TW201525001A - 包含n-端abp之單鏈結合分子 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種包含至少三個結合結構域之單鏈結合分子,其中第一結合結構域能夠結合於血清白蛋白且位於第二結合結構域之N-端,該第二結合結構域能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子且第三結合結構域能夠結合於T細胞CD3受體複合物。此外,本發明係關於用於產生此類結合分子之方法、編碼其之核酸序列、包含該核酸序列之載體及表現本發明結合分子之宿主細胞。此外,本發明係關於一種包含本發明結合分子之醫藥組合物、包含投與本發明結合分子之步驟的治療方法及本發明結合分子之醫學用途。
Description
本發明提供一種包含至少三個結合結構域之單鏈結合分子,其中第一結合結構域能夠結合於血清白蛋白且位於第二結合結構域之N-端,第二結合結構域能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子且第三結合結構域能夠結合於T細胞CD3受體複合物。此外,本發明提供一種用於產生此類結合分子之方法、編碼其之核酸序列、包含該核酸序列之載體及表現本發明結合分子之宿主細胞。此外,本發明提供一種包含本發明結合分子之醫藥組合物、包含投與本發明結合分子之步驟的治療方法及本發明結合分子之醫學用途。
增加之半衰期一般適用於免疫球蛋白、尤其抗體及最尤其小尺寸抗體片段之活體內應用。該等片段(Fv、二硫鍵鍵結之Fv、Fab、scFv、dAb)可能自身體快速清除;因此,雖然其能夠快速地到達身體的大部分,且迅速產生且容易處置,但其活體內應用可受其在活體內短暫的存留限制。
諸如BiTE(雙特異性T細胞接合)抗體之雙特異性分子為由兩個可撓性地連接之單鏈抗體(scFv)製成的重組蛋白質構築體。BiTE抗體之一個scFv對標靶細胞上之所選腫瘤相關表面抗原具有特異性;第二scFv對CD3(T細胞上T細胞受體複合物之次單元)具有特異性。藉由其
特定設計及二價結合,BiTE抗體特別適於將T細胞短暫地結合於標靶細胞,且同時有效活化T細胞針對標靶細胞之固有細胞溶解潛能。BiTE分子為分子量低於腎截止之小蛋白質,可能導致半衰期較短,此為具有許多其他抗體格式之BiTE所共享的一個特徵。實際上,雖然一方面希望具有小結合分子,因為例如其可迅速到達其在體內之指定位置且亦可到達身體的大部分,但此類結合分子之「尺寸」在尤其腎清除率方面並不有利。此類結合分子亦可更快降解,因為可謂,其不具有優良的天然保護,除非其之前例如藉由胺基酸改變而穩定化。因此,需兼顧小尺寸與穩定性/腎清除率兩方面。
因此,希望可獲得一種結合分子,尤其一種雙特異性結合分子,其穩定性提高及/或其腎清除延遲,從而血清半衰期整體增加,但仍有利地小,使得其可以優良產率製造及/或便利地處置。
本發明提供一種包含至少三個結合結構域之單鏈結合分子,其中(a)第一結合結構域能夠結合於血清白蛋白且位於第二結合結構域之N-端;(b)該第二結合結構域能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子;以及(c)第三結合結構域能夠結合於T細胞CD3受體複合物。
在一個實施例中,本發明之結合分子特徵在於三個結構域自N-端至C-端按以下次序連續位於一個多肽鏈上:˙第一結合結構域;˙第二結合結構域;及˙第三結合結構域。
本發明亦提供一種包含至少三個結合結構域之單鏈結合分子,
該至少三個結合結構域包含在一個多肽鏈中,其中(a)第一結構域能夠結合於血清白蛋白且位於第二結合結構域之N-端;(b)該第二結構域能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子;以及(c)第三結構域能夠結合於T細胞CD3受體複合物,其中可表現之單體結合分子之百分比[相對於結合分子之總量]視該結合分子中第一及第二結合結構域之次序而定。
本發明進一步提供一種包含至少三個結合結構域之單鏈結合分子,該至少三個結合結構域以第一結構域、第二結構域及第三結構域之次序包含在一個多肽鏈中,其中(a)第一結構域能夠結合於血清白蛋白且位於第二結合結構域之N-端;(b)該第二結構域能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子;以及(c)第三結構域能夠結合於T細胞CD3受體複合物;其中自產生該結合分子之宿主細胞之培養物上清液分離的單體結合分子之產率為自產生包含能夠結合於血清白蛋白之結合結構域在分子C-端的結合分子之宿主細胞之培養物上清液分離的單體結合分子之產率的至少1.5倍。
在一個實施例中,本發明之結合分子特徵在於至少一個結合結構域、較佳第二及/或第三結合結構域為scFv或單域抗體。
亦在本發明結合分子之一個實施例中,該分子包含一或多種其他異源多肽。
本發明之結合分子亦可包含呈異源多肽形式之His-標籤。對於本發明之結合分子而言,較佳地,His-標籤位於第三結合結構域之C-
端。
本發明亦提供一種結合分子,其中(a)第一結合結構域能夠結合於人類及非人類靈長類動物血清白蛋白;(b)第二結合結構域能夠結合於人類及非人類靈長類動物細胞上之細胞表面分子,以及(c)第三結合結構域能夠結合於人類及非人類靈長類動物細胞上之T細胞CD3受體複合物。
在一個實施例中,根據本發明之結合分子特徵在於能夠結合於血清白蛋白之第一結合結構域衍生自組合庫或抗體結合結構域。
在本發明結合分子之一較佳實施例中,第一結合結構域包含10至25個胺基酸殘基。
在本發明結合分子之一個實施例中,能夠結合於血清白蛋白之第一結合結構域包含胺基酸序列Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp,其中Xaa為任何胺基酸。
在本發明結合分子之一個實施例中,能夠結合於血清白蛋白之第一結合結構域衍生自單域抗體之CDR。
亦在本發明結合分子之一個實施例中,第一結合結構域以500nM之親和力(KD)結合於血清白蛋白。
在本發明結合分子之一個實施例中,˙第二結合結構域以100nM之親和力(KD)結合於標靶細胞上之細胞表面分子;以及˙第三結合結構域以100nM親和力(KD)結合於T細胞CD3受體複合物。
在本發明結合分子之一個實施例中,結合分子在活體外分析中展示細胞毒性活性,該活體外分析量測在10%人類血清白蛋白存在下
效應細胞對標靶細胞之溶解。
在本發明結合分子之一較佳實施例中,分子由單一多肽鏈組成。
在本發明結合分子之一個實施例中,(a)第二結合結構域包含抗體來源之VL及VH鏈;及/或(b)第二結合結構域包含抗體來源之VL及VH鏈。
在本發明結合分子之一個實施例中,能夠結合於細胞表面分子之第一結合結構域結合於腫瘤抗原。
在本發明結合分子之一較佳實施例中,能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第二結合結構域能夠結合於人類及白鬢狨(Callithrix jacchus)、棉頂狨(Saguinus oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3ε鏈之抗原決定基,其中該抗原決定基為包含在由WO 2008/119567之SEQ ID NO:2、4、6或8組成之群中的胺基酸序列之一部分且包含至少胺基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(SEQ ID NO:37)。
在本發明之一較佳實施例中,第二結合結構域能夠結合CD33或CEA。
在一個實施例中,本發明之結合分子特徵在於如SEQ ID NO:8、12、16、20、24、26、30或34中描繪之胺基酸序列。
本發明之一替代性實施例提供一種用於產生本發明結合分子之方法,該方法包含以下步驟:˙選擇包含能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子之結合結構域的結合分子,其在N-端包含能夠結合於血清白蛋白之結合結構域。
在一個實施例中,本發明之方法進一步包含以下步驟:˙向該分子添加能夠結合於T細胞CD3受體複合物之另一結合結構域。
在一個實施例下,本發明提供一種具有編碼本發明結合分子之
序列的核酸分子。
本發明亦提供一種包含本發明核酸序列之載體。
本發明提供經本發明核酸或經本發明載體轉型或轉染之宿主細胞。
在一個實施例中,本發明提供一種用於產生本發明結合分子或藉由本發明方法產生之結合分子的方法,該方法包含在允許本發明結合分子或藉由本發明方法產生之結合分子表現的條件下培養本發明之宿主細胞且自培養物回收所產生之結合分子。
本發明亦提供一種包含本發明結合分子或根據本發明方法產生之結合分子的醫藥組合物。
根據本發明之一個實施例,本發明之結合分子或根據本發明方法產生之結合分子用於預防、治療或改善選自由增生性疾病、發炎疾病、傳染性疾病及自體免疫疾病組成之群的疾病。
在一個實施例中,本發明提供一種用於治療或改善選自由增生性疾病、發炎疾病、傳染性疾病及自體免疫疾病組成之群的疾病之方法,其包含向有需要之個體投與本發明之結合分子或根據本發明方法產生之結合分子的步驟。
亦在一個實施例中,本發明提供一種包含本發明之結合分子或根據本發明方法產生之結合分子、本發明之核酸分子、本發明之載體或本發明之宿主細胞的套組。
圖1:
來自SA-21-CEAxCD3結合分子之IMAC純化的溶離型態圖。1:捕捉,2:洗去未結合之樣品,3:預溶離50mM咪唑,4:溶離500mM咪唑。藍線:280nm下光學吸收,紅線:254nm下光學吸收。
圖2:
SA-21-CEAxCD3結合分子之SEC型態圖。峰1:空體積之聚集體(非結合分子)。峰2:結合分子二聚體。峰3:結合分子單體。峰4:低分子量污染物及鹽。280nm下光學吸收,紅線:254nm下光學吸收。
圖3:
如在18小時51鉻釋放分析中在10% HSA存在下量測之CD33雙特異性抗體的細胞毒性活性。效應細胞:經刺激之富集之人類CD8 T細胞。標靶細胞:人類CD33轉染之CHO細胞。效應細胞與標靶細胞(E:T)比率:10:1。
必須注意,除非上下文另外清楚指示,否則如本文所用之單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個提及物。因此,舉例而言,提及「試劑」包括一或多種此類不同試劑且提及「方法」包括提及同等步驟及熟習此項技術者已知之可修改或取代本文所述之方法的方法。
除非另外指示,否則在一系列要素前面之術語「至少」據瞭解係指該系列中之每個要素。熟習此項技術者將想到,或僅僅使用常規實驗將能夠確定本文所述之本發明之特定實施例的多個同等物。該等同等物意欲涵蓋於本發明中。
本文中各處所用之術語「及/或」包括「及」、「或」及「由該術語連接之要素之所有或任何其他組合」的含義。
如本文所用之術語「約」或「大約」意謂給定值或範圍之±20%內,較佳±15%內,更佳±10%內,且最佳±5%內。
在本說明書及隨後之申請專利範圍中,除非上下文另外需要,否則詞語「包含(comprise)」及其變體(諸如「包含(comprises)」及「包含(comprising)」)應理解為指示包括所述整數或步驟或整數或步
驟之群,但不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟之群。當在本文中使用時,術語「包含」可經術語「含有」或「包括」取代或有時在本文中使用時,經術語「具有」取代。
當在本文中使用時,「由……組成」排除在主張要素中未指明之任何要素、步驟或成分。當在本文中使用時,「基本上由……組成」不排除本質上不影響技術方案之基本及新穎特徵的材料或步驟。
在本文中之每一例子中,術語「包含」、「基本上由...組成」及「由...組成」中之任一者可經另外兩個術語之任一者替換。
在本發明之意義上術語「結合分子」或「抗體構築體」指示能夠(特異性)結合於標靶分子、與其相互作用或識別其之任何分子。對於第二結合結構域,所述標靶分子為標靶細胞上之細胞表面分子。對於第三結合結構域,所述標靶分子為T細胞CD3受體複合物。
關於本發明,術語「單鏈結合分子」定義呈最簡單形式之所揭示之結合分子為單體。分子或構築體可包括蛋白質部分及非蛋白質部分(例如化學連接子或化學交聯劑,諸如戊二醛)。因此,根據本發明,單鏈結合分子可包含較佳連接結合結構域中之至少兩者的非肽連接子。亦依據本發明為本文中定義之肽連接子。
結合分子可謂為該一或多種結合結構域提供骨架,以便該等結合結構域可結合標靶細胞上之表面分子及T細胞上之CD3受體複合物/與其相互作用。舉例而言,此類骨架可由以下來提供:蛋白質A、尤其其Z-結構域(親和抗體)、ImmE7(免疫性蛋白質)、BPTI/APPI(庫尼結構域(Kunitz domain))、Ras-結合蛋白質AF-6(PDZ-結構域)、卡律蠍毒素(蠍毒素)、CTLA-4、Min-23(打結素(knottin))、脂質運載蛋白(抗運載蛋白)、新制癌菌素(neokarzinostatin)、纖維結合蛋白結構域、錨蛋白共同重複結構域(Stumpp等人,Curr Opin Drug Discov Devel.10(2),153-159(2007))或硫氧還蛋白(Skerra,Curr.Opin.
