei microtubuli come DM1, antimitotici come monometil auristatina E (MMAE) e similari.

Infatti, il complesso anticorpale della presente invenzione può essere coniugato con composti citotossi, per esempio metalli, tossine di origine microbica o vegetale, radioisotopi, enzimi e composti generalmente utilizzati a tale scopo.

Preferibilmente, il complesso anticorpale, preferibilmente gli scFv, multivalenti, più preferibilmente bivalente (diabody), trivalente (triabody), quadrivalente (tetrabody), o le forme anticorpali IgG, preferibilmente le classi IgG1 e/o IgG4, possono essere modificati con l’aggiunta di PEG per aumentarne il tempo di ritenzione nel circolo sanguigno in una persona che riceva detto complesso anticorpale.

Alternativamente può essere coniugato con un marcatore/tracciante rilevabile per esempio con tecniche di imaging. Alternativamente esso può essere immobilizzato su un supporto solido solida e/o coniugato con un composto eterologo.

Secondo una forma di realizzazione dell’invenzione, il complesso anticorpale come sopra dettagliatamente descritto può essere bi-specifico o multispecifico reattivo con uno o più ulteriori antigeni, preferibilmente antigeni noti come target per le terapie contro il cancro.

Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il complesso anticorpale come sopra dettagliatamente descritto può essere utilizzato anche nella realizzazione di linfociti T con recettori antigenici chimerici (CAR-T cells) diretti contro cellule tumorali esprimenti CD99.

L'invenzione riguarda anche un kit immunodiagnostico per il riconoscimento della proteina umana CD99, in particolare il dominio extracellulare di CD99, preferibilmente l'epitopo 50-74 comprendente il complesso anticorpale come sopra dettagliatamente descritto, preferibilmente comprendente detti scFv, multivalenti, più preferibilmente bivalente (diabody), trivalente (triabody), quadrivalente (tetrabody), o le forme anticorpali IgG, preferibilmente le classi IgG1 e/o IgG4.

Detto kit immunodiagnostico è impiegato preferibilmente per la diagnosi tumorale, preferibilmente per diagnosticare patologie caratterizzate dall’espressione di CD99, preferibilmente overespressione di CD99, preferibilmente dette patologie essendo scelte tra: leucemie, sindromi mielodisplastiche, e tumori solidi esprimenti CD99, preferibilmente scelti tra: i sarcomi tra cui sarcoma di Ewing e sarcomi dei tessuti molli (sarcoma sinoviale, condrosarcoma mesenchimale e rabdomiosarcoma),tumore gastrointestinale, tumore al fegato, tumore al polmone, tumore al seno, tumore alla prostata, tumore al pancreas, tumore testa collo, tumore renale, tumore ai testicoli, tumore alle ovaie, tumori neuroendocrini, melanoma, glioma maligni e astrocitoma, linfomi,

Il kit comprende anche materiale monouso e sterile per lo svolgimento della procedura diagnostica.

Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda un metodo per la prevenzione e/o per il trattamento e/o per il follow-up delle leucemie esprimenti la proteina CD99, in particolare delle forme di leucemie che iper-esprimono la proteina CD99.

Detto metodo comprende una fase di somministrazione di almeno una dose terapeuticamente efficace del complesso anticorpale della presente invenzione e/o della composizione comprendente detto complesso o dell’anticorpo anti-CD99 della presente invenzione a pazienti che necessitano di una diagnosi differenziale delle leucemie o di un trattamento per la cura di leucemie esprimenti CD99.

Come qui usato, il termine "dose terapeuticamente efficace" si riferisce ad una quantità che è sufficiente per ottenere il risultato terapeutico desiderato o per avere un effetto su sintomi indesiderati, ma è generalmente insufficiente a causare effetti collaterali avversi.

La somministrazione può essere orale, endovenosa, intraperitoneale, sottocutanea, polmonare, transdermica, intramuscolare, intranasale, buccale, sublinguale o supposta.

ESEMPIO

C7dAbd

Il C7 diabody (C7dAbd) è un derivato dimerico di scFv C7 caratterizzato da una lunghezza ridotta del linker tra la regione variabile della catena pesante (VH) e la regione variabile della catena leggera (VL) nell’scFvC7 da 15 a 5 amminoacidi. L’scFv C7 specifico per il dominio extracellulare della molecola di adesione umana CD99, è stato isolato da una libreria anticorpale fagica sintetica umana utilizzando l’antigene CD99 per il panning come descritto nella domanda di brevetto WO2011058517.

Valutazione dell’affinità per l’antigene CD99 di C7dAbd e C7IgG L’affinità di C7 nei formati scFv, dAbd, IgG4 e IgG1 per il dominio extracellulare dell’antigene CD99 è stata valutata tramite una metodica ELISA come riportato in Rath S et al 1988 con piccole modifiche, utilizzando l’antigene CD99ecd/GST come target.

I risultati sono riportati in Tabella II e mostrano un’affinità apparente, espressa come costante di dissociazione (kd) simile tra scFv e diabody mentre l’affinità di C7IgG4 è risultata sorprendentemente elevata e quella di IgG1 invece più bassa. In questo caso la variante IgG4 mostra una kd di ben due ordini di grandezza inferiore rispetto a quella dell’scFvC7 originario. Ciò è sorprendete perché diversi studi riportano una perdita di affinità dopo la conversione di frammenti scFv in IgG come nel caso di C7IgG1, o che le varianti IgG mantengono la stessa affinità dell’scFv da cui derivano.

