JP6324399B2 - 抗ｃｅａｃａｍ５抗体およびその使用 - Google Patents

抗ｃｅａｃａｍ５抗体およびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP6324399B2
JP6324399B2 JP2015542313A JP2015542313A JP6324399B2 JP 6324399 B2 JP6324399 B2 JP 6324399B2 JP 2015542313 A JP2015542313 A JP 2015542313A JP 2015542313 A JP2015542313 A JP 2015542313A JP 6324399 B2 JP6324399 B2 JP 6324399B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
sequence
antibody
ceacam5
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2015542313A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2016506370A (ja
Inventor
ピエール−フランソワ・ベルン
フランシス・ブランシェ
エルベ・ブシャール
ベアトリス・キャメロン
タリック・ダビドビ
ステファニー・デカリー
ポウル・フェラーリ
アレクセイ・ラク
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi SA
Original Assignee
Sanofi SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi SA filed Critical Sanofi SA
Publication of JP2016506370A publication Critical patent/JP2016506370A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6324399B2 publication Critical patent/JP6324399B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/537—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57473—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen, i.e. CEA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

本発明は、ヒトおよびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に特異的に結合する抗体ならびに前記抗体をコードする配列を含む単離された核酸、ベクターおよび宿主細胞を開示する。本発明はまた、増殖阻害剤にコンジュゲートまたは連結された前記抗体を含むイムノコンジュゲート、および本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを含む医薬組成物も開示する。本発明は、がんの処置のため、または診断目的での本発明の抗体またはイムノコンジュゲートの使用を開示する。
がん胎児性抗原（ＣＥＡ）は、細胞接着に関与する糖タンパク質である。ＣＥＡは、妊娠の最初の６カ月に胎児の腸により通常発現され、膵臓、肝臓および結腸のがんにおいて見出されるタンパク質として１９６５年に初めて同定された（非特許文献１）。ＣＥＡファミリーは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。ＣＥＡファミリーは、１８個の遺伝子からなり、２つのタンパク質亜群：がん胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）亜群と、妊娠特異的糖タンパク質亜群とにさらに分けられる（非特許文献２）。
ヒトにおいては、ＣＥＡＣＡＭ亜群は、７つのメンバー：ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８からなる。いくつかの研究により、ＣＥＡＣＡＭ５は、元々同定されたＣＥＡと同一であり、結腸直腸、胃、肺、乳房、前立腺、卵巣、子宮頸部、および膀胱の腫瘍細胞の表面上で高度に発現され、結腸中の円柱上皮細胞および杯細胞、胃中の粘液頸細胞ならびに食道および子宮頸部中の扁平上皮細胞のようないくつかの正常上皮組織において弱く発現されることが示された（非特許文献３）。かくして、ＣＥＡＣＡＭ５は、イムノコンジュゲートのような、腫瘍特異的標的化手法にとって好適な治療標的であり得る。本発明は、ＣＥＡＣＡＭ５を指向するモノクローナル抗体を提供し、それらを細胞傷害剤にコンジュゲートさせて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞を殺傷し、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍退縮を誘導することができる細胞傷害活性を誘導することができることを示す。
ＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーの細胞外ドメインは、配列相同性に従って３つの型、Ａ、ＢおよびＮに分類された反復免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインから構成される。ＣＥＡＣＡＭ５は、７つのそのようなドメイン、すなわち、Ｎ、Ａ１、Ｂ１、Ａ２、Ｂ２、Ａ３およびＢ３を含有する。
一方でＣＥＡＣＡＭ５ Ａ１、Ａ２およびＡ３ドメイン、他方でＢ１、Ｂ２およびＢ３ドメインは、高い配列相同性を示し、ヒトＣＥＡＣＡＭ５のＡドメインは、８４〜８７％、Ｂドメインは６９〜８０％のペアワイズ配列類似性を提示する。さらに、構造中にＡおよび／またはＢドメインを提示する他のヒトＣＥＡＣＡＭメンバー、すなわち、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７およびＣＥＡＣＡＭ８は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５との相同性を示す。特に、ヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質のＡおよびＢドメインは、それぞれ、ヒトＣＥＡＣＡＭ５のＡドメインおよびＢドメイン間で観察されるものよりもさらに高い、ヒトＣＥＡＣＡＭ５のＡ１およびＡ３ドメイン、ならびにＢ１〜Ｂ３ドメインのいずれかとの配列相同性を示す。
いくつかの抗ＣＥＡ抗体が、ＣＥＡを標的とする診断または治療目的を考慮して作成された。関連抗原に対する特異性は、非特許文献４による例として、この分野における関心として常に言及されてきた。上記の相同性のため、いくつかの以前に記載された抗体は、異なる免疫グロブリンドメイン中に存在するＣＥＡＣＡＭ５の反復エピトープへの結合が、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、またはＣＥＡＣＡＭ８のような他のＣＥＡＣＡＭメンバーとの交差反応性を示し、ＣＥＡＣＡＭ５に対する特異性を欠くことを証明することができる。抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体の特異性は、それがヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞に結合するが、他のＣＥＡＣＡＭメンバーを発現するいくつかの正常組織には結合しないようなＣＥＡ標的化療法を考慮すると望ましい。ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６およびＣＥＡＣＡＭ８は、ヒトおよび非ヒト霊長類の好中球により発現されると記載され（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）、それらが顆粒球形成を調節し、免疫応答において役割を果たすことが示されたことは注目すべきことである。
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発されたメイタンシノイド抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体のような抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体薬物コンジュゲートが記載されており（非特許文献７）、非ヒト霊長類においてＣＥＡＣＡＭ６依存的造血毒性を誘導することが示された。この毒性は、骨髄への抗体薬物コンジュゲートの蓄積ならびに顆粒球およびそれらの細胞の前駆体の枯渇に起因し、主要な安全性の関心として著者らによって考慮された。従って、より正確には、治療目的での、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体と、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、またはＣＥＡＣＡＭ８との交差反応性は、正常組織に対する毒性の増加により化合物の治療指数を低下させ得る。かくして、特に、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）としての使用のために、または標的細胞の殺傷をもたらす任意の他の作用様式を用いて、ＣＥＡＣＡＭファミリーの他の分子と交差反応しないＣＥＡＣＡＭ５を特異的に指向する抗体を取得することには強力な利点がある。
さらに、ＣＥＡＣＡＭ５はいくつかの正常細胞組織中で発現されるが、低レベルで発現されると記載されているため、ヒトＣＥＡＣＡＭ５ならびにカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＥＡＣＡＭ５に結合することができる抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体を開発することが重要であり、そのような抗体はその安全性プロファイルを評価するためのカニクイザルにおける前臨床毒性試験において容易に試験することができる。治療抗体の有効性は、機能的抗体の場合（非特許文献８）およびエフェクター機能が関与する場合（非特許文献９）の両方において、標的中エピトープの局在化に依存し得ることが示されたため、ヒト／サル交差反応性抗体は、ヒトおよびカニクイザルタンパク質の同じ反復Ｉｇ様相同ドメイン中のエピトープに結合することが示される必要がある。
ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５に対する特異性を有するそのような抗体の種交差反応性、すなわち、他のカニクイザルおよびヒトＣＥＡＣＡＭメンバーとの非交差反応性の必要性の組合せは、ヒトとカニクイザルのＣＥＡＣＡＭタンパク質間の全体的な配列相同性を考慮すれば、さらに複雑度を増す。
実際、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５配列と、ヒトＣＥＡＣＡＭ５配列との全体的ペアワイズアラインメント（ＡＡＡ５１９６７．１／ＧＩ：１８０２２３、７０２アミノ酸）は、わずか７８．５％の同一性を示した。カニクイザルＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、およびＣＥＡＣＡＭ６遺伝子をクローニングし、ヒトおよびカニクイザルのＡ、ＢおよびＮドメインの全体的アラインメントを実施した。このアラインメントにより、ヒトおよびマカクのＣＥＡＣＡＭ５に共通であり、任意の他のファミリーメンバーと共有されない理想的なエピトープを局在化させる領域は、たとえあったとしても、非常に少ないと予測された。これらの理由から、ヒトおよびカニクイザルのＣＥＡＣＡＭ５間で交差反応し、他のヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭメンバーと交差反応しない抗体の開発は、成功する確率が低いと予想された。注目すべきことに、以前に記載された抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体は、カニクイザルの交差反応性について、ごくわずかの例外を除いて、ほぼ全く立証されていない（ＭＴ１１１、以下を参照されたい）。
Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓのラベツズマブ（ｈＭＮ１４としても知られる、非特許文献１０）のような、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体が臨床試験で既に用いられている。この抗体は、関連抗原に結合しないが、カニクイザルに由来するＣＥＡＣＡＭ５と交差反応しないことが示されている。注目すべきことに、ＭｉｃｒｏｍｅｔのＭＴ１１１抗体（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＭＥＤＩ−５６５抗体としても知られる）は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＤ３に結合する二重特異的抗体である（非特許文献１１、特許文献１）。ＭＴ１１１は、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５を認識する抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と、ヒトＣＤ３を認識する抗体に由来するｓｃＦｖとの融合により作出されたと言われる（非特許文献１２のポスター）。また、ＭＴ１１１が他のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーに結合しないことも報告されている（非特許文献１１）。ＭＴ１１１は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５のＡ２ドメイン中の立体的エピトープに結合する。この立体的エピトープは、ヒトＣＥＡＣＡＭ５のスプライスバリアント中では失われており、腫瘍上で完全長ＣＥＡＣＡＭ５と同時に発現される（非特許文献１１）。さらに、ＭＴ１１１はカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５における同じエピトープに結合する証拠はない。
治療目的で最適な特徴を有するＣＥＡＣＡＭ５表面タンパク質に対する新しい抗体を生成する試みにおいて、本発明者らは、組換えタンパク質および腫瘍細胞を用いてマウスを免疫した。本発明者らは、ＣＥＡＣＡＭファミリーのいくつかの組換えタンパク質上でのＥＬＩＳＡ、および関連細胞系を用いるフローサイトメトリーを用いて数百のハイブリドーマをスクリーニングして、有利なプロファイルを有する免疫グロブリン（ＩｇＧ）のみを選択した。予想外なことに、それらは、所望の特徴の全てを含むハイブリドーマクローンを選択し、対応する成熟ＩｇＧを生成することができた。それらは高い親和性でヒトＣＥＡＣＡＭ５のＡ３−Ｂ３ドメインに特異的に結合し、ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７およびＣＥＡＣＡＭ８タンパク質を認識しない。細胞の文脈において、これらの抗体は、腫瘍細胞に対する高い親和性を示す（ナノモル濃度の範囲で）。さらに、これらの抗体はまた、１０以下のサル／ヒト親和性の比でカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５タンパク質にも結合する。本発明の抗体はカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５のＡ３−Ｂ３ドメインに特異的に結合し、他のカニクイザルＣＥＡＣＡＭメンバーを認識しない。
ＣＥＡＣＡＭ５のＡ３−Ｂ３ドメインを標的化することにより、これらの抗体は完全長ヒトＣＥＡＣＡＭ５と、非特許文献１１により同定されたそのスプライスバリアントの両方に結合する能力を有するため、それらは腫瘍標的化能力を増加させた。
最後に、ＣＥＡＣＡＭ５は、弱く内在化された表面タンパク質として文献中に記載され（非特許文献１３に概説されている）、従って、抗体薬物コンジュゲートのための好ましい標的ではない場合がある。先行技術において報告されたことにも拘らず、本発明者らは、本発明者らが生成した抗体が結合後にＣＥＡＣＡＭ５抗体複合体を内在化し、細胞傷害剤と組み合わせた場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を誘導することができることを示した。細胞傷害剤と組み合わせた同抗体は、ヒト原発性結腸および胃腫瘍を担持するマウスにおける腫瘍増殖を顕著に阻害することもできる。
ＷＯ２００７／０７１４２６
ＧｏｌｄおよびＦｒｅｅｄｍａｎ、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１２１、４３９頁、１９６５ Ｋａｍｍｅｒｅｒ ＆ Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、ＢＭＣ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０、８：１２頁 Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｅｍら、２００２、「Ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｄｉａｍａｎｄｉｓ Ｅ． Ｐ．ら（編）、ＡＡＣＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ３７５頁 Ｓｈａｒｋｅｙら、１９９０、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０、２８２３頁 Ｅｂｒａｈｉｍｍｎｅｊａｄら、２０００、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２６０、３６５頁 Ｚｈａｏら、２００４、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９３、２０７頁 Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄら、２００９、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２１８、３８０頁 Ｄｏｅｒｎら、２００９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２８４、１０２５４頁 Ｂｅｅｒｓら、Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ４７：１０７〜１１４頁 Ｓｈａｒｋｅｙら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５、５９３５頁 Ｐｅｎｇら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（５）：ｅ３６４１頁 Ｏｂｅｒｓｔら、ＡＡＣＲ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｐｒｉｌ ２００９ Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ Ｓｃｈｍｉｄｔら、２００８、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５７、１８７９頁
定義
本明細書で用いられる場合、「ＣＥＡＣＡＭ５」は、「ＣＤ６６ｅ」（分化抗原群６６ｅ）またはＣＥＡとしても知られる、「がん胎児性抗原関連細胞接着分子５」を指す。ＣＥＡＣＡＭ５は、細胞接着に関与する糖タンパク質である。ＣＥＡＣＡＭ５は、特に、結腸直腸、胃、肺および子宮の腫瘍細胞の表面上に高度に発現される。
シグナルペプチド（位置１〜３４）およびプロペプチド（位置６８６〜７０２）を含む、完全長ヒトＣＥＡＣＡＭ５の参照配列は、受託番号ＡＡＡ５１９６７．１（配列番号５２）の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能である。５つの非同義ＳＮＰは、白人集団においては２％より高い頻度で同定されており、そのうちの４つはヒトＣＥＡＣＡＭ５（配列番号５８）のＮドメイン中に位置し（位置８０、８３、１１２、１１３に）、最後の１つはＡ２ドメイン（位置３９８）中に局在化する。ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＡ５１９６７．１は、主要なハプロタイプを含有する（Ｉ８０、Ｖ８３、Ｉ１１２、Ｉ１１３およびＥ３９８）。
本発明者らによってクローニングされた、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５の細胞外ドメインの配列は、配列番号５３に開示される。
「ドメイン」は、配列相同性に基づいて一般に定義され、特異的構造的または機能的実体と関連することが多い、タンパク質の任意の領域であってもよい。ＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーは、Ｉｇ様ドメインから構成されることが知られる。ドメインという用語は、「Ｎドメイン」のような個々のＩｇ様ドメイン、または「Ａ３−Ｂ３ドメイン」のような連続するドメイン群のいずれかを指すように本明細書で用いられる。
ヒトＣＥＡＣＡＭ５のドメイン構成は、以下の通りである（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＡ５１９６７．１配列；配列番号５２に基づく）。
従って、ヒトＣＥＡＣＡＭ５のＡ３−Ｂ３ドメインは、配列番号５２の位置４９９〜６８５のアミノ酸からなる。
カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５のドメイン構成は、以下の通りである（クローニングされた細胞外ドメイン配列；配列番号５３に基づく）。
従って、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５のＡ３−Ｂ３ドメインは、配列番号５３の位置４６５〜６５４のアミノ酸からなる。
ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素のような、「コード配列」または発現生成物を「コードする」配列は、発現された場合、そのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の生成をもたらすヌクレオチド配列である、すなわち、そのヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素のためのアミノ酸配列をコードする。タンパク質のためのコード配列は、開始コドン（通常はＡＴＧ）と停止コドンとを含んでもよい。
本明細書で用いられる場合、特定のタンパク質（例えば、抗体）に対する参照は、天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにその起源または製造様式と無関係なバリアントおよび改変形態を含んでもよい。天然のアミノ酸配列を有するタンパク質は、自然から得られたのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質である。そのような天然配列タンパク質を、自然から単離するか、または標準的な組換えおよび／もしくは合成方法を用いて製造することができる。天然配列タンパク質は、天然に存在するトランケート形態または可溶性形態、天然に存在するバリアント形態（例えば、選択的にスプライスされた形態）、天然に存在する対立遺伝子バリアントおよび翻訳後改変を含む形態を特に包含する。天然配列タンパク質は、いくつかのアミノ酸残基のグリコシル化、またはリン酸化、または他の改変のような翻訳後改変を担持するタンパク質を含む。
用語「遺伝子」は、１つまたはそれ以上のタンパク質の全部または一部を含み、例えば、その遺伝子が発現される条件を決定付けるプロモーター配列のような調節ＤＮＡ配列を含んでも、または含まなくてもよい、アミノ酸の特定の配列をコードするか、またはそれと一致するＤＮＡ配列を意味する。構造遺伝子ではないいくつかの遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡに転写され得るが、アミノ酸配列には翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子として、またはＤＮＡ転写の調節因子として機能し得る。特に、遺伝子という用語は、タンパク質をコードするゲノム配列、すなわち、調節因子、プロモーター、イントロンおよびエクソン配列を含む配列を意図してもよい。
「参照配列と少なくとも８５％同一である」配列は、その全長にわたって、参照配列の全長との、８５％、またはそれ以上、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列である。
「配列同一性」のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって最適に整列された２つの配列を比較することによって決定することができ、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントについて参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。このパーセンテージは、両方の配列中で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、およびその結果に１００を乗算して、配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。比較のための配列の最適なアラインメントは、全体的ペアワイズアラインメントにより、例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０）のアルゴリズムを用いて行われる。配列同一性のパーセンテージを、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、および以下のパラメーターギャップ−オープン＝１０、ギャップ−伸長＝０．５を含むプログラムＮｅｅｄｌｅを用いて容易に決定することができる。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する化学的特性（例えば、電荷、サイズまたは疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基により置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。類似する化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換基は、アミノ酸サイズに基づいて定義することもできる。
「抗体」は、２つの重鎖がジスルフィド結合により互いに連結され、それぞれの重鎖がジスルフィド結合により軽鎖に連結される天然の、または従来の抗体であってもよい。２つの型の軽鎖、ラムダ（ｌ）およびカッパ（ｋ）が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。それぞれの鎖は異なる配列ドメインを含有する。軽鎖は、２つのドメインまたは領域、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、集合的にＣＨと呼ばれる）を含む。軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合のような、重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端パートであり、１つの軽鎖と１つの重鎖の可変ポーションからなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、主として超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基から作られる。場合により、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する残基は、全体的なドメイン構造、従って、結合部位に影響する。従って、相補性決定領域またはＣＤＲとは、天然の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、ＣＤＲ１−Ｌ、ＣＤＲ２−Ｌ、ＣＤＲ３−ＬおよびＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈと命名される３つのＣＤＲをそれぞれ有する。従って、従来の抗体抗原結合部位は、重鎖および軽鎖Ｖ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。
「フレームワーク領域」（ＦＲ）とは、ＣＤＲ間に置かれたアミノ酸配列、すなわち、単一の種において異なる免疫グロブリン間で比較的保存された免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域のポーションを指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、ＦＲ１−Ｌ、ＦＲ２−Ｌ、ＦＲ３−Ｌ、ＦＲ４−Ｌ、およびＦＲ１−Ｈ、ＦＲ２−Ｈ、ＦＲ３−Ｈ、ＦＲ４−Ｈと命名される４つのＦＲをそれぞれ有する。
本明細書で用いられる場合、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一である（約８５％、またはそれ以上、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）フレームワーク領域である。
本発明の文脈において、免疫グロブリン軽鎖または重鎖におけるＣＤＲ／ＦＲの定義は、ＩＭＧＴ定義（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３、２７（１）：５５〜７７頁；ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に基づいて決定されるべきである。
本明細書で用いられる用語「抗体」は、従来の抗体およびその断片、ならびに単一ドメイン抗体およびその断片、特に、単一ドメイン抗体の可変重鎖、ならびにキメラ、ヒト化、二重特異的または多重特異的抗体を指す。
本明細書で用いられる場合、抗体または免疫グロブリンはまた、より最近記載され、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である「単一ドメイン抗体」も含む。単一ドメイン抗体の例としては、重鎖抗体、天然では軽鎖を含まない抗体、従来の４鎖抗体から誘導される単一ドメイン抗体、操作された単一ドメイン抗体を含む。単一ドメイン抗体は、限定されるものではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシなどの任意の種から誘導することができる。単一ドメイン抗体は、軽鎖を含まない重鎖抗体として知られる天然に存在する単一ドメイン抗体であってもよい。特に、ラクダ科動物の種、例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカおよびグアナコは、天然では軽鎖を含まない重鎖抗体を生成する。ラクダ科動物の重鎖抗体は、ＣＨ１ドメインも欠く。
軽鎖を含まないこれらの単一ドメイン抗体の可変重鎖は、「ＶＨＨ」または「ナノボディ」として当業界で公知である。従来のＶＨドメインと同様、ＶＨＨは４つのＦＲと３つのＣＤＲとを含有する。ナノボディは従来の抗体を超える利点を有する：それらはＩｇＧ分子よりも約１０倍小さく、結果として、高い収率を達成しながら、適切に折畳まれた機能的ナノボディをｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現により生成することができる。さらに、ナノボディは非常に安定的であり、プロテアーゼの作用に対して耐性である。ナノボディの特性および生成は、ＨａｒｍｓｅｎおよびＤｅ Ｈａａｒｄ ＨＪ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ Ｎｏｖ；７７（１）：１３〜２２頁）により概説されている。
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」とは、特定の抗原を指向し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されない、単一のアミノ酸配列の抗体分子を指す。モノクローナル抗体を、Ｂ細胞またはハイブリドーマの単一のクローンにより生成することができるが、組換えであってもよい、すなわち、タンパク質工学によって生成することもできる。
用語「キメラ抗体」とは、その最も広い意味において、１つの抗体に由来する１つまたはそれ以上の領域および１つまたはそれ以上の他の抗体に由来する１つまたはそれ以上の領域を含有する操作された抗体を指す。ある実施形態において、キメラ抗体は、非ヒト動物から誘導される抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインと共に、別の抗体を、ある実施形態において、ヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインを含む。非ヒト動物として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどのような任意の動物を用いることができる。キメラ抗体はまた、少なくとも２つの異なる抗原に対する特異性を有する多重特異的抗体を示してもよい。
用語「ヒト化抗体」とは、全体的または部分的に非ヒト起源のものであり、ヒトにおける免疫応答を回避するか、または最小化するために、例えば、ＶＨおよびＶＬドメインのフレームワーク領域中のある特定のアミノ酸を置き換えるように改変された抗体を指す。ヒト化抗体の定常ドメインは、ほとんど常にヒトＣＨおよびＣＬドメインである。
（従来の）抗体の「断片」は、無傷抗体の一部、特に、無傷抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ、抗体断片から形成される二重特異的および多重特異的抗体が挙げられる。従来の抗体の断片は、重鎖抗体またはＶＨＨのような、単一ドメイン抗体であってもよい。
用語「Ｆａｂ」は、重鎖のＮ末端側の約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合により一緒に結合した、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を示す。それは通常、ＩｇＧを、プロテアーゼ、パパインで処理することによって断片間で得られる。
用語「Ｆ（ａｂ’）２」とは、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合した２つの同一のＦａｂ断片よりもわずかに大きい、約１００，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を指す。それは通常、ＩｇＧをプロテアーゼ、ペプシンで処理することによって断片間で得られる。
用語「Ｆａｂ」とは、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体断片を指す。
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーにより連結されたＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から通常発現される共有的に連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。本発明のヒトｓｃＦｖ断片は、例えば、遺伝子組換え技術を用いることにより、適切なコンフォメーション中に保持されるＣＤＲを含む。二価および多価抗体断片は、一価ｓｃＦｖの会合により自発的に形成し得るか、または二価ｓｃ（Ｆｖ）２のような、ペプチドリンカーにより一価ｓｃＦｖをカップリングさせることにより生成することができる。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されるＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。「（ｄｓＦｖ）２」は、ペプチドリンカーによりカップリングされた２つのｄｓＦｖを示す。
用語「二重特異的抗体」または「ＢｓＡｂ」は、単一の分子内で２つの抗体の抗原結合部位を結合させる抗体を示す。かくして、ＢｓＡｂは、２つの異なる抗原に同時に結合することができる。例えば、ＥＰ２０５０７６４Ａ１に記載のように、所望のセットの結合特性およびエフェクター機能を有する抗体または抗体誘導体を設計、改変および生成するために、高い頻度で遺伝子操作が用いられてきた。
用語「多重特異的抗体」は、単一の分子内で２つまたはそれ以上の抗体の抗原結合部位を結合させる抗体を示す。
用語「ダイアボディ」とは、断片が同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指す。同じ鎖の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、これらのドメインを、別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作出する。
用語「ハイブリドーマ」は、非ヒト哺乳動物を抗原で免疫することによって調製されたＢ細胞を、抗原特異性を有する所望のモノクローナル抗体を生成するマウスなどから誘導されるミエローマ細胞との細胞融合にかけることにより得られる細胞を示す。
「精製された」および「単離された」とは、ポリペプチド（すなわち、本発明の抗体）またはヌクレオチド配列を言う場合、示された分子が同じ型の他の生体高分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。本明細書で用いられる用語「精製された」とは、少なくとも７５重量％、８５重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、または９８重量％の同じ型の生体高分子が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子とは、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指す；しかしながら、この分子は、組成物の基本的特徴に有害に影響しないいくつかのさらなる塩基または部分を含んでもよい。
本明細書で用いられる用語「対象」は、げっ歯類、ネコ科、イヌ科、および霊長類のような哺乳動物を示す。さらに、本発明による対象は、ヒトである。
抗体
本発明者らは、ヒトおよびカニクイザルの両方のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に対する高い親和性を示し、ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７およびＣＥＡＣＡＭ８タンパク質、ならびにカニクイザルＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６およびＣＥＡＣＡＭ８タンパク質と有意に交差反応しない、特異的マウス抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体を作成、スクリーニングおよび選択するのに成功した。
本発明者らは、そのようなモノクローナル抗体、いわゆる抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、およびＭＡｂ５の可変重鎖および軽鎖の配列を決定した。
いわゆる「抗体ＭＡｂ１」は、
− ＦＲ１−Ｈがアミノ酸位置１〜２５にまたがり、ＣＤＲ１−Ｈがアミノ酸位置２６〜３３（配列番号１）にまたがり、ＦＲ２−Ｈがアミノ酸位置３４〜５０にまたがり、ＣＤＲ２−Ｈがアミノ酸位置５１〜５８（配列番号２）にまたがり、ＦＲ３−Ｈがアミノ酸位置５９〜９６にまたがり、ＣＤＲ３−Ｈがアミノ酸位置９７〜１０９（配列番号３）にまたがり、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置１１０〜１２０にまたがる、配列
からなる重鎖の可変ドメイン、ならびに
− ＦＲ１−Ｌがアミノ酸位置１〜２６にまたがり、ＣＤＲ１−Ｌがアミノ酸位置２７〜３２（配列番号４）にまたがり、ＦＲ２−Ｌがアミノ酸位置３３〜４９にまたがり、ＣＤＲ２−Ｌがアミノ酸位置５０〜５２にまたがり、ＦＲ３−Ｌがアミノ酸位置５３〜８８にまたがり、ＣＤＲ３−Ｌがアミノ酸位置８９〜９８（配列番号６）にまたがり、およびＦＲ４−Ｌがアミノ酸位置９９〜１０８にまたがる、配列
からなる軽鎖の可変ドメイン
を含む。
いわゆる「抗体ＭＡｂ２」は、
− ＦＲ１−Ｈがアミノ酸位置１〜２５にまたがり、ＣＤＲ１−Ｈがアミノ酸位置２６〜３３（配列番号７）にまたがり、ＦＲ２−Ｈがアミノ酸位置３４〜５０にまたがり、ＣＤＲ２−Ｈがアミノ酸位置５１〜５８（配列番号８）にまたがり、ＦＲ３−Ｈがアミノ酸位置５９〜９６にまたがり、ＣＤＲ３−Ｈがアミノ酸位置９７〜１０９（配列番号９）にまたがり、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置１１０〜１２０にまたがる、配列
からなる重鎖の可変ドメイン、ならびに
− ＦＲ１−Ｌがアミノ酸位置１〜２６にまたがり、ＣＤＲ１−Ｌがアミノ酸位置２７〜３２（配列番号１０）にまたがり、ＦＲ２−Ｌがアミノ酸位置３３〜４９にまたがり、ＣＤＲ２−Ｌがアミノ酸位置５０〜５２にまたがり、ＦＲ３−Ｌがアミノ酸位置５３〜８８にまたがり、ＣＤＲ３−Ｌがアミノ酸位置８９〜９７（配列番号１２）にまたがり、およびＦＲ４−Ｌがアミノ酸位置９８〜１０７にまたがる、配列
からなる軽鎖の可変ドメイン
を含む。
ＣＤＲ２−Ｌ中にＫ５２Ｒ置換を導入することにより、抗体ＭＡｂ２のバリアントも作成された。このバリアントは、本明細書では「Ｍａｂ２Ｋ５２Ｒ」と呼ばれ、ＭＡｂ２と本質的に同じヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５に対する親和性を有する。
いわゆる「抗体ＭＡｂ３」は、
− ＦＲ１−Ｈがアミノ酸位置１〜２５にまたがり、ＣＤＲ１−Ｈがアミノ酸位置２６〜３３（配列番号１３）にまたがり、ＦＲ２−Ｈがアミノ酸位置３４〜５０にまたがり、ＣＤＲ２−Ｈがアミノ酸位置５１〜５７（配列番号１４）にまたがり、ＦＲ３−Ｈがアミノ酸位置５８〜９５にまたがり、ＣＤＲ３−Ｈがアミノ酸位置９６〜１０８（配列番号１５）にまたがり、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置１０９〜１１９にまたがる、配列
からなる重鎖の可変ドメイン、ならびに
− ＦＲ１−Ｌがアミノ酸位置１〜２６にまたがり、ＣＤＲ１−Ｌがアミノ酸位置２７〜３２（配列番号１６）にまたがり、ＦＲ２−Ｌがアミノ酸位置３３〜４９にまたがり、ＣＤＲ２−Ｌがアミノ酸位置５０〜５２にまたがり、ＦＲ３−Ｌがアミノ酸位置５３〜８８にまたがり、ＣＤＲ３−Ｌがアミノ酸位置８９〜９８（配列番号１８）にまたがり、およびＦＲ４−Ｌがアミノ酸位置９９〜１０８にまたがる、配列
からなる軽鎖の可変ドメイン
を含む。
いわゆる「抗体ＭＡｂ４」は、
− ＦＲ１−Ｈがアミノ酸位置１〜２５にまたがり、ＣＤＲ１−Ｈがアミノ酸位置２６〜３３（配列番号１９）にまたがり、ＦＲ２−Ｈがアミノ酸位置３４〜５０にまたがり、ＣＤＲ２−Ｈがアミノ酸位置５１〜５８（配列番号２０）にまたがり、ＦＲ３−Ｈがアミノ酸位置５９〜９６にまたがり、ＣＤＲ３−Ｈがアミノ酸位置９７〜１０９（配列番号２１）にまたがり、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置１１０〜１２０にまたがる、配列
からなる重鎖の可変ドメイン、ならびに
− ＦＲ１−Ｌがアミノ酸位置１〜２６にまたがり、ＣＤＲ１−Ｌがアミノ酸位置２７〜３２（配列番号２２）にまたがり、ＦＲ２−Ｌがアミノ酸位置３３〜４９にまたがり、ＣＤＲ２−Ｌがアミノ酸位置５０〜５２にまたがり、ＦＲ３−Ｌがアミノ酸位置５３〜８８にまたがり、ＣＤＲ３−Ｌがアミノ酸位置８９〜９７（配列番号２４）にまたがり、およびＦＲ４−Ｌがアミノ酸位置９８〜１０７にまたがる、配列
からなる軽鎖の可変ドメイン
を含む。
いわゆる「抗体ＭＡｂ５」は、
− ＦＲ１−Ｈがアミノ酸位置１〜２５にまたがり、ＣＤＲ１−Ｈがアミノ酸位置２６〜３３（配列番号２５）にまたがり、ＦＲ２−Ｈがアミノ酸位置３４〜５０にまたがり、ＣＤＲ２−Ｈがアミノ酸位置５１〜５８（配列番号２６）にまたがり、ＦＲ３−Ｈがアミノ酸位置５９〜９６にまたがり、ＣＤＲ３−Ｈがアミノ酸位置９７〜１０９（配列番号２７）にまたがり、およびＦＲ４−Ｈがアミノ酸位置１１０〜１２０にまたがる、配列
からなる重鎖の可変ドメイン、ならびに
− ＦＲ１−Ｌがアミノ酸位置１〜２６にまたがり、ＣＤＲ１−Ｌがアミノ酸位置２７〜３２（配列番号２８）にまたがり、ＦＲ２−Ｌがアミノ酸位置３３〜４９にまたがり、ＣＤＲ２−Ｌがアミノ酸位置５０〜５２にまたがり、ＦＲ３−Ｌがアミノ酸位置５３〜８８にまたがり、ＣＤＲ３−Ｌがアミノ酸位置８９〜９７（配列番号３０）にまたがり、およびＦＲ４−Ｌがアミノ酸位置９８〜１０７にまたがる、配列
からなる軽鎖の可変ドメイン
を含む。
従って、本発明は、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５に結合する抗体に関する。
ある実施形態において、本発明の抗体は、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５のＡ３−Ｂ３ドメインに結合する。より具体的には、抗体は、単離された形態で発現されるか、または可溶性細胞外ドメインもしくは膜に固定された完全長ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質中に存在するかどうかに関係なく、ヒトおよびカニクイザルＡ３−Ｂ３ドメインに結合することができる。
ヒトＣＥＡＣＡＭ５のＡ３−Ｂ３ドメインの抗体の特異性は、白人集団において２％より高い頻度でＳＮＰはこのドメイン中で報告されていないため、有利であり、ＣＥＡＣＡＭ５上の抗体のエピトープが集団の一部において変化する危険性を最小化する。
本発明はまた、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のＡ３−Ｂ３ドメインへの結合について、いわゆる抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ２Ｋ５２Ｒ、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、およびＭＡｂ５からなる群から選択される、すなわち、
ａ）配列番号３１の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３２の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；
ｂ）配列番号３３の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３４の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；
ｃ）位置５２のＫがＲにより置き換えられた、配列番号３３の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３４の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；
ｄ）配列番号３５の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３６の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；
ｅ）配列番号３７の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３８の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；ならびに
ｆ）配列番号３９の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号４０の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体
からなる群から選択される抗体の可変重鎖および軽鎖を含む抗体と競合する抗体も提供する。
ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のＡ３−Ｂ３ドメインへの結合について、抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、およびＭＡｂ５からなる群から選択される抗体の可変重鎖および軽鎖を含む抗体（以後、「参照」抗体とする）と競合する候補抗体の能力を、例えば、抗原（すなわち、ヒトもしくはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５のＡ３−Ｂ３ドメイン、またはＡ３−Ｂ３ドメイン、特に、ヒトもしくはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５の細胞外ドメインを含むヒトもしくはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５の断片を含むか、もしくはそれからなるポリペプチド）を固相支持体に結合させ、それぞれ、候補抗体および参照抗体を含有する２つの溶液を添加し、抗体を抗原への結合について競合させる、競合的ＥＬＩＳＡにより容易にアッセイすることができる。次いで、抗原に結合した参照抗体の量を測定し、陰性対照（例えば、抗体を含有しない溶液）に対して測定された場合の抗原に結合した参照抗体の量と比較することができる。陰性対照の存在下での結合した参照抗体の量と比較して減少した候補抗体の存在下での結合した参照抗体の量は、候補抗体が参照抗体と競合したことを示す。便宜上、参照抗体を標識（例えば、蛍光的に）して、結合した参照抗体の検出を容易にすることができる。候補および／または参照抗体の連続希釈液を用いて反復測定を実施することができる。
ある実施形態によれば、そのような抗体、例えば、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のＡ３−Ｂ３ドメインへの結合について、上記のｂ）、ｃ）、ｅ）およびｆ）に定義された抗体と競合する抗体は、それぞれ、ヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のＡ３−Ｂ３ドメインの位置１０９〜１１５のアミノ酸（配列番号７６）および位置１３１〜１４３のアミノ酸（配列番号７７）からなるヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のＡ３−Ｂ３ドメインの２つの領域に結合する。実際、ＭＡｂ２抗体の立体的エピトープは、ヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のＡ３−Ｂ３ドメインの領域１０９〜１１５および１３１〜１４３に属することが同定され、ＭＡｂ２、ＭＡｂ４およびＭＡｂ５は構造的に密接に関連し、前記抗体が同じエピトープに結合することが本発明者らによって推測される。
ある実施形態によれば、本発明による抗体は、表面ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に特異的である。ある実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ６、ヒトＣＥＡＣＡＭ７、ヒトＣＥＡＣＡＭ８、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ１、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ８タンパク質に結合しないか、またはそれらと有意に交差反応しない。
特に、抗体は、上記のヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭタンパク質の細胞外ドメインに結合しないか、またはそれと有意に交差反応しない。
ヒトＣＥＡＣＡＭ１完全長タンパク質は、受託番号ＮＰ＿００１７０３．２（配列番号１１）の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースで入手可能である。ヒトＣＥＡＣＡＭ１の細胞外ドメインは、配列番号１１の位置３５〜４２８のアミノ酸からなる。ヒトＣＥＡＣＡＭ６完全長タンパク質は、受託番号ＮＰ＿００２４７４．３（配列番号７１）の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースで入手可能である。ヒトＣＥＡＣＡＭ６の細胞外ドメインは、配列番号７１の位置３５〜３２７のアミノ酸からなる。
ヒトＣＥＡＣＡＭ７完全長タンパク質は、受託番号ＮＰ＿００８８２１．１（配列番号７２）の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースで入手可能である。ヒトＣＥＡＣＡＭ７の細胞外ドメインは、配列番号７２の位置３６〜２４８のアミノ酸からなる。
ヒトＣＥＡＣＡＭ８完全長タンパク質は、受託番号ＮＰ＿００１８０７．２（配列番号７３）の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースで入手可能である。ヒトＣＥＡＣＡＭ８の細胞外ドメインは、配列番号７３の位置３５〜３３２のアミノ酸からなる。
