ES2778823T3 - Anticuerpos anti-CEACAM5 y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos anti-CEACAM5 y usos de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2778823T3
ES2778823T3 ES17157890T ES17157890T ES2778823T3 ES 2778823 T3 ES2778823 T3 ES 2778823T3 ES 17157890 T ES17157890 T ES 17157890T ES 17157890 T ES17157890 T ES 17157890T ES 2778823 T3 ES2778823 T3 ES 2778823T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
sequence
seq
ceacam5
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17157890T
Other languages
English (en)
Inventor
Pierre-François Berne
Francis Blanche
Hervé Bouchard
Béatrice Cameron
Tarik Dabdoubi
Stéphanie Decary
Paul Ferrari
Alexey Rak
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi SA
Original Assignee
Sanofi SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi SA filed Critical Sanofi SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2778823T3 publication Critical patent/ES2778823T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/537—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57473—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen, i.e. CEA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Un anticuerpo que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia SEQ ID NO: 5, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO:7, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO:8, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO:9, y el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia SEQ ID NO: 29, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO:10, una CDR2-L de secuencia NTR, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO:12.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-CEACAM5 y usos de los mismos
La presente invención describe anticuerpos que se unen específicamente a proteínas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis, así como ácidos nucleicos aislados, vectores y células hospedantes que comprenden una secuencia que codifica dichos anticuerpos. La invención también describe inmunoconjugados que comprenden dichos anticuerpos conjugados o unidos a un agente inhibidor del crecimiento, y a composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos o inmunoconjugados de la invención. La invención describe el uso de los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención para el tratamiento de cáncer o para fines de diagnóstico.
El antígeno carcinoembrionario (CEA) es una glicoproteína implicada en la adhesión celular. El CEA fue por primera vez identificado en 1965 (Gold y Freedman, J Exp Med, 121, 439, 1965) como una proteína que se expresa normalmente en el intestino fetal durante los primeros seis meses de gestación, y se encuentra en cánceres del páncreas, hígado y colon. La familia del CEA pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. La familia del CEA, que consiste en 18 genes, se subdivide en dos subgrupos de proteínas: el subgrupo de la molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM) y el subgrupo de glicoproteínas específicas del embarazo (Kammerer y Zimmermann, BMC Biology 2010, 8:12).
En los seres humanos, el subgrupo CEACAM consiste en 7 miembros: CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8. Numerosos estudios han mostrado que CEACAM5, el cual es idéntico al CEA identificado originalmente, se expresa altamente en la superficie de las células de tumor colorrectal, gástrico, de pulmón, de mama, de próstata, de ovario, de cuello uterino así como de vejiga, y se expresa débilmente en muy pocos tejidos epiteliales normales tales como células epiteliales columnares y células caliciformes en el colon, células mucosas del cuello en el estómago y células epiteliales escamosas en el esófago y cuello uterino (Hammarstrom et al, 2002, en “Tumor markers, Physiology, Pathobiology, Technology and Clinical Applications” Eds. Diamandis E. P. et al., AACC Press, Washington p. 375). De este modo, el CEACAM5 puede constituir una diana terapéutica adecuada para las estrategias dirigidas específicamente de tumor, tales como inmunoconjugados. La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales dirigidos contra CEACAM5, y muestra que éstos pueden conjugarse con un agente citotóxico para inducir una actividad citotóxica capaz de matar células tumorales in vitro y para inducir regresión tumoral in vivo.
Los dominios extracelulares de los miembros de la familia de la CEACAM están compuestos por dominios repetidos similares a inmunoglobulina (similares a Ig) que se han clasificado en 3 tipos, A, B y N, de acuerdo con homologías de secuencia. El CEACAM5 contiene siete de dichos dominios, concretamente N, A1, B1, A2, B2, A3 y B3.
Los dominios A1, A2 y A3 de CEACAM5, por una parte, y los dominios B1, B2 y B3, por otra parte, muestran altas homologías de secuencia, presentando los dominios A de CEACAM5 humana de 84 a 87% de similitud de secuencia por parejas, y los dominios B de 69 a 80%. Además, otros miembros de la CEACAM humana que presentan dominios A y/o B en su estructura, concretamente CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 y CEACAM8, muestran homología con CEACAM5 humana. En particular, los dominios A y B de la proteína humana CEACAM6 presentan homologías de secuencia con los dominios A1 y A3, y cualquiera de los dominios B1 a B3 de CEACAM5 humana, respectivamente, que son incluso mayores que las observadas entre los dominios A y los dominios B de CEACAM5 humana.
Se generaron numerosos anticuerpos anti-CEA con fines de diagnóstico o terapéuticos dirigidos a CEA. La especificidad frente a antígenos relacionados siempre se ha mencionado como una preocupación en este campo, como un ejemplo lo ha hecho Sharkey et al (1990, Cancer Research 50, 2823). Debido a las homologías mencionadas anteriormente, algunos de los anticuerpos previamente descritos pueden demostrar unión a epítopos repetitivos de CEACAM5 presentes en los diferentes dominios de inmunoglobulina y mostrar reactividad cruzada frente a otros miembros de CEACAM tales como CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7, o CEACAM8, careciendo de especificidad frente a CEACAM5. La especificidad del anticuerpo anti-CEACAM5 es deseada a la vista de terapias dirigidas a CEA de manera que se una a células tumorales que expresan CEACAM5 humana, pero que no se una a algunos tejidos normales que expresan los demás miembros de CEACAM. Es importante destacar que se ha descrito que CEACAM1, CEACAM6 y CEACAM8 son expresadas por neutrófilos de primates humanos y no humanos (Ebrahimmnejad et al, 2000, Exp Cell Res, 260, 365; Zhao et al, 2004, J Immunol Methods 293, 207; Strickland et al, 2009 J Pathol, 218, 380), en los que han mostrado que regulan la granulopoyesis y que juegan un papel en la respuesta inmune.
Se ha descrito un conjugado de fármaco de anticuerpo anti-CEACAM6, tal como el anticuerpo anti-CEACAM6 con maitansinoide desarrollado por Genentech ((Strickland et al, 2009 J Pathol, 218, 380), que se ha mostrado que induce toxicidad hematopoyética dependiente de CEACAM6 en primates no humanos. Esta toxicidad, atribuida a la acumulación del conjugado de fármaco y anticuerpo en la médula ósea y a la depleción de granulocitos y sus precursores celulares, se consideró por los autores como un problema de seguridad importante. Así, más precisamente, para fines terapéuticos, la reactividad cruzada de un anticuerpo anti-CEACAM5 con CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7, o CEACAM8 puede disminuir el índice terapéutico del compuesto por toxicidad incrementada en los tejidos normales. Así, existe una fuerte ventaja en obtener anticuerpos dirigidos específicamente a CEACAM5 que no reaccionarían de manera cruzada con otras moléculas de la familia de la CEACAM, especialmente para uso como un conjugado de anticuerpo fármaco (ADC) o con cualquier otro modo de acción que da como resultado la muerte de la célula diana.
Además, como se describe que CEACAM5 se expresa, aunque a un nivel bajo, en algunos tejidos celulares normales, es crítico desarrollar anticuerpos anti-CEACAM5 capaces de unirse a CEACAM5 humana así como a CEACAM5 de mono macaco (Macaca fascicularis), ya que dichos anticuerpos pueden ensayarse fácilmente en estudios toxicológicos preclínicos en monos macacos para evaluar su perfil de seguridad. Como se ha mostrado que la eficacia de los anticuerpos terapéuticos puede depender de la localización del epítopo en la diana, tanto en el caso de los anticuerpos funcionales (Doern et al. 2009, J. Biol. Chem 284 10254) como en el caso en el que están implicadas funciones efectoras (Beers et al. Semin Hematol 47:107-114), tiene que mostrarse que un anticuerpo con reactividad cruzada humano/mono se une a epítopos en el mismo dominio homólogo repetido semejante a Ig de proteínas humanas y de mono macaco.
Combinando la necesidad de la reactividad cruzada en especies de dichos anticuerpos con la especificidad para CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis, es decir, sin reactividad cruzada con otros miembros de CEACAM de Macaca fascicularis y humanos, se añade un grado adicional de complejidad, dadas las homologías de secuencia globales entre las proteínas de CEACAM humanas y de Macaca fascicularis.
De hecho, el alineamiento global por parejas de la secuencia de CEACAM5 de Macaca fascicularis con la secuencia de CEACAM5 humana (AAA51967,1/GI:180223, 702 aminoácidos) indicó solo un 78,5% de identidad. Los genes de CEACAM1, CEACAM5, y CEACAM6 de Macaca fascicularis se clonaron, y se realizó un alineamiento global de los dominios A, B y N humanos y de Macaca fascicularis. Este alineamiento predijo que hay muy pocas regiones, si hay alguna, para localizar un epítopo ideal que sería común a CEACAM5 humana y de macaco y no compartida por ningún otro miembro de la familia. Por estas razones, se esperaba que el desarrollo de anticuerpos con reactividad cruzada entre CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis sin reactividad cruzada con otros miembros de CEACAM humanos y de Macaca fascicularis tuviera una baja probabilidad de éxito. De forma importante, los anticuerpos anti-CEACAM5 descritos previamente casi nunca se documentaron para reactividad cruzada con Macaca fascicularis, con muy pocas excepciones (MT111, véase más adelante).
Los anticuerpos anti-CEACAM5 humana ya se han usado en ensayos clínicos, tales como Immunomedics labetuzumab (también conocido como hMN14, Sharkey et al, 1995, Cancer Research 55, 5935). Se ha mostrado que este anticuerpo no se une a antígenos relacionados, pero no reacciona de manera cruzada con CEACAM5 de Macaca fascicularis. De forma importante, el anticuerpo MT111 de Micromet (también conocido como anticuerpo MEDI-565 de MedImmune) es un anticuerpo biespecífico que se une a CEACAM5 humana y CD3 humana (Peng et al., PLoS ONE 7(5): e3641; documento WO 2007/071426). Se afirma que MT111 se ha creado por la fusión de un fragmento variable de cadena única (scFv) a partir de un anticuerpo que reconoce CEACAM5 humana y de macaco con scFv de un anticuerpo que reconoce CD3 humana (póster de Oberst et al., AACR Annual Meeting April 2009 Denver, CO). También se ha dado a conocer que MT111 no se une a otros miembros de la familia de la CEACAM (Peng et al., PLoS ONE 7(5): e3641). MT111 se une a un epítopo conformacional en el dominio A2 de CEACAM5 humana. Este epítopo conformacional no está presente en una variante de corte y empalme de CEACAM5 humana, que se expresa concomitantemente con CEACAM5 de longitud completa en tumores (Peng et al., PLoS ONE 7(5): e3641). Además, no hay evidencia de que MT111 se una al mismo epítopo en CEACAM5 de Macaca fascicularis.
En un intento de producir nuevos anticuerpos frente a la proteína de superficie CEACAM5 con características óptimas para fines terapéuticos, los inventores han inmunizado ratones con proteínas recombinantes y con células tumorales. Han cribado cientos de hibridomas usando ELISA en varias proteínas recombinantes de la familia de la CEACAM, y citometría de flujo con líneas celulares relevantes, con el fin de seleccionar solo inmunoglobulinas (IgG) con el perfil ventajoso. Inesperadamente, fueron capaces de seleccionar clones de hibridoma y producir IgG maduras correspondientes que comprenden todas las características deseadas. Se unen específicamente al dominio A3-B3 de CEACAM5 humana con una alta afinidad, y no reconocen las proteínas humanas CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 y CEACAM8. En un contexto celular, estos anticuerpos presentan una alta afinidad por células tumorales (en el intervalo nanomolar). Además, estos anticuerpos también se unen a la proteína CEACAM5 de Macaca fascicularis con una relación de afinidad mono/humana menor o igual a 10. Los anticuerpos de la invención se unen específicamente al dominio A3-B3 de CEACAM5 de Macaca fascicularis, y no reconocen otros miembros de la familia de la CEACAM de Macaca fascicularis.
Seleccionando como diana el dominio A3-B3 de CEACAM5, estos anticuerpos tienen un potencial incrementado dirigido a tumores, ya que tienen la capacidad de unirse tanto a CEACAM5 humana de longitud completa como a su variante de corte y empalme identificada por Peng et al. (PLoS ONE 7(5): e3641).
Finalmente, se describe en la bibliografía que CEACAM5 es una proteína de superficie con poca internalización (revisado en Schmidt et al, 2008, Cancer Immunol. Immunother. 57, 1879), y por lo tanto puede no ser una diana favorable para los conjugados de anticuerpo fármaco. A pesar de lo que se ha dado a conocer en la técnica anterior, los inventores han mostrado que los anticuerpos que han producido son capaces de internalizar el complejo CEACAM5-anticuerpo después de la unión, e inducir actividad citotóxica en células tumorales in vitro cuando se combinan con un agente citotóxico. Los mismos anticuerpos combinados con un agente citotóxico también son capaces de inhibir de forma importante el crecimiento tumoral en ratones que presentan tumores humanos de colon y estómago primarios.
Definiciones
Tal y como se usa en el presente documento, “CEACAM5” designa la “molécula de adhesión celular 5 relacionada con antíqeno carcinoembrionario”, también conocida como “CD66e” (Grupo de Diferenciación 66e) o CEA. CEACAM5 es una glicoproteína implicada en la adhesión celular. CEACAM5 se expresa altamente en particular en la superficie de las células de tumor colorrectal, gástrico, de pulmón y uterino.
Una secuencia de referencia de CEACAM5 humana de longitud completa, incluyendo el péptido señal (posiciones 1­ 34) y propéptido (posiciones 686-702), está disponible en la base de datos GenBank con el número de registro AAA51967,1 (SEQ ID NO:52). Se han identificado cinco SNP no sinónimos con una frecuencia mayor del 2% en la población caucásica, estando cuatro de ellos localizados en el dominio N (en las posiciones 80, 83, 112, 113), el último en el dominio A2 (en la posición 398) de CECAM5 humana (SEQ ID NO:58). GenBank Aa A51967,1 contiene el haplotipo principal (I80, V83, I112, I113 y E398).
Una secuencia del dominio extracelular de CEACAM5 de Macaca fascicularis, clonada por los inventores, se describe en SEQ ID NO:53.
Un “dominio” puede ser cualquier región de una proteína, definida generalmente sobre la base de homologías de secuencia y relacionada frecuentemente con una entidad estructural o funcional específica. Se sabe que los miembros de la familia de la CEACAM están compuestos por dominios similares a Ig. El término dominio se usa en este documento para designar ya sea dominios similares a Ig individuales, tal como “dominio N” o para grupos de dominios consecutivos, tal como “dominio A3-B3”.
La organización de los dominios de CEACAM5 humana es como sigue (basado en la secuencia GenBank AAA51967.1; SEQ ID NO:52):
Figure imgf000004_0002
De acuerdo con esto, el dominio A3-B3 de CEACAM5 humana consiste en los aminoácidos en las posiciones 499­ 685 de SEQ ID NO:52.
La organización de los dominios de CEACAM5 de Macaca fascicularis es como sigue (basado en la secuencia clonada del dominio extracelular; SEQ ID NO:53):
Figure imgf000004_0001
De acuerdo con esto, el dominio A3-B3 de CEACAM5 de Macaca fascicularis consiste en los aminoácidos en las posiciones 465-654 de SEQ ID NO:53.
Una “secuencia codificante” o una secuencia “que codifica” un producto de expresión, tal como un ARN, polipéptido, proteína o enzima, es una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa, da como resultado la producción de ese ARN, polipéptido, proteína o enzima, es decir, la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos para ese polipéptido, proteína o enzima. Una secuencia codificante para una proteína puede incluir un codón de inicio (habitualmente ATG) y un codón de parada.
Tal y como se usa en el presente documento, las referencias a proteínas específicas (por ejemplo, anticuerpos) pueden incluir un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos nativa, así como variantes y formas modificadas independientemente de su origen o modo de preparación. Una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos nativa es una proteína que tiene la misma secuencia de aminoácidos como se obtiene de la naturaleza. Dichas proteínas con secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden prepararse usando métodos estándar recombinantes y/o sintéticos. Las proteínas con secuencia nativa engloban específicamente formas naturales truncadas o solubles, formas naturales variantes (por ejemplo, formas con corte y empalme alternativo), variantes y formas alélicas naturales incluyendo modificaciones post-traduccionales. Las proteínas con secuencia nativa incluyen proteínas que portan modificaciones post-traduccionales tales como glicosilación, o fosforilación, u otras modificaciones de algunos restos de aminoácidos.
El término “gen” significa una secuencia de ADN que codifica, o corresponde a, una secuencia particular de aminoácidos que comprende todo o parte de una o más proteínas o enzimas, y puede o no incluir secuencias de ADN reguladoras, tales como secuencias promotoras, que determinan por ejemplo las condiciones en las que el gen se expresa. Algunos genes, que no son genes estructurales, pueden transcribirse a partir de ADN en ARN, pero no se traducen en una secuencia de aminoácidos. Otros genes pueden funcionar como reguladores de genes estructurales o como reguladores de la transcripción del ADN. En particular, el término gen puede estar destinado para la secuencia genómica que codifica una proteína, es decir, una secuencia que comprende secuencias reguladoras, promotoras, de intrones y de exones.
Una secuencia “al menos 85% idéntica a una secuencia de referencia” es una secuencia que tiene, en su longitud completa, 85%, o más, por ejemplo 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la longitud completa de la secuencia de referencia.
Un porcentaje de “identidad de secuencia” puede determinarse comparando las dos secuencias, alineadas de manera óptima sobre una ventana de comparación, en el que la parte de la secuencia de polinucleótido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, espacios) comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico o el resto de aminoácido idéntico aparece en ambas secuencias para dar como resultado el número de posiciones concordantes, dividiendo el número de posiciones concordantes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar como resultado el porcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación se realiza por alineamiento por parejas global, por ejemplo usando el algoritmo de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970). El porcentaje de identidad de secuencia puede determinarse fácilmente por ejemplo usando el programa Needle, con la matriz BLOSUM62, y los parámetros siguientes apertura de espacio = 10, extensión de espacio = 0,5.
Una “sustitución de aminoácidos conservativa” es aquella en la que un resto de aminoácido se sustituye por otro resto de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga, tamaño o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen: 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales con hidroxilo alifático: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativa también pueden definirse tomando como base el tamaño del aminoácido.
Un “anticuerpo” puede ser un anticuerpo natural o convencional en el que dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro, y cada cadena pesada está unida a una cadena ligera por un enlace disulfuro. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (l) y kappa (k). Existen cinco clases principales de cadena pesada (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene distintos dominios de secuencia. La cadena ligera incluye dos dominios o regiones, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, referidos colectivamente como CH). Las regiones variables tanto de la cadena ligera (VL) como pesada (VH) determinan el reconocimiento de unión y especificidad al antígeno. Los dominios de región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren propiedades biológicas importantes, tales como asociación de cadenas del anticuerpo, secreción, movilidad trans-placentaria, unión de complemento y unión a receptores de Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte N terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina, y consiste en las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación del anticuerpo y el determinante antigénico. Los sitios de combinación del anticuerpo están compuestos por restos que son principalmente de las regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDR). Ocasionalmente, los restos de las regiones no hipervariables o del marco (FR) influyen en la estructura global del dominio y por lo tanto en el sitio de combinación.
Las Regiones Determinantes de la Complementariedad o CDR se refieren por lo tanto a secuencias de aminoácidos que conjuntamente definen la afinidad de unión y especificidad de la región Fv natural de un sitio de unión de una inmunoglobulina nativa. Las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tienen cada una tres CDR, designadas CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L y CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, respectivamente. Un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo convencional, por lo tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una región V de cadena pesada y cadena ligera.
“Regiones del Marco” (FR) se refieren a secuencias de aminoácidos interpuestas entre las CDR, es decir, a aquellas porciones de las regiones variables de cadena ligera y pesada de una inmunoglobulina que están relativamente conservadas entre diferentes inmunoglobulinas en una única especie. Las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tienen cada una cuatro FR, designadas FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, y FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H, respectivamente.
Como se usa en el presente documento, una “región del marco humana” es una región del marco que es sustancialmente idéntica (aproximadamente 85%, o más, por ejemplo 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) a la región del marco de un anticuerpo humano que se produce de forma natural.
En el contexto de la invención, la definición CDR/FR en una cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina se determina tomando como base la definición de IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org).
Tal y como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” indica anticuerpos convencionales y fragmentos de éstos, así como anticuerpos de dominio único y fragmentos de éstos, en particular cadena pesada variable de anticuerpos de dominio único, y anticuerpos quiméricos, humanizados, biespecíficos o multiespecíficos. Tal y como se usa en el presente documento, anticuerpo o inmunoglobulina también incluye “anticuerpos de dominio único” que se han descubierto más recientemente y que son anticuerpos cuyas regiones determinantes de la complementariedad son parte de un polipéptido de dominio único. Los ejemplos de anticuerpos de dominio único incluyen anticuerpos de cadena pesada, anticuerpos desprovistos naturalmente de cadenas ligeras, anticuerpos de dominio único derivados de anticuerpos de cuatro cadenas convencionales, anticuerpos de dominio único preparados por ingeniería. Los anticuerpos de dominio único pueden derivar de cualquier especie, incluyendo, pero no limitado a, ratón, ser humano, camello, llama, cabra, conejo, bovino. Los anticuerpos de dominio único pueden ser anticuerpos de dominio único naturales conocidos como anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. En particular, las especies Camelidae, por ejemplo camello, dromedario, llama, alpaca y guanaco, producen anticuerpos de cadena pesada desprovistos de forma natural de cadena ligera. Los anticuerpos de cadena pesada de camélidos también carecen del dominio CH1.
La cadena pesada variable de estos anticuerpos de dominio único desprovistos de cadenas ligeras se conoce en la técnica como “VHH” o “nanocuerpo”. De manera similar a los dominios VH convencionales, los VHH contienen cuatro FR y tres CDR. Los nanocuerpos tienen ventajas sobre los anticuerpos convencionales: son aproximadamente diez veces más pequeños que las moléculas de IgG, y consecuentemente nanocuerpos funcionales plegados apropiadamente pueden producirse por expresión in vitro a la vez que se consigue un rendimiento alto. Además, los nanocuerpos son muy estables y resistentes a la acción de proteasas. Las propiedades y producción de nanocuerpos se han revisado por Harmsen y De Haard HJ (Appl. Microbiol. Biotechnol.
2007 Nov; 77(1 ):13-22).
La expresión “anticuerpo monoclonal” o “mAb”, tal y como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de anticuerpo de una única secuencia de aminoácidos, que está dirigido contra un antígeno específico, y no debe interpretarse que se requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Un anticuerpo monoclonal puede producirse por un único clon de células B o hibridoma, pero también puede ser recombinante, es decir, producido por ingeniería de proteínas.
La expresión “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo preparado por ingeniería que, en su sentido más amplio, contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos distintos. En una realización, un anticuerpo quimérico comprende un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano, en asociación con un dominio CH y un dominio CL de otro anticuerpo, en una realización, un anticuerpo humano. Como el animal no humano, puede usarse cualquier animal tal como ratón, rata, hámster, conejo o similares. Un anticuerpo quimérico también puede indicar un anticuerpo multiespecífico que tiene especificidad por al menos dos antígenos diferentes.
La expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo que tiene un origen no humano completa o parcialmente y que se ha modificado para reemplazar determinados aminoácidos, por ejemplo en las regiones del marco de los dominios VH y VL, con el fin de evitar o minimizar una respuesta inmune en los seres humanos. Los dominios constantes de un anticuerpo humanizado son la mayor parte de las veces dominios CH y CL humanos. “Fragmentos” de anticuerpos (convencionales) comprenden una porción de un anticuerpo intacto, en particular la región de unión a antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fv, Fab, F(ab’)2, Fab’, dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, anticuerpos bivalentes, anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Un fragmento de un anticuerpo convencional también puede ser un anticuerpo de dominio único, tal como un anticuerpo de cadena pesada o VHH.
El término “Fab” indica un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50,000 y actividad de unión a antígeno, en el que aproximadamente una mitad del lado N-terminal de la cadena pesada y la cadena ligera completa están unidas entre sí a través de un enlace disulfuro. Habitualmente se obtiene entre fragmentos tratando IgG con una proteasa, papaína.
El término “F(ab’)2” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100,000 y actividad de unión a antígeno, que es ligeramente mayor que 2 fragmentos Fab idénticos unidos por un enlace disulfuro de la región bisagra. Habitualmente se obtiene entre fragmentos tratando IgG con una proteasa, pepsina.
El término “Fab’” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50,000 y actividad de unión a antígeno, que se obtiene cortando un enlace disulfuro de la región bisagra del F(ab’)2.
Un polipéptido Fv monocatenario (“scFv”) es un heterodímero VH::VL enlazado covalentemente que habitualmente es expresa a partir de una fusión génica que incluye genes que codifican VH y VL enlazados por un enlazador que codifica un péptido. El fragmento scFv humano de la invención incluye las CDR que se mantienen en una conformación apropiada, por ejemplo usando técnicas de recombinación génica. Los fragmentos de anticuerpo divalentes y multivalentes pueden formarse bien espontáneamente por asociación de scFv monovalentes, o pueden generarse acoplando scFv monovalentes por un enlazador peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente. “dsFv” es un heterodímero VH::VL estabilizado por un enlace disulfuro. “(dsFv)2” indica dos dsFv acoplados por un enlazador peptídico.
La expresión “anticuerpo biespecífico” o “BsAb” indica un anticuerpo que combina los sitios de unión a antígeno de dos anticuerpos en una única molécula. Así, los BsAb son capaces de unirse a dos antígenos diferentes simultáneamente. La ingeniería genética se ha usado cada vez más para diseñar, modificar y producir anticuerpos o derivados de anticuerpos con un conjunto deseado de propiedades de unión y funciones efectoras como se describe, por ejemplo, en el documento EP 2050764 A1.
La expresión “anticuerpo multiespecífico” indica un anticuerpo que combina los sitios de unión a antígeno de dos o más anticuerpos en una única molécula.
El término “anticuerpos bivalentes” se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Por medio del uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. El término “hibridoma” indica una célula que se obtiene sometiendo una célula B preparada mediante la inmunización de un mamífero no humano con un antígeno a fusión celular con una célula de mieloma derivada de un ratón o semejante que produce un anticuerpo monoclonal deseado que tiene una especificidad antigénica.
Por “purificado” y “aislado” se quiere decir, cuando se refiere a una secuencia de polipéptido (es decir, el anticuerpo de la invención) o de nucleótido, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término “purificado”, tal y como se usa en el presente documento, significa que están presentes al menos 75%, 85%, 95%, 96%, 97%, o 98% en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tipo. Una molécula de ácido nucleico “aislada” que codifica un polipéptido particular se refiere a una molécula de ácido nucleico que carece sustancialmente de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido en cuestión; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o restos adicionales que no afectan perjudicialmente las características básicas de la composición.
Tal y como se usa en el presente documento, el término “sujeto” indica un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. Además, un sujeto de acuerdo con la invención es un ser humano.
Anticuerpos
Los inventores han tenido éxito en la generación, cribado y selección de anticuerpos anti-CEACAM5 de ratón específicos que presentan una alta afinidad por la proteína CEACAM5 tanto humana como de Macaca fascicularis y que no reaccionan de manera cruzada significativamente con las proteínas CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 y CEACAM8 humanas, y con las proteínas CEACAM1, CEACAM6 y CEACAM8 de Macaca fascicularis.
Los inventores han determinado la secuencia de las cadenas pesada y ligera variables de dichos anticuerpos monoclonales, los denominados anticuerpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, y MAb5.
El denominado “anticuerpo MAb1” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGG SYIYYLDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARPAYYGNPAMDYWG QGTSVTVSS (SEQ ID NO:31, con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO:1), FR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 51 a 58 (SEQ ID NO:2), FR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 97 a 109 (SEQ ID NO:3), y FR4-H abarca las posiciones de aminoácidos 110 a 120, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DILMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSASYRYS GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:32, con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 26, CDR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO:4), FR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 89 a 98 (SEQ ID NO:6), y FR4-L abarca las posiciones de aminoácidos 99 a 108.
El denominado “anticuerpo MAb2” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLQESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFVFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGG GITYFPDTVQGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAIYYCAAHYFGSSGPFAYWG QGTLVTVSA (SEQ ID NO:33, con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO:7), FR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 51 a 58 (SEQ ID NO:8), FR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 97 a 109 (SEQ ID NO:9), y FR4-H abarca las posiciones de aminoácidos 110 a 120, y
- un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIFSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNTKTLAEG VPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:34, con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 26, CDR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO:10), FR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 89 a 97 (SEQ ID nO:12), y FR4-L abarca las posiciones de aminoácidos 98 a 107.
También se generó una variante del anticuerpo MAb2 introduciendo una sustitución K52R en el CDR2-L. Esta variante, que se denomina en el presente documento “Mab2K52R”, tiene esencialmente la misma afinidad por CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis que MAb2.
El denominado “anticuerpo MAb3” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVKLVESGGGLVKPGGSLTLPCAASGFTFSRYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGG DTYYPDSVKGRFTVSRDNARNILFLQMSSLRSEDTGMYYCARVNYYDSSFLDWWG QGTTLTVSS (SEQ ID NO:35, con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO:13), FR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 51 a 57 (SEQ ID NO:14), FR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 58 a 95, CDR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 96 a 108 (SEQ ID NO:15), y FR4-H abarca las posiciones de aminoácidos 109 a 119, y - un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIVMTQSQRFMSTLEGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRY SGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNYPLYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:36, con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 26, CDR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO:16), FR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 89 a 98 (SEQ ID nO:18), y FR4-L abarca las posiciones de aminoácidos 99 a 108.
El denominado “anticuerpo MAb4” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAFISSYG GRTYYADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMFYCAAHYFGTSGPFAYWG QGTLVTVSA (SEQ ID NO:37, con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO:19), FR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 51 a 58 (SEQ ID NO:20), FR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 97 a 109 (SEQ ID NO:21), y FR4-H abarca las posiciones de aminoácidos 110 a 120, y - un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYFAWYQQKQGKSPQLLVYNAKILAEG VPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGTYYCQHHYGIPFTFGSGTKLELK (SEQ ID NO:38, con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 26, CDR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO:22), FR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 89 a 97 (SEQ ID NO:24), y FR4-L abarca las posiciones de aminoácidos 98 a 107.
El denominado “anticuerpo MAb5” comprende:
- un dominio variable de cadena pesada que consiste en la secuencia ELQLVESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVTYINSGG GITYYPDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCTAHYFGSSGPFAYWGQ GTLVTVSA (SEQ ID NO:39, con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 25, CDR1-H abarca las posiciones de aminoácidos 26 a 33 (SEQ ID NO:25), FR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 34 a 50, CDR2-H abarca las posiciones de aminoácidos 51 a 58 (SEQ ID NO:26), FR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 59 a 96, CDR3-H abarca las posiciones de aminoácidos 97 a 109 (SEQ ID NO:27), y FR4-H abarca las posiciones de aminoácidos 110 a 120, y - un dominio variable de cadena ligera que consiste en la secuencia DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLTEG VPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:40, con las CDR mostradas en caracteres en negrita) en la que FR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 1 a 26, CDR1-L abarca las posiciones de aminoácidos 27 a 32 (SEQ ID NO:28), FR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 33 a 49, CDR2-L abarca las posiciones de aminoácidos 50 a 52, FR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 53 a 88, CDR3-L abarca las posiciones de aminoácidos 89 a 97 (SEQ ID nO:30), y FR4-L abarca las posiciones de aminoácidos 98 a 107.