Tabella II

Valutazione della reattività su cellule tumorali leucemiche

scFvC7 (ovvero il monomero scFv) è stato caratterizzato per la sua specificità su cellule esprimenti CD99 come descritto nella domanda di brevetto WO2011058517. I risultati di questi studi mostrano che scFvC7 è in grado di legarsi in modo specifico a cellule e tessuti di sarcoma di Ewing mentre – secondo questi studi - non si dimostra reattivo in altri tipi di cellule tumorali esprimenti CD99.

Inaspettatamente, in un analisi in citofluorimetria di un pannello di linee di leucemia linfoblastica acuta (T-ALL), lo stesso anticorpo C7 in formato diabody avente un’affinità per CD99 simile all’scFvC7, è risultato reattivo in 9/9 linee testate incluse quelle che risultavano negative al legame con scFv (Fig.1A-L).

I livelli di intensità di fluorescenza (mean fluorescence intensity; MFI) sono variabili a seconda della linea testata.

Questo è un risultato inaspettato dato che scFvC7 e C7dAbd condividono la stessa sequenza VH e VL e dimostrano una simile affinità per CD99. Risultati simili sono stati ottenuti in analisi in microscopia a fluorescenza dove C7dAb è risultato reattivo con tutte le linee cellulari di T-ALL analizzate (Fig. 2).

L’analisi della reattività di C7dAbd in citofluorimetria per le cellule leucemiche è stata quindi estesa anche a linee cellulari di leucemia mieloide acuta (AML). Anche in questo caso le cellule si sono dimostrate altamente positive per il legame con C7 diabody (Fig.3).

Ad ulteriore conferma della diversa specificità tra C7 in formato scFv e C7 in formato diabody per le cellule leucemiche esprimenti CD99, è stata testata la linea cellulare MOLT-16 di T-ALL e la linea cellulare THP-1 di AML per la reattività a scFvC7 in citofluorimetria. Entrambe le linee cellulari sono altamente positive al legame per C7dAbd (Fig.1G e 3A) mentre si sono dimostrate completamente negative al legame con scFv alle stesse concentrazioni di utilizzo (Fig.4).

Molto probabilmente, la differente specificità tra scFv e diabody per le cellule leucemiche non è dettata da una diversa affinità per l’antigene ma potrebbe essere legata alle diverse caratteristiche chimico-fisiche e strutturali tra le due molecole. L’scFv ha dimensioni ridotte (25kDa) rispetto al diabdoy (50kDa) ed un solo sito di legame per l’antigene e potrebbe riconoscere un epitopo di CD99 più accessibile sulle cellule di sarcoma di Ewing e che viene mascherato nelle cellule leucemiche, oppure ci potrebbe essere una diversa conformazione di CD99 nelle Ewing e leucemie.

Allo scopo di indagare la risposta delle cellule, in particolare la morte cellulare, indotta dal legame con gli anticorpi in oggetto sono stati condotti dei saggi in citofluorimetria con Annessina V e ioduro di propidio. Un pannello di 7 linee di T-ALL sono state trattate con diverse concentrazioni di C7dAbd. I risultati mostrati in Fig.5 mostrano che tutte le cellule analizzate sono suscettibili alla morte cellulare indotta da C7dAb sebbene con livelli di intensità differenti.

In un altro set di esperimenti due linee di T-ALL, le ALL-SILL altamente positive e le CCRF-CEM meno positive al legame con C7dAbd (Fig. 1F e1B rispettivamente) e all’induzione di morte cellulare (Fig. 5), e la linea cellulare THP-1 di AML altamente positiva al legame con C7dAbd (Fig.3), sono state trattate con C7dAbd alla concentrazione fissa di 100µg/ml a diversi tempi di incubazione. Anche in questo caso tutte le linee testate sono risultate suscettibili al trattamento con l’anticorpo con un’efficacia evidente già dopo un’ora di incubazione e che raggiunge il massimo dopo due ore (Fig. 6). Le linee cellulari ALL-SILL ed in particolar modo la linea di AML THP-1 si sono confermate altamente suscettibili alla morte indotta da C7dAbd.

C7 IgG

I frammenti anticorpali come gli scFv sono caratterizzati da un’emivita in circolo di alcune ore mentre gli anticorpi IgG hanno una emivita che varia da 7 a 21 giorni. Gli anticorpi in formato IgG mostrano anche delle funzioni effettrici quali la citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (antibodydependent cellular cytotoxicity; ADCC), la fagocitosi cellulare anicorpodipendente (Antibody Dependant Cellular Phagocytosis; ADCP) e la citotossicità mediata dal complemento (complement-dependent cytotoxicity (CDC), che dipendono dalla presenza del frammento costante (Fc) e il legame con diversi recettori per Fc, che potrebbero essere utili in determinate applicazioni terapeutiche (Kellner C 2017).

Sono stati creati due derivati IgG di scFv C7, il primo appartiene alla sottoclasse IgG4 ed il secondo alla sottoclasse IgG1.

C7IgG4 è stato generato fondendo la sequenza della regione variabile della catena leggera (VL) di scFvC7 alla sequenza della regione costante della catena leggera umana di IgG4 e fondendo la sequenza della regione variabile della catena pesante (VH) di scFvC7 alla sequenza della regione costante della catena pesante umana di IgG4.

IgG1 è stato generato allo stesso modo fondendo però le regioni VL e VH di scFvC7 alle rispettive sequenze costanti di IgG1 umane.

I due derivati IgG di C7 sono stati testati per valutare l’affinità per CD99 ricombinante come riportato in Tabella II e la loro affinità apparente è risultata sorprendentemente elevata per la variante IgG4 mentre più bassa per IgG1.