カニクイザルＣＥＡＣＡＭ１細胞外ドメインは、完全長タンパク質の位置３５〜４２８のアミノ酸、すなわち、配列番号５７のアミノ酸１〜３９４からなる。
カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６細胞外ドメインは、完全長タンパク質の位置３５〜３２７のアミノ酸、すなわち、配列番号６１のアミノ酸１〜２９３からなる。
カニクイザルＣＥＡＣＡＭ８細胞外ドメインは、完全長タンパク質の位置３５〜３３２のアミノ酸、すなわち、配列番号６３のアミノ酸１〜２９８からなる。
「親和性」は、理論的には、全抗体と抗原との間の平衡会合により定義される。それを、表面プラズモン共鳴を用いる会合および解離速度の測定または免疫化学アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ）におけるＥＣ５０（もしくは見かけのＫＤ）の測定のような様々な公知の方法によって実験的に評価することができる。これらのアッセイにおいて、ＥＣ５０は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）による規定濃度の抗原またはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）による抗原を発現する細胞へのある特定の曝露時間後のベースラインと最大との間の中間の応答を誘導する抗体の濃度である。
抗原１（Ａｇ１）に結合するモノクローナル抗体は、ＥＣ５０が両抗原について類似する範囲にある場合、抗原２（Ａｇ２）と「交差反応」する。本出願においては、Ａｇ１に結合するモノクローナル抗体は、Ａｇ２の親和性とＡｇ１の親和性との比が１０以下（例えば、５、２、１または０．５）である場合、Ａｇ２と交差反応し、その親和性は両抗原について同じ方法を用いて測定される。
Ａｇ１に結合するモノクローナル抗体は、親和性が２つの抗原について非常に異なる場合、Ａｇ２と「有意に交差反応しない」。Ａｇ２に対する親和性は、結合応答が低すぎる場合、測定可能でなくてもよい。本出願においては、Ａｇ１に結合するモノクローナル抗体は、Ａｇ２に対するモノクローナル抗体の結合応答が、同じ実験設定および同じ抗体濃度でＡｇ１に対する同じモノクローナル抗体の結合応答の５％未満である場合、Ａｇ２と有意に交差反応しない。実際には、用いられる抗体濃度は、ＥＣ５０またはＡｇ１を用いて得られる飽和プラトーに達するのに必要とされる濃度であってもよい。
モノクローナル抗体は、それがＡｇ２と有意に交差反応しない場合、Ａｇ１に「特異的に結合する」またはＡｇ１「に特異的である」。従って、本発明による抗体は、１０以下、例えば、５以下、２以下、１以下、または０．５以下である、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に対する親和性とカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５に対する親和性との比を有する。かくして、サルにおいて観察される毒性プロファイルはヒトにおける潜在的な有害効果を予測するのに関連するため、本発明によるポリペプチドを、サルにおいて実施される毒性試験において用いることができる。
本発明のある実施形態は、１０ｎＭ以下、例えば、５ｎＭ以下、３ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下である、ヒトＣＥＡＣＡＭ５またはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５、またはその両方に対する親和性、例えば、０．０１ｎＭ〜５ｎＭの親和性、または０．１ｎＭ〜５ｎＭの親和性、または０．１ｎＭ〜１ｎＭの親和性を有する。
ヒトＣＥＡＣＡＭ５またはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５に対する親和性を、捕捉抗原として可溶性組換えＣＥＡＣＡＭ５を用いるＥＬＩＳＡにおいてＥＣ５０値として決定することができる。
本発明の抗体はまた、２５ｎＭ以下、例えば、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、３ｎＭ以下または１ｎＭ以下である、腫瘍細胞系ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ４０９）または患者に由来する異種移植片腫瘍細胞（Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、腫瘍コレクションＣＲｅＭＥＣから入手可能なＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ）上でのＦＡＣＳ分析により決定することができるような、見かけの解離定数（見かけのＫＤ）を有してもよい。見かけのＫＤは、０．０１〜２０ｎＭの範囲内にあってもよく、または０．１〜２０ｎＭ、０．１〜１０ｎＭ、もしくは０．１〜５ｎＭの範囲内にあってもよい。
さらに、本発明による抗体は、凍結およびホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片中での免疫組織化学分析によりＣＥＡＣＡＭ５発現を検出することができることが示されている。
ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４およびＭＡｂ５抗体のＶＨおよびＶＬ領域の配列のアラインメントを、図７に示す。ＣＲＤ−ＨおよびＣＤＲ−Ｌ配列の比較は、構造的に、一方でＭＡｂ２、ＭＡｂ４およびＭＡｂ５、他方でＭＡｂ１およびＭＡｂ３が密接に関連し、前記抗体がおそらく同じエピトープに結合することを示す。ＣＲＤ−ＨおよびＣＤＲ−Ｌ配列の比較は、２つの抗体群間で厳密に保存され、かくして、特異性にとって重要であると推測されるＣＤＲ位置をさらに同定するが、他の位置は置換を支援することができる。
ＭＡｂ２ ＶＨの位置１０１〜１０９の残基（すなわち、ＣＤＲ３−Ｈの残基）ならびにＭＡｂ２ ＶＬの位置４７〜５４および８８〜１０４の残基（すなわち、それぞれ、ＣＤＲ２−ＬおよびＣＤＲ３−Ｌを含む領域）が、ヒトＣＥＡＣＡＭ５−Ａ３Ｂ３ドメインのための抗体パラトープの一部を成すか、またはそれを形成することが、本発明者らによってさらに同定された。
さらに、ＭＡｂ２ ＶＬの位置２７、２８、２９、３１、５１、５２、８９、９０、９３、９４、９６および９７の残基（すなわち、ＣＤＲ１−Ｌ、ＣＤＲ２−ＬおよびＣＤＲ３−Ｌ内）、ならびにＭＡｂ２ ＶＨの位置２６〜３１、５１〜５８、９７、１０３、１０４、１０７、および１０９の残基（すなわち、ＣＤＲ１−Ｈ内、ＣＤＲ２−Ｈの全部およびＣＤＲ３−Ｈ内）は、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５細胞外ドメインへの結合について中性であるとして単一のアミノ酸置換により同定された。さらに、ＭＡｂ２ ＶＨの位置３０および９２の残基（すなわち、ＣＤＲ１−ＬおよびＣＤＲ３−Ｌ内）、ならびにＭＡｂ２ ＶＨの位置９８および１００の残基（すなわち、ＣＤＲ３−Ｈ内）は、保存的置換を許容することが示された。ＭＡｂ２、ＭＡｂ４およびＭＡｂ５は６つのＣＤＲの同じセットまたは非常に密接に関連するものを担持するため、ＶＨもしくはＶＬまたはＶＨとＣＬ配列の両方におけるＭＡｂ４またはＭＡｂ５の同じ位置での変化は、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５に対する結合特異性および／または親和性を維持するバリアント抗体をももたらすと考えられる。
注目すべきことに、ＣＤＲ２−Ｈの全ての残基は、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５細胞外ドメインへの結合について中性であると同定され、本発明者らは、ＣＤＲ２−Ｈが相互作用に関与しなくてもよいと推測した。従って、本発明の抗体において、ＣＤＲ２−Ｈは、６〜１０アミノ酸の任意の配列であってよく、これはヒト抗体における規則的な長さのＣＤＲ２−Ｈ配列である。
従って、本発明による抗体は、
ａ）配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＤ（配列番号８３）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６はそれぞれ任意のアミノ酸である）からなるＣＤＲ１−Ｈ；ならびに
任意のアミノ酸が任意の位置に存在してもよい６〜１０アミノ酸長の配列、好ましくは８アミノ酸長の配列からなるＣＤＲ２−Ｈ；ならびに
配列Ｘ１Ｘ２ＨＸ３ＦＧＸ４Ｘ５ＧＰＸ６ＡＸ７（配列番号８４）（式中、Ｘ１、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７はそれぞれ任意のアミノ酸であり、Ｘ２はＡもしくはＳであり、Ｘ３はＹ、ＦもしくはＷである）からなるＣＤＲ３−Ｈ；ならびに／または
ｂ）配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｙ（配列番号８５）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ５はそれぞれ任意のアミノ酸であり、Ｘ４はＹ、ＦもしくはＷである）からなるＣＤＲ１−Ｌ；ならびに
配列番号ＮＸ１Ｘ２（式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ任意のアミノ酸である）からなるＣＤＲ２−Ｌ；ならびに
配列Ｘ１Ｘ２ＨＸ３Ｘ４Ｘ５ＰＸ６Ｘ７（配列番号８６）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７はそれぞれ任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＹ、ＦもしくはＷである）からなるＣＤＲ３−Ｌ
を含む。
ある実施形態において、配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＤ（配列番号８３）からなるＣＤＲ１−Ｈにおいて、Ｘ１はＧであるか、またはＸ２はＦであるか、またはＸ３はＴ、ＡもしくはＶであるか、またはＸ４はＦであるか、またはＸ５はＳであるか、またはＸ６はＳであるか、またはその任意の組合せである。
ある実施形態において、ＣＤＲ２−Ｈは、配列ＩＸ１ＳＸ２ＧＧＸ３Ｔ（配列番号７９）（式中、Ｘ１はＳまたはＮ（特に、Ｓ）であり、Ｘ２はＹまたはＧ（特に、Ｇ）であり、Ｘ３はＲまたはＩである）からなる。さらなる実施形態において、Ｘ３はＩである。
ある実施形態において、配列Ｘ１Ｘ２ＨＸ３ＦＧＸ４Ｘ５ＧＰＸ６ＡＸ７（配列番号８４）からなるＣＤＲ３−Ｈにおいて、Ｘ１はＡもしくはＴであるか、またはＸ４はＴもしくはＳであるか、またはＸ５はＳであるか、またはＸ６はＦであるか、またはＸ７はＹであるか、またはその任意の組合せである。
ある実施形態において、配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｙ（配列番号８５）からなるＣＤＲ１−Ｌにおいて、Ｘ１はＥであるか、またはＸ２はＮであるか、またはＸ３はＩであるか、またはＸ５はＳであるか、またはその任意の組合せである。
ある実施形態において、ＣＤＲ２−Ｌは、配列ＮＸ１Ｘ２（式中、Ｘ１はＡまたはＴであり、Ｘ２はＫまたはＲである）からなる。
ある実施形態において、配列Ｘ１Ｘ２ＨＸ３Ｘ４Ｘ５ＰＸ６Ｘ７（配列番号８６）からなるＣＤＲ３−Ｌにおいて、Ｘ１はＱであるか、またはＸ２はＨであるか、またはＸ４はＧであるか、またはＸ５はＴであるか、またはＸ６はＦであるか、またはＸ７はＴであるか、またはその任意の組合せである。ある実施形態によれば、本発明による抗体は、
ａ）配列ＧＦＸ１ＦＳＳＹＤ（配列番号７８）（式中、Ｘ１はＴ、ＡもしくはＶである）からなるＣＤＲ１−Ｈ；および
配列ＩＸ１ＳＸ２ＧＧＸ３Ｔ（配列番号７９）（式中、Ｘ１はＳもしくはＮ（特に、Ｓ）であり、Ｘ２はＹもしくはＧ（特に、Ｇ）であり、Ｘ３はＲもしくはＩである）からなるＣＤＲ２−Ｈ；および
配列Ｘ１ＡＨＹＦＧＸ２ＳＧＰＦＡＹ（配列番号８０）（式中、Ｘ１はＡもしくはＴ（特に、Ａ）であり、Ｘ２はＴもしくはＳである）からなるＣＤＲ３−Ｈ；ならびに／または
ｂ）配列ＥＮＩＦＳＹ（配列番号１０）もしくはＥＮＩＹＳＹ（配列番号２２）からなるＣＤＲ１−Ｌ；および
配列ＮＸ１Ｘ２（式中、Ｘ１はＡもしくはＴであり、Ｘ２はＫもしくはＲである）からなるＣＤＲ２−Ｌ；および
配列ＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号１２）もしくはＱＨＨＹＧＩＰＦＴ（配列番号２４）からなるＣＤＲ３−Ｌ
を含む。
ある実施形態によれば、ＣＤＲ２−Ｈにおいて、Ｘ１はＳまたはＮであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＩである。
ある実施形態によれば、ＣＤＲ２−Ｈは、ＩＳＳＧＧＧＩＴ（配列番号８）、ＩＳＳＹＧＧＲＴ（配列番号２０）またはＩＮＳＧＧＧＩＴ（配列番号２６）からなる。
ある実施形態によれば、ＣＤＲ３−Ｈにおいて、Ｘ１はＡまたはＴであり、Ｘ２はＳである。
ある実施形態によれば、ＣＤＲ３−Ｈは、ＡＡＨＹＦＧＳＳＧＰＦＡＹ（配列番号９）、ＡＡＨＹＦＧＴＳＧＰＦＡＹ（配列番号２１）、またはＴＡＨＹＦＧＳＳＧＰＦＡＹ（配列番号２７）からなる。
これらの実施形態の任意の組合せは、本発明の一部を成す。
あるいは、本発明による抗体は、
ａ）配列ＧＦＴＦＳＸ１ＹＸ２（配列番号８１）（式中、Ｘ１はＲもしくはＳであり、
特にＳであり、Ｘ２はＡもしくはＤである）からなるＣＤＲ１−Ｈ；および
配列ＩＳＳＧＧＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号８２）（式中、Ｘ１は存在しないか、ＳもしくはＧ（特に、Ｇ）であり、Ｘ２はＤ、ＹもしくはＩであり、Ｘ３はＴもしくはＩである）からなるＣＤＲ２−Ｈ；および
配列ＡＲＰＡＹＹＧＮＰＡＭＤＹ（配列番号３）もしくはＡＲＶＮＹＹＤＳＳＦＬＤＷ（配列番号１５）からなるＣＤＲ３−Ｈ；ならびに／または
ｂ）配列ＱＮＶＧＴＮ（配列番号４）からなるＣＤＲ１−Ｌ；および
配列ＳＡＳからなるＣＤＲ２−Ｌ；および
配列ＱＱＹＮＳＹＰＬＹＴ（配列番号６）もしくはＱＱＹＮＮＹＰＬＹＴ（配列番号１８）からなるＣＤＲ３−Ｌ
を含む。
ある実施形態によれば、ＣＤＲ２−Ｈは、配列ＩＳＳＧＧＳＹＩ（配列番号２）またはＩＳＳＧＧＤＴ（配列番号１４）からなる。
ある実施形態によれば、ＣＤＲ２−Ｈは、配列ＩＳＳＧＧＳＹＩ（配列番号２）からなり、ＣＤＲ３−Ｈは、配列ＡＲＰＡＹＹＧＮＰＡＭＤＹ（配列番号３）からなる。
ある実施形態によれば、ＣＤＲ２−Ｈは、ＩＳＳＧＧＤＴ（配列番号１４）からなり、ＣＤＲ３−Ｈは、配列ＡＲＶＮＹＹＤＳＳＦＬＤＷ（配列番号１５）からなる。
ある実施形態によれば、本発明による抗体は、いわゆる抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ２Ｋ５２Ｒ、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、およびＭＡｂ５の１つの重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ配列を含む。
従って、本発明は、
ａ）配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号１）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号１と異なる配列のＣＤＲ１−Ｈ；配列ＩＳＳＧＧＳＹＩ（配列番号２）もしくは１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換により配列番号２と異なる配列のＣＤＲ２−Ｈ；配列ＡＲＰＡＹＹＧＮＰＡＭＤＹ（配列番号３）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号３と異なる配列のＣＤＲ３−Ｈ；配列ＱＮＶＧＴＮ（配列番号４）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号４と異なる配列のＣＤＲ１−Ｌ；配列ＳＡＳもしくは１個のアミノ酸置換によりＳＡＳと異なる配列のＣＤＲ２−Ｌおよび配列ＱＱＹＮＳＹＰＬＹＴ（配列番号６）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号６と異なる配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
ｂ）配列ＧＦＶＦＳＳＹＤ（配列番号７）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号７と異なる配列のＣＤＲ１−Ｈ；配列ＩＳＳＧＧＧＩＴ（配列番号８）もしくは１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換により配列番号８と異なる配列のＣＤＲ２−Ｈ；配列ＡＡＨＹＦＧＳＳＧＰＦＡＹ（配列番号９）もしくは１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換により配列番号９と異なる配列のＣＤＲ３−Ｈ；配列ＥＮＩＦＳＹ（配列番号１０）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号１０と異なる配列のＣＤＲ１−Ｌ；配列ＮＴＫもしくはＮＴＲもしくは１個のアミノ酸置換によりＮＴＫもしくはＮＴＲと異なる配列のＣＤＲ２−Ｌおよび配列ＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号１２）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号１２と異なる配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
ｃ）配列ＧＦＴＦＳＲＹＡ（配列番号１３）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号１３と異なる配列のＣＤＲ１−Ｈ；配列ＩＳＳＧＧＤＴ（配列番号１４）もしくは１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換により配列番号１４と異なる配列のＣＤＲ２−Ｈ；配列ＡＲＶＮＹＹＤＳＳＦＬＤＷ（配列番号１５）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号１５と異なる配列のＣＤＲ３−Ｈ；配列ＱＮＶＧＴＮ（配列番号１６）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号１６と異なる配列のＣＤＲ１−Ｌ；配列ＳＡＳもしくは１個のアミノ酸置換によりＳＡＳと異なる配列のＣＤＲ２−Ｌおよび配列ＱＱＹＮＮＹＰＬＹＴ（配列番号１８）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号１８と異なる配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
ｄ）配列ＧＦＴＦＳＳＹＤ（配列番号１９）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号１９と異なる配列のＣＤＲ１−Ｈ；配列ＩＳＳＹＧＧＲＴ（配列番号２０）もしくは１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換により配列番号２０と異なる配列のＣＤＲ２−Ｈ；配列ＡＡＨＹＦＧＴＳＧＰＦＡＹ（配列番号２１）もしくは１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換により配列番号２１と異なる配列のＣＤＲ３−Ｈ；配列ＥＮＩＹＳＹ（配列番号２２）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号２２と異なる配列のＣＤＲ１−Ｌ；配列ＮＡＫもしくは１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換によりＮＡＫと異なる配列のＣＤＲ２−Ｌおよび配列ＱＨＨＹＧＩＰＦＴ（配列番号２４）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号２４と異なる配列のＣＤＲ３−Ｌ；または
ｅ）配列ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号２５）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号２５と異なる配列のＣＤＲ１−Ｈ；配列ＩＮＳＧＧＧＩＴ（配列番号２６）もしくは１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換により配列番号２６と異なる配列のＣＤＲ２−Ｈ；配列ＴＡＨＹＦＧＳＳＧＰＦＡＹ（配列番号２７）もしくは１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換により配列番号２７と異なる配列のＣＤＲ３−Ｈ；配列ＥＮＩＹＳＹ（配列番号２８）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号２８と異なる配列のＣＤＲ１−Ｌ；配列ＮＡＫもしくは１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換によりＮＡＫと異なる配列のＣＤＲ２−Ｌおよび配列ＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３０）もしくは１個のアミノ酸置換により配列番号３０と異なる配列のＣＤＲ３−Ｌ
を含む抗体に関する。
１個またはそれ以上の個々のアミノ酸を、上記ＣＤＲ配列の１つまたはそれ以上において、置換、特に、保存的置換により変化させることができる。そのような変化は、例えば、抗体のヒト化と共に、グリコシル化部位または脱アミド化部位を除去することが意図されてもよい。
ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４およびＭＡｂ５のＶＨおよびＶＬ領域の配列のアラインメントに基づいて、ならびにＭＡｂ２抗体のバリアントにおける単一のアミノ酸置換に基づいて、アミノ酸を、
− ＣＤＲ１−Ｈにおいて：配列ＧＦＶＦＳＳＹＤ（配列番号７）、ＧＦＴＦＳＳＹＤ（配列番号１９）もしくはＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号２５）のＣＤＲ１−Ｈの位置１〜６の１つもしくはそれ以上、例えば、位置３で、もしくは配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号１）もしくはＧＦＴＦＳＲＹＡ（配列番号１３）のＣＤＲ１−Ｈの位置６で；ならびに／または
− ＣＤＲ２−Ｈにおいて、配列ＩＳＳＧＧＧＩＴ（配列番号８）、ＩＳＳＹＧＧＲＴ（配列番号２０）もしくはＩＮＳＧＧＧＩＴ（配列番号２６）のＣＤＲ２−Ｈの任意の位置の１つもしくはそれ以上、もしくは位置２、４および７の１つ、２つもしくは３つで、もしくは配列ＩＳＳＧＧＳＹＩ（配列番号２）もしくはＩＳＳＧＧＤＴ（配列番号１４）のＣＤＲ２−Ｈの位置６、７および８（配列が８アミノ酸長である場合）の１つ、２つもしくは３つで；ならびに／または上記を参照されたい
− ＣＤＲ３−Ｈにおいて、配列ＡＡＨＹＦＧＳＳＧＰＦＡＹ（配列番号９）、ＡＡＨＹＦＧＴＳＧＰＦＡＹ（配列番号２１）、もしくはＴＡＨＹＦＧＳＳＧＰＦＡＹ（配列番号２７）のＣＤＲ３−Ｈの位置１、７、８、１１および１３の１つもしくはそれ以上、例えば、位置１および７の１つもしくは２つで、もしくは配列ＡＲＰＡＹＹＧＮＰＡＭＤＹ（配列番号３）もしくはＡＲＶＮＹＹＤＳＳＦＬＤＷ（配列番号１５）の位置３、４、７、８、９、１０もしくは１１で；ならびに／または
− ＣＤＲ１−Ｌにおいて、配列ＥＮＩＦＳＹ（配列番号１０）もしくはＥＮＩＹＳＹ（配列番号２８）のＣＤＲ１−Ｌの位置１〜５の１つもしくはそれ以上、特に、位置１、２、３および５の１つもしくはそれ以上、もしくは位置４で；ならびに／または
− ＣＤＲ２−Ｌにおいて、配列ＮＡＫ、ＮＴＫもしくはＮＴＲの位置２および／もしくは３、特に、Ｋが存在する場合、少なくとも位置３で。そのような場合、例えば、Ｒを、ＣＤＲ２−Ｌの位置３でＫに置換することができる；ならびに／または
− ＣＤＲ３−Ｌにおいて、配列ＱＨＨＹＧＩＰＦＴ（配列番号２４）もしくはＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３０）のＣＤＲ３−Ｌの位置１、２、５、６、８および９の１つもしくはそれ以上、例えば、位置６で、もしくは配列ＱＱＹＮＳＹＰＬＹＴ（配列番号６）もしくはＱＱＹＮＮＹＰＬＹＴ（配列番号１８）のＣＤＲ３−Ｌの位置５で
置換することができる。
ある実施形態によれば、本発明の抗体において：
− 配列ＡＡＨＹＦＧＳＳＧＰＦＡＹ（配列番号９）、ＡＡＨＹＦＧＴＳＧＰＦＡＹ（配列番号２１）、もしくはＴＡＨＹＦＧＳＳＧＰＦＡＹ（配列番号２７）のＣＤＲ３−Ｈの位置５；および／または
− 配列ＥＮＩＦＳＹ（配列番号１０）もしくはＥＮＩＹＳＹ（配列番号２８）のＣＤＲ１−Ｌの位置６；および／または
− 配列ＱＨＨＹＧＩＰＦＴ（配列番号２４）もしくはＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３０）のＣＤＲ３−Ｌの位置３
は、非改変である。
ある実施形態によれば、配列ＧＦＶＦＳＳＹＤ（配列番号７）、ＧＦＴＦＳＳＹＤ（配列番号１９）またはＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号２５）のＣＤＲ１−Ｈにおいて、ＣＤＲ１−Ｈの位置３のアミノ酸に置換されるアミノ酸は、Ｔ、ＡまたはＶからなる群から選択される。
ある実施形態によれば、配列ＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号１）またはＧＦＴＦＳＲＹＡ（配列番号１３）のＣＤＲ１−Ｈにおいて、ＣＤＲ１−Ｈの位置６のアミノ酸に置換されるアミノ酸は、ＲまたはＳである。
ある実施形態によれば、配列ＡＡＨＹＦＧＳＳＧＰＦＡＹ（配列番号９）、ＡＡＨＹＦＧＴＳＧＰＦＡＹ（配列番号２１）、またはＴＡＨＹＦＧＳＳＧＰＦＡＹ（配列番号２７）のＣＤＲ３−Ｈにおいて、ＣＤＲ３−Ｈの位置１のアミノ酸に置換されるアミノ酸は、ＡもしくはＴである、および／またはＣＤＲ３−Ｈの位置７のアミノ酸に置換されるアミノ酸は、ＴもしくはＳである。
ある実施形態によれば、配列ＡＲＰＡＹＹＧＮＰＡＭＤＹ（配列番号３）またはＡＲＶＮＹＹＤＳＳＦＬＤＷ（配列番号１５）のＣＤＲ３−Ｈにおいて、ＣＤＲ３−Ｈの位置３のアミノ酸に置換されるアミノ酸は、ＶもしくはＰであり、位置４ではＡもしくはＮであり、位置７ではＤもしくはＧであり、位置８ではＳもしくはＮであり、位置９ではＳもしくはＰであり、位置１０ではＦもしくはＡであるか、または位置１１ではＷもしくはＹである。
ある実施形態によれば、ＣＤＲ１−Ｌの位置４のアミノ酸に置換されるアミノ酸は、ＹまたはＦである。
ある実施形態によれば、配列ＮＡＫ、ＮＴＫまたはＮＴＲのＣＤＲ２−Ｌにおいて、ＣＤＲ２−Ｌの位置２のアミノ酸に置換されるアミノ酸は、ＡまたはＴである。
ある実施形態によれば、配列ＱＱＹＮＳＹＰＬＹＴ（配列番号６）またはＱＱＹＮＮＹＰＬＹＴ（配列番号１８）のＣＤＲ３−Ｌにおいて、ＣＤＲ３−Ｌの位置５のアミノ酸に置換されるアミノ酸は、ＮまたはＳである。
ある実施形態によれば、配列ＱＨＨＹＧＩＰＦＴ（配列番号２４）またはＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号３０）のＣＤＲ３−Ｌにおいて、ＣＤＲ３−Ｌの位置６のアミノ酸に置換されるアミノ酸は、ＩまたはＴである。
上記実施形態の任意の組合せは、本発明の一部を成す。
ある実施形態において、本発明による抗体は、従来のモノクローナル抗体、または抗体断片、二重特異的もしくは多重特異的抗体のような従来の抗体である。
ある実施形態において、本発明による抗体は、ＩｇＧ、またはその断片を含むか、またはそれからなる。
本発明はまた、５つのいわゆる抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、およびＭＡｂ５の１つの少なくとも重鎖の可変ドメインおよび／または軽鎖の可変ドメインをさらに含む、上記で定義された抗体も提供する。
かくして、本発明のある実施形態は、
ａ）配列番号３１の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号３２の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
ｂ）配列番号３３の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号３４の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
ｃ）配列番号３５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号３６の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
ｄ）配列番号３７の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号３８の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
ｅ）配列番号３９の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび／もしくは配列番号４０の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン
を含む抗体に関する。例えば、重鎖または軽鎖の可変ドメインの配列は、必要に応じて、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、特に、１つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換および／または標準的な残基との置換により、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の参照配列と異なっていてもよい。ある実施形態において、重鎖または軽鎖の可変ドメインの配列は、保存的アミノ酸置換のみによって、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の参照配列と異なっていてもよい。
配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の配列と比較した配列変化は、本質的には１つまたはそれ以上のフレームワーク領域、ＦＲ１−Ｌ、ＦＲ２−Ｌ、ＦＲ３−Ｌ、ＦＲ４−Ｌおよび／またはＦＲ１−Ｈ、ＦＲ２−Ｈ、ＦＲ３−Ｈ、ＦＲ４−Ｈ中に存在する。
しかしながら、１つまたはそれ以上のＣＤＲ中のアミノ酸置換も可能である。ある実施形態において、軽鎖の可変ドメインの配列は、配列番号３４（ＣＤＲ２−Ｌ中）の位置５２での少なくともＫからＲへの置換により配列番号３４の配列と異なっていてもよい。
本発明の抗体およびその断片は、それぞれ、マウス抗体およびマウス抗体の断片であってもよい。
抗体はまた、キメラ抗体であってもよく、ある実施形態において、マウス／ヒト抗体、例えば、重鎖および軽鎖のマウス可変ドメインと、ヒト抗体に由来するＣＨドメインおよびＣＬドメインとを含む抗体であってもよい。ポリペプチドは、そのような抗体の断片であってもよい。
ある実施形態によれば、本発明の抗体は、
ａ）配列番号４１の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖もしくは配列番号４２の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖（すなわち、実施例５に記載のｃｈＭＡｂ１の重鎖および／または軽鎖）；もしくは重鎖および軽鎖を含む、もしくはそれからなるキメラ抗体、または
ｂ）配列番号４３の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖もしくは配列番号４４の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖（すなわち、実施例５に記載のｃｈＭＡｂ２の重鎖および／または軽鎖）；もしくは重鎖および軽鎖を含む、もしくはそれからなるキメラ抗体、または
ｃ）配列番号４５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖もしくは配列番号４６の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖（すなわち、実施例５に記載のｃｈＭＡｂ３の重鎖および／または軽鎖）；もしくは重鎖および軽鎖を含む、もしくはそれからなるキメラ抗体、または
ｄ）配列番号４７の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖もしくは配列番号４８の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖（すなわち、実施例５に記載のｃｈＭＡｂ４の重鎖および／または軽鎖）；もしくは重鎖および軽鎖を含む、もしくはそれからなるキメラ抗体、または
ｅ）配列番号４９の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖もしくは配列番号５０の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖（すなわち、実施例５に記載のｃｈＭＡｂ５の重鎖および／または軽鎖）；もしくは重鎖および軽鎖を含む、もしくはそれからなるキメラ抗体、または
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）もしくはｅ）に定義されたキメラ抗体の断片
である。
抗体はまた、ヒト化抗体またはヒト化抗体の断片であってもよい。ある実施形態において、本発明の抗体は、上記のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）に定義されたキメラ抗体のいずれかのヒト化から生じてもよい。
抗体配列のヒト化のためのいくつかの方法が当業界で公知である；例えば、Ａｌｍａｇｒｏ＆Ｆｒａｎｓｓｏｎ（２００８）Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３頁による概説を参照されたい。１つの一般的に用いられる方法は、ＣＤＲ移植、またはドナー抗体、一般的にはマウス抗体のＣＤＲ配列を、異なる特異性のヒト抗体のフレームワーク足場に移植することを含む抗体再形成である。ＣＤＲ移植はＣＤＲ移植された非ヒト抗体の結合特異性および親和性、かくして、生物活性を低下させ得るため、ＣＤＲ移植された抗体の選択された位置に復帰変異を導入して、親抗体の結合特異性および親和性を保持することができる。可能な復帰変異のための位置の同定を、文献および抗体データベース中で入手可能な情報を用いて実施することができる。復帰変異のための候補であるアミノ酸残基は、典型的には、抗体分子の表面に位置するものであるが、埋まった残基または表面露出度が低い残基は通常、変化されない。ＣＤＲ移植および復帰変異に対する代替的なヒト化技術は、非ヒト起源の表面露出していない残基を保持するが、表面残基をヒト残基に変化させるリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）である。別の代替的な技術は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」（Ｊｅｓｐｅｒｓら（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２、８９９頁）として公知であり、これを用いて、マウス抗体から、親抗体のエピトープおよび結合特性を保持する完全ヒト抗体を誘導することができる。
キメラ抗体について、ヒト化は、典型的には、可変領域配列のフレームワーク領域の改変を含む。
ＣＤＲの一部であるアミノ酸残基は、典型的には、ヒト化に関連して変化されないが、ある特定の事例では、個々のＣＤＲアミノ酸残基を変化させて、例えば、グリコシル化部位、脱アミド化部位または望ましくないシステイン残基を除去することが望ましい場合がある。Ｎ結合グリコシル化は、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であってよい）中のアスパラギン残基へのオリゴ糖鎖の結合により生じる。Ｎ−グリコシル化部位の除去を、例えば、保存的置換により、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のいずれかを異なる残基に変異させることにより達成することができる。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出のような因子に依存して起こり得る。アスパラギン残基は、主に配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ中に存在する場合、脱アミド化の影響を特に受けやすく、Ａｓｎ−Ａｌａのような他のジペプチド配列中ではその程度はより低い。そのような脱アミド化部位、例えば、Ａｓｎ−ＧｌｙがＣＤＲ配列中に存在する場合、従って典型的には、関与する残基の１つを除去するための保存的置換によってその部位を除去することが望ましい場合がある。関与する残基の１つを除去するためのＣＤＲ配列中の置換もまた、本発明により包含されることが意図される。
例としていわゆる「抗体ＭＡｂ２」を取れば、ヒト化抗体またはその断片は、可変重鎖中に以下の変異：位置９にＧの代わりにＰ；および／または位置１０にＶの代わりにＧ；および／または位置１９にＫの代わりにＳ；および／または位置４３にＫの代わりにＲ；および／または位置４４にＲの代わりにＧ；および／または位置６０にＦの代わりにＡ；および／または位置６２にＤの代わりにＳ；および／または位置６５にＱの代わりにＫ；および／または位置８７にＫの代わりにＴ；および／または位置８９にＩの代わりにＶ；および／または位置１１３にＡの代わりにＳを含んでもよく；これらの位置は配列番号３３を参照することにより与えられる。
例としていわゆる「抗体ＭＡｂ２」をさらに取れば、ヒト化抗体またはその断片は、可変軽鎖中に以下の変異：位置１７にＥの代わりにＤ；および／または位置１８にＴの代わりにＲ；および／または位置４０にＱの代わりにＰ；および／または位置４５にＱの代わりにＫ；および／または位置５２にＫの代わりにＲ；および／または位置７０にＱの代わりにＤ；および／または位置７４にＫの代わりにＴ；および／または位置７６にＮの代わりにＳ；および／または位置８４にＧの代わりにＡ；および／または位置８５にＳの代わりにＴを含んでもよく；これらの位置は配列番号３４を参照することにより与えられる。
ある実施形態において、本発明の抗体は、配列番号３３を参照することにより与えられる位置に、以下の変異：
ａ）位置９にＧの代わりにＰ；および位置１０にＶの代わりにＧ；および位置１９にＫの代わりにＳ；および位置４３にＫの代わりにＲ；および位置６２にＤの代わりにＳ；および位置６５にＱの代わりにＫ；および位置８７にＫの代わりにＴ；または
ｂ）位置９にＧの代わりにＰ；および位置１０にＶの代わりにＧ；および位置１９にＫの代わりにＳ；および位置４３にＫの代わりにＲ；および位置４４にＲの代わりにＧ；および位置６０にＦの代わりにＡ；および位置６２にＤの代わりにＳ；および位置６５にＱの代わりにＫ；および位置８７にＫの代わりにＴ；および位置８９にＩの代わりにＶ；および位置１１３にＡの代わりにＳ
を含む重鎖を含むか、もしくはそれからなるヒト化抗体；ならびに／または
配列番号３４を参照することにより与えられる位置に、以下の変異：
ｃ）位置１７にＥの代わりにＤ；および位置４０にＱの代わりにＰ；および位置４５にＱの代わりにＫ；および位置７４にＫの代わりにＴ；および位置７６にＮの代わりにＳ；または
ｄ）位置１７にＥの代わりにＤ；および位置１８にＴの代わりにＲ；および位置４０にＱの代わりにＰ；および位置４５にＱの代わりにＫ；および位置７０にＱの代わりにＤ；および位置７４にＫの代わりにＴ；および位置７６にＮの代わりにＳ；および位置８４にＧの代わりにＡ；および位置８５にＳの代わりにＴ；または
ｅ）位置１７にＥの代わりにＤ；および位置１８にＴの代わりにＲ；および位置４０にＱの代わりにＰ；および位置４５にＱの代わりにＫ；および位置５２にＫの代わりにＲ；および位置７０にＱの代わりにＤ；および位置７４にＫの代わりにＴ；および位置７６にＮの代わりにＳ；および位置８４にＧの代わりにＡ；および位置８５にＳの代わりにＴ
を含む軽鎖を含むヒト化抗体である。
ある実施形態において、本発明の抗体は、本発明の抗体のＣＤＲを、代替的な抗体フレームワーク領域、より具体的には、ヒトフレームワーク領域に移植することにより得られるヒト化抗体である。例としてＭＡｂ２を取れば、ＭＡｂ２Ｋ５２Ｒの６つのＣＤＲを、ＩＧＨＶ３−２３およびＩＧＫＶ１Ｄ−３９遺伝子からなるヒトフレームワークに移植し、ＶＬ（配列番号３４）中の位置３４および５３ならびにＶＨ（配列番号３３）中の位置５０に対応する３つの復帰変異を導入し、配列番号７４の配列の重鎖の可変ドメインと、配列番号７５の配列の軽鎖の可変ドメインとを含む抗体を得た。
ある実施形態において、本発明の抗体は、配列番号５１、配列番号５、もしくは配列番号７４の配列、もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖；および／または配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号５５もしくは配列番号７５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖を含むか、またはそれからなるヒト化抗体である（ＭＡｂ２の重鎖および軽鎖のヒト化可変ドメイン）。
ある実施形態において、本発明の抗体は、配列番号５１の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖および配列番号１７の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖、または配列番号５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖および配列番号２３の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖、または配列番号５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖および配列番号２９の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖、または配列番号５１の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖および配列番号５５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖、または配列番号７４の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖および配列番号７５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖を含むヒト化抗体である。
前記ヒト化抗体またはその断片において、重鎖および軽鎖の可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域を含んでもよい。ヒト化抗体は、存在する場合、ヒト定常重鎖および軽鎖ドメインをさらに含む。
ある実施形態において、本発明の抗体は、抗体ｈｕＭＡｂ２−３またはそのバリアント、すなわち、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のＡ３−Ｂ３ドメインに結合し、
ａ）配列番号８７の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列からなる重鎖；または
ｂ）配列番号８８の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列からなる軽鎖または重鎖および軽鎖
を含む、単離された抗体である。
ある実施形態において、本発明の抗体は、抗体ｈｕＭＡｂ２−４（ＭＡｂ２＿ＶＬ１ｄＶＨ１−ＩｇＧ１）またはそのバリアント、すなわち、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のＡ３−Ｂ３ドメインに結合し、
ｃ）配列番号８９の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列からなる重鎖；および／または
ｄ）配列番号９０の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列からなる軽鎖を含む、単離された抗体である。
本発明による抗体はまた、単一ドメイン抗体またはその断片であってもよい。本発明のある実施形態において、単一ドメイン抗体断片は、上記の抗体のＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−ＨおよびＣＤＲ３−Ｈを含む可変重鎖（ＶＨＨ）からなっていてもよい。抗体はまた、重鎖抗体、すなわち、軽鎖を含まない抗体であってもよく、ＣＨ１ドメインを含有しても、または含有しなくてもよい。
単一ドメイン抗体またはその断片はまた、ラクダ科動物単一ドメイン抗体のフレームワーク領域、および場合により、ラクダ科動物単一ドメイン抗体の定常ドメインを含んでもよい。
本発明による抗体はまた、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、およびダイアボディからなる群から選択される、抗体断片、例えば、ヒト化抗体断片であってもよい。
抗体はまた、抗体断片から形成される二重特異的または多重特異的抗体であってもよく、少なくとも１つの抗体断片は、本発明による抗体断片である。多重特異的抗体は、例えば、ＥＰ２０５０７６４Ａ１またはＵＳ２００５／０００３４０３Ａ１に記載の多価タンパク質複合体である。
本発明による二重特異的または多重特異的抗体は、（ａ）いわゆるＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４およびＭＡｂ５抗体の１つにより標的化されるヒト／カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５上のＡ３−Ｂ３エピトープならびに（ｂ）少なくとも１つの他の抗原に対する特異性を有してもよい。ある実施形態によれば、少なくとも１つの他の抗原は、ヒトまたはカニクイザルＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーではなく、ある実施形態において、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ１、ヒトおよびサルＣＥＡＣＡＭ６、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ７、ならびにヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ８の少なくとも１つまたは全部ではない。別の実施形態によれば、少なくとも１つの他の抗原は、いわゆるＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４およびＭＡｂ５抗体の１つにより標的化される前記Ａ３−Ｂ３エピトープ以外のヒトカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５上のエピトープであってもよい。
前記抗体を、当業界で周知の任意の技術により生成することができる。ある実施形態において、前記抗体を、以後に記載の技術により生成する。本発明による抗体およびその断片を、単離された（例えば、精製された）形態で用いるか、または膜もしくは脂質ベシクル（例えば、リポソーム）のようなベクター中に含有させることができる。
核酸、ベクターおよび組換え宿主細胞
本発明のさらなる目的は、上記で定義された本発明の抗体をコードする配列を含むか、またはそれからなる核酸配列に関する。
典型的には、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターのような任意の好適なベクター中に含むことができるＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞中に導入して、宿主を形質転換し、導入される配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することができるビヒクルを意味する。
従って、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
そのようなベクターは、対象への投与の際に前記ポリペプチドの発現を引き起こすか、または指令するプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの調節エレメントを含んでもよい。動物細胞のための発現ベクターにおいて用いられるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ．ら、１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ Ｙら、１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｍａｓｏｎ ＪＯら、１９８５）およびエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤら、１９８３）などが挙げられる。
ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入し、発現させることができる限り、動物細胞のための任意の発現ベクターを用いることができる。好適なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ Ｈら、１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔら、１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ Ｇら、１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋら、１９８１）、ｐＳＧ１ベータｄ２−４−（Ｍｉｙａｊｉ Ｈら、１９９０）などが挙げられる。
プラスミドの他の例としては、複製起点を含む複製プラスミド、または例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組込みプラスミドが挙げられる。
ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶベクターが挙げられる。そのような組換えウイルスを、パッケージング細胞にヘルパープラスミドまたはウイルスをトランスフェクトするか、または一過的にトランスフェクトすることのような、当業界で公知の技術により生成することができる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。そのような複製欠損組換えウイルスを生成するための詳細なプロトコールを、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６およびＷＯ９４／１９４７８に見出すことができる。
本発明のさらなる目的は、本発明による核酸および／またはベクターによりトランスフェクト、感染または形質転換された細胞に関する。
用語「形質転換」は、宿主細胞が、導入された遺伝子または配列を発現して、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子または配列によりコードされるタンパク質または酵素を生成するような、宿主細胞への「外来」（すなわち、外因性）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の導入を意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容し、発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。
本発明の核酸を用いて、好適な発現系中で本発明の組換え抗体を生成させることができる。用語「発現系」は、例えば、ベクターにより担持され、宿主細胞に導入される外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のための好適な条件下での宿主細胞および適合可能なベクターを意味する。
一般的な発現系としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、限定されるものではないが、原核細胞（細菌のような）および真核細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などのような）が挙げられる。具体例としては、大腸菌、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母、哺乳動物細胞系（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）ならびに初代または確立された哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから生成される）が挙げられる。また、例として、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子（本明細書では以後「ＤＨＦＲ遺伝子」と呼ぶ）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ Ｇら、１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、本明細書では以後「ＹＢ２／０細胞」と呼ぶ）なども挙げられる。ある実施形態において、キメラまたはヒト化抗体のＡＤＣＣ活性がＹＢ２／０細胞中で発現された場合に増強されるため、この細胞が用いられる。
