BRPI0620632A2 - composições farmacêuticas com resistência a cea solúvel, processo de produção das mesmas, usos de anticorpo bi-especìfico de cadeia simples, molécula de ácido nucléico, vetor e hospedeiro na preparação de composição farmacêuticas, e kits - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES FARMACêUTICAS COM RESISTêNCIA A CEA SOLúVEL, PROCESSO DE PRODUçãO DAS MESMAS, USOS DE ANTICORPO BI-ESPECìFICO DE CADEIA SIMPLES, MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO, VETOR E HOSPEDEIRO NA PREPARAçãO DE COMPOSIçãO FARMACêUTICA, E KITS. A presente invenção está relacionada a composições farmacêuticas para o tratamento de um tumor epitelial em humanos, dita composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de cadeia simples bi-específico que possui um primeiro domínio de ligação se ligando especificamente a CD3 humano, e um segundo domínio de ligação se ligando especificamente a CEA humano, caracterizado pelo fato de que dito segundo domínio de ligação compreende pelo menos uma parte do CDR-H3 ou o CDR-H3 completo de anticorpo monoclonal A5B7 murino. Adicionalmente, são descritos processos para a produção de ditas composições farmacêuticas assim como usos médicos/farmacêuticos para as moléculas especificas de anticorpo bi-específico de cadeia simples carregando especificidades para o antígeno CD3 humano e o antígeno CEA humano.

Description

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COM RESISTENCIA A CEA SOLÚVEL, PROCESSO DE PRODUÇÃO DAS MESMAS, USOS DE ANTICORPO BI- ESPECÍFICO DE CADEIA SIMPLES, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR E HOSPEDEIRO NA PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E KITS

Mais de três. décadas se passaram desde que Gold e Freedman descreveram pela primeira vez o antígeno carcinoembriônico associado a tumor (CEA) em extrações de tecidos de câncer de cólon humano (Gold and Freedman; J. Exp. Med. 122 (1965); 467-481).

Enquanto isso, 28 outros genes/pseudogenes relacionados à família de genes CEA foram descobertos. Em uma tentativa de simplificar a nomenclatura usada para os membros da família de genes CEA, a família foi recentemente renomeada de "moléculas de adesão celular relacionada a CEA" (CEACAMs) e a nomenclatura para seus membros foi unificada (Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249). Por exemplo, de acordo com essa nomenclatura, CEA humano (CD66e) é chamada CEACAM5.

A família de genes CEA humana é agrupada no cromossomo 19ql3.2 (Olsen et al. Genomics 23 (1994); 659-668). Seus 29 genes e pseudogenes podem ser divididos em três subgrupos, i.e. o subgrupo CEA contendo sete genes expressados, o subgrupo de glicoproteína específica de gravidez (PSG) contendo onze genes expressados e o terceiro subgrupo que contém apenas pseudogenes (Hammarstrõm, Sem. Câncer Biol. 9 (1999), 67-81; Beauchemin, Εχρ. Cell Res. 252 (1999), 243- 249) . A análise das seqüências de aminoácidos de CEA e dos outros membros da família revelou que pertencem à superfamília de imunoglobulinas (Ig) (Williams and Barclay, Annul. Rev. Immunol. 6 (1988), 381-405). Todos os membros do subgrupo CEA estão anexados à membrana de superfície da célula: Glicoproteína biliar (CEACAMl; BGP1; TM-CEA; CD66a), membro 1 da família de genes CEA (CEACAM3; CGMl; CD66d) e membro 7 da família de genes CEA (CEACAM4; CGM7) possuem domínios transmembrana hidrofóbicos, enquanto antígeno carcinoembriônico (molécula 5 de adesão de celular relacionada com antígeno carcinoembriônico; CEACAM5; CEA; CD66e), antígeno não específico de reação cruzada (CEACAM6;

NCA; NCA-50/90; CD66c), membro 2 da família de genes CEA (CEACAM7; CGM2) e membro 6 da família de genes CEA (CEACAM8; CGM6; CD66b) são ligados à membrana plasmática por arranjos lipídicos de glicosilfosfatidilinositol (GPI). As proteínas CEA são altamente glicosiladas com um peso molecular de até aproximadamente 300 kDa, dependendo do número- de domínios Ig.

No que se refere à atividade biológica das proteínas CEA, estudos in vitro com linhas de células de tumor sugeriram que diversas subfamílias CEA incluindo glicoproteína biliar, CEA e antígeno não específico de reação cruzada podem atuar como moléculas de adesão celular homofílicos e heterotípicos quando expressados na superfície de célula tumoral (Oikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (1992), 881-887; Zhou et al., Câncer Res. 53 (1993), 3817-3822). Mais recentemente, foi discutido um possível papel de CEA e de antígeno não especifico de reação cruzada na defesa imune inata protegendo o cólon de ataque microbiano (Hammarstrõm and Baranov, Trends Microbiol. 9 (2001), p. 119-125). Em particular, foi proposto que essas proteínas se ligam e capturam microorganismos prevenindo-os de alcançar e invadir as células epiteliais das microvilosidades.

Foi hipotetizado que CEA é um antígeno oncofetal que é expressado durante a vida fetal, ausente no adulto saudável e re-expressado em câncer. Contudo, CEA é também expressado em tecido adulto normal. Por exemplo, glicoproteína biliar, CEA, antígeno não específico de reação cruzada e membro 2 da família de genes CEA são expressados em cólon humano normal, particularmente nas células epiteliais maduras do cólon voltadas para o lúmen digestivo e as células altamente diferenciadas na boca da cripta (Frãngsmyr et al., Câncer Res. 55 (1995), 2963-2967; Frãngsmyr et al., Tumor Bi οΓ. 20 (1999), 277-292). Mais especificamente, essas proteínas são localizadas na superfície do glicocálice dos colonócitos maduros enfileirados na superfície livre do lúmen. Glicoproteína biliar, CEA e antígeno não específico de reação cruzada são também expressados em um número de tumores de origem epitelial (Hammarstrõm, Sem. Câncer Biol. 9 (1999), 67-81; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355- 399) . Já no final dos anos de 1970 e início dos anos de 1980, CEA se tornou um antigeno alvo favorecido para radioimunolocalização de tumores colo-retais e outros tumores epiteliais. Isto é devido ao fato de que CEA é sobre-expressado em 95% de cânceres gastrointestinais e pancreáticos, assim como na maioria dos carcinomas de pulmão de células pequenas e de células não pequenas. Também é expressado em carcinoma de mama e carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço (Primus et al., Câncer 42 (1978), 1540-1545). Na verdade, CEA é um dos marcadores clínicos tumorais mais extensamente usados. Ele é usado como marcador de soro de tumor para câncer colo-retal e alguns outros cânceres devido a sua estabilidade, sua expressão razoavelmente restrita em tecido adulto normal e sua alta expressão em tumores de origem epitelial. 0 grosso de CEA em um indivíduo saudável é produzido no cólon. Aí, CEA é liberado a partir da superfície apical de células maduras do cólon no lúmen do trato digestivo e desaparece com as fezes. Assim, apenas níveis muito baixos são normalmente vistos no sangue de indivíduos saudáveis. Por exemplo, níveis de CEA no sangue de indivíduos saudáveis é menor que 2pg/l. Em contraste, níveis de CEA no soro de pacientes com carcinomas colo-retais e outros carcinomas são aumentados, variando até mais do que 2000pg/l (Thomson et al., PNAS 64 (1969), 161-167). Em particular, tumores epiteliais progressivos, malignos, ou de estágio avançado são freqüentemente acompanhados por altas concentrações de soro de CEA solúvel (Fletcher; Ann. Intern. Med. 104 (1986), 66-73). É conhecido que componentes da membrana plasmática, incluindo CEA, são continuamente esfoliados a partir da superfície como vesiculas derivadas de membrana plasmática (Taylor and Black, J. Natl. Câncer Inst. 74 (1985), 859-866; Sack et al. , J Clin Invest. 82 (1988), 586-93) o que, através de drenagem linfática e vasos sangüíneos, pode acabar no sangue. À medida que o tamanho do tumor aumenta, mais CEA irá acumular no sangue. O uso principal de determinações de CEA de soro como marcador tumoral está na vigilância pós-cirúrgica de câncer de cólon. Níveis aumentados de CEA são o primeiro indicador da doença recorrente em 81% (Minton et al., Câncer 55 (1985), 1284-1290) e 89% (Wanebo et al., Surg. Gynecol. Obstet. 169 (1989), 479-487) dos pacientes, respectivamente. Níveis de CEA no soro podem ser também usados como um indicador prognóstico (Mulcahy and Benson, Curr. Oncol. Rep. 1 (1999), 168-172).

Devido à sua sobre-expressão em vários cânceres epiteliais, CEA não é usado apenas como marcador de tumor, mas também como um alvo para terapia antitumoral. Por exemplo, cânceres gastrointestinais contabilizam uma grande proporção de tumores epiteliais humanos, com estimados 21.700 novos casos de câncer gástrico e 135.400 novos casos de câncer colo-retal nos Estados Unidos no ano de 2001 (Greenlee; CA Câncer J Clin 51 (2001), 15-36). Câncer colo- retal é o terceiro tumor maligno mais comum e a terceira causa de morte por câncer tanto em homens como mulheres (Ries; Câncer 88 (2000), 2398-2424). Em uma tentativa de encontrar novas terapias contra esses tumores, anticorpos monoclonais anti-CEA foram explorados como terapêuticos para cânceres CEA positivos (Murakami et al., Immunol. Invest. 25 (1996), 23-35).

Um exemplo para uma abordagem na qual pacientes com carga tumoral baixa (correspondente a niveis baixos de CEA no soro) foram tratados com sucesso é um estudo realizado por Behr et al. Nessa abordagem, um variante 131I-rotulado de labetuzumab (labetuzumab é uma forma humanizada de anticorpo monoclonal anti-CEA MN-14; Behr et al. , Câncer, 94: 1373-1381, (2002), 1559-64) foi analisado em uma fase II de testes na qual foram envolvidos 30 pacientes CRC com pequeno volume metastático de doença quimio-refractal a 5- fluorouracil e ácido folinico ou em um ajuste de adjuvante após metástase de fígado. Uma única injeção de labetuzumab 131I-rotulado foi aplicada. De 19 pacientes passíveis de avaliação, 3 tinham remissões parciais e oito apresentaram respostas menores em até 15 meses de duração. No ajuste de adjuvante, 7 de 9 pacientes ficaram sem doença por até 3 anos, enquanto quê a taxa de reincidência no grupo controle foi de 67% no mesmo período de tempo. Os níveis de CEA no soro dos pacientes variou de 3,9 - 45 ng/ml (Behr et al., Câncer, 94: 1373-1381, 2002). Em outro estudo caracterizado por pacientes com baixos níveis de CEA no soro (<5ng/ml), a terapia radioimuno de CEA com 131I-labetuzumab (loc. cit.) mostrou-se por melhorar a sobrevivência pós-remoção cirúrgica de metástases de câncer colo-retal no fígado. 23 pacientes receberam uma dose de 40-60 mCi/m2 131I- labetuzumab. A sobrevivência em cinco anos foi de 51,3% para tratados e 7,4% para os grupos controle, respectivamente (Liersch et al., JCO, 2005, ASCO Proc, Vol 23, No 16S: 3627).

Ainda, abordagens terapêuticas com altas concentrações de CEA no soro freqüentemente resultaram em baixas respostas ou nenhuma resposta antitumoral. Por exemplo, em um estudo clinico realizado para avaliar um anticorpo monoclonal anti-CEA humanizado em clinica, uma versão CDR transplantada de MN-14 (hMN-14; Sharkey, Câncer Res. 55 (23 Suppl) (1995) 5935s-5945s. ) foi rotulada com 131I. 19 pacientes com tumores avançados produtores de CEA receberam hMN-14 131I rotulado. 0 comportamento de biodistribuição, direcionamento de tumor, e farmacocinético de hMN-14 foi similar àquele visto com MN-14 murino. Contudo, pacientes com CEA elevado (> 200 ng/ml) no plasma tinham mais do que 30% do anticorpo rotulado complexado em 1 h após a injeção. Em alguns desses pacientes, complicações aumentadas resultaram em metabolismo intensificado do anticorpo com liberação mais "rápida a partir do sangue do que visto em pacientes com CEA de plasma mais baixo (Sharkey, loc. cit.). Em outra fase I teste conduzida por Yu et al., um anticorpo monoclonal (mAb) murino 131I-rotulado de afinidade contra CEA, COL-I (Muraro, Câncer Res. 45 (1985), 5769-80), foi investigado em pacientes com tumores malignos gastrointestinais. Em particular, a influência de CEA no soro e volume tumoral na farmacocinética foi analisada. Até então, 18 pacientes com tumores malignos gastrointestinais avançados receberam 20 mg de COL-I rotulado com 131I, com doses de 10 mCi/m2 a 75 mCi/m2. Nivel de CEA no soro variou de 6 a 2739 ng/mL (média +/- Desvio Padrão, 500 + /- 639) . 82% de todos os órgãos envolvidos no tumor e 58% de todas as lesões foram positivos. Contudo, foi novamente observado que CEA de soro elevado (> 500 ng/mL) e volume de tumor se correlacionam diretamente com a liberação de radioatividade de soro. Os autores concluíram que pacientes com níveis de CEA circulantes altamente elevados e/ou volume de tumor aumentado se livram de 131I-rotulado COL-I mais rapidamente a partir da circulação (Yu et al., J. Cli. Oncol. 14 (1996), 1798-1809). Resultados similares foram obtidos em um estudo por Hajjar et al. Com anticorpo monoclonal anti- CEA MN-14 rotulado com iodina 131 em pacientes com câncer metastático gastrointestinal e colo-retal. Nessa fase de testes I, 21 pacientes tanto antes como após a radiação emitida ou após quimioterapia padrão foram tratados com anticorpo. 7 de 21 pacientes possuíam anticorpos humanos anti-humanos (HAHAs), mas nenhum efeito adverso. Nenhuma resposta anti-tumor foi observada. Novamente, foi visto que níveis elevados de CEA em plasma aumentam a liberação do anticorpo do sangue e de todo o corpo (Hajjar et al., Clin Colo-retal Câncer, 2 (2002), 31-42) o que pelo menos em parte pode prover uma explicação da falta de resposta anti- tumor observada nesse estudo. 0 fenômeno de rápida liberação de anticorpo terapêutico do sangue e do corpo pode ser explicada pela formação aumentada de complexos imune que têm de ser rapidamente removidos do corpo para prevenir dano a órgãos. Nenhum efeito terapêutico poderia ser observado nos pacientes com tumor envolvidos nesses estudos, mais provavelmente devido à rápida liberação dos anticorpos monoclonais.

Para evitar problemas causados pela formação de complexo imune e rápida liberação de anticorpos terapêuticos monoclonais que são mais provavelmente mediados pela parte Fc dos anticorpos reconhecidos por receptores Fc de células imune, derivados de anticorpo (e.g. constructos scFv) ou fragmentos (e.g. fragmentos Fab e Fab2) sem parte Fc foram produzidos e analisados em clinica. A maioria desses estudos é direcionada para obtenção de imagens de tumor e detecção/localização (ver e.g. Chester et al., Câncer Chemother Pharmacol, 46 (2000) Suppl: S 8 -12; Mayer et al., Clin Câncer Res, 6: (2000) 1711-1719; Begent et al., Nat Med, 2 (1996): 979-984). Apenas poucos estudos investigaram a eficácia terapêutica de tais derivados/fragmentos de anticorpo em clinica. Por exemplo, em uma abordagem clinica por Francis et al. (Francis, Br. J. Câncer 87(6) (2002), 600-607) a atividade anti-tumor de ~ um constructo de scFv-carboxipeptidase foi investigada. Nessa fase teste I, a terapia pró-droga de enzima direcionada para anticorpo (ADEPT) foi usada em pacientes com carcinoma colo-retal avançado ou outros tumores produtores de CEA. Até então, A5CP, consistindo de um fragmento F(ab)2 de um anticorpo monoclonal de camundongo para CEA (A5B7) se ligou á enzima bacteriana carboxipeptidase (CPG2) como o agente direcionador anticorpo-enzima e ZD2767P, um droga mostarda bis-iodo fenol foi utilizada. Como resultado, nenhuma resposta clinica ou radiológica foi vista no estudo. Niveis de CEA no soro pré-tratamento variaram até 1000 ng/ml. Essas altas concentrações de CEA de soro dos pacientes com tumor tratados podem ser pelo menos em parte responsáveis pela falta de resposta anti-tumor observada nesse estudo.

Em vista dos problemas revelados acima, o fornecimento de meios e métodos para terapias eficientes para tumores epiteliais progressivos, malignos, ou de estágio tardio é altamente desejável.

Conseqüentemente, um aspecto da invenção está relacionado a uma composição farmacêutica, dita composição farmacêutica compreendendo um anticorpo bi-especifico de cadeia simples que possui

(a) um primeiro domínio de ligação se ligando especificamente a CD3 humano, e

(b) um "segundo domínio de ligação se ligando especificamente a CEA humano,

em que o dito domínio de ligação compreende pelo menos a seqüência de aminoácidos "DX1X2X3X4FYFDY" (SEQ ID NO. 65), caracterizado pelo fato de que "Χ1", "X2", "X3" or "X4" representa qualquer resíduo de aminoácido, e o resíduo de aminoácido "D" corresponde à posição de Kabat 95 de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino e os resíduos de aminoácidos "FYFDY" correspondem às posições de Kabat 100, 100a, 100b, 101, e 102, respectivamente, de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino. Em um avanço, "Xi" representa "R" (Arginina), "F" (Fenilalanina), "M" (Metionina) , "E" (Ácido Glutâmico) , ou "T" (Treonina) ; "X2" representa "G" (Glicina), "Y" (Tirosina), "A" (Alanina), "D" (Ácido Aspártico), ou "S" (Serina); "X3" representa "L" (Leucina), "F" (Fenilalanina), "M" (Metionina), "E" (Ácido Glutâmico) , ou "T" (Treonina) ; e "X4" representa "R" (Arginina) , "Y" (Tirosina), "A" (Alanina) , "D" (Ácido Aspártico), ou "S" (Serina).

Em um avanço da composição farmacêutica da invenção, dito segundo domínio de ligação específico para CEA humano do anticorpo bi-específico de cadeia simples aqui definido compreende pelo menos a seqüência de aminoácidos "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) correspondente às posições de Kabat 95 - 102 do CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino.

A "presente invenção provê meios e métodos particularmente adequados para tratamento de pacientes com tumor epitelial com altas concentrações de CEA solúvel em seu plasma. Tais altas concentrações de CEA solúvel são encontradas no soro/plasma de pacientes com tumor epitelial com tumores progressivos, tumores recorrentes, metastáticos, de estágio tardio e em pacientes com alta carga tumoral. Foi visto que anticorpos bi-específicos de cadeia simples com um domínio de ligação de CEA compreendendo a seqüência de aminoácidos "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) não se ligam apenas a células alvo CEA positivas, mas também a CEA solúvel; ver Exemplo 3 e Figura 2 da presente invenção; e EP Bl 491031. A seqüência de aminoácidos indicada por "DRGLRFYFDY" corresponde às posições de Kabat 95 - 102 (SEQ ID NO. 66) de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino (Harwood, Br J Câncer. 54 (1986), 75-82). Surpreendentemente, apesar de se ligar a CEA solúvel, ditos anticorpos bi-especificos de cadeia simples matam células tumorais carregando CEA, mesmo na presença de altas concentrações de CEA solúvel (até lpg/ml de CEA solúvel foi testado). Posto em outras palavras, ditos constructos bi-especificos não são inibidos por CEA solúvel em sua atividade citotóxica contra células tumorais CEA positivas.

Como mostrado nos Exemplos 5 e 8 a seguir (em combinação com as Figuras 5, 6, 8, 10, 19, 20, 22 e 27), anticorpos bi-especificos de cadeia simples com um domínio de ligação de CEA compreendendo a seqüência de aminoácidos "DRGLRFYFDY" mediaram citotoxicidade a células tumorais CEA positivas, na presença de concentrações mesmo altas de CEA solúvel. Por exemplo, A Figura 10 apresenta um teste de citotoxicidade de constructos bi-specificos de cadeia simples reativos a CEA redirecionados a células Kato III (linhagem celular de carcinoma gástrico humano CEA positivo) na presença de quantidades crescentes de antígeno de CEA solúvel. Células T citotóxicas humanas CD8 positivas estimuladas (CTLs) foram usadas como células efetoras. Citotoxicidade mediada por CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL é resistente a CEA solúvel. Em contraste, a atividade citotóxica mediada por CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL é inibida por quantidades mais altas de CEA solúvel. CEAI é uma região variável derivada de mAb A5B7 murino, enquanto que CEAII VHVL é derivado de mAb T84.66.

De forma importante, foi visto que a seqüência de aminoácidos "DRGLRFYFDY" é suficiente para mediar resistência a CEA solúvel quando usada em um domínio de ligação de CEA humano (i.e. um domínio de ligação humano se ligando especificamente a CEA humano) de anticorpos bi- específicos de cadeia simples anti-CEAxanti-CD3; ver e.g. Figuras 19, 20, 22 e 27.

A seguir, anticorpos bi-específicos de cadeia simples como aqui definidos são portando referidos como sendo resistentes a antígeno de CEA solúvel. 0 termo "resistência a antígeno de CEA solúvel", "resistente a CEA solúvel" ou termos relacionados, como aqui usados, referem-se ao fato de que ã citotoxicidade contra alvos CEA-positivos ou células tumorais mediada por ditos anticorpos bi- específicos de cadeia simples não é afetadas por concentrações aumentadas de CEA solúvel. Em particular, a atividade citotóxica não é inibida mesmo por altas concentrações de CEA solúvel (até ^g/ml foi testado). Como apresentado acima, os níveis de CEA no sangue de indivíduos saudáveis são menores do que 2ng/ml. Altas concentrações de CEA solúvel no soro/plasma de pacientes com tumor são características de tumores progressivos, recorrentes, metastáticos, ou de estágio tardio e para pacientes com alta carga tumoral. Assim, a presente invenção provê meios e métodos particularmente adequados para o tratamento de pacientes com tumor epitelial com tais altas concentrações de CEA solúvel em seu plasma. O termo "altas concentrações de CEA solúvel" como aqui usado denota uma concentração de CEA solúvel de soro/plasma maior do que 10, 20, 50, 70, 80, 90 ou 100 ng/ml. Essa concentração de CEA de soro/plasma pode ser determinada, inter alia, por ELISA. Preferencialmente, dita concentração de CEA solúvel de soro/plasma é maior do que 100 ng/ml, como determinado e.g. por ELISA.

A geração de ditos anticorpos bi-especificos de cadeia simples com resistência a antigeno de CEA solúvel não foi uma tarefa trivial, como evidente a partir dos seguintes Exemplos. Por exemplo, anticorpos bi-especificos de cadeia simples com um domínio de ligação de CEA derivado de um anticorpo monoclonal (mAb) conhecido por se liqar a CEA de limite membrana mas não a CEA solúvel, i.e. mAb PR1A3 (Durbin, Proc Natl Acad Sci USA. 91 (1994), 4313-7), não poderia ser produzido: Quando usado no formato de anticorpo bi-específico de cadeia simples, nenhuma expressão/secreção do constructo bi-específico de cadeia simples anti- CD3xanti-CEA poderia ser conseguido. Quando uma versão humanizada de PR1A3 (Durbin, loc. cit.) foi utilizada para a geração, o constructo de anticorpo bi-específico de cadeia simples foi expressado e secretado a partir da célula hospedeira. Contudo, nenhuma ligação do domínio de ligação anti-CEA para CEA de limite de membrana poderia ser obtido.

Quando anticorpos bi-especificos de cadeia simples derivados dos bem descritos anticorpos monoclonais T84.66 (Neumaier, M. et al. , Câncer Res 50 (1990), 2128-34) ou MFE-23 (Boehm, Μ. K. Biochem J 2 (2000), 519-28) foram gerados, esses anticorpos bi-especificos foram altamente sensíveis a antígeno de CEA solúvel, i.e. sua atividade citotóxica contra alvos CEA-positivos ou células tumorais foi bloqueada na presença de antígeno de CEA solúvel. Já que ditos constructos foram vistos por se ligar a CEA solúvel, foi concluído que antígeno de CEA solúvel previne o anticorpo de se ligar a CEA de limite de membrana, bloqueando, dessa forma, a atividade citotóxica mediada por anticorpo. Por exemplo, a Figura 7 mostra um teste de citotoxicidade de um constructo bi-específico de cadeia simples reativo a CEA redirecionado para células CHO transfectadas com CEA na presença de CEA solúvel humano. Células " T "citotóxicas humanas CD8 positivas estimuladas (CTLs) foram usadas como células efetoras. A atividade citotóxica de CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL é claramente inibida por quantidades crescentes de CEA solúvel. CEAII VHVL é derivado de mAb T84.66; SEQ ID NO. 77 é um domínio VH-VL anti-CD3.

Resistência a antígeno de CEA solúvel poderia ser encontrada apenas para anticorpos bi-específicos de cadeia simples, o domínio de ligação de CEA que compreendeu a seqüência de aminoácidos "DRGLRFYFDY" de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino (Harwood, Br J Câncer. 54 (1986), 75-82) . Como para constructos bi-especificos de cadeia simples derivados de MFE-23 e T84.66, anticorpos bi- especificos de cadeia simples derivados de A5B7 se ligam a CEA solúvel. À luz dos resultados obtidos para constructos bi-especificos de cadeia simples derivados de MFE-23 e T84.66, não poderia ser esperado que CEA solúvel não influencia a atividade citotóxica em constructos de anticorpos bi-especificos de cadeia simples derivados de A5B7 .

Como apresentado acima, várias abordagens terapêuticas direcionadas contra tumores epiteliais carregando CEA em humanos são seriamente complicadas pela presença de altos níveis de antígeno CEA solúvel no plasma de pacientes com câncer. Por exemplo, a formação aumentada de complexo imune e liberação de anticorpos monoclonais terapêuticos anti-CEA na presença de altas concentrações de CEA no plasma foi observada em diversos estudos clínicos. Além disso, antígeno CEA solúvel - freqüentemente presente em altas concentrações no soro de pacientes com câncer com tumores progressivos, câncer recorrente, tumores metastáticos, alta carga tumoral, ou tumores de estágio tardio - bloqueia as terapias direcionadas contra células tumorais CEA positivas, prevenindo, assim, o reconhecimento e destruição de células tumorais. Portanto, a quantidade real do medicamento que alcança o tumor é reduzida, resultando em uma atividade diminuída, baixa ou até nenhuma atividade antitumoral. Essa limitação até então restringe e.g. abordagens baseadas em anticorpos para aqueles pacientes com quantidades muito baixas de antigeno de CEA solúvel improváveis de prevenir interação celular entre o medicamento e o tumor.

Na presente invenção, foi visto que é possível gerar medicamentos de anticorpo bi-especifico de cadeia simples com especificidade para CD3 humano e CEA humano, caracterizado pelo fato de que a atividade citotóxica direcionada contra células tumorais é resistente até a altas concentrações de antigeno de CEA solúvel (até Iyg/ml de CEA solúvel foi testado). Essa descoberta é totalmente inesperada em vista do fato de que os anticorpos bi- específicos de cadeia simples da invenção se ligam a antigeno de CEA solúvel (ver Exemplo 3 e Figura 2 da presente invenção; ver também EP Bl 491031). NO entanto, os anticorpos bi-específicos de cadeia simples como aqui definidos são totalmente resistentes à presença mesmo de níveis altos dè CEA solúvel em sua atividade citotóxica para células tumorais. Assim, a presente invenção provê meios e métodos particularmente adequados para o tratamento de pacientes com tumor com altas concentrações de CEA solúvel em seu plasma, como observado e.g. durante a progressão do tumor, para câncer recorrente, para metástase, para pacientes com alta carga tumoral, ou tumores de estágio tardio. De acordo com esta invenção, o termo "composição farmacêutica" está relacionado a uma composição para administração para um paciente humano. Preferencialmente, a composição farmacêutica compreende formulações adequadas de carregadores, estabilizadores e/ou excipientes. Em um avanço preferido, a composição farmacêutica compreende uma composição para administração parenteral, transdermal, intraluminal, intra-arterial, intratecal e/ou intranasal ou por injeção direta no tecido. É visado em particular que dita composição é administrada a um paciente via infusão ou injeção. A administração das composições adequadas pode ser efetuada por diferentes meios, e.g., por administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica ou intradermal. A composição da presente invenção pode compreender ainda um carregador farmaceuticamente aceitável. Exemplos de carregadores farmacêuticos adequados são bem conhecidos na arte e incluem soluções salinas de fosfato tamponadas, água, vários tipos de agentes úmidos, soluções estéreis, lipossomos, etc.. Composições compreendendo tais carregadores podem ser formuladas por métodos convencionais bem conhecidos. Essas composições podem ser administradas ao sujeito em uma dose adequada que pode ser determinada e.g. pode estudos de variação de dosagem por administração de doses aumentadas do anticorpo bi-especifico de cadeia simples exibindo resistência a antigeno de CEA de soro solúvel aqui descrito. Como apresentado acima, o anticorpo bi-especifico de cadeia simples aqui descrito com resistência a antigeno de CEA de soro solúvel pode ser usado vantajosamente no tratamento de pacientes com câncer com altas concentrações de CEA no soro, tais como tumores progressivos, câncer recorrente, tumores metastáticos, alta carga tumoral, ou tumores de estágio tardio. Essas composições podem ser também administradas em combinação com outras drogas protéicas e não protéicas, e.g. na forma de uma co-terapia. Essas drogas podem ser administradas simultaneamente com a composição compreendendo o anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui definido ou separadamente antes ou após a administração de dito anticorpo bi-especifico em intervalos de tempo e doses definidos. O regime de dosagem será determinado pelo médico acompanhante e fatores clínicos. Como é bem conhecido nas artes médicas, dosagens para qualquer paciente dependem de vários fatores, incluindo o tamanho do paciente, área de superfície corporal, idade, o composto em particular a ser administrado, sexo, tempo e rota de administração, saúde geral, e outras drogas sendo administradas concomitantemente. Preparações para administração parenteral incluem soluções estéreis aquosas ou não aquosas, e suspensões. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, e estes orgânicos injetáveis, tais como etil oleato. Carregadores aquosos incluem água, soluções aquosas, ou suspensões, incluindo meio salino e tamponado. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, ou Ringer's lactado. Veículos intravenosos incluem fluidos e nutrientes reabastecedores, reabastecedores eletrólitos (tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer) , e similares. Preservativos e outros aditivos também podem estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes de quelação, gases inertes e similares. Além disso, a composição da presente invenção pode compreender carregadores protéicos, tipo, e.g., albumina ou imunoglobulina de soro, preferencialmente de origem humana. É visado que a co-terapia compreenda, além do anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui definido, mais agentes biologicamente ativos, dependendo do uso pretendido da composição. Tais agentes podem ser drogas atuando no sistema gastrointestinal, drogas atuando como agentes antineoplásicos, quimioterapêuticos, citostática, drogas prevenindo hiperuriquemia, drogas inibindo reações imuno (e.g. corticosteróides), drogas modulando a resposta inflamatória, drogas atuando no sistema circulatório e/ou agentes, tais como citoquinas, conhecidos na arte.

Preferencialmente, o anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui definido é formulado em um tampão, um estabilizante e um surfactante. 0 tampão pode ser um tampão de fosfato, citrato, succinato ou acetato. O estabilizante pode ser (um) aminoácido(s) e/ou um açúcar. Os surfactantes podem ser detergentes, PEGs, ou similares. Mais preferencialmente, o anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui definido é formulado em citrato, lisina, trealose e Tween 80. Como diluente para a composição farmacêutica da invenção, isotônico salino e Tween 80 são preferidos. Como aqui usado, um "anticorpo bi-especifico de cadeia simples" denota uma única cadeia polipeptidica compreendendo dois domínios de ligação. Cada "domínio de ligação" como aqui usado compreende uma região variável de uma cadeia pesada de anticorpo ("região VH"), caracterizado pelo fato de que a região VH do primeiro domínio de ligação se liga especificamente a dita primeira molécula, i.e. a molécula CD3 humana, e uma região VH do segundo domínio de ligação se liga especificamente a CEA humano, como definido em mais detalhes abaixo. Os dois domínios de ligação são otimamente ligados um ao outro por um polipeptídeo espaçador curto geralmente compreendendo na ordem de 5 aminoácidos. Cada domínio de ligação pode compreender adicionalmente uma região variável de uma cadeia leve de anticorpo ("região VL") , uma região VH e região VL em cada do primeiro e segundo domínios de ligação sendo ligados um ao outro via um polipeptídeo ligante, por exemplo, do tipo descrito e reivindicado em EP Bl 623679, mas em qualquer caso IoTigo õ suficiente para permitir que uma região VH e região VL do primeiro domínio de ligação e uma região VH e região VL do segundo domínio de ligação formem pares uma com a outra, de forma que, juntas, elas sejam capazes de se ligar especificamente às respectivas primeira e segunda moléculas. 0 arranjo das regiões V do primeiro ou segundo domínio de ligação podem ser VH-VL ou VL-VH. Preferencialmente, o arranjo do primeiro domínio de ligação se ligando especificamente a CD3 humano é VH-VL, como apresentados nos Exemplos a seguir. É visado que o primeiro domínio de ligação pode ser localizado N-terminalmente ou C- terminalmente em relação ao segundo domínio de ligação. Assim, os arranjos dos domínios de ligação dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos podem ser VHcea-VLcea-VHCd3-VLCd3/ VLcea-VHcea-VHcd3-VLcd3, VHcd3_VLCd3-VHCea- VLcea ou VHcd3-VLcd3-VLcea-VHcea. Preferencialmente, dito primeiro domínio de ligação específico para CD3 está localizado C- terminalmente em relação ao segundo domínio de ligação. Mais preferencialmente, os domínios de ligação dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos são arranjados na ordem VHCea-VLCea-VHcd3-VLcd3 ou VLcea-VHcea-VHCd3-VLCd3 · Ainda mais preferido, o arranjo é VLcea-VHcea-VHCd3-VLCd3. Mais preferido é o constructo de anticorpo bi-específico de cadeia simples A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO. 77 VHVL como definido em SEQ ID NO. 34. É visado que ditos primeiro e/ou segundo domínios de ligação dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos pode ser de origem não humana (i.e. derivados de seqüências não humanas). Por exemplo, ditos primeiro e/ou segundo domínios de ligação podem ser derivados de anticorpos monoclonais murinos. Contudo, anticorpos bi-específicos de cadeia simples derivados de anticorpos murinos podem ser reconhecidos como estrangeiros, quando sendo administrados a pacientes humanos. Assim, ditos primeiro e/ou segundo domínios de ligação dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos são preferencialmente de origem humana (i.e. derivados de seqüências humanas). Tais domínios de ligação humanos se ligando especificamente a CEA ou CD3 podem ser identificados e.g. por técnicas baseadas em apresentação de fago. É também visado que e.g. uma região VH do primeiro (ou segundo) dominio de ligação é uma região VH humana, enquanto que a região VL correspondente do primeiro (ou segundo) dominio de ligação pode ser de origem não humana. Tais domínios de ligação podem ser também referidos como domínios de ligação quiméricos. Ou um de ditos domínios de ligação é de origem não humana, enquanto que o outro é de origem humana, resultando em um anticorpo bi-específico de cadeia simples quimérico. Ditos primeiro e/ou segundo domínios de ligação podem ser ainda modificados para reduzir a imunogenicidade do anticorpo bi-específico de cadeia simples aqui descrito, quando sendo administrado a pacientes humanos. Por exemplo, pelo menos um de dito primeiro ou segundo domínios de ligação dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos pode ser humanizado, CDR-transplantado, quimérico e/ou desimunizado ou humano, como apresentado em mais detalhes abaixo. É também visado que o ligante do polipeptídeo ligando as regiões VH e VL no primeiro e/ou segundo domínio de ligação é desimunizado. Preferencialmente, o ligante do polipeptídeo ligando as regiões VH e VL no primeiro domínio de ligação desimunizado (específico para CD3) é um ligante de polipeptídeo desimunizado tendo a seqüência "GEGTSTGS(G2S)2GGAD" (SEQ ID NO. 141). É adicionalmente visado, que um ou ambos de ditos domínios de ligação dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos carreguem as chamadas "marcas" que podem ser usadas e.g. para expressão, purificação, detecção ou enriquecimento de proteínas, tais como marcas Flag-tag, marcas c-myc-tag, marcas GST-tag ou His-tag. Por exemplo, para a marca Flag- tag, o octapeptídeo hidrofílico mais amplamente usado é agora DYKDDDDK (Chubet and Brizzard, Biotechniques 20 (1996):136-141), apesar de estudos recentes sugerirem que um peptídeo mais curto, DYKD, pode ser reconhecido quase com a mesma afinidade pelo anticorpo monoclonal Ml (Knappik A, Pluckthun A; Biotechniques 17 (1994):754-761). Marcas Flag-tag, marcas c-myc-tag, marcas GST-tag ou His-tag ou similares podem ser posicionadas tanto no terminal N ou no terminal C dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples, tais como, por exemplo, tag-VHcea-VLcea-VHcD3-VLcD3 ou VLCea~ VHcea-VHcD3-VLcD3-tag. As fontes para e propriedades de tais marcas para propósitos de expressão, detecção ou purificação são bem descritas na arte; ver e.g. Lichty, Protein Expr Purif. 41 (2005), 98-105.