Por lo tanto, la invención se refiere a un anticuerpo que se une a CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis. En una realización, el anticuerpo de la invención se une a los dominios A3-B3 de CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis. Más específicamente, el anticuerpo puede unirse a los dominios A3-B3 humanos y de Macaca fascicularis indistintamente de si se expresan en forma aislada o si están presentes en un dominio extracelular soluble o proteína CEACAM5 de longitud completa anclada a membrana.
La especificidad de los anticuerpos por el dominio A3-B3 de CEACAM5 humana es ventajosa, ya que no se ha dado a conocer ningún SNP con una frecuencia mayor de 2% en la población caucásica en este dominio, lo que minimiza el riesgo de que el epítopo o epítopos de los anticuerpos en CEACAM5 estén alterados en parte de la población. La invención también proporciona un anticuerpo que compite por la unión al dominio A3-B3 de las proteínas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis con un anticuerpo que comprende las cadenas pesadas y ligeras variables de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos denominados MAb1, MAb2, MAb2K52R, MAb3, MAb4, y MAb5, es decir, seleccionado del grupo que consiste en:
a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:31 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:32;
b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:33 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:34;
c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:33 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:34 en la que K en la posición 52 se ha sustituido por R;
d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:35 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:36;
e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:37 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:38; y
f) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:39 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:40.
La capacidad de un anticuerpo candidato para competir por la unión al dominio A3-B3 de proteínas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis con un anticuerpo que comprende las cadenas pesadas y ligeras variables de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los anticuerpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, y MAb5 (de aquí en adelante en el presente documento, un anticuerpo “de referencia”) puede ensayarse fácilmente, por ejemplo por ELISA competitivo en el que el antígeno (es decir, el dominio A3-B3 de CEACAM5 humana o de Macaca fascicularis, o un polipéptido que comprende o consiste en un fragmento de CEACAM5 humana o de Macaca fascicularis que incluye el dominio A3-B3, en particular el dominio extracelular de CEACAM5 humana o de Macaca fascicularis) está unido a un soporte sólido y se añaden dos disoluciones que contienen el anticuerpo candidato y el anticuerpo de referencia, respectivamente, y se deja que los anticuerpos compitan por la unión al antígeno. La cantidad de anticuerpo de referencia unido al antígeno puede medirse entonces y se puede comparar con la cantidad de anticuerpo de referencia unido al antígeno cuando se mide frente a un control negativo (por ejemplo, una disolución que no contiene anticuerpo). Una cantidad de anticuerpo de referencia unido en presencia del anticuerpo candidato, disminuida en comparación con la cantidad de anticuerpo de referencia unido en presencia del control negativo, indica que el anticuerpo candidato ha competido con el anticuerpo de referencia. Convenientemente, el anticuerpo de referencia puede estar marcado (por ejemplo, fluorescentemente) para facilitar la detección del anticuerpo de referencia unido. Pueden realizarse medidas repetidas con diluciones seriadas del anticuerpo candidato y/o de referencia.
De acuerdo con una realización, dicho anticuerpo, y por ejemplo el anticuerpo que compite por la unión al dominio A3-B3 de las proteínas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis con un anticuerpo como se define en b), c), e) y f) anteriores, se une a dos regiones del dominio A3-B3 de la proteína CEACAM5 humana que consiste en los aminoácidos en las posiciones 109-115 (SEQ ID NO:76) y aminoácidos en las posiciones 131-143 (SEQ ID NO:77) del dominio A3-B3 de la proteína CEACAM5 humana, respectivamente. De hecho, se ha identificado que un epítopo conformacional para el anticuerpo MAb2 pertenece a las regiones 109-115 y 131-143 del dominio A3-B3 de la proteína CEACAM5 humana, y estando MAb2, MAb4 y MAb5 estructuralmente muy relacionados, se asume por los inventores que dichos anticuerpos se unen al mismo epítopo.
De acuerdo con una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención es específico para las proteínas de superficie CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis. En una realización, el anticuerpo de la invención no se une a, o no reacciona de manera cruzada significativamente con las proteínas CEACAM1 humana, CEACAM6 humana, CEACAM7 humana, CEACAM8 humana, CEACAM1 de Macaca fascicularis, CEACAM6 de Macaca fascicularis y CEACAM8 de Macaca fascicularis.
En particular, el anticuerpo no se une a, o no reacciona de manera cruzada significativamente con, el dominio extracelular de las proteínas CEACAM humana y de Macaca fascicularis mencionadas anteriormente.
La proteína CEACAM1 humana de longitud completa está disponible en la base de datos GenBank con el número de registro NP_001703,2 (SEQ ID NO:11). El dominio extracelular de CEACAM1 humana consiste en los aminoácidos en las posiciones 35-428 de SEQ ID NO:11. La proteína CEACAM6 humana de longitud completa está disponible en la base de datos GenBank con el número de registro NP_002474,3 (SEQ ID NO:71). El dominio extracelular de CEACAM6 humana consiste en los aminoácidos en las posiciones 35-327 de SEQ ID NO:71.
La proteína CEACAM7 humana de longitud completa está disponible en la base de datos GenBank con el número de registro NP_008821,1 (SEQ ID NO:72). El dominio extracelular de CEACAM7 humana consiste en los aminoácidos en las posiciones 36-248 de SEQ ID NO:72.
La proteína CEACAM8 humana de longitud completa está disponible en la base de datos GenBank con el número de registro NP_001807,2 (SEQ ID NO:73). El dominio extracelular de CEACAM8 humana consiste en los aminoácidos en las posiciones 35-332 de SEQ ID NO:73.
El dominio extracelular de CEACAM1 de M. fascicularis consiste en los aminoácidos en las posiciones 35-428 de la proteína de longitud completa, es decir, los aminoácidos 1 -394 de SEQ ID NO:57.
El dominio extracelular de CEACAM6 de M. fascicularis consiste en los aminoácidos en las posiciones 35-327 de la proteína de longitud completa, es decir, los aminoácidos 1 -293 de SEQ ID NO:61.
El dominio extracelular de CEACAM8 de M. fascicularis consiste en los aminoácidos en las posiciones 35-332 de la proteína de longitud completa, es decir, los aminoácidos 1 -298 de SEQ ID NO:63.
La “afinidad” se define, en teoría, por la asociación en equilibrio entre el anticuerpo completo y el antígeno. Puede evaluarse experimentalmente por una variedad de métodos conocidos, tal como midiendo las velocidades de asociación y disociación con resonancia de plasmones superficiales, o midiendo la CE50 (o Kd aparente) en un ensayo inmunoquímico (ELISA, FACS). En estos ensayos, la CE50 es la concentración del anticuerpo que induce una respuesta que es la mitad entre la línea base y el máximo después de algún tiempo de exposición especificado en una concentración definida de antígeno por ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima) o célula que expresa el antígeno por FACS (Clasificación Celular Activada por Fluorescencia).
Un anticuerpo monoclonal que se une al antígeno 1 (Agí) “reacciona de manera cruzada” con el antígeno 2 (Ag2) cuando las CE50 están en un intervalo similar para ambos antígenos. En la presente solicitud, un anticuerpo monoclonal que se une a Agí reacciona de manera cruzada con Ag2 cuando la relación de la afinidad de Ag2 a la afinidad de Agí es igual a o menor que 10 (por ejemplo 5, 2, 1 o 0,5), midiéndose las afinidades con el mismo método para ambos antígenos.
Un anticuerpo monoclonal que se une a Ag1 “no reacciona de manera cruzada significativamente” con Ag2 cuando las afinidades son muy diferentes para los dos antígenos. La afinidad por Ag2 puede no ser medible si la respuesta de unión es demasiado baja. En la presente solicitud, un anticuerpo monoclonal que se une a Ag1 no reacciona de manera cruzada significativamente con Ag2 cuando la respuesta de unión del anticuerpo monoclonal a Ag2 es menor que 5% de la respuesta de unión del mismo anticuerpo monoclonal a Ag1 en el mismo entorno experimental y a la misma concentración de anticuerpo. En la práctica, la concentración de anticuerpo usada puede ser la CE50 o la concentración requerida para alcanzar la meseta de saturación obtenida con Ag1.
Un anticuerpo monoclonal “se une específicamente” a, o “es específico para” Ag1 cuando no reacciona de manera cruzada significativamente con Ag2. De acuerdo con esto, el anticuerpo de acuerdo con la invención tiene una relación de afinidad por CEACAM5 humana a la afinidad por CEACAM5 de Macaca fascicularis que es < 10, por ejemplo < 5, < 2, < 1, o < 0,5. Así, el polipéptido de acuerdo con la invención puede usarse en estudios toxicológicos realizados en monos debido a que el perfil de toxicidad observado en monos sería relevante para anticipar efectos adversos potenciales en los seres humanos.
Una realización de la invención tiene una afinidad por CEACAM5 humana o CEACAM5 de Macaca fascicularis, o por ambas, que es < 10 nM, por ejemplo < 5 nM, < 3 nM, < 1 nM o < 0,1 nM, por ejemplo una afinidad de 0,01 nM a 5 nM, o/y afinidad de 0,1 nM a 5 nM, o de 0,1 nM a 1 nM.
La afinidad por CEACAM5 humana o CEACAM5 de Macaca fascicularis puede determinarse como el valor de CE50 en un ELISA usando CEACAM5 recombinante soluble como antígeno de captura.
El anticuerpo de la invención también puede tener una constante de disociación aparente (KD aparente), como puede determinarse por análisis FACS en la línea celular tumoral MKN45 (DSMZ, ACC 409) o en células tumorales de xenoinjerto derivadas del paciente (CR-IGR-034P disponible en Oncodesign Biotechnology, colección tumoral CReMEC), que es < 25 nM, por ejemplo < 20 nM, < 10nM, < 5nM, < 3nM o < 1 nM. La KD aparente puede estar en el intervalo de 0,01 -20 nM, o puede estar en el intervalo de 0,1-20 nM, 0,1-10 nM, o 0,1-5 nM.
Además, se ha mostrado que los anticuerpos de acuerdo con la invención son capaces de detectar la expresión de CEACAM5 por inmunohistoquímica en secciones tisulares congeladas y fijadas con formalina y embebidas en parafina (FFPE).
Los alineamientos de las secuencias de las regiones VH y VL de los anticuerpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 y MAb5 se muestran en la Figura 7. La comparación de las secuencias de CDR-H y CDR-L indica que, estructuralmente, MAb2, MAb4 y MAb5, por una parte, y MAb1 y MAb3, por otra parte, están muy relacionados, uniéndose dichos anticuerpos probablemente al mismo epítopo. La comparación de las secuencias CDR-H y CDR-L identifica además posiciones de CDR que están estrictamente conservadas entre los dos grupos de anticuerpos y se asume así que son importantes para la especificidad, mientras que las demás posiciones podrían tolerar una sustitución.
Los inventores han identificado además que los restos en las posiciones 101-109 de MAb2 VH (es decir, los restos de CDR3-H) y los restos en las posiciones 47-54 y 88-104 de MAb2 VL (es decir, las regiones que incluyen CDR2-L y CDR3-L, respectivamente) forman parte, o constituyen, el paratopo de anticuerpo para el dominio A3B3 de CEACAM5 humana.
Además, los restos en las posiciones 27, 28, 29, 31, 51,52, 89, 90, 93, 94, 96, y 97 de MAb2 VL (es decir, en CDR1 -L, CDR2-L y CDR3-L), y los restos en las posiciones 26 a 31, 51 a 58, 97, 103, 104, 107, y 109 de MAb2 VH (es decir, en CDR1-H, todos los CDR2-H y en CDR3-H) se han identificado por sustituciones de un solo aminoácido como neutros para unión a los dominios extracelulares de CEACAM5 humana y de macaco. Además, se ha mostrado que los restos en las posiciones 30 y 92 de MAb2 VL (es decir, en CDR1-L y CDR3-L), y los restos en las posiciones 98 y 100 de MAb2 VH (es decir, en CDR3-H), toleran una sustitución conservativa. Como MAb2, MAb4 y MAb5 portan el mismo conjunto de 6 CDR o unas muy relacionadas, se considera que las variaciones en las mismas posiciones de MAb4 o MAb5 en las secuencias VH o VL o tanto de VH y CL darán como resultado también anticuerpos variantes que mantienen la especificidad y/o afinidad de unión por CEACAM5 humana y de macaco. De forma importante, habiéndose identificado todos los restos de CDR2-H como neutros para la unión a los dominios extracelulares de CEACAM5 humana y de macaco, los inventores asumieron que CDR2-H podría no participar en la interacción. De acuerdo con esto, en los anticuerpos de la invención, CDR2-H podría ser cualquier secuencia de 6 a 10 aminoácidos, siendo ésta la longitud normal de las secuencias de CDR2-H en los anticuerpos humanos.
De acuerdo con esto, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende:
a) una CDR1-H que consiste en la secuencia X1X2X3X4X5X6YD (SEQ ID NO:83), en la que cada uno de Xi, X2, X3, X4, X5 y X6 es cualquier aminoácido; y
una CDR2-H que consiste en una secuencia con una longitud de 6 a 10 aminoácidos, preferiblemente una secuencia con una longitud de 8 aminoácidos en la que cualquier aminoácido puede estar presente en cualquier posición; y
una CDR3-H que consiste en la secuencia X1X2HX3FGX4X5GPX6AX7 (SEQ ID NO:84), en la que cada uno de X1, X4, X5, X6, y X7 es cualquier aminoácido, X2 es A o S, y X3 es Y, F o W; y/o
b) una CDR1-L que consiste en la secuencia X1X2X3X4X5Y (SEQ ID NO:85), en la que cada uno de X1, X2, X3 y X5 es cualquier aminoácido, y X4 es Y, F o W; y
una CDR2-L que consiste en la secuencia NX1X2, en la que cada uno de X1 y X2 es cualquier aminoácido; y una CDR3-L que consiste en la secuencia X1X2HX3X4X5PX6X7 (SEQ ID NO:86), en la que cada uno de X1, X2, X4, X5, X6 y X7 es cualquier aminoácido, X3 es Y, F o W.
En una realización, en la CDR1-H que consiste en una secuencia X1X2X3X4X5X6YD (SEQ ID NO:83), X1 es G, o X2 es F, o X3 es T, A o V, o X4 es F, o X5 es S, o X6 es S, o cualquier combinación de los mismos.
En una realización, la CDR2-H consiste en una secuencia IX1SX2GGX3T (SEQ ID NO:79), en la que X1 es S o N (en particular S), X2 es Y o G (en particular G), X3 es R o I. En una realización adicional X3 es I.
En una realización, en la CDR3-H que consiste en una secuencia X1X2HX3FGX4X5GPX6AX7 (SEQ ID NO:84), X1 es A o T, o X4 es T o S, o X5 es S, o X6 es F, o X7 es Y, o cualquier combinación de los mismos.
En una realización, en la CDR1-L que consiste en una secuencia X1X2X3X4X5Y (SEQ ID NO:85), X1 es E, o X2 es N, o X3 es I, o X5 es S, o cualquier combinación de los mismos.
En una realización, la CDR2-L consiste en una secuencia NX1X2, en la que X1 es A o T, y X2 es K o R.
En una realización, en la CDR3-L que consiste en una secuencia X1X2HX3X4X5PX6X7 (SEQ ID NO:86), X1 es Q, o X2 es H, o X4 es G, o X5 es T, o X6 es F, o X7 es T, o cualquier combinación de los mismos. De acuerdo con una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende:
a) una CDR1-H que consiste en una secuencia GFX1FSSYD (SEQ ID NO:78), en la que X1 es T, A o V; y una CDR2-H que consiste en una secuencia IX1SX2GGX3T (SEQ ID NO:79), en la que X1 es S o N (en particular S), X2 es Y o G (en particular G), X3 es R o I; y
una CDR3-H que consiste en una secuencia X1AHYFGX2SGPFAY (SEQ ID NO:80), en la que X1 es A o T (en particular A), y X2 es T o S ; y/o
b) una CDR1-L que consiste en una secuencia ENIFSY (SEQ ID NO:10) o ENIYSY (SEQ ID NO:22); y una CDR2-L que consiste en una secuencia NX1X2 en la que X1 es A o T, y X2 es K o R, en particular R; CDR2-L que consiste en particular en NAK, NTK y NTR; y
una CDR3-L que consiste en una secuencia QHHYGTPFT (SEQ ID NO:12) o QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24). De acuerdo con una realización, en CDR2-H, X1 es S o N, X2 es G y X3 es I.
De acuerdo con una realización, CDR2-H consiste en ISSGGGIT (SEQ ID NO:8), ISSYGGRT (SEQ ID NO:20) o INSGGGIT (SEQ ID NO:26).
De acuerdo con una realización, en CDR3-H, X1 es A o T, y X2 es S.
De acuerdo con una realización, CDR3-H consiste en AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21), o TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27).
Cualquier combinación de estas realizaciones forma parte de la invención.
Alternativamente, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende:
a) una CDR1-H que consiste en una secuencia GFTFSX1YX2 (SEQ ID NO:81), en la que X1 es R o S, en particular S, y X2 es A o D; y
una CDR2-H que consiste en una secuencia ISSGGX1X2X3 (SEQ ID NO:82), en la que X1 está ausente, S o G (en particular G), X2 es D, Y o I, y X3 es T o I; y
una CDR3-H que consiste en una secuencia ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) o ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15); y/o
b) a CDR1-L que consiste en una secuencia QNVGTN (SEQ ID NO:4); y
una CDR2-L que consiste en una secuencia SAS; y
una CDR3-L que consiste en una secuencia QQYNSYPLYT (SEQ ID NO:6) o QQYNNYPLYT (SEQ ID NO:18).
De acuerdo con una realización, CDR2-H consiste en una secuencia ISSGGSYI (SEQ ID NO:2) o ISSGGDT (SEQ ID NO:14).
De acuerdo con una realización, CDR2-H consiste en una secuencia ISSGGSYI (SEQ ID NO:2) y CDR3-H consiste en la secuencia ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3).
De acuerdo con una realización, CDR2-H consiste en ISSGGDT (SEQ ID NO:14) y CDR3-H consiste en la secuencia ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15).
De acuerdo con una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende las secuencias de CDR de las cadenas pesadas y/o ligeras de uno de los denominados anticuerpos anti-CEACAM5 MAb1, MAb2, MAb2K52R, MAb3, MAb4, y MAb5.
Por lo tanto, la invención se refiere a un anticuerpo que comprende:
a) una CDR1-H de secuencia GFTFSSYA (SEQ ID NO:1) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:1 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-H de secuencia ISSGGSYI (SEQ ID NO:2) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:2 por una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:3 por una sustitución de aminoácidos; CDR1-L de secuencia QNVGTN (SEQ ID NO:4) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:4 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-L de secuencia SAS o una secuencia que difiere de SAS por una sustitución de aminoácidos; y CDR3-L de secuencia QQYNSYPLYT (SEQ ID NO:6) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:6 por una sustitución de aminoácidos; o
b) una CDR1-H de secuencia GFVFSSYD (SEQ ID NO:7) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:7 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-H de secuencia ISSGGGIT (SEQ ID NO:8) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:8 por una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:9 por una o más sustituciones de aminoácidos; CDR1-L de secuencia ENIFSY (SEQ ID NO:10) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:10 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-L de secuencia NTK o NTR o una secuencia que difiere de NTK o NTR por una sustitución de aminoácidos; y CDR3-L de secuencia QHHYGTPFT (SEQ ID NO:12) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:12 por una sustitución de aminoácidos; o c) una CDR1-H de secuencia GFTFSRYA (SEQ ID NO:13) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:13 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-H de secuencia ISSGGDT (SEQ ID NO:14) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:14 por una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:15 por una sustitución de aminoácidos; CDR1-L de secuencia QNVGTN (SEQ ID NO:16) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:16 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-L de secuencia SAS o una secuencia que difiere de SAS por una sustitución de aminoácidos; y CDR3-L de secuencia QQYNNYPLYT (SEQ ID NO:18) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:18 por una sustitución de aminoácidos; o
d) una CDR1-H de secuencia GFTFSSYD (SEQ ID NO:19) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:19 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-H de secuencia ISSYGGRT (SEQ ID NO:20) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:20 por una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID nO:21) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:21 por una o más sustituciones de aminoácidos; CDR1-L de secuencia ENIYSY (SEQ ID NO:22) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:22 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-L de secuencia NAK o una secuencia que difiere de NAK por una o más sustituciones de aminoácidos; y CDR3-L de secuencia QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:24 por una sustitución de aminoácidos; o
e) un anticuerpo que comprende una CDR1-H de secuencia GFAFSSYD (SEQ ID NO:25)o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:25 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-H de secuencia INSGGGIT (SEQ ID NO:26) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:26 por una o más sustituciones de aminoácidos; CDR3-H de secuencia TAHy Fg SSGPFAY (SEQ ID NO:27) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:27 por una o más sustituciones de aminoácidos; CDR1-L de secuencia ENIYSY (SEQ ID NO:28) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:28 por una sustitución de aminoácidos; CDR2-L de secuencia NAK o una secuencia que difiere de NAK por una o más sustituciones de aminoácidos; y CDR3-L de secuencia QHHYGTPFT (SEQ ID NO:30) o una secuencia que difiere de la SEQ ID NO:30 por una sustitución de aminoácidos.
Uno o más aminoácidos individuales se pueden alterar por sustitución, en particular por sustitución conservativa, en una o más de las secuencias de CDR anteriores. Dicha alteración puede pretender, por ejemplo, eliminar un sitio de glicosilación o un sitio de desamidación, en conexión con la humanización del anticuerpo.
Tomando como base los alineamientos de las secuencias de las regiones VH y VL de los MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 y MAb5, y tomando como base las sustituciones de aminoácidos únicas en una variante del anticuerpo MAb2, puede sustituirse un aminoácido:
- en CDR1-H: en una o más de las posiciones 1 a 6, por ejemplo en la posición 3, de CDR1-H de secuencia GFVFSSYD (SEQ ID NO:7), GFTFSSYD (SEQ ID NO:19) o GFAFSSYD (SEQ ID NO:25) o en la posición 6 de CDR1-H de la secuencia GFTFSSYA (SEQ ID NO:1) o GFTFSRYA (SEQ ID NO:13); y/o
- en CDR2-H, en una o más de cualesquiera de las posiciones, o en una, dos o tres de las posiciones 2, 4, y 7 de CDR2-H de secuencia ISSGGGIT (SEQ ID NO:8), ISSYGGRT (SEQ ID NO:20) o INSGGGIT (SEQ ID NO:26), o en una, dos, o tres de las posiciones 6, 7 y 8 (en las que la secuencia tiene una longitud de 8 aminoácidos) de CDR2-H de secuencia ISSGGSYI (s Eq ID NO:2) o ISSGGDT (SEQ ID NO:14); y/o véase anteriormente
- en CDR3-H, en una o más de las posiciones 1, 7, 8, 11 y 13, por ejemplo en una o dos de las posiciones 1 y 7 de CDR3-H de secuencia AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21), o TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27), o en la posición 3, 4, 7, 8, 9, 10, u 11 de secuencia Ar PAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) o ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15); y/o
- en CDR1 -L, en una o más de las posiciones 1 a 5, en particular en una o más de las posiciones 1, 2, 3 y 5 o en la posición 4 de CDR1-L de secuencia ENIFSY (SEQ ID NO:10) o ENIYSY (SEQ ID NO:28); y/o
- en CDR2-L, en las posiciones 2 y/o 3 de secuencia NAK, NTK o NTR, en particular al menos en la posición 3 si K está presente. En dicho caso, R por ejemplo puede sustituirse por K en la posición 3 de CDR2-L; y/o - en CDR3-L, en una o más de las posiciones 1, 2, 5, 6, 8 y 9, por ejemplo en la posición 6 de CDR3-L de secuencia QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24) o QHHYGTPFT (SEQ ID NO:30), o en la posición 5 de CDR3-L de secuencia QQYNSYPLYT (SEQ ID NO:6) o QQYNNYPLYT (SEQ ID NO:18).
De acuerdo con una realización, en los anticuerpos de la invención:
- la posición 5 de CDR3-H de secuencia AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21), o TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27); y/o
- la posición 6 de CDR1-L de secuencia ENIFSY (SEQ ID NO:10) o ENIYSY (SEQ ID NO:28); y/o
- la posición 3 de CDR3-L de secuencia QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24) o QHHYGTPFT (SEQ ID NO:30) no está (están) modificada(s).
De acuerdo con una realización, en CDR1-H de secuencia GFVFSSYD (SEQ ID NO:7), GFTFSSYD (SEQ ID NO:19) o GFAFSSYD (SEQ ID NO:25), el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 3 de CDR1-H se selecciona del grupo que consiste en T, A o V.
De acuerdo con una realización, en CDR1-H de secuencia GFTFSSYA (SEQ ID NO:1) o GFTFSRYA (SEQ ID NO:13), el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 6 de CDR1 -H es R o S.
De acuerdo con una realización, en CDR3-H de secuencia AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21), o TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27), el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 1 de CDR3-H es A o T, y/o el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 7 de CDR3-H es T o S.
De acuerdo con una realización, en CDR3-H de secuencia ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) o ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15), el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 3 de CDR3-H es V o P, en la posición 4 es A o N, en la posición 7 es D o G, en la posición 8 es S o N, en la posición 9 es S o P, en la posición 10 es F o A, o en la posición 11 es W o Y.
De acuerdo con una realización, el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 4 de CDR1-L es Y o F.
De acuerdo con una realización, en CDR2-L de secuencia NAK, NTK o NTR, el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 2 de CDR2-L es A o T.
De acuerdo con una realización en CDR3-L de secuencia QQYNSYPLYT (SEQ ID NO:6) o QQYNNYPLYT (SEQ ID NO:18), el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 5 de CDR3-L es N o S.
De acuerdo con una realización, en CDR3-L de secuencia QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24) o QHHYGTPFT (SEQ ID NO:30), el aminoácido que se sustituye por el aminoácido en la posición 6 de CDR3-L es I o T.
Cualquier combinación de las realizaciones anteriores forma parte de la invención.
En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención es un anticuerpo convencional, tal como un anticuerpo monoclonal convencional, o un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo biespecífico o multiespecífico.
En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende o consiste en una IgG, o un fragmento de ésta.
La invención también proporciona anticuerpos como se ha definido anteriormente que comprenden además al menos el dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera de uno de los cinco denominados anticuerpos anti-CEACAM5 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, y MAb5.
Así, una realización de la invención se refiere a un anticuerpo que comprende:
a) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:31, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:32, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; o
b) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:33, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:34, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; o
c) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:35, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:36, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; o
d) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:37, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:38, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; o
e) un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:39, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y/o un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:40, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta. Por ejemplo, la secuencia del dominio variable de cadena pesada o ligera puede diferir de la secuencia de referencia SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40, según sea apropiado, en una o más sustituciones de aminoácidos, en particular en una o más sustituciones de aminoácidos conservativas y/o sustitución o sustituciones con restos canónicos. En una realización, la secuencia del dominio variable de cadena pesada o ligera puede diferir de la secuencia de referencia SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 solo en una sustitución o sustituciones de aminoácidos conservativas.
Las alteraciones de la secuencia comparadas con la secuencia SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 estarán presentes esencialmente en una o más de las regiones del marco, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L y/o FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.
Sin embargo, también son posibles las sustituciones de aminoácidos en una o más CDR. En una realización, la secuencia del dominio variable de cadena ligera puede diferir de la secuencia SEQ ID NO:34 al menos por una sustitución de K a R en la posición 52 de SEQ ID NO:34 (en CDR2-L).
El anticuerpo de la invención y un fragmento de éste pueden ser, respectivamente, un anticuerpo murino y un fragmento de un anticuerpo murino.
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo quimérico, y en una realización, un anticuerpo murino/humano, por ejemplo un anticuerpo que comprende dominios variables murinos de cadenas pesada y ligera y un dominio CH y un dominio CL de un anticuerpo humano. El polipéptido puede ser un fragmento de dicho anticuerpo.
De acuerdo con una realización, el anticuerpo de la invención es:
a) un anticuerpo quimérico que comprende, o consiste en, una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:41 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:42 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta (es decir, cadena pesada y/o ligera de chMAb1 como se describe en el ejemplo 5); o una cadena pesada y una cadena ligera o,
b) un anticuerpo quimérico que comprende, o consiste en, una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:43 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:44, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta (es decir, cadena pesada y/o ligera de chMAb2 como se describe en el ejemplo 5); o una cadena pesada y una cadena ligera o,
c) un anticuerpo quimérico que comprende, o consiste en, una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:45 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:46 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta (es decir, cadena pesada y/o ligera de chMAb3 como se describe en el ejemplo 5); o una cadena pesada y una cadena ligera o,
d) un anticuerpo quimérico que comprende, o consiste en, una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:47 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:48 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta (es decir, cadena pesada y/o ligera de chMAb4 como se describe en el ejemplo 5); o una cadena pesada y una cadena ligera o,
e) un anticuerpo quimérico que comprende, o consiste en, una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:49 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:50 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta (es decir, cadena pesada y/o ligera de chMAb5 como se describe en el ejemplo 5); o una cadena pesada y una cadena ligera o,
f) un fragmento del anticuerpo quimérico definido en a), b), c), d) o e).
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo humanizado o un fragmento de un anticuerpo humanizado. En una realización, el anticuerpo de la invención puede resultar de la humanización de cualquiera de los anticuerpos quiméricos definidos anteriormente en a), b), c), d), e) o f).
En la técnica se conocen numerosos métodos para la humanización de una secuencia de anticuerpo; véase, por ejemplo, la revisión por Almagro y Fransson (2008) Front Biosci. 13: 1619-1633. Un método usado comúnmente es el injerto de CDR, o remodelado de anticuerpo, que implica el injerto de las secuencias de CDR de un anticuerpo donante, generalmente un anticuerpo de ratón, en la estructura del marco de un anticuerpo humano de diferente especificidad. Como el injerto de CDR puede reducir la especificidad y afinidad de unión, y de este modo la actividad biológica, de un anticuerpo no humano injertado con CDR, pueden introducirse retromutaciones en posiciones seleccionadas del anticuerpo injertado con CDR con el fin de retener la especificidad y afinidad de unión del anticuerpo parental. La identificación de posiciones para posibles retromutaciones puede realizarse usando la información disponible en la bibliografía y en bases de datos de anticuerpos. Los restos de aminoácidos que son candidatos para retromutaciones son típicamente aquellos que están localizados en la superficie de una molécula de anticuerpo, mientras que los restos que están enterrados o que tienen un grado bajo de exposición en la superficie normalmente no se alterarán. Una técnica de humanización alternativa al injerto de CDR y retromutación es la modificación de superficie, en la que se retienen los restos de origen no humano no expuestos en la superficie, mientras que los restos de la superficie se alteran a restos humanos. Otra técnica alternativa se conoce como “selección guiada” (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12, 899), y puede usarse para derivar a partir de un anticuerpo murino un anticuerpo completamente humano que conserva el epítopo y las características de unión del anticuerpo parental.
