BR112015010993B1 - Anticorpos anti-ceacam5, célula hospedeira, imunoconjugado e composição farmacêutica - Google Patents

Anticorpos anti-ceacam5, célula hospedeira, imunoconjugado e composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

ANTICORPOS ANTI-CEACAM5 E USOS DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam a proteínas CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis, bem como ácidos nucleicos isolados, vetores e células hospedeiras compreendendo uma sequência que codifica os ditos anticorpos. A invenção também revela imunoconjugados compreendendo os ditos anticorpos conjugados ou ligados a um Agente inibidor de crescimento, e a composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos ou imunoconjugados da invenção. Os anticorpos ou imunoconjugados da invenção são usados para o tratamento de câncer ou para fins diagnósticos.

Description

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos que especifica mente se ligam às proteínas CEACAM5 humanas e de Macaca fasci- cularis bem como ácidos nucleicos isolados, vetores e células hospedeiras compreendendo uma sequência que codifica os ditos anticorpos. A invenção também descreve imunoconjugados compreendendo os ditos anticorpos conjugados ou ligados a um agente inibidor de crescimento, e composições farmacêuticas compreendendo anticorpos ou imunoconjugados da invenção. A invenção descreve o uso dos anticorpos ou imunoconjugados da invenção para o tratamento de câncer ou para fins diagnósticos.
[002] O antígeno carcinoembrionário (CEA) é uma glicoproteína envolvida na adesão celular. CEA foi primeiro identificado em 1965 (Gold e Freeman, J Exp Med, 121, 439, 1965) como uma proteína normalmente expressa pelo intestino fetal durante os seis primeiros meses de gestação, e encontrada em cânceres do pâncreas, fígado e cólon. A família de CEA pertence à superfamília de imunoglobulina. A família CEA, que consiste em 18 genes, é subdividida em dois subgrupos de proteínas: o subgrupo da molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrionário (CEACAM) e o subgrupo de gli- coproteína específica para a gravidez (Kammerer & Zimmermann, BMC Biology 2010, 8:12).
[003] Em humanos, o subgrupo de CEACAM consiste em 7 membros: CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8. Numerosos estudos mostraram que CEACAM5, idêntica ao CEA originalmente identificado, é altamente expressa na superfície de células de tumor colorretal, gástrico, de pulmão, de mama, de próstata, de ovário, de cérvix e de bexiga e fra- camente expressa em poucos tecidos epiteliais normais tais como células epiteliais colunares e caliciformes no cólon, células mucosas de pescoço no estômago e células epiteliais escamosas no esôfago e na cérvix (Hammarstrom et al., 2002, em "Tumor markers, Physiology, Pathobiology, Technology e Clinical Applications" Eds DIAMANDIS E. P. et al., AACC Press, Washington pp 375). Dessa forma, CEACAM5 pode constituir um alvo terapêutico adequado para abordagens de direcionamento específico tumoral, como imunoconjugados. A presente invenção fornece anticorpos monoclonais direcionados contra CEACAM5 e mostra que podem ser conjugados a um agente citotóxi- co para induzir uma atividade citotóxica capaz de eliminar as células tumorais in vitro e induzir a regressão tumoral in vivo.
[004] Os domínios extracelulares de membros da família CEACAM são compostos de domínios similares à imunoglobulina (similares à Ig) repetidos que foram categorizados em 3 tipos, A, B e N, de acordo com a homologia de sequência. CEACAM5 contém os tais sete domínios, ou seja, N, A1, B1, A2, B2, A3 e B3.
[005] Os domínios A1, A2 e A3 de CEACAM5, por um lado, e domínios B1, B2 e B3, por outro lado, mostram alta homologia de sequência, os domínios A de CEACAM5 humana apresentando similaridade de sequência de pareamento de 84 a 87% e os domínios B de 69 a 80%. Além disso, outros membros de CEACAM humana que apresentam os domínios A e/ou B na sua estrutura, ou seja, CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 e CEACAM8, mostram homologia com CEACAM5 humana. Em particular, os domínios A e B da proteína CEACAM6 humana exibem homologias de sequência com os domí-nios A1 e A3 e alguns dos domínios B1 a B3 de CEACAM5 humana, respectivamente, que são até mais altas do que as observadas entre os domínios A e os domínios B de CEACAM5 humana.
[006] Numerosos anticorpos anti-CEA foram gerados em vista de diagnósticos direcionados a CEA ou fins terapêuticos. A especificidade em direção a antígenos relacionados sempre era mencionada como uma preocupação neste campo como, por exemplo, por Sharkey et al. (1990, Cancer Research 50, 2823). Devido às homologias mencionadas acima, alguns anticorpos anteriormente descritos podem demonstrar que a ligação a epítopos repetitivos da CEACAM5 presente nos diferentes domínios de imunoglobulina mostra reatividade cruzada a outros membros de CEACAM como CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 ou CEACAM8, sem especificidade para CEACAM5. A especificidade do anticorpo anti-CEACAM5 é desejada em vista das terapias direcionadas a CEA tais que ele se ligue a células tumorais que expressam CEACAM5 humana, mas não se ligue a quaisquer tecidos normais que expressam os outros membros de CEACAM. É notável que CEACAM1, CEACAM6 e CEACAM8 foram descritas como expressas por neutrófilos de primatas humanos e não humanos (Ebra- himmnejad et al., 2000, Exp Cell Res, 260, 365; Zhao et al., 2004, J Immunol Methods 293, 207; Strickle et al., 2009 J Pathol, 218, 380) onde foi mostrado que regulam a granulopoiese e desempenham um papel na resposta imune.
[007] Um conjugado fármaco-anticorpo anti-CEACAM6 foi des crito, tal como o maitansinoide-anticorpo anti-CEACAM6 desenvolvido por Genentech (Strickle et al., 2009 J Pathol, 218, 380), que foi demonstrado induzir toxicidade hematopoiética dependente de CEACAM6 em primatas não humanos. Esta toxicidade, atribuída ao acúmulo do conjugado fármaco-anticorpo na medula óssea e a deple- ção dos granulócitos e seus precursores celulares, foi considerada pelos autores como uma preocupação de segurança principal. Deste modo, mais precisamente, para fins terapêuticos, a reatividade cruzada de um anticorpo anti-CEACAM5 com CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 ou CEACAM8 pode reduzir o índice terapêutico do com- posto pela toxicidade aumentada em tecidos normais. Dessa forma, há uma forte vantagem na obtenção de anticorpos especificamente direcionados à CEACAM5 que não reagissem transversalmente com outras moléculas da família CEACAM, especialmente para o uso como um conjugado fármaco-anticorpo (ADC) ou com qualquer outro modo de ação resultando em eliminação da célula-alvo.
[008] Além disso, como CEACAM5 é descrita como sendo ex pressa, embora em baixo nível, em alguns tecidos celulares normais, é crítico desenvolver anticorpos anti-CEACAM5 capazes da ligação à CEACAM5 humana bem como à CEACAM5 de macaco cinomolgus (Macaca fascicularis), conforme tais anticorpos possam ser prontamente testados em estudos toxicológicos pré-clínicos em macacos ci- nomolgus para avaliar seu perfil de segurança. Uma vez que foi mostrada que a eficiência dos anticorpos terapêuticos pode ser dependente da localização do epítopo no alvo, ambos no caso de anticorpos funcionais (Doern et al. 2009, J. Biol. Chem 284 10254) e no caso onde as funções efetoras estão envolvidas (Beers et al. Semin Hematol 47:107-114), um humano / macaco tem de mostrar que o anticorpo reativo transversal se liga a epítopos no mesmo domínio homólogo similar à Ig repetido de proteínas humanas e de macaco cinomolgus.
[009] Ao combinar a necessidade por reatividade cruzada de es pécies de tais anticorpos com a especificidade de CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis, isto é, nenhuma reatividade cruzada com outros membros de CEACAM de Macaca fascicularis e humana, adiciona um grau adicional de complexidade, considerando a homologia de sequência total entre as proteínas CEACAM humanas e de Macaca fascicularis.
[0010] De fato, o alinhamento de pareamento global da sequência de CEACAM5 de Macaca fascicularis com a sequência de CEACAM5 humana (AAA51967.1/GI:180223, 702 aminoácidos) indicou identidade de somente 78,5%. Os genes de CEACAM1, CEACAM5 e CEACAM6 de Macaca fascicularis foram clonados e um alinhamento global dos domínios A, B e N humanos e de Macaca fascicularis foi realizado. Este alinhamento predisse que há muito poucas regiões, se houver alguma, para localizar um epítopo ideal que fosse comum em CEACAM5 humana e de macaco e não compartilhado com qualquer outro membro da família. Por estas razões, é esperado o desenvolvimento de anticorpos com reatividade cruzada entre CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis sem reatividade cruzada com outros membros de CEACAM humana e de Macaca fascicularis tivesse uma probabilidade baixa de êxito. Notavelmente, os anticorpos anti- CEACAM5 anteriormente descritos quase nunca são documentados para a reatividade cruzada de Macaca fascicularis, com muito poucas exceções (MT111, ver abaixo).
[0011] Os anticorpos anti-CEACAM5 humana já foram usados em pesquisas clínicas, como labetuzumabe da Immunomedics (também conhecido como hMN14, Sharkey et al., 1995, Cancer Research 55, 5935). Foi mostrado que este anticorpo não se liga a antígenos relacionados, mas não reage de forma cruzada com CEACAM5 de Macaca fascicularis. Digno de nota, o anticorpo MT111 da Micromet (também conhecido como o anticorpo MEDI-565 de MedImmune) é um anticorpo biespecífico que se liga à CEACAM5 humana e CD3 humana (Peng et al., PLoS ONE 7 (5): e3641; WO 2007/071426). Foi dito que MT111 foi criado pela fusão de um fragmento variável da cadeia única (scFv) de um anticorpo que reconhece CEACAM5 humana e de cinomolgus com scFv de um anticorpo que reconhece CD3 humana (anúncio de Oberst et al., AACR Annual Meeting April 2009 Denver, CO). Também foi relatado que MT111 não se liga a outros membros da família CEACAM (Peng et al., PLoS ONE 7 (5): e3641). MT111 liga-se a um epítopo conformacional no domínio A2 de CEACAM5 humana. Este epítopo conformacional está faltando em uma variante de splicing de CEACAM5 humana, que é expressa concomitantemente com CEACAM5 completa em tumores (Peng et al., PLoS ONE 7 (5): e3641). Além disso, não há nenhuma evidência que MT111 se liga ao mesmo epítopo em CEACAM5 de Macaca fascicularis.
[0012] Em uma tentativa de produzir novos anticorpos contra a proteína de superfície de CEACAM5 com características ótimas para fins terapêuticos, os inventores imunizaram camundongos com proteínas recombinantes e com células tumorais. Rastrearam centenas de hibridomas usando ELISA em várias proteínas recombinantes da família CEACAM e citometria de fluxo com linhagens celulares relevantes, a fim de selecionar somente as imunoglobulinas (IgGs) com o perfil vantajoso. Inesperadamente, foram capazes de selecionar clones de hibridoma e produzir IgGs maduras correspondentes compreendendo todos os atributos desejados. Especificamente se ligam ao domínio A3-B3 de CEACAM5 humana com uma alta afinidade e não reconhecem as proteínas de CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 e CEACAM8 humanas. Em um contexto celular, estes anticorpos exibem alta afinidade por células tumorais (na faixa de nanomolar). Além disso, estes anticorpos também se ligam à proteína CEACAM5 de Macaca fascicu- laris com uma proporção de afinidade macaco / ser humano menor ou igual a 10. Os anticorpos da invenção ligam-se especificamente ao domínio A3-B3 de CEACAM5 de Macaca fascicularis e não reconhecem outros membros de CEACAM de Macaca fascicularis.
[0013] Pelo direcionamento do domínio A3-B3 de CEACAM5, es tes anticorpos aumentaram o potencial de direcionamento ao tumor, conforme têm a capacidade de ligar-se tanto à CEACAM5 humana completa como à sua variante de junção identificada por Peng et al. (PLoS ONE 7 (5): e3641).
[0014] Finalmente, CEACAM5 é descrita na literatura como uma proteína de superfície que se incorpora fracamente (revisto em Schmidt et al., 2008, Cancer Immunol. Immunother. 57, 1879), e por isso pode não ser um alvo favorável de conjugados fármaco-anticorpo. Apesar disso que foi relatado na técnica prévia, os inventores mostraram que os anticorpos que produziram são capazes de se incorporar ao complexo CEACAM5-anticorpo após a ligação e induzir a atividade citotóxica sobre células tumorais in vitro quando combinado a um agente citotóxico. Os mesmos anticorpos combinados a um agente citotóxico também são capazes de inibir acentuamente o crescimento tumoral em camundongos que carregam tumores humanos primários de cólon e de estômago.
Definições
[0015] Como usado neste pedido "CEACAM5", designa "molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrionário 5", também conhecida como "CD66e" (Grupo de Diferenciação 66e) ou CEA. CEACAM5 é uma glicoproteína envolvida na adesão celular. CEACAM5 é altamente expressa, em particular, na superfície de células de tumores colorretal, gástrico, de pulmão e uterino.
[0016] Uma sequência de referência completa de CEACAM5 hu mana, incluindo peptídeo sinal (posições 1-34) e pró-peptídeo (posições 686-702), está disponível no banco de dados GenBank sob o número de acesso AAA51967.1 (SEQ ID NO:52). Cinco SNPs não sinônimos foram identificados com uma frequência mais alta do que 2% na população caucasiana, quatro deles localizado no domínio N (nas posições 80, 83, 112, 113), o último no domínio A2 (na posição 398) de CECAM5 humana (SEQ ID NO:58). GenBank AAA51967.1 contém o haplótipo principal (I80, V83, I112, I113 e E398).
[0017] Uma sequência do domínio extracelular de CEACAM5 de Macaca fascicularis, clonada pelos inventores, é descrita na SEQ ID NO:53.
[0018] Um "domínio" pode ser qualquer região de uma proteína, geralmente definida com base na homologia de sequência e muitas vezes relacionada a uma entidade estrutural ou funcional específica. É conhecido que os membros da família de CEACAM são compostos de domínios similares à Ig. O termo domínio é usado neste documento para designar domínios similares à Ig individuais, como "domínio N" ou para grupos de domínios consecutivos, como "domínio A3-B3".
[0019] A organização do domínio de CEACAM5 humana é como se segue (com base na sequência do GenBank AAA51967.1; SEQ ID NO:52):
Figure img0001
[0020] Consequentemente, o domínio A3-B3 de CEACAM5 huma na consiste em aminoácidos nas posições 499-685 da SEQ ID NO:52.
[0021] A organização do domínio de CEACAM5 de Macaca fasci- cularis é como se segue (baseado na sequência de domínio extracelu- lar clonada; SEQ ID NO:53):
Figure img0002
[0022] Consequentemente, o domínio A3-B3 de CEACAM5 de Macaca fascicularis consiste em aminoácidos nas posições 465-654 da SEQ ID NO:53.
[0023] Uma "sequência de codificação" ou sequência "codificante" de um produto de expressão, como RNA, polipeptídeo, proteína, ou enzima, é uma sequência nucleotídica que, quando expressa, resulta na produção daquele RNA, polipeptídeo, proteína ou enzima, isto é, a sequência nucleotídica codifica uma sequência de aminoácidos daquele polipeptídeo, proteína ou enzima. Uma sequência de codificação de uma proteína pode incluir um códon de partida (normalmente ATG) e um códon de parada.
[0024] Como usado neste pedido, as referências para proteínas específicas (por exemplo, anticorpos) podem incluir um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos nativa, bem como variantes e formas modificadas apesar da sua origem ou modo de preparação. Uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos nativa é uma proteína que tem a mesma sequência de aminoácidos que a obtida da natureza. Tais proteínas de sequências nativas podem ser isoladas da natureza ou podem ser preparadas usando métodos recombinantes e/ou sintéticos padrão. As proteínas de sequências nativas especificamente englobam formas truncadas ou solúveis de ocorrência natural, formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas de splicing alternativo), variantes alélicas de ocorrência natural e formas incluindo modificações pós-tradução. As proteínas de sequências nati-vas incluem proteínas que carregam modificações pós-tradução como glicosilação, ou fosforilação ou outras modificações de alguns resíduos de aminoácidos.
[0025] O termo "gene" significa uma sequência de DNA que codifi ca ou corresponde a uma sequência de aminoácidos particular com-preendendo toda ou parte de uma ou mais proteínas ou enzimas, e pode incluir ou não sequências de DNA reguladoras, como sequências de promotor que, por exemplo, determinam as condições sob as quais o gene é expresso. Alguns genes, que não são genes estruturais, podem ser transcritos de DNA a RNA, mas não são traduzidos para uma sequência de aminoácidos. Outros genes podem funcionar como reguladores dos genes estruturais ou como reguladores de transcrição de DNA. Em particular, o termo gene pode ser destinado à sequência ge- nômica que codifica uma proteína, isto é, a sequência compreendendo sequências de regulador, promotor, íntron e éxon.
[0026] Uma sequência "pelo menos 85% idêntica a uma sequência de referência" é uma sequência tendo, no seu comprimento inteiro, 85%, ou mais, por exemplo, identidade de sequência de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ao comprimento inteiro da sequência de referência.
[0027] Uma porcentagem de "identidade de sequência" pode ser determinada comparando as duas sequências, alinhadas otimamente sobre uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) quando comparada com a sequência de referência (que não compreende adições ou dele- ções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico ou o resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela da comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem da identidade de sequência. O alinhamento ótimo de sequências para comparação é conduzido pelo alinhamento de pareamento global, por exemplo, usando o algoritmo de Needleman e Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970). A porcentagem da identidade de sequência pode ser prontamente determinada por exemplo, usando o programa Needle, com a matriz BLOSUM62 e os seguintes parâmetros abertura de lacuna=10, extensão de lacuna=0,5.
[0028] Uma "substituição de aminoácido conservativa" é aquela na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido que tem um grupo R na cadeia lateral com propriedades químicas similares (por exemplo, carga, tamanho ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não modificará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais alifáticas com hidroxilas: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: aspa- ragina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais acídicas: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos conservativos também podem ser definidos com base no tamanho do aminoácido.
[0029] Um "anticorpo" pode ser um anticorpo natural ou convenci onal no qual duas cadeias pesadas são ligadas entre si por ligações de dissulfeto e cada cadeia pesada é ligada a uma cadeia leve por uma ligação de dissulfeto. Há dois tipos de cadeia leve, lambda (l) e kappa (k). Há cinco classes de cadeia pesada principais (ou isotipos) que determinam a atividade funcional de uma molécula de anticorpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadeia contém domínios de sequência distintos. A cadeia leve inclui dois domínios ou regiões, um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL). A cadeia pesada inclui quatro domínios, um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3, coletivamente referidos como CH). As regiões vari- áveis tanto das cadeias leves (VL) como das pesadas (VH) determinam o reconhecimento de ligação e a especificidade ao antígeno. Os domínios de região constante das cadeias leves (CL) e pesadas (CH) conferem propriedades biológicas importantes, como associação da cadeia do anticorpo, secreção, mobilidade transplacentária, ligação de complemento e ligação a receptores de Fc (FcR). O fragmento Fv é a parte N-terminal do fragmento Fab de uma imunoglobulina e consiste nas porções variáveis de uma cadeia leve e uma cadeia pesada. A especificidade do anticorpo reside na complementaridade estrutural entre o sítio de combinação de anticorpo e o determinante antigênico. Os sítios de combinação de anticorpo são compostos de resíduos que são principalmente de regiões hipervariáveis ou de determinação de complementaridade (CDRs). Ocasionalmente, os resíduos de regiões não hipervariáveis ou estruturais (FR) influenciam na estrutura do domínio total e por isso o sítio de combinação. As Regiões de Determinação de Complementaridade ou CDRs, por isso, referem-se a sequências de aminoácidos que em conjunto definem a afinidade de ligação e a es-pecificidade da região de Fv natural de um sítio de ligação de imuno- globulina nativa. As cadeias leves e pesadas de uma imunoglobulina, cada uma, têm três CDRs, designadas CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L e uma CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, respectivamente. Um sítio de ligação do anticorpo ao antígeno convencional, por isso, inclui seis CDRs, compreendendo o conjunto de uma CDR de cada de uma região V da cadeia pesada e uma da leve.
[0030] "Regiões estruturais" (FRs) referem-se a sequências de aminoácidos interpostas entre as CDRs, isto é, naquelas porções das regiões variáveis da cadeia leve e pesada da imunoglobulina que são relativamente conservadas entre diferentes imunoglobulinas em uma única espécie. As cadeias leves e pesadas de uma imunoglobulina cada uma tem quatro FRs, designadas FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, e FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H, respectivamente.
[0031] Como usado neste pedido, uma "região estrutural humana" é uma região estrutural que é substancialmente idêntica (aproximadamente 85%, ou mais, por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) à região estrutural de um anticorpo humano de ocorrência natural.
[0032] No contexto da invenção, a definição de uma CDR/FR em uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina deve ser determinada baseada na definição IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27 (1):55-77; www.imgt.org).
[0033] Como usado neste pedido, o termo "anticorpo" denota anti corpos convencionais e fragmentos destes, bem como anticorpos de domínio único e fragmentos destes, em particular cadeia pesada variável de anticorpos de domínio único e anticorpos quiméricos, humanizados, biespecíficos ou multiespecíficos.
[0034] Como usado neste pedido, anticorpo ou imunoglobulina também inclui "anticorpos de domínio único" que foram mais recentemente descritos e que são anticorpos cujas regiões de determinação de complementaridade são parte de um polipeptídeo de domínio único. Exemplos de anticorpos de domínio único incluem anticorpos de cadeia pesada, anticorpos naturalmente destituídos de cadeias leves, anticorpos de domínio único derivados de anticorpos de quatro cadeias convencionais, anticorpos de domínio único engendrados. Os anticorpos de domínio único podem ser derivados de qualquer espécie incluindo, mas não limitados a camundongo, ser humano, camelo, lhama, cabra, coelho, bovino. Anticorpos de domínio único podem ser anticorpos de domínio único de ocorrência natural conhecidos como anticorpo da cadeia pesada destituído de cadeias leves. Em particular, as espécies Camelidae, por exemplo, camelo, dromedário, lhama, alpaca e guanaco, produzem anticorpos de cadeia pesada naturalmente destituídos da cadeia leve. Os anticorpos de cadeia pesada de camelídeos também não têm o domínio CH1.
[0035] A cadeia pesada variável destes anticorpos de domínio úni co destituídos de cadeias leves é conhecida na técnica como "VHH" ou "nanocorpo". Similares aos domínios VH convencionais, os VHHs contêm quatro FRs e três CDRs. Os nanocorpos têm vantagens em relação aos anticorpos convencionais: são aproximadamente dez vezes menores do que moléculas de IgG, e por conseguinte nanocorpos funcionais enovelados apropriadamente podem ser produzidos pela expressão in vitro ao alcançar alto rendimento. Além disso, os nanocor- pos são muito estáveis, e resistentes à ação de proteases. As propriedades e a produção de nanocorpos foram revistas por Harmsen e De Haard HJ (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007 Nov; 77 (1):13-22).
[0036] O termo "anticorpo monoclonal" ou "mAb", como usado neste pedido, refere-se a uma molécula de anticorpo de uma sequência de aminoácidos única, que é direcionada contra um antígeno específico e não deve ser interpretada como requerimento para a produção do anticorpo por qualquer método particular. Um anticorpo monoclonal pode ser produzido por um clone único de células B ou hibridoma, mas também pode ser recombinante, isto é, produzido pela engenharia proteica.
[0037] O termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo en gendrado que, no seu sentido mais amplo, contém uma ou mais regiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de um ou mais anticorpos. Em uma modalidade, um anticorpo quimérico compreende um domínio VH e um domínio VL de um anticorpo derivado de um animal não humano, em associação com um domínio CH e um domínio CL de outro anticorpo, em uma modalidade, anticorpo humano. Como animal não humano, qualquer animal como camundongo, rato, hamster, coelho ou similares pode ser usado. Um anticorpo quimérico também pode deno- tar um anticorpo multiespecífico tendo especificidade por pelo menos dois antígenos diferentes.
[0038] O termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo que é inteiramente ou parcialmente de origem não humana e que foi modificado para substituir certos aminoácidos, por exemplo, nas regiões estruturais dos domínios VH e VL, a fim de evitar ou minimizar uma resposta imune em humanos. Os domínios constantes de um anticorpo humanizado são na maior parte do tempo domínios CH e CL humanos.
[0039] "Fragmentos" de anticorpos (convencionais) compreendem uma porção de um anticorpo intacto, em particular a região de ligação ao antígeno ou a região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, diacorpos, anticorpos biespecíficos e multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Um fragmento de um anticorpo convencional também pode ser um anticorpo de domínio único, como um anticorpo da cadeia pesada ou VHH.
[0040] O termo "Fab" denota um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de aproximadamente 50,000 e atividade de ligação ao antígeno, na qual aproximadamente a metade do lado N-terminal da cadeia pesada e a cadeia leve inteira estão ligados em conjunto através de uma ligação de dissulfeto. É normalmente obtido entre fragmentos pelo tratamento de IgG com uma protease, papaína.
[0041] O termo "F(ab')2" refere-se a um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de aproximadamente 100,000 e atividade de ligação ao antígeno, que é levemente maior do que 2 fragmentos Fab idênticos ligados através de uma ligação de dissulfeto da região de dobradiça. É normalmente obtido entre fragmentos pelo tratamento de IgG com uma protease, pepsina.
[0042] O termo "Fab'" refere-se a um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de aproximadamente 50,000 e atividade de ligação ao antígeno, que é obtida pelo corte de uma ligação de dissulfeto da região de dobradiça de F(ab')2.
[0043] Um polipeptídeo de Fv de cadeia única ("scFv") é um hete- rodímero VH::VL ligado covalentemente que é normalmente expresso de uma fusão gênica incluindo genes que codificam VH e VL ligados por um ligante codificante de peptídeo. O fragmento de scFv humano da invenção inclui CDRs que são mantidas em conformação apropriada, por exemplo, usando técnicas de recombinação gênica. Os fragmentos de anticorpos divalentes e multivalentes espontaneamente podem se formar pela associação de scFvs monovalentes ou podem ser gerados pelo acoplamento de scFvs monovalentes através de um li- gante peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente. "dsFv" é um heterodímero VH::VL estabilizado por uma ligação de dissulfeto. "(dsFv)2" denota dois dsFv acoplados por um ligante peptídico.
[0044] O termo "anticorpo biespecífico" ou "BsAb" denota um anti corpo que combina os sítios de ligação ao antígeno de dois anticorpos dentro de uma molécula única. Dessa forma, BsAbs são capazes de ligação a dois antígenos diferentes simultaneamente. A engenharia genética foi usada com frequência crescente para projetar, modificar e produzir anticorpos ou derivados de anticorpos com um conjunto desejado de propriedades de ligação e funções efetoras como descrito por exemplo, em EP 2.050.764 A1.
[0045] O termo "anticorpo multiespecífico" denota um anticorpo que combina os sítios de ligação ao antígeno de dois ou mais anticorpos dentro de uma molécula única.
[0046] O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno, fragmentos os quais compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia de poli- peptídeo (VH-VL). Usando um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios da mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno.
[0047] O termo "hibridoma" denota uma célula, que é obtida sub metendo uma célula B preparada pela imunização de um mamífero não humano com um antígeno para fusão celular com uma célula de mieloma derivada de um camundongo ou similar que produz um anticorpo monoclonal desejado tendo uma especificidade de antígeno.
[0048] Por "purificado" e "isolado" entende-se, ao referir-se a um polipeptídeo (isto é, o anticorpo da invenção) ou uma sequência nu- cleotídica, que a molécula indicada está presente na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas do mesmo tipo. O termo "purificado", como usado neste pedido, significa pelo menos 75%, 85%, 95%, 96%, 97% ou 98% em peso de macromoléculas biológicas do mesmo tipo estão presentes. Uma molécula de ácido nucleico "isolada" que codifica um polipeptídeo particular refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é substancialmente isenta de outras moléculas de ácido nucleico que não codificam o polipeptídeo objeto; entretanto, a molécula pode incluir algumas bases ou porções adicionais que não afetam deleteriamente as características básicas da composição.
[0049] Como usado neste pedido, o termo "indivíduo" denota um mamífero, como um roedor, um felino, um canino e um primata. Além disso, um indivíduo, de acordo com a invenção, é o ser humano. Anticorpos
[0050] Os inventores tiveram sucesso em geração, rastreamento e seleção de anticorpos anti-CEACAM5 de camundongo específicos que exibem alta afinidade tanto pela proteína CEACAM5 humana como a de Macaca fascicularis, e que não reagem de forma cruzada significativamente com as proteínas CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 e CEACAM8 humanas, e com as proteínas CEACAM1, CEACAM6 e CEACAM8 de Macaca fascicularis.
[0051] Os inventores determinaram a sequência das cadeias vari áveis leve e pesada de tais anticorpos monoclonais, os chamados anticorpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 e MAb5.
[0052] O chamado "anticorpo MAb1" compreende:
[0053] - um domínio variável da cadeia pesada consistindo na se quência EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLE WVATISSGGSYIYYLDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMY YCARPAYYGNPAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:31, com as CDRs mostradas em caracteres em negrito) no qual FR1-H abrange as posições de aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abrange as posições de aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO:1), FR2-H abrange as posições de aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abrange as posições de aminoácidos 51 a 58 (SEQ ID NO:2), FR3-H abrange as posições de aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abrange as posições de aminoácidos 97 a 109 (SEQ ID NO:3), e FR4-H abrange as posições de aminoácidos 110 a 120, e
[0054] - um domínio variável da cadeia leve consistindo na se quência DILMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPK PLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYN SYPLYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:32, com as CDRs mostradas em caracteres em negrito) no qual FR1-L abrange as posições de aminoá- cidos 1 a 26, CDR1-L abrange as posições de aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO:4), FR2-L abrange as posições de aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abrange as posições de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abrange as posições de aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abrange as posições de aminoácidos 89 a 98 (SEQ ID NO:6), e FR4-L abrange as posições de aminoácidos 99 a 108.
[0055] O chamado "anticorpo MAb2" compreende:
[0056] - um domínio variável da cadeia pesada consistindo na se quência EVQLQESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFvFSSYDMSWVR- QTPEKRLEWVAYIsSgGGiTYFPDTVQGRFTVSRDNAKNTLYLQMNS- LKSEDTAIYYCaAHYFGsSGPFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:33, com as CDRs mostradas em caracteres em negrito) no qual FR1-H abrange as posições de aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abrange as posições de aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO:7), FR2-H abrange as posições de aminoácidos 34 para 50, CDR2-H abrange as posições de aminoácidos 51 a 58 (SEQ ID NO:8), FR3-H abrange as posições de aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abrange as posições de aminoácidos 97 para 109 (SEQ ID NO:9), e FR4-H abrange as posições de aminoá- cidos 110 a 120, e
[0057] - um domínio variável da cadeia leve consistindo na se quência DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIFSYLAWYQQKQGKSPQLL VYNTKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYG TPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:34, com as CDRs mostradas em caracteres em negrito) no qual FR1-L abrange as posições de aminoáci- dos 1 a 26, CDR1-L abrange as posições de aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO:10), FR2-L abrange as posições de aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abrange as posições de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abrange as posições de aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abrange as posições de aminoácidos 89 a 97 (SEQ ID NO:12), e FR4-L abrange as posições de aminoácidos 98 para 107.
[0058] Uma variante do anticorpo MAb2 também foi gerada pela introdução de uma substituição K52R em CDR2-L. Esta variante, que é chamada neste pedido de "MAb2K52R", tem essencialmente a mesma afinidade por CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis como MAb2.
[0059] O chamado "anticorpo MAb3" compreende:
[0060] - um domínio variável da cadeia pesada consistindo na se quência EVKLVESGGGLVKPGGSLTLPCAASGFTFSRYAMSWVRQTPEKRLE WVASISSGGDTYYPDSVKGRFTVSRDNARNILFLQMSSLRSEDTGM YYCARVNYYDSSFLDWWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:35, com as CDRs mostradas em caracteres em negrito) no qual FR1-H abrange as posições de aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abrange as posições de aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO:13), FR2-H abrange as posições de aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abrange as posições de aminoácidos 51 a 57 (SEQ ID NO:14), FR3-H abrange as posições de aminoácidos 58 a 95, CDR3-H abrange as posições de aminoácidos 96 a 108 (SEQ ID NO:15), e FR4-H abrange as posições de aminoácidos 109 a 119, e
[0061] - um domínio variável da cadeia leve consistindo na se quência DIVMTQSQRFMSTLEGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPK ALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYN NYPLYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:36, com as CDRs mostradas em caracteres em negrito) no qual FR1-L abrange as posições de aminoá- cidos 1 a 26, CDR1-L abrange as posições de aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO:16), FR2-L abrange as posições de aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abrange as posições de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abrange as posições de aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abrange as posições de aminoácidos 89 a 98 (SEQ ID NO:18), e FR4-L abrange as posições de aminoácidos 99 a 108.