Como aqui usado, o termo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" refere-se a fragmentos de anticorpo compreendendo os domínios VH e VL de um anticorpo, caracterizado pelo fato desses domínios estarem presentes em uma única cadeia polipeptídica. Domínios variáveis podem ser arranjados na ordem VH-VL ou VL-VH. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende, ainda, um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígeno. Para uma revisão de scFv, veja Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Em um avanço específico, a invenção está relacionada a scFvs anti-CEA derivados dos anticorpos bi-especificos de cadeia simples aqui definidos.

De acordo com a presente invenção, o termo "domínio de ligação" ou "região variável", usado no contexto com interação com antígeno derivada de Ig, compreende fragmentos e derivados de polipeptídeos que compreendem pelo menos um CDR derivado de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado desse. É visado pela invenção, que o segundo domínio de ligação se ligue especificamente a CEA humano do anticorpo bi-especifico de cadeia simples aqui definido,compreendendo pelo menos um CDR, preferencialmente um CDR-H3, mais preferencialmente uma parte do CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino com a seqüência de aminoácidos "FYFDY" (SEQ ID NO. 112) correspondendo às posições de Kabat 100, 100a, 100b, 101, e 102, respectivamente, de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino; ainda mais preferido, com a seqüência de aminoácidos "DX1X2X3X4FYFDY" (SEQ ID NO. 65), caracterizado pelo fato de "Xi", "X2", "X3" ou "X4" representa qualquer resíduo de aminoácido, e o resíduo de aminoácido "D" corresponde à posição de Kabat 95 de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino e os resíduos de aminoácidos "FYFDY" correspondem às posições de Kabat 100, 100a, 100b, 101, e 102, respectivamente, de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino. É visado que "Xi", "X2", "X3" ou "X4" correspondentes às posições de Kabat 96 ("Xi"), 97 ("X2"), 98 ("X3") e 99 ("X4"), respectivamente, de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino, representem resíduos de aminoácidos "R" (Arginina), "G" (Glicina), "L" (Leucina), "Y" (Tirosina), "A" (Alanina), "D" (Ácido aspártico), "S" (Serina), "W" (Triptofano), "F" (Fenilalanina) ou "T" (Treonina). Aqui, está excluído do escopo da invenção que "Χ1", "X2", "X3" e "X4" representem o mesmo aminoácido, e.g. que "Χ1", "X2", "X3" e "X4" sejam todos "F" (Fenilalanina). Preferencialmente, "Χχ" representa "R" (Arginina), "F" (Fenilalanina), "M" (Metionina), "E" (Ácido glutâmico), ou "T" (Treonina); "X2" representa "G" (Glicina), "Y" (Tirosina), "A" (Alanina), "D" (Ácido aspártico), ou "S" (Serina); "X3" representa "L" (Leucina), "F" (Fenilalanina), "M" (Metionina), "E" (Ácido glutâmico), ou "T" (Treonina); e "X4" representa "R" (Arginina), "Y" (Tirosina), "A" (Alanina), "D" (Ácido aspártico), ou "S" (Serina). Ou mais preferido, o segundo domínio de ligação se ligando especificamente a CEA humano do anticorpo bi- específico de cadeia simples aqui definido compreende o CDR-H3 completo de A5B7 com a seqüência de aminoácidos "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) correspondente às posições de Kabat 95 - 102 do CDR-H3 de A5B7. Como mostrado nos Exemplos a seguir, a atividade citotóxica contra células tumorais do anticorpo bi-específico de cadeia simples aqui definido compreendendo tido seqüência de aminoácidos CDR-H3 mAb derivada de A5B7 "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) no segundo domínio de ligação interagindo com CEA é resistente a antígeno de CEA solúvel, permitindo, dessa forma, o tratamento de pacientes com tumor com altas concentrações de CEA no soro em seu plasma. A determinação de CDRs é conhecida da pessoa especialista na arte; ver e.g. http://www.bioinf.org.Uk/abs/#cdrid. A numeração de seqüências de aminoácidos em anticorpos pode ser conduzida e.g. de acordo com o esquema de numeração de Kabat descrito na arte; ver e.g. Kabat, Ε. Α., Τ. T. Wu, Η. M. Perry, K. S. Gottesman, and C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine.

Mais preferencialmente e como documentado nos exemplos anexados, o "anticorpo bi-especifico de cadeia simples" a ser empregado na composição farmacêutica da invenção é um Fv de cadeia simples bi-especifico (scFv) com um domínio de ligação anti-CD3 desimunizado (WO 2005/040220) e um domínio de ligação anti-CEA humano compreendendo pelo menos a seqüência de aminoácidos "DRGLRFYFDY" correspondente às posições de Kabat 95 - 102 (SEQ ID NO. 66) do CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino. Moléculas bi-específicas de cadeia simples são conhecidas na arte e são descritas e.g. em WO 99/54440 ou Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025.

0 termo "cadeia simples" como usado de acordo com a presente invenção significa que dito primeiro e dito segundo domínios do constructo bi-específico de cadeia simples são ligados covalentemente, preferencialmente na forma de uma seqüência de aminoácidos co-linear codificável por uma única molécula de ácido nucléico. Como aqui usado, "humano" refere-se à espécie Homo sapíens. Uma molécula "humana", e.g. CEA humano ou CD3 humano (CD3 épsilon) é, portanto, o variante daquela molécula como naturalmente expressada em Homo sapiens.

O termo "tumor epitelial" como aqui usado denota um tumor de origem epitelial que é CEA positivo (Câncer Medicine; 6th ed.; Kufe, Donald W.; Pollock, Raphael E.; Weichselbaum, Ralph R.; Bast, Robert C., Jr.; Gansler, Ted S.; Holland, James F.; Frei III, Emil, editors. Hamilton (Canada): BC Decker Inc. 2003; http://www.dkfζ.de; http://www.krebsinformationsdienst.de/Krebsarten/index.html ). O tumor epitelial a ser tratado pode ser um adenocarcinoma gastrointestinal, um adenocarcinoma de mama ou um adenocarcinoma de pulmão. Dito adenocarcinoma gastrointestinal é preferencialmente um adenocarcinoma colo-retal, pancreático, um adenocarcinoma esofágico ou gástrico. Como aqui apresentado, a composição farmacêutica da invenção é particularmente vantajosa para o tratamento de pacientes com tumores progressivos, metástase, câncer recorrente, tumores epiteliais de estágio tardio, alta carga de tumor epitelial, ou pacientes com tumor com uma concentração de CEA no soro maior do que 100 ng/ml (como determinado e.g. por ELISA), caracterizado pelos altos níveis de antígeno de CEA solúvel no plasma dos pacientes com tumor. Também está no escopo da invenção que dita composição farmacêutica pode ser usada após a remoção cirúrgica do tumor primário. Por exemplo, células tumorais residuais disseminadas derivadas de um tumor epitelial produtor de CEA também espalham CEA em seus microambientes. Assim, nas redondezas dessas células tumorais, o nível de CEA solúvel também é alto. Conseqüentemente, a resistência a CEA solúvel de atividade citotóxica de composições farmacêuticas da invenção é vantajosa também para o tratamento de doença residual mínima. É visado que ditas composições farmacêuticas possa ser administradas em um período no qual níveis de CEA no soro diminuem (devido à remoção da fonte de CEA, i.e. o tumor primário) para matar as células tumorais remanescentes. As composições farmacêuticas podem ser úteis, também, após a remoção do tumor primário, no caso de níveis de CEA no soro aumentarem devido à formação de tumores secundários ou metástases. A concentração de CEA no soro pode ser determinada e.g. por testes CEA ELISA (ver e.g. IBL CEA EIA, IBL Hamburg, Germany). Como apresentado acima, em várias abordagens terapêuticas baseadas em anticorpos, dito CEA de soro inibe a ligação do anticorpo à CEA de limite de membrana nas células tumorais e bloqueia a atividade de anticorpo, dessa forma, piorando o sucesso da terapia antitumoral.

Como aqui usado, o termo "se liga especificamente" ou expressões relacionadas, tais como "se ligando especificamente" ou "reatividade específica com/para" etc. refere-se à habilidade do primeiro e/ou segundo domínios de ligação do anticorpo bi-específico de cadeia simples como aqui definido para discriminar entre a respectiva primeira e/ou segunda molécula em tal extensão que, de um grupo de uma pluralidade de moléculas diferentes como parceiros de ligação em potencial, apenas dita respectiva primeira e/ou segunda molécula está/estão ligadas, ou está/estão significativamente ligadas. Tais medições de ligação podem ser rotineiramente realizadas e.g. em um aparato, por ELISA, análise FACS ou similares. Mais especificamente, o primeiro domínio de ligação do anticorpo bi-específico de cadeia simples como aqui definido se a CD3 humano, preferencialmente CD3 humano épsilon. O segundo domínio de ligação dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples como aqui definido se liga a um antígeno de tumor epitelial, i.e. CEA humano (antígeno carcinoembriônico, molécula 5 de adesão celular relacionada a antígeno carcinoembriônico; CEACAM5; CD66e), como apresentado abaixo. O termo "se ligando especificamente" significa, de acordo com esta invenção, que o anticorpo bi-específico de cadeia simples molécula é capaz de interagir especificamente com e/ou se liga a pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou até mais aminoácidos de cada da molécula alvo humana como aqui definido. Dito termo refere-se à especificidade da molécula de anticorpo, i.e. à sua habilidade de discriminar entre as regiões específicas da molécula alvo humana, como aqui definido. A interação específica do sítio de interação com antígeno com seu antígeno específico pode resultar em uma iniciação de um sinal, e.g. devido à indução de uma mudança da conformação do antígeno, uma oligomerização do antígeno, etc. Ainda, dita ligação pode ser exemplificada pela especificidade de um "princípio chave-fechadura". Assim, motivos específicos na seqüência de aminoácidos do sítio de interação com antigeno e a ligação de antigeno um ao outro como resultado de sua estrutura primária, secundária ou terciária, assim como o resultado de modificações secundárias de dita estrutura. A interação especifica do sitio de interação com antigeno com seu antigeno especifico pode resultar também um uma ligação de dito sitio ao antigeno.

A "ligação especifica" de um anticorpo é caracterizada primariamente por dois parâmetros: um parâmetro qualitativo (o epitopo de ligação, ou onde o anticorpo se liga) e um parâmetro quantitativo (a afinidade de ligação, ou quão fortemente ele se liga no local onde de ligação) . Qual epitopo é ligado por um anticorpo pode ser vantajosamente determinado por e.g. metodologia FACS conhecida, mapeamento de epitopo por localização de peptideo, espectroscopia de massa ou ELISA de peptideo. A força de ligação de anticorpo a um epitopo em particular pode ser vantajosamente determinada por e.g. metodologias conhecidas de Biacore e/ou ELISA. Uma combinação de tais técnicas permite o cálculo de uma razão sinal:ruído como uma medida representativa de especificidade de ligação. Em tal, uma razão sinal:ruído, o sinal representa a força de ligação de anticorpo ao epitopo de interesse, enquanto que o ruído representa a força de ligação do anticorpo a outros epitopos não relacionados diferindo do epitopo de interesse. Preferencialmente, uma razão sinal:ruído para um epitopo de interesse que é cerca de 50 vezes maior do que para outros epitopos diferentes do epitopo de interesse pode ser tomada como uma indicação de que o anticorpo avaliado se liga ao epitopo de interesse de maneira especifica, i.e. é um "ligante especifico".

O termo "ligação especifica" ou "interação especifica" como usado de acordo com a presente invenção significa que o constructo bi-especifico de cadeia simples não ou essencialmente não reage cruzadamente com polipeptideos de estruturas similares. Reatividade cruzada de um painel de constructo bi-especifico de cadeia simples sob investigação pode ser testada, por exemplo, avaliando-se a ligação de dito painel de constructo bi-especifico de cadeia simples sob condições convencionais (ver, e.g., Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 e Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) para o polipeptideo de interesse assim como para um número de mais ou menos (estruturalmente e/ou funcionalmente)

polipeptideos proximamente relacionados. Por exemplo, está no escopo da invenção que o primeiro domínio de ligação do anticorpo bi-especifico de cadeia simples da invenção se liga a CEA humano (antígeno carcinoembriônico; CEACAM5; CEA; CD66e) i.e. tanto para antigeno de CEA solúvel como para CEA de limite de membrana, ao contrário, anticorpos bi-especificos se ligando a outros membros da família CEA, tais como glicoproteína biliar (CEACAM1; BGP1; TM-CEA; CD66a), estão excluídos de dito escopo.

Exemplos para a interação específica de um sítio de interação com antígeno com um antígeno específico compreendem a especificidade de um ligante ao seu receptor. Dita definição compreende, particularmente, a interação de ligantes que induzem um sinal quando se ligando a seu receptor especifico. Exemplos para ligantes correspondentes compreendem citoquininas que interagem/se ligam com/a seus receptores específicos de citoquinina. Também

particularmente compreendido por dita definição está a ligação de um sítio de interação com antígeno para antígenos como antígenos da família das selectinas, integrinas e da família de fatores de crescimento como EGF. Outro exemplo para dita interação, que é também particularmente compreendido por dita definição, é a interação de um determinante antigênico (epitopo) com o sítio de ligação antigênico de um anticorpo.

O termo "se ligando a/interagindo com" pode também estar relacionado com um epitopo conformacional, um epitopo estrutural ou um epitopo descontínuo consistindo de duas regiões das moléculas alvo humanas ou partes dessas. No contexto desta invenção, um epitopo conformacional é definido por duas ou mais seqüências de aminoácidos discretas separadas na seqüência primária que vêm juntas na superfície da molécula quando o polipeptídeo se dobra na proteína nativa (Sela, (1969) Science 166, 1365 and Laver, (1990) Cell 61, 553-6).

O termo "epitopo descontínuo" significa, no contexto da invenção, epitopos não lineares que são reunidos a partir de resíduos de porções distantes da cadeia polipeptidica. Esses resíduos vêm juntos na superfície da molécula quando a cadeia polipeptidica se dobra em uma estrutura tridimensional para constituir um epitopo conformacional/estrutural.

"CD3" como aqui usado denota um antígeno que é expressado em células T como parte do complexo receptor multimolecular da célula T e que consiste de pelo menos cinco cadeias diferentes, CD3-gama, -delta, -épsilon, zeta, e -eta. O agrupamento de CD3 em células T, e.g., por anticorpos anti-CD3 imobilizados, acarreta na ativação da célula T similar ao engajamento do receptor da célula T, mas independente de sua especificidade típica de clone. Na verdade, a maioria dos anticorpos anti-CD3 reconhecem a cadeia épsilon CD3. A seqüência de aminoácidos de CD3 épsilon humano é representada no GenBank número de acesso accession number NM_000733 e compreende a SEQ ID NO. 111.

"CEA" denota o antígeno carcinoembriônico molécula 5 de adesão celular relacionada a antígeno carcinoembriônico; CEACAM5; CEA; CD66e), um antígeno expressado em um grande número de tumores de origem epitelial (Hammarstrõm, Sem. Câncer Biol. 9 (1999), 67-81; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399). A seqüência de aminoácidos de CEA humano é representada no GenBank número de acesso accession number NM_004363 e compreende SEQ ID NO. 76. Na presente invenção, foi surpreendentemente visto que é possível gerar medicamentos baseados em anticorpos com especificidade para CD3 humano e CEA humano, caracterizado pelo fato de que a atividade citotóxica direcionada contra células tumorais é resistente até a altas concentrações de antígeno de CEA solúvel. Essa descoberta é totalmente inesperada em vista do fato de que os anticorpos bi- específicos de cadeia simples da invenção se ligam ao antígeno de CEA solúvel. Por exemplo, quando constructos de anticorpo bi-específico de cadeia simples derivados dos anticorpos monoclonais T84.66 ou MFE-23 foram gerados, esses anticorpos foram altamente sensíveis a antígeno de CEA solúvel, i.e. sua atividade citotóxica foi bloqueada na presença de antígeno de CEA solúvel. A inibição da atividade citotóxica de ditos constructos por CEA solúvel poderia também não ser sobreposta por quantidades crescentes de anticorpo. Esses constructos foram também vistos sendo capazes de se ligar a CEA solúvel. Em vista disto, foi concluído que antígeno de CEA solúvel previne o anticorpo de exercer sua atividade citotóxica. Em contraste, os anticorpos bi-específicos de cadeia simples como aqui definidos são totalmente resistentes à presença até de altos níveis de CEA solúvel em sua atividade citotóxica em relação a células tumorais. Além do mais, devido a sua alta atividade citotóxica, ditos constructos bi-específicos como aqui definidos retém sua atividade biológica até em baixas concentrações. Em conseqüência, quantidades pequenas de composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos bi-específicos de cadeia simples como aqui definidos são suficientes para alcançar um efeito terapêutico em pacientes com tumor epitelial caracterizado pelas altas concentrações de CEA solúvel em seu soro/plasma. Altas concentrações de CEA solúvel no soro/plasma de pacientes com tumor epitelial são características de tumores progressivos, recorrentes, metastáticos, ou de estágio tardio e para pacientes com alta carga tumoral. Ainda mais surpreendente, foi visto que a seqüência de aminoácidos "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) correspondente às posições de Kabat 95 - 102 de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino é suficiente para mediar resistência a antigeno de CEA solúvel quando usada em um domínio de ligação CEA humano (i.e. domínios de ligação humanos se ligando especificamente a CEA humano) de anticorpos bi-específicos de cadeia simples anti-CEAxanti- CD3. Devido a sua origem humana, ditos constructos são pouco ou não imunogênicos quando sendo administrados a pacientes humanos com tumor. Em resumo, as composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos bi-específicos de cadeia simples como aqui definidos são particularmente úteis para o tratamento de pacientes com tumor epitelial com altas concentrações de CEA solúvel em seu plasma, como observado e.g. durante a progressão do tumor, para câncer recorrente, para metástase, para pacientes com alta carga tumoral, ou tumores de estágio tardio.

Em outro avanço preferido da composição farmacêutica da invenção, dito primeiro domínio de ligação específico para CD3 dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos está localizado C-terminalmente em relação ao segundo domínio de ligação.

No escopo da invenção e todos os avanços desta, a ordem de arranjo do primeiro e segundo domínios de ligação na cadeia polipeptídica simples, i.e. no anticorpo bi- específico de cadeia simples aqui definido, é relevante. É visado que o arranjo dos domínios de ligação dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos possam ser VHcea-VLcea-VHcd3—VLcd3 / VLcea-VHcea-VHcd3-VLcd3, VHcd3—VLcd3-VHcea- VLcea ou VHcd3-VLcd3_VLcea-VHcea. Como mostrado nos exemplos a seguir, as vantagens, como aqui descrito acima, são particularmente realizáveis quando o primeiro domínio de ligação (se ligando especificamente a CD3) está localizado C terminalmente em relação ao segundo domínio de ligação, i.e. mais próximo do terminal C do anticorpo bi-específico de cadeia simples do que o segundo domínio de ligação. É preferido que o primeiro domínio de ligação se ligando especificamente a CD3 humano seja arranjado na orientação VH-VL. Por exemplo, os domínios de ligação dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos podem ser arranjados na ordem VHcea-VLcea-VHcd3-VLcd3 ou VLcea-VHcea-VHcd3- VLCD3· Como aqui usado, "N terminalmente em relação a" ou "C terminalmente em relação a" e variantes gramaticais desses denotam a localização relativa na seqüência de aminoácidos primária, ao invés da localização no próprio terminal N ou C do anticorpo bi-específico de cadeia simples. Em conseqüência, como um exemplo não limitante, um primeiro domínio de li gação que está "localizado C terminalmente em relação ao segundo domínio de ligação" simplesmente denota que o primeiro domínio de ligação está localizado no lado carboxi do segundo domínio de ligação no anticorpo bi- específico de cadeia simples, e não excluí a possibilidade de que uma seqüência adicional, por exemplo, uma marca como apresentado acima, ou outro composto protéico ou não protéico, tal como um radioisótopo, seja localizado no terminal C propriamente do anticorpo bi-específico de cadeia simples.

Preferencialmente, ditos domínios de ligação dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos são arranjados na ordem VHcea-VLcea-VHcd3-VLcd3 ou VLcea-VHcea- VHcd3-VLcd3 · Ainda mais preferido, o arranjo é VLcea-VHcea- VHcd3-VLcd3. Mais preferido é o constructo de anticorpo bi- específico de cadeia simples A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO. 77 VHVL como definido na SEQ ID NO. 34.

É preferível que o segundo domínio de ligação se ligando especificamente a CEA humano do anticorpo bi- específico de cadeia simples aqui definido compreenda pelo menos um CDR, preferencialmente um CDR-H3, mais preferencialmente uma parte do CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino com a seqüência de aminoácidos viFYFDY" (SEQ ID NO. 112) correspondente às posições de Kabat 100, 100a, 100b, 101, e 102, respectivamente, de CDR- H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino; ainda mais preferível com a seqüência de aminoácidos xvDx1X2XsX4FYFDY" (SEQ ID NO. 65), caracterizado pelo fato de que "X1", "X2", "X3" ou "X4" representam qualquer resíduo de aminoácido, e o resíduo de aminoácido "D" corresponde à posição de Kabat 95 de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino e os resíduos de aminoácidos "FYFDY" correspondem às posições de Kabat 100, 100a, 100b, 101, e 102, respectivamente, de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino. Aqui, "Χι", "X2", "X3" e "X4" correspondem às posições de Kabat 96 ("X1"), 97 ("X2"), 98 ("X3") e 99 ("X4"), respectivamente, de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino. É visado que "Χι", "X2", "X3" ou "X4" represente os resíduos de aminoácidos "R" (Arginina), "G" (Glicina), "L" (Leucina), "Y" (Tirosina), "A" (Alanina), "D" (Ácido aspártico), "S" (Serina), "W" (Triptofano), "F" (Fenilalanina) ou "T" (Treonina). Aqui, é excluído do escopo das reivindicações da invenção que "X1", "X2", "X3" e "X4" representem o mesmo aminoácido, e.g. que "Xi", "X2", "X3" e "X4" sejam todos "F" (Fenilalanina) . Preferencialmente, "X1" representa "R" (Arginina), "F" (Fenilalanina), "M" (Metionina), "E" (Ácido glutâmico), ou "T" (Treonina); "X2" representa "G" (Glicina), "Y" (Tirosina), "A" (Alanina), "D" (Ácido aspártico), ou "S" (Serina); "X3" representa "L" (Leucina), "F" (Fenilalanina), "M" (Metionina), "E" (Ácido glutâmico), ou "T" (Treonina); e "X4" representa "R" (Arginina), "Y" (Tirosina), "A" (Alanina), "D" (Ácido aspártico), ou "S" (Serina). Ainda mais preferido, o segundo domínio de ligação específico para CEA humano compreende pelo menos a seqüência de aminoácidos "RFYFDY" (SEQ ID NO. 113), "LRFYFDY" (SEQ ID NO. 114), "GLRFYFDY" (SEQ ID NO. 115), ou "RGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 116) de CDR-H3 de anticorpo monoclonal Α5Β7. Mais preferido é o CDR-H3 completo de A5B7 com a seqüência de aminoácidos "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) correspondente às posições de Kabat 95 (vxD", Ácido aspártico), 96 ("R"; Arginina), 97 ("G"; Glicina), 98 ("L"; Leucina), 99 ("R"; Arginina), 100 ("F"; Fenilalanina) , 100a ("Y"; Tirosina), 100b ("F"; Fenilalanina), 101 ("D"; Ácido aspártico), e 102 ("Y"; Tirosina), respectivamente. A numeração de acordo com o sistema de Kabat é apresentada e.g. em Kabat, Ε. Α., Τ. T. Wu, Η. M. Perry, K. S. Gottesman, and C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md. : National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine.

Como mostrado nos Exemplos a seguir, a atividade citotóxica contra células tumorais do anticorpo bi- especifico de cadeia simples aqui definido compreendendo dita seqüência de aminoácidos CDR-H3 derivada de mAb A5B7 "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) no segundo domínio de ligação interagindo com CEA é resistente a antígeno de CEA solúvel, permitindo, dessa forma, o tratamento de pacientes com tumor com altas concentrações de CEA no soro em seu plasma.

Pode ser desejável modificar mais essa seqüência de aminoácidos CDR-H3 derivada de A5B7 "DRGLRFYFDY" e.g. para melhorar a afinidade para o antígeno alvo CEA (nas células de tumor epitelial) e/ou otimizar "especificidade precisa" do anticorpo bi-específico de cadeia simples como aqui definido. Até então, na seqüência de aminoácidos "DXiX2X3X4FYFDY" (SEQ ID NO. 65)", vários resíduos de aminoácidos podem ser testados nas posições "Χ1", "X2", "X3" e/ou "X4" (correspondentes às posições de Kabat 96 ("Χ1") , 97 ("X2"), 98 ("X3") e 99 ("X4"), respectivamente, de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino) para identificar um CDR-H3 modificado com afinidade e/ou especificidade fina melhorada. Por exemplo, "X1", "X2", "X3" ou "X4" pode representar resíduo de aminoácido "R" (Arginina) , "G" (Glicina), "L" (Leucina), "Y" (Tirosina), "A" (Alanina) , "D" (Ácido aspártico), "S" (Serina), "W" (Triptofano) , "F" (Fenilalanina) ou "T" (Treonina) . Aqui, um, dois, três ou quatro das posições "X" indicadas podem ser trocadas em comparação com a seqüência de aminoácidos "RGLR" original nas posições de Kabat 96 a 99 na seqüência de aminoácidos CDR-H3 "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66). Contudo, é excluído do escopo das reivindicações da invenção que "X1", "X2", "X3" e "X4" representem o mesmo aminoácido, e.g. que "Χ1", "X2", "X3" e "X4" seja todos "F" (Fenilalanina) . A modificação mencionada acima da seqüência de aminoácidos CDR-H3 "DRGLRFYFDY" derivada de A5B7 pode ser alcançadas por métodos conhecidos na arte, tais como PCR usando primers randomizados, o que permite a geração de anticorpos bi- específicos de cadeia simples com tais regiões CDR-H3 modificadas no domínio de ligação CEA. A afinidade ou especificidade fia desses anticorpos bi-específicos de cadeia simples modificados pode ser testada por métodos descritos na arte, e.g. por ELISA, Biacore ou análise FACS. A resistência a antígeno de CEA solúvel de um anticorpo bi- específico de cadeia simples com tal CDR-H3 modificado pode ser testada em testes de citotoxicidade na presença de quantidades crescentes de CEA solúvel, como descrito nos Exemplos a seguir.

Mais preferencialmente, dito segundo domínio de ligação específico para CEA humano dos anticorpos bi- específicos de cadeia simples aqui definidos compreende SEQ ID NO. 65 ou 66 e/ou um CDR-Hl tendo a seqüência de aminoácidos "SYWMH" (SEQ ID NO. 68) e/ou a CDR-H2 tendo a seqüência de aminoácidos "FIRNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 67) ou "FILNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 145). Assim, dito segundo domínio de ligação específico para CEA humano dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos pode compreender uma, duas ou três regiões CDR-H como definidas acima. Alternativamente, dito segundo domínio de ligação específico para CEA humano dos anticorpos bi- específicos de cadeia simples aqui definidos compreende SEQ ID NO. 65 ou 66 e/ou um CDR-Hl tendo a seqüência de aminoácidos "TYAMH" (SEQ ID NO. 70) e/ou um CDR-H2 tendo a seqüência de aminoácidos "LISNDGSNKYYADSVKG" (SEQ ID NO. 69). Assim, alternativamente, dito segundo domínio de ligação específico para CEA humano dos anticorpos bi- específicos de cadeia simples aqui definidos pode compreender uma, duas ou três regiões CDR-H como acima definidas. Ainda mais preferível, dito segundo domínio de ligação específico para CEA humano dos anticorpos bi- específicos de cadeia simples aqui definidos além de uma, duas ou três regiões CDR-H como descrito acima, compreende um CDR-Ll tendo a seqüência de aminoácidos "TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO. 73) e/ou um CDR-L2 tendo a seqüência de aminoácidos "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) e/ou um CDR-L3 tendo a seqüência de aminoácidos "MIWHSGASAV" (SEQ ID NO.71).

A seqüência de aminoácidos da região VH do segundo domínio de ligação específico para CEA humano dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos é preferencialmente SEQ ID NO. 60 compreendendo "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) correspondente às posições de Kabat 95 - 102 do CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino e um CDR-Hl tendo a seqüência de aminoácidos "SYWMH" (SEQ ID NO. 68) e um CDR-H2 tendo a seqüência de aminoácidos "FIRNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 67) .

A seqüência de aminoácidos da região VH do segundo domínio de ligação específico para CEA humano dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos is preferencialmente SEQ ID NO. 146 compreendendo "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) correspondente às posições de Kabat 95 - 102 do CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino e um CDR-Hl tendo a seqüência de aminoácidos xxSYWMH" (SEQ ID NO. 68) e um CDR-H2 tendo a seqüência de aminoácidos "FILNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 145) .

A seqüência de aminoácidos da região VH do segundo domínio de ligação específico para CEA humano dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos é preferencialmente SEQ ID NO. 58 ou SEQ ID NO. 62 compreendendo "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO. 66) correspondendo às posições de Kabat 95 - 102 de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino e um CDR-Hl tendo a seqüência de aminoácidos "TYAMH" (SEQ ID NO. 70} e um CDR-H2 tendo a seqüência de aminoácidos "LISNDGSNKYYADSVKG" (SEQ ID NO. 69) .

A região VL do segundo domínio de ligação específico para CEA humano dos anticorpos bi-específicos de cadeia simples aqui definidos é preferencialmente SEQ ID NO. 64 compreendendo CDR-Ll tendo a seqüência de aminoácidos "TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO. 73) e um CDR-L2 tendo a seqüência de aminoácidos "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO. 72) e um CDR-L3 tendo a seqüência de aminoácidos "MIWHSGASAV" (SEQ ID NO. 71).

Como apresentado acima, a ordem ou arranjo das regiões variáveis do segundo domínio de ligação se ligando especificamente a CEA pode ser VH-VL ou VL-VH. Ambos os arranjos estão no escopo da invenção. Para um segundo domínio de ligação compreendendo a VH de SEQ ID NO. 60 e a VL de SEQ ID NO. 64, o arranjo VH-VL é apresentado em SEQ ID NO. 52, enquanto que o arranjo VL-VH é representado em SEQ ID NO. 122. Para um segundo domínio de ligação compreendendo a VH de SEQ ID NO. 146 e a VL de SEQ ID NO. 64, o arranjo VH-VL é apresentado em SEQ ID NO. 147.

Para um segundo domínio de ligação compreendendo a VH de SEQ ID NO. 58 e a VL de SEQ ID NO. 64, o arranjo VH-VL é apresentado em SEQ ID NO 50, enquanto que o arranjo VL-VH é apresentado em SEQ ID NO. 120. Para um segundo domínio de ligação compreendendo a VH de SEQ ID NO. 62 e a VL de SEQ ID NO. 64, o arranjo VH-VL é apresentado em SEQ ID NO. 54, enquanto que o arranjo VL-VH é representado em SEQ ID NO. 124. Para um segundo domínio de ligação compreendendo a VH de SEQ ID NO. 56 e a VL de SEQ ID NO. 64, o arranjo VH-VL é apresentado em SEQ ID NO. 48, enquanto que o arranjo VL-VH é representado em SEQ ID NO. 118.

Ainda mais preferido, as regiões V do segundo domínio de ligação específico para CEA dos anticorpos bi- específicos de cadeia simples aqui definidos são selecionadas do grupo consistindo de:

(a) a região VH consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 60 e a região VL consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 64;

(b) a região VH consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 146 e a região VL consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 64;

(c) a região VH consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 58 e a região VL consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 64; (d) a região VH consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 62 e a região VL consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 64; e

(e) a região VH consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 56 e a região VL consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 64.

Mais preferível, dito anticorpo bi-especifico de cadeia simples compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de:

(a) a seqüência de aminoácidos como representada em qualquer de SEQ ID NOs. 6, 8, 16, 18, 24, 26, 32, 34, 40, 42, 126, 130, 134 ou 143;

(b) a seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos como apresentada em SEQ ID NOs. 5, 7, 15, 17, 23, 25, 31, 33, 39, 41, 125, 129, 133 ou 142;

(c) a seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos hibridizando sob condições estringentes à seqüência de ácidos nucléicos complementar de (b); (d) a seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos que é degenerada como resultado do código genético para uma seqüência de nucleotideos de (b); e

(e) a seqüência de aminoácidos pelo menos 85 % idêntica, mais preferido pelo menos 90 % idêntica, mais preferido pelo menos 95 % idêntica à seqüência de aminoácidos de (a) ou (b).

Em outro avanço preferido da composição farmacêutica da invenção, dito tumor epitelial a ser tratado é um adenocarcinoma gastrointestinal, uma adenocarcinoma de mama ou um adenocarcinoma de pulmão. Dito adenocarcinoma gastrointestinal é preferencialmente uma adenocarcinoma colo-retal, pancreático, um esofágico ou um adenocarcinoma gástrico.

Mais preferencialmente, dita composição farmacêutica da invenção é para o tratamento de tumores progressivos, tumores de estágio tardio, pacientes com tumor com alta carga tumoral, tumores metastáticos, ou pacientes com tumor com uma concentração de CEA no soro maior que 100 ng/ml. Dita concentração de CEA no soro pode ser determinada e.g. por ELISA.

Em mais um avanço preferido da composição farmacêutica da invenção, pelo menos um de dito primeiro ou segundo domínios de ligação dos anticorpos bi-especificos de cadeia simples aqui definidos é quimérico, humanizado, CDR- transplantado, e/ou desimunizado ou humano.

O termo "quimérico" como aqui usado foi definido acima. O termo domínio de ligação "humano", e.g. um domínio de ligação humano se ligando especificamente a CEA humano como aqui usado deve ser entendido significando que o anticorpo bi-específico de cadeia simples como aqui definido compreende (uma) seqüência de aminoácidos(s) contida no repertório de anticorpos humano ou repertório de anticorpos tendo pelo menos a seqüência de aminoácidos "FYFDY" correspondendo às posições de Kabat 100, 100a, 100b, 101, e 102 (SEQ ID NO. 112) do CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino ou um CDR-H3 derivado de A5B7 como definido acima. Um anticorpo bi-específico de cadeia simples como aqui definido pode ser também relacionado como humano se consistir de (a) seqüência (s) que desvia (m) de sua (suas) seqüência(s) linha de germes humana mais relacionadas por não mais do que deveria ser esperado devido à impressão de hipermutação somática. Adicionalmente, os anticorpos de vários mamíferos não humanos, por exemplo roedores, tais como camundongos e ratos, compreendem seqüências de aminoácidos VH CDR as quais pode-se esperar que existam também no repertório de anticorpos humano expressado. Qualquer tal seqüência(s) de origem humana ou não humana que pode ser esperada por existir no repertório humano expressado seria também considerada "humana" para os propósitos da presente invenção. Como aqui usado, o termo "humanizado", "humanização" ou "tipo humano" são usados intercambiavelmente para referir-se a um anticorpo bi-especifico de cadeia simples compreendendo em pelo menos um de seus domínios de ligação pelo menos uma região ("CDR") determinante de complementaridade de um anticorpo não humano ou fragmento desse. Abordagens de humanização são descritas, por exemplo, em WO 91/09968 e US 6.407.213. Como exemplos não limitantes, o termo engloba o caso no qual uma região variável de pelo menos um domínio de ligação compreende uma única região CDR, por exemplo a terceira região CDR da VH, de outro animal não humano, por exemplo um roedor, assim como o caso no qual uma ou ambas regiões variáveis compreendem, em cada de suas respectivas primeira, segunda e terceira CDRs, CDRs de dito animal não humano. No evento em que todos CDRs de um domínio de ligação do anticorpo bi- específico de cadeia simples foram substituídas por seus equivalentes correspondentes de, por exemplo, um roedor, referido por "transplante de CDR", e este termo deve ser entendido como sendo englobado pelo termo "humanizado" ou variantes gramaticalmente relacionados desse como aqui usado. 0 termo "humanizado" ou variantes gramaticalmente relacionados também engloba casos nos quais, além da substituição de uma ou mais regiões CDR em uma VH e/ou VL do primeiro e/ou segundo domínio de ligação, mutações adicionais (e.g. substituições) de pelo menos um único resíduo de aminoácido nas regiões ferramenta ("FR") entre os CDRs foram efetuadas de forma que os aminoácidos naquelas posições correspondem aos aminoácidos naquelas posições no animal do qual as regiões CDR usadas para substituir são derivadas. Como é conhecido na arte, tais mutações individuais são freqüentemente feitas nas regiões ferramenta após transplante de CDR para restaurar a afinidade de ligação original do anticorpo não humano usado como um doador de CDR para sua molécula alvo. O termo "humanizado" pode ainda englobar (uma) substituição de aminoácido(s) nas regiões CDR de um animal não humano para o(s) aminoácido (s) de uma região CDR correspondente de um anticorpo humano, além das substituições de aminoácidos nas regiões ferramenta como descrito acima.