Para los anticuerpos quiméricos, la humanización implica típicamente la modificación de las regiones del marco de las secuencias de la región variable.
Los restos de aminoácidos que forman parte de una CDR no se alterarán típicamente en conexión con la humanización, aunque en determinados casos puede ser deseable alterar restos de aminoácidos individuales de CDR, por ejemplo para eliminar un sitio de glicosilación, un sitio de desamidación o un resto de cisteína no deseado. La glicosilación enlazada mediante N ocurre por la unión de una cadena oligosacarídica a un resto de asparagina en la secuencia del tripéptido Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro. La eliminación de un sitio de N-glicosilación puede conseguirse mutando bien el resto de Asn o el Ser/Thr a un resto diferente, por ejemplo mediante una sustitución conservativa. La desamidación de los restos de asparagina y glutamina puede ocurrir dependiendo de factores tales como pH y exposición en la superficie. Los restos de asparagina son particularmente susceptibles a la desamidación, principalmente cuando están presentes en la secuencia Asn-Gly, y en menor medida en otras secuencias de dipéptido tales como Asn-Ala. Cuando está presente dicho sitio de desamidación, por ejemplo Asn-Gly, en una secuencia de CDR, puede ser deseable por lo tanto eliminar el sitio, típicamente por sustitución conservativa para eliminar uno de los restos implicados. La sustitución en una secuencia de CDR para eliminar uno de los restos implicados también se pretende que esté englobada por la presente invención.
Tomando el denominado “anticuerpo MAb2” como un ejemplo, un anticuerpo humanizado o fragmento de éste puede comprender las mutaciones siguientes en la cadena pesada variable: P en lugar de G en la posición 9; y/o G en lugar de V en la posición 10; y/o S en lugar de K en la posición 19; y/o R en lugar de K en la posición 43; y/o G en lugar de R en la posición 44; y/o A en lugar de F en la posición 60; y/o S en lugar de D en la posición 62; y/o K en lugar de Q en la posición 65; y/o T en lugar de K en la posición 87; y/o V en lugar de I en la posición 89; y/o S en lugar de A en la posición 113; proporcionándose las posiciones por referencia a SEQ ID NO:33.
Tomando aún el denominado “anticuerpo MAb2” como un ejemplo, un anticuerpo humanizado o fragmento de éste puede comprender las mutaciones siguientes en la cadena ligera variable: D en lugar de E en la posición 17; y/o R en lugar de T en la posición 18; y/o P en lugar de Q en la posición 40; y/o K en lugar de Q en la posición 45; y/o R en lugar de K en la posición 52; y/o D en lugar de Q en la posición 70; y/o T en lugar de K en la posición 74; y/o S en lugar de N en la posición 76; y/o A en lugar de G en la posición 84; y/o T en lugar de S en la posición 85; proporcionándose las posiciones por referencia a SEQ ID NO:34.
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado que comprende, o consiste en, una cadena pesada que comprende las mutaciones siguientes, proporcionándose las posiciones por referencia a SEQ ID NO:33:
a) P en lugar de G en la posición 9; y G en lugar de V en la posición 10; y S en lugar de K en la posición 19; y R en lugar de K en la posición 43; y S en lugar de D en la posición 62; y K en lugar de Q en la posición 65; y T en lugar de K en la posición 87; o
b) P en lugar de G en la posición 9; y G en lugar de V en la posición 10; y S en lugar de K en la posición 19; y R en lugar de K en la posición 43; y G en lugar de R en la posición 44; y A en lugar de F en la posición 60; y S en lugar de D en la posición 62; y K en lugar de Q en la posición 65; y T en lugar de K en la posición 87; y V en lugar de I en la posición 89; y S en lugar de A en la posición 113; y/o
un anticuerpo humanizado que comprende una cadena ligera que comprende las mutaciones siguientes, proporcionándose las posiciones por referencia a SEQ ID NO:34:
c) D en lugar de E en la posición 17; y P en lugar de Q en la posición 40; y K en lugar de Q en la posición 45; y T en lugar de K en la posición 74; y S en lugar de N en la posición 76; o
d) D en lugar de E en la posición 17; y R en lugar de T en la posición 18; y P en lugar de Q en la posición 40; y K en lugar de Q en la posición 45; y D en lugar de Q en la posición 70; y T en lugar de K en la posición 74; y S en lugar de N en la posición 76; y A en lugar de G en la posición 84; y T en lugar de S en la posición 85; o e) D en lugar de E en la posición 17; y R en lugar de T en la posición 18; y P en lugar de Q en la posición 40; y K en lugar de Q en la posición 45; y R en lugar de K en la posición 52; y D en lugar de Q en la posición 70; y T en lugar de K en la posición 74; y S en lugar de N en la posición 76; y A en lugar de G en la posición 84; y T en lugar de S en la posición 85.
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado obtenido injertando las CDR de un anticuerpo de la invención en regiones del marco de anticuerpo alternativas, más específicamente en regiones del marco humanas. Tomando MAb2 como un ejemplo, las 6 CDR de MAb2K52R se han injertado en un marco humano que consiste en los genes IGHV3-23 e IGKV1D-39, y se introdujeron tres retromutaciones correspondientes a las posiciones 34 y 53 en la VL (SEQ ID NO. 34) y en la posición 50 en la VH (SEQ ID NO. 33) que dan como resultado un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:74 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:75.
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado que comprende, o consiste en, una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO: 74, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; y/o una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:55 o SEQ ID NO:75 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta (dominios variables humanizados de cadenas pesada y ligera de MAb2).
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:51 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:17 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:5 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:23 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:5 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:29 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:51 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:55 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO: 74 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO: 75 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta.
En dicho anticuerpo humanizado o fragmento de éste, los dominios variables de las cadenas pesada y ligera pueden comprender regiones del marco aceptoras humanas. El anticuerpo humanizado comprende además dominios constantes de cadena pesada y ligera humana, cuando están presentes.
En una realización, el anticuerpo de la invención es el anticuerpo huMAb2-3 o una variante de éste, es decir, un anticuerpo aislado que se une al dominio A3-B3 de las proteínas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis, y que comprende:
a) una cadena pesada que consiste en la secuencia SEQ ID NO:87 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; o
b) una cadena ligera que consiste en la secuencia SEQ ID NO:88 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, o una cadena pesada y una cadena ligera.
En una realización, el anticuerpo de la invención es el anticuerpo huMAb2-4 (MAb2_VL1d VH1-IgG1) o una variante de éste, es decir, un anticuerpo aislado que se une al dominio A3-B3 de las proteínas CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis, y que comprende:
c) una cadena pesada que consiste en la secuencia SEQ ID NO:89 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta; y/o
d) una cadena ligera que consiste en la secuencia SEQ ID NO:90 o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta.
El anticuerpo de acuerdo con la invención también puede ser un anticuerpo de dominio único o un fragmento de éste. En una realización de la invención, un fragmento de anticuerpo de dominio único puede consistir en una cadena pesada variable (VHH) que comprende las CDR1-H, CDR2-H y CDR3-H de los anticuerpos como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo de cadena pesada, es decir, un anticuerpo desprovisto de cadena ligera, que puede contener o no un dominio CH1.
El anticuerpo de dominio único o un fragmento de éste también pueden comprender las regiones del marco de un anticuerpo de dominio único de camélido, y opcionalmente el dominio constante de un anticuerpo de dominio único de camélido.
El anticuerpo de acuerdo con la invención también puede ser un fragmento de anticuerpo, por ejemplo un fragmento de anticuerpo humanizado, seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab’)2, Fab’, dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, y anticuerpos bivalentes.
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo biespecífico o multiespecífico formado a partir de fragmentos de anticuerpo, siendo al menos un fragmento de anticuerpo un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención. Los anticuerpos multiespecíficos son complejos proteicos polivalentes como se describe, por ejemplo, en los documentos EP 2050764 A1 o US 2005/0003403 A1.
Los anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos de acuerdo con la invención pueden tener especificidad por (a) el epítopo A3-B3 de CEACAM5 humana/de Macaca fascicularis al que está dirigido uno de los anticuerpos denominados MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 y MAb5, y (b) al menos otro antígeno diferente. De acuerdo con una realización, el al menos otro antígeno diferente no es un miembro de la familia de la CEACAM humana o de Macaca fascicularis, y en una realización, no es al menos uno o todos de CEACAM1 humana y de Macaca fascicularis, CEACAM6 humana y de mono, CEACAM7 humana y de Macaca fascicularis, y CEACAM8 humana y de Macaca fascicularis. De acuerdo con otra realización, el al menos otro antígeno diferente puede ser un epítopo en CEACAM5 humana o de Macaca fascicularis distinto de dicho epítopo A3-B3 al que está dirigido uno de los anticuerpos denominados MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 y MAb5.
Dichos anticuerpos pueden producirse por cualquier técnica muy conocida en la técnica. En una realización, dichos anticuerpos se producen por técnicas como se describe posteriormente en el presente documento. Los anticuerpos y fragmentos de éstos de acuerdo con la invención pueden usarse en una forma aislada (por ejemplo, purificada) o estar contenidos en un vector, tal como una membrana o vesícula lipídica (por ejemplo, un liposoma).
Ácidos nucleicos, vectores y células hospedantes recombinantes
Un objeto adicional de la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia que codifica un anticuerpo de la invención como se ha definido anteriormente.
Típicamente, dicho ácido nucleico es una molécula de ADN o ARN, que puede estar incluida en cualquier vector adecuado, tal como un plásmido, cósmido, episoma, cromosoma artificial, fago o un vector viral.
Los términos “vector”, “vector de clonación” y “vector de expresión” significan el vehículo por el que una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen extraño) puede introducirse en una célula hospedante, para transformar el hospedante y promover la expresión (por ejemplo, la transcripción y la traducción) de la secuencia introducida. Así, un objeto adicional de la invención se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico de la invención. Dichos vectores pueden comprender elementos reguladores, tales como un promotor, potenciador, terminador y similares, para causar o dirigir la expresión de dicho polipéptido después de la administración a un sujeto. Los ejemplos de promotores y potenciadores usados en el vector de expresión para una célula animal incluyen el promotor temprano y potenciador de SV40 (Mizukami T. et al. 1987), promotor y potenciador LTR del virus de la leucemia de ratón de Moloney (Kuwana Y et al. 1987), promotor (Mason 10 et al. 1985) y potenciador (Gillies SD et al. 1983) de la cadena de inmunoglobulina H, y similares.
Puede usarse cualquier vector de expresión para células animales, siempre que pueda insertarse y expresarse un gen que codifica la región C del anticuerpo humano. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen pAGE107 (Miyaji H et al. 1990), pAGE103 (Mizukami T et al. 1987), pHSG274 (Brady G et al. 1984), pKCR (O’Hare K et al. 1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H et al. 1990), y similares.
Otros ejemplos de plásmidos incluyen plásmidos replicantes que comprenden un origen de replicación, o plásmidos integrativos, tales como por ejemplo pUC, pcDNA, pBR, y similares.
Otros ejemplos de vector viral incluyen vectores adenovirales, retrovirales, del virus del herpes y de AAV. Dichos virus recombinantes pueden producirse por técnicas conocidas en la técnica, tal como transfectando células empaquetadoras o por transfección transitoria con plásmidos o virus auxiliares. Los ejemplos típicos de células empaquetadoras de virus incluyen células PA317, células PsiCRIP, células GPenv+, células 293, etc. Los protocolos detallados para producir dichos virus recombinantes defectuosos en la replicación pueden encontrarse, por ejemplo, en los documentos WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 y WO 94/19478.
Un objeto adicional de la presente invención se refiere a una célula que se ha transfectado, infectado o transformado mediante un ácido nucleico y/o un vector de acuerdo con la invención.
El término “transformación” significa la introducción de un gen, secuencia de ADN o ARN “extraño” (es decir, extrínseco) en una célula hospedante, de manera que la célula hospedante expresará la secuencia o gen introducido para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada por la secuencia o gen introducido. Una célula hospedante que recibe y expresa ADN o ARN introducido se ha “transformado”.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden usarse para producir un anticuerpo recombinante de la invención en un sistema de expresión adecuado. La expresión “sistema de expresión” significa una célula hospedante y vector compatible en condiciones adecuadas, por ejemplo para la expresión de una proteína codificada por ADN extraño portado por el vector e introducido en la célula hospedante.
Los sistemas de expresión habituales incluyen células hospedantes de E. coli y vectores plasmídicos, células hospedantes de insecto y vectores de baculovirus, y células hospedantes y vectores de mamíferos. Otros ejemplos de células hospedantes incluyen, sin limitación, células procariotas (tales como bacterias) y células eucariotas (tales como células de levadura, células de mamífero, células de insecto, células de planta, etc.). Los ejemplos específicos incluyen E. coli, levaduras Kluyveromyces o Saccharomyces, líneas celulares de mamíferos (por ejemplo, células Vero, células CHO, células 3T3, células COS, etc.), así como cultivos celulares de mamíferos primarios o establecidos (por ejemplo, producidos a partir de linfoblastos, fibroblastos, células embrionarias, células epiteliales, células nerviosas, adipocitos, etc.). Los ejemplos también incluyen célula de ratón SP2/0-Ag14 (ATCC CRL1581), célula de ratón P3X63-Ag8,653 (ATCC CRL1580), célula CHO en la que un gen de dihidrofolato reductasa (referido de aquí en adelante en el presente documento como “gen DHFR”) es defectuoso (Urlaub G et al; 1980), célula de rata YB2/3HL.P2.G11,16Ag,20 (ATCC CRL1662, referida de aquí en adelante en el presente documento como “célula YB2/0”), y similares. En una realización, se usa la célula YB2/0, ya que la actividad de ADCC de los anticuerpos quiméricos o humanizados se potencia cuando se expresan en esta célula.
Para la expresión de un anticuerpo humanizado, el vector de expresión puede ser de un tipo en el que un gen que codifica una cadena pesada de anticuerpo y un gen que codifica una cadena ligera de anticuerpo existan en vectores separados, o de un tipo en el que ambos genes existen en el mismo vector (tipo tándem). Respecto a la facilidad de construcción de un vector de expresión de un anticuerpo humanizado, la facilidad de introducción en células animales, y el equilibrio entre los niveles de expresión de las cadenas H y L del anticuerpo en células animales, el vector de expresión del anticuerpo humanizado es del tipo tándem (Shitara K et al. J Immunol Methods.
1994 Ene. 3; 167(1 -2):271 -8). Los ejemplos de vector de expresión de anticuerpo humanizado de tipo tándem incluyen pKANTEX93 (documento WO 97/10354), pEE18, y similares.
La presente invención también se refiere a un método para producir una célula hospedante recombinante que expresa un anticuerpo de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho método las etapas que consisten en: (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico recombinante o un vector como se ha descrito anteriormente en una célula hospedante competente, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula hospedante recombinante obtenida, y (iii), opcionalmente, seleccionar las células que expresan y/o segregan dicho anticuerpo.
Dichas células hospedantes recombinantes pueden usarse para la producción de anticuerpos de la invención.
Métodos para producir anticuerpos de la invención
Los anticuerpos de la invención pueden producirse por cualquier técnica conocida en la técnica, tal como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, bien sola o en combinación.
Conociendo la secuencia de aminoácidos de la secuencia deseada, un experto en la técnica puede producir fácilmente dichos anticuerpos o cadenas de inmunoglobulina por técnicas estándar para la producción de polipéptidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse usando el método bien conocido de fase sólida usando un aparato de síntesis de péptidos disponible comercialmente (tal como el fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, los anticuerpos y cadenas de inmunoglobulina de la invención pueden sintetizarse por técnicas de ADN recombinante como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, estos fragmentos pueden obtenerse como productos de la expresión de ADN después de la incorporación de secuencias de ADN que codifican el (poli)péptido deseado en vectores de expresión y la introducción de dichos vectores en hospedantes eucariotas o procariotas adecuados que expresarán el polipéptido deseado, a partir de los cuales puede aislarse posteriormente usando técnicas muy conocidas.
La invención se refiere además a un método para producir un anticuerpo de la invención, método que comprende las etapas que consisten en: (i) cultivar una célula hospedante transformada de acuerdo con la invención; (ii) expresar dicho anticuerpo o polipéptido; y (iii) recuperar el anticuerpo o polipéptido expresado.
Los anticuerpos de la invención se separan adecuadamente del medio de cultivo por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
En una realización, un anticuerpo quimérico humanizado de la presente invención puede producirse obteniendo secuencias nucleicas que codifican dominios VL y VH humanizados como se ha descrito previamente, construyendo un vector de expresión de anticuerpo quimérico humano insertándolos en un vector de expresión para células animales que tiene los genes que codifican CH de anticuerpo humano y CL de anticuerpo humano, y expresando la secuencia codificante introduciendo el vector de expresión en una célula animal.
Como el dominio CH de un anticuerpo quimérico humano, puede ser cualquier región que pertenezca a las cadenas pesadas de inmunoglobulina humana, sin embargo son adecuadas aquellas de la clase IgG y también puede usarse una cualquiera de las subclases que pertenece a la clase IgG, tales como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Además, como la CL de un anticuerpo quimérico humano, puede ser cualquier región que pertenezca a las cadenas ligeras de inmunoglobulina humana, y pueden usarse aquellas de la clase kappa o de la clase lambda.
Los métodos para producir anticuerpos humanizados o quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y transfección génica que son muy conocidas en la técnica (véase Morrison SL. et al. (1984) y los documentos de patente US 5.202.238; y US 5.204.244).
Los métodos para producir anticuerpos humanizados basados en técnicas convencionales de ADN recombinante y transfección génica son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985). Los anticuerpos pueden humanizarse usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la técnica descrita en la solicitud W02009/032661, injerto de CDR (documento EP 239.400; publicación PCT WO91/09967; Patentes U.S. nos 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), revestimiento o modificación de la superficie (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan EA (1991); Studnicka Gm et al. (1994); Roguska MA. et al. (1994)), e intercambio de cadenas (patente U.S. n° 5.565.332). La tecnología general de ADN recombinante para la preparación de dichos anticuerpos también es conocida (véase la Solicitud de Patente Europea EP 125023 y la Solicitud de Patente Internacional WO 96/02576).
El Fab de la presente invención puede obtenerse tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con CEACAM5 con una proteasa, tal como papaína. También, el Fab puede producirse insertando secuencias de ADN que codifican ambas cadenas del Fab del anticuerpo en un vector para la expresión procariota, o para la expresión eucariota, e introduciendo el vector en células procariotas o eucariotas (según sea apropiado) para expresar el Fab. El F(ab’)2 de la presente invención puede obtenerse tratando un anticuerpo que reacciona específicamente con CEACAM5 con una proteasa, pepsina. También, el F(ab’)2 puede producirse uniendo Fab’ descrito anteriormente mediante un enlace tioéter o un enlace disulfuro.
El Fab’ de la presente invención puede obtenerse tratando F(ab’)2 que reacciona específicamente con CEACAM5 con un agente reductor, tal como ditiotreitol. También, el Fab’ puede producirse insertando secuencias de ADN que codifican cadenas Fab’ del anticuerpo en un vector para la expresión procariota, o un vector para la expresión eucariota, e introduciendo el vector en células procariotas o eucariotas (según sea apropiado) para llevar a cabo su expresión.
El scFv de la presente invención puede producirse tomando secuencias de las CDR o dominios VH y VL como se ha descrito previamente, construyendo un ADN que codifica un fragmento scFv, insertando el ADN en un vector de expresión procariota o eucariota, e introduciendo entonces el vector de expresión en células procariotas o eucariotas (según sea apropiado) para expresar el scFv. Para generar un fragmento scFv humanizado, puede usarse una tecnología muy conocida denominada injerto de CDR, que implica seleccionar las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de acuerdo con la invención, e injertarlas en un marco de fragmento scFv humano de estructura tridimensional conocida (véase, por ejemplo, los documentos WO 98/45322; WO 87/02671; US 5.859.205; US 5.585.089; US 4.816.567; EP 0173494).
Modificación de los anticuerpos de la invención
Se contemplan la o las modificaciones de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se sabe que cuando se produce un anticuerpo humanizado injertando simplemente solo CDR en VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en FR de VH y VL de un anticuerpo humano, la actividad de unión a antígeno puede reducirse en comparación con la del anticuerpo original derivado de un animal no humano. Se considera que varios restos de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo no humano, no solo en CDR sino también en FR, pueden estar asociados directa o indirectamente con la actividad de unión a antígeno. Por lo tanto, la sustitución de estos restos de aminoácidos por diferentes restos de aminoácidos derivados de FR de VH y VL del anticuerpo humano reduciría la actividad de unión. Con el fin de resolver este problema, en los anticuerpos humanos injertados con CDR no humanas, se han hecho intentos para identificar, entre las secuencias de aminoácidos de FR de VH y VL de anticuerpos humanos, un resto de aminoácido que está directamente asociado con la unión del anticuerpo, o que interacciona con un resto de aminoácido de una CDR, o que mantiene la estructura tridimensional del anticuerpo y que está directamente asociado con la unión al antígeno. La actividad de unión a antígeno reducida podría incrementarse reemplazando los aminoácidos identificados por restos de aminoácidos del anticuerpo original derivado de un animal no humano.
En una realización de la presente invención, las seis CDR de un anticuerpo murino de la invención y tres aminoácidos de su marco se injertaron en un marco humano, dando como resultado un anticuerpo humanizado (MAb2_VLg5VHg2) que tiene una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:74 y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:75, que mantuvo las características de unión a CEACAM5 humano y de macaco.
Pueden hacerse modificaciones y cambios en la estructura de los anticuerpos de la presente invención, y en las secuencias de ADN que los codifican, e incluso así dar como resultado un anticuerpo o polipéptido funcional con características deseables.
Al realizar los cambios en las secuencias de aminoácidos del polipéptido, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos a la hora de conferir función biológica interactiva en una proteína se entiende generalmente en la técnica. Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático tomando como base sus características de hidrofobia y de carga; éstos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (­ 1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (­ 4,5).
Un objeto adicional de la presente invención también engloba las variantes conservativas de la función de los polipéptidos de la presente invención.
Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de la actividad. Como la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína definen su actividad funcional biológica, pueden hacerse determinadas sustituciones de aminoácidos en una secuencia proteica, y por supuesto en su secuencia de codificante del ADN, a la vez que no obstante se obtiene una proteína con propiedades similares. Se contempla así que pueden hacerse varios cambios en las secuencias de los anticuerpos de la invención, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos polipéptidos, sin pérdida apreciable de su actividad biológica.
Se sabe en la técnica que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y aun así dar como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, aun así obtener una proteína biológica funcionalmente equivalente. También es posible usar tecnologías bien establecidas, tales como estrategias de escaneo de alanina, para identificar, en un anticuerpo o polipéptido de la invención, todos los aminoácidos que pueden sustituirse sin pérdida significativa de unión al antígeno. Dichos restos pueden calificarse como neutros, ya que no están implicados en la unión al antígeno ni en mantener la estructura del anticuerpo. Una o más de estas posiciones neutras puede sustituirse por alanina o por otro aminoácido sin cambiar las características principales del anticuerpo o polipéptido de la invención.
Esto se ilustró en la presente invención por una estrategia de escaneo de alanina hecho en las CDR de MAb2K52R, que muestra que varias posiciones de estas CDR aparecen como neutras, ya que una alanina pudo sustituirse de hecho sin efecto significativo sobre la unión a CEACAM5 humana y de macaco. Por lo tanto se espera que las variantes de anticuerpo que resultan de dichas sustituciones neutras permanezcan funcionalmente idénticas al anticuerpo parental. En el ejemplo 6,4 proporcionado, se hicieron sustituciones en una variante humanizada de MAb2, pero es predecible que las mismas variaciones también mantendrían la función biológica cuando se introduzcan en cualquier variante de MAb2, Mab4 o Mab5, ya que estos anticuerpos relacionados portan todos el mismo conjunto de 6 CDR o unas muy relacionadas. Las posiciones neutras pueden definirse como restos 27, 28, 29, 31, 51, 52, 89, 90, 93, 94, 96, 97 en las secuencias de VL de esta familia de anticuerpos (SEQ ID NO:34 o SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:40 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:23 o SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:55 o SEQ ID NO:75), y restos 26 a 31, 51 a 58, 97, 103, 104, 107, 109 en las secuencias de VH de esta familia de anticuerpos (SEQ iD NO:33 o SEQ ID NO:37 o SEQ ID NO:39 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:51 o SEQ ID NO:74).
Las posiciones neutras pueden observarse como las posiciones en las que cualquier sustitución de aminoácidos podría incorporarse en las CDR de Mab2, Mab4 o Mab5. De hecho, en el principio del escaneo de alanina, la alanina se elige porque este resto no porta características estructurales o químicas específicas. Se admite generalmente que si una alanina puede sustituirse por un aminoácido específico sin cambiar las propiedades de una proteína, es probable que muchas otras, si no todas las sustituciones de aminoácidos también sean neutras. En el caso opuesto en el que la alanina es el aminoácido de tipo salvaje, si puede mostrarse que una sustitución específica es neutra, es probable que otras sustituciones también serían neutras.
En el ejemplo 6,4 proporcionado, también se han identificado cuatro posiciones en las CDR de Mab2, Mab4 o Mab5, que no se encontraron neutras en el contexto del escaneo de alanina, pero en las que un tipo conservativo de sustituciones de aminoácidos tiene un efecto neutro (restos 30 y 92 en las secuencias de VL y restos 98 y 100 en las secuencias de VH de esta familia de anticuerpos).
También se espera que dos o más mutaciones neutras en diferentes posiciones en cualquiera o en las dos secuencias de cadena de los anticuerpos, cuando se combinan, dieran como resultado habitualmente un anticuerpo que mantiene esencialmente las actividades funcionales del anticuerpo parental. Esto se ha ilustrado, por ejemplo, con las sustituciones combinadas LC_T51A y LC_T94A,, VL_S31a y VH_G54Y, o VL_T53I y VH_s 53A en MAb2_VLg5VHg2.
Como se ha indicado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente, por lo tanto, en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ejemplares que tienen en cuenta cualquiera de las características anteriores son muy conocidas para los expertos en la técnica, e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
También puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención respecto a la función efectora, por ejemplo para potenciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede conseguirse introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, pueden introducirse resto(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor capacidad para exterminar células mediada por complemento y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Caron PC. et al. 1992; y Shopes B. 1992).
Otro tipo de modificación de aminoácidos del anticuerpo de la invención puede ser útil para alterar el patrón de glicosilación original del anticuerpo, es decir, eliminando uno o más restos de hidratos de carbono encontrados en el anticuerpo, y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La presencia de las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina, y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, crea un sitio de glicosilación potencial. La adición o supresión de sitios de glicosilación en el anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación enlazada mediante N). Otro tipo de modificación implica la eliminación de secuencias identificadas, bien in silico o experimentalmente, como que dan como resultado potencialmente productos de degradación o heterogeneidad de las preparaciones de anticuerpo. Como ejemplos, la desamidación de los restos de asparagina y glutamina puede ocurrir dependiendo de factores tales como pH y exposición en la superficie. Los restos de asparagina son particularmente susceptibles a la desamidación, principalmente cuando están presentes en la secuencia Asn-Gly, y en menor medida en otras secuencias de dipéptido tales como Asn-Ala. Cuando está presente dicho sitio de desamidación, en particular Asn-Gly, en un anticuerpo o polipéptido de la invención, puede ser por lo tanto deseable eliminar el sitio, típicamente por sustitución conservativa para eliminar uno de los restos implicados. También se pretende que dichas sustituciones en una secuencia para eliminar uno o más de los restos implicados estén englobadas por la presente invención. Otro tipo de modificación covalente implica el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción del anticuerpo en una célula hospedante que tenga capacidades de glicosilación para glicosilación enlazada mediante N o mediante O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el azúcar o azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) restos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Por ejemplo, dichos métodos se describen en el documento WO 87/05330.
La eliminación de cualquier resto de hidratos de carbono presente en el anticuerpo puede realizarse química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición del anticuerpo al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayor parte o de todos los azúcares excepto el azúcar enlazante (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras deja el anticuerpo intacto. La desglicosilación química se describe por Sojahr H. et al. (1987) y por Edge, AS. et al. (1981). La escisión enzimática de restos de hidratos de carbono en anticuerpos puede conseguirse por el uso de una variedad de endoE- y exoglicosidasas, como se describe por Thotakura, NR. et al. (1987).
Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende el enlace del anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes US nos 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.
Inmunoconjugados
La presente invención también incluye conjugados citotóxicos, o inmunoconjugados, o conjugados anticuerpofármaco, o conjugados. Tal y como se usa en el presente documento, todos estos términos tienen el mismo significado y son intercambiables.
Los anticuerpos murinos, MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, y MAb5, se han conjugado a un maitansinoide (DM4) mediante un enlazador SPDB (piridilditiobutirato de N-succinimidilo). Se encontró que los conjugados de anticuerpofármaco (ADC) resultantes tenían actividad citotóxica en células de cáncer gástrico humano MKN45, con valores de CI50 £ 1 nM.
De manera similar, se prepararon conjugados de anticuerpo-SPDB-DM4 tomando como base una forma quimérica de cada uno de MAb1, MAb2, MAb4, y MAb5. Los chMAb1-SPDB-DM4, chMAb2-SPDB-DM4, chMAb3-SPDB-DM4, y chMAb4-SPDB-DM4 resultantes se evaluaron a dos dosis frente a tumores medibles de colon primario CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra SCID. El análisis de los cambios en el volumen tumoral para cada tratado y control y el % de la regresión tumoral indicaron que chMAb2-SPDB-DM4, chMAb4-SPDB-DM4, y chMAb5-SPDB-DM4 eran altamente activos, al menos a la máxima dosis ensayada, y que chMAb2-SPDB-DM4 era activo a ambas dosis ensayadas. De forma importante, se obtuvieron porcentajes de regresión tumoral hasta 82%.
Los conjugados de anticuerpo-SPDB-DM4 también se prepararon usando las variantes humanizadas de MAb2 (huMAb2-1 -SPDB-DM4, huMAb2-2-SPDB-DM4, y huMAb2-3-SPDB-DM4). ADC, que incluyen las variantes quiméricas (chMAb2-SPDB-DM4) o humanizadas de MAb2, se compararon con un anticuerpo-SPDB-DM4 irrelevante en busca de actividad citotóxica sobre células MKN45. Todas las variantes quiméricas y humanizadas de los ADC de MAb2 presentaron valores de CI50 £ 1 nM, es decir, valores de CI50 53 a 35 veces menores que la actividad citotóxica medida del conjugado de DM4 irrelevante, indicando de esta manera actividades citotóxicas mediadas por CEACAM5 de los conjugados anti-CEACAM5.
La actividad anti-tumoral de huMAb2-3-SPDB-DM4 y huMAb2-4-SPDB-DM4 se evaluó y se comparó con la de chMAb2-SPDB-DM4 frente a tumores medibles de colon primario CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra atímicos CD-1. Todos los conjugados fueron altamente activos a la máxima dosis ensayada (10 mg/kg).
La actividad anti-tumoral de huMAb2-3-SPDB-DM4 y huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 se evaluó adicionalmente frente a tumores de colon primarios medibles CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra SCID. huMAb2-3-SPDB-DM4 fue activo a 5 y 2,5 mg/kg, huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 fue muy activo a 5 mg/kg y activo a 2,5 mg/kg.