ヒト化抗体の発現のために、発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子と抗体軽鎖をコードする遺伝子とが別々のベクター上に存在する型または両方の遺伝子が同じベクター上に存在する型（タンデム型）のいずれかであってもよい。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易性、動物細胞への導入の容易性、および動物細胞中での抗体ＨおよびＬ鎖の発現レベル間の平衡の点では、ヒト化抗体発現ベクターは、タンデム型のものである（Ｓｈｉｔａｒａ Ｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９４ Ｊａｎ．３；１６７（１−２）：２７１〜８頁）。タンデム型ヒト化抗体発現ベクターの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８などが挙げられる。
本発明はまた、本発明による抗体を発現する組換え宿主細胞を生成する方法であって、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、上記の組換え核酸またはベクターをコンピテント宿主細胞中に導入すること、（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、得られた組換え宿主細胞を培養することならびに（ｉｉｉ）場合により、前記抗体を発現および／または分泌する細胞を選択することからなる工程を含む方法に関する。
そのような組換え宿主細胞を、本発明の抗体の生成のために用いることができる。
本発明の抗体を生成する方法
本発明の抗体を、限定されるものではないが、単独の、または組み合わせた、任意の化学的、生物学的、遺伝学的または酵素的技術のような当業界で公知の任意の技術により生成することができる。
所望の配列のアミノ酸配列を知れば、当業者であれば、ポリペプチドの生成のための標準的な技術により、前記抗体または免疫グロブリン鎖を容易に生成することができる。例えば、それらを、製造業者の説明書に従って市販のペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにより製造されたものなど）を使用する周知の固相方法を用いて合成することができる。あるいは、本発明の抗体および免疫グロブリン鎖を、当業界で周知の組換えＤＮＡ技術により合成することができる。例えば、これらの断片を、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現ベクター中への組込みおよび所望のポリペプチドを発現する好適な真核または原核宿主中へのそのようなベクターの導入後にＤＮＡ発現生成物として取得した後、周知の技術を用いてそれらを単離することができる。
本発明はさらに、（ｉ）本発明による形質転換された宿主細胞を培養すること；（ｉｉ）本発明の抗体またはポリペプチドを発現させること；および（ｉｉｉ）発現された抗体またはポリペプチドを回収することからなる工程を含む、前記抗体を生成する方法に関する。
本発明の抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地から好適に分離される。
ある実施形態において、本発明のヒト化キメラ抗体を、以前に記載されたヒト化ＶＬおよびＶＨドメインをコードする核酸配列を取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクター中にそれらを挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞中に発現ベクターを導入することによりコード配列を発現させることによって生成することができる。
ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとして、それはヒト免疫グロブリン重鎖に属する任意の領域であってもよいが、ＩｇＧクラスのものが好適であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のようなＩｇＧクラスに属するサブクラスのいずれか１つを用いることもできる。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとして、それはヒト免疫グロブリン軽鎖に属する任意の領域であってもよく、カッパクラスまたはラムダクラスのものを用いることができる。
従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術を含むヒト化またはキメラ抗体を生成するための方法は、当業界で周知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ．ら（１９８４）ならびに特許文献ＵＳ５，２０２，２３８；およびＵＳ５，２０４，２４４を参照されたい）。
従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技術に基づくヒト化抗体を生成するための方法は、当業界で周知である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ら、１９８８；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ＭＳ．ら、１９８５を参照されたい）。例えば、特許出願ＷＯ２００９／０３２６６１に開示された技術、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ ＥＡ（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ＧＭら（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ ＭＡ．ら（１９９４））、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）などの、当業界で公知の様々な技術を用いて、抗体をヒト化することができる。そのような抗体の製造のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願ＥＰ１２５０２３および国際特許出願ＷＯ９６／０２５７６を参照されたい）。
本発明のＦａｂを、ＣＥＡＣＡＭ５と特異的に反応する抗体を、パパインのようなプロテアーゼで処理することにより取得することができる。また、Ｆａｂを、抗体のＦａｂの両方の鎖をコードするＤＮＡ配列を、原核発現のための、または真核発現のためのベクター中に挿入し、このベクターを原核または真核細胞（必要に応じて）中に導入して、Ｆａｂを発現させることにより生成することができる。
本発明のＦ（ａｂ’）２を、ＣＥＡＣＡＭ５と特異的に反応する抗体を、プロテアーゼであるペプシンで処理することにより取得することができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を、チオエーテル結合またはジスルフィド結合により、以下に記載のＦａｂ’を結合することにより生成することができる。
本発明のＦａｂ’を、ＣＥＡＣＡＭ５と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２をジチオトレイトールのような還元剤で処理することにより取得することができる。また、Ｆａｂ’を、抗体のＦａｂ’鎖をコードするＤＮＡ配列を、原核発現のためのベクター、または真核発現のためのベクター中に挿入し、このベクターを原核または真核細胞（必要に応じて）中に導入して、その発現を行うことにより生成することができる。
本発明のｓｃＦｖを、以前に記載のようにＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬドメインの配列を取得し、ｓｃＦｖ断片をコードするＤＮＡを構築し、そのＤＮＡを原核または真核発現ベクター中に挿入した後、発現ベクターを原核または真核細胞（必要に応じて）中に導入して、ｓｃＦｖを発現させることにより生成することができる。ヒト化ｓｃＦｖ断片を作成するために、本発明による相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択し、それらを既知の三次元構造のヒトｓｃＦｖ断片フレームワーク上に移植することを含む、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知の技術を用いることができる（例えば、Ｗ０９８／４５３２２；ＷＯ８７／０２６７１；ＵＳ５，８５９，２０５；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ４，８１６，５６７；ＥＰ０１７３４９４を参照されたい）。
本発明の抗体の改変
本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ中に非ヒト動物から誘導される抗体のＶＨおよびＶＬ中のＣＤＲのみを単に移植することによりヒト化抗体を生成する場合、抗原結合活性を、非ヒト動物から誘導される元の抗体のものと比較して低下させることができることが知られている。ＣＤＲ中だけでなくＦＲ中の、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのいくつかのアミノ酸残基を、抗原結合活性と直接または間接に関連付けることができると考えられる。従って、これらのアミノ酸残基の、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲから誘導される異なるアミノ酸残基との置換は、結合活性を低下させる。この問題を解決するために、非ヒトＣＤＲを移植されたヒト抗体において、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列間で、抗体の結合と直接関連するか、またはＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するか、または抗体の三次元構造を維持し、抗原への結合と直接関連するアミノ酸残基を同定するための試みが行われなければならない。同定されたアミノ酸を、非ヒト動物から誘導される元の抗体のアミノ酸残基と置き換えることにより、低下した抗原結合活性を増加させることができる。
本発明の一実施形態において、本発明のマウス抗体の６つのＣＤＲおよびそのフレームワークに由来する３つのアミノ酸をヒトフレームワーク上に移植し、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５に対する結合特性を維持する、配列番号７４の配列の重鎖および配列番号７５の配列の軽鎖を有するヒト化抗体（ＭＡｂ２＿ＶＬｇ５ＶＨｇ２）を得た。
本発明の抗体の構造、およびそれらをコードするＤＮＡ配列中で改変および変化を作製し、依然として望ましい特徴を有する機能的抗体またはポリペプチドを得ることができる。
ポリペプチドのアミノ酸配列中に変化を作製する際に、アミノ酸のハイドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することができる。タンパク質に対して相互作用的生物機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当業界で一般的に理解される。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、次いで、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが受け入れられている。それぞれのアミノ酸に、その疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指標を割当てた。これらのものは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
本発明のさらなる目的は、本発明のポリペプチドの機能保存的バリアントも包含する。
例えば、ある特定のアミノ酸を、活性を感知できるほどに失わせることなくタンパク質構造中で他のアミノ酸により置換することができる。タンパク質の相互作用能力および性質はその生物機能的活性を規定するため、ある特定のアミノ酸置換をタンパク質配列、勿論、そのＤＮＡコード配列中で行うことができるが、それにも拘わらず、同様の特性を有するタンパク質を取得することができる。かくして、本発明の抗体配列、または前記ポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列中で、その生物活性を感知できるほどに失わせることなく様々な変化を作製することができることが企図される。
ある特定のアミノ酸を、類似するハイドロパシー指標またはスコアを有し、依然として類似する生物活性を有するタンパク質をもたらす、すなわち、依然として生物機能的に等価なタンパク質を取得する他のアミノ酸により置換することができることは当業界で公知である。また、本発明の抗体またはポリペプチド中の、抗原への結合を有意に失わせることなく置換することができる全てのアミノ酸を同定するために、アラニンスキャニング手法のようなよく確立された技術を使用することもできる。そのような残基は抗原結合または抗体の構造の維持に関与しないため、それを中性として定性化することができる。これらの中性位置の１つまたはそれ以上を、本発明の抗体またはポリペプチドの主特性を変化させることなく、アラニンまたは別のアミノ酸により置換することができる。
これを、ＭＡｂ２Ｋ５２ＲのＣＤＲに対して行われるアラニンスキャニング手法によって本発明において実証したところ、アラニンはヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５への結合に対する有意な効果なしに実際に置換することができるため、これらのＣＤＲのいくつかの位置が中性として出現することが示された。そのような中性置換の結果得られる抗体バリアントは従って、依然として親抗体と機能的に同一であると予想される。提供される実施例６．４において、ＭＡｂ２のヒト化バリアント中で置換を行ったが、これらの関連抗体は全て同じセットの６つのＣＤＲまたは非常に密接に関連するものを担持するため、同じ変化はＭＡｂ２、Ｍａｂ４またはＭａｂ５の任意のバリアント中に導入された場合、生物機能も維持することが予測される。中性位置は、この抗体ファミリーのＶＬ配列（配列番号３４または配列番号３８または配列番号４０または配列番号１７または配列番号２３または配列番号２９または配列番号５５または配列番号７５）中の残基２７、２８、２９、３１、５１、５２、８９、９０、９３、９４、９６、９７およびこの抗体ファミリーのＶＨ配列（配列番号３３または配列番号３７または配列番号３９または配列番号５または配列番号５１または配列番号７４）中の残基２６〜３１、５１〜５８、９７、１０３、１０４、１０７、１０９と定義することができる。
中性位置を、任意のアミノ酸置換をＭａｂ２、Ｍａｂ４またはＭａｂ５のＣＤＲに組込むことができる位置として見ることができる。実際、アラニンスキャニングの原理においては、アラニンは特異的構造または化学的特徴を担持しないため、この残基が選択される。アラニンを、タンパク質の特性を変化させることなく特定のアミノ酸に置換することができる場合、他に多くは、全てのアミノ酸置換が中性でもある可能性がない場合、それは一般に許容される。アラニンが野生型アミノ酸である反対の事例では、特異的置換を中性と示すことができる場合、他の置換も中性である可能性が高い。
提供される実施例６．４において、アラニンスキャニングの文脈で中性であることがわからなかったが、保存的な型のアミノ酸置換が中性効果を有する場合（この抗体ファミリーのＶＬ配列中の残基３０および９２ならびにＶＨ配列の残基９８および１００）、Ｍａｂ２、Ｍａｂ４またはＭａｂ５のＣＤＲ中の４つの位置も同定される。
また、組み合わせた場合、２つの抗体鎖配列のいずれか、または両方における異なる位置の２つまたはそれ以上の中性変異は、通常、親抗体の機能的活性を本質的に保持する抗体をもたらすと予想される。これは、例えば、ＭＡｂ２＿ＶＬｇ５ＶＨｇ２中の置換の組合せＬＣ＿Ｔ５１ＡとＬＣ＿Ｔ９４Ａ、ＶＬ＿Ｓ３１ＡとＶＨ＿Ｇ５４Ｙ、またはＶＬ＿Ｔ５３ＩとＶＨ＿Ｓ５３Ａを用いて実証された。
上記に概略したように、従って、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前記特徴のいずれかを考慮に入れる例示的置換は当業者には周知であり、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
また、例えば、抗体の抗原依存的細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することも望ましい場合がある。これを、抗体のＦｃ領域中に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成することができる。あるいは、またはさらに、システイン残基をＦｃ領域中に導入することによって、この領域中での鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。かくして作成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力および／または増加した補体媒介性細胞殺傷および／または抗体依存的細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有してもよい（Ｃａｒｏｎ ＰＣ．ら、１９９２；およびＳｈｏｐｅｓ Ｂ．１９９２）。
本発明の抗体の別の型のアミノ酸改変は、すなわち、抗体中に見出される１つもしくはそれ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／または抗体中に存在しない１つもしくはそれ以上のグリコシル化部位を付加することにより、抗体の元のグリコシル化パターンを変化させるのに有用であり得る。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン、およびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作出する。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、アミノ酸配列が１つまたはそれ以上の上記トリペプチド配列を含有するようにアミノ酸配列を変化させる（Ｎ結合グリコシル化部位について）ことによって都合良く達成される。
別の型の改変は、分解生成物または抗体製造物の不均質性を潜在的にもたらすとしてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、または実験的に同定される配列の除去を含む。例として、アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面露出のような因子に依存して起こり得る。アスパラギン残基は、主に配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ中に存在する場合、脱アミド化を特に受けやすく、Ａｓｎ−Ａｌａのような他のジペプチド配列中でのその程度はより低い。そのような脱アミド化部位、特に、Ａｓｎ−Ｇｌｙが本発明の抗体またはポリペプチド中に存在する場合、従って典型的には、関与した残基の１つを除去するための保存的置換により、その部位を除去することが望ましい場合がある。関与した残基の１つまたはそれ以上を除去するための配列中でのそのような置換もまた、本発明により包含されることが意図される。
別の型の共有改変は、抗体に化学的または酵素的にカップリングするグリコシドを含む。これらの手順は、それらがＮまたはＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞中での抗体の生成を必要としない点で有利である。用いられるカップリング様式に依存して、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのもののような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのもののような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのもののような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。例えば、そのような方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。
抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去を、化学的または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸化合物、または等価な化合物への抗体の曝露を必要とする。この処理は、抗体を無傷のままにしながら、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の多くの、または全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、Ｓｏｊａｈｒ Ｈ．ら（１９８７）およびＥｄｇｅ、ＡＳ．ら（１９８１）により記載されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断を、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ、Ｎ．Ｒ．ら（１９８７）により記載されたように様々なエンド−およびエキソ−グルコシダーゼの使用により達成することができる。
抗体の別の型の共有改変は、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号に記載の様式での、様々な非タンパク質性ポリマーの１つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンへの抗体の連結を含む。
イムノコンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害性コンジュゲート、またはイムノコンジュゲート、または抗体−薬物コンジュゲート、またはコンジュゲートも含む。本明細書で用いられる場合、これらの用語は全て、同じ意味を有し、互換的である。
マウス抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４、およびＭＡｂ５を、ＳＰＤＢリンカー（Ｎ−スクシンイミジルピリジルジチオブチレート）を介してメイタンシノイド（ＤＭ４）にコンジュゲートさせた。得られた抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、１ｎＭ以下のＩＣ５０値で、ＭＫＮ４５ヒト胃がん細胞に対する細胞傷害活性を有することがわかった。
同様に、抗体−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートを、ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ４、およびＭＡｂ５のそれぞれのキメラ形態に基づいて製造した。得られたｃｈＭＡｂ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｃｈＭＡｂ３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、およびｃｈＭＡｂ４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を、雌のＳＣＩＤマウスにｓ．ｃ．移植された測定可能な原発性結腸ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ腫瘍に対して２つの用量で評価した。処置された腫瘍と対照のそれぞれに関する腫瘍体積の変化および腫瘍退縮率（％）の分析により、ｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｃｈＭＡｂ４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、およびｃｈＭＡｂ５−ＳＰＤＢ−ＤＭ４が、少なくともアッセイした最も高い用量で高活性であり、ｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４が両方のアッセイした用量で活性であることが示された。特に、最大８２％の腫瘍退縮率が得られた。
また、抗体−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートを、ＭＡｂ２（ｈｕＭＡｂ２−１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｈｕＭＡｂ２−２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、およびｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）のヒト化バリアントを用いて製造した。ＭＡｂ２のキメラ（ｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）またはヒト化バリアントを含むＡＤＣを、ＭＫＮ４５細胞に対する細胞傷害活性について無関係の抗体−ＳＰＤＢ−ＤＭ４と比較した。ＭＡｂ２ ＡＤＣの全てのキメラおよびヒト化バリアントは、１ｎＭ以下のＩＣ５０値、すなわち、無関係のＤＭ４コンジュゲートの測定された細胞傷害活性よりも５３〜３５倍低いＩＣ５０値を示し、それによって、抗ＣＥＡＣＡＭ５コンジュゲートのＣＥＡＣＡＭ５媒介性細胞傷害活性を示した。
ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびｈｕＭＡｂ２−４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の抗腫瘍活性を評価し、雌のＣＤ−１ヌードマウス中にｓ．ｃ．移植された測定可能な原発性結腸ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ腫瘍に対してｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４と比較した。全てのコンジュゲートがアッセイした最も高い用量（１０ｍｇ／ｋｇ）で高活性であった。
ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびｈｕＭＡｂ２−３−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の抗腫瘍活性を、雌のＳＣＩＤマウス中にｓ．ｃ．移植された測定可能な原発性結腸ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ腫瘍に対してさらに評価した。ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、５および２．５ｍｇ／ｋｇで活性であり、ｈｕＭＡｂ２−３−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は５ｍｇ／ｋｇで高活性であり、２．５ｍｇ／ｋｇで活性であった。
ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の抗腫瘍活性を、雌のＳＣＩＤマウス中にｓ．ｃ．移植された測定可能な原発性肺ＬＵＮ−ＮＩＣ−００１４腫瘍に対してさらに評価したところ、１０および５ｍｇ／ｋｇで高活性であることがわかった。
それぞれのＤＭ４コンジュゲートは、２〜５の範囲の平均数のＤＭ４分子（または「薬物抗体比」もしくは「ＤＡＲ」）を含んでいた。
従って、本発明は、細胞傷害剤または放射性同位体のような、少なくとも１つの増殖阻害剤に連結またはコンジュゲートされた本発明の抗体を含む「イムノコンジュゲート」に関する。
区別無く用いることができる「増殖阻害剤」または「抗増殖剤」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、細胞、特に、腫瘍細胞の増殖を阻害する化合物または組成物を指す。
本明細書で用いられる用語「細胞傷害剤」とは、細胞の機能を阻害もしくは防止する、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。用語「細胞傷害剤」は、化学療法剤、酵素、抗生物質、および低分子毒素または細菌、菌類、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素のような毒素、例えば、その断片および／またはバリアント、ならびに以下に開示される様々な抗腫瘍剤もしくは抗がん剤を含むことが意図される。いくつかの実施形態において、細胞傷害剤は、タキソイド、ビンカ、ＤＭ１またはＤＭ４のようなメイタンシノイドまたはメイタンシノイド類似体、低分子薬物、トメイマイシンまたはピロロベンゾジアゼピン誘導体、クリプトフィシン誘導体、レプトマイシン誘導体、オーリスタチンまたはドラスタチン類似体、プロドラッグ、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、抗チューブリン剤、ＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５類似体である。
本明細書で用いられる場合、「メイタンシノイド」は、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体を示す。メイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、哺乳動物細胞に対する毒性が高い薬物である。
好適なメイタンシノイドの例としては、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が挙げられる。
好適なメイタンシノール類似体の例としては、改変芳香環を有するもの、および他の位置に改変を有するものが挙げられる。そのような好適なメイタンシノイドは、米国特許第４，４２４，２１９号；第４，２５６，７４６号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６２，６６３号；第４，３６４，８６６号；第４，４５０，２５４号；第４，３２２，３４８号；第４，３７１，５３３号；第６，３３３，４１０号；第５，４７５，０９２号；第５，５８５，４９９号；および第５，８４６，５４５号に開示されている。
改変芳香環を有するメイタンシノールの好適な類似体の具体例としては、
（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサミトシンＰ２のＬＡＨ還元により製造される）；
（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および第４，３０７，０１６号）（ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）もしくはアクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を用いる脱メチル化またはＬＡＨを用いる脱塩素化により製造される）；ならびに
（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（アシルクロリドを用いるアシル化により製造される）
が挙げられる。
他の位置の改変を有するメイタンシノールの好適な類似体の具体例としては、
（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応により製造される）；
（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；
（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から製造される）；
（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトミセスによるメイタンシノールの変換により製造される）；
（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および第４，３１５，９２９号）（トレウィア・ヌディフローラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離される）；
（６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および第４，３２２，３４８号）（ストレプトミセスによるメイタンシノールの脱メチル化により製造される）；ならびに
（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により製造される）
が挙げられる。
本発明のある実施形態において、本発明の細胞傷害性コンジュゲートは、細胞傷害剤として、以前はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンと呼ばれた、チオール含有メイタンシノイド（ＤＭ１）を用いる。ＤＭ１は、以下の構造式（Ｉ）：
により表される。
別の実施形態において、本発明の細胞傷害性コンジュゲートは、細胞傷害剤として、以前はＮ２’−デアセチル−Ｎ−２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシンと呼ばれた、チオール含有メイタンシノイドＤＭ４を用いる。ＤＭ４は、以下の構造式（ＩＩ）：
により表される。
本発明のさらなる実施形態において、硫黄原子を担持する炭素原子上にモノまたはジ−アルキル置換を担持するチオールおよびジスルフィド含有メイタンシノイドなどの他のメイタンシンを用いることができる。これらのものは、チオール官能基を担持するアシル基の炭素原子が、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、溶液中に存在してもよい１〜１０の試薬および任意の凝集体を有する線状もしくは分枝状アルキルもしくはアルケニルである、１つまたは２つの置換基を有する、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチルに、妨害されたスルフヒドリル基を担持するアシル基を含むアシル化されたアミノ酸側鎖を有するメイタンシノイドを含む。
これらの細胞傷害剤およびコンジュゲーション方法の例は、参照によって組み入れられる特許出願ＷＯ２００８／０１０１０１にさらに与えられる。
用語「放射性同位体」は、Ａｔ２１１、Ｂｉ２１２、Ｅｒ１６９、Ｉ１３１、Ｉ１２５
、Ｙ９０、Ｉｎ１１１、Ｐ３２、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｓｒ８９、およびＬｕの放射性同位体のような、がんを処置するのに好適な放射性同位体を含むことが意図される。そのような放射性同位体は一般に、主としてベータ線を放出する。ある実施形態において、放射性同位体は、アルファ放射体同位体、より正確には、アルファ線を放出するトリウム２２７である。本発明によるイムノコンジュゲートを、特許出願ＷＯ２００４／０９１６６８に記載のように製造することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体を、少なくとも１つの増殖阻害剤に、直接的に、または切断性もしくは非切断性リンカーを介して共有的に結合させる。
本明細書で用いられる場合、「リンカー」は、共有結合を含む化学部分またはポリペプチドを薬物部分に共有的に結合させる原子の鎖を意味する。
コンジュゲートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法により製造することができる。薬物またはプロドラッグを抗体に連結するために、連結基が用いられる。好適な連結基は当業界で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基が挙げられる。本発明の抗体と、細胞傷害剤または増殖阻害剤とのコンジュゲーションを、限定されるものではないが、Ｎ−スクシンイミジルピリジルジチオブチレート（ＳＰＤＢ）、ブタン酸４−［（５−ニトロ−２−ピリジニル）ジチオ］−２，５−ジオキソ−１−ピロリジニルエステル（ニトロ−ＳＰＤＢ）、４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）−２−スルホ−酪酸（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）−ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンを、Ｖｉｔｅｔｔａら（１９８７）に記載のように製造することができる。炭素標識された１−イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート化剤である（ＷＯ９４／１１０２６）。
リンカーは、細胞中での細胞傷害剤または増殖阻害剤の放出を容易にする「切断性リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、エステラーゼ不安定リンカー、光不安定リンカーまたはジスルフィド含有リンカー（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい）を用いることができる。リンカーはまた、いくつかの場合、より良好な許容性をもたらし得る「非切断性リンカー」（例えば、ＳＭＣＣリンカー）であってもよい。
あるいは、本発明の抗体と、細胞傷害または増殖阻害ポリペプチドとを含む融合タンパク質を、組換え技術またはペプチド合成により作製することができる。ＤＮＡの長さは、互いに隣接するか、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により隔てられたコンジュゲートの２つのポーションをコードするそれぞれの領域を含んでもよい。
本発明の抗体はまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照されたい）を、活性な抗がん剤（例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい）に変換するプロドラッグ活性化酵素にポリペプチドをコンジュゲートさせることによる依存的酵素媒介性プロドラッグ療法において用いることもできる。ＡＤＥＰＴにとって有用なイムノコンジュゲートの酵素成分は、それをそのより活性な細胞傷害形態に変換するような方法でプロドラッグに対して作用することができる任意の酵素を含む。本発明の方法において有用である酵素としては、限定されるものではないが、リン酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性フルオロシトシンを抗がん剤５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用である、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（カテプシンＢおよびＬなど）のようなプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なＯ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼのような炭水化物切断酵素；Ｐ−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なＰ−ラクタマーゼ；ならびにそのアミン窒素において誘導体化された薬物を、それぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で遊離薬物に変換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼのようなペニシリンアミダーゼが挙げられる。上記で考察されたヘテロ二官能性架橋試薬の使用のような当業界で周知の技術により、酵素を本発明のポリペプチドに共有結合させることができる。
ある実施形態によれば、本発明のコンジュゲートにおいて、増殖阻害剤はメイタンシノイドであり、ある実施形態において、ＤＭ１またはＤＭ４である。
前記コンジュゲートにおいて、抗体は連結基によって前記少なくとも１つの増殖阻害剤にコンジュゲートされる。ある実施形態において、前記連結基は、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢ、またはＳＭＣＣのような切断性または非切断性リンカーである。
コンジュゲートを、
ｉ）式（ＩＩＩ）
の抗体−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート
ｉｉ）式（ＩＶ）
の抗体−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート
および
ｉｉｉ）式（Ｖ）
の抗体−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート
からなる群から選択することができる。
前記実施形態において、コンジュゲート中に含まれる抗体は、
ｉ）配列番号５１の配列の重鎖および配列番号１７の配列の軽鎖を含むヒト化抗体、
ｉｉ）配列番号５の配列および重鎖と配列番号２３の配列の軽鎖を含むヒト化抗体、
ｉｉｉ）配列番号５の配列および重鎖と配列番号２９の配列の軽鎖を含むヒト化抗体、および
ｉｖ）配列番号５１の配列および重鎖と配列番号５５の配列の軽鎖を含むヒト化抗体
からなる群から選択される。
ある実施形態において、コンジュゲートは、抗体が配列番号５の配列の重鎖および配列番号２９の配列の軽鎖を含むヒト化抗体である、上記で定義された式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）または（Ｖ）のコンジュゲートである。
一般に、コンジュゲートを、
（ｉ）細胞結合剤（例えば、本発明による抗体）の場合により緩衝化された水性溶液を、リンカーおよび細胞傷害化合物の溶液と接触させる工程；
（ｉｉ）次いで、場合により、未反応の細胞結合剤から（ｉ）で形成されたコンジュゲートを分離する工程
を含む方法により取得することができる。
細胞結合剤の水性溶液を、例えば、リン酸カリウム、酢酸、クエン酸またはＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ緩衝液）のような緩衝液で緩衝化することができる。緩衝液は、細胞結合剤の性質に依存する。細胞傷害化合物は、有機極性溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中の溶液中にある。
反応温度は通常、２０〜４０℃を含む。反応時間は１〜２４時間で変化してもよい。細胞結合剤と細胞傷害剤との反応を、屈折率検出器および／またはＵＶ検出器を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりモニタリングすることができる。コンジュゲートの収量が低すぎる場合、反応時間を延長することができる。
当業者であれば、いくつかの異なるクロマトグラフィー法を用いて、工程（ｉｉ）の分離を実行することができる：コンジュゲートを、例えば、ＳＥＣ、吸着クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、ＩＥＣなど）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのような混合支持体クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製することができる。透析または透析濾過により精製を用いることもできる。
本明細書で用いられる用語「凝集体」とは、コンジュゲーションにより改変されたか、または改変されていない２つまたはそれ以上の細胞結合剤の間で形成させることができる会合を意味する。凝集体を、溶液中の高濃度の細胞結合剤、溶液のｐＨ、高い剪断力、結合した二量体の数およびその疎水性、温度のような多数のパラメーターの影響下で形成させることができる（Ｗａｎｇ ＆ Ｇｏｓｈ、２００８、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉ．、３１８：３１１〜３１６頁、およびそこに引用される参考文献を参照されたい）；これらのパラメーターのいくつかの相対的影響は明確に確立されていないことに留意されたい。タンパク質および抗体の場合、当業者であれば、Ｃｒｏｍｗｅｌｌら（２００６、ＡＡＰＳ Ｊｏｕｎａｌ、８（３）：Ｅ５７２〜Ｅ５７９頁）を参照するであろう。凝集体中の内容物を、ＳＥＣのような、当業者には周知の技術を用いて決定することができる（Ｗａｌｔｅｒら、１９９３、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１２（２）：４６９〜４８０頁を参照されたい）。
工程（ｉ）または（ｉｉ）の後、コンジュゲート含有溶液を、クロマトグラフィー、限外濾過および／または透析濾過のさらなる工程（ｉｉｉ）にかけることができる。
コンジュゲートは、水性溶液中でのこれらの工程の終わりに回収される。
ある実施形態によれば、本発明によるコンジュゲートは、１〜１０、例えば、２〜５、特に、３〜４の範囲の「薬物抗体比」（または「ＤＡＲ」）を特徴とする。これは一般に、メイタンシノイド分子を含むコンジュゲートの場合である。
このＤＡＲ数は、コンジュゲーションのために用いられる実験条件（増殖阻害剤／抗体の比、反応時間、溶媒および存在する場合、共溶媒の性質など）と共に、用いられる抗体および薬物（すなわち、増殖阻害剤）の性質に応じて変化してもよい。かくして、抗体と増殖阻害剤との接触は、異なる薬物抗体比；場合により裸の抗体；場合により凝集体により互いに異なるいくつかのコンジュゲートを含む混合物をもたらす。かくして、決定されるＤＡＲは平均値である。
ＤＡＲを決定するために用いることができる方法は、λＤおよび２８０ｎｍでの実質的に精製されたコンジュゲートの溶液の吸光度の比を分光光度測定することにある。２８０ｎｍは、抗体濃度のような、タンパク質濃度を測定するために一般的に用いられる波長である。波長λＤは、薬物を抗体から識別することができるように選択される、すなわち、当業者には容易にわかるように、λＤは、薬物が高い吸光度を有する波長であり、λＤは薬物と抗体の吸光度のピークにおける実質的な重複を回避するために２８０ｎｍから十分に離れている。メイタンシノイド分子の場合、λＤを、２５２ｎｍであると選択することができる。ＤＡＲ算出の方法を、Ａｎｔｏｎｙ Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ（編）、ＬＬＣ、２００９、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ｖｏｌ ５２５、４４５頁、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅから誘導することができる。
λＤ（ＡλＤ）および２８０ｎｍ（Ａ２８０）でのコンジュゲートの吸光度は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析の単量体ピーク（「ＤＡＲ（ＳＥＣ）」パラメーターを算出することができる）上で、または古典的な分光光度計装置（「ＤＡＲ（ＵＶ）」パラメーターを算出することができる）を用いて測定される。吸光度を以下のように表すことができる：
ＡλＤ＝（ＣＤ×εＤλＤ）＋（ＣＡ×εＡλＤ）
Ａ２８０＝（ＣＤ×εＤ２８０）＋（ＣＡ×εＡ２８０）
（式中、
・ＣＤおよびＣＡはそれぞれ、薬物および抗体の溶液中での濃度であり、
・εＤλＤおよびεＤ２８０はそれぞれ、λＤおよび２８０ｎｍでの薬物のモル吸光係数であり、
・εＡλＤおよびεＡ２８０はそれぞれ、λＤおよび２８０ｎｍでの抗体のモル吸光係数である）。
２つの未知数を用いてこれらの２つの式を分解すると、以下の式が得られる：
ＣＤ＝［（εＡ２８０×ＡλＤ）−（εＡλＤ×Ａ２８０）］／［（εＤλＤ×εＡ２８０）−（εＡλＤ×εＤ２８０）］
ＣＡ＝［Ａ２８０−（ＣＤ×εＤ２８０）］／εＡ２８０
次いで、平均ＤＡＲを、抗体：ＤＡＲの比＝ＣＤ／ＣＡに対する薬物濃度の比から算出する。
医薬組成物
本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを、薬学的に許容される賦形剤、および場合により、生分解性ポリマーのような持続放出マトリックスと組み合わせて、治療組成物を形成させることができる。
かくして、本発明の別の目的は、本発明の抗体またはイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、薬剤としての使用のための、本発明によるポリペプチドまたはイムノコンジュゲートに関する。
「薬学的に」または「薬学的に許容される」とは、必要に応じて、哺乳動物、特に、ヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー反応または他の望ましくない反応を生成しない分子的実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤とは、任意の型の非毒性固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、封入材料または製剤補助剤を指す。
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合する任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤などを含む。好適な担体、希釈剤および／または賦形剤の例としては、水、アミノ酸、塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸緩衝液；ヒスチジン、アルギニン、グリシン、プロリン、グリシルグリシンのようなアミノ酸および誘導体；無機塩ＮａＣｌ、塩化カルシウム；デキストロース、グリセリン、エタノール、スクロース、トレハロース、マンニトールのような糖またはポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー１８８のような界面活性剤などの１つまたはそれ以上、ならびにその組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に糖、ポリアルコール、または塩化ナトリウムのような等張剤を含むことが好ましく、製剤はまたトリプタミンのような酸化防止剤およびＴｗｅｅｎ２０のような安定化剤を含有してもよい。
医薬組成物の形態、投与経路、投与量およびレジメンは、処置しようとする状態、疾患の重症度、患者の年齢、体重、および性別などに自然に依存する。
本発明の医薬組成物を、局所、経口、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下または眼内投与などのために製剤化することができる。
ある実施形態において、医薬組成物は、注射することができる製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらのものは、等張性、無菌性の塩溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウムなど、またはそのような塩の混合物）、または場合により、滅菌水もしくは生理食塩水の添加時に、注射溶液の構成を許容する乾燥、特に、凍結乾燥組成物であってもよい。
医薬組成物を、薬物組合せデバイスを介して投与することができる。
投与に用いられる用量を、様々なパラメーターの関数として、例えば、用いられる投与様式、関連する病理、あるいは、所望の処置期間の関数として適合させることができる。
医薬組成物を製造するために、本発明の抗体またはイムノコンジュゲートの有効量を、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解するか、または分散させることができる。
注射的使用にとって好適な医薬形態としては、滅菌水性溶液または分散物；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および滅菌注射溶液または分散物の即興の製造のための滅菌粉末が挙げられる。全ての事例において、形態は、無菌性であり、分解することなく送達するための適切なデバイスまたはシステムを用いて注射可能でなければならない。それは製造および保存の条件下で安定であり、細菌および菌類のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、界面活性剤と好適に混合された水中で製造することができる。分散物はまた、グリセリン、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物ならびに油中で製造することもできる。通常の保存および使用条件下では、これらの製造物は微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。
本発明のポリペプチド、抗体またはイムノコンジュゲートを、中性形態または塩形態で組成物中に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）および例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩を、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または第二鉄のような無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、グリシン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