Como aqui usado, o termo "desimunizado" ou "desimunização" denota modificação do primeiro e/ou segundo domínio de ligação vis-à-vis um constructo de tipo selvagem original transmitindo dito constructo de tipo selvagem não imunogênico ou menos imunogênico em humanos. Abordagens de desimunização são apresentadas em e.g. WO 00/34317, WO 98/52976, WO 02/079415 ou WO 92/10755. 0 termo "desimunizado" também está relacionado a constructos, que apresentam propensão reduzida para gerar epitopos de célula T. De acordo com esta invenção, o termo "propensão reduzida para gerar epitopos de célula T" está relacionado à remoção de epitopos de célula T levando a ativação específica de célula T. Adicionalmente, "propensão reduzida para gerar epitopos de célula T" significa substituição de aminoácidos contribuindo para a formação de epitopos de célula T, i.e. substituição de aminoácidos, que são essenciais para a formação de um epitopo de célula T. Em outras palavras, "propensão reduzida para gerar epitopos de célula T" está relacionada a imunogenicidade reduzida ou capacidade reduzida para induzir proliferação de células T independente de antigeno. O termo "epitopo de célula T" está relacionado a seqüências peptidicas curtas que podem ser liberadas durante a degradação de peptídeos, polipeptideos ou proteínas em células e subseqüentemente ser apresentadas por moléculas do principal complexo de histocompatibilidade (MHC) para iniciar a ativação de células T; ver inter alia WO 02/066514. Para peptídeos apresentados por MHC classe II tal ativação de células T pode, então, dar início a uma resposta a anticorpo por estímulo direto de células T para produzir ditos anticorpos. "Propensão reduzida para gerar epitopos de célula T" e/ou "desimunização" pode ser medida por técnicas conhecidas na arte. Preferencialmente, desimunização de proteínas pode ser testada in vitro por teste de proliferação de células T. Nesse teste PBMCs de doadores representando > 80 % de alelos HLA-DR no mundo são rastreados para proliferação em resposta tanto a peptídeos de tipo selvagem ou a peptídeos desimunizados. Idealmente a proliferação celular é detectada apenas com carregamento das células apresentando antígenos com peptídeos de tipo selvagem. Alternativamente, pode-se testar desimunização expressando tetrâmeros de HLA-DR representando todos os haplótipos. Esses tetrâmeros podem ser testados para ligação de peptídeo ou carregados com substitutos de peptídeos para células apresentando antigeno em testes de proliferação. Para testar se peptideos desimunizados são apresentados em haplótipos HLA-DR, a ligação de e.g. peptideos rotulados por fluorescência em PBMCs pode ser medida. Adicionalmente, a desimunização pode ser provada determinando se anticorpos contra moléculas desimunizadas foram formadas após a administração em pacientes. Preferencialmente, moléculas derivadas de anticorpo são desimunizadas nas regiões ferramenta, e na maioria das regiões CDR, não são modificadas para gerar propensão reduzida para induzir epitopo de célula T de forma que a afinidade de ligação das regiões CDR não é afetada. Até a eliminação de um epitopo de célula T resulta em imunogenicidade reduzida.

Em resumo, as abordagens acima ajudam a reduzir a imunogenicidade dos anticorpos bi-especificos de cadeia simples terapêuticos, como aqui definidos, quando sendo administrados a pacientes com tumor epitelial. Por exemplo, o primeiro domínio de ligação se ligando especificamente a CD3 como mostrado em SEQ ID NO. 77 é desimunizado; ver também W02005/040220. Preferencialmente, o arranjo das regiões V neste domínio de ligação CD3 é VH-VL.

Em outro aspecto, a invenção está relacionada a um anticorpo bi-específico de cadeia simples compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) a seqüência de aminoácidos como representada em qualquer de SEQ ID NOs. 6, 8, 16, 18, 24, 26, 32, 34, 40, 42, 126, 130, 134 ou 143;

(b) a seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos como apresentado em SEQ ID NOs. 5, 7, 15, 17, 23, 25, 31, 33, 39, 41, 125, 129, 133 ou 142;

(c) a seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos hibridizando sob condições estringentes à seqüência de ácidos nucléicos complementar de (b);

(d) a seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos que é degenerada como resultado do código genético para uma seqüência de nucleotideos de (b); e

(e) a seqüência de aminoácidos pelo menos 85 % idêntica, mais preferida pelo menos 90 % idêntica, mais preferida pelo menos 95 % idêntica à seqüência de aminoácidos de (a) ou (b).

Em um avanço, a invenção está relacionada a uma composição compreendendo a anticorpos bi-especificos de cadeia simples, como definidos acima. Preferencialmente, ditos anticorpos bi-especificos de cadeia simples, como definidos acima, são usados como composições farmacêuticas para o tratamento de um tumor epitelial ou tumores epiteliais em um humano. Dito(s) tumor(es) epitelial(is) é (são) CEA-positivo(s). A atividade citotóxica contra células de tumor epitelial CEA-positivas dessas composições farmacêuticas é resistente até a altas concentrações de antigeno de CEA solúvel no plasma de pacientes com tumor. Além do mais, ditos anticorpos bi-especificos de cadeia simples como definidos acima ou scFvs anti-CEA derivados desses podem ser usados como composições diagnosticas para a detecção de um tumor epitelial ou tumores epiteliais em um humano, como apresentado em mais detalhes abaixo.

O termo "hibridizando sob condições estringentes" como aqui usado refere-se a seqüências de ácidos nucléicos capazes de hibridizar, sob condições de hibridização estringentes, para seqüências representadas em SEQ ID NOs. 5, 7, 15, 17, 23, 25, 31, 33, 39, 41, 125, 129, 133 ou 142, ou o complemento dessas, e que codificam um anticorpo bi- especifico de cadeia simples tendo atividade citotóxica contra células tumorais CEA positivas. "Condições de hibridização estringentes" referem-se a uma incubação de um dia para o outro a 42°C em uma solução compreendendo formamida 50%, 5x SSC (NaCl a 750 mM, trissódio citrato a 75 mM) , fosfato de sódio a 50 mM (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, 10% dextran sulfato, e 20 ug/ml de DNA de esperma de salmão tosquiado desnaturado, seguido por lavagem em filtros em 0,lx SSC a cerca de 65°C.

Se qualquer molécula de ácido nucléico ou polipeptideo em particular é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de nucleotideos ou seqüência de aminoácidos, aqui definida, pode ser determinado convencionalmente usando programas de computador conhecidos. Um método preferido para determinar a melhor correspondência geral entre uma seqüência em questão (uma seqüência aqui definida) e uma seqüência objeto, também referido como alinhamento global de seqüência, pode ser determinado usando o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag et al.

(Comp. App. Biosci. 6:237-245(1990)). Em um alinhamento de seqüência as seqüências em questão e objeto são ambas as seqüências de DNA. Uma seqüência de RNA pode ser comparada convertendo-se U's em T's.

A invenção também provê uma composição farmacêutica compreendendo a seqüência de ácidos nucléicos codificando um anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui definido. Dito ácido nucléico pode ser utilizado e.g. para terapia gênica para tratar um tumor epitelial em um humano, como apresentado em mais detalhes abaixo.

A invenção está relacionada ainda a uma composição farmacêutica compreendendo um vetor que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos como definida acima. Preferencialmente, dito vetor compreende ainda uma seqüência reguladora que é operacionalmente ligada a dita seqüência de ácidos nucléicos definida acima. Mais preferencialmente, dito vetor é um vetor de expressão. Adicionalmente, o vetor da presente invenção pode também ser um vetor de transferência de genes ou de direcionamento de genes. A terapia gênica que é baseada na introdução de genes ou ácidos nucléicos terapêuticos em células por técnicas ex-vivo ou in-vivo é uma das mais importantes aplicações de transferência de genes. Vetores, métodos ou sistemas de distribuição de genes adequados para uma terapia gênica in-vitro ou in-vivo são descritos na literatura e são conhecidos de uma pessoa especialista na arte; ver, e.g., Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534- 539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370- 374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodua, Blood 91 (1998), 30-36; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-2251; Verma, Nature 389 (1997), 239-242; Anderson, Nature 392 (Supp. 1998), 25-30; Wang, Gene Therapy 4 (1997), 393-400; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957; US 5.580.859; US 5.589.466; US 4.394.448 ou Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640, e referências ai citadas. A molécula de ácido nucléicos e vetores como aqui definidos podem ser projetados para introdução direta ou para introdução via lipossomos, vetores virais (e.g. adenoviral, retroviral), eletroporação, ou outros sistemas de distribuição na célula. Adicionalmente, um sistema baciloviral pode ser usado como um sistema de expressão eucarionte para a molécula de ácido nucléicos como aqui definida. A abordagem de introdução e de terapia gênica deveria, preferencialmente, levar à expressão de um constructo funcional de anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui definido, pelo qual dito constructo de anticorpo bi-especifico de cadeia simples expressado é particularmente útil no tratamento, melhora e/ou prevenção de um tumor epitelial em um humano.

Em um aspecto adicional, a invenção está relacionada a uma composição farmacêutica compreendendo um hospedeiro transformado ou transfectado com um vetor ou um ácido nucléico como definido acima.

Um aspecto adicional da invenção está relacionada a uma composição farmacêutica como aqui definido acima, compreendendo ainda um composto protéico capaz de prover um sinal de ativação para células imuno efetoras.

Preferencialmente, a composição farmacêutica compreende ainda formulações de carregadores, estabilizantes e/ou excipientes adequados.

Em outro aspecto, a invenção está relacionada a um processo para a produção de uma composição farmacêutica como definida acima, dito processo compreendendo cultivar um hospedeiro como definido acima sob condições permitindo a expressão do anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui definido acima e recuperar o anticorpo bi- especif ico de cadeia simples produzido a partir da cultura. Um aspecto adicional da invenção está relacionado a um uso de um anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui definido acima ou como produzido pelo processo como aqui definido acima, uma molécula de ácido nucléico como aqui definida acima, um vetor como aqui definido acima ou um hospedeiro como aqui definido acima para a preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção, tratamento ou melhora de um tumor epitelial em um humano. Outro aspecto da invenção está relacionado a um método para a prevenção, tratamento ou melhora de um tumor epitelial em um humano, dito método compreendendo a etapa de administração de uma quantidade efetiva de uma composição farmacêutica da invenção ou como produzida de acordo pelo processo apresentado acima. A pessoa especialista na arte, em particular o médico acompanhante, pode avaliar o tratamento bem-sucedido do paciente com necessidade de administração da molécula bi-especifica/anticorpo bi-especifico de cadeia simples da invenção. Conseqüentemente, o esquema de administração, assim como a dosagem e o tempo de administração, pode ser avaliado por dita pessoa especialista na arte: Uma "melhora" e/ou "tratamento" correspondente a ser avaliado são definidos abaixo.

Como aqui usado, uma "quantidade efetiva" ou "quantidade terapeuticamente efetiva" de uma composição farmacêutica da invenção no contexto de tumores epiteliais refere-se àquela quantidade do agente terapêutico suficiente para destruir, modificar, controlar ou remover tecido tumoral primário, regional ou metastático. Uma quantidade terapeuticamente efetiva pode referir-se à quantidade de agente terapêutico suficiente para atrasar ou minimizar o espalhamento do(s) tumor(es) epitelial(s). Uma quantidade terapeuticamente efetiva pode também referir-se à quantidade do agente terapêutico ou agente farmacêutico que provê um beneficio terapêutico no tratamento ou gerenciamento do(s) tumor(es) epitelial(s). Ainda, uma quantidade terapeuticamente efetiva com relação a um agente terapêutico ou agente farmacêutico da invenção significa que quantidade de agente terapêutico ou agente farmacêutico sozinha, ou em combinação com outras terapias, que provê um beneficio terapêutico no tratamento ou gerenciamento de um tumor epitelial. Usado em conexão com uma quantidade do anticorpo bi-especifico de cadeia simples aqui definido, o termo pode englobar uma quantidade que melhore a terapia geral, reduz ou evita efeitos indesejados, ou intensifica a eficácia terapêutica de ou sinergia (como aqui definido) com outro agente terapêutico. Preferencialmente, uma quantidade terapeuticamente efetiva de um terapêutico melhora a terapia no geral, reduz ou evita efeitos indesejados, ou intensifica a eficácia terapêutica de ou sinergia com outro agente terapêutico no tratamento de (um) tumor epitelial. Por exemplo, um anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui definido pode causar um encolhimento do diâmetro de um tumor epitelial de 20% se administrado a um paciente como uma monoterapia. Em contraste, um segundo medicamento e.g. um agente anti- câncer como definido abaixo, pode causar um encolhimento de tumor de 10%. Contudo, se ambos anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui medicamento são administrados co-terapia, um encolhimento observado. Tal efeito é sinergistico como aqui usado.

definido e dito segundo em combinação em forma de uma de tumor de 50% pode ser entendido como um efeito

Como aqui referido, o termo "terapia" refere-se a qualquer esquema de administração, método e/ou agente que possa ser usado na prevenção, tratamento ou melhora de um tumor epitelial. O termo "prevenção, tratamento ou melhora de um tumor epitelial" é apresentado em mais detalhes abaixo. Os termos "terapias" e "terapia" podem referir-se a uma terapia biológica, terapia de apoio, quimioterapia, terapia de radiação e/ou outras terapias úteis no tratamento, prevenção ou melhora de um tumor epitelial, ou um ou mais sintomas desse.

Como aqui usado, os termos "tratar", "tratamento" e "tratando" no contexto de administrar uma terapia ou terapias a um paciente referem-se à redução ou melhora da progressão, severidade, e/ou duração de um tumor epitelial. Dito tumor(es) epitelial(is) pode ser associado com expressão aberrante e.g., sobre-expressão ou atividade de CEA, e/ou a melhora de um ou mais sintomas dessas resultantes da administração de uma mais terapias (incluindo a administração de um ou mais fármacos ou agentes terapêuticos). O modo mais preferencial de administração é uma administração intravenosa por um dado tempo/periodo de tempo. Enquanto o anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui definido pode ser administrado sozinho, preferível é a administração em um carregador farmaceuticamente aceitável. Exemplos de carregadores farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos na arte e incluem soluções salinas tamponadas de fosfato, água, lipossomos, vários tipos de agentes umidificantes, soluções estéreis, etc. Composições compreendendo tais carregadores podem ser formuladas por métodos convencionais bem conhecidos. Essas composições farmacêuticas podem ser administradas ao sujeito a uma dose adequada. O regime de dosagem será determinado pelo médico acompanhante e fatores clínicos. Como é bem conhecido nas artes médicas, dosagens para qualquer paciente depende de vários fatores, incluindo o tamanho do paciente, área de superfície corporal, idade, o composto em particular a ser administrado, sexo, tempo e rota de administração, saúde geral, e outras drogas sendo administradas concomitantemente. Preparações para administração parenteral incluem soluções aquosas ou não aquosas estéreis, e suspensões. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como etil oleato. Carregadores aquosos incluem água, soluções aquosas, ou suspensões, incluindo meio salino e tamponado. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringerr dextrose e cloreto de sódio, ou Ringer1S lactado, ou óleos fixados. Veículos intravenosos incluem fluidos e nutrientes reabastecedores, reabastecedores eletrólitos (tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer), e similares. Preservativos e outros aditivos também podem estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes de quelação, gases inertes e similares. Além disso, a composição da presente invenção pode compreender carregadores protéicos, tipo, e.g., albumina ou imunoglobulina de soro, preferencialmente de origem humana. É visado que a co-terapia deva compreender, além do anticorpo bi-especifico de cadeia simples protéico, como aqui definido, mais agentes biologicamente ativos, dependendo do uso pretendido da composição farmacêutica. Tais agentes podem ser agentes atuando no sistema gastrointestinal, agentes atuando como agentes citostáticos, drogas prevenindo hiperuriquemia, agentes inibindo reações imuno (e.g. corticosteróides, FK506), drogas atuando no sistema circulatório e/ou agentes tais como moléculas co-estimuladoras de células T ou citoquininas conhecidas na arte. Preferencialmente, o anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui definido é formulado em um tampão, um estabilizante e um surfactante. O tampão pode ser um tampão de fosfato, citrato, succinato ou acetato. O estabilizante pode ser (um) aminoácido(s) e/ou um açúcar. Os surfactantes podem ser detergentes, PEGs, ou similares. Mais preferencialmente, o anticorpo bi-especifico de cadeia simples como aqui definido é formulado em citrato, lisina, trealose e Tween 80. Como diluente para dita composição farmacêutica, isotônico salino e Tween 80 são preferidos. O termo "melhora" como aqui usado refere-se a uma melhoria ou uma moderação na severidade de uma doença, i.e. um tumor epitelial. Por exemplo, tal melhora pode ser a transformação para uma doença estável - ou até, mais preferível - um encolhimento do(s) tumor(es) epitelial(s), i.e. uma resposta parcial mínima ou resposta completa, devido à administração das composições farmacêuticas da invenção. "Doença estável" refere-se a um estado da doença no qual nenhum tumor ou nenhum crescimento / progressão significativa de tumor possa ser observado ou detectado por métodos diagnósticos clínicos e/ou histológicos. Por exemplo, um encolhimento do tumor de mais do que 50% de diminuição da soma de áreas seccionais de lesões de índice pode ser considerado como uma "resposta parcial". Uma "resposta completa" denota um estado no qual nenhuma lesão possa ser mais detectada após o tratamento. Uma resposta com um encolhimento de tumor entre doença estável e resposta parcial pode ser considerada como uma reposta mínima. Por exemplo, um encolhimento de 20%, 25% ou 30% da soma de áreas seccionais de lesões de índice pode ser referido como resposta mínima.

O termo "melhora" como aqui usado engloba também uma redução do número de tumores epiteliais. O termo adicionalmente denota a prevenção/retardo da progressão do tumor. Além do mais, uma melhoria da sobrevivência geral de pacientes com tumor tratados, em comparação a pacientes com tumor não tratados, pode ser considerado como uma "melhora" como aqui usado. Isto aplica mutatis mutandis para uma melhoria da sobrevivência livre de progressão ou a sobrevivência livre de reincidência de pacientes com tumor tratados, se comparado a pacientes com tumor não tratados.

Além disso, o termo "melhora" pode referir-se, também, a uma redução da intensidade dos sintomas de um tumor epitelial, resultando e.g. em uma melhoria da qualidade de vida dos pacientes com tumor tratados.

O termo "prevenção de um tumor epitelial" como aqui usado deve ser entendido como a seguir: Após a remoção cirúrgica do(s) tumor(es) epitelial(is) primário(s) de um paciente humano e/ou após a quimioterapia ou tratamento radiológico do(s) tumor(es) epitelial(is) primário(s), pode ser o caso de que nem todas as células tumorais puderam ser eliminadas do corpo. Contudo, essas células tumorais remanescentes podem dar inicio a câncer recorrente, i.e. recorrência local e/ou metástases no paciente. Metástase é uma complicação freqüente de câncer, ainda o processo através do qual células cancerosas se disseminam a partir do(s) tumor(es) primário(s) para formar colônias distantes é pobremente entendido. Cânceres metastáticos são, quase sem exceção, incuráveis, o que levanta a necessidade de novas modalidades terapêuticas. A composição farmacêutica da invenção pode ser usada para matar essas células tumorais disseminadas para prevenir a formação de tumores secundários (se originando das células tumorais remanescentes no corpo após a terapia primária). Desse jeito, a composição farmacêuti ca ajuda a prevenir a formaçao de recorrência local e/ou metástases em pacientes com tumor.

O sucesso da terapia antitumoral pode ser monitorado estabelecendo métodos padrão para as respectivas entidades de doença, e.g. por tomografia computadorizada, raio-X, tomografia de ressonância magnética nuclear (e.g. para avaliação de resposta baseada nos critérios do National Câncer Institute [Cheson (1999), J. Clin. Oncol.; 17(4) : 1244]) , tomografia de varredura por emissão de pósitrons, endoscopia, Sorteio de Células Ativadas por Fluorescência, aspiração de tutano de osso, fluido pleural ou peritoneal, tecido/histologias, e vários parâmetros químicos clínicos específicos de tumor epitelial (e.g. concentração de CEA solúvel no soro) e outros métodos padrão estabelecidos. Além disso, testes determinando a ativação de células T podem ser usados; ver e.g. W099/054440. Estatísticas para a determinação de sobrevivência geral, sobrevivência livre de progressão ou sobrevivência livre de recorrência de pacientes com tumor tratados, em comparação a pacientes com tumor não tratados, podem ser também usadas.

Preferencialmente, dito tumor epitelial é um adenocarcinoma gastrointestinal, um adenocarcinoma de mama ou um adenocarcinoma de pulmão. Dito adenocarcinoma gastrointestinal é mais preferencialmente um adenocarcinoma colo-retal, pancreático, um esofágico ou um adenocarcinoma gástrico. Ainda mais preferido, dita composição farmacêutica da invenção é para o tratamento de tumores progressivos, tumores de estágio tardio, pacientes com tumor com alta carga tumoral, tumores metastáticos, ou pacientes com tumor com uma concentração de CEA no soro maior que 100 ng/ml (como determinada e.g. por ELISA).

Em outro avanço preferido dos usos ou métodos da invenção, dita composição farmacêutica como aqui definida acima é adequada para ser administrada em combinação com uma droga adicional, i.e. como parte de uma co-terapia.

Em certos avanços, o anticorpo bi-especifico de cadeia simples, ou composição farmacêutica, como aqui definidos, é administrado em combinação com uma ou mais terapias. Em certos avanços, o anticorpo bi-especifico de cadeia simples, ou composição farmacêutica, como aqui definidos, é administrado a um paciente concomitantemente com uma ou mais terapias. Preferencialmente, tais terapias são úteis para o tratamento de tumores epiteliais. O termo "concomitantemente" não é limitado à administração de composições farmacêuticas ou agentes terapêuticos exatamente no mesmo tempo, mas sim, significa que o anticorpo bi-especifico de cadeia simples, ou composição farmacêutica, como aqui definidos, e outros agentes são administrados a um paciente em uma seqüência e em um intervalo de tempo de forma que o anticorpo bi-especifico de cadeia simples, ou composição farmacêutica, como aqui definidos, possam atuar juntos com o outro agente para prover um beneficio aumentado do que se fosse administrados de outra forma. Por exemplo, cada agente terapêutico pode ser administrado ao mesmo tempo ou seqüencialmente em qualquer ordem em diferentes pontos de tempo; contudo, se não administrados no mesmo momento, eles deveriam ser administrados em momentos suficientemente próximos de forma a prover o efeito terapêutico desejado.

Cada agente terapêutico pode ser administrado separadamente, de qualquer forma apropriada e por qualquer rota adequada. Em outros avanços, o anticorpo bi-especifico de cadeia simples, ou composição farmacêutica, como aqui definidos, são administrados antes, concomitantemente ou após cirurgia. Preferencialmente, a cirurgia remove completamente tumores epiteliais localizados ou reduz o tamanho de grandes tumores epiteliais. A cirurgia pode ser feita como uma medida preventiva ou para aliviar a dor.

As quantidades de dosagem e freqüências de administração aqui providas são englobadas pelo termo "terapeuticamente efetivo" como definido acima. A dosagem e freqüência irão variar, tipicamente, de acordo com fatores específicos para cada paciente dependendo dos agentes terapêuticos ou profiláticos específicos administrados, a severidade e tipo de tumor epitelial, a rota de administração, assim como a idade, peso corporal, resposta, e histórico médico do paciente. Regimes adequados podem ser selecionados por um especialista na arte considerando-se tais fatores e seguindo, por exemplo, dosagens relatadas na literatura e recomendadas nas referências Physiciansf Desk Reference (59th ed., 2005).

Em alguns avanços, terapia por administração do anticorpo bi-especifico de cadeia simples, ou composição farmacêutica, como aqui definidos, é combinada com a administração de uma ou mais terapias, tais como quimioterapias, terapias de radiação, terapias hormonais, e/ou terapias biológicas /imunoterapias. Agentes terapêuticos incluem, mas não são limitados a, moléculas protéicas, incluindo, mas não limitadas a, peptideos, polipeptideos, proteínas, incluindo proteínas modificadas após a tradução, anticorpos etc.; ou moléculas pequenas (menores do que 1000 dáltons), compostos inorgânicos ou orgânicos; ou moléculas de ácido nucléicos incluindo DNA de dupla-fita ou fita simples, ou RNA de dupla-fita ou fita simples, assim como moléculas de ácido nucléicos de hélice tripla. Agentes terapêuticos podem ser derivados de qualquer organismo conhecido (incluindo, mas não limitados a, animais, plantas, bactérias, fungos, e protistas, ou vírus) ou de uma biblioteca de moléculas sintéticas.

Em um avanço específico, os métodos e usos da invenção englobam administração do anticorpo bi-específico de cadeia simples, ou composição farmacêutica, como aqui definidos, em combinação com a administração de um ou mais agentes terapêuticos que são inibidores de quinases, tais como Gefitinib (Iressa), Erlotinib (Tarceva), anticorpos anti- EGFR (e.g. Cetuximab; Erbitux), ou anticorpos anti-Her2/neu (e.g. Trastuzumab; Herceptina) descritos na arte; ver e.g., Hardie and Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Book, I and II, Academic Press, San Diego, Califórnia.

Em outro avanço especifico, os métodos e usos da invenção englobam administração do anticorpo bi-especifico de cadeia simples, ou composição farmacêutica, como aqui definidos, em combinação com a administração de um ou mais agentes terapêuticos que são inibidores de angiogênese, tais como anticorpos anti-VEGF (e.g. Bevacizumab; Avastina), pequenos compostos moleculares (e.g. Vatalanib ou Sorafenib) ou inibidores de COX descritos na arte.

Em outro avanço especifico, os métodos e usos da invenção englobam a administração de anticorpo de cadeia simples bi-especifico ou composição farmacêutica como definida aqui em combinação com a administração de um ou mais agentes terapêuticos que são agentes anticâncer como 5-fluorouracil, Leucovorin, Capecitabina, Oxaliplatina, Irinotecan, Gemcitabine, Doxorubicina, Epirubicina, Etoposideo, Cisplatina, Carboplatina, Taxanos (por exemplo, Docetaxel, Paclitaxel) descritos na arte.

Preferencialmente, uma co-terapia de um paciente com um tumor epitelial usando anticorpo de cadeia simples bi- especifico ou composição farmacêutica como definida aqui em combinação com (um) agente(s) terapêutico(s) adicional(is) resulta em efeito sinergistico. Como usado aqui, o termo "sinergístico" refere-se a uma combinação de terapias (por exemplo, uma combinação de um anticorpo de cadeia simples bi-especifico como definido aqui e (a) agente(s) terapêutico (s) adicional(is) como determinado acima) a qual é mais efetiva do que os efeitos aditivos de quaisquer duas ou mais terapias simples (por exemplo, um ou mais agentes terapêuticos). Por exemplo, um anticorpo de cadeia simples bi-especifico como definido aqui pode causar um encolhimento do diâmetro de um tumor epitelial de 20% se administrado para um paciente como uma mono-terapia. Em contraste, um segundo medicamento, por exemplo, um agente anticâncer como definido abaixo, pode causar um encolhimento tumoral de 10%. Entretanto, se ambos o anticorpo de cadeia simples bi-especifico como aqui definido e o dito segundo medicamento são administrados em combinação na forma de uma co-terapia, um encolhimento tumoral de 50% pode ser observado.

Um efeito sinergistico de uma combinação de terapias (por exemplo, uma combinação de um anticorpo de cadeia simples bi-especifico como definido aqui e (um) agente(s) terapêutico (s) adicional (is) como determinado acima) permite o uso de dosagens menores de uma ou mais das terapias (por exemplo, um ou mais agentes terapêuticos) e/ou administração menos freqüente de ditas terapias para um paciente com uma doença, por exemplo um tumor epitelial. A habilidade de utilizar dosagens menores de terapias (por exemplo, agentes terapêuticos) e/ou de administrar ditas terapias menos freqüentemente reduz a toxicidade associada com a administração de ditas terapias para um sujeito sem reduzir a eficácia de ditas terapias na prevenção ou tratamento de uma doença, por exemplo, um tumor epitelial. Além disso, um efeito sinergistico pode resultar em eficácia melhorada de terapias (por exemplo, agentes terapêuticos) na prevenção, gerenciamento, tratamento e/ou melhora de um tumor epitelial (o qual pode estar associado com expressão aberrante (por exemplo, aumento na expressão) ou atividade de CEA). Finalmente, o efeito sinergistico de uma combinação de terapias (por exemplo, agentes terapêuticos) pode evitar ou reduzir efeitos colaterais adversos ou indesejados associados com o uso de qualquer terapia simples.

Em dita co-terapia, um agente ativo pode ser opcionalmente incluído na mesma composição farmacêutica que o anticorpo de cadeia simples bi-específico como definido aqui, ou pode ser incluído em uma composição farmacêutica separada. Nesse último caso, dita composição farmacêutica separada é apropriada para administração antes, simultaneamente ou após administração de dita composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de cadeia simples bi-específico como definido aqui. A droga adicional ou composição farmacêutica pode ser um composto não protéico ou um composto protéico. No caso da droga adicional ser um composto protéico, é vantajoso que o composto protéico seja capaz de fornecer um sinal de ativação para células imunes efetoras. Preferencialmente, dito composto protéico ou composto não protéico pode ser administrado simultaneamente ou não simultaneamente com um anticorpo de cadeia simples bi- especifico como definido aqui acima, uma molécula de ácido nucléico como definida aqui acima, um vetor como definido como definido aqui acima, ou um hospedeiro como definido como definido aqui acima. Preferencialmente, dito sujeito a ser tratado é um humano.

Em um avanço adicional, um anticorpo de cadeia simples bi-especifico ou anti-CEA scFvs como definido aqui pode ser conjugado com um agente diagnóstico ou detectável. Tal diagnose ou detecção pode ser realizada pelo acoplamento do anticorpo ou scFv a substâncias detectáveis por exemplo a várias enzimas, como peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, galactosidades-beta, ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, como estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, como, umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, fluoresceina diclorotriazinilamina, cloreto de dansil ou ficoeritrina; materiais luminescentes, como, luminol; materiais bioluminescentes, como, luciferase, luciferina, e aequorina; materiais radioativos e isótopos, como cobalto (Co-57), indio (In-115, In-113, In-112, In- 111), iodo (1-131, 1-125, 1-123, 1-121), ou itrio (Y-90), metais emissores de pósitrons usando várias tomografias de emissão de pósitrons, e ions metálicos paramagnéticos não radioativos. Técnicas para conjugar componentes a anticorpos são bem conhecidas. Componentes podem ser conjugados a anticorpos por qualquer método conhecido na arte, incluindo, mas não limitado a ligação de aldeido/Schiff, ligação de sulfidrila, ligação ácido-lábil, ligação cis- aconitil, ligação com hidrazona, ligação enzimaticamente degradável; veja geralmente Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216. Técnicas adicionais para conjugar componentes a anticorpos são bem conhecidas, veja, por exemplo, Arnon e tal., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy. In Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985). Métodos para fusionar ou conjugar anticorpos a componentes polipeptidicos são bem conhecidos na arte; veja, por exemplo; Ashkenazi et al., 1991, PNAS 88: 10535-10539. A fusão de um anticorpo a um componente não precisa necessariamente ser direta, mas pode ocorrer através de seqüências de ligação. Tais moléculas de ligação são comumente conhecidas na arte e descritas em Denardo et al., 1998, Clin Câncer Res. 4:2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553.

Em um aspecto adicional, a invenção está relacionada a um jogo compreendendo um anticorpo de cadeia simples bi- especifico como definido aqui acima, uma molécula de ácido nucléico como definida aqui acima, um vetor como definido aqui acima, ou um hospedeiro como definido aqui acima. Estes e outros avanços são descritos e abrangidos pela descrição e Exemplos da presente invenção. Técnicas recombinantes e métodos em imunologia são descritos, por exemplo, em Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002. Literatura adicional concernente a qualquer um dos anticorpos, métodos, usos e compostos a serem empregados de acordo com a invenção presente pode ser recuperada de bibliotecas públicas e bancos de dados, usando, por exemplo, dispositivos eletrônicos. Por exemplo, o banco de dados público "Medline", disponível na Internet, pode ser utilizado,por exemplo, em http://www.ncbi.nlm.nih.qov/PubMed/medline.html. Bancos de dados adicionais e endereços, como http://www.ncbi.nim.nih.qov/, http://www.infobioaen.In/, http://www.fmi.ch/bioloqv/researchtools.html, http://www.tiqr.orQ/ são conhecidos da pessoa especialista na arte e também pode ser obtida usando, por exemplo, http://www.lvcos.com. Para tópicos relacionados a tumores, por exemplo, http://www.nih.gov ou http://www.dkfz.de.

As Figuras mostram:

Figura 1: Análise de ligação em FACS de várias constructos de cadeia simples bi-especificos reativas a CEA humano com células CHO transfectadas com CEA humano e células HPB-All positivas para CD3, respectivamente. Como controle positivo para ligação a CEA, anticorpo monoclonal Col-I foi usado. Para controle da ligação a CD3 humano, um constructo de cadeia simples bi-especifico CD19xCD3 como descrita em WO 99/054440 foi usada. Neste controle positivo, a linha grossa representa células incubadas com 10 pg/mL de anticorpo de cadeia simples bi-especifico CD19xCD3 purificado que foi subseqüentemente incubado com o anticorpo anti-His e o anticorpo de detecção. A linha fina do histograma reflete o controle negativo: células incubadas com o anticorpo anti-His e o anticorpo de detecção. Atividade de ligação para CEA humano (associada e membrana) e CD3 humano eram detectáveis para CEAI VHVLxSEQ ID NO.7 7 VHVL, CEAI VLVHxSEQ ID NO.7 7 VHVL, CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL, CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL e CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL. Nos histogramas respectivos correspondendo a anticorpos de cadeia simples bi- específicos como descritos na invenção, a linha fina representa o controle negativo, a linha fina brilhante representa células incubadas com sobrenadante de cultura, enquanto a linha grossa escura (mais a direita) representa células incubadas com 10 pg/mL de anticorpo de cadeia simples bi-especifico purificado.

Figura 2: Sinais de ligação de anticorpos de cadeia simples bi-especificos anti-CEA/anti-CD3 CEAI VHVLxSEQ ID NO. 7 7 VHVL, CEAII VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL e CEAIII VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL e anticorpo anti-CEA Col-I a CEA solúvel detectados por ELISA direto. Anticorpos de cadeia simples bi-especificos CEAI VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL (dominio de ligação anti-CEA derivado de anticorpo monoclonal A5B7), CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (dominio de ligação anti-CEA derivado de anticorpo monoclonal T84.66), e CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (dominio de ligação anti- CEA derivado de anticorpo monoclonal MFE-23) e o anticorpo monoclonal de camundongo Col-I ligaram-se especificamente a CEA humano solúvel imobilizada. Nenhum sinal de ligação foi observado na ausência do antigeno solúvel CEA (controle PBS).

Figura 3: Os constructos de cadeia simples bi- especificos indicados reativos a CEA redirecionaram células T para lisar células CHO transfectadas com CEA, na ausência de CEA solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. Para demonstrar a especificidade de Iise redirecionada, um constructo de cadeia simples bi-especifico não reativo a CEA foi incluído como controle negativo. Atividade citotóxica contra células humanas transfectadas com CEA (células CHO-CEA+) para vários arranjos de domínios, isto é para SEQ ID NO. 77 VHVLxCEAI VHVL e SEQ ID NO. 7 7 VHVLxCEAI VLVH (ambas os constructos com domínio de ligação anti-CD3 N-terminal), assim como para CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL e CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (domínio de ligação anti-CD3 C-terminal) puderam ser mostradas, Células CHO não transfectadas (sem CEA humano) foram usadas como controle negativo. Figura 4: Os constructos indicados de cadeia simples bi-especificos redirecionaram células T para lisar células CHO transfectadas com CEA, na ausência de CEA solúvel. Para demonstrar a especificidade da Iise redirecionada, células CHA não transfectadas foram incluídas como controle negativo. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. CEA I-HL (CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL) , CEA III-LH (CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL) , CEA III-HL (CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL) , e CEA II HL (CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL) mostraram atividade citotóxica contra células CHO humanas transfectadas com CEA. Células CHO não transf ectadas (sem CEA humano) foram usadas com controle negativo para CEA I-LH (CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL), CEA III-HL (CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL) e CEA II HL (CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL). CEAI denota a região variável derivada de anticorpo rnonoclonal murino A5B7, CEAII é a região variável derivada de anticorpo rnonoclonal murino T84.66 e CEAIII refere-se a região variável de anticorpo rnonoclonal murino MFE-23.

Figura 5: 0 constructo de cadeia simples bi-especifico indicado reativo a CEA redirecionou células T para lisar células CHO transfectadas com CEA na presença de CEA humano solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. A atividade citotóxica mediada por CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL e CEAI VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL não é inibida por quantidades crescentes de CEA humano solúvel, até 1 μg/mL. CEAI é a região variável derivada de anticorpo rnonoclonal murino A5B7. Figura 6: Os constructos de cadeia simples bi- especificos indicados reativos a CEA redirecionaram células T para lizar células CHO transfectadas com CEA na presença de CEA humano solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. A atividade citotóxica mediada por SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VHVL e SEQ ID NO. 77 VHVLxCEAI VLVH não é inibida por quantidades crescentes de CEA humano solúvel, até 1 μg/mL. CEAI é a região variável derivada de anticorpo monoclonal murino A5B7.

Figura 7: Um constructo de cadeia simples bi- especifico indicado reativo a CEA redirecionou células T para lisar células CHO transfectadas com CEA na presença de CEA humano solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. A atividade citotóxica mediada por CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL é inibida por quantidades crescentes de CEA humano solúvel. CEAII VHVL é derivada de anticorpo monoclonal T84.66.

Figura 8: Os constructos de cadeia simples bi- especificos indicados reativos a CEA redirecionaram células T para lisar células CHO transfectadas com CEA na presença de CEA humano solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. Enquanto a citotoxicidade mediada por CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL é resistente a inibição por antigeno solúvel de CEA, a atividade citotóxica mediada por CEAIII VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL é inibida por quantidades ainda mais baixas de CEA solúvel. CEAII VHVL é derivado de anticorpo monoclonal MFE- 23, enquanto CEAI é a região variável derivada de anticorpo monoclonal murino A5B7.