[0062] O chamado "anticorpo MAb4" compreende:
[0063] - um domínio variável da cadeia pesada consistindo na se quência EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWVRQTPEKRLE WVAFISSYGGRTYYADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAM FYCAAHYFGTSGPFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:37, com as CDRs mostradas em caracteres em negrito) no qual FR1-H abrange as posições de aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abrange as posições de aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO:19), FR2-H abrange as posições de aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abrange as posições de aminoácidos 51 a 58 (SEQ ID NO:20), FR3-H abrange as posições de aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abrange as posições de aminoácidos 97 a 109 (SEQ ID NO:21), e FR4-H abrange as posições de aminoácidos 110 a 120, e
[0064] - um domínio variável da cadeia leve consistindo na se quência DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYFAWYQQKQGKSPQLL VYNAKILAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGTYYCQHHYGI PFTFGSGTKLELK (SEQ ID NO:38, com as CDRs mostradas em caracteres em negrito) no qual FR1-L abrange as posições de aminoáci- dos 1 a 26, CDR1-L abrange as posições de aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO:22), FR2-L abrange as posições de aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abrange as posições de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abrange as posições de aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abrange as posições de aminoácidos 89 a 97 (SEQ ID NO:24), e FR4-L abrange as posições de aminoácidos 98 para 107.
[0065] O chamado "anticorpo MAb5" compreende:
[0066] - um domínio variável da cadeia pesada consistindo na se quência ELQLVESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLE WVTYINSGGGITYYPDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLKSEDTAIY YCTAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:39, com as CDRs mostradas em caracteres em negrito) no qual FR1-H abrange as posições de aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abrange as posições de aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO:25), FR2-H abrange as posições de aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abrange as posições de aminoácidos 51 a 58 (SEQ ID NO:26), FR3-H abrange as posições de aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abrange as posições de aminoácidos 97 a 109 (SEQ ID NO:27), e FR4-H abrange as posições de aminoácidos 110 a 120, e
[0067] - um domínio variável da cadeia leve consistindo na se quência DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLL VYNAKTLTEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYG TPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:40, com as CDRs mostradas em caracteres em negrito) no qual FR1-L abrange as posições de aminoáci- dos 1 a 26, CDR1-L abrange as posições de aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO:28), FR2-L abrange as posições de aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abrange as posições de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abrange as posições de aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abrange as posições de aminoácidos 89 a 97 (SEQ ID NO:30), e FR4-L abrange as posições de aminoácidos 98 para 107.
[0068] Por isso, a invenção refere-se a um anticorpo que se liga à CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis.
[0069] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção liga-se aos domínios A3-B3 de CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis. Mais especificamente, o anticorpo pode ligar-se aos domínios A3-B3 humanos e de Macaca fascicularis indiferentemente se expresso em forma isolada, ou presente em um domínio extracelular solúvel ou proteína CEACAM5 inteira ancorada na membrana.
[0070] A especificidade dos anticorpos do domínio A3-B3 de CEACAM5 humana é vantajosa já que nenhum SNP com uma frequência mais alta do que 2% na população caucasiana foi relatado neste domínio, que minimiza o risco que o epítopo(s) dos anticorpos em CEACAM5 ser alterado em parte da população.
[0071] A invenção também fornece um anticorpo que compete pe la ligação ao domínio A3-B3 das proteínas CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis com um anticorpo compreendendo as cadeias variáveis leve e pesada do anticorpo selecionado a partir do grupo consistindo dos chamados anticorpos MAb1, MAb2, MAb2K52R, MAb3, MAb4 e MAb5, isto é selecionado a partir do grupo consistindo em:
[0072] a) um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:31 e um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:32;
[0073] b) um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:33 e um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:34;
[0074] c) um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:33 e um domínio variável da cadeia leve da sequência da sequência SEQ ID NO:34 no qual K na posição 52 foi substituído por R;
[0075] d) um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:35 e um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:36;
[0076] e) um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:37 e um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:38; e
[0077] f) um anticorpo compreendendo um domínio variável da ca deia pesada da sequência SEQ ID NO:39 e um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:40.
[0078] A capacidade de um anticorpo de candidato de competir por ligação ao domínio A3-B3 das proteínas CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis com um anticorpo que compreende as cadeias variáveis leve e pesada do anticorpo selecionado a partir do grupo consistindo dos anticorpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 e MAb5 (depois um anticorpo "de referência") podem ser prontamente analisados, por exemplo, por ELISA competitivo em que o antígeno (isto é, o domínio A3-B3 de CEACAM5 humana ou de Macaca fascicularis, ou um poli- peptídeo compreendendo ou consistindo em um fragmento de CEACAM5 humana ou de Macaca fascicularis incluindo o domínio A3- B3, em particular o domínio extracelular de CEACAM5 humana ou de Macaca fascicularis) está ligado a um suporte sólido e duas soluções que contêm o anticorpo candidato e o anticorpo de referência, respectivamente, são adicionadas e permite-se que os anticorpos compitam por ligação ao antígeno. A quantidade do anticorpo de referência ligado ao antígeno então pode ser medida, e em comparação com a quantidade do anticorpo de referência ligado ao antígeno quando medido contra um controle negativo (por exemplo, solução que não contém nenhum anticorpo). Uma quantidade do anticorpo de referência ligado na presença do anticorpo candidato reduzida quando comparada com a quantidade do anticorpo de referência ligado na presença do controle negativo indica que o anticorpo candidato competiu com o anticorpo de referência. Convenientemente, o anticorpo de referência pode ser marcado (por exemplo, fluorescentemente) para facilitar a detecção do anticorpo de referência ligado. Medidas repetidas podem ser realizadas com diluições seriadas do anticorpo de referência e/ou candidato.
[0079] De acordo com uma modalidade, tal anticorpo, e por exem plo, o anticorpo que compete pela ligação ao domínio A3-B3 das proteínas CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis com um anticorpo como definido em b), c), e) e f) acima, liga-se a duas regiões do domínio A3-B3 da proteína CEACAM5 humana que consistem dos aminoá- cidos nas posições 109-115 (SEQ ID NO:76) e aminoácidos nas posições 131-143 (SEQ ID NO:77) do domínio A3-B3 da proteína CEACAM5 humana, respectivamente. De fato, um epítopo conforma- cional do anticorpo MAb2 foi identificado por pertencer às regiões 109115 e 131-143 do domínio A3-B3 da proteína CEACAM5 humana, e MAb2, MAb4 e MAb5 que é estruturalmente estreitamente relacionado, é hipotetizado pelos inventores que os ditos anticorpos se ligam ao mesmo epítopo.
[0080] De acordo com uma modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção é específico para proteínas de superfície de CEACAM5 humana e Macaca fascicularis. Em uma modalidade, o anticorpo da invenção não se liga, ou não possui reatividade cruzada significativa com proteínas CEACAM1 humana, CEACAM6 humana, CEACAM7 humana, CEACAM8 humana, CEACAM1 de Macaca fasci- cularis, CEACAM6 de Macaca fascicularis e CEACAM8 de Macaca fascicularis.
[0081] Em particular, o anticorpo não se liga, ou não possui reati- vidade cruzada significativa com o domínio extracelular das proteínas CEACAM humana e de Macaca fascicularis mencionadas acima.
[0082] A proteína inteira CEACAM1 humana está disponível no banco de dados GenBank sob o número de acesso NP_001703.2 (SEQ ID NO:11). O domínio extracelular de CEACAM1 humana consiste em aminoácidos nas posições 35-428 da SEQ ID NO:11. A proteína inteira CEACAM6 humana está disponível no banco de dados GenBank sob o número de acesso NP_002474.3 (SEQ ID NO:71). O domínio extracelular de CEACAM6 humano consiste em aminoácidos nas posições 35-327 da SEQ ID NO:71.
[0083] A proteína inteira CEACAM7 humana está disponível no banco de dados GenBank sob o número de acesso NP_008821.1 (SEQ ID NO:72). O domínio extracelular de CEACAM7 humana consiste em aminoácidos nas posições 36-248 da SEQ ID NO:72.
[0084] A proteína inteira CEACAM8 humana está disponível no banco de dados GenBank sob o número de acesso NP_001807.2 (SEQ ID NO:73). O domínio extracelular de CEACAM8 humana consiste em aminoácidos nas posições 35-332 da SEQ ID NO:73.
[0085] O domínio extracelular de CEACAM1 de M. fascicularis consiste em aminoácidos nas posições 35-428 da proteína inteira, isto é, aminoácidos 1-394 da SEQ ID NO:57.
[0086] O domínio extracelular de CEACAM6 de M. fascicularis consiste em aminoácidos nas posições 35-327 da proteína inteira, isto é, aminoácidos 1-293 da SEQ ID NO:61.
[0087] O domínio extracelular de CEACAM8 de M. fascicularis consiste em aminoácidos nas posições 35-332 da proteína inteira, isto é, aminoácidos 1-298 da SEQ ID NO:63.
[0088] "Afinidade" é definida, na teoria, pela associação de equilí brio entre o anticorpo inteiro e o antígeno. Pode ser experimentalmente avaliada por uma variedade de métodos conhecidos, como medida de taxas de associação e de dissociação com ressonância de plás- mons de superfície ou medida da EC50 (ou KD aparente) em um ensaio imunoquímico (ELISA, FACS). Nestes ensaios, a EC50 é a concentração do anticorpo que induz uma resposta até a metade entre a base e máximo após algum tempo de revelação especificado em uma concentração definida do antígeno por ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima) ou célula que expressa o antígeno por FACS (Separação de Células Ativada por Fluorescência).
[0089] Um anticorpo monoclonal que se liga ao antígeno 1 (Ag1) é "reativo de forma cruzada" ao antígeno 2 (Ag2) quando as EC50S estão em uma faixa similar de ambos os antígenos. No presente pedido de patente, um anticorpo monoclonal que se liga a Ag1 é reage de forma cruzada com Ag2 quando a razão de afinidade de Ag2 para afinidade de Ag1 é igual ou menos de 10 (por exemplo, 5, 2, 1 ou 0,5), afinidades que são medidas com o mesmo método de ambos os antígenos.
[0090] Um anticorpo monoclonal que se liga a Ag1 é "não significa tivamente reativo de forma cruzada" a Ag2 quando as afinidades são muito diferentes para os dois antígenos. A afinidade por Ag2 pode não ser mensurável se a resposta de ligação for demasiado baixa. No pre- sente pedido de patente, um anticorpo monoclonal que se liga a Ag1 não é significativamente reativo de forma cruzada para Ag2, quando a resposta de ligação do anticorpo monoclonal a Ag2 é menor que 5% da resposta de ligação do mesmo anticorpo monoclonal para Ag1 no mesmo cenário experimental e na mesma concentração de anticorpo. Na prática, a concentração de anticorpo usada pode ser a EC50 ou a concentração requerida para alcançar o patamar de saturação obtido com Ag1.
[0091] Um anticorpo monoclonal "liga-se especificamente", ou "é específico para" Ag1 quando não é significativamente reativo de forma cruzada para Ag2. Consequentemente, o anticorpo de acordo com a invenção tem uma razão de afinidade por CEACAM5 humana para afinidade por CEACAM5 de Macaca fascicularis que é <10, por exemplo, <5, <2, <1, ou <0,5. Dessa forma, o polipeptídeo de acordo com a invenção pode ser usado em estudos toxicológicos realizados em macacos porque o perfil de toxicidade observado em macacos seria relevante para esperar efeitos adversos potenciais em seres humanos.
[0092] Uma modalidade da invenção tem uma afinidade por CEACAM5 humana ou CEACAM5 de Macaca fascicularis ou ambos, que é <10nM, por exemplo, <5 nM, <3 nM, <1 nM ou <0,1 nM, por exemplo, uma afinidade de 0,01 nM a 5 nM, ou e afinidade de 0,1 nM a 5 nM, ou de 0,1 nM a 1 nM.
[0093] A afinidade por CEACAM5 humana ou por CEACAM5 de Macaca fascicularis pode ser determinada conforme o valor de EC50 em um ELISA usando CEACAM5 recombinante solúvel como o antí- geno de captura.
[0094] O anticorpo da invenção também pode ter uma constante de dissociação aparente (KD aparente), como pode ser determinado pela análise FACS na linhagem de células tumorais MKN45 (DSMZ, ACC 409) ou em células tumorais de xenoenxerto que derivam do pa- ciente (CR-IGR-034P disponível de Oncodesign Biotechnology, coleção tumoral CReMEC), que é <25 nM, por exemplo, <20 nM, <10 nM, <5 nM, <3 nM ou <1 nM. O KD aparente pode estar dentro da faixa 0,01-20 nM ou pode estar dentro da faixa 0,1-20nM, 0,1-10nM, ou 0,1- 5nM.
[0095] Adicionalmente, foi mostrado que os anticorpos de acordo com a invenção são capazes de detectar a expressão de CEACAM5 pela imunohistoquímica em seções de tecido congeladas e fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE).
[0096] Os alinhamentos das sequências das regiões VH e VL de anticorpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 e MAb5 são mostrados na Figura 7. A comparação das sequências CRD-H e CDR-L indica que, estruturalmente, MAb2, MAb4 e MAb5, por um lado, e MAb1 e MAb3, por outro lado, são estreitamente relacionados, os ditos anticorpos provavelmente se ligam ao mesmo epítopo. A comparação das sequências CRD-H e CDR-L ainda identifica posições de uma CDR que são estritamente conservadas entre os dois grupos de anticorpos e que são dessa forma consideradas serem importantes para a especificidade, ao passo que outras posições podem suportar a substituição.
[0097] Foi ainda identificado pelos inventores que resíduos nas posições 101-109 de VH de MAb2 (isto é, resíduos de uma CDR3-H) e resíduos nas posições 47-54 e 88-104 de VL de MAb2 (isto é, regiões incluindo CDR2-L e uma CDR3-L, respectivamente) fazem parte, ou formam o parátopo de anticorpo para o domínio CEACAM5-A3B3 humano.
[0098] Além disso, os resíduos nas posições 27, 28, 29, 31, 51, 52, 89, 90, 93, 94, 96, e 97 de VL de MAb2 (isto é, dentro de uma CDR1-L, CDR2-L e uma CDR3-L), e os resíduos nas posições 26 a 31, 51 a 58, 97, 103, 104, 107, e 109 de VH de MAb2 (isto é, dentro de uma CDR1-H, toda de uma CDR2-H e dentro de uma CDR3-H) foram identificados por substituições ácidas únicas por neutras para ligação aos domínios extracelulares de CEACAM5 humana e de cinomolgus. Além disso, foi mostrado que os resíduos nas posições 30 e 92 de VL de MAb2 (isto é, dentro de uma CDR1-L e CDR3-L) e os resíduos nas posições 98 e 100 de VH de MAb2 (isto é, dentro de uma CDR3-H), toleram uma substituição conservativa. Uma vez que MAb2, MAb4 e MAb5 carregam o mesmo conjunto de 6 CDRs ou muito estreitamente relacionadas, considera-se que as variações nas mesmas posições de MAb4 ou MAb5 em VH ou VL ou tanto sequências VH como CL também resultarão em anticorpos variantes que mantêm a especificidade de ligação e/ou afinidade por CEACAM5 humana e de cinomolgus.
[0099] De forma notável, todos os resíduos de uma CDR2-H iden tificados como neutros para ligação a domínios extracelulares de CEACAM5 humana e de cinomolgus, os inventores assumiram que uma CDR2-H não pudesse participar na interação. Consequentemente, nos anticorpos da invenção, CDR2-H pode ser qualquer sequência de 6 a 10 aminoácidos, este que é o comprimento regular de sequências CDR2-H em anticorpos humanos.
[00100] Consequentemente, o anticorpo de acordo com a invenção compreende:
[00101] a) uma CDR1-H consistindo na sequência X1X2X3X4X5X6YD (SEQ ID NO:83) em que cada um entre X1, X2, X3, X4, X5 e X6 é qualquer aminoácido; e
[00102] uma CDR2-H consistindo emem uma sequência de 6 a 10 aminoácidos de comprimento, preferencialmente uma sequência de 8 aminoácidos de comprimento na qual qualquer aminoácido pode estar presente em qualquer posição; e
[00103] uma CDR3-H consistindo na sequência X1X2HX3FGX4X5GPX6AX7 (SEQ ID NO:84) em que cada um entre X1, X4, X5, X6 e X7 é qualquer aminoácido, X2 é A ou S e X3 é Y, F ou W; e/ou
[00104] b) uma CDR1-L consistindo na sequência X1X2X3X4X5Y (SEQ ID NO:85) em que cada um entre X1, X2, X3 e X5 é qualquer ami- noácido e X4 é Y, F ou W; e
[00105] uma CDR2-L consistindo na sequência NX1X2 em que cada um entre X1 e X2 é qualquer aminoácido; e
[00106] uma CDR3-L consistindo na sequência X1X2HX3X4X5PX6X7 (SEQ ID NO:86) em que cada um entre X1, X2, X4, X5, X6 e X7 é qualquer aminoácido, X3 é Y, F ou W.
[00107] Em uma modalidade, na CDR1-H consistindo na sequência X1X2X3X4X5X6YD (SEQ ID NO:83), X1 é G, ou X2 é F, ou X3 é T, A ou V, ou X4 é F, ou X5 é S, ou X6 é S ou qualquer combinação disso.
[00108] Em uma modalidade, CDR2-H consiste na sequência IX1SX2GGX3T (SEQ ID NO:79) em que X1 é S ou N (em particular S), X2 é Y ou G (em particular G), X3 é R ou I. Em uma modalidade adicional X3 é I.
[00109] Em uma modalidade, na CDR3-H consistindo na sequência X1X2HX3FGX4X5GPX6AX7 (SEQ ID NO:84), X1 é A ou T, ou X4 é T ou S, ou X5 é S, ou X6 é F, ou X7 é Y ou qualquer combinação destas.
[00110] Em uma modalidade, na CDR1-L consistindo na sequência X1X2X3X4X5Y (SEQ ID NO:85), X1 é E, ou X2 é N, ou X3 é I, ou X5 é S ou qualquer combinação destas.
[00111] Em uma modalidade, CDR2-L consiste na sequência NX1X2 em que X1 é A ou T, e X2 é K ou R.
[00112] Em uma modalidade, na CDR3-L consistindo na sequência X1X2HX3X4X5PX6X7 (SEQ ID NO:86), X1 é Q, ou X2 é H, ou X4 é G, ou X5 é T, ou X6 é F, ou X7 é T ou qualquer combinação destas. De acordo com uma modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção compreende:
[00113] a) uma CDR1-H consistindo na sequência GFX1FSSYD (SEQ ID NO:78) em que X1 é T, A ou V; e
[00114] uma CDR2-H consistindo na sequência IX1SX2GGX3T (SEQ ID NO:79) em que X1 é S ou N (em particular S), X2 é Y ou G (em particular G), X3 é R ou I; e
[00115] uma CDR3-H consistindo na sequência X1AHYFGX2SGPFAY (SEQ ID NO:80) em que X1 é A ou T (em particular A), e X2 é T ou S; e/ou
[00116] b) uma CDR1-L consistindo na sequência ENIFSY (SEQ ID NO:10) ou ENIYSY (SEQ ID NO:22); e
[00117] uma CDR2-L consistindo na sequência NX1X2 em que X1 é A ou T e X2 é K ou R, em particular R; uma CDR2-L consistindo em particular de NAK, NTK e NTR; e
[00118] uma CDR3-L consistindo na sequência QHHYGTPFT (SEQ ID NO:12) ou QHHYGiPFT (SEQ ID NO:24).
[00119] De acordo com uma modalidade, em CDR2-H, X1 é S ou N, X2 é G e X3 é I.
[00120] De acordo com uma modalidade, CDR2-H consiste em ISSGGGIT (SEQ ID NO:8), ISSYGGRT (SEQ ID NO:20) ou INSGGGIT (SEQ ID NO:26).
[00121] De acordo com uma modalidade, em CDR3-H, X1 é A ou T, e X2 é S.
[00122] De acordo com uma modalidade, CDR3-H consiste em AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21), ou TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27).
[00123] Qualquer combinação destas modalidades faz a parte da invenção.
[00124] Alternativamente, o anticorpo de acordo com a invenção compreende:
[00125] a) uma CDR1-H consistindo na sequência GFTFSX1YX2 (SEQ ID NO:81) em que X1 é R ou S, em particular S e X2 é A ou D; e
[00126] uma CDR2-H consistindo na sequência ISSGGX1X2X3 (SEQ ID NO:82) em que X1 está ausente, S ou G (em particular G), X2 é D, Y ou I e X3 é T ou I; e
[00127] uma CDR3-H consistindo na sequência ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) ou ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15); e/ou
[00128] b) uma CDR1-L consistindo na sequência QNVGTN (SEQ ID NO:4); e
[00129] uma CDR2-L consistindo na sequência SAS; e
[00130] uma CDR3-L consistindo na sequência QQYNSYPLYT (SEQ ID NO:6) ou QQYNNYPLYT (SEQ ID NO:18).
[00131] De acordo com uma modalidade, CDR2-H consiste na sequência ISSGGSYI (SEQ ID NO:2) ou ISSGGDT (SEQ ID NO:14).
[00132] De acordo com uma modalidade, CDR2-H consiste na sequência ISSGGSYI (SEQ ID NO:2) e CDR3-H da sequência ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3).
[00133] De acordo com uma modalidade, CDR2-H consiste em ISSGGDT (SEQ ID NO:14) e CDR3-H da sequência ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15).
[00134] De acordo com uma modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção compreende as sequências de uma CDR das cadeias pesadas e/ou leves dos chamados anticorpos anti-CEACAM5 MAb1, MAb2, MAb2K52R, MAb3, MAb4 e MAb5.
[00135] Por isso, a invenção relaciona-se a um anticorpo que compreende:
[00136] a) CDR1-H de sequência GFTFSSYA (SEQ ID NO:1) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:1 por uma substituição de aminoácido; uma CDR2-H de sequência ISSGGSYI (SEQ ID NO:2) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:2 por uma ou mais substituições de aminoácidos; uma CDR3-H de sequência ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:3 por uma substituição de aminoácido; uma CDR1-L de sequência QNVGTN (SEQ ID NO:4) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:4 por uma substituição de aminoáci- do; uma CDR2-L de sequência SAS ou uma sequência que se diferencia de SAS por uma substituição de aminoácido e uma CDR3-L de sequência QQYNSYPLYT (SEQ ID NO:6) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:6 por uma substituição de aminoácido; ou
[00137] b) CDR1-H de sequência GFVFSSYD (SEQ ID NO:7) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:7 por uma substituição de aminoácido; uma CDR2-H de sequência ISSGGGIT (SEQ ID NO:8) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:8 por uma ou mais substituições de aminoácidos; uma CDR3-H de sequência AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:9 por uma ou mais substituições de aminoácidos; uma CDR1-L de sequência ENIFSY (SEQ ID NO:10) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:10 por uma substituição de ami- noácido; uma CDR2-L de sequência NTK ou NTR ou uma sequência que se diferencia de NTK ou NTR por uma substituição de aminoácido e uma CDR3-L de sequência QHHYGTPFT (SEQ ID NO:12) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:12 por uma substituição de aminoácido; ou
[00138] c) CDR1-H de sequência GFTFSRYA (SEQ ID NO:13) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:13 por uma substituição de aminoácido; uma CDR2-H de sequência ISSGGDT (SEQ ID NO:14) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:14 por uma ou mais substituições de aminoácidos; uma CDR3-H de sequência ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:15 por uma substituição de aminoácido; uma CDR1-L de sequência QNVGTN (SEQ ID NO:16) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:16 por uma substituição de aminoáci- do; uma CDR2-L de sequência SAS ou uma sequência que se diferencia de SAS por uma substituição de aminoácido e uma CDR3-L de sequência QQYNNYPLYT (SEQ ID NO:18) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:18 por uma substituição de aminoácido; ou
[00139] d) CDR1-H de sequência GFTFSSYD (SEQ ID NO:19) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:19 por uma substituição de aminoácido; uma CDR2-H de sequência ISSYGGRT (SEQ ID NO:20) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:20 por uma ou mais substituições de aminoácidos; uma CDR3-H de sequência AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:21 por uma ou mais substituições de aminoá- cidos; uma CDR1-L de sequência ENIYSY (SEQ ID NO:22) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:22 por uma substituição de aminoácido; uma CDR2-L de sequência NAK ou uma sequência que se diferencia de NAK por uma ou mais substituições de aminoácidos e uma CDR3-L de sequência QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:24 por uma substituição de aminoácido; ou
[00140] e) um anticorpo que compreende uma CDR1-H de sequência GFAFSSYD (SEQ ID NO:25) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:25 por uma substituição de aminoácido; uma CDR2-H de sequência INSGGGIT (SEQ ID NO:26) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:26 por uma ou mais substituições de amino- ácidos; uma CDR3-H de sequência TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:27 por uma ou mais substituições de aminoácidos; uma CDR1-L de sequência ENIYSY (SEQ ID NO:28) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:28 por uma substituição de aminoácido; uma CDR2-L de sequência NAK; ou uma sequência que se diferencia de NAK por uma ou mais substituições de aminoácidos e uma CDR3-L de sequência QHHYGTPFT (SEQ ID NO:30) ou uma sequência que se diferencia da SEQ ID NO:30 por uma substituição de aminoácido.
[00141] Um ou mais aminoácidos individuais podem ser alterados pela substituição, em particular pela substituição conservativa, em uma ou mais das sequências acima de uma CDR. Tal alteração pode ser, por exemplo, destinada a remover um sítio de glicosilação ou um sítio de deamidação, com relação à humanização do anticorpo.
[00142] Baseado nos alinhamentos das sequências das regiões VH e VL de MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 e MAb5, e baseado em substituições ácidas únicas em uma variante do anticorpo MAb2, um aminoá- cido pode ser substituído:
[00143] - em CDR1-H: em uma ou mais das posições 1 a 6, por exemplo, na posição 3, de uma CDR1-H de sequência GFVFSSYD (SEQ ID NO:7), GFTFSSYD (SEQ ID NO:19) ou GFAFSSYD (SEQ ID NO:25), ou na posição 6 de uma CDR1-H de sequência GFTFSSYA (SEQ ID NO:1) ou GFTFSRYA (SEQ ID NO:13); e/ou
[00144] - em CDR2-H, em uma ou mais de qualquer uma das posi ções, ou em uma, duas ou três das posições 2, 4, e 7 de uma CDR2-H da sequência ISSGGGIT (SEQ ID NO:8), ISSYGGRT (SEQ ID NO:20) ou INSGGGIT (SEQ ID NO:26), ou em uma, duas ou três das posições 6, 7 e 8 (onde a sequência é 8 aminoácidos maior) de uma CDR2-H da sequência ISSGGSYI (SEQ ID NO:2) ou ISSGGDT (SEQ ID NO:14); e/ou ver acima
[00145] - em CDR3-H, em uma ou mais das posições 1, 7, 8, 11 e 13, por exemplo, em uma ou duas das posições 1 e 7 de CDR3-H da sequência AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21), ou TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27), ou na posição 3, 4, 7, 8, 9, 10, ou 11 da sequência ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) ou ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15); e/ou
[00146] - em CDR1-L, em uma ou mais das posições 1 a 5, em par ticular em uma ou mais das posições 1, 2, 3 e 5 ou na posição 4 de CDR1-L da sequência ENIFSY (SEQ ID NO:10) ou ENIYSY (SEQ ID NO:28); e/ou
[00147] - em CDR2-L, nas posições 2 e/ou 3 da sequência NAK, NTK ou NTR, em particular pelo menos na posição 3 se K está presente. Em tal caso, R, por exemplo, pode ser substituído por K na posição 3 de uma CDR2-L; e/ou
[00148] - em CDR3-L, em uma ou mais das posições 1, 2, 5, 6, 8 e 9, por exemplo, na posição 6 de CDR3-L da sequência QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24) ou QHHYGTPFT (SEQ ID NO:30), ou na posição 5 de CDR3-L da sequência QQYNsYPLYT (SEQ ID NO:6) ou QQYNNYPLYT (SEQ ID NO:18).
[00149] De acordo com uma modalidade, nos anticorpos da invenção:
[00150] - posição 5 de CDR3-H da sequência AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21), ou TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27); e/ou
[00151] - posição 6 de CDR1-L da sequência ENIFSY (SEQ ID NO:10) ou ENIYSY (SEQ ID NO:28); e/ou
[00152] - posição 3 de CDR3-L da sequência QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24) ou QHHYGTPFT (SEQ ID NO:30)
[00153] é (são) não modificados.
[00154] De acordo com uma modalidade, em CDR1-H da sequência GFVFSSYD (SEQ ID NO:7), GFTFSSYD (SEQ ID NO:19) ou GFAFSSYD (SEQ ID NO:25), o aminoácido que é substituído pelo aminoácido na posição na posição 3 de CDR1-H é selecionado a partir do grupo consistindo em T, A ou V.
[00155] De acordo com uma modalidade, em CDR1-H da sequência GFTFSSYA (SEQ ID NO:1) ou GFTFSRYA (SEQ ID NO:13), o amino- ácido que é substituído pelo aminoácido na posição 6 de CDR1-H é R ou S.
[00156] De acordo com uma modalidade, em CDR3-H da sequência AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21), ou TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27), o aminoácido que é substituído pelo aminoácido na posição 1 de CDR3-H é A ou T e/ou o aminoácido que é substituído pelo aminoácido na posição 7 de CDR3- H é T ou S.
[00157] De acordo com uma modalidade, em CDR3-H da sequência ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) ou ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15), o aminoácido que é substituído pelo aminoácido na posição 3 de CDR3-H é V ou P, na posição 4 é A ou N, na posição 7 é D ou G, na posição 8 é S ou N, na posição 9 é S ou P, na posição 10 é F ou A, ou na posição 11 é W ou Y.
[00158] De acordo com uma modalidade, o aminoácido que é substituído pelo aminoácido na posição 4 de CDR1-L é Y ou F.
[00159] De acordo com uma modalidade, em CDR2-L da sequência NAK, NTK ou NTR, o aminoácido que é substituído pelo aminoácido na posição 2 de CDR2-L é A ou T.
[00160] De acordo com uma modalidade, em CDR3-L da sequência QQYNsYPLYT (SEQ ID NO:6) ou QQYNNYPLYT (SEQ ID NO:18), o aminoácido que é substituído pelo aminoácido na posição 5 de CDR3- L é N ou S.
[00161] De acordo com uma modalidade, em CDR3-L da sequência QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24) ou QHHYGTPFT (SEQ ID NO:30), o aminoácido que é substituído pelo aminoácido na posição 6 de CDR3- L é I ou T.
[00162] Qualquer combinação das modalidades acima faz parte da invenção.
[00163] Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção é um anticorpo convencional, como um anticorpo monoclonal convencional, ou um fragmento de anticorpo, um anticorpo biespecífico ou multiespecífico.
[00164] Em uma modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção compreende ou consiste em IgG ou fragmento desta.
[00165] A invenção também fornece anticorpos como definido acima compreendendo ainda pelo menos o domínio variável da cadeia pesada e/ou o domínio variável da cadeia leve de um dos chamados cinco anticorpos anti-CEACAM5 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 e MAb5.
[00166] Dessa forma, uma modalidade da invenção refere-se a um anticorpo compreendendo:
[00167] a) um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:31 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela, e/ou um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:32 ou sequência pelo menos 85% idêntica a ela; ou
[00168] b) um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:33 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela, e/ou domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:34 ou sequência pelo menos 85% idêntica a ela; ou
[00169] c) um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:35 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela, e/ou domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:36 ou sequência pelo menos 85% idêntica a ela; ou
[00170] d) um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:37 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela, e/ou domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:38 ou sequência pelo menos 85% idêntica a ela; ou
[00171] e) um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:39 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela, e/ou domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:40 ou se- quência pelo menos 85% idêntica a ela. Por exemplo, a sequência do domínio variável da cadeia pesado ou leve pode diferenciar-se da sequência de referência SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40, como apropriado, por uma ou mais substituição(ões) de aminoáci- do, em particular por uma ou mais substituição(ões) de aminoácido conservativa e/ou substituição(ões) com resíduos canônicos. Em uma modalidade, a sequência do domínio variável da cadeia pesada ou leve pode diferenciar-se da sequência de referência SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 pela substituição(ões) de aminoácido conservativa, somente.
[00172] As alterações de sequência quando comparadas com a sequência SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 estarão presentes essencialmente em uma ou mais das regiões estruturais, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L e/ou FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.
[00173] Entretanto, as substituições de aminoácido em uma ou mais CDRs também são possíveis. Em uma modalidade, a sequência do domínio variável da cadeia leve pode diferenciar-se da sequência SEQ ID NO:34 pelo menos por uma substituição de K por R na posição 52 da SEQ ID NO:34 (em CDR2-L).
[00174] O anticorpo da invenção e um fragmento deste podem ser, respectivamente, um anticorpo murino e um fragmento de um anticorpo murino.
[00175] O anticorpo também pode ser um anticorpo quimérico, e em uma modalidade, um anticorpo murino/humano, por exemplo, um anticorpo compreendendo os domínios variáveis murinos das cadeias pesadas e leves e um domínio CH e um domínio CL de um anticorpo humano. O polipeptídeo pode ser um fragmento de tal anticorpo.