また、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散物の場合は必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止を、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収の延長を、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によりもたらすことができる。
適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙された他の成分のいずれかと共に組み入れた後、滅菌濾過を行うことにより、滅菌注射溶液を製造する。一般に、様々な滅菌活性成分を、基本分散媒と、上記に列挙されたものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に組み入れることにより、分散物を製造する。滅菌注射溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、活性成分の粉末と、予め滅菌濾過されたその溶液に由来する任意のさらなる所望の成分とを得る減圧乾燥および凍結乾燥技術である。
溶媒としてのＤＭＳＯの使用が、高濃度の活性薬剤を小さい腫瘍エリアに送達する、極端に迅速な浸透をもたらすことが想定される、直接的注射のためのより濃縮された、または高度に濃縮された溶液の製造も企図される。
製剤化の際に、投与量製剤と適合する様式で、および治療上有効であるような量で溶液を投与する。製剤は、上記の注射溶液の型のような様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどを用いることもできる。
水性溶液中での非経口投与のために、例えば、必要に応じて溶液を好適に緩衝化させ、液体希釈剤を最初に十分な塩水またはグルコースで等張性にするべきである。これらの水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与にとって特に好適である。これに関連して、用いることができる滅菌水性媒体は、本開示を考慮すると当業者には公知である。例えば、１つの投与量を、等張性ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解し、皮下注入液１０００ｍｌに添加するか、または提唱される輸注部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照されたい）。投与量のいくらかの変動が処置される対象の状態に応じて必ず生じる。投与を担う人が、いずれにせよ、個々の対象のための適切な用量を決定する。
本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを、用量当たり約０．０１〜１００ミリグラムを含むように治療混合物内で製剤化することができる。
静脈内または筋肉内注射のような非経口投与のために製剤化された抗体またはイムノコンジュゲートに加えて、他の薬学的に許容される形態は、例えば、錠剤または経口投与のための他の固体；時間放出カプセル；および現在用いられる任意の他の形態を含む。
ある特定の実施形態において、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が、宿主細胞中へのポリペプチドの導入について企図される。リポソームおよび／またはナノ粒子の形成および使用は、当業者には公知である。
ナノカプセルは一般に、安定で再現可能な方法で化合物を捕捉することができる。細胞内ポリマー過剰充填に起因する副作用を回避するために、そのような超微細粒子（約０．１μｍのサイズ）は一般にｉｎ ｖｉｖｏで分解され得るポリマーを用いて設計される。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子、または生分解性ポリラクチドもしくはポリラクチドコグリコリドナノ粒子が、本発明における使用について企図され、そのような粒子を容易に作製することができる。
リポソームは、水性媒体中に分散され、多層膜同心二重層ベシクル（多層膜ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中に水性溶液を含有する、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小単層膜ベシクル（ＳＵＶ）の形成をもたらす。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。
治療方法および使用
本発明者らは、本発明者らが生成した５つの抗体が結合後にＣＥＡＣＡＭ５−抗体複合体を内在化させることができることを示した。さらに、本発明者らは、これらの抗体が、細胞傷害性メイタンシノイド（ＤＭ４）と組み合わせた場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＭＫＮ４５腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を誘導することを示した。本発明者らはまた、これらのイムノコンジュゲートが、腫瘍移植後１４日目での単回注射で、５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇの用量で用いた場合、患者に由来するヒト原発性結腸腫瘍異種移植片のマウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで顕著な抗腫瘍活性を誘導することも示した。
かくして、本発明のポリペプチド、抗体、イムノコンジュゲート、または医薬組成物は、がんを処置するのに有用であり得る。
本発明の抗体、イムノコンジュゲート、または医薬組成物を用いて処置されるがんは、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する、特に、同じ組織源の正常（すなわち、非腫瘍）細胞と比較してＣＥＡＣＡＭ５を過剰発現するがんである。がん細胞によるＣＥＡＣＡＭ５の発現を、例えば、以下のセクション「診断的使用」に記載のような、本発明による抗体を用いることにより、特に、例えば、実施例８に記載のような免疫組織化学的方法により容易にアッセイすることができる。
ある実施形態において、がんは、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、子宮頸がん、膵臓がん、食道がん、卵巣がん、甲状腺がん、膀胱がん、子宮内膜がん、乳がん、肝臓がん（例えば、胆管がん）、前立腺がん、または皮膚がんであってもよい。本発明によるマウス抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体を用いる免疫組織化学分析によるヒト腫瘍のパネルのスクリーニングにより、実施例８にさらに詳細に記載されるように、これらの型のがんにおける抗体染色が実際に示された。
本発明の抗体またはイムノコンジュゲートを、単独で、または任意の好適な増殖阻害剤と組み合わせて用いることができる。
本発明の抗体を、以前に記載されたような増殖阻害剤、細胞傷害剤、またはプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートまたは連結することができる。本発明の抗体は、前記増殖阻害剤、細胞傷害剤、またはプロドラッグを、表面上にＣＥＡＣＡＭ５を発現するか、または過剰発現するがん性細胞に標的化するのに実際に有用であってもよい。
また、治療的モノクローナル抗体は、該抗体により特異的に認識される抗原を担持する細胞の枯渇をもたらし得ることも周知である。この枯渇は、少なくとも３つの機構：抗体媒介性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存的溶解、および抗体により標的化される抗原を介して与えられるシグナルによる腫瘍増殖の直接的抗腫瘍阻害によって媒介され得る。
「補体依存的細胞傷害性」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１の成分の、その同族抗原に結合した抗体への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９７）に記載のようなＣＤＣアッセイを実施することができる。
「抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」とは、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した分泌抗体が、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて標的細胞を殺傷することができるようにする細胞傷害性の形態を指す。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載のもののようなｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣアッセイを実行することができる。
かくして、本発明の目的は、治療上有効量の本発明のポリペプチド、抗体、イムノコンジュゲートまたは医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、がんを処置するための方法に関する。
本発明の文脈において、本明細書で用いられる用語「処置すること」または「処置」は、そのような用語が適用される障害もしくは状態、またはそのような障害もしくは状態の１つもしくはそれ以上の症状の進行を逆転させること、軽減すること、阻害すること、またはそれを防止することを意味する。本明細書で用いられる用語「がんを処置すること」は、腫瘍の悪性細胞の増殖および／または前記腫瘍からの転移の進行の阻害を意味する。そのような処置はまた、腫瘍増殖の退縮、すなわち、測定可能な腫瘍サイズの減少ももたらし得る。特に、そのような処置は、腫瘍または転移の完全な退縮をもたらす。
本発明によれば、用語「患者」または「それを必要とする患者」は、悪性腫瘍に罹患したか、または罹患する可能性があるヒトまたは非ヒト哺乳動物を意図する。特に、前記患者は、ＣＥＡＣＡＭ５を標的とする治療剤、特に、本発明による、例えば、以下に記載の方法による抗体またはイムノコンジュゲートに対して感受性であると決定された患者であってもよい。
本発明のポリペプチドの「治療上有効量」とは、任意の医学的処置に適用可能な合理的なリスク／ベネフィット比で、前記がん疾患を処置するためのポリペプチドの十分な量を意味する。しかしながら、本発明のポリペプチドおよび組成物の１日当たりの総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。任意の特定の患者のための特定の治療上有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度；用いられる特定のポリペプチドの活性；用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事；用いられる特定のポリペプチドの投与の時間、投与経路、および排出の速度；処置の持続期間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせて用いられる、またはそれと同時に存在する薬物；ならびに医学業界において周知の同様の因子などの様々な因子に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるものよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまでその投与量を徐々に増加させることは、当業者には周知である。
本発明の別の目的は、悪性腫瘍の処置における使用のための本発明のポリペプチド、抗体、イムノコンジュゲートまたは医薬組成物に関する。
ポリペプチド、抗体、イムノコンジュゲートまたは医薬組成物を、悪性腫瘍の転移の進行を阻害するために用いることができる。
本発明のポリペプチドを、悪性腫瘍を処置するため（例えば、アジュバント療法）、および／または転移性腫瘍の増殖を減少させるための任意の他の治療戦略と組み合わせて用いることができる。
本発明による抗体またはイムノコンジュゲートを用いる処置の効能を、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、がんのマウスモデル上で、および例えば、実施例５．３に定義されるような処置群と対照群との間の腫瘍体積の変化、腫瘍退縮、部分的退縮および／または完全な退縮（％）を測定することにより、容易にアッセイすることができる。
診断的使用
ＣＥＡＣＡＭ５は、結腸直腸、胃、肺、子宮腫瘍細胞の表面上で高度に発現され、結腸および食道上皮細胞のようないくつかの正常な上皮細胞中で弱く発現されることが報告されている。さらに、本発明によるマウス抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体を用いる免疫組織化学分析によるヒト腫瘍パネルのスクリーニングにより、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、子宮頸がん、膵臓がん、食道がん、卵巣がん、甲状腺がん、膀胱がん、子宮内膜がん、乳がん、肝臓がん（特に、胆管がん）、前立腺がん、および皮膚がんにおける抗体染色が示された。
従って、ＣＥＡＣＡＭ５は、がんマーカーであり、従って、抗がん療法の有効性を示すか、または疾患の再発を検出するために用いられる能力を有する。
ある実施形態において、本発明の抗体は、治療剤に対する患者の感受性を決定するため、抗がん療法の有効性をモニタリングするため、または処置後の疾患の再発を検出するために、ＣＥＡＣＡＭ５発現腫瘍を標的とする療法の文脈におけるアッセイの成分として用いられる。特に、本発明の同じ抗体は、治療剤の成分および診断アッセイの成分の両方として用いられる。
かくして、本発明のさらなる目的は、対象におけるＣＥＡＣＡＭ５発現をｉｎ ｖｉｖｏで検出するための使用のため、または対象の生物試料中でのＣＥＡＣＡＭ５発現をｅｘ ｖｉｖｏで検出するための使用のための本発明による抗体に関する。前記検出は、特に、腫瘍細胞上での表面タンパク質ＣＥＡＣＡＭ５の発現を検出することにより、
ａ）対象におけるがんの存在を診断すること、または
ｂ）ＣＥＡＣＡＭ５を標的とする治療剤、特に、本発明によるイムノコンジュゲートに対する、がんを有する患者の感受性を決定すること、または
ｃ）抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法の有効性をモニタリングすること、もしくは抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法、特に、本発明によるイムノコンジュゲートを用いる療法後のがんの再発を検出すること
を意図してもよい。
ある実施形態において、抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの使用を意図される。例えば、ＣＥＡＣＡＭ５を、本発明の抗体を用いて、対象から得られた生物試料中、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで検出することができる。本発明による使用はまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用であってもよい。例えば、本発明による抗体を、対象に投与し、抗体−細胞複合体を検出および／または定量し、それによって前記複合体の検出ががんを示す。
本発明はさらに、対象におけるがんの存在を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの方法であって、
（ａ）対象の生物試料を、本発明による抗体と、特に、抗体が前記生物試料との複合体を形成するのに十分な条件で接触させること；
（ｂ）前記生物試料に結合した抗体のレベルを測定すること、
（ｃ）結合した抗体の測定されたレベルを対照と比較することによってがんの存在を検出し、対照と比較した結合した抗体のレベルの増加ががんを示すこと
からなる工程を含む方法に関する。
本発明はまた、ＣＥＡＣＡＭ５を標的とする治療剤、特に、本発明によるイムノコンジュゲートに対する、がんを有する患者の感受性を決定するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの方法であって、
（ａ）がんを有する患者の生物試料を、本発明による抗体と、特に、抗体が前記生物試料との複合体を形成するのに十分な条件で接触させること；
（ｂ）前記生物試料に結合した抗体のレベルを測定すること、
（ｃ）前記生物試料に結合した抗体の測定されたレベルを、対照に結合した抗体のレベルと比較すること；
からなる工程を含み、対照と比較した前記生物試料に結合した抗体のレベルの増加が、患者がＣＥＡＣＡＭ５を標的とする治療剤に感受性であることを示す方法に関する。
上記方法において、前記対照は、同じ型の正常な、非がん性、生物試料、または同じ型の正常な生物試料中での抗体結合レベルを表すとして決定された参照値であってもよい。
ある実施形態において、本発明の抗体は、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、子宮頸がん、膵臓がん、食道がん、卵巣がん、甲状腺がん、膀胱がん、子宮内膜がん、乳がん、肝臓がん（特に、胆管がん）、前立腺がん、または皮膚がんのような、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんを診断するのに有用である。
本発明はさらに、抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法の有効性をモニタリングするｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの方法であって、
（ａ）抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法を受けている対象の生物試料を、本発明による抗体と、特に、該抗体が前記生物試料と複合体を形成するのに十分な条件で接触させること；
（ｂ）前記生物試料に結合した抗体のレベルを測定すること、
（ｃ）結合した抗体の測定されたレベルを、対照に結合した抗体のレベルと比較すること
からなる工程を含み、対照と比較した前記生物試料に結合した抗体のレベルの低下が、前記抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法の有効性を示す方法に関する。
前記方法において、対照と比較した前記生物試料に結合した抗体のレベルの増加は、前記抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法の無効性を示す。
ある実施形態において、前記対照は、分析にかけられた生物試料と同じ型の生物試料であるが、抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法の経過中に、時間において以前に対象から得られた生物試料である。
本発明はさらに、抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法後のがんの再発を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの方法であって、
（ａ）抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法を完了した対象の生物試料を、本発明による抗体と、特に、該抗体が前記生物試料と複合体を形成するのに十分な条件で接触させること；
（ｂ）前記生物試料に結合した抗体のレベルを測定すること、
（ｃ）結合した抗体の測定されたレベルを、対照に結合した抗体のレベルと比較すること；
からなる工程を含み、対照と比較した前記生物試料に結合した抗体のレベルの増加が、抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法後のがんの再発を示す方法に関する。
前記対照は、特に、分析にかけられた生物試料と同じ型の生物試料であるが、抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法の完了時に、またはその後に、時間において以前に対象から得られた生物試料である。
前記抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法は、特に、本発明による抗体またはイムノコンジュゲートを用いる療法である。前記抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがん、特に、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、子宮頸がん、膵臓がん、食道がん、卵巣がん、甲状腺がん、膀胱がん、子宮内膜がん、乳がん、肝臓がん（特に、胆管がん）、前立腺がん、または皮膚がんを標的とする。
ある実施形態において、本発明の抗体を、蛍光分子、放射性分子またはシグナルを提供する（直接的もしくは間接的に）点で公知の任意の他の標識のような、検出可能な分子または物質で標識することができる。
本発明による抗体に関する、本明細書で用いられる用語「標識された」とは、放射性薬剤またはフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）もしくはフィコエリトリン（ＰＥ）もしくはインドシアニン（Ｃｙ５））のような検出可能物質をポリペプチドにカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによる抗体の直接的標識化、ならびに検出可能物質との反応性によるポリペプチドの間接的標識化を包含することが意図される。
本発明の抗体を、当業界で公知の任意の方法によって放射性分子で標識することができる。例えば、放射性分子としては、限定されるものではないが、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｔｃ９９のようなシンチグラフィー試験のための放射性原子が挙げられる。また、本発明のポリペプチドを、ヨウ素１２３、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄のような、核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化、ＭＲＩとしても知られる）のためのスピン標識を用いて標識することもできる。
「生物試料」は、対象から得られる様々な試料の型を包含し、診断またはモニタリングアッセイにおいて用いることができる。生物試料としては、限定されるものではないが、血液および生物起源の他の液体試料、生検標本のような固形組織試料または組織培養物もしくはそれから誘導される細胞、およびその子孫が挙げられる。従って、生物試料は、臨床試料、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的流体、および組織試料、特に、腫瘍試料を包含する。
ある実施形態において、生物試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料であってもよい。実際、本発明による抗体は、組織試料を収集し、アーカイブに保管するために多くの病院によって用いられる形式であるＦＦＰＥ組織上で有利に用いることができる。
本発明はまた、
ａ）検出可能に標識された本発明による抗体を患者に投与すること；
ｂ）画像化によって患者における前記検出可能に標識された抗体の局在化を検出すること
からなる工程を含む、対象におけるがんの存在を検出するｉｎ ｖｉｖｏでの方法に関する。
本発明の抗体は、がんの段階評価（例えば、放射性イメージングにおける）にとって有用であってよい。それらを単独で、または他のがんマーカーと組み合わせて用いることができる。
本明細書で用いられる用語「検出」または「検出された」は、対照に対する参照を用いるか、または用いない定性的および／または定量的検出（レベルの測定）を含む。
本発明の内容において、本明細書で用いられる用語「診断すること」は、いくつかの収集されたデータから対象に影響する病理を同定することを意図される医学的状態の性質の決定を意味する。
前記方法において、がんは、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するがん、特に、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、子宮頸がん、膵臓がん、食道がん、卵巣がん、甲状腺がん、膀胱がん、子宮内膜がん、乳がん、肝臓がん（特に、胆管がん）、前立腺がん、または皮膚がんである。
キット
最後に、本発明は、本発明の少なくとも１つの抗体またはイムノコンジュゲートを含むキットも提供する。本発明の抗体を含有するキットは、表面タンパク質ＣＥＡＣＡＭ５の検出、または治療的もしくは診断的アッセイにおいて有用である。本発明のキットは、固相支持体、例えば、組織培養プレートまたはビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされたポリペプチドまたは抗体を含有してもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおける表面タンパク質ＣＥＡＣＡＭ５の検出および定量のための抗体を含有するキットを提供することができる。検出にとって有用なそのような抗体を、蛍光または放射性標識のような標識と共に提供することができる。
配列の簡単な説明
配列番号１〜４および６は、いわゆる「ＭＡｂ１」抗体のＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈ、ＣＤＲ１−ＬおよびＣＤＲ３−Ｌの配列を示す。
配列番号５は、ヒト化ＭＡｂ２抗体のＶＨバリアント配列ＶＨ１ａを示す。
配列番号７〜１０、および１２は、いわゆる「ＭＡｂ２」抗体のＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈ、ＣＤＲ１−ＬおよびＣＤＲ３−Ｌの配列を示す。
配列番号１１は、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１７０３．２から入手可能なヒトＣＥＡＣＡＭ１の配列を示す。
配列番号１３〜１６、および１８は、いわゆる「ＭＡｂ３」抗体のＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈ、ＣＤＲ１−ＬおよびＣＤＲ３−Ｌの配列を示す。
配列番号１７は、ヒト化ＭＡｂ２抗体のＶＬバリアント配列ＶＬ１を示す。
配列番号１９〜２２、および２４は、いわゆる「ＭＡｂ４」抗体のＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈ、ＣＤＲ１−ＬおよびＣＤＲ３−Ｌの配列を示す。
配列番号２３は、ヒト化ＭＡｂ２抗体のＶＬバリアント配列ＶＬ１ａを示す。
配列番号２５〜２８、および３０は、いわゆる「ＭＡｂ５」抗体のＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈ、ＣＤＲ１−ＬおよびＣＤＲ３−Ｌの配列を示す。
配列番号２９は、ヒト化ＭＡｂ２抗体のＶＬバリアント配列ＶＬ１ｃを示す。
配列番号３１は、「ＭＡｂ１」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号３２は、「ＭＡｂ１」抗体のＶＬ配列を示す。
配列番号３３は、「ＭＡｂ２」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号３４は、「ＭＡｂ２」抗体のＶＬ配列を示す。
配列番号３５は、「ＭＡｂ３」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号３６は、「ＭＡｂ３」抗体のＶＬ配列を示す。
配列番号３７は、「ＭＡｂ４」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号３８は、「ＭＡｂ４」抗体のＶＬ配列を示す。
配列番号３９は、「ＭＡｂ５」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号４０は、「ＭＡｂ５」抗体のＶＬ配列を示す。
配列番号４１は、ｃｈＭＡｂ１抗体の重鎖配列を示す。
配列番号４２は、ｃｈＭＡｂ１抗体の軽鎖配列を示す。
配列番号４３は、ｃｈＭＡｂ２抗体の重鎖配列を示す。
配列番号４４は、ｃｈＭＡｂ２抗体の軽鎖配列を示す。
配列番号４５は、ｃｈＭＡｂ３抗体の重鎖配列を示す。
配列番号４６は、ｃｈＭＡｂ３抗体の軽鎖配列を示す。
配列番号４７は、ｃｈＭＡｂ４抗体の重鎖配列を示す。
配列番号４８は、ｃｈＭＡｂ４抗体の軽鎖配列を示す。
配列番号４９は、ｃｈＭＡｂ５抗体の重鎖配列を示す。
配列番号５０は、ｃｈＭＡｂ５抗体の軽鎖配列を示す。
配列番号５１は、ヒト化ＭＡｂ２抗体のＶＨバリアント配列ＶＨ１を示す。
配列番号５２は、受託番号ＡＡＡ５１９６７．１の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能な完全長ヒトＣＥＡＣＡＭ５の配列を示す。
配列番号５３は、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５の細胞外ドメインの配列を示す。
配列番号５４は、Ｋ５２からＲ５２への変異を含むキメラ抗体（「ＭＡｂ２」抗体から誘導される）の軽鎖の配列を示す。
配列番号５５は、ヒト化ＭＡｂ２抗体のＶＬバリアント配列ＶＬ１ｄを示す。
配列番号５６は、ｈＣＥＡＣＡＭ１細胞外ドメイン（完全長ｈＣＥＡＣＡＭ１（ＮＰ＿００１７０３．２）の位置３５〜４２８、次いで、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含有する２４アミノ酸伸長）の配列を示す。
配列番号５７は、ｃＣＥＡＣＡＭ１細胞外ドメイン、次いで、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含有する２４アミノ酸伸長の配列を示す。
配列番号５８は、ｈＣＥＡＣＡＭ５細胞外ドメイン（完全長ｈＣＥＡＣＡＭ５（ＡＡＡ５１９６７．１）の位置３５〜６８５、次いで、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含有する２４アミノ酸伸長）の配列を示す。
配列番号５９は、ｃＣＥＡＣＡＭ５細胞外ドメイン、次いで、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含有する２４アミノ酸伸長の配列を示す。
配列番号６０は、ｈＣＥＡＣＡＭ６細胞外ドメイン（完全長ｈＣＥＡＣＡＭ６（ＮＰ＿００２４７４．３）の位置３５〜３２７、次いで、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含有する２４アミノ酸伸長）の配列を示す。
配列番号６１は、ｃＣＥＡＣＡＭ６細胞外ドメイン、次いで、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含有する２４アミノ酸伸長の配列を示す。
配列番号６２は、ｈＣＥＡＣＡＭ８細胞外ドメイン（完全長ｈＣＥＡＣＡＭ８（ＮＰ＿００１８０７．２）の位置３５〜３３２、次いで、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含有する２４アミノ酸伸長の配列を示す。
配列番号６３は、ｃＣＥＡＣＡＭ８細胞外ドメイン、次いで、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含有する２４アミノ酸伸長の配列を示す。
配列番号６４は、ｈＣＥＡＣＡＭ７細胞外ドメイン（完全長ｈＣＥＡＣＡＭ７（ＮＰ＿００８８２１．１）の位置３６〜２４８、次いで、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含有する２４アミノ酸伸長）の配列を示す。
配列番号６５は、ｈＣＥＡＣＡＭ５ Ｎ−Ａ１−Ｂ１（完全長ｈＣＥＡＣＡＭ５（ＡＡＡ５１９６７．１）の位置３５〜３２０）、次いで、６アミノ酸のＨｉｓ−Ｔａｇの配列を示す。
配列番号６６は、ｈＣＥＡＣＡＭ５−Ａ２−Ｂ２（完全長ｈＣＥＡＣＡＭ５（ＡＡＡ５１９６７．１）の位置３２１〜４９８）、次いで、６アミノ酸のＨｉｓ−Ｔａｇの配列を示す。
配列番号６７は、ｈＣＥＡＣＡＭ５ Ａ３−Ｂ３（完全長ｈＣＥＡＣＡＭ５（ＡＡＡ５１９６７．１）の位置４９９〜６８５）、次いで、６アミノ酸のＨｉｓ−Ｔａｇの配列を示す。
配列番号６８は、ｃＣＥＡＣＡＭ５ Ｎ−Ａ１−Ｂ１、次いで、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含有する２４アミノ酸伸長の配列を示す。
配列番号６９は、ｃＣＥＡＣＡＭ５ Ａ２−Ｂ２、次いで、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含有する２４アミノ酸伸長の配列を示す。
配列番号７０は、ｃＣＥＡＣＡＭ５ Ａ３−Ｂ３、次いで、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含有する２４アミノ酸伸長の配列を示す。
配列番号７１は、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００２４７４．３から入手可能なヒトＣＥＡＣＡＭ６完全長タンパク質の配列を示す。
配列番号７２は、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００８８２１．１から入手可能なヒトＣＥＡＣＡＭ７完全長タンパク質の配列を示す。
配列番号７３は、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１８０７．２から入手可能なヒトＣＥＡＣＡＭ８完全長タンパク質の配列を示す。
配列番号７４は、バリアントヒト化ＭＡｂ２＿ＶＬｇ５ＶＨｇ２のＶＨ配列を示す。
配列番号７５は、バリアントヒト化ＭＡｂ２＿ＶＬｇ５ＶＨｇ２のＶＬ配列を示す。
配列番号７６は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５ Ａ３−Ｂ３の位置１０９〜１１５のアミノ酸の配列を示す。
配列番号７７は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５ Ａ３−Ｂ３の位置１３１〜１４３のアミノ酸の配列を示す。
配列番号７８は、配列比較に基づくＭＡｂ２／ＭＡｂ４／ＭＡｂ５抗体ファミリーのＣＤＲ１−Ｈに関するコンセンサス配列を示す。
配列番号７９は、配列比較に基づくＭＡｂ２／ＭＡｂ４／ＭＡｂ５抗体ファミリーのＣＤＲ２−Ｈに関するコンセンサス配列を示す。
配列番号８０は、配列比較に基づくＭＡｂ２／ＭＡｂ４／ＭＡｂ５抗体ファミリーのＣＤＲ３−Ｈに関するコンセンサス配列を示す。
配列番号８１は、ＭＡｂ１／ＭＡｂ３抗体ファミリーのＣＤＲ１−Ｈに関するコンセンサス配列を示す。
配列番号８２は、ＭＡｂ１／ＭＡｂ３抗体ファミリーのＣＤＲ２−Ｈに関するコンセンサス配列を示す。
配列番号８３は、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５細胞外ドメインの結合において中性であると同定された残基に基づくＭＡｂ２／ＭＡｂ４／ＭＡｂ５抗体ファミリーのＣＤＲ１−Ｈに関するコンセンサス配列を示す。
配列番号８４は、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５細胞外ドメインの結合において中性であると同定された残基に基づくＭＡｂ２／ＭＡｂ４／ＭＡｂ５抗体ファミリーのＣＤＲ３−Ｈに関するコンセンサス配列を示す。
配列番号８５は、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５細胞外ドメインの結合において中性であると同定された残基に基づくＭＡｂ２／ＭＡｂ４／ＭＡｂ５抗体ファミリーのＣＤＲ１−Ｌに関するコンセンサス配列を示す。
配列番号８６は、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５細胞外ドメインの結合において中性であると同定された残基に基づくＭＡｂ２／ＭＡｂ４／ＭＡｂ５抗体ファミリーのＣＤＲ３−Ｌに関するコンセンサス配列を示す。
配列番号８７は、ｈｕＭＡｂ２−３の重鎖配列（ＭＡｂ２＿ＶＬ１ｃＶＨ１ａ−ＩｇＧ１）を示す。
配列番号８８は、ｈｕＭＡｂ２−３の軽鎖配列（ＭＡｂ２＿ＶＬ１ｃＶＨ１ａ−ＩｇＧ１）を示す。
配列番号８９は、ｈｕＭＡｂ２−４の重鎖配列（ＭＡｂ２＿ＶＬ１ｄＶＨ１−ＩｇＧ１）を示す。
配列番号９０は、ｈｕＭＡｂ２−４の軽鎖配列（ＭＡｂ２＿ＶＬ１ｄＶＨ１−ＩｇＧ１）を示す。
抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体の選択性の評価を示す図である。 図１−１の続き。 図１−２の続き。 ヒトＣＥＡＣＡＭ５上での抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体のドメインマッピングを示す図である。 図２−１の続き。 図２−２の続き。 カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５上での抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体のドメインマッピングを示す図である。 図３−１の続き。 図３−２の続き。 ＳＣＩＤ雌マウスにおける原発性ヒト結腸腺がんＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐに対するｃｈＭＡｂ４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｃｈＭＡｂ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｃｈＭＡｂ５−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、およびｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ＳＣＩＤ雌マウスにおける原発性ヒト結腸腺がんＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐに対するｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｈｕＭＡｂ２−４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、およびｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ＳＣＩＤ雌マウスにおける原発性ヒト胃腺がんＳＴＯ−ＩＮＤ−００６に対するｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４およびＭＡｂ５抗体のＶＨおよびＶＬ領域の配列アラインメントを示す図である。 ｃｈＭＡｂ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートのＨＲＭＳ分析を示す図である。 ｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートのＨＲＭＳ分析を示す図である。 ｃｈＭＡｂ４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートのＨＲＭＳ分析を示す図である。 ｃｈＭＡｂ５−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートのＨＲＭＳ分析を示す図である。 ｈｕＭＡｂ２−２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートのＨＲＭＳ分析を示す図である。 ｈｕＭＡｂ２−１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートのＨＲＭＳ分析を示す図である。 ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートのＨＲＭＳ分析を示す図である。 ｈｕＭＡｂ２−４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートのＨＲＭＳ分析を示す図である。 ヒトおよびサルＣＥＡＣＡＭ５細胞外ドメインに対するＭＡｂ２のヒト化バリアントの結合活性を示す図である。 ヒトおよびサルＣＥＡＣＡＭ５細胞外ドメインに対するＭＡｂ２のヒト化バリアントの結合の安定性を示す図である。 ＳＣＩＤ雌マウスにおける原発性ヒト肺腺がんＬＵＮ−ＮＩＣ−００１４に対するｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ＣＤ１ヌード雌マウスにおける原発性ヒト結腸腺がんＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐに対するｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびｈｕＭＡｂ２−３−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの抗腫瘍活性の評価を示す図である。 ｈｕＭＡｂ２−３−スルホＳＰＤＢ−ＤＭ４のＨＲＭＳ分析を示す図である。 ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のＨＲＭＳ分析を示す図である。 ＭＡｂ２、ＭＡｂ４、ＭＡｂ５、ヒト化ＶＨ１ａ、ヒト化ＶＨ１およびヒト化ＶＨｇ２の重鎖可変ドメインアラインメントを示す図である。 ＭＡｂ２、ＭＡｂ４、ＭＡｂ５、ヒト化ＶＬ１、ヒト化ＶＬ１ａ、ヒト化ＶＬ１ｃ、ヒト化ＶＬ１ｄおよびヒト化ＶＬｇ５の軽鎖可変ドメインアラインメントを示す図である。
〔実施例〕
以下の実施例によって本発明をさらに例示するが、これらはさらなる限定と解釈されないものとする。
本出願全体で引用された配列リスト、図面および全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
〔実施例１〕
ＣＥＡＣＡＭタンパク質の組換え細胞外ドメインの製造
この実施例では、表１で概説したそれぞれのｃＤＮＡを発現させることが可能なプラスミドを用いたヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞における一過性発現により、ヒト（ｈ）またはカニクイザル（ｃ）由来ＣＥＡＣＡＭの細胞外タンパク質ドメイン（ＥＣＤ）を製造した。
各発現プラスミドを２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と複合体化し、懸濁培養した２９３−Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３細胞から得られた）に添加した。トランスフェクションから８日後に、培養上清を収集し、対応する可溶性タンパク質をＩＭＡＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、タンパク質のバッチを作製した（表１を参照）。
〔実施例２〕
モノクローナルマウス抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体の作製
この実施例において、マウス免疫化後に、抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｍＡｂの作製をもたらすプロトコールに従ってモノクローナル抗体を作製した。
実施例２．１：免疫化およびハイブリドーマ作製
Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ Ａ．Ｅら、１９９３．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４３（４）、１０５０〜１０５４およびＫｉｌｐａｔｒｉｃｋら、１９９７．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３８１３８９で説明されているようにして、ヒトＣＥＡＣＡＭ５の細胞外ドメイン、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５の細胞外ドメインのいずれかを有するＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞を使用して、またはヒト腫瘍ＵＭＣ１１細胞で、免疫化、融合およびスクリーニングを行った。
Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋら（１９９７．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３８１３８９）によって説明されているようなＲＩＭＭＳ法を使用して、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｓ０８２３４２；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）はそれぞれ、３〜４日のインターバルを置いて１４日の期間にわたり４回の免疫化を受けた。マウスの背中に沿った流入領域リンパ節近位の６つの部位と、それと並行する腹部に沿った６つの部位とに、タイターマックスのアジュバント（ＴｉｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ；Ｓｉｇｍａ番号Ｔ２６８４）に乳化した抗原を皮下投与した。最後の注射から４日後に、マウスを殺した。両側膝窩、浅鼠径、腋窩および上腕リンパ節を無菌的に単離し、新しいＲＰＭＩ培地で洗浄した。
Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ Ａ．Ｅら（１９９３．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４３（４）、１０５０〜１０５４）で説明されているような古典的方法を使用して、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｓ０８２３４２；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）はそれぞれ、４１日の期間にわたり３回の免疫化を受けた。マウスの腹側部に抗原を腹腔内投与した。最後の注射から３日後にマウスを殺し、脾臓を無菌的に単離し、新しいＲＰＭＩ培地で洗浄した。
リンパ節または脾臓からリンパ球を取り出し、単一細胞の懸濁液をＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、その後、ポリエチレングリコールを使用してＰ３Ｘ６３−ＡＧ８．６５３骨髄腫細胞と融合させた。融合後、インキュベーターで細胞混合物を３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。得られた細胞調製物を選択的な半固形培地に移し、１００ｍｍペトリプレートに無菌的に塗り広げ３７℃でインキュベートした。選択開始から１０日後に、ハイブリドーマの増殖に関してプレートを試験し、目に見えるコロニーをピックアップし、増殖培地２００μＬを含有する９６−ウェルプレートに置いた。９６−ウェルプレートをインキュベーターで３７℃で２〜４日保持した。
実施例２．２：マウス抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体のスクリーニングおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの特徴付け
捕捉抗原としてヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質（実施例１で説明されているようにして製造された）を使用した酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって、さらに数種のヒト腫瘍細胞（Ｈ４６０、ＭＫＮ４５、ＳＷ１４６３、ＳＫＭＥＬ２８およびＵＭＣ１１）を使用したＦＡＣＳによって、抗ＣＥＡＣＡＭ５のＩｇＧ産生に関する一次スクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡアッセイのために、プレートをヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質で、ＰＢＳ中０．２５μｇ／ウェルでコーティングし、１００μＬ／ウェルの抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体をプレートに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄した。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ；番号Ａ９０４４）の１：５０，０００希釈液１００μＬを各ウェルに添加した。暗所で３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２緩衝液を添加することによって抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。ＦＡＣＳアッセイのために、９６−ウェルのハイバインドプレート（ＭＳＤ Ｌ１５ＸＢ−３）上にヒト腫瘍細胞を細胞４０，０００個／ウェルでコーティングし、１００μＬ／ウェルの抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体を４℃で４５分かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＡｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ａ２１３５）とコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧを４℃で４５分かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。遠心分離して、２００μｌ／ウェルの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加することによって細胞を再懸濁し、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った後、抗体結合を評価した。
抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体のＣＥＡＣＡＭ５に対する特異性を評価するために、以前に説明された同じコーティング条件を使用して、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７およびＣＥＡＣＡＭ８タンパク質（実施例１で説明されているようにして製造された）で９６−ウェルプレートをコーティングした。抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体をプレートに添加し、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ；番号Ａ９０４４）を使用して検出した。ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２緩衝液を添加することによって抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。図１に表示した結果は、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７およびＣＥＡＣＡＭ８と比べてヒトＣＥＡＣＡＭ５に選択的であることを示す。
実施例２．３：ｍＡｂ結合の特徴付け
ヒトＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ４０９）腫瘍細胞表面で発現されたｈＣＥＡＣＡＭ５への抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体の見かけの親和性を、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムによって決定した。９６−ウェルのハイバインドプレート（ＭＳＤ Ｌ１５ＸＢ−３）上にＭＫＮ４５腫瘍細胞を細胞４０，０００個／ウェルでコーティングし、１００μＬ／ウェルの抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体を、アッセイ用希釈剤で２０μｇ／ｍｌから開始して１２回まで希釈した連続２倍希釈液に４℃で４５分かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＡｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ａ２１３５）とコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧを４℃で４５分かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。遠心分離して、２００μｌ／ウェルの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加することによって細胞を再懸濁し、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った後、抗体結合を評価した。見かけのＫＤおよびＥＣ５０値を、それぞれＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＢＩＮＤＩＮＧおよびＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。
ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に対する抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体のドメインマッピングを、ＥＬＩＳＡによって決定した。以前に説明された同じコーティング条件を使用して、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質（実施例１で説明されているようにして製造された）の組換えヒトＡ１（１４３〜２３７）、Ａ１−Ｂ１（１４３〜３２０）、Ａ２−Ｂ２（３２１〜４９８）およびＡ３−Ｂ３（４９９〜６８５）ドメイン、ならびにＣＥＡＣＡＭ５タンパク質の組換えカニクイザルＮ−Ａ１−Ｂ１（１〜３２０）、Ａ１−Ｂ１（１４３〜３２０）、Ａ２−Ｂ２（３２１〜４９８）およびＡ３−Ｂ３（４９９〜６８８）ドメイン（実施例１で説明されているようにして製造された）で、９６−ウェルプレートをコーティングした。精製した抗体をプレートに添加し、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ；番号Ａ９０４４）を使用して検出した。ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２緩衝液を添加することによって抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。結果は、図２および３に示され、それによれば、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体は、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のＡ３−Ｂ３ドメインに結合することが示される。
マウスＩｇＧアイソタイピングキットを製造元の説明書（ＳＥＲＯＴＥＣ参照番号ＭＭＴ１）に従って使用して個々のｍＡｂのアイソタイプを決定した。５種のＣＥＡＣＡＭ５特異的ｍＡｂは、ＩｇＧ１のｋアイソタイプに属していた。
〔実施例３〕
マウス抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体の特徴付け
実施例３．１：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウス抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体の特徴付け
ＣＥＡＣＡＭ５特異的Ａｂを発現するマウスハイブリドーマを産生してＴ５００フラスコに入れ、７日間増殖させた後に馴化培地を収集した。ＣＥＡＣＡＭ５特異的Ａｂを、馴化培地をプロテイン−Ｇカラムに通して精製し、洗浄し、１００ｍＭのグリシン／ＨＣｌのｐＨ２．７の緩衝液で溶出させた。溶出液をＰＢＳに対して透析し、その後濾過滅菌し、４℃で保存した。
全てのＣＥＡＣＡＭ５特異的ｍＡｂを、ヒトおよび霊長類ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質と結合するそれらの能力についてＥＬＩＳＡで査定した。プレートをヒトまたは霊長類ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質でコーティングし、抗ｈＣＥＡＣＡＭ５ ｍＡｂをプレートに添加し、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ；番号Ａ９０４４）で検出した。ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２緩衝液を添加することによって抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。
実施例３．２：フローサイトメトリーによる、進行性のヒト原発性結腸腫瘍細胞ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐへの抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体の見かけの親和性および抗体結合能力
進行性のヒト原発性結腸腫瘍ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ（Ｊｕｌｉｅｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２０１２年１０月１日、１８：５３１４〜５３２８）を、マウス中の患者由来異種移植片から得た。ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号１７１０４−０１９）およびＩ型デオキシリボヌクレアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号１８０４７−０１９）を４℃で１時間使用することにより、腫瘍ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐを酵素的に解離させた。Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用したＶｉａｃｏｕｎｔアプリケーションにより細胞生存率を推定した。見かけの親和性を推定するために、９６−ウェルのハイバインドプレート（ＭＳＤ Ｌ１５ＸＢ−３）上にＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ腫瘍細胞を細胞４０，０００個／ウェルでコーティングし、１００μＬ／ウェルの抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体を、アッセイ用希釈剤で２０μｇ／ｍｌから開始して１２回まで希釈した連続２倍希釈液に４℃で４５分かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＡｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ａ２１３５）とコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧまたはＡｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；番号Ａ１１０１３）とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧを４℃で４５分かけて添加し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した。遠心分離して、２００μｌ／ウェルの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加することによって細胞を再懸濁し、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用して読み取った後、抗体結合を評価した。見かけのＫＤおよびＥＣ５０値を、それぞれＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＢＩＮＤＩＮＧおよびＢＩＯＳＴ＠Ｔ−ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。
マウスＩｇＧキャリブレーターキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ番号７２０８）またはヒトＩｇＧキャリブレーターキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ番号ＣＰ０１０）を製造元の説明書に従って使用して、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体の抗体結合能力を決定した。
実施例３．３：マウスＣＥＡＣＡＭ５特異的抗体の内在化活性
抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体であるＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４およびＭＡｂ５の内在化を評価するために、生存可能なＭＫＮ４５細胞を、１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で予め標識された抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体と共に３７℃／５％ＣＯ２（または陰性対照の場合は氷上で４℃）で２４時間インキュベートした。次いでウェルの一部を培地ですすぎ、細胞に結合した細胞外ＡＦで標識された抗体を、抗ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗体（５０μｇ／ｍＬ）と共に細胞を氷上で３０分インキュベートすることによってクエンチした（細胞内蛍光レベル）。ウェルの他の一部は、同じ時間条件で培地のみでインキュベートした（総蛍光レベル）。
次いで細胞を取り外し、洗浄し、培地中で収集し、その後ＭＡＣＳＱＵＡＮＴ Ｖｙｂアナライザーを使用してフローサイトメトリー分析を行った。１×１０４個の細胞の細胞に関連する蛍光が測定され、ゲートをかけた生存可能な細胞の平均蛍光強度を定量した。内在化比率（％）は、クエンチした細胞に関連する蛍光を合計の細胞に関連する蛍光で割って１００を掛けた値と定義される。データを、平均±標準偏差（ＳＤ）として示す。
５種のＣＥＡＣＡＭ５特異的抗体は、細胞表面の膜で発現されたＣＥＡＣＡＭ５と結合した後、内在化を経るが、これは、癌細胞に対する細胞毒性に特化して取り組むための抗体イムノコンジュゲート分野におけるそれらの使用を支持するものである。抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ＭＡｂ１、ＭＡｂ２、ＭＡｂ３、ＭＡｂ４およびＭＡｂ５は、インキュベートから２４時間後に、それぞれ４９．９％、４５％、５１．１％、４２．５％、５１．７％のＭＫＮ４５ヒト癌細胞株における内在化を示した。
実施例３．４：ＭＫＮ４５細胞株における対応するマウスＡＤＣの細胞毒性活性
マウス抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性活性を定義するために、マウス抗体をコンジュゲートした。１５ｍｌチューブ中、室温（２３℃）で、ｍＡｂ、緩衝液Ａ／ＨＥＰＥＳ（４％）、ＤＭＡ（ジメチルアセトアミド、２０％ｖ／ｖ）、次いで６当量のＳＰＤＢリンカーを連続的に磁気撹拌下で導入した。室温で一晩経過した後、１５ｍＭのＤＭＡ溶液中のＤＭ４（メイタンシノイド、９．６当量）を添加し、５時間反応させた。スーパーデックス２００ｐｇ １６／６０またはＧ２５ ２６／１０カラム（ＰＢＳ−Ｎａ、ｐＨ７．４／５％ＮＭＰ）で未精製のコンジュゲーション混合物を精製し、５０００ｇのＡｍｉｃｏｎ１５で濃縮し、０．２２μｍのミレックスで濾過した。
次いで抗ＣＥＡＣＡＭ５メイタンシノイドコンジュゲートの作用を、セルタイター−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して腫瘍細胞生存率に関して試験した。そうすることにより、ＭＫＮ４５ヒト胃癌細胞を９６−ウェルプレートで平板培養し、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気で４時間かけてそのまま接着させた。植え付けた細胞に、様々な濃度の抗ＣＥＡＣＡＭ５コンジュゲートを添加した。次いで同じ雰囲気中で細胞を９６時間インキュベートした。次いでセルタイター−Ｇｌｏ試薬を室温で１０分かけてウェルに添加し、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して発光シグナルを測定した。
メイタンシノイド（ＤＭ４）にコンジュゲートした抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体であるＭＡｂ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ＭＡｂ３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ＭＡｂ４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびＭＡｂ５−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、それぞれ０．８９、０．１４、０．５３、０．９６および０．２４ｎＭのＩＣ５０で細胞毒性活性を示した。
〔実施例４〕
抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｍＡｂの重鎖および軽鎖の配列決定
ｍＡｂの可変ドメインの配列をハイブリドーマから取り出し、これを発現ベクターにクローニングして、クローニングしたｍＡｂが確実に最初のマウスのｍＡｂと同じ特徴を有するようにした。
得られたアミノ酸配列から、重鎖および軽鎖（ＬＣ、ＨＣ）のＮ末端の配列決定および質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって、ハイブリドーマ由来の精製ｍＡｂで得たデータに一致する情報が得られた（表７を参照）。
〔実施例５〕
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（キメラ体（ｃｈｉｍｅｒ））
実施例５．１：裸のキメラ体ｍＡｂ
可変ドメインＶＨ、ＶＬの核酸配列を、それぞれヒトＩｇＧ１またはヒトＣカッパ定常ドメインのコード配列と融合した状態で発現ベクターにクローニングし、実施例１で説明されているようにしてＨＥＫ２９３で一過性発現させることによりキメラ体ｍＡｂのバッチを作製した。ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５に対する親和性は、マウスおよびキメラ体ｍＡｂの場合と類似したままであった。表８に、ヒトまたはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５を用いたＥＬＩＳＡにより得られたＥＣ５０によって、親和性を例示する。
ＩＭＧＴの学術名を使用したタンパク質配列からＣＤＲ領域に関する配列を推測した。これらの配列は、配列番号１〜４、６、７〜１０、１２、１３〜１６、１８、１９〜２２、２４、２５〜２８、３０に相当する。
注目すべきことに、クローニングされたハイブリドーマ（ＭＡｂ２ｉ）によって産生された抗体と比較して、クローンＭＡｂ２に、ＶＬには４１Ｇ位、４２Ｋ位、および４５Ｑ位で、さらにＶＨには５Ｑ位および７Ｓ位で標準的な残基が導入された。
加えて、クローンＭＡｂ２ ＣＥＡ−４のＶＬにおける５２位のリシンは、ＣＤＲ２に位置し、クローンＭａｂ２Ｋ５２Ｒではアルギニンで置き換えられていた。クローンＭＡｂ２に対応する条件と同じ条件でバッチを作製したところ、表７で示した通りヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５の細胞外ドメインに対して類似の親和性をもたらした。ここで強調すべきことは、このＣＤＲにおける点変異は、結合にいかなる影響も与えることなく作り出すことができることである。
クローンＭＡｂ２およびクローンＭａｂ２Ｋ５２Ｒに関するキメラ体ｍＡｂのＬＣおよびＨＣ配列は、配列番号４３、４４、５４に相当する。
実施例４で説明されているようにしてｃｈＭＡｂ２を構築した。これは、ヒトＩｇＧ１のＣｋアイソタイプとのクローンＭＡｂ２から得られたキメラ体ｍＡｂである。配列は配列番号４３および４４に相当する。ＨＥＫ２９３での一過性発現、それに続くタンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製によって３００ｍｇスケールでバッチを製造した。結合データに関しては表７を参照されたい。ＡＤＣ産生には裸のｍＡｂを使用した。
実施例５．２：ＡＤＣの産生および特徴付け
この実施例では、裸のキメラ体ｍＡｂからイムノコンジュゲートを製造した。次いでｉｎ ｖｉｖｏでの効能を査定した。
ＤＡＲの計算：
コンジュゲートは、一般的に抗体に共有結合した１から１０分子のメイタンシノイドを含む（いわゆる「薬物対抗体比」または「ＤＡＲ」）。この数値は、コンジュゲーションに使用される実験条件（例えばメイタンシノイド／抗体比、反応時間、存在する場合は溶媒および共溶媒の性質など）と共に、使用される抗体およびメイタンシノイドの性質に応じて様々であってもよい。したがって抗体とメイタンシノイドとが接触すると、様々な薬物対抗体比；場合により裸の抗体；場合により凝集体の点で互いに異なる数種のコンジュゲートを含む混合物がもたらされる。したがって決定されるＤＡＲは、平均値である。
ＤＡＲを決定するのに本明細書で使用される方法の原理は、分光光度法により、実質的に精製されたコンジュゲートの溶液の２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度比を測定することにある。特に、前記ＤＡＲは、抗体およびメイタンシノイドに関してそれぞれ２８０および２５２ｎｍで測定された吸光係数を使用して分光光度法により決定できる（εＤ２８０＝５，１８０Ｍ−１ｃｍ−１およびεＤ２５２＝２６，１５９Ｍ−１ｃｍ−１）。計算方法は、Ａｎｔｏｎｙ Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ（編集）、ＬＬＣ、２００９、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、５２５巻、４４５、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅから派生したものであり、以下でより詳細に説明される：
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析のモノマーのピーク（「ＤＡＲ（ＳＥＣ）」パラメーターの計算を可能にする）または典型的な分光光度計の使用（「ＤＡＲ（ＵＶ）」パラメーターの計算を可能にする）のいずれかで、２５２ｎｍ（Ａ２５２）および２８０ｎｍ（Ａ２８０）におけるコンジュゲートの吸光度を測定する。吸光度は、以下のように表すことができる：
Ａ２５２＝（ｃＤ×εＤ２５２）＋（ｃＡ×εＡ２５２）
Ａ２８０＝（ｃＤ×εＤ２８０）＋（ｃＡ×εＡ２８０）
式中：
・ ｃＤおよびｃＡはそれぞれ、メイタンシノイドおよび抗体の溶液中の濃度であり、
・ εＤ２５２およびεＤ２８０はそれぞれ、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるメイタンシノイドのモル吸光係数であり、
・ εＡ２５２およびεＡ２８０はそれぞれ、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数である。
２つの未知数を含むこれらの２つの方程式の解により、以下の方程式が得られる：
ｃＤ＝［（εＡ２８０×Ａ２５２）−（εＡ２５２×Ａ２８０）］／［（εＤ２５２×εＡ２８０）−（εＡ２５２×εＤ２８０）］
ｃＡ＝［Ａ２８０−（ｃＤ×εＤ２８０）］／εＡ２８０
次いで薬物濃度の抗体濃度に対する比率：ＤＡＲ＝ｃＤ／ｃＡから平均ＤＡＲを計算する。
コンジュゲートの脱グリコシル化および高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）
脱グリコシル化とは、グリコシダーゼの手段によって酵素消化する技術である。脱グリコシル化は、コンジュゲート５００μｌと、５０ｍＭトリス緩衝液ＨＣｌ １００μｌと、グリカナーゼ−Ｆ酵素（凍結乾燥酵素１００ユニット／水１００μｌ）１０μｌとから作り出した。培地をボルテックス混合し、３７℃で一晩維持した。脱グリコシル化されたサンプルはＨＲＭＳですぐに分析できる状態であった。Ｗａｔｅｒｓ Ｑ−Ｔｏｆ−２システムでエレクトロスプレーポジティブモード（ＥＳ＋）により質量スペクトルを得た。クロマトグラフ条件は以下の通りである：カラム：４μｍのＢｉｏＳｕｉｔｅ２５０ ＵＲＨ ＳＥＣ４．６×３００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）；溶媒：Ａ：２５ｍＭギ酸アンモニウム＋１％ギ酸：Ｂ：ＣＨ３ＣＮ；カラム温度：３０℃；流速０．４ｍｌ／分；定組成溶離７０％Ａ＋３０％Ｂ（１５分）。
分析的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
− カラム：ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ ５μｍカラム、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ、ＬＬＣパート番号０８５４１＋ガードカラムＴＳＫ−ゲルＳＷＸＬ ７μＭ、４０ｍｍ×６ｍｍ、ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ、ＬＬＣパート番号０８５４３
− 移動相：ＫＣｌ（０．２Ｍ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．０５２Ｍ）、Ｋ２ＨＰＯ４（０．１０７Ｍ）、ｉＰｒＯＨ（２０体積％）
− 分析条件：０．５ｍｌ／分で３０分の定組成溶離
− 分析はＬ２４５５ＤＡＤ分光光度検出器を使用したＬａｃｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ ＨＰＬＣシステム（Ｍｅｒｃｋ）で行われた。
緩衝液の内容物
− 緩衝液Ａ（ｐＨ６．５）：ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）
− 緩衝液ＨＧＳ（ｐＨ５．５）：ヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース５％（ｗ／ｖ）、ＨＣｌ（８ｍＭ）。
使用される略語
ＣＶ：カラム体積；ＤＡＲ：薬物抗体比；ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド；ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸；ＨＲＭＳ：高分解能質量分光分析；ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ニトロ−ＳＰＤＢ：ブタン酸、４−［（５−ニトロ−２−ピリジニル）ジチオ］−、２，５−ジオキソ−１−ピロリジニルエステル（ＷＯ２００４０１６８０１号特許で説明されているようにして製造可能）；ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリジノン；ＲＴ：室温；ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー。
ＡＤＣ（キメラ体）：
ｃｈＭＡｂ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４
分析データ：
ＭＷ（Ａｂ）＝１４８４３８ｇ／ｍｏｌ；ＭＷ（ＤＭ４）＝７８０．３８ｇ／ｍｏｌ
ε２８０ｎｍ（Ａｂ）＝２１３３２０；ε２５２ｎｍ（Ａｂ）＝７３４７３
ε２８０ｎｍ（ＤＭ４）＝５１８０；ε２５２ｎｍ（ＤＭ４）＝２６１５９
室温で撹拌しながら、ｃｈＭＡｂ１（Ｃ＝５．７２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液中）３．５９ｍｌ、続いてＤＭＡ ０．３１２ｍｌおよびニトロ−ＳＰＤＢリンカー溶液（５．０当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．０４６ｍｌを容器に入れた。溶液を３０秒ボルテックス混合し、次いで室温で３時間ゆっくり撹拌した。磁気撹拌下で、ｐＨ７．５のＰＢＳ緩衝液３．８ｍｌ、ＤＭＡ ０．３８９ｍｌおよびＤＭ４溶液０．０７４ｍｌ（ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）を連続的に添加した。室温で２．５時間後、未精製の反応混合物を１ＣＶの１ＭのＮａＯＨ、２ＣＶの水および２ＣＶの体積で５％のＮＭＰを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で予め調整したＨｉＬｏａｄ２６／６０脱塩カラム（スーパーデックス２００ｐｇ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。コンジュゲートを５％のＮＭＰを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で溶出させ、単量体のコンジュゲート画分をプールし、アミコン・ウルトラ−１５（Ｕｌｔｒａｃｅｌ １０ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、０．２２μｍフィルターで濾過した。
このようにしてｃｈＭＡｂ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝２．１９ｍｇ／ｍｌ）７．６ｍｌを無色透明な溶液として得た。次いでコンジュゲートを最終的な薬物含有量および単量体の純度に関して分析した：ＤＡＲ（ＵＶ）＝３．３８；ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝３．３４；ＲＴ＝１７．５４分；単量体の純度＝９９．８％。
図８にＨＲＭＳ分析の結果を示す。
ｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４
分析データ：
ＭＷ（Ａｂ）＝１４７９００ｇ／ｍｏｌ；ＭＷ（ＤＭ４）＝７８０．３８ｇ／ｍｏｌ
ε２８０ｎｍ（Ａｂ）＝２０１４００；ε２５２ｎｍ（Ａｂ）＝７０８８９
ε２８０ｎｍ（ＤＭ４）＝５１８０；ε２５２ｎｍ（ＤＭ４）＝２６１５９
室温で撹拌しながら、ｃｈＭＡｂ２（Ｃ＝５．０８ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液中）３．８ｍｌ、続いてＤＭＡ ０．３３７ｍｌおよびニトロ−ＳＰＤＢリンカー溶液（５．０当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．０４３３ｍｌを容器に入れた。溶液を３０秒ボルテックス混合し、次いで室温で３時間ゆっくり撹拌した。磁気撹拌下で、ｐＨ７．５のＰＢＳ緩衝液３．１２ｍｌ、ＤＭＡ ０．３１９ｍｌおよびＤＭ４溶液０．０６９ｍｌ（ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）を連続的に添加した。室温で２時間後、未精製の反応混合物を０．４５μｍフィルターで濾過し、１ＣＶの１ＭのＮａＯＨ、２ＣＶの水および２ＣＶの体積で５％のＮＭＰを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で予め調整したＨｉＬｏａｄ２６／６０脱塩カラム（スーパーデックス２００ｐｇ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。コンジュゲートを５％のＮＭＰを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で溶出させ、モノマーのコンジュゲート画分をプールし、アミコン・ウルトラ−１５（Ｕｌｔｒａｃｅｌ １０ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、０．２２μｍフィルターで濾過した。
このようにしてｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝１．８ｍｇ／ｍｌ）７．５ｍｌを無色透明な溶液として得た。次いでコンジュゲートを最終的な薬物含有量およびモノマーの純度に関して分析した：ＤＡＲ（ＵＶ）＝４．１０；ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝４．０５；ＲＴ＝１７．５２分；モノマーの純度＝９９．９％。
図９にＨＲＭＳ分析の結果を示す。
ｃｈＭＡｂ４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４
分析データ：
ＭＷ（Ａｂ）＝１４８１２４ｇ／ｍｏｌ；ＭＷ（ＤＭ４）＝７８０．３８ｇ／ｍｏｌ
ε２８０ｎｍ２８０ｎｍ（Ａｂ）＝２０４３８０；ε２８０ｎｍ２５２ｎｍ（Ａｂ）＝７３１４２
ε２８０ｎｍ２８０ｎｍ（ＤＭ４）＝５１８０；ε２８０ｎｍ２５２ｎｍ（ＤＭ４）＝２６１５９
室温で撹拌しながら、ｃｈＭＡｂ４（Ｃ＝５．６９ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液中）３．６３ｍｌ、続いてＤＭＡ ０．３１６ｍｌおよびニトロ−ＳＰＤＢリンカー溶液（５．０当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．０４６５ｍｌを容器に入れた。溶液を３０秒ボルテックス混合し、次いで室温で３時間ゆっくり撹拌した。磁気撹拌下で、ｐＨ７．５のＰＢＳ緩衝液３．８ｍｌ、ＤＭＡ ０．３８９ｍｌおよびＤＭ４溶液０．０７４ｍｌ（ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）を連続的に添加した。室温で２時間後、未精製の反応混合物を１ＣＶの１ＭのＮａＯＨ、２ＣＶの水および２ＣＶの体積で５％のＮＭＰを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で予め調整したＨｉＬｏａｄ２６／６０脱塩カラム（スーパーデックス２００ｐｇ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。コンジュゲートを５％のＮＭＰを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で溶出させ、単量体のコンジュゲート画分をプールし、アミコン・ウルトラ−１５（Ｕｌｔｒａｃｅｌ １０ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、０．２２μｍフィルターで濾過した。
このようにしてｃｈＭＡｂ４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝２．２０ｍｇ／ｍｌ）６．５ｍｌを無色透明な溶液として得た。次いでコンジュゲートを最終的な薬物含有量および単量体の純度に関して分析した：ＤＡＲ（ＵＶ）＝３．８７；ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝３．８５；ＲＴ＝１７．５２分；単量体の純度＝９９．８％。
図１０にＨＲＭＳ分析の結果を示す。
ｃｈＭＡｂ５−ＳＰＤＢ−ＤＭ４
分析データ：
ＭＷ（Ａｂ）＝１４８０４０ｇ／ｍｏｌ；ＭＷ（ＤＭ４）＝７８０．３８ｇ／ｍｏｌ
ε２８０ｎｍ２８０ｎｍ（Ａｂ）＝２０７３６０；ε２８０ｎｍ２５２ｎｍ（Ａｂ）＝７２２８８
ε２８０ｎｍ２８０ｎｍ（ＤＭ４）＝５１８０；ε２８０ｎｍ２５２ｎｍ（ＤＭ４）＝２６１５９
室温で撹拌しながら、ｃｈＭＡｂ５（Ｃ＝６．３８ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液中）３．１５ｍｌ、続いてＤＭＡ ０．２６９ｍｌおよびニトロ−ＳＰＤＢリンカー溶液（５．０当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．０４５３ｍｌを容器に入れた。溶液を３０秒ボルテックス混合し、次いで室温で３時間ゆっくり撹拌した。磁気撹拌下で、ｐＨ７．５のＰＢＳ緩衝液４．１ｍｌ、ＤＭＡ ０．３１７ｍｌおよびＤＭ４溶液０．０７２ｍｌ（ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）を連続的に添加した。室温で２時間後、未精製の反応混合物を０．４５μｍフィルターで濾過し、１ＣＶの１ＭのＮａＯＨ、２ＣＶの水および２ＣＶの体積で５％のＮＭＰを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で予め調整したＨｉＬｏａｄ２６／６０脱塩カラム（スーパーデックス２００ｐｇ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。コンジュゲートを５％のＮＭＰを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で溶出させ、単量体のコンジュゲート画分をプールし、アミコン・ウルトラ−１５（Ｕｌｔｒａｃｅｌ １０ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、０．２２μｍフィルターで濾過した。
このようにしてＡｎｔｉＣＥＡＣＡＭ５＿ｈｙｂ＿１９１７ＣＥＡ４＿ＶＨ５Ｑ７Ｓ＿ＶＬ４１Ｇ４２Ｋ４５Ｑ＿ＩｇＧ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝３．４ｍｇ／ｍｌ）７．５ｍｌを無色透明な溶液として得た。次いでコンジュゲートを最終的な薬物含有量および単量体の純度に関して分析した：ＤＡＲ（ＵＶ）＝３．４；ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝３．４；ＲＴ＝１７．４９分；単量体の純度＝９９．８％。
図１１にＨＲＭＳ分析の結果を示す。
実施例５．３：ｉｎ ｖｉｖｏでの効能
４種のキメラコンジュゲート（ｃｈＭＡｂ４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｃｈＭＡｂ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｃｈＭＡｂ５−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）を、２種の用量で、雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な原発性結腸ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ腫瘍に対して評価した。対照グループは未処置のままとした。コンジュゲートの用量をｍｇ／ｋｇで示した。腫瘍の埋め込みから１４日目に、これらを５および２．５ｍｇ／ｋｇでボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。
コンジュゲートの抗腫瘍活性を評価するために、動物の体重を毎日量り、腫瘍をノギスで週２回測定した。ナディア期（ｎａｄｉｒ）で２０％体重の減少（グループの平均）または１０％またはそれより高い薬物死をもたらす投薬量を過剰な毒性投薬とみなした。動物の体重は腫瘍の重さを包含していた。腫瘍の体積を、質量（ｍｍ３）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２という式を使用して計算した。主要効能の評価項目は、ΔＴ／ΔＣ、退縮のパーセント中央値、部分退縮および完全退縮（ＰＲおよびＣＲ）である。
特定の観察日における腫瘍体積から１回目の処置の日（開始日）における腫瘍体積を引くことによって、処置（Ｔ）および対照（Ｃ）それぞれの腫瘍体積の変化を腫瘍ごとに計算した。処置グループで中央値ΔＴを計算し、対照グループで中央値ΔＣを計算した。次いでΔＴ／ΔＣ比を計算し、パーセンテージ：ΔＴ／ΔＣ＝（デルタＴ／デルタＣ）×１００として示した。
用量は、ΔＴ／ΔＣが４０％よりも低ければ治療的に活性とみなされ、ΔＴ／ΔＣが１０％よりも低ければ極めて活性とみなされる。ΔＴ／ΔＣが０よりも低い場合、その用量は高度に活性とみなされ、退縮のパーセンテージを記録した（Ｐｌｏｗｍａｎ Ｊ、Ｄｙｋｅｓ ＤＪ、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ Ｍ、Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｈｅｒｒｅｎ ＬおよびＡｌｌｅｙ ＭＣ．Ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ ＮＣＩ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｉｎ：編集者Ｆｅｉｂｉｇ ＨＨ ＢＡ．Ｂａｓｅｌ：Ｋａｒｇｅｒ．；１９９９、１０１〜１２５頁）：
％腫瘍退縮は、腫瘍体積の％が、特定の観察日に、１回目の処置の初日におけるその体積と比較して処置グループで減少していることと定義される。
特定のタイムポイントで、動物ごとに退縮％を計算した。次いでグループごとに中央値の退縮％を計算した：
部分退縮（ＰＲ）：退縮は、腫瘍体積が処置開始時の腫瘍体積の５０％に減少する場合、部分的と定義される。
完全退縮（ＣＲ）：完全退縮は、腫瘍体積＝０ｍｍ３の場合に達成される（すなわちＣＲは、腫瘍体積が記録できない場合とみなされる）。
結果：
図４および表９（以下）に結果を示す。２．５および５ｍｇ／ｋｇでの単回投与スケジュールを使用したところ、この研究で試験された全てのコンジュゲートは毒性を誘導しなかった。
ｃｈＭＡｂ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、５および２．５ｍｇ／ｋｇでは、極めて活性であり、ここでΔＴ／ΔＣはそれぞれ０および７％であった（対照に対してｐ＜０．０００１およびｐ＝０．０１７０）。ｃｈＭＡｂ４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびｃｈＭＡｂ５−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、５ｍｇ／ｋｇでは、高度に活性であり、ここでΔＴ／ΔＣはそれぞれ−５および−７％であり（対照に対してｐ＜０．０００１）、腫瘍退縮はそれぞれ２５および６５％であった。これらは、２．５ｍｇ／ｋｇでは、極めて活性であり、ここでΔＴ／ΔＣはそれぞれ７および２％であった（対照に対してｐ＝０．０１５２およびｐ＝０．００２０）。ｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、５および２．５ｍｇ／ｋｇでは、高度に活性であり、ここでΔＴ／ΔＣはそれぞれ−１０および−８％であり（対照に対してｐ＜０．０００１）、腫瘍退縮はそれぞれ８２および３９％であり、さらにそれぞれ３および１ＣＲ／６であった。
これらの結果から、キメラコンジュゲートであるｃｈＭＡｂ４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｃｈＭＡｂ１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｃｈＭＡｂ５−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４はいずれも、治療的ＡＤＣの開発に有用であった。
〔実施例６〕
抗ＣＥＡＣＡＭ５＿ＭＡｂ２のｍＡｂのヒト化
この実施例では、親マウスＩｇＧのＭＡｂ２のヒト化バリアントをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計した。得られたｍＡｂを産生したところ、キメラＩｇＧのｃｈ−ＭＡｂ２と類似の特徴を示した。
実施例６．１：４Ｄ−ヒト化プロトコール
ａ）分子力学的軌道に基づくヒト化
マウスＭＡｂ２クローンのＶＬおよびＶＨ配列を、タンパク質データベース（ＰＤＢ）（Ｂｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００、２８：２３５〜２４２）と比較した。以下のテンプレート：軽鎖および重鎖フレームワーク−３ＥＨＢ（９０．９％のフレームワーク軽鎖の同一性および９０．８％のフレームワーク重鎖の同一性）、Ｌ１−１Ｉ８Ｍ、Ｌ２−１Ｆ６Ｌ、Ｌ３−１Ｐ７Ｋ、Ｈ１−２ＱＨＲ、Ｈ２−１ＩＧＴおよびＨ３−１Ｐ４Ｂを使用して、モレキュラー・オペレーティング・エンバイロンメント（ＭＯＥ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）（ｖ．２０１１．１０−Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）を使用して抗ＣＥＡＣＡＭ５のＬＣおよびＨＣの相同性モデルを組み立てた。続いてＭＯＥで実施される標準的手法を使用して相同性モデルのエネルギーを最小化した。
その後、一般化Ｂｏｒｎインプリシット溶媒（Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎ ｉｍｐｌｉｃｉｔ ｓｏｌｖｅｎｔ）中で、５００Ｋの温度で１．１ナノ秒（ｎｓ）でタンパク質主鎖への制約を用いてマウスＭＡｂ２の最小化された３Ｄ相同性モデルの分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを行った。最後の１ｎｓの間の１００ピコ秒（ｐｓ）ごとに、この第一のＭＤ試行から１０種の多様なコンフォメーションが抽出された。次いでこれらの多様なコンフォメーションをそれぞれ、タンパク質主鎖への制約を用いない３００Ｋの温度、２．３ｎｓでのＭＤシミュレーションに送った。１０回のＭＤ試行のそれぞれにおいて、次いで、ＭＤ軌道からの毎１ｐｓでの最後の２，０００枚のスナップショットを使用して、マウスＭＡｂ２アミノ酸ごとに、参照ミドイド（ｍｅｄｏｉｄ）位置と比較したその根平均二乗変位（ｒｍｓｄ）を計算した。所定のアミノ酸の１０種の別々のＭＤ試行における平均ｒｍｓｄを、全てのＭＡｂ２マウスのアミノ酸の総体的な平均ｒｍｓｄと比較することによって、そのアミノ酸が、ＭＤ中に見られるように、Ｔ細胞受容体と相互作用する可能性が高いとみなされる程度に十分フレキシブルであり、免疫応答の活性化に関与するかどうかが決断される。ＣＤＲとその５Å近傍を除いて、３２のアミノ酸がマウスＭＡｂ２抗体においてフレキシブルであると同定された。
次いで、分子力学シミュレーションの２０ｎｓ（１０×２ｎｓ）中での６０種の最もフレキシブルなマウスＭＡｂ２のアミノ酸の動きを、それぞれ同じＭＤシミュレーションが試行された４９種のヒト３Ｄ相同性モデルの対応するフレキシブルなアミノ酸の動きと比較した。これらの４９種のヒト生殖細胞系モデルは、７種のヒト軽鎖（すなわちｖｋ１、ｖｋ２、ｖｋ３、ｖｋ４、ｖラムダ１、ｖラムダ２、ｖラムダ３）の代表的なパネルと、７種のヒト重鎖（すなわちｖｈ１ａ、ｖｈ１ｂ、ｖｈ２、ｖｈ３、ｖｈ４、ｖｈ５、ｖｈ６）の代表的なパネルとを系統的に組み合わせることによって構築された（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５、３３巻、Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ Ｄ５９３〜Ｄ５９７）。
ｖｋ１〜ｖｈ６の組み合わせは、マウスＭＡｂ２抗体のフレキシブルなアミノ酸と比較して、そのフレキシブルなアミノ酸の最大（７２．６％）の４Ｄ類似性を示した；それゆえにこのモデルを使用して、フレキシブルなアミノ酸に的を絞ってＭＡｂ２抗体をヒト化した。マウスＭＡｂ２とｖｋ１〜ｖｈ６アミノ酸との対になったアミノ酸の会合に関して、アルファ炭素の最適な３Ｄの重ね合わせと２つの対応する相同性モデルに基づいて、これら２つの配列を並べた。
ｂ）変異の安定化
抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体のＶＬおよびＶＨ領域の安定性を改善するために、ＣＤＲを除いてそれらそれぞれの標準的な配列と比べて低い出現頻度の軽鎖および重鎖のアミノ酸を、最も高頻度で見出されるアミノ酸に変異させることが以前から提唱されている（ΔΔＧｔｈ＞０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ；（ＭｏｎｓｅｌｌｉｅｒらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００６、３６２、５８０〜５９３）。ＬＣおよびＨＣのコンセンサス変異の第一のリストは、最も近いヒトモデルで見出されるアミノ酸（すなわちｖｋ１〜ｖｈ６）に制限されている。これらの変異のうち「バーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）」ゾーンに位置するものはない（Ｆｏｏｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２、２２４、４８７〜４９９）。これらのコンセンサス変異が抗ＣＥＣＡＭ５ ＭＡｂ２抗体を安定化する可能性について考慮に入れるには、他の基準が考慮される。これらの基準は、表面におけるハイドロパシーの好都合な変化、または分子機構に基づき予測された突然バリアントの安定化である。文献（Ｂｅｄｏｕｅｌｌｅ，Ｈ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００６、３６２、５８０〜５９３；Ｓｔｅｉｐｅ Ｂ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９４、２４０、１８８〜１９２）で成功したと報告された変異の安定化を考慮に入れた。
ｃ）不要な配列モチーフの除去
以下の配列モチーフを考慮に入れた：Ａｓｐ−Ｐｒｏ（酸不安定性の結合）、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（グリコシル化、Ｘ＝Ｐｒｏ以外のあらゆるアミノ酸）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（フレキシブルな場所でスクシンイミド／イソ−ａｓｐ形成）、Ａｓｎ−Ｇｌｙ／Ｈｉｓ／Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｃｙｓ（露出した脱アミド部位）、Ｍｅｔ（露出した場所で酸化）。得られたヒト化配列を、配列類似性に関して、免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）データベース（（ＰＬｏｓ Ｂｉｏｌ（２００５）３（３）ｅ９１）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ）に対してブラスト処理したところ、上記配列は、そこに列挙された公知のＢ細胞またはＴ細胞エピトープをまったく含有していないことが確実になった。
ｄ）ヒト化ＶＨおよびＶＬ領域
軽鎖に関する３つのバージョン（ＶＬ１、ＶＬ１ａ、およびＶＬ１ｃ）および重鎖に関する３つのバージョン（ＶＨ１、ＶＨ１ａ、およびＶＨ１ｂ）が提唱されている。各ヒト化ＭＡｂ２のＶＬおよびＶＨバリアントにおいて変更されたアミノ酸残基の特定の組み合わせは、それぞれ表１０および表１１に記載されている。表１２に、ヒト化ＶＨおよびＶＬドメインの完全なアミノ酸配列が記載されている。
ＶＬ１バリアントは、５つの変異を示し、この変異は、抗ＣＥＡＣＡＭ５ ＭＡｂ２軽鎖の非ＣＤＲの最もフレキシブルなアミノ酸とｖｋ１ヒト軽鎖配列とを直接比較することにより得られた。
ＶＬ１ａバリアントは、ＶＬ１から得られ、コンセンサス（ｖｋ１配列）であり安定化する可能性がある４つの新しい変異を包含する。さらに、これらの変異のうち１種が、問題のある脱アミド部位（Ｄ１７Ｔ１８）を解決する可能性がある。
ＶＬ１ｃバリアントは、ＶＬ１ａから得られ、５２位においてＫの代わりに１つの変異Ｒが導入されている。実際に、このＫ５２はＣＤＲのＬ２に位置しており、コンジュゲーションプロセスの「標的」にすることができる。
ＶＨ１バリアントは、７つの変異を示し、この変異は、抗ＣＥＡＣＡＭ５重鎖の非ＣＤＲの最もフレキシブルなアミノ酸とｖｈ６ヒト重鎖配列とを直接比較することにより得られた。
ＶＨ１ａバリアントは、ＶＨ１から得られ、コンセンサス（ｖｈ６配列）であり安定化する可能性がある４つの新しい変異を包含する。
ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５ ＭＡｂ２抗体ＶＬおよびＶＨドメインを以下のように組み合わせた：ＶＬ１およびＶＨ１；ＶＬ１ａおよびＶＨ１ａ；ＶＬ１ｃおよびＶＨ１ａ；ＶＬ１ａおよびＶＨ１ｂ。
実施例６．２：ヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｍＡｂの配列
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのＶＬおよびＶＨバリアントのアミノ酸配列から、核酸配列を得て、Ｇｅｎｅａｒｔによって合成した。これらの配列を、それぞれヒトＩｇＧ１またはヒトＣカッパ定常ドメインコード配列と融合させて発現ベクターにクローニングした。
実施例６．３：産生およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの特徴付け
ヒト化ｍＡｂのバッチを、ＨＥＫ２９３での一過性発現により産生し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、サイズ排除クロマトグラフィーおよび質量分析によって構造および同一性を確認した。
ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５に対する親和性をＥＬＩＳＡによって検証し、表１３にＥＣ５０を示した。
ヒトＣＥＡＣＡＭ５に対する特異性と、ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７およびＣＥＡＣＡＭ８に対する特異性とをＥＬＩＳＡによって検証した。これは、ヒトＣＥＡＣＡＭ５との完全な結合と比較した結合パーセンテージとして報告された。表１４を参照されたい。
エピトープ結合ドメインをＥＬＩＳＡによって検証したところ、ヒト化バリアントはＡ３−Ｂ３ドメインを特異的に認識したことが示された。これは、表１５において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５との完全な結合と比較した結合パーセンテージとして報告された。
キメラＭＡｂ２と比較した、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ５（ｈＣＥＡＣＡＭ５）およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５（ｃＣＥＡＣＡＭ５）へのヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５＿ＭＡｂ２バリアントの結合速度論を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．、Ｕｐｐｓａｌａ、ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイによって決定した。
簡単に言えば、ＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップを機器にドッキングし、室温で１：１のＮＨＳ／ＥＤＣ ７０μＬで活性化した。全てのフローセル中の活性化されたチップ上に、マウス抗αヒトＦｃ ＩｇＧ１（ＢＩＡｃｏｒｅ番号ＢＲ−１００８−３９）（５０μｇ／ｍＬ、ｐＨ５の１Ｍ酢酸緩衝液中）を固定化した。１０μＬ／分の流速で飽和するまで固定化を実行した。次いでエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５ ７０μＬを注入することによりチップをブロッキングし、続いて３ＭのＭｇＣｌ２で１回洗浄した。ヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質またはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５タンパク質への抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｍＡｂの結合を測定するために、抗体をＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ）中１〜５μｇ／ｍＬで使用した。抗原（ヒトＣＥＡＣＡＭ５またはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５）を１から５００ｎＭで注入した。注入期間が完了した後、同じ流速で６００秒間、ＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液中で解離をモニターした。２×５μＬの３ＭのＭｇＣｌ２（２×３０秒）を使用して、注入と注入の間で表面を再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して個々のセンサーグラムを分析した。
キメラＭＡｂ２と比較した、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５に対する、およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６およびＣＥＡＣＡＭ８に対するヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５＿ＭＡｂ２バリアントの特異性をＥＬＩＳＡによって検証した。これは、ＣＥＡＣＡＭ５との完全な結合またはＥＣ５０での結合と比較した結合パーセンテージとして報告された。以下の表１７を参照されたい。
実施例６．４：ヒト生殖細胞系フレームワークへのグラフトにより得られたＭａｂ２のヒト化バリアントの特徴付け
この実施例では、ＣＲＤグラフト手法によりＭａｂ２のヒト化バリアントを得た。さらに、ヒト化抗体のＣＤＲをアラニンスキャニング手法に送ったところ、いくつかの位置が、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５への結合に影響を及ぼすことなく置換が可能であることが示された。
まずｉｎ ｓｉｌｉｃｏで、マウス抗体Ｍａｂ２との構造的な相同性に基づきヒト生殖細胞系フレームワークを選択することによってＭａｂ２のヒト化バージョンの配列を作製した。軽鎖の場合、選択されたヒトフレームワークは、遺伝子ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１およびＩＧＫＪ２＊０２によって定義され、重鎖の場合、遺伝子ＩＧＨＶ３−２３＊０４およびＩＧＨＪ４＊０１によって定義された。Ｍａｂ２Ｋ５２Ｒの６つのＣＤＲをこれらのヒトフレームワークにグラフトした。ＶＬにおける３４位および５３位（配列番号３４）（それぞれＦＲ２−ＬおよびＦＲ３−Ｌ領域）ならびにＶＨにおける５０位（配列番号３３）（ＦＲ２−Ｈ領域）に対応する３つの逆変異を導入したところ、結果としてＭＡｂ２＿ＶＬｇ５ＶＨｇ２と定義された以下の配列が得られた。