Figura 9: O constructo de cadeia simples bi-especifico indicado reativo a CEA redirecionou células T para lisar células Kato III na presença de quantidades crescentes de antigeno CEA solúvel. PBMCs humanas nativas foram usadas como células efetoras. A atividade citotóxica mediada por CEAII VHVLxSEQ ID NO. 77 não é resistente a CEA solúvel. CEAII VHVL é derivada de anticorpo monoclonal T84.66.

Figura 10: Os constructos de cadeia simples bi- específicos indicados reativos a CEA redirecionaram células T para lisar células Kato III na presença de quantidades crescentes de antigeno CEA solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. A citotoxicidade mediada por CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL é resistente a CEA solúvel. Em contraste, atividade citotóxica mediada por CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL é inibida por quantidades crescentes de antigeno solúvel CEA. CEAII VHVL é derivada de anticorpo monoclonal T84.66, enquanto CEAI é uma região variável derivada de anticorpo monoclonal murino A5B7.

Figura 11: Os constructos de cadeia simples bi- específicos indicados reativos a CEA redirecionaram células T para lisar células CHO transfectadas com CEA na presença de quantidades crescentes de antigeno CEA solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. A atividade citotóxica mediada por CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL é inibida por quantidades crescentes de CEA solúvel. CEAII VHVL é derivada de anticorpo monoclonal T84.66.

Figura 12: Análise de citometria de fluxo de preparações periplásmicas contendo fragmentos de proteína scFv marcada com Flag de clones selecionados. Preparações periplásmicas de fragmentos solúveis de proteína scFv foram adicionadas a 100.00 a 200.000 células CHO transfectadas com CEA. Para detecção um anticorpo monoclonal anti-Flag foi usado seguido por um anticorpo policlonal anti- camundongo marcado com PE. Ligação de scFvs a células foi medida por um aumento na intensidade de fluorescência como comparada a células que foram incubadas somente em PBS. A intensidade de fluorescência é traçada no eixo X, o número de eventos é traçado no eixo Y. 0 controle negativo (PBS e reagentes de detecção) é mostrado como curva preenchida, os scFvs respectivos são mostrados como linhas cinza. Deslocar à direita indica ligação positiva às células. Todos os scFvs, isto é A-121, A-183, A-240, A-313, A-290, A-315, A4- 35, A4-52 e MP2-A5,ligam a CEA associada a membrana em células CHO. Cada um dos scFv consiste na região VH do A5B7 murino e uma região VL humana, como descrito no exemplo 6.

Figura 13: Análise de citometria de fluxo de preparações periplásmicas contendo fragmentos de proteína scFv marcada com Flag de selecionados. Preparações periplásmicas de fragmentos solúveis de proteína scFv foram adicionadas a 100.00 a 200.000 células CHO transfectadas com CEA. Detecção foi realizada por um anticorpo monoclonal anti-Flag foi usado seguido por um anticorpo policlonal anti-camundongo marcado com PE. Ligação de scFvs a células foi medida por um aumento na intensidade de fluorescência como comparada a células que foram incubadas somente em PBS. A intensidade de fluorescência é traçada no eixo X, o número de eventos é traçado no eixo Υ. O controle negativo (PBS e reagentes de detecção) é mostrado como curva preenchida, os scFvs respectivos são mostrados como linhas cinza. Deslocar à direita indica ligação positiva às células. Os constructos scFvs completamente humanas MP510_3-A5.3, MP510_3-B9.1, e MP510_3-D8.1 ligam a CEA associada a membrana em células CHO. Cada um dos scFv consiste na região VH humana e a região VL humana de A240, como descrito no exemplo 7. 240 Vlambda.3 é um scFv consistindo da região VH de A5B7 murino e a região VL A-240 humana. Este constructo também mostra a atividade de ligação de CEA.

Figura 14: Análise de ligação em FACS de vários constructos de cadeia simples bi-específicos reativos a CEA a células Kato III e células HPB-All, respectivamente. A linha grossa representa células incubadas com sobrenadante de cultura celular de células CHO transfectadas incubadas com o anticorpo anti-His e o anticorpo de detecção. A linha estreita do histograma reflete o controle negativo: células incubadas com o anticorpo anti-His e o anticorpo de detecção. Os constructos de anticorpo humano de cadeia simples bi-especifico A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, B9 VH-A2 4 0 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, e D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO. 77 VHVL ligam a CEA humano em células Kato e a CD3 humano em células HPB-All. CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL com a região VH de domínio de ligação a CEA derivado de anticorpo monoclonal A5B7 mostra a mesma atividade de ligação.

Figura 15: Ensaio de citotoxicidade de construções de cadeia simples bi-especificas reativas a CEA redirecionadas a células CHO transf ectadas com CEA, na ausência de CEA solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. Atividade citotóxica pôde ser detectada para A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL, B9 VH-A240 VLx SEQ ID NO. 77 VHVL, D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO. 77 VHVL e CEAI VH-A24 0 VLx SEQ ID NO. 7 7 VHVL. CEAI VH é a região VH derivada de anticorpo monoclonal A5B7.

Figura 16: Ensaio de citotoxicidade dos constructos de cadeia simples bi-específicos indicados reativos a CEA redirecionadas a células CHO transfectadas com CEA, na ausência de CEA solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. A Figura demonstra a atividade citotóxica para A240 VL-A5 VHxSEQ ID NO.77 VHVL, A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL, A240 VL-D8 VHx SEQ ID NO.77 VHVL, e A240 VL-CEAI VHx SEQ ID NO.77 VHVL. Figura 17: Ensaio de citotoxicidade dos constructos de cadeia simples bi-especificos indicados reativos a CEA redirecionadas a células CHO transfectadas com CEA, na ausência de CEA solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. Citotoxicidade contra células alvo CEA+ é mostrada para SEQ ID NO. 77 VHVLxA5 VH-A24 0 VL, SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A24 0 VL, SEQ ID NO.77 VHVLxD8 VH-A240 VL, SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VH-A240 VL e SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH.

Figura 18: Ensaio de citotoxicidade dos constructos de cadeia simples bi-especificos indicados reativos a CEA redirecionadas a células CHO transfectadas com CEA, na ausência de CEA solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. Atividade citotóxica é mostrada para SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-A5 VH, SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-B9 VH, SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL- D8 VH, e SEQ ID NO.77 VHVLx A24OVL-CEAI VH e SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VLVH.

Figura 19: Ensaio de citotoxicidade dos constructos de cadeia simples bi-especificos indicados reativos a CEA redirecionadas a células CHO transfectadas com CEA na presença de quantidades crescentes de antigeno CEA solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. A Figura demonstra a resistência a atividade citotóxica de construções de anticorpos humanos de cadeia simples bi-especificos a antigeno CEA solúvel, como exemplificado para A5 VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL e B9 VH-A240 VLx SEQ ID NO.77 VHVL.

Figura 20: Ensaio de citotoxicidade dos constructos de cadeia simples bi-especificos indicados reativos a CEA redirecionadas a células CHO transfectadas com CEA na presença de quantidades crescentes de antigeno CEA solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. Os constructos de anticorpos humanos de cadeia simples bi-especificos D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL e CEAI VH-A2 40 VLx SEQ ID NO. 77 VHVL também mostram resistência a antigeno EA solúvel.

Figura 21: Os constructos de cadeia simples bi- específicos indicados reativos a CEA redirecionaram células T para lisar células CHO transfectadas com CEA, na ausência de CEA solúvel. Para demonstrar a especificidade de lise redirecionada, células CHO não transfectadas foram incluídas como controle negativo. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL, SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-B9 VH, SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240 VL, B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO. 7 7 VHVL, e SEQ ID NO. 77 VHVLxCEA I VHVL revelaram atividade citotóxica contra células CHO humanas transfectadas com CEA.

Figura 22: Os constructos de cadeia simples bi- específicos indicados reativos a CEA redirecionaram células T a lisar células CHO-CEA+ na presença de quantidades crescentes de antigeno CEA solúvel. Células T CD8+ humanas estimuladas foram usadas como células efetoras. Atividade citotóxica mediada por A240 VL-B9 VHx SEQ ID NO. 77 VHVL é resistente a CEA solúvel.

Figura 23: Cromatograma de troca de cátions de alta resolução do constructo de cadeia simples bi-especifico A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL, a linha azul curva superior) mostra as isoformas de carga totais da proteína.

Um pico único foi detectado mostrando a alta homogeneidade do constructo.

Figura 24: Ensaio de estabilidade da proteína baseado na avaliação de citotoxicidade após incubação em plasma humano por 24 horas. 0 constructo de cadeia simples bi- específico reativa a CEA redirecionou para células CHO transfectadas com CEA, na ausência de CEA solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. A Figura demonstra a estabilidade em plasma do constructo de cadeia simples bi-específico A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL em plasma humano. A atividade citotóxica do constructo não é influenciada por proteínas de plasma em condições fisiológicas.

Figura 25: Cromatograma de troca de cátions de alta resolução do constructo de cadeia simples bi-específico SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL, a linha azul curva superior) mostra as isoformas de carga totais da proteína. A Figura demonstra a homogeneidade do constructo de cadeia simples bi-especifico SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL.

Figura 26: Ensaio de estabilidade da proteína baseado na avaliação de citotoxicidade após incubação em plasma humano por 24 horas. O constructo de cadeia simples bi- especifico reativa a CEA redirecionou para células CHO transf ectadas com CEA, na ausência de CEA solúvel. CTLs humanas estimuladas positivas para CD8 foram usadas como células efetoras. Esta Figura demonstra a estabilidade em plasma do constructo de cadeia simples bi-especifico SEQ ID NO.7 7 VHVLxE12 VH-A24 0 VL em plasma humano. Atividade citotóxica do constructo não é influenciada por proteínas do plasma em condições fisiológicas.

Figura 27: O constructo de cadeia simples bi- especifico indicado reativo a CEA redirecionou células T para lisar células CHO-CEA+ na presença de quantidades crescentes de antígeno CEA solúvel. Células T CD8 + humanas estimuladas foram usadas como células efetoras. 0 constructo de cadeia simples bi-especifico SEQ ID NO. 77 VHVLxE12 VH-A240 VL mediou atividade citotóxica que é resistente a CEA solúvel.

Os seguintes Exemplos ilustram a invenção: EXEMPLO 1: Geração de células CHO transf ectadas com CEA humano (molécula de adesão celular carcinoembriônica relacionada a antígeno 5; CEACAM5) Células Kato III positivas para CEA (linhagem celular de carcinoma gástrico humano; ATCC HTB-103) foram usadas para obter RNA total que foi isolada de acordo com as instruções do manual do jogo (Qiagen, RNeasy Mini kit) . 0 RNA obtido foi usado para síntese de cDNA por transcrição reversa de primer aleatório. Para clonagem da seqüência de comprimento completo do antígeno CEA, os seguintes oligonucleotídeos foram usados: 5' CEACAM5 EcoRI GAATTCGCCACCATGGAGTCTCCCTCGGCCCC (SEQ ID NO. 74) e 3' CEACAM5 Sal I GTCGACCTATATCAGAGCAACCCC (SEQ ID NO. 75) . Um PCR (desnaturação a 93° C por 1 minuto, alongamento a 12° C por 1 minuto para o primeiro ciclo; desnaturação a 93° C por 1 minuto, anelamento a 58° C por 1 minuto, alongamento a 72° C por 1 minuto por 30 ciclos; extensão terminal a 72° C por 5 minutos) foi usado para amplificar a seqüência codificadora. O produto de PCR foi subseqüentemente digerido com EcoRI e SalI, ligado no vetor de expressão pEF-DHFR apropriadamente digerido, e transformado em E. coli. O DNA de plasmídio isolado foi seqüenciado e comparado com a seqüência de nucleotídeos estabelecida de CEACAM5 (NM_004363 no Centro Nacional para informação de biotecnologia, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nova Iorque (1989; 2001). O clone com a seqüência de nucleotídeos verificada foi transfectado em células CHO deficientes em DHFR para expressão eucariótica do constructo. Expressão de proteína eucariótica em células CHO deficientes em DHFR foi executada como descrito em Kaufmann (Kaufmann R.J., Methods Enzymol. 185 (1990), 537- 566) . Amplificação do gene do constructo foi induzida por concentrações crescentes de MTX até uma concentração final de até MTX a 20 nM. As células transfectadas foram então testadas para expressão do antígeno CEA usando um ensaio de FACS. Para essa finalidade, 2,5xl05 células transfectadas foram incubadas com 5 pg/mL do anticorpo monoclonal murino COL-I (No. MS-613-P1ABX, Neomakers; Fremont, CA, EUA), /a ligação do anticorpo foi detectada com um fragmento F(ab')2 purificado por afinidade conjugado a R-ficoeritrina, IgG anti-camundongo de cabra, anticorpo específico para fragmento Fc-gama, diluído 1:100 em 50 pL de PBS com FCS a 2% (obtido de Dianova, Hamburgo, Alemanha). Células foram analisadas por citometria de fluxo em um FACS-Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg). Coloração e medição da intensidade de fluorescência por FACS foram executadas como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies,. Shevach e Strober, Wiley- Interscience, 2002) . Como resultado, os transfectantes demonstraram uma marcação claramente positiva para o antígeno CEA humano.

EXEMPLO 2: Geração de anticorpos bi-especificos de cadeia simples CEAxCD3

Geralmente, moléculas de anticorpo de cadeia simples bi-especificos, cada qual compreendendo um domínio com especificidade de ligação para antigeno CEA humano assim como a domínio desimunizado com especificidade de ligação para o antigeno CD3 humano descrito na SEQ ID NO. 77 foram projetados como mostrado na Tabela 1. O arranjo das regiões V neste domínio de ligação a CD3 é sempre VH-V. Este domínio de ligação anti-CD3 desimunizado usado nos anticorpos de cadeia simples bi-específicos como definidos aqui foi descrito anteriormente, por exemplo, em W02005/04022 0.

1. Formatos das moléculas de anticorpos de cadeia simples bi-específicos compreendendo especificidades anti- CEA e anti-CD3 (Tabela 1)

<table>table see original document page 90</column></row><table> <table>table see original document page 91</column></row><table>

Os constructos acima mencionados contendo as regiões de cadeia leve variável (VL) e de cadeia pesada variável (VH) especificas para o antigeno CE humano derivados de anticorpos monoclonais, hibridomas ou obtidas por seleção guiada por mostra de fagos (PDGS) foram obtidos por síntese gênica e subseqüente clonagem em um vetor de expressão compreendendo as combinações VH e VL específicas de CD3. A geração de ditos constructos de cadeia simples bi- especificos também pode ser realizada de acordo com técnicas de recombinação descritas, por exemplo, em Sambrook (lo.cit.). Uma descrição detalhada, portanto é fornecida, por exemplo, em WO 99/054440.

O domínio de ligação anti-CD3 corresponde a um domínio desimunizado com especificidade de ligação para antígeno CD3 humano. 0 arranjo das regiões V do domínio de ligação desimunizados anti-CD3 nos constructos de cadeia simples bi-específicos aqui descritos é sempre VH-VL. A seqüência de aminoácidos correspondente do dito domínio VH-VL é descrita em SEQ ID NO.77. CEAI, CEAII, CEAIII específicas para o antígeno carcinoembriônico humano contém as regiões de cadeia leve variável (VL) e de cadeia pesada variável (VH) derivadas de anticorpos monoclonais A5B7 (Chester, K. A. et al., Int J Câncer 57 (1994), 67-72), T84.66 (Neumaier, M. et al., Câncer Res 50 (1990), 2128-34) e MFE- 23 (Boehm, Μ. K. Biochem J 2 (2000), 519-28), respectivamente. A5, B9, D8, e E12 são regiões VH humanas específicas para CEA humano, enquanto A240 é uma região VL humana com a mesma especificidade. A geração de regiões V A5, B9, D8, E12 e A240 é descrita em detalhe nos Exemplo 6 e 7. As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos correspondentes de todos os anticorpos de cadeia simples bi-específicos descritos aqui são apresentados na listagem de seqüências. Em seguida, a geração do constructo CEA I VLVH χ SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO.6) é descrita e maior detalhe. A geração das outros constructos mencionados acima pode ser executada de acordo com a implementação necessária de modificações para os métodos estando bem no âmbito da pessoa especialista na arte.

Para gerar moléculas de anticorpo de cadeia simples bi-especificas compreendendo a acima mencionada especificidade a CEAI e a especificidade a anti-CD3 desimunizado primeiramente as regiões variáveis de CEAI obtidas por síntese gênica de acordo com protocolos padrão tiveram que ser modificados por PCR para obter os fragmentos de cadeia simples Fv do anticorpo. Para esta finalidade um PCR de fusão em dois passos foi usado para amplificar a seqüência codificadora para as regiões variáveis. Um conjunto de primers apropriados foi projetado para executar os passos de clonagem baseados em PCR, finalmente resultando em um anticorpo de cadeia simples conectando os dois domínios variáveis com uma seqüência de ligação com 15 aminoácidos ([Gly4Ser] 3) na ordem V-Ligante- VH.

Brevemente, as seguintes combinações de primer foram usadas: <table>table see original document page 94</column></row><table>

As seqüências de nucleotídeos dos primers de oligonucleotídeos são dadas abaixo:

5'CEAI LH: 5' AGGTGTACACTCCGACATTGAGCTCACCCAG 3' (SEQ ID NO. 137)

3'CEAI VL Linker: 5' GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACC TTTGATCTCGAGCTTGG 3' (SEQ ID NO. 138)

5'CEAI VH Linker: 5' GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCT CAGGTCCAACTGCAGGAG 3' (SEQ ID NO. 139)

3'CEAI LH: 5' AATCCGGAGGAGACGGTGACCG 3' (SEQ ID NO. 140)

Para gerar o anticorpo de cadeia simples, dois PCRs com as respectivas combinações de primers descritas acima como passos 1 e 2 de PCR foram realizados. Durante este PCR seqüências complementares sobrepostas foram introduzidas nos produtos do PCR que combinaram para formar a seqüência codificadora do ligante de 15 aminoácidos durante o PCR de fusão subseqüente. Subseqüentemente os domínios VH e VL amplificados foram juntados neste PCR de fusão no qual apenas os primers externos e ambos os produtos do PCR eram requeridos. O anticorpo scFv resultante é flanqueado na sua extremidade 5' com o sítio de reconhecimento da enzima de restrição BsrGI e na extremidade 3' com o sítio de reconhecimento da enzima de restrição BspEI. Adição do sítio BsrGI foi realizada de modo a permitir a fusão em quadro com a seqüência codificadora de um peptídeo líder de imunoglobulina murina como descrito em W02005/040220. O sítio BspEI foi criado de modo a permitir a fusão em quadro com a seqüência codificadora para o anticorpo de cadeia simples específico para CD3 para gerar o anticorpo de cadeia simples bi-específico. Para realizar a fusão dos anticorpos Fv de cadeia simples e para permitir a expressão eucariótica a seqüência codificadora do anticorpo Fv de cadeia simples específico para CEA foi clonado via BsrGI e BspEI em um vetor de expressão pEFDHFR (pEFDHFR foi descrito em Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92 (1995) 7021-7025) contendo o anticorpo Fv desimunizado de cadeia simples anti-CD3 como descrito em W02005/040220; na presente invenção referida como SEQ ID NO.77. Clones simples do constructo foram isolados e seqüenciados com primers complementares a regiões flanqueadoras no vetor de expressão de acordo com protocolos padrão (Sambrock, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbour laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nova Iorque (1989)). Para experimentos adicionais um clone do constructo com uma seqüência de nucleotideos verificada foi selecionado.

2. Expressão e purificação dos anticorpos de cadeia simples bi-especificos CEAxCD3

Os anticorpos de cadeia simples bi-especificos foram expressos em células de ovário de hamster chinês (CHO). A expressão de proteina eucariótica em células CHO deficientes em DHFR foi executada como descrito em Kaufmann (loc. Cit.). As amplificações gênicas dos constructos foram induzidas por concentrações crescentes de MTX para uma concentração final de até 20 nM de MTX. Após duas passagens de cultura estacionária as células foram crescidas em garrafas rolo com meio DMEM modificado para CHO (HiQ®, HiClone) por 7 dias antes da colheita. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteina expressa foi estocado a -20° C.

Os programas Ãkta® FPLC System (Pharmacia) e Unicorn® Software foram usados para cromatografia. Todos os reagentes químicos eram de grau de pesquisa e comprados da Sigma (Deisenhofen) ou Merck (Darmstadt). Cromatografia de afinidade de metal imobilizado ("IMAC") foi realizada usando coluna Fractogel® (Merck) a qual foi carregada com ZnCl2 de acordo com protocolo fornecido pela fabricante. A coluna foi equilibrada com tampão A2 (tampão de fosfato de sódio a 20 mM pH 7,5, NaCl a 0,4 M) e o sobrenadante de cultura (500mL) foi aplicado à coluna (10 mL) em uma taxa de fluxo de 3 mL/minuto. A coluna foi lavada com tampão A2 para remover amostras desligadas. Proteínas ligadas foram eluídas usando um gradiente de 2 etapas de tampão B2 (tampão fosfato de sódio a 20 mM pH 7,5, NaCl a 0,4 M, Imidazol a 0,5 M) de acordo com os seguintes passos:

Etapa 1: tampão B2 20% em 6 volumes de coluna;

Etapa 2: tampão B2 100% em 6 volumes de coluna.

Frações de proteína eluída da etapa 2 foram agrupadas para purificação adicional.

Cromatografia de filtração em gel foi realizada em uma coluna Sephadex S200 HiPrep (Pharmacia) equilibrada com PBS (Gibco). Amostras de proteínas eluídas (taxa de fluxo de 1 mL/minuto) foram sujeitas a SDS-PAGE e Western Blot padrão para detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para determinação do peso molecular (jogo de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Concentrações de proteínas foram determinadas usando tintura de ensaio de proteína (MicroBCA, Pierce) e IgG (Biorad) como proteína padrão.

Os anticorpos de cadeia simples CEAxCD3 foram isolados em um processo de purificação de dois passos de IMAC e filtração em gel. 0 produto principal tinha um peso molecular de cerca de 52 kDa em condições nativas como determinado por filtração em gel em PBS. Este peso molecular corresponde ao anticorpo de cadeia simples bi- especifico. Todos os constructos foram purificados de acordo com este método.

Proteina de anticorpo de cadeia simples bi-especifico foi analisada por SDS PAGE em condições redutoras executado com géis 4-12% Bis Tris pré-formados (Invitrogen). Preparação e aplicação da amostra foram realizadas de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. 0 peso molecular foi determinado com padrão de proteína MultiMark (Invitrogen) . 0 gel foi corado com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada foi >95% como determinado por SDS-PAGE.

Western blot foi executado usando uma membrana Optitran® BA-S83 e o Módulo de Blot da Invitrogen de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Os anticorpos usados foram direcionados contra a marcação His (Penta His, Qiagen) e IgG anti-camundongo feito em cabra marcado com fosfatase alcalina (AP) (Sigma), e BCIP/NBT (Sigma) como substrato. O anticorpo de cadeia simples bi-especifico pôde ser especificamente detectado por Western Blot. Uma banda única foi detectada a 50 kD correspondendo à molécula de anticorpo de cadeia simples bi-específico.

3. Análise da ligação por citometria de fluxo de anticorpos de cadeia simples bi-específicos CEAxCD3 A fim de testar a funcionalidade dos constructos em relação à capacidade de ligação de CEA humano e CD3 humano ligados a membrana, análise de FACS foi realizada. Para este propósito, células CHO transfectadas com CEA humano e a linhagem celular HPB-All de células T de leucemia humana positivas para CD8 (DSMZ, Braunschweig, ACC483) foram usadas. 200.000 células CHO positivas para CEA ou 200.000 células HPB-All foram incubadas por 30 minutos em gelo com 50 pL do sobrenadante celular puro de culturas de células CHO cada qual expressando anticorpos bi-especificos com diferentes arranjos de regiões VH e VL de CEA e CD3 (como descrito acima). As células foram lavadas duas vezes em PBS e a ligação do constructo foi detectada com um anticorpo murino Penta His (diluído 1:20 em 50 pL de PBS com FCS a 2%; Qiagen), o qual especificamente se liga ao constructo ligado a células por meio da marcação histidina C-terminal do constructo. Um passo de lavagem se seguiu para remover anticorpos murinos Penta His desligados. Anticorpos anti- His ligados foram detectados com um anticorpo específica para Fc gama (Dianova) conjugado a ficoeritrina, diluído 1:100 em 50 μl de PBS com FCS a 2%. Como um controle positivo para ligação a CEA humano, anticorpo monoclonal Col-I (veja Exemplo 3) foi usado. Para controle da ligação a CD3 humano, um constructo de cadeia simples bi-específico CDl9xCD3 como descrita em WO 99/054440 foi utilizada. Como um controle negativo meio de cultura fresco foi usado no lugar do sobrenadante de cultura. Células foram analisadas por citometria de fluxo (FACS-Calibur; Becton Dickison, Heidelberg). Coloração e mensuração da intensidade de fluorescência por FACS foi realizada como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley- Interscience, 2002).

Como mostrado na Figura 1, vários arranjos de domínios dos anticorpos de cadeia simples bi-especificos, isto é

CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 8), CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 6), CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 10), CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 12) e CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 14), ligaram-se a CEA humano e CD3 humano ligados a membrana.

Como um controle negativo, meio de cultivo e anticorpos de detecção 1. e 2. Foram usados.

EXEMPLO 3: Ligação de anticorpo de cadeia simples bi- especificos CEAxCD3 a CEA humano solúvel

A fim de determinar a especificidade contra CEA humano solúvel, vários anticorpos de cadeia simples bi-específicos CEAxCD3 foram testados em ELISA.

Neste sentido, antígeno de CEA humano solúvel foi primeiro biotinilado. A biotinilação é realizada em PBS contendo DMSO a 5% (Sigma) com excesso molar de quinze vezes de EZ-Link Sulfo NHS-LC-LC-Biotin (Pierce) por 1 hora em temperatura ambiente em um misturador de amostra (Dynal) . Para a separação de Biotina livre e antigeno CEA biotinilado, o ensaio foi excessivamente dialisado contra PBS de acordo com protocolos padrão. A bioatividade retida do CEA marcado com biotina foi confirmada em experimentos de ligação por ELISA.

0 ELISA direto para determinar a especificidade do anticorpo de cadeia simples bi-especificos CEAxCD3 contra CEA humano solúvel foi realizado de acordo com procedimentos padrão. Brevemente, 50 μL/poço de PBS ou CEA humano biotinilada solúvel (Abcam; 5 pg/mL em PBS lx) foram imobilizados em uma placa de ELISA de 96 poços recoberta com estreptavidina (Nunc) pela incubação a 4o C por cerca de 16 horas. Após lavagem com 200 yL de água por poço 200 μL de solução bloqueadora (PBS/BSA a 3%) foi adicionada. Após bloqueio por 1 hora em temperatura ambiente a solução bloqueadora foi removida. Todas as lavagens subseqüentes (200 μL/poço de PBS Ix/Tween20 a 0,05%) e passos de incubação foram realizados em temperatura ambiente. Após lavar uma vez, os anticorpos de cadeia simples bi- especif icos CEAI VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 8; parte anti-CEA derivada de anticorpo monoclonal A5B7), CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 10; parte anti-CEA derivada de anticorpo monoclonal T84.66), e CEAIII VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 14; parte anti-CEA derivada de anticorpo monoclonal MFE-23), e anticorpo monoclonal de camundongo CEA/CD66 Ab-3 (Col-1; Dunn) foram incubados em diferentes concentrações (0,5 pg/mL e 5 μg/mL em PBS lx; 50 μί/ροςο) por 1 hora. PBS Ix (50 μί/ροςο) foi adicionado como um controle para ligação inespecífica. 3 passos de lavagem foram seguidos pela adição de 50 μL/poço de IgG Penta-His (Qiagen; 2 μg/mL em PBS lx) para detecção dos anticorpos de cadeia simples bi-especificos marcados com His. Subseqüentemente, os poços foram lavados 3 vezes e incubados com 50 pL de um anticorpo especifico para Fc-gama anti-camundongo feito em cabra marcado com peroxidase (Jackson ImmuneResearch; 1:1000 em PBS lx) por 1 hora. Após lavar 3 vezes o ELISA foi desenvolvido pela adição da solução substrato ABTS (Roche) e a absorbância foi medida no comprimento de onda de 4 05 nm.

A Figura 2 mostra a absorbância dos diferentes anticorpos de cadeia simples bi-especificos detectados em ELISA. Os anticorpos de cadeia simples bi-especificos CEAI VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 8; parte anti-CEA derivada de anticorpo monoclonal A5B7), CEAII VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 10; parte anti-CEA derivada de anticorpo monoclonal T84.66), e CEAIII VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 14; parte anti-CEA derivada de anticorpo monoclonal MFE-23) e o anticorpo monoclonal de camundongo Col-I especificamente ligam-se a CEA humano solúvel. Nenhum sinal de ligação foi observado na ausência do antigeno CEA (controle PBS). Em sumário, os domínios de ligação anti-CEA derivados dos anticorpos monoclonais A5B7, T84.66 e MFE-23 ligam-se tanto a CEA solúvel quanto a CEA ligado a membrana. EXEMPLO 4: Bioatividade de anticorpos de cadeia simples bi-especificos CEAxCD3

A bioatividade dos anticorpos de cadeia simples bi- específicos CEAxCD3 gerados foi analisada por ensaios de citotoxicidade por liberação in vitro de cromo usando a linhagem celular de carcinoma gástrico humano Kato III ou as células CHO transfectadas com CEA humano como células alvo e células T humanas estimuladas positivas para CD8 ou PBMC nativas como células efetoras, respectivamente.

A geração de células T CD8+ estimuladas foi realizada como segue:

Uma placa de Petri (diâmetro de 145 mm, greiner bio- one) foi pré-recoberta com um anticorpo anti-CD3 (0KT3 Jansen-Cilag GmbH, Orthoclone a 1 mg/mL; concentração final de 1 pg/mL) e um anticorpo anti-CD28 (BD, 1 mg/mL; concentração final de 1 pg/mL) por 1 hora a 37° C. Após o período de incubação, as proteínas desligadas foram removidas por um passo de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas de sangue periférico (30-50 mL) por centrifugação em gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5xl07 PBMCs foram adicionadas às placas de Petri pré-recobertas em 150 mL de RPMI 1640/FCS a 10%/IL-2 a 20 U/mL (Proleucina, Chiron) e estimuladas por 2 dias. No terceiro dia as células foram coletadas, lavadas uma vez com RPMI 1640 e transferidas para um frasco T grande. IL-2 foi adicionada até uma concentração final de 20 U/mL e cultivadas novamente por um dia. As CTLs CD8 + foram isoladas com a ajuda de um jogo de isolamento negativo para CD8 (Dynal Biotech) seguindo-se as instruções do manual. As PMCs nativas foram usadas diretamente após a centrifugação por gradiente de Ficoll sem o procedimento de estimulação.

Células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e marcadas com 11,1 MBq de 51Cr em um volume final de 100 pL de RPMI com FCS a 50% por 45 minutos a 37° C. Subseqüentemente, as células alvo marcadas foram lavadas 3 vezes com 5 mL de RPMI e então usadas no ensaio de citotoxicidade. 0 ensaio foi realizado uma placa de 96 poços com fundo arredondado em um volume total de 250 μl; de RPMI suplementado (como acima) com uma razão E:A de 10:1 correspondendo a 5000 células alvo e 50000 células efetoras por poço. Para a avaliação dos constructos uma concentração inicial de 1 μg/mL das moléculas de cadeia simples bi- especificas no volume de ensaio e 12 diluições de três vezes ali foram aplicadas. O tempo de ensaio foi 18 horas e citotoxicidade medida como valores relativos de cromo liberado no sobrenadante em relação à diferença de lise máxima (adição de Triton X-100) e lise espontânea (sem células efetoras). Todas as medidas foram feitas em triplicatas. Medida da atividade do cromo nos sobrenadantes sofram realizadas com um Wizard 3 gammacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colônia, Alemanha). Análise dos dados experimentais foi realizada com Prism 4 para Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., São Diego, Califórnia, EUA). Curvas dose resposta sigmoidais tipicamente tinham valores de R2 > 0,90 como determinado pelo programa. Valores de EC5O calculados pelo programa de análise foram usados para comparação da bioatividade.

A Figura 3 mostra a atividade citotóxica contra células alvo transfectadas com CEA humano (células CHO- CEA+) para vários arranjos de domínio, isto é para SEQ ID NO. 77 VHVLxCEAI VHVL (SEQ ID NO. 4) e SEQ ID NO. 77 VHVLxCEAI VLVH (SEQ ID NO. 2) (ambos os constructos com a parte anti-CD3 no terminal Ν), assim como para CEAI VLVHxSEQ ID NO. 7 7 VHVL (SEQ ID NO. 6) e CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 8) (anti-CD3 no terminal C). Células CHO não transfectadas (sem CEA humano) foram usadas como um controle negativo.

Na Figura 4, CEAI VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 8), CEAIII VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 12), CEAIII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 14), e CEAII VHVLxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 10) exibem atividade citotóxica contra células CHO transfectadas com CEA humano. Células CHO não transfectadas (sem CEA humano) foram usadas como um controle negativo. Como determinado acima, CEAI denota uma região variável derivada de anticorpo monoclonal murino A5B7, CEAII é uma região variável derivada de anticorpo monoclonal murino T84.66 e CEAIII refere-se a uma região variável derivada de anticorpo monoclonal murino MFE-23. Em sumário, todos os constructos testados mostraram atividade citotóxica contra Kato III expressando CEA (humano) e células CHO transfectadas com CEA, na ausência de CEA humano solúvel.

EXEMPLO 5: Bioatividade de anticorpos CEAxCD3de cadeia simples bi-especificos específicos na presença de antígeno CEA solúvel

Os ensaios de competição são realizados como descrito no Exemplo 4, com a seguinte exceção: a bioatividade de anticorpos de cadeia simples bi—específicos CEAxCD3 é testada na presença de várias concentrações de antígeno CEA humano solúvel. 0 antígeno CEA humano solúvel (acCAM Itd. Cambridge Reino Unido) usado foi isolado de um carcinoma metastático em colônia do fígado de um único paciente. Experimentalmente, o teste de competição foi realizado pela pré-incubação de uma determinada quantidade de anticorpo de cadeia simples bi-específico com quantidades crescentes de antígeno CEA humano solúvel (seja 0 μg/mL; 0,1 pg/mL; 1 pg/mL; ou 0 pg/mL; 0,004 μg/mL; 0,02 pg/mL; 0,1 pg/mL; 0,5 pg/mL; 1 pg/mL) por 30 minutos a 37° C antes da adição das células. 0 restante do ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 4. Os resultados destes experimentos de competição são mostrados nas Figuras 5 a 11.

A atividade citotóxica dos anticorpos de cadeia simples bi-específicos CEAII VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 10; veja Figuras 7 e 9 a 11) com a parte anti-CEA derivada de anticorpo monoclonal T84.66, e CEAIII VLVHxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 12; veja Figura 8) com a região anti-CEA derivada de anticorpo monoclonal MFE-23, contra células alvo positivas para CEA foi drasticamente inibida por quantidades crescentes de antigeno CEA humano solúvel. Como determinado acima, ditos constructos se ligam a ambos os antigenos CEA humano solúvel e ligado à membrana; veja, por exemplo, Exemplos 2 e 3 e Figuras 1 e 2. Assim, muito provavelmente, CEA humano solúvel previne a parte anti-CEA de ditos anticorpos de cadeia simples bi-especificos de ligarem-se a CEA humano ligado a membrana em células alvo, por exemplo, células tumorais CHO-CEA+ ou Kato III, assim inibindo a atividade citotóxica mediada por ditos constructos de anticorpos.

Em contraste, tem sido surpreendentemente descoberto que anticorpos de cadeia simples bi-especificos com uma parte anti-CEA derivada de anticorpo monoclonal A5B7 são resistentes a CEA humano solúvel: por exemplo, a atividade citotóxica mediada por CEAI VLVHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 6; veja Figura 5), CEAI VHVLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 8; veja Figuras 5, 8 e 10), SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VHVL (SEQ ID NO. 4; veja Figura 6) e SEQ ID NO.7 7 VHVLxCEAI VLVH (SEQ ID NO. 2; veja Figura 6) não é inibida por quantidades crescentes de CEA humano solúvel, nem mesmo por altas concentrações (1 μg/mL). Isto não poderia ser esperado, haja visto o fato de que a parte anti-CEA de ditos anticorpos de cadeia simples bi-especificos ligam-se a CEA humano solúvel (Figura 2) . Ao invés, inibição da atividade citotóxica contra células alvo positivas para CEA por quantidades crescentes de CEA humano solúvel era esperada, como foi o caso para construções derivadas de T84.66 e MFE- 23; veja acima.

Assim, a presente invenção fornece composições farmacêuticas com atividade citotóxica anti-tumoral na presença de níveis ainda maiores de antígeno CEA solúvel. Portanto, estas composições farmacêuticas são particularmente úteis para o tratamento de pacientes com tumores com altas concentrações de antígeno CEA humano solúvel no seu plasma, como pacientes com tumores epiteliais progressivos, tumores epiteliais metastáticos, alta carga/fardo tumoral, tumores epiteliais de estágio tardio ou pacientes de tumores com a concentração sérica de CEA maior do que 100 ng/mL, como determinado por ELISA.