La actividad anti-tumoral de huMAb2-3-SPDB-DM4 se evaluó adicionalmente frente a tumores de pulmón primarios medibles LUN-NIC-0014 implantados s.c. en ratones hembra SCID, y se encontró que era muy activo a 10 y 5 mg/kg.
Cada conjugado de DM4 incluyó un número medio de moléculas de DM4 (o “relación fármaco a anticuerpo” o “DAR”) que variaba de 2 a 5.
De acuerdo con esto, la invención se refiere a “inmunoconjugados” que comprenden un anticuerpo de la invención enlazado o conjugado a al menos un agente inhibidor del crecimiento, tal como un agente citotóxico o un isótopo radioactivo.
Un “agente inhibidor del crecimiento”, o “agente anti-proliferativo”, que puede usarse indistintamente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula tumoral, bien in vitro o in vivo.
El término “agente citotóxico”, tal y como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o causa la destrucción de las células. Se pretende que la expresión “agente citotóxico” incluya agentes quimioterapéuticos, enzimas, antibióticos y toxinas tales como toxinas que son moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, de planta o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de éstas, y los diversos agentes antitumorales o anticancerígenos descritos más adelante. En algunas realizaciones, el agente citotóxico es un taxoide, vincas, un maitansinoide o análogo de maitansinoide tal como DM1 o DM4, un fármaco pequeño, un derivado de tomaimicina o pirrolobenzodiazepina, un derivado de criptoficina, un derivado de leptomicina, un análogo de auristatina o dolastatina, un profármaco, inhibidores de la topoisomerasa II, un agente alquilante de ADN, un agente anti-tubulina, un CC-1065 o análogo de CC-1065.
Tal y como se usa en el presente documento, “maitansinoides” indica maitansinoides y análogos de maitansinoide. Los maitansinoides son fármacos que inhiben la formación de microtúbulos y que son altamente tóxicos para las células de los mamíferos.
Los ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen maitansinol y análogos de maitansinol.
Los ejemplos de análogos de maitansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado, y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Dichos maitansinoides adecuados están descritos en las patentes U.S. nos 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; y 5.846.545.
Los ejemplos específicos de análogos de maitansinol adecuados que tienen un anillo aromático modificado incluyen:
(1) C-19-descloro (patente U.S. n° 4.256.746) (preparado por reducción con LAH de ansamitocina P2);
(2) C-20-hidroxi (o C-20-desmetilo) /-C-19-descloro (patente U.S. nos 4.361.650 y 4.307.016) (preparado por desmetilación utilizando Streptomyces o Actinomyces o descloración utilizando LAH); y
(3) C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), /-descloro (patente U.S. n° 4.294.757) (preparado por acilación utilizando cloruros de acilo).
Los ejemplos específicos de análogos de maitansinol adecuados que tienen modificaciones en otras posiciones incluyen:
(1) C-9-SH (patente U.S. n° 4.424.219) (preparado por la reacción de maitansinol con H2S o P2S5);
(2) C-14-alcoximetilo (desmetoxi/CH2OR) (patente U.S. n° 4.331.598);
(3) C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (patente U.S. n° 4.450.254) (preparado de Nocardia);
(4) C-15-hidroxi/aciloxi (patente U.S. n° 4.364.866) (preparado mediante la conversión de maitansinol por Streptomyces);
(5) C-15-metoxi (patente U.S. nos 4.313.946 y 4.315.929) (aislado de Trewia nudiflora);
(6) C-18-N-desmetilo (patente U.S. nos 4.362.663 y 4.322.348) (preparado mediante la desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y
(7) 4.5-desoxi (patente U.S. n° 4.371.533) (preparado mediante la reducción de maitansinol por tricloruro de titanio/LAH).
En una realización de la invención, los conjugados citotóxicos de la presente invención utilizan el maitansinoide que contiene tiol (DM1), denominado formalmente W2’-desacetil-W2’-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, como el agente citotóxico. DM1 se representa por la siguiente fórmula estructural (I):
Figure imgf000024_0001
En otra realización, los conjugados citotóxicos de la presente invención utilizan el maitansinoide DM4 que contiene tiol, denominado formalmente W2’-desacetil-W2’-(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina, como el agente citotóxico. DM4 se representa por la siguiente fórmula estructural (II):
Figure imgf000025_0001
En realizaciones adicionales de la invención, se pueden utilizar otras maitansinas, incluyendo maitansinoides que contienen tiol y disulfuro que presentan una sustitución con mono- o dialquilo en el átomo de carbono que lleva el átomo de azufre. Éstos incluyen un maitansinoide que tiene, en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi, o C-20 desmetilo, una cadena lateral de aminoácido acilada con un grupo acilo que porta un grupo sulfhidrilo impedido, en el que el átomo de carbono del grupo acilo que porta la funcionalidad tiol tiene uno o dos sustituyentes, siendo dichos sustituyentes CH3 , C2H5 , alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 reactivos, y cualquier agregado que pueda estar presente en la disolución.
Los ejemplos de estos agentes citotóxicos y de los métodos de conjugación se proporcionan además en la solicitud WO 2008/010101, que se incorpora como referencia.
Se pretende que la expresión “isótopo radioactivo” incluya isótopos radioactivos adecuados para tratar cáncer, tales como At211, Bi212, Er169, I131, I125, Y90, In111, P32, Re186, Re188, Sm153, Sr89, e isótopos radioactivos de Lu. Dichos radioisótopos emiten en general principalmente radiación beta. En una realización, el isótopo radioactivo es un isótopo emisor alfa, más precisamente Torio 227 que emite radiación alfa. Los inmunoconjugados de acuerdo con la presente invención pueden prepararse como se describe en la solicitud WO 2004/091668.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención están unidos covalentemente, directamente o a través de un enlazador escindible o no escindible, a al menos un agente inhibidor del crecimiento.
“Enlazador”, tal y como se usa en el presente documento, significa un resto químico que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que une covalentemente un polipéptido a un resto de fármaco.
Los conjugados pueden prepararse mediante métodos in vitro. Con el fin de enlazar un fármaco o profármaco al anticuerpo, se utiliza un grupo enlazador. En la técnica son bien conocidos los grupos enlazadores adecuados, e incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos foto-lábiles, grupos lábiles a peptidasas y grupos lábiles a esterasas. La conjugación de un anticuerpo de la invención con agentes citotóxicos o agentes inhibidores del crecimiento puede hacerse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, que incluyen, pero no se limitan a, piridilditiobutirato de N-succinimidilo (SPDB), éster 4-[(5-nitro-2-piridinil)ditio]-2,5-dioxo-1 -pirrolidinílico del ácido butanoico (nitro-SPDB), ácido 4-(piridin-2-ildisulfanil)-2-sulfo-butírico (sulfo-SPDB), (2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), (N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(pdiazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos fluorados bisactivos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil metildietilen triaminopentaácetico marcado en carbono (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación de radionucleótido al anticuerpo (documento WO 94/11026).
El enlazador puede ser un “enlazador escindible” que facilita la liberación del agente citotóxico o agente inhibidor del crecimiento en la célula. Por ejemplo, puede usarse un enlazador lábil a ácidos, un enlazador sensible a peptidasas, un enlazador lábil a esterasas, un enlazador fotolábil o un enlazador que contiene disulfuro (véase, por ejemplo, la patente U.S. n° 5,208,020). El enlazador también puede ser un “enlazador no escindible” (por ejemplo, enlazador de SMCC) que podría dar lugar a una mejor tolerancia en algunos casos.
Alternativamente, puede prepararse, por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo de la invención y un polipéptido citotóxico o inhibidor del crecimiento. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en Terapia con Profármacos Dirigida por Enzimas conjugando el polipéptido a una enzima que activa un profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidílico, véase el documento WO 81/01145) en un fármaco anticanceroso activo (véanse, por ejemplo, el documento WO 88/07378 y la patente U.S. n° 4.975.278). El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco de una manera tal que lo convierte en su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticanceroso 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptido en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácido; enzimas que esciden hidratos de carbono tales como O-galactosidasa y neuraminidasa, útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; P-lactamasa, útil para convertir fármacos derivatizados con P-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos amínicos con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Las enzimas se pueden unir covalentemente a los polipéptidos de la invención por técnicas muy conocidas en la técnica tales como el uso de los reactivos de reticulación heterobifuncionales discutidos anteriormente.
De acuerdo con una realización, en el conjugado de la invención, el agente inhibidor del crecimiento es un maitansinoide; en una realización, DM1 o DM4.
En dicho conjugado, el anticuerpo se conjuga a dicho al menos un agente inhibidor del crecimiento por un grupo enlazador. En una realización, dicho grupo enlazador es un enlazador escindible o no escindible, tal como SPDB, sulfo-SPDB, o SMCC.
El conjugado se puede seleccionar del grupo que consiste en:
i) un conjugado de anticuerpo-SPDB-DM4 de fórmula (III)
Figure imgf000026_0001
ii) un conjugado de anticuerpo-sulfo-SPDB-DM4 de fórmula (IV)
Figure imgf000027_0001
iii) un conjugado de anticuerpo-SMCC-DMI de fórmula (V)
Figure imgf000027_0002
En dicha realización, el anticuerpo incluido en el conjugado se selecciona del grupo que consiste en:
i) un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:51 y una cadena ligera de secuencia SEQ ID nO:17,
ii) un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:5 y una cadena ligera de secuencia SEQ ID nO:23,
iii) un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:5 y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:29, y
iv) un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:51 y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:55.
En una realización, el conjugado es un conjugado de fórmula (III), (IV) o (V) como se ha definido anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de secuencia SEQ ID NO:5 y una cadena ligera de secuencia SEQ ID NO:29.
En general, el conjugado se puede obtener por un procedimiento que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una disolución acuosa opcionalmente amortiguada de un agente de unión a células (por ejemplo, un anticuerpo de acuerdo con la invención) con disoluciones de un enlazador y un compuesto citotóxico;
(ii) después, separar opcionalmente el conjugado que se ha formado en (i) del agente de unión a células que no ha reaccionado.
La disolución acuosa del agente de unión a células puede amortiguarse con amortiguadores tales como, por ejemplo, fosfato de potasio, acetato, citrato o ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N’-2-etanosulfónico (amortiguador de Hepes). El amortiguador depende de la naturaleza del agente de unión a células. El compuesto citotóxico está en disolución en un disolvente orgánico polar, por ejemplo sulfóxido de dimetilo (DMSO) o dimetilacetamida (DMA).
La temperatura de reacción normalmente está comprendida entre 20 y 40°C. El tiempo de reacción puede variar de 1 a 24 horas. La reacción entre el agente de unión a células y el agente citotóxico se puede monitorizar mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) con un detector refractométrico y/o UV. Si el rendimiento del conjugado es demasiado bajo, se puede ampliar el tiempo de reacción.
El experto en la técnica puede usar varios métodos de cromatografía diferentes para realizar la separación de la etapa (ii): el conjugado se puede purificar por ejemplo mediante SEC, cromatografía de adsorción (tal como cromatografía de intercambio iónico, IEC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de afinidad, cromatografía de soporte mixto tal como cromatografía de hidroxiapatita o cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). También puede usarse la purificación por diálisis o diafiltración.
Tal y como se usa en el presente documento, el término “agregados” significa las asociaciones que se pueden formar entre dos o más agentes de unión a células, estando dichos agentes modificados o no por conjugación. Los agregados se pueden formar bajo la influencia de un gran número de parámetros, tales como una elevada concentración de agentes de unión a células en la disolución, el pH de la disolución, fuerzas de cizallamiento elevadas, el número de dímeros enlazados y su carácter hidrófobo, la temperatura (véase Wang y Gosh, 2008, J. Membrane Sci., 318: 311-316, y referencias citadas en dicho documento); nótese que la influencia relativa de algunos de estos parámetros no está claramente establecida. En el caso de proteínas y anticuerpos, el experto en la técnica se referirá a Cromwell et al. (2006, AAPS Jounal, 8(3): E572-E579). El contenido de agregados se puede determinar con técnicas bien conocidas por el experto, tales como SEC (véase Walter et al., 1993, Anal. Biochem., 212(2): 469-480).
Después de la etapa (i) o (ii), la disolución que contiene el conjugado puede someterse a una etapa adicional (iii) de cromatografía, ultrafiltración y/o diafiltración.
El conjugado se recupera al final de estas etapas en una disolución acuosa.
De acuerdo con una realización, el conjugado de acuerdo con la invención se caracteriza por una “relación fármaco a anticuerpo” (o “DAR”) que varía de 1 a 10, por ejemplo de 2 a 5, en particular de 3 a 4. Este es generalmente el caso de conjugados que incluyen moléculas de maitansinoide.
Este número DAR puede variar con la naturaleza del anticuerpo y del fármaco (es decir, el agente inhibidor del crecimiento) usado, junto con las condiciones experimentales usadas para la conjugación (como la relación agente inhibidor del crecimiento/anticuerpo, el tiempo de reacción, la naturaleza del disolvente y del codisolvente, si se usa). Así, el contacto entre el anticuerpo y el agente inhibidor del crecimiento da lugar a una mezcla que comprende varios conjugados que difieren entre sí por diferentes relaciones fármaco a anticuerpo; opcionalmente el anticuerpo desnudo; opcionalmente agregados. La DAR que se determina es así un valor medio.
Un método que puede usarse para determinar la DAR consiste en medir espectrofotométricamente la relación de la absorbancia de una disolución de conjugado sustancialmente puro a I d y a 280 nm. 280 nm es una longitud de onda usada generalmente para medir concentración de proteínas, tal como concentración de anticuerpo. La longitud de onda I d se selecciona para permitir discriminar el fármaco del anticuerpo, es decir, como ya conoce el experto, I d es una longitud de onda a la que el fármaco tiene una absorbancia alta y I d está lo suficientemente alejada de 280 nm como para evitar una superposición sustancial en los picos de absorbancia del fármaco y el anticuerpo. I d puede seleccionarse para ser 252 nm en el caso de moléculas de maitansinoide. Un método para calcular DAR puede obtenerse de Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science:
Las absorbancias para el conjugado a I d (Ai d ) y a 280 nm (A280) se miden o bien sobre el pico monomérico del análisis por cromatografía de exclusión de tamaños (SEC) (que permite calcular el parámetro “DAR(SEC)”) o bien usando un aparato espectrofotométrico clásico (que permite calcular el parámetro “DAR(UV)”). Las absorbancias se pueden expresar como se indica a continuación:
A ad - (Cd x sdad) (Ca x Saad)
en las que:
• Cd y Ca son respectivamente las concentraciones en la disolución del fármaco y del anticuerpo
• edid y eD280 son respectivamente los coeficientes molares de extinción del fármaco a I d y 280 nm • eaid y EA280 son respectivamente los coeficientes molares de extinción del anticuerpo a I d y 280 nm. La resolución de estas dos ecuaciones con dos desconocidos conduce a las ecuaciones siguientes:
Cd = [(SA280 X Aad) - (SAAD x A 280) ] / [(SDAD x Sa 28o) - (SAAD X Sd28o)]
Figure imgf000029_0001
La DAR promedio se calcula a partir de la relación de la concentración de fármaco a la del anticuerpo: DAR = Cd/Ca . Composiciones farmacéuticas
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas.
Así, otro objeto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un inmunoconjugado de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención también se refiere a un polipéptido o un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, para uso como un medicamento.
“Farmacéuticamente” o “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción desfavorable cuando se administra a un mamífero, especialmente un ser humano, según sea apropiado. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a un material de relleno sólido, semi-sólido o líquido, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar no tóxico de cualquier tipo.
Tal y como se usa en el presente documento, “vehículos farmacéuticamente aceptables” incluyen todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, y similares, que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen uno o más de agua, aminoácidos, disolución salina, disolución salina amortiguada con fosfato, amortiguador de fosfato, acetato, citrato, succinato; aminoácidos y derivados tales como histidina, arginina, glicina, prolina, glicilglicina; sales inorgánicas de NaCl, cloruro de calcio; azúcares o polialcoholes tales como dextrosa, glicerol, etanol, sacarosa, trehalosa, manitol; tensioactivos tales como Polisorbato 80, Polisorbato 20, poloxámero 188; y similares, así como combinación de éstos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, polialcoholes o cloruro de sodio en la composición, y la formulación también puede contener un antioxidante tal como triptamina y un agente estabilizador tal como Tween 20.
La forma de las composiciones farmacéuticas, la ruta de administración, la dosificación y el régimen dependen naturalmente de la afección que se va a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, peso y sexo del paciente, etc. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse para administración tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraocular, y similares.
En una realización, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos que son farmacéuticamente aceptables para una formulación que puede ser inyectada. Éstas pueden ser disoluciones salinas isotónicas, estériles (fosfato de monosodio o de disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, y similares, o mezclas de estas sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas, que después de la adición, dependiendo del caso, de agua esterilizada o de disolución salina fisiológica, permiten la constitución de disoluciones inyectables.
La composición farmacéutica puede administrarse mediante dispositivos de combinación de fármacos.
Las dosis usadas para la administración pueden adaptarse como una función de varios parámetros, y por ejemplo como una función del modo de administración usado, de la patología relevante, o alternativamente de la duración deseada del tratamiento.
Para preparar composiciones farmacéuticas, puede disolverse o dispersarse una cantidad eficaz del anticuerpo o inmunoconjugado de la invención en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones estériles inyectables. En todos los casos, la forma debe ser estéril e inyectable con el dispositivo o sistema apropiado para el suministro sin degradación. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe proteger frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Las disoluciones de los compuestos activos como una base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y sus mezclas y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estos preparados contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Un polipéptido, anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede formularse en una composición en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y las que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar a partir de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, glicina, histidina, procaína, y similares.
El vehículo también puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), sus mezclas adecuadas, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión, y usando tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser causada por el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.
Las disoluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con cualquiera de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado en vacío y liofilización, que rinden un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolución previamente esterilizada por filtración de éstos.
También se contempla la preparación de disoluciones más concentradas o altamente concentradas para inyección directa, en las que se considera el uso de DMSO como disolvente para dar como resultado una penetración extremadamente rápida, administrando altas concentraciones de los agentes activos en una pequeña área tumoral. Al formularlas, las disoluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tal como el tipo de disoluciones inyectables descrito anteriormente, pero también pueden emplearse cápsulas de liberación de fármaco y similares.
Para la administración parenteral en una disolución acuosa, por ejemplo, la disolución debe amortiguarse adecuadamente si es necesario, y el diluyente líquido debe volverse isotónico en primer lugar con disolución salina o glucosa suficiente. Estas disoluciones acuosas son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos para los expertos en la técnica a la vista de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de disolución isotónica de NaCl, y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión (véase, por ejemplo, “Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente ocurrirá alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se está tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.
El anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede formularse en una mezcla terapéutica para comprender aproximadamente 0,01 a 100 miligramos, por dosis aproximadamente.
Además del anticuerpo o inmunoconjugado formulado para administración parenteral, tal como inyección intravenosa o intramuscular, otras formas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros sólidos para administración oral; cápsulas de liberación temporal; y cualquier otra forma usada actualmente.
En determinadas realizaciones, se contempla el uso de liposomas y/o nanopartículas para la introducción de polipéptidos en células hospedantes. La formación y uso de liposomas y/o nanopartículas son conocidos para los expertos en la técnica.
Las nanocápsulas pueden atrapar generalmente compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar efectos secundarios debidos a sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (con un tamaño de aproximadamente 0,1 pm) se diseñan generalmente usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Las nanopartículas biodegradables de policianoacrilato de alquilo, o las nanopartículas biodegradables de polilactida o polilactida-co-glicolida que cumplen estos requisitos se contemplan para uso en la presente invención, y dichas partículas pueden prepararse fácilmente.
Los liposomas están formados por fosfolípidos que están dispersados en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas con bicapa multilaminares concéntricas (también denominadas vesículas multilaminares (MLV)). Las MLV tienen generalmente diámetros de 25 nm a 4 pm. La sonicación de las MLV da como resultado la formación de vesículas unilaminares pequeñas (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 Á, que contienen una disolución acuosa en el núcleo. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes.
Métodos terapéuticos y usos
Los inventores han mostrado que los cinco anticuerpos que han producido son capaces de internalizar el complejo de CEACAM5-anticuerpo después de la unión. Además, han mostrado que estos anticuerpos, combinados con un maitansinoide citotóxico (DM4), inducen actividad citotóxica en células tumorales humanas MKN45 in vitro. También han mostrado que estos inmunoconjugados inducen una actividad anti-tumoral importante in vivo en un modelo murino de xenoinjertos de tumor de colon primario humano derivado de un paciente, cuando se usan a una dosis de 5 mg/kg y 2,5 mg/kg, con una única inyección en el día 14 después del implante del tumor.
Así, los polipéptidos, anticuerpos, inmunoconjugados o composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser útiles para tratar cáncer.
El cáncer que se va a tratar con anticuerpos, inmunoconjugados o composiciones farmacéuticas de la invención es un cáncer que expresa CEACAM5, en particular que sobreexpresa CEACAM5 comparado con células normales (es decir, no tumorales) del mismo origen tisular. La expresión de CEACAM5 por las células cancerosas puede ensayarse fácilmente, por ejemplo, usando un anticuerpo de acuerdo con la invención, como se describe en la sección siguiente “Usos diagnósticos”, y en particular por un método inmunohistoquímico, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 8.
En una realización, el cáncer puede ser un cáncer colorrectal, de estómago, de pulmón, de cuello uterino, de páncreas, de esófago, de ovario, de tiroides, de vejiga, de endometrio, de mama, de hígado (por ejemplo colangiocarcinoma), de próstata o de piel. El cribado de un panel de tumores humanos por inmunohistoquímica usando un anticuerpo de ratón anti-CEACAM5 humana de acuerdo con la invención mostró de hecho tinción de anticuerpo en estos tipos de cánceres, como se describe con más detalles en el Ejemplo 8.
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden usarse solos o en combinación con cualquier agente inhibidor del crecimiento adecuado.
Los anticuerpos de la invención pueden conjugarse o enlazarse a un agente inhibidor del crecimiento, agente citotóxico o una enzima activadora de profármaco como se ha descrito previamente. Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles de hecho para dirigir dicho agente inhibidor del crecimiento, agente citotóxico o un profármaco a las células cancerosas que expresan o sobreexpresan CEACAM5 en su superficie.
También es bien conocido que los anticuerpos monoclonales terapéuticos pueden dar lugar al agotamiento de células que portan el antígeno reconocido específicamente por el anticuerpo. Este agotamiento puede estar mediado por al menos tres mecanismos: citotoxicidad celular mediada por anticuerpo (ADCC), lisis dependiente de complemento, e inhibición anti-tumoral directa del crecimiento tumoral mediante señales proporcionadas mediante el antígeno al que está dirigido el anticuerpo.
“Citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC” se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la ruta clásica del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento a anticuerpos que están unidos a su antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al. (1997).
“Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos” o “ADCC” se refiere a una forma de citotoxicidad en la que anticuerpos segregados unidos a receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana que porta un antígeno, y posteriormente exterminar a la célula diana. Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente US n° 5.500.362 o 5.821.337.
Así, un objeto de la invención se refiere a un método para tratar un cáncer, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, un anticuerpo, un inmunoconjugado o una composición farmacéutica de la invención.
En el contexto de la invención, el término “tratar” o “tratamiento”, tal y como se usa en el presente documento, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastorno o la afección a la que se aplica tal término, o uno o más síntomas de dicho trastorno o afección. Por la expresión “tratar cáncer”, tal y como se usa en el presente documento, se quiere decir la inhibición del crecimiento de células malignas de un tumor y/o la progresión de metástasis de dicho tumor. Dicho tratamiento también puede dar lugar a la regresión del crecimiento tumoral, es decir, la disminución del tamaño de un tumor medible. En particular, dicho tratamiento da lugar a la regresión completa del tumor o metástasis.
De acuerdo con la invención, el término “paciente” o “paciente que lo necesita” está destinado a un ser humano o mamífero no humano afectado o con probabilidad de estar afectado con un tumor maligno. En particular, dicho paciente puede ser un paciente que se ha determinado que es susceptible a un agente terapéutico dirigido a CEACAM5, en particular a un anticuerpo o inmunoconjugado de acuerdo con la invención, por ejemplo de acuerdo con un método como se describe más adelante aquí.
Por una “cantidad terapéuticamente eficaz” del polipéptido de la invención se quiere decir una cantidad suficiente del polipéptido para tratar dicha patología cancerosa, con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Sin embargo, se entenderá que el uso total diario de los polipéptidos y composiciones de la presente invención lo decidirá el médico que atiende dentro del criterio médico razonable. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo el trastorno que se va a tratar y la gravedad del trastorno; la actividad del polipéptido específico empleado; la composición específica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, vía de administración, y tasa de excreción del polipéptido específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación o al mismo tiempo con el polipéptido específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica el empezar con dosis del compuesto a niveles menores que los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosificación hasta que se consigue el efecto deseado.
Otro objeto de la invención se refiere a un polipéptido, un anticuerpo, un inmunoconjugado o una composición farmacéutica de la invención para uso en el tratamiento de un tumor maligno.
El polipéptido, anticuerpo, inmunoconjugado o composición farmacéutica puede usarse para inhibir la progresión de metástasis de un tumor maligno.
Los polipéptidos de la invención pueden usarse en combinación con cualquier otra estrategia terapéutica para tratar un tumor maligno (por ejemplo, terapia adyuvante), y/o para reducir el crecimiento del tumor metastásico.
La eficacia del tratamiento con un anticuerpo o inmunoconjugado de acuerdo con la invención puede ensayarse fácilmente in vivo, por ejemplo en un modelo de ratón de cáncer, y midiendo, por ejemplo, cambios en el volumen tumoral entre los grupos tratado y de control, % de regresión tumoral, regresión parcial y/o regresión completa como se define en el Ejemplo 5.3.
Usos diagnósticos
Se ha dado a conocer que CEACAM5 se expresa altamente en la superficie de células de tumor colorrectal, gástrico, de pulmón, uterino, y se expresa débilmente en pocas células epiteliales normales tales como células epiteliales de colon y esófago. Además, el cribado de un panel de tumores humanos por inmunohistoquímica usando un anticuerpo de ratón anti-CEACAM5 humana de acuerdo con la invención mostró tinción de anticuerpo en cánceres colorrectal, de estómago, de pulmón, de cuello uterino, de páncreas, de esófago, de ovario, de tiroides, de vejiga, de endometrio, de mama, de hígado (en particular colangiocarcinoma), de próstata, y de piel.
Por lo tanto, CEACAM5 constituye un marcador canceroso y, por lo tanto, tiene el potencial de usarse para indicar la eficacia de una terapia anti-cancerosa o detectar la recurrencia de la enfermedad.
En una realización, el anticuerpo de la invención se usa como componente de un ensayo en el contexto de una terapia dirigida a tumores que expresan CEACAM5, con el fin de determinar la susceptibilidad del paciente al agente terapéutico, monitorizar la eficacia de la terapia anti-cancerosa, o detectar la recurrencia de la enfermedad después del tratamiento. En particular, el mismo anticuerpo de la invención se usa tanto como componente del agente terapéutico como componente del ensayo de diagnóstico.
Así, un objeto adicional de la invención se refiere a un anticuerpo de acuerdo con la invención para uso para detectar in vivo la expresión de CEACAM5 en un sujeto, o para uso para detectar ex vivo la expresión de CEACAM5 en la muestra biológica de un sujeto. Dicha detección puede estar destinada en particular para
a) diagnosticar la presencia de un cáncer en un sujeto, o
b) determinar la susceptibilidad de un paciente que tiene cáncer a un agente terapéutico dirigido a CEACAM5, en particular un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, o
c) monitorizar la eficacia de una terapia contra el cáncer anti-CEACAM5 o detectar la recaída de cáncer después de una terapia contra el cáncer anti-CEACAM5, en particular para terapia con un inmunoconjugado de acuerdo con la invención;
detectando la expresión de la proteína de superficie CEACAM5 en células tumorales.
En una realización, el anticuerpo está destinado para un uso in vitro o ex vivo. Por ejemplo, CEACAM5 puede detectarse in vitro o ex vivo en una muestra biológica obtenida de un sujeto, usando un anticuerpo de la invención. El uso de acuerdo con la invención también puede ser un uso in vivo. Por ejemplo, un anticuerpo de acuerdo con la invención se administra al sujeto y los complejos anticuerpo-células se detectan y/o cuantifican, con lo cual la detección de dichos complejos es indicativa de un cáncer.
La invención se refiere además a un método in vitro o ex vivo para detectar la presencia de un cáncer en un sujeto, que comprende las etapas que consisten en:
(a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica; (b) medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(c) detectar la presencia de un cáncer comparando el nivel medido de anticuerpo unido con un control, siendo un nivel incrementado de anticuerpo unido comparado con el control indicativo de un cáncer.
La invención también se refiere a un método in vitro o ex vivo para determinar la susceptibilidad de un paciente que tiene cáncer a un agente terapéutico dirigido a CEACAM5, en particular a un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, método que comprende las etapas que consisten en:
(a) poner en contacto una muestra biológica de un paciente que tiene cáncer con un anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica;
(b) medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(c) comparar el nivel medido de anticuerpo unido a dicha muestra biológica con el nivel de anticuerpo unido a un control;
en el que un nivel incrementado de anticuerpo unido a dicha muestra biológica comparado con control es indicativo de un paciente susceptible a un agente terapéutico dirigido a CEACAM5.
En los métodos anteriores, dicho control puede ser una muestra biológica normal, no cancerosa, del mismo tipo, o un valor de referencia que se determina como representativo del nivel de unión del anticuerpo en una muestra biológica normal del mismo tipo.
En una realización, los anticuerpos de la invención son útiles para diagnosticar un cáncer que expresa CEACAM5, tal como un cáncer colorrectal, de estómago, de pulmón, de cuello uterino, de páncreas, de esófago, de ovario, de tiroides, de vejiga, de endometrio, de mama, de hígado (en particular colangiocarcinoma), de próstata, o de piel. La invención se refiere además a un método in vitro o ex vivo para monitorizar la eficacia de una terapia contra el cáncer anti-CEACAM5, que comprende las etapas que consisten en:
(a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto que está sometido a terapia contra el cáncer anti-CEACAM5 con un anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica;
(b) medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(c) comparar el nivel medido de anticuerpo unido con el nivel de anticuerpo unido a un control;
en el que un nivel disminuido de anticuerpo unido a dicha muestra biológica comparado con el control es indicativo de eficacia de dicha terapia contra el cáncer anti-CEACAM5.
En dicho método, un nivel incrementado de anticuerpo unido a dicha muestra biológica comparado con el control es indicativo de ineficacia de dicha terapia contra el cáncer anti-CEACAM5.
En una realización, dicho control es una muestra biológica del mismo tipo que la muestra biológica sometida a análisis, pero que se ha obtenido del sujeto previamente en el tiempo, durante el curso de la terapia contra el cáncer anti-CEACAM5.