Biotechnol.18,295-304(2005);Hosse等人,Protein Sci.15,14-27(2006);Nicaise等人,Protein Sci.13,1882-1891(2004);Nygren及Uhlen,Curr.Opin.Struc.Biol.7,463-469(1997))。一較佳結合分子為抗體,更佳為雙特異性抗體。
術語「抗體」之定義包括諸如單株、嵌合、單鏈、人類化及人類抗體之實施例,以及抗體片段,如尤其Fab片段。抗體片段或衍生物進一步包括F(ab')2、Fv、scFv片段或單域抗體,諸如域抗體或奈米抗體、單可變域抗體或僅包含一個可變域,可能VHH、VH或VL之免疫球蛋白單可變域,其特異性結合與其他V區或結構域無關之抗原或抗原決定基;參見例如Harlow及Lane(1988)及(1999),在上述引文中;Kontermann及Dübel,Antibody Engineering,Springer,2010年第2版及Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Cambridge University Press 2009。此類免疫球蛋白單可變域不僅涵蓋分離之抗體單可變域多肽,而且亦涵蓋包含抗體單可變域多肽序列之一或多個單體的較大多肽。
依據以上定義之單價抗體片段描述關於本發明之結合結構域之一個實施例。該等單價抗體片段結合於特定抗原且亦可稱為「抗原結合結構域」、「抗原結合片段」或「抗體結合區」。
根據此定義,術語抗體之所有上述實施例可歸入術語「抗體構築體」內。該術語亦包括雙功能抗體或雙親和力重新靶向(DART)抗體。進一步設想(雙特異性)單鏈雙功能抗體;串聯雙功能抗體(Tandab);由如下結構例示之微型抗體:(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2或(scFv-CH3-scFv)2;「Fc DART」抗體及「IgG DART」抗體,以及多功能抗體,諸如三功能抗體。免疫球蛋白單可變域不僅涵蓋分離之抗體單可變域多肽,而且亦涵蓋包含抗體單可變域多肽序列之一或多個單體的較大多肽。
各種程序在此項技術中已知且可用於產生該等抗體構築體(抗體及/或片段)。因此,(抗體)衍生物可藉由肽模擬物產生。此外,針對單鏈抗體產生所述之技術(參見尤其美國專利4,946,778、Kontermann及Dübel(2010),在上述引文中及Little(2009),在上述引文中)可改適成產生對所選擇之多肽具有特異性之單鏈抗體。同時,基因轉殖動物可用於表現對本發明之多肽及融合蛋白質具有特異性之人類化抗體。為製備單株抗體,可使用提供藉由連續細胞株培養產生之抗體的任何技術。該等技術之實例包括融合瘤技術(Köhler及Milstein Nature 256(1975),495-497)、三源雜交瘤技術、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor,Immunology Today 4(1983),72)及產生人類單株抗體之EBV-融合瘤技術(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96)。如用於BIAcore系統中之表面電漿子共振可用於提高結合於標靶多肽,諸如CD3ε之抗原決定基之噬菌體抗體的效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105;Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。在本發明之上下文中亦設想術語「抗體」包含可在如下文中所述之宿主中表現的抗體構築體,例如可經由尤其病毒或質體載體轉染及/或轉導之抗體構築體。
此外,如用於本發明之術語「抗體」亦指顯示與所述抗體相同特異性的本文所述之抗體之衍生物或變異體。
術語「抗原結合結構域」、「抗原結合片段」及「抗體結合區」在本文中使用時係指包含負責抗體且抗原之間的特異性結合之胺基酸的抗體分子一部分。由抗體特異性識別且結合之抗原部分稱為如上文所述之「抗原決定基」。如上所提及,抗原結合結構域可通常包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH);然而,其無須包含兩個。舉例而言,Fd片段具有兩個VH區且時常保留完整抗原結合結構域之一些抗原結合功能。抗體之抗原結合片段之實例包括(1)Fab片段,具
有VL、VH、CL及CH1結構域之單價片段;(2)F(ab')2片段,具有兩個在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之Fab片段的二價片段;(3)Fd片段,具有兩個VH及CH1結構域;(4)Fv片段,具有抗體單臂之VL及VH結構域,(5)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546),其具有VH結構域;(6)分離之互補決定區(CDR),及(7)單鏈Fv(scFv)。雖然Fv片段之兩個結構域VL及VH藉由分開之基因編碼,但可使用重組方法藉由能夠將其製成其中VL及VH區成對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見例如Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:5879-5883)之單一蛋白質鏈的合成連接子將其接合。此等抗體片段使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得,且以與完整抗體相同之方式評估該等片段之功能。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上均質之抗體群體所獲得之抗體,亦即,構成該群體之個別抗體除可微量存在之可能的天然存在之突變及/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)外均相同。單株抗體針對單一抗原位點具高度特異性。此外,與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑不同,各單株抗體針對抗原上之單一決定子。除其特異性以外,單株抗體之有利之處在於其藉由融合瘤培養合成,不受其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體係自實質上均質之抗體群體獲得之特徵,且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言,根據本發明有待使用之單株抗體可藉由最初由Kohler等人,Nature 256:495(1975)所描述之融合瘤方法來製成,或可藉由重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)來製成。「單株抗體」亦可使用例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)及Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述之技術自噬菌體抗體文庫中分離。
術語「人類抗體」包括具有實質上與此項技術中已知之人類生
殖系免疫球蛋白序列相對應之可變及恆定區的抗體,包括例如Kabat等人描述之彼等序列(參見Kabat等人(1991)在上述引文中)。本發明之人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如,在活體外藉由隨機或定點突變誘發或在活體內藉由體細胞突變而引入之突變),例如在CDR中且尤其在CDR3中。人類抗體可具有至少一個、兩個、三個、四個、五個或更多個經不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基置換的位置。強調如本文所用之人類抗體之定義亦涵蓋完全人類抗體,當彼等抗體可藉由使用技術,使用諸如Xenomice之系統得到時,其僅包括抗體之非人工及/或基因改變之人類序列。
「抗體變異體」之實例包括非人類抗體之人類化變異體、「親和力成熟」抗體(參見例如Hawkins等人J.Mol.Biol.254,889-896(1992)及Lowman等人,Biochemistry 30,10832-10837(1991))及具有改變之效應功能之抗體突變體(參見例如美國專利5,648,260;Kontermann及Dübel(2010),在上述引文中;及Little(2009),在上述引文中)。
如本文所用,「活體外產生之抗體」係指其中可變區所有或部分(例如至少一個CDR)在非免疫細胞選擇(例如活體外噬菌體呈現、蛋白質晶片或其中可測試候選序列結合於抗原之能力的任何其他方法)中產生的抗體。此術語因此較佳排除藉由免疫細胞中基因重排所產生之序列。
VH與VL配對一起形成單一抗原結合位點。最鄰近VH之CH結構域稱為CH1。各L鏈經由一個共價二硫鍵與H鏈連接,而視H鏈同型而定,兩條H鏈經由一或多個二硫鍵彼此連接。VH及VL域由四個稱為框架區(FR1、FR2、FR3及FR4)的相對保守序列之區域組成,該等框架區形成三個高變序列區(互補決定區,CDR)之骨架。CDR含有負責
抗體與抗原之特異性相互作用的大部分殘基。CDR稱為CDR1、CDR2及CDR3。因此,重鏈上之CDR組分稱為H1、H2及H3,而輕鏈上之CDR組分稱為L1、L2及L3。
術語「可變」係指顯示出其序列可變性且與測定特定抗體之特異性及結合親和力有關的免疫球蛋白域部分(亦即「可變域」)。可變性在抗體之可變域上不均勻分佈;其集中在每一重鏈及輕鏈可變區之子結構域。此等子結構域稱作「高變」區或「互補決定區」(CDR)。可變域之較保守(亦即非高變)部分稱作「構架」區(FRM)。天然存在之重鏈及輕鏈之可變域各包含四個FRM區,基本上採用β-片狀組態,由三個高變區連接,其形成環連接,且在一些情況下,形成為β-片狀結構的一部分。各鏈中之高變區藉由FRM緊密固持在一起,且與來自另一鏈之高變區一起促成抗原結合位點之形成(參見Kabat等人,在上述引文中)。恆定域不直接參與抗原結合,但顯示出各種效應功能,諸如例如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性及補體活化。
術語「CDR」及其複數「CDRs」係指互補決定區(CDR),其中三個組成輕鏈可變區之結合特性(CDRL1、CDRL2及CDRL3)且三個組成重鏈可變區之結合特徵(CDRH1、CDRH2及CDRH3)。CDR促成抗體分子之功能活性且由包含骨架或構架區之胺基酸序列分開。精確定義之CDR界限及長度服從不同分類及編號系統。因此CDR可藉由Kabat、Chothia、接觸或任何其他界限定義,包括本文所述之編號系統提及。儘管界限不同,但此等系統中之每一者關於可變序列內之所謂「高變區」構成部分具有一定程度的重疊。根據此等系統之CDR定義因此可在長度及相對於相鄰構架區之界限區域方面有所不同。參見例如Kabat、Chothia及/或MacCallum(Kabat等人,在上述引文中;Chothia等人,J.Mol.Biol,1987,196:901;及MacCallum等人,J.Mol.Biol,1996,262:732)。然而,根據所謂Kabat系統之編號較佳。輕鏈
CDR3及尤其重鏈CDR3可構成輕鏈及重鏈可變區內抗原結合中之最重要決定子。在一些抗體構築體中,重鏈CDR3似乎構成抗原與抗體之間的主要接觸區域。其中單單CDR3變化之活體外選擇方案可用於變化抗體之結合特性或測定哪些殘基促成抗原結合。
「基本上由組成」意謂如本文所述,胺基酸序列可相對於所述SEQ ID NO:序列變化約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%,且仍保留生物活性。
在一些實施例中,本發明之結合分子為分離之蛋白質或實質上純的蛋白質。「分離」之蛋白質不伴有在其天然狀態下通常締合之至少一些物質,例如在給定樣品中佔總蛋白質之至少約5重量%或至少約50重量%。應瞭解分離之蛋白質可佔總蛋白質內含物的5重量%至99.9重量%,視情況而定。舉例而言,經由使用誘導性啟動子或高表現啟動子,可製備顯著更高濃度之蛋白質,使得蛋白質以提高之濃度水準來製備。定義包括在此項技術中已知之多種生物體及/或宿主細胞中產生抗原結合蛋白質。
對於胺基酸序列,序列一致性及/或類似性藉由使用此項技術中已知之標準技術測定,該等技術包括(但不限於)Smith及Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482之局部序列一致性演算法;Needleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443之序列一致性比對演算法;Pearson及Lipman,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85:2444之類似性搜索法;此等演算法之電腦化執行(Wisconsin Genetics套裝軟體(Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.)中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA);Devereux等人,1984,Nucl.Acid Res.12:387-395描述之Best Fit序列程式,較佳使用內定設置,或藉由檢查。較佳地,一致性百分比藉由FastDB,基於以下參數計算:錯配罰分1;間隙罰分1;間隙尺寸罰分0.33;及接合罰分30,「Current
Methods in Sequence Comparison and Analysis」,Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications,第127-149頁(1988),Alan R.Liss,Inc.。
適用演算法之一個實例為PILEUP。PILEUP使用漸進成對比對來產生一組相關序列之多序列比對。其亦可繪製展示用於產生比對之叢集關係的樹。PILEUP使用Feng及Doolittle,1987,J.Mol.Evol.35:351-360之漸進比對方法之簡化;該方法類似於Higgins及Sharp,1989,CABIOS 5:151-153所述之方法。適用PILEUP參數包括內定間隙權數3.00、內定間隙長度權數0.10及加權末端間隙。
適用演算法之另一個實例為BLAST演算法,描述於以下中:Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410;Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402;及Karin等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5787。一種尤其適用BLAST程式為WU-BLAST-2程式,其自Altschul等人,1996,Methods in Enzymology 266:460-480獲得。WU-BLAST-2使用若干搜索參數,大部分參數設置為內定值。可調參數用以下值設置:重疊間距=1,重疊分數=0.125,字符臨限值(T)=II。HSP S及HSP S2參數為動態值且藉由程式自身,視特定序列之組成及正搜索所關注序列之特定資料庫之組成而定來確定;然而,值可調整以提高靈敏度。
另一個適用演算法為間隙BLAST,如Altschul等人,1993,Nucl.Acids Res.25:3389-3402所報導。間隙BLAST使用BLOSUM-62取代評分;臨限T參數設置為9;使用兩命中點法(two-hit method)來觸發無間隙延伸,k之間隙長度為10+k之成本;Xu設置為16,且針對資料庫搜索階段,Xg設置為40,且針對演算法之輸出階段,設置為67。間隙比對藉由對應於約22位元之評分觸發。
一般而言,針對本文中描述之序列,個別變異CDR之間的胺基酸
同源性、類似性或一致性為至少80%,並且更通常較佳地,至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及幾乎100%的遞增同源性或一致性。以類似方式,關於本文中鑑別之結合蛋白之核酸序列的「核酸序列一致性百分比(%)」定義為候選序列中與抗原結合蛋白之編碼序列中核苷酸殘基一致的核苷酸殘基百分比。一特定方法利用設置為內定參數之WU-BLAST-2之BLASTN模塊,其中重疊間距及重疊分數分別設置為1及0.125。
一般而言,編碼個別變異CDR之核苷酸序列與本文中描述之核苷酸序列之間的核酸序列同源性、類似性或一致性為至少80%,且更通常較佳地,至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%及幾乎100%之遞增同源性或一致性。
因此,「變異CDR」為與本發明之親本CDR具有指定同源性、類似性或一致性的CDR,並且共享生物功能,包括(但不限於)親本CDR之特異性及/或活性的至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
雖然用於引入胺基酸序列變異之位點或區域預先確定,但突變本身無需預先確定。舉例而言,為使給定位點上突變之效能最佳化,可在標靶密碼子或區域進行隨機突變誘發且針對所需活性之最優組合篩選表現之抗原結合蛋白CDR變異體。熟知用於在具有已知序列之DNA中預先確定位點處製造取代突變的技術,例如M13引子突變誘發及PCR突變誘發。使用抗原結合蛋白活性,諸如與標靶細胞上所選細胞表面分子之結合的分析進行突變體之篩選。
術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」通常係指具有其在此項技術中公認之定義的胺基酸,諸如選自由以下各胺基酸組成之群的胺基
酸:丙胺酸(Ala或A);精胺酸(Arg或R);天冬醯胺(Asn或N);天冬胺酸(Asp或D);半胱胺酸(Cys或C);麩醯胺酸(Gln或Q);麩胺酸(Glu或E);甘胺酸(Gly或G);組胺酸(His或H);異白胺酸(He或I);白胺酸(Leu或L);離胺酸(Lys或K);甲硫胺酸(Met或M);苯丙胺酸(Phe或F);脯胺酸(Pro或P);絲胺酸(Ser或S);蘇胺酸(Thr或T);色胺酸(Trp或W);酪胺酸(Tyr或Y);及纈胺酸(Val或V),不過如需要,可使用修飾、合成或稀有胺基酸。一般而言,胺基酸可分組為具有非極性側鏈(例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val);帶負電荷側鏈(例如Asp、Glu);帶正電荷側鏈(例如Arg、His、Lys);或不帶電荷極性側鏈(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp及Tyr)。
術語「高變區」(亦稱「互補決定區」或CDR)在本文中使用時係指在免疫球蛋白之V區結構域內(通常三個或四個具有極度序列可變性之短區)的形成抗原結合位點且為抗原特異性之主要決定子的抗體胺基酸殘基。存在至少兩種鑑別CDR殘基之方法:(1)基於跨物種序列可變性之方法(亦即Kabat等人,在上述引文中);及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究的方法(Chothia,C.等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。然而,在兩殘基鑑別技術界定重疊區域而非一致區域的程度上,其可組合以界定混雜CDR。然而,一般而言,CDR殘基較佳根據所謂Kabat(編號)系統鑑別。
術語「構架區」係指此項技術中公認的存在於更多樣(亦即高變)CDR之間的抗體可變區部分。此類構架區通常稱為構架1至4(FR1、FR2、FR3及FR4)且為六個CDR(三個來自重鏈且三個來自輕鏈)在三維空間中之呈現提供骨架以形成抗原結合表面。
通常,CDR形成環狀結構,該環狀結構分類為典型結構。術語「典型結構」係指抗原結合(CDR)環所採取的主鏈構形。由比較結構