EXEMPLO 6: Seleção de regiões VL humanas

Para fornecer composições farmacêuticas com reduzida imunogenicidade quando administrada a pacientes com câncer, anticorpos de cadeia simples bi-específicos humanos com resistência a antígeno EA solúvel foram gerados. Em um primeiro passo, regiões VL humanas com resistência a CEA solúvel foram isolados. Assim, o objetivo deste experimento é a seleção de regiões VL humanas as quais podem parear com o VH murino, maternal de anticorpo monoclonal A5B7.

1. Biotinilação de antígeno CEA humano solúvel Para seleção de biblioteca de fagos, antigeno CEA solúvel foi biotinilado. Biotinilação foi cumprida em PBS contendo DMSO a 5% (Sigma) com um excesso molar de quinze vezes de EZ-Link Sulfo NHS-LC-LC-Biotin (Pierce) por 1 hora em temperatura ambiente em um misturador de amostra (Dynal) . Para a separação de Biotina livre e antigeno CEA biotinilado, o ensaio foi excessivamente dialisado contra PBS de acordo com protocolos padrão.

A bioatividade retida do CEA marcado com biotina foi confirmada em experimentos de ligação por ELISA.

2. Isolamento do RNA de células B humanas 100 mL de sangue foram pegos de cinco doadores humanos saudáveis. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por um gradiente de ficoll de acordo com métodos padrão. RNA total foi isolado das células isoladas usando o RNeasy® Midi Kit (QIAGEN) seguindo as instruções do fabricante. DNAc foi sintetizado de acordo com métodos padrão (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001) .

3. Amplificação por PCR das regiões de cadeia leve variáveis (regiões VL)

Para o isolamento do DNA da região V de cadeia leve, foi realizado RT-PCR usando jogos de primer V-kappa- (5'- huVKl-SacI-2 001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC-3') (SEQ ID NO. 78), 5' -huVK2/4-SacI-2001 (5'- GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACY CAGTCTCC-3') (SEQ ID NO. 79), 5'-huVK3-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGWTGACR CAGTCTCC-3') (SEQ ID NO. 80), 5'-huVK5-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC-3') (SEQ ID NO. 81), 5'-huVK6-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC-3') (SEQ ID NO. 82), 3'-hu-Vk-Jl-SpeI- BsiWI (5' -GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATTTCCACC TTGGTCC-3') (SEQ ID NO. 83), 3'-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI (5'- GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATCTCCASC TTGGTCC-3') (SEQ ID NO. 84), 3'-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATATCCACT TTGGTCC-3') (SEQ ID NO. 85), 3'-hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI (5'-GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT AATCTCCAGT CGTGTCC-3') (SEQ ID NO. 86)) e V lambda (5'-huVLla-SacI-2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG TTG ACG CAG CCG CCC TC) (SEQ ID NO. 87), 5'-huVLlb- SacI-2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG CTG ACT CAG CCA CCC TC) (SEQ ID NO. 88), 5'-huVL2-SacI-2001 (GAG CCG CAG GAG CCC GAG CTC GCC CTG ACT CAG CCT SCC TCC GT) (SEQ ID NO. 89), 5' -huVL4-SacI-2001 (ACC TGC GAG CTC GTG CTG ACT CAR YCM YCC TCT GC) (SEQ ID NO. 90), 5'-huVL5-SacI-2001 (ACC TGC GAG CTC GTG CTG ACT CAG CCR SCT TCC) (SEQ ID NO. 91), 5'-huVL6-SacI-2001 (ACC TGC GAG CTC ATG CTG ACT CAG CCC CAC TC) (SEQ ID NO. 92), 5'-huVL3/9-SacI-2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GWG CTG ACT CAG CCA CCY TC) (SEQ ID NO. 93), 5' -huVL7 /8-SacI-2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG GTG ACY CAG GAG CCM TC) (SEQ ID NO. 94), 3' -hu-Vlam-Blnl-Spel- 2001 (CGT GGG ACT AGT CTT GGG CTG ACC TAG GAC GGT) (SEQ ID NO. 95), 3' -hu-Vlam2-BlnI-SpeI-2002: CGT GGG ACT AGT CTT GGG CTG ACC GAG GAC GGT) (SEQ ID NO. 96).

RNA de células B humanas foram transcritos em cDNA (como descrito acima) e usados como moldes de DNA em reações de PCR. Por reação de PCR, um primer 5' foi combinado com um primer 3' . O número de reações de PCR diferentes foi determinado pelo número de combinações possíveis de primers 5' e 3' . O seguinte programa de PCR foi usado para amplif icação: desnaturação a 94° C por 15 segundos, anelamento de primer a 52° C por 50 segundos e extensão do primer a 72° C por 90 segundos foram realizados por 40 ciclos, seguido de extensão final a 12° C por 10 minutos. Fragmentos V de DNA de cadeia leve foram então isolados de acordo com protocolos padrão.

4. Construção de biblioteca - clonagem do agrupamento de VL humana

Uma biblioteca de mostra de fagos foi geralmente construída baseada em protocolos padrão, como por exemplo mostrado em "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Os primers escolhidos para amplificação por PCR originaram sítios de reconhecimento 5'-SacI e 3'-SpeI para os fragmentos V de cadeia leve. Quatro reações de ligação foram preparadas, cada qual consistindo de 400 ng de fragmentos de cadeia leve (digeridas por SacI-SpeI, 2 χ kappa e 2 χ lambda) e 1400 ng do fagemídio pComb3H5BHis (digerido por SacI-SpeI; fragmento grande; este vetor é descrito na dissertação de tese do Dr. Ralf Lutterbüse. As quatro mostras de V de cadeia leve de anticorpos resultantes foram então cada qual transformadas em 300 μί de Escherichia coli XLl Blue eletrocompetente por eletroporação (2.5 kV, cuvete com abertura de 0,2 cm, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser) resultando em bibliotecas com tamanhos de

kappal: 2 χ 10"8

kappa2: 6 χ 10"7

lambdal: 9 χ 10"7

lambda2: 6 χ 10"7

clones independentes

Fragmentos de DNA kappa (cadeia leve) das diferentes amplificações por PCR foram pesadas para cada ligação da seguinte forma: cada prímer 5' define um grupo especifico.

Dentro destes grupos os primers 3' definem os subgrupos. Os subgrupos kappa foram pesados 1:2:1:1 correspondendo aos primers 3'-hu-Vk-Jl-SpeI-BsiWI : 3'-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI : 3'-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI : 3'-hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI. Os grupos foram pesados de acordo com sua distribuição de linhagem germinativa 1:1:1:0,2:0,2 correspondendo aos primers 5'- huVKl-Sac-2001 : 5'-huVK3-Sac-2001 : 5'-huVK2/4-Sac-2001 : 5' -huVK5-Sac-2001 : 5'-huVK6-Sac-2001.

Fragmentos de DNA lambda (cadeia leve) de diferentes amplificações por PCR foram pesados para cada ligação da seguinte forma: cada primer 5' define um grupo especifico. Dentro destes grupos os primers 3'definem os subgrupos. Os subgrupos lambda foram pesados 3:1 correspondendo aos primers 3'-hu-Vlam-BlnI-SpeI-2001: 3'-hu-Vlam2-BlnI-SpeI- 2002 .

Os grupos foram pesados de acordo com sua distribuição de linhagem germinativa 1:1:2:2:2:3 correspondendo aos primers 5'-huVLla-SacI-2001: 5'-huVLlb-SacI-2001 : 5'- huVL2-SacI-2001: 5'-huVL4-SacI-2001 + 5'-huVL5-SacI-2001 : 5'-huVL6-SacI-2001 + 5'-huVL7/8-SacI-2001 : 5'-huVL3/9- SacI-2001.

Após a eletroporação cada reação foi incubada em caldo SOC (Fluka) para expressão fenotipica. As duas culturas kappa foram combinadas assim como as duas culturas lambda. A cultura kappa resultante e a cultura lambda resultante foram então cada qual incubada em 500 mL de meio seletivo SB contendo carbenicilina a 50 yg/mL e glicose a 2% p/v. No dia seguinte, células foram coletadas por centrifugação e preparação de plasmidios foi realizada usando um jogo de preparação de plasmidio comercialmente disponível (Qiagen). 5. Construção da biblioteca de anticorpos - VL humana - VH maternal

PCR foi realizado para amplificar a VH maternal de anticorpos monoclonais A5B7 de um vetor contendo dito VH maternal. Para amplificação um protocolo de PCR de acordo como procedimentos padrão foi seguido usando o primer 5' 5'-AVH-XhoI (5'-GTC ACA CTC GAG TCA GGA GGA GGC TTG GTA C- 3') (SEQ ID NO. 97) e o primer 3' 3'-AVH-BstEII (5'-GTC ACA GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3' (SEQ ID NO. 98) . Após purificação do produto de amplificação de aproximadamente 350 pb de um gel de agarose analítico, o fragmento de DNA foi cortado com as enzimas de restrição BstEII e XhoI. 0 fagemídio pComb3H5BHis (este vetor é descrito na dissertação de tese do Dr. Ralf Lutterbüse) foi digerido de mesma forma e o fragmento grande foi ligado com o fragmento mencionado acima. Após transformação em E. coli XLl blue, um único clone foi cultivado em 100 mL de meio SB (contendo carbenicilina a 50 pg/mL) e o plasmídio foi preparado de acordo com protocolos padrão. 0 sucesso da clonagem foi confirmado pelo seqüenciamento do inserte (Sequiserve, Munique).

Este vetor pComb3H5BHis/maternalVH do anticorpo monoclonal A5B7 foi restringido com as enzimas de restrição SacI e SpeI. 0 fragmento grande do vetor foi isolado. DNA de plasmídio contendo a biblioteca Vkappa e a Vlambda foi restringida com as enzimas de restrição SacI e SpeI. 0 fragmento Vkappa pequeno e o respectivo Vlambda (cada qual com aproximadamente 350 pb) foram isolados de acordo com protocolos padrão.

1200 ng do fragmento do vetor foram ligados com uma mistura cada qual de 200 ng de ambos os fragmentos Vkappa e o Vlambda. A reação de ligação foi transformada em 300 μΙ. de E. coli XLl Blue eletrocompetente por eletroporação (2,5 kV, cuvete com abertura de 0,2 cm, 25 mF, 200 Ohm) resultando em biblioteca de scFv total com tamanho de l,2xl08 clones independentes.

Após expressão fenotipica e adaptação lenta a carbenicilina, a biblioteca de anticorpos foi transferida para meio de seleção SB-Carbenicilina (50 μg/mL) . A biblioteca de anticorpos foi então infectada com uma dose infectante de IxlO12 partículas de fago ajudante VCSM13 resultando em uma produção e secreção de fago M13 filamentoso, no qual cada partícula de fago continha DNA de fita simples pComb3H5BHis codificando um fragmento de scFv metade humano e mostrava a proteína scFv correspondente como uma fusão de tradução para proteína de revestimento de fago III.

6. Seleção da mostra de fagos de uma VL humana As partículas de fago carreando o repertório de scFv foram coletadas do sobrenadante de cultura por precipitação e centrifugação com PEG8000/NaCl. Então aproximadamente IxlO11 a IxlO12 partículas de fago scFv foram ressuspendidas em 0,5 mL de TBS/BSA a 1% e incubados com CEA solúvel biotinilada, que foi imobilizada em poços recobertos com estreptavidina de uma placa de ELISA (Nunc) por 1 hora. Uma solução de 10 pg de antígeno/mL (50 uL) foi incubada de um dia para o outro a 4°C nos poços recobertos com estreptavidina, lavados uma vez com água, seguido por bloqueio por 1 hora a 37°C com 200 uL de BSA a 3% em TBS, que foi removido após a incubação.

Fagos scFv que não se ligaram especificamente aos antigenos alvo foram eliminados pelos passos de lavagem com TBS/Tween a 0,05%. Este procedimento de lavagem foi repetido em até 10 vezes em rodadas adicionais.

Após lavar, entidades ligadas foram eluídas pelo uso de glicina-HCl, pH 2,2. Após neutralização com Tris a 2M, pH 12, o eluato foi usado para infecção de uma cultura fresca e não infectada de E. coli XLl Blue.

Para eluir entidades de alta ligação remanescentes 50 yL de uma cultura fresca de E. coli XLl Blue (OD6OO ≥ 0.5) foi adicionada aos poços e incubados por 15 minutos. Ambas as culturas foram então misturadas e células transduzidas com sucesso com uma cópia fagemídio, codificando um fragmento scFv humano, foram novamente selecionadas para resistência a carbenicilina e subseqüentemente infectadas com fago ajudante VCMS13 para iniciar a segunda rodada de mostra de anticorpos e seleção in vitro. DNA de plasmídio correspondendo a 4 rodadas de cozimento foi isolado de culturas de E. coli. Para a produção de proteína scFv solúvel, fragmentos de DNA VH-VL foram excisados dos plasmídios (XhoI-SpeI) , e clonados por meio dos mesmos sítios de restrição no plasmídio pComb3H5BFlag/His, no qual o constructo de expressão (por exemplo scFv) inclui uma marcação bandeira (TGDYKDDDDK) (SEQ ID NO. 99) entre o scFv e a marcação His6 e as proteínas adicionais do fago são deletadas.

Após a ligação cada mostra (diferentes rodadas de cozimento) de DNA de plasmídio foi transformada em 100 μΙ< de E. coli TGl choque térmico competente e plaqueada em LB- agar com carbenicilina. Colônias simples foram recolhidas e inoculadas em 120 p.L de LB carb (50 pg/mL) com glicose a 1% em placas de 96 poços (Greiner). Os poços foram selados com uma membrana semipermeável (Greiner) e as placas foram incubadas de um dia para o outro a 37° C em uma incubadora agitadora (placa mestra). Então 10 pL das culturas da placa mestra são transferidos para uma segunda placa de 96 poços (placa de trabalho) contendo 90 pL de LB carb (50 pg/mL) com glicose a 0,1% por poço. Após incubação por 4 horas a 37° C em uma incubadora agitadora, a produção de scFv foi induzida pela adição de 20 pL de LB carb com IPTG a 6 mM em cada poço. Após outro passo de incubação de um dia para o outro a 30° C com agitação, as células foram lisadas em 1 hora de incubação em temperatura ambiente com 40 pL de tampão de Iise (ácido bórico 400 mM, NaCl a 320 mM, EDTA a 4 itiM pH 8, lisozima a 2,5 mg/mL) . Células residuais e restos celulares foram separados por centrifugação por 12 minutos a 1.900 χ g (Hettich).

Os sobrenadantes contendo moléculas de scFv foram então testados para ligação em ensaios de ligação por citometria de fluxo. Células CHO transfectadas com CEA humano foram usadas como linhagem celular positiva para CEA. Ensaios de ligação celular foram realizados inicialmente pela incubação de entre 100.000 e 200.000 células com preparação periplásmica contendo scFv humana ou controles relevantes. Após incubação as células foram lavadas em PBS/FCS a 1% (soro fetal de vitelo) e adicionalmente incubado com 5-10 pg/mL de anticorpo anti- FLAG M2 (Sigma). Após as células terem sido novamente lavadas, elas foram incubadas com anticorpos policlonais anti-camundongos marcados cm PE (Dianova) e subseqüentemente analisados por citometria de fluxo. Aproximadamente 600 clones foram testados para sinais de ligação a células CHO positivas para CEA. 27 clones positivos foram obtidos. Após seqüenciamento dos DNAs respectivos, um total de 9 seqüências diferentes foram obtidas.

A figura 12 mostra a ligação das nove construções diferentes de scFv metade humanos (isto é A5B7 VL murino VH humano) a várias linhagens celulares como medido por análise de citometria de fluxo. A Figura contém múltiplos diagramas, uma para cada constructo testado. Em qualquer diagrama, a distribuição preta mostra a intensidade de fluorescência para células incubadas somente com PBS na ausência de qualquer constructo, mas com todos os agentes de detecção apropriados como usado para a detecção dos scFvs. Desta forma, qualquer desvio de fluorescência observado pode ser definitivamente atribuído ao constructo scFv ao invés dos agentes de detecção ou tampão. Desvio na fluorescência, o qual é indicativo de ligação do constructo à linhagem celular respectiva são mostradas por uma linha cinza em cada diagrama. Geralmente, um desvio para longe de maior magnitude, isto é mais longe do controle (preto) indica ligação mais forte, enquanto um desvio para longe de menor magnitude, isto é mais perto do controle (preto) indica uma ligação mais fraca.

Pode ser visto da Figura 12 que os constructos A-121, A-183, A-240, A-313, A-290, A-315, A4-35, A4-52, MP2-A5 mostram claramente desvios discerníveis na intensidade de fluorescência como comparado ao controle respectivo, indicativo de ligação dos scFvs a CEA ligada a membrana nas células alvo CHO. Na seguinte, a região VL humana do scFv A-240 (SEQ ID NO. 48) foi selecionada e usada para o isolamento de uma região VH humana. Dita região VL humana é descrita em SEQ ID Nos. 63 (seqüência de nucleotideos) e 64 (seqüência de aminoácidos).

EXEMPLO 7: Construção das bibliotecas de anticorpo e seleção de mostra de fagos de regiões VH humanas resistentes a antigeno CEA solúvel O objetivo dos experimentos seguintes é a seleção de um conjunto de regiões VH humanas resistentes a antigeno CEA humano que pareie com a região VL humana do scFv A-240, selecionado como descrito no Exemplo 6. Dita região VL humana é descrita em SEQ ID NOs. 63 (seqüência de nucleotideos) e 64 (seqüência de aminoácidos).

1. Isolamento de RNA de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs)

100 mL de sangue foram coletados de cinco doadores humanos saudáveis. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por um gradiente de ficoll de acordo com métodos padrão. RNA total foi isolado de PBMCs usando o RNeasy® Midi Kit (QIAGEN) seguindo as instruções do fabricante. DNAc foi sintetizado de acordo com métodos padrão (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001) .

2. Amplificaçâo por PCR de regiões de cadeia pesada variáveis (regiões VH)

A biblioteca VH foi construída e nomeada Lib 134-VH. Esta biblioteca VH consiste do repertório humano de FRl- CDR1-FR2-CDR2-FR3 das regiões VH amplificadas por PCR da mostra de PBMC descrita acima, operativamente associada ao VH CDR3 do anticorpo materno seguido por uma seqüência de linhagem germinativa FR4 humana. Para o isolamento de regiões VH modelo humanas, RT-PCR foi realizado usando um conjunto de primer 5' especifico para VH (5'-huVHl,3,5-XhoI-2001 (5'-AGG TGC AGC TGC TCG AGT CTG G-3') (SEQ ID NO. 100), 5'-huVH4-XhoI-2001 (5'-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3') (SEQ ID NO. 101), 5'-huVH4B- XhoI-2001 (5'-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3') (SEQ ID NO. 102)) e um conjunto de dois primers 3' específicos para VH (3' -hu-VH-BstEII-2001 (5'-CTG AGG AGA CGG TGA CC-3') (SEQ ID NO. 103), 3'-hu-VH-J3-BstEII-2001 (5'-CTG AAG AGA CGG TGA CC-3') (SEQ ID NO. 104)). Por reação de PCR, um primer 5' foi combinado com um primer 3' ; o número de diferentes reações de CR foi determinado pelo número de combinações possíveis de primers 5' e 3'. O DNAc de PBMC de cinco doadores foi usado como uma fonte de genes VH. O seguinte programa de PCR foi usado para amplificação: desnaturação a 94° C por 15 segundos, anelamento de primer a 52° C por 50 segundos e extensão do primer a 72° C por 60 segundos foram realizados por 40 ciclos, seguido de extensão final a 72° C por 10 minutos. Os produtos de amplificação com um tamanho de aproximadamente 350 pb foram isolados de acordo com métodos padrão.

Para o isolamento de regiões VH da Lib 134, RT-PCR foi realizado em duas etapas. Primeiro, os segmentos VH de cadeia pesada humana (FRl-CDRl-FR2-CDR2-FR3) foram amplificados por PCR a partir dos fragmentos VH modelo humanos usando o mesmo conjunto de primer 5' específico para VH como descrito acima (5'-huVHl,3,5-XhoI-2001, 5'- huVH4-XhoI-2001, 5'-huVH4B-XhoI-2001; SEQ ID NOs. 100-102) e o conjunto de prímer 3' específico (3'-A134-VH1A (5'-GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT YGC ACA GTA ATA CAC GGC -3') (SEQ ID NO. 105) , 3'-Al34-VHlB (5'-GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT YGC ACA GTA ATA CAY RGC - 3') (SEQ ID NO. 106), 3'-A134-VH3A (5'-GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT TGY ACA GTA ATA CAC RGC -3') (SEQ ID NO. 107), onde o "T" indicado também pode ser substituído por "A", vvC" ou xxG", 3'-A134-VH3B (5'-GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT TGC ACA GTA ATA CAA RGC -3') (SEQ ID NO. 108), onde o xxT" indicado também pode ser substituído por xxA", xxC" ou xxG", 3'-A134-VH4 (5'-GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT SGC ACA GTA ATA CAC RGC -3') (SEQ ID NO. 109)) para as subfamílias VH humanas 1, 3 e 4 combinando na região mais terminal do FR3.

As seguintes combinações de primer foram usadas:

a) 5'-huVHl,3,5-XhoI-2001 χ 3'-A134-VH1A

b) 5'-huVHl,3,5-XhoI-2001 χ 3'-A134-VHlB

c) 5'-huVHl,3,5-XhoI-2001 χ 3'-A134-VH3A

d) 5'-huVHl,3,5-XhoI-2001 χ 3'-A134-VH3B

e) 5'-huVH4-XhoI-2001 χ 3'-A134-VH4

f) 5'-huVH4B-XhoI-2001 χ 3'-A134-VH4 Por reação de PCR, um primer 5' foi combinado com um primer 3'; o número de diferentes reações de CR foi determinado pelo número de combinações possíveis de primers 5' e 3' . O seguinte programa de PCR foi usado para amplificação: desnaturação a 94° C por 15 segundos, anelamento de primer a 52° C por 50 segundos e extensão do primer a 12° C por 90 segundos foram realizados por 40 ciclos, seguido de extensão final a 72° C por 10 minutos.

Através deste passo de PCR e a seqüência respectiva de primer 3', os segmentos VH humanos são prolongados para uma parte do VH CDR3 maternal, o qual então por sua vez é o sítio de priming para o primer 3' do segundo passo de PCR.

Estes fragmentos de DNA VH-(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3) foram então usados como moldes em uma segunda reação de PCR usando novamente o respectivo primer 5' específico para VH e o primer 3' universal combinando com o terminal 3'universal dos fragmentos de DNA amplificados (3' A134- JH6-BstEII, 5'- CGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CC -3') (SEQ ID NO. 110) .

O seguinte programa de PCR foi usado para amplificação:

Desnaturação a 94° C por 15 segundos, anelamento de primer a 52° C por 50 segundos e extensão do primer a 72° C por 60 segundos foram realizados por 40 ciclos, seguido de extensão final a 72° C por 10 minutos. Os fragmentos de DNA V foram isolados de acordo com protocolos padrão.

3. Construção de biblioteca - clonagem da mostra de VH humana

Em uma segunda rodada do método antecedente, a VL humana do scFv A-240 identificado na primeira, seleção prévia (veja Exemplo 6) foi escolhida, e subseqüentemente combinada com a biblioteca de fragmentos VH humanos com o objetivo de gerar uma scFv humana. Uma biblioteca de mostra de fagos foi construída de modo geral baseada em procedimentos padrão, como por exemplo divulgado em "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Fragmentos de cadeia pesada de cadeia pesada de diferentes amplificações de PCR foram pesados para cada ligação da seguinte forma:

a:b:c:d:e:f = 3:1:3:1:1:1, onde a-f têm os seguintes significados:

a) 5 '-huVHl, 3, 5- -XhoI -2001 χ 3' -A134 -VH1A b) 5' -huVHl, 3, 5- -XhoI -2001 χ 3' -A134 -VHlB c) 5' -huVHl, 3, 5- -XhoI -2001 χ 3' -Al34 -VH3A d) 5'-huVHl,3,5-XhoI-2001 χ 3'-A134-VH3B

e) 5'-huVH4-XhoI-2001 χ 3'-A134-VH4

f) 5'-huVH4B-XhoI-2001 χ 3'-A134-VH4

Uma reação de ligação foi ajustada consistindo de 400 ng da mostra de fragmentos humanos VH da Lib 134 (digeridas por XhoI-BstEII) e 1200 ng do plasmidio pComb3H5BHis/A-240 VL (o DNA codificando a região VL de scFv A-240 foi clonada por meio dos sítios de restrição SacI e SpeI em pComb3H5Bhis de acordo com procedimentos padrão). Ά mostra resultante de anticorpos VH humanos foi então transformada em 300 μL de Escherichia coli XLl Blue eletrocompetente por eletroporação (2,5 kV, cuvete com abertura de 0,2 cm, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser) resultando em uma biblioteca com tamanho de 0,8xl08 clones independentes no total.

Após eletroporação o ensaio foi incubado em caldo SOC (Fluka) para expressão fenotípica. As culturas foram então cada uma incubada em 500 mL de meio seletivo SB contendo 50 μg/L de carbenicilina e glicose a 2% v/v de um dia para o outro. No dia seguinte, células das culturas foram coletadas por centrifugação e preparação dos plasmídios foi realizada usando jogos de preparação de plasmídios comercialmente disponíveis (Qiagen) para preservar a biblioteca de DNA. 1,5 pg desta mostra de plasmídios codificando a mostra de scFv respectiva foi então eletroporada em E. coli XLl blue (2,5 kV, cuvete com abertura de 0,2 cm, 25 mF, 200 Ohm, Biorad gene-pulser) resultando em uma biblioteca com tamanho de 2,4xl09 clones independentes no total. Após expressão fenotipica e adaptação lenta a carbenicilina a biblioteca de anticorpos foi transferida para meio seletivo SB-carbenicilina (50 pg/mL). A biblioteca de anticorpos foi então infectada com uma dose infecciosa de IxlO12 partículas de fago ajudante VCSM13 resultando na produção e secreção de fagos M13 f ilamentosos, onde cada partícula de fago contém DNA de fita simples pComb3H5Bhis codificando um fragmento scFv humano e mostrava a proteína scFv correspondente como uma fusão de tradução para proteína de recobrimento de fago III.

4. Seleção de mostra de fagos de um VH humano

As partículas de fago carreando o repertório de scFv humana foram coletadas do sobrenadante de cultura por precipitação e centrifugação com PEG8000/NaCl. Então aproximadamente IxlO11 a IxlO12 partículas de fago scFv foram ressuspendidas em 0,5 mL de TBS/BSA a 1% e incubados com CEA solúvel biotinilada, que foi imobilizada em poços de uma placa de ELISA (Nunc) recobertos com estreptavidina por 1 hora. Uma solução (50 pL) com 10 pg de antígeno/mL foi incubada de um dia para o outro a 4 o C nos poços recobertos com estreptavidina lavados uma vez com água, seguido de bloqueio por 1 hora a 31°C com 200 μL de BSA a 3% em TBS, que foi removido após a incubação.

Fagos scFv que não se ligaram especificamente aos antigenos alvo foram eliminados por passos de lavagem com TBS/Tween 0,05%. Este procedimento de lavagem foi repetido por até 10 vezes em rodadas adicionais.

Após lavagem, entidades ligadas foram eluidas pelo uso de glicina-HCl, pH 2,2. Em seguida a neutralização com Tris a 2M, pH 12, as entidades eluidas foram usadas para infecção de uma cultura fresca não infectada de E. coli XLl Blue.

Para eluir entidades de alta ligação remanescentes 50 μL de uma cultura fresca de E. coli XLl Blue (OD6OO ≥ 0.5) foi adicionada aos poços e incubados por 15 minutos. Ambas as culturas foram então misturadas e células transduzidas com sucesso com uma cópia de fagemidio, codificando um fragmento scFv humano, foram novamente selecionadas para resistência a carbenicilina e subseqüentemente infectadas com fago ajudante VCMS13 para iniciar a segunda rodada de mostra de anticorpos e seleção in vitro.

DNA de plasmídio correspondendo a 4 rodadas de cozimento foi isolado de culturas de E. coli. Para a produção de proteina scFv solúvel, fragmentos de DNA VH-VL foram excisados dos plasmidios (XhoI-SpeI), e clonados por meio dos mesmos sítios de restrição no plasmídio pComb3H5BFlag/His, no qual o constructo de expressão (por exemplo scFv) inclui uma marcação bandeira (TGDYKDDDDK; SEQ ID NO. 99) entre o scFv e a marcação His6 e as proteínas adicionais do fago são deletadas.

Após a ligação cada mostra (diferentes rodadas de cozimento) de DNA de plasmídio foi transformada em 100 μ]1 de E. coli TGl choque térmico competente e plaqueada em LB- agar com carbenicilina. Colônias simples foram recolhidas e inoculadas em 120 pL de LB carb (50 μg/mL) com glicose a 1% em placas de 96 poços (Greiner). Os poços foram selados com uma membrana semipermeável (Greiner) e as placas foram incubadas de um dia para o outro a 37° C em uma incubadora agitadora (placa mestra). Então 10 μL das culturas da placa mestra são transferidos para uma segunda placa de 96 poços (placa de trabalho) contendo 90 μL de LB carb (50 μg/mL) com glicose a 0,1% por poço. Após incubação por 4 horas a 37° C em uma incubadora agitadora, a produção de scFv foi induzida pela adição de 20 μl de LB carb com IPTG a 6 mM em cada poço. Após outro passo de incubação de um dia para o outro a 30° C com agitação, as células foram lisadas em 1 hora de incubação em temperatura ambiente com 40 μl de tampão de lise (ácido bórico 400 mM, NaCl a 320 mM, EDTA a 4 mM pH 8, lisozima a 2,5 mg/mL). Células residuais e restos celulares foram separados por centrifugação por 12 minutos a 1.900 χ g (Hettich). Os sobrenadantes contendo moléculas de scFv foram então testados para ligação em ensaios de ligação por citometria de fluxo.

Células CHO transfectadas com CEA humano foram usadas como linhagem celular positiva para CEA. Ensaios de ligação celular foram realizados inicialmente pela incubação de entre 100.000 e 200.000 células com preparação periplásmica contendo scFv humana ou controles relevantes. Após incubação as células foram lavadas em PBS/FCS a 1% (soro fetal de vitelo) e adicionalmente incubado com 5-10 μg/mL de anticorpo anti-FLAG M2. Após as células terem sido novamente lavadas, elas foram incubadas com anticorpos policlonais anti-camundongos marcados cm PE (Dianova) e subseqüentemente analisados por citometria de fluxo. 46 clones foram testados para sinais de ligação a células CHO positivas para CEA. Todos eles mostraram sinais positivos. Após seqüenciamento dos DNAs de scFv respectivos um total de 9 seqüências diferentes foram obtidas, oito das quais demonstraram alto grau de homologia. Os constructos humanas MP510_3-A5.3 (MP510-A5; SEQ ID NO. 50), MP510_3-B9.1 (MP511-B9; SEQ ID NO. 52), MP510_3-D8.1 (MP511-D8; SEQ ID NO. 54) foram selecionadas para caracterização adicional. As seqüências de aminoácidos correspondentes são mostradas na listagem de seqüências.

Extratos periplásmicos de ditos constructos humanos MP510-A5, MP511-B9, MP511-D8 assim como um constructo metade humano A-240 Vlambda.3 (VH de A5B7 murino/ VL de Α240 humano; SEQ ID NO. 48) foram adicionalmente analisadas em experimentos de citometria de fluxo com linhagens celulares positivas e negativas para CEA. Pode ser visto da Figura 13, que os constructos humanas MP510-A5 (SEQ ID NO.

50), MP511-B9 (SEQ ID NO. 52), MP511-D8 (SEQ ID NO. 54) mostram claramente desvios discerniveis na intensidade de fluorescência quando comparadas ao respectivo controle metade humano A-240 Vlambda.3 (VH A5B7 murina/ VL A240 humana; SEQ ID NO. 48) . Assim, os constructos humanas de scFv mostram atividades de ligação mais fortes a CEA humano ligada a membrana do que o constructo metade humana A-240 Vlambda.3. Além disso, todos os constructos humanas mostraram ligação distinta a células humanas Kato III positivas para CEA (linhagem celular de câncer gástrico humano), enquanto nenhuma delas mostrou ligação a células CHO não transfectadas negativas para CEA assim como para células humanas NALM 6 negativas para CEA (linhagem de células B humanas) (dados não mostrados) .

EXEMPLO 8: Geração e atividade citotóxica de anticorpos humanos de cadeia simples bi-específicos CEAxCD3

1. Arranjos

No próximo passo, vários arranjos de domínios de moléculas de anticorpo humano de cadeia simples bi- específico foram geradas. Estas moléculas compreendem o domínio de ligação anti-CEA humano (a geração a que foi descrita no Exemplo 7, acima) e o domínio de ligação desimunizado com especificidade para o antigeno CD3 humano mostrado em SEQ ID NO.77 VHVL foram projetados como descrito na Tabela 1; veja também o Exemplo 2, acima. Todos os constructos de anticorpos de cadeia simples bi- específicos com os domínios de ligação anti CEA humano descritos aqui (aparentemente) ligam-se a antigeno CEA humano solúvel uma vez que foram isolados após quatro rodadas de seleção de mostra de fagos com antigeno CEA solúvel imobilizados em placas de ELISA.

Em particular, os seguintes arranjos foram gerados:

(a) parte de anti-CEA humano localizada N- terminalmente:

(i) orientação VH-VL de anti-CEA: A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 24),

A5 VH-A24 0 VL# χ SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 126),

B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 32),

B9 VH-A240 VL# χ SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 130),

D8 VH-A2 4 0 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 40)

D8 VH-A240 VL# χ SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 134), e CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 16)

(ii) orientação VL-VH de anti-CEA:

A24 0 VL-A5 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 26),

A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34),

A240 VL-D8 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 42),

A240 VL-CEAI VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 18)

(b) parte de anti-CEA humano localizada terminalmente:

(i) orientação VH-VL de anti-CEA:

SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A2 4 0VL (SEQ ID NO. 30),

SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A240VL# (SEQ ID NO. 128),

SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240VL (SEQ ID NO. 36),

SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A24 0VL (SEQ ID NO. 143),

SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240VL# (SEQ ID NO. 132),

SEQ ID NO.77 VHVLxD8 VH-A240VL (SEQ ID NO. 44), SEQ ID NO.77- VHVLxD8 VH-A240VL# (SEQ ID NO. 136), e

SEQ ID NO.7 7 VHVLxCEAI VH-A2 4 0VL (SEQ ID NO. 20).

(ii) orientação VL-VH de anti-CEA:

SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-A5 VH (SEQ ID NO. 28),

SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-B9VH (SEQ ID NO. 38),

SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL-D8VH (SEQ ID NO. 46), e

SEQ ID NO.77 VHVLx A24OVL-CEAI VH (SEQ ID NO. 22).

CEAI VH (SEQ ID NO. 56) denota a região VH derivada de anticorpo monoclonal A5B7 murino, enquanto CEAI VHVL ou CEAI VLVH refere-se ao domínio VH-VL e ao domínio VL-VH, respectivamente, derivados de anticorpo monoclonal A5B7. A240 corresponde a região VL humana (veja SEQ ID NO.64 e Exemplo 7). Desta maneira, por exemplo CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO.16) corresponde a um constructo bi-específico com domínio de ligação a CEA metade humano tendo uma região VH murina de mAb7 e uma região VL humana de A240.

Para a clonagem da biblioteca de anticorpos humanos, as seqüências de nucleotídeos codificando os terminais N originais da região VL da A240 tiveram de ser convertidas para sítios de restrição. Em A5 VH-A240 VL# χ SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 126), SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A240VL# (SEQ ID NO. 128), B9 VH-A240 VL# χ SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 130), SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240VL# (SEQ ID NO. 132), D8 VH-A240 VL# χ SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 134), e SEQ ID NO.77 VHVLxD8 VH-A240VL# (SEQ ID NO. 136), os terminais N original teve de ser reintroduzido.

O constructo de anticorpo de cadeia simples bi- especifico SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240VL (SEQ ID NO. 143) difere do constructo SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A24 0VL (SEQ ID NO. 36) e apenas um resíduo de aminoácido: a seqüência CDR- H2 na VH de E12 lê "FILNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 145), enquanto na VH de B9 lê-se "FIRNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO. 67) . A região VH de E12 humano foi isolada como descrito no Exemplo 7.

2. Expressão, purificação e análise por citometria de fluxo

Expressão, purificação e análise por citometria de fluxo destes anticorpos de cadeia simples bi-específicos CEAxCD3 foram realizados por métodos descritos no Exemplo 2, acima.

3. Atividade de ligação

Como exemplificado na Figura 14, construções de anticorpos humanos de cadeia simples bi-específicos A5 VH- A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 24), B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 32), D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 40) e CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 16) se ligam a células Kato III humanas positivas para CEA e para células HPB-ALL CD3 positivas.

4. Atividade citotóxica na ausência de antigeno CEA solúvel

A atividade citotóxica contra células alvo CHO-CEA+ foi demonstrada para os seguintes arranjos de domínios dos anticorpos de cadeia simples bi-especificos:

Para os constructos com a parte anti-CEA localizada N- terminalmente e uma orientação VH-VL da parte anti-CEA, a Figura 15 mostra a atividade citotóxica para A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 24), B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 32), D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 40) e CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 16) . A Figura 16 demonstra a atividade citotóxica para a orientação VL-VH dos domínios anti-CEA (localizados N- terminalmente) para A240 VL-A5 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 26), A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34), A240 VL-D8 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 42), e A240 VL- CEAI VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 18).