Sebbene la letteratura documenti una perdita di affinità dopo la conversione di frammenti scFv in IgG o che le varianti IgG mantengono la stessa affinità dell’scFv da cui derivano la variante IgG4 qui descritta e testata mostra una kd di ben due ordini di grandezza inferiore rispetto a quella dell’scFvC7 originario. C7-IgG4 e C7-IgG1 sono stati poi analizzati per la reattività verso le cellule di T-ALL e AML tramite saggi di citofluorimetria.

I risultati ottenuti sono analoghi a quelli di C7 in formato diabody. Anche in questo caso infatti, le IgG1 ed in particolare le IgG4 sono risultati altamente reattivi nelle cellule leucemiche (Fig.7 e 8). Per quanto riguarda C7IgG4, la reattività nelle cellule di T-ALL ALL-SIL e di AML THP-1 e MV4-11 rimane ad elevati livelli fino alla più bassa concentrazione indagata di 6.25µg/ml.

Sono stati quindi condotti dei saggi in citofluorimetria con Annessina V e ioduro di propidio, per analizzare l’efficacia terapeutica di C7IgG4 valutando l’induzione della morte cellulare in un pannello di linee di T-ALL e AML. Le cellule sono state trattate con C7IgG4 alla concentrazione fissa di 50µg/ml a diversi tempi di incubazione. I risultati mostrati in Fig.9 dimostrano che tutte le cellule analizzate sono suscettibili alla morte cellulare indotta da C7IgG4 con un’efficacia evidente già dopo un’ora di incubazione ma con livelli di intensità differenti.

In maniera simile, la IgG1 è in grado di indurre la morte di cellule di AML THP-1 e di T-ALL CCRF-CEM dopo un’ora di trattamento con diverse concentrazioni di anticorpo (Fig.10). In particolare, le cellule THP-1 che sono più reattive al legame dAbd, IgG4 e IgG1, risultano particolarmente sensibili al trattamento mentre le CCRF-CEM sono più resistenti.

Studio di internalizzazione di C7 diabody

Sono stati condotti degli studi tramite microscopia confocale per valutare se C7dAbd è in grado di internalizzare dopo il legame a CD99 sulla superficie cellulare. Gli esperimenti sono stati condotti su cellule di T-ALL e AML ed evidenziano la capacità di C7dAbd di penetrare all’interno della cellula (Fig.11). In particolare la cinetica e il tasso di internalizzazione rispecchiano la cinetica e il tasso di morte cellulare indotta da C7dAbd (Fig.6). Nelle cellule THP-1 che muoiono in maniera veloce e massiva dopo il trattamento con C7dAbd, il segnale è già tutto interno dopo 30 minuti mentre nelle CCRF-CEM che hanno una cinetica più lenta e un minor tasso di morte cellulare il segnale si ritrova all’interno di alcune cellule dopo 1 ora di incubazione. Questo risultato è utile per capire il meccanismo d’azione dell’anticorpo e consente anche l’uso di C7dAbd in applicazioni che richiedono l’internalizzazione dell’anticorpo come nel caso degli Antibody-drug conjugates (ADCs).

Selezione della specie rilevante per la valutazione della sicurezza preclinica di C7dAbd

Nel processo di sviluppo di un nuovo bioterapeutico e nel disegno degli studi preclinici mirati a stabilirne la sicurezza, è di fondamentale importanza la selezione della specie rilevante. Come riportato nella linea guida “CHMP Note for guidance on Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals (ICH S6) (CHMP / ICH / 302/95)”, una specie rilevante è quella in cui il materiale di prova è farmacologicamente attivo a causa dell'espressione del recettore o dell’epitopo, nel caso di anticorpi monoclonali.

La molecola di adesione CD99 è una proteina transmembrana di tipo I altamente glicosilata, piccola, (32 kDa nell'uomo) codificata dal gene MIC2 che non appartiene a nessuna famiglia nota di proteine. Il CD99 ha una struttura unica e non è correlata a nessun'altra molecola nel genoma umano, ad eccezione del paralogo simile a CD99 (CD99L2), che può essere originato da un gene ancestrale comune. Il gene MIC2 si trova nella regione pseudo-autosomica dei cromosomi sessuali, X (Xp22.33-Xpter) e Y (Yp11-Ypter). Il gene mostra una lunghezza di 50kb e contiene 10 piccoli esoni. La ricerca di omologhi di CD99 mediante esperimenti di ibridazione incrociata con cDNA o con sonde a singolo esone ha avuto successo solo nei primati, indicando un alto livello di divergenza di questo gene durante l'evoluzione. Nell'uomo il gene MIC2 codifica due distinte proteine a seguito di un processo di splicing alternativo: un CD99 full length o di tipo 1 (CD99wt) e una forma troncata detta CD99 di tipo II (CD99sh) con un dominio citoplasmatico più corto. Entrambe le isoforme sono conservate nei primati. Il gene D4 situato nella regione C7-D1 del cromosoma 4 è stato identificato come un ortologo di topo del CD99 umano. L'analisi dell'organizzazione genomica ha rivelato che il gene contiene 10 esoni putativi mentre il cDNA consiste di nove esoni che codificano per una proteina che condivide il 46% di identità con CD99 umano. Le molecole di CD99 di roditori hanno un dominio citoplasmatico corto, come si trova nell'isoforma umana CD99 di tipo II. CD99 di topo mostra caratteristiche biochimiche, omologia funzionale e modelli di espressione simili a quelli del CD99 umano.

Allo scopo di identificare la specie più rilevante per gli studi preclinici di C7dAbd sono stati presi in considerazione non solo i dati della letteratura scientifica e l'analisi dell'omologia dell'antigene target sui database di sequenze pubbliche, ma anche i dati sperimentali sul riconoscimento dell'epitopo bersaglio in tre diverse specie (due primati e un roditore).