研究,已發現六個抗原結合環中之五個僅具有有限的可用構形譜系。每個典型結構可藉由多肽主鏈之扭轉角表徵。抗體之間的對應環因此可具有非常類似的三維結構,儘管在環之大部分中具有高度胺基酸序列可變性(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.,1987,196:901;Chothia等人,Nature,1989,342:877;Martin及Thornton,J.Mol.Biol,1996,263:800,每一者以全文引用的方式併入本文中)。此外,所採取之環狀結構與圍繞其之胺基酸序列之間存在一種關係。特定典型類別之構形由環長度及位於環內關鍵位置處以及保守構架內(亦即在環外)之胺基酸殘基決定。因此可基於此等關鍵胺基酸殘基之存在分配至特定典型類別。術語「典型結構」亦可包括關於抗體線性序列之考慮因素,例如如Kabat(Kabat等人,在上述引文中)按目錄分類。Kabat編號方案(系統)為一種廣泛採取的用於以一致方式對抗體可變域之胺基酸殘基進行編號的標準且為本發明中應用以及本文別處提及之較佳方案。其他的結構考慮因素亦可用於確定抗體之典型結構。舉例而言,Kabat編號未完全反映之彼等差異可藉由Chothia等人之編號系統描述及/或藉由其他技術,例如結晶學及二維或三維計算模型化來揭露。因此,可將給定抗體序列放入典型類別中,此尤其允許鑑別適當的經典序列(例如基於希望包括文庫中之多種典型結構)。抗體胺基酸序列之Kabat編號及如Chothia等人,在上述引文中描述之結構考慮因素以及其用於解釋抗體結構典型態樣之推斷描述於文獻中。
CDR3通常為抗體結合位點內分子多樣性之最大來源。舉例而言,H3可短至兩個胺基酸殘基或大於26個胺基酸。此項技術中熟知不同類別免疫球蛋白之次單元結構及三維組態。關於抗體結構之評述,參見Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,編輯Harlow等人,1988。熟習此項技術者將認識到每個次單元結構,例如CH、VH、CL、VL、CDR、FR結構,包含活性片
段,例如結合於抗原之VH、VL或CDR次單元部分,亦即抗原結合片段,或例如結合於及/或活化例如Fc受體及/或補體之CH次單元部分。CDR通常係指Kabat CDR,如Sequences of Proteins of immunological Interest,US Department of Health and Human Services(1991),編輯Kabat等人中描述。關於表徵抗原結合位點之另一個標準係指如Chothia描述之高變環。參見例如Chothia等人,(1987;J.Mol.Biol.227:799-817);及Tomlinson等人(1995)EMBO J.14:4628-4638。又一個標準為Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用之AbM定義。一般參見例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.Antibody Engineering Lab Manual(編輯:Duebel,S.及Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg)中。或者,關於Kabat CDR描述之實施例可使用關於Chothia高變環或AbM定義之環類似描述之關係執行。
組裝及體細胞突變後抗體基因之序列高度改變,且據估計此等改變之基因編碼1010個不同的抗體分子(Immunoglobulin Genes,第2版,編輯Jonio等人,Academic Press,San Diego,CA,1995)。因此,免疫系統提供免疫球蛋白譜系。術語「譜系」係指完全或部分衍生自編碼至少一種免疫球蛋白之至少一種序列的至少一種核苷酸序列。該(等)序列可藉由重鏈之V、D及J區段以及輕鏈之V及J區段的活體內重排產生。或者,該(等)序列可自細胞產生,對此起反應,發生重排,例如活體外刺激。或者,部分或全部該(該等)序列可藉由DNA剪接、核苷酸合成、突變誘發及其他方法獲得,參見例如美國專利5,565,332。譜系可僅包括一種序列或可包括複數個序列,包括遺傳多樣之集合中之一者。
在本發明之意義上術語「結合分子」或「抗體構築體」指示能夠(特異性)結合於標靶分子,即標靶細胞上之細胞表面分子及CD3,
與其相互作用或識別其的任何分子。此類分子或構築體可包括蛋白質部分及非蛋白質部分(例如化學連接子或化學交聯劑,諸如戊二醛)。
若使用連接子,則較佳地,此連接子長度及序列足以保證第一、第二及第三結構域中之每一者可彼此獨立地保留其有差別的結合特異性。最佳地,且如隨附實例中所證明,本發明之結合分子為一種「雙特異性單鏈結合分子」,更佳地,為一種雙特異性單鏈Fv(scFv)。此項技術中已知雙特異性單鏈分子且描述於以下:WO 99/54440;Mack,J.Immunol.(1997),158,3965-3970;Mack,PNAS,(1995),92,7021-7025;Kufer,Cancer Immunol.Immunother.,(1997),45,193-197;Löffler,Blood,(2000),95,6,2098-2103;Brühl,Immunol.,(2001),166,2420-2426;Kipriyanov,J.Mol.Biol.,(1999),293,41-56中。
本文中描述之結合分子中所包含的該等可變結構域可藉由其他的連接子序列連接。根據本發明術語「肽連接子」定義一種胺基酸序列,本發明結合分子之第一結構域、第二結構域及第三結構域之胺基酸序列藉由其來互相連接。此類肽連接子之一本質技術特徵為該肽連接子不包含任何聚合活性。適合肽連接子為美國專利4,751,180及4,935,233或WO 88/09344中描述之肽連接子。肽連接子之一較佳實施例特徵為胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,亦即Gly4Ser,或其聚合物,亦即(Gly4Ser)x,其中x為整數1或更大。缺乏二級結構促進之該肽連接子之特徵為此項技術中已知且描述於例如Dall'Acqua等人(Biochem.(1998)37,9266-9273)、Cheadle等人(Mol Immunol(1992)29,21-30)以及Raag及Whitlow(FASEB(1995)9(1),73-80)中。亦不促進任何二級結構之肽連接子為較佳。該等結構域彼此之連接可藉由例如遺傳工程改造,如實例中描述來提供。關於製備融合及可操作地連接之雙特異性單鏈構築體以及在哺乳動物細胞或細菌中表現其的方法
為此項技術中熟知(例如WO 99/54440或Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2001)。
對於連接本發明結合分子中之結合結構域的肽連接子而言,較佳為僅包含幾個胺基酸殘基,例如12個胺基酸殘基或更少胺基酸殘基的肽連接子。因此,較佳為具有12、11、10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基之肽連接子。具有少於5個胺基酸之設想肽連接子包含4、3、2或1個胺基酸,其中富含Gly連接子為較佳。在該「肽連接子」背景下一尤其較佳之「單一」胺基酸為Gly。因此,該肽連接子可由單一胺基酸Gly組成。
如本文中所用之術語「多特異性」係指包含至少能夠結合於至少一種其他抗原或標靶的本發明結合分子。
亦設想本發明之結合分子具有除了對血清白蛋白之特異性及除了其結合於標靶細胞上之細胞表面分子及CD3以外的另一功能。以此格式,抗體構築體為一種多功能抗體構築體,其經由結合於標靶細胞上之細胞表面分子靶向細胞,經由CD3結合介導細胞毒性T細胞活性,且經由募集效應細胞,如NK細胞,提供另一功能,諸如完全功能Fc恆定結構域介導之抗體依賴性細胞毒性,用作標記(螢光等)、治療劑(諸如例如毒素或放射性核素)及/或增加血清半衰期之手段等等。
結合本發明,術語「結合結構域」表徵一種能夠特異性地結合於給定標靶抗原決定基或標靶細胞上標靶細胞表面分子上的給定標靶位點及CD3/與其相互作用的結構域。
結合結構域可衍生自諸如例如抗體之結合結構域。設想本發明之結合結構域至少包含任何上述結合結構域的結合於給定標靶抗原決定基或標靶細胞上細胞表面分子上之給定標靶位點及CD3/與其相互作用所需的該部分。
設想上述結合結構域供體之結合結構域特徵為負責結合各別標靶之此等供體的部分,亦即當該部分自結合結構域供體移除時,該供體喪失其結合能力。「喪失」意謂當與結合供體相比較時,結合能力降低至少50%。定位此等結合位點之方法為此項技術中所熟知-因此,熟習此項技術者能夠鎖定/定位結合結構域供體之結合位點,且由此,自各別結合結構域供體「產生」該結合結構域。
術語「抗原決定基」係指抗原上諸如抗體或免疫球蛋白或者抗體或免疫球蛋白之衍生物或片段特異性結合之位點。「抗原決定基」為抗原性的且因此術語抗原決定基有時在本文中亦稱為「抗原結構」或「抗原決定子」。因此,結合結構域為「抗原相互作用位點」。亦瞭解該結合/相互作用定義「特異性識別」。在一個實例中,(特異性)結合於給定標靶抗原決定基或標靶細胞上細胞表面分子上之給定標靶位點及CD3/與其相互作用之該結合結構域為抗體或免疫球蛋白,且該結合結構域為抗體或免疫球蛋白之VH及/或VL區。
「抗原決定基」可藉由鄰接胺基酸或藉由蛋白質三級摺疊而毗鄰之非鄰接胺基酸形成。「線性抗原決定基」為胺基酸一級序列包含所識別之抗原決定基的抗原決定基。線性抗原決定基通常包括呈獨特順序之至少3個或至少4個,且更通常至少5個或至少6個或至少7個,例如約8至約10個胺基酸。
與線性抗原決定基對比,「構形抗原決定基」為其中包含抗原決定基之胺基酸一級序列並非所識別抗原決定基之唯一界定組分的抗原決定基(例如其中胺基酸一級序列不一定由結合結構域識別之抗原決定基)。通常構形抗原決定基包含相對於線性抗原決定基增加數目之胺基酸。關於構形抗原決定基之識別,結合結構域識別抗原之三維結構,較佳肽或蛋白質或其片段(在本發明上下文中,結合結構域之一的抗原包含在標靶細胞上之細胞表面分子內)。舉例而言,當蛋白質
分子摺疊形成三維結構時,形成構形抗原決定基之某些胺基酸及/或多肽主鏈變得毗鄰,使抗體能夠識別抗原決定基。確定抗原決定基構形之方法包括(但不限於)x射線結晶學、二維核磁共振(2D-NMR)光譜學及定點自旋標記及電子順磁共振(EPR)光譜學。此外,所提供之實例描述另一種藉助於重新分級來表徵給定結合結構域之方法,其包括測試給定結合結構域是否結合於給定蛋白質之一或多個抗原決定基叢,尤其標靶細胞上之細胞表面分子。
如本文中所用之術語「抗原決定基叢」表示在抗原之界定鄰接延伸內的全部抗原決定基。抗原決定基叢可包含一個、兩個或更多個抗原決定基。抗原決定基叢之觀念亦用於表徵本發明結合分子之特徵。
術語「(能夠)結合於」、「特異性識別」、「針對」及「與……反應」意謂根據本發明,結合結構域能夠特異性地與抗原決定基之一或多個、較佳至少兩個、更佳至少三個且最佳至少四個胺基酸相互作用。
如本文中所用之術語「特異性相互作用」、「特異性結合(specifically binding)」或「特異性結合(specifically bind(s))」意謂結合結構域顯示對特定蛋白質或抗原可評估的親和力,且一般不顯示與除標靶細胞上之細胞表面分子或CD3以外之蛋白質或抗原的顯著反應性。「可評估的親和力」包括以約10-6M(KD)或更強之親和力結合。較佳地,當結合親和力為約10-12至10-8M、10-12至10-9M、10-12至10-10M、10-11至10-8M,較佳約10-11至10-9M時,認為結合為特異性的。結合結構域是否與標靶特異性反應或結合可容易尤其藉由將該結合結構域與標靶蛋白或抗原的反應同該結合結構域與除標靶細胞上之細胞表面分子或CD3外之蛋白質或抗原的反應進行比較來測試。較佳地,本發明之結合結構域基本上不結合或不能夠結合於除標靶細胞上之細
胞表面分子或CD3以外的蛋白質或抗原(亦即第二結合結構域不能夠結合於除標靶細胞上之細胞表面分子以外的蛋白質且第三結合結構域不能夠結合於除CD3以外的蛋白質)。
術語「基本上不結合」或「不能夠結合」意謂本發明之結合結構域不結合除標靶細胞上之所選細胞表面分子或CD3以外的另一種蛋白質或抗原,亦即顯示與除標靶細胞上之細胞表面分子或CD3以外的蛋白質或抗原的反應性不超過30%,較佳不超過20%,更佳不超過10%,尤其較佳不超過9%、8%、7%、6%或5%,其中結合於標靶細胞上之細胞表面分子或CD3分別設為100%。
咸信特異性結合受到結合結構域之胺基酸序列中特定基元及抗原影響。因此,作為其一級、二級及/或三級結構之結果以及該等結構之二次修飾之結果,實現結合。抗原相互作用位點與其特異性抗原之特異性相互作用可引起該位點與該抗原之簡單結合。此外,或者或另外,例如由於誘發抗原構形之變化、抗原寡聚等等,抗原相互作用位點與其特異性抗原之特異性相互作用引發信號。
蛋白質(包括其片段,較佳生物活性片段,及通常具有少於30個胺基酸之肽)包含一或多個經由共價肽鍵彼此偶合之胺基酸(產生胺基酸鏈)。如本文中所用之術語「多肽」描述由超過30個胺基酸組成之一組分子。多肽進一步形成多聚物,諸如二聚物、三聚物及更高級寡聚物,亦即由超過一個多肽分子組成。形成此類二聚物、三聚物等等之多肽分子可為一致或不一致的。此類多聚物之對應高級結構因此稱為同二聚物或雜二聚物、同三聚物或雜三聚物等等。雜多聚物之一個實例為抗體分子,其在其天然存在之形式中,由兩個一致多肽輕鏈及兩個一致多肽重鏈組成。術語「多肽」及「蛋白質」亦指天然修飾之多肽/蛋白質,其中修飾例如藉由轉譯後修飾,如糖基化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾來實現。「多肽」在本文中提及時亦可經化學修
飾,諸如聚乙二醇化。此類修飾為此項技術中所熟知。
「分離」在用以描述本文中揭示之結合分子時意謂結合分子已自其產生環境之組分鑑別,分離及/或回收。較佳地,分離之結合分子不與來自其產生環境之所有其他組分締合。其產生環境之污染組分,諸如由重組轉染細胞產生之組分,為通常將干擾多肽之診斷或治療用途的物質,且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶解物。在較佳實施例中,結合分子將純化:(1)至足以獲得N-端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度,利用旋杯式測序儀;或(2)至均質,利用SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色。然而,分離之抗體通常將由至少一個純化步驟來製備。
涵蓋本文中描述之結合分子之胺基酸序列修飾。舉例而言,可需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性。結合分子之胺基酸序列變異體藉由將適當的核苷酸變化引入結合分子核酸或藉由肽合成來製備。
此類修飾包括例如結合分子之胺基酸序列內殘基的缺失及/或插入及/或取代。進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體,其限制條件為該最終構築體具有所需特徵。胺基酸變化亦可改變結合分子之轉譯後過程,諸如改變糖基化位點之數目或位置。較佳地,CDR中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸可取代,而構架區(FR)中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸可取代。取代較佳為如本文中描述之保守性取代。或者或另外,每個CDR中1、2、3、4、5或6個胺基酸可插入或缺失(當然視其長度而定),而每個FR中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸可插入或缺失。
一種適用於鑑別結合分子之作為突變誘發較佳位置之某些殘基
或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」,如Cunningham及Wells,Science,244:1081-1085(1989)所述。此處,結合分子內殘基或一組標靶殘基經鑑別(例如帶電荷殘基,諸如arg、asp、his、lys及glu)且由中性或帶負電荷胺基酸(最佳丙胺酸或聚丙胺酸)置換以影響胺基酸與抗原決定基之相互作用。
隨後,藉由在取代位點處或為取代位點引入進一步或其他變異體來改進彼等證明對取代具有功能敏感性之胺基酸位置。因此,雖然引入胺基酸序列變異之位點預先確定,但突變之性質本身無需預先確定。舉例而言,為研究給定位點處突變之效能,在標靶密碼子或區域進行ala掃描或隨機突變誘發且針對所需活性篩選所表現之結合分子。
較佳地,胺基酸序列插入包括長度在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基至包含一百或一百以上殘基之多肽範圍內的胺基及/或羧基端融合,以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。結合分子之插入變異體包括與酶之抗體之N-或C-端的融合,或與增加抗體血清半衰期之多肽的融合。
另一類型變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體較佳使結合分子中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基經不同殘基置換。取代突變誘發之最大關注位點包括重鏈及/或輕鏈之CDR,尤其高變區,但亦涵蓋重鏈及/或輕鏈中之FR改變。
舉例而言,若CDR序列包括6個胺基酸,則設想此等胺基酸中之一個、兩個或三個經取代。類似地,若CDR序列包括15個胺基酸,則設想此等胺基酸中之一個、兩個、三個、四個、五個或六個經取代。
一般而言,若重鏈及/或輕鏈之CDR中之一者或多者或全部中胺基酸經取代,則此後獲得之「經取代」之序列與「原始」CDR序列較佳至少60%,更佳65%,甚至更佳70%,尤其較佳75%,尤其更佳80%
一致。此意謂與「經取代」之序列一致的程度視CDR長度而定。舉例而言,具有5個胺基酸之CDR較佳與其經取代序列80%一致,以具有至少一個經取代之胺基酸。因此,結合分子之CDR可與其經取代序列具有不同程度之一致性,例如CDRL1可具有80%,而CDRL3可具有90%。
較佳取代(或置換)為保守性取代。然而,設想任何取代(包括非保守性取代或來自下表1中列出之「示範性取代」之一或多者),只要結合分子保留其經由第二結合結構域結合於標靶細胞上之細胞表面分子以及經由第三結合結構域結合於CD3ε的能力及/或其CDR與隨後經取代序列具有一致性(與「原始」CDR序列至少60%,更佳65%,甚至更佳70%,尤其較佳75%,尤其更佳80%一致)即可。
保守性取代以標題「較佳取代」展示於表1中。若此類取代引起生物活性變化,則可引入更實質的變化,表1中名為「示範性取代」,或如下關於胺基酸類別進一步所述,且針對所需特徵篩選產物。
本發明結合分子之生物特性的實質修飾藉由選擇對維持以下之影響顯著不同之取代實現:(a)取代區域中多肽主鏈之結構,例如呈片狀或螺旋構形;(b)標靶位點處分子之電荷或疏水性;或(c)側鏈之體積。基於常見的側鏈特性,天然存在之殘基分成以下各群:(1)疏水性:正白胺酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中性親水性:cys、ser、thr;(3)酸性:asp、glu;(4)鹼性:asn、gin、his、lys、arg;(5)影響鏈取向之殘基:gly、pro;及(6)芳族:trp、tyr、phe。
非保守性取代將需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別。未參與維持結合分子之適當構形的任何半胱胺酸殘基可一般經絲胺酸取代,以提高分子之氧化穩定性且阻止異常交聯。反之,可在抗體中添加半胱胺酸鍵以提高其穩定性(尤其在抗體為諸如Fv片段之抗體片段的情況下)。
取代變異體之一尤其較佳類型包括取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言,選擇用於進一步研發之所得變異體應相對於產生其之親本抗體具有改良之生物特性。用於產生該等取代變異體之一種適宜方法包括使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言之,若干高變區位點(例如6-7個位點)突變,產生每個位點所有可能的胺基酸取代。由此產生之抗體變異體以單價方式以與封裝於各顆粒中之M13之基因III產物的融合物形式自絲狀噬菌體顆粒呈現。接著如本文中所揭示,針對其生物活性(例如結合親和力)篩選噬菌體呈現之變異體。為鑑別用於修飾之候選高變區位點,可進行丙胺酸掃描突變誘發以鑑別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。或者或另外,分析抗原-抗體複合物之晶體結構可為有益的,以鑑別結合結構域與例如標靶細胞上之人類細胞表面分子之間的接觸點。該等接觸殘基及
相鄰殘基為用於根據本文中詳述之技術取代的候選物。在產生此等變異體後,如本文所述對變異體組進行篩選,且可在一或多個相關分析中選擇具有優良特性之抗體用於進一步研發。