Para constructos com a parte anti-CEA localizada C- terminalmente e uma orientação VH-VL da parte anti-CEA, a Figura 17 exibe a citotoxicidade contra células alvo CEA+ para SEQ ID NO.77 VHVLxA5 VH-A24 0VL (SEQ ID NO. 30), SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240VL (SEQ ID NO. 36), SEQ ID NO.77 VHVLXD8 VH-A24OVL (SEQ ID NO. 44), e SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI VH-A240VL (SEQ ID NO. 20). SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI LH foi usada como controle positivo. A Figura 18 mostra a atividade citotóxica de constructos com orientação VL-VH do domínio anti-CEA (localizado C-terminalmente) para SEQ ID NO.77 VHVLxA2 4 0VL-A5 VH (SEQ ID NO. 28), SEQ ID NO.77 VHVLxA2 4 OVL-B 9VH (SEQ ID NO. 38), SEQ ID NO.77 VHVLxA240VL- D8VH (SEQ ID NO. 46), e SEQ ID NO.77 VHVLx A2 4 OVL-CEAIVH (SEQ ID NO. 22). SEQ ID NO.77 VHVLxCEAI LH (SEQ ID NO. 2) foi usada como controle positivo.

A Figura 21 mostra a atividade citotóxica de constructos de anticorpos de cadeia simples bi-especificos compreendendo a região VH de B9 humano e a região VL de A240 humano em diferentes arranjos: A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34), SEQ ID NO.77 VHVLxA240 VL-B9 VH (SEQ ID NO. 38), SEQ ID NO.77 VHVLxB9 VH-A240 VL (SEQ ID NO. 36), e B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 32) revelaram atividade citotóxica contra células CHO transfectadas com CEA humano.

5. Resistência de anticorpos de cadeia simples bi- especificos a CEAxCD3 humanos

Ensaios de competição na presença de antígeno CEA humano solúvel para os anticorpos de cadeia simples bi- específicos humanos foram realizados como descrito no Exemplo 5, acima. As Figuras 19 e 20 demonstram a resistência a antigeno CEA solúvel da atividade citotóxica também para constructos humanos, como exemplificado para os constructos A5 VH-A240 VLxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 24), B9 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 32), D8 VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 40) e CEAI VH-A240 VLxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 16); para resistência a CEA solúvel de anticorpos de cadeia simples bi-especificos derivados de murinos veja o Exemplo 5. Além disso, a Figura 22 mostra que o constructo de cadeia simples bi-especifico reativo a CEA A240 VL-B9 VHx SEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34) redirecionou células T para lisar células CHO-CEA+ na presença de quantidades crescentes de antigeno CEA solúvel. Este experimento demonstra que a atividade citotóxica mediada por A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL também é resistente a CEA solúvel. Finalmente, como pode ser derivado da Figura 27, a atividade citotóxica mediada pelo constructo de cadeia simples bi-especifico SEQ ID NO. 77 VHVLxE 12 VH-A24 0 VL (SEQ ID NO. 143) é resistente a CEA solúvel.

Assim, a presente invenção fornece composições farmacêuticas com atividade antitumoral citotóxica na presença de níveis ainda mais altos de antigeno CEA solúvel. Como descrito acima, altas concentrações de CEA de soro em pacientes com tumores epiteliais reduzem o sucesso de terapias baseadas em anticorpos anti-CEA. Portanto, as composições farmacêuticas da invenção são particularmente apropriadas para o tratamento de pacientes com tumores epiteliais progressivos (por exemplo, tumores metastáticos secundários após remoção cirúrgica do(s) tumor(es) primário(s)), tumores epiteliais malignos, alta carga tumoral (epitelial) e tumores epiteliais de estágio avançado caracterizados por altas concentrações de antigeno CEA solúvel no soro/plasma de ditos pacientes. Adicionalmente, composições farmacêuticas da invenção também são esperadas para serem administradas em dosagens baixas. Além disso, ditas composições farmacêuticas são improváveis de serem tumorigênicas quando administradas aos pacientes em função da origem humana da parte anti-CEA e a parte anti-CD3 desimunizada dos anticorpos de cadeia simples bi-especificos nas composições farmacêuticas da invenção. Além disso, as composições farmacêuticas da invenção são esperadas que forneçam para alta penetração tumoral em função do pequeno peso molecular e pequeno tamanho dos constructos de cadeia simples bi-especificos. Adicionalmente, para o tratamento dos tumores pequenas quantidades de anticorpos de cadeia simples bi-especificos serão usadas por causa da alta atividade citotóxica das ditas moléculas. Porque pequenas quantidades são esperadas que sejam administradas aos pacientes, os efeitos adversos para os pacientes também são esperados que sejam reduzidos. Finalmente, anticorpos de cadeia simples bi-especificos sem resistência a CEA solúvel seriam altamente sensível a até baixas concentrações de antigeno de CEA solúvel no plasma de pacientes com tumores uma vez que eles seriam administrados em baixas concentrações, como descrito acima. Este problema também é contornado pelas composições farmacêuticas da invenção. EXEMPLO 9: Avaliação da homogeneidade protéica de monômero purificado de VL de A240 - B9 VHxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 34) por cromatografia de troca de cátions de alta resolução

Para caracterizar adicionalmente a homogeneidade do constructo purificada A240 VL - B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34), a fração monomérica isolada foi sujeita a Cromatografia de Troca da Cátions de Alta Resolução. A cromatografia foi realizada em uma coluna MiniS (Mini S PE 4.6/50 CatX 0,8 ml; GE Healthcare 17-5005-01), equilibrada com tampão MES a 20 mM pH 5,5. A amostra foi diluída 1:3 com o mesmo tampão antes de ser carregada na coluna. Proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente de tampão de equilíbrio contendo NaCl a 1M: 0-30% em 60 volumes de coluna. Proteínas remanescentes foram eluídas em 3 volumes de coluna com NaCl a IM. 0 cromatograma resultante é mostrado na Figura 23 e exibe uma fração protéica homogênea com um único pico principal.

EXEMPLO 10: Estabilidade plasmática de Ά240 VL-B 9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34)

A estabilidade plasmática do constructo A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO. 77 VHVL (SEQ ID NO. 34) foi testada sob diferentes condições de incubação seguidas de um ensaio padrão baseado na liberação de cromo-51 como descrito no exemplo 4. Uma mostra de plasma humano com o sangue de cinco doadores saudáveis foi gerada por coleta de sangue em seringas recobertas com EDTA. Os componentes celulares foram removidos por centrifugação e a fase superior do plasma foi coletada e subseqüentemente mostrada. 0 constructo A240 VL-B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34) foi incubada ou a 37° C ou a 4o C na presença ou ausência de plasma. Como controles, o constructo foi diluída imediatamente antes ao ensaio de citotoxicidade em plasma ou meio RPMI 1640, respectivamente. CHO-CEA+ serviram como células alvo; células T CD8+ foram usadas como células efetoras. A razão efetora:alvo (E:A) foi 10:1. A duração do ensaio foi de 18 horas.

Como mostrado na Figura 24, o constructo de cadeia simples bi-específico reativa a CEA A240 VL - B9 VHxSEQ ID NO.77 VHVL (SEQ ID NO. 34) provou ser muito estável; nenhuma perda de atividade citotóxica pode ser detectada após incubação em plasma humano por 24 horas a 37° C.

EXEMPLO 11: Avaliação da homogeneidade protéica de monômero purificado de SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL (SEQ ID NO. 143) por cromatografia de troca de cátions de alta resolução

O experimento foi conduzido em analogia com o Exemplo 9, exceto que SEQ ID NO.77 VHVLxE12 VH-A240 VL (SEQ ID NO. 143) foi analisada. O cromatograma resultante é mostrado na Figura 25 e exibe a fração protéica homogênea com um único pico principal.

EXEMPLO 12: Estabilidade plasmática de SEQ ID NO. 77 VHVLxE12 VH-A240 VL (SEQ ID NO. 143)

O experimento foi conduzido em analogia com o Exemplo 10, exceto que SEQ ID NO. 77 VHVL χ E12 VH-A240 VL (SEQ ID NO. 143) foi analisada. Como demonstrado na Figura 26, o constructo de cadeia simples bi-especifico SEQ ID NO.77 VHVL χ E12 VH-A24 0 VL (SEQ ID NO. 143) provou ser muito estável; nenhuma perda de atividade citotóxica pode ser detectada após incubação em plasma humano por 24 horas a 37°C. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

I) INFORMAÇÕES GERAIS:

I.a) Requerente: Micromet AG

II) Título da Invenção: Composições farmacêuticas com resistência a CEA solúvel, processo de produção das mesmas, usos de anticorpo bi-especifico de cadeia simples, molécula de ácido nucléico, vetor e hospedeiro na preparação de composição farmacêutica, e kits

III) Arquivo de Referência: L1652 PCT S3

IV.a) Dados de Prioridade Unionista: EP 05 02 8064.3 IV.b) Data de preenchimento do formulário anterior: 2005-12- 21

IV.a) Dados de Prioridade Unionista: US 60/751.963

IV.b) Data de preenchimento do formulário anterior: 2005-12- 21

IV.a) Dados de Prioridade Unionista: US 60/780.861

IV.b) Data de preenchimento do formulário anterior: 2006-10- 03

V)Número de Seqüências: 147 (cento e quarenta e sete)

VI)Programa para leitura: PatentIn version 3.3

2) INFORMAÇÕES GERAIS DAS SEQÜÊNCIAS:

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 1

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1476

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ CEA I VLVH ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 1

gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360 gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420 ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480 agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540 aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600 agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatccgac attgagctca cccagtctcc agcaatcctg 780 tctgcatctc caggggagaa ggtcacaatg acttgcaggg ccagctcaag tgtaacttac 840 attcactggt accagcagaa gccaggatcc tcccccaaat cctggattta tgccacatcc 900 aacctggctt ctggagtccc tgctcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct 960 ctcacaatca gcagagtgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca acattggagt 1020 agtaaaccac cgacgttcgg tggagggacc aagctcgaga tcaaaggtgg tggtggttct 1080 ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct caggtccaac tgcaggagtc aggaggaggc 1140 ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact 1200 gattactaca tgaactgggt ccgccagcct ccaggaaagg cacttgagtg gttgggtttt 1260 attggaaaca aagctaatgg ttacacaaca gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc 1320 accatctcca gagataaatc ccaaagcatc ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct 1380 gaggacagtg ccacttatta ctgtaccaga gatagggggc tacggttcta ctttgactac 1440 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcctag 1476

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 2

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 491

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ CEA I VLVH ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 2 Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser 245 250 255

Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 260 265 270

Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 275 280 285

Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 290 295 300

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 305 310 315 320 Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 325 330 335

Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 340 345 350

Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 355 360 365

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 370 375 380

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr 385 390 395 400

Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 405 410 415

Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr 420 425 430

Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln 435 440 445

Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala 450 455 460

Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 465 470 475 480 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 485 490

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 3

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 147 6

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ CEA I VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ gacgtccaac tggtgcagtc ID NO. aggggctgaa 3 gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360 gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420 ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480 agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540 aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600 agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatcccag gtccaactgc aggagtcagg aggaggcttg 780 gtacagcctg ggggttctct gagactctcc tgtgcaactt ctgggttcac cttcactgat 840 tactacatga actgggtccg ccagcctcca ggaaaggcac ttgagtggtt gggttttatt 900 ggaaacaaag ctaatggtta cacaacagag tacagtgcat ctgtgaaggg tcggttcacc 960 atctccagag ataaatccca aagcatcctc tatcttcaaa tgaacaccct gagagctgag 1020 gacagtgcca cttattactg taccagagat agggggctac ggttctactt tgactactgg 1080 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc 1140 ggtggtggtg gttctgacat tgagctcacc cagtctccag caatcctgtc tgcatctcca 1200 ggggagaagg tcacaatgac ttgcagggcc agctcaagtg taacttacat tcactggtac 1260 cagcagaagc caggatcctc ccccaaatcc tggatttatg ccacatccaa cctggcttct 1320 ggagtccctg ctcgcttcag tggcagtggg tctgggacct cttactctct cacaatcagc 1380 agagtggagg ctgaagatgc tgccacttat tactgccaac attggagtag taaaccaccg 1440 acgttcggtg gagggaccaa gctcgagatc aaatag 1476

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 4

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 4 91

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ CEA I VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 4

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 35 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser 245 250 255

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 260 265 270

Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln 275 280 285

Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala 290 295 300

Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 305 310 315 320

Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr 325 330 335

Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly 340 345 350

Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 355 360 365

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 370 375 380

Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro 385 390 395 400

Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr 405 410 415

Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile 420 425 430

Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 435 440 445

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala 450 455 460

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro 465 470 475 480

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 485 490

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 5

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1473

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: CEA I VLVH χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 5

gacattgagc tcacccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgtaact tacattcact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca aatcctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccaacattgg agtagtaaac caccgacgtt cggtggaggg 300

accaagctcg agatcaaagg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt 360

tctcaggtcc aactgcagga gtcaggagga ggcttggtac agcctggggg ttctctgaga 420

ctctcctgtg caacttctgg gttcaccttc actgattact acatgaactg ggtccgccag 480

cctccaggaa aggcacttga gtggttgggt tttattggaa acaaagctaa tggttacaca 540

acagagtaca gtgcatctgt gaagggtcgg ttcaccatct ccagagataa atcccaaagc 600 atcctctatc ttcaaatgaa caccctgaga gctgaggaca gtgccactta ttactgtacc 660 agagataggg ggctacggtt ctactttgac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 720 tcctccggag gtggtggatc cgacgtccaa ctggtgcagt caggggctga agtgaaaaaa 780 cctggggcct cagtgaaggt gtcctgcaag gcttctggct acacctttac taggtacacg 840 atgcactggg taaggcaggc acctggacag ggtctggaat ggattggata cattaatcct 900 agccgtggtt atactaatta cgcagacagc gtcaagggcc gcttcacaat cactacagac 960 aaatccacca gcacagccta catggaactg agcagcctgc gttctgagga cactgcaacc 1020 tattactgtg caagatatta tgatgatcat tactgccttg actactgggg ccaaggcacc 1080 acggtcaccg tctcctcagg cgaaggtact agtactggtt ctggtggaag tggaggttca 1140 ggtggagcag acgacattgt actgacccag tctccagcaa ctctgtctct gtctccaggg 1200 gagcgtgcca ccctgagctg cagagccagt caaagtgtaa gttacatgaa ctggtaccag 1260 cagaagccgg gcaaggcacc caaaagatgg atttatgaca catccaaagt ggcttctgga 1320 gtccctgctc gcttcagtgg cagtgggtct gggaccgact actctctcac aatcaacagc 1380 ttggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccaacagt ggagtagtaa cccgctcacg 1440 ttcggtggcg ggaccaaggt ggagatcaaa tag 1473

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 6

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 490

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: CEA I VLVH χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 6

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr 35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser 115 120 125

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 130 135 140

Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln 145 150 155 160

Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala 165 170 175

Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190

Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr 195 200 205

Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly 210 215 220

Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala 245 250 255

Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 260 265 270

55 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 275 280 285

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr 290 295 300 Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp 305 310 315 320

Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu 325 330 335

Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys 340 345 350

Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu 355 360 365

Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp 370 375 380

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 385 390 395 400

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 405 410 415

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 420 425 430

35 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 435 440 445

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu 450 455 460

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 465 470 475 480

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 485 490

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 7

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1476

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: CEA I VHVL χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples IV) Seqüência: SEQ ID NO. 7

caggtccaac tgcaggagtc aggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact gattactaca tgaactgggt ccgccagcct 120 ccaggaaagg cacttgagtg gttgggtttt attggaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataaatc ccaaagcatc 240 ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ctgtaccaga 300 gatagggggc tacggttcta ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tccggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tccggtggtg gtggttctga cattgagctc 420 acccagtctc cagcaatcct gtctgcatct ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg 480 gccagctcaa gtgtaactta cattcactgg taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa 540 tcctggattt atgccacatc caacctggct tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt 600 gggtctggga cctcttactc tctcacaatc agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact 660 tattactgcc aacattggag tagtaaacca ccgacgttcg gtggagggac caagctcgag 720 atcaaatccg gaggtggtgg atccgacgtc caactggtgc agtcaggggc tgaagtgaaa 780 aaacctgggg cctcagtgaa ggtgtcctgc aaggcttctg gctacacctt tactaggtac 840 acgatgcact gggtaaggca ggcacctgga cagggtctgg aatggattgg atacattaat 900 cctagccgtg gttatactaa ttacgcagac agcgtcaagg gccgcttcac aatcactaca 960 gacaaatcca ccagcacagc ctacatggaa ctgagcagcc tgcgttctga ggacactgca 1020 acctattact gtgcaagata ttatgatgat cattactgcc ttgactactg gggccaaggc 1080 accacggtca ccgtctcctc aggcgaaggt actagtactg gttctggtgg aagtggaggt 1140 tcaggtggag cagacgacat tgtactgacc cagtctccag caactctgtc tctgtctcca 1200 ggggagcgtg ccaccctgag ctgcagagcc agtcaaagtg taagttacat gaactggtac 1260 cagcagaagc cgggcaaggc acccaaaaga tggatttatg acacatccaa agtggcttct 1320 ggagtccctg ctcgcttcag tggcagtggg tctgggaccg actactctct cacaatcaac 1380 agcttggagg ctgaagatgc tgccacttat tactgccaac agtggagtag taacccgctc 1440 acgttcggtg gcgggaccaa ggtggagatc aaatag 1476

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 8

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 491

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial III) Característica:

III.c) Outras informações: CEA I VHVL χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-especifico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 8

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Tyr Het Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro 130 135 140

Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg 145 150 155 160

Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175

Ser Ser Pro Lys Ser Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 180 185 190

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220

His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 240

Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 245 250 255

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala 260 265 270

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala 275 280 285

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly 290 295 300

Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr 305 310 315 320

Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 325 330 335

Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr 340 345 350

Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly 355 360 365

Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala 370 375 380

Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro 385 390 395 400

Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr 405 410 415

Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile 420 425 430

Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 435 440 445 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 450 455 460

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu 465 470 475 480

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 485 490

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 9

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1491

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: CEA II VHVL χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 9

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtggagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tagtaaatat 180 gtcccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcagctca ccagcctgac atctgaggac actgccgtct attattgtgc tccgtttggt 300 tactacgtgt ctgactatgc tatggcctac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360 tccggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tccggtggtg gtggttctga cattgtgctg 420 acccaatctc cagcttcttt ggctgtgtct cttgggcaga gggccaccat gtcctgcaga 480 gccggtgaaa gtgttgatat ttttggcgtt gggtttttgc actggtacca gcagaaacca 540 ggacagccac ccaaactcct catctatcgt gcatccaacc tagaatctgg gatccctgtc 600 aggttcagtg gcactgggtc taggacagac ttcaccctca tcattgatcc tgtggaggct 660 gatgatgttg ccacctatta ctgtcagcaa actaatgagg atccgtacac gttcggaggg 720 gggaccaagc tcgagataaa atccggaggt ggtggatccg acgtccaact ggtgcagtca 780 ggggctgaag tgaaaaaacc tggggcctca gtgaaggtgt cctgcaaggc ttctggctac 840 acctttacta ggtacacgat gcactgggta aggcaggcac ctggacaggg tctggaatgg 900 attggataca ttaatcctag ccgtggttat actaattacg cagacagcgt caagggccgc 960 ttcacaatca ctacagacaa atccaccagc acagcctaca tggaactgag cagcctgcgt 1020 tctgaggaca ctgcaaccta ttactgtgca agatattatg atgatcatta ctgccttgac 1080 tactggggcc aaggcaccac ggtcaccgtc tcctcaggcg aaggtactag tactggttct 1140 ggtggaagtg gaggttcagg tggagcagac gacattgtac tgacccagtc tccagcaact 1200 ctgtctctgt ctccagggga gcgtgccacc ctgagctgca gagccagtca aagtgtaagt 1260 tacatgaact ggtaccagca gaagccgggc aaggcaccca aaagatggat ttatgacaca 1320 tccaaagtgg cttctggagt ccctgctcgc ttcagtggca gtgggtctgg gaccgactac 1380 tctctcacaa tcaacagctt ggaggctgaa gatgctgcca cttattactg ccaacagtgg 1440 agtagtaacc cgctcacgtt cggtggcggg accaaggtgg agatcaaata g 1491

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 10

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 496

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: CEA II VHVL χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 10

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 130 135 140

Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg 145 150 155 160

Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr 165 170 175

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser

180 185 190

Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg 195 200 205

Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala 210 215 220

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 225 230 235 240

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln 245 250 255

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys

260 265 270

Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His 275 280 285

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile 290 295 300

Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 305 310 315 320

Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 325 330 335

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr

340 345 350

Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 355 360 365 Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly 370 375 380

Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr 385 390 395 400

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser 405 410 415

Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

420 425 430

Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro 435 440 445

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 450 455 460

Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 465 470 475 480

Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 485 490 495

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 11

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1470

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: CEA III VLVH χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ gagaacgttc tcacccagtc ID NO. tccagcaatc 11 atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atcacctgca gtgccagctc aagcgtcagc tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120 acctccccca aactctggat ttattctaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttctctggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagaat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagaga agtagttacc cactcacgtt cggtgctggg 300 accaagctcg agctgaaagg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt 360 tctcaggtta agctgcagca gtctggggca gagcttgtga gatcagggac atcagtcaag 420 ttgtcctgca cagcttctgg cttcaacatt aaagactcct atatgcactg gctgaggcag 480 gggcctgaac agggcctgga gtggattgga tggattgatc ctgagaatgg tgatactgaa 540 tatgccccga agttccaggg caaggccact ttcactactg acacatcctc caacacagcc 600 tacctgcagc tcagcagcct gacatctgag gacactgccg tctattactg taacgagggc 660 acacctacag ggccttacta ctttgactac tggggccaag gcaccactgt cacagtctcc 720 tccggaggtg gtggatccga cgtccaactg gtgcagtcag gggctgaagt gaaaaaacct 780 ggggcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggct tctggctaca cctttactag gtacacgatg 840 cactgggtaa ggcaggcacc tggacagggt ctggaatgga ttggatacat taatcctagc 900 cgtggttata ctaattacgc agacagcgtc aagggccgct tcacaatcac tacagacaaa 960 tccaccagca cagcctacat ggaactgagc agcctgcgtt ctgaggacac tgcaacctat 1020 tactgtgcaa gatattatga tgatcattac tgccttgact actggggcca aggcaccacg 1080 gtcaccgtct cctcaggcga aggtactagt actggttctg gtggaagtgg aggttcaggt 1140 ggagcagacg acattgtact gacccagtct ccagcaactc tgtctctgtc tccaggggag 1200 cgtgccaccc tgagctgcag agccagtcaa agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag 1260 aagccgggca aggcacccaa aagatggatt tatgacacat ccaaagtggc ttctggagtc 1320 cctgctcgct tcagtggcag tgggtctggg accgactact ctctcacaat caacagcttg 1380 gaggctgaag atgctgccac ttattactgc caacagtgga gtagtaaccc gctcacgttc 1440 ggtggcggga ccaaggtgga gatcaaatag 1470

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 12

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 489 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: CEA III VLVH χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-especifico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 12

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser 115 120 125

Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr 130 135 140

Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser Tyr Met His Trp Leu Arg Gln 145 150 155 160

Gly Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn 165 170 175

Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr 180 185 190

Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr 195 200 205

Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly 210 215 220

Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 245 250 255

Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 260 265 270 Tyr Thr Phe Thr -Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 275 280 285

Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr 290 295 300

Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys 305 310 315 320

Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 325 330 335

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu 340 345 350

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly 355 360 365

Thr Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp 370 375 380

Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu 385 390 395 400

Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn 405 410 415

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp 420 425 430

Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 435 440 445

Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp 450 455 460

Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe 465 470 475 480

Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 485

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 13

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1473

II.b) tipo: DNA II.c) organismo: seqüência artificial III) Característica:

III.c) Outras informações: CEA III VHVL χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-especifico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 13

caggttaagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgagat cagggacatc agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactcctata tgcactggct gaggcagggg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtga tactgaatat 180 gccccgaagt tccagggcaa ggccactttc actactgaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtaa cgagggcaca 300 cctacagggc cttactactt tgactactgg ggccaaggca ccactgtcac agtctcctcc 360 ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc ggtggtggtg gttctgagaa cgttctcacc 420 cagtctccag caatcatgtc tgcatctcca ggggagaagg tcaccatcac ctgcagtgcc 480 agctcaagcg tcagctacat gcactggttc cagcagaagc caggcacctc ccccaaactc 540 tggatttatt ctacatccaa cctggcttct ggagtccctg ctcgcttctc tggcagtggg 600 tctgggacct cttactctct cacaatcagc agaatggagg ctgaagatgc tgccacttat 660 tactgccagc agagaagtag ttacccactc acgttcggtg ctgggaccaa gctcgagctg 720 aaatccggag gtggtggatc cgacgtccaa ctggtgcagt caggggctga agtgaaaaaa 780 cctggggcct cagtgaaggt gtcctgcaag gcttctggct acacctttac taggtacacg 840 atgcactggg taaggcaggc acctggacag ggtctggaat ggattggata cattaatcct 900 agccgtggtt atactaatta cgcagacagc gtcaagggcc gcttcacaat cactacagac 960 aaatccacca gcacagccta catggaactg agcagcctgc gttctgagga cactgcaacc 1020 tattactgtg caagatatta tgatgatcat tactgccttg actactgggg ccaaggcacc 1080 acggtcaccg tctcctcagg cgaaggtact agtactggtt ctggtggaag tggaggttca 1140 ggtggagcag acgacattgt actgacccag tctccagcaa ctctgtctct gtctccaggg 1200 gagcgtgcca ccctgagctg cagagccagt caaagtgtaa gttacatgaa ctggtaccag 1260 cagaagccgg gcaaggcacc caaaagatgg atttatgaca catccaaagt ggcttctgga 1320 gtccctgctc gcttcagtgg cagtgggtct gggaccgact actctctcac aatcaacagc 1380 ttggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccaacagt ggagtagtaa cccgctcacg 1440 ttcggtggcg ggaccaaggt ggagatcaaa tag 1473

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 14 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 490

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: CEA III VHVL χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 14

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Thr 15 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser 20 25 30

Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 130 135 140

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala 145 150 155 160

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr 165 170 175

Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 180 185 190 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 195 200 205

Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 215 220

Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 225 230 235 240

Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala 245 250 255

Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 260 265 270

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 275 280 285

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr 290 295 300

Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp 305 310 315 320

Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu 325 330 335

Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys 340 345 350

Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu 355 360 365

Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp 370 375 380

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 385 390 395 400

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 405 410 415

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 420 425 430 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 435 440 445

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu 450 455 460

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 465 470 475 480

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 485 490

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 15

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1506

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: CEA I VH-A240VL χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 15 gaggtgcagc tggtcgagtc aggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact gattactaca tgaactgggt ccgccagcct 120 ccaggaaagg cacttgagtg gttgggtttt attggaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataaatc ccaaagcatc 240 ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ctgtaccaga 300 gatagggggc tacggttcta ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tccggtggtg gtggttctca ggccgtgctg 420 actcagccgg CttCCCtCtC tgcatctcct ggagcatcag ccagtctcac ctgcaccttg 480 cgcaggggca tcaatgttgg tgcctacagt atatactggt accagcagaa gccagggagt 540 cctccccagt atctcctgag gtacaaatca gactcagata agcagcaggg ctctggagtc 600 tccagccgct tctctgcatc caaagatgct tcggccaatg cagggatttt actcatctct 660 gggctccagt ctgaggatga ggctgactat tactgtatga tttggcacag cggcgcttct 720 gcggtgttcg gcggagggac caagttgacc gtcctatccg gaggtggtgg atccgacgtc 780 caactggtgc agtcaggggc tgaagtgaaa aaacctgggg cctcagtgaa ggtgtcctgc 840 aaggcttctg gctacacctt tactaggtac acgatgcact gggtaaggca ggcacctgga 900 cagggtctgg aatggattgg atacattaat cctagccgtg gttatactaa ttacgcagac 960 agcgtcaagg gccgcttcac aatcactaca gacaaatcca ccagcacagc ctacatggaa 1020 ctgagcagcc tgcgttctga ggacactgca acctattact gtgcaagata ttatgatgat 1080 cattactgcc ttgactactg gggccaaggc accacggtca ccgtctcctc aggcgaaggt 1140 actagtactg gttctggtgg aagtggaggt tcaggtggag cagacgacat tgtactgacc 1200 cagtctccag caactctgtc tctgtctcca ggggagcgtg ccaccctgag ctgcagagcc 1260 agtcaaagtg taagttacat gaactggtac cagcagaagc cgggcaaggc acccaaaaga 1320 tggatttatg acacatccaa agtggcttct ggagtccctg ctcgcttcag tggcagtggg 1380 tctgggaccg actactctct cacaatcaac agcttggagg ctgaagatgc tgccacttat 1440 tactgccaac agtggagtag taacccgctc acgttcggtg gcgggaccaa ggtggagatc 1500 aaatag 1506

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 16

II) Características da seqüência: II.a) tamanho: 501

Il.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: CEA I VH-A24OVL χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala 130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu 145 150 155 160

Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser 180 185 190

Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys 195 200 205

Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser 210 215 220

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser 225 230 235 240

Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 260 265 270

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 275 280 285

Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu 290 295 300

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp 305 310 315 320

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr 325 330 335

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 340 345 350

Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly 355 360 365

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly 370 375 380

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr 385 390 395 400

Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu

405 410 415

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln 420 425 430

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val 435 440 445

Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 450 455 460

Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 465 470 475 480

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 485 490 495

Lys Val Glu Ile Lys 500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 17

II) Características da seqüência: II.a) tamanho: 1503

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A240VL - CEA I VH χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 17 caggccgtgc tgactcagcc ggcttccctc tctgcatctc ctggagcatc agccagtctc 60 acctgcacct tgcgcagggg catcaatgtt ggtgcctaca gtatatactg gtaccagcag 120 aagccaggga gtcctcccca gtatctcctg aggtacaaat cagactcaga taagcagcag 180 ggctctggag tctccagccg cttctctgca tccaaagatg cttcggccaa tgcagggatt 240 ttactcatct ctgggctcca gtctgaggat gaggctgact attactgtat gatttggcac 300 agcggcgctt ctgcggtgtt cggcggaggg accaagttga ccgtcctagg tggtggtggt 360 tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctgaggtgc agctggtcga gtcaggagga 420 ggcttggtac agcctggggg ttctctgaga ctctcctgtg caacttctgg gttcaccttc 480 actgattact acatgaactg ggtccgccag cctccaggaa aggcacttga gtggttgggt 540 tttattggaa acaaagctaa tggttacaca acagagtaca gtgcatctgt gaagggtcgg 600 ttcaccatct ccagagataa atcccaaagc atcctctatc ttcaaatgaa caccctgaga 660 gctgaggaca gtgccactta ttactgtacc agagataggg ggctacggtt ctactttgac 720 tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctccggag gtggtggatc cgacgtccaa 780 ctggtgcagt caggggctga agtgaaaaaa cctggggcct cagtgaaggt gtcctgcaag 840 gcttctggct acacctttac taggtacacg atgcactggg taaggcaggc acctggacag 900 ggtctggaat ggattggata cattaatcct agccgtggtt atactaatta cgcagacagc 960 gtcaagggcc gcttcacaat cactacagac aaatccacca gcacagccta catggaactg 1020 agcagcctgc gttctgagga cactgcaacc tattactgtg caagatatta tgatgatcat 1080 tactgccttg actactgggg ccaaggcacc acggtcaccg tctcctcagg cgaaggtact 1140 agtactggtt ctggtggaag tggaggttca ggtggagcag acgacattgt actgacccag 1200 tctccagcaa ctctgtctct gtctccaggg gagcgtgcca ccctgagctg cagagccagt 1260 caaagtgtaa gttacatgaa ctggtaccag cagaagccgg gcaaggcacc caaaagatgg 1320 atttatgaca catccaaagt ggcttctgga gtccctgctc gcttcagtgg cagtgggtct 1380 gggaccgact actctctcac aatcaacagc ttggaggctg aagatgctgc cacttattac 1440 tgccaacagt ggagtagtaa cccgctcacg ttcggtggcg ggaccaaggt ggagatcaaa 1500 tag 1503

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 18

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 500

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial III) Característica:

III.c) Outras informações: A240VL - CEA I VH χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 18

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala 20 25 30

Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 35 40 45

Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60

Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95

Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105 110

Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe 145 150 155 160

Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu 165 170 175

Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu 180 185 190

Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser 195 200 205

Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp 225 230 235 240

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 245 250 255

Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 260 265 270

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg 275 280 285

Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 290 295 300

Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser 305 310 315 320

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala 325 330 335

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 340 345 350

Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 355 360 365

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser 370 375 380

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln 385 390 395 400

Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 405 410 415

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 420 425 430

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala 435 440 445

Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 450 455 460

Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 465 470 475 480

Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 485 490 495

Val Glu Ile Lys 500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 19

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1506

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ CEA I VH - A240 VL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 19

gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360 gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420 ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480 agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540 aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600 agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgg tcgagtcagg aggaggcttg 780 gtacagcctg ggggttctct gagactctcc tgtgcaactt ctgggttcac cttcactgat 840 tactacatga actgggtccg ccagcctcca ggaaaggcac ttgagtggtt gggttttatt 900 ggaaacaaag ctaatggtta cacaacagag tacagtgcat ctgtgaaggg tcggttcacc 960 atctccagag ataaatccca aagcatcctc tatcttcaaa tgaacaccct gagagctgag 1020 gacagtgcca cttattactg taccagagat agggggctac ggttctactt tgactactgg 1080 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc 1140 ggtggtggtg gttctgagct cgtgctgact cagccggctt ccctctctgc atctcctgga 1200 gcatcagcca gtctcacctg caccttgcgc aggggcatca atgttggtgc ctacagtata 1260 tactggtacc agcagaagcc agggagtcct ccccagtatc tcctgaggta caaatcagac 1320 tcagataagc agcagggctc tggagtctcc agccgcttct ctgcatccaa agatgcttcg 1380 gccaatgcag ggattttact catctctggg ctccagtctg aggatgaggc tgactattac 1440 tgtatgattt ggcacagcgg cgcttctgcg gtgttcggcg gagggaccaa gttgaccgtc 1500 ctatag 1506

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 20

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 501

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ CEA I VH - A240 VL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 20

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser

180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 260 265 270

Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln 275 280 285

Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala 290 295 300

Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 305 310 315 320

Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr 325 330 335 Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly 340 345 350

Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 355 360 365

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 370 375 380

Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 385 390 395 400

Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly 405 410 415

Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln 420 425 430

Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly 435 440 445

Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly 450 455 460

Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 465 470 475 480

Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr 485 490 495

Lys Leu Thr Val Leu 500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 21

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1506

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ A240 VL - CEA I VH ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 21

gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120

cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180

gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240

atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300

gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360

gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420

ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480

agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540

aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600

agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660

acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720

gagatcaaat ccggaggtgg tggatcccag gccgtgctga ctcagccggc ttccctctct 780

gcatctcctg gagcatcagc cagtctcacc tgcaccttgc gcaggggcat caatgttggt 840

gcctacagta tatactggta ccagcagaag ccagggagtc ctccccagta tctcctgagg 900

tacaaatcag actcagataa gcagcagggc tctggagtct ccagccgctt ctctgcatcc 960

aaagatgctt cggccaatgc agggatttta ctcatctctg ggctccagtc tgaggatgag 1020

gctgactatt actgtatgat ttggcacagc ggcgcttctg cggtgttcgg cggagggacc 1080

aagttgaccg tcctaggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct 1140

gaggtgcagc tggtcgagtc aggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 1200

tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact gattactaca tgaactgggt ccgccagcct 1260

ccaggaaagg cacttgagtg gttgggtttt attggaaaca aagctaatgg ttacacaaca 1320

gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataaatc ccaaagcatc 1380

ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ctgtaccaga 1440 gatagggggc tacggttcta ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 1500

tcctag 1506

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 22

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 501

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica: III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ A240 VL CEA I VH ; Anticorpo bi-especifico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 22

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser

180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro 245 250 255

Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr

260 265 270

Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln 275 280 285

Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp 290 295 300

Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser 305 310 315 320

Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln 325 330 335

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala

340 345 350

Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 355 360 365

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 370 375 380

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 385 390 395 400

Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp 405 410 415

Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly

420 425 430

Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly 435 440 445

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln 450 455 460 Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg 465 470 475 480

Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 485 490 495

Val Thr Val Ser Ser 500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 23

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1500

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A5 VH - A240 VL χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 23

gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt acctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaagcaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatagg 300 gggctacggt tctactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360 ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctgagctcgt gctgactcag 420 ccggcttccc tctctgcatc tcctggagca tcagccagtc tcacctgcac cttgcgcagg 480 ggcatcaatg ttggtgccta cagtatatac tggtaccagc agaagccagg gagtcctccc 540 cagtatctcc tgaggtacaa atcagactca gataagcagc agggctctgg agtctccagc 600 cgcttctctg catccaaaga tgcttcggcc aatgcaggga ttttactcat ctctgggctc 660 cagtctgagg atgaggctga ctattactgt atgatttggc acagcggcgc ttctgcggtg 720 ttcggcggag ggaccaagtt gaccgtccta tccggaggtg gtggatccga cgtccaactg 780 gtgcagtcag gggctgaagt gaaaaaacct ggggcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggct 840 tctggctaca cctttactag gtacacgatg cactgggtaa ggcaggcacc tggacagggt 900 ctggaatgga ttggatacat taatcctagc cgtggttata ctaattacgc agacagcgtc 960 aagggccgct tcacaatcac tacagacaaa tccaccagca cagcctacat ggaactgagc 1020 agcctgcgtt ctgaggacac tgcaacctat tactgtgcaa gatattatga tgatcattac 1080 tgccttgact actggggcca aggcaccacg gtcaccgtct cctcaggcga aggtactagt 1140 actggttctg gtggaagtgg aggttcaggt ggagcagacg acattgtact gacccagtct 1200 ccagcaactc tgtctctgtc tccaggggag cgtgccaccc tgagctgcag agccagtcaa 1260 agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aagccgggca aggcacccaa aagatggatt 1320 tatgacacat ccaaagtggc ttctggagtc cctgctcgct. tcagtggcag tgggtctggg 1380 accgactact ctctcacaat caacagcttg gaggctgaag atgctgccac ttattactgc 1440 caacagtgga gtagtaaccc gctcacgttc ggtggcggga ccaaggtgga gatcaaatag 1500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 24