Al fine di trovare una specie rilevante per gli studi non clinici di C7 dAbd è stata analizzata l'omologia della sequenza di CD99 e dell’epitopo di scFvC7 tra diverse specie. Infine, è stato clonato e purificato il dominio extracellulare CD99 delle specie selezionate per l'analisi dell'affinità di legame a C7dAbd.

Omologia di sequenza tra CD99 in diverse specie

L’omologia tra CD99 umano e quella di specie diverse è stata studiata utilizzando il programma NCBI BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/;. L’analisi è stata focalizzata sulla scimmia cynomolgus (Macaca fascicularis) e sulla scimmia verde africana (Chlorocebus aethiops) che sono due specie di primati non umani (NHP) largamente usati negli studi preclinici di anticorpi monoclonali e sull'omologia di CD99 di topo. Gli allineamenti di sequenza (Tabella II e Fig.12) hanno rivelato che CD99 umano condivide il 55-93% di omologia con gli omologhi delle specie analizzate con i valori più alti (92-93%) per le proteine dei primati. Inoltre, l'intera regione dell’epitopo è ben conservata nei primati ma non nel topo (Figura 12B).

Tabella II. La sequenza amminoacidica umana di CD99 comparata con quella di altre specie.

Per determinare la cross-reattività e la potenza di legame di C7dAbd per il CD99 delle specie analizzate, i domini extracellulari di CD99 di cynomolgus monkey, African green monkey e di topo sono stati clonati dai rispettivi geni e le proteine ricombinanti espresse in E.coli e purificate. Dopo la purificazione le proteine sono state utilizzate come antigeni target in saggi ELISA per valutare la reattività di C7dAbd. I risultati sono mostrati in Fig.13 e mostrano che l’anticorpo è in grado di reagire con i CD99 di tutte e tre le specie analizzate ma con diversa affinità. In particolare, C7dAbd riconosce il CD99 umano e dei due primati con un’affinità molto simile e molto più elevata rispetto a quella osservata per il CD99 di topo. In conclusione, i risultati ottenuti sulla cross-reattività di C7dAbd, le omologie di sequenza e le informazioni disponibili suggeriscono fortemente che i NHP come cynomolgus monkey o African Green monkey possono essere considerati le specie più rilevanti per la determinazione preclinica della sicurezza di C7 dAbd.

Preparazione dei costrutti genetici di C7dAbd, C7IgG4 e C7IgG1.

C7dAbd. Il costrutto genico di C7dAbd è stato creato partendo da quello di scFv C7 riducendo la lunghezza del linker tra VH eVL da 15 a 5 amminoacidi. I primers utilizzati per il clonaggio sono elencati in Tabella I. In un primo step di PCR la sequenza VH di scFvC7 è stata amplificata utilizzando la coppia di primers SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 25 introducendo all’estremità 5’ dell’amplificato un sito di taglio per l’enzima NcoI; mentre la sequenza VL è stata amplificata con la coppia di primers SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27 (i siti di restrizione per NcoI, NdeI and EcoRI sono in corsivo. Il codone di stop è sottolineato), quest’ultimo contenente un codone di stop seguito da un sito taglio per l’enzima EcoRI. I primers SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 contengono una regione che si sovrappone tra loro corrispondente ai 5 residui componenti il linker tra VH e VL; in questo modo le sequenze VH e VL amplificate contengono questa regione di sovrapposizione che può essere estesa in una reazione di PCR. Le sequenze VH e VL amplificate sono state utilizzate come templato ed unite in una seconda PCR utilizzando i primers SEQ ID No 24 e SEQ ID No 27 (per l’amplificazione. Gli amplificati sono stati digeriti insieme al vettore pET22b(+) (Merck Millipore) con gli enzimi NcoI e EcoRI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) a 37°C per 3 ore. I prodotti digeriti sono stati purificati e ligati insieme con la T4 DNA ligasi (Promega, Madison, WI, USA) a 4°C overnight. La miscela di ligazione è stata trasformata nel ceppo di E.coli BL21(DE3) ((F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3)) per consentire l’espressione e la purificazione della proteina. I cloni positivi sono stata analizzati per il corretto inserimento del costrutto tramite sequenziamento.

C7IgG4 e C7IgG1. I geni che codificano per la catena leggera e per la catena pesante di C7IgG4 e C7IgG1 sono stati sintetizzati da GeneScript (Piscataway, NJ, USA) ed inseriti nel vettore pcDNA3.1(-) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). In particolare i costrutti genici delle catene leggere contengono la sequenza VL di scFvC7 fusa alla sequenza della regione costante di IgG4 (per C7IgG4) o IgG1 (per C7IgG1) umane, mentre i costrutti genici delle catene pesanti contengono la sequenza VH di scFvC7 fusa alla sequenza della regione costante di IgG4 (per C7IgG4) o IgG1 (per C7IgG1) umane.