本文中涵蓋結合分子之其他修飾。舉例而言,結合分子可連接於多種非蛋白質聚合物之一,例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物。結合分子亦可捕集於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(例如分別羥甲基纖維素或明膠-微膠囊與聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中,膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中,或巨乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.編(1980)中。
本文中揭示之結合分子亦可調配為免疫脂質體。「脂質體」為由各種類型之脂質、磷脂及/或適用於遞送藥物至哺乳動物之界面活性劑構成的小微脂粒。脂質體之組分通常排列為雙層形式,類似於生物膜之脂質排列。含有抗體之脂質體藉由此項技術中已知之方法製備,諸如Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985);Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,77:4030(1980);美國專利第4,485,045號及第4,544,545號;及1997年10月23日公開之WO 97/38731中描述。循環時間提高之脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。尤其適用之脂質體可藉由逆相蒸發法使用包含膽鹼磷脂、膽固醇及PEG衍生化之磷酯醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物產生。脂質體經具有界定孔徑之過濾器擠出以產生具有所需直徑之脂質體。本發明抗體之Fab'片段可經由二硫化物交換反應而結合於如Martin等人,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述之脂質體。脂質體中視情況含有化學治療劑。參見Gabizon等人J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
當使用重組技術時,結合分子可在細胞內、在周質間隙中產生,或直接分泌至培養基中。若結合分子於細胞內產生,則作為第一步驟,例如藉由離心或超濾移除宿主細胞或已溶解片段之顆粒碎片。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述分離分泌至大腸桿菌之周質間隙中之抗體的程序。
由該等細胞所製備之抗體分子組合物可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化,其中親和層析為較佳純化技術。
術語「核酸」為熟習此項技術者熟知且包括DNA(諸如cDNA)及RNA(諸如mRNA)。核酸可為雙股及單股,線性及環形。該核酸分子較佳包含在較佳包含在寄主細胞中之載體中。該寄主細胞例如在經本發明之核酸序列轉型或轉染後能夠表現結合分子。為此,核酸分子與控制序列可操作地連接。
載體為用作將(外來)遺傳物質轉移至細胞中之運載體的核酸分子。術語「載體」包括但不限於質體、病毒、黏質體及人工染色體。一般而言,工程改造之載體包含複製起點、多選殖位點及選擇性標記物。載體本身一般為核苷酸序列,常見為DNA序列,其包含插入物(轉殖基因)及用作載體「主鏈」之較大序列。除轉殖基因插入物及主鏈外,現代載體可包括其他特徵:啟動子、遺傳標記物、抗生素抗性、報導基因、靶向序列、蛋白質純化標籤。稱為表現載體(表現構築體)之載體特異性用於轉殖基因在標靶細胞中之表現,且一般具有控制序列,諸如驅動轉殖基因表現之啟動子序列。載體插入標靶細胞中對於細菌通常稱為「轉型」,對於真核細胞,為「轉染」,不過病毒載體之插入亦稱為「轉導」。
如本文中所用之術語「宿主細胞」意指編碼本發明結合分子之核酸藉助於轉型、轉染及其類似方式引入之細胞。應瞭解,該等術語
不僅係指特定個體細胞,而且亦指此種細胞之子代或潛在子代。由於某些修飾可能因突變或環境影響而在繼代中存在,所以該子代實際上可能不與母細胞一致,但其仍包括在如本文所用之該術語之範疇內。
如本文中所用之術語「表現」包括與本發明結合分子之產生有關的任何步驟,包括(但不限於)轉錄、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後修飾及分泌。
術語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需之DNA序列。適於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱子序列(operator sequence)及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。
當一種核酸置置於與另一種核酸序列之功能關係時其為「可操作地連接」。舉例而言,若前序列或分泌性前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前體蛋白,則其與該多肽之DNA可操作地連接;若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄,則其與該序列可操作地連接;或若核糖體結合位點經定位以便有助於轉譯,則其與編碼序列可操作地連接。一般而言,「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列相鄰且在分泌性前導序列之情況下,相鄰且在閱讀相(reading phase)中。然而,增強子不必為相鄰的。連接係藉由在適宜限制性位點處接合來實現。若該等位點不存在,則根據慣例使用合成寡核苷酸接附子或連接子。
術語「宿主細胞」、「標靶細胞」或「受體細胞」意欲包括可為或已為載體接受者或併入外來核酸分子、多核苷酸及/或蛋白質之任何個別細胞或細胞培養物。其亦意欲包括單個細胞之子代,且該子代由於天然、意外或故意突變而可能不一定完全一致(形態學或基因組或總DNA補體上)。細胞可為原核或真核細胞,且包括(但不限於)細菌、酵母細胞、動物細胞及哺乳動物細胞,例如鼠科、大鼠、獼猴或人類。
適合的宿主細胞包括原核及真核宿主細胞,包括酵母、真菌、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。
本發明之結合分子可在細菌中產生。表現後,本發明之結合分子,較佳結合分子在可溶部分中與大腸桿菌細胞漿分離,且可經由例如親和層析法及/或尺寸排除加以純化。最終純化可類似於關於純化例如在CHO細胞中表現之抗體的方法進行。
除原核生物之外,真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)為適合於本發明之結合分子的選殖或表現宿主。在低級真核宿主微生物中最常使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通麵包酵母。然而,許多其他屬、種及菌株通常可得且適用於本文中,諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe);刻魯維拉菌(Kluyveromyce)宿主,諸如例如乳酸刻魯維拉菌(K.lactis)、脆壁刻魯維拉菌(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亞刻魯維拉菌(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、魏氏刻魯維拉菌(K.wickeramii)(ATCC 24178)、瓦爾特刻魯維拉菌(K.waltii)(ATCC 56500)、果蠅刻魯維拉菌(K.drosophilarum)(ATCC 36906)、耐熱刻魯維拉菌(K.thermotolerans)及馬克斯刻魯維拉菌(K.marxianus);耶氏酵母(yarrowia)(EP 402 226);甲醇酵母(Pichia pastoris)(EP 183 070);念珠菌屬(Candida);里氏木黴(Trichoderma reesia)(EP 244 234);粗糙脈孢菌(Neurospora crassa);許旺酵母屬(Schwanniomyce),諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis);及絲狀真菌,諸如例如脈孢菌屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)及麴菌屬(Aspergillus)宿主,諸如構巢麴菌(A.nidulans)及黑麴菌(A.niger)。
適合於表現本發明之糖基化結合分子,較佳抗體來源結合分子之宿主細胞係衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株及變異體以及來自諸如以下的相
應許可昆蟲宿主細胞:草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)及家蠶(Bombyx mori)之宿主。用於轉染之多種病毒株公開可得,例如苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica)NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5病毒株,且根據本發明該等病毒可用作本文中之病毒,尤其用於轉染草地黏蟲細胞。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛花(petunia)、番茄、擬南芥屬(Arabidopsis)及菸草之植物細胞培養物亦可用作宿主。適用於在植物細胞培養物中產生蛋白質之選殖及表現載體為熟習此項技術者所知。參見例如Hiatt等人,Nature(1989)342:76-78;Owen等人(1992)Bio/Technology 10:790-794;Artsaenko等人(1995)The Plant J 8:745-750;及Fecker等人(1996)Plant Mol Biol 32:979-986。
然而,脊椎動物細胞最受關注,且脊椎動物細胞於培養物(組織培養物)中之繁殖已成為一種常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7,ATCC CRL 1651);人類胚腎細胞株(293或針對在懸浮培養物中生長進行次選殖之293細胞,Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977));幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));小鼠足細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細胞(CVI ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL1587);人類子宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2);犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34);水牛大鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75);人類肝細胞(Hep G2,1413 8065);小鼠乳房腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL5 1);TRI細胞(Mather等人,Annals N.Y Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC 5細胞;FS4細胞;及人類肝細胞瘤細
胞株(Hep G2)。
當使用重組技術時,本發明之結合分子可在細胞內、在周質間隙中產生,或直接分泌至培養基中。若結合分子於細胞內產生,則作為第一步驟,例如藉由離心或超濾移除宿主細胞或已溶解片段之顆粒碎片。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述用於分離分泌至大腸桿菌之周質間隙中的抗體之程序。簡言之,細胞漿在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯基氟(PMSF)存在下經約30分鐘解凍。可藉由離心移除細胞碎片。在抗體分泌至培養基中之情形下,一般首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮此等表現系統之上清液。在任何先前步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解,且可包括抗生素以防止外來污染物生長。
由宿主細胞製備之本發明結合分子可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化,其中親和層析為較佳純化技術。
雖然親和配位體所連接之基質最常為瓊脂糖,但可利用其他基質。與用瓊脂糖可達成之流動速率及處理時間相比,機械穩定性基質(諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)流動速率更快且處理時間更短。在本發明之結合分子包含CH3結構域之情況下,Bakerbond ABXMresin(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)適用於純化。亦可視欲回收之抗體而定,利用其他用於蛋白質純化之技術,諸如離子交換管柱上之分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素層析、SEPHAROSETM陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。
術語「培養」係指在培養基中在適合條件下細胞之活體外供養、分化、生長、增殖及/或繁殖。
如本文中所用之術語「醫藥組合物」係指投與患者,較佳人類
患者之組合物。尤其較佳之本發明醫藥組合物包含本發明之結合分子。較佳地,醫藥組合物包含載劑、穩定劑及/或賦形劑之適合調配物。在一較佳實施例中,醫藥組合物包含用於非經腸、經皮、管腔內、動脈內、鞘內及/或鼻內投與或藉由直接注入組織中的組合物。尤其設想該組合物經由輸注或注射投與患者。適合組合物之投與可受到不同的方式影響,例如藉由靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部或真皮內投與。詳言之,本發明提供適合組合物之連續投與。作為一非限制性實例,不間斷,亦即,連續投與可藉由患者佩戴之小泵系統實現,該小泵系統用於計量流入患者體內之治療劑之流入量。包含本發明結合分子之醫藥組合物可藉由使用該泵系統投與。此類泵系統一般為此項技術中已知,且通常依賴於包含待輸注之治療劑之藥筒的週期交換。當此類泵系統中之藥筒交換時,治療劑之另外不間斷流入患者體內可臨時中斷。在此類情況下,在藥筒置換前的投與階段及在藥筒置換後的投與階段仍認為在醫藥手段的含義內且本發明之方法一起構成此類治療劑之一個「不間斷投與」。
本發明之此等結合分子的連續或不間斷投與可藉助於流體遞送裝置或小泵系統靜脈內或皮下進行,該流體遞送裝置或小泵系統包括用於驅動流體離開儲集器之流體驅動機構及用於致動驅動機構之致動機構。用於皮下投與之泵系統可包括用於穿透患者皮膚且遞送適合組合物至患者體內之針或套管。該等泵系統可直接固定或連接到與靜脈、動脈或血管無關之患者皮膚,由此允許泵系統與患者皮膚之間直接接觸。泵系統可連接至患者皮膚達24小時至長達數天。泵系統可具有小尺寸,具有小體積之儲集器。作為一非限制性實例,用於待投與之適合醫藥組合物之儲集器體積可在0.1與50ml之間。
連續投與可藉助於戴在皮膚上且每隔一段時間置換之貼片經皮進行。熟習此項技術者瞭解適於達成此目的之用於藥物遞送的貼片系
統。注意,經皮投與尤其適於不間斷投與,因為第一廢棄之貼片之交換可有利地與新的第二貼片之置放同時實現,該第二貼片置放在例如皮膚表面上與第一廢棄之貼片相鄰且在即將移除第一廢棄貼片時進行。流動中斷或電池故障之問題不會出現。
本發明之組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑。適合醫藥載劑之實例為此項技術中熟知且包括溶液,例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)、各種類型之濕潤劑、無菌溶液、脂質體等。包含所述載劑之組合物可藉由熟知之習知方法調配。調配物可包含碳水化合物、緩衝溶液、胺基酸及/或界面活性劑。碳水化合物可為非還原糖,較佳為海藻糖、蔗糖、八硫酸酯、山梨糖醇或木糖醇。一般而言,如本文所用,「醫藥學上可接受之載劑」意謂與醫藥投與相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑。醫藥活性物質之此類介質及試劑的使用為此項技術中所熟知。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用劑量及濃度下對接受者而言為無毒的,且包括:其他緩衝劑;防腐劑;共溶劑;抗氧化劑,包括抗壞血酸及甲硫胺酸;螯合劑,諸如EDTA;金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物);生物可降解之聚合物,諸如聚酯;成鹽相對離子,諸如鈉、多羥糖醇;胺基酸,諸如丙胺酸、甘胺酸、天冬醯胺、2-苯丙胺酸及蘇胺酸;糖或糖醇,諸如海藻糖、蔗糖、八硫酸酯、山梨糖醇或木糖醇、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌醇(myoinositol)、半乳糖醇、甘油、環醇(例如環己六醇)、聚乙二醇;含硫還原劑,諸如麩胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸鈉、硫代甘油、[α]-硫代甘油及硫代硫酸鈉;低分子量蛋白質,諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白;及親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯啶酮。該等調配物可用於連續投與,該等投與可為靜脈內或皮下的,使用及/或不使用泵系統。胺基酸可為帶電胺基酸,較佳
為離胺酸、離胺酸乙酸鹽、精胺酸、麩胺酸及/或組胺酸。界面活性劑可為清潔劑,較佳分子量>1.2KD,及/或聚醚,較佳分子量>3KD。較佳清潔劑之非限制性實例為吐溫(Tween)20、吐溫40、吐溫60、吐溫80或吐溫85。較佳聚醚之非限制性實例為PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000或PEG 5000。本發明中所用之緩衝系統可具有5-9之較佳pH值且可包含檸檬酸鹽、丁二酸鹽、磷酸鹽、組胺酸及乙酸鹽。
本發明之組合物可以適合劑量投與個體,劑量可例如藉由劑量升高研究,藉由投與遞增劑量之對非黑猩猩靈長類動物(例如獼猴)顯示出本文所述之跨物種特異性的本發明多肽來確定。如以上所闡述,顯示出本文所述之跨物種特異性的本發明結合分子可有利地以一致形式用於在非黑猩猩靈長類動物中之臨床前測試中及在人類中用作藥物。此等組合物亦可與其他蛋白質及非蛋白質藥物組合投與。此等藥物可與包含如本文中定義之本發明多肽的組合物同時或在該多肽投與之前或之後以界定適合之間隔及劑量分開投與。給藥方式將由主治醫師及臨床因素決定。如醫藥技術中所熟知,對於任一患者而言,劑量將視諸多因素而定,包括患者體型、體表面積、年齡、待投與之特定化合物、性別、投藥時間及途徑、一般健康狀況及同時投與之其他藥物。
非經腸投藥之製劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油之植物油以及諸如油酸乙酯之可注射有機酯。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液,包括生理食鹽水及經緩衝之培養基。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充液、電解質補充液(諸如基於林格氏右旋糖之電解質補充液)及其類似物。防腐劑