[00176] De acordo com uma modalidade, o anticorpo da invenção é:
[00177] um anticorpo quimérico compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:41 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela ou uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:42 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela (isto é, cadeia pesada e/ou leve de chMAb1 como descrita no exemplo 5); ou uma cadeia pesada e uma cadeia leve ou,
[00178] um anticorpo quimérico compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:43 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela ou uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:44 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela; (isto é, cadeia pesada e/ou leve de chMAb2 como descrita no exemplo 5); ou ou uma cadeia pesada e uma cadeia leve ou,
[00179] um anticorpo quimérico compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:45 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela ou uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:46 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela; (isto é, cadeia pesada e/ou leve de chMAb3 como descrita no exemplo 5); ou uma cadeia pesada e uma cadeia leve ou,
[00180] um anticorpo quimérico compreendendo ou consistindo em cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:47 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela ou uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:48 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela, (isto é, cadeia pesada e/ou leve de chMAb4 como descrita no exemplo 5); ou ou uma cadeia pesada e uma cadeia leve ou,
[00181] um anticorpo quimérico compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:49 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela ou uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:50 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela (isto é, cadeia pesada e/ou leve de chMAb5 como descrito no exemplo 5), ou uma cadeia pesada e uma cadeia leve ou,
[00182] um fragmento do anticorpo quimérico definido na), b), c), d) ou e).
[00183] O anticorpo também pode ser um anticorpo humanizado ou um fragmento de um anticorpo humanizado. Em uma modalidade, o anticorpo da invenção pode resultar de humanização de qualquer um dos anticorpos quiméricos definidos acima na), b), c), d), e) ou f).
[00184] Numerosos métodos de humanização de uma sequência de anticorpo são conhecidos na técnica; ver por exemplo, a revisão por Almagro & Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633. Um método comumente usado é o enxerto de uma CDR ou reformatação de anticorpo, que envolve o enxerto das sequências da CDR de um anticorpo de doador, geralmente um anticorpo de camundongo, na estrutura de um anticorpo humano de especificidade diferente. Uma vez que o enxerto de uma CDR pode reduzir a especificidade de ligação e afinidade, e dessa forma a atividade biológica, de um anticorpo não humano com enxerto de CDR, as retromutações podem ser introduzidas nas posições selecionadas a partir do anticorpo enxertado com CDR a fim de conservar a especificidade de ligação e a afinidade do anticorpo parental. A identificação de posições de retromutações possíveis pode ser realizada usando a informação disponível na literatura e em bancos de dados de anticorpos. Os resíduos de aminoácidos que são candidatos à retromutações são tipicamente aqueles que estão localizados na superfície de uma molécula de anticorpo, enquanto os resíduos que estão inseridos ou que têm um baixo grau de exposição superficial não serão normalmente alterados. Uma técnica de humanização alternativa ao enxerto de uma CDR e retromutação é recomposição da superfície, na qual os resíduos expostos não superficiais de origem não humana são conservados, enquanto os resíduos superficiais são alterados para resíduos humanos. Outra técnica alternativa é conhecida como "seleção guiada" (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12, 899) e pode ser usada para derivar de um anticorpo murino um anticorpo totalmente humano que conserva o epítopo e caraterísticas de ligação do anticorpo parental.
[00185] Para anticorpos quiméricos, a humanização tipicamente envolve a modificação das regiões estruturais das sequências da região variável.
[00186] Os resíduos de aminoácido que são parte de uma CDR tipicamente não serão alterados com relação à humanização, embora em certos casos possa ser desejável alterar os resíduos de aminoácidos de CDR individuais, por exemplo, para remover um sítio de glicosila- ção, um sítio de deamidação ou um resíduo cisteína indesejado. A gli- cosilação N-ligada ocorre pela ligação de uma cadeia de oligossacarí- deos a um resíduo de asparagina na sequência do tripeptídeo Asn-X- Ser ou Asn-X-Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto Pro. A remoção de um sítio de N-glicosilação pode ser alcançada transformando o resíduo Asn ou Ser/Thr por um resíduo diferente, por exemplo, por meio da substituição conservativa. A deamidação dos resíduos asparagina e glutamina pode ocorrer dependendo de fatores como pH e exposição da superfície. Os resíduos de asparagina são particularmente suscetíveis à deamidação, principalmente quando presentes na sequência Asn-Gly, e até um menor grau em outras sequências dipep- tídicas como Asn-Ala. Quando tal sítio de deamidação, por exemplo, Asn-Gly, está presente em uma sequência de CDR, por isso, pode ser desejável remover o sítio, tipicamente pela substituição conservativa para remover um dos resíduos envolvidos. A substituição em uma sequência de CDR para remover um dos resíduos envolvidos também é destinada a ser englobada pela presente invenção.
[00187] Tomando o chamado "anticorpo MAb2" como um exemplo, um anticorpo humanizado ou fragmento deste podem compreender as seguintes mutações na cadeia pesada variável: P ao invés de G na posição 9; e/ou G ao invés de V na posição 10; e/ou S ao invés de K na posição 19; e/ou R ao invés de K na posição 43; e/ou G ao invés de R na posição 44; e/ou A ao invés de F na posição 60; e/ou S ao invés de D na posição 62; e/ou K ao invés de Q na posição 65; e/ou T ao invés de K na posição 87; e/ou V ao invés de I na posição 89; e/ou S ao invés de um na posição 113; as posições sendo dadas por referência à SEQ ID NO:33.
[00188] Ainda tomando o chamado "anticorpo MAb2" como um exemplo, um anticorpo humanizado ou fragmento deste pode compreender as seguintes mutações na cadeia leve variável: D ao invés de E na posição 17; e/ou R ao invés de T na posição 18; e/ou P ao invés de Q na posição 40; e/ou K ao invés de Q na posição 45; e/ou R ao invés de K na posição 52; e/ou D ao invés de Q na posição 70; e/ou T ao invés de K na posição 74; e/ou S ao invés de N na posição 76; e/ou A ao invés de G na posição 84; e/ou T ao invés de S na posição 85; as posições sendo dadas por referência à SEQ ID NO:34.
[00189] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é um anticorpo humanizado compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada compreendendo as seguintes mutações, as posições sendo dadas por referência à SEQ ID NO:33:
[00190] a) P ao invés de G na posição 9; e G ao invés de V na posição 10; e S ao invés de K na posição 19; e R ao invés de K na posição 43; e S ao invés de D na posição 62; e K ao invés de Q na posição 65; e T ao invés de K na posição 87; ou
[00191] b) P ao invés de G na posição 9; e G ao invés de V na posição 10; e S ao invés de K na posição 19; e R ao invés de K na posição 43; e G ao invés de R na posição 44; e A ao invés de F na posição 60; e S ao invés de D na posição 62; e K ao invés de Q na posição 65; e T ao invés de K na posição 87; e V ao invés de I na posição 89; e S ao invés de um na posição 113; e/ou
[00192] um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia leve compreendendo as seguintes mutações, as posições sendo dadas por referência à SEQ ID NO:34:
[00193] c) D ao invés de E na posição 17; e P ao invés de Q na posição 40; e K ao invés de Q na posição 45; e T ao invés de K na posição 74; e S ao invés de N na posição 76; ou
[00194] d) D ao invés de E na posição 17; e R ao invés de T na posição 18; e P ao invés de Q na posição 40; e K ao invés de Q na posição 45; e D ao invés de Q na posição 70; e T ao invés de K na posição 74; e S ao invés de N na posição 76; e A ao invés de G na posição 84; e T ao invés de S na posição 85; ou
[00195] e) D ao invés de E na posição 17; e R ao invés de T na posição 18; e P ao invés de Q na posição 40; e K ao invés de Q na posição 45; e R ao invés de K na posição 52; e D ao invés de Q na posição 70; e T ao invés de K na posição 74; e S ao invés de N na posição 76; e A ao invés de G na posição 84; e T ao invés de S na posição 85.
[00196] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é um anticorpo humanizado obtido pelo enxerto das CDRs de um anticorpo da invenção em regiões estruturais de anticorpos alternativos, mais especificamente em regiões estruturais humanas. Tomando MAb2 como um exemplo, as 6 CDRs de MAb2K52R foram enxertadas em uma região estrutural humana consistindo dos genes IGHV3-23 e IGKV1D-39, e três retromutações foram introduzidas correspondendo às posições 34 e 53 em VL (SEQ ID NO. 34) e à posição 50 em VH (SEQ ID NO. 33) resultando em um anticorpo compreendendo um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:74 e um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:75.
[00197] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é um anticorpo humanizado compreendendo ou consistindo em uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO: 74, ou sequência pelo menos 85% idêntica a ela; e/ou uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:55 ou SEQ ID NO: 75 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela (domínios variáveis humanizados de cadeias pesadas e leves de MAb2).
[00198] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:51 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela e uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:17 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela, ou uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:5 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela e uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:23 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela, ou cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:5 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela e uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:29 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela, ou cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:51 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela e uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:55 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela, ou uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO: 74 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela e uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO: 75 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela.
[00199] No dito anticorpo humanizado ou fragmento deste, os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves podem compreender regiões estruturais aceptoras humanas. O anticorpo humanizado compreende ainda domínios constantes das cadeias pesada e leve humanas, onde presente.
[00200] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é anticorpo huMAb2-3 ou uma variante deste, isto é, o anticorpo isolado que se liga ao domínio A3-B3 das proteínas CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis e que compreende:
[00201] a) uma cadeia pesada consistindo na sequência SEQ ID NO:87 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela; ou
[00202] b) uma cadeia leve consistindo na sequência SEQ ID NO:88 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela ou uma cadeia pesada e uma cadeia leve.
[00203] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é o anticorpo huMAb2-4 (MAb2_VL1d VH1-IgG1) ou uma variante deste, isto é, o anticorpo isolado que se liga ao domínio A3-B3 das proteínas CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis e que compreende:
[00204] c) uma cadeia pesada consistindo na sequência SEQ ID NO:89 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela; e/ou
[00205] d) uma cadeia leve consistindo na sequência SEQ ID NO:90 ou uma sequência pelo menos 85% idêntica a ela.
[00206] O anticorpo, de acordo com a invenção, também pode ser um anticorpo de domínio único ou um fragmento deste. Em uma modalidade da invenção, um fragmento de anticorpo de domínio único pode consistir de uma cadeia pesada variável (VHH) que compreende uma CDR1-H, CDR2-H e CDR3-H dos anticorpos como descrito acima. O anticorpo também pode ser um anticorpo de cadeia pesada, isto é, anticorpo destituído da cadeia leve, que pode ou não conter um domínio CH1.
[00207] O anticorpo de domínio único ou um fragmento deste também pode compreender as regiões estruturais de um anticorpo de domínio único camelídeo, e opcionalmente o domínio constante de um anticorpo de domínio único camelídeo.
[00208] O anticorpo, de acordo com a invenção, também pode ser um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo humanizado, selecionado a partir do grupo consistindo em Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, e diacorpos.
[00209] O anticorpo também pode ser um anticorpo biespecífico ou multiespecífico formado de fragmentos de anticorpo, pelo menos um fragmento de anticorpo sendo um fragmento de anticorpo de acordo com a invenção. Os anticorpos multiespecíficos são complexos proteicos polivalentes como descrito por exemplo, em EP 2.050.764 A1 ou US 2005/0003403 A1.
[00210] Os anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos, de acordo com a invenção, podem ter especificidade pelo (a) epítopo A3-B3 em CEACAM5 de Macaca fascicularis / humana visado por um dos chamados anticorpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 e MAb5 e (b) pelo menos um outro antígeno. De acordo com uma modalidade, pelo menos um outro antígeno não é membro da família de CEACAM humana ou de Macaca fascicularis, e em uma modalidade pelo menos uma ou todas de CEACAM1 humana e de Macaca fascicularis, CEACAM6 humana e de macaco, CEACAM7 humana e de Macaca fascicularis, e CEACAM8 humana e de Macaca fascicularis. De acordo com outra modalidade, pelo menos um outro antígeno pode ser um epítopo em CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis exceto o dito epítopo A3- B3 visado por um dos chamados anticorpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 e MAb5.
[00211] Os ditos anticorpos podem ser produzidos por qualquer técnica bem conhecida na técnica. Em uma modalidade, os ditos anticorpos são produzidos por técnicas como descrito a seguir.
[00212] Os anticorpos e os fragmentos destes, de acordo com a invenção, podem ser usados em um isolado (por exemplo, purificado) ou contidos em um vetor, como uma membrana ou vesícula lipídica (por exemplo, um lipossoma). Ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras recombinantes
[00213] Um objeto adicional da invenção refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo ou consistindo em uma sequência que codifica um anticorpo da invenção como definido acima.
[00214] Tipicamente, o dito ácido nucleico é uma molécula de DNA ou RNA, que pode estar incluída em qualquer vetor adequado, como um plasmídeo, cosmídeo, epissoma, cromossomo artificial, fago ou um vetor viral.
[00215] Os termos "vetor", "vetor de clonagem" e "vetor de expressão" significam o veículo pelo qual a sequência de DNA ou RNA (por exemplo, um gene estranho) pode ser introduzida em uma célula hospedeira, para transformar o hospedeiro e promover a expressão (por exemplo, transcrição e tradução) da sequência introduzida.
[00216] Deste modo, um objeto adicional da invenção refere-se a um vetor compreendendo um ácido nucleico da invenção.
[00217] Tais vetores podem compreender elementos reguladores, como um promotor, potencializador, terminador e similares, para provocar ou direcionar a expressão do dito polipeptídeo na administração a um indivíduo. Exemplos de promotores e potencializadores usados no vetor de expressão para uma célula animal incluem o promotor precoce e o potencializador de SV40 (Mizukami T. et al. 1987), o promotor de LTR e potencializador de vírus de leucemia de camundongo Moloney (Kuwana Y et al. 1987), promotor (Mason JO et al. 1985) e poten- cializador (Gillies SD et al. 1983) de cadeia H de imunoglobulina e similares.
[00218] Qualquer vetor de expressão de célula animal pode ser usado, contanto que um gene que codifica a região C do anticorpo humano possa ser inserido e expresso. Exemplos de vetores adequados incluem pAGE107 (Miyaji H et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T et al. 1987), pHSG274 (Brady G et al. 1984), pKCR (O'Hare K et al. 1981), pSG1 a beta d2-4-(Miyaji H et al. 1990) e similares.
[00219] Outros exemplos de plasmídeos incluem plasmídeos de replicação compreendendo uma origem de replicação ou plasmídeos integrativos, tais como, por exemplo, pUC, pcDNA, pBR e similares.
[00220] Outros exemplos do vetor viral incluem vetores adenovirais, retrovirais, vírus de herpes e AAV. Tais vírus recombinantes podem ser produzidos por técnicas conhecidas na técnica, tais como por transfecção de células de empacotamento ou por transfecção transiente com plasmídeos de auxiliar ou vírus. Exemplos típicos do vírus células de empacotametno incluem células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. protocolos detalhados para produzir tais vírus recombinantes com replicação defectiva podem ser encontrados por exemplo, nos WO 95/14785, WO 96/22378, US 5.882.877, US 6.013.516, US 4.861.719, US 5.278.056 e WO 94/19478.
[00221] Um objeto adicional da presente invenção refere-se a uma célula que foi transfectada, infectada ou transformada por um ácido nucleico e/ou um vetor de acordo com a invenção.
[00222] O termo "transformação" significa a introdução de um gene (isto é, extrínseco), sequência de DNA ou RNA "estranhos" a uma célula hospedeira, para que a célula hospedeira expresse o gene ou a sequência introduzidos para produzir uma substância desejada, tipicamente uma proteína ou enzima codificada pelo gene ou sequência introduzidos. Uma célula hospedeira que recebe e expressa DNA introduzido ou RNA foi "transformada".
[00223] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser usados para produzir um anticorpo recombinante da invenção em um sistema de expressão adequado. O termo "sistema de expressão" significa uma célula hospedeira e vetor compatível sob condições adequadas, por exemplo, para a expressão de uma proteína codificada pelo DNA estranho transportado pelo vetor e introduzido na célula hospedeira.
[00224] Sistemas de expressão comuns incluem células hospedeiras de E. coli e vetores de plasmídeo, células hospedeiras de insetos e vetores de Baculovírus, e células hospedeiras mamíferas e vetores. Outros exemplos de células hospedeiras incluem, sem limitação, células procarióticas (como bactérias) e células eucarióticas (como células de levedura, células mamíferas, células de insetos, células vegetais, etc.). Exemplos específicos incluem E. coli, leveduras Kluyveromyces ou Saccharomyces, linhagens de células mamíferas (por exemplo, células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.) bem como culturas de células primárias ou estabelecidas de mamíferos (por exemplo, produzidas de linfoblastos, fibroblastos, células embrionárias, células epiteliais, células nervosas, adipócitos, etc.). Exemplos também incluem célula de camundongo SP2/0-Ag14 (ATCC CRL1581), célula de camundongo P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL1580), célula CHO na qual um gene de dihidrofolato redutase (a seguir designado como "gene DHFR") é defectivo (Urlaub G e al; 1980), célula de rato YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (ATCC CRL1662, a seguir designada como "célula YB2/0"), e similares. Em uma modalidade, a célula YB2/0 é usada, uma vez que a atividade de ADCC de anticorpos quiméricos ou humanizados é aumentada quando expressos nesta célula.
[00225] Para a expressão do anticorpo humanizado, o vetor de expressão pode ser do tipo no qual um gene que codifica uma cadeia pesada do anticorpo e um gene que codifica uma cadeia leve do anticorpo existem em vetores separados ou do tipo no qual ambos os genes existem no mesmo vetor (tipo tandem). A respeito da facilidade da construção de um vetor de expressão de anticorpo humanizado, facilidade da introdução em células animais e equilíbrio entre os níveis de expressão de cadeias H e L do anticorpo em células animais, o vetor de expressão de anticorpo humanizado é do tipo tandem Shitara K et al. J Immunol Methods. 1994 Jan 3; 167 (1-2):271-8). Exemplos do vetor de expressão do anticorpo humanizado tipo tandem incluem pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 e similares.
[00226] A presente invenção também se refere a um método de produção de uma célula hospedeira recombinante que expressa um anticorpo de acordo com a invenção, o dito método compreendendo as etapas consistindo em: (i) introdução in vitro ou ex vivo de um ácido nucleico recombinante ou um vetor como descrito acima em uma célula hospedeira competente, (ii) cultura in vitro ou ex vivo da célula hospedeira recombinante obtida e (iii), opcionalmente, seleção das células que expressam e/ou secretam o dito anticorpo.
[00227] Tais células hospedeiras recombinantes podem ser usadas para a produção de anticorpos da invenção. Métodos de produção de anticorpos da invenção
[00228] Os anticorpos da invenção podem ser produzidos por qualquer técnica conhecida na técnica, tal como, sem limitação, qualquer técnica química, biológica, genética ou enzimática, sozinha ou em combinação.
[00229] Conhecendo a sequência de aminoácidos da sequência desejada, um especialista na técnica pode produzir prontamente os ditos anticorpos ou cadeias de imunoglobulina, por técnicas padrão para a produção de polipeptídeos. Por exemplo, podem ser sintetizados usando o método em fase sólida bem conhecido usando um aparelho de síntese de peptídeos comercialmente disponível (como aquele feito pela Applied Biosystems, Foster City, Califórnia) e seguindo as instruções do fabricante. Alternativamente, os anticorpos e as cadeias de imunoglobulina da invenção podem ser sintetizados por técnicas de DNA recombinante como é bem conhecido na técnica. Por exemplo, estes fragmentos podem ser obtidos como produtos de expressão de DNA após incorporação de sequências de DNA que codificam o (po- li)peptídeo desejado em vetores de expressão e introdução de tais vetores em hospedeiros eucarióticos ou procarióticos adequados que expressarão o polipeptídeo desejado, o qual pode ser depois isolado usando técnicas bem conhecidas.
[00230] A invenção refere-se ainda a um método de produção de um anticorpo da invenção, método o qual compreende as etapas con- sistindo em: (i) cultura de uma célula hospedeira transformada de acordo com a invenção; (ii) a expressão do dito anticorpo ou polipeptí- deo; e (iii) recuperação do anticorpo ou polipeptídeo expresso.
[00231] Os anticorpos da invenção são apropriadamente separados do meio de cultura por procedimentos de purificação de imunoglobuli- na convencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, croma- tografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatogra- fia de afinidade.
[00232] Em uma modalidade, um anticorpo quimérico humanizado da presente invenção pode ser produzido obtendo sequências nuclei- cas que codificam os domínios VL e VH humanizados como anteriormente descrito, construção de um vetor de expressão de anticorpo quimérico humano inserindo-os em um vetor de expressão de célula animal tendo genes que codificam CH de anticorpo humano e CL de anticorpo humano, e expressam a sequência de codificação pela introdução do vetor de expressão em uma célula animal.
[00233] Já que o domínio CH de um anticorpo quimérico humano pode ser qualquer região que pertença às cadeias pesadas de imuno- globulina humana, mas aquelas da classe de IgG são adequadas e qualquer uma das subclasses que pertencem à classe de IgG, como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, também podem ser usadas. Também, como a CL de um anticorpo quimérico humano, pode ser qualquer região que pertença a cadeias leves de imunoglobulina humana, e aquelas de classe kappa ou classe lambda podem ser usadas.
[00234] Métodos para produção de anticorpos humanizados ou quiméricos envolvem DNA recombinante convencional e técnicas de transfecção gênica são bem conhecidos na técnica (Ver Morrison SL. et al. (1984) e documentos de patentes US5.202.238; e US5.204.244).
[00235] Os métodos para produção de anticorpos humanizados baseados em DNA recombinante convencional e técnicas de transfecção gênica são bem conhecidos na técnica (Ver, e. g., Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS.et al. 1985). Os anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, a técnica descrita no pedido de patente WO2009/032661, enxerto da CDR (EP239.400; publicação PCT WO91/09967; Pat. U.S. Nos. 5.225.539; 5.530.101; e 5.585.089), embutindo ou recomposição de superfície (EP 592,106; EP 519,596; Pa- dlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA.et al. (1994)), e mistura da cadeia (U.S. Apropriado. N° 5,565,332). A tecnologia de DNA recombinante geral para a preparação de tais anticorpos também é conhecida (ver Pedido de Patente Europeia EP 125023 e Pedido de Patente Internacional WO 96/02576).
[00236] O Fab da presente invenção pode ser obtido pelo tratamento de um anticorpo que especificamente reage com CEACAM5 com uma protease, como papaína. Também, Fab pode ser produzido pela inserção de sequências de DNA que codificam ambas as cadeias de Fab do anticorpo em um vetor da expressão procariótica, ou de expressão eucariótica, e introdução do vetor em células procarióticas ou eucarióticas (como apropriado) para expressar Fab.
[00237] O F(ab')2 da presente invenção pode ser obtido pelo tratamento de um anticorpo que especificamente reage com CEACAM5 com uma protease, pepsina. Também, o F(ab')2 pode ser produzido por ligação de Fab' descrito abaixo via uma ligação de tioéter ou uma ligação de dissulfeto.
[00238] O Fab' da presente invenção pode ser obtido pelo tratamento de F(ab')2 que reage especificamente com CEACAM5 com um agente redutor, como ditiotreitol. Além disso, Fab' pode ser produzido pela inserção de sequências de DNA que codificam as cadeias de Fab' do anticorpo em um vetor para expressão procariótica, ou um vetor da expressão eucariótica e introdução do vetor em células procarióticas ou eucarióticas (como apropriado) para realizar sua expressão.
[00239] O scFv da presente invenção pode ser produzido tomando sequências das CDRs ou domínios VH e VL como anteriormente descrito, construindo um DNA que codifica um fragmento de scFv, inserindo o DNA em um vetor de expressão procariótico ou eucariótico, e em seguida introduzindo o vetor de expressão em células procarióticas ou eucarióticas (como apropriado) para expressar o scFv. Para gerar um fragmento de scFv humanizado, uma tecnologia bem conhecida chamada enxerto de CDR pode ser usada, que envolve a seleção das regiões de determinação de complementariedade (CDRs) de acordo com a invenção e enxerto delas para uma região estrutural de fragmento de scFv humano de estrutura tridimensional conhecida (ver, por exemplo, W098/45322; WO 87/02671; US5.859.205; US5.585.089; US4.816.567; EP0173494).
Modificação dos anticorpos da invenção
[00240] A(s) modificação(ões) da sequência de aminoácidos dos anticorpos descrita neste pedido é(são) contemplada(s). Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. É conhecido que, quando um anticorpo humanizado é produzido enxertando simplesmente somente CDRs em VH e VL de um anticorpo derivado de um animal não humano em FRs do VH e VL de um anticorpo humano, a atividade de ligação de antígeno pode ser reduzida em comparação com aquele do anticorpo original derivado de um animal não humano. Considera-se que vários resíduos de aminoácidos de VH e VL do anticorpo não humano, não somente em CDRs mas também em FRs, podem ser diretamente ou indiretamente associados com a atividade de ligação ao antígeno. Por isso, a substituição destes resíduos de aminoácidos por resíduos de aminoácido diferentes derivados de FRs de VH e VL do anticorpo humano reduziria a atividade de ligação. A fim de resolver o problema, em anticorpos humanos enxertados com CDRs não humanas, tentativas têm de ser feitas para identificar, entre as sequências de aminoá- cidos de FR de VH e VL de anticorpos humanos, um resíduo de ami- noácido que esteja associado diretamente com a ligação do anticorpo, ou que interage com um resíduo de aminoácido de uma CDR, ou que mantém a estrutura tridimensional do anticorpo e que esteja associado diretamente com a ligação ao antígeno. A atividade de ligação ao antí- geno reduzida pode ser aumentada substituindo os aminoácidos identificados por resíduos de aminoácidos do anticorpo original derivado de um animal não humano.
[00241] Em uma modalidade da presente invenção, as seis CDRs de um anticorpo murino da invenção e três aminoácidos da sua região estrutural foram enxertados para uma região estrutural humana, resultando em um anticorpo humanizado (MAb2_VLg5VHg2) tendo uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:74 e uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:75, que manteve as características de ligação à CEACAM5 humana e de cinomolgus.
[00242] Modificações e alterações podem ser feitas na estrutura dos anticorpos da presente invenção, e nas sequências de DNA que os codificam, e ainda resultar em um anticorpo ou polipeptídeo funcional com características desejáveis.
[00243] Na criação das modificações nas sequências amino do po- lipeptídeo, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice hidropático de aminoácidos ao conferir função biológica interativa em uma proteína é geralmente entendida na técnica. Reconhece-se que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e similares. Foi atribuído a cada aminoácido um índice hidropático com base na sua hidrofobicidade e características de carga que estes são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3, 8); fenilalanina (+2, 8); cis- teína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1, 8); glicina (-0,4); tre- onina (-0,7); serina (-0, 8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).
[00244] Um objetivo adicional da presente invenção também engloba variantes conservativas de função dos polipeptídeos da presente invenção.
[00245] Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura proteica sem perda apreciável da atividade. Uma vez que a capacidade interativa e a natureza de uma proteína definem sua atividade funcional biológica, certas substituições de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência proteica, e naturalmente na sua sequência de codificação de DNA, ao obter, no entanto, uma proteína com propriedades similares. É dessa forma contemplado que várias modificações podem ser feitas nas sequências de anticorpos da invenção, ou as sequências de DNA correspondentes que codificam os ditos polipeptídeos, sem perda apreciável da sua atividade biológica.
[00246] É conhecido na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que têm um índice hidropático similar ou escore e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obter uma proteína biológica funcionalmente equivalente. Também é possível usar tecnologias bem estabelecidas, como abordagens de varredura de alanina, para identificar, em um anticorpo ou polipeptídeo da invenção, todos os aminoácidos que podem ser substituídos sem perda significante da ligação ao antígeno. Tais resíduos podem ser qualificados como neutros, uma vez que não estão envolvidos na ligação ao antígeno ou na manutenção da estrutura do anticorpo. Uma ou mais destas posições neutras podem ser substituídas por alanina ou por outro aminoácido podem não modificar as características principais do anticorpo ou polipeptídeo da invenção.
[00247] Isto foi ilustrado na invenção atual por uma abordagem de varredura de alanina feita nas CDRs de MAb2K52R, mostrando que várias posições destas CDRs parecem neutras, uma vez que uma alani- na de fato pode ser substituída sem efeito significante na ligação à CEACAM5 humana e de cinomolgus. Por isso, espera-se que as variantes de anticorpo que resultam de tais substituições neutras permaneçam funcionalmente idênticas ao anticorpo parental. No exemplo fornecido 6.4, as substituições foram feitas em uma variante humanizada de MAb2, mas é predizível que as mesmas variações também manteriam a função biológica quando introduzidas em qualquer variante de MAb2, Mab4 ou Mab5, uma vez que estes anticorpos relacionados todos transportam o mesmo conjunto de 6 CDRs ou muito estrei-tamente relacionadas. As posições neutras podem ser definidas como resíduos 27, 28, 29, 31, 51, 52, 89, 90, 93, 94, 96, 97 nas sequências VL desta família de anticorpo (SEQ ID NO:34 ou SEQ ID NO:38 ou SEQ ID NO:40 ou SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:23 ou SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:55 ou SEQ ID NO:75) e resíduos 26 a 31, 51 a 58, 97, 103, 104, 107, 109 nas sequências VH desta família de anticorpo (SEQ ID NO:33 ou SEQ ID NO:37 ou SEQ ID NO:39 ou SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:51 ou SEQ ID NO:74).
[00248] As posições neutras podem ser vistas como posições onde qualquer substituição de aminoácido pode ser incorporada a CDRs de Mab2, Mab4 ou Mab5. De fato, no princípio da varredura da alanina, a alanina é escolhida uma vez que este resíduo não transporta atributos estruturais ou químicos específicos. É reconhecido geralmente que se uma alanina puder ser substituída por um aminoácido específico sem modificar as propriedades de uma proteína, muitas outras, se não to das as substituições de aminoácidos também sejam provavelmente neutras. No caso oposto onde a alanina é o aminoácido selvagem, se uma substituição específica puder ser mostrada como neutra, é provável que outras substituições também fossem neutras.
[00249] No exemplo fornecido 6.4, quatro posições nas CDRs de Mab2, Mab4 ou Mab5 também são identificadas, que não foram descobertas neutras no contexto da varredura da alanina, mas onde um tipo conservativo de substituições de aminoácidos tem um efeito neutro (resíduos 30 e 92 em sequências VL e resíduos 98 e 100 em sequências VH desta família de anticorpo).
[00250] Também é esperado que duas ou mais mutações neutras nas posições diferentes em uma ou em ambas as duas sequências da cadeia do anticorpo, quando combinadas, resultariam normalmente em um anticorpo que essencialmente mantém as atividades funcionais do anticorpo parental. Isto foi ilustrado, por exemplo, com as substituições combinadas LC_T51A e LC_T94A, VL_S31A e VH_G54Y ou VL_T53I e VH_S53A em MAb2_VLg5VHg2.
[00251] Como delineado acima, as substituições de aminoácidos, por isso, são geralmente baseadas na similaridade relativa dos substi- tuintes da cadeia lateral de aminoácidos, por exemplo, sua hidrofobici- dade, hidrofilicidade, carga, tamanho, e similares. Substituições exemplares que consideram alguma das características precedentes são bem conhecidas por aqueles especialistas na técnica e incluem: argi- nina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e as- paragina; e valina, leucina e isoleucina.
[00252] Também pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com respeito à função efetora, por exemplo, para aumentar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser alcançado introduzindo uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região de Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, o resíduo(s) cisteína pode ser introduzido na região de Fc, por meio disso permitindo a formação de ligação de dissulfeto in- tercadeia nesta região. O anticorpo homodimérico gerado dessa forma pode ter capacidade melhorada de internalização e/ou ter eliminação celular mediada por complemento e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) aumentadas (Caron PC.et al. 1992; e Shopes B. 1992).
[00253] Outro tipo de modificação de aminoácidos do anticorpo da invenção pode ser útil para alterar o modelo de glicosilação original do anticorpo, isto é, deletando uma ou mais porções de carboidratos encontradas no anticorpo e/ou adicionando um ou mais sítios de glicosi- lação que não estão presentes no anticorpo. A presença de qualquer das sequências de tripeptídeos asparagina-X-serina e asparagina-X- treonina, onde X é qualquer aminoácido além de prolina, cria um sítio de glicosilação potencial. A adição ou a deleção de sítios de glicosila- ção ao anticorpo são convenientemente realizadas alterando a se-quência de aminoácidos tal que contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N- ligados).
[00254] Outro tipo da modificação envolve a remoção de sequências identificadas, in silico ou experimentalmente, como potencialmente resultando em produtos de degradação ou heterogeneidade de preparações de anticorpo. Como exemplos, a deamidação de resíduos asparagina e glutamina pode ocorrer dependendo de fatores como pH e exposição da superfície. Os resíduos asparagina são particularmente suscetíveis à deamidação, principalmente quando presentes na sequência Asn-Gly, e mesmo um menor grau em outras sequências de dipeptídeos como Asn-Ala. Quando tal sítio de deamidação, em particular Asn-Gly, está presente em um anticorpo ou polipeptídeo da in- venção, por isso, pode ser desejável remover o sítio, tipicamente pela substituição conservativa para remover um dos resíduos envolvidos. Tais substituições em uma sequência para remover um ou mais dos resíduos envolvidos também são destinadas a serem englobadas pela presente invenção.