Purificazione di C7dAbd

La purificazione di C7dAbd è stata effettuata come descritto in Moricoli D, 2015. Brevemente, cellule di E. coli BL21(DE3) contenenti il costrutto genico C7dAbd, sono state fatte crescere overnight a 37°C in agitazione in terreno LB addizionato di ampicillina alla concentrazione di 100 µg/ml. La coltura è stata quindi inoculata in terreno sintetico addizionato di ampicillina 50 µg/ml in un bioreattore da 20L (Biostat C, Sartorius). Nel bioreattore i batteri sono stati fatti crescere fino ad un O.D.600 di 10. L’espressione di C7dAbd è stata quindi indotta aggiungendo Isopropyl- --thiogalactopyranoside (IPTG) 1mM e saccarosio 40mM alla coltura. Dopo 3 ore dall’induzione la coltura cellulare è stata raccolta tramite centrifugazione. Il pellet cellulare è stato quindi risospeso in un buffer di lisi (buffer L) contenente: 30mM Saccarosio, 2mM EDTA, 1mM DTT and 20 mM tampone fosfato pH 7.0; e sottoposto a distruzione cellulare tramite un omogeneizzatore (GEA Niro Soavi) a 680 bar e quindi centrifugato a 8000 rpm per 60 min at 4 °C. Il surnatante è stato utilizzato per la purificazione di C7dAbd tramite sistema cromatografico automatico AKTA explorer 100 (GE-Healthcare). Il primo step cromatografico consiste in una cromatografia a scambio cationico con resina SP sepharose fast flow (GE Healthcare equilibrata con buffer L. Dopo caricamento del campione e successivi lavaggi, la proteina è stata eluita con buffer L addizionato di NaCl 0.5M Il secondo ed ultimo step di purificazione prevede una cromatografia di affinità con proteina A ricombinante utilizzando la resina rProteinA Sepharose fast flow (GE Healthcare) equilibrata con PBS (phosphate buffer saline). L’eluato della resina SP è stato caricato in colonna e dopo lavaggi il C7dAbd è stato eluito con un buffer contenente 0.1M Sodium citrate pH 3 e 0.05% (v/v) glicerolo e immediatamente neutralizzato a pH 7 con 1M Tris. Infine, C7dAbd è stato filtrato utilizzando Sartobind Q device (Sartorius) e con filtri da 0.22 m e stoccato a -80°c in aliquote. La determinazione della concentrazione proteica è stata valutata tramite assorbimento a 280nm e la purezza tramite SDS-PAGE.

Produzione di C7IgG4 e C7IgG1

Per la produzione di C7IgG4 e C7IgG1 i plasmidi contenenti la catena leggera e la catena pesante di C7IgG4 o C7IgG1 sono stati co-trasfettati in cellule Expi293FTM fatte crescere in terreno privo di siero Expi293TM Expression Medium (Thermo Fisher Scientific). Le cellule sono state mantenute in fiasche Erlenmeyer (Corning Inc.) a 37°C con 8% CO2 in un orbital shaker (VWR Scientific). Il giorno precedente la trasfezione, le cellule sono state seminate alla densità appropriate in fiasche Corning Erlenmeyer. Il giorno della trafsezione il DNA e ExpiFectamine™ 293 Reagent (Thermo Fisher Scientific) sono stati miscelati e aggiunti alle fiasche contenenti le cellule. 16–18 dopo la trasfezione, ExpiFectamine™ 293 Transfection Enhancer 1 e ExpiFectamine™ 293 Transfection Enhancer 2 (Thermo Fisher Scientific) sono stati aggiunti ad ogni fiasca. I surnatanti delle colture cellulari contenenti gli anticorpi sono stati prelevati 6 giorni dopo la trasfezione, centrifugati, filtrati e utilizzati per la purificazione su proteina A. Dopo l’eluizione il pool è stato dializzato in PBS, aliquotato e stoccato a -80°C. La determinazione della concentrazione proteica è stata valutata tramite assorbimento a 280nm e la purezza tramite SDS-PAGE.

Clonaggio e purificazione CD99ecd/GST umana

Il dominio extracellulare di CD99 è stato amplificato dal costrutto genetico CD99ecd in pQE30Xa con i primers CD99BamHI Fw: 5’-GGAACGGATCCGATGGTGGTTTCGAT-3’ (SEQ ID NO: 28) e CD99_EcoRIRev:5’-GGCTGGAATTCCTAGTCGGCCTCTTCCC-3’ (SEQ ID NO: 29) introducendo all’estremità 5’ dell’amplificato un sito di taglio per l’enzima BamHI e all’estremità 3’ un sito per EcoRI. L’amplificato è stato digerito insieme al vettore pGEX-2T (GE Healthcare Life Sciences) che consente di fondere il gene di interesse a valle del gene per la Glutatione-S-transferasi, con gli enzimi BamHI e EcoRI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) a 37°C per 3 ore. Inserto e vettore digeriti sono stati purificati e ligati insieme con la T4 DNA ligasi (Promega, Madison, WI, USA) a 4°C overnight. La miscela di ligazione è stata trasformata nel ceppo di E.coli BL21(DE3) per consentire l’espressione e la purificazione della proteina. I cloni positivi sono stati analizzati per il corretto inserimento del costrutto tramite sequenziamento.

Le cellule di E.coli contenenti il plasmide pGEX+CD99ecd/GST sono state fatte crescere in beuta in 1L di terreno LB addizionato di ampicillina 100µg/ml a 37°C in un agitatore orbitante fino al raggiungimento di un’OD600 di circa 0.6. A quel punto l’espressione proteica è stata indotta addizionando IPTG 1mM alla coltura. La crescita cellulare è stata mantenuta a 37°C in agitazione per ulteriori 3 ore dopodiché le cellule sono state raccolte tramite centrifugazione. Il pellet cellulare è stato risospeso in 100ml di PBS e quindi lisato tramite sonicazione. Il lisato cellulare è stato centrifugato a 10.200 rpm per 30’ a 4°C ed il surnatante raccolto, filtrato e caricato, per la purificazione di CD99ecd/GST tramite cromatografia per affinità, su resina Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare Life Sciences) precedentemente equilibrata in PBS. Dopo lavaggio con PBS, la proteina d’interesse è stata eluita con tampone 50 mM Tris-HCl, 10 mM GSH, pH 8.0. La determinazione della concentrazione proteica è stata valutata tramite saggio Bradford e la purezza tramite SDS-PAGE. Il pool è stato aliquotato e le aliquote mantenute a -80°C.