及其他添加劑亦可存在,諸如例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體及其類似物。另外,本發明之組合物可包含蛋白質載劑,如例如血清白蛋白或免疫球蛋白,較佳來自人類。設想本發明之組合物除本文中定義之本發明多肽外可包含其他生物活性劑,視組合物之所欲用途而定。該等藥劑可為作用於胃腸系統之藥物、充當細胞抑制劑之藥物、防止高尿酸血之藥物、抑制免疫反應之藥物(例如皮質類固醇)、調節發炎反應之藥物、作用於循環系統之藥物及/或此項技術中已知之藥劑,諸如細胞因子。亦設想本發明之結合分子以共療法,亦即與另一抗癌藥劑組合施加。
本文中定義之醫藥組合物之生物活性可例如藉由如以下實例中、WO 99/54440中或藉由Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.20(2005),1-12)所述之細胞毒性分析測定。如本文所用之「功效」或「活體內功效」係指使用例如標準化NCI反應準則,對本發明醫藥組合物之療法的反應。使用本發明醫藥組合物之療法的成功或活體內功效係指組合物對於其所欲目的之有效性,亦即組合物產生其所需作用,亦即消耗病理性細胞,例如腫瘤細胞之能力。活體內功效可藉由針對相應疾病實體已確定的標準方法監測,包括(但不限於)白血球數、差異、螢光活化細胞分選、骨髓抽吸。另外,可使用各種疾病特定的臨床化學參數及其他已確定的標準方法。此外,可使用電腦輔助斷層攝影術、X射線、核磁共振斷層攝影術(例如基於美國國家癌症研究所準則之反應評估(National Cancer Institute-criteria based response assessment)[Cheson BD,Horning SJ,Coiffier B,Shipp MA,Fisher RI,Connors JM,Lister TA,Vose J,Grillo-Lopez A,Hagenbeek A,Cabanillas F,Klippensten D,Hiddemann W,Castellino R,Harris NL,Armitage JO,Carter W,Hoppe R,Canellos GP.Report of an international workshop to standardize response criteria for non-
Hodgkin's lymphomas.NCI Sponsored International Working Group.J Clin Oncol.1999年4月;17(4):1244])、正電子發射斷層攝影術掃描、白血球數、差異、螢光活化細胞分選、骨髓抽吸、淋巴結生檢/組織學及各種淋巴瘤特定的臨床化學參數(例如乳酸去氫酶)及其他已確定的標準方法。
在發展諸如本發明醫藥組合物之藥物的過程中另一個重大挑戰為藥物動力學性質之可預測調節。為此,可建立候選藥物之藥物動力學型態,亦即影響特定藥物治療給定病狀之能力的藥物動力學參數之型態。影響藥物治療某一疾病實體之能力之藥物的藥物動力學參數包括(但不限於):半衰期、分佈體積、肝臟首次代謝及血清結合程度。給定藥劑之功效可受上文所提及之每一參數影響。
「半衰期」意謂50%所投藥物經由例如代謝、排泄等生物過程除去之時間。
「肝臟首次代謝」意謂藥物在第一次與肝臟接觸時,亦即在其第一次通過肝臟期間之代謝傾向。
「分佈體積」意謂藥物在身體各個隔室,如例如細胞內及細胞外間隙、組織及器官等中之滯留程度,以及藥物在此等隔室內之分佈。
「血清結合程度」意謂藥物與血清蛋白(諸如白蛋白)相互作用及結合於其,引起藥物生物活性降低或損失之傾向。
藥物動力學參數亦包括針對給定量之所投藥物的生物利用率、滯後時間(Tlag)、Tmax、吸收速率、更多發作及/或Cmax。「生物利用率」意謂血液隔室中藥物之量。「滯後時間」意謂投藥與血液或血漿中其偵測及可量測性之間的時間延遲。
「Tmax」為達到藥物最大血液濃度之時間,且「Cmax」為由給定藥物最大程度得到之血液濃度。達到藥物之生物效應所需之藥物血液或組織濃度的時間受所有參數影響。顯示出跨物種特異性之雙特異
性單鏈抗體之藥物動力學參數亦闡述於例如Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.20(2005),1-12)之公開案中,該等參數可在如以上概述之非黑猩猩靈長類動物中之臨床前動物試驗中測定。
如本文所用之術語「毒性」係指在不良事件或嚴重不良事件中顯現之藥物毒性作用。此等負面事件可指投藥後總體上缺乏藥物耐受性及/或缺乏局部耐受性。毒性亦可包括由藥物所引起之致畸或致癌效應。
如本文所用之術語「安全性」、「活體內安全性」或「耐受性」定義在投與後未立即誘發(局部耐受性)及在施用藥物長時間期間未誘發嚴重不良事件之投藥。「安全性」、「活體內安全性」或「耐受性」可例如在治療及追蹤隨訪期間定期評估。量測包括臨床評估,例如器官顯現及實驗室異常篩選。臨床評估可根據NCI-CTC及/或MedDRA標準進行且對與正常發現之偏差進行記錄/編碼。器官顯現可包括諸如過敏症/免疫學、血液/骨髓、心律失常、凝血及其類似物之準則,如例如the Common Terminology Criteria for adverse events v3.0(CTCAE)中闡述。可測試之實驗室參數包括例如血液學、臨床化學、凝血型態及尿分析以及其他體液(諸如血清、血漿、淋巴或脊髓液、液體及其類似物)之檢查。安全性因此可例如藉由身體檢查、成像技術(亦即超音波、x射線、CT掃描、磁共振成像MRI)、使用技術裝置之其他手段(亦即心電圖)、生命徵象,藉由量測實驗室參數及記錄不利事件評估。舉例而言,根據本發明之用途及方法中非黑猩猩靈長類動物中之不利事件可藉由組織病理學及/或組織化學方法檢查。
術語「有效劑量(effective dose)」或「有效劑量(effective dosage)」定義為足以實現或至少部分實現所需效應之量。術語「治療有效劑量」定義為足以治癒或至少部分抑制疾病及其在已罹患所述疾病之患者中之併發症的量。有效實現此用途之量將視感染嚴重程度
及個體自身免疫系統之整體狀況而定。術語「患者」包括接收預防性或治療性治療之人類及其他哺乳動物個體。
如本文所用之術語「有效及無毒劑量」係指本發明結合分子之可耐受劑量,其足夠高以消耗病理性細胞、消除腫瘤、收縮腫瘤或穩定化疾病而無或基本上無重大毒性作用。該等有效及無毒劑量可例如藉由此項技術中描述之劑量升高研究來確定且應低於誘發嚴重不良負面事件之劑量(劑量限制性毒性,DLT)。
以上術語亦在例如the Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6;ICH Harmonised Tripartite Guideline;ICH Steering Committee meeting,1997年7月16日中提及。
本發明結合分子之適當劑量或治療有效量將視待治療之病狀、病狀嚴重程度、先前療法以及患者臨床病史及對治療劑之反應而定。適當劑量可根據主治醫師之判斷而調整,使得其可一次性投與患者或經一系列投與來投與。醫藥組合物可作為唯一治療劑或如需要,與諸如抗癌療法之其他療法組合投與。
本發明之醫藥組合物尤其適用於非經腸投與,亦即皮下、肌肉內、靜脈內、關節內及/或滑膜內。非經腸投與可藉由快速注射或連續輸注進行。
若醫藥組合物已凍乾,則凍乾材料在投與之前首先在適當液體中復原。凍乾材料可在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)或凍乾前蛋白質所在之相同調配物中復原。
結合於標靶細胞上之細胞表面分子(諸如腫瘤抗原)與T細胞CD3受體複合物之結合分子的作用方式通常已知。使T細胞緊挨標靶細胞,亦即在此情況下嚙合該T細胞導致T細胞殺死標靶細胞。此過程可用於對抗增生性疾病、發炎疾病、傳染性疾病及自體免疫疾病。因此,諸如其他胺基酸序列之任何物質與CD3結合結構域,亦即結合分
子之「效應結構域」或與標靶結合結構域之融合影響結合分子之性質,使得其不再能夠恰當地嚙合T細胞及/或結合於其標靶。實際上,T細胞裝備有含有稱為穿孔素之孔道形成蛋白與稱為顆粒酶之細胞死亡誘發蛋白酶之致命組合的顆粒。此等蛋白質經由細胞溶解突觸遞送至標靶細胞,該細胞溶解突觸僅可在T細胞與旨在殺死之標靶細胞最靠近時形成。通常,T細胞與標靶細胞之間的最靠近藉由T細胞使用其匹配T細胞受體結合於MHC I類/肽複合物來實現。然而,本發明結合分子之作用為在缺乏T細胞受體/MHC相互作用下使T細胞與標靶細胞如此靠近。因此,可想像,諸如其他胺基酸序列之任何物質與本發明結合分子之第一、第二及/或第三結合結構域每一者或全部融合可負面影響其作用,亦即使標靶細胞與T細胞在一起,從而殺死標靶細胞。
由此看來且考慮到非常希望增加結合分子之血清半衰期以穩定化其或防止其快速腎清除及其類似物,熟習此項技術者似乎進退兩難。實際上,雖然半衰期之增加可藉由使結合分子結合於例如血清白蛋白實現,而此需要該結合分子裝備有能夠結合於血清白蛋白之結構域,但此類結構域之添加可能不利地影響該結合分子之性質,例如其可能喪失其作用或至少變得不太有效。
儘管此潛在的困境且考慮到本發明之結合分子可能藉由能夠結合於血清白蛋白之另一結合的添加而至少削弱或甚至不活化,本發明者仍產生除能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子的結合結構域及能夠結合於T細胞CD3受體複合物之結合結構域外亦具有能夠結合於血清白蛋白之另一結合結構域的結合分子。
提供血清白蛋白結合結構域之WO 01/45746完全由熟習此項技術者來決定血清白蛋白結合結構域應與蛋白質、尤其抗體之哪一端稠合-其可為N-端或者C-端且可視情況而定。因此,先前技術未提供指
導。
已意外地發現,位於CD3受體特定結構域之C-端的白蛋白結合結構域與自產生結合結構域之宿主細胞上清液分離的單體分子之不良產率相關。相比之下,當白蛋白結合結構域位於分子N-端時,與以上提及之白蛋白結合結構域位於CD3受體之C-端的結合分子比較,觀測到表現產率及產率顯著增加。
單體分子產率之此增加實際上為意外的,因為更可能料想到添加一致的短白蛋白結合結構域至對細胞表面抗原具有兩種不同特異性的給定結合分子之N-端或C-端具有相似的影響。
考慮到本發明結合分子之商業化生產,觀測到之單體分子較高產率尤其相關。產品品質之此優化允許工作溶液中以及結合分子之最終醫藥調配物中較高化合物濃度。其進一步允許產率相同而醱酵槽體積較小,且純化管柱及其他用於製造產品之設備的成本更低,且因此商品計算之成本較佳。此外,產生細胞上清液中產品之較高生產濃度/濃度允許在生產期間具有更高可接受之產品損失的更嚴格的純化/分離程序,其使得產品與不需組分清晰分離,且因此至較佳更高的產品純度。
更加地,先前技術結合分子,諸如具有兩個結合結構域(一個用於CD3及第二個用於標靶分子,諸如CEA)且裝備有血清白蛋白結合結構域之雙功能抗體,以血清白蛋白結合結構域與結合於標靶細胞之結構域之C-端稠合的方式構築;參見Stork等人,Prot Eng Des Sel 20(11),569-576(2007)及Mueller等人,J Biol Chem 282(17),12650-12660(2007)。因此,亦自先前技術推斷出,血清白蛋白結合結構域應添加至結合於標靶細胞之細胞表面分子之結構域的C-端。類似方法在諸如ABD-DART之DART抗體之構築中進行(參見WO 2010/080538,例如圖45)。
由此看來,儘管先前技術之教示及自先前技術之教示領會之期望,本發明者仍將血清白蛋白結合結構域添加至結合結構域之N-端,其經由結合於細胞表面分子使標靶細胞與T細胞經由結合於T細胞受體複合物嚙合,且成功產生血清半衰期增加且具有所需產率,而仍能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子且結合於T細胞CD3受體複合物的結合分子。由此,以對標靶細胞施加殺死作用之方式嚙合T細胞仍為可行的。因此,結合結構域呈如本文所述之次序(參見例如技術方案1)的本發明結合分子能夠介導由該結合分子所嚙合之T細胞實現的對標靶細胞之細胞毒性。
歸因於本發明結合分子之白蛋白結合結構域,本發明之結合分子較佳具有增加的半衰期及/或在體內較長的存留時間,由此亦提供結合分子之較長功能活性,而其仍可以商業化生產規模所需之量生產。
另外,本發明者已觀測到本發明之結合分子亦能夠在10%(v/v)血清白蛋白、尤其人類血清白蛋白存在下介導活體外細胞毒性。此為一個重要的特徵,因為在人類血清白蛋白中,白蛋白以約10-20%(v/v)存在。實際上,本發明之結合分子在哺乳動物中,尤其在人類中非天然存在,且因此很可能血清白蛋白之存在以某種方式擾亂或干擾本發明結合分子之作用。
舉例而言,在血清白蛋白、尤其人類血清白蛋白存在下的活體外細胞毒性分析可用於測試本發明結合分子介導細胞毒性之能力。
具有如本文所述(例如技術方案1中)之結構域次序(建立/排列)的本發明結合分子之另一驚人特性可主要呈單體形式以高產率產生。詳言之,本發明者發現可自表現該結合分子之宿主細胞獲得的超過80%、85%、90%或甚至95%之結合分子呈單體形式。此為一個重要的特徵,因為二聚體或甚至多聚體為非所希望的,因為認為其喪失大
部分其與標靶細胞(經由細胞表面分子)及/或T細胞(經由T細胞受體複合物)結合之能力。
考慮到以上,本發明提供一種包含至少三個結合結構域之分離之單鏈結合分子,其中(a)第一結合結構域能夠結合於血清白蛋白且位於第二結合結構域之N-端;(b)該第二結合結構域能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子;及(c)第三結合結構域能夠結合於T細胞CD3受體複合物。
如本文所用之術語「標靶細胞上之細胞表面分子」或「細胞表面抗原」表示在細胞表面上呈現之分子。在大多數情況下,此分子將位於細胞之質膜中或上,使得在三級形式中至少部分此分子保持自細胞外易接近。位於質膜中之細胞表面分子之一非限制性實例為在三級構形中包含親水性及疏水性區之跨膜蛋白。此處,至少一個疏水性區允許細胞表面分子包埋或插入細胞之疏水性質膜中,而親水性區分別在質膜兩側上延伸至細胞質及細胞外間隙中。位於質膜上之細胞表面分子之非限制性實例為在半胱胺酸殘基上經修飾以載有軟脂醯基之蛋白質、在C-端半胱胺酸殘基上經修飾以載有法呢基之蛋白質或在C-端經修飾以載有糖基磷脂醯肌醇(「GPI」)錨之蛋白質。此等基團允許蛋白質共價連接至質膜外表面,其中其保持由諸如抗體之細胞外分子易接近以供識別。如自隨附實例所顯而易見,標靶細胞上之細胞表面分子的非限制性實例為CD33分子及CEA分子。適於本文中描述之結合分子格式的CD33之結合結構域詳細描述例如WO 2008/119567中。適於本文中描述之結合分子格式的CEA之對應結合結構域詳細描述例如WO 2007/071426中。
T細胞CD3受體複合物為一種蛋白質複合物且由四條獨特的鏈構
成。在哺乳動物中,複合物含有CD3γ鏈、CD3δ鏈及兩條CD3ε(ε)鏈。此等鏈與稱為T細胞受體(TCR)之分子及ζ鏈締合以在T淋巴細胞中產生活化信號。
標靶細胞經由T細胞藉由多特異性、至少雙特異性結合分子募集之轉向溶解包括細胞溶解突觸形成及遞送穿孔素及顆粒酶。嚙合之T細胞能夠進行連續的標靶細胞溶解,且不受干擾肽抗原加工及呈現之免疫逃避機制或純系T細胞分化的影響;參見例如WO 2007/042261。
第二結合結構域對標靶細胞上之人類細胞表面分子的親和力較佳100nM且更佳50nM。在本發明之一較佳實施例中,親和力15nM,更佳10nM,甚至更佳5nM,甚至更佳1nM,甚至更佳0.5nM,甚至更佳0.1nM,且最佳0.05nM。第二結合結構域對標靶細胞上之獼猴細胞表面分子的親和力較佳100nM且更佳50nM。在本發明之一較佳實施例中,親和力15nM,更佳10nM,甚至更佳5nM,甚至更佳1nM,甚至更佳0.5nM,甚至更佳0.1nM,且最佳0.05nM,或甚至0.01nM。親和力可例如在Biacore分析中或Scatchard分析中量測,例如如實例中所述。結合於標靶細胞上之獼猴細胞表面分子對比標靶細胞上之人類細胞表面分子的親和力間隙較佳為[1:10-1:5]或[5:1-10:1],更佳為[1:5-5:1],且最佳為[1:2-3:1]或甚至[1:1-3:1]。測定親和力之其他方法為熟習此項技術者熟知。
人類抗體、對應人類結合分子避免一些與具有鼠類或大鼠可變及/或恆定區之抗體/結合分子有關的問題。該等鼠類或大鼠來源蛋白質之存在可引起抗體/結合分子之快速清除或可引起患者針對抗體/結合分子之免疫反應的產生。為避免利用鼠類或大鼠來源抗體/結合分子,人類或完全人類抗體可經由引入人類抗體功能至嚙齒動物中以便嚙齒動物產生完全人類抗體來產生。
選殖及重新構築YAC中兆鹼基尺寸之人類基因座及將其引入小鼠
生殖系中的能力提供一種說明非常巨大或粗定位之基因座之功能組分以及產生人類疾病之適用模型的有效方法。此外,利用此技術使得小鼠基因座經其人類同等物取代可提供對在發育期間人類基因產物之表現及調控、其與其他系統之通信以及其在疾病誘發及進展中之牽連獨特的理解。
此類策略之一種重要實際應用為小鼠體液免疫系統之「人類化」。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入內源性Ig基因已不活化之小鼠中提供研究抗體漸進式表現及組裝之根本機制以及其在B細胞發育中之作用的機會。此外,此類策略可提供用於產生完全人類單株抗體(mAb)的一個理想來源,完全人類單株抗體為實現在人類疾病中之抗體療法希望的重要里程碑。完全人類抗體/結合分子預計將小鼠或小鼠來源mAb固有的免疫原性及過敏性反應降至最低,且因此增加所投抗體/結合分子之功效及安全性。完全人類抗體/結合分子之使用可預計在治療需要重複化合物投與之慢性及復發性人類疾病,諸如發炎、自體免疫及癌症中提供實質優勢。
實現此目標之一種方法為預先將缺乏小鼠抗體產生之小鼠品系用大的人類Ig基因座片段工程化,使得該等小鼠將在小鼠抗體缺乏下產生人類抗體之巨大譜系。大的人類Ig片段將保持大的可變基因多樣性以及抗體產生及表現之適當調控。藉由利用小鼠對抗體多樣化及選擇之機制及缺乏對人類蛋白質之免疫耐受性,此等小鼠品系中複製之人類抗體譜系應產生針對任何所關注抗原(包括人類抗原)高親和力抗體。使用融合瘤技術,可容易產生具有所需特異性之抗原特異性人類Mab且進行選擇。結合如1994年公開之第一XenoMouse小鼠品系之產生,顯示此一般策略(參見Green等人Nature Genetics 7:13-21(1994))。XenoMouse品系經含有人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座分別245kb及190kb尺寸之生殖系組態片段(其含有核心可變及恆定區序
列)的酵母人工染色體(YAC)工程化。同前。含有YAC之人類Ig經證明與用於抗體重排及表現之小鼠系統相容且能夠取代不活化小鼠Ig基因。此由其誘發B細胞發育、產生完全人類抗體之成人樣人類譜系及產生抗原特異性人類mAb之能力顯示。此等結果亦表明引入含有更大數目之V基因、其他調控元件及人類Ig恆定區的更大部分人類Ig基因座可實質上概括特徵為對感染及免疫之人類體液反應的全部譜系。Green等人之工作近來延伸至經由引入人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座分別兆鹼基尺寸的生殖系組態YAC片段來引入超過大約80%人類抗體譜系。參見Mendez等人Nature Genetics 15:146-156(1997)及美國專利申請案第08/759,620號,1996年12月3日申請,其揭示內容以引用的方式併入本文中。
XenoMouse小鼠之產生在以下中進一步討論及描繪:美國專利申請案第07/466,008號,1990年1月12日申請;第07/610,515號,1990年11月8日申請;第07/919,297號,1992年7月24日申請;第07/922,649號,1992年7月30日申請;第08/031,801號,1993年3月15日申請;第08/112,848號,1993年8月27日申請;第08/234,145號,1994年4月28日申請;第08/376,279號,1995年1月20日申請;第08/430,938號,1995年4月27日申請;第08/464,584號,1995年6月5日申請;第08/464,582號,1995年6月5日申請;第08/463,191號,1995年6月5日申請;第08/462,837號,1995年6月5日申請;第08/486,853號,1995年6月5日申請;第08/486,857號,1995年6月5日申請;第08/486,859號,1995年6月5日申請;第08/462,513號,1995年6月5日申請;第08/724,752號,1996年10月2日申請及第08/759,620號,1996年12月3日申請;以及美國專利第6,162,963號、第6,150,584號、第6,114,598號、第6,075,181號及第5,939,598號以及日本專利第3 068 180 B2號、第3 068 506 B2號及第3 068 507 B2號。亦參見Mendez等人Nature