６つのＣＤＲの各アミノ酸を優先的にアラニンで１回置き換えることによりＭＡｂ２＿ＶＬｇ５ＶＨｇ２の数種のバリアントを得た。ＭＡｂ２＿ＶＬｇ５ＶＨｇ２のＣＤＲでアラニンがすでに見出されており、そのようなアラニンがＨ−ＣＤＲ３中に存在する場合、別のアミノ酸を置換した（配列番号７４の残基９７ではＶａｌ、残基９８ではＡｒｇおよび残基１０８ではＡｓｐ）。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのＶＬおよびＶＨバリアントのアミノ酸配列から核酸配列を得て、遺伝子合成により作製した。これらの配列を、それぞれヒトＩｇＧ１またはヒトＣカッパ定常ドメインのコード配列と融合させて哺乳動物の発現ベクターにクローニングした。ヒト化ＭＡｂ２＿ＶＬｇ５ＶＨｇ２、それと１つの位置において異なる単一のバリアント、および限られた数の突然バリアントの組み合わせを、ＨＥＫ２９３細胞での一過性発現により産生した。ヒトＣＥＡＣＡＭ５のＥＣＤ、カニクイザルのＥＣＤおよびヒトＣＥＡＣＡＭ５のＡ３−Ｂ３ドメインへの結合アッセイで使用するために、分泌されたＩｇＧを（２０〜７０μｇ／ｍｌで）含有する細胞上清を１μｇ／ｍｌに希釈した。
これらの改変の影響を評価するために、ＩｇＧ結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ユニット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＲシグナルを測定することによって決定した。抗ヒトＦｃ抗体を、アミンカップリングキットによってシリーズＳのＣＭ５チップにカップリングして、１０，０００反応単位（ＲＵ）のレベルに達した。６０秒の接触時間および１０μＬ／分の流速を用いて上清を１μｇ／ｍＬで注入することによって、およそ３００〜６００ＲＵの各バリアントを捕捉した。全ての実験を、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を用いて２５℃で行った。スクリーニングモードで、捕捉したＩｇＧバリアント上にヒトＣＥＡＣＡＭ５／カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５／ヒトＡ３Ｂ３ドメインを５０ｎＭで３０μＬ／分の流速で１分注入した。６０秒の解離期間を保ち、その後、３ＭのＭｇＣｌ２の１パルスの注入で、１０μＬ／分の流速および３０秒の接触時間で表面を再生した。
実験ごとに、基準面を使用して応答データを処理することにより、バルクの屈折率変化およびあらゆる非特異的な結合に関して補正を行った。ブランク注入からの応答を使用してデータを二重に基準化した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからのアプリケーションノート（アプリケーションノート２８−９７７７−７２ＡＡ）で説明されているスクリーニング法に従って、２つのパラメーターを考慮に入れて、バリアントを結合特徴に関してランク付けした。第一に、測定された理論上の最大シグナルの比率によって結合活性を推定した（Ｒｍａｘのパーセンテージ、図１６を参照）。第二に、解離が報告されたポイント（第一のポイントは注入終了後の１０秒間、第二のポイントは１つの注入終了後の５０秒間）を使用して残りのシグナルのパーセンテージを計算し、結合安定性を反映させた（図１７を参照）。
以下の位置での単一アラニンバリアントから、元の抗体と比較して同等の結合パラメーターが実証され、これは、これらの位置におけるＣＤＲアミノ酸は結合に関して中立であることを示唆している：ＬＣ残基２７、２８、２９、３１、５１、５２、８９、９０、９３、９４、９６、９７、およびＨＣ残基２６〜３１、５１〜５８、９７、１０３、１０４、１０７、１０９。これらのバリアントの挙動はヒトおよびサルＣＥＡＣＡＭ５と類似していることから、それらの交差反応性が維持される。またＣＥＡＣＡＭ５のＡ３−Ｂ３ドメインへの結合も、影響を受けないことが見出された。２つの中立な置換の組み合わせもいくつか作製したところ、ＬＣ＿Ｔ５１ＡとＬＣ＿Ｔ９４Ａとの会合、ＬＣ＿Ｓ３１ＡとＨＣ＿Ｇ５４Ｙとの会合、またはＬＣ＿Ｔ５３ＩとＨＣ＿Ｓ５３Ａとの会合で例示されるように、変わらない結合パラメーターがもたらされることが見出された。
逆に言えば、その他全てのＣＤＲ位置において、元のアミノ酸をアラニンで置換することにより、完全な結合の損失を誘導するか、または結合パラメーターを劇的に変更することが見出された。重鎖の１０１位または軽鎖の３２位および９１位は、図１６および１７に示される例である。バリアントの第二のセットの本質は、このような位置のうちいくつかにおけるより保存的な変異を試験することであった。そうすることにより、本発明者らは、以下の保存的置換は抗原結合に関して中立であることを見出した：ＭＡｂ２＿ＶＬｇ５の残基３０におけるＰｈｅからＴｙｒ、ＭＡｂ２＿ＶＬｇ５の残基９２におけるＴｙｒからＰｈｅ、ＭＡｂ２＿ＶＨｇ２の残基９８におけるＡｌａからＳｅｒ、およびＭＡｂ２＿ＶＨｇ２の残基１００におけるＴｙｒからＰｈｅ（図に示された通り）。
〔実施例７〕
ＭＡｂ２薬物コンジュゲートのヒト化バリアント
実施例７．１：産生および特徴付け
ｈｕＭＡｂ２−２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４
分析データ：
ＭＷ（Ａｂ）＝１４７３６０ｇ／ｍｏｌ；ＭＷ（ＤＭ４）＝７８０．３８ｇ／ｍｏｌ
ε２８０ｎｍ（Ａｂ）＝２０１４００；ε２８０ｎｍ（Ａｂ）＝７１６９３
ε２８０ｎｍ（ＤＭ４）＝５１８０；ε２８０ｎｍ（ＤＭ４）＝２６１５９
室温で撹拌しながら、ｈｕＭＡｂ２−２（Ｃ＝５．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液中）１９．４ｍｇ、続いてＤＭＡ ０．３７５ｍｌおよびニトロ−ＳＰＤＢリンカー溶液（５．０当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．０４３９ｍｌを容器に入れた。溶液を３０秒ボルテックス混合し、次いで室温で２時間ゆっくり撹拌した。追加の体積０．００４４ｍｌのニトロ−ＳＰＤＢリンカー溶液（５．０当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）を添加した。室温で２時間後、磁気撹拌下で、ｐＨ＝７．５のＰＢＳ緩衝液２ｍｌおよびＤＭ４溶液（ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．０７０２ｍｌを連続的に添加した。室温で２時間後、未精製の反応混合物を０．４５μｍフィルターで濾過し、１ＣＶの１ＭのＮａＯＨ、２ＣＶの水および２ＣＶのヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース（５％）、ｐＨ＝５．５の緩衝液で予め調整したＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（セファデックスＧ２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。コンジュゲートをヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース（５％）、ｐＨ＝５．５の緩衝液で溶出させ、単量体のコンジュゲート画分をプールし、０．２２μｍフィルターで濾過した。
このようにしてｈｕＭＡｂ２−２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝１．３５ｍｇ／ｍｌ）１０．３ｍｌを無色透明な溶液として得た。次いでコンジュゲートを最終的な薬物含有量および単量体の純度に関して分析した：ＤＡＲ（ＵＶ）＝３．７；ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝３．６；ＲＴ＝１７．２９分；単量体の純度＝９７．９％。
図１２にＨＲＭＳ分析の結果を示す。
ｈｕＭＡｂ２−１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４
分析データ：
ＭＷ（Ａｂ）＝１４７５６３ｇ／ｍｏｌ；ＭＷ（ＤＭ４）＝７８０．３８ｇ／ｍｏｌ
ε２８０ｎｍ（Ａｂ）＝２０１４００；ε２５２ｎｍ（Ａｂ）＝６９６６９
ε２８０ｎｍ（ＤＭ４）＝５１８０；ε２５２ｎｍ（ＤＭ４）＝２６１５９
室温で撹拌しながら、ｈｕＭＡｂ２−１の溶液（Ｃ＝５．０８ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液中）３．８ｍｌ、続いてＤＭＡ ０．３４１ｍｌおよびニトロ−ＳＰＤＢリンカー溶液（４．５当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．０３９２ｍｌを容器に入れた。溶液を３０秒ボルテックス混合し、次いで室温で３時間ゆっくり撹拌した。追加の体積０．００８７ｍｌのニトロ−ＳＰＤＢリンカー溶液（１．０当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）を添加した。室温で２時間後、磁気撹拌下で、ｐＨ７．５のＰＢＳ緩衝液２．６２ｍｌ、ＤＭＡ ０．２５４ｍｌおよびＤＭ４溶液（ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．０７６ｍｌを連続的に添加した。室温で１時間後、未精製の反応混合物を０．４５μｍフィルターで濾過し、１ＣＶの１ＭのＮａＯＨ、２ＣＶの水および２ＣＶのヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース（５％）、ｐＨ＝５．５の緩衝液で予め調整したＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（セファデックスＧ２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。コンジュゲートをヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース（５％）、ｐＨ＝５．５の緩衝液で溶出させ、モノマーのコンジュゲート画分をプールし、０．２２μｍフィルターで濾過した。
このようにしてｈｕＭＡｂ２−１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝１．３５ｍｇ／ｍｌ）９．５ｍｌを無色透明な溶液として得た。次いでコンジュゲートを最終的な薬物含有量およびモノマーの純度に関して分析した：ＤＡＲ（ＵＶ）＝４．１；ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝４．０；ＲＴ＝１７．３９分；モノマーの純度＝９６．７％。
図１３にＨＲＭＳ分析の結果を示す。
ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４
分析データ：
ＭＷ（Ａｂ）＝１４７４１７ｇ／ｍｏｌ；ＭＷ（ＤＭ４）＝７８０．３８ｇ／ｍｏｌ
ε２８０ｎｍ（Ａｂ）＝２０１４００；ε２５２ｎｍ（Ａｂ）＝７１４５１
ε２８０ｎｍ（ＤＭ４）＝５１８０；ε２５２ｎｍ（ＤＭ４）＝２６１５９
室温で撹拌しながら、ｈｕＭＡｂ２−３の溶液（Ｃ＝５．０９ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液中）３．８ｍｌ、続いてＤＭＡ ０．３３６ｍｌおよびニトロ−ＳＰＤＢリンカー溶液（５当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．０４３７ｍｌを容器に入れた。溶液を３０秒ボルテックス混合し、次いで室温で３時間ゆっくり撹拌した。追加の体積０．００３５ｍｌのニトロ−ＳＰＤＢリンカー溶液（０．４当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）を添加した。室温で１時間後、磁気撹拌下で、ｐＨ７．５のＰＢＳ緩衝液２．６０ｍｌ、ＤＭＡ ０．２４８ｍｌおよびＤＭ４溶液（ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．０７４ｍｌを連続的に添加した。室温で１時間後、未精製の反応混合物を０．４５μｍフィルターで濾過し、１ＣＶの１ＭのＮａＯＨ、２ＣＶの水および２ＣＶのヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース（５％）、ｐＨ＝５．５の緩衝液で予め調整したＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（セファデックスＧ２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。コンジュゲートをヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース（５％）、ｐＨ＝５．５の緩衝液で溶出させ、単量体のコンジュゲート画分をプールし、０．２２μｍフィルターで濾過した。
このようにしてｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝１．０８ｍｇ／ｍｌ）１１ｍｌを無色透明な溶液として得た。次いでコンジュゲートを最終的な薬物含有量および単量体の純度に関して分析した：ＤＡＲ（ＵＶ）＝３．９；ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝３．８；ＲＴ＝１７．４４分；単量体の純度＝９８．４％。
図１４にＨＲＭＳ分析の結果を示す。
ｈｕＭＡｂ２−４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４
分析データ：
ＭＷ（Ａｂ）＝１４７６２８ｇ／ｍｏｌ；ＭＷ（ＤＭ４）＝７８０．３８ｇ／ｍｏｌ
ε２８０ｎｍ（Ａｂ）＝２０１４００；ε２５２ｎｍ（Ａｂ）＝７０６２８
ε２８０ｎｍ（ＤＭ４）＝５１８０；ε２５２ｎｍ（ＤＭ４）＝２６１５９
室温で撹拌しながら、ｈｕＭＡｂ２−４の溶液（Ｃ＝５．０９ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液中）３．８ｍｌ、続いてＤＭＡ ０．３４５ｍｌおよびニトロ−ＳＰＤＢリンカー溶液（５当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．０４４８ｍｌを容器に入れた。溶液を３０秒ボルテックス混合し、次いで室温で３時間ゆっくり撹拌した。追加の体積０．００２７ｍｌのニトロ−ＳＰＤＢリンカー溶液（０．３当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）を添加した。室温で１時間後、磁気撹拌下で、ｐＨ７．５のＰＢＳ緩衝液２．７０ｍｌ、ＤＭＡ ０．２６３ｍｌおよびＤＭ４溶液（ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．０７５ｍｌを連続的に添加した。室温で１時間後、未精製の反応混合物を０．４５μｍフィルターで濾過し、１ＣＶの１ＭのＮａＯＨ、２ＣＶの水および２ＣＶのヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース（５％）、ｐＨ＝５．５の緩衝液で予め調整したＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（セファデックスＧ２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。コンジュゲートをヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース（５％）、ｐＨ＝５．５の緩衝液で溶出させ、単量体のコンジュゲート画分をプールし、０．２２μｍフィルターで濾過した。
このようにしてｈｕＭＡｂ２−４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝１．２３ｍｇ／ｍｌ）１１ｍｌを無色透明な溶液として得た。次いでコンジュゲートを最終的な薬物含有量および単量体の純度に関して分析した：ＤＡＲ（ＵＶ）＝３．８；ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝３．８；ＲＴ＝１７．５３分；単量体の純度＝９９．３％。
図１５にＨＲＭＳ分析の結果を示す。
実施例７．２：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性
材料および方法：
腫瘍細胞生存率に対する抗ＣＥＡＣＡＭ５メイタンシノイドコンジュゲートの作用を、実施例３．４で説明されているようにして査定した。
結果：
これらのｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｈｕＭＡｂ２−１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｈｕＭＡｂ２−２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、およびｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートおよびＤＭ４の無関係のコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、それぞれ０．２４、０．１８、０．２３、０．１６、および８．５２ｎＭのＩＣ５０で、培養中のＭＫＮ４５細胞に対して細胞毒性活性を示した。抗ＣＥＡＣＡＭ５コンジュゲートの細胞毒性活性は、測定された無関係のＤＭ４コンジュゲートの活性よりも５３〜３５倍低かったことから、抗ＣＥＡＣＡＭ５コンジュゲートのＣＥＡＣＡＭ５が介在する細胞毒性活性が示された。
実施例７．３：雌ＣＤ−１ヌードマウスの皮下に埋め込まれた原発性結腸ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ腫瘍に対するｉｎ ｖｉｖｏでの効能
材料および方法
コンジュゲートであるｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびｈｕＭＡｂ２−４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４としての２つのヒト化配列を、４種の用量レベルで、ｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４と比較して、雌ＣＤ−１ヌードマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な原発性結腸ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐ腫瘍に対して評価した。対照グループは未処置のままとした。コンジュゲートの用量をｍｇ／ｋｇで示した。これらを、腫瘍の埋め込みから１９日目に、１０、５、２．５および１．２５ｍｇ／ｋｇで、ボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。
実施例５で報告されているようにして毒性および効能評価を行った。
結果：
図５および表２０（以下）に結果を示す。
１．２５、２．５、５および１０ｍｇ／ｋｇでの単回投与スケジュールを使用したところ、この研究で試験された全てのコンジュゲートは毒性を誘導しなかった。
ｈｕＭＡｂ２−４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびｃｈＭＡｂ２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、１０ｍｇ／ｋｇでは、高度に活性であり、ここでΔＴ／ΔＣは−４％であり（対照に対してｐ＜０．０００１）、腫瘍退縮はそれぞれ２１および１９％であり、５ｍｇ／ｋｇでは、活性であり、ここでΔＴ／ΔＣはそれぞれ１２（対照に対してｐ＝０．０１０５）および１７％（対照に対してｐ＝０．０４１７）であり、２．５ｍｇ／ｋｇでは、わずかに活性であり、ここでΔＴ／ΔＣはそれぞれ３６および３７％であり（対照に対するｎｓ）、１．２５ｍｇ／ｋｇでは、不活性であった。ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、１０ｍｇ／ｋｇでは、高度に活性であり、ここでΔＴ／ΔＣは−６％であり（対照に対してｐ＜０．０００１）、腫瘍退縮は３１％であり、５ｍｇ／ｋｇでは、極めて活性であり、ここでΔＴ／ΔＣは４％であり（対照に対してｐ＜０．０００１）、２．５ｍｇ／ｋｇでは、活性であり、ここでΔＴ／ΔＣは１２であり（対照に対してｐ＝０．０３２２）、１．２５ｍｇ／ｋｇでは、わずかに活性であり、ここでΔＴ／ΔＣは３４％であった（対照に対するｎｓ）。
これらの結果から、ヒト化配列ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびｈｕＭＡｂ２−４−ＳＰＤＢ−ＤＭ４はどちらも、治療的ＡＤＣの開発に有用であった。両方の配列のなかでもｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４が最良であった。
実施例７．４：雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた原発性胃腫瘍ＳＴＯ−ＩＮＤ−００６に対するｉｎ ｖｉｖｏでの効能
材料および方法
ヒト化コンジュゲートであるｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を、３種の用量レベルで、雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な原発性胃腫瘍ＳＴＯ−ＩＮＤ−００６に対して評価した。対照グループは未処置のままとした。コンジュゲートの用量をｍｇ／ｋｇで示した。これらを、腫瘍の埋め込みから２７日目に、１０、５および２．５ｍｇ／ｋｇでボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。
実施例５で報告されているようにして毒性および効能評価を行った。
結果：
２．５、５および１０ｍｇ／ｋｇでの単回投与スケジュールを使用したところ、ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は毒性を誘導しなかった。
図６および表２１に示した通り、ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、１０ｍｇ／ｋｇでは、極めて活性であり、ここでΔＴ／ΔＣは７％であり（対照に対してｐ＜０．０００１）、５ｍｇ／ｋｇでは、活性であり、ここでΔＴ／ΔＣは３６％であり（対照に対してｐ＝０．０２８１）、２．５ｍｇ／ｋｇでは、不活性であった。
実施例７．５：雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた原発性肺腫瘍ＬＵＮ−ＮＩＣ−０
０１４に対するｉｎ ｖｉｖｏでの効能
材料および方法
ヒト化コンジュゲートｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を、３種の用量レベルで、雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な原発性肺ＬＵＮ−ＮＩＣ−００１４腫瘍に対して評価した。対照グループは未処置のままとした。コンジュゲートの用量をｍｇ／ｋｇで示した。これらを、腫瘍の埋め込みから２９日目に、１０、５および２．５ｍｇ／ｋｇでボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。
実施例５で報告されているようにして毒性および効能評価を行った。
結果
２．５、５および１０ｍｇ／ｋｇでの単回投与スケジュールを使用したところ、ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は毒性を誘導しなかった。
図１８および表２２に示した通り、ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、１０および５ｍｇ／ｋｇでは、高度に活性であり、ここでΔＴ／ΔＣは０％より低く（対照に対してｐ＜０．０００１）および腫瘍退縮はそれぞれ６７および５７％であり、２．５ｍｇ／ｋｇでは、活性であり、ここでΔＴ／ΔＣは１２％であった（対照に対してｐ＝０．０３６３）。
実施例７．６：雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた原発性結腸腫瘍ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐに対するｉｎ ｖｉｖｏでの効能
材料および方法
２種の異なるリンカー（ＳＰＤＢおよびスルホ−ＳＰＤＢ）を介してＤＭ４にコンジュゲートしたヒト化ｈｕＭＡｂ２−３で構成される３種のコンジュゲートを、２種の用量レベルで、雌ＳＣＩＤマウスの皮下に埋め込まれた測定可能な原発性結腸腫瘍ＣＲ−ＩＧＲ−０３４Ｐに対して評価した。対照グループは未処置のままとした。コンジュゲートの用量をｍｇ／ｋｇで示した。これらを、腫瘍の埋め込みから１９日目に、５および２．５ｍｇ／ｋｇでボーラス注射により静脈内（ＩＶ）投与した。
実施例５で報告されているようにして毒性および効能評価を行った。
結果
２．５および５ｍｇ／ｋｇでの単回投与スケジュールを使用したところ、ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４およびｈｕＭＡｂ２−３−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は毒性を誘導しなかった。
図１９および表２３に示した通り、ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、５および２．５ｍｇ／ｋｇでは、活性であり、ここでΔＴ／ΔＣはそれぞれ１２％および４０％であり（対照に対してｐ＜０．０００１）、ｈｕＭＡｂ２−３−スルホ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４は、５ｍｇ／ｋｇでは、高度に活性であり、ここでΔＴ／ΔＣは０％より低く（対照に対してｐ＜０．０００１）、腫瘍退縮は１２％であり、さらに２．５ｍｇ／ｋｇでは、活性であり、ここでΔＴ／ΔＣは１％であった（対照に対してｐ＜０．０００１）。
〔実施例８〕
ホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織中でのヒトおよびサルＣＥＡＣＡＭ５タンパク質検出に貢献する免疫組織化学（ＩＨＣ）プロトコールの開発。
材料および方法
組織
ヒト（腫瘍および非腫瘍）、同様にカニクイザル（正常）組織の源として、ＦＦＰＥ組織マイクロアレイ（ＴＭＡ、表２４）を使用した。
抗体
一次マウス抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５モノクローナル抗体として、ＭＡｂ２を使用した。二次抗体として、ビオチンとコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ１（γ１鎖特異的）（参照番号１０７０−０８、バッチＬ４３０９−Ｘ７６１、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を使用した。
免疫染色
抗原検索手法を、９５℃で８分、次いで１００℃で２８分で細胞調整１（ＣＣ１）緩衝液を用いることにより適用した。内因性ビオチンをブロッキングする工程の後、スライドを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５μｇ／ｍＬに希釈した一次抗抗体と共に２４℃で２時間インキュベートした。二次抗体のビオチンとコンジュゲートしたヤギ抗マウスを０．５μｇ／ｍＬで２４℃で３２分インキュベートした。ＤＡＢＭａｐ（商標）発色検出キット（７６０−１２４、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）からの３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）を製造元の推奨に従って用いて、免疫染色を行った。ヘマトキシリン（７６０−２０３７、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を用いて対比染色工程を行い、青色化試薬を適用した（７６０−２０３７、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＵＳＡ）。染色されたスライドを脱水させ、サイトシール（ｃｙｔｏｓｅａｌ）ＸＹＬ（８３１２−４、Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いてカバースリップをかけた。
ＩＨＣスコア付け
ＳｃａｎＳｃｏｐｅ ＸＴシステム（Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）を使用して免疫染色したスライドをスキャンした。ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェア（バージョン１０．２．２．２３１９、Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して２０倍の倍率でデジタル化した画像を捕捉した。
染色評価には、反応性の組織学的部位、主要なタイプの反応性細胞、染色強度、および細胞の染色頻度が包含される。陰性サンプルを０＋とスコア付けした。陽性サンプルを１＋から４＋の強度のスケールでスコア付けした。強度範囲は、弱い［０；２＋］、中程度［２＋；３＋］および強い［３＋；４＋］と記載された。細胞頻度は、免疫染色された細胞のパーセンテージであり、組織学者の観察によってサンプルの中央値として推定された。細胞頻度を、比率スコアの５つのカテゴリー：１（０〜５％）、２（６〜２５％）、３（２６〜５０％）、４（５１〜７５％）および５（７６〜１００％）で順序を付けた。
腫瘍の場合、Ａｌｌｒｅｄスコア（ＡＳ）から世界的な発現スコアを適応した（Ｍｏｈｓｉｎ Ｓ、Ｗｅｉｓｓ Ｈ、Ｈａｖｉｇｈｕｒｓｔ Ｔ、Ｃｌａｒｋ ＧＭ、Ｂｅｒａｒｄｏ Ｍ、Ｒｏａｎｈ ＬＤら、Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ．Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．２００４；１７：１５４５〜１５５４）。このＡＳは、強度スコアと比率スコアとを加えて０〜９の範囲の総スコアを得ることにより得られた。ＡＳを最大の世界的なスコアのパーセントとして報告し、５つのカテゴリー：極めて低い（０〜２５％）、弱い（２６〜５０％）、中程度（５１〜７５％）、および高い（７６〜１００％）に分類した。罹患率を、指標に関して陽性のケースのパーセントと定義した。
説明的な統計的分析
マイクロソフト・エクセル２００３ソフトウェアを用いて記述統計を計算した。指標ごとに、ケースの数、陽性ケースの数、罹患率、強度スコアの中央値、頻度の中央値、Ａｌｌｒｅｄスコア平均、強度範囲、頻度範囲およびＡｌｌｒｅｄスコア範囲を説明した。
実施例８．１：ＦＦＰＥヒト腫瘍におけるＣＥＡＣＡＭ５タンパク質を免疫組織化学（ＩＨＣ）によって評価するための抗ＣＥＡＣＡＭ５モノクローナル抗体の使用
市販の組織アレイスライド（ＦＦＰＥフォーマット）を使用してヒト腫瘍の大きいパネルを研究した。ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質の発現は腫瘍細胞の膜＋／−細胞質に位置する（図１Ｃ、Ｄ）。より高度に分化した腫瘍の細胞の頂極で、一部の膜染色は極性化していた。ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質が、以下で発現されることが見出された：
・ 結腸腺癌のケースの８９％（１９４／２１９、強度２〜２．５＋、頻度５３〜５９％、ＡＳ６０〜６６％）
・ 胃腺癌のケースの４９％（９５／１９５、強度２．５＋、頻度５３％、ＡＳ６２％）
・ 肺腺癌のケースの４１％（２４／５８、強度１．８〜２＋、頻度５０〜５３％、ＡＳ５４〜５８％）
・ 子宮癌、子宮頸癌、扁平上皮癌のケースの７９％（１１／１４、強度２＋、頻度２２％、ＡＳ４６％）
・ 膵臓腺癌のケースの５３％（１８／３４、強度２＋、頻度２３％、ＡＳ４２％）
・ 食道扁平上皮癌のケースの３７％（２３／６２、強度２＋、頻度１６％、ＡＳ３８％）
・ 卵巣癌腫のケースの４％（３／７７、強度２＋、頻度４３％、ＡＳ５４％）
・ 甲状腺癌腫のケースの１１％（２／１８、強度１．５＋、頻度６３％、ＡＳ５６％）
・ 膀胱癌腫のケースの２５％（５／２０、強度１．５＋、頻度６１％、ＡＳ５６％）
・ 子宮内膜腺癌のケースの７％（１／１４、強度２＋、頻度５０％、ＡＳ５６％）
・ 乳管癌のケースの１１％（２／１８、強度１．５＋、頻度５３％、ＡＳ５０％）
・ 胆管癌のケースの５３％（２／６、強度１．５＋、頻度７５％、ＡＳ５０％）
・ 肺扁平上皮癌のケースの５３％（３１／１４８、強度１．５＋、頻度２２％、ＡＳ３９％）
・ 前立腺腺癌のケースの８％（１／１３、強度２＋、頻度５０％、ＡＳ４４％）
・ 皮膚扁平上皮癌のケースの２５％（２／８、強度１．５＋、頻度２３％、ＡＳ３９％）。
実施例８．２：カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）における抗ＣＥＡＣＡＭ５モノクローナル抗体の組織交差反応性およびヒト発現パターンとの比較
ヒト（ｈ）またはカニクイザル（ｃ）由来ＣＥＡＣＡＭ５の細胞外タンパク質ドメインを、ＣＥＡＣＡＭ５のｃＤＮＡプラスミドを用いたヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞での一過性発現により製造した（実施例１、表１）。細胞ペレットを１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）中で１６時間固定し、標準的な組織学的な手法に従って組織断片としてパラフィンに包埋させた。
ヒトおよびサル正常組織源として市販のＴＭＡを使用した（表２１）。
Ｍａｂ２の交差反応性は、ヒトおよびサルＣＥＡＣＡＭ５でトランスフェクトした細胞の両方における免疫染色（膜および細胞質への局在化）によって示された。
カニクイザル正常組織において、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質発現は、柱状の吸収上皮細胞で見出された（３のうち２が陽性のケース、中央値強度１．５＋、平均頻度５５％）。
ヒト非腫瘍組織において、ＣＥＡＣＡＭ５発現も、柱状の吸収上皮細胞で観察された（６４のうち６２が陽性ケース、中央値強度２＋、平均頻度９０％）。ヒト組織において、ＣＥＡＣＡＭ５発現は、食道上皮細胞、頭頸部上皮細胞、胃小窩上皮細胞および子宮頸部上皮細胞において、より低い程度で観察された。
〔実施例９〕
抗体薬物コンジュゲート（バリアント）
抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｈｕＭＡｂ２−３−スルホＳＰＤＢ−ＤＭ４
分析データ：
ＭＷ（Ａｂ）＝１４７４１７ｇ／ｍｏｌ；ＭＷ（ＤＭ４）＝７８０．３８ｇ／ｍｏｌ
ε２８０ｎｍ（Ａｂ）＝２０１４００；ε２５２ｎｍ（Ａｂ）＝７１４５１
ε２８０ｎｍ（ＤＭ４）＝５１８０；ε２５２ｎｍ（ＤＭ４）＝２６１５９。
室温で撹拌しながら、抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｈｕＭＡｂ２−３の溶液（Ｃ＝５．３２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液中）７．０ｍｌ、続いてＤＭＡ １．６ｍｌおよびニトロ−スルホＳＰＤＢリンカー（ＷＯ２００９１３４９７７で説明されている）の溶液（１０当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）１６８．４μｌを容器に入れた。溶液を室温で３時間ゆっくり撹拌した。追加量のニトロ−スルホＳＰＤＢリンカー溶液（２．０当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）３．４μｌを添加した。室温で２時間後、磁気撹拌下で、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液２．９０ｍｌ、ＤＭＡ ０．４０７ｍｌおよびＤＭ４溶液（ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．３２２ｍｌを連続的に添加した。室温で１時間および５℃で１６時間後、１ＣＶの１ＭのＮａＯＨ、２ＣＶの水および２ＣＶのヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース（５％）、ｐＨ＝５．５の緩衝液で予め調整したＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（セファデックスＧ２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、未精製の反応混合物を精製した。コンジュゲートをヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース（５％）、ｐＨ＝５．５の緩衝液で溶出させ、モノマーのコンジュゲート画分をプールし、０．２２μｍフィルターで濾過した。
このようにして抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｈｕＭＡｂ２−３−スルホＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲート（ｃ＝１．５１ｍｇ／ｍｌ）１９ｍｌを無色透明な溶液として得た。次いでコンジュゲートを最終的な薬物含有量およびモノマーの純度に関して分析した：ＤＡＲ（ＵＶ）＝３．４；ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝３．３；モノマーの純度＝９９．８％；ＨＲＭＳデータ：図２０を参照されたい。
抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１
分析データ：
ＭＷ（Ａｂ）＝１４７４１７ｇ／ｍｏｌ；ＭＷ（ＤＭ１）＝７３８ｇ／ｍｏｌ
ε２８０ｎｍ（Ａｂ）＝２０１４００；ε２５２ｎｍ（Ａｂ）＝７１４５１
ε２８０ｎｍ（ＤＭ１）＝５１８０；ε２５２ｎｍ（ＤＭ１）＝２６１５９。
室温で撹拌しながら、抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｈｕＭＡｂ２−３の溶液（Ｃ＝３．４７ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝６．５の緩衝液Ａ中）１１．３ｍｌ、続いてＤＭＡ ０．３８７ｍｌおよびＳＭＣＣリンカー溶液（１０当量−ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）１７８μｌを容器に入れた。溶液をゆっくり室温で２時間撹拌した。２ＣＶのＮａＯＨ０．２Ｍ、５ＣＶの水および５ＣＶのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で予め調整したＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（セファデックスＧ２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で未精製の反応混合物の緩衝液を交換した。コンジュゲートをクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で溶出させ、モノマーのコンジュゲート画分をプールし、０．２２μｍフィルターで濾過した。この溶液に、室温で撹拌しながら、ＤＭＡ ０．４７６ｍｌおよびＤＭ１溶液（ＤＭＡ中１５ｍＭの溶液）０．１２４ｍｌを連続的に添加した。室温で２時間後、未精製の反応混合物を、２ＣＶの０．２ＭのＮａＯＨ、５ＣＶの水および５ＣＶのヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース（５％）、ｐＨ＝５．５の緩衝液で予め調整したＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（セファデックスＧ２５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２回精製した。コンジュゲートをヒスチジン（１０ｍＭ）、グリシン（１３０ｍＭ）、スクロース（５％）、ｐＨ＝５．５の緩衝液で溶出させ、モノマーのコンジュゲート画分をプールし、０．２２μｍフィルターで濾過した。
このようにして抗ＣＥＡＣＡＭ５ ｈｕＭＡｂ２−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（ｃ＝１．７３ｍｇ／ｍｌ）９．５ｍｌを無色透明な溶液として得た。次いでコンジュゲートを最終的な薬物含有量およびモノマーの純度に関して分析した：ＤＡＲ（ＵＶ）＝２．７；ＤＡＲ（ＳＥＣ）＝２．９；モノマーの純度＝９９．６％；ＨＲＭＳデータ：図２１を参照されたい。
〔実施例１０〕
水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ ＭＳ）を使用したＭＡｂ２＿ＶＨ１ａＶＬ１ｃ Ｆａｂと複合体化したＣＥＡＣＡＭ５−Ａ３Ｂ３のエピトープおよびパラトープの特徴付け実施例１０．１：ＨＤＸ ＭＳの原理
質量分析（ＭＳ）に関連するアミド水素−重水素交換（ＨＤＸ）は、コンフォメーション変化または相互作用に関連するタンパク質領域の同定を可能にする。この技術は、より具体的には、重水素化緩衝液中でインキュベートしてタンパク質分解した後に、遊離の形7態と比較して抗体に結合した形態で取り込まれた重水素の減少を示す抗原の領域を同定することを可能にする。
エピトープは、これらの領域に属しており、その変換は、抗体への結合によって低下する。近年の論文では、この手法を使用してエピトープを特徴付ける様々な工程が詳細に説明されている（Ｚｈａｎｇ，Ｑ．、Ｗｉｌｌｉｓｏｎ，Ｌ．Ｎ．、Ｔｒｉｐａｔｈｉ，Ｐ．、Ｓａｔｈｅ，Ｓ．Ｋ．、Ｒｏｕｘ，Ｋ．Ｈ．、Ｅｍｍｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．、Ｂｌａｋｎｅｙ，Ｇ．Ｔ．、Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｍ．およびＭａｒｓｈａｌｌ，Ａ．Ｇ．（２０１１）．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８３、７１２９〜７１３６）。
実施例１０．２：材料
ＭＡｂ２＿ＶＨ１ａＶＬ１ｃの可変ドメインのコード配列（配列番号５および配列番号２９）を、それぞれ（パパインで切断したＩｇＧ１から得られたＦａｂで見出されるように）ヒトＣＨ１ドメインのコード配列、それに続いて６−ヒスチジンタグと融合させて、またはヒトＣカッパ定常ドメインと融合させて哺乳動物の発現ベクターにクローニングした。懸濁培養したＨＥＫ２９３−ＦＳ（商標）細胞中でＭＡｂ２＿ＶＨ１ａＶＬ１ｃのＦａｂのバッチを、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合体化した２つの鎖をコードする２つの発現プラスミドの一過性トランスフェクションによって産生した。トランスフェクションから７日後に、分泌されたタンパク質を含有する培養上清を回収し、遠心分離し、０．２２μｍの膜で濾過した。Ｆａｂを、ＰＢＳ中のイミダゾール勾配を使用したＩＭＡＣ（ＨｉｓＴｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。次いで、Ｆａｂを含有する画分のプールをＰＢＳで平衡化したサイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
Ｈｉｓ−タグを有するｈＣＥＡＣＡＭ５−Ａ３Ｂ３ドメイン（配列番号６７）を、発現プラスミドの一過性トランスフェクションによりフラスコで培養されたＨＥＫ２９３−ＦＳ（商標）細胞を用いて産生した。キフネンシン（Ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ）（トリミンググリコシル化（ｔｒｉｍｍｉｎｇ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）プロセスの阻害剤）を毎日添加した。トランスフェクションから７日後に、分泌されたタンパク質を含有する培養上清を回収し、遠心分離し、０．２２μｍの膜で濾過した。上清にＥｎｄｏＨを６２５ｕ／ｍｌまで添加し、次いで３７℃で３時間インキュベートした。脱グリコシル化したｈＣＥＡＣＡＭ５−Ａ３Ｂ３を、ＰＢＳ中のイミダゾール勾配を使用したＩＭＡＣ（ＨｉｓＴｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのアフィニティークロマトグラフィーで精製した。次いで、脱グリコシル化したｈＣＥＡＣＡＭ５−Ａ３Ｂ３を含有する画分のプールを、ＰＢＳで平衡化したサイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。脱グリコシル化したｈＣＥＡＣＡＭ５−Ａ３Ｂ３の質量分析から２つの種（２２４８５および２２２７８Ｄａ）が示され、これは、タンパク質が７または８つのＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）を有することを示す。
複合体を組み立てるために、両方のタンパク質を、１モルのＦａｂ当たり過量の１．５モルの脱グリコシル化したｈＣＥＡＣＡＭ５−Ａ３Ｂ３と共にプールした。リン酸緩衝生理食塩水で平衡化したスーパーデックス２００でのサイズ排除クロマトグラフィーによってこの過量分を除去した。抗原とのＦａｂ複合体に対応する画分を重水素交換研究に使用した。
実施例１０．３：方法
ＰＡＬオートサンプラー（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）を使用して水素／重水素交換（ＨＤＸ）実験を完全に自動化した。それにより、変換の開始とクエンチ、タンパク質分解温度の制御（４℃）、重水素化ペプチドの注入、注入および洗浄バルブの管理、ならびに質量分析計およびＨＰＬＣポンプのトリガリング獲得（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）が可能になった。ペルティエ冷却されたボックス（４℃）は、２つのＲｈｅｏｄｙｎｅ自動バルブ（注入用の６つのポートおよび洗浄用の１０のポート）、脱塩カートリッジ（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｍｉｃｈｒｏｍ製のペプチドマイクロトラップ）およびＨＰＬＣカラム（Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ−Ｃ１８、１×５０ｍｍ、２．７μＭ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を有していた。Ｄ２Ｏ中のＰＢＳを用いたＣＥＡＣＡＭ５、ｍＡｂまたは複合体の５倍希釈液によって重水素化を開始させた。２ＭのＧｎｄＨＣｌ、０．８ＭのＴＣＥＰ、１Ｍのグリシンを使用して逆交換をクエンチし、４℃で２分かけてジスルフィド架橋を還元した。
ペプシンおよびネペンテシン（ｎｅｐｅｎｔｈｅｓｉｎ）プロテアーゼを用いてタンパク質を消化し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＨＰＬＣポンプで１００μＬ／分の０．０３％のＴＦＡ水溶液を使用してペプチドを脱塩した。次いで、別のＡｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＨＰＬＣポンプを使用して、２０分かけてＢが１５〜１００％の勾配で（Ａ：０．０３％のＴＦＡ水溶液；Ｂ：アセトニトリル９０％、０．０３％のＴＦＡ水溶液）ペプチドを分離した。エレクトロスプレー−ＴＯＦ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ ６２１０）を使用してペプチドの質量を測定した。
Ｂｒｕｋｅｒ ＡＰＥＸ−Ｑ ＦＴＭＳ（９．４Ｔ）およびＢｒｕｋｅｒ１２Ｔ ＳｏｌａｒｉＸを使用したタンデムＭＳ（ＭＳＭＳ）によってペプチドを同定した。
データ獲得には、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｒｕｋｅｒ）およびＭａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ソフトウェアを使用した。ＭＳＭＳデータ処理には、Ｄａｔａ ＡｎａｌｙｓｉｓおよびＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。ＨＤＸデータ処理には、Ｍａｓｓ ＨｕｎｔｅｒおよびＨＤ Ｅｘａｍｉｎｅｒ（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）ソフトウェアを使用した。
ＨＤＸ実験を少なくとも３回繰り返した。
実施例１０．４：結果
ペプチドの同定および選択
重水素化中、ジスルフィド架橋を無傷のままに保持することにより、それらに関する構造的な情報を維持した。タンパク質分解およびペプチド同定に適するように、低いｐＨおよび低温でのクエンチ工程の後、ＴＣＥＰで架橋を還元した。ＣＥＡＣＡＭ５−Ｆａｂ複合体消化後にＭＳＭＳを使用して、３つのタンパク質鎖から生じた多数のペプチドを同定することができた。ＨＤＸ実験後、優れた品質のシグナルを示したものだけを選択した：ＣＥＡＣＡＭ５−Ａ３−Ｂ３抗原、ＭＡｂ２＿ＶＨ１ａＶＬ１ｃ Ｆａｂの重鎖およびＭＡｂ２＿ＶＨ１ａＶＬ１ｃ軽鎖からそれぞれ２５、３０および２０種のペプチドを選択した。これらのペプチドは、ＣＥＡＣＡＭ５−Ａ３−Ｂ３抗原、ＭＡｂ２＿ＶＨ１ａＶＬ１ｃ Ｆａｂの重鎖およびＭＡｂ２＿ＶＨ１ａＶＬ１ｃの軽鎖配列それぞれの８９％、７７％および６８％に当たる（表２５）。それ以外のＦａｂ鎖の領域は、主としてそれらのＣ末端部分にある。
グリコシル化の可能性のある部位である８つのアスパラギン残基全てが、内部Ｈ（ｅｎｄｏ Ｈ）の脱グリコシル化から残ったＧｌｃＮＡｃを有する数種のペプチド内で同定された。特にＮ１１４が、ペプチド１０８〜１１５に見出された。第一の実験では（ＨＤＸに使用せず）、Ｎ１６６が両方の形態（ＧｌｃＮＡｃ含有および非含有）で見出された。これは、７および８個のＧｌｃＮＡｃに相当する、脱グリコシル化後にＣＥＡＣＡＭ５−Ａ３Ｂ３の質量スペクトルで観察された不均質性の説明になる可能性がある。
エピトープおよびパラトープ同定
遊離の抗原、遊離のＦａｂおよびそれらの複合体を、４℃で２分または２０分、または室温（２６℃）で２０分で重水素化した。アミドの水素と温度との変換速度論を考慮すると（１０℃で変換は約３倍増加する）、最終的な条件は、４℃で２００分の重水素化に等しい。
エピトープ
ＣＥＡＣＡＭ５−Ａ３Ｂ３の２５種の選択されたペプチドに関する重水素取り込みの速度論を、抗原が遊離の形態で重水素化された場合と、Ｆａｂとの複合体の形態で重水素化された場合とで比較した。いくつかのペプチドは、両方の状況間で有意なＨＤＸ差（ΔＨＤＸ）をまったく示さなかった。対照的に、それらのうちいくつか（１０８〜１１５および１２８〜１４３）は、有意なΔＨＤＸを示した。第二の領域は、５種の異なるペプチド：１２８〜１４２、１２８〜１４３、１３０〜１４２、１３０〜１４３および１４０〜１４３で占められ、２分の重水素化後に、１３〜１５±２％（１．６±０．２Ｄまで）のΔＨＤＸを示した。
１２８〜１４２と１３０〜１４２とを比較し、１２８〜１４３と１３０〜１４３とを比較したところ、本発明者らは、それぞれのケースにおいて有意なΔＨＤＸ変化をまったく測定せず（２分の重水素化後、第一の２種のペプチドについては１．３〜１．４Ｄであり、最後の２つのペプチドについては１．６であった）、これは、アミドＷ１２９およびＲ１３０はエピトープに関与しない可能性があることを意味する。対照的に、１２８〜１４２と１２８〜１４３とを比較し、１３０〜１４２と１３０〜１４３とを比較したところ、本発明者らは小さいΔＨＤＸ変化（約０．２Ｄ）を測定し、これは、アミドＦ１４３が関与していることを意味する。ペプチド１４０〜１４３におけるΔＨＤＸ（約０．３Ｄ）は、アミドＶ１４１またはＬ１４２も関与していることを示す。Ｉ１３１からＱ１４０の９種のアミドにおいて、それらのうちいくつかはエピトープに関与する（共通して平均約１のΔＨＤＸ）。
これらの重水素取り込みの差は、エピトープが特に領域（アミド）、すなわち配列ＳＧＡＮＬＮＬ（配列番号７６）およびＩＮＧＩＰＱＱＨＴＱＶＬＦ（配列番号７７）のペプチドに属することを示す。
パラトープ
Ｆａｂの重鎖の３０種の選択されたペプチドに関する重水素取り込みの速度論を、Ｆａｂが遊離の形態で重水素化された場合と、抗原との複合体の形態で重水素化された場合とで比較した。ほとんど全てのペプチドが、両方の状況間で有意なΔＨＤＸをまったく示さなかった。ペプチド（１００〜１０９）のみが２００分の重水素化後にΔＨＤＸを示した：１１±２％（０．７±０．２Ｄ）。ＭＡｂ２＿ＶＨ１ａＶＬ１ｃ Ｆａｂの重鎖の領域（アミド）１０１〜１０９は、パラトープに関与する。
Ｆａｂ軽鎖の２０種の選択されたペプチドに関する重水素取り込みの速度論を、Ｆａｂが遊離の形態で重水素化された場合と、抗原との複合体の形態で重水素化された場合とで比較した。ほとんど全てペプチドが、両方の状況間で有意なΔＨＤＸをまったく示さなかった。２種のペプチド（４７〜５４および８７〜１０４）のみが差を示した。２０分の重水素化後、それぞれ第一のペプチドについては、ΔＨＤＸは１０±２％（０．６±０．２Ｄ）であり、第二のペプチドについては５±２％（０．９±０．２Ｄ）であった。ＭＡｂ２＿ＶＨ１ａＶＬ１ｃの軽鎖の領域４８〜５４および８８〜１０４は、パラトープに関与する。