[00255] Outro tipo de modificação covalente envolve acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos ao anticorpo. Estes procedimentos são vantajosos em que não requerem a produção do anticorpo em uma célula hospedeira que tem capacidades de glicosilação para gli- cosilação N- ou O-ligada. Dependendo do modo de acoplamento usado, o açúcar(es) pode ser ligado à arginina (a) e histidina, (b) grupos carboxila livres, (c) grupos sulfidrila livres como aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxilas livres como aqueles de serina, treonina ou hidro- xiprolina, (e) resíduos aromáticos como aqueles de fenilalanina, tirosi- na, ou triptofano ou (f) o grupo amida da glutamina. Por exemplo, tais métodos são descritos no WO87/05330.
[00256] A remoção de quaisquer porções de carboidrato presentes no anticorpo pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer a exposição do anticorpo ao composto ácido trifluorometanossulfônico ou composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou todos os açúcares exceto o açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), ao deixar o anticorpo intacto. A desglicosilação química é descrita por So- jahr H. et al. (1987) e por Edge, AS. et al. (1981). A clivagem enzimáti- ca de porções de carboidrato em anticorpos pode ser alcançada pelo uso de uma variedade endo- e exo-glicosidases como descrito por Thotakura, NR. et al. (1987).
[00257] Outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreende a ligação do anticorpo a um de uma variedade de polímeros não proteicos, por exemplo, polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxi- alquilenos, na forma apresentada na Patente US No. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670. 417; 4.791.192 ou 4.179.337.
Imunoconjugados
[00258] A presente invenção também inclui conjugados citotóxicos, ou imunoconjugados, ou conjugados anticorpo-fármaco, ou conjugados. Como usado neste pedido, todos estes termos têm o mesmo significado e são intercambiáveis.
[00259] Os anticorpos murinos, MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, e MAb5, foram conjugados a um maitansinoide (DM4) por um ligante SPDB (N-succinimidil piridilditiobutirato). Foi descoberto que os conjugados do fármaco do anticorpo (ADC) resultantes tinham atividade ci- totóxica sobre células de câncer gástrico humano MKN45, com valores de IC50 < 1 nM.
[00260] Similarmente, os conjugados anticorpo-SPDB-DM4 foram preparados baseados em uma forma quimérica de cada um de MAb1, MAb2, MAb4 e MAb5. Os chMAb1-SPDB-DM4 resultantes, chMAb2- SPDB-DM4, chMAb3-SPDB-DM4, e chMAb4-SPDB-DM4 foram avaliados em duas doses contra tumores primários de cólon CR-IGR-034P mensuráveis implantados s.c. em camundongos SCID fêmeas. A análise de modificações no volume tumoral para cada tratado e controle, e % da regressão tumoral indicou que chMAb2-SPDB-DM4, chMAb4- SPDB-DM4, e chMAb5-SPDB-DM4 foram altamente ativos, pelo menos na dose mais alta analisada, e que chMAb2-SPDB-DM4 foi ativo em ambas as doses analisadas. Porcentagens da regressão tumoral até 82% foram notavelmente obtidas.
[00261] Os conjugados anticorpo-SPDB-DM4 também foram preparados usando as variantes humanizadas de MAb2 (huMAb2-1-SPDB- DM4, huMAb2-2-SPDB-DM4, e huMAb2-3-SPDB-DM4). ADC incluindo variantes quiméricas (chMAb2-SPDB-DM4) ou humanizadas de MAb2 foram comparadas com um anticorpo-SPDB-DM4 irrelevante para a atividade citotóxica sobre células MKN45. Todas as variantes quiméricas e humanizadas de MAb2 ADCs exibiram valores de IC50 < 1 nM, isto é, valores de IC50 53 a 35 vezes inferiores do que a atividade cito- tóxica medida do conjugado de DM4 irrelevante, por meio disso indicando atividades citotóxicas mediadas por CEACAM5 dos conjugados anti-CEACAM5.
[00262] A atividade antitumoral de huMAb2-3-SPDB-DM4 e hu- MAb2-4-SPDB-DM4 foi avaliada e comparada com chMAb2-SPDB- DM4 contra tumores primários de cólon CR-IGR-034P mensuráveis implantados s.c. em camundongos fêmea CD-1 nude. Todos os conjugados foram altamente ativos na dose mais alta analisada (10 mg/kg).
[00263] A atividade antitumoral de huMAb2-3-SPDB-DM4 e hu- MAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 foi ainda avaliada contra tumores primários de cólon CR-IGR-034P mensuráveis implantados s.c. em camundongos SCID fêmeas. huMAb2-3-SPDB-DM4 foi ativo em 5 e 2,5 mg/kg, huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 foi altamente ativo em 5 mg/kg e ativo em 2,5 mg/kg.
[00264] A atividade antitumoral de huMAb2-3-SPDB-DM4 foi ainda avaliada contra tumores primários pulmão LUN-NIC-0014 mensuráveis implantados s.c. em camundongos SCID fêmeas e foi descoberto ser altamente ativo em 10 e 5 mg/kg.
[00265] Cada conjugado de DM4 incluiu um número médio de mo léculas de DM4 (ou "proporção de fármaco para anticorpo" ou "DAR") variando de 2 a 5.
[00266] Consequentemente, a invenção refere-se a "imunoconjuga- dos" compreendendo um anticorpo da invenção ligado ou conjugado a pelo menos um agente inibidor de crescimento, como um agente cito- tóxico ou um isótopo radioativo.
[00267] O "agente inibidor de crescimento" ou "agente antiprolifera- tivo", que podem ser usados indiferentemente, referem-se a um com- posto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente célula de tumor, in vitro ou in vivo.
[00268] O termo "agente citotóxico", como usado neste pedido, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou provoca a destruição das células. O termo "agente citotóxico" é destinado a incluir agentes quimioterápicos, enzimas, antibióticos e toxinas como as toxinas de pequena molécula ou toxinas enzimatica- mente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas e vários agentes anticâncer ou antitumorais descritos abaixo. Em algumas modalidades, o agente ci- totóxico é um taxoide, vincas, um maitansinoide ou análogo de mai- tansinoide como DM1 ou DM4, um pequeno fármaco, um derivado de tomaimicina ou pirrolobenzodiazepina, um derivado de criptoficina, um derivado de leptomicina, um análogo de auristatina ou dolastatina, um profármaco, inibidores de topoisomerase II, um agente alquilante de DNA, um agente antitubulina, um CC-1065 ou análogo de CC-1065.
[00269] Como usado neste pedido, "maitansinoides" denota mai- tansinoides e análogos de maitansinoides. Os maitansinoides são fár- macos que inibem a formação de microtúbulos e que são altamente tóxicos a células mamíferas.
[00270] Exemplos de maitansinoides adequados incluem maitansi- nol e análogos de maitansinol.
[00271] Exemplos de análogos de maitansinol adequados incluem os que têm um anel aromático modificado e os que têm modificações em outras posições. Tais maitansinoides adequados são descritos nas patente U.S. Nos. 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; e 5.846.545.
[00272] Exemplos específicos de análogos adequados de maitansi- nol tendo um anel aromático modificado incluem:
[00273] (1) C-19-decloro (Pat. U.S. No. 4.256.746) (preparado por redução por LAH de ansamitocina P2);
[00274] (2) C-20-hidróxi (ou C-20-demetil) +/-C-19-decloro (Pat. U.S. Nos. 4.361.650 e 4.307.016) (preparado por demetilação usando Streptomyces ou Actinomyces ou decloração usando LAH); e
[00275] (3) C-20-demetóxi, C-20-acilóxi (-OCOR), +/-decloro (Pat. U.S. N° 4.294.757) (preparado por acilação usando acil cloretos).
[00276] Exemplos específicos de análogos adequados de maitansi- nol tendo as modificações de outras posições incluem:
[00277] (1) C-9-SH (Pat. U.S. No. 4.424.219) (preparado pela rea ção de maitansinol com H2S ou P2S5);
[00278] (2) C-14-alcoximetil (demetóxi/CH2OR) (U.S. Pat. No. 4,331,598);
[00279] (3) C-14-hidroximetil ou aciloximetil (CH2OH ou CH2OAc) (Pat. U.S. No. 4.450.254) (preparado de Nocardia);
[00280] (4) C-15-hidróxi/acilóxi (Pat. U.S. No. 4.364.866) (preparado pela conversão de maitansinol por Streptomices);
[00281] (5) C-15-metóxi (Pat. U.S. Nos. 4.313.946 e 4.315.929) (isolado de Trewia nudiflora);
[00282] (6) C-18-N-demetil (Pat. U.S. Nos. 4.362.663 e 4.322.348) (preparado pela demetilação de maitansinol por Streptomyces); e
[00283] (7) 4,5-desóxi (Pat. U.S. No. 4.371.533) (preparado pela redução com tricloreto de titânio/LAH de maitansinol).
[00284] Em uma modalidade da invenção, os conjugados citotóxi- cos da presente invenção utilizam o maitansinoide contendo tiol (DM1), formalmente denominado N2'-deacetil-N2'-(3-mercapto-1- oxopropil)-maitansina, como o agente citotóxico. DM1 é representado pela seguinte fórmula (I) estrutural:
Figure img0003
[00285] Em outra modalidade, os conjugados citotóxicos da presen- te invenção utilizam o maitansinoide contendo tiol DM4, formalmente denominado N2'-deacetil-N2'-(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)- maitansina, como o agente citotóxico. DM4 é representado pela seguinte fórmula (II) estrutural:
Figure img0004
[00286] Em modalidades adicionais da invenção, outras maitansi- nas, incluindo maitansinoides contendo tiol e dissulfeto que carregam uma substituição substituição mono ou di-alquila do átomo de carbono carregando o átomo de enxofre, podem ser usadas. Estas incluem um maitansinoide tendo, em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi ou C-20 desmetila, uma cadeia lateral de aminoácido acilada com um grupo acila que carrega um grupo sulfidrila impedido, em que o átomo de carbono do grupo acila que suporta a funcionalidade tiol tem um ou dois substituintes, os ditos substituintes sendo CH3, C2H5, alquila linear ou ramificada ou alquenila tendo de 1 a 10 reagentes e qualquer agregado que possa estar presente na solução.
[00287] Exemplos destes agentes citotóxicos e de métodos da con- jugação são ainda dados no pedido de patente WO2008/010101 que é incorporado por referência.
[00288] O termo "isótopo radioativo" é destinado a incluir isótopos radioativos adequados para tratamento de câncer, como At211, Bi212, Er169, I131, I125, Y90, In111, P32, Re186, Re188, Sm153, Sr89 e os isótopos radioativos de Lu. Tais radioisótopos geralmente emitem principalmente radiação beta. Em uma modalidade, o isótopo radioativo é o isótopo emissor de alfa, mais precisamente Tório 227 que emite radiação alfa. Os imunoconjugados, de acordo com a presente invenção, podem ser preparados como descrito no pedido de patente WO2004/091668.
[00289] Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção são covalentemente ligados, diretamente ou via um ligante cli- vável ou não clivável, a pelo menos um agente inibidor de crescimento.
[00290] "Ligante", como usado neste pedido, significa uma porção química compreendendo uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que covalentemente liga um polipeptídeo a uma porção de fármaco.
[00291] Os conjugados podem ser preparados por métodos in vitro. A fim de ligar um fármaco ou profármaco ao anticorpo, um grupo de ligação é usado. Grupos de ligação adequados são bem conhecidos na técnica e incluem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos ácido lábeis, grupos fotolábeis, grupos peptidase lábeis e grupos esterase lábeis. A conjugação de um anticorpo da invenção com agentes citotó- xicos ou agentes inibitórios de crescimento podem ser feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento proteico bifuncionais incluindo mas não limitados a N-succinimidil piridilditiobutirato (SPDB), 4- [(5-nitro-2-piridinil)ditio]-2,5-dioxo-1-pirrolidinil éster de ácido butanoico (nitro-SPDB), ácido 4-(Piridin-2-ildissulfanil)-2-sulfo-butírico (sulfo- SPDB), N-succinimidil (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil (N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCl), ésteres ativos (como dissuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)- hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p- diazoniobenzoil)-etilenodiamino), di-isocianatos (como tolueno 2,6-di- isocianato), e compostos de flúor bis-ativos (como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al. (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil metildietileno triaminopentacético (MX-DTPA) mar-cado com carbono é um agente quelante exemplar para a conjugação do radionucleotídeo ao anticorpo (WO 94/11026).
[00292] O ligante pode ser um "ligante clivável" facilitando a liberação do agente citotóxico ou agente inibidor de crescimento na célula. Por exemplo, um ligante ácido-lábil, um ligante sensível à peptidase, um ligante esterase lábil, um ligante fotolábil ou um ligante contendo dissulfeto (Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.208.020) podem ser usados. O ligante pode ser também um "ligante não clivável" (por exemplo, ligante SMCC) que pode levar à melhor tolerância em alguns casos.
[00293] Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo o anticorpo da invenção e um polipeptídeo citotóxico ou inibitório de crescimento pode ser feita, por técnicas recombinantes ou síntese de peptídeo. O comprimento de DNA pode compreender as respectivas regiões que codificam as duas porções do conjugado adjacentes entre si ou separadas por uma região que codifica um peptídeo ligante que não destrói as propriedades desejadas do conjugado.
[00294] Os anticorpos da presente invenção também podem ser usados na Terapia com Profármaco Mediada por Enzima Dependente conjugando o polipeptídeo a uma enzima que ativa o profármaco que converte um profármaco (por exemplo, um agente quimioterápico pep- tidil, ver WO81/01145) a um remédio ativo contra o câncer (Ver, por exemplo, WO 88/07378 e Patente U.S. No. 4.975.278). O componente da enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz da atuação sobre um profármaco de tal modo para convertê-lo na sua forma mais ativa, citotóxica. As enzimas que são úteis no método desta invenção incluem, mas não são limitadas à fosfatase alcalina útil para converter profármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatase útil para converter profármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina deaminase útil para converter fluorocitosina não tóxica em remédio contra o câncer, 5-fluorouracila; proteases, como protease de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (como catepsinas B e L), que são úteis para converter pro- fármacos contendo peptídeo em fármacos livres; D- alanilcarboxipeptidases, úteis para converter profármacos contendo substituintes de D-aminoácido; enzimas de clivagem de carboidrato como O-galactosidase e neuraminidase úteis para converter profárma- cos glicosilados em fármacos livres; P-lactamase útil para converter fármacos derivados com P-lactamas em fármacos livres; e penicilina amidases, como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, úteis para converter fármacos derivados nos seus nitrogênios da amina com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em fármacos livres. As enzimas podem estar covalentemente ligadas aos polipeptí- deos da invenção por técnicas bem conhecidas na técnica como o uso da reticulação heterobifuncional de reagentes discutidos acima.
[00295] De acordo com uma modalidade, no conjugado da invenção, o agente inibidor de crescimento é um maitansinoide, em uma modalidade, DM1 ou DM4.
[00296] No dito conjugado, o anticorpo é conjugado pelo menos a um dito agente inibidor de crescimento por um grupo de ligação. Em uma modalidade, a dita ligação de grupo é um ligante clivável ou um não clivável, como SPDB, sulfo-SPDB, ou SMCC.
[00297] O conjugado pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em:
[00298] i) um conjugado anticorpo-SPDB-DM4 de fórmula (III)
Figure img0005
[00299] ii) um conjugado anticorpo-sulfo-SPDB-DM4 de fórmula (IV)
Figure img0006
[00300] iii) um conjugado anticorpo-SMCC-DM1 de fórmula (V)
Figure img0007
[00301] Na dita modalidade, o anticorpo incluído no conjugado é selecionado a partir do grupo consistindo emem:
[00302] um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:51 e uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:17,
[00303] ii) um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:5 e uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:23,
[00304] iii) um anticorpo humanizado compreendendo a cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:5 e uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:29, e
[00305] iv) um anticorpo humanizado compreendendo a cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:51 e uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:55.
[00306] Em uma modalidade, o conjugado é um conjugado da fórmula (III), (IV) ou (V) como definido acima, na qual o anticorpo é um anticorpo humanizado compreendendo a cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:5 e uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:29.
[00307] Em geral, o conjugado pode ser obtido por um processo compreendendo as etapas de:
[00308] i) colocar em contato uma solução aquosa opcionalmente tamponada de um agente de ligação à célula (por exemplo, um anticorpo de acordo com a invenção) com soluções de um ligante e um composto citotóxico;
[00309] ii) então opcionalmente separar o conjugado que foi formado em (i) do agente de ligação à célula não reagido.
[00310] A solução aquosa do agente de ligação à célula pode ser tamponada com tampões tais como, por exemplo, fosfato, acetato, citrato de potássio, ou ácido N-2-Hidroxietilpiperazino-N'-2- etanossulfônico (tampão Hepes). O tampão depende da natureza do agente de ligação à célula. O composto citotóxico está na solução em um solvente polar orgânico, por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO) ou dimetilacetamida (DMA).
[00311] A temperatura de reação é normalmente compreendida entre 20 e 40°C. O tempo da reação pode variar de 1 a 24 horas. A reação entre o agente de ligação à célula e o agente citotóxico pode ser monitorada pela cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com um detector refractométrico e/ou de UV. Se o rendimento conjugado for demasiado baixo, o tempo da reação pode ser estendido.
[00312] Diversos métodos de cromatografia diferentes podem ser usados pelo especialista na técnica a fim de realizar a separação da etapa (ii): o conjugado pode ser purificado, por exemplo, por SEC, cromatografia de adsorção (como cromatografia de troca iônica, IEC), cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de afinidade, cromatografia de suporte variado como cromatografia em hidroxia- patita ou cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A purificação por diálise ou diafiltração também pode ser usada.
[00313] Como usado neste pedido, o termo "agregados" significa as associações que podem ser formadas entre dois ou mais agentes de ligação à célula, os ditos agentes que são modificados ou não pela conjugação. Os agregados podem ser formados sob influência de um grande número de parâmetros, como uma alta concentração de agente de ligação à célula na solução, o pH da solução, altas forças de ci- salhamento, o número de dímeros ligados e seu caráter hidrofóbico, a temperatura (ver Wang & Gosh, 2008, J. Membrane Sci., 318: 311316, e referências citadas neste); observar que a influência relativa de alguns destes parâmetros não é claramente estabelecida. No caso de proteínas e anticorpos, o especialista na técnica se referirá a CroPMell et al. (2006, AAPS Journal, 8 (3): E572-E579). O conteúdo em agregados pode ser determinado com técnicas bem conhecidas pelo especialista, como SEC (ver Walter et al., 1993, Anal. Biochem., 212 (2): 469-480).
[00314] Após a etapa (i) ou (ii), a solução contendo o conjugado pode ser submetida a uma etapa adicional de (iii) de cromatografia, ultrafiltração e/ou diafiltração.
[00315] O conjugado é recuperado no fim destas etapas em uma solução aquosa.
[00316] De acordo com uma modalidade, o conjugado, de acordo com a invenção, é caraterizado por uma "proporção de fármaco para anticorpo" (ou "DAR") variando de 1 a 10, por exemplo, de 2 a 5, em particular de 3 a 4. Isto é geralmente o caso de conjugados incluindo moléculas de maitansinoide.
[00317] Este número de DAR pode variar com a natureza do anticorpo e do fármaco (isto é, o agente inibidor de crescimento) usado junto com as condições experimentais usadas para a conjugação (como a proporção agente inibidor de crescimento/anticorpo, o tempo de reação, a natureza do solvente e do cossolvente se houver algum). Dessa forma, o contato entre o anticorpo e o agente inibidor de crescimento leva a uma mistura compreendendo vários conjugados que se diferenciam entre si por proporções fármaco-anticorpo diferentes; opcionalmente o anticorpo não conjugado; opcionalmente agregados. A DAR que é determinada dessa forma é um valor médio.
[00318] Um método que pode ser usado para determinar a DAR consiste em medir espectrofotometricamente a proporção da absor- vância em uma solução do conjugado substancialmente purificado em ÀD e 280 nm. 280 nm é um comprimento de onda usado geralmente para medir a concentração de proteínas, como concentração de anticorpo. O comprimento de onda àD é selecionado para permitir discriminar o fármaco do anticorpo, isto é, como prontamente conhecido pelo especialista, àD é um comprimento de onda no qual o fármaco tem uma alta absorvância e àD está suficientemente distante de 280 nm para evitar a sobreposição substancial nos picos de absorvância do fármaco e do anticorpo. ÀD pode ser selecionado como sendo 252 nm no caso de moléculas de maitansinoide. Um método de cálculo de DAR pode ser derivado de Antony S. Dimitrov (editor), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science:
[00319] As absorvâncias do conjugado em àD (AàD) e em 280 nm (A280) são medidas no pico monomérico da análise de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) (permitindo calcular o parâmetro "DAR (SEC)") ou usando um aparelho espectrofotômetro clássico (permitindo calcular o parâmetro "DAR (UV)"). As absorvâncias podem ser expressas como se segue: AÀD = (CD x εDAD) + (CA x £AÀD) A280 = (cD x εD280) + (CA x εA280) em que:
[00320] CD e CA são respectivamente as concentrações na solução do fármaco e do anticorpo
[00321] £DÀD e εA280 são respectivamente os coeficientes de extinção molar do fármaco em àD e 280 nm
[00322] εAAD e εA280 são respectivamente os coeficientes de extinção molar do anticorpo em àD e 280 nm.
[00323] A resolução destas duas equações com duas variáveis desconhecidas leva às seguintes equações: CD=[(εA280 x AÀD) - (£AÀD x A280)] / [(EDÀD X εA280) - (£AÀD X εD280)] CA = [A280 - (CD x εD280)] / εA280
[00324] A DAR média então é calculada da proporção da concentração de fármaco para aquela do anticorpo: DAR = CD / CA. Composições farmacêuticas
[00325] Os anticorpos ou os imunoconjugados da invenção podem ser combinados com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, e op-cionalmente matrizes de liberação sustentada, como polímeros biode gradáveis, para formar composições terapêuticas.
[00326] Dessa forma, outro objeto da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou um imu- noconjugado da invenção e um veículo ou excipiente farmaceutica- mente aceitável.
[00327] A invenção também se refere a um polipeptídeo ou um imunoconjugado, de acordo com a invenção, para o uso como um me-dicamento.
[00328] "Farmaceuticamente" ou "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação desfavorável adversa, alérgica ou outra quando administradas a um mamífero, especialmente um ser humano, como apropriado. Um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável referem-se a um sólido não tóxico, enchimento semissólido ou líquido, diluente, material de encapsulamento ou formulação auxiliar de qualquer tipo.
[00329] Como usado neste pedido, "veículos farmaceuticamente aceitáveis" incluem todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, e similares que são fisiologicamente compatíveis. Exemplos de veículos, diluentes e/ou excipientes adequados incluem uma ou mais de água, aminoáci- dos, salina, salina tamponada com fosfato, tampões fosfato, acetato, citrato, succinato; aminoácidos e derivados como histidina, arginina, glicina, prolina, glicilglicina; sais inorgânicos NaCl, cloreto de cálcio; açúcares ou poliálcoois tais como dextrose, glicerol, etanol, sacarose, trehalose, manitol; tensoativos tais como Polissorbato 80, polissorbato 20, poloxâmero 188; e similares, bem como combinação destes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, como açúcares, poli álcoois ou cloreto de sódio na composição, e a formulação também pode conter um antioxidante como triptamina e um agente estabilizante como Tween 20.
[00330] A forma das composições farmacêuticas, a via da administração, a dosagem e o regime naturalmente dependem da condição a ser tratada, a severidade da doença, a idade, peso e sexo do paciente, etc.
[00331] As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas para uma administração tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intraocular e similares.
[00332] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas contêm veículos que são farmaceuticamente aceitáveis para uma formulação capazes de serem injetados. Estas podem ser soluções isotôni- cas, estéreis, salinas (fosfato monossódico ou dissódico, cloreto de sódio, potássio, cálcio ou magnésio e similares ou misturas de tais sais), ou composições secas, especialmente congeladas a vácuo que após adição, dependendo do caso, de água esterilizada ou salina fisiológica, permitem a constituição de soluções injetáveis.
[00333] A composição farmacêutica pode ser administrada por dis-positivos de combinação de medicamentos.
[00334] As doses usadas para a administração podem ser adaptadas como uma função de vários parâmetros, e por exemplo, como uma função do modo de administração usada, da patologia relevante, ou alternativamente da duração desejada do tratamento.
[00335] Para preparar composições farmacêuticas, uma quantidade eficaz do anticorpo ou o imunoconjugado da invenção podem ser dis-solvidos ou dispersados em um veículo farmaceuticamente aceitável ou meio aquoso.
[00336] Formas farmacêuticas adequadas para o uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis; formulações incluindo óleo de gergelim, óleo de amendoim ou propilenoglicol aquoso; e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e inje- tável com o dispositivo ou sistema apropriado para a entrega sem de-gradação. Deve ser estável sob as condições de produção e armaze-namento e deve ser conservada contra a ação de contaminação de micro-organismos, como bactérias e fungos.
[00337] As soluções dos compostos ativos como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água apro-priadamente misturada com um tensoativo. As dispersões também po-dem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e misturas destes e em óleos. Sob condições ordinárias de armazenamento e uso, estas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de micro-organismos.
[00338] Um polipeptídeo, o anticorpo ou o imunoconjugado da invenção podem ser formulados em uma composição em uma forma neutra ou forma salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição ácidos (formados com os grupos amino livres da proteína) e os que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico ou tais como ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e similares. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxido de sódio, de potássio, de amônio, de cálcio, ou férrico e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, glicina, histidina, procaína e similares.
[00339] O veículo também pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glice- rol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido, e similares), misturas adequadas destes e óleos vegetais. Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário em caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microorganismos pode ser ocasionada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbi- co, timerosal, e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A ab-sorção prolongada das composições injetáveis pode ser ocasionada pelo uso nas composições de agentes de retardo de absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00340] As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando os compostos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com qualquer um dos outros ingredientes listados acima, como requerido, e depois esterilização em filtro. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e outros ingredientes necessários dos listados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais da preparação são técnicas de secagem a vácuo e congelamento a vácuo que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução anteriormente filtrada de forma estéril deste.
[00341] A preparação de soluções mais concentradas, ou altamente concentradas para a injeção direta também é contemplada, onde o uso de DMSO como solvente é idealizado para resultar em penetração ex-tremamente rápida, entregando altas concentrações dos agentes ativos à pequena área tumoral.
[00342] Na formulação, as soluções serão administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade como é terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, como tipo de soluções injetáveis descritas acima, mas cápsulas de liberação de fármaco e similares também podem ser empregadas.
[00343] Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser apropriadamente tamponada se necessário e antes tornar o diluente líquido isotônico com salina suficiente ou glicose. Estas soluções aquosas são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitonial. Nesta relação, os meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão conhecidos por aqueles especialistas na técnica à luz da presente revelação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml de solução de NaCl isotônica e adicionada a 1000 ml de fluido de hipodermóclise ou injetada no sítio proposto da infusão, (por exemplo, ver, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na dosagem poderá ocorrer necessariamente dependendo da condição do indivíduo que é tratado. A pessoa responsável pela administração determinará, em todo o caso, a dose apropriada para o indivíduo.
[00344] O anticorpo ou o imunoconjugado da invenção pode ser formulado dentro de uma mistura terapêutica para compreender apro-ximadamente 0,01 a 100 miligramas, por dose ou mais.
[00345] Além do anticorpo ou imunoconjugado formulado para a administração parenteral, como injeção intravenosa ou intramuscular, outras formas farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, comprimidos ou outros sólidos para administração oral; cápsulas de liberação por tempo; e qualquer outra forma atualmente usada.
[00346] Em certas modalidades, o uso de lipossomas e/ou nanopar- tículas é contemplado para a introdução de polipeptídeos em células hospedeiras. A formação e o uso de lipossomas e/ou nanopartículas são conhecidos por aqueles especialistas na técnica.
[00347] Nanocápsulas podem capturar geralmente compostos de uma forma estável e reprodutível. Para evitar efeitos colaterais devido à sobrecarga polimérica intracelular, tais partículas ultrafinas (com di-mensão de aproximadamente 0,1 μm) são geralmente projetadas usando polímeros capazes de serem degradados in vivo. As nanopar- tículas de polialquil-cianoacrilato biodegradáveis, ou nanopartículas de polilactídeo biodegradável ou polilactídeo co-glicolídeo que satisfazem condições, são contemplados para o uso na presente invenção, e tais partículas podem ser são facilmente produzidas.
[00348] Os lipossomas são formados de fosfolipídeos que são dis-persados em um meio aquoso e espontaneamente formam vesículas em bicamadas concêntricas multilamelares (também denominadas vesículas multilamelares (MLVs)). MLVs geralmente têm diâmetros de 25 nm a 4 μm. A sonicação de MLVs resulta na formação das pequenas vesículas unilamelares (SUVs) com diâmetros na faixa de 200 a 500 Â, contendo uma solução aquosa no núcleo. As características físicas de lipossomas dependem do pH, força iônica e a presença de cátions divalentes. Métodos terapêuticos e usos
[00349] Os inventores mostraram que os cinco anticorpos que pro-duziram são capazes de incorporar o complexo CEACAM5-anticorpo após a ligação. Além disso, mostraram que estes anticorpos, combi-nados com um maitansinoide citotóxico (DM4), induzem a atividade citotóxica sobre células tumorais MKN45 humanas in vitro. Também mostraram que estes imunoconjugados induzem uma atividade anti- tumoral acentuada in vivo em um modelo murino de xenoenxertos de tumor de cólon primários humanos derivados do paciente, quando usados em uma dose de 5 mg/kg e 2,5 mg/kg, com uma injeção única no dia 14 pós-implante tumoral.
[00350] Dessa forma, os polipeptídeos, anticorpos, imunoconjuga- dos ou composições farmacêuticas da invenção podem ser úteis para tratar o câncer.
[00351] O câncer a ser tratado com anticorpos, imunoconjugados ou composições farmacêuticas da invenção é um câncer que expressa CEACAM5, em particular superexpressa CEACAM5 quando comparado com células normais (isto é, não tumorais) da mesma origem tissular. A expressão de CEACAM5 por células cancerosas pode ser prontamente analisada, por exemplo, usando um anticorpo de acordo com a invenção, como descrito na seção seguinte "Usos diagnósticos", e em particular por um método imunohistoquímico, por exemplo, como descrito no Exemplo 8.
[00352] Em uma modalidade, o câncer pode ser um câncer colorre- tal, de estômago, pulmão, cérvix uterino, pâncreas, esôfago, ovário, tireoide, bexiga, endométrio, mama, fígado (por exemplo, colangiocar- cinoma), próstata ou pele. O rastreamento de um painel de tumores humanos por imuno-histoquímica usando um anticorpo anti-CEACAM5 humana de camundongo, de acordo com a invenção, de fato mostrou a marcação por anticorpo nestes tipos de cânceres, como descrito em detalhes adicionais no Exemplo 8.
[00353] Os anticorpos ou imunoconjugados da invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com qualquer agente inibidor de crescimento adequado.
[00354] Os anticorpos da invenção podem ser conjugados ou ligados a um agente inibidor de crescimento, agente citotóxico ou uma enzima que ativa o profármaco como anteriormente descrito. Os anticorpos da invenção de fato podem ser úteis para direcionar o dito agente inibidor de crescimento, agente citotóxico ou um profármaco às células cancerosas que expressam e/ou superexpressam CEACAM5 na sua superfície.
[00355] Também é bem conhecido que os anticorpos monoclonais terapêuticos podem levar à depleção de células que carregam o antí- geno especificamente reconhecido pelo anticorpo. Esta depleção pode ser mediada por pelo menos três mecanismos: citotoxicidade celular mediada por anticorpo (ADCC), lise dependente de complemento e inibição antitumoral direta do crescimento de tumor por sinais dados através do antígeno visado pelo anticorpo.
[00356] "Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula-alvo na presença do complemento. A ativação da via de complemento clássica é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento a anticorpos que estão ligados ao seu antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano- Santoro et al. (1997) pode ser realizado.
[00357] "Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma forma da citotoxicidade na qual os anticorpos secretados ligados em receptores de Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permite a ligação destas células efeto- ras citotóxicas especificamente a uma célula alvo que carrega o antí- geno e posteriormente eliminar a célula alvo. Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCC in vitro, como aquele descrito na Patente US No. 5.500,362 ou 5.821.337 pode ser realizado.
[00358] Dessa forma, um objeto da invenção refere-se a um método para tratamento de um câncer compreendendo administração de um indivíduo em necessidade deste com uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de um polipeptídeo, um anticorpo, um imunoconjugado ou uma composição farmacêutica da invenção.
[00359] No contexto da invenção, o termo "tratar" ou "tratamento", como usado neste pedido, significa reverter, aliviar, inibir o progresso ou prevenir o distúrbio ou condição à qual tal termo se aplica, ou um ou mais sintomas de tal distúrbio ou condição. Pelo termo "tratamento de câncer", como usado neste pedido, entende-se a inibição do crescimento de células malignas de um tumor e/ou a progressão de metás- tases do dito tumor. Tal tratamento também pode levar à regressão do crescimento tumoral, isto é, a redução no tamanho de um tumor men-surável. Em particular, tal tratamento leva à regressão completa do tumor ou metástase.