Genetics 15:146-156(1997)及Green及Jakobovits J.Exp.Med.188:483-495(1998)。亦參見歐洲專利第EP 0 463151 B1號,1996年6月12日授予公開;國際專利申請案第WO 94/02602號,1994年2月3日公開;國際專利申請案第WO 96/34096號,1996年10月31日公開;第WO 98/24893號,1998年1月11日公開;第WO 00/76310號,2000年12月21日公開;WO 03/47336。上文所引用之專利、申請案及參考文獻每一者之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
在一替代方法中,包括GenPharm International,Inc.之其他人利用「小基因座」方法。在小基因座方法中,經由包括來自Ig基因座之片斷(個別基因)來模仿外生Ig基因座。因此,一或多個VH基因、一或多個DH基因、一或多個JH基因、μ恆定區及第二恆定區(較佳γ恆定區)形成用於插入動物中之構築體。此方法描述於以下中:Surani等人之美國專利第5,545,807號;及各頒予Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號、第5,625,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號、第5,770,429號、第5,789,650號、第5,814,318號、第5,877,397號、第5,874,299號及第6,255,458號;頒予Krimpenfort及Berns之美國專利第5,591,669號及第6,023.010號;頒予Berns等人之美國專利第5,612,205號、第5,721,367號及第5,789,215號;及頒予Choi及Dunn之美國專利第5,643,763號;及GenPharm國際美國專利申請案第07/574,748號,1990年8月29日申請;第07/575,962號,1990年8月31日申請;第07/810,279號,1991年12月17日申請;第07/853,408號,1992年3月18日申請;第07/904,068號,1992年6月23日申請;第07/990,860號,1992年12月16日申請;第08/053,131號,1993年4月26日申請;第08/096,762號,1993年7月22日申請;第08/155,301號,1993年11月18日申請;第08/161,739號,1993年12月3日申請;第08/165,699號,1993年12月10日申請;第08/209,741號,1994年3月9
日申請,其揭示內容以引用的方式併入本文中。亦參見歐洲專利第0 546 073 B 1號、國際專利申請案第WO 92/03918號、第WO 92/22645號、第WO 92/22647號、第WO 92/22670號、第WO 93/12227號、第WO 94/00569號、第WO 94/25585號、第WO 96/14436號、第WO 97/13852號及第WO 98/24884號以及美國專利第5,981,175號,其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。進一步參見Taylor等入,1992;Chen等人,1993;Tuaillon等人,1993;Choi等人,1993;Lonberg等人,(1994);Taylor等人,(1994);及Tuaillon等人,(1995),Fishwild等人,(1996),其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
Kirin亦證明可由小鼠產生人類抗體,其中經由微細胞融合將染色體之大碎片或完整染色體導入。參見歐洲專利申請案第773 288號及第843 961號,其揭示內容以引用的方式併入本文中。Xenerex Biosciences正在開發一種可能產生人類抗體之技術。在此技術中,SCID小鼠用人類淋巴細胞,例如B及/或T細胞重構。接著小鼠用抗原免疫接種且可產生針對抗原之免疫反應。參見美國專利第5,476,996號、第5,698,767號及第5,958,765號。
人類抗小鼠抗體(HAMA)反應已引導此行業製備嵌合或以其他方式人類化抗體。儘管嵌合抗體具有人類恆定區及鼠類可變區,但預期將會觀測到某些人類抗嵌合抗體(HACA)反應,尤其在抗體之長期或多劑量使用中。因此,將希望提供針對EGFRvIII之完全人類抗體以解決HAMA或HACA反應之問題及/或影響。
抗細胞表面分子/CD3雙特異性結合分子介導之細胞毒性可以各種方式量測。效應細胞可為例如經刺激之富集(人類)之CD8陽性T細胞或未經刺激之(人類)外周血單核細胞(PBMC)。若標靶細胞衍生自獼猴或表現獼猴細胞表面分子或經其轉染,則效應細胞亦應衍生自獼猴,諸如獼猴T細胞株,例如4119LnPx。標靶細胞應表現細胞表面分
子(至少胞外域),例如人類或獼猴細胞表面分子。標靶細胞可為穩定或短暫經細胞表面分子轉染的細胞株(諸如CHO),例如人類或獼猴細胞表面分子。或者,標靶細胞可為所選的細胞表面分子陽性天然表現細胞株。因此,若例如所選的細胞表面分子為CD33,則標靶細胞必須表現CD33,如天然表現CD33分子之標靶細胞,或如描述,在以表現載體格式轉染對應基因後。通常EC50值預計在更高程度表現細胞表面上之所選細胞表面分子的標靶細胞株下較低。效應細胞比標靶細胞(E:T)比率通常為約10:1,但亦可變化。抗細胞表面分子/CD3雙特異性結合分子之細胞毒性活性可在51-鉻釋放分析(約18小時培育時間)中或在基於FACS之細胞毒性分析(約48小時培育時間)中量測。亦可對分析培育時間(細胞毒性反應)進行修改。量測細胞毒性之其他方法為熟習此項技術者熟知,且包含MTT或MTS分析、基於ATP之分析(包括生物發光分析)、磺醯若丹明B(SRB)分析、WST分析、細胞群落分析及ECIS技術。
藉由本發明之抗細胞表面分子/CD3雙特異性結合分子介導的細胞毒性活性較佳在基於細胞之細胞毒性分析中量測。其由EC50值表示,對應於半最大有效濃度(結合分子誘發基線與最大值之間一半的細胞毒性反應的濃度)。較佳地,抗細胞表面分子/CD3雙特異性結合分子之EC50值20,000pg/ml,更佳5000pg/ml,甚至更佳1000pg/ml,甚至更佳500pg/ml,甚至更佳350pg/ml,甚至更佳320pg/ml,甚至更佳250pg/ml,甚至更佳100pg/ml,甚至更佳50pg/ml,甚至更佳10pg/ml且最佳5pg/ml。
以上給出之任何EC50值均可與基於細胞之細胞毒性分析之任一指示情況組合。舉例而言,當(人類)CD8陽性T細胞或獼猴T細胞株用作效應細胞時,抗細胞表面分子/CD3雙特異性結合分子之EC50值較佳1000pg/ml,更佳500pg/ml,甚至更佳250pg/ml,甚至更佳100
pg/ml,甚至更佳50pg/ml,甚至更佳10pg/ml,且最佳5pg/ml。若在此分析中,標靶細胞為(人類或獼猴)所選的細胞表面分子轉染之細胞,諸如CHO細胞,則抗細胞表面分子/CD3雙特異性結合分子之EC50值較佳150pg/ml,更佳100pg/ml,甚至更佳50pg/ml,甚至更佳30pg/ml,甚至更佳10pg/ml,且最佳5pg/ml。
若標靶細胞為所選的細胞表面分子陽性天然表現細胞株,則EC50值較佳350pg/ml,更佳320pg/ml,甚至更佳250pg/ml,甚至更佳200pg/ml,甚至更佳100pg/ml,甚至更佳150pg/ml,甚至更佳100pg/ml,且最佳50pg/ml或更低。
當(人類)PBMC用作效應細胞時,抗細胞表面分子/CD3雙特異性結合分子之EC50值較佳1000pg/ml,更佳750pg/ml,更佳500pg/ml,甚至更佳350pg/ml,甚至更佳320pg/ml,甚至更佳250pg/ml,甚至更佳100pg/ml,且最佳50pg/ml或更低。
個別抗細胞表面分子/CD3雙特異性結合分子之單體與二聚物同功異型物之間的細胞毒性活性差異稱為「效能間隙」。此效能間隙可例如計算為分子單體與二聚形式之EC50值之間的比率。本發明之抗細胞表面分子/CD3雙特異性結合分子之效能間隙較佳5,更佳4,甚至更佳3,甚至更佳2且最佳1。
本發明之結合分子為一種包含至少兩個結合結構域之融合蛋白質,有或無肽連接子(間隔肽)。適合肽連接子為美國專利4,751,180及4,935,233或WO 88/09344中描述之肽連接子。用於製備寡聚抗體構築體衍生物之另一方法包括白胺酸拉鏈之使用。白胺酸拉鏈結構域為促進發現該等白胺酸拉鏈結構域之蛋白質之寡聚的肽。白胺酸拉鏈最初在若干DNA結合蛋白質中鑑別出(Landschulz等人,1988,Science 240:1759),且隨後在多種不同蛋白質中發現。已知之白胺酸拉鏈包括可二聚或三聚之天然存在之肽及其衍生物。適用於產生可溶性寡聚
蛋白質之白胺酸拉鏈結構域之實例描述於PCT申請案WO 94/10308中,且衍生自肺界面活性蛋白D(lung surfactant protein D;SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等人,1994,FEBS Letters 344:191(以引用的方式併入本文中)中。允許與其稠合之異源蛋白質穩定三聚的經修飾白胺酸拉鏈之使用描述於Fanslow等人,1994,Semin.Immunol.6:267-78中。在一種方法中,包含所選細胞表面分子抗體片段或衍生物與白胺酸拉鏈肽稠合的重組融合蛋白質在適合的宿主細胞中表現,且自培養物上清液回收可溶性寡聚所選細胞表面分子抗體片段或衍生物。
抗原結合蛋白質之共價修飾包括在本發明範疇內,且一般而非始終,在轉譯後進行。舉例而言,藉由使抗原結合蛋白質之特定胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或N-或C-端殘基反應之有機衍生化劑反應,將抗原結合蛋白質之若干類型共價修飾引入分子中。
最通常使半胱胺醯基殘基與α-鹵基乙酸酯(及相應胺)(諸如氯乙酸、氯乙醯胺)反應以得到羧甲基或羧醯胺基甲基衍生物。亦可藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基-)丙酸、氯乙醯基磷酸酯、N-烷基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應來衍生半胱胺醯基殘基。
組胺醯基殘基係藉由在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應而衍生化,因為此試劑對組胺醯基側鏈具相對特異性。亦可使用對溴苯甲醯甲基溴;反應較佳在pH 6.0下在0.1M二甲胂酸鈉中進行。
使離胺醯基及胺基端殘基與丁二酸酐或其他羧酸酐反應。用此等試劑進行衍生化具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的作用。其他用於衍生含有α-胺基之殘基之適合試劑包括亞胺基酯類,諸如甲基吡啶醯亞胺甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛、吡哆醛、硼氫化氯(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮及與乙
醛酸酯之轉胺酶催化的反應。
精胺醯基殘基係藉由與一種或若干種習知試劑(其中有苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚滿三酮)反應而進行修飾。由於胍官能基具有高pKa,因此精胺酸殘基之衍生化需要反應在鹼性條件下進行。此外,此等試劑可與離胺酸之基團以及精胺酸ε-胺基反應。
可對酪胺醯基殘基進行特定修飾,其中尤其關注藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應而將光譜標記引入酪胺醯基殘基中。最通常分別使用N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷來形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。使用125I或131I將酪胺醯基殘基碘化以製備用於放射免疫分析之標記蛋白質,上述氯胺T方法為適合的。
羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)藉由與碳化二亞胺(R-N=C=N-R')反應而選擇性地修飾,其中R及R'為視情況不同的烷基,諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外,天冬胺醯基及麩胺醯基殘基藉由與銨離子反應而轉化成天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基。
用雙官能劑衍生化適用於將抗原結合蛋白質與水不溶性支撐基質或表面交聯以用於多種方法。常用交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基丁二醯亞胺酯(例如與4-疊氮水楊酸之酯)、同雙官能亞胺基酯(包括二丁二醯亞胺基酯,諸如3,3'-二硫代雙(丁二醯亞胺基丙酸酯))及雙官能順丁烯二醯亞胺(諸如雙-N-順丁烯二醯亞胺-1,8-辛烷)。諸如3-[(對疊氮苯基)二硫代]丙醯亞胺甲酯之衍生劑產生能夠在光存在下形成交聯之可光活化中間物。或者,諸如溴化氰活化之碳水化合物的反應性水不溶性基質,以及美國專利第3,969,287號、第3,691,016號、第4,195,128號、第4,247,642號、第4,229,537號及第4,330,440號中描述之反應性基質用於蛋白質固定。
常使麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基脫去醯胺基以分別形成相
應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。或者,在適度酸性條件下將該等殘基脫醯胺化。此等殘基之任一形式均屬於本發明範疇內。
其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或酥胺醯基殘基之羥基之磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,1983,第79-86頁)、N-端胺之乙醯化及任何C-端羧基之醯胺化。
包括在本發明範疇內的抗原結合蛋白質之另一類型共價修飾包含改變蛋白質之糖基化模式。如此項技術中所已知,糖基化模式可視蛋白質之序列(例如存在或不存在以下所論述之特定糖基化胺基酸殘基)或產生蛋白質之宿主細胞或生物體而定。以下論述特定表現系統。
多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸之外的任何胺基酸)為碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈之識別序列。為此,此等三肽序列中之任一者在多肽中的存在產生潛在性糖基化位點。經O連接之糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸連接,儘管亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸,但該羥基胺基酸最通常為絲胺酸或蘇胺酸。
向抗原結合蛋白中添加糖基化位點宜藉由改變胺基酸序列以使得其含有一或多個上述三肽序列來實現(對於經N連接之糖基化位點)。亦可藉由向起始序列加入一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或經一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代起始序列來進行改變(對於經O連接之糖基化位點)。為求簡易,抗原結合蛋白質胺基酸序列較佳經由DNA水準之改變,尤其藉由使編碼標靶多肽之DNA在預選鹼基突變,使得
產生將轉譯成所需胺基酸之密碼子來改變。
另一增加抗原結合蛋白質上碳水化合物部分之數目的方法為使糖苷化學或酶促偶合於蛋白質。此等程序為有利的,因為其不需要在具有糖基化能力之宿主細胞中產生蛋白質來進行經N連接及經O連接之糖基化。視所用偶合模式而定,可將該(等)糖連接至(a)精胺酸及組胺酸、(b)游離羧基、(c)游離巰基(諸如半胱胺酸之彼等巰基)、(d)游離羥基(諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之彼等羥基)、(e)芳族殘基(諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等芳族殘基)或(f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於WO 87/05330,1987年9月11日公開,以及Aplin及Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.,第259-306頁中。
起始抗原結合蛋白質上存在之碳水化合物部分的移除可以化學方法或以酶促方法實現。化學去糖基化需要將該抗體暴露於化合物三氟甲磺酸或同等化合物。此處理導致除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)之外的絕大多數或所有糖之裂解,而使抗體完整。化學去糖基化由Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52及由Edge等人,1981,Anal.Biochem.118:131描述。如Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol.138:350所述,多肽上之碳水化合物部分的酶促裂解可藉由使用多種內或外糖苷酶來達成。潛在糖基化位點上之糖基化可藉由如Duskin等人,1982,J.Biol.Chem.257:3105所述,使用化合物衣黴素來預防。衣黴素阻止蛋白質-N-糖苷鍵之形成。
抗原結合蛋白質之另一類型共價修飾包含以美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中闡述之方式將抗原結合蛋白質連接至多種非蛋白質聚合物,包括(但不限於)各種多元醇,諸如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。另外,如此項技術中已知,胺基酸取代可在抗原結合蛋白質內各個位置中進行以促進諸如PEG之聚合物之添加。
在一些實施例中,本發明之抗原結合蛋白質之共價修飾包含一或多種標記之添加。
術語「標記基團」意謂任何可偵測標記。適合標記基團之實例包括(但不限於)以下:放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如FITC、若丹明、鑭系元素磷光體)、酶促基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團或由二次報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中,標記基團經由各種長度之間隔臂偶合於抗原結合蛋白以降低潛在位阻。用於標記蛋白質之各種方法為此項技術中已知且可用於執行本發明。
一般而言,標記分成多種類別,視待檢測其之分析而定:a)同位素標記,其可為放射性或重同位素;b)磁性標記(例如磁性粒子);c)氧化還原活性部分;d)螢光染料;酶促基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶);e)生物素標記基團;及f)由二次報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定基標籤等)。在一些實施例中,標記基團經由各種長度之間隔臂偶合於抗原結合蛋白以降低潛在位阻。用於標記蛋白質之各種方法為此項技術中已知且可用於執行本發明。
特定標記包括螢光染料,包括(但不限於)發色團、磷光體及螢光團,其中後者在許多情況下為特定的。螢光團可為「小分子」螢光團或蛋白質螢光團。
「螢光標記」意謂可經由其固有螢光特性偵測之任何分子。適合螢光標記包括(但不限於)螢光素、若丹明、四甲基若丹明、曙紅、藻