Determinazione della kd tramite ELISA

L’affinità di legame espresso come costante di dissociazione (kd) di scFv C7, C7dAbd, C7IgG4 e C7IgG1 per CD99, è stata determinata tramite analisi di saturazione del legame all’equilibrio con un saggio ELISA competitivo in accordo a quanto descritto in Rath S 1988 con piccole variazioni. Un primo saggio di titolazione in ELISA è stato eseguito per determinare la concentrazione di anticorpo che determina il 50% di legame all’antigene (EC50). Allo scopo, piastre da 96 pozzetti sono state sensibilizzate distribuendo 500ng/pozzetto di CD99ecd/GST diluito in Tampone Carbonato 0,5M pH 9.6 e incubando ON a 4°C. Dopo 3 lavaggi con PBS addizionato con 0,05% V/V di Tween20, le piastre sono state bloccate con una soluzione al 1%W/V di BSA in PBS (PBSB), pH 7.4 per 60 min. a 37°C. Dopo lavaggio, le piastre sono state incubate per 1 ora a 37°C con diluizioni seriali di C7 (da 200µg/ml a 0,03µg/ml in triplicato) diluito in PBSB e dispensato 100µl/pozzetto). Le piastre sono state incubate a 37°C per 90 minuti. Dopo lavaggio è stato dispensata 100 µl/pozzetto, una diluizione di anti-scFv policlonale diluita 1:500 in PBSB ed incubata per 60 minuti a 37°C. Dopo lavaggi è stata aggiunta 100µl pozzetto una diluizione di 1:1000v/v dell’anticorpo di rivelazione costituito da anti-rabbit HRP in PBSB. Dopo incubazione di 1 ora a 37°C le piastre sono state lavate di nuovo ed è stata aggiunta la soluzione colorante costituita da ABTS

L’intensità di colorazione è stata letta a 405nm con microplate reader.

I risultati sottratti del background sono stati utilizzati per costruire con software statistico (Graphpad 4) una Curva di Michaelis Menten al fine di stabilire il valore di EC50.

E’ stato quindi allestito un saggio ELISA di tipo competitivo. A tal fine è stato effettuato un coating con 500ng a pozzetto di CD99ecd/GST diluito in Tampone Carbonato 0,5M pH 9.6 e incubando ON a 4°C. Dopo 3 lavaggi con PBS addizionato con 0,05% V/V di Tween20 le piastre sono state bloccate con una soluzione di PBSB erogata 100 µl pozzetto ed incubata 60 minuti a 37°C. Dopo lavaggi, sono state piastrate diluizioni seriali di antigene CD99ecd/GST da 400 µg/ml a 0,015ug/ml diluito in PBSB in presenza dell’anticorpo alla quantità stabilita da EC50 calcolato con il precedente ELISA diretto. La determinazione del segnale di scFvC7 e C7 diabody è stata effettuata erogando in un primo step un anticorpo policlonale anti scFv generato in conigli immunizzati con scFvC7 e diluito 1:500v/v in PBSB e successivamente con un anti rabbit HRP diluito 1:1000v/v. La rilevazione di C7IgG4 e C7IgG1 è stata effettuata erogando un anti- Human IgG HRP diluito 1:1000v/v. Dopo incubazione e lavaggi il segnale è stato evidenziato con aggiunta di ABTS come substrato cromo genico. Dopo lettura delle assorbanze a 405nm è stato calcolato il risultato con software GraphPad effettuando una curva di decadimento monoesponenziale e definendo l’IC50 ossia la quantità in molarità dell’inibitore richiesto per fornire il 50% di inibizione del segnale.

Linee cellulari

Le linee cellulari leucemiche sono state coltivate in terreno RPMI-1640 (Carlo Erba) completato con 10% di siero fetale bovino decomplementato (FBS, Fetal Bovine Serum), 2mM L-Glutammina e 1%v/v di Penicillina-Streptomicina. Tutte le linee cellulari sono state mantenute in incubatore a 37°C in atmosfera umidificata e 5% di CO2.

Immunofluorescenza

Le cellule sono state trattate sotto cappa a flusso laminare rispettando le condizioni di sterilità e la loro vitalità è stata monitorata al microscopio.

Le cellule sono state lavate con terreno di coltura pre-riscaldato a 37°C e centrifugate per 6 minuti a 1600 rpm il surnatante è stato eliminato mentre il pellet è stato risospeso in 10 mL di PBS e lavato in questa soluzione per 3 volte. E’ stata quindi effettuata la conta su camera emocromocitometrica dopo colorazione con Trypan Blue, quindi 3,5x106 cellule sono state prelevate per essere fissate.

La fissazione è stata effettuata con Formaldeide al 4% (v/v) in PBS; dopo centrifugata le cellule sono state risospese in 6 ml di questa soluzione portando la loro concentrazione a 5x105cellule/ml. Questa sospensione è stata seminata in piastra da 6 wells, 1 ml per pozzetto con vetrino copri oggetto posto sul fondo. La fase di fissaggio è stata mantenuta 15 minuti a temperatura ambiente, successivamente le cellule sono state lavate per 3 volte con 3 mL di PBS. Le cellule sono state trattate a temperatura ambiente per 60 minuti con una soluzione di blocco costituita da PBS 1X, 1%W/V di BSA e 0,05 %W/V di gelatina disciolta a 37°C. A questo punto è stato aggiunto l’anticorpo C7dAbd diluito in PBS 1 mL per pozzetto e lasciato ad incubare per 90 minuti. Dopo la fase di incubazione sono stati effettuati 3 lavaggi con 3 mL di PSB 1X per pozzetto; Successivamente è stata erogata la proteina A-FITC diluita 1:1000v/v in soluzione di blocco ed incubata al buio per 60 minuti. Dopo 3 lavaggi è stato aggiunto DAPI diluito 1:10000v/v in PBS 1X; questa soluzione è stata mantenuta a contatto con le cellule per un minuto; le cellule sono state infine lavate di nuovo e sottoposte all’analisi microscopica. I segnali sono stati evidenziati con microscopio a Fluorescenza Leica DMLB equipaggiato con camera digitale DC300F CCD.