Claims (35)

  1. ａ）ヒトおよびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のＡ３−Ｂ３ドメインに結合し；
    ｂ）ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ６、ヒトＣＥＡＣＡＭ７、ヒトＣＥＡＣＡＭ８、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ１、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６、およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ８と有意に交差反応しない、
    単離された抗体。
  2. ａ）配列番号３１の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３２の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；
    ｂ）配列番号３３の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３４の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；
    ｃ）位置５２のＫがＲにより置き換えられた、配列番号３３の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３４の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；
    ｄ）配列番号３５の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３６の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；
    ｅ）配列番号３７の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３８の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体；ならびに
    ｆ）配列番号３９の配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号４０の配列の軽鎖の可変ドメインを含む抗体
    からなる群から選択される抗体の可変重鎖および軽鎖を含む抗体である、請求項１に記載の抗体。
  3. ａ）１２以下である、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に対する親和性と、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ５に対する親和性との比で；または
    ｂ）１０ｎＭ以下である、ヒトＣＥＡＣＡＭ５および／もしくはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５に対する親和性で、または
    ｃ）ａとｂの両方で、
    ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５のＡ３−Ｂ３ドメインに結合する、請求項１または２に記載の抗体。
  4. それぞれ、配列番号７６および配列番号７７の配列を含むヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のＡ３−Ｂ３ドメインの２つの領域に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
  5. ａ）配列ＧＦＸ1ＦＳＳＹＤ（配列番号７８）（式中、Ｘ1はＴ、ＡもしくはＶである）からなるＣＤＲ１−Ｈ；および
    配列ＩＸ1ＳＸ2ＧＧＸ3Ｔ（配列番号７９）（式中、Ｘ1はＳもしくはＮであり、Ｘ2はＹもしくはＧであり、Ｘ3はＲもしくはＩである）からなるＣＤＲ２−Ｈ；および
    配列Ｘ1ＡＨＹＦＧＸ2ＳＧＰＦＡＹ（配列番号８０）（式中、Ｘ1はＡもしくはＴであり、Ｘ2はＴもしくはＳである）からなるＣＤＲ３−Ｈ；ならびに
    ｂ）配列ＥＮＩＦＳＹ（配列番号１０）もしくはＥＮＩＹＳＹ（配列番号２２）からなるＣＤＲ１−Ｌ；および
    配列ＮＸ1Ｘ2（式中、Ｘ1はＡもしくはＴであり、Ｘ2はＫもしくはＲである）からなるＣＤＲ２−Ｌ；および
    配列ＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号１２）もしくはＱＨＨＹＧＩＰＦＴ（配列番号２４）からなるＣＤＲ３−Ｌ、
    を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
  6. ａ）配列ＧＦＴＦＳＸ1ＹＸ2（配列番号８１）（式中、Ｘ1はＲもしくはＳであり、Ｘ2はＡもしくはＤである）からなるＣＤＲ１−Ｈ；および
    配列ＩＳＳＧＧＸ1Ｘ2Ｘ3（配列番号８２）（式中、Ｘ1は存在しないか、ＳもしくはＧであり、Ｘ2はＤ、ＹもしくはＩであり、Ｘ3はＴもしくはＩである）からなるＣＤＲ２−Ｈ；および
    配列ＡＲＰＡＹＹＧＮＰＡＭＤＹ（配列番号３）もしくはＡＲＶＮＹＹＤＳＳＦＬＤＷ（配列番号１５）からなるＣＤＲ３−Ｈ；ならびに
    ｂ）配列ＱＮＶＧＴＮ（配列番号４）からなるＣＤＲ１−Ｌ；および
    配列ＳＡＳからなるＣＤＲ２−Ｌ；および
    配列ＱＱＹＮＳＹＰＬＹＴ（配列番号６）もしくはＱＱＹＮＮＹＰＬＹＴ（配列番号１８）からなるＣＤＲ３−Ｌ、
    を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
  7. ａ）配列番号３１の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３２の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
    ｂ）配列番号３３の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３４の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
    ｃ）配列番号３５の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３６の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
    ｄ）配列番号３７の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号３８の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン；または
    ｅ）配列番号３９の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の重鎖の可変ドメインおよび配列番号４０の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列の軽鎖の可変ドメイン
    を含む、請求項５または６に記載の抗体。
  8. キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
  9. ａ）配列番号４１の配列の重鎖および配列番号４２の配列の軽鎖；または
    ｂ）配列番号４３の配列の重鎖および配列番号４４の配列の軽鎖；または
    ｃ）配列番号４５の配列の重鎖および配列番号４６の配列の軽鎖；または
    ｄ）配列番号４７の配列の重鎖および配列番号４８の配列の軽鎖；または
    ｅ）配列番号４９の配列の重鎖および配列番号５０の配列の軽鎖
    を含む抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
  10. ａ）配列番号５１、配列番号５、もしくは配列番号７４の配列の重鎖；および
    ｂ）配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号５５、もしくは配列番号７５の配列の軽鎖
    を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
  11. ａ）配列番号５１の配列の重鎖および配列番号１７の配列の軽鎖；または
    ｂ）配列番号５の配列の重鎖および配列番号２３の配列の軽鎖；または
    ｃ）配列番号５の配列の重鎖および配列番号２９の配列の軽鎖；または
    ｄ）配列番号５１の配列の重鎖および配列番号５５の配列の軽鎖；または
    ｅ）配列番号７４の配列の重鎖および配列番号７５の配列の軽鎖
    を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
  12. ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ５タンパク質のＡ３−Ｂ３ドメインに結合し、
    ａ）配列番号８７の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列からなる重鎖であって；配列ＧＦＸ 1 ＦＳＳＹＤ（配列番号７８）（式中、Ｘ 1 はＴ、ＡもしくはＶである）からなるＣＤＲ１−Ｈ；配列ＩＸ 1 ＳＸ 2 ＧＧＸ 3 Ｔ（配列番号７９）（式中、Ｘ 1 はＳもしくはＮであり、Ｘ 2 はＹもしくはＧであり、Ｘ 3 はＲもしくはＩである）からなるＣＤＲ２−Ｈ；および配列Ｘ 1 ＡＨＹＦＧＸ 2 ＳＧＰＦＡＹ（配列番号８０）（式中、Ｘ 1 はＡもしくはＴであり、Ｘ 2 はＴもしくはＳである）からなるＣＤＲ３−Ｈを含む、上記重鎖；
    ならびに
    ｂ）配列番号８８の配列もしくはそれと少なくとも８５％同一である配列からなる軽鎖であって；配列ＥＮＩＦＳＹ（配列番号１０）もしくはＥＮＩＹＳＹ（配列番号２２）からなるＣＤＲ１−Ｌ；配列ＮＸ 1 Ｘ 2 （式中、Ｘ 1 はＡもしくはＴであり、Ｘ 2 はＫもしくはＲである）からなるＣＤＲ２−Ｌ；および配列ＱＨＨＹＧＴＰＦＴ（配列番号１２）もしくはＱＨＨＹＧＩＰＦＴ（配列番号２４）からなるＣＤＲ３−Ｌを含む、上記軽鎖；
    を含む、単離された抗体。
  13. 抗体断片である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
  14. 単一ドメイン抗体の可変重鎖（ＶＨＨ）である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
  15. 二重特異的または多重特異的抗体である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
  16. Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、およびダイアボディからなる群から選択される断片である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体。
  17. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体をコードする配列を含む単離された核酸。
  18. 請求項１７に記載の核酸により形質転換された宿主細胞。
  19. 少なくとも１つの増殖阻害剤にコンジュゲートまたは連結された請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体を含むイムノコンジュゲート。
  20. 前記増殖阻害剤は細胞傷害剤または放射性同位体である、請求項１９に記載のイムノコンジュゲート。
  21. 前記増殖阻害剤は、化学療法剤、酵素、抗生物質、および低分子毒素または酵素活性毒素のような毒素、タキソイド、ビンカ、タキサン、メイタンシノイドまたはメイタンシノイド類似体、トメイマイシンまたはピロロベンゾジアゼピン誘導体、クリプトフィシン誘導体、レプトマイシン誘導体、オーリスタチンまたはドラスタチン類似体、プロドラッグ、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、抗チューブリン剤、ならびにＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５類似体からなる群から選択される、請求項１９または２０に記載のイムノコンジュゲート。
  22. 前記増殖阻害剤は、（Ｎ2'−デアセチル−Ｎ2'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン）（ＤＭ１）またはＮ2'−デアセチル−Ｎ−2'（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、請求項２０または２１に記載のイムノコンジュゲート。
  23. 抗体が切断可能な、または切断不可能なリンカーにより少なくとも１つの増殖阻害剤に共有結合している、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  24. 前記リンカーは、Ｎ−スクシンイミジルピリジルジチオブチレート（ＳＰＤＢ）、４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）−２−スルホ−酪酸（スルホ−ＳＰＤＢ）、およびスクシンイミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）からなる群から選択される、請求項２３に記載のイムノコンジュゲート。
  25. 抗体が配列番号５の配列の重鎖および配列番号２９の配列の軽鎖を含む、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  26. １〜１０の範囲の薬物抗体比（ＤＡＲ）を特徴とする、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
  27. 配列番号７の配列のＣＤＲ１−Ｈ、配列番号８のＣＤＲ２−Ｈ、配列番号９の配列のＣＤＲ３−Ｈ、配列番号１０の配列のＣＤＲ１−Ｌ、ＮＴＲの配列のＣＤＲ２−Ｌ、および配列番号１２のＣＤＲ３−Ｌを含む、請求項１に記載の抗体を含むイムノコンジュゲートであって、ここで、抗体は、Ｎ−スクシンイミジルピリジルジチオブチレート（ＳＰＤＢ）を介しＮ2'−デアセチル−Ｎ−2'（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）に共有結合している、上記イムノコンジュゲート。
  28. 配列番号８７の配列からなる重鎖および配列番号８８の配列からなる軽鎖を含む抗体を含むイムノコンジュゲートであって、前記抗体は、Ｎ−スクシンイミジルピリジルジチオブチレート（ＳＰＤＢ）を介しＮ 2' −デアセチル−Ｎ− 2' （４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）に共有結合している、上記イムノコンジュゲート。
  29. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体、または請求項１９〜２８のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  30. がんの処置のための使用のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体、または請求項１９〜２８のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート、または請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. がんはＣＥＡＣＡＭ５を発現するがんである、請求項３０に記載の使用のための抗体、イムノコンジュゲートまたは医薬組成物。
  32. がんは結腸直腸がん、胃がん、肺がん、子宮頸がん、膵臓がん、食道がん、卵巣がん、甲状腺がん、膀胱がん、子宮内膜がん、乳がん、肝臓がん、前立腺がん、または皮膚がんである、請求項３０または３１に記載の使用のための抗体、イムノコンジュゲートまたは医薬組成物。
  33. 対象の生物試料中のＣＥＡＣＡＭ５発現をｅｘ ｖｉｖｏで検出するための使用のための請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体。
  34. 検出可能な分子または物質で標識される、請求項３３に記載の使用のための抗体。
  35. 前記使用は、対象におけるがんの存在を診断するため、ＣＥＡＣＡＭ５を標的とする治療剤に対する、がんを有する患者の感受性を決定するため、または抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法の有効性をモニタリングするため、または抗ＣＥＡＣＡＭ５がん療法後のがんの再発を検出するためのものである、請求項３３または３４に記載の使用のための抗体。
JP2015542313A 2012-11-20 2013-11-20 抗ｃｅａｃａｍ５抗体およびその使用 Active JP6324399B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12306444.6 2012-11-20
EP12306444 2012-11-20
PCT/EP2013/074291 WO2014079886A1 (en) 2012-11-20 2013-11-20 Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2016506370A JP2016506370A (ja) 2016-03-03
JP6324399B2 true JP6324399B2 (ja) 2018-05-16