[00360] De acordo com a invenção, o termo "paciente" ou "paciente em necessidade deste" é destinado a um mamífero humano ou não humano afetado ou provável de ser afetado por um tumor maligno. Em particular, o dito paciente pode ser paciente que foi determinado ser suscetível a um agente terapêutico que visa CEACAM5, em particular de um anticorpo ou imunoconjugado de acordo com a invenção, por exemplo, de acordo com um método como descrito abaixo.
[00361] Por uma "quantidade terapeuticamente eficaz" do polipeptí- deo da invenção entende-se uma quantidade suficiente do polipeptí- deo para tratar a dita doença de câncer, em uma proporção de benefí- cio/risco razoável aplicável a qualquer tratamento médico. Será entendido, entretanto, que o uso diário total dos polipeptídeos e composições da presente invenção será decidido pelo médico assistente dentro do escopo do juízo médico sólido. O nível de dose específica tera- peuticamente eficaz de qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores incluindo o distúrbio que é tratado e a severidade do distúrbio; a atividade do polipeptídeo específico empregada; a composição específica empregada, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, a via de administração e a taxa de excreção do polipeptídeo específico empregados; a duração do tratamento; fármacos usados em combinação ou coincidentes com o polipeptídeo específico empregado; e como fatores bem conhecidos nas técnicas médicas. Por exemplo, é bem conhecido dentro da técnica iniciar as doses do composto em níveis mais baixo do que os requeridos para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja al- cançado.
[00362] Outro objeto da invenção refere-se a um polipeptídeo, um anticorpo, um imunoconjugado ou uma composição farmacêutica da invenção para o uso no tratamento de um tumor maligno.
[00363] O polipeptídeo, o anticorpo, o imunoconjugado ou a composição farmacêutica podem ser usados para inibir a progressão de metástases de um tumor maligno.
[00364] Os polipeptídeos da invenção podem ser usados em combinação com qualquer outra estratégia terapêutica para tratamento do tumor maligno (por exemplo, terapia com adjuvante), e/ou para redução do crescimento do tumor metastásico.
[00365] A eficácia do tratamento com um anticorpo ou imunoconju- gado, de acordo com a invenção, pode ser prontamente analisada in vivo, por exemplo, em um modelo de camundongo do câncer e medindo, por exemplo, modificações no volume tumoral entre os grupos controle e tratados, % de regressão tumoral, regressão parcial e/ou regressão completa como definido no Exemplo 5.3. Usos diagnósticos
[00366] Foi relatado que CEACAM5 seja altamente expressa na superfície de células tumorais colorretais, gástricas, pulmonares, uteri-nas e fracamente expressa em poucas células epiteliais normais como células epiteliais do cólon e do esôfago. Adicionalmente, o rastreamen- to de um painel de tumores humanos por imunohistoquímica usando um anticorpo anti-CEACAM5 humana de camundongo de acordo com a invenção mostrou a marcação com anticorpo em cânceres colorre- tais, de estômago, pulmão, cérvix uterina, pâncreas, esôfago, ovário, tireoide, bexiga, endométrio, mama, fígado (em particular, colangiocar- cinoma), próstata e pele.
[00367] Por isso, CEACAM5 constitui um marcador de câncer e, por isso, tem potencial para ser usado para indicar a eficácia de uma tera- pia anticâncer ou detectar a recidiva da doença.
[00368] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é usado como o componente de um ensaio no contexto de uma terapia que visa tumores que expressam CEACAM5, a fim de determinar a suscetibilidade do paciente ao agente terapêutico, monitorar a eficácia da terapia anticâncer ou detectar a recidiva da doença após o tratamento. Em particular, o mesmo anticorpo da invenção é usado tanto como componente do agente terapêutico como o componente do ensaio diagnóstico.
[00369] Dessa forma, um objeto adicional da invenção refere-se a um anticorpo, de acordo com a invenção, para o uso para in vivo que detecta expressão de CEACAM5 em um indivíduo, ou para o uso para detecção ex vivo da expressão de CEACAM5 na amostra biológica de um indivíduo. A dita detecção pode ser destinada em particular para
[00370] a) diagnosticar a presença de um câncer em um indivíduo, ou
[00371] b) determinar a suscetibilidade de um paciente tendo câncer a um agente terapêutico que visa CEACAM5, em particular um imunoconjugado de acordo com a invenção, ou
[00372] c) monitorar a eficácia da terapia anti-CEACAM5 para câncer ou detecção de recidiva de câncer após terapia anti-CEACAM5 para câncer, em particular para terapia com um imunoconjugado de acordo com a invenção;
[00373] pela detecção da expressão da proteína CEACAM5 superficial em células tumorais.
[00374] Em uma modalidade, o anticorpo é destinado a um uso in vitro ou ex vivo. Por exemplo, CEACAM5 pode ser detectada in vitro ou ex vivo em uma amostra biológica obtida de um indivíduo, usando um anticorpo da invenção. O uso, de acordo com a invenção, também pode ser um uso in vivo. Por exemplo, um anticorpo, de acordo com a invenção, é administrado ao indivíduo e os complexos de células- anticorpo são detectados e/ou quantificados, pelo qual a detecção dos ditos complexos é indicativa de um câncer.
[00375] A invenção refere-se ainda a um método in vitro ou ex vivo de detectar a presença de um câncer em um indivíduo, compreendendo as etapas consistindo em:
[00376] (a) colocar em contato uma amostra biológica de um indiví duo com um anticorpo, de acordo com a invenção, em particular em condições suficientes para o anticorpo formar complexos com a dita amostra biológica;
[00377] (b) medir do nível do anticorpo ligado à dita amostra bioló gica,
[00378] (c) detectar a presença de um câncer comparando o nível medido de anticorpo ligado com um controle, um nível aumentado de anticorpo ligado comparado com o controle sendo indicativo de um câncer.
[00379] A invenção também se refere a um método in vitro ou ex vivo para determinar a suscetibilidade de um paciente tendo câncer a um agente terapêutico que visa CEACAM5, em particular, a um imu- noconjugado de acordo com a invenção, da qual o método compreende as etapas consistindo em:
[00380] (a) colocar em contato uma amostra biológica de um paci ente tendo câncer com um anticorpo de acordo com a invenção, em particular em condições suficientes para o anticorpo formar complexos com a dita amostra biológica;
[00381] (b) medir o nível do anticorpo ligado à amostra da dita amostra biológica,
[00382] (c) comparar o nível medido do anticorpo ligado à amostra da dita amostra biológica com o nível do anticorpo ligado a um controle;
[00383] em que um nível aumentado do anticorpo ligado à amostra da dita amostra biológica comparado ao controle é indicativo de um paciente suscetível a um agente terapêutico que visa CEACAM5.
[00384] Nos métodos acima, o dito controle pode ser uma amostra biológica normal, não cancerosa, do mesmo tipo, ou um valor de refe-rência determinado como representativo do nível de ligação do anticorpo na amostra biológica normal do mesmo tipo.
[00385] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção são úteis para diagnosticar um câncer que expressa CEACAM5, tal como um câncer colorretal, de estômago, pulmão, cérvix uterina, pâncreas, esôfago, ovário, tireoide, bexiga, endométrio, mama, fígado (em particular, colangiocarcinoma), próstata ou pele.
[00386] A invenção refere-se ainda a um método in vitro ou ex vivo de monitorar a eficácia da terapia anti-CEACAM5 para câncer, com-preendendo as etapas consistindo em:
[00387] (a) colocar em contato uma amostra biológica de um indiví duo que passa por terapia anti-CEACAM5 para câncer, com um anticorpo de acordo com a invenção, em particular em condições suficientes para o anticorpo formar complexos com a dita amostra biológica;
[00388] (b) medir o nível do anticorpo ligado à dita amostra biológi ca,
[00389] (c) comparar o nível medido do anticorpo ligado com o nível do anticorpo ligado a um controle;
[00390] em que um nível reduzido do anticorpo ligado à dita amostra biológica comparado ao controle é indicativo da eficácia da dita terapia anti-CEACAM5 para câncer.
[00391] No dito método, um nível aumentado do anticorpo ligado à dita amostra biológica comparado ao controle é indicativo da ineficácia da dita terapia anti-CEACAM5 para câncer.
[00392] Em uma modalidade, o dito controle é uma amostra biológi- ca do mesmo tipo que a amostra biológica submetida à análise, mas que foi obtida do indivíduo previamente, durante o curso da terapia an- ti-CEACAM5 para câncer.
[00393] A invenção refere-se ainda a um método in vitro ou ex vivo para detectar a recidiva de câncer após a terapia anti-CEACAM5 para câncer, compreendendo as etapas consistindo em:
[00394] (a) colocar em contato uma amostra biológica de um indiví duo tendo a terapia anti-CEACAM5 para câncer finalizada, com um anticorpo, de acordo com a invenção, em particular, em condições su-ficientes para o anticorpo formar complexos com a dita amostra bioló-gica;
[00395] (b) medir o nível do anticorpo ligado à dita amostra biológi ca,
[00396] (c) comparar o nível medido do anticorpo ligado com o nível do anticorpo ligado a um controle;
[00397] em que um nível aumentado do anticorpo ligado à dita amostra biológica comparado ao controle é indicativo da recidiva de câncer após a terapia anti-CEACAM5 para câncer.
[00398] O dito controle é, em particular, uma amostra biológica do mesmo tipo que a amostra biológica submetida à análise, mas que foi obtida do indivíduo previamente, durante a realização ou após a terapia para câncer.
[00399] A dita terapia anti-CEACAM5 para câncer é, em particular, uma terapia usando um anticorpo ou imunoconjugado de acordo com a invenção. A dita terapia anti-CEACAM5 para câncer visa um câncer que expressa CEACAM5, em particular um câncer colorretal, de estômago, pulmão, cérvix uterina, pâncreas, esôfago, ovário, tireoide, bexiga, endométrio, mama, fígado (em particular, colangiocarcinoma), próstata ou pele.
[00400] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção podem ser marcados com uma molécula ou substância detectável, como uma mo-lécula fluorescente, uma molécula radioativa ou qualquer outro marcador conhecido em que fornecem (diretamente ou indiretamente) um sinal.
[00401] Como usado neste pedido, o termo "marcado", quanto ao anticorpo de acordo com a invenção, é destinado a englobar a marcação direta do anticorpo por acoplamento (isto é, ligando-se fisicamente) de uma substância detectável, como um agente radioativo ou um fluoróforo (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou ficoeri- trina (PE) ou Indocianina (Cy5)) ao polipeptídeo, bem como a marcação indireta do polipeptídeo pela reatividade com uma substância de- tectável.
[00402] Um anticorpo da invenção pode ser marcado com uma molécula radioativa por qualquer método conhecido pela técnica. Por exemplo, as moléculas radioativas incluem, mas não são limitadas ao átomo radioativo para estudos cintilográficos como I123, I124, In111, Re186, Re188, Tc99. Os polipeptídeos da invenção também podem ser marcados com um marcador spin para imageamento por ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecido como imageamento por ressonância magnética, MRI), como iodo-123, índio-111, flúor-19, car- bono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[00403] Uma "amostra biológica" engloba uma variedade de tipos de amostra obtidos de um indivíduo e pode ser usada em um ensaio diagnóstico ou de monitoramento. As amostras biológicas incluem mas não são limitadas ao sangue e outras amostras líquidas de origem bio-lógica, amostras de tecido sólido como um espécime de biópsia ou cul-turas de tecido ou células derivadas deste, e a progênie deste. Por isso, as amostras biológicas englobam amostras clínicas, células em cultura, sobrenadantes celulares, lisados celulares, soro, plasma, fluido biológico e amostras de tecido, em particular amostra tumoral.
[00404] Em uma modalidade, a amostra biológica pode ser fixada em formalina e a amostra de tecido embebida em parafina (FFPE). De fato, os anticorpos, de acordo com a invenção, podem ser vantajosamente usados em tecidos FFPE que é o formato usado pela maioria dos hospitais para coletar e arquivar amostras de tecido.
[00405] A invenção também se refere a um método in vivo de detecção da presença de um câncer em um indivíduo, compreendendo as etapas consistindo em:
[00406] a) administração de um anticorpo de acordo com a invenção marcado detectavelmente a um paciente;
[00407] b) detecção da localização do dito anticorpo marcado de- tectavelmente no paciente por imageamento.
[00408] Os anticorpos da invenção podem ser úteis para estadia- mento do câncer (por exemplo, em radioimageamento). Podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros marcadores de câncer.
[00409] Os termos "detecção" ou "detectado", como usados neste pedido, incluem a detecção qualitativa e/ou quantitativa (medindo os níveis) com ou sem referência a um controle.
[00410] No conteúdo da invenção, o termo "diagnóstico", como usado neste pedido, significa que a determinação da natureza de uma condição médica destina-se a identificar uma patologia que afeta o indivíduo a partir de diversos dados coletados.
[00411] No dito método, o câncer é um câncer que expressa CEACAM5, em particular um câncer colorretal, de estômago, pulmão, cérvix uterina, pâncreas, esôfago, ovário, tireoide, bexiga, endométrio, mama, fígado (em particular, colangiocarcinoma), próstata ou pele. Kits
[00412] Finalmente, a invenção também fornece kits compreendendo pelo menos um anticorpo ou imunoconjugado da invenção. Os kits que contêm os anticorpos da invenção encontram uso na detecção da proteína CEACAM5 superficial, ou em ensaios terapêuticos ou diag-nósticos. Os kits da invenção podem conter um polipeptídeo ou anticorpo acoplado a um suporte sólido, por exemplo, uma placa de cultura de tecido ou contas (por exemplo, contas de sefarose). Os kits que podem ser fornecidos contêm anticorpos para detecção e quantificação da proteína CEACAM5 superficial in vitro, por exemplo, em um ELISA ou um Western blot. Tal anticorpo útil para a detecção pode ser fornecido com um marcador tal como um fluorescente ou radiomarca- dor. BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[00413] A SEQ ID NO:1-4, e 6 mostram as sequências da CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L e CDR3-L do chamado anticorpo "MAb1".
[00414] A SEQ ID NO:5 mostra a sequência variante VH VH1a do anticorpo MAb2 humanizado.
[00415] A SEQ ID NO:7-10, e 12 mostram as sequências da CDR1- H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L e CDR3-L do chamado anticorpo "MAb2".
[00416] A SEQ ID NO:11 mostra a sequência de CEACAM1 humana como disponível no GenBank NP_001703.2.
[00417] A SEQ ID NO:13-16, e 18 mostram as sequências da CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L e CDR3-L do chamado anticorpo "MAb3".
[00418] A SEQ ID NO:17 mostra a sequência variante VL VL1 do anticorpo MAb2 humanizado.
[00419] A SEQ ID NO:19-22, e 24 mostram as sequências da CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L e CDR3-L do chamado anticorpo "MAb4".
[00420] A SEQ ID NO:23 mostra as sequências variantes VL VL1a do anticorpo MAb2 humanizado.
[00421] A SEQ ID NO:25-28, e 30 mostra as sequências da CDR1- H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L e CDR3-L do chamado anticorpo "MAb5".
[00422] A SEQ ID NO:29 mostra as sequências variantes VL VL1c do anticorpo MAb2 humanizado.
[00423] A SEQ ID NO:31 mostra a sequência VH do anticorpo "MAb1".
[00424] A SEQ ID NO:32 mostra a sequência VL do anticorpo "MAb1".
[00425] A SEQ ID NO:33 mostra a sequência VH do anticorpo "MAb2".
[00426] A SEQ ID NO:34 mostra a sequência VL do anticorpo "MAb2".
[00427] A SEQ ID NO:35 mostra a sequência VH do anticorpo "MAb3".
[00428] A SEQ ID NO:36 mostra a sequência VL do anticorpo "MAb3".
[00429] A SEQ ID NO:37 mostra a sequência VH do anticorpo "MAb4".
[00430] A SEQ ID NO:38 mostra a sequência VL do anticorpo "MAb4".
[00431] A SEQ ID NO:39 mostra a sequência VH do anticorpo "MAb5".
[00432] A SEQ ID NO:40 mostra a sequência VL do anticorpo "MAb5".
[00433] A SEQ ID NO:41 mostra a sequência da cadeia pesada do anticorpo chMAb1.
[00434] A SEQ ID NO:42 mostra a sequência da cadeia leve do anticorpo chMAb1.
[00435] A SEQ ID NO:43 mostra a sequência da cadeia pesada do anticorpo chMAb2.
[00436] A SEQ ID NO:44 mostra a sequência da cadeia leve do anticorpo chMAb2.
[00437] A SEQ ID NO:45 mostra a sequência da cadeia pesada do anticorpo chMAb3.
[00438] A SEQ ID NO:46 mostra a sequência da cadeia leve do anticorpo chMAb3.
[00439] A SEQ ID NO:47 mostra a sequência da cadeia pesada do anticorpo chMAb4.
[00440] A SEQ ID NO:48 mostra a sequência da cadeia leve do anticorpo chMAb4.
[00441] A SEQ ID NO:49 mostra a sequência da cadeia pesada do anticorpo chMAb5.
[00442] A SEQ ID NO:50 mostra a sequência da cadeia leve do anticorpo chMAb5.
[00443] A SEQ ID NO:51 mostra a sequência variante VH VH1 de anticorpo MAb2 humanizado.
[00444] A SEQ ID NO:52 mostra a sequência de CEACAM5 humana inteira como disponível no banco de dados GenBank sob o número de acesso AAA51967.1.
[00445] A SEQ ID NO:53 mostra a sequência do domínio extracelu- lar de CEACAM5 de Macaca fascicularis.
[00446] A SEQ ID NO:54 mostra a sequência da cadeia leve de um anticorpo quimérico (derivado do anticorpo "MAb2") compreendendo uma mutação K52 para R52.
[00447] A SEQ ID NO: 55 mostra a sequência variante VL VL1d do anticorpo MAb2 humanizado.
[00448] A SEQ ID NO: 56 mostra a sequência do domínio extracelu- lar de hCEACAM1 (posições 35-428 de hCEACAM1 completa (NP_001703.2), seguida de uma extensão de 24 aminoácidos conten- do um marcador His).
[00449] A SEQ ID NO:57 mostra a sequência do domínio extracelu- lar de cCEACAM1 seguida de uma extensão de 24 aminoácidos contendo um marcador His.
[00450] A SEQ ID NO:58 mostra a sequência do domínio extracelu- lar de hCEACAM5 (posições 35-685 de hCEACAM5 completa (AAA51967.1) seguida de uma extensão de 24 aminoácidos contendo um marcador His).
[00451] A SEQ ID NO:59 mostra a sequência do domínio extracelu- lar de cCEACAM5 seguida de uma extensão de 24 aminoácidos contendo um marcador His.
[00452] A SEQ ID NO:60 mostra a sequência do domínio extracelu- lar de hCEACAM6 (posições 35-327 de hCEACAM6 completa (NP_002474.3), seguida de uma extensão de 24 aminoácidos contendo um marcador His).
[00453] A SEQ ID NO:61 mostra a sequência do domínio extracelu- lar de cCEACAM6 seguida de uma extensão de 24 aminoácidos contendo um marcador His.
[00454] A SEQ ID NO:62 mostra a sequência do domínio extracelu- lar de hCEACAM8 (posições 35-332 de hCEACAM8 completa (NP_001807.2), seguida de uma extensão de 24 aminoácidos contendo um marcador His.
[00455] A SEQ ID NO:63 mostra a sequência do domínio extracelu- lar de cCEACAM8, seguida de uma extensão de 24 aminoácidos contendo um marcador His.
[00456] A SEQ ID NO:64 mostra a sequência do domínio extracelu- lar de hCEACAM7 (posições 36-248 de hCEACAM7 completa (NP_008821.1), seguida de uma extensão de 24 aminoácidos contendo um marcador His).
[00457] A SEQ ID NO:65 mostra a sequência de N-A1-B1 de hCEACAM5 (posições 35-320 de hCEACAM5 completa (AAA51967.1.)) seguida do marcador His de 6 aminoácidos.
[00458] A SEQ ID NO:66 mostra a sequência de hCEACAM5-A2-B2 (posições 321-498 de hCEACAM5 completa (AAA51967.1.)) seguida do marcador His de 6 aminoácidos.e depois 6 A sua-marcação de aminoácido.
[00459] A SEQ ID NO:67 mostra a sequência de A3-B3 de hCEA- CAM5 (posições 499-685 de hCEACAM5 completa (AAA51967.1.)) seguida do marcador His de 6 aminoácidos. e depois 6 A sua- marcação de aminoácido-.
[00460] A SEQ ID NO:68 mostra a sequência de N-A1-B1 de cCEACAM5, seguida de uma extensão de 24 aminoácidos contendo um marcador His.
[00461] A SEQ ID NO:69 mostra a sequência de A2-B2 de cCEA- CAM5, seguida de uma extensão de 24 aminoácidos contendo um marcador His.
[00462] A SEQ ID NO:70 mostra a sequência de A3-B3 de cCEA- CAM5, seguida de uma extensão de 24 aminoácidos contendo um marcador His.
[00463] A SEQ ID NO:71 mostra a sequência de proteína inteira CEACAM6 humana como disponível no GenBank NP_002474.3.
[00464] A SEQ ID NO:72 mostra a sequência de proteína inteira CEACAM7 humana como disponível no GenBank NP_008821.1.
[00465] A SEQ ID NO:73 mostra a sequência de proteína inteira CEACAM8 humana como disponível no GenBank NP_001807.2.
[00466] A SEQ ID NO: 74 mostra a sequência VH da variante hu-manizada MAb2_VLg5VHg2.
[00467] A SEQ ID NO: 75 mostra a sequência VL da variante humanizada MAb2_VLg5VHg2.
[00468] A SEQ ID NO: 76 mostra a sequência de aminoácidos nas posições 109-115 de A3-B3 de CEACAM5 humana.
[00469] A SEQ ID NO: 77 mostra a sequência de aminoácidos nas posições 131-143 de A3-B3 de CEACAM5 humana.
[00470] A SEQ ID NO: 78 mostra uma sequência consenso para CDR1-H da família do anticorpo MAb2/MAb4/MAb5 baseada em comparações de sequência.
[00471] A SEQ ID NO: 79 mostra uma sequência consenso para CDR2-H da família do anticorpo MAb2/MAb4/MAb5 baseada em comparações de sequência.
[00472] A SEQ ID NO: 80 mostra uma sequência consenso para CDR3-H da família do anticorpo MAb2/MAb4/MAb5 baseada em comparações de sequência.
[00473] A SEQ ID NO: 81 mostra uma sequência consenso para CDR1-H da família do anticorpo MAb1/MAb3.
[00474] A SEQ ID NO: 82 mostra uma sequência consenso para CDR2-H da família de anticorpo MAb1/MAb3.A SEQ ID NO: 82 mostra uma sequência consenso para CDR2-H da família do anticorpo MAb1/MAb3.
[00475] A SEQ ID NO:83 mostra uma sequência consenso para CDR1-H da família do anticorpo MAb2/MAb4/MAb5 baseada em resíduos identificados como neutros na ligação de domínios de ligação extracelulares de CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis.
[00476] A SEQ ID NO:84 mostra uma sequência consenso para CDR3-H da família do anticorpo MAb2/MAb4/MAb5 baseada em resíduos identificados como neutros na ligação dos domínios de ligação extracelulares de CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis.
[00477] A SEQ ID NO:85 mostra uma sequência consenso para CDR1-L da família de anticorpo MAb2/MAb4/MAb5 baseada em resíduos identificados como neutros na ligação dos domínios extracelula- res de CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis.
[00478] A SEQ ID NO:86 mostra uma sequência consenso para CDR3-L da família de anticorpo MAb2/MAb4/MAb5 baseada em resíduos identificados como neutros na ligação dos domínios extracelula- res de CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis.
[00479] A SEQ ID NO:87 mostra a sequência da cadeia pesada de huMAb2-3 (MAb2_VL1cVH1a-IgG1).
[00480] A SEQ ID NO:88 mostra a sequência da cadeia leve de huMAb2-3 (MAb2_VL1cVH1a-IgG1).
[00481] A SEQ ID NO:89 mostra a sequência da cadeia pesada de huMAb2-4 (MAb2_VL1d VH1-IgG1).
[00482] A SEQ ID NO:90 mostra a sequência da cadeia leve de huMAb2-4 (MAb2_VL1d VH1-IgG1). DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00483] Figura 1: Avaliação da seletividade dos anticorpos anti- CEACAM5.
[00484] Figura 2: Mapeamento de domínio dos anticorpos anti- CEACAM5 em CEACAM5 humana.
[00485] Figura 3: Mapeamento de domínio dos anticorpos anti- CEACAM5 em CEACAM5 de cinomolgus.
[00486] Figura 4: Avaliação da atividade antitumoral de conjugados chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1-SPDB-DM4, chMAb5-SPDB-DM4, e chMAb2-SPDB-DM4 contra adenocarcinoma de cólon humano primário CR-IGR-034P em camundongos fêmeas SCID.
[00487] Figura 5: Avaliação da atividade antitumoral de conjugados huMAb2-3-SPDB-DM4, huMAb2-4-SPDB-DM4 e chMAb2-SPDB-DM4 contra adenocarcinoma de cólon humano primário CR-IGR-034P em camundongos fêmeas SCID.
[00488] Figura 6: Avaliação da atividade antitumoral do conjugado huMAb2-3-SPDB-DM4 contra adenocarcinoma de estômago humano primário STO-IND-006 em camundongos fêmeas SCID.
[00489] Figura 7: Alinhamentos de sequência de regiões VH e VL dos anticorpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 e MAb5.
[00490] Figura 8: Análise de HRMS do conjugado chMAb1-SPDB- DM4.
[00491] Figura 9: Análise de HRMS do conjugado chMAb2-SPDB- DM4.
[00492] Figura 10: Análise de HRMS do conjugado chMAb4-SPDB- DM4.
[00493] Figura 11: Análise de HRMS do conjugado chMAb5-SPDB- DM4.
[00494] Figura 12 Análise de HRMS do conjugado huMAb2-2- SPDB-DM4.
[00495] Figura 13 Análise de HRMS do conjugado huMAb2-1- SPDB-DM4.
[00496] Figura 14 Análise de HRMS do conjugado huMAb2-3- SPDB-DM4.
[00497] Figura 15 Análise de HRMS do conjugado huMAb2-4- SPDB-DM4.
[00498] Figura 16: Atividade de ligação de variantes humanizadas de MAb2 para o domínio extracelular de CEACAM5 humana e de macaco.
[00499] Figura 17: Estabilidade da ligação de variantes humanizadas de MAb2 para o domínio extracelular de CEACAM5 humana e de macaco.
[00500] Figura 18: Avaliação da atividade antitumoral de conjugado huMAb2-3-SPDB-DM4 contra adenocarcinoma de pulmão humano primário LUN-NIC-0014 em camundongos fêmeas SCID.
[00501] Figura 19: Avaliação da atividade antitumoral do conjugado huMAb2-3-SPDB-DM4 e huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 contra adeno-carcinoma de cólon humano primário CR-IGR-034P em camundongos fêmeas nude CD1.
[00502] Figura 20: Análise de HRMS de huMAb2-3-sulfoSPDB- DM4.
[00503] Figura 21: Análise de HRMS de huMAb2-3-SMCC-DM1.
[00504] Figura 22: Alinhamento de domínio variável da cadeia pesada de MAb2, MAb4, MAb5, VH1a humanizado, VH1 humanizado e VHg2 humanizado.
[00505] Figura 23: Alinhamento de domínio variável da cadeia leve de MAb2, MAb4, MAb5, VL1 humanizado, VL1a humanizado, VL1c humanizado, VL1d humanizado e VLg5 humanizado. EXEMPLOS
[00506] A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos a seguir que não devem ser interpretados como limitação adicional.
[00507] Os conteúdos da Listagem de Sequências, figuras e todas as referências, patentes e pedidos de patentes publicados citados ao longo deste relatório descritivo são expressamente incorporados neste pedido por referência em sua totalidade. Exemplo 1: Preparação de domínios extracelulares recombinantes de proteínas CEACAM
[00508] Neste exemplo, os domínios proteicos extracelulares (ECD) de CEACAM de origem humana (h) ou de macaco cinomolgus (c) foram preparados pela expressão transiente em células embrionárias de rim humanas HEK293 com plasmídeos que permitem a expressão do respectivo cDNA como delineado na Tabela 1.
[00509] Cada plasmídeo de expressão foi complexado com 293fectin™ (Life Technologies) e adicionado a células 293-F cultivadas em suspensão (derivadas de células HEK293). Oito dias pós- transfecção, os sobrenadantes de cultura foram coletados e a proteína solúvel correspondente foi purificada por IMAC (GE Healthcare) para gerar um lote proteico (ver a Tabela 1). Tabela 1: Descrição dos domínios extracelulares recombinantes de proteínas CEACAM
Figure img0008
Figure img0009
Exemplo 2: Geração de anticorpos monoclonais anti-CEACAM5 em camundongo
[00510] Neste exemplo, anticorpos monoclonais foram gerados após a imunização de camundongos de acordo com um protocolo que levou à geração de mAb antiCEACAM5. Exemplo 2.1: Imunização & Geração de hibridoma
[00511] Imunizações, fusão e rastreamento foram realizados usando as células de mieloma P3X63-Ag8.653 com o domínio extracelular de CEACAM5 humana, o domínio extracelular da CEACAM5 de cino- molgus ou com células tumorais humanas UMC11 como descrito em Wennerberg A.E et al., 1993. Am. J. Pathol., 143(4), 1050-1054 e Kilpatrick et al. 1997. Hybridoma 16: 381389.
[00512] Usando o método RIMMS como descrito por Kilpatrick et al. (1997. Hybridoma 16: 381389), camundongos BALB/c fêmeas de 6 a 8 semanas (S082342; Charles River Labs, Bar Harbor, ME) receberam quatro ciclos de imunização ao longo de um curso de 14 dias em inter-valos de 3 a 4 dias. Antígenos emulsionados no adjuvante de Titermax (TierMax Gold Adjuvant; Sigma #T2684) foram administrados subcuta- neamente em seis sítios proximais à drenagem de linfonodos, ao longo do dorso dos camundongos e em seis sítios justapostos ao longo do abdômen. Quatro dias após a última injeção, os camundongos foram sacrificados. Linfonodos popliteais bilaterais, inguinais superficiais, axi-lares e branquiais foram isolados assepticamente e lavados com meio RPMI fresco.
[00513] Usando o método clássico como descrito por Wennerberg A.E et al. (1993. Am. J. Pathol., 143 (4), 1050-1054), camundongos BALB/c fêmeas de 6 a 8 semanas (S082342; Charles River Labs, Bar Harbor, ME) receberam três ciclos de imunização ao longo de um curso de 41 dias. Os antígenos foram administrados intraperitonealmente no sítio ventral dos camundongos. Três dias após a última injeção, os camundongos foram sacrificados e os baços foram isolados assepti- camente e lavados com meio RPMI fresco.
[00514] Os linfócitos foram retirados dos linfonodos ou dos baços e a suspensão de um único tipo celular foi lavada duas vezes com meio RPMI antes de serem fundidos com as células de mieloma P3X63- AG8.653 usando polietilenoglicol. Após a fusão, a mistura celular foi incubada em uma incubadora a 37°C por 16 a 24 horas. A preparação celular resultante foi transferida para o meio semissólido seletivo e as- septicamente plaqueada em placas de Petri de 100 mm e incubada a 37°C. Dez dias após o início da seleção, as placas foram examinadas acerca do crescimento de hibridoma, e as colônias visíveis foram es-colhidas e colocadas em placas de 96 poços contendo 200 μL do meio de crescimento. As placas de 96 poços foram mantidas em uma incubadora a 37°C por 2 a 4 dias. Exemplo 2.2: Rastreamento e caracterização in vitro de anticorpos mu- rinos anti-CEACAM5
[00515] O rastreamento primário para a produção de IgG anti- CEACAM5 foi realizado pelo Ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) usando a proteína CEACAM5 humana (preparada como descrito no Exemplo 1) como antígeno de captura e por FACS usando diversas células tumorais humanas (H460, MKN45, SW1463, SKMEL28 e UMC11). Para o ensaio de ELISA, as placas foram revestidas com a proteína CEACAM5 humana em 0,25 μg/poço em PBS e 100 μL/poço de anticorpos anti-CEACAM5 foram adicionados à placa. A placa foi incubada a 37°C por 1h e lavada cinco vezes com PBS contendo Tween-20 0,05% (PBS-T). Então, 100 μL de uma diluição 1:50.000 de IgG de coelho anticamundongo conjugada com peroxidase de rábano silvestre (Sigma; #A9044) foram adicionados a cada poço. Após a incubação a 37°C por 1h no escuro, as placas foram lavadas com PBS- T cinco vezes. A ligação do anticorpo foi visualizada pela adição do tampão TMB-H2O2 e lida em um comprimento de onda de 450 nm. Para o ensaio de FACS, as células tumorais humanas foram recobertas em 40.000 células/poço em placa de 96 poços de Alta Ligação (MSD L15XB-3) e 100 μL/poço de anticorpos anti-CEACAM5 foram adicionados por 45 min a 4°C e lavadas três vezes com PBS BSA 1%. 100 μL/poço de IgG de cabra anticamundongo conjugada com Ale- xa647 (Invitrogen; # A2135) foram adicionados por 45 min a 4°C e lavados três vezes com PBS BSA 1%. A ligação do anticorpo foi avaliada após centrifugação e ressuspensão das células pela adição de 200 μl/poço de PBS BSA 1% e leitura usando o Sistema de Citometria de Fluxo Guava® easyCyte™ 8HT.