Saggio di binding in citofluorimetria

Le cellule sono state prelevate dalle Fiasche e poste in tubo con 11 mL di terreno di coltura pre-riscaldato a 37°C, precipitate centrifugando per 6 minuti a 1600 rpm, eliminando dopo centrifugata il sopranatante; il pellet è stato risospeso in 3 ml di terreno ed è stata effettuata la conta su camera emocromocitometrica dopo colorazione con Trypan Blue, quindi la densità cellulare è stata portata a 5x105 cellule/ml aggiungendo terreno. Sono stati preparati tubi da citofluorimetria, erogando 1 ml della sospensione cellulare per ogni tubo.

Le cellule sono state poi lavate 2 volte in 4 ml di PBS 1 X centrifugando a 1600 rpm per 6 min, eliminando ogni volta il surnatante. Successivamente sono state risospese in 200 l di soluzione di blocco costituita da PBS 1X e BSA 1% w/v; questa condizione è stata mantenuta per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo questa fase, è stato aggiunto l’anticorpo nei 200 l di soluzione di blocco che è stato state mantenuto per 60 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell’incubazione, ciascun tubo è stato lavato 2 volte con 4 mL di PBS 1X e successiva centrifugata di 6 minuti a 1600 rpm, decantando ogni volta il sopranatante. Ciascun pellet cellulare è stato risospeso in 200 l di una soluzione costituita da proteina A-FITC diluita 1:1000v/v in soluzione di blocco, l’incubazione è stata mantenuta per 60 minuti a temperatura ambiente. Dopo questa fase le cellule sono state lavate una volta con 4 mL di PBS 1X e centrifugate come sopra, il sopranatante è stato rimosso aspirando con pompa, lasciando in ogni tubo circa 500 l di soluzione di lavaggio. I campioni sono stati sottoposti ad analisi citofluorimetrica con FacScan (Becton Dickinson).

Valutazione dell’apoptosi

L’apoptosi nelle cellule di leucemia è stata valutata tramite il test di Annessina V e Ioduro di Propidio con tecniche di citofluorimetria. Le cellule sono state raccolte, contate e trasferite in provette da 50 mL portandole alla concentrazione di 5x10<5 >cellule/ml con terreno RPMI, successivamente, la sospensione cellulare è stata erogata 1ml per tubo (5x105 cellule). Dopo centrifugata a 1600 rpm per 6 minuti, le cellule sono state trattate con l’anticorpo, in parallelo sono stati allestiti i campioni trattati con Placebo. I campioni sono stati mantenuti in incubazione per 4 ore a 37°C. Al termine dell’incubazione, le cellule sono state centrifugate a 1200 rpm per 8 minuti, il surnatante è stato allontanato e per ogni tubo sono stati aggiunti 150 l di Binding Buffer del kit Human Annexin V FITC kit (Valter Occhiena). In seguito, le cellule risospese, sono state trasferite in tubi da citofluorimetria a cui sono stati aggiunti 3 l di annessina V-FITC e 3 l di Ioduro di Propidio; I campioni sono stati miscelati bene e poi lasciati in incubazione al buio per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo l’incubazione, i campioni sono stati lavati con 4ml di PBS centrifugando a 1200 rpm per 8 minuti e decantando il sopranatante, per ogni tubo sono stati aggiunti 200 l di Binding Buffer ed esaminati al citofluorimetro.

Microscopia confocale

Le cellule sono state prelevate dalle Fiasche e poste in tubo con in 11 mL di terreno di coltura pre-riscaldato a 37°C, precipitate centrifugando per 6 minuti a 1600 rpm, eliminando dopo centrifugata il sopranatante; il pellet è stato risospeso in 3 ml di terreno ed è stata effettuata la conta su camera emocromocitometrica dopo colorazione con Trypan Blue, quindi la densità cellulare è stata portata a 5x10<5 >cellule/ml aggiungendo terreno. Sono state preparate le diverse condizioni erogando 1 ml della sospensione cellulare per ogni tubo.

Le cellule sono state poi lavate 2 volte in 4 ml di PBS 1 X centrifugando a 1600 rpm per 6 min, eliminando ogni volta il surnatante. Successivamente sono state risospese in 200 l di soluzione di blocco costituita da PBS 1X e BSA 1% w/v; questa condizione è stata mantenuta per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo questa fase, è stato aggiunto l’anticorpo C7dAbd, precedentemente marcato con FITC, nei 200 l di soluzione di blocco che è stato state mantenuto per 30 minuti, 1 ora, 2 ore e 4 ore. Al termine di ogni incubazione, ciascun tubo è stato lavato 2 volte con 4 mL di PBS 1X e successiva centrifugata di 6 minuti a 1600 rpm, decantando ogni volta il sopranatante. Ciascun pellet cellulare è stato risospeso in 200 l e i campioni sono stati sottoposti ad analisi confocale.

Clonaggio e purificazione CD99ecd/GST di cynomolgus monkey, african green monkey e topo

I domini extracellulari di CD99 di cynomolgus monkey (Macaca fascicolaris) e african green monkey (Cercopithecus aethiops) sono stati amplificati dai rispettivi costrutti genetici CD99ecd in pET45b precedentemente creati a partire da cDNA retro trascritto da RNA di linfociti di cynomolgus monkey o da RNA proveniente dalla linea cellulare COS-1 di african green monkey.