La invención se refiere además a un método in v itro o e x v ivo para detectar la recidiva del cáncer después de una terapia contra el cáncer anti-CEACAM5, que comprende las etapas que consisten en:
(a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto que ha completado una terapia contra el cáncer anti-CEACAM5 con un anticuerpo de acuerdo con la invención, en particular en condiciones suficientes para que el anticuerpo forme complejos con dicha muestra biológica;
(b) medir el nivel de anticuerpo unido a dicha muestra biológica,
(c) comparar el nivel medido de anticuerpo unido con el nivel de anticuerpo unido a un control;
en el que un nivel incrementado de anticuerpo unido a dicha muestra biológica comparado con el control es indicativo de recidiva del cáncer después de la terapia contra el cáncer anti-CEACAM5.
Dicho control es en particular una muestra biológica del mismo tipo que la muestra biológica sometida a análisis, pero que se ha obtenido del sujeto previamente en el tiempo, durante o después de la finalización de la terapia contra el cáncer anti-CEACAM5.
Dicha terapia contra el cáncer anti-CEACAM5 es en particular una terapia que usa un anticuerpo o inmunoconjugado de acuerdo con la invención. Dicha terapia contra el cáncer anti-CEACAM5 está dirigida a un cáncer que expresa CEACAM5, en particular un cáncer colorrectal, de estómago, de pulmón, de cuello uterino, de páncreas, de esófago, de ovario, de tiroides, de vejiga, de endometrio, de mama, de hígado (en particular colangiocarcinoma), de próstata, o de piel.
En una realización, los anticuerpos de la invención pueden marcarse con una molécula o sustancia detectable, tal como una molécula fluorescente, una molécula radioactiva o cualesquiera otros marcadores conocidos en la técnica que proporcionen (bien directa o indirectamente) una señal.
Tal y como se usa en el presente documento, el término “marcado”, respecto al anticuerpo de acuerdo con la invención, pretende englobar el marcaje directo del anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, enlazamiento físico) de una sustancia detectable, tal como un agente radioactivo o un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5)) al polipéptido, así como el marcaje indirecto del polipéptido por reactividad con una sustancia detectable.
Un anticuerpo de la invención puede marcarse con una molécula radioactiva por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las moléculas radioactivas incluyen, pero no están limitadas a, un átomo radioactivo para estudios escintigráficos, tal como I123, I124, In111, Re186, Re188, Tc99. Los polipéptidos de la invención también pueden marcarse con un marcador de espín para formación de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocido como formación de imágenes de resonancia magnética, MRI), tal como yodo-123, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Una “muestra biológica” engloba una variedad de tipos de muestra obtenidos de un sujeto, y pueden usarse en un ensayo de diagnóstico o monitorización. Las muestras biológicas incluyen, pero no están limitadas a, sangre u otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tal como muestra de biopsia o cultivos de tejido o células derivados de ésta, y la progenie de éstas. Por lo tanto, las muestras biológicas engloban muestras clínicas, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biológico y muestras de tejido, en particular muestra tumoral.
En una realización, la muestra biológica puede ser una muestra de tejido fijada en formalina y embebida en parafina (FFPE). De hecho, los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden usarse ventajosamente en tejidos de FFPE que es el formato usado por la mayor parte de los hospitales para recolectar y archivar muestras de tejido.
La invención también se refiere a un método in vivo para detectar la presencia de un cáncer en un sujeto, que comprende las etapas que consisten en:
a) administrar un anticuerpo de acuerdo con la invención marcado detectablemente a un paciente;
b) detectar la localización de dicho anticuerpo marcado detectablemente en el paciente por formación de imágenes.
Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles para determinar el estadío del cáncer (por ejemplo, en formación de radioimágenes). Pueden usarse solos o en combinación con otros marcadores cancerosos.
Los términos “detección” o “detectado”, tal y como se usan en el presente documento, incluyen la detección cualitativa y/o cuantitativa (medir los niveles) con o sin referencia a un control.
En el contexto de la invención, el término “diagnosticar”, tal y como se usa en el presente documento, significa la determinación de la naturaleza de una afección médica destinada a identificar una patología que afecta al sujeto a partir de varios datos recolectados.
En dicho método, el cáncer es un cáncer que expresa CEACAM5, en particular un cáncer colorrectal, de estómago, de pulmón, de cuello uterino, de páncreas, de esófago, de ovario, de tiroides, de vejiga, de endometrio, de mama, de hígado (en particular colangiocarcinoma), de próstata, o de piel.
Kits
Finalmente, la invención también proporciona kits que comprenden al menos un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención. Los kits que contienen anticuerpos de la invención encuentran uso en la detección de la proteína de superficie CEACAM5, o en ensayos terapéuticos o de diagnóstico. Los kits de la invención pueden contener un polipéptido o anticuerpo acoplado a un soporte sólido, por ejemplo una placa de cultivo tisular o perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa). Pueden proporcionarse kits que contienen anticuerpos para la detección y cuantificación de la proteína de superficie CEACAM5 in vitro, por ejemplo en un ELISA o una transferencia Western. Dicho anticuerpo útil para la detección puede proporcionarse con un marcador tal como uno fluorescente o radiomarcador.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO:1-4, y 6 muestran las secuencias de las CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo “MAb1”.
SEQ ID NO:5 muestra la secuencia de la variante de VH VH1a del anticuerpo MAb2 humanizado.
SEQ ID NO:7-10, y 12 muestran las secuencias de las CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo “MAb2”.
SEQ ID NO:11 muestra la secuencia de CEACAM1 humana según está disponible en GenBank NP_001703,2.
SEQ ID NO:13-16, y 18 muestran las secuencias de las CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo “MAb3”.
SEQ ID NO:17 muestra la secuencia de la variante de VL VL1 del anticuerpo MAb2 humanizado.
SEQ ID NO:19-22, y 24 muestran las secuencias de las CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo “MAb4”.
SEQ ID NO:23 muestra la secuencia de la variante de VL VL1a del anticuerpo MAb2 humanizado.
SEQ ID NO:25-28, y 30 muestran las secuencias de las CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L y CDR3-L del denominado anticuerpo “MAb5”.
SEQ ID NO:29 muestra la secuencia de la variante de VL VL1c del anticuerpo MAb2 humanizado.
SEQ ID NO:31 muestra la secuencia de VH del anticuerpo “MAb1”.
SEQ ID NO:32 muestra la secuencia de VL del anticuerpo “MAb1”.
SEQ ID NO:33 muestra la secuencia de VH del anticuerpo “MAb2”.
SEQ ID NO:34 muestra la secuencia de VL del anticuerpo “MAb2”.
SEQ ID NO:35 muestra la secuencia de VH del anticuerpo “MAb3”.
SEQ ID NO:36 muestra la secuencia de VL del anticuerpo “MAb3”.
SEQ ID NO:37 muestra la secuencia de VH del anticuerpo “MAb4”.
SEQ ID NO:38 muestra la secuencia de VL del anticuerpo “MAb4”.
SEQ ID NO:39 muestra la secuencia de VH del anticuerpo “MAb5”.
SEQ ID NO:40 muestra la secuencia de VL del anticuerpo “MAb5”.
SEQ ID NO:41 muestra la secuencia de cadena pesada del anticuerpo chMAb1.
SEQ ID NO:42 muestra la secuencia de cadena ligera del anticuerpo chMAb1.
SEQ ID NO:43 muestra la secuencia de cadena pesada del anticuerpo chMAb2.
SEQ ID NO:44 muestra la secuencia de cadena ligera del anticuerpo chMAb2.
SEQ ID NO:45 muestra la secuencia de cadena pesada del anticuerpo chMAb3.
SEQ ID NO:46 muestra la secuencia de cadena ligera del anticuerpo chMAb3.
SEQ ID NO:47 muestra la secuencia de cadena pesada del anticuerpo chMAb4.
SEQ ID NO:48 muestra la secuencia de cadena ligera del anticuerpo chMAb4.
SEQ ID NO:49 muestra la secuencia de cadena pesada del anticuerpo chMAb5.
SEQ ID NO:50 muestra la secuencia de cadena ligera del anticuerpo chMAb5.
SEQ ID NO:51 muestra la secuencia de la variante de VH VH1 del anticuerpo MAb2 humanizado.
SEQ ID NO:52 muestra la secuencia de CEACAM5 humana de longitud completa según está disponible en la base de datos GenBank con el número de registro AAA51967,1.
SEQ ID NO:53 muestra la secuencia del dominio extracelular de CEACAM5 de Macaca fascicularis.
SEQ ID NO:54 muestra la secuencia de la cadena ligera de un anticuerpo quimérico (derivado del anticuerpo “MAb2”) que comprende una mutación K52 a R52.
SEQ ID NO:55 muestra la secuencia de la variante de VL VL1d del anticuerpo MAb2 humanizado.
SEQ ID NO:56 muestra la secuencia del dominio extracelular de hCEACAM1 (posiciones 35-428 de hCEACAM1 de longitud completa (NP_001703,2), seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His).
SEQ ID NO:57 muestra la secuencia del dominio extracelular de cCEACAM1, seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His.
SEQ ID NO:58 muestra la secuencia del dominio extracelular de hCEACAM5 (posiciones 35-685 de hCEACAM5 de longitud completa (AAA51967,1), seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His).
SEQ ID NO:59 muestra la secuencia del dominio extracelular de cCEACAM5, seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His.
SEQ ID NO:60 muestra la secuencia del dominio extracelular de hCEACAM6 (posiciones 35-327 de hCEACAM6 de longitud completa (NP_002474,3), seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His).
SEQ ID NO:61 muestra la secuencia del dominio extracelular de cCEACAM6, seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His.
SEQ ID NO:62 muestra la secuencia del dominio extracelular de hCEACAM8 (posiciones 35-332 de hCEACAM8 de longitud completa (NP_001807,2), seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His.
SEQ ID NO:63 muestra la secuencia del dominio extracelular de cCEACAM8, seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His.
SEQ ID NO:64 muestra la secuencia del dominio extracelular de hCEACAM7 (posiciones 36-248 de hCEACAM7 de longitud completa (NMP_008821,1), seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His).
SEQ ID NO:65 muestra la secuencia de N-A1-B1 de hCEACAM5 (posiciones 35-320 de hCEACAM5 de longitud completa (AAA51967,1.)), seguido de 6 aminoácidos de la etiqueta de His.
SEQ ID NO:66 muestra la secuencia de A2-B2 de hCEACAM5 (posiciones 321-498 de hCEACAM5 de longitud completa (AAA51967,1.)), seguido de 6 aminoácidos de la etiqueta de His.
SEQ ID NO:67 muestra la secuencia de A3-B3 de hCEACAM5 (posiciones 499-685 de hCEACAM5 de longitud completa (AAA51967,1.)), seguido de 6 aminoácidos de la etiqueta de His.
SEQ ID NO:68 muestra la secuencia de N-A1-B1 de cCEACAM5, seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His.
SEQ ID NO:69 muestra la secuencia de A2-B2 de cCEACAM5, seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His.
SEQ ID NO:70 muestra la secuencia de A3-B3 de cCEACAM5, seguido de una extensión de 24 aminoácidos que contiene una etiqueta de His.
SEQ ID NO:71 muestra la secuencia de la proteína de longitud completa CEACAM6 humana según está disponible en GenBank NP_002474,3.
SEQ ID NO:72 muestra la secuencia de la proteína de longitud completa CEACAM7 humana según está disponible en GenBank NP_008821,1.
SEQ ID NO:73 muestra la secuencia de la proteína de longitud completa CEACAM8 humana según está disponible en GenBank NP_001807,2.
SEQ ID NO:74 muestra la secuencia de VH del MAb2_VLg5VHg2 humanizado variante.
SEQ ID NO:75 muestra la secuencia de VL del MAb2_VLg5VHg2 humanizado variante.
SEQ ID NO:76 muestra la secuencia de aminoácidos en las posiciones 109-115 de A3-B3 de CEACAM5 humana.
SEQ ID NO: 77 muestra la secuencia de aminoácidos en las posiciones 131-143 de A3-B3 de CEACAM5 humana.
SEQ ID NO: 78 muestra una secuencia de consenso para CDR1-H de la familia de anticuerpos MAb2/MAb4/MAb5 basada en comparaciones de secuencias.
SEQ ID NO:79 muestra una secuencia de consenso para CDR2-H de la familia de anticuerpos MAb2/MAb4/MAb5 basada en comparaciones de secuencias.
SEQ ID NO:80 muestra una secuencia de consenso para CDR3-H de la familia de anticuerpos MAb2/MAb4/MAb5 basada en comparaciones de secuencias.
SEQ ID NO:81 muestra una secuencia de consenso para CDR1-H de la familia de anticuerpos de MAb1/MAb3.
SEQ ID NO:82 muestra una secuencia de consenso para CDR2-H de la familia de anticuerpos de MAb1/MAb3.
SEQ ID NO:83 muestra una secuencia de consenso para CDR1-H de la familia de anticuerpos MAb2/MAb4/MAb5 basada en restos identificados como neutros en la unión de los dominios extracelulares de CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis.
SEQ ID NO:84 muestra una secuencia de consenso para CDR3-H de la familia de anticuerpos MAb2/MAb4/MAb5 basada en restos identificados como neutros en la unión de los dominios extracelulares de CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis.
SEQ ID NO:85 muestra una secuencia de consenso para CDR1-L de la familia de anticuerpos MAb2/MAb4/MAb5 basada en restos identificados como neutros en la unión de los dominios extracelulares de CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis.
SEQ ID NO:86 muestra una secuencia de consenso para CDR3-L de la familia de anticuerpos MAb2/MAb4/MAb5 basada en restos identificados como neutros en la unión de los dominios extracelulares de CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis.
SEQ ID NO:87 muestra la secuencia de cadena pesada de huMAb2-3 (MAb2_VL1cVH1a-IgG1).
SEQ ID NO:88 muestra la secuencia de cadena ligera de huMAb2-3 (MAb2_VL1cVH1a-IgG1).
SEQ ID NO:89 muestra la secuencia de cadena pesada de huMAb2-4 (MAb2_VL1d VH1-IgG1).
SEQ ID NO:90 muestra la secuencia de cadena ligera de huMAb2-4 (MAb2_VL1d VH1-IgG1).
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Evaluación de la selectividad de los anticuerpos anti-CEACAM5.
Figura 2: Cartografiado de los dominios de los anticuerpos anti-CEACAM5 en CEACAM5 humana.
Figura 3: Cartografiado de los dominios de los anticuerpos anti-CEACAM5 en CEACAM5 de mono macaco.
Figura 4: Evaluación de la actividad anti-tumoral de los conjugados chMAb4-SPDB-DM4, chMAbl-SPDB-DM4, chMAb5-SPDB-DM4, y chMAb2-SPDB-DM4 frente a adenocarcinoma de colon humano primario CR-IGR-034P en ratones hembra SCID.
Figura 5: Evaluación de la actividad anti-tumoral de los conjugados huMAb2-3-SPDB-DM4, huMAb2-4-SPDB-DM4 y chMAb2-SPDB-DM4 frente a adenocarcinoma de colon humano primario CR-IGR-034P en ratones hembra SCID.
Figura 6: Evaluación de la actividad anti-tumoral del conjugado huMAb2-3-SPDB-DM4 frente a adenocarcinoma de estómago humano primario STO-IND-006 en ratones hembra SCID.
Figura 7: Alineamientos de secuencia de las regiones VH y VL de los anticuerpos MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 y MAb5.
Figura 8: Análisis de HRMS del conjugado chMAb1-SPDB-DM4.
Figura 9: Análisis de HRMS del conjugado chMAb2-SPDB-DM4.
Figura 10: Análisis de HRMS del conjugado chMAb4-SPDB-DM4.
Figura 11: Análisis de HRMS del conjugado chMAb5-SPDB-DM4.
Figura 12: Análisis de HRMS del conjugado huMAb2-2-SPDB-DM4.
Figura 13: Análisis de HRMS del conjugado huMAb2-1-SPDB-DM4.
Figura 14: Análisis de HRMS del conjugado huMAb2-3-SPDB-DM4.
Figura 15: Análisis de HRMS del conjugado huMAb2-4-SPDB-DM4.
Figura 16: Actividad de unión de variantes humanizadas de MAb2 al dominio extracelular de CEACAM5 humana y de mono.
Figura 17: Estabilidad de la unión de variantes humanizadas de MAb2 al dominio extracelular de CEACAM5 humana y de mono.
Figura 18: Evaluación de la actividad anti-tumoral del conjugado huMAb2-3-SPDB-DM4 frente a adenocarcinoma de pulmón humano primario LUN-NIC-0014 en ratones hembra SCID.
Figura 19: Evaluación de la actividad anti-tumoral de los conjugados huMAb2-3-SPDB-DM4 y huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 frente a adenocarcinoma de colon humano primario CR-IGR-034P en ratones hembra atímicos CD1.
Figura 20: Análisis de HRMS de huMAb2-3-sulfoSPDB-DM4.
Figura 21: análisis de HRMS de huMAb2-3-SMCC-DM1.
Figura 22: Alineamiento del dominio variable de cadena pesada de MAb2, MAb4, MAb5, VH1a humanizado, VH1 humanizado y VHg2 humanizado.
Figura 23: Alineamiento del dominio variable de cadena ligera de MAb2, MAb4, MAb5, VL1 humanizado, VL1 a humanizado, VL1c humanizado, VL1d humanizado y VLg5 humanizado.
EJEMPLOS
La presente invención se ilustra además mediante los ejemplos siguientes, que no deberían constituir una limitación adicional.
Ejemplo 1: Preparación de dominios extracelulares recombinantes de proteínas CEACAM
En este ejemplo, los dominios proteicos extracelulares (ECD) de CEACAM de origen humano (h) o de mono macaco (c) se han preparado por expresión transitoria en células de riñón embrionario humano HEK293 con plásmidos que permiten la expresión del ADNc respectivo como se muestra en la Tabla 1.
Cada plásmido de expresión formó un complejo con 293fectin™ (Life Technologies) y se añadió a células 293-F cultivadas en suspensión (derivadas de células HEK293). Ocho días después de la transfección, los sobrenadantes de los cultivos se recolectaron, y la proteína soluble correspondiente se purificó por IMAC (GE Healthcare) para generar un lote de proteína (véase la Tabla 1).
Tabla 1: Descripción de los dominios extracelulares recombinantes de proteínas CEACAM
Figure imgf000039_0001
Ejemplo 2: Generación de anticuerpos monoclonales de ratón anti-CEACAM5
En este ejemplo, se han generado anticuerpos monoclonales después de inmunizar ratones de acuerdo con un protocolo que dio lugar a la generación de mAb anti-CEACAM5.
Ejemplo 2.1: Inmunización y generación de hibridomas
Las inmunizaciones, fusión y cribado se realizaron usando células de mieloma P3X63-Ag8,653 con el dominio extracelular de CEACAM5 humana, el dominio extracelular de CEACAM5 de macaco o con células tumorales humanas UMC11 como se describe en Wennerberg A.E et al., 1993. Am. J. Pathol., 143(4), 1050-1054 y Kilpatrick et al. 1997. Hybridoma 16: 381389.
Usando el método de RIMMS como se describe por Kilpatrick et al. (1997. Hybridoma 16: 381389), cada uno de ratones hembra BALB/c de 6-8 semanas de edad (S082342; Charles River Labs, Bar Harbor, ME) recibió cuatro ciclos de inmunización durante una tanda de tratamiento de 14 días a intervalos de 3-4 días. Los antígenos emulsionados en adyuvante de Titermax (TierMax Gold Adjuvant; Sigma #T2684) se administraron subcutáneamente en seis sitios próximos a los ganglios linfáticos de drenaje, a lo largo del lomo de los ratones, y en seis sitios yuxtapuestos a lo largo del abdomen. Cuatro días después de la última inyección, se sacrificaron los ratones. Se aislaron asépticamente ganglios linfáticos inguinales, axilares y branquiales, superficiales, popliteales, bilaterales, y se lavaron con medio RPMI fresco.
Usando el método clásico como se describe por Wennerberg A.E et al. (1993. Am. J. Pathol., 143(4), 1050-1054), cada uno de ratones hembra BALB/c de 6-8 semanas de edad ((S082342; Charles River Labs, Bar Harbor, ME) recibió tres ciclos de inmunización durante una tanda de tratamiento de 41 días. Los antígenos se administraron intraperitonealmente en el sitio ventral de los ratones. Tres días después de la última inyección, los ratones se sacrificaron, y los bazos se aislaron asépticamente y se lavaron con medio RPMI fresco.
Se liberaron linfocitos de los ganglios linfáticos o de los bazos, y la suspensión de una sola célula se lavó dos veces con medio RPMI antes de fusionarse con células de mieloma P3X63-AG8,653 usando polietilenglicol. Después de la fusión, la mezcla celular se incubó en una incubadora a 37°C durante 16-24 horas. La preparación de células resultante se transfirió a medio semisólido selectivo, y se colocó de manera aséptica en placas Petri de 100 mm y se incubó a 37°C. Diez días después del inicio de la selección, las placas se examinaron para determinar el crecimiento de los hibridomas, y las colonias visibles se recogieron y se colocaron en placas de 96 pocillos que contenían 200 pl de medio de crecimiento. Las placas de 96 pocillos se mantuvieron en una incubadora a 37°C durante 2 a 4 días.
Ejemplo 2.2: Cribado y caracterización in v i t r o de anticuerpos murinos anti-CEACAM5
El cribado primario para la producción de Ig anti-CEACAM5 se realizó por el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) usando proteína CEACAM5 humana (preparada como se describe en el Ejemplo 1) como antígeno de captura, y con FACS usando varias células tumorales humanas (H460, MKN45, SW1463, Sk m El28 y UMC11). Para el ensayo ELISA, las placas se revistieron con proteína CEACAM5 humana a 0,25 mg/pocillo en PBS, y se añadieron 100 ml/pocillo de anticuerpos anti-CEACAM5 a la placa. La placa se incubó a 37°C durante 1 h y se lavó cinco veces con PBS que contenía 0,05% de Tween-20 (PBS-T). Después, se añadieron a cada pocillo 100 ml de una dilución 1:50,000 de IgG de conejo anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma; #A9044). Después de incubar a 37°C durante 1 h en la oscuridad, las placas se lavaron con PBS-T cinco veces. La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo amortiguador de TMB-H2O2 y leyendo a una longitud de onda de 450 nm. Para el ensayo FACS, se utilizaron células tumorales humanas a 40,000 células/pocillo para revestir una placa de 96 pocillos High Bind (MSD L15XB-3), y se añadieron 100 ml/pocillo de los anticuerpos anti-CEACAM5 durante 45 min. a 4°C y se lavó tres veces con PBS 1% BSA. Se añadieron 100 ml/pocillo de IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa647 (Invitrogen; # A2135) durante 45 min. a 4°C, y se lavó tres veces con PBS 1% BSA. La unión del anticuerpo se evaluó después de centrifugar y resuspender las células añadiendo 200 ml/pocillo de PBS 1% BSA, y de leer usando el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte™ 8HT.
Para evaluar la especificidad por CEACAM5 de los anticuerpos anti-CEACAM5, se revistieron placas de 96 pocillos con proteínas recombinantes humanas CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 y CEACAM8 (preparadas como se describe en el Ejemplo 1) usando las mismas condiciones de revestimiento descritas previamente. Los anticuerpos anti-CEACAM5 se añadieron a las placas y se detectaron usando IgG anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma; #A9044). La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo amortiguador de TMB-H2O2 y leyendo a una longitud de onda de 450 nm. Los resultados presentados en la Figura 1 muestran que los anticuerpos anti-CEACAM5 son selectivos para CEACAM5 humana frente a CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 y CEACAM8 humanas.
Ejemplo 2.3: Caracterización de la unión de mAb
La afinidad aparente de los anticuerpos anti-CEACAM5 por hCEACAM5 expresada en la superficie de células tumorales humanas MKN45 (DSMZ, ACC 409) se determinó por el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte™ 8HT. Las células tumorales humanas MKN45 se utilizaron para revestir a 40,000 células/pocillo una placa de 96 pocillos High Bind (MSD L15XB-3), y se añadieron 100 ml/pocillo de anticuerpos anti-CEACAM5 en diluciones seriadas de 2 veces empezando en 20 mg/ml hasta 12 diluciones en diluyente de ensayo durante 45 min. a 4°C, y se lavó tres veces con PBS 1% BSA. Se añadieron 100 ml/pocillo de IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa647 (Invitrogen; # A2135) durante 45 min. a 4°C, y se lavó tres veces con PBS 1% BSA. La unión del anticuerpo se evaluó después de centrifugar y resuspender las células añadiendo 200 ml/pocillo de PBS 1% BSA y de leer usando el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte™ 8HT. Los valores de KD aparente y de CE50 se estimaron usando los software BIOST@T-BINDING y BIOST@T-SPEED, respectivamente.
Tabla 2: Valores de CE50 obtenidos en células MKN45
Figure imgf000040_0001
El cartografiado de dominios de los anticuerpos anti-CEACAM5 contra las proteínas CEACAM5 humana y CEACAM5 de macaco se determinó por ELISA. Se revistieron placas de 96 pocillos con los dominios recombinantes humanos A1 (143-237), A1-B1 (143-320), A2-B2 (321-498) y A3-B3 (499-685) de la proteína CEACAM5 (preparados como se describe en el Ejemplo 1) y con los dominios recombinantes de macaco N-A1-B1 (1-320), A1-B1 (143-320), A2-B2 (321-498) y A3-B3 (499-688) de la proteína CEACAM5 (preparados como se describe en el Ejemplo 1 ) usando las mismas condiciones de revestimiento descritas previamente. Los anticuerpos purificados se añadieron a las placas y se detectaron usando IgG anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma; #A9044). La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo amortiguador de TMB-H2O2 y leyendo a una longitud de onda de 450 nm. Los resultados se presentan en las Figuras 2 y 3, y muestran que los anticuerpos anti-CEACAM5 se unen al dominio A3-B3 de las proteínas CEACAM5 humana y de macaco.
Los isotipos de mAb individuales se determinaron usando un kit de isotipado de IgG de ratón de acuerdo con las instrucciones del fabricante (SEROTEC ref. MMT1). Los cinco mAb específicos de CEACAM5 fueron del isotipo IgG1, k.
Ejemplo 3: Caracterización de los anticuerpos murinos anti-CEACAM5
Ejemplo 3.1: Caracterización in v it ro de anticuerpos murinos anti-CEACAM5
Se produjeron hibridomas de ratón que expresan Ab específicos de CEACAM5 en matraces T500, y el medio acondicionado se recolectó después de 7 días de crecimiento. Los Ab específicos de CEACAM5 se purificaron haciendo pasar el medio acondicionado a través de una columna de Proteína G, lavándolo y se eluyéndolo con amortiguador de glicina/HCl 100 mM pH 2,7. El eluato se dializó frente a PBS antes de filtrarlo de forma esterilil y almacenarlo a 4°C.
Todos los mAb específicos de CEACAM5 se evaluaron para determinar su capacidad para unirse a la proteína CEACAM5 humana y de primate por ELISA. Se revistieron las placas con proteína CEACAM5 humana o de primate, se añadieron mAb anti-hCEACAM5 a la placa, y se detectaron usando IgG anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma; #A9044). La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo amortiguador de TMB-H2O2 y leyendo a una longitud de onda de 450 nm.
Tabla 3: Valores de CE50 correspondientes a la capacidad de unión de mAb específicos de CEACAM5 a proteínas CEACAM5 de primate
Figure imgf000041_0001
Ejemplo 3.2: Afinidad aparente y capacidad de unión del anticuerpo de anticuerpos anti-CEACAM5 a células tumorales de colon humano primario CR-IGR-034P por citometría de flujo
El tumor de colon primario humano avanzado CR-IGR-034P (Julien et al., Clin Cancer Res October 1,2012 18:5314-5328) se obtuvo de xenoinjerto derivado de paciente en ratones. El tumor CR-IGR-034P se disoció enzimáticamente usando colagenasa tipo IV (Invitrogen; #17104-019) y desoxirribonucleasa I (Invitrogen; #18047-019) durante 1 h a 4°C. La viabilidad celular se estimó por aplicación Viacount usando el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte™ 8HT. Para la estimación de la afinidad aparente, las células tumorales CR-IGR-034P se utilizaron para revestir a 40,000 células/pocillo una placa de 96 pocillos High Bind (MSD L15XB-3), y se añadieron 100 pl/pocillo de anticuerpos anti-CEACAM5 en diluciones seriadas de 2 veces empezando en 20 pg/ml hasta 12 diluciones en diluyente de ensayo durante 45 min. a 4°C, y se lavó tres veces con PBS 1% BSA. Se añadieron 100 pl/pocillo de IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa647 (Invitrogen; # A2135) o IgG anti-humana de cabra conjugada con Alexa488 (Invitrogen; # A11013) durante 45 min. a 4°C, y se lavó tres veces con PBS 1% BSA. La unión del anticuerpo se evaluó después de centrifugar y resuspender las células añadiendo 200 pl/pocillo de PBS 1% BSA, y de leer usando el sistema de citometría de flujo Guava® easyCyte™ 8HT. Los valores de KD aparente y CE50 se estimaron usando los software BIOST@T-BIn DiNG y BIOST@T-SPEED, respectivamente.
La capacidad de unión del anticuerpo de los anticuerpos anti-CEACAM5 se determinó usando el kit calibrador de IgG de ratón (Biocytex #7208) o el kit calibrador de IgG humana (Biocytex #CP010) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Tabla 4: Valores de KD y de CE50 obtenidos en células de tumor de colon primario humano avanzado CR-IGR-034P
Figure imgf000041_0002
Ejemplo 3.3: Actividad de internalización de los anticuerpos murinos específicos de CEACAM5
Para evaluar la internalización de los anticuerpos anti-CEACAM5 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 y MAb5, se incubaron células MKN45 viables durante 24 h a 37°C/5% de CO2 (o 4°C en hielo para el control negativo) con 10 pg/ml de anticuerpos anti-CEACAM5 marcados previamente con AlexaFluor488. Después, una parte de los pocillos se enjuagó con medio de cultivo, y los anticuerpos extracelulares marcados con AF unidos a las células se paralizaron incubando las células con anticuerpo anti-AlexaFluor 488 (50 pg/ml) en hielo durante 30 min. (nivel de fluorescencia intracelular). La otra parte de los pocillos solo se incubó con medio de cultivo en la misma condición de tiempo (nivel de fluorescencia total). Las células se despegaron y se lavaron entonces, y se recolectaron en medio de cultivo antes de análisis por citometría de flujo usando un analizador MACSQUANT Vyb. Se midió la fluorescencia asociada a las células de 1 x 104 células, y se cuantificó la intensidad fluorescente media de las células viables agrupadas. La proporción de internalización (%) se define dividiendo la fluorescencia extinguida asociada a las células entre la fluorescencia total asociada a las células multiplicado por 100. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar (SD).
Tabla 5: Internalización del anticuerpo murino anti-CEACAM5 a 24 h en la línea celular MKN45
Figure imgf000041_0003
Los cinco anticuerpos específicos de CEACAM5 experimentaron internalización después de la unión de CEACAM5 expresada en la membrana de la superficie celular, apoyando su uso en el campo de los inmunoconjugados de anticuerpo para dirigir citotoxicidad específicamente a las células cancerosas. Los anticuerpos anti-CEACAM5 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 y MAb5 mostraron internalización en la línea celular de cáncer humana MKN45 de 49,9%, 45%, 51,1%, 42,5%, 51,7%, respectivamente, después de 24 horas de incubación.