[00516] Para avaliar a especificidade por CEACAM5 de anticorpos anti-CEACAM5, placas de 96 poços foram revestidas com as proteínas humanas recombinantes CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 e CEACAM8 (preparadas como descrito no Exemplo 1) usando as mesmas condições de revestimento descritas anteriormente. Os anti-corpos anti-CEACAM5 foram adicionados às placas e detectados usando a IgG de coelho anticamundongo conjugada com peroxidase de rábano silvestre (Sigma; #A9044). A ligação do anticorpo foi visualizada pela adição do tampão TMB-H2O2 e leitura em um comprimento de onda de 450 nm. Os resultados apresentados na Figura 1 mostram que os anticorpos anti-CEACAM5 são seletivos para CEACAM5 humana v. humanas CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 e CEACAM8. Exemplo 2.3: caracterização da ligação do mAb
[00517] A afinidade aparente dos anticorpos anti-CEACAM5 por hCEACAM5 expressa na superfície de células tumorais humanas MKN45 (DSMZ, ACC 409) foi determinada pelo Sistema de Citometria de Fluxo Guava® easyCyte™ 8HT. As células tumorais MKN45 foram plaqueadas em 40.000 células/poço em placa de 96 poços de Alta Ligação (MSD L15XB-3) e 100 μL/poço de anticorpos anti-CEACAM5 foram adicionados em diluições seriadas de 2 vezes iniciando em 20 μg/ml até 12 diluições no ensaio de diluição por 45 min a 4°C e lavadas três vezes com PBS BSA 1%. 100 μL/poço de IgG de cabra anti- camundongo conjugada com Alexa647 (Invitrogen; # A2135) foram adicionados por 45 min a 4°C e lavados três vezes com PBS BSA 1%. A ligação do anticorpo foi avaliada após centrifugação e ressuspensão das células pela adição de 200 μl/poço de PBS BSA 1% e leitura usando o Sistema de Citometria de Fluxo Guava® easyCyte™ 8HT. Os valores de KD aparente e de EC50 foram estimados usando os programas BIOST@T-BINDING e BIOST@T-SPEED, respectivamente. Tabela 2: Valores de EC50 obtidos em células MKN45
Figure img0010
[00518] O mapeamento do domínio dos anticorpos anti-CEACAM5 para as proteínas CEACAM5 humana e CEACAM5 de cinomolgus foi determinado por ELISA. As placas de 96 poços foram revestidas com os domínios da proteína CEACAM5 humana recombinante A1 (143237), A1-B1 (143-320), A2-B2 (321-498) e A3-B3 (499-685) (preparada como descrito no Exemplo 1) e com os domínios da proteína CEACAM5 de cinomolgus recombinante N-A1-B1 (1-320), A1-B1 (143320), A2-B2 (321-498) e A3-B3 (499-688) (preparada como descrito no Exemplo 1) usando as mesmas condições de revestimento descritas anteriormente. Os anticorpos purificados foram adicionados às placas e detectados usando a IgG de coelho anticamundongo conjugada com peroxidase de rábano silvestre (Sigma; #A9044). A ligação do anticorpo foi visualizada pela adição do tampão TMB-H2O2 e leitura em um comprimento de onda de 450 nm. Os resultados são apresentados nas Figuras 2 e 3 e mostram que os anticorpos anti-CEACAM5 se ligam ao domínio A3-B3 das proteínas CEACAM5 humana e de cinomolgus.
[00519] Os isotipos de mAbs individuais foram determinados usando um kit de isotipagem de IgG de camundongo de acordo com as instruções do fabricante (SEROTEC ref. MMT1). Os cinco mAbs específicos para CEACAM5s foram do isotipo IgG1, k. Exemplo 3: Caracterização de anticorpos murinos anti-CEACAM5 Exemplo 3.1: Caracterização in vitro de anticorpos murinos anti- CEACAM5
[00520] O hibridoma de camundongo expressando os Abs específicos para CEACAM5 foi produzido em frasco T500 e os meios condicionados coletados após 7 dias de crescimento. Os Abs específicos para CEACAM5 foram purificados através da passagem dos meios con-dicionados por uma coluna de Proteína-G, lavados e eluídos com tampão Glicina/HCl 100 mM pH 2,7. O eluato foi dializado contra PBS antes da filtração estéril e armazenado a 4°C.
[00521] Todos os mAbs específicos para CEACAM5s foram avaliados quanto sua capacidade de ligar-se à proteína CEACAM5 humana e de primata por ELISA. As placas foram revestidas com a proteína CEACAM5 de humano ou primata, os mAbs anti-hCEACAM5 foram adicionados à placa e detectados com a IgG de coelho anticamundon- go conjugada com peroxidase de rábano silvestre (Sigma; #A9044). A ligação do anticorpo foi visualizada pela adição do tampão TMB-H2O2 e leitura em um comprimento de onda de 450 nm. Tabela 3: Valores de EC50 correspondentes à capacidade de ligação de mAbs específicos para CEACAM5 a proteínas CEACAM5 de primata
Figure img0011
Exemplo 3.2: Afinidade aparente e capacidade de ligação ao anticorpo dos anticorpos anti-CEACAM5 a células primárias humanas de tumor de cólon avançado CR-IGR-034P por Citometria de fluxo
[00522] Tumor de cólon primário humano avançado CR-IGR-034P (Julien et al., Clin Cancer Res October 1, 2012 18:5314-5328) foi obtido do xenoenxerto derivado de Pacientes em camundongos. O tumor CR-IGR-034P foi enzimaticamente dissociado usando colagenase Tipo IV (Invitrogen; #17104-019) e deoxirribonuclease I (Invitrogen; #18047- 019) por 1h a 4°C. A viabilidade celular foi estimada pela aplicação Viacount usando o Sistema de Citometria de Fluxo Guava® easyCyte™ 8HT. Para a estimativa de afinidade aparente, células tumorais CR- IGR-034P foram plaqueadas em 40,000 células/poço em placa de 96 poços de Alta Ligação (MSD L15XB-3) e 100 μL/poço de anticorpos anti-CEACAM5 foram adicionados em diluições seriadas de 2 vezes iniciando em 20 μg/ml até 12 diluições no ensaio de diluição por 45 min a 4°C e lavadas três vezes com PBS BSA 1%. 100 μL/poço de IgG de cabra anticamundongo conjugada com Alexa647 (Invitrogen; # A2135) ou IgG de cabra antihumana conjugada com Alexa488 (Invitro- gen; # A11013) foram adicionados por 45 min a 4°C e lavados três vezes com PBS BSA 1%. A ligação do anticorpo foi avaliada após centrifugação e ressuspensão das células pela adição de 200 μl/poço de PBS BSA 1% e leitura usando o Sistema de Citometria de Fluxo Guava® easyCyte™ 8HT. Os valores de KD aparente e de EC50 foram estimados usando os programas BIOST@T-BINDING e BIOST@T- SPEED, respectivamente.
[00523] A capacidade de ligação do anticorpo dos anticorpos anti- CEACAM5 foi determinada usando o kit Mouse IgG Calibrator (Bio- cytex #7208) ou Kit Human IgG Calibrator (Biocytex #CP010) de acordo com as instruções do fabricante. Tabela 4: Valores de KD e de EC50 obtidos em células primárias de tumor de cólon humano avançado CR-IGR-034P
Figure img0012
Exemplo 3.3: Atividade de internalização de anticorpos murinos espe-cíficos para CEACAM5
[00524] Para avaliar a internalização dos anticorpos anti-CEACAM5 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 e MAb5, as células MKN45 viáveis foram incubadas por 24 h a 37°C/5% CO2 (ou 4°C em gelo para controle ne-gativo) com 10 μg/ml de anticorpos anti-CEACAM5 Marcados com AlexaFluor488. Então, uma parte dos poços foram rinsados com meio de cultura e os anticorpos extracelulares marcados com AF ligados às células foram suprimidos através da incubação das células com anti-corpo anti-AlexaFluor 488 (50 μg/mL) em gelo por 30 min (nível de flu-orescência intracelular). Outra parte dos poços foi somente incubada com meio de cultura na mesma condição de tempo (nível de fluores-cência total).
[00525] As células então foram separadas e lavadas e coletadas em meio de cultura antes da análise por citometria de fluxo usando um analisador MACSQUANT Vyb. A fluorescência associada à célula de 1 x 104 células foi medida, e a intensidade de fluorescência média de células viáveis selecionadas foi quantificada. A razão de internalização (%) é definida pela divisão da fluorescência associada à célula suprimida pelo total da fluorescência associada a células multiplicado por 100. Os dados são expressos como média ± desvio-padrão (SD) Tabela 5: Internalização do anticorpo murino anti-CEACAM5 em 24 horas na linhagem celular MKN45
Figure img0013
[00526] Os cinco anticorpos específicos para CEACAM5 sofrem in- ternalização após ligação da CEACAM5 expressa na membrana da superfície celular, suportando seu uso no campo de imunoconjugados a anticorpo para fornecer uma resposta citotóxica específica para células de câncer. Os anticorpos anti-CEACAM5 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 e MAb5 mostraram internalização na linhagem celular humana de câncer MKN45 de 49,9%, 45%, 51,1%, 42,5%, 51,7%, respectivamente, após 24 horas de incubação. Exemplo 3.4: Atividade citotóxica dos ADCs murinos correspondentes sobre a linhagem celular MKN45
[00527] Os anticorpos murinos foram conjugados a fim de definir sua atividade citotóxica in vitro. Em um tubo de 15 ml, à temperatura ambiente (23°C), mAb, Tampão A/HEPES (4%), DMA (dimetilacetami- da, 20% v/v), então 6 equivalentes do ligante SPDB são sucessiva- mente introduzidos sob agitação magnética. Após uma noite à tempe-ratura ambiente, DM4 (maitansinoide, 9,6 equivalentes) em solução de DMA 15 mM é adicionada e reagida 5 horas. A mistura de conjugação bruta é purificada em colunas Superdex 200pg 16/60 ou G25 26/10 (PBS-Na pH7,4 / NMP 5%), concentrada em Amicon 15 a 5000g e filtrada em Millex 0,22μm.
[00528] O efeito dos conjugados de maitansinoide anti-CEACAM5 então foi testado sobre a viabilidade celular tumoral usando o kit Cell Titer-Glo (Promega). Para fazê-lo, as células humanas de câncer gástrico MKN45 foram plaqueadas em placas de 96 poços e deixadas aderir por 4 horas na atmosfera 37°C/5%CO2. Diferentes concentrações de conjugados de anti-CEACAM5 foram adicionadas às células semeadas. As células então foram incubadas por 96 horas na mesma atmosfera. O reagente Cell Titer-Glo então foi adicionado aos poços por 10 min à temperatura ambiente e o sinal luminescente foi medido usando um contador de placa EnVision (Perkin-Elmer). Tabela 6: Atividades citotóxicas dos ADCs específica para o CEACAM5 murino na linhagem celular MKN45 CEACAM5+
Figure img0014
[00529] Os anticorpos anti-CEACAM5 conjugados ao maitansinoide (DM4) MAb1-SPDB-DM4, MAb2-SPDB-DM4, MAb3-SPDB-DM4, MAb4-SPDB-DM4 e MAb5-SPDB-DM4 mostraram atividades citotóxi- cas in vitro com uma IC50 de 0,89, 0,14, 0,53, 0,96 e 0,24 nM, respectivamente. Exemplo 4: Determinação da sequência das cadeias pesadas e leves dos mAbs anti-CEACAM5
[00530] As sequências dos domínios variáveis do mAb foram recu-peradas a partir do hibridoma e clonadas em um vetor de expressão para assegurar que os mAbs clonados possuiam as mesmas características que o mAbs murinos iniciais.
[00531] As sequências de aminoácidos derivadas forneceram a in-formação em concordância com os dados obtidos em mAbs purificados derivados do hibridoma por sequenciamento N-terminal e espec- trometria de massa (LC/MS) das cadeias pesadas e leves (LC, HC) (ver a Tabela 7). Tabela 7: Análise por espectrometria de massa de mAbs anti- CEACAM5 oriundos de hibridoma
Figure img0015
*: MAb2i é o anticorpo produzido por um dos hibridomas clonados e a partir do qual o chamado "MAb2" foi derivado pela introdução de resíduos canônicos nas regiões estruturais de VL e VH, como explicado no exemplo 5. Exemplo 5: Conjugado Fármaco Anticorpo (ADC) (quimera) Exemplo 5.1: mAb quimérico não conjugado
[00532] As sequências de ácido nucleico dos domínios variáveis VH, VL foram clonadas em vetores de expressão fundidos com as se-quências de codificação de domínio constantes da IgG1 humana ou Ccapa humana respectivamente para gerar então lotes de mAbs qui-méricos pela expressão transiente em HEK293 como descrito no Exemplo 1. As afinidades por CEACAM5 humana e de cinomolgus permaneceram similares para os mAbs murino e quimérico. Na Tabela 8, as afinidades são ilustradas pela EC50 obtida por ELISA com a CEACAM5 humana ou de cinomolgus. Tabela 8: EC50 obtida com CEACAM5 para mAbs de hibridoma murino e quiméricos correspondentes
Figure img0016
[00533] As sequências das regiões da CDR foram deduzidas a partir da sequência proteica usando a nomenclatura IMGT. Elas correspondem às SEQ ID NO: 1 a 4, 6, 7 a 10, 12, 13 a 16, 18, 19 a 22, 24, 25 a 28, 30.
[00534] De forma notável, em comparação ao anticorpo produzido pelo hibridoma clonado (MAb2i), os resíduos canônicos foram introduzidos no clone MAb2 nas posições 41G, 42K, e 45Q em VL, e nas posições 5Q e 7S em VH.
[00535] Além disso, a lisina na posição 52 no VL do clone MAb2 CEA-4 está localizada na CDR2, tendo sido substituída pela arginina no clone MAb2K52R. Um lote foi gerado nas mesmas condições que aquelas correspondentes para clonar o MAb2 e levado à afinidade similar ao domínio extracelular da CEACAM5 humana e de cinomolgus como mostrado na Tabela 7. Destaca-se que esta mutação pontual na CDR pode ser feita sem qualquer impacto na ligação.
[00536] As sequências de LC e HC do mAb quimérico para o clone MAb2e cloneMAb2K52R correspondem às SEQ ID NO: 43, 44, 54.
[00537] chMAb2 foi construído como descrito no exemplo 4. É um mAb quimérico derivado do clone MAb2 com um isotipo IgG1, Ck humano. As sequências correspondem às SEQ ID NO: 43 e 44. Um lote foi preparado na escala de 300 mg pela expressão transiente em HEK293 seguida pela purificação por cromatografia por afinidade pela proteína An, ver a Tabela 7 para os dados de ligação. Ele foi o mAb não conjugado usado para a produção do ADC. Exemplo 5.2: Produção e Caracterização de ADC
[00538] Neste exemplo, os imunoconjugados foram preparados do mAb quimérico não conjugado. A eficácia in vivo então foi avaliada. Cálculo de DAR:
[00539] Um conjugado compreende em geral de 1 a 10 molécula(s) do maitansinoide ligada covalentemente ao anticorpo (chamado, "razão fármaco-para-anticorpo" ou "DAR"). Este número pode variar com a natureza do anticorpo e do maitansinoide usado juntamente com as condições experimentais usadas para a conjugação (como a razão maitansinoide/anticorpo, o tempo de reação, a natureza do solvente e do cossolvente, caso haja). Dessa forma, o contato entre o anticorpo e o maitansinoide leva a uma mistura compreendendo vários conjugados que se diferenciam um do outro por diferentes razões fármaco-para- anticorpo; opcionalmente o anticorpo não conjugado; opcionalmente agregados. A DAR que é determinada é dessa forma um valor médio.
[00540] O método usado neste pedido para determinar a DAR con- siste em medir espectrofotometricamente a razão da absorvância em 252 nm e 280 nm de uma solução de conjugado substancialmente purificado. Em particular, a dita DAR pode ser determinada espectro- fotometricamente usando os coeficientes de extinção do anticorpo e do maitansinoide medidos respectivamente em 280 e 252 nm (SD28Ü = 5.180 M-1cm-1 e SD252 = 26.159 M-1cm-1). O método do cálculo é derivado de Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science e é descrito em mais detalhes abaixo:
[00541] As absorvâncias do conjugado em 252 nm (A252) e em 280 nm (A280) são medidas no pico monomérico da análise de cromato- grafia por exclusão de tamanho (SEC) (permitindo calcular o parâmetro "DAR (SEC)") ou usando um aparelho espectrofotômetro clássico (permitindo calcular o parâmetro "DAR (UV)"). As absorvâncias podem ser expressas como se segue: A252 = (CD X SD252) + (CA X SA252) A28Ü = (CD X SD28Ü) + (CA X SA28Ü) em que:
[00542] CD e CA são respeCtivamente as ConCentrações na solução do maitansinoide e do antiCorpo
[00543] SD252 e SD28Ü são respectivamente os coeficientes de extinção molar do maitansinoide em 252 nm e 28ü nm
[00544] SA252 e SA28Ü são respectivamente os coeficientes de extinção molar do anticorpo em 252 nm e 280 nm.
[00545] A resolução destas duas equações com duas incógnitas leva às seguintes equações: CD=[(SA28ÜXA252) - (SA252 X A28Ü)] / [(SD252 X SA28Ü) - (SA252X SD28Ü)] CA = [A28Ü — (CD X SD28Ü)] / SA28Ü
[00546] A DAR média então é calculada a partir da razão da concentração de fármaco para aquela do anticorpo: DAR = cD / cA
Desglicosilação e Espectrometria de Massa de Alta Resolução dos conjugados (HRMS)
[00547] A desglicosilação é uma técnica de digestão enzimática por meio dae glicosidase. A desglicosilação é feita a partir de 500 μl do conjugado + 100 μl do tampão Tris HCl 50 mM + 10 μl da enzima gli- canase-F (100 unidades da enzima liofilizada / 100 μl de água). O meio é agitado em vórtex e mantido uma noite a 37°C. A amostra des- glicosilada então está pronta para ser analisada por HRMS. Os espectros de massa foram obtidos em um sistema Waters Q-Tof-2 no modo eletropulverização positiva (ES+). As condições cromatográficas são as seguintes: coluna: 4 μm BioSuite 250 SEC URH 4,6x300 mm (Waters); solventes: A: formato de amônio 25 mM + ácido fórmico 1%: B: CH3CN; temperatura da coluna: 30°C; taxa de fluxo 0,4 ml/min; elui- ção isocrática 70% A + 30% B (15 min). Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC) Analítica
[00548] - Coluna: coluna TSKgel G3000 SWXL 5μm, 7,8 mm x 30 cm, TOSOH BIOSCIENCE, LLC Part # 08541 + pré-coluna TSK-GEL SWXL 7 μM, 40 mm x 6 mm, TOSOH BIOSCIENCE, LLC Part # 08543
[00549] - Fase móvel: KCl (0,2M), KH2PO4 (0,052 M), K2HPO4 (0,107 M), iPrOH (20% em volume)
[00550] - Condições de análise: eluição isocrática em 0,5 ml/min por 30 min
[00551] - Análise realizada em um sistema de HPLC Lachrom Elite (Merck) usando um detector de espectrofotômetro L2455 DAD. Conteúdos dos tampões
[00552] - Tampão A (pH 6,5): NaCl (50 mM), tampão de Fosfato de Potássio (50 mM), EDTA (2 mM)
[00553] - Tampão HGS (pH 5,5): histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose 5% (p/v), HCl (8 mM) Abreviações usadas
[00554] CV: Volume de Coluna; DAR: Razão Fármaco Anticorpo; DMA: dimetilacetamida; HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina- etanosulfônico; HRMS: Espectroscopia de massa de Alta resolução; NHS: N-hidroxisuccinimida; Nitro-SPDB: ácido butanoico, éster 4-[(5- nitro-2-piridinil) ditio]-2,5-dioxo-1-pirrolidinil (pode ser preparado como descrito na patente WO2004016801); NMP: N-metilpirrolidinona; RT: temperatura ambiente; SEC: Cromatografia por Exclusão de Tamanho ADC (quimeras): chMAb1-SPDB-DM4 Dados analíticos:
[00555] PM(Ab) = 148438 g/mol; PM (DM4) = 780,38 g/mol
[00556] θ280nm (Ab) = 213320; θ252nm (Ab) = 73473
[00557] θ280nm (DM4) = 5180 e 825^ (DM4) = 26159
[00558] Sob agitação, em TA, 3,59 ml de chMAb1 (C = 5,72 mg / ml em tampão PBS pH =7,4) são introduzidos em um reservatório, e depois 0,312 ml de DMA e 0,046 ml da solução ligante nitro-SPDB (5,0 Eq - solução de 15 mM em DMA). A solução é agitada em vórtex por 30 seg e então lentamente agitada em TA por 3 horas. Sob agitação magnética, 3,8 ml de tampão PBS pH7,5, 0,389 ml de DMA e 0,074 ml da solução DM4 (solução 15 mM em DMA) foram sucessivamente adicionados. Após 2,5 horas em TA, a mistura de reação bruta é purificada em coluna de dessalinização HiLoad 26/60 (Superdex 200 pg; GE Healthcare), pré-condicionada com 1CV de NaOH 1M, 2 CV de água e 2 CV de tampão PBS pH 7,4 contendo 5% de NMP em volume. O conjugado é eluido com tampão PBS pH 7,4 contendo 5% de NMP, e as frações monoméricas conjugadas são agrupadas, concentradas em Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore) e filtradas em filtro de 0,22μm.
[00559] 7,6 ml do conjugado chMAb1-SPDB-DM4 (c=2,19 mg/ml) foram então obtidos como uma solução incolor límpida. O conjugado então é analisado quanto a carga de fármaco e pureza monomérica finais: DAR (UV) = 3,38; DAR (SEC) = 3,34; Tr = 17,54 min; pureza monomérica = 99,8%.
[00560] O resultado da análise por HRMS é mostrado na Figura 8. chMAb2-SPDB-DM4 Dados analíticos:
[00561] PM (Ab) = 147900 g/mol; PM (DM4) = 780,38 g/mol
[00562] θ280nm (Ab) = 201400; θ252nm (Ab) = 70889
[00563] θ280nm (DM4) = 5180 e e^m, (DM4) = 26159
[00564] Sob agitação, em TA, 3,8 ml de chMAb2 (C = 5,08 mg / ml em tampão PBS pH =7,4) são introduzidos em um reservatório, e depois 0,337 ml de DMA e 0,0433 ml da solução ligante nitro-SPDB (5,0 Eq - solução 15 mM em DMA). A solução é agitada em vórtex por 30 segundos e então lentamente agitada em TA por 3 horas. Sob agitação magnética, 3,12 ml de tampão PBS pH7,5, 0,319 ml de DMA e 0,069 ml da solução DM4 (solução 15 mM em DMA) foram sucessivamente adicionados. Após 2 horas em TA, a mistura de reação bruta é filtrada em filtro de 0,45 μm e purificada em coluna de dessalinização HiLoad 26/60 (Superdex 200 pg; GE Healthcare), pré-condicionada com 1CV de NaOH 1M, 2 CV de água e 2 CV de tampão PBS pH 7,4 contendo 5% de NMP em volume. O conjugado é eluido com tampão PBS pH 7,4 contendo 5% de NMP, e as frações monoméricas conjugadas são agrupadas, concentradas em Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore) e filtradas em filtro de 0,22μm.
[00565] 7,5 ml do conjugado chMAb2-SPDB-DM4 (c=1,8 mg/ml) foram então obtidos como uma solução incolor límpida. O conjugado então é analisado quanto a carga de fármaco e pureza monomérica finais: DAR (UV) = 4,10; DAR (SEC) = 4,05; Tr = 17,52 min; pureza monomérica = 99,9%.
[00566] O resultado da análise por HRMS é mostrado na Figura 9. chMAb4-SPDB-DM4 Dados analíticos:
[00567] PM (Ab) = 148124 g/mol; PM (DM4) = 780,38 g/mol
[00568] ε280nm 280nm (Ab) = 204380; ε280nm 252nm (Ab) = 73142
[00569] ε280nm 280nm (DM4) = 5180 e ε280nm 252nm (DM4) = 26159
[00570] Sob agitação, em TA, 3,63 ml de chMAb4 (C = 5,69 mg / ml em tampão PBS pH =7,4) são introduzidos em um reservatório, e depois 0,316 ml de DMA e 0,0465 ml da solução ligante nitro-SPDB (5,0 Eq - solução 15 mM em DMA). A solução é agitada em vórtex por 30 segundos e então lentamente agitada em TA por 3 horas. Sob agitação magnética, 3,8 ml de tampão PBS pH7,5, 0,389 ml de DMA e 0,074 ml da solução DM4 (solução 15 mM em DMA) foram sucessivamente adicionados. Após 2 horas em TA, a mistura de reação bruta é purificada em coluna de dessalinização HiLoad 26/60 (Superdex 200 pg; GE Healthcare), pré-condicionada com 1CV de NaOH 1M, 2 CV de água e 2 CV de tampão PBS pH 7,4 contendo 5% de NMP em volume. O conjugado é eluido com tampão PBS pH 7,4 contendo 5% de NMP, e as frações monoméricas conjugadas são agrupadas, concentradas em Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore) e filtradas em filtro de 0,22μm.
[00571] 6,5 ml do conjugado chMAb4-SPDB-DM4 (c=2,20 mg/ml) foram então obtidos como uma solução incolor límpida. O conjugado então é analisado quanto a carga de fármaco e pureza monomérica finais: DAR (UV) = 3,87; DAR (SEC) = 3,85; Tr = 17,52 min; pureza monomérica = 99,8%.
[00572] O resultado da análise por HRMS é mostrado na Figura 10. chMAb5-SPDB-DM4 Dados analíticos:
[00573] PM (Ab) = 148040 g/mol; PM (DM4) = 780,38 g/mol
[00574] ε280nm 280nm (Ab) = 207360; ε280nm 252nm (Ab) = 72288
[00575] ε280nm 280nm (DM4) = 5180 e ε280nm 252nm (DM4) = 26159
[00576] Sob agitação, em TA, 3,15 ml de chMAb5 (C = 6,38 mg / ml em tampão PBS pH =7,4) são introduzidos em um reservatório, e depois 0,269 ml de DMA e 0,0453 ml da solução ligante nitro-SPDB (5,0 Eq - solução 15 mM em DMA). A solução é agitada em vórtex por 30 segundos e então lentamente agitada em TA por 3 horas. Sob agitação magnética, 4,1 ml de tampão PBS pH7,5, 0,317 ml de DMA e 0,072 ml da solução DM4 (solução 15 mM em DMA) foram sucessivamente adicionados. Após 2 horas em TA, a mistura de reação bruta é filtrada em filtro de 0,45 μm e purificada em coluna de dessalinização HiLoad 26/60 (Superdex 200 pg; GE Healthcare), pré-condicionada com 1CV de NaOH 1M, 2 CV de água e 2 CV de tampão PBS pH 7,4 contendo 5% de NMP em volume. O conjugado é eluido com tampão PBS pH 7,4 contendo 5% de NMP, e as frações monoméricas conjugadas são agrupadas, concentradas em Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore) e filtradas em filtro de 0,22μm.
[00577] 7,5 ml de conjugado AntiCEA- CAM5_hyb_1917CEA4_VH5Q7S_VL41G42K45Q_IgG1-SPDB-DM4 (c=3,4 mg/ml) foram então obtidos como uma solução incolor límpida. O conjugado então é analisado quanto a carga de fármaco e pureza monomérica finais: DAR (UV) = 3.4; DAR (SEC) = 3.4; Tr = 17,49 min; pureza monomérica = 99,8%.
[00578] O resultado da análise por HRMS é mostrado na Figura 11. Exemplo 5.3: Eficácia in vivo
[00579] Quatro conjugados quiméricos (chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1-SPDB-DM4, chMAb5-SPDB-DM4 e chMAb2-SPDB-DM4) foram avaliados em 2 doses contra tumores de cólon primário CR-IGR- 034P mensuráveis implantados s.c. em camundongos SCID fêmeas. Os grupos controle foram mantidos não tratados. Os conjugados em doses foram fornecidos em mg/kg. Foram administrados em 5 e 2,5 por uma injeção intravenosa (IV) em bolus, no dia 14 após a implantação tumoral.
[00580] Para a avaliação da atividade antitumoral dos conjugados, os animais foram pesados diariamente e os tumores foram medidos 2 vezes semanalmente com paquímetro. Uma dosagem que produz uma perda de peso de 20% na concentração mínima do fármaco (médio do grupo) ou 10% ou mais mortes pelo fármaco foi considerada uma dosagem excessivamente tóxica. Os pesos corporais dos animais incluíram os pesos tumorais. O volume tumoral foi calculado usando a fórmula de massa (mm3) = [comprimento (mm) x largura (mm) 2]/2. A eficácia primária dos pontos finais são ΔT/ΔC, regressão mediana percentual, regressões parciais e completas (PR e CR).
[00581] Modificações no volume tumoral para cada um tratador (T) e controle (C) são calculadas para cada tumor pela subtração do volume tumoral no dia do primeiro tratamento (dia de estadiamento) a partir do volume tumoral no dia de observação especificado. A mediana de ΔT é calculada para o grupo tratado e a mediana de ΔC é calculada para o grupo controle. Então, a razão ΔT/ΔC é calculada e expressa como uma porcentagem: ΔT/ΔC = (delta T/delta C) x 100.
[00582] A dose é considerada como terapeuticamente ativa quando ΔT/ΔC é menor que 40% e muito ativa quando ΔT/ΔC é menor que 10%. Se ΔT/ΔC for menor que 0, a dose é considerada como altamente ativa e a porcentagem da regressão é datada (Plowman J, Dykes DJ, Hollingshead M, Simpson-Herren L and Alley MC. Human tumor xenograft models in NCI drug development. In: Feibig HH BA, editor. Basel: Karger.; 1999 p 101-125):
[00583] % da regressão tumoral é definida como a % de redução do volume tumoral no grupo tratado em um dia de observação especificado em comparação com seu volume no primeiro dia do primeiro tratamento.
[00584] Em um ponto de tempo específico e para cada animal, a % de regressão é calculada. A % de regressão mediana então é calculada para o grupo:
Figure img0017
[00585] Regressão parcial (PR): As regressões são definidas como parciais se o volume tumoral diminuir para 50% do volume tumoral no início do tratamento.
[00586] Regressão completa (CR): Aregressão completa é alcançada quando o volume tumoral = 0 mm3 (CR é considerada quando o volume tumoral não pode ser registrado). Resultados:
[00587] Os resultados são apresentados na Figura 4 e na Tabela 9 (abaixo). Usando um esquema de administração única em 2,5 e 5 mg/kg, todos os conjugados testados neste estudo não induziram toxicidade.
[00588] chMAb1-SPDB-DM4 foi muito ativo em 5 e 2,5 mg/kg com uma ΔT/ΔC de 0 e 7% (p < 0,0001 e p = 0,0170 em comparação com o controle), respectivamente. chMAb4-SPDB-DM4 e chMAb5-SPDB- DM4 foram altamente ativos em 5 mg/kg com ΔT/ΔC de -5 e-7% (p < 0,0001 em comparação com o controle), respectivamente e regressão tumoral de 25 e 65%, respectivamente. Foram muito ativos em 2,5 mg/kg com ΔT/ΔC de 7 e 2% (p = 0,0152 e p = 0,0020 em comparação com o controle), respectivamente. chMAb2-SPDB-DM4 foi altamente ativo em 5 e 2,5 mg/kg com ΔT/ΔC de -10 e -8% (p < 0,0001 em comparação com o controle), respectivamente, regressão tumoral de 82 e 39%, respectivamente e 3 e 1 CR/6, respectivamente.
[00589] A partir destes resultados, todos os conjugados quiméricos chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1-SPDB-DM4, chMAb5-SPDB-DM4 e chMAb2-SPDB-DM4 foram usáveis para desenvolver um ADC tera-pêutico. Tabela 9: Avaliação da atividade antitumoral dos conjugados chMAb1-SPDB-DM4, chMAb2-SPDB-DM4, chMAb4-SPDB-DM4 e chMAb5- SPDB-DM4 contra adenocarcinoma primário de cólon humano CR-IGR-034P em camundongos fêmeas SCID.