紅、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀綠、芪、螢光黃、Cascade藍J、得克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC紅640、Cy 5、Cy 5.5、LC紅705、俄勒岡綠、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、Cascade藍、Cascade黃及R-藻紅素(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、若丹明及得克薩斯紅(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA)。適合螢光染料,包括螢光團,描述在以引用的方式明確併入本文中之Molecular Probes Handbook,Richard P.Haugland中。
適合蛋白質螢光標記亦包括(但不限於)綠色螢光蛋白質,包括海腎(Renilla)、海筆(Ptilosarcus)或水母(Aequorea)物種GFP(Chalfie等人,1994,Science 263:802-805)、EGFP(Clontech Laboratories,Inc.,Genbank寄存編號U55762);藍色螢光蛋白質(BFP,Quantum Biotechnologies,Inc.1801 de Maisonneuve Blvd.West,8th Floor,Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9;Stauber,1998,Biotechniques 24:462-471;Heim等人,1996,Curr.Biol.6:178-182)、增強之黃色螢光蛋白質(EYFP,Clontech Laboratories,Inc.)、螢光素酶(Ichiki等人,1993,J.Immunol.150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2603-2607)及海腎(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利第5292658號、第5418155號、第5683888號、第5741668號、第5777079號、第5804387號、第5874304號、第5876995號、第5925558號)。所有以上引用之參考文獻以引用的方式明確併入本文中。
在一個實施例中,本發明之結合分子特徵在於三個結構域自N-端至C-端按以下次序連續位於一個多肽鏈上:
˙第一結合結構域;˙第二結合結構域;及˙第三結合結構域。
本發明亦提供一種包含至少三個結合結構域之單鏈結合分子,該至少三個結合結構域包含在一個多肽鏈中,其中(a)第一結構域能夠結合於血清白蛋白且位於第二結合結構域之N-端;(b)該第二結構域能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子;以及(c)第三結構域能夠結合於T細胞CD3受體複合物,其中自產生結合分子之宿主細胞之培養物上清液分離的可表現之單體結合分子相對於結合分子之總量的產率視該結合分子中第一及第二結合結構域之次序而定。
本發明進一步提供一種包含至少三個結合結構域之單鏈結合分子,該至少三個結合結構域以第一結構域、第二結構域及第三結構域之次序包含在一個多肽鏈中,其中(a)第一結構域能夠結合於血清白蛋白且位於第二結合結構域之N-端;(b)該第二結構域能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子;以及(c)第三結構域能夠結合於T細胞CD3受體複合物;其中自產生該結合分子之宿主細胞之培養物上清液分離的單體結合分子之產率為自產生包含能夠結合於血清白蛋白之結合結構域在分子C-端的結合分子之宿主細胞之培養物上清液分離的單體結合分子之產率的至少1.5倍。
進一步較佳地,單體結合分子之此產率高2倍,更佳高2.5倍,甚
至更佳高3倍、4倍或5倍。
在一個實施例中,本發明之結合分子特徵在於至少一個結合結構域、較佳第二及/或第三結合結構域為scFv或單域抗體。
亦在本發明結合分子之一個實施例中,該分子包含一或多種其他異源多肽。
本發明之結合分子亦可包含呈異源多肽形式之His-標籤。對於本發明之結合分子而言,較佳地,His-標籤位於第三結合結構域之C-端。
本發明之結合分子亦可包含其他結構域,其例如有助於該分子之分離或涉及該分子之改適之藥物動力學型態。
有助於分離結合分子之結構域可選自肽基元或第二引入之部分,其可在例如分離管柱之分離法中捕捉。該等其他結構域之一非限制性實施例包含稱為以下之肽基元:Myc-標籤、HAT-標籤、HA-標籤、TAP-標籤、GST-標籤、甲殼素結合結構域(CBD-標籤)、麥芽糖結合蛋白質(MBP-標籤)、Flag-標籤、Strep-標籤及其變異體(例如StrepII-標籤)及His-標籤。特徵為鑑別之CDR的所有本文中揭示之結合分子較佳包含His-標籤結構域,其一般已知為分子胺基酸序列中連續His殘基,較佳六個His殘基之重複序列。
如自隨附實例顯而易見,似乎自表現結合分子之宿主細胞之細胞上清液分離的本發明單體結合分子之產率可藉由使用不包含His-標籤之結合分子進一步提高。因此,在不受理論束縛下,選擇不包含His-標籤結構域之本發明結合分子可進一步提高單體結合分子自表現結合分子之宿主細胞之細胞上清液的產率。因此,不包含His-標籤之結合分子或為較佳。
本發明亦提供一種結合分子,其中(a)第一結合結構域能夠結合於人類及非人類靈長類動物血清
白蛋白;(b)第二結合結構域能夠結合於人類及非人類靈長類動物細胞上之細胞表面分子,以及(c)第三結合結構域能夠結合於人類及非人類靈長類動物細胞上之T細胞CD3受體複合物。
在一個實施例中,本發明結合分子之特徵在於能夠結合於血清白蛋白之第一結合結構域衍生自組合庫或抗體結合結構域。
在本發明結合分子之一較佳實施例中,第一結合結構域包含10至25個胺基酸殘基。
在本發明結合分子之一個實施例中,能夠結合於血清白蛋白之第一結合結構域包含胺基酸序列Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp,其中Xaa為任何胺基酸。
在本發明結合分子之一個實施例中,能夠結合於血清白蛋白之第一結合結構域衍生自單域抗體之CDR。
此外,在本發明結合分子之一個實施例中,第一結合結構域以500nM之親和力(KD)結合於血清白蛋白。
在本發明結合分子之一個實施例中,˙第二結合結構域以100nM之親和力(KD)結合於標靶細胞上之細胞表面分子;以及˙第三結合結構域以100nM之親和力(KD)結合於T細胞CD3受體複合物。
在本發明結合分子之一個實施例中,結合分子在活體外分析中展示細胞毒性活性,該活體外分析量測在10%人類血清白蛋白存在下效應細胞對標靶細胞之溶解。
在本發明結合分子之一較佳實施例中,分子由單一多肽鏈組成。
在本發明結合分子之一個實施例中,(a)第二結合結構域包含抗體來源之VL及VH鏈;及/或(b)第三結合結構域包含抗體來源之VL及VH鏈。
亦在本發明結合分子之一個實施例中,該分子包含一或多種其他異源多肽。
在本發明結合分子之一個實施例中,能夠結合於細胞表面分子之第一結合結構域結合於腫瘤抗原。
在本發明結合分子之一較佳實施例中,能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第三結合結構域能夠結合於人類及白鬢狨、棉頂狨或松鼠猴CD3ε鏈之抗原決定基,其中該抗原決定基為包含在由WO 2008/119567之SEQ ID NO:2、4、6或8組成之群中的胺基酸序列之一部分且包含至少胺基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。
在本發明之一個態樣中,第三結合結構域能夠結合於人類CD3及獼猴CD3,較佳結合於人類CD3ε及獼猴CD3ε。或者或另外,第三結合結構域能夠結合於白鬢狨、棉頂狨及/或松鼠猴CD3ε。根據此等實施例,本發明結合分子之一個或兩個結合結構域較佳對哺乳動物靈長類動物目成員具有跨物種特異性。跨物種特異性CD3結合結構域例如描述於WO 2008/119567中。
對於本發明之結合分子,尤其較佳地,能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第三結合結構域包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3選自以下之VL區:(a)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:27中描繪之CDR-L1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO:28中描繪之CDR-L2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:29中描繪之CDR-L3;(b)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:117中描繪之CDR-L1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO:118中描繪之CDR-L2及如WO
2008/119567之SEQ ID NO:119中描繪之CDR-L3;以及(c)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:153中描繪之CDR-L1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO:154中描繪之CDR-L2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:155中描繪之CDR-L3。
在本發明結合分子之替代較佳實施例中,能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第三結合結構域包含CDR-H 1、CDR-H2及CDR-H3選自以下之VH區:(a)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:12中描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO:13中描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:14中描繪之CDR-H3;(b)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:30中描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO:31中描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:32中描繪之CDR-H3;(c)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:48中描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO:49中描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:50中描繪之CDR-H3;(d)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:66中描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO:67中描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:68中描繪之CDR-H3;(e)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:84中描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO:85中描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:86中描繪之CDR-H3;(f)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:102中描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO:103中描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:104中描繪之CDR-H3;(g)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:120中描繪之CDR-H1、如
WO 2008/119567之SEQ ID NO:121中描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:122中描繪之CDR-H3;(h)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:138中描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO:139中描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:140中描繪之CDR-H3;(i)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:156中描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO:157中描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:158中描繪之CDR-H3;以及(j)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:174中描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567之SEQ ID NO:175中描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:176中描繪之CDR-H3。
對於本發明之結合分子而言,進一步較佳地,能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第三結合結構域包含選自由以下組成之群的VL區:如WO 2008/119567之SEQ ID NO:35、39、125、129、161或165中描繪之VL區。
或者較佳地,能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第三結合結構域包含選自由以下組成之群之VH區:如WO 2008/1 19567之SEQ ID NO:15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181中描繪之VH區。
更佳地,本發明之結合分子特徵為能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第三結合結構域包含選自由以下組成之群的VL區及VH區:(a)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:17或21中描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:15或19中描繪之VH區;(b)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:35或39中描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:33或37中描繪之VH區;(c)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:53或57中描繪之VL區及
如WO 2008/119567之SEQ ID NO:51或55中描繪之VH區;(d)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:71或75中描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:69或73中描繪之VH區;(e)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:89或93中描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:87或91中描繪之VH區;(f)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:107或111中描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:105或109中描繪之VH區;(g)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:125或129中描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:123或127中描繪之VH區;(h)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:143或147中描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:141或145中描繪之VH區;(i)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:161或165中描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:159或163中描繪之VH區;以及(j)如WO 2008/119567之SEQ ID NO:179或183中描繪之VL區及如WO 2008/119567之SEQ ID NO:177或181中描繪之VH區。
根據本發明結合分子之一較佳實施例,尤其能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第三結合結構域,VH區與VL區對呈單鏈抗體(scFv)格式。VH與VL區以VH-VL或VL-VH次序排列。較佳地,VH區位於連接子序列N-端。VL區位於連接子序列C-端。
本發明之上述結合分子之一較佳實施例特徵為能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第三結合結構域包含選自由以下組成之群之胺基酸序列:WO 2008/119567之SEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187。
在一個實施例中,本發明之結合分子特徵在於如SEQ ID NO:8、12、16、20、24、26、30或34中描繪之胺基酸序列。
本發明之一替代性實施例提供一種用於產生本發明結合分子的方法,該方法包含以下步驟:˙選擇包含能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子之結合結構域的結合分子,其在N-端包含能夠結合於血清白蛋白之結合結構域。
在一個實施例中,本發明之方法進一步包含以下步驟:˙向該分子添加能夠結合於T細胞CD3受體複合物之另一結合結構域。
本發明進一步提供一種具有編碼本發明結合分子之序列的核酸分子。
此外,本發明提供一種包含本發明之核酸序列之載體。此外,本發明提供一種經本發明之核酸序列轉型或轉染之宿主細胞。
在一個實施例中,本發明提供一種用於產生本發明結合分子或藉由本發明方法產生之結合分子的方法,該方法包含在允許本發明結合分子或藉由本發明方法產生之結合分子表現的條件下培養本發明之宿主細胞且自培養物回收所產生之結合分子。
此外,本發明提供一種醫藥組合物,其包含本發明之結合分子或根據本發明方法產生之結合分子。
本文所述之調配物可用作醫藥組合物來治療、改善及/或預防有需要之患者的如本文所述之病理學醫學病狀。術語「治療」係指治療性治療與防護性或預防性措施。治療包括將調配物施加於或投與來自患有疾病/病症、疾病/病症之症狀或疾病/病症誘因之患者的身體、分離之組織或細胞,旨在治癒、醫治、減輕、緩和、改變、治好、緩解、改善或影響疾病、疾病症狀或疾病誘因。
「需要治療」者包括已患有病症者以及有待預防病症者。術語「疾病」為將受益於用本文所述之蛋白質調配物治療的任何病狀。此包括慢性及急性病症或疾病,包括使哺乳動物易患所討論疾病之彼等