Ejemplo 3.4: Actividad citotóxica de los ADC murinos correspondientes en la línea celular MKN45
Los anticuerpos murinos se conjugaron con el fin de definir su actividad citotóxica in vitro. En un tubo de 15 ml, a temperatura ambiente (23°C), se introdujeron sucesivamente con agitación magnética mAb, amortiguador A/HEPES (4%), DMA (dimetilacetamida, 20% v/v), y después 6 equivalentes de enlazador de SPDB. Después de una noche a temperatura ambiente, se añadió DM4 (maitansinoide, 9,6 equivalentes) en disolución de DMA 15 mM, y se hizo reaccionar 5 horas. La mezcla de conjugación bruta se purifica en columnas Superdex 200pg 16/60 o G25 26/10 (PBS-Na pH 7,4/5% de NMP), se concentró en Amicon 15 a 5000 g, y se filtró en Millex 0,22 pm.
El efecto de los conjugados anti-CEACAM5 con maitansinoide se ensayó entoces con respecto a la viabilidad de las células tumorales usando el kit Cell Titer-Glo (Promega). Para hacer esto, se colocaron en placas de 96 pocillos células de cáncer gástrico humano MKN45 y se dejaron adhirir durante 4 horas en una atmósfera a 37°C/5% de CO2. Se añadieron diferentes concentraciones de conjugados de anti-CEACAM5 a las células sembradas. Las células se incubaron entonces durante 96 horas en la misma atmósfera. Entonces se añadió reactivo Cell Titer-Glo a los pocillos durante 10 min. a temperatura ambiente, y la señal luminiscente se midió usando un contador de placas EnVision (Perkin-Elmer).
Tabla 6: Actividades citotóxicas de ADC murinos específicos de CEACAM5 en la línea celular CEACAM5+ MKN45
Figure imgf000042_0001
Los anticuerpos anti-CEACAM5 conjugados con maitansinoide (DM4), MAb1-SPDB-DM4, MAb2-SPDB-DM4, MAb3-SPDB-DM4, MAb4-SPDB-DM4 y MAb5-SPDB-DM4, mostraron actividades citotóxicas in vitro con una CI50 de 0,89, 0,14, 0,53, 0,96 y 0,24 nM, respectivamente.
Ejemplo 4: Determinación de la secuencia de las cadenas pesadas y ligeras de los mAb anti-CEACAM5 Las secuencias de los dominios variables del mAb se recuperaron del hibridoma y se clonaron en un vector de expresión para asegurar que los mAb clonados tenían las mismas características que los mAb murinos iniciales. Las secuencias de aminoácidos derivadas proporcionaron información de acuerdo con los datos obtenidos en mAb purificados derivados del hibridoma por secuenciación N-terminal y espectrometría de masas (LC/MS) de las cadenas pesada y ligera (LC, HC) (véase la Tabla 7).
Tabla 7: Análisis de espectrometría de masas de mAb anti-CEACAM5 de hibridoma
Figure imgf000042_0002
Ejemplo 5: Conjugado de anticuerpo fármaco (ADC) (quimera)
Ejemplo 5.1: mAb quimera desnudo
Las secuencias de ácido nucleico de los dominios variables VH, VL se clonaron en vectores de expresión en fusión con las secuencias codificantes del dominio constante de IgG1 humana o de Ckappa humana respectivamente para generar entonces lotes de mAb quimeras por expresión transitoria en HEK293 como se describe en el Ejemplo 1. Las afinidades por CEACAM5 humana y de macaco permanecieron similares para los mAb murinos y quimeras. En la Tabla 8, se ilustran las afinidades por la CE50 obtenida por ELISA con CEACAM5 humana o de macaco.
Tabla 8: CE50 obtenidas con CEACAM5 para hibridoma murino y mAb quimeras correspondientes
Figure imgf000043_0001
Las secuencias para las regiones de CDR se dedujeron de la secuencia de proteínas usando la nomenclatura IMGT. Corresponden a SEQ ID NO: 1-4, 6, 7-10, 12, 13-16, 18, 19-22, 24, 25-28, 30.
De forma importante, comparado con el anticuerpo producido por el hibridoma clonado (MAb2i), los restos canónicos se han introducido en el clon MAb2 en las posiciones 41G, 42K, y 45Q en VL, y en las posiciones 5Q y 7S en VH. Además, la lisina en la posición 52 en el VL del clon MAb2 CEA-4 localizada en la CDR2 se ha reemplazado por arginina en el clon Mab2K52R. Se generó un lote en las mismas condiciones a las correspondientes al clon MAb2 y dio lugar a una afinidad similar por el dominio extracelular de CEACAM5 humana y de macaco como se muestra en la Tabla 7. Resaltó que esta mutación de punto en la CDR puede hacerse sin ningún impacto en la unión.
Las secuencias de LC y HC del mAb quimera para el clon MAb2 y el clon Mab2K52R corresponden a SEQ ID NO:43, 44, 54.
chMAb2 se construyó como se describe en el ejemplo 4. Es un mAb quimera derivado del clon MAb2 con una IgG1 humana, isotipo Ck. Las secuencias corresponden a SEQ ID NO:43 y 44. Se preparó un lote a escala de 300 mg por expresión transitoria en HEK293, seguido de una purificación en cromatografía de afinidad de proteínas; véase la Tabla 7 para los datos de unión. Fue el mAb desnudo usado para la producción del ADC.
Ejemplo 5.2: Producción y caracterización de ADC
En este ejemplo, se prepararon inmunoconjugados a partir de mAb quimera desnudo. Se evaluó entonces la eficacia in vivo.
Cálculo de DAR:
Un conjugado generalmente comprende de 1 a 10 molécula(s) del maitansinoide unido covalentemente al anticuerpo (denominado, “relación fármaco a anticuerpo” o “DAR”). Este número puede variar con la naturaleza del anticuerpo y del maitansinoide usado, junto con las condiciones experimentales usadas para la conjugación (como la relación maitansinoide/anticuerpo, el tiempo de reacción, la naturaleza del disolvente y del codisolvente, si se usa). Así, el contacto entre el anticuerpo y el maitansinoide da lugar a una mezcla que comprende varios conjugados que difieren entre sí por diferentes relaciones de fármaco a anticuerpo; opcionalmente el anticuerpo desnudo; opcionalmente agregados. El DAR que se determina es así un valor medio.
El método usado en el presente documento para determinar la DAR consiste en medir espectrofotométricamente la relación de la absorbancia a 252 nm y 280 nm de una disolución del conjugado purificado sustancialmente. En particular, dicha DAR puede determinarse espectrofotométricamente usando los coeficientes de extinción medidos a respectivamente 280 y 252 nm para el anticuerpo y para el maitansinoide £D280 = 5,180 M-1cm-1 y £D252 = 26,159 M-1cm-1). El método de cálculo se deriva de Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science, y se describe con más detalle a continuación:
Las absorbancias para el conjugado a 252 nm (A252) y a 280 nm (A280) se miden o bien sobre el pico monomérico del análisis por cromatografía de exclusión de tamaños (SEC) (que permite calcular el parámetro “DAR(SEC)”) o bien usando un aparato espectrofotométrico clásico (que permite calcular el parámetro “DAR(UV)”). Las absorbancias se pueden expresar como se indica a continuación:
A252 -(Cd x 80252) (Ca x SA252)
A28O = (Cd X So28o) (Ca X SA28o)
en las que:
• Cd y Ca son respectivamente las concentraciones en la disolución del maitansinoide y del anticuerpo
• eD252 y eD280 son respectivamente los coeficientes molares de extinción del maitansinoide a 252 nm y 280 nm • 8A252 y 8A280 son respectivamente los coeficientes molares de extinción del anticuerpo a 252 nm y 280 nm. La resolución de estas dos ecuaciones con dos desconocidos conduce a las ecuaciones siguientes:
Cd = [(SA280 X A252) - (SA252 X A280)] / [(SD252 X Sa28o) " (SA252 X Sd28o)]
Ca - [A28O -(Cd x Sd28o)] / SA280
La DAR promedio se calcula entonces a partir de la relación de la concentración de fármaco a la del anticuerpo: DAR = Cd/Ca.
Desglicosilación y espectrometría de masas de alta resolución de los conjugados (HRMS)
La desglicosilación es una técnica de digestión enzimática mediante glicosidasa. La desglicosilación se realiza a partir de 500 pl de conjugado 100 pl de amortiguador Tris HCl 50 mM 10 pl de enzima glucanasa-F (100 unidades de enzima liofilizada/100 pl de agua). El medio se sometió a vórtice y se mantuvo una noche a 37°C. La muestra desglicosilada está entonces lista para ser analizada en HRMS. Los espectros de masas se obtuvieron en un sistema Waters Q-Tof-2 en modo de electropulverización positiva (ES+). Las condiciones cromatográficas son las siguientes: columna: 4 pm BioSuite 250 URH SEC 4,6 x 300 mm (Waters); disolventes: A: formiato de amonio 25 mM 1% de ácido fórmico, B: CH3CN; temperatura de la columna: 30°C; caudal 0,4 ml/min.; elución isocrática 70% de A 30% de B (15 min).
Cromatografía analítica de exclusión por tamaño (SEC)
- Columna: Columna TSKgel G3000 SWXL 5 pm, 7,8 mm x 30 cm, TOSOH BIOSCIENCE, LLC n° de pieza 08541 columna de guarda TSK-GEL SWXL 7 pM, 40 mm x 6mm, TOSOH BIOSCIENCE, LLC n° de pieza 08543
- Fase Móvil: KCl (0,2M), KH2PO4 (0,052 M), K2HPO4 (0,107 M), iPrOH (20% en volumen)
- Condiciones de análisis: elución isocrática a 0,5 ml/min. durante 30 min.
- Análisis realizado en un sistema HPLC Lachrom Elite (Merck) usando un detector espectrofotométrico con DAD L2455.
Contenidos de amortiguadores
- Amortiguador A (pH 6,5): NaCl (50 mM), amortiguador de fosfato de potasio (50 mM), EDTA (2 mM) - Amortiguador HGS (pH 5,5): histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa al 5% (p/v), HCl (8 mM) Abreviaturas usadas
CV: Volumen de la columna; DAR: Relación de fármaco a anticuerpo; DMA: dimetilacetamida; HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-etanosulfónico; HRMS: espectroscopia de masas de alta resolución; NHS: N-hidroxisuccinimida; Nitro-SPDB: éster 4-[(5-nitro-2-piridinil)ditio]-2,5-dioxo-1 -pirrolidinílico del ácido butanoico (puede prepararse como se describe en la patente WO2004016801); NMP: N-metilpirrolidinona; RT: temperatura ambiente; SEC: cromatografía de exclusión por tamaño
ADC (quimeras):
chMAb1 -SPDB-DM4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 148438 g/mol; MW(DM4) = 780,38 g/mol
8280nm(Ab) = 213320; 8252nm(Ab) = 73473
8280nm(DM4) = 5180 y 8252nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,59 ml de chMAbl (C = 5,72 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,312 ml de DMA y 0,046 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (5,0 eq - disolución 15 mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos, y después se agita lentamente a RT durante 3 horas. Con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 3,8 ml de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,389 ml de DMA y 0,074 ml de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 2,5 horas a RT, la mezcla de reacción bruta se purifica en una columna desaladora HiLoad 26/60 (Superdex 200 pg; GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP en volumen. El conjugado se eluye con amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan, se concentran en Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore), y se filtran en un filtro de 0,22 pm.
Se obtienen así 7,6 ml de conjugado chMAb1-SPDB-DM4 (c = 2,19 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV)= 3,38; DAR (SEC)= 3,34; RT = 17,54 min.; pureza monomérica = 99,8%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 8.
chMAb2-SPDB-DM4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 147900 g/mol; MW(DM4) = 780,38 g/mol
£280nm (Ab) = 201400 ; £252nm (Ab) = 70889
£28ünm(DM4) = 5180 y £252nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,8 ml de chMAb2 (C = 5,08 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,337 ml de DMA y 0,0433 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (5,0 eq - disolución 15 mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos, y después se agita lentamente a RT durante 3 horas. Con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 3,12 ml de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,319 ml de DMA y 0,069 ml de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a Rt , la mezcla de reacción bruta se filtra en un filtro de 0,45 pm y se purifica en una columna desaladora HiLoad 26/60 (Superdex 200 pg; GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP en volumen. El conjugado se eluye con amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan, se concentran en Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore), y se filtran en un filtro de 0,22 pm.
Se obtienen así 7,5 ml de conjugado chMAb2-SPDB-DM4 (c = 1,8 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV) = 4,10; DAR (SEC) = 4,05; RT = 17,52 min.; pureza monomérica = 99,9%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 9.
chMAb4-SPDB-DM4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 148124 g/mol; MW(DM4) = 780,38 g/mol
£280nm 280nm(Ab) = 204380; £280nm 252nm(Ab) = 73142
£280nm 280nm(DM4) = 5180 y £280nm 252nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,63 ml de chMAb4 (C = 5,69 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,316 ml de DMA y 0,0465 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (5,0 eq - disolución 15mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos, y entonces se agita lentamente a RT durante 3 horas. Con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 3,8 ml de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,389 ml de DMA y 0,074 ml de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT, la mezcla de reacción bruta se purifica en una columna desaladora HiLoad 26/60 (Superdex 200 pg; GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP en volumen. El conjugado se eluye con amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan, se concentran en Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore), y se filtran en un filtro de 0,22 pm.
Se obtienen así 6,5 ml de conjugado chMAb4-SPDB-DM4 (c = 2,20 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV) = 3,87; DAR (SEC) = 3,85; RT = 17,52 min.; pureza monomérica = 99,8%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 10.
chMAb5-SPDB-DM4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 148040 g/mol; MW(DM4) = 780,38 g/mol
£280nm 280nm(Ab) = 207360; £280nm 252nm(Ab) = 72288
£280nm 280nm(DM4) = 5180 y £280nm 252nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,15 ml de chMAb5 (C = 6,38 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,269 ml de DMA y 0,0453 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (5,0 eq - disolución 15 mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos, y entonces se agita lentamente a RT durante 3 horas. Con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 4,1 ml de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,317 ml de DMA y 0,072 ml de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT, la mezcla de reacción bruta se filtra en un filtro de 0,45 mm y se purifica en una columna desaladora HiLoad 26/60 (Superdex 200 pg; GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP en volumen. El conjugado se eluye con amortiguador de PBS pH 7,4 que contiene 5% de NMP, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan, se concentran en Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore) y se filtran en un filtro de 0,22 mm.
Se obtienen así 7,5 ml de conjugado AntiCEACAM5_hyb_1917CEA4_VH5Q7S_VL41G42K45Q_IgG1-SPDB-DM4 (c = 3,4 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV) = 3,4; DAR (SEC) = 3,4; RT = 17,49 min.; pureza monomérica = 99,8%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 11.
Ejemplo 5.3: Eficacia in v iv o
Los cuatro conjugados quiméricos (chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1-SPDB-DM4, chMAb5-SPDB-DM4 y chMAb2-SPDB-DM4) se evaluaron a 2 dosis frente a tumores medibles de colon primario CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra SCID. Los grupos de control se dejaron sin tratar. Las dosis de los conjugados se proporcionaron en mg/kg. Se administraron a 5 y 2,5 por una inyección de bolo intravenosa (IV) en el día 14 después del implante del tumor.
Para la evaluación de la actividad anti-tumoral de los conjugados, los animales se pesaron diariamente, y los tumores se midieron 2 veces a la semana con un calibre. Una dosificación que producía un 20% de pérdida de peso corporal en el punto más bajo (media del grupo) o 10% o más muertes relacionadas con el fármaco se consideró una dosificación excesivamente tóxica. Los pesos corporales de los animales incluían los pesos de los tumores. Los volúmenes tumorales se calcularon usando la fórmula masa (mm3) = [longitud (mm) x anchura (mm)2]/2. Los criterios primarios de valoración de la eficacia son AT/AC, mediana del porcentaje de regresión, y regresiones parcial y completa (PR y CR).
Los cambios del volumen tumoral para cada animal tratado (T) y de control (C) se calculan para cada tumor restando el volumen tumoral en el día del primer tratamiento (día de estadificación) del volumen tumoral en el día de observación especificado. El AT mediano se calcula para el grupo tratado, y el AC mediano se calcula para el grupo de control. A continuación se calcula la relación AT/AC y se expresa como un porcentaje: AT/AC = (delta T/delta C) x 100.
La dosis se considera como terapéuticamente activa cuando AT/AC es menor de 40%, y muy activa cuando AT/AC es menor de 10%. Si AT/AC es menor de 0, la dosis se considera como altamente activa y se data el porcentaje de regresión (Plowman J, Dykes DJ, Hollingshead M, Simpson-Herren L y Alley MC. Human tumor xenograft models in NCI drug development. En; Feibig HH BA, editor. Basel: Karger.; 1999 p 101-125):
% de regresión tumoral se define como el % de disminución del volumen tumoral en el grupo tratado en un día de observación especificado comparado con su volumen en el primer día del primer tratamiento.
El % de regresión se calcula en un tiempo de medición específico y para cada animal. Después se calcula el % de regresión mediano para el grupo:
volument0 - volument %deregresión(at) = x100
volument0
Regresión parcial (PR): Las regresiones se definen como parciales si el volumen tumoral disminuye al 50% del volumen tumoral al comienzo del tratamiento.
Regresión completa (CR): La regresión completa se logra cuando el volumen tumoral = 0 mm3 (CR se considera cuando el volumen tumoral no se puede registrar).
Resultados:
Los resultados se presentan en la Figura 4 y en la Tabla 9 (más adelante). Usando un esquema de una única administración a 2,5 y 5 mg/kg, ninguno de los conjugados ensayados en este estudio indujo toxicidad. chMAb1-SPDB-DM4 fue muy activo a 5 y 2,5 mg/kg con una AT/AC de 0 y 7% (p < 0,0001 y p = 0,0170 frente al control), respectivamente. chMAb4-SPDB-DM4 y chMAb5-SPDB-DM4 fueron altamente activos a 5 mg/kg con AT/AC de -5 y -7% (p < 0,0001 frente al control), respectivamente, y regresión tumoral de 25 y 65%, respectivamente. Fueron muy activos a 2,5 mg/kg con AT/AC de 7 y 2% (p = 0,0152 y p = 0,0020 frente al control), respectivamente. chMAb2-SPDB-DM4 fue altamente activo a 5 y 2,5 mg/kg con AT/AC de -10 y -8% (p < 0,0001 frente al control), respectivamente, regresión tumoral de 82 y 39%, respectivamente, y 3 y 1 CR/6, respectivamente. A partir de estos resultados, todos los conjugados quiméricos chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1-SPDB-DM4, chMAb5-SPDB-DM4 y chMAb2-SPDB-DM4 fueron usables para desarrollar un ADC terapéutico.
Figure imgf000048_0001
Ejemplo 6: Humanización del mAb anti-CEACAM5_MAb2
En este ejemplo, se han diseñado in silico variantes humanizadas de IgG MAb2 murino parental. Los mAb resultantes se produjeron y proporcionaron características similares al IgG ch-MAb2 quimérico.
Ejemplo 6.1: Protocolo de humanización 4D
a) Humanización basada en trayectorias moleculares dinámicas
Las secuencias de VL y VH del clon MAb2 murino se compararon frente a la base de datos de proteínas (PDB) (Berman et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242). Se usaron los moldes siguientes: marco de la cadena ligera y pesada - 3EHB (90,9% de identidad de cadena ligera del marco y 90,8% de identidad de cadena pesada del marco), L1 -1I8M, L2 - 1 F6L, L3 - 1 P7K, H1 - 2QHR, H2 - 11GT y H3 - 1 P4B para construir un modelo de homología de anti-CEACAM5 LC y HC usando Molecular Operating Environment (MOE) (v. 2011.10 - Chemical Computing Group, Quebec, Canadá). Posteriormente, el modelo de homología se minimizó en energía usando los procedimientos estándar implementados en MOE.
Posteriormente, se realizó una simulación de dinámicas moleculares (MD) del modelo de homología 3D minimizado del MAb2 murino, con restricciones en la cadena principal proteica a 500 K de temperatura durante 1,1 nanosegundos (ns) en disolvente implícito de Born generalizado. Se extrajeron 10 conformaciones diversas de este primer ciclo de MD cada 100 picosegundos (ps) para el último 1 ns. Cada una de estas diversas conformaciones se sometió entonces a una simulación de MD, sin restricciones en la cadena principal proteica y a 300 K de temperatura durante 2,3 ns. Para cada uno de los 10 ciclos de MD, las últimas 2000 imágenes, una cada ps, de la trayectoria de MD se usaron entonces para calcular, para cada aminoácido de MAb2 murino, sus desviaciones cuadráticas medias (rmsd) comparado con una posición medoide de referencia. Comparando la rmsd promedio en los 10 ciclos de MD separados de un aminoácido dado con la rmsd promedio global de todos los aminoácidos murinos de MAb2, se decide si el aminoácidos es lo suficientemente flexible, como se observa durante la MD, para considerarse que probablemente interacciona con los receptores de las células T y que es responsable de la activación de la respuesta inmune. Se identificaron 32 aminoácidos como flexibles en el anticuerpo MAb2 murino, excluyendo la CDR y sus alrededores inmediatos a 5 Á.
El movimiento de los 60 aminoácidos más flexibles de MAb2 murino, durante los 20 ns (10 x 2 ns) de simulación de dinámica molecular, se comparó después con el movimiento de los aminoácidos flexibles correspondientes de 49 modelos de homología 3D humanos, para cada uno de los cuales se realizaron las mismas simulaciones de MD. Estos 49 modelos de línea germinal humana se han construido combinando sistemáticamente un panel representativo de 7 cadenas ligeras humanas (concretamente vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) con un panel representativo de 7 cadenas pesadas humanas (concretamente vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) (Nucleic Acid Research, 2005, Vol. 33, Database issue D593-D597).
La combinación vk1-vh6 mostró la similitud más alta (72,6%) 4D de sus aminoácidos flexibles comparado con los aminoácidos flexibles del anticuerpo MAb2 murino; este modelo se usó por lo tanto para humanizar el anticuerpo MAb2 centrándose en los aminoácidos flexibles. Para la asociación de aminoácidos por parejas entre los aminoácidos de MAb2 murino y vk1-vh6, las 2 secuencias se alinearon basándose en la superposición 3D óptima de los carbonos alfa de los 2 modelos de homología correspondientes.
b) Mutaciones estabilizadoras
Para mejorar la estabilidad de las regiones VL y VH del anticuerpo anti-CEACAM5, se propone originalmente que los aminoácidos de las cadenas ligera y pesada con baja frecuencia de aparición frente a sus secuencias canónicas respectivas, excluyendo las CDR, estén mutados en los aminoácidos encontrados más frecuentemente (AAGth > 0,5 kcal/mol; (Monsellier et al. J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593). Una primera lista de mutaciones de consenso para la LC y para la HC se ha restringido a los aminoácidos encontrados en el modelo humano más cercano (es decir, vk1-vh6). Ninguna de estas mutaciones está localizada en la zona “Vernier” (Foote et al., J. Mol. Biol. 1992, 224, 487­ 499). Se tienen en cuenta otros criterios para considerar estas mutaciones de consenso para estabilizar potencialmente el anticuerpo MAb2 anti-CECAM5. Estos criterios son un cambio favorable de hidropatía en la superficie, o una estabilización predicha del mutante basado en mecánicas moleculares. Se consideraron las mutaciones estabilizadoras indicadas como exitosas en la bibliografía (Bedouelle, H. J. Mol. Biol. 2006, 362, 580­ 593; Steipe B. J. Mol. Biol. 1994, 240, 188-192).
c) Eliminación de motivos de secuencias no deseados
Se consideraron los siguientes motivos de secuencias: Asp-Pro (enlace lábil a ácidos), Asn-X-Ser/Thr (glicosilación, X = cualquier aminoácido salvo Pro), Asp-Gly/Ser/Thr (formación de succinimida/iso-asp en áreas flexibles), Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys (sitios de desamidación expuestos), Met (oxidación en área expuesta). Las secuencias humanizadas resultantes se analizaron por blast en busca de la similitud de secuencias frente a la base de datos Immune Epitope Data Base (IEDB) database ((PLos Biol (2005) 3(3)e91) http://www.immuneepitope.org) para asegurar que ninguna de las secuencias contenía ningún epítopo conocido de células B o T listado.
d) Regiones VH y VL humanizadas
Se proponen tres versiones para la cadena ligera (VL1, VL1a, y VL1c) y tres versiones para la cadena pesada (VH1, VH1a y VH1b). La combinación particular de restos de aminoácidos alterados en cada variante de VL y VH de MAb2 humanizado se muestra en la Tabla 10 y en la Tabla 11, respectivamente. Las secuencias completas de aminoácidos de los dominios VH y VL humanizados se muestran en la Tabla 12.
La variante VL1 presenta 5 mutaciones que derivan de la comparación directa entre los aminoácidos más flexibles no de CDR de la cadena ligera de MAb2 anti-CEACAM5 y la secuencia de cadena ligera humana de vk1.
La variante VL1a deriva de VL1 e incluye 4 nuevas mutaciones que son de consenso (secuencia vk1) y potencialmente estabilizadoras. Además, 1 de estas mutaciones plantea un sitio de desamidación potencialmente problemático (D17T18).
La variante VL1c deriva de VL1a con la introducción de 1 mutación R en lugar de K en la posición 52. De hecho, este K52 está localizado en la CDR L2 y podría ser una “diana” para el proceso de conjugación.
La variante VH1 presenta 7 mutaciones que derivan de la comparación directa entre los aminoácidos más flexibles no de CDR de la cadena pesada de anti-CEACAM5 y la secuencia de cadena pesada humana de vh6.
La variante VH1a deriva de VH1 e incluye 4 nuevas mutaciones que son de consenso (secuencia vh6) y potencialmente estabilizadoras.
Los dominios VL y VH humanizados del anticuerpo MAb2 anti-CEACAM5 se combinaron como sigue: VL1 y VH1; VL1a y VH1a; VL1c y VH1a; VL1a y VH1b.
Tabla 10: Mutaciones de las variantes VL del anticuerpo MAb2 anti-CEACAM5
Figure imgf000050_0001
Tabla 11: Mutaciones de las variantes VH del anticuerpo MAb2 anti-CEACAM5
Figure imgf000050_0002
Tabla 12: Secuencias de aminoácidos de VH y VL de anticuerpos anti-CEACAM5 humanizados ejemplares.
Figure imgf000051_0001
Ejemplo 6.2: Secuencia de mAb anti-CEACAM5 humanizado
A partir de las secuencias de aminoácidos de las variantes VL y VH in silico, se derivaron las secuencias de ácido nucleico y se sintetizaron por Geneart. Las secuencias se clonaron en vectores de expresión fusionadas con las secuencias codificantes del dominio constante de IgG1 humana o de Ckappa humana, respectivamente.
Ejemplo 6.3: Producción y caracterización in v itro
Se produjeron lotes de mAb humanizados por expresión transitoria en HEK293 y se purificaron por cromatografía de afinidad en proteína A. La estructura e identidad se confirmaron por análisis por SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaños y espectrometría de masas.
La afinidad por CEACAM5 humana y de macaco se verificó por ELISA; las CE50 se proporcionan en la Tabla 13.
Tabla 13: Afinidad de mAb anti-CEACAM5 humanizado por CEACAM5 humana y de macaco
Figure imgf000051_0002
La especificidad por CEACAM5 humana frente a CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 y CEACAM8 humanas se verificó por ELISA. Se dio a conocer como el porcentaje de unión comparado con la unión completa con CEACAM5 humana; véase la Tabla 14.
Tabla 14: Porcentaje de unión de mAb anti-CEACAM5 humanizado a CEACAM humanas
Figure imgf000051_0003
El dominio de unión al epítopo se verificó por ELISA, y se mostró que las variantes humanizadas reconocían el dominio A3-B3 específicamente. Se dio a conocer como el porcentaje de unión comparado con la unión completa con CEACAM5 humana en la Tabla 15.
Tabla 15: Porcentaje de unión de mAb anti-CEACAM5 humanizado a dominios de CEACAM5 humana
Figure imgf000052_0001
Las cinéticas de unión de las variantes de MAb2 anti-CEACAM5 humanizadas, comparadas con MAb2 quimérico, a CEACAM5 humana recombinante (hCEACAM5) y a CEACAM5 de mono macaco (cCEACAM5) se determinaron por un ensayo de resonancia de plasmones superficiales usando un BIAcore 2000 (BIAcore Inc., Uppsala, NJ).
Brevemente, un chip biosensor de BIAcore CM5 se acopló en el instrumento y se activó con 70 pl de NHS/EDC 1:1 a temperatura ambiente. Se inmovilizó una IgG1 de ratón anti-Fc humano (BIAcore #BR-1008-39) (50 pg/mL en amortiguador de acetato 1M, pH 5) en los chips activados en todas las celdas de flujo. La inmovilización se llevó a cabo a un caudal de 10 pl/min. hasta la saturación. El chip se bloqueó entonces por inyección de 70 pl de etanolamina-HCl, pH 8,5, seguido de un lavado con MgCl23M. Para medir la unión de los mAb anti-CEACAM5 a la proteína CEACAM5 humana o a la proteína CEACAM5 de macaco, se usaron los anticuerpos a 1-5 pg/ml en amortiguador de migración de BIAcore (HBS-EP). Los antígenos (CEACAM5 humana o CEACAM5 de macaco) se inyectaron de 1 a 500 nM. Después de la finalización de la fase de inyección, se monitorizó la disociación en un amortiguador de migración de BIAcore al mismo caudal durante 600 segundos. La superficie se regeneró entre las inyecciones usando 2 x 5 pl MgCl23M (2 x 30 s). Los sensogramas individuales se analizaron usando el software BIAevaluation.
Tabla 16: Unión de mAb anti-CEACAM5 humanizado a CEACAM5 humana y de mono
Figure imgf000052_0002
La especificidad de las variantes de MAb2 anti-CEACAM5 humanizadas, comparada con MAb2 quimérico, por CEACAM5 de macaco frente a CEACAM1, CEACAM6 y CEACAM8 de macaco se verificó por ELISA. Se indicó como el porcentaje de unión comparado con la unión completa con CEACAM5 o unión a la CE50; véase la Tabla 17 a continuación.
Tabla 17: Porcentaje de unión de mAb anti-CEACAM5 humanizado a las CEACAM de macaco
Figure imgf000052_0003
Ejemplo 6.4: Caracterización de variantes humanizadas de Mab2 obtenidas por injerto en marcos de línea germinal humana
En este ejemplo, se obtuvieron variantes humanizadas de Mab2 por una estrategia de injerto de CRD. Además, las CDR del anticuerpo humanizado se sometieron a una estrategia de escaneo de alanina para mostrar que varias posiciones podían sustituirse sin afectar la unión a CEACAM5 humana y de Macaca fascicularis.
La secuencia de una versión humanizada de Mab2 se generó en primer lugar in silico seleccionando marcos de línea germinal humana tomando como base la homología estructural con el anticuerpo murino Mab2. Para la cadena ligera, los marcos humanos seleccionados están definidos por los genes IGKV1D-39*01 y IGKJ2*02, y para la cadena pesada, por los genes IGHV3-23*04 y IGHJ4*01. Las seis CDR de Mab2K52R se injertaron en estos marcos humanos. Se introdujeron tres retromutaciones, correspondientes a las posiciones 34 y 53 en la VL (SEQ ID NO. 34) (regiones FR2-L y FR3-L, respectivamente) y a la posición 50 en la VH (SEQ ID nO. 33) (región FR2-H), que da como resultado la secuencia siguiente, definida como MAb2_VLg5VHg2.