Figure img0018
1 formulação de fármaco: HGS (Histidina 10 mM, Glicina 130 mM, Sacarose 5% v/v, Tween 80 0,01%) pH 7,4 2 p-valor: Teste de Dunett em comparação com o controle após Anova bidirecional com medidas repetidas em modificações com dados transformados por intervalos do volume tumoral de referência. 120/161 Petição 870220047417, de 31/05/2022, pág. 123/177 Exemplo 6: Humanização do mAb anti-CEACAM5MAb2
[00590] Neste exemplo, as variantes humanizadas da IgG murina parental MAb2 foram projetadas in silico. Os mAbs resultantes foram produzidos e forneceram características similares às da IgG ch-MAb2 quimérica. Exemplo 6.1: Protocolo de humanização em 4D a) Humanização Baseada em trajetórias dinâmicas moleculares
[00591] As sequências de VL & VH do clone de MAb2 murino foram comparadas com a base de dados proteica (PDB) (Berman et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242). Os seguintes moldes foram usados: região estrutural da cadeia leve e pesada - 3EHB (90,9% de identidade da cadeia leve da região estrutural e 90,8% de identidade da cadeia pesada da região estrutural), L1 - 1I8M, L2 - 1F6L, L3 - 1P7K, H1 - 2QHR, H2 - 1IGT e H3 - 1P4B para construir um modelo de homologia de LC e HC do anti-CEACAM5 usando o Molecular Operating Environment (MOE) (v. 2011.10 - Chemical Computing Group, Quebec, Canadá). O modelo de homologia teve posteriormente a energia minimizada usando procedimentos padrão implementados em MOE.
[00592] Uma simulação de dinâmica molecular (MD) do modelo de homologia 3D minimizado do MAb2 murino foi posteriormente realizada, com restrições no esqueleto proteico a temperatura de 500 K por 1,1 nanossegundos (ns) no solvente implícito Generalized Born. 10 conformações diversas foram extraídas desta primeira MD corrida a cada 100 picosegundos (ps) para o último 1 ns. Estas conformações diversas então foram submetidas a uma simulação MD, sem restrições no esqueleto proteico e a temperatura de 300 K, por 2,3 ns. Para cada uma das 10 corridas de MD, os últimos 2.000 instantâneos, um a cada ps, a partir da trajetória de MD então foram usados para calcular, para cada aminoácido do MAb2 murino, seus desvios da raiz quadrada mé- dia (rmsd) em comparação com uma referência posição medoide. Pela comparação da rmsd média em 10 corridas de MD separadas de um dado aminoácido à rmsd média total de todos os aminoácidos murinos de MAb2, pode-se decidir se o aminoácido é flexível o suficiente, como visto durante a MD para ser condiderado como provavelmente interagir com receptores de célula T e responsável pela ativação da resposta imune. 32 aminoácidos foram identificados como flexíveis no anticorpo MAb2 murino, excluindo a CDR e nas imediações dentro de 5 Â.
[00593] O movimento dos 60 aminoácidos do MAb2 murino mais flexíveis, durante os 20 ns (10 x 2 ns) da simulação dinâmica molecular, então foram comparados com o movimento dos aminoácidos flexíveis correspondentes de 49 modelos de homologia 3D humanos, para cada um dos quais foram corridas as mesmas simulações MD. Estes 49 modelos de linhagem germinativa humana foram construídos pela combinação sistemática de painel representativo de 7 cadeias leves humanas (ou seja, vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) com um pannel representativo de 7 cadeias pesadas humanas (ou seja, vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) (Nucleic Acid Research, 2005, Vol. 33, Database issue D593-D597).
[00594] A combinação vk1-vh6 mostrou as mais altas similaridades 4D (72,6%) dos seus aminoácidos flexíveis em comparação com os aminoácidos flexíveis do anticorpo MAb2 murino; este modelo, por isso, foi usado para humanizar o anticorpo MAb2 focando nos aminoáci- dos flexíveis. Para a associação de aminoácido aos pares entre o MAb2 murino e aminoácidos vk1-vh6, as 2 sequências foram alinhadas com base na superposição 3D ótima dos carbonos f alfa dos 2 modelos de homologia correspondentes. b) Mutações Estabilizadoras
[00595] Para melhorar a estabilidade das regiões VL e VH do anticorpo anti-CEACAM5, os aminoácidos das cadeias leves e pesadas com baixa frequência de ocorrência em comparação com suas respec-tivas sequências canônicas, excluindo as CDRs, são originalmente propostos para ser mutados nos aminoácidos mais frequentemente encontrados (ΔΔGth > 0,5 kcal/mol; (Monsellier et al. J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593). Uma primeira lista de mutações consenso para a LC e para a HC foi limitada aos aminoácidos encontrados no modelo humano mais próximo (isto é, vk1-vh6). Nenhuma destas mutações rstá localizada na zona "Vernier" (Foote et al., J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499). Outros critérios são levados em conta para considerar estas mutações consenso para potencialmente estabilizar o anticorpo anti- CECAM5 MAb2. Estes critérios são uma modificação favorável de hi- dropatia na superfície ou uma mecânica molecular baseada na estabilização predita do mutante. Mutações estabilizadoras relatadas como bem sucedidas na literatura (Bedouelle, H. J. Mol. Biol. 2006, 362,580593; Steipe B. J. Mol. Biol. 1994, 240, 188-192) foram consideradas. c) Remoção de Motivos de Sequência Não Desejados
[00596] Os seguintes motivos de sequências foram considerados: Asp-Pro (ligação ácido-lábeis), Asn-X-Ser/Thr (glicosilação, X=qualquer aminoácido de senão Pro), Asp-Gly/Ser/Thr (formação em áreas flexíveis succinimida/iso-asp), Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys (sítios de deamidação expostos), Met (oxidação em área exposta). As sequências humanizadas resultantes foram comparadas para a similaridade de sequência contra o banco de dados de Immune Epitope Data Base (IEDB) ((PLos Biol (2005) 3(3)e91) http://www.immuneepitope.org) para assegurar que nenhuma das sequências contém nenhum dos epí- topo conhecidos listados para celúlas B ou T. d) Regiões VH e VL Humanizadas
[00597] Três versões para a cadeia leve (VL1, VL1a e VL1c) e três versões para a cadeia pesada são propostas (VH1, VH1a e VH1b). A particular combinação de resíduos de aminoácido alterados em cada VL e VH variante do MAb2 humanizado é apresentada na Tabela 10 e na Tabela 11, respectivamente. As sequências completas de aminoá- cidos dos domínios humanizado VH e VL são apresentadas na Tabela 12.
[00598] A variante VL1 exibe 5 mutações que derivam da comparação direta entre os aminoácidos não CDR mais flexíveis da sequência da cadeia leve e da cadeia leve vk1 humana do MAb2 anti-CEACAM5.
[00599] A variante VL1a deriva da VL1 e inclui 4 novas mutações que são consenso (sequência vk1) e potencialmente estabilizadoras. Além disso, 1 destas mutações aborda um sítio de deamidação potencialmente problemático (D17T18).
[00600] A variante VL1c deriva da VL1a com a introdução de 1 mutação R ao invés de K na posição 52. De fato, esta K52 está localizada na CDR L2 e pode ser um "alvo" para o processo de conjugação.
[00601] A variante VH1 exibe 7 mutações que derivam da comparação direta entre a maioria dos aminoácidos flexíveis não CDR da sequência da cadeia pesada humana vh6 e da cadeia pesada do anti- CEACAM5.
[00602] A variante VH1a deriva de VH1 e inclui 4 novas mutações que são consenso (sequência vh6) e potencialmente estabilizadoras.
[00603] Os domínios VL e VH humanizados do anticorpo MAb2 an- ti-CEACAM5 foram combinados como se segue: VL1 e VH1; VL1a e VH1a; VL1c e VH1a; VL1a e VH1b Tabela 10: Mutações das variantes de VL do anticorpo MAb2 anti- CEACAM5
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Tabela 11: Mutações das variantes de VH do anticorpo MAb2 anti- CEACAM5
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Tabela 12: Sequências de aminoácidos de VH e VL de anticorpos exemplares humanizados anti-CEACAM5.
Figure img0022
Figure img0023
Exemplo 6.2: Sequência do mAb anti CEACAM5 humanizado
[00604] A partir das sequências de aminoácidos da VL e VH variantes in silico, as sequências de ácido nucleico foram derivadas e sintetizadas por Geneart. As sequências foram clonadas em vetores de expressão em fusão com as sequências da IgG1 humana ou de codificação do domínio constante Ckappa humano respectivamente. Exemplo 6.3: Produção e caracterização in vitro
[00605] Os lotes de mAbs humanizados foram produzidos pela expressão transiente em HEK293 e purificados pela cromatografia por afinidade pela proteína A. A estrutura e a identidade foram confirmadas por análise por SDS-PAGE, Cromatografia por Exclusão de Tamanho e Espectrometria de massa.
[00606] A afinidade pela CEACAM5 humana e de cinomolgus foi verificada por ELISA, as EC50 são fornecidas na Tabela 13. Tabela 13: Afinidade do mAb anti-CEACAM5 humanizado pela CEACAM5 humana e cinomolgus
Figure img0024
[00607] A especificidade pela CEACAM5 humana em comparação com CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 e CEACAM8 humanas foi verificada por ELISA. Foi relatada como a porcentagem de ligação em comparação com a ligação completa com CEACAM5 humana, ver a Tabela 14. Tabela 14: Porcentagem de ligação do mAb anti-CEACAM5 humanizado a CEACAMs humanas
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[00608] O domínio de ligação ao epítopo foi verificado por ELISA e mostrou que as variantes humanizadas reconheceram o domínio A3- B3 especificamente. Foi relatado como a porcentagem de ligação em comparação com a ligação completa com a CEACAM5 humana na Tabela 15. Tabela 15: Porcentagem de ligação do mAb anti-CEACAM5 humanizado aos domínios das CEACAM5 humanas
Figure img0026
[00609] A cinética de ligação das variantes humanizadas anti- CEACAM5_MAb2, em comparação com o MAb2 quimérico, à CEACAM5 humana recombinante (hCEACAM5) e à CEACAM5 de macaco cinomolgus (cCEACAM5) foi determinada pelo ensaio de ressonância de plásmons de superfície usando um BIAcore 2000 (BIAco- re Inc., Uppsala, NJ).
[00610] Resumidamente, um chip biosensor BIAcore CM5 foi acoplado ao instrumento e ativado com 70 μL de 1:1 NHS/EDC à temperatura ambiente. Uma IgG1 anti-αhumana Fc de camundongo (BIAcore #BR-1008-39) (50 μg/mL em tampão acetato 1M, pH5) foi imobilizada chip ativado em todas as células de fluxo. A imobilização foi realizada em uma taxa de fluxo de 10 μL/min até a saturação. O chip então foi bloqueado pela injeção de 70 μL de etanolamina-HCl, pH8,5, e depois lavagem com MgCl2 3M. Para medir a ligação dos mAbs anti- CEACAM5 à proteína CEACAM5 humana ou à proteína CEACAM5 de cinomolgus, os anticorpos foram usados em 1 a 5 μg/mL em tampão de corrida BIAcore (HBS-EP). Os antígenos (CEACAM5 humana ou CEACAM5 de cinomolgus) foram injetados de 1 a 500 nM. Após a finalização da fase de injeção, a dissociação foi monitorada em um Tampão de corrida BIAcore na mesma taxa de fluxo por 600 seg. A superfície foi regenerada entre as injeções usando 2 x 5 μL MgCl2 3M (2 x 30s). Sensorgramas individuais foram analisados usando o programa BIAevaluation. Tabela 16: Ligação do mAb anti-CEACAM5 humanizado a CEACAM5 humana e de macaco
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[00611] A especificidade de variantes anti-CEACAM5_MAb2 huma-nizadas, comparadas com o MAb2 quimérico, à CEACAM5 de cinomo- lgus em comparação com CEACAM1, CEACAM6 e CEACAM8 de ci- nomolgus foi verificada por ELISA. Foi relatado como a porcentagem de ligação em comparação com a ligação completa com CEACAM5 ou ligação na EC50, ver a Tabela 17 abaixo Tabela 17: Porcentagem de ligação do mAb anti-CEACAM5 humanizado a CEACAMs de cinomolgus
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Exemplo 6.4: Caracterização de variantes humanizadas de Mab2 obtidas pelo exerto das regiões estruturais da linhagem germinativa humana
[00612] Neste exemplo, as variantes humanizadas de Mab2 foram obtidas por uma abordagem de enxerto de CRD. Além disso, as CDRs do anticorpo humanizado foram submetidas a uma abordagem de varredura de alanina para mostrar que diversas posições podem ser substituídas sem afetar a ligação à CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis.
[00613] A sequência de uma versão humanizada do Mab2 foi gerada primeiro in silico pela seleção das regiões estruturais de linhagem germinativa humana com base na homologia estrutural com o anticorpo Mab2 murino. Para a cadeia leve, as regiões estruturais humanas selecionadas são definidas pelos genes IGKV1D-39*01 e IGKJ2*02 e para a cadeia pesada, pelos genes IGHV3-23*04 e IGHJ4*01. As seis CDRs de MAb2K52R foram enxertadas nestas regiões estruturais hu-manas. Três retromutações foram introduzidas, correspondendo às posições 34 e 53 na VL (SEQ ID NO. 34) (regiões FR2-L e FR3-L, res-pectivamente) e à posição 50 na VH (SEQ ID NO. 33) (região FR2-H), resultando na seguinte sequência, definida como MAb2_VLg5VHg2. Tabela 18: Sequências de VH e VL do MAb2VLg5VHg2
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[00614] Diversas variantes de MAb2_VLg5VHg2 foram obtidas pela substituição única de cada aminoácido das seis CDRs, preferencialmente por uma alanina. Quando a alanina já é encontrada nas CDRs do MAb2_VLg5VHg2, o que ocorre na H-CDR3, outro aminoácido foi substituído (Val no resíduo 97, Arg no resíduo 98 e Asp no resíduo 108 da SEQ ID NO:74).
[00615] A partir das sequências de aminoácidos in silico da VL e VH variantes, as sequências de ácido nucleico foram derivadas e geradas por síntese gênica. As sequências foram clonadas em um vetor de ex-pressão mamífero em fusão com a sequências da IgG1 humana e de codifcação dos domínios constantes Ckappa, respectivamente. MAb2_VLg5VHg2 humanizados, variantes únicas que se diferenciam dele por uma posição e um número limitado de mutantes de combinação, foram produzidos pela expressão transiente em células HEK293. Os sobrenadantes celulares contendo IgGs secretada (20 a 70 μg/ml) foram diluídos a 1 μg/ml para uso em ensaios de ligação ao ECD da CEACAM5 humana, ECD de Macaca fascicularis e domínio A3-B3 da CEACAM5 humana.
[00616] Para avaliar o impacto destas modificações, a ligação das IgGs foi determinada medindo os sinais SPR com uma unidade de Bi- acore T200 (GE Healthcare). Os anticorpos anti Fc humanos foram acoplados a um chip Series S CM5 através do kit de acoplamento de amina para alcançar um nível de 10,000 unidades de resposta (RU). Aproximadamente 300 a 600 RU de cada variante foram capturados pela injeção dos sobrenadantes em 1 μg/mL com um tempo de contato de 60 segundos e uma taxa de fluxo de 10 μL/min. Todos os experimentos foram realizados a 25°C com HBS-EP+ (Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensoativo P20 0,05%) como o tampão de corrida. Em um modo de rastreamento, a CEACAM5 humana / CEACAM5 de cinomolgus / domínio A3B3 humano foi injetado em 50 nM sobre as IgG variantes capturadas em uma taxa de fluxo de 30 μL/min por 1 minuto. Uma fase de dissociação de 60 segundos foi mantida antes que a superfície fosse regenerada com 1 pulso de injeção de MgCl2 3 M em uma taxa de fluxo de 10 μL/minuto e um tempo de contato de 30 segundos.
[00617] Para cada experimento, os dados de resposta foram processados usando uma superfície de referência, permitindo com isso, a correção de modificações do índice refrativo do volume e qualquer li-gação não específica. Os dados foram duas vezes referenciados usando a resposta a partir das injeções do branco. De acordo com o método de rastreamento descrito em uma informação da GE Healthcare (Informação 28-9777-72 AA), dois parâmetros foram considerados para classificar as variantes com respeito a características de ligação. Em primeiro lugar, a atividade de ligação é estimada pela razão do sinal máximo teórico medido (porcentagem de Rmax, ver a Figura 16). Em segundo lugar, a porcentagem do sinal restante é calculada usando pontos de relato de dissociação (o primeiro, 10 segundos após o fim da injeção, e o segundo, 50 segundos após o fim da injeção) e reflete a estabilidade da ligação (ver a Figura 17).
[00618] As variantes de alanina única nas seguintes posições de-monstraram parâmetros de ligação equivalentes, em comparação com o anticorpo original, sugerindo que os aminoácidos de uma CDR nestas posições são neutros para a ligação: resíduos de LC 27, 28, 29, 31, 51, 52, 89, 90, 93, 94, 96, 97 e resíduos de HC 26 a 31, 51 a 58, 97, 103, 104, 107, 109. Os comportamentos destas variantes são similares a CEACAM5 humana e de macaco, dessa forma mantendo sua reatividade cruzada. Foi encontrado que a ligação ao domínio A3-B3 de CEACAM5 também não foi afetada. Algumas combinações de substituições duplo neutras também foram geradas e foi encontrado que resultam em parâmetros de ligação inalterados, como ilustrado com a associação de LC_T51A com LC_T94A, LC_S31A com HC_G54Y ou LC_T53I com HC_S53A.
[00619] De modo inverso, em todas as outras posições de uma CDR, foi encontrado que a substituição da alanina no aminoácido original induz uma perda completa da ligação ou altera dramaticamente os parâmetros de ligação. A posição 101 da cadeia pesada ou as posições 32 e 91 da cadeia leve são exemplos mostrados nas Figuras 16 e 17). Um segundo conjunto de variantes consistiu no teste de mais mutações conservativas em algumas de tais posições. Fazendo isto, encontramos que as seguinte substituições conservativas foram neutras para a ligação de antígeno: Tyr por Phe no resíduo 30 do MAb2_VLg5, Phe por Tyr no resíduo 92 do MAb2_VLg5, Ser por Ala no resíduo 98 do MAb2_VHg2 e Phe por Tyr no resíduo 100 do MAb2_VHg2 (mostradas nas figuras) Exemplo 7: variantes humanizadas de conjugados fármaco MAb2 Exemplo 7.1: Produção e Caracterização huMAb2-2-SPDB-DM4 Dados analíticos: PM (Ab) = 147360 g/mol; PM (DM4) = 780,38 g/mol θ280nm (Ab) = 201400; θ280nm (Ab) = 71693 θ280nm (DM4) = 5180; i^m (DM4) = 26159
[00620] Sob agitação, em TA, 19,4 mg do huMAb2-2 (C = 5,1 mg / ml em tampão PBS pH =7,4) são introduzidos em um reservatório, e depois 0,375 ml de DMA e 0,0439 ml da solução ligante nitro-SPDB (5,0 Eq - solução 15 mM em DMA). A solução é agitada em vórtex por 30 segundos e então lentamente agitada em TA por 2 horas. É adicionado um volume extra de 0,0044 ml da solução ligante nitro-SPDB (5,0 Eq - solução 15 mM em DMA). Após 2 horas em TA sob agitação magnética, 2 ml de tampão PBS pH=7,5 e 0,0702 ml da solução DM4 (solução 15 mM em DMA) foram sucessivamente adicionados. Após 2 horas em TA, a mistura de reação bruta é filtrada em filtro de 0,45 μm e purificada em coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), pré-condicionada com 1CV de NaOH 1M, 2 CV de água e 2 CV de tampão histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose (5%), pH=5,5. O conjugado é eluido com o tampão histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose (5%), pH=5,5, e as frações monomé- ricas conjugadas são agrupadas e filtradas em filtro de 0,22μm.
[00621] 10,3 ml do conjugado huMAb2-2-SPDB-DM4 (c=1,35 mg/ml) foram então obtidos como uma solução incolor límpida. O con-jugado então é analisado quanto a carga de fármaco e pureza mono- mérica finais: DAR (UV) = 3,7; DAR (SEC) = 3,6; Tr = 17,29 min; pureza monomérica = 97,9%.
[00622] O resultado da análise por HRMS é mostrado na Figura 12. huMAb2-1-SPDB-DM4 Dados analíticos: PM (Ab) = 147563 g/mol; PM (DM4) = 780,38 g/mol θ280nm (Ab) = 201400; θ252nm (Ab) = 69669 θ280nm (DM4) = 5180; (^ (DM4) = 26159
[00623] Sob agitação, em TA, 3,8 ml de uma solução do huMAb2-1 (C = 5,08 mg / ml em tampão PBS pH =7,4) são introduzidos em um reservatório, e depois 0,341 ml de DMA e 0,0392 ml da solução ligante nitro-SPDB (4,5 Eq - solução 15 mM em DMA). A solução é agitada em vórtex por 30 segundos e então lentamente agitada em TA por 3 horas. É adicionado um volume extra de 0,0087 ml da solução ligante nitro-SPDB (1,0 Eq - solução 15 mM em DMA). Após 2 horas em TA sob agitação magnética, 2,62 ml de tampão PBS pH7,5, 0,254 ml de DMA e 0,076 ml da solução DM4 (solução 15 mM em DMA) foram sucessivamente adicionados. Após 1 hora em TA, a mistura de reação bruta é filtrada em filtro de 0,45 μm e purificada em coluna de dessali- nização HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), pré- condicionada com 1CV de NaOH 1M, 2 CV de água e 2 CV de tampão histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose (5%), pH=5,5. O conjugado é eluido com o tampão histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose (5%), pH=5,5, e as frações monoméricas conjugadas são agrupadas e filtradas em filtro de 0,22μm.
[00624] 9,5 ml do conjugado huMAb2-1-SPDB-DM4 (c=1,35 mg/ml) foram então obtidos como uma solução incolor límpida. O conjugado então é analisado quanto a carga de fármaco e pureza monomérica finais: DAR (UV) = 4,1; DAR (SEC) = 4,0; Tr = 17,39 min; pureza mo- nomérica = 96,7%.
[00625] O resultado da análise por HRMS é mostrado na Figura 13. huMAb2-3-SPDB-DM4 Dados analíticos: PM (Ab) = 147417 g/mol; PM (DM4) = 780,38 g/mol θ280nm (Ab) = 201400; θ252nm (Ab) = 71451 θ280nm (DM4) = 5180; (^ (DM4) = 26159
[00626] Sob agitação, em TA, 3,8 ml de uma solução do huMAb2-3 (C = 5,09 mg/ml em tampão PBS pH =7,4) são introduzidos em um reservatório, e depois 0,336 ml de DMA e 0,0437 ml da solução ligante nitro-SPDB (5 Eq - solução 15 mM em DMA). A solução é agitada em vórtex por 30 segundos e então lentamente agitada em TA por 3 horas. É adicionado um volume extra de 0,0035 ml da solução ligante nitro-SPDB (0,4 Eq - solução 15 mM em DMA). Após 1 hora em TA sob agitação magnética, 2,60 ml de tampão PBS pH7,5, 0,248 ml de DMA e 0,074 ml da solução DM4 (solução 15 mM em DMA) foram sucessivamente adicionados. Após 1 hora em TA, a mistura de reação bruta é filtrada em filtro de 0,45 μm e purificada em coluna de dessali- nização HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), pré- condicionada com 1CV de NaOH 1M, 2 CV de água e 2 CV de tampão histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose (5%), pH=5,5. O conjugado é eluido com o tampão histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose (5%), pH=5,5, e as frações monoméricas conjugadas são agrupadas e filtradas em filtro de 0,22μm.
[00627] 11 ml do conjugado huMAb2-3-SPDB-DM4 (c=1,08 mg/ml) foram dessa forma obtidos como uma solução límpida incolor. O con-jugado então é analisado quanto a carga de fármaco e pureza mono- mérica finais: DAR (UV) = 3,9; DAR (SEC) = 3,8; Tr = 17,44 min; pure- za monomérica = 98,4%.
[00628] O resultado da análise por HRMS é mostrado na Figura 14. huMAb2-4-SPDB-DM4 Dados analíticos: PM (Ab) = 147628 g/mol; PM (DM4) = 780,38 g/mol θ280nm (Ab) = 201400; θ252nm (Ab) = 70628 θ280nm (DM4) = 5180; θ252nm (DM4) = 26159
[00629] Sob agitação, em TA, 3,8 ml de uma solução do huMAb2-4 (C = 5,09 mg/ml em tampão PBS pH =7,4) são introduzidos em um reservatório, e depois 0,345 ml de DMA e 0,0448 ml da solução ligante nitro-SPDB (5 Eq - solução 15 mM em DMA). A solução é agitada em vórtex por 30 segundos e então lentamente agitada em TA por 3 horas. É adicionado um volume extra de 0,0027 ml da solução ligante nitro-SPDB (0,3 Eq - solução 15 mM em DMA). Após 1 hora em TA sob agitação magnética, 2,70 ml de tampão PBS pH7,5, 0,263 ml de DMA e 0,075 ml da solução DM4 (solução 15 mM em DMA) foram sucessivamente adicionados. Após 1 hora em TA, a mistura de reação bruta é filtrada em filtro de 0,45 μm e purificada em coluna de dessali- nização HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), pré- condicionada com 1CV de NaOH 1M, 2 CV de água e 2 CV de tampão histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose (5%), pH=5,5. O conjugado é eluido com o tampão histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose (5%), pH=5,5, e as frações monoméricas conjugadas são agrupadas e filtradas em filtro de 0,22μm.
[00630] 11 ml do conjugado huMAb2-4-SPDB-DM4 (c=1.23 mg/ml) foram dessa forma obtidos como uma solução límpida incolor. O con-jugado então é analisado quanto a carga de fármaco e pureza mono- mérica finais: DAR (UV) = 3,8; DAR (SEC) = 3,8; Tr = 17,53 min; pureza monomérica = 99,3%.
[00631] O resultado da análise por HRMS é mostrado na Figura 15. Exemplo 7.2: Citotoxicidade in vitro Material e métodos:
[00632] O efeito dos conjugados maitansinoide anti-CEACAM5 sobre a viabilidade celular tumoral foi avaliado como descrito no exemplo 3.4. Resultados: Tabela 19: Atividades citotóxicas dos ADCs específicos para CEACAM5 humanizados sobre a linhagem celular MKN45 CEACAM5+
Figure img0030
[00633] Estes conjugados chMAb2-SPDB-DM4, huMAb2-1-SPDB- DM4, huMAb2-2-SPDB-DM4, e huMAb2-3-SPDB-DM4 e o conjugado irrelevante DM4 mostraram atividades citotóxicas in vitro sobre células MKN45 em cultura com uma IC50 de 0,24, 0,18, 0,23, 0,16 e 8,52 nM, respectivamente. As atividades citotóxicas dos conjugados anti- CEACAM5 foram 53 a 35 vezes menores do que a atividade medida do conjugado DM4 irrelevante, indicando as atividades citotóxicas mediadas pela CEACAM5 dos conjugados anti-CEACAM5. Exemplo 7.3: Eficácia in vivo contra tumores primários de cólon CR- IGR-034P implantados s.c. em camundongos CD-1 fêmeas sem pelo Material e método
[00634] Duas sequências humanizadas como os conjugados hu- MAb2-3-SPDB-DM4 e huMAb2-4-SPDB-DM4 foram avaliadas em 4 níveis de dose em comparação com o chMAb2-SPDB-DM4, contra os tumores primários de cólon mensuráveis CR-IGR-034P implantados s.c. em camundongos CD-1 fêmeas sem pelo. Os grupos controle fo- ram mantidos não tratados. Os conjugados em doses foram fornecidos em mg/kg. Foram administrados em 10, 5, 2,5 e 1,25 mg/kg por uma injeção intravenosa (IV) em bolus, no dia 19 após a implantação tumoral.
[00635] A avaliação da toxicidade e a avaliação da eficácia foram realizadas como relatado no exemplo 5. Resultados:
[00636] Os resultados são apresentados na Figura 5 e na Tabela 20 (abaixo).
[00637] Usando um esquema de administração única em 1,25, 2,5, 5 e 10 mg/kg, todos os conjugados testados neste estudo não induziram toxicidade.
[00638] huMAb2-4-SPDB-DM4 e chMAb2-SPDB-DM4 foram altamente ativos em 10 mg/kg com ΔT/ΔC de -4% (p < 0,0001 em comparação com o controle) e regressão tumoral de 21 e 19%, respectivamente, ativos em 5 mg/kg com ΔT/ΔC de 12 (p = 0,0105 em comparação com o controle) e 17% (p = 0,0417 em comparação com o controle), respectivamente e ligeiramente ativos em 2,5 mg/kg com ΔT/ΔC de 36 e 37% (ns em comparação com o controle), respectivamente, e inativos em 1,25 mg/kg. huMAb2-3-SPDB-DM4 foi altamente ativo em 10 mg/kg com ΔT/ΔC de -6% (p < 0,0001 em comparação com o controle) e regressão tumoral de 31%, muito ativo em 5 mg/kg com ΔT/ΔC de 4% (p < 0,0001 em comparação com o controle), ativo em 2,5 mg/kg com ΔT/ΔC de 12 (p = 0,0322 em comparação com o controle) e ligeiramente ativo em 1,25 mg/kg ΔT/ΔC de 34% (ns em comparação com o controle).
[00639] A partir destes resultados, ambas as sequências humanizadas huMAb2-3-SPDB-DM4 e huMAb2-4-SPDB-DM4 foram usáveis para desenvolver um ADC terapêutico. huMAb2-3-SPDB-DM4 foi a melhor de ambas as sequências. Tabela 20: Avaliação da atividade antitumoral dos conjugados huMAb2-3-SPDB-DM4 e huMAb2-4-SPDB-DM4 e chMAb2-SPDB-DM4 con-tra adenocarcinoma primário de cólon humano CR-IGR-034P em camundongos CD-1 fêmeas.
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1: formulação do fármaco: HGS (Histidina 10 mM, Glicina 130 mM, Sacarose 5% v/v, Tween 80 0,01%) pH 7,4 2 :p-valor: Teste de Dunett em comparação com o controle após Anova bidirecional com medidas repetidas em modificações com dados transformados por intervalos do volume tumoral de referência; ns: não significativo Petição 870220047417, de 31/05/2022, pág. 142/177 Exemplo 7.4: Eficácia in vivo contra tumores primários de estômago STO-IND-006 implantados s.c. em camundongos SCID fêmeas Material e método
[00640] O conjugado humanizado huMAb2-3-SPDB-DM4 foi avaliado em 3 níveis de dose contra os tumores primários de estômago mensuráveis STO-IND-006 implantados s.c. em camundongos SCID fêmeas. Os grupos controle foram mantidos não tratados. Os conjugados em doses foram fornecidos em mg/kg. Foram administrados em 10, 5 e 2,5 mg/kg por uma injeção intravenosa (IV) em bolus, no dia 27 após a implantação tumoral.
[00641] A avaliação da toxicidade e a avaliação da eficácia foram realizadas como relatado no exemplo 5. Resultados:
[00642] Usando um esquema de administração única em 2,5, 5 e 10 mg/kg, huMAb2-3-SPDB-DM4 não induziu toxicidade.
[00643] Como mostrado na Figura 6 e na Tabela 21, huMAb2-3- SPDB-DM4 foi muito ativo em 10 mg/kg com ΔT/ΔC de 7% (p < 0,0001 em comparação com o controle), ativo em 5 mg/kg com ΔT/ΔC de 36% (p = 0,0281 em comparação com o controle) e inativo em 2,5 mg/kg. Tabela 21: Avaliação da atividade antitumoral do conjugado huMAb2-3-SPDB-DM4 contra o adenocarcinoma de estômago primário humano STO-IND-006 em camundongos fêmeas SCID
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1: formulação do fármaco: HGS (Histidina 10 mM, Glicina 130 mM, Sacarose 5% v/v, Tween 80 0,01%) pH 7,4 2: p-valor: Teste de Dunett em comparação com o controle após Anova bidirecional com medidas repetidas em modificações com dados transformados por intervalos do volume tumoral de referência; ns: não significativo 141/161 Petição 870220047417, de 31/05/2022, pág. 144/177 Exemplo 7.5: Eficácia in vivo contra tumores primários de pulmão LUN-NIC-0014 implantados s.c. em camundongos SCID fêmeas Material e método
[00644] O conjugado humanizado huMAb2-3-SPDB-DM4 foi avaliado em 3 níveis de dose contra os tumores primários de pulmão mensuráveis LUN-NIC-0014 implantados s.c. em camundongos SCID fêmeas. Os grupos controle foram mantidos não tratados. Os conjugados em doses foram fornecidos em mg/kg. Foi administrado em 10, 5 e 2,5 mg/kg por uma injeção intravenosa (IV) em bolus, no dia 29 após a implantação tumoral.
[00645] A avaliação da toxicidade e da eficácia foram realizadas como relatado no exemplo 5. Resultados
[00646] Usando um esquema de administração única em 2,5, 5 e 10 mg/kg, huMAb2-3-SPDB-DM4 não induziu toxicidade.