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 4 99

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A5 VH - A240 VL χ SEQ ID NO: 77

VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu 130 135 140

Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg 145 150 155 160

Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys 180 185 190

Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala 195 200 205

Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp 210 215 220

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val 225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 260 265 270

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 275 280 285

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 290 295 300

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 305 310 315 320

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 325 330 335

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 340 345 350 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 355 360 365

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 370 375 380

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 385 390 395 400

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 405 410 415

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 420 425 430

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 435 440 445

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 450 455 460

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 465 470 475 480

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 485 490 495

Glu Ile Lys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 25

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1497

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A240 VL - A5 VH χ SEQ ID NO: 77

VHVL ; Anticorpo bi-especifico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 25

caggccgtgc tgactcagcc ggcttccctc tctgcatctc ctggagcatc agccagtctc 60

acctgcacct tgcgcagggg catcaatgtt ggtgcctaca gtatatactg gtaccagcag 120

aagccaggga gtcctcccca gtatctcctg aggtacaaat cagactcaga taagcagcag 180 ggctctggag tctccagccg cttctctgca tccaaagatg cttcggccaa tgcagggatt 240 ttactcatct ctgggctcca gtctgaggat gaggctgact attactgtat gatttggcac 300 agcggcgctt ctgcggtgtt cggcggaggg accaagttga ccgtcctagg tggtggtggt 360 tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctgaggtgc agctggtcga gtctggggga 420 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg attcaccctc 480 agtacctatg ccatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 540 cttatatcaa atgatggaag caataaatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 600 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagctgag 660 gacacggccg tgtattactg tgcgagagat agggggctac ggttctactt tgactactgg 720 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc ggaggtggtg gatccgacgt ccaactggtg 780 cagtcagggg ctgaagtgaa aaaacctggg gcctcagtga aggtgtcctg caaggcttct 840 ggctacacct ttactaggta cacgatgcac tgggtaaggc aggcacctgg acagggtctg 900 gaatggattg gatacattaa tcctagccgt ggttatacta attacgcaga cagcgtcaag 960 ggccgcttca caatcactac agacaaatcc accagcacag cctacatgga actgagcagc 1020 ctgcgttctg aggacactgc aacctattac tgtgcaagat attatgatga tcattactgc 1080 cttgactact ggggccaagg caccacggtc accgtctcct caggcgaagg tactagtact 1140 ggttctggtg gaagtggagg ttcaggtgga gcagacgaca ttgtactgac ccagtctcca 1200 gcaactctgt ctctgtctcc aggggagcgt gccaccctga gctgcagagc cagtcaaagt 1260 gtaagttaca tgaactggta ccagcagaag ccgggcaagg cacccaaaag atggatttat 1320 gacacatcca aagtggcttc tggagtccct gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc 1380 gactactctc tcacaatcaa cagcttggag gctgaagatg ctgccactta ttactgccaa 1440 cagtggagta gtaacccgct cacgttcggt ggcgggacca aggtggagat caaatag 1497

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 26

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 498

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A240 VL - A5 VH χ SEQ ID NO: 77

VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 26

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 10 15

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala 20 25 30

Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 35 40 45

Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60

Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

85 90 95

Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105 110

Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 130 135 140

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 145 150 155 160

Ser Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

165 170 175

Glu Trp Val Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 45 180 185 190

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 245 250 255

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 260 265 270

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr 275 280 285

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 290 295 300

Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 305 310 315 320

Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met

325 330 335

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 340 345 350

Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 355 360 365

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly Gly 370 375 380

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 385 390 395 400

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 405 410 415

Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 420 425 430

Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly 435 440 445

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu 450 455 460

Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 465 470 475 480

Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 485 490 495

Ile Lys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 27

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1500

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ A240 VL - A5 VH ; Anticorpo bi-especifico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ gacgtccaac tggtgcagtc ID NO. aggggctgaa 27 gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360 gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420 ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480 agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540 aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600 agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatcccag gccgtgctga ctcagccggc ttccctctct 780 gcatctcctg gagcatcagc cagtctcacc tgcaccttgc gcaggggcat caatgttggt 840 gcctacagta tatactggta ccagcagaag ccagggagtc ctccccagta tctcctgagg 900 tacaaatcag actcagataa gcagcagggc tctggagtct ccagccgctt ctctgcatcc 960 aaagatgctt cggccaatgc agggatttta ctcatctctg ggctccagtc tgaggatgag 1020 gctgactatt actgtatgat ttggcacagc ggcgcttctg cggtgttcgg cggagggacc 1080 aagttgaccg tcctaggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct 1140 gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 1200 tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt acctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 1260

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaagcaa taaatactat 1320

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 1380

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatagg 1440

gggctacggt tctactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcctag 1500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 28

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 499

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ A240 VL - A5 VH ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 28

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro 245 250 255

Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr 260 265 270

Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln 275 280 285

Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp 290 295 300

Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser 305 310 315 320

Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln 325 330 335

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala 340 345 350

Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 355 360 365

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 370 375 380 Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu 385 390 395 400

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr Ala Met His Trp 405 410 415

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Ser 420 425 430

Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 435 440 445

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 450 455 460

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg 465 470 475 480

Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 485 490 495

Val Ser Ser

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 29

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1500

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ A5 VH - A240 VL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 29

gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360 gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420 ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480 agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540 aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600 agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgg tcgagtctgg gggaggcgtg 780 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cctcagtacc 840 tatgccatgc actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcacttata 900 tcaaatgatg gaagcaataa atactatgca gactccgtga agggccgatt caccatctcc 960 agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg 1020 gccgtgtatt actgtgcgag agataggggg ctacggttct actttgacta ctggggccaa 1080 gggaccacgg tcaccgtctc ctcaggtggt ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt 1140 ggtggttctg agctcgtgct gactcagccg gcttccctct ctgcatctcc tggagcatca 1200 gccagtctca cctgcacctt gcgcaggggc atcaatgttg gtgcctacag tatatactgg 1260 taccagcaga agccagggag tcctccccag tatctcctga ggtacaaatc agactcagat 1320 aagcagcagg gctctggagt ctccagccgc ttctctgcat ccaaagatgc ttcggccaat 1380 gcagggattt tactcatctc tgggctccag tctgaggatg aggctgacta ttactgtatg 1440 atttggcaca gcggcgcttc tgcggtgttc ggcggaggga ccaagttgac cgtcctatag 1500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 30

40 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 4 99 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ A5 VH - A240 VL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 30

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 260 265 270 Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln 275 280 285

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly 290 295 300

Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 305 310 315 320

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 325 330 335

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg 340 345 350

Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 355 360 365

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 370 375 380

Leu Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser 385 390 395 400

Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr 405 410 415

Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu 420 425 430

Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser 435 440 445

Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu 450 455 460

Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met 50 465 470 475 480

Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 485 490 495

Thr Val Leu I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 31

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1506

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: B9 VH - A240 VL χ SEQ ID NO: 77

VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ gaggtgcagc tggtcgagtc ID NO. tgggggaggc 31 ttggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccgtcagt agctactgga tgcactgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtaggtttc attagaaaca aagctaatgg tgggacaaca 180 gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caagaacacg 240 ctgtatcttc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaaga 300 gatagggggc tacggttcta ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tccggtggtg gtggttctga gctcgtgctg 420 actcagccgg cttccctctc tgcatctcct ggagcatcag ccagtctcac ctgcaccttg 480 cgcaggggca tcaatgttgg tgcctacagt atatactggt accagcagaa gccagggagt 540 cctccccagt atctcctgag gtacaaatca gactcagata agcagcaggg ctctggagtc 600 tccagccgct tctctgcatc caaagatgct tcggccaatg cagggatttt actcatctct 660 gggctccagt ctgaggatga ggctgactat tactgtatga tttggcacag cggcgcttct 720 gcggtgttcg gcggagggac caagttgacc gtcctatccg gaggtggtgg atccgacgtc 780 caactggtgc agtcaggggc tgaagtgaaa aaacctgggg cctcagtgaa ggtgtcctgc 840 aaggcttctg gctacacctt tactaggtac acgatgcact gggtaaggca ggcacctgga 900 cagggtctgg aatggattgg atacattaat cctagccgtg gttatactaa ttacgcagac 960 agcgtcaagg gccgcttcac aatcactaca gacaaatcca ccagcacagc ctacatggaa 1020 ctgagcagcc tgcgttctga ggacactgca acctattact gtgcaagata ttatgatgat 1080 cattactgcc ttgactactg gggccaaggc accacggtca ccgtctcctc aggcgaaggt 1140 actagtactg gttctggtgg aagtggaggt tcaggtggag cagacgacat tgtactgacc 1200 cagtctccag caactctgtc tctgtctcca ggggagcgtg ccaccctgag ctgcagagcc 1260 agtcaaagtg taagttacat gaactggtac cagcagaagc cgggcaaggc acccaaaaga 1320 tggatttatg acacatccaa agtggcttct ggagtccctg ctcgcttcag tggcagtggg 1380 tctgggaccg actactctct cacaatcaac agcttggagg ctgaagatgc tgccacttat 1440 tactgccaac agtggagtag taacccgctc acgttcggtg gcgggaccaa ggtggagatc 1500 aaatag 1506

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 32

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 501

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: B9 VH - A240 VL χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60

35 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 40 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Pro Ala 130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu 145 150 155 160 Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln 165 170 175

Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser 180 185 190

Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys 195 200 205

Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser 210 215 220

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser 225 230 235 240

Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly 245 250 255

Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 260 265 270

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 275 280 285

Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu 35 290 295 300

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp 305 310 315 320

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr 325 330 335

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 340 345 350

Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly 355 360 365

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly 370 375 380

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr 385 390 395 400 Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 405 410 415

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln 420 425 430

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val 435 440 445

Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 450 455 460

Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 465 470 475 480

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 485 490 495

Lys Val Glu Ile Lys 500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 33

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1503

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A240 VL - B9 VH χ SEQ ID NO: 77

VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ caggccgtgc tgactcagcc ID NO. ggcttccctc 33 tctgcatctc ctggagcatc agccagtctc 60 acctgcacct tgcgcagggg catcaatgtt ggtgcctaca gtatatactg gtaccagcag 120 aagccaggga gtcctcccca gtatctcctg aggtacaaat cagactcaga taagcagcag 180 ggctctggag tctccagccg cttctctgca tccaaagatg cttcggccaa tgcagggatt 240 ttactcatct ctgggctcca gtctgaggat gaggctgact attactgtat gatttggcac 300 agcggcgctt ctgcggtgtt cggcggaggg accaagttga ccgtcctagg tggtggtggt 360 tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctgaggtgc agctggtcga gtctggggga 420 ggcttggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcgtctgg attcaccgtc 480 agtagctact ggatgcactg ggtccgccaa gctccaggga aggggctgga atgggtaggt 540 ttcattagaa acaaagctaa tggtgggaca acagaatacg ccgcgtctgt gaaaggcaga 600 ttcaccatct caagagatga ttccaagaac acgctgtatc ttcaaatgaa cagcctgaga 660 gccgaggaca cggccgtgta ttactgtgca agagataggg ggctacggtt ctactttgac 720 tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctccggag gtggtggatc cgacgtccaa 780 ctggtgcagt caggggctga agtgaaaaaa cctggggcct cagtgaaggt gtcctgcaag 840 gcttctggct acacctttac taggtacacg atgcactggg taaggcaggc acctggacag 900 ggtctggaat ggattggata cattaatcct agccgtggtt atactaatta cgcagacagc 960 gtcaagggcc gcttcacaat cactacagac aaatccacca gcacagccta catggaactg 1020 agcagcctgc gttctgagga cactgcaacc tattactgtg caagatatta tgatgatcat 1080 tactgccttg actactgggg ccaaggcacc acggtcaccg tctcctcagg cgaaggtact 1140 agtactggtt ctggtggaag tggaggttca ggtggagcag acgacattgt actgacccag 1200 tctccagcaa ctctgtctct gtctccaggg gagcgtgcca ccctgagctg cagagccagt 1260 caaagtgtaa gttacatgaa ctggtaccag cagaagccgg gcaaggcacc caaaagatgg 1320 atttatgaca catccaaagt ggcttctgga gtccctgctc gcttcagtgg cagtgggtct 1380 gggaccgact actctctcac aatcaacagc ttggaggctg aagatgctgc cacttattac 1440 tgccaacagt ggagtagtaa cccgctcacg ttcggtggcg ggaccaaggt ggagatcaaa 1500 tag 1503

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 34

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 500

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A240 VL - B9 VH χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 34

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala 20 25 30

Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 35 40 45 Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60

Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

85 90 95

Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105 110

Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val 145 150 155 160

Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

165 170 175

Glu Trp Val Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu 180 185 190

Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 195 200 205

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp 225 230 235 240

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

245 250 255

Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 260 265 270

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg 275 280 285 Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 290 295 300

Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser 305 310 315 320

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala

325 330 335

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 340 345 350

Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 355 360 365

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser 370 375 380

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln 385 390 395 400

Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser

405 410 415

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 420 425 430

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala 435 440 445

Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 450 455 460

Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 465 470 475 480

Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

485 490 495

Val Glu Ile Lys 55 500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 35

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1506 Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ B9 VH-A240 VL ; Anticorpo bi-especifico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 35

gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360 gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420 ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480 agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540 aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600 agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgg tcgagtctgg gggaggcttg 780 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcgt ctggattcac cgtcagtagc 840 tactggatgc actgggtccg ccaagctcca gggaaggggc tggaatgggt aggtttcatt 900 agaaacaaag ctaatggtgg gacaacagaa tacgccgcgt ctgtgaaagg cagattcacc 960 atctcaagag atgattccaa gaacacgctg tatcttcaaa tgaacagcct gagagccgag 1020 gacacggccg tgtattactg tgcaagagat agggggctac ggttctactt tgactactgg 1080 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc 1140 ggtggtggtg gttctgagct cgtgctgact cagccggctt ccctctctgc atctcctgga 1200 gcatcagcca gtctcacctg caccttgcgc aggggcatca atgttggtgc ctacagtata 1260 tactggtacc agcagaagcc agggagtcct ccccagtatc tcctgaggta caaatcagac 1320 tcagataagc agcagggctc tggagtctcc agccgcttct ctgcatccaa agatgcttcg 1380 gccaatgcag ggattttact catctctggg ctccagtctg aggatgaggc tgactattac 1440 tgtatgattt ggcacagcgg cgcttctgcg gtgttcggcg gagggaccaa gttgaccgtc 1500 ctatag 1506 I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 36

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 501

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ B9 VH - A240 VL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 36

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 260 265 270

Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln 275 280 285

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala 290 295 300

Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 35 305 310 315 320

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 325 330 335

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly 340 345 350

Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 355 360 365

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 370 375 380

Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 385 390 395 400

Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly 405 410 415 Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln 420 425 430

Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly 435 440 445

Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly 450 455 460

Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 465 470 475 480

Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr 485 490 495

Lys Leu Thr Val Leu 500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 37

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1506

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ A240 VL - B9

VH ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 37

gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120

cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180

gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240

atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300

gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360

gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420

ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480

agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540

aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600

agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatcccag gccgtgctga ctcagccggc ttccctctct 780 gcatctcctg gagcatcagc cagtctcacc tgcaccttgc gcaggggcat caatgttggt 840 gcctacagta tatactggta ccagcagaag ccagggagtc ctccccagta tctcctgagg 900 tacaaatcag actcagataa gcagcagggc tctggagtct ccagccgctt ctctgcatcc 960 aaagatgctt cggccaatgc agggatttta ctcatctctg ggctccagtc tgaggatgag 1020 gctgactatt actgtatgat ttggcacagc ggcgcttctg cggtgttcgg cggagggacc 1080 aagttgaccg tcctaggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct 1140 gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc ttggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 1200 tcctgtgcag cgtctggatt caccgtcagt agctactgga tgcactgggt ccgccaagct 1260 ccagggaagg ggctggaatg ggtaggtttc attagaaaca aagctaatgg tgggacaaca 1320 gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caagaacacg 1380 ctgtatcttc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaaga 1440 gatagggggc tacggttcta ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 1500 tcctag 1506

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 38

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 501

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ A240 VL - B9 VH ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 38

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser

180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro 245 250 255

Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr

260 265 270

Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln 275 280 285

Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp 290 295 300 Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser 305 310 315 320

Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln 325 330 335

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala

340 345 350

Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 355 360 365

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 370 375 380

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu 385 390 395 400

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr Trp Met His Trp 405 410 415

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Arg 420 425 430

Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 435 440 445

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 450 455 460

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 465 470 475 480

Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 485 490 495

Val Thr Val Ser Ser 500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 39 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1500

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial III) Característica:

III.c) Outras informações: D8 VH - A240 VL χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ gaggtgcagc tggtcgagtc ID NO. tgggggaggc 39 gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt acctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaagcaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtac tagagatagg 300 gggctacggt tctactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360 ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctgagctcgt gctgactcag 420 ccggcttccc tctctgcatc tcctggagca tcagccagtc tcacctgcac cttgcgcagg 480 ggcatcaatg ttggtgccta cagtatatac tggtaccagc agaagccagg gagtcctccc 540 cagtatctcc tgaggtacaa atcagactca gataagcagc agggctctgg agtctccagc 600 cgcttctctg catccaaaga tgcttcggcc aatgcaggga ttttactcat ctctgggctc 660 cagtctgagg atgaggctga ctattactgt atgatttggc acagcggcgc ttctgcggtg 720 ttcggcggag ggaccaagtt gaccgtccta tccggaggtg gtggatccga cgtccaactg 780 gtgcagtcag gggctgaagt gaaaaaacct ggggcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggct 840 tctggctaca cctttactag gtacacgatg cactgggtaa ggcaggcacc tggacagggt 900 ctggaatgga ttggatacat taatcctagc cgtggttata ctaattacgc agacagcgtc 960 aagggccgct tcacaatcac tacagacaaa tccaccagca cagcctacat ggaactgagc 1020 agcctgcgtt ctgaggacac tgcaacctat tactgtgcaa gatattatga tgatcattac 1080 tgccttgact actggggcca aggcaccacg gtcaccgtct cctcaggcga aggtactagt 1140 actggttctg gtggaagtgg aggttcaggt ggagcagacg acattgtact gacccagtct 1200 ccagcaactc tgtctctgtc tccaggggag cgtgccaccc tgagctgcag agccagtcaa 1260 agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aagccgggca aggcacccaa aagatggatt 1320 tatgacacat ccaaagtggc ttctggagtc cctgctcgct tcagtggcag tgggtctggg 1380 accgactact ctctcacaat caacagcttg gaggctgaag atgctgccac ttattactgc 1440 caacagtgga gtagtaaccc gctcacgttc ggtggcggga ccaaggtgga gatcaaatag 1500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 40

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 4 99 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: D8 VH - A240 VL χ SEQ ID NO: 77

VHVL ; Anticorpo bi-especifico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 40

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr 15 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 35 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu 130 135 140

Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg 145 150 155 160

Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys 180 185 190

Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala 195 200 205 Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp 210 215 220

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val 225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 260 265 270

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 275 280 285

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 290 295 300

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 305 310 315 320

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 325 330 335

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

340 345 350

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 355 360 365

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 370 375 380

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 385 390 395 400

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 405 410 415

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 420 425 430

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 435 440 445

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 450 455 460 Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 465 470 475 480

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 485 490 495

Glu Ile Lys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 41

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1497

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A240 VL - D8 VH χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 41

caggccgtgc tgactcagcc ggcttccctc tctgcatctc ctggagcatc agccagtctc 60 acctgcacct tgcgcagggg catcaatgtt ggtgcctaca gtatatactg gtaccagcag 120 aagccaggga gtcctcccca gtatctcctg aggtacaaat cagactcaga taagcagcag 180 ggctctggag tctccagccg cttctctgca tccaaagatg cttcggccaa tgcagggatt 240 ttactcatct ctgggctcca gtctgaggat gaggctgact attactgtat gatttggcac 300 agcggcgctt ctgcggtgtt cggcggaggg accaagttga ccgtcctagg tggtggtggt 360 tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctgaggtgc agctggtcga gtctggggga 420 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg attcaccctc 480 agtacctatg ccatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 540 cttatatcaa atgatggaag caataaatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 600 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagctgag 660 gacacggctg tgtattactg tactagagat agggggctac ggttctactt tgactactgg 720 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc ggaggtggtg gatccgacgt ccaactggtg 780 cagtcagggg ctgaagtgaa aaaacctggg gcctcagtga aggtgtcctg caaggcttct 840 ggctacacct ttactaggta cacgatgcac tgggtaaggc aggcacctgg acagggtctg 900 gaatggattg gatacattaa tcctagccgt ggttatacta attacgcaga cagcgtcaag 960 ggccgcttca caatcactac agacaaatcc accagcacag cctacatgga actgagcagc 1020 ctgcgttctg aggacactgc aacctattac tgtgcaagat attatgatga tcattactgc 1080 cttgactact ggggccaagg caccacggtc accgtctcct caggcgaagg tactagtact 1140 ggttctggtg gaagtggagg ttcaggtgga gcagacgaca ttgtactgac ccagtctcca 1200 gcaactctgt ctctgtctcc aggggagcgt gccaccctga gctgcagagc cagtcaaagt 1260 gtaagttaca tgaactggta ccagcagaag ccgggcaagg cacccaaaag atggatttat 1320 gacacatcca aagtggcttc tggagtccct gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc 1380 gactactctc tcacaatcaa cagcttggag gctgaagatg ctgccactta ttactgccaa 1440 cagtggagta gtaacccgct cacgttcggt ggcgggacca aggtggagat caaatag 1497

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 42

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 498

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A240 VL -D8 VH χ SEQ ID NO: 77

VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 42

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 10 15

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala 20 25 30

Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 35 40 45

Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60

Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105 110

Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 130 135 140

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 145 150 155 160

Ser Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175

Glu Trp Val Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 180 185 190

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220

Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 245 250 255

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 260 265 270

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr 275 280 285

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 290 295 300

Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 305 310 315 320

Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 325 330 335 Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 340 345 350

Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 355 360 365

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly Gly 370 375 380

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 385 390 395 400

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 405 410 415

Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 420 425 430

Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly 435 440 445

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu 450 455 460

Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 465 470 475 480

Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 485 490 495

Ile Lys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 43

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1500

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ D8 VH - A240

VL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 43

gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360 gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420 ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480 agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540 aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600 agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgg tcgagtctgg gggaggcgtg 780 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cctcagtacc 840 tatgccatgc actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcacttata 900 tcaaatgatg gaagcaataa atactatgca gactccgtga agggccgatt caccatctcc 960 agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg 1020 gctgtgtatt actgtactag agataggggg ctacggttct actttgacta ctggggccaa 1080 gggaccacgg tcaccgtctc ctcaggtggt ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt 1140 ggtggttctg agctcgtgct gactcagccg gcttccctct ctgcatctcc tggagcatca 1200 gccagtctca cctgcacctt gcgcaggggc atcaatgttg gtgcctacag tatatactgg 1260 taccagcaga agccagggag tcctccccag tatctcctga ggtacaaatc agactcagat 1320 aagcagcagg gctctggagt ctccagccgc ttctctgcat ccaaagatgc ttcggccaat 1380 gcagggattt tactcatctc tgggctccag tctgaggatg aggctgacta ttactgtatg 1440 atttggcaca gcggcgcttc tgcggtgttc ggcggaggga ccaagttgac cgtcctatag 1500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 44

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 4 99

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ D8 VH - A240

VL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples IV) Seqüência: SEQ ID NO. 44

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 260 265 270

Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln 275 280 285

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly 290 295 300

Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 305 310 315 320

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 325 330 335

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg 340 345 350

Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 355 360 365

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 370 375 380

Leu Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser 385 390 395 400

Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr 405 410 415

Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu 420 425 430

Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser 435 440 445

Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu 450 455 460

Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met 465 470 475 480

Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 485 490 495

Thr Val Leu

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 45

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1500 II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ A240 VL - D8 VH ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ gacgtccaac tggtgcagtc ID NO. aggggctgaa 45 gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360 gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420 ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480 agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540 aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600 agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatcccag gccgtgctga ctcagccggc ttccctctct 780 gcatctcctg gagcatcagc cagtctcacc tgcaccttgc gcaggggcat caatgttggt 840 gcctacagta tatactggta ccagcagaag ccagggagtc ctccccagta tctcctgagg 900 tacaaatcag actcagataa gcagcagggc tctggagtct ccagccgctt ctctgcatcc 960 aaagatgctt cggccaatgc agggatttta ctcatctctg ggctccagtc tgaggatgag 1020 gctgactatt actgtatgat ttggcacagc ggcgcttctg cggtgttcgg cggagggacc 1080 aagttgaccg tcctaggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct 1140 gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 1200 tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt acctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 1260 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaagcaa taaatactat 1320 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 1380 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtac tagagatagg 1440 gggctacggt tctactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcctag 1500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 46

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 4 99

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ A240 VL - D8

VH ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 46

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro 245 250 255

Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr 260 265 270

Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln 275 280 285

Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp 290 295 300

Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser 305 310 315 320

Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln 325 330 335

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala 340 345 350

Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 370 375 380

Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu 385 390 395 400

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr Ala Met His Trp 405 410 415

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Ser 420 425 430

Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 435 440 445

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 450 455 460

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg 465 470 475 480

Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 485 490 495

Val Ser Ser

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 47

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 75 6

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A5B7 VH - A240 VL ; Fv Cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 47 gaggtgcagc tggtcgagtc aggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact gattactaca tgaactgggt ccgccagcct 120 ccaggaaagg cacttgagtg gttgggtttt attggaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataaatc ccaaagcatc 240 I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 48

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 252

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A5B7 VH - A240 VL ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ctgtaccaga gatagggggc tacggttcta ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tccggtggtg gtggttctca ggccgtgctg actcagccgg cttccctctc tgcatctcct ggagcatcag ccagtctcac ctgcaccttg cgcaggggca tcaatgttgg tgcctacagt atatactggt accagcagaa gccagggagt cctccccagt atctcctgag gtacaaatca gactcagata agcagcaggg ctctggagtc tccagccgct tctctgcatc caaagatgct tcggccaatg cagggatttt actcatctct gggctccagt ctgaggatga ggctgactat tactgtatga tttggcacag cggcgcttct gcggtgttcg gcggagggac caagttgacc gtccta Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala 130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu 145 150 155 160

Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser 180 185 190

Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys 195 200 205

Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser 210 215 220

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser 225 230 235 240

Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245 250

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 49

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 753

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A5 VH - A240 VL ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 49 gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt acctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaagcaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatagg 300 gggctacggt tctactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360 ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctcaggccgt gctgactcag 420 ccggcttccc tctctgcatc tcctggagca tcagccagtc tcacctgcac cttgcgcagg 480 ggcatcaatg ttggtgccta cagtatatac tggtaccagc agaagccagg gagtcctccc 540 cagtatctcc tgaggtacaa atcagactca gataagcagc agggctctgg agtctccagc 600 cgcttctctg catccaaaga tgcttcggcc aatgcaggga ttttactcat ctctgggctc 660 cagtctgagg atgaggctga ctattactgt atgatttggc acagcggcgc ttctgcggtg 720 ttcggcggag ggaccaagtt gaccgtccta tag 753

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 50

II.a) tamanho: 250

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A5 VH - A240 VL ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 50

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100

105

110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu 130 135 140

Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg 145 150 155 160

Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys

180 185 190

Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala 195 200 205

Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp 210 215 220

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val 225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245 250

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 51

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 759

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: B9 VH - A240 VL ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 51

gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc ttggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccgtcagt agctactgga tgcactgggt ccgccaagct 120

ccagggaagg ggctggaatg ggtaggtttc attagaaaca aagctaatgg tgggacaaca 180 gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caagaacacg 240 ctgtatcttc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaaga 300 gatagggggc tacggttcta ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tccggtggtg gtggttctca ggccgtgctg 420 actcagccgg cttccctctc tgcatctcct ggagcatcag ccagtctcac ctgcaccttg 480 cgcaggggca tcaatgttgg tgcctacagt atatactggt accagcagaa gccagggagt 540 cctccccagt atctcctgag gtacaaatca gactcagata agcagcaggg ctctggagtc 600 tccagccgct tctctgcatc caaagatgct tcggccaatg cagggatttt actcatctct 660 gggctccagt ctgaggatga ggctgactat tactgtatga tttggcacag cggcgcttct 720 gcggtgttcg gcggagggac caagttgacc gtcctatag 759

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 52 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 252

II.b) tipo: PRT

II. c) orqanismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: B9 VH - A240VL ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 52

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

10 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala 130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu 15 145 150 155 160

Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln 165 170 175

Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser 180 185 190

Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys 195 200 205

Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser 210 215 220

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser 225 230 235 240

Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245 250

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 53

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 753

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: D8 VH - A240VL ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 53

gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt acctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaagcaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtac tagagatagg 300 gggctacggt tctactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360 ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctcaggccgt gctgactcag 420 ccggcttccc tctctgcatc tcctggagca tcagccagtc tcacctgcac cttgcgcagg 480 ggcatcaatg ttggtgccta cagtatatac tggtaccagc agaagccagg gagtcctccc 540 cagtatctcc tgaggtacaa atcagactca gataagcagc agggctctgg agtctccagc 600 cgcttctctg catccaaaga tgcttcggcc aatgcaggga ttttactcat ctctgggctc 660 cagtctgagg atgaggctga ctattactgt atgatttggc acagcggcgc ttctgcggtg 720 ttcggcggag ggaccaagtt gaccgtccta tag 753

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 54

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 250

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: D8 VH - A240VL ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 54

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu 130 135 140

Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg 145 150 155 160

Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys

180 185 190

Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala 195 200 205

Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp 210 215 220

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val 225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245 250

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 55

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 363

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Mus musculus

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A5B7 VH ; Região VH

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 55

gaggtgcagc tggtcgagtc aggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact gattactaca tgaactgggt ccgccagcct 120 ccaggaaagg cacttgagtg gttgggtttt attggaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataaatc ccaaagcatc 240 ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ctgtaccaga 300 gatagggggc tacggttcta ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 56

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 121

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Mus musculus

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A5B7 VH ; Região VH

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 56

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 57

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 357

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A5 VH ; Região VH

IV) Seqüência: SEQ gaggtgcagc tggtcgagtc ID NO. tgggggaggc 57 gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt acctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaagcaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatagg 300 gggctacggt tctactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 58

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 119

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A5 VH ; Região VH

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 58

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 59

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 363

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: B9 VH ; Região VH

IV) Seqüência: SEQ gaggtgcagc tggtcgagtc ID NO. tgggggaggc 59 ttggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccgtcagt agctactgga tgcactgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtaggtttc attagaaaca aagctaatgg tgggacaaca 180 gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caagaacacg 240 ctgtatcttc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaaga 300 gatagggggc tacggttcta ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 60

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 121

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: B9 VH ; Região VH

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 60

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 61

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 357

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: D8 VH ; Região VH

IV) Seqüência: SEQ gaggtgcagc tggtcgagtc ID NO. tgggggaggc 61 gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt acctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaagcaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtac tagagatagg 300 gggctacggt tctactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 62

II) Características da seqüência: II.a) tamanho: 119 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: D8 VH ; Região VH

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 62

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 25 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 63

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 348

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A240 VL ; Região VL

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 63

caggccgtgc tgactcagcc ggcttccctc tctgcatctc ctggagcatc agccagtctc 60 acctgcacct tgcgcagggg catcaatgtt ggtgcctaca gtatatactg gtaccagcag 120 aagccaggga gtcctcccca gtatctcctg aggtacaaat cagactcaga taagcagcag 180 ggctctggag tctccagccg cttctctgca tccaaagatg cttcggccaa tgcagggatt 240 ttactcatct ctgggctcca gtctgaggat gaggctgact attactgtat gatttggcac 300 agcggcgctt ctgcggtgtt cggcggaggg accaagttga ccgtccta 348

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 64 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 116

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A240VL ; Região VL IV) Seqüência: SEQ ID NO. 64

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala

20 25 30

Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 35 40 45

Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60

Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95

Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

100 105 110

Leu Thr Val Leu 55 115

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 65 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 10

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Mus musculus

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CDR-H3* A5B7 CDR-3 mais curto de VH de A5B7 com D correspondendo à posição de Kabat 95;

posições de Kabat 100, 100a, 100b, 101, 102 correspondem a FYFDY, respectivamente

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: com "XI", "X2", "X3" e "X4" correspondentes às posições de Kabat 96 ("XI"), 97 ("X2"), 98 ("X3") and 99 ("X4"), respectivamente, de CDR-H3 de anticorpo monoclonal murino A5B7 e caracterizado pelo fato de que "X" representa qualquer resíduo de aminoácido. "XI" é preferencialmente "R"

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.b) Localização: (2).. (5)

III.c) Outras informações: Xaa pode ser qualquer aminoácido naturalmente ocorrente

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 65

Asp Xaal Xaa2 Xaa3 Xaa4 Phe Tyr Phe Asp Tyr 15 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 66 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 10 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Mus musculus

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CDR-H3 A5B7 CDR-3 de VH de A5B7 corresponente às posições de Kabat 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 100b, 101, 102

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 66

Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 15 10 I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 67

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 19

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CDR-H2 B9 ; CDR-2 de VH B9

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 67

Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser 1 5 10 15

Val Lys Gly

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 68

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 5

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CDR-Hl B9 ; CDRl de VH B9

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 68

Ser Tyr Trp Met His 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 69

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 17

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CDR-H2 A5/D8 ; CDR-2 de VH A5/D8

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 69 Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 70

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 5

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CDR-Hl A5/D8 ; CDR-I de VH A5/D8

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 70

Thr Tyr Ala Met His

1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 71

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 10

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CDR-L3 A240 ; CDR-3 de VL A240

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 71

Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val 1 5 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 72

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 11

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CDR-L2 A240 ; CDR-2 de VL A240 IV) Seqüência: SEQ ID NO. 72

Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser 1 5 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 73

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 14

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CDR-Ll A240 ; CDR-I de VL A240

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 73

Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr 1 5 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 74

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 32

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 5' CEACAM5 EcoRI ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 74 gaattcgcca ccatggagtc tccctcggcc cc 32

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 75

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 2 4

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 3' CEACAM5 SaII ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 75 gtcgacctat atcagagcaa cccc 24

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 76 II) Características da seqüência: II.a) tamanho: 702

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CEACAM5 (NM_004363) ; proteína

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 76

Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln 15 10 15

Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr 20 25 30

Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly 35 40 45

Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly 50 55 60

Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile 65 70 75 80

Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser 85 90 95

Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile 100 105 110

Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp 115 120 125

Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu 130 135 140

Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys 145 150 155 160

Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr 165 170 175

Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln 180 185 190 Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn 195 200 205

Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg 210 215 220

Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro 225 230 235 240

Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn 245 250 255

Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe 260 265 270

Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn 275 280 285

Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser 290 295 300

Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala 305 310 315 320

Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu 325 330 335

Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr 340 345 350

Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg 355 360 365

Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr 370 375 380

Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser 385 390 395 400

Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp 405 410 415

Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn 420 425 430 Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser 435 440 445

Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile 450 455 460

Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn 465 470 475 480

Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val 485 490 495

Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro 500 505 510

Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln 515 520 525

Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser 530 535 540

Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn 545 550 555 560

Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser 35 565 570 575

Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly 580 585 590

Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly 595 600 605

Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln 610 615 620

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu 625 630 635 640

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe 645 650 655

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile 660 665 670 Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr 675 680 685

Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile 690 695 700

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 77

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 24 3

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: anti-CD3 VHVL deimunizado Fv cadeia simples como descrito em W02005/040220

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 77

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145

150

155

160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 78

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 38

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 51-huVKl-SacI-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 78

gagccgcacg agcccgagct ccagatgacc cagtctcc 38

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 79

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 38

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 51-huVK2/4-SacI-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 79

gagccgcacg agcccgagct cgtgatgacy cagtctcc 38

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 80 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 38

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 51-huVK3-SacI-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 80

gagccgcacg agcccgagct cgtgwtgacr cagtctcc 38

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 81

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 38

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 5'-huVK5-SacI-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 81

gagccgcacg agcccgagct cacactcacg cagtctcc 38

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 82

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 38

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: SEQÜÊNCIA ARTIFICIAL

III) Característica:

III.c) Outras informações: 51-huVK6-SacI-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 82

gagccgcacg agcccgagct cgtgctgact cagtctcc 38

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 83

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 4 7

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 31-hu-Vk-Jl-Spel-BsiWI ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 83 gacgacacta gttgcagcca ccgtacgttt gatttccacc ttggtcc 47

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 84

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 47

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 31-hu-Vk-J2/4-SpeI-Bsi/WI ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 84 gacgacacta gttgcagcca ccgtacgttt gatctccasc ttggtcc 47

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 85

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 47

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 31-hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 85 gacgacacta gttgcagcca ccgtacgttt gatatccact ttggtcc 47

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 86

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 47

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 3'-hu-Vk-J5-SpeI-BsiWI ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 86 gacgacacta gttgcagcca ccgtacgttt aatctccagt cgtgtcc 47