Tabla 18: Secuencias de VH y VL de MAb2_VLg5VHg2
Figure imgf000053_0001
Se obtuvieron varias variantes de MAb2_VLg5VHg2 por el único reemplazo de cada aminoácido de las seis CDR, preferiblemente por una alanina. Cuando la alanina ya se encontraba en las CDR de MAb2_VLg5VHg2, lo que ocurre en H-CDR3, se sustituyó otro aminoácido (Val en el resto 97, Arg en el resto 98, y Asp en el resto 108 de SEQ ID NO:74).
A partir de las secuencias de aminoácidos de las variantes VL y VH in silico, se derivaron las secuencias de ácido nucleico y se generaron por síntesis génica. Las secuencias se clonaron en un vector de expresión de mamífero fusionadas con las secuencias codificantes del dominio constante de IgG1 humana o de Ckappa humana respectivamente. Las variantes únicas humanizadas MAb2_VLg5VHg2, que difieren de ésta en una posición, y un número limitado de mutantes de combinación, se produjeron por la expresión transitoria en células HEK293. Los sobrenadantes celulares que contenían las IgG segregadas (20 a 70 mg/ml) se diluyeron hasta 1 mg/ml para uso en ensayos de unión a ECD de CEACAM5 humana, ECD de Macaca fascicularis y dominio A3-B3 de CEACAM5 humana.
Para evaluar el impacto de estas modificaciones, la unión de IgG se determinó midiendo las señales deSPR con una unidad Biacore T200 (GE Healthcare). Se acoplaron anticuerpos anti-Fc humano a un chip Series S CM5 mediante un kit de acoplamiento de amina para alcanzar un nivel de 10.000 unidades de respuesta (RU). Aproximadamente 300 a 600 RU de cada variante se capturaron inyectando sobrenadantes a 1 mg/ml con un tiempo de contacto de 60 segundos y un caudal de 10 ml/min. Todos los experimentos se realizaron a 25°C con HBS-EP+ (Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05%) como el amortiguador de migración. En un modo de cribado, se inyectó CEACAM5 humana/CEACAM5 de macaco/dominio A3B3 humano a 50 nM sobre las variantes IgG capturadas, a un caudal de 30 ml/min. durante 1 minuto. Se mantuvo una fase de disociación de 60 segundos antes de que la superficie se regenerara con una inyección de 1 pulso de MgCl23 M a un caudal de 10 ml/minuto y un tiempo de contacto de 30 segundos.
Para cada experimento, se procesaron los datos de respuesta usando una superficie de referencia, permitiendo de esta manera la corrección para cambios en el índice de refracción bruto y cualquier unión no específica. Los datos se referenciaron doblemente usando respuesta de inyecciones de blanco. De acuerdo con el método de cribado descrito en una nota de solicitud de GE Healthcare (nota de solicitud 28-9777-72 AA), se consideraron dos parámetros para clasificar las variantes con respecto a las características de unión. En primer lugar, la actividad de unión se estima por la proporción de la señal máxima teórica medida (porcentaje de Rmax, véase la Figura 16). En segundo lugar, el porcentaje de señal restante se calcula usando puntos indicados de disociación (el primero 10 segundos después del final de la inyección, y el segundo 50 segundos después del final de la inyección), y refleja la estabilidad de la unión (véase la Figura 17).
Las variantes de una sola alanina en las posiciones siguientes demostraron parámetros de unión equivalentes, comparados con el anticuerpo original, lo que sugiere que los aminoácidos de CDR en esas posiciones son neutros para la unión: restos de LC 27, 28, 29, 31,51,52, 89, 90, 93, 94, 96, 97, y restos HC 26 a 31,51 a 58, 97, 103, 104, 107, 109. Los comportamientos de estas variantes son similares con CEACAM5 humana y de mono, manteniendo así su reactividad cruzada. También se encontró que la unión al dominio A3-B3 de CEACAM5 no resultaba afectada. También se generaron algunas combinaciones de dos sustituciones neutras, y se encontró que daban como resultado parámetros de unión inalterados, como se ilustra con asociación de LC_T51A con LC_T94A, LC_S31A con HC_G54Y, o LC_T53I con HC_S53A.
A la inversa, en todas las demás posiciones de CDR, se encontró que la sustitución del aminoácido original por alanina induce una pérdida completa de unión o alteró drásticamente los parámetros de la unión. La posición 101 de la cadena pesada o las posiciones 32 y 91 de la cadena ligera son ejemplos mostrados en las Figuras 16 y 17. Un segundo conjunto de variantes consistió en ensayar más mutaciones conservativas en algunas de dichas posiciones. Haciendo esto, encontramos que las sustituciones conservativas siguientes eran neutras para la unión al antígeno: Tyr por Phe en el resto 30 de MAb2_VLg5, Phe por Tyr en el resto 92 del MAb2_VLg5, Ser por Ala en el resto 98 de MAb2_VHg2 y Phe por Tyr en el resto 100 de MAb2_VHg2 (mostrados en las figuras).
Ejemplo 7: variantes humanizadas de conjugados de MAb2 fármaco
Ejemplo 7.1: Producción y caracterización
huMAb2-2-SPDB-DM4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 147360 g/mol; MW(DM4) = 780,38 g/mol
£280nm (Ab) = 201400; £28ünm (Ab) = 71693
£280nm (DM4) = 5180; £280nm (DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 19,4 mg de huMAb2-2 (C = 5,1 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,375 ml de DMA y 0,0439 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (5,0 eq - disolución 15 mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos y se agita lentamente a RT durante 2 horas. Se añade un volumen extra de 0,0044 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (5,0 eq - disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 2 ml de amortiguador de PBS pH =7,5 y 0,0702 ml de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT, la mezcla de reacción bruta se filtra en un filtro de 0,45 pm y se purifica en una columna desaladora HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5. El conjugado se eluye con histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 pm.
Se obtienen así 10,3 ml de conjugado huMAb2-2-SPDB-DM4 (c = 1,35 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV) = 3,7; DAR (SEC) = 3,6; RT = 17,29 min.; pureza monomérica = 97,9%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 12.
huMAb2-1 -SPDB-DM4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 147563 g/mol; MW(DM4) = 780,38 g/mol
£280nm(Ab) = 201400. £252nm(Ab) = 69669
£280nm(DM4) = 5180; £252nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,8 ml de una disolución de huMAb2-1 (C = 5,08 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,341 ml de DMA y 0,0392 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (4,5 eq -disolución 15 mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos y se agita lentamente a RT durante 3 horas. Se añade un volumen extra de 0,0087 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (1,0 eq -disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 2,62 ml de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,254 ml de DMA y 0,076 ml de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 1 hora a RT, la mezcla de reacción bruta se filtra en un filtro de 0,45 pm y se purifica en una columna desaladora HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5. El conjugado se eluye con histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 pm.
Se obtienen así 9,5 ml de conjugado huMAb2-1-SPDB-DM4 (c = 1,35 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV) = 4,1; DAR (SEC) = 4,0; RT = 17,39 min.; pureza monomérica = 96,7%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 13.
huMAb2-3-SPDB-DM4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 147417 g/mol; MW(DM4) = 780,38 g/mol
£280nm(Ab) = 201400; £252nm(Ab) = 71451
£280nm(DM4) = 5180; £252nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,8 ml de una disolución de huMAb2-3 (C = 5,09 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,336 ml de DMA y 0,0437 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (5 eq -disolución 15 mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos y entonces se agita lentamente a RT durante 3 horas. Se añade un volumen extra de 0,0035 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (0,4 eq -disolución 15 mM en DMA). Después de 1 hora a RT con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 2,60 ml de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,248 ml de DMA y 0,074 ml de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 1 hora a RT, la mezcla de reacción bruta se filtra en un filtro de 0,45 pm y se purifica en una columna desaladora HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5. El conjugado se eluye con histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 pm.
Se obtienen así 11 ml de conjugado huMAb2-3-SPDB-DM4 (c = 1,08 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV) = 3,9; Da R (SEC) = 3,8; RT = 17,44 min.; pureza monomérica = 98,4%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 14.
huMAb2-4-SPDB-DM4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 147628 g/mol; MW(DM4) = 780,38 g/mol
£28ünm(Ab) = 201400; £252nm(Ab) = 70628
£280nm(DM4) = 5180; £252nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 3,8 ml de una disolución de huMAb2-4 (C = 5,09 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 0,345 ml de DMA y 0,0448 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (5 eq -disolución 15 mM en DMA). La disolución se somete a vórtice durante 30 segundos y entonces se agita lentamente a RT durante 3 horas. Se añade un volumen extra de 0,0027 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (0,3 eq -disolución 15 mM en DMA). Después de 1 hora a RT con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 2,70 ml de amortiguador de PBS pH 7,5, 0,263 ml de DMA y 0,075 ml de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 1 hora a RT, la mezcla de reacción bruta se filtra en un filtro de 0,45 pm y se purifica en una columna desaladora HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5. El conjugado se eluye con histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 pm.
Se obtienen así 11 ml de conjugado huMAb2-4-SPDB-DM4 (c = 1,23 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV) = 3,8; Da R (SEC) = 3,8; RT = 17,53 min.; pureza monomérica = 99,3%.
El resultado del análisis de HRMS se muestra en la Figura 15.
Ejemplo 7.2: Citotoxicidad in v it ro
Material y métodos:
El efecto de los conjugados anti-CEACAM5 maitansinoide sobre la viabilidad de las células tumorales se evaluó como se describe en el ejemplo 3.4.
Resultados:
Tabla 19: Actividades citotóxicas de los ADC humanizados específicos de CEACAM5 sobre la línea celular
CEACAM5+ MKN45
Figure imgf000055_0001
Estos conjugados chMAb2-SPDB-DM4, huMAb2-1 -SPDB-DM4, huMAb2-2-SPDB-DM4, y huMAb2-3-SPDB-DM4 y el conjugado de DM4 irrelevante mostraron actividades citotóxicas in vitro en células MKN45 en cultivo con una CI50 de 0,24, 0,18, 0,23, 0,16, y 8,52 nM, respectivamente. Las actividades citotóxicas de los conjugados anti-CEACAM5 fueron 53 a 35 veces menores que la actividad medida del conjugado de DM4 irrelevante, indicando actividades citotóxicas mediadas por CEACAM5 de los conjugados anti-CEACAM5.
Ejemplo 7.3: Eficacia in v iv o frente a tumores de colon primarios CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra atímicos CD-1
Material y método
Dos secuencias humanizadas como conjugados huMAb2-3-SPDB-DM4 y huMAb2-4-SPDB-DM4 se evaluaron a niveles de 4 dosis comparado con chMAb2-SPDB-DM4, frente a tumores de colon primario medibles CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra atímicos CD-1. Los grupos de control se dejaron sin tratar. Las dosis de los conjugados se proporcionaron en mg/kg. Se administraron a 10, 5, 2,5 y 1,25 mg/kg por una inyección de bolo intravenosa (IV) en el día 19 después del implante del tumor.
La evaluación de la toxicidad y eficacia se realizó como se indica en el ejemplo 5.
Resultados:
Los resultados se presentan en la Figura 5 y en la Tabla 20 (más adelante).
Usando un esquema de una única administración a 1,25, 2,5, 5 y 10 mg/kg, ninguno de los conjugados ensayados en este estudio indujo toxicidad.
huMAb2-4-SPDB-DM4 y chMAb2-SPDB-DM4 fueron altamente activos a 10 mg/kg con AT/AC de -4% (p < 0,0001 frente al control) y regresión tumoral de 21 y 19%, respectivamente; activos a 5 mg/kg con AT/AC de 12 (p = 0,0105 frente al control) y 17% (p = 0,0417 frente al control), respectivamente; y marginalmente activos a 2,5 mg/kg con AT/AC de 36 y 37% (ns frente al control), respectivamente; e inactivos a 1,25 mg/kg. huMAb2-3-SPDB-DM4 fue altamente activo a 10 mg/kg con AT/AC de -6% (p < 0,0001 frente al control) y regresión tumoral de 31%; muy activo a 5 mg/kg con AT/AC de 4% (p < 0,0001 frente al control); activo a 2,5 mg/kg con AT/AC de 12 (p = 0,0322 frente al control); y marginalmente activo a 1,25 mg/kg con AT/AC de 34% (ns frente al control).
A partir de estos resultados, las dos secuencias humanizadas huMAb2-3-SPDB-DM4 y huMAb2-4-SPDB-DM4 fueron usables para desarrollar un ADC terapéutico. huMAb2-3-SPDB-DM4 fue la mejor de las dos secuencias.
Figure imgf000057_0001
Ejemplo 7.4: Eficacia in vivo frente a tumores de estómago primarios STO-IND-006 implantados s.c. en ratones hembra SCID
Material y método
El conjugado humanizado huMAb2-3-SPDB-DM4 se evaluó a 3 niveles de dosis frente a tumores de estómago primarios medibles STO-IND-006 implantados s.c. en ratones hembra SCID. Los grupos de control se dejaron sin tratar. Las dosis de los conjugados se proporcionaron en mg/kg. Se administraron a 10, 5 y 2,5 mg/kg por una inyección de bolo intravenosa (IV) en el día 27 después del implante del tumor.
La evaluación de la toxicidad y eficacia se realizó como se indica en el ejemplo 5.
Resultados:
Usando un esquema de una única administración a 2,5, 5 y 10 mg/kg, huMAb2-3-SPDB-DM4 no indujo toxicidad. Como se muestra en la Figura 6 y en la Tabla 21, huMAb2-3-SPDB-DM4 fue muy activo a 10 mg/kg con AT/AC de 7% (p < 0,0001 frente al control); activo a 5 mg/kg con AT/AC de 36% (p = 0,0281 frente al control); e inactivo a 2,5 mg/kg.
Figure imgf000059_0001
Ejemplo 7.5: Eficacia in vivo frente a tumores de pulmón primarios LUN-NIC-0014 implantados s.c. en ratones hembra SCID
Material y método
El conjugado humanizado huMAb2-3-SPDB-DM4 se evaluó a 3 niveles de dosis frente a tumores de pulmón primarios medibles LUN-NIC-0014 implantados s.c. en ratones hembra SCID. Los grupos de control se dejaron sin tratar. Las dosis de los conjugados se proporcionaron en mg/kg. Se administró a 10, 5 y 2,5 mg/kg por una inyección de bolo intravenosa (IV) en el día 29 después del implante del tumor.
La evaluación de la toxicidad y eficacia se realizó como se indica en el ejemplo 5.
Resultados
Usando un esquema de una única administración a 2,5, 5 y 10 mg/kg, huMAb2-3-SPDB-DM4 no indujo toxicidad. Como se muestra en la Figura 18 y en la Tabla 22, huMAb2-3-SPDB-DM4 fue altamente activo a 10 y 5 mg/kg con AT/AC inferior a 0% (p < 0,0001 frente al control) y regresión tumoral de 67 y 57%, respectivamente; y activo a 2,5 mg/kg con AT/AC de 12% (p = 0,0363 frente al control).
Figure imgf000061_0001
Ejemplo 7.6: Eficacia in vivo frente a tumores de colon primarios CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra SCID
Material y método
Tres conjugados, constituidos por el huMAb2-3 humanizado conjugado con el DM4 a través de dos enlazadores diferentes (SPDB y sulfo-SPDB), se evaluaron a 2 niveles de dosis frente a tumores de colon primario medibles CR-IGR-034P implantados s.c. en ratones hembra SCID. Los grupos de control se dejaron sin tratar. Las dosis de los conjugados se proporcionaron en mg/kg. Se administraron a 5 y 2,5 mg/kg por una inyección de bolo intravenosa (IV) en el día 19 después del implante del tumor.
La evaluación de la toxicidad y eficacia se realizó como se indica en el ejemplo 5.
Resultados
Usando un esquema de una única administración a 2,5 y 5 mg/kg, huMAb2-3-SPDB-DM4 y huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 no indujeron toxicidad.
Como se muestra en la Figura 19 y en la Tabla 23, huMAb2-3-SPDB-DM4 fue activo a 5 y 2,5 mg/kg con AT/AC de 12% y 40%, respectivamente (p < 0,0001 frente al control); huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 fue altamente activo a 5 mg/kg con AT/AC inferior a 0% (p < 0,0001 frente al control) y una regresión tumoral de 12%; y activo a 2,5 mg/kg con AT/AC de 1% (p < 0,0001 frente al control).
Figure imgf000063_0001
Ejemplo 8: Desarrollo de un protocolo de inmunohistoquímica (IHC) dedicado a la detección de proteína CEACAM5 humana y de mono en tejidos fijados con formalina y embebidos en parafina (FFPE).
Materiales y métodos
Tejidos
Se usaron micromatrices de tejido FFPE (TMA, Tabla 24) como fuente de tejidos humanos (tumorales y no tumorales) así como de mono macaco (normales).
Tabla 24: Micromatrices de tejido fijado en formalina y embebido en parafina usadas como fuentes de tejido
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000065_0001
Anticuerpos
MAb2 se usó como anticuerpo monoclonal primario de ratón anti-CEACAM5 humana. Una IgG1 de cabra anti-ratón conjugada con biotina (específica de cadena g1) (referencia 1070-08, lote L4309-X761, Southern Biotech, USA) se usó como anticuerpo secundario.
Inmunotinción
El procedimiento de recuperación del antígeno se aplicó con amortiguador Cell Conditioning 1 (CC1) a 95°C durante 8 min., y después a 100°C durante 28 min. Después de una etapa de bloqueo de biotinas endógenas, los portaobjetos se incubaron con el anti-anticuerpo primario diluido en disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) a 5 mg/ml durante 2 horas a 24°C. El anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con biotina se incubó a 24°C durante 32 minutos a 0,5 mg/ml. La inmunotinción se hizo con tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobenzidina (DAB) del kit de detección cromogénico DABMap™ (760-124, Ventana Medical Systems, Inc, USA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se realizó una etapa de contratinción con hematoxilina (760-2037, Ventana Medical Systems, Inc, USA) y se aplicó reactivo azulado (760-2037, Ventana Medical Systems, Inc, USA). Los portaobjetos teñidos se deshidrataron y se cubrieron con cubreobjetos con cytoseal XYL (8312-4, Richard-Allan Scientific, USA). Puntuación de IHC
Los portaobjetos inmunoteñidos se escanearon usando el sistema ScanScope XT (Aperio Technologies, Vista, CA). Se capturaron imágenes digitalizadas usando el software ImageScope (versión 10.2.2.2319, Aperio Technologies) a un aumento de x20.
La evaluación de la tinción incluyó el sitio histológico de reactividad, tipo principal de célula reactiva, intensidad de la tinción y frecuencia de la tinción celular. Las muestras negativas se puntuaron como 0+. Las muestras positivas se puntuaron con una escala de intensidad de 1+ a 4+. Los intervalos de intensidades se describieron como débil ]0;2+[, moderada [2+;3+[, y fuerte [3+;4+]. La frecuencia celular fue el porcentaje de células inmunoteñidas, y se estimó por la observación del histólogo como una mediana por muestra. La frecuencia celular se ordenó en 5 categorías de puntuación de proporción: 1 (0-5%), 2 (6-25%), 3 (26-50%), 4 (51-75%) y 5 (76-100%).
Para los tumores, se adaptó una puntuación de expresión global de la puntuación Allred (AS) (Mohsin S, Weiss H, Havighurst T, Clark GM, Berardo M, Roanh LD, et al. Progesterone receptor by immunohistochemistry and clinical outcome in breast cancer: a validation study. Mod. Pathol. 2004; 17:1545-1554). Esta AS se obtuvo sumando las puntuaciones de intensidad y proporción para obtener una puntuación total que varía de 0-9. La AS se dio como un porcentaje de la puntuación global máxima y varió en 5 categorías: muy baja (0-25%), débil (26-50%), moderada (51-75%), y alta (76-100%). La prevalencia se definió como el porcentaje de casos positivos para la indicación. Análisis estadístico descriptivo
Las estadísticas descriptivas se calcularon con el software Microsoft Excel 2003. Para cada indicación se describieron número de casos, número de casos positivos, prevalencia, mediana de la puntuación de intensidad, mediana de la frecuencia, media de la puntuación Allred, intervalo de intensidad, intervalo de frecuencia e intervalo de puntuación Allred.
Ejemplo 8.1: Uso de un anticuerpo monoclonal anti-CEACAM5 para la evaluación de la proteína CEACAM5 en tumores humanos FFPE por inmunohistoquímica (IHC)
Se estudió un gran panel de tumores humanos usando portaobjetos de matrices de tejido comerciales (formato FFPE). La expresión de la proteína CEACAM5 se localizó en membrana /citoplasma de las células tumorales (Figura 1C, D). Parte de la tinción de membrana estaba polarizada en el polo apical de las células en los tumores más diferenciados. Se encontró que la proteína CEACAM5 se expresa en:
89% de casos de adenocarcinoma de colon (194/219, intensidad 2-2,5+, frecuencia 53-59%, AS 60-66%) 49% de casos de adenocarcinoma de estómago (95/195, intensidad 2,5+, frecuencia 53%, AS 62%) 41% de casos de adenocarcinoma de pulmón (24/58, intensidad 1,8-2+, frecuencia 50-53%, AS 54-58%) 79% de casos de carcinoma escamoso de cuello de útero (11/14, intensidad 2+, frecuencia 22%, AS 46%) 53% de casos de adenocarcinoma de páncreas (18/34, intensidad 2+, frecuencia 23%, AS 42%)
37% de casos de carcinoma de células escamosas de esófago (23/62, intensidad 2+, frecuencia 16%, AS 38%)
4% de casos de carcinoma de ovario (3/77, intensidad 2+, frecuencia 43%, AS 54%)
11 % de casos de carcinoma de tiroides (2/18, intensidad 1,5+, frecuencia 63%, AS 56%)
25% de casos de carcinoma de vejiga (5/20, intensidad 1,5+, frecuencia 61%, AS 56%)
7% de casos de adenocarcinoma de endometrio (1/14, intensidad 2+, frecuencia 50%, AS 56%)
11 % de casos de carcinoma ductal de mama (2/18, intensidad 1,5+, frecuencia 53%, AS 50%)
53% de casos de colangiocarcinoma (2/6, intensidad 1,5+, frecuencia 75%, AS 50%)
53% de casos de carcinoma de células escamosas de pulmón (31/148, intensidad 1,5+, frecuencia 22%, AS 39%)
8% de casos de adenocarcinoma de próstata (1/13, intensidad 2+, frecuencia 50%, AS 44%)
25% de casos de carcinoma escamoso de la piel (2/8, intensidad 1,5+, frecuencia 23%, AS 39%) Ejemplo 8.2: Reactividad cruzada en tejidos de un anticuerpo monoclonal anti-CEACAM5 en mono Macaco (M a c a c a fa s c ic u la r is ) y comparación con el patrón de expresión humano
El dominio extracelular de la proteína de CEACAM5 de origen humano (h) o de mono macaco (c) se ha preparado mediante expresión transitoria en células de riñón embrionario humano HEK293 con el plásmido de ADNc de CEACAM5 (ejemplo 1, Tabla 1). Los peletes celulares se fijaron en formalina al 10% (Sigma Aldrich, USA) durante 16 horas, y se embebieron en parafina como una pieza de tejido de acuerdo con el procedimiento histológico estándar.
Se usaron TMA comerciales como fuente de tejido normal humano y de mono (Tabla 21).
La reactividad cruzada de Mab2 se mostró por inmunotinción en las células transfectadas tanto con CEACAM5 humana como de mono (localización en la membrana y el citoplasma).
En tejidos normales de macaco, la expresión de la proteína CEACAM5 se encontró en células epiteliales columnares absorbentes (2/3 casos positivos, intensidad mediana 1,5+, frecuencia media 55%).
En tejidos no tumorales humanos, la expresión de CEACAM5 también se observó en células epiteliales columnares absorbentes (62/64 casos positivos, intensidad mediana 2+, frecuencia media 90%). En los tejidos humanos, la expresión de CEACAM5 se observó en menor grado en células epiteliales del esófago, células epiteliales de cabeza y cuello, células epiteliales de la fosa gástrica del estómago, y células epiteliales del cuello uterino.
Ejemplo 9: Conjugado de anticuerpo fármaco (variante)
huMAb2-3-antiCEACAM5-sulfo-SPDB-DM4
Datos analíticos:
MW(Ab) = 147417 g/mol; MW(DM4) = 780,38 g/mol
£280nm(Ab) = 201400; £252nm(Ab) = 71451
£280nm(DM4) = 5180; £252nm(DM4) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 7,0 ml de una disolución de huMAb2-3 antiCEACAM5 (C = 5,32 mg/ml en amortiguador de PBS pH = 7,4) en un recipiente, seguido de 1,6 ml de DMA y 168,4 ml de disolución de enlazador nitro-sulfoSPDB (descrito en el documento WO2009134977) (10 eq - disolución 15 mM en DMA). La disolución se agita lentamente a RT durante 3 horas. Se añade un volumen extra de 3,4 ml de disolución de enlazador nitro-SPDB (2,0 eq - disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT con agitación magnética, se añadieron sucesivamente 2,90 ml de amortiguador de PBS pH 7,4, 0,407 ml de DMA y 0,322 ml de disolución de DM4 (disolución 15 mM en DMA). Después de 1 hora a RT, y 16 horas a 5°C, la mezcla de reacción bruta se purifica en una columna desaladora HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 1 CV de NaOH 1M, 2 CV de agua y 2 CV de histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5. El conjugado se eluye con histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 mm.
Se obtienen así 19 ml de conjugado huMAb2-3-antiCEACAM5-sulfoSPDB-DM4 (c = 1,51 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV) = 3,4; DAR (SEC)= 3,3; pureza monomérica = 99,8%; datos de HRMS: véase la Figura 20.
huMAb2-3 antiCEACAM5-SMCC-DM1
Datos analíticos:
MW(Ab) = 147417 g/mol; MW(DM1) = 738 g/mol
£280nm(Ab) = 201400; £252nm(Ab) = 71451
£280nm(DM1) = 5180; £252nm(DM1) = 26159
Con agitación, a RT, se introducen 11,3 ml de una disolución de huMAb2-3 antiCEACAM5 (C = 3,47 mg/ml en amortiguador A pH = 6,5) en un recipiente, seguido de 0,387 ml de DMA y 178 ml de disolución de enlazador SMCC (10 eq - disolución 15 mM en DMA). La disolución se agita lentamente a RT durante 2 horas. Se intercambia el amortiguador de la mezcla de reacción bruta en una columna desaladora HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 2 CV de NaOH 0,2M, 5 CV de agua y 5 CV de amortiguador de citrato (pH 5,5). El conjugado se eluye con amortiguador de citrato (pH 5,5), y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 mm. A esta disolución se añaden sucesivamente, con agitación, a RT, 0,476 ml de DMA y 0,124 ml de disolución de DM1 (disolución 15 mM en DMA). Después de 2 horas a RT, la mezcla de reacción bruta se purifica dos veces en una columna desaladora HiPrep 26/10 (Sephadex G25, GE Healthcare), preacondicionada con 2 CV de NaOH 0,2M, 5 CV de agua y 5 CV de histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5. El conjugado se eluye con histidina (10 mM), glicina (130 mM), sacarosa (5%), amortiguador pH = 5,5, y las fracciones de conjugado monomérico se combinan y se filtran en un filtro de 0,22 mm. Se obtienen así 9,5 ml de huMAb2-3 antiCEACAM5-SMCC-DM1 (c = 1,73 mg/ml) como una disolución transparente incolora. El conjugado se analiza entonces para determinar la carga final de fármaco y la pureza monomérica: DAR (UV) = 2,7; Da R (SEC) = 2,9; pureza monomérica = 99,6%; datos de HRMS: véase la Figura 21.
Ejemplo 10: Caracterización del epítopo y del paratopo de A3B3 de CEACAM5 en complejo con Fab de MAb2_VH1aVL1c usando intercambio de hidrógeno-deuterio asociado con espectrometría de masas (HDX MS)
Ejemplo 10.1: Principio de HDX MS
El intercambio de hidrógeno-deuterio de amida (HDX) asociado con espectrometría de masas (MS) permite la identificación de regiones de proteínas implicadas en cambios conformacionales o interacciones. Esta técnica permite más específicamente identificar las regiones de un antígeno que muestran, después de incubación en un amortiguador deuterado y proteolisis, una disminución de la incorporación de deuterio en su forma unida a un anticuerpo comparado con su forma libre.
El epítopo pertenece a estas regiones, cuyo intercambio se ralentiza por la unión al anticuerpo. Un artículo reciente describe con detalle las diferentes etapas para caracterizar epítopos usando esta estrategia (Zhang, Q., Willison, L. N., Tripathi, P., Sathe, S. K., Roux, K. H., Emmett, M. R., Blakney, G. T., Zhang, H. M. y Marshall, A. G. (2011). Analytical Chemistry 83, 7129-7136.).
Ejemplo 10.2: Materiales
Las secuencias codificantes del dominio variable de MAb2_VH1aVL1c (SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:29) se clonaron en un vector de expresión de mamíferos en fusión con las secuencias codificantes del dominio CH1 humano (como se encuentra en los Fabs derivados de IgG1 escindida por papaína), seguido de una etiqueta de hexa-histidina, o con el dominio constante Ckappa humano, respectivamente. Se produjo un lote de Fab de MAb2_VH1aVL1c en células HEK293-FS™ cultivadas en suspensión por transfección transitoria de dos plásmidos de expresión, que codifican las dos cadenas, formando un complejo con 293fectin™ (Invitrogen). El sobrenadante del cultivo que contiene la proteína segregada se recolectó siete días después de la transfección, se centrifugó y se filtró en una membrana de 0,22 pm. El Fab se purificó por cromatografía de afinidad en IMAC (HisTrap, GE Healthcare) usando gradiente de imidazol en PBS. Después, el conjunto de fracciones que contiene el Fab se purificó por cromatografía de exclusión por tamaños (Superdex 200, GE Healthcare) equilibrada con PBS.
El dominio A3B3 hCEACAM5 etiquetado con His (SEQ ID NO:67) se produjo con células HEK293-FS™ cultivadas en un matraz por transfección transitoria del plásmido de expresión. Cada día se añadió kifunensina (inhibidor del proceso de recorte en la glicosilación). El sobrenadante del cultivo que contiene la proteína segregada se recolectó siete días después de la transfección, se centrifugó y se filtró en una membrana de 0,22 pm. Se añadió endoH al sobrenadante hasta 625 u/ml, y después se incubó 3 h a 37°C. El A3B3 de hCEACAM5 desglicosilado se purificó por cromatografía de afinidad en IMAC (HisTrap, GE Healthcare) usando gradiente de imidazol en PBS. Después, el conjunto de fracciones que contiene el A3B3 de hCEACAM5 desglicosilado se purificó por cromatografía de exclusión por tamaños (Superdex 200, GE Healthcare) equilibrada con PBS. El análisis por espectrometría de masas de A3B3 de hCEACAM5 desglicosilado mostró dos especies (22485 y 22278 Da), lo que indica que la proteína porta 7 u 8 restos de N-acetilglucosamina (GlcNAc).