L’amplificazione è stata ottenuta per entrambe le specie con i primers AGM_CD99_BamHI_Fw:5’-GTCGCGGATCCGATGATGGTTTC-3’ (SEQ ID NO 30) e AGM_CD99_EcoRIRev: 5’-ATCACGAATTCCTAGTCCGCCTCCTCCC-3’ (SEQ ID NO 31). Il dominio extracellulare di CD99 di topo è stato amplificato da un plasmide contenente il gene CD99 utilizzando i primers: mmCD99BamHIFw2: 5’-GGCGCGGATCCGACGACTTCAACCT-3’ (SEQ ID NO 32) e mmCD99EcoRIRev: 5’-ACCACGAATTCCTACAAGCCCTGGGGCGT-3’ (SEQ ID NO 33). Tutti i primers utilizzati introducono all’estremità 5’ dell’amplificato un sito di taglio per l’enzima BamHI e all’estremità 3’ un sito per EcoRI. Gli amplificati sono stati digeriti insieme al vettore pGEX-2T (GE Healthcare Life Sciences) che consente di fondere il gene di interesse a valle del gene per la Glutatione-S-transferasi, con gli enzimi BamHI e EcoRI (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) a 37°C per 3 ore. Inserti e vettore digeriti sono stati purificati e ligati insieme con la T4 DNA ligasi (Promega, Madison, WI, USA) a 4°C overnight. Ciascuna miscela di ligazione è stata trasformata nel ceppo di E.coli BL21(DE3) per consentire l’espressione e la purificazione della proteina. I cloni positivi sono stati analizzati per il corretto inserimento del costrutto tramite sequenziamento.

La purificazione delle tre proteine è avvenuta come descritto per CD99ecd/GST umana.

I CD99ecd/GST delle diverse specie sono stati utilizzati in saggi di titolazione in ELISA per valutare la reattività di C7dAbd, come descritto sopra.

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Anticorpo o composizione comprendente detto anticorpo per uso nella prevenzione e/o nel trattamento e/o nel follow-up di una leucemia o di una sindrome mielodisplastica detto anticorpo comprendente almeno due regioni variabili in grado di riconoscere e legare un epitopo del dominio extracellulare della proteina umana CD99, preferibilmente caratterizzato da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 21, dette almeno due regioni variabili comprendenti ciascuna: una catena variabile pesante (VH) caratterizzata da una CDR3 comprendente SEQ ID NO: 1 o sequenze aventi una identità almeno del 95%., una catena variabile leggera (VL) caratterizzata da una CDR3 comprendente SEQ ID NO: 2 o sequenze aventi una identità almeno del 95%.
2. 2. Anticorpo o composizione per uso secondo la rivendicazione1 in cui detto epitopo è caratterizzato da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 23.
3. 3. Anticorpo o composizione per uso secondo la rivendicazione1 o 2, in cui: (1) detta catena VH comprende una regione CDR1 ed una regione CDR2 caratterizzate da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 3 e 4 o sequenze con una identità almeno del 95%; e/o (2) detta catena VL comprende una regione CDR1 ed una regione CDR2 caratterizzate da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 5 e 6 o sequenze con una identità almeno del 95%.
4. 4. Anticorpo o composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 3, in cui: (1) detta catena VH è caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 7 o sequenze con una identità almeno del 95%; e/o (2) detta catena VL è caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 8 o sequenze con una identità almeno del 95%.
5. 5. Anticorpo o composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 4, in cui detto anticorpo è un frammento di regione variabile a singola catena (scFv) multivalente, preferibilmente scelto tra: un diabody, un trivalente (triabody) e quadrivalente (tetrabody), oppure una IgG, preferibilmente di classe IgG1 e/o IgG4.
6. 6. Anticorpo o composizione per uso secondo la rivendicazione 5, in cui le unità scFv di detto scFv multivalente, preferibilmente del diabody, sono uniti tra loro tramite un linker preferibilmente caratterizzato da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 9 o sequenze con una identità almeno del 95%.
7. 7. Anticorpo o composizione per uso secondo la rivendicazione 5 o 6, in cui ciascuna unità scFv di detto scFv multivalente è caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente nella SEQ ID NO: 10 o sequenze con una identità almeno del 95%.
8. 8. Anticorpo o composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 5 alla 7, in cui (1) la catena VH di detta IgG è caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente rispettivamente SEQ ID NO: 7 o sequenze con una identità almeno del 95% e/o la catena VL di detta IgG è caratterizzata da una sequenza amminoacidica comprendente SEQ ID NO: 8 o sequenze con una identità almeno del 95%.
9. 9. Anticorpo o composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 8, in cui in cui detta leucemia comprende cellule leucemiche che esprimono CD99, preferibilmente cellule leucemiche che iper-esprimono CD99, più preferibilmente detta leucemia è scelta tra: leucemia linfoblastica acuta (LLA), leucemia mieloide acuta (LMA), leucemia linfatica cronica (LLC), leucemia mieloide cronica (LMC) e sindrome mielodisplastica (SMD). Particolarmente preferita è la leucemia acuta, più preferibilmente la LLA, o la LMA.
10. 10. Anticorpo o composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 9 in combinazione con ulteriori chemioterapici, preferibilmente scelti tra: daunorubicina, idarubicina, citarabina, azacitidina, decitabina e loro combinazioni, e/o in combinazione con la chirurgia e/o immunoterapia e/o radioterapia e/o terapia mirata