[00647] Como mostrado na Figura 18 e na Tabela 22, huMAb2-3- SPDB-DM4 foi altamente ativo em 10 e 5 mg/kg com ΔT/ΔC inferior a 0% (p < 0,0001 em comparação com o controle) e regressão tumoral de 67 e 57% respectivamente e ativo em 2,5 mg/kg com ΔT/ΔC de 12% (p = 0,0363 em comparação com o controle) Tabela 22: a Avaliação da atividade antitumoral do conjugado huMAb2-3-SPDB-DM4 contra adenocarcinoma primário de pulmão humano LUN-NIC-0014 em camundongos fêmeas SCID
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1: formulação do fármaco: HGS (Histidina 10 mM, Glicina 130 mM, Sacarose 5% v/v, Tween 80 0,01%) pH 7,4 2: p-valor: Teste de Dunett em comparação com o controle após Anova bidirecional com medidas repetidas em modificações com dados transformados por intervalos do volume tumoral de referência. Exemplo 7.6: Eficácia in vivo contra tumores primários de cólon CR- IGR-034P implantados s.c. em camundongos SCID fêmeas Material e método
[00648] Três conjugados, constituídos pelo huMAb2-3 humanizado conjugado ao DM4 por dois ligantes diferentes (SPDB e sulfo-SPDB), foram avaliados em 2 níveis de dose contra os tumores primários de cólon mensuráveis CR-IGR-034P implantados s.c. em camundongos SCID fêmeas. Os grupos controle foram mantidos não tratados. Os conjugados em doses foram fornecidos em mg/kg. Foram administrados em 5 e 2,5 mg/kg por uma injeção intravenosa (IV) em bolus, no dia 19 após a implantação tumoral.
[00649] A avaliação da toxicidade e a avaliação da eficácia foram realizadas como relatado no exemplo 5. Resultados
[00650] Usando um esquema de administração única em 2,5 e 5 mg/kg, huMAb2-3-SPDB-DM4 e huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 não induziu toxicidade.
[00651] Como mostrado na Figura 19 e na Tabela 23, huMAb2-3- SPDB-DM4 foi ativo em 5 e 2,5 mg/kg com ΔT/ΔC de 12% e 40%, res-pectivamente (p < 0,0001 em comparação com o controle), huMAb2-3- sulfo-SPDB-DM4 foi altamente ativo em 5 mg/kg com ΔT/ΔC inferior a 0% (p < 0,0001 em comparação com o controle) e uma regressão tu-moral de 12% e ativo em 2,5 mg/kg com ΔT/ΔC de 1% (p < 0,0001 contra o controle). Tabela 23: Avaliação da atividade antitumoral dos conjugados huMAb2-3-SPDB-DM4 e huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 contra o adenocarci-noma primário de cólon humano CR-IGR-034P em camundongos fêmeas SCID
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1: formulação do fármaco: HGS (Histidina 10 mM, Glicina 130 mM, Sacarose 5% v/v, Tween 80 0,01%) pH 7,4 2: p-valor: Teste de Dunett em comparação com o controle após Anova bidirecional com medidas repetidas em modificações com dados transformados por intervalos do volume tumoral de referência. Exemplo 8: Desenvolvimento de um protocolo de imunohistoquímica (IHC) dedicado à detecção da proteína CEACAM5 humana e de macaco em tecidos fixados em formalina e emblocado em parafina (FFPE). Materiais e métodos Tecidos
[00652] Microarranjos de tecido FFPE (TMA, Tabela 24) foram usa dos como fonte de tecidos humanos (tumorais e não tumorais) bem como de macaco cinomolgus (normais). Tabela 24: Microarranjos de tecido emblocados em parafina e fixado em formalina usados como fontes de tecido
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Anticorpos
[00653] MAb2 foi usado como anticorpo monoclonal primário anti- CEACAM5 humana de camundongo. Uma IgG1 anticamundongo de cabra conjugada com biotina (Y1 cadeia específica) (referência 107008, lote L4309-X761, Southern Biotech, EUA) foi usada como anticorpo secundário. Imunomarcação
[00654] O procedimento de recuperação de antígeno foi aplicado com o tampão Cell Conditioning 1 (CC1) a 95°C por 8 min e em seguida a 100°C por 28 min. Após a etapa de bloqueio de biotinas endógenas, as lâminas foram incubadas com o antianticorpo primário diluído em salina tamponada com fosfato (PBS) em 5 μg/mL por 2 horas a 24°C. O anticorpo secundário anticamundongo de cabra conjugado com biotina foi incubado a 24°C por 32 minutos em 0,5 μg/mL. A imu- nomarcação foi feita com tetrahidrocloreto de 3,3-diaminobenzidina (DAB) do kit de detecção cromogênica DABMap™ (760-124, Ventana Medical Systems, Inc, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante. Uma etapa de contramarcação foi feita com hematoxilina (760-2037, Ventana Medical Systems, Inc, EUA) e o reagente de azu- lamento foi aplicado (760-2037, Ventana Medical Systems, Inc, EUA). As lâminas marcadas foram desidratadas e recobertas com lâminas com cytoseal XYL (8312-4, Richard-Allan Scientific, EUA). Marcação de IHC
[00655] As lâminas imunomarcadas foram esquadrinhadas usando o sistema ScanScope XT (Aperio Technologies, Vista, CA). As imagens digitalizadas foram capturadas usando o programa ImageScope (versão 10.2.2.2319, Aperio Technologies) em ampliação x20.
[00656] Avaliação de marcação incluiu o sítio histológico de reativi- dade, tipo principal da célula reativa, intensidade de marcação e a frequência de marcação da célula. As amostras negativas foram marcadas como 0+. As amostras positivas foram marcadas com uma escala da intensidade de 1+ a 4+. As faixas de intensidades foram descritas como fracas ]0; 2+[, moderadas [2+; 3+[ e forte [3+; 4+]. A frequência celular foi a porcentagem de células imunomarcadas e foi estimada pela observação do histologista como um número médio por amostra. A frequência celular foi ordenada em 5 categorias do escore de proporção: 1 (0-5%), 2 (6-25%), 3 (26-50%), 4 (51-75%) e 5 (76-100%).
[00657] Para tumores, um escore de expressão global foi adaptado do Escore de Allred (AS) (Mohsin S, Weiss H, Havighurst T, Clark GM, Berardo M, Roanh LD, et al. Progesterone receptor by immunohisto-chemistry e clinical outcome in breast cancer: a validation study. Mod. Pathol.2004; 17:1545-1554). Este AS foi obtido pela adição da intensidade e dos escores de proporção para obter um escore total que variou de 0-9. O AS foi relatado como uma porcentagem do escore global máximo e variou em 5 categorias: muito baixa (0-25%), fraca (2650%), moderada (51-75%), e alta (76-100%). A prevalência foi definida como a porcentagem de casos positivos para a indicação. Análise estatística descritiva
[00658] As estatísticas descritivas foram calculadas com o programa Microsoft Excel 2003. Para cada indicação, número de casos, número de casos positivos, prevalência, número médio do escore de in- tensidade, número médio de frequência, escore de Allred médio, faixa de intensidade, faixa de frequência e faixa de escore de Allred foram descritos. Exemplo 8.1: Uso de um anticorpo monoclonal anti-CEACAM5 para avaliação da proteína CEACAM5 em tumores humanos FFPE por imunohistoquímica (IHC)
[00659] Um grande painel de tumores humanos foi estudado usando lâminas de arranjo de tecido comerciais (formato de FFPE). A expressão da proteína CEACAM5 foi localizada na membrana +/- citoplasma de células tumorais (Figura 1C, D). Alguma marcação de membrana foi polarizada no polo apical de células nos tumores mais diferenciados. Foi encontrado que a proteína CEACAM5 era expressa em:
[00660] 89% dos casos de adenocarcinoma de cólon (194/219, in tensidade 2-2,5+, frequência 53-59%, AS 60-66%)
[00661] 49% dos casos de adenocarcinoma de estômago (95/195, intensidade 2,5+, frequência 53%, AS 62%)
[00662] 41% dos casos de adenocarcinoma de pulmão (24/58, in tensidade 1,8-2+, frequência 50-53%, AS 54-58%)
[00663] 79% dos casos de carcinomas escamosos de cérvix uterina (11/14, intensidade 2+, frequência 22%, AS 46%)
[00664] 53% dos casos de adenocarcinoma de pâncreas (18/34, intensidade 2+, frequência 23%, AS 42%)
[00665] 37% dos casos de carcinoma de células escamosas do esôfago (23/62, intensidade 2+, frequência 16%, AS 38%)
[00666] 4% dos casos de carcinoma de ovário (3/77, intensidade 2+, frequência 43%, AS 54%)
[00667] 11% dos casos de carcinoma de tireoide (2/18, intensidade 1,5+, frequência 63%, AS 56%)
[00668] 25% dos casos de carcinoma de bexiga (5/20, intensidade 1,5+, frequência 61%, AS 56%)
[00669] 7% dos casos de adenocarcinoma de endométrio (1/14, in tensidade 2+, frequência 50%, AS 56%)
[00670] 11% de casos de carcinoma mama ductal (2/18, intensida de 1,5+, frequência 53%, AS 50%)
[00671] 53% dos casos de colangiocarcinoma (2/6, intensidade 1,5+, frequência 75%, AS 50%)
[00672] 53% dos casos de carcinoma de células escamosas de pulmão (31/148, intensidade 1,5+, frequência 22%, AS 39%)
[00673] 8% dos casos de adenocarcinoma de próstata (1/13, inten sidade 2+, frequência 50%, AS 44%)
[00674] 25% dos casos de carcinoma escamoso de pele (2/8, inten sidade 1,5+, frequência 23%, AS 39%) Exemplo 8.2: Reatividade cruzada de tecido de um anticorpo monoclonal anti-CEACAM5 em macaco cinomolgus (Macaca fascicularis) e comparação com padrão de expressão humano
[00675] O domínio proteico extracelular de CEACAM5 de origem humana (h) ou de macaco cinomolgus (c) foi preparado pela expressão transiente em células HEK293 de rim embrionárias humanas com plasmídeo de cDNA de CEACAM5 (exemplo 1, Tabela 1). Os precipitados celulares foram fixados em formalina 10% (Sigma Aldrich, USA) por 16 horas, e introduzidos em parafina como uma parte do tecido de acordo com o procedimento histológico padrão.
[00676] TMA comerciais foram usados como fonte de tecidos normais humanos e de macaco (Tabela 21).
[00677] Reatividade cruzada de Mab2 foi mostrado pela imunomar- cação tanto em células transfectadas com CEACAM5 humana como CEACAM5 de macaco (localização de membrana e citoplasma).
[00678] Nos tecidos normais de cinomolgus, a expressão da proteína CEACAM5 foi encontrada em células epiteliais absorventes coluna- res (2/3 casos positivos, intensidade mediana 1,5+, frequência média 55%).
[00679] Em tecidos tumorais não humanos, a expressão de CEACAM5 também foi observada em células epiteliais absorventes colunares (62/64 casos positivos, intensidade mediana 2 +, frequência média 90%). Em tecidos humanos, a expressão de CEACAM5 foi observada em menor extensão nas células epiteliais do esôfago, células epiteliais de cabeça e pescoço, células epiteliais da fosseta gástrica do estômago e células epiteliais de cérvix uterina. Exemplo 9: Conjugado fármaco-anticorpo (variante) AntiCEACAM5 huMAb2-3-sulfoSPDB-DM4 Dados analíticos: PM (Ab) = 147417 g/mol; PM (DM4) = 780,38 g/mol S280nm (Ab) = 201400; S 252nm (Ab) = 71451 £ 280nm (DM4) = 5180; S 252nm (DM4) = 26159
[00680] Sob agitação, em TA, 7,0 ml de uma solução de antiCEA- CAM5 huMAb2-3 (C = 5,32 mg / ml em tampão PBS pH =7,4) são introduzidos em um reservatório, e depois 1,6 ml de DMA e 168,4 μl da solução do ligante nitro-sulfoSPDB (descrito em WO2009134977) (10 Eq - solução 15 mM em DMA). A solução é lentamente agitada em TA por 3 horas. É adicionado um volume extra de 3,4 μl da solução ligante nitro-sulfoSPDB (2,0 Eq - solução 15 mM em DMA). Após 2 horas em TA sob agitação magnética, 2,90 ml do tampão PBS pH= 7,4, 0,407 ml de DMA e 0,322 ml da solução DM4 (solução 15 mM em DMA) foram sucessivamente adicionados. Após 1 hora em TA e 16 horas a 5°C, a mistura de reação bruta é purificada em coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), pré-condicionada com 1CV de NaOH 1M, 2 CV de água e 2 CV de tampão histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose (5%), pH=5,5. O conjugado é eluido com o tampão histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose (5%), pH=5,5, e as frações monoméricas conjugadas são agrupadas e filtradas em filtro de 0,22μm.
[00681] 19 ml do conjugado antiCEACAM5 huMAb2-3-sulfoSPDB- DM4 (c=1,51 mg/ml) foram dessa forma obtidos como uma solução límpida incolor. O conjugado então é analisado quanto a carga de fár- maco e pureza monomérica finais: DAR (UV) = 3,4; DAR (SEC) = 3,3; pureza monomérica = 99,8%; dados de HRMS: ver a Figura 20. AntiCEACAM5 huMAb2-3-SMCC-DM1 Dados analíticos: PM (Ab) = 147417 g/mol; PM (DM1) = 738 g/mol S280nm (Ab) = 201400; S252nm (Ab) = 71451 S280nm (DM1) = 5180; S252nm (DM1) = 26159
[00682] Sob agitação, em TA, 11,3 ml de uma solução de antiCEA- CAM5 huMAb2-3 (C = 3,47 mg / ml em tampão A pH = 6,5) são introduzidos em um reservatório, e depois 0,387 ml de DMA e 178 μl da solução ligante SMCC (10 Eq - solução 15 mM em DMA). A solução é lentamente agitada em TA por 2 horas. A mistura de reação bruta é trocada em tampão em coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), pré-condicionada com 2CV de NaOH 0,2M, 5 CV de água e 5 CV de tampão citrato (pH 5,5). O conjugado é eluido com o tampão citrato (pH 5,5) e as frações monoméricas conjugadas são agrupadas e filtradas em filtro de 0,22μm. A esta solução, são sucessivamente adicionados, sob agitação, em TA, 0,476 ml de DMA e 0,124 ml da solução DM1 (solução 15 mM em DMA). Após 2 horas em TA, a mistura de reação bruta é purificada duas vezes em coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), pré-condicionada com 2CV de NaOH 0,2M, 5 CV de água e 5 CV do tampão histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose (5%), pH=5,5. O conjugado é eluido com o tampão histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarose (5%), pH=5,5, e as frações monoméricas conju- gadas são agrupadas, filtradas em filtro de 0,22μm.
[00683] 9,5 ml de antiCEACAM5 huMAb2-3-SMCC-DM1 (c=1,73 mg/ml) foram então obtidos como uma solução incolor límpida. O con-jugado então é analisado quanto a carga de fármaco e pureza mono- mérica finais: DAR (UV) = 2,7; DAR (SEC) = 2,9; pureza monomérica = 99,6%; dados de HRMS: ver a Figura 21. Exemplo 10: Caracterização do epítopo e do parátopo de CEACAM5- A3B3 no complexo com MAb2 VH1aVL1c Fab utilização de troca hi- drogênio-deutério associda com espectrometria de massa (HDX MS) Exemplo 10.1: Princípio de MS HDX
[00684] A troca de hidrogênio-deutério amida (HDX) associada com a espectrometria de massa (MS) permite a identificação de regiões de proteínas contidas em modificações ou interações conformacionais. Esta técnica permite mais especificamente identificar as regiões de um antígeno mostrando, após incubação em um tampão deuteratado e proteólise, uma redução da incorporação de deutério na sua forma ligada a um anticorpo em comparação com sua forma livre.
[00685] O epítopo pertence a estas regiões, a troca das quais é di-minuída pela ligação ao anticorpo. Um artigo recente descreve deta-lhadamente as diferentes etapas para caracterizar epítopos usando esta abordagem (Zhang, Q., Willison, L. N., Tripathi, P., Sathe, S. K., Espessante para molhos, K. H., Emmett, M. R., Blakney, G. T., Zhang, H. M. & Marshall, A. G. (2011). Analytical Chemistry 83, 7129-7136). Exemplo 10.2: Materiais
[00686] As sequências de codificação dos domínios variáveis de MAb2_VH1aVL1c (SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:29) foram clonadas em um vetor de expressão mamífero em fusão com as sequências de co-dificação do domínio CH1 humano (como encontrado na IgG1 clivada por papaína derivada de Fabs), e depois um marcador de hexa- histidina ou com o domínio constante Ccapa humano, respectivamen- te. Um lote de MAb2_VH1aVL1c Fab foi produzido em células HEK293-FS™ cultivadas em suspensão pela transfecção transiente de dois plasmídeos de expressão, codificando as duas cadeias, comple- xadas com 293fectin™ (Invitrogen). O sobrenadante da cultura contendo a proteína secretada foi coletado sete dias pós-transfecção, centrifugado e filtrado em membrana de 0,22 μm. O Fab foi purificado por cromatografia de afinidade em IMAC (HisTrap, GE Healthcare) usando o gradiente de imidazol em PBS. Então, o agrupamento das frações que contendo Fab foi purificado por cromatografia por exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) equilibrada com PBS.
[00687] O domínio hCEACAM5-A3B3 marcado com His (SEQ ID NO:67) foi produzido com células HEK293-FS™ cultivadas em frasco pela transfecção transiente do plasmídeo de expressão. Kifunensine (inibidor do processo de exclusão da glicosilação) foi adicionado a cada dia. O sobrenadante de cultura contendo a proteína secretada foi coletado sete dias pós-transfecção, centrifugado e filtrado em membrana de 0,22 μm. EndoH foi adicionada no sobrenadante até 625 u/ml então incubado 3 h a 37°C. hCEACAM5-A3B3 desglicosilado foi purificado por cromatografia de afinidade em IMAC (HisTrap, GE Healthcare) usando gradiente de imidazol em PBS. Então, o agrupamento de frações contendo hCEACAM5-A3B3 desglicosilado foi purificado por cromatografia por exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) equilibrado com PBS. A análise por espectrometria de massa do hCEACAM5-A3B3 desglicosilado mostrou duas espécies (22.485 e 22.278 Da), indicando que a proteína carrega 7 ou 8 resíduos N- acetilglicosamina (GlcNAc).
[00688] Para construir um complexo, ambas as proteínas, foram agrupadas com um excesso de 1,5 mols de hCEACAM5-A3B3 desgli- cosilado para um mol de Fab. Este excesso foi removido por cromato- grafia por exclusão de tamanho em superdex 200 equilibrada com a salina tamponada por fosfato. As frações que correspondem ao Fab complexo com o antígeno foram usadas para o estudo de troca de deutério. Exemplo 10.3: Métodos
[00689] Os experimentos de troca de hidrogênio/deutério (HDX) foram totalmente automatizados usando um autoamostrador PAL (CTC Analytics). O início da troca foi permitido e suprimido, o controle da temperatura de proteólise (4°C), a injeção dos peptídeos deuteratados, a adminstração das válvulas de injeção e lavagem e o desencadeamento da aquisição do espectrômetro de massa e bombas de HPLC. A caixa Peltier resfriada (4°C) continha válvulas automatizadas de dois Rheodyne (de 6 portas para a injeção e de 10 portas para lavagem), um cartucho destilador (peptide Micro Trap from Bruker-Michrom) e uma coluna HPLC (Poroshell 120 EC-C18, 1x 50 mm, 2,7 μM da Agilent Technologies). A deuteração foi iniciada por uma diluição de 5 vezes de CEACAM5, mAb ou do complexo com PBS em D2O. 2M GndHCl, TCEP 0,8 M, glicina 1M foram usados para suprimir a retro- troca e reduzir as pontes de dissulfeto por 2 min a 4°C.
[00690] As proteínas foram digeridas com as proteases pepsina e nepentesina e os peptídeos foram dessalinizados usando uma bomba Agilent Technologies HPLC com TFA 0,03% em água em 100 μL/min. Os peptídeos então foram separados usando outra bomba Agilent Technologies HPLC com 15 a 100% de gradiente de B em 20 min (A: TFA 0,03% em água; B: acetonitrila 90%, TFA 0,03% em água). As massas dos peptídeos foram medidas usando um espectrômetro de massa por eletropulverização-TOF (Agilent 6210).
[00691] Os peptídeos foram identificados pelo MS tandem (MSMS), usando um APEX-Q Bruker FTMS (9.4 T) e Bruker 12 T SolariX.
[00692] Os programas Data Analysis (Bruker) e Mass Hunter (Agilent Technologies) foram usados para as aquisições de dados. Data Analysis e Mascot (Matrix Science) foram usados para processar os dados de MSMS. Os programas Mass Hunter and HD Examiner (Sierra Analytics) foram usados para o processamento dos dados de HDX.
[00693] Os experimentos de HDX foram repetidos pelo menos três vezes.
Exemplo 10.4: Resultados Identificação e seleção dos peptídeos
[00694] As pontes de dissulfeto permaneceram intactas durante a deuteração para manter a informação estrutural relacionada a elas. Para favorecer a proteólise e a identificação de peptídeos, as pontes foram reduzidas com TCEP após etapa de supressão em pH baixo e temperatura baixa. Ao usar MSMS após digestão do complexo CEACAM5-Fab foi possível identificar um grande número de peptídeos resultantes de três cadeias proteicas. Após os experimentos de HDX somente aqueles fornecendo bons sinais de qualidade foram selecio-nados: 25, 30 e 20 peptídeos do antígeno CEACAM5-A3-B3, cadeia pesada de MAb2_VH1aVL1c Fab e cadeia leve de MAb2_VH1aVL1c, respectivamente. Estes peptídeos cobrem 89%, 77% e 68% das se-quências do antígeno CEACAM5-A3-B3, cadeia pesada de MAb2_VH1aVL1c Fab e cadeia leve MAb2_VH1aVL1c, respectivamente (Tabela 25). As regiões descobertas das cadeias de Fab estão principalmente nas suas partes de C-terminal. Tabela 25: cobertura de sequência com peptídeos deuterados
Figure img0039
Figure img0040
[00695] Todos os 8 resíduos asparagina que são potenciais sítios de glicosilações foram identificados dentro de vários peptídeos com um remanescente de GlcNAc da desglicosilação por endo H. Em particular, N114 foi encontrado no peptídeo 108 a 115. Nos primeiros experimentos (não usados para HDX), N166 foi encontrado em ambas as formas (com e sem GlcNAc). Isso poderia explicar a heterogeneidade observada no espectro de massa de CEACAM5-A3B3 após desglicosi- lação, correspondendo a 7 e 8 GlcNAc.
Epítopo e identificação de parátopo
[00696] O antígeno livre, o Fab livre e seu complexo foram deutera- tados por 2 min ou 20 min a 4°C ou 20 min à temperatura ambiente (26°C). Considerando a cinética de ctrocaâmbio de amida hidrogênio com a temperatura (aumento de troca de cerca de 3 vezes 10°C) a última condição é equivalente a 200 min de deuteração a 4°C.
Epítopo
[00697] A cinética de incorporação do deutério para os 25 peptí- deos selecionados a partir de CEACAM5-A3B3 foi comparada quando o antígeno foi deuteratado na forma livre e quando estava em complexo com Fab. Vários peptídeos não mostraram diferença significativa de HDX (ΔHDX) entre ambos os estados. Por outro lado, alguns deles (108-115 e 128-143), mostraram ΔHDX significativa. A segunda região foi coberta por 5 peptídeos diferentes: 128-142, 128-143, 130-142, 130-143 e 140-143 mostrando ΔHDX 13 a 15 ± 2% (até 1,6 ± 0,2 D) após 2 min de deuteração.
[00698] Comparando 128-142 com 130-142 e 128-143 com 130143, não medimos nenhuma modificação de ΔHDX significativa em cada caso (1,3-1,4 D para os dois primeiros peptídeos e 1,6 para os dois últimos, após deuteração de 2 min), significando que as amidas W129 e R130 provavelmente não estão envolvidas no epítopo. Por outro lado, comparando 128-142 com 128-143 e 130-142 com 130143, medimos pequena modificação de ΔHDX (aproximadamente 0,2 D), significando que a amida F143 está envolvida. A ΔHDX no peptí- deo 140-143 (aproximadamente 0,3 D) indica que as amidas V141 ou L142 também poderiam estar envolvidas. Dentro das 9 amidas de I131 a Q140, várias delas estão envolvidas no epítopo (aproximadamente 1 ΔHDX compartilhada em média).
[00699] Estas diferenças na incorporação de deutério indicam que o epítopo pertence em particular às regiões (amidas), isto é, peptídeos de sequências SGANLNL (SEQ ID NO: 76) e INGIPQQHTQVLF (SEQ ID NO: 77).
Parátopo
[00700] A cinética de incorporação de deutério dos 30 peptídeos selecionados a partir de cadeia pesada de Fab foi comparada quando Fab foi deuteratado na forma livre e quando estava em complexo com o antígeno. Quase todos os peptídeos não mostraram ΔHDX significativa entre ambos os estados. Somente um peptídeo (100-109) apresentou uma ΔHDX após 200 min de deuteração: 11 ± 2% (0,7 ± 0,2 D). A região (amidas) 101-109 da cadeia pesada de MAb2_VH1aVL1c Fab está contida no parátopo.
[00701] A cinética de incorporação do deutério dos 20 peptídeos selecionados a partir da cadeia leve de Fab foi comparada quando Fab foi deuteratado na forma livre e quando estava em complexo com o antígeno. Quase todos os peptídeos não mostraram ΔHDX significativa entre ambos os estados. Somente dois peptídeos (47-54 e 87-104) apresentaram uma diferença. Após 20 min de deuteração, foi 10 ± 2% (0,6 ± 0,2 D) para o primeiro e 5 ± 2% (0,9 ± 0,2 D) para o segundo, respectivamente. As regiões 48-54 e 88-104 da cadeia leve de MAb2_VH1aVL1c estão envolvidas no parátopo.

Claims (31)

1. Anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de que se liga ao domínio A3-B3 das proteínas CEACAM5 humana e de Macaca fas- cicularis e compreende as cadeias variáveis leve e pesada de um anti-corpo selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um anticorpo que compreende um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:31 e um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:32; (b) um anticorpo que compreende um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:33 e um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:34; (c) um anticorpo que compreende um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:33 e um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:34 em que K na posição 52 foi substituído por R; (d) um anticorpo que compreende um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:35 e um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:36; (e) um anticorpo que compreende um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:37 e um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:38; e (f) um anticorpo que compreende um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:39 e um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:40.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se liga ao domínio A3-B3 de CEACAM5 humana e de Macaca fascicularis: (a) com uma razão de afinidade para CEACAM5 humana sobre a afinidade para CEACAM5 de Macaca fascicularis que é <12; ou (b) com uma afinidade para CEACAM5 humana e/ou CEACAM5 de Macaca fascicularis que é <10nM, ou (c) tanto a como b.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte-rizado pelo fato de que o dito anticorpo se liga a duas regiões do domínio A3-B3 da proteína CEACAM5 humana que compreende as sequências SEQ ID NO:76 e SEQ ID NO:77, respectivamente.
4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma CDR1-H da sequência SEQ ID NO:1; uma CDR2-H da sequência SEQ ID NO:2; uma CDR3-H da sequência SEQ ID NO:3; uma CDR1-L da sequência SEQ ID NO:4; uma CDR2-L de sequência SAS, e uma CDR3-L da sequência SEQ ID NO:6; ou (b) uma CDR1-H da sequência SEQ ID NO:7; uma CDR2-H da sequência SEQ ID NO:8; uma CDR3-H da sequência SEQ ID NO:9; uma CDR1-L da sequência SEQ ID NO:10; uma CDR2-L de sequência NTK, e uma CDR3-L da sequência SEQ ID NO:12; ou (c) uma CDR1-H da sequência SEQ ID NO:13; uma CDR2- H da sequência SEQ ID NO:14; uma CDR3-H da sequência SEQ ID NO:15; uma CDR1-L da sequência SEQ ID NO:16; uma CDR2-L de sequência SAS, e uma CDR3-L da sequência SEQ ID NO:18; ou (d) uma CDR1-H da sequência SEQ ID NO:19; uma CDR2- H da sequência SEQ ID NO:20; uma CDR3-H da sequência SEQ ID NO:21; uma CDR1-L da sequência SEQ ID NO:22; uma CDR2-L de sequência NAK, e uma CDR3-L da sequência SEQ ID NO:24; ou (e) uma CDR1-H da sequência SEQ ID NO:25; uma CDR2- H da sequência SEQ ID NO:26; uma CDR3-H da sequência SEQ ID NO:27; uma CDR1-L da sequência SEQ ID NO:28; uma CDR2-L de sequência NAK, e uma CDR3-L da sequência SEQ ID NO:30.
5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:31 e/ou um domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:32; ou (b) um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:33 e/ou domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:34; ou (c) um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:35 e/ou domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:36; ou (d) um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:37 e/ou domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:38; ou (e) um domínio variável da cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:39 e/ou domínio variável da cadeia leve da sequência SEQ ID NO:40.
6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo quimérico ou humanizado.
7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo que compreende: (a) uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:41 e/ou uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:42; ou (b) uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:43 e/ou uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:44; ou (c) uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:45 e/ou uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:46; ou (d) uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:47 e/ou uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:48; ou (e) uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:49 e/ou uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:50.
8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um domínio variável de uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO: 74; e/ou (b) um domínio variável de uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:55 ou SEQ ID NO: 75.
9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um domínio variável de uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:51 e um domínio variável de uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:17, ou (b) um domínio variável de uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:5 e um domínio variável de uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:23, ou (c) um domínio variável de uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:5 e um domínio variável de uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:29, ou (d) um domínio variável de uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:51 e um domínio variável de uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:55, ou (e) um domínio variável de uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:74 e um domínio variável de uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:75.
10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 6, 8 e 9, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma cadeia pesada que consiste na sequência SEQ ID NO:87; e/ou (b) uma cadeia leve que consiste na sequência SEQ ID NO:88.
11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é um fragmento de anticorpo.
12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é uma cadeia pesada variável de um anticorpo de domínio único (VHH).
13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo biespecífi- co ou multiespecífico.
14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é um fragmento selecionado a partir do grupo que consiste em Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, e diacorpos.
15. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é transformada por um ácido nucleico como definido na reivindicação 20, em que a referida célula hospedeira é um microrganismo transgênico.
16. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que com-preende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, conjugado ou ligado a pelo menos um agente inibidor de crescimento.
17. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 16, ca-racterizado pelo fato de que o dito agente inibidor de crescimento é um agente citotóxico ou um isótopo radioativo.
18. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o dito agente inibidor de crescimento é selecionado a partir do grupo que consiste em agentes quimiote- rápicos, enzimas, antibióticos e toxinas tal como as toxinas de pequenas moléculas ou toxinas enzimaticamente ativas, taxoides, vincas, taxanos, maitansinoide ou análogos de maitansinoide, derivados de tomaimicina ou pirrolobenzodiazepina, derivados de criptoficina, deri-vados de leptomicina, análogos de auristatina ou dolastatina, profár- macos, inibidores de topoisomerase II, Agentes alquilantes de DNA, Agentes antitubulina, e análogos de CC-1065 ou CC-1065.
19. Imunoconjugado de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que o dito agente inibidor de crescimento é (N2'-deacetil-N2'-(3-mercapto-1-oxopropil)- maitansina) DM1 ou N2'-deacetil-N-2' (4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)- maitansina (DM4).
20. Imunoconjugado de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é ligado covalentemente através de um ligante clivável ou não clivável a pelo menos um agente inibidor de crescimento.
21. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 20, ca-racterizado pelo fato de que o dito ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em N-succinimidil piridilditiobutirato (SPDB), ácido 4-(Piridin-2-ildisulfanil)-2-sulfo-butírico (sulfo-SPDB) e succinimidil (N- maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC).
22. Imunoconjugado de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 16 a 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo com-preende um domínio variável de uma cadeia pesada da sequência SEQ ID NO:5 e um domínio variável de uma cadeia leve da sequência SEQ ID NO:29.
23. Imunoconjugado de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 16 a 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo com-preende uma cadeia pesada que consiste na sequência SEQ ID NO: 87 e uma cadeia leve que consiste na sequência SEQ ID NO: 88.
24. Imunoconjugado de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 16 a 23, caracterizado pelo fato de que o imunoconjugado é definido por uma razão fármaco para anticorpo (DAR) variando de 1 a 10.
25. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou imunoconjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 24, e um veículo farmaceuticamente acei-tável.
26. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 14, ou imunoconjugado de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 16 a 24, ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de câncer.
27. Anticorpo, imunoconjugado ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, caracterizados pelo fato de que o câncer é o câncer que expressa CEACAM5.
28. Anticorpo, imunoconjugado ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizados pelo fato de que o câncer é câncer colorretal, de estômago, de pulmão, de cér- vix uterina, de pâncreas, de esôfago, de ovário, de tireoide, de bexiga, de endométrio, de mama, de fígado, de próstata ou de pele.
29. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de ser para uso na detecção ex vivo da expressão de CEACAM5 em amostra biológica de um indivíduo.
30. Anticorpo de acordo com a reivindicação 29, caracteri-zado pelo fato de que o dito anticorpo é marcado com uma molécula ou substância detectável.
31. Anticorpo de acordo com a reivindicação 29 ou 30, ca-racterizado pelo fato de ser para diagnosticar a presença de um câncer em um indivíduo, determinando a suscetibilidade de um paciente que tem câncer a um agente terapêutico que visa a CEACAM5, ou monitorando a eficácia da terapia anti-CEACAM5 para câncer ou de-tecção da recidiva de câncer após terapia anti-CEACAM5 para câncer.
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