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 87

II.a) tamanho: 41

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica: III.c) Outras informações: 5'-huVLla-SacI-2001 ; oligonucleotideo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 87 gagccgcacg agcccgagct cgtgttgacg cagccgccct c 41

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 88

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 41

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 51-huVLlb-SacI-2001 ; oligonucleotideo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 88 gagccgcacg agcccgagct cgtgctgact cagccaccct c 41

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 89

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 4 4

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 5'-huVL2-SacI-2001 ; oligonucleotideo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 89 gagccgcagg agcccgagct cgccctgact cagcctscct ccgt 44

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 90

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 35

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 51-huVL4-SacI-2001 ; oligonucleotideo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 90 acctgcgagc tcgtgctgac tcarycmycc tctgc 35

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 91

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 33 Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 51-huVL5-SacI-2001 ; oligonucleotideo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 91

acctgcgagc tcgtgctgac tcagccrsct tcc 33

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 92

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 32

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 51-huVL6-SacI-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 92 acctgcgagc tcatgctgac tcagccccac tc 32

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 93

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 41

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 5 *-huVL3/9-SacI-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 93 gagccgcacg agcccgagct cgwgctgact cagccaccyt c 41

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 94

II) Características da seqüência: II.a) tamanho: 41

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 51-huVL7/8-SacI-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 94

gagccgcacg agcccgagct cgtggtgacy caggagccmt c 41 I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 95

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 33

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 3'-hu-VIam-BInI-SpeI-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 95

cgtgggacta gtcttgggct gacctaggac ggt 33

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 96

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 33

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 3'-hu-Vlam2-BInI-SpeI-2002 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 96 cgtgggacta gtcttgggct gaccgaggac ggt 33

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 97

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 31

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 51-primer 51-AVH-XhoI ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 97 gtcacactcg agtcaggagg aggcttggta c 31

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 98

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 31 Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 31-primer 31-AVH-BstEII ; oligonucleotídeo IV) Seqüência: SEQ ID NO. 98

gtcacaggtg accgtggtcc cttggcccca g 31

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 99

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 10

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: marca Flag tag

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 99

Thr Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 100

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 22

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 5'-huVHl,3,5-XhoI-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 100

aggtgcagct gctcgagtct gg 22

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 101

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 23

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 5'-huVH4-XhoI-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 101

caggtgcagc tgctcgagtc ggg 23

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 102

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 23

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial III) Característica:

III.c) Outras informações: 51-huVH4B-XhoI-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 102 caggtgcagc tactcgagtg ggg 23

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 103

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 17

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 3'-hu-VH-BstEII-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 103 ctgaggagac ggtgacc 17

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 104

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 17

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 31-hu-VH-J3-BstEII-2001 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 104 ctgaagagac ggtgacc 17

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 105

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 51

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 3'-A134-VHlA ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 105 gtagtcaaag tagaaccgta gccccctatc tctygcacag taatacacgg c 51

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 106

II) Características da seqüência: 111/151

II.a) tamanho: 51 Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 3'-A134-VHlB ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 106 gtagtcaaag tagaaccgta gccccctatc tctygcacag taatacayrg c 51

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 107

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 51

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 3'-A134-VH3A ; oligonucleotídeo

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: variation

III.b) Localização: (34)..(34)

III.c) Outras informações: /substituir = "a"

/substituir = "c"

/substituir = "g"

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 107 gtagtcaaag tagaaccgta gccccctatc tcttgyacag taatacacrg c 51

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 108

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 51

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 3' -A134-VH3B ; oligonucleotídeo

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: variação

III.b) Localização: (34)..(34)

III.c) Outras informações: /substituir = "a" /substituir = "c"

/substituir = "g"

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 108

gtagtcaaag tagaaccgta gccccctatc tcttgcacag taatacaarg c 51

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 109

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 51

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 3'-A134-VH4 ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 109 gtagtcaaag tagaaccgta gccccctatc tctsgcacag taatacacrg c 51

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 110

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 53

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 3' A134-JH6-BstEII ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 110

cgagacggtg accgtggtcc cttggcccca gtagtcaaag tagaaccgta gcc 53

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 111

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 207

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CD3 epsilon (NM_000733) ; proteína

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 111

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met 115 120 125

Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu 130 135 140

Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 145 150 155 160

Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 165 170 175

Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 200 205

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 112

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 5

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Mus musculus

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto III.c) Outras informações: DR-H3 A5B7 CDR-3 mais curto de VH de A5B7 correspondente às posições de Kabat 96, 97, 98, 99, 10GJ, 100a, 100b, 101, 102

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 112

Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 113

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 6

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Mus musculus

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto III.c) Outras informações: DR-H3 A5B7 CDR-3 mais curto de VH de A5B7 correspondente às posições de Kabat 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 100b, 101, 102

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 113

Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 114

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 7

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Mus musculus

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: DR-H3 A5B7 CDR-3 mais curto de VH de A5B7 correspondente às posições de Kabat 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 100b, 101, 102

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 114

Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 115

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 8

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Mus musculus III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: DR-H3 A5B7 CDR-3 mais curto de VH de A5B7 correspondente às posições de Kabat 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 100b, 101, 102

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 115

Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 116

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 9

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Mus musculus

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: DR-H3 A5B7 CDR-3 mais curto de VH de A5B7 correspondente às posições de Kabat 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 100b, 101, 102

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 116

Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 117

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 7 59

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A240 VL -A5B7 VH ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 117 caggccgtgc tgactcagcc ggcttccctc tctgcatctc ctggagcatc agccagtctc 60 acctgcacct tgcgcagggg catcaatgtt ggtgcctaca gtatatactg gtaccagcag 120 aagccaggga gtcctcccca gtatctcctg aggtacaaat cagactcaga taagcagcag 180 ggctctggag tctccagccg cttctctgca tccaaagatg cttcggccaa tgcagggatt 240 ttactcatct ctgggctcca gtctgaggat gaggctgact attactgtat gatttggcac 300 agcggcgctt ctgcggtgtt cggcggaggg accaagttga ccgtcctagg tggtggtggt 360 tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctgaggtgc agctggtcga gtcaggagga 420 ggcttggtac agcctggggg ttctctgaga ctctcctgtg caacttctgg gttcaccttc 480 actgattact acatgaactg ggtccgccag cctccaggaa aggcacttga gtggttgggt 540 tttattggaa acaaagctaa tggttacaca acagagtaca gtgcatctgt gaagggtcgg 600 ttcaccatct ccagagataa atcccaaagc atcctctatc ttcaaatgaa caccctgaga 660 gctgaggaca gtgccactta ttactgtacc agagataggg ggctacggtt ctactttgac 720 tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcctga 759

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 118

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 252

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A240 VL -A5B7 VH ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 118

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala 20 25 30

Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 35 40 45

Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60

Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 45 65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95

Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105 110

Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe 145 150 155 160

Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu

165 170 175

Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu 180 185 190

Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser 195 200 205

Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser 210 215 220

Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp 225 230 235 240

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

245 250

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 119

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 753

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A240VL -A5 VH ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ caggccgtgc tgactcagcc ID NO. ggcttccctc 119 tctgcatctc ctggagcatc agccagtctc 60 acctgcacct tgcgcagggg catcaatgtt ggtgcctaca gtatatactg gtaccagcag 120 aagccaggga gtcctcccca gtatctcctg aggtacaaat cagactcaga taagcagcag 180 ggctctggag tctccagccg cttctctgca tccaaagatg cttcggccaa tgcagggatt 240 ttactcatct ctgggctcca gtctgaggat gaggctgact attactgtat gatttggcac 300 agcggcgctt ctgcggtgtt cggcggaggg accaagttga ccgtcctagg tggtggtggt 360 tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctgaggtgc agctggtcga gtctggggga 420 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg attcaccctc 480 agtacctatg ccatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 540 cttatatcaa atgatggaag caataaatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 600 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagctgag 660 gacacggccg tgtattactg tgcgagagat agggggctac ggttctactt tgactactgg 720 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc tga 753

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 120

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 250

II.b) tipo: PRT II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A240VL -A5 VH ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 120

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala 20 25 30

Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 35 40 45

4 0 Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60

Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 45 65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95

Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105 110

Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 130 135 140

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 145 150 155 160

Ser Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175

Glu Trp Val Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 180 185 190

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

245 250

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 121 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 759

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A240VL- B9 VH ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ caggccgtgc tgactcagcc ID NO. ggcttccctc 121 tctgcatctc ctggagcatc agccagtctc 60 acctgcacct tgcgcagggg catcaatgtt ggtgcctaca gtatatactg gtaccagcag 120 aagccaggga gtcctcccca gtatctcctg aggtacaaat cagactcaga taagcagcag 180 ggctctggag tctccagccg cttctctgca tccaaagatg cttcggccaa tgcagggatt 240 ttactcatct ctgggctcca gtctgaggat gaggctgact attactgtat gatttggcac 300 agcggcgctt ctgcggtgtt cggcggaggg accaagttga ccgtcctagg tggtggtggt 360 tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctgaggtgc agctggtcga gtctggggga 420 ggcttggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcgtctgg attcaccgtc 480 agtagctact ggatgcactg ggtccgccaa gctccaggga aggggctgga atgggtaggt 540 ttcattagaa acaaagctaa tggtgggaca acagaatacg ccgcgtctgt gaaaggcaga 600 ttcaccatct caagagatga ttccaagaac acgctgtatc ttcaaatgaa cagcctgaga 660 gccgaggaca cggccgtgta ttactgtgca agagataggg ggctacggtt ctactttgac 720 tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcctga 759

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 122

II) Características da seqüência: II.a) tamanho: 252

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A240VL- B9 VH ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 122

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala 20 25 30

Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 35 40 45

Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60

Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 50 85 90 95

Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105 110

Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val 145 150 155 160

Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175

Glu Trp Val Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu

180 185 190

Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 195 200 205

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp 225 230 235 240

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 123

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 753

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: A240VL -D8 VH ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 123

caggccgtgc tgactcagcc ggcttccctc tctgcatctc ctggagcatc agccagtctc 60 acctgcacct tgcgcagggg catcaatgtt ggtgcctaca gtatatactg gtaccagcag 120 aagccaggga gtcctcccca gtatctcctg aggtacaaat cagactcaga taagcagcag 180 ggctctggag tctccagccg cttctctgca tccaaagatg cttcggccaa tgcagggatt 240 ttactcatct ctgggctcca gtctgaggat gaggctgact attactgtat gatttggcac 300 agcggcgctt ctgcggtgtt cggcggaggg accaagttga ccgtcctagg tggtggtggt 360 tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctgaggtgc agctggtcga gtctggggga 420 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg attcaccctc 480 agtacctatg ccatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca 540 cttatatcaa atgatggaag caataaatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 600 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagctgag 660 gacacggctg tgtattactg tactagagat agggggctac ggttctactt tgactactgg 720 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc tga 753

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 124 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 250 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto III.c) Outras informações: A240VL -D8 VH ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 124

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala 20 25 30

Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 35 40 45

Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60

Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 50 85 90 95

Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105 110

Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 130 135 140

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu 145 150 155 160

Ser Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175

Glu Trp Val Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala

180 185 190

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220

Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 125

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1500

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A5 VH - A240 VL# χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ gaggtgcagc tggtcgagtc ID NO. tgggggaggc 125 gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt acctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaagcaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatagg 300 gggctacggt tctactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360 ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctcaggccgt gctgactcag 420 ccggcttccc tctctgcatc tcctggagca tcagccagtc tcacctgcac cttgcgcagg 480 ggcatcaatg ttggtgccta cagtatatac tggtaccagc agaagccagg gagtcctccc 540 cagtatctcc tgaggtacaa atcagactca gataagcagc agggctctgg agtctccagc 600 cgcttctctg catccaaaga tgcttcggcc aatgcaggga ttttactcat ctctgggctc 660 cagtctgagg atgaggctga ctattactgt atgatttggc acagcggcgc ttctgcggtg 720 ttcggcggag ggaccaagtt gaccgtccta tccggaggtg gtggatccga cgtccaactg 780 gtgcagtcag gggctgaagt gaaaaaacct ggggcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggct 840 tctggctaca cctttactag gtacacgatg cactgggtaa ggcaggcacc tggacagggt 900 ctggaatgga ttggatacat taatcctagc cgtggttata ctaattacgc agacagcgtc 960 aagggccgct tcacaatcac tacagacaaa tccaccagca cagcctacat ggaactgagc 1020 agcctgcgtt ctgaggacac tgcaacctat tactgtgcaa gatattatga tgatcattac 1080 tgccttgact actggggcca aggcaccacg gtcaccgtct cctcaggcga aggtactagt 1140 actggttctg gtggaagtgg aggttcaggt ggagcagacg acattgtact gacccagtct 1200 ccagcaactc tgtctctgtc tccaggggag cgtgccaccc tgagctgcag agccagtcaa 1260 agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aagccgggca aggcacccaa aagatggatt 1320 tatgacacat ccaaagtggc ttctggagtc cctgctcgct tcagtggcag tgggtctggg 1380 accgactact ctctcacaat caacagcttg gaggctgaag atgctgccac ttattactgc 1440 caacagtgga gtagtaaccc gctcacgttc ggtggcggga ccaaggtgga gatcaaatag 1500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 126

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 4 99

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: A5 VH - A240 VL# χ SEQ ID NO: 77

VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 126

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu 130 135 140

Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg 145 150 155 160

Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys 180 185 190

Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala 195 200 205

Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp 210 215 220

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val 225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 60 260 265 270 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 275 280 285

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 290 295 300

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 305 310 315 320

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

325 330 335

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 340 345 350

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 355 360 365

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 370 375 380

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 385 390 395 400

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 405 410 415

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 420 425 430

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 435 440 445

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 450 455 460

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 465 470 475 480

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 485 490 495

Glu Ile Lys I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 127

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1500

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ A5 VH - A240 VL# ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 127

gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120

cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180

gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240

atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300

gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360

gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420

ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480

agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540

aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600

agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660

acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720

gagatcaaat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgg tcgagtctgg gggaggcgtg 780

gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cctcagtacc 840

tatgccatgc actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcacttata 900

tcaaatgatg gaagcaataa atactatgca gactccgtga agggccgatt caccatctcc 960

agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg 1020

gccgtgtatt actgtgcgag agataggggg ctacggttct actttgacta ctggggccaa 1080

gggaccacgg tcaccgtctc ctcaggtggt ggtggttctg gcggoggcgg ctccggtggt 1140

ggtggttctc aggccgtgct gactcagccg gcttccctct ctgcatctcc tggagcatca 1200

gccagtctca cctgcacctt gcgcaggggc atcaatgttg gtgcctacag tatatactgg 1260

taccagcaga agccagggag tcctccccag tatctcctga ggtacaaatc agactcagat 1320

aagcagcagg gctctggagt ctccagccgc ttctctgcat ccaaagatgc ttcggccaat 1380 gcagggattt tactcatctc tgggctccag tctgaggatg aggctgacta ttactgtatg 1440 atttggcaca gcggcgcttc tgcggtgttc ggcggaggga ccaagttgac cgtcctatag 1500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 128

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 499

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ A5 VH - A240 VL# ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 128

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

35 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

260 265 270

Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln 275 280 285

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly 290 295 300

Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 305 310 315 320

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 325 330 335

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg

340 345 350

Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 355 360 365

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 370 375 380

Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser 385 390 395 400 Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr 405 410 415

Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu 420 425 430

Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser 435 440 445

Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu 450 455 460

Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met 465 470 475 480

Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 485 490 495

Thr Val Leu

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 129

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1506

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: B9 VH -A240 VL# χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-especifico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ gaggtgcagc tggtcgagtc ID NO. tgggggaggc 129 ttggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccgtcagt agctactgga tgcactgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtaggtttc attagaaaca aagctaatgg tgggacaaca 180 gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caagaacacg 240 ctgtatcttc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaaga 300 gatagggggc tacggttcta ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tccggtggtg gtggttctca ggccgtgctg 420 actcagccgg CttCCCtCtC tgcatctcct ggagcatcag ccagtctcac ctgcaccttg 480 cgcaggggca tcaatgttgg tgcctacagt atatactggt accagcagaa gccagggagt 540 cctccccagt atctcctgag gtacaaatca gactcagata agcagcaggg ctctggagtc 600 tccagccgct tctctgcatc caaagatgct tcggccaatg cagggatttt actcatctct 660 gggctccagt ctgaggatga ggctgactat tactgtatga tttggcacag cggcgcttct 720 gcggtgttcg gcggagggac caagttgacc gtcctatccg gaggtggtgg atccgacgtc 780 caactggtgc agtcaggggc tgaagtgaaa aaacctgggg cctcagtgaa ggtgtcctgc 840 aaggcttctg gctacacctt tactaggtac acgatgcact gggtaaggca ggcacctgga 900 cagggtctgg aatggattgg atacattaat cctagccgtg gttatactaa ttacgcagac 960 agcgtcaagg gccgcttcac aatcactaca gacaaatcca ccagcacagc ctacatggaa 1020 ctgagcagcc tgcgttctga ggacactgca acctattact gtgcaagata ttatgatgat 1080 cattactgcc ttgactactg gggccaaggc accacggtca ccgtctcctc aggcgaaggt 1140 actagtactg gttctggtgg aagtggaggt tcaggtggag cagacgacat tgtactgacc 1200 cagtctccag caactctgtc tctgtctcca ggggagcgtg ccaccctgag ctgcagagcc 1260 agtcaaagtg taagttacat gaactggtac cagcagaagc cgggcaaggc acccaaaaga 1320 tggatttatg acacatccaa agtggcttct ggagtccctg ctcgcttcag tggcagtggg 1380 tctgggaccg actactctct cacaatcaac agcttggagg ctgaagatgc tgccacttat 1440 tactgccaac agtggagtag taacccgctc acgttcggtg gcgggaccaa ggtggagatc 1500 aaatag 1506

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 130

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 501

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: B9 VH -A240 VL# χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 130

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala 130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu 145 150 155 160

Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln 165 170 175

Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser 180 185 190

Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys 195 200 205

Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser 210 215 220

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser 225 230 235 240

Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 260 265 270

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 275 280 285 Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu 290 295 300

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp 305 310 315 320

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr

325 330 335

Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 340 345 350

Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly 355 360 365

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly 370 375 380

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr 385 390 395 400

Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu

405 410 415

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln 420 425 430

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val 435 440 445

Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 450 455 460

Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 465 470 475 480

Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr

485 490 495

Lys Val Glu Ile Lys 500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 131 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1506 II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ B9 VH - A240 VL# ; Anticorpo bi-especifico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 131

gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360 gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420 ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480 agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540 aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600 agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgg tcgagtctgg gggaggcttg 780 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcgt ctggattcac cgtcagtagc 840 tactggatgc actgggtccg ccaagctcca gggaaggggc tggaatgggt aggtttcatt 900 agaaacaaag ctaatggtgg gacaacagaa tacgccgcgt ctgtgaaagg cagattcacc 960 atctcaagag atgattccaa gaacacgctg tatcttcaaa tgaacagcct gagagccgag 1020 gacacggccg tgtattactg tgcaagagat agggggctac ggttctactt tgactactgg 1080 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc 1140 ggtggtggtg gttctcaggc cgtgctgact cagccggctt ccctctctgc atctcctgga 1200 gcatcagcca gtctcacctg caccttgcgc aggggcatca atgttggtgc ctacagtata 1260 tactggtacc agcagaagcc agggagtcct ccccagtatc tcctgaggta caaatcagac 1320 tcagataagc agcagggctc tggagtctcc agccgcttct ctgcatccaa agatgcttcg 1380 gccaatgcag ggattttact catctctggg ctccagtctg aggatgaggc tgactattac 1440 tgtatgattt ggcacagcgg cgcttctgcg gtgttcggcg gagggaccaa gttgaccgtc 1500 ctatag 1506 I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 132

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 501

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ B9 VH - A240 VL# ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 132

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 260 265 270

Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln 275 280 285

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala 290 295 300

Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 305 310 315 320

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 325 330 335

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly 340 345 350

Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 355 360 365

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 370 375 380

Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 55 385 390 395 400

Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly 405 410 415 Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln 420 425 430

Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly 435 440 445

Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly 450 455 460

Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 465 470 475 480

Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr 485 490 495

Lys Leu Thr Val Leu 500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 133

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1500

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: D8 VH - A240 VL# χ SEQ ID NO: 77 VHVL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 133

gaggtgcagc tggtcgagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccctcagt acctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg atggaagcaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtac tagagatagg 300

gggctacggt tctactttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360

ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctcaggccgt gctgactcag 420

ccggcttccc tctctgcatc tcctggagca tcagccagtc tcacctgcac cttgcgcagg 480

ggcatcaatg ttggtgccta cagtatatac tggtaccagc agaagccagg gagtcctccc 540

cagtatctcc tgaggtacaa atcagactca gataagcagc agggctctgg agtctccagc 600

cgcttctctg catccaaaga tgcttcggcc aatgcaggga ttttactcat ctctgggctc 660 cagtctgagg atgaggctga ctattactgt atgatttggc acagcggcgc ttctgcggtg 720 ttcggcggag ggaccaagtt gaccgtccta tccggaggtg gtggatccga cgtccaactg 780 gtgcagtcag gggctgaagt gaaaaaacct ggggcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggct 840 tctggctaca cctttactag gtacacgatg cactgggtaa ggcaggcacc tggacagggt 900 ctggaatgga ttggatacat taatcctagc cgtggttata ctaattacgc agacagcgtc 960 aagggccgct tcacaatcac tacagacaaa tccaccagca cagcctacat ggaactgagc 1020 agcctgcgtt ctgaggacac tgcaacctat tactgtgcaa gatattatga tgatcattac 1080 tgccttgact actggggcca aggcaccacg gtcaccgtct cctcaggcga aggtactagt 1140 actggttctg gtggaagtgg aggttcaggt ggagcagacg acattgtact gacccagtct 1200 ccagcaactc tgtctctgtc tccaggggag cgtgccaccc tgagctgcag agccagtcaa 1260 agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aagccgggca aggcacccaa aagatggatt 1320 tatgacacat ccaaagtggc ttctggagtc cctgctcgct tcagtggcag tgggtctggg 1380 accgactact ctctcacaat caacagcttg gaggctgaag atgctgccac ttattactgc 1440 caacagtgga gtagtaaccc gctcacgttc ggtggcggga ccaaggtgga gatcaaatag 1500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 134

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 4 99

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: D8 VH - A240 VL# χ SEQ ID NO: 77 VHVL ;

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 134

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 55 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu 130 135 140

Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg 145 150 155 160

Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys 180 185 190

Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala 195 200 205

Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp 210 215 220

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val 225 230 235 240

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 260 265 270

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 275 280 285

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 290 295 300

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 305 310 315 320

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 325 330 335

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 340 345 350

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 355 360 365

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 370 375 380

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 385 390 395 400

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 405 410 415

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 420 425 430

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 435 440 445

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 450 455 460

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 465 470 475 480

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 485 490 495

Glu Ile Lys

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 135

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 1500

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica: III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ D8 VH - A240

VL# ; Anticorpo bi-especifico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 135

gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360 gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420 ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480 agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540 aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600 agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgg tcgagtctgg gggaggcgtg 780 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cctcagtacc 840 tatgccatgc actgggtccg ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcacttata 900 tcaaatgatg gaagcaataa atactatgca gactccgtga agggccgatt caccatctcc 960 agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg 1020 gctgtgtatt actgtactag agataggggg ctacggttct actttgacta ctggggccaa 1080 gggaccacgg tcaccgtctc ctcaggtggt ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt 1140 ggtggttctc aggccgtgct gactcagccg gcttccctct ctgcatctcc tggagcatca 1200 gccagtctca cctgcacctt gcgcaggggc atcaatgttg gtgcctacag tatatactgg 1260 taccagcaga agccagggag tcctccccag tatctcctga ggtacaaatc agactcagat 1320 aagcagcagg gctctggagt ctccagccgc ttctctgcat ccaaagatgc ttcggccaat 1380 gcagggattt tactcatctc tgggctccag tctgaggatg aggctgacta ttactgtatg 1440 atttggcaca gcggcgcttc tgcggtgttc ggcggaggga ccaagttgac cgtcctatag 1500

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 136

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 4 99

II.b) tipo: PRT II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ D8 VH - A240 VL# ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 136

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

25 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205 Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

260 265 270

Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln 275 280 285

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Ser Asn Asp Gly 290 295 300

Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 305 310 315 320

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 325 330 335

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg

340 345 350

Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 40 355 360 365

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 370 375 380

Ala Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser 385 390 395 400

Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr 405 410 415

Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu

420 425 430

Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser 60 435 440 445 Ser Arg Phe Ser Ala 450

Ser Lys Asp Ala Ser 455

Ala Asn Ala Gly Ile Leu 460

Leu Ile Ser Gly Leu 465

Gln Ser Glu Asp Glu 470

Ala Asp Tyr 475

Tyr Cys Met 480

Ile Trp His Ser Gly Ala 485

Ser Ala Val Phe 490

Gly Gly Gly Thr Lys Leu 495

Thr Val Leu

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 137

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 31

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 51 CEAI LH ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 137 aggtgtacac tccgacattg agctcaccca g 31

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 138

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 47

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 3'CEAI VL Ligante ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 138 ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc tttgatctcg agcttgg 47

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 139

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 4 8

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: 51 CEAI VH Ligante; oligonucleotídeo IV) Seqüência: SEQ ID NO. 139

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct caggtccaac tgcaggag 48

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 140

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 22

II.b) tipo: DNA

II.c) organismo: SEQÜÊNCIA ARTIFICIAL

III) Característica:

III.c) Outras informações: 31 CEAI LH ; oligonucleotídeo

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 140

aatccggagg agacggtgac cg 22

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 141

II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 14

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: Ligante de polipeptídeo não imunizado

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 141

Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp 15 10

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 142

II) Características da seqüência: II.a) tamanho: 1524

Il.b) tipo: DNA

II.c) organismo: seqüência artificial

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO:77 VHVL χ E12 VH - A240 VL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 142

gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120

cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180

gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240

atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctcaggc 360 gaaggtacta gtactggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagcaga cgacattgta 420 ctgacccagt ctccagcaac tctgtctctg tctccagggg agcgtgccac cctgagctgc 480 agagccagtc aaagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagccggg caaggcaccc 540 aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc 600 agtgggtctg ggaccgacta ctctctcaca atcaacagct tggaggctga agatgctgcc 660 acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtggcgg gaccaaggtg 720 gagatcaaat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgg tcgagtctgg gggaggcttg 780 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc tgtgcagcgt ctggattcac cgtcagtagc 840 tactggatgt actgggtccg ccaagctcca gggaaggggc tggaatgggt aggtttcatt 900 ctcaacaaag ctaatggtgg aacaacagaa tacgccgcgt ctgtgaaagg cagattcacc 960 atctcaagag atgattccaa gaacacgctg tatcttcaaa tgaacagcct gagagccgag 1020 gacacggccg tgtattactg tgcaagagat agggggctac ggttctactt tgactactgg 1080 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc 1140 ggtggtggtg gttctgagct cgtgctgact cagccggctt ccctctctgc atctcctgga 1200 gcatcagcca gtctcacctg caccttgcgc aggggcatca atgttggtgc ctacagtata 1260 tactggtacc agcagaagcc agggagtcct ccccagtatc tcctgaggta caaatcagac 1320 tcagataagc agcagggctc tggagtctcc agccgcttct ctgcatccaa agatgcttcg 1380 gccaatgcag ggattttact catctctggg ctccagtctg aggatgaggc tgactattac 1440 tgtatgattt ggcacagcgg cgcttctgcg gtgttcggcg gagggaccaa gttgaccgtc 1500 ctacatcatc accatcatca ttag 1524

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 143

II) Características da seqüência: II.a) tamanho: 507

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: SEQÜÊNCIA ARTIFICIAL

III) Característica:

III.c) Outras informações: SEQ ID NO: 77 VHVL χ E12 VH

A240 VL ; Anticorpo bi-específico de cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 143

Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 4 165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 195 200 205

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 225 230 235 240

Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 60 245 250 255 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 260 265 270

Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln 275 280 285

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Leu Asn Lys Ala 290 295 300

Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 305 310 315 320

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 325 330 335

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly 340 345 350

Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 355 360 365

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 370 375 380

Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 385 390 395 400

Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly 405 410 415

Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln 420 425 430

Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly 435 440 445

Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly 450 455 460

Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 465 470 475 480

Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr 485 490 495

Lys Leu Thr Val Leu His His His His His His 500 505

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 144 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 5

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: HOMO SAPIENS

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CDR-Hl E12 ; CDRl de VH E12 IV) Seqüência: SEQ ID NO. 144

Ser Tyr Trp Met His 1 5

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 145

II) Características da seqüência: II.a) tamanho: 19

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: CDR-H2 E12 ; CDR-2 de VH E12

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 145

Phe Ile Leu Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser 15 10 15

Val Lys Gly

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 14 6 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 121 II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: Homo sapiens

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto III.c) Outras informações: E12 VH ; região VH

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 146

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Phe Ile Leu Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

25 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

I.a) Número identificador da seqüência: SEQ ID No: 147 II) Características da seqüência:

II.a) tamanho: 252

II.b) tipo: PRT

II.c) organismo: HOMO SAPIENS

III) Característica:

III.a) Nome/Legenda: incerto

III.c) Outras informações: E12 VH - A240 VL ; Fv cadeia simples

IV) Seqüência: SEQ ID NO. 147

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Phe Ile Leu Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Pro Ala 130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu 145 150 155 160

Arg Arg Gly Ile Asn Val Gly Ala Tyr Ser Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser 180 185 190

Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala Ser Lys 195 200 205

Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser 210 215 220

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly Ala Ser 225 230 235 240

Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245 250

Claims (35)

1. Composição farmacêutica para o tratamento de um tumor epitelial em um humano, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo bi-específico de cadeia simples que possui (a) um primeiro domínio de ligação se ligando especificamente a CD3 humano, e (b) um segundo domínio de ligação se ligando especificamente a CEA humano, em que o dito segundo domínio de ligação compreende pelo menos a seqüência de aminoácidos " DX1X2X3X4 FYFDY" (SEQ ID NO: 65), "Χι", "X2", "X3" ou "X4" representa qualquer resíduo de aminoácido, e o resíduo de aminoácido "D" corresponde à posição de Kabat 95 de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino e os resíduos de aminoácidos "FYFDY" correspondem às posições de Kabat 100, 100a, 100b, 101, e -102, respectivamente, de CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação -1, caracterizada pelo fato de que: "Xi" representa "R" (Arginina) , "F" (Fenilalanina), "M" (Metionina), "E" (Ácido glutâmico), ou "T" (Treonina); "X2" representa "G" (Glycine), "Y" (Tirosina), "A" (Alanina), "D" (Ácido aspártico), ou "S" (Serina); "X3" representa "L" (Leucina), "F" (Fenilalanina), "M" (Metionina), "E" (Ácido glutâmico), ou "T" (Treonina); e - "X4" representa "R" (Arginina) , "Y" (Tirosina) , "A" (Alanina), "D" (Ácido aspártico), ou "S" (Serina).

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação -1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o dito segundo domínio de ligação específico para CEA humano compreende pelo menos a seqüência de aminoácidos "DRGLRFYFDY" (SEQ ID NO: 66) correspondente às posições de Kabat 95 - 102 do CDR-H3 de anticorpo monoclonal A5B7 murino.

4. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o dito primeiro domínio de ligação específico para CD3 está localizado C terminalmente.

5. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que os ditos domínios de ligação são arranjados na ordem VHcea- VLcea-VHCD3-VLCD3 OU VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3 ·

6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o dito segundo domínio de ligação específico para CEA humano compreende um CDR-Hl tendo a seqüência de aminoácidos "SYWMH" (SEQ ID NO: 68) e/ou um CDR-H2 tendo a seqüência de aminoácidos nFIRNKANGGTTEYAASVKG" .,(SEQ ID NO: 67) ou "FILNKANGGTTEYAASVKG" (SEQ ID NO: 145).

7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o dito segundo domínio de ligação específico para CEA humano compreende um CDR-Hl tendo a seqüência de aminoácidos "TYAMH" (SEQ ID NO: 70) e/ou um CDR-H2 tendo a seqüência de aminoácidos "LISNDGSNKYYADSVKG" (SEQ ID NO: 69) .

8. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o dito segundo domínio de ligação específico para CEA humano compreende um CDR-Ll tendo a seqüência de aminoácidos " TLRRGINVGAYSIY" (SEQ ID NO: 73) e/ou a CDR-L2 tendo a seqüência de aminoácidos "YKSDSDKQQGS" (SEQ ID NO: 72) e/ou a CDR-L3 tendo a seqüência de aminoácidos "MIWHSGASAV" (SEQ ID NO: 71).

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação -6, caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos de uma região VH do segundo domínio de ligação específico para CEA humano é SEQ ID NO: 60 ou 146.

10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação -7, caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos de uma região VH do segundo domínio de ligação específico para CEA humano é SEQ ID NO: 58 ou SEQ ID NO:62.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação -8, caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácidos de uma região VL do segundo domínio de ligação específico para CEA humano é SEQ ID NO: 64.

12. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que as regiões V do segundo domínio de ligação específico para CEA são selecionadas do grupo consistindo de: (a) a região VH consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 60 e a região VL consiste da seqüência de aminoácidos aprensentada em SEQ ID NO: 64; (b) a região VH consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 146 e a região VL consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 64 (c) a região VH consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 58 e a região VL consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 64; (d) a região VH consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 62 e a região VL consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 64; e (e) a região VH consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 56 e a região VL consiste da seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 64.

13. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o dito anticorpo bi-específico de cadeia simples compreende a seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de: (a) a seqüência de aminoácidos como representada em qualquer das SEQ ID NOS: 6, 8, 16, 18, 24, 26, -32, 34, 40, 42, 126, 130, 134 ou 143; (b) a seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos como mostrado nas SEQ ID NOS: 5, 7, 15, 17, 23, 25, 31, 33, 39, 41, -125, 129, 133 ou 142; (c) a seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos hibridizando sobr condições estringentes à seqüência de ácidos nucléicos complementar de (b); (d) a seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos que é degenerada como resultado do código genético para uma nucleotide seqüência de (b); e (e) a seqüência de aminoácidos pelo menos 85 % idêntica, mais preferivelmente pelo menos 90 % idêntica, mais preferivelmente pelo menos 95 % idêntica à seqüência de aminoácidos de (a) ou (b).

14. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o dito tumor epitelial é um adenocarcinoma gastrointestinal, um adenocarcinoma de mama ou um adenocarcinoma de pulmão.

15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação -14, caracterizada pelo fato de que o dito adenocarcinoma gastrointestinal é um adenocarcinoma colorectal, pancreático, oesofageal ou gástrico.

16. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é para o tratamento de tumores progressivos, tumores de estágio tardio, pacientes com tumor e alta carga tumoral, tumores metastáticos, ou pacientes com tumor com uma concentração de CEA no soro maior do que 100 ng/ml.

17. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que pelo menos um do dito primeiro ou segundo domínios de ligação é quimérico, humanizado, CDR-transplantado, e/ou desimunizado ou humano .

18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência de ácidos nucléicos codificando o anticorpo bi-específico de cadeia simples como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor compreendendo a seqüência de ácidos nucléicos como definida na reivindicação 18.

20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação -19, caracterizada pelo fato de que o dito vetor compreende, ainda, uma seqüência reguladora que é operacionalmente ligada com a dita seqüência de ácidos nucléicos como definida na reivindicação 18.

21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação -19 ou 20, caracterizada pelo fato de que o dito vetor é vetor de expressão.

22. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o hospedeiro transformado ou transfectado com o ácido nucléico como definido na reivindicação 18 ou o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a -21.

23. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que compreende ainda o composto proteináceo capaz de prover um sinal de ativação para células de efeito imune.

24. Processo para a produção da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar o hospedeiro como definido na reivindicação 22 sob condições permitindo a expressão do anticorpo bi-especifico de cadeia simples como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 e recuperar o anticorpo bi-especifico de cadeia simples produzido a partir da cultura.

25. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que compreende ainda formulações adequadas de carregadores, estabilizadores e/ou excipientes.

26. Uso do anticorpo bi-especifico de cadeia simples como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, da molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação -18, do vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 21, ou do hospedeiro como definido na reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção, o tratamento ou a melhora de um tumor epitelial em um humano.

27. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o dito tumor epitelial é um adenocarcinoma gastrointestinal, um adenocarcinoma de mama ou um adenocarcinoma de pulmão.

28. Uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o dito adenocarcinoma gastrointestinal é um adenocarcinoma colorectal, pancreático, um oesofageal ou gástrico.

29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -28, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é para o tratamento de tumores progressivos, tumores de estágio tardio, pacientes com tumor com alta carga tumoral, tumores metastáticos, ou pacientes com tumor com uma concentração de CEA no soro mais alta do que 100 ng/ml.

30. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -29, caracterizado pelo fato de que a dita composição farmacêutica é adequada para ser administrada em combinação com uma droga adicional.

31. Uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a dita droga é um composto não proteináceo ou um composto proteináceo.

32. Uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um composto proteináceo capaz de prover um sinal de ativação para células de efeito imune.

33. Uso de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o dito composto proteináceo ou composto não proteináceo é administrado simultaneamente ou não-simultaneamente com o anticorpo bi-específico de cadeia simples como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, a molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 18, o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 21, ou o hospedeiro como definido na reivindicação 22.

34. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo bi-específico de cadeia simples como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, a molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 18, o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 21, ou o hospedeiro como definido na reivindicação 22.

35. Composição farmacêutica como definida na reivindicação -16 ou uso como definido na reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a dita concentração de CEA no soro e determinada por ELISA.