Family

ID=47257727

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015542313A Active JP6324399B2 (ja) 2012-11-20 2013-11-20 抗ｃｅａｃａｍ５抗体およびその使用

Country Status (38)

Country Link
US (4) US9617345B2 (ja)
EP (3) EP2922875B1 (ja)
JP (1) JP6324399B2 (ja)
KR (4) KR20240063172A (ja)
CN (2) CN104918958B (ja)
AR (1) AR093557A1 (ja)
AU (2) AU2013349733C1 (ja)
BR (1) BR112015010993B1 (ja)
CA (2) CA3207769A1 (ja)
CL (1) CL2015001321A1 (ja)
CR (1) CR20150258A (ja)
CY (1) CY1119219T1 (ja)
DK (2) DK3199552T3 (ja)
DO (1) DOP2015000110A (ja)
EA (1) EA039377B1 (ja)
EC (1) ECSP15025845A (ja)
ES (2) ES2778823T3 (ja)
HR (2) HRP20170743T1 (ja)
HU (1) HUE033369T2 (ja)
IL (1) IL238559B (ja)
LT (2) LT2922875T (ja)
MA (1) MA38194B1 (ja)
MX (1) MX358321B (ja)
MY (1) MY171100A (ja)
NZ (1) NZ708528A (ja)
PE (1) PE20151180A1 (ja)
PH (1) PH12015501092B1 (ja)
PL (2) PL3199552T3 (ja)
PT (2) PT3199552T (ja)
RS (2) RS60043B1 (ja)
SG (1) SG11201503285TA (ja)
SI (2) SI3199552T1 (ja)
TN (1) TN2015000177A1 (ja)
TW (2) TWI664192B (ja)
UA (1) UA120247C2 (ja)
UY (1) UY35147A (ja)
WO (1) WO2014079886A1 (ja)
ZA (1) ZA201502959B (ja)

Families Citing this family (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE033369T2 (en) 2012-11-20 2017-11-28 Sanofi Sa Anti-CEACAM5 antibodies and their applications
US9753036B2 (en) 2014-04-29 2017-09-05 Edp Biotech Corporation Methods and compositions for screening and detecting biomarkers
JP2017526682A (ja) * 2014-09-02 2017-09-14 イミュノジェン， インコーポレイテッド 抗体薬物複合体組成物の製剤化方法
CA2990755A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffman-La Roche Ag Bispecific anti-ceaxcd3 t cell activating antigen binding molecules
CN108368179B (zh) 2016-01-08 2022-08-23 豪夫迈·罗氏有限公司 使用pd-1轴结合拮抗剂和抗cea/抗cd3双特异性抗体治疗cea阳性癌症的方法
EP3523333B1 (en) * 2016-10-10 2023-12-13 Singapore Health Services Pte Ltd Anti-ceacam6 antibodies and methods of use
WO2018092885A1 (ja) 2016-11-18 2018-05-24 アステラス製薬株式会社 新規な抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント
CN111533805B (zh) * 2016-12-04 2022-02-08 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 一种抗癌胚抗原的高亲和力纳米抗体及其应用
CN108341876B (zh) * 2017-01-22 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗人ceacam5单克隆抗体及其制备方法和应用
CN106946989B (zh) * 2017-03-02 2020-02-18 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 抗cea抗原vhh结构域及含有其的双特异性抗体
TWI795415B (zh) * 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎的抗人類ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段
EP3651792A1 (en) * 2017-07-11 2020-05-20 Pfizer Inc Immunogenic compositions comprising cea muc1 and tert
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
PL3765525T3 (pl) 2018-03-13 2023-12-27 Zymeworks Bc Inc. Koniugaty biparatopowe przeciwciało anty-her2 – lek i sposoby stosowania
US11505610B2 (en) 2018-04-06 2022-11-22 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods comprising anti-NRP2 antibodies
EP3781592A4 (en) * 2018-04-20 2023-01-11 The Regents of the University of California TREATMENT OF PROSTATE CANCER WITH CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS
EP3795590A4 (en) 2018-05-17 2022-05-04 Astellas Pharma Inc. COMPLEX WITH ANTI-HUMAN MUC1 ANTIBODY FAB FRAGMENT, PEPTIDE LINKER AND/OR LIGAND
ES2973518T3 (es) 2018-06-03 2024-06-20 Lamkap Bio Beta Ag Anticuerpos biespecíficos contra CEACAM5 y CD47
TW202519270A (zh) 2018-06-07 2025-05-16 美商思進公司 喜樹鹼結合物
CN110684107B (zh) * 2018-07-06 2021-03-23 中国人民解放军第四军医大学 抗MG7-Ag的单克隆抗体(MGd1)及其用途
CN110684108B (zh) * 2018-07-06 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗MG7-Ag的单克隆抗体(CEA37)及其用途
WO2020047462A2 (en) 2018-08-30 2020-03-05 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
CA3108951A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 HCW Biologics, Inc. Single-chain chimeric polypeptides and uses thereof
US11518792B2 (en) 2018-08-30 2022-12-06 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
CN112839683B (zh) 2018-10-10 2023-11-14 安斯泰来制药株式会社 含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物
CN111487411B (zh) * 2019-01-29 2023-05-09 瑞博奥(广州)生物科技股份有限公司 Ceacam1多肽的新应用
EP3693023A1 (en) 2019-02-11 2020-08-12 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
CN114173823A (zh) * 2019-02-07 2022-03-11 赛诺菲 抗ceacam5免疫缀合物用于治疗肺癌的用途
CA3137464A1 (en) * 2019-04-23 2020-10-29 Sanofi Stable, low-viscosity antibody formulations and uses thereof
CA3142635A1 (en) * 2019-06-04 2020-12-10 Biotheus Inc. Anti-ceacam5 monoclonal antibody and preparation method thereof and use thereof
US11655302B2 (en) 2019-06-10 2023-05-23 Sanofi Anti-CD38 antibodies and formulations
KR20220034784A (ko) 2019-06-13 2022-03-18 볼트 바이오테라퓨틱스 인코퍼레이티드 아미노벤즈아제핀 화합물, 면역접합체, 및 이의 용도
CA3143035A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
CN114531878A (zh) 2019-06-27 2022-05-24 豪夫迈·罗氏有限公司 新颖icos抗体及包含它们的肿瘤靶向抗原结合分子
CA3148694A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Romas Kudirka Aminoquinoline compounds, immunoconjugates, and uses thereof
PE20221045A1 (es) 2019-09-18 2022-06-22 Lamkap Bio Alpha AG Anticuerpos biespecificos contra ceacam5 y cd3
AU2020359446A1 (en) 2019-09-30 2022-04-21 Bolt Biotherapeutics, Inc. Amide-linked, aminobenzazepine immunoconjugates, and uses thereof
AU2020358854A1 (en) 2019-10-03 2022-05-26 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods comprising anti-NRP2 antibodies
KR20220088901A (ko) 2019-10-25 2022-06-28 볼트 바이오테라퓨틱스 인코퍼레이티드 티에노아제핀 면역접합체, 및 이의 용도
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
CN115380045A (zh) 2020-02-11 2022-11-22 Hcw生物科技公司 激活调节性t细胞的方法
AU2021219720B2 (en) 2020-02-11 2025-10-02 Immunitybio, Inc. Chromatography resin and uses thereof
CA3169231A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 HCW Biologics, Inc. Methods of treating age-related and inflammatory diseases
CN115427083A (zh) * 2020-04-24 2022-12-02 赛诺菲 含有抗ceacam5抗体缀合物和西妥昔单抗的抗肿瘤组合
TW202206109A (zh) * 2020-04-24 2022-02-16 法商賽諾菲公司 含有抗ｃｅａｃａｍ５抗體接合物與ｆｏｌｆｉｒｉ之抗腫瘤組合
BR112022020592A2 (pt) * 2020-04-24 2022-11-29 Sanofi Sa Combinações antitumor contendo conjugados de anticorpo anti-ceacam5, trifluridina e tipiracila
CA3181005A1 (en) * 2020-04-24 2021-10-28 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates and folfox
EP4143231A1 (en) 2020-04-29 2023-03-08 HCW Biologics, Inc. Anti-cd26 proteins and uses thereof
EP4146282A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 Bolt Biotherapeutics, Inc. Elastase-substrate, peptide linker immunoconjugates, and uses thereof
WO2021247003A1 (en) 2020-06-01 2021-12-09 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
IL298608A (en) 2020-06-01 2023-01-01 Hcw Biologics Inc Methods of treating aging-related disorders
US12024545B2 (en) 2020-06-01 2024-07-02 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
CN111690061B (zh) * 2020-06-28 2022-08-23 中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心 人源化抗鼠疫耶尔森菌抗原f1的抗体及应用
CN113105548B (zh) * 2020-08-04 2022-03-29 中山大学附属第五医院 抗ceacam5纳米抗体
EP4196168A1 (en) 2020-08-13 2023-06-21 Bolt Biotherapeutics, Inc. Pyrazoloazepine immunoconjugates, and uses thereof
MX2023002017A (es) 2020-08-20 2023-04-28 A2 Biotherapeutics Inc Composiciones y métodos para tratar cánceres positivos para ceacam.
WO2022040454A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating mesothelin positive cancers
BR112023001733A2 (pt) * 2020-09-04 2023-03-28 Merck Patent Gmbh Anticorpos anti-ceacam5 e conjugados e usos dos mesmos
AU2021379882A1 (en) * 2020-11-10 2023-06-29 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugate formulation
WO2022116079A1 (zh) * 2020-12-03 2022-06-09 上海吉倍生物技术有限公司 一种抗ceacam5的人源化抗体及其制备方法和用途
US20240238430A1 (en) 2020-12-11 2024-07-18 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-cea immunoconjugates, and uses thereof
US20220195066A1 (en) 2020-12-11 2022-06-23 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-cea immunoconjugates, and uses thereof
CN117083525A (zh) 2020-12-21 2023-11-17 福瑞诺姆控股公司 用于结肠细胞增殖性病症的早期检测的标志物
CN112521509B (zh) * 2020-12-23 2022-07-08 姚雪英 一种抗ceacam5人源化抗体、其缀合物及其用途
EP4305069A4 (en) * 2021-03-08 2025-01-01 University of Pittsburgh - of the Commonwealth System of Higher Education MOLECULES THAT BIND TO CD66E POLYPEPTIDES
EP4313162A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 Bolt Biotherapeutics, Inc. 2-amino-4-carboxamide-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
CA3212907A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Gary Brandt 2-amino-4-carboxamide-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
WO2022242681A1 (en) * 2021-05-21 2022-11-24 Beigene, Ltd. Anti-cea antibodies and methods of use
KR20240082398A (ko) 2021-10-07 2024-06-10 사노피 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 화합물 및 이의 접합체, 이들의 제조 및 이들의 치료 응용
WO2023079057A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates and anti-vegfr-2 antibodies
US20250251400A1 (en) * 2021-11-05 2025-08-07 American Diagnostics & Therapy, Llc (Adxrx) Monoclonal Antibodies Against Carcinoembryonic Antigens, and Their Uses
KR20240112348A (ko) 2021-12-02 2024-07-18 사노피 암 치료법에서 환자 선택을 위한 cea 검정
IL313223A (en) 2021-12-02 2024-07-01 Sanofi Sa Combined treatment for CEACAM5 ADC - anti-PD1/PD-L1
US20250188170A1 (en) * 2022-02-25 2025-06-12 Atyr Pharma, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING ANTI-NRP2b ANTIBODIES
AU2023228683B2 (en) 2022-03-02 2025-12-04 Immunitybio, Inc. Method of treating pancreatic cancer
IL315549A (en) * 2022-03-09 2024-11-01 Merck Patent Gmbh Anti-ceacam5 antibodies and conjugates and uses thereof
CN119233830A (zh) 2022-03-23 2024-12-31 新锐生物技术公司 用于靶向表达癌胚抗原的肿瘤的抗体缀合物
CA3263798A1 (en) 2022-08-10 2024-02-15 Dragonfly Therapeutics Inc NKG2D, CD16 AND CEACAM5 BINDING PROTEINS
WO2024140905A1 (en) * 2022-12-28 2024-07-04 Full-Life Technologies Hk Limited Antibodies specifically binding to ceacam5
AU2024228735A1 (en) 2023-03-01 2025-10-16 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating neuroendocrine cancers expressing ceacam5
EP4427763A1 (en) 2023-03-06 2024-09-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates, anti-vegfr-2 antibodies and anti-pd1/pd-l1 antibodies
CN117545780A (zh) * 2023-05-16 2024-02-09 成都优洛生物科技有限公司 抗lilrb1纳米抗体或其抗原结合片段、制备方法和用途
WO2024251733A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates, anti-pd1/pd-l1 antibodies and anti-ctla4 antibodies
WO2024250924A1 (en) * 2023-06-05 2024-12-12 Nona Biosciences (Suzhou) Co., Ltd. Anti-ceacam5/6 dual-binding antibodies
WO2025031923A1 (en) 2023-08-04 2025-02-13 Sanofi Imidazo[4,5-d]pyridazine compounds and conjugates thereof, their preparation, and their therapeutic applications
TW202528350A (zh) * 2023-11-10 2025-07-16 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 抗ｄｒ５和ｃｅａｃａｍ５的雙特異性抗體及其用途
US20250230168A1 (en) 2023-12-22 2025-07-17 Gilead Sciences, Inc. Azaspiro wrn inhibitors
WO2025169012A1 (en) 2024-02-06 2025-08-14 Sanofi Methods of treating ceacam5-expressing cancers
WO2025184208A1 (en) * 2024-02-27 2025-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US417A (en) 1837-09-28 Endless-ghain horse-power for driving iviaci-iii
US192A (en) 1837-05-15 Machine for cutting
US4496A (en) 1846-05-02 Machinery for
US4640A (en) 1846-07-14 Book-lock
US4670A (en) 1846-07-28 Improvement in fish-hooks
US4301A (en) 1845-12-11 Ebenezbr barrows
US835A (en) 1838-07-12 X i i i x
US5204A (en) 1847-07-24 james cantelo
US689A (en) 1838-04-13 Julius austin
US144A (en) 1837-03-11 Improvement in scythe-snaths
US4791A (en) 1846-10-03 john g
US244A (en) 1837-06-30 Edward flint
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
JPS63501765A (ja) 1985-11-01 1988-07-21 インタ−ナショナル、ジェネティック、エンジニアリング　インコ−ポレ−テッド 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途
JPS63502716A (ja) 1986-03-07 1988-10-13 マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー 糖タンパク安定性の強化方法
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5278056A (en) 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5215534A (en) 1991-12-02 1993-06-01 Lawrence De Harde Safety syringe system
CA2076465C (en) 1992-03-25 2002-11-26 Ravi V. J. Chari Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
RU2139731C1 (ru) 1992-11-13 1999-10-20 Айдек Фармасьютикалс Корпорейшн (US Способ лечения, антитела, гибридома
ATE341638T1 (de) 1993-02-22 2006-10-15 Univ Rockefeller Herstellung von helfer-freien retroviren mit hohem titer mittels transienter transfektion
FR2712812B1 (fr) 1993-11-23 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo.
US5994524A (en) 1994-07-13 1999-11-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polynucleotides which encode reshaped IL-8-specific antibodies and methods to produce the same
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
JP3946256B2 (ja) 1995-09-11 2007-07-18 協和醗酵工業株式会社 ヒトインターロイキン５受容体α鎖に対する抗体
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
EP0971952A2 (en) 1997-04-10 2000-01-19 Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences Diagnosis method and reagents
US6629949B1 (en) 2000-05-08 2003-10-07 Sterling Medivations, Inc. Micro infusion drug delivery device
US6659982B2 (en) 2000-05-08 2003-12-09 Sterling Medivations, Inc. Micro infusion drug delivery device
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
ATE499116T1 (de) 2002-08-16 2011-03-15 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
GB0308731D0 (en) 2003-04-15 2003-05-21 Anticancer Therapeutic Inv Sa Method of radiotherapy
US20050003403A1 (en) 2003-04-22 2005-01-06 Rossi Edmund A. Polyvalent protein complex
PT1976880T (pt) 2005-12-21 2016-09-28 Amgen Res Munich Gmbh Composições farmacêuticas com resistência a cea solúvel
US8460667B2 (en) 2006-07-18 2013-06-11 Sanofi EPHA2 receptor antagonist antibodies
SI2474557T1 (sl) * 2007-07-16 2014-12-31 Genentech, Inc. Protiteles proti CD79b in imunokonjugati in postopki za uporabo
KR20140117638A (ko) 2007-08-29 2014-10-07 사노피 인간화된 항-ｃｘｃｒ5 항체, 이의 유도체 및 이들의 용도
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US8236319B2 (en) 2008-04-30 2012-08-07 Immunogen, Inc. Cross-linkers and their uses
CN102482701B (zh) * 2009-09-16 2015-05-13 免疫医疗公司 I类抗-cea抗体及其使用
US9427531B2 (en) 2010-06-28 2016-08-30 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Auto-injector
MX347590B (es) * 2011-03-02 2017-05-03 Roche Glycart Ag Anticuerpos del cea.
US9248242B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Safety Syringes, Inc. Anti-needle stick safety device for injection device
HUE033369T2 (en) 2012-11-20 2017-11-28 Sanofi Sa Anti-CEACAM5 antibodies and their applications
US20140155827A1 (en) 2012-12-03 2014-06-05 Mylan, Inc. Medicament information system and method
TWI595006B (zh) * 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
CN104948958A (zh) * 2015-07-01 2015-09-30 上海顿格电子贸易有限公司 一种利用热敏电阻限流的led灯
CN108341876B (zh) * 2017-01-22 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗人ceacam5单克隆抗体及其制备方法和应用
EP3866924A4 (en) * 2018-06-29 2022-07-06 Krystal Biotech, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF ANTIBODY DELIVERY
CN114173823A (zh) * 2019-02-07 2022-03-11 赛诺菲 抗ceacam5免疫缀合物用于治疗肺癌的用途
CN115427083A (zh) * 2020-04-24 2022-12-02 赛诺菲 含有抗ceacam5抗体缀合物和西妥昔单抗的抗肿瘤组合
BR112022020592A2 (pt) * 2020-04-24 2022-11-29 Sanofi Sa Combinações antitumor contendo conjugados de anticorpo anti-ceacam5, trifluridina e tipiracila
TW202206109A (zh) * 2020-04-24 2022-02-16 法商賽諾菲公司 含有抗ｃｅａｃａｍ５抗體接合物與ｆｏｌｆｉｒｉ之抗腫瘤組合
AU2021379882A1 (en) * 2020-11-10 2023-06-29 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugate formulation
KR20240112348A (ko) * 2021-12-02 2024-07-18 사노피 암 치료법에서 환자 선택을 위한 cea 검정
WO2024108053A1 (en) * 2022-11-17 2024-05-23 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150085828A (ko) 2015-07-24
RS60043B1 (sr) 2020-04-30
US10457739B2 (en) 2019-10-29
NZ708528A (en) 2020-07-31
AU2013349733B2 (en) 2018-08-23
EP3199552A1 (en) 2017-08-02
LT3199552T (lt) 2020-04-10
PT2922875T (pt) 2017-05-31
CN104918958A (zh) 2015-09-16
ZA201502959B (en) 2016-01-27
BR112015010993A2 (ja) 2017-08-22
EP2922875B1 (en) 2017-03-15
PH12015501092B1 (en) 2019-01-11
PL3199552T3 (pl) 2020-06-01
KR20200143527A (ko) 2020-12-23
WO2014079886A1 (en) 2014-05-30
AU2013349733A1 (en) 2015-06-11
AU2018267636A1 (en) 2018-12-13
AR093557A1 (es) 2015-06-10
RS55987B1 (sr) 2017-09-29
IL238559A0 (en) 2015-06-30
EP3594243A1 (en) 2020-01-15
CR20150258A (es) 2015-06-11
EA039377B1 (ru) 2022-01-20
MY171100A (en) 2019-09-25
TN2015000177A1 (en) 2016-10-03
US20180022817A1 (en) 2018-01-25
AU2013349733C1 (en) 2020-10-01
SI3199552T1 (sl) 2020-06-30
TWI664192B (zh) 2019-07-01
UY35147A (es) 2014-06-30
UA120247C2 (uk) 2019-11-11
ES2625742T3 (es) 2017-07-20
IL238559B (en) 2018-10-31
PL2922875T3 (pl) 2017-08-31
CA2889962A1 (en) 2014-05-30
CA2889962C (en) 2023-10-24
KR20220084193A (ko) 2022-06-21
TW201427997A (zh) 2014-07-16
JP2016506370A (ja) 2016-03-03
DK2922875T3 (en) 2017-06-06
EP3199552B1 (en) 2019-12-25
CY1119219T1 (el) 2018-02-14
KR102661801B1 (ko) 2024-04-26
EP2922875A1 (en) 2015-09-30
CN109180815B (zh) 2022-06-21
PT3199552T (pt) 2020-03-25
HUE033369T2 (en) 2017-11-28
HRP20200415T1 (hr) 2020-06-26
DK3199552T3 (da) 2020-03-30
US20200102401A1 (en) 2020-04-02
MA38194B1 (fr) 2018-12-31
CL2015001321A1 (es) 2015-07-17
US11332542B2 (en) 2022-05-17
TW201940519A (zh) 2019-10-16
PH12015501092A1 (en) 2015-07-27
BR112015010993B1 (pt) 2022-08-30
CN109180815A (zh) 2019-01-11
SI2922875T1 (sl) 2017-06-30
CA3207769A1 (en) 2014-05-30
MX358321B (es) 2018-08-14
MA38194A1 (fr) 2018-02-28
PE20151180A1 (es) 2015-08-12
SG11201503285TA (en) 2015-05-28
HRP20170743T1 (hr) 2017-07-28
LT2922875T (lt) 2017-06-12
HK1215444A1 (en) 2016-08-26
US9617345B2 (en) 2017-04-11
ECSP15025845A (es) 2016-01-29
KR102408660B1 (ko) 2022-06-15
ES2778823T3 (es) 2020-08-12
US20220340682A1 (en) 2022-10-27
KR20240063172A (ko) 2024-05-09
CN104918958B (zh) 2019-12-10
DOP2015000110A (es) 2015-08-16
MX2015006374A (es) 2015-10-09
US20160108131A1 (en) 2016-04-21
EA201590986A1 (ru) 2016-05-31
KR102194748B1 (ko) 2020-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220340682A1 (en) Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
JP6441232B2 (ja) 抗ｌａｍｐ１抗体および抗体薬物コンジュゲート、ならびにその使用
OA17305A (en) Anti-CEACAM5 antibodies and uses thereof.
HK1215444B (en) Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
EA047681B1 (ru) Способы получения антител к ceacam5

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20160920

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170801

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20171030

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20171219

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180315

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20180327

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20180410

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6324399

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250