Para construir un complejo, ambas proteínas se combinaron con un exceso de 1,5 moles de A3B3 de hCEACAM5 desglicosilado por un mol de Fab. Este exceso se eliminó por cromatografía de exclusión por tamaño en superdex 200 equilibrada con disolución salina amortiguada con fosfato. Las fracciones correspondientes a Fab en complejo con el antígeno se usaron para el estudio de intercambio de deuterio.
Ejemplo 10.3: Métodos
Los experimentos de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX) se automatizaron completamente usando un automuestreador PAL (CTC Analytics). Activó el inicio y la parada del intercambio, el control de la temperatura de proteolisis (4°C), la inyección de los péptidos deuterados, la gestión de las válvulas de inyección y de lavado, y desencadenó la adquisición de las bombas del espectrómetro de masas y HPLC. Una caja enfriada por efecto Peltier (4°C) contenía dos válvulas Rheodyne automatizadas (6 puertos para inyección y 10 puertos para lavado), un cartucho de desalado (Micro Trap de péptidos de Bruker-Michrom) y una columna de HPLC (Poroshell 120 EC-C18, 1 x 50 mm, 2,7 pM de Agilent Technologies). La deuteración se inició por una dilución de 5 veces de CEACAM5, mAb o complejo con PBS en D2O. Se usó GndHCl 2M, TCEP 0,8 M, glicina 1 M para detener el retrointercambio y reducir los puentes de disulfuro durante 2 min. a 4°C.
Las proteínas se digirieron con las proteasas pepsina y nepentesina, y los péptidos se desalaron usando una bomba de HPLC de Agilent Technologies con TFA 0,03% en agua a 100 pl/min. Los péptidos se separaron entonces usando otra bomba de HPLC de Agilent Technologies con un gradiente 15-100% de B en 20 min. (A: TFA 0,03% en agua; B: acetonitrilo 90%, TFA 0,03% en agua). Las masas de los péptidos se midieron usando un espectrómetro de masas TOF con electropulverización (Agilent 6210).
Los péptidos se identificaron por MS en tándem (MSMS), usando un Bruker APEX-Q FTMS (9,4 T) y un Bruker 12 T SolariX.
Los software Data Analysis (Bruker) y Mass Hunter (Agilent Technologies) se usaron para las adquisiciones de los datos. Data Analysis y Mascot (Matrix Science) se usaron para procesar los datos de MSMS. Los software Mass Hunter y HD Examiner (Sierra Analytics) se usaron para el procesamiento de los datos de HDX.
Los experimentos de HDX se repitieron al menos tres veces.
Ejemplo 10.4: Resultados
Identificación y selección de los péptidos
Los puentes de disulfuro permanecieron intactos durante la deuteración para mantener la información estructural relacionada con ellos. Para favorecer la proteolisis y la identificación de los péptidos, los puentes se redujeron con TCEP después de la etapa de paralización a pH bajo y temperatura baja. Usando MSMS después de la digestión del complejo CEACAM5-Fab fue posible identificar un gran número de péptidos que surgen de las tres cadenas de proteína. Después de los experimentos de HDX, solo se seleccionaron los que proporcionaron señales de buena calidad: 25, 30 y 20 péptidos del antígeno A3-B3 de CEACAM5, cadena pesada de Fab de MAb2_VH1aVL1c y cadena ligera de MAb2_VH1aVL1c, respectivamente. Estos péptidos abarcan 89%, 77% y 68 % de las secuencias del antígeno A3-B3 de CEACAM5, cadena pesada de Fab de MAb2_VH1aVL1c y cadena ligera de MAb2_VH1aVL1c, respectivamente (Tabla 25). Las regiones no abarcadas de las cadenas de Fab están principalmente en sus partes C-terminales.
Tabla 25: Cobertura de secuencia con péptidos deuterados
Figure imgf000069_0001
Los 8 restos de asparagina que son sitios potenciales de glicosilaciones se identificaron en varios péptidos con una GlcNAc que queda de la desglicosilación con endo H. En particular, se encontró N114 en el péptido 108-115. En los primeros experimentos (no usados para HDX), se encontró N166 en ambas formas (con y sin GlcNAc). Podría explicar la heterogeneidad observada en el espectro de masas de A3B3 de CEACAM5 después de la glicosilación, que corresponde a 7 y 8 GlcNAc.
Identificación de epítopo y paratopo
El antígeno libre, el Fab libre y su complejo se deuteraron durante 2 min. o 20 min. a 4°C, o a 20 min. a temperatura ambiente (26°C). Considerando las cinéticas del intercambio de hidrógenos de amida con la temperatura (un incremento de intercambio de aproximadamente 3 veces con 10°C), la última condición es equivalente a 200 min. de deuteración a 4°C.
Epítopo
Las cinéticas de la incorporación de deuterio para los 25 péptidos seleccionados de A3B3 de CEACAM5 se compararon cuando el antígeno se deuteró en la forma libre y cuando estaba formando un complejo con el Fab. Varios péptidos no mostraron ninguna diferencia significativa en HDX (DHDX) entre ambos estados. Por el contrario, algunos de ellos (108-115 y 128-143) mostraron DHDX significativa. La segunda región estaba abarcada con 5 péptidos diferentes: 128-142, 128-143, 130-142, 130-143 y 140-143, que muestran 13-15 ± 2% (hasta 1,6 ± 0,2 D) DHDX después de 2 min. de deuteración.
Comparando 128-142 con 130-142, y 128-143 con 130-143, no medimos ningún cambio significativo en DHDX en cada caso (1,3-1,4 D para los dos primeros péptidos, y 1,6 para los dos últimos, después de 2 min. de deuteración), lo que significa que las amidas W129 y R130 probablemente no estén implicadas en el epítopo. Por el contrario, comparando 128-142 con 128-143, y 130-142 con 130-143, medimos un pequeño cambio en DHDX (aproximadamente 0,2 D), lo que significa que la amida F143 está implicada. El DHDX en el péptido 140-143 (aproximadamente 0,3 D) indica que las amidas V141 o L142 también podrían estar implicadas. Dentro de las 9 amidas de I131 a Q140, varias de ellas están implicadas en el epítopo (aproximadamente 1 DHDX compartido en promedio).
Estas diferencias en la incorporación de deuterio indican que el epítopo pertenece en particular a regiones (amidas), es decir, péptidos de secuencias SGANLNL (SEQ ID NO: 76) y INGIPQQHTQVLF (SEQ ID NO: 77).

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia SEQ ID NO: 5, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, una CDR1-H de secuencia SEQ ID NO:7, una CDR2-H de secuencia SEQ ID NO:8, y una CDR3-H de secuencia SEQ ID NO:9, y el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia SEQ ID NO: 29, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, una CDR1-L de secuencia SEQ ID NO:10, una CDR2-L de secuencia NTR, y una CDR3-L de secuencia SEQ ID NO:12.
2. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia SEQ ID NO: 5, o una secuencia al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a ésta.
3. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia SEQ ID NO: 29, o una secuencia al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a ésta.
4. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia SEQ ID NO:87, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta, y una cadena ligera que consiste en la secuencia SEQ ID NO:88, o una secuencia al menos 85% idéntica a ésta.
5. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Una célula hospedante que se ha transformado por un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado o enlazado a al menos un agente inhibidor del crecimiento.
8. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho agente inhibidor del crecimiento es un agente citotóxico o un isótopo radioactivo.
9. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que dicho agente inhibidor del crecimiento se selecciona del grupo que consiste en agentes quimioterapéuticos, enzimas, antibióticos, y toxinas tales como toxinas que son moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas, taxoides, vincas, taxanos, maitansinoide o análogos de maitansinoides, derivados de tomaimicina o pirrolbenzodiazepina, derivados de criptoficina, derivados de leptomicina, análogos de auristatina o dolastatina, profármacos, inhibidores de la topoisomerasa II, agentes alquilantes de ADN, agentes anti-tubulina, y CC-1065 o análogos CC-1065.
10. El inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicho agente inhibidor del crecimiento es (W2’-desacetil-A/2’-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina) DM1 o /V2’-desacetil-W-2’(4-metil-4-mercapto-1 -oxopentil)-maitansina (DM4).
11. El inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el anticuerpo está unido covalentemente mediante un enlazador escindible o no escindible a al menos un agente inhibidor del crecimiento.
12. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho enlazador se selecciona del grupo que consiste en piridilditiobutirato de N-succinimidilo (SPDB), ácido 4-(piridin-2-ildisulfanil)-2-sulfo-butírico (sulfo-SPDB), y (N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC).
13. El inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que el anticuerpo está enlazado covalentemente mediante piridilditiobutirato de N-succinimidilo (SPDB) a N2’-desacetil-N-2’(4-metil-4-mercapto-1 -oxopentil)-maitansina (DM4).
14. Un inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia SEQ ID NO:87 y una cadena ligera que consiste en la secuencia SEQ ID NO:88, y está enlazado covalentemente mediante piridilditiobutirato de N-succinimidilo (SPDB) a N2’-desacetil-N-2’(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (DM4).
15. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, para uso para el tratamiento de cáncer.
17. Un anticuerpo o un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el cáncer es cáncer colorrectal, de estómago, gástrico, o de pulmón.
18. Un método para producir un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, método el cual comprende las etapas que consisten en: (i) cultivar una célula hospedante transformada de acuerdo con la reivindicación 6; (ii) expresar dicho anticuerpo o polipéptido; y (iii) recuperar el anticuerpo o polipéptido expresado.
19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho anticuerpo se separa adecuadamente del medio de cultivo por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas.
20. Un método para producir un inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, que comprende las etapas de: (i) poner en contacto una disolución acuosa opcionalmente amortiguada de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 con disoluciones de un enlazador y un compuesto citotóxico, y (ii) después, separar opcionalmente el conjugado que se ha formado en (i) del anticuerpo que no ha reaccionado.
21. Un método para producir un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 20, en el que, después de la etapa (i) o (ii), la disolución que contiene el conjugado puede someterse a una etapa adicional (iii) de cromatografía, ultrafiltración y/o diafiltración.
22. Un método para preparar una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u obtenido mediante un método de acuerdo con las reivindicaciones 18 o 19, o un inmunoconjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 u obtenido mediante un método de acuerdo con las reivindicaciones 20 o 21, en el que una cantidad eficaz de dicho anticuerpo o de dicho inmunoconjugado se disuelve o dispersa en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.
ES17157890T 2012-11-20 2013-11-20 Anticuerpos anti-CEACAM5 y usos de los mismos Active ES2778823T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12306444 2012-11-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2778823T3 true ES2778823T3 (es) 2020-08-12

Family

ID=47257727

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13794894.9T Active ES2625742T3 (es) 2012-11-20 2013-11-20 Anticuerpos anti-CEACAM5 y usos de los mismos
ES17157890T Active ES2778823T3 (es) 2012-11-20 2013-11-20 Anticuerpos anti-CEACAM5 y usos de los mismos

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13794894.9T Active ES2625742T3 (es) 2012-11-20 2013-11-20 Anticuerpos anti-CEACAM5 y usos de los mismos

Country Status (39)

Country Link
US (4) US9617345B2 (es)
EP (3) EP3594243A1 (es)
JP (1) JP6324399B2 (es)
KR (4) KR102661801B1 (es)
CN (2) CN104918958B (es)
AR (1) AR093557A1 (es)
AU (2) AU2013349733C1 (es)
BR (1) BR112015010993B1 (es)
CA (2) CA3207769A1 (es)
CL (1) CL2015001321A1 (es)
CR (1) CR20150258A (es)
CY (1) CY1119219T1 (es)
DK (2) DK3199552T3 (es)
DO (1) DOP2015000110A (es)
EA (1) EA039377B1 (es)
EC (1) ECSP15025845A (es)
ES (2) ES2625742T3 (es)
HK (1) HK1215444A1 (es)
HR (2) HRP20170743T1 (es)
HU (1) HUE033369T2 (es)
IL (1) IL238559B (es)
LT (2) LT3199552T (es)
MA (1) MA38194B1 (es)
MX (1) MX358321B (es)
MY (1) MY171100A (es)
NZ (1) NZ708528A (es)
PE (1) PE20151180A1 (es)
PH (1) PH12015501092A1 (es)
PL (2) PL3199552T3 (es)
PT (2) PT3199552T (es)
RS (2) RS60043B1 (es)
SG (1) SG11201503285TA (es)
SI (2) SI3199552T1 (es)
TN (1) TN2015000177A1 (es)
TW (2) TWI664192B (es)
UA (1) UA120247C2 (es)
UY (1) UY35147A (es)
WO (1) WO2014079886A1 (es)
ZA (1) ZA201502959B (es)

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2013349733C1 (en) 2012-11-20 2020-10-01 Sanofi Anti-CEACAM5 antibodies and uses thereof
US9753036B2 (en) * 2014-04-29 2017-09-05 Edp Biotech Corporation Methods and compositions for screening and detecting biomarkers
CN109147874A (zh) * 2014-09-02 2019-01-04 伊缪诺金公司 用于配制抗体药物缀合物组合物的方法
CA2990755A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffman-La Roche Ag Bispecific anti-ceaxcd3 t cell activating antigen binding molecules
KR20180097615A (ko) 2016-01-08 2018-08-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항물질 및 항-cea/항-cd3 이중특이성 항체를 사용하는 cea-양성 암의 치료 방법
JP7032412B2 (ja) * 2016-10-10 2022-03-08 シンガポール・ヘルス・サービシーズ・ピーティーイー・リミテッド 抗ｃｅａｃａｍ６抗体及び使用方法
MX2019005558A (es) 2016-11-18 2019-08-12 Astellas Pharma Inc Fragmento fab de anticuerpo anti-muc1 de humano novedoso.
CN111499750B (zh) * 2016-12-04 2022-02-08 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 一种抗癌胚抗原的高中和活性纳米抗体及其应用
CN108341876B (zh) * 2017-01-22 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗人ceacam5单克隆抗体及其制备方法和应用
CN106946989B (zh) * 2017-03-02 2020-02-18 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 抗cea抗原vhh结构域及含有其的双特异性抗体
TWI795415B (zh) * 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎的抗人類ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段
CN111065408A (zh) * 2017-07-11 2020-04-24 辉瑞公司 免疫原性组合物
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
CA3093477A1 (en) 2018-03-13 2019-09-19 Zymeworks Inc. Anti-her2 biparatopic antibody-drug conjugates and methods of use
US11505610B2 (en) 2018-04-06 2022-11-22 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods comprising anti-NRP2 antibodies
WO2019204827A2 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 The Regents Of The University Of California Treatment of prostate cancer using chimeric antigen receptors
AU2019281358A1 (en) 2018-06-03 2021-01-07 Lamkap Bio Beta Ltd. Bispecific antibodies against CEACAM5 and CD47
CN110684107B (zh) * 2018-07-06 2021-03-23 中国人民解放军第四军医大学 抗MG7-Ag的单克隆抗体(MGd1)及其用途
CN110684108B (zh) * 2018-07-06 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗MG7-Ag的单克隆抗体(CEA37)及其用途
JP7407822B2 (ja) 2018-08-30 2024-01-04 エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド 単鎖キメラポリペプチドおよびその使用
JP7397874B2 (ja) 2018-08-30 2023-12-13 エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド 多鎖キメラポリペプチドおよびその使用
WO2020047462A2 (en) 2018-08-30 2020-03-05 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
TWI835880B (zh) * 2018-10-10 2024-03-21 日商安斯泰來製藥股份有限公司 含有標識部－抗人類抗體Ｆａｂ片段複合體之醫藥組成物
CN111487411B (zh) * 2019-01-29 2023-05-09 瑞博奥(广州)生物科技股份有限公司 Ceacam1多肽的新应用
EP3920972A1 (en) * 2019-02-07 2021-12-15 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
EP3693023A1 (en) 2019-02-11 2020-08-12 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
CA3137464A1 (en) * 2019-04-23 2020-10-29 Sanofi Stable, low-viscosity antibody formulations and uses thereof
JP2022535553A (ja) * 2019-06-04 2022-08-09 シャンハイ、ケンパーソー、バイオテクノロジー、カンパニー、リミテッド 抗ｃｅａｃａｍ５モノクローナル抗体、その作製方法およびその使用
US11655302B2 (en) 2019-06-10 2023-05-23 Sanofi Anti-CD38 antibodies and formulations
AU2020291014A1 (en) 2019-06-13 2022-01-27 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aminobenzazepine compounds, immunoconjugates, and uses thereof
JP2022537054A (ja) 2019-06-21 2022-08-23 エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド 多鎖キメラポリペプチドおよびその使用
EP3990492A1 (en) 2019-06-27 2022-05-04 F. Hoffmann-La Roche AG Novel icos antibodies and tumor-targeted antigen binding molecules comprising them
CA3148694A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Romas Kudirka Aminoquinoline compounds, immunoconjugates, and uses thereof
AU2020350205A1 (en) 2019-09-18 2022-05-12 Lamkap Bio Alpha AG Bispecific antibodies against CEACAM5 and CD3
US20220347310A1 (en) 2019-09-30 2022-11-03 Bolt Biotherapeutics, Inc. Amide-linked, aminobenzazepine immunoconjugates, and uses thereof
CA3155077A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Romas Kudirka Thienoazepine immunoconjugates, and uses thereof
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
US20210268022A1 (en) 2020-02-11 2021-09-02 HCW Biologics, Inc. Methods of activating regulatory t cells
EP4103601A2 (en) 2020-02-11 2022-12-21 HCW Biologics, Inc. Methods of treating age-related and inflammatory diseases
US20210277054A1 (en) 2020-02-11 2021-09-09 HCW Biologics, Inc. Chromatography resin and uses thereof
EP4138926A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates and folfox
AU2021258464A1 (en) * 2020-04-24 2023-01-05 Sanofi Antitumor combinations containing anti-CEACAM5 antibody conjugates, trifluridine and tipiracil
AU2021258465A1 (en) * 2020-04-24 2023-01-05 Sanofi Antitumor combinations containing anti-CEACAM5 antibody conjugates and cetuximab
KR20230005257A (ko) 2020-04-24 2023-01-09 사노피 항-ceacam5 항체 접합체 및 folfiri를 함유하는 항종양 병용물
EP4143231A1 (en) 2020-04-29 2023-03-08 HCW Biologics, Inc. Anti-cd26 proteins and uses thereof
JP2023524271A (ja) 2020-05-08 2023-06-09 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド エラスターゼ－基質ペプチドリンカーイムノコンジュゲート、及びそれらの使用
US12024545B2 (en) 2020-06-01 2024-07-02 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
AU2021283199A1 (en) 2020-06-01 2023-01-05 Immunitybio, Inc. Methods of treating aging-related disorders
WO2021247003A1 (en) 2020-06-01 2021-12-09 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
CN111690061B (zh) * 2020-06-28 2022-08-23 中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心 人源化抗鼠疫耶尔森菌抗原f1的抗体及应用
CN113278074B (zh) * 2020-08-04 2022-03-29 中山大学附属第五医院 抗ceacam5纳米抗体
CN116234586A (zh) 2020-08-13 2023-06-06 博尔特生物治疗药物有限公司 吡唑并氮呯免疫缀合物及其用途
AU2021329371A1 (en) 2020-08-20 2023-04-20 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating mesothelin positive cancers
EP4097486A4 (en) 2020-08-20 2023-09-06 A2 Biotherapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF POSITIVE CANCERS AT CEACAM
JP2023547707A (ja) * 2020-11-10 2023-11-13 サノフイ Ｃｅａｃａｍ５抗体－薬物コンジュゲート製剤
WO2022116079A1 (zh) * 2020-12-03 2022-06-09 上海吉倍生物技术有限公司 一种抗ceacam5的人源化抗体及其制备方法和用途
CN116635084A (zh) 2020-12-11 2023-08-22 博尔特生物治疗药物有限公司 抗cea免疫缀合物和其用途
US20220195066A1 (en) 2020-12-11 2022-06-23 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-cea immunoconjugates, and uses thereof
CN112521509B (zh) * 2020-12-23 2022-07-08 姚雪英 一种抗ceacam5人源化抗体、其缀合物及其用途
EP4313162A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 Bolt Biotherapeutics, Inc. 2-amino-4-carboxamide-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
TW202300175A (zh) 2021-03-26 2023-01-01 美商博特生物治療公司 ２－胺基－４－羧醯胺－苯并氮呯免疫結合物及其用途
EP4341299A1 (en) * 2021-05-21 2024-03-27 BeiGene Switzerland GmbH Anti-cea antibodies and methods of use
JP2024536382A (ja) 2021-10-07 2024-10-04 サノフイ イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン化合物及びそのコンジュゲート、それらの調製並びにそれらの治療用途
KR20240099412A (ko) 2021-11-05 2024-06-28 사노피 항-ceacam5 항체-약물 접합체 및 항-vegfr-2 항체를 함유하는 항종양 조합
WO2023099682A1 (en) 2021-12-02 2023-06-08 Sanofi Ceacam5 adc–anti-pd1/pd-l1 combination therapy
IL313224A (en) 2021-12-02 2024-07-01 Sanofi Sa CEA test to select patients in cancer treatment
WO2023164610A2 (en) * 2022-02-25 2023-08-31 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods comprising anti-nrp2b antibodies
WO2023168363A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 HCW Biologics, Inc. Method of treating pancreatic cancer
AU2023232411A1 (en) * 2022-03-09 2024-10-24 Merck Patent Gmbh Anti-ceacam5 antibodies and conjugates and uses thereof
AU2023237620A1 (en) 2022-03-23 2024-08-29 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing carcinoembyronic antigen
TW202417483A (zh) 2022-08-10 2024-05-01 美商默沙東有限責任公司 結合nkg2d、cd16及ceacam5之蛋白質
WO2024140905A1 (en) * 2022-12-28 2024-07-04 Full-Life Technologies Hk Limited Antibodies specifically binding to ceacam5
WO2024180192A1 (en) 2023-03-01 2024-09-06 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating neuroendocrine cancers expressing ceacam5
EP4427763A1 (en) 2023-03-06 2024-09-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates, anti-vegfr-2 antibodies and anti-pd1/pd-l1 antibodies

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4301A (en) 1845-12-11 Ebenezbr barrows
US4640A (en) 1846-07-14 Book-lock
US4791A (en) 1846-10-03 john g
US144A (en) 1837-03-11 Improvement in scythe-snaths
US4496A (en) 1846-05-02 Machinery for
US244A (en) 1837-06-30 Edward flint
US5204A (en) 1847-07-24 james cantelo
US689A (en) 1838-04-13 Julius austin
US192A (en) 1837-05-15 Machine for cutting
US835A (en) 1838-07-12 X i i i x
US4670A (en) 1846-07-28 Improvement in fish-hooks
US417A (en) 1837-09-28 Endless-ghain horse-power for driving iviaci-iii
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
WO1987002671A1 (en) 1985-11-01 1987-05-07 International Genetic Engineering, Inc. Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5278056A (en) 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5215534A (en) 1991-12-02 1993-06-01 Lawrence De Harde Safety syringe system
EP0563475B1 (en) 1992-03-25 2000-05-31 Immunogen Inc Cell binding agent conjugates of derivatives of CC-1065
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
DE69329503T2 (de) 1992-11-13 2001-05-03 Idec Pharma Corp Therapeutische Verwendung von chimerischen und markierten Antikörpern, die gegen ein Differenzierung-Antigen gerichtet sind, dessen Expression auf menschliche B Lymphozyt beschränkt ist, für die Behandlung von B-Zell-Lymphoma
EP0689601B1 (en) 1993-02-22 2006-10-04 The Rockefeller University Production of high titer helper-free retroviruses by transient transfection
FR2712812B1 (fr) 1993-11-23 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo.
US5994524A (en) 1994-07-13 1999-11-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polynucleotides which encode reshaped IL-8-specific antibodies and methods to produce the same
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
JP3946256B2 (ja) 1995-09-11 2007-07-18 協和醗酵工業株式会社 ヒトインターロイキン５受容体α鎖に対する抗体
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
AU7071598A (en) 1997-04-10 1998-10-30 Erasmus University Rotterdam Diagnosis method and reagents
US6629949B1 (en) 2000-05-08 2003-10-07 Sterling Medivations, Inc. Micro infusion drug delivery device
US6659982B2 (en) 2000-05-08 2003-12-09 Sterling Medivations, Inc. Micro infusion drug delivery device
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
AU2003259163B2 (en) 2002-08-16 2008-07-03 Immunogen, Inc. Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs
GB0308731D0 (en) 2003-04-15 2003-05-21 Anticancer Therapeutic Inv Sa Method of radiotherapy
WO2004094613A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Ibc Pharmaceuticals Polyvalent protein complex
BRPI0620632A2 (pt) 2005-12-21 2011-12-20 Micromet Ag composições farmacêuticas com resistência a cea solúvel, processo de produção das mesmas, usos de anticorpo bi-especìfico de cadeia simples, molécula de ácido nucléico, vetor e hospedeiro na preparação de composição farmacêuticas, e kits
USRE47123E1 (en) 2006-07-18 2018-11-13 Sanofi EPHA2 receptor antagonist antibodies
CL2008002085A1 (es) 2007-07-16 2008-11-21 Genentech Inc Anticuerpo humanizado anti-cd79b/igbeta/b29; polinucleotido codificacnte, vector, celula huesped; metodo de fabricacion; inmunoconjugado; composicion farmaceutica; uso para tratar cancer; metodo in vitro para determinar presencia de cd79b, oinhibir crecimiento de celulas quqe expresa cd79b; ensayo in vitro para detectar celulas b
PE20090993A1 (es) 2007-08-29 2009-07-08 Sanofi Aventis Anticuerpos anti-cxcr5 humanizados y derivados de los mismos
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
KR101764081B1 (ko) 2008-04-30 2017-08-01 이뮤노젠 아이엔씨 가교제 및 그 용도
WO2011034660A1 (en) * 2009-09-16 2011-03-24 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
US9427531B2 (en) 2010-06-28 2016-08-30 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Auto-injector
BR112013021460B1 (pt) 2011-03-02 2022-12-20 Roche Glycart Ag Anticorpos, composição e uso do anticorpo
US9248242B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Safety Syringes, Inc. Anti-needle stick safety device for injection device
AU2013349733C1 (en) 2012-11-20 2020-10-01 Sanofi Anti-CEACAM5 antibodies and uses thereof
US20140155827A1 (en) 2012-12-03 2014-06-05 Mylan, Inc. Medicament information system and method
TWI595006B (zh) * 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
CN104948958A (zh) * 2015-07-01 2015-09-30 上海顿格电子贸易有限公司 一种利用热敏电阻限流的led灯
CN108341876B (zh) * 2017-01-22 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗人ceacam5单克隆抗体及其制备方法和应用
CA3103374A1 (en) * 2018-06-29 2020-01-02 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for antibody delivery
EP3920972A1 (en) * 2019-02-07 2021-12-15 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
JP2023547707A (ja) * 2020-11-10 2023-11-13 サノフイ Ｃｅａｃａｍ５抗体－薬物コンジュゲート製剤
US20240226313A1 (en) * 2022-11-17 2024-07-11 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200143527A (ko) 2020-12-23
EP3594243A1 (en) 2020-01-15
PT2922875T (pt) 2017-05-31
DOP2015000110A (es) 2015-08-16
US20160108131A1 (en) 2016-04-21
PT3199552T (pt) 2020-03-25
TW201940519A (zh) 2019-10-16
WO2014079886A1 (en) 2014-05-30
AR093557A1 (es) 2015-06-10
LT2922875T (lt) 2017-06-12
KR102194748B1 (ko) 2020-12-23
EA039377B1 (ru) 2022-01-20
ZA201502959B (en) 2016-01-27
UA120247C2 (uk) 2019-11-11
EP3199552B1 (en) 2019-12-25
TWI664192B (zh) 2019-07-01
RS55987B1 (sr) 2017-09-29
KR102661801B1 (ko) 2024-04-26
CA3207769A1 (en) 2014-05-30
JP6324399B2 (ja) 2018-05-16
PE20151180A1 (es) 2015-08-12
CA2889962A1 (en) 2014-05-30
US10457739B2 (en) 2019-10-29
CA2889962C (en) 2023-10-24
EP2922875B1 (en) 2017-03-15
SI2922875T1 (sl) 2017-06-30
KR20240063172A (ko) 2024-05-09
PL3199552T3 (pl) 2020-06-01
US9617345B2 (en) 2017-04-11
US20220340682A1 (en) 2022-10-27
ES2625742T3 (es) 2017-07-20
PH12015501092B1 (en) 2015-07-27
EP2922875A1 (en) 2015-09-30
US20180022817A1 (en) 2018-01-25
MA38194A1 (fr) 2018-02-28
SI3199552T1 (sl) 2020-06-30
KR20150085828A (ko) 2015-07-24
HUE033369T2 (en) 2017-11-28
IL238559B (en) 2018-10-31
AU2013349733B2 (en) 2018-08-23
BR112015010993B1 (pt) 2022-08-30
LT3199552T (lt) 2020-04-10
IL238559A0 (en) 2015-06-30
ECSP15025845A (es) 2016-01-29
KR102408660B1 (ko) 2022-06-15
CN109180815B (zh) 2022-06-21
AU2013349733A1 (en) 2015-06-11
MA38194B1 (fr) 2018-12-31
CR20150258A (es) 2015-06-11
HRP20200415T1 (hr) 2020-06-26
US20200102401A1 (en) 2020-04-02
CN104918958B (zh) 2019-12-10
US11332542B2 (en) 2022-05-17
TW201427997A (zh) 2014-07-16
NZ708528A (en) 2020-07-31
RS60043B1 (sr) 2020-04-30
CY1119219T1 (el) 2018-02-14
PL2922875T3 (pl) 2017-08-31
CN104918958A (zh) 2015-09-16
DK2922875T3 (en) 2017-06-06
CN109180815A (zh) 2019-01-11
CL2015001321A1 (es) 2015-07-17
AU2013349733C1 (en) 2020-10-01
UY35147A (es) 2014-06-30
EA201590986A1 (ru) 2016-05-31
MX2015006374A (es) 2015-10-09
PH12015501092A1 (en) 2015-07-27
SG11201503285TA (en) 2015-05-28
AU2018267636A1 (en) 2018-12-13
TN2015000177A1 (en) 2016-10-03
HK1215444A1 (zh) 2016-08-26
DK3199552T3 (da) 2020-03-30
KR20220084193A (ko) 2022-06-21
MY171100A (en) 2019-09-25
EP3199552A1 (en) 2017-08-02
JP2016506370A (ja) 2016-03-03
MX358321B (es) 2018-08-14
BR112015010993A2 (es) 2017-08-22
HRP20170743T1 (hr) 2017-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11332542B2 (en) Anti-CEACAM5 antibodies and uses thereof
JP2023540732A (ja) 抗ｃｅａｃａｍ５抗体及びコンジュゲート並びにそれらの使用
ES2871816T3 (es) Anticuerpos anti-LAMP1 y conjugados anticuerpo-fármaco, y usos de los mismos
CA3208580A1 (en) Anti-alpp/alppl2 antibodies and antibody-drug conjugates
OA17305A (en) Anti-CEACAM5 antibodies and uses thereof.
EA047681B1 (ru) Способы получения антител к ceacam5