病理性病狀。本文中待治療之疾病/病症之非限制性實例包括增生性疾病、腫瘤疾病或免疫病症。
在一些實施例中,本發明提供一種醫藥組合物,其包含治療有效量之一種或複數種本發明之結合分子以及醫藥學上有效之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。本發明之醫藥組合物包括(但不限於)液體、冷凍及凍乾組合物。
較佳地,調配物質在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒。在特定實施例中,醫藥組合物包含治療有效量之本發明結合分子。
在某些實施例中,醫藥組合物可含有用於改變、維持或保持例如該組合物之pH值、容積莫耳滲透濃度、黏度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌度、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或穿透的調配物質。在該等實施例中,適合的調配物質包括(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸、脯胺酸或離胺酸);抗微生物劑;抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉);緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸);增積劑(諸如甘露糖醇或甘胺酸);螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA));複合劑(諸如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精);填充劑;單醣;雙醣;及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精);蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白);著色、調味及稀釋劑;乳化劑;親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮);低分子量多肽;成鹽相對離子(諸如鈉);防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫);溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇);糖醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇);懸浮劑;界面活性劑或濕潤劑(諸如普洛尼克、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20)、聚山梨醇酯、曲拉通、緩血酸胺、卵磷脂、膽固醇、塔
洛帕爾(tyloxapal));穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨糖醇);張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物,較佳氯化鈉或氯化鉀、甘露糖醇山梨糖醇);遞送媒劑;稀釋劑;賦形劑及/或醫藥佐劑。參見REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版,(A.R.Genrmo編輯),1990,Mack Publishing Company。
在某些實施例中,最佳的醫藥組合物將由熟習此項技術者視例如預期投與途徑、遞送格式及所需劑量而確定。參見例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,上述。在某些實施例中,該等組合物可影響本發明之抗原結合蛋白質的物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。在某些實施例中,醫藥組合物中之原始媒劑或載劑可天然為水性或非水性的。舉例而言,適合之媒劑或載劑可為注射用水、生理食鹽水溶液或人工腦脊液,可能補充有在非經腸投與之組合物中常用之其他物質。中性緩衝生理食鹽水或與血清白蛋白混合之生理食鹽水為另外的例示性媒劑。在特定實施例中,醫藥組合物包含pH值約為7.0-8.5之Tris緩衝劑或pH值約為4.0-5.5之己酸鹽緩衝劑,其可進一步包括山梨糖醇或其適合之替代物。在本發明之某些實施例中,本發明之人類抗體或其抗原結合片段或本發明組合物之結合分子可藉由將具有所需純度之所選組合物與視情況選用之調配劑(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,上述)混合來製備成凍乾塊狀或水溶液形式進行儲存。此外,在某些實施例中,本發明之人類抗體或其抗原結合片段或本發明之結合分子可使用諸如蔗糖之適當賦形劑調配為凍乾物。
本發明之醫藥組合物可經選擇用於非經腸遞送。或者,組合物可經選擇用以吸入或經由消化道(諸如經口)遞送。熟習此項技術者能夠製備該等醫藥學上可接受之組合物。調配物組分較佳以投與部位可接受之濃度存在。在某些實施例中,緩衝劑係用以將組合物維持於生
理pH值或略微較低之pH值,通常在約5至約8之pH值範圍內。
當涵蓋非經腸投與時,用於本發明之治療組合物可以包含本發明之所需人類抗體或其抗原結合片段或本發明之結合分子於醫藥學上可接受之媒劑中的無熱原之非經腸可接受之水溶液的形式提供。一種尤其適合之非經腸注射用媒劑為無菌蒸餾水,其中本發明之結合分子調配為無菌等滲溶液,適當防腐。在某些實施例中,製備可包括用諸如可注射微球體、生物可侵蝕之粒子、聚合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體之試劑調配所需分子,該等試劑可提供可經由積存注射遞送之產物的控制或持續釋放。在某些實施例中,亦可使用玻尿酸,其在循環中具有促進持久持續時間之作用。在某些實施例中,可植入藥物遞送裝置可用於引入所需抗原結合蛋白質。
其他的醫藥組合物對熟習此項技術者而言將為顯然的,包括包含本發明之結合分子於持續或控制遞送調配物中的調配物。用於調配多種其他持續或控制遞送手段(諸如脂質體載劑、生物可侵蝕微粒或多孔珠粒及積存注射劑)之技術,亦為熟習此項技術者所知。參見例如國際專利申請案第PCT/US93/00829號,其以引用的方式併入且描述供遞送醫藥組合物之多孔聚合微粒之控制釋放。持續釋放製劑可包括呈成形物品形式之半透性聚合物基質,例如膜或微囊。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯(如美國專利第3,773,919號及歐洲專利申請案公開案第EP 058481號中揭示,每一者以引用的方式併入)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物(Sidman等人,1983,Biopolymers 2:547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,1981,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277及Langer,1982,Chem.Tech.12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人,1981,上述)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案第EP 133,988號)。持續釋放組合物亦可包括可藉由此項技術中已知之若干方法中的任一者製備之脂質體。參
見例如Eppstein等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3688-3692;歐洲專利申請公開案第EP 036,676號、第EP 088,046號及第EP 143,949號,以引用的方式併入。
用於活體內投與之醫藥組合物通常呈無菌製劑提供。殺菌可藉由經無菌過濾膜過濾來實現。當組合物經凍乾時,使用該方法之殺菌可於凍乾及復原之前或之後執行。用於非經腸投與之組合物可以凍乾形式或於溶液中儲存。一般將非經腸組合物置放於具有無菌取孔(access port)之容器中,例如具有可藉由皮下注射針穿透之塞子之靜脈溶液袋或小瓶。
本發明之態樣包括本發明調配物之自緩衝結合分子,其可用作醫藥組合物,如以全文引用的方式併入本文中之國際專利申請案WO 06138181A2(PCT/US2006/022599)中所述。
如上所討論,某些實施例提供本發明蛋白質組合物、尤其本發明之醫藥組合物之結合分子,該等組合物除本發明之結合分子外,亦包含一或多種賦形劑,諸如本節中及文中別處例示性描述之賦形劑。在此方面,賦形劑可用於本發明中達成多種目的,諸如調節調配物之物理、化學或生物特性,諸如調整黏度,及或調整本發明之方法以改善有效性及或穩定化該等調配物及方法以防由於例如在製造、運送、儲存、使用前製備、投與及此後過程中出現之應力而降解及損壞。
多種說明可用於在此方面適用之蛋白質穩定化及調配物質及方法,諸如Arakawa等人,「Solvent interactions in pharmaceutical formulations」,Pharm Res.8(3):285-91(1991);Kendrick等人,「Physical stabilization of proteins in aqueous solution」,RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS:THEORY AND PRACTICE,Carpenter及Manning編輯,Pharmaceutical Biotechnology.13:61-84(2002);及Randolph等人,「Surfactant-protein
interactions」,Pharm Biotechnol.13:159-75(2002),每一者以全文引用的方式併入本文中,尤其在與用於根據本發明之自緩衝蛋白質調配物的賦形劑及方法有關,尤其關於用於獸醫學及/或人類醫學用途之蛋白質醫藥產品及方法的部分。
根據本發明之某些實施例,可使用鹽以例如調整調配物之離子強度及/或等滲性及/或改善根據本發明之組合物之蛋白質或其他成分的溶解性及/或物理穩定性。
如所熟知,離子可藉由結合於蛋白質表面上之帶電荷殘基且藉由屏蔽蛋白質中之帶電荷及極性基團且降低其靜電相互作用、引力及斥力相互作用之強度來穩定化蛋白質之天然狀態。離子亦可藉由尤其結合於蛋白質之變性肽鍵(--CONH)來穩定化蛋白質之變性狀態。此外,蛋白質中離子與帶電荷及極性基團之相互作用可減少分子間靜電相互作用且由此防止或減少蛋白質聚集及不可溶性。
離子種類對蛋白質的影響千差萬別。已發展大量等級明確之離子及其對蛋白質的影響,其可用於調配根據本發明之醫藥組合物。一個實例為郝夫麥士特離子序列(Hofmeister series),其藉由對溶液中蛋白質構形穩定性的影響將離子及極性非離子溶質分級。穩定化溶質稱為「非離液序列高」的。使溶質不穩定稱為「離液序列高」的。非離液劑通常以高濃度(例如>1莫耳硫酸銨)使用以自溶液沈澱蛋白質(「鹽析」)。離液劑通常用以使蛋白質變性及/或溶解蛋白質(「鹽溶」)。離子對「鹽溶」及「鹽析」之相對有效性界定其在郝夫麥士特離子序列中的位置。
游離胺基酸可用於根據本發明之各實施例的本發明調配物之結合分子中作為增積劑、穩定劑及抗氧化劑以及其他標準用途。離胺酸、脯胺酸、絲胺酸及丙胺酸可用於穩定化調配物中之蛋白質。甘胺酸適用於凍乾中以確保正確的塊狀結構及性質。精胺酸可用於抑制液
體與凍乾調配物中蛋白質聚集。甲硫胺酸可用作抗氧化劑。
多元醇包括糖,例如甘露糖醇、蔗糖及山梨糖醇,以及多元醇,諸如例如甘油與丙二醇,且為達成本文中之討論之目的,聚乙二醇(PEG)及相關物質。多元醇為非離液序列高的。其為適用於液體與凍乾調配物中的穩定劑以保護蛋白質避開物理及化學降解過程。多元醇亦適用於調整調配物之張力。
適用於本發明之選擇實施例的多元醇為甘露糖醇,通常用以確保凍乾調配物中塊狀物之結構穩定性。其確保塊狀物之結構穩定性。其一般與例如蔗糖之凍乾保護劑一起使用。山梨糖醇及蔗糖為調整張力較佳之試劑且作為穩定劑來防止在製造過程期間在大批輸送或製備期間的凍融應力。諸如葡萄糖及乳糖之還原糖(其含有游離醛或酮基)可糖化表面離胺酸及精胺酸殘基。因此,其一般不為用於本發明之較佳多元醇。另外,形成該等反應性物質的糖,諸如在酸性條件下水解成果糖及葡萄糖,且因此引起糖化之蔗糖,在此方面亦不為本發明之較佳多元醇。PEG可用於穩定化蛋白質且作為低溫防護劑且可在此方面用於本發明。
本發明調配物之結合分子之實施例進一步包含界面活性劑。蛋白質分子可容易吸附於表面上且變性且隨之聚集在空氣-液體、固體-液體及液體-液體界面上。此等影響一般與蛋白質濃度成反比。此等有害相互作用一般與蛋白質濃度成反比且通常藉由物理攪動,諸如在產品運送及處置期間產生之攪動而加劇。
界面活性劑通常用以預防、最小化或減少表面吸附。在此方面本發明中適用之界面活性劑包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脫水山梨糖醇聚乙氧化物之其他脂肪酸酯及泊洛沙姆188(poloxamer 188)。
界面活性劑亦通常用以控制蛋白質構形穩定性。在此方面界面
活性劑之使用為蛋白質特定的,因為任何給定界面活性劑通常將穩定化一些蛋白質而使其他蛋白質不穩定。
聚山梨醇酯容易氧化降解且時常在供應時含有足夠量之過氧化物而氧化蛋白質殘基側鏈,尤其甲硫胺酸。因此,聚山梨醇酯應小心使用,且當使用時,應以其最低有效濃度採用。在此方面,聚山梨醇酯例示賦形劑應以其最低有效濃度使用之一般規則。
本發明調配物之結合分子之實施例進一步包含一或多種抗氧化劑。在一定程度上,可藉由維持周圍氧氣及溫度之適當水準且藉由避免曝光來防止醫藥調配物中蛋白質之不良氧化。抗氧化賦形劑亦可使用以預防蛋白質氧化降解。在此方面適用之抗氧化劑為還原劑、氧/自由基清除劑及螯合劑。用於根據本發明之治療蛋白質調配物的抗氧化劑較佳為水溶性的且在整個產品存放期維持其活性。EDTA為根據本發明在此方面較佳之抗氧化劑。
抗氧化劑可破壞蛋白質。舉例而言,諸如尤其麩胱甘肽之還原劑可破壞分子內二硫鍵。因此,用於本發明之抗氧化劑經選擇以尤其消除或足夠減少自身破壞調配物中之蛋白質的可能性。
根據本發明之調配物可包括作為蛋白質輔因子且為形成蛋白質配位錯合物所需的金屬離子,諸如形成某些胰島素懸浮液所需之鋅。金屬離子亦可抑制降解蛋白質之一些過程。然而,金屬離子亦催化降解蛋白質之物理及化學過程。
鎂離子(10-120mM)可用於抑制天冬胺酸至異天冬胺酸之異構化。Ca+2離子(至多100mM)可提高人類去氧核糖核酸酶之穩定性。然而,Mg+2、Mn+2及Zn+2可使rhDNase不穩定。類似地,Ca+2及Sr+2可穩定化因子VIII,因子VIII可由Mg+2、Mn+2及Zn+2、Cu+2及Fe+2而不穩定,且其聚集可由Al+3離子增加。
本發明調配物之結合分子之實施例進一步包含一或多種防腐
劑。當研發包括自同一容器一次以上提取之多劑量非經腸調配物時防腐劑為需要的。其主要功能為抑制微生物生長且確保產品在藥品整個存放期或使用期的無菌性。通常使用之防腐劑包括苄醇、苯酚及間甲酚。雖然防腐劑具有悠久的用於小分子非經腸投與史,但包括防腐劑之蛋白質調配物之研發可為挑戰性的。防腐劑幾乎對蛋白質一直具有失穩作用(聚集),且此已變成限制其用於多劑量蛋白質調配物之主要因素。迄今為止,大部分蛋白質藥物僅調配用於單次使用。然而,當多劑量調配物為可能時,其具有便利患者且提高可銷售性之附加優點。一種很好的實例為人類生長激素(hGH)之調配物,其中防腐調配物之研發已引起更便利、多用途注射筆呈現形式的商業化。至少四種含有hGH防腐調配物之此類筆裝置目前在市場上可獲得。Norditropin(液體,Novo Nordisk)、Nutropin AQ(液體,Genentech)及Genotropin(凍乾--雙室筒,Pharmacia & Upjohn)含有苯酚,而Somatrope(Eli Lilly)用間甲酚調配。在調配及研發防腐劑型期間需要考慮若干態樣。藥品中有效防腐劑濃度必須最佳化。此需要在劑型中測試賦予抗微生物有效性且蛋白質穩定性不受損之濃度範圍下的給定防腐劑。
正如所料,含有防腐劑之液體調配物之研發比凍乾調配物挑戰更大。冷凍乾燥產品可在無防腐劑下凍乾且在使用時用含有防腐劑之稀釋劑復原。此縮短防腐劑與蛋白質接觸之時間,顯著地將相關穩定性風險降至最低。在液體調配物下,應在整個產品存放期(約18至24月)內維持防腐劑有效性及穩定性。需注意之一個要點為防腐劑有效性應在含有活性藥物及所有賦形劑組分之最終調配物中顯示。
本發明之結合分子一般將針對特定的投藥途徑及方法、特定的投藥劑量及投藥頻率、特定疾病之特定治療而設計,尤其具有一系列生物可用性及持久性。因此調配物可根據本發明設計以藉由任何適合途徑遞送,包括(但不限於)經口、經耳、經眼、直腸及陰道,以及藉
由非經腸途徑,包括靜脈內及動脈內注射、肌肉內注射及皮下注射。
醫藥組合物一經調配,即可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌小瓶中。此等調配物可以即用形式或需要於投與前復原之形式(例如凍乾)儲存。本發明亦提供用於產生單劑量投與單元之套組。本發明之套組可各自含有具有乾燥蛋白質之第一容器及具有水性調配物之第二容器。在本發明之某些實施例中,提供含有單室及多室預填充注射器之套組(例如液體注射器及凍乾物注射器)。待採用之含蛋白質之醫藥組合物中本發明結合分子之治療有效量將取決於例如治療背景及客觀因素。熟習此項技術者應瞭解,治療之適當劑量將部分視以下而變化:遞送之分子、本發明結合分子所用於之適應症、投藥途徑及患者體型(體重、體表或器官尺寸)及/或狀態(年齡及整體健康狀況)。在某些實施例中,臨床醫師可滴定劑量且修改投藥途徑以得到最佳治療效果。典型劑量視上文所提及之因素而定,可在約0.1μg/kg至高達約30mg/kg或更高之範圍內。在特定實施例中,劑量可在1.0μg/kg至高達約20mg/kg之範圍內,視情況10μg/kg至高達約10mg/kg或100μg/kg至高達約5mg/kg。
治療有效量之本發明結合分子較佳減輕疾病症狀之嚴重程度,增加無疾病症狀時期之頻率或持續時間或預防由患病而引起之損傷或殘疾。為治療表現由本發明結合分子之第二結合結構域結合之細胞表面分子的特定腫瘤,治療有效量之本發明結合分子,例如抗細胞表面分子/CD3結合分子,相對於未經治療之患者,較佳抑制細胞生長或腫瘤生長至少約20%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。可在可預測人類腫瘤中功效之動物模型中評估化合物抑制腫瘤生長之能力。
醫藥組合物可使用醫學裝置投與。用於投與醫藥組合物之醫學裝置之實例描述於美國專利第4,475,196號;第4,439,196號;第
4,447,224號;第4,447,233號;第4,486,194號;第4,487,603號;第4,596,556號;第4,790,824號;第4,941,880號;第5,064,413號;第5,312,335號;第5,312,335號;第5,383,851號;及第5,399,163號,均以引用的方式併入本文中。
根據本發明之一個實施例,本發明之結合分子或根據本發明方法產生之結合分子用於預防、治療或改善選自由增生性疾病、發炎疾病、傳染性疾病及自體免疫疾病組成之群的疾病。
在一個實施例中,本發明提供一種用於治療或改善選自由增生性疾病、發炎疾病、傳染性疾病及自體免疫疾病組成之群的疾病之方法,其包含向有需要之個體投與本發明之結合分子或根據本發明方法產生之結合分子的步驟。
此外,在一個實施例中,本發明提供一種包含本發明之結合分子或根據本發明方法產生之結合分子、本發明之核酸分子、本發明之載體或本發明之宿主細胞的套組。
應瞭解在本文中本發明不侷限於特定方法、方案或試劑,因而可變化。本文所提供之討論及實例僅為描述特定實施例而呈現且不意欲限制本發明之範疇,本發明之範疇僅由申請專利範圍界定。
貫穿本說明書全文引用之所有公開案及專利(包括所有專利、專利申請案、科技出版物、製造商說明書、說明書等)無論上述還是下述,均以全文引用的方式併入本文中。不應認為本文中承認本發明無權先於根據先前發明之此揭示內容。在以引用的方式併入之材料與本說明書相矛盾或不一致的程度上,本說明書將替代任何此類材料。
以下實例係出於說明本發明之特定實施例或特徵的目的而提供。此等實例不應視為限制本發明之範疇。該等實例係出於說明目的而包括,且本發明僅由申請專利範圍限制。
自適應於20nM MTX的穩定轉染之中國倉鼠卵巢細胞(CHO)之培養物上清液純化BiTE抗體。為產生一公升用於BiTE抗體構築體純化之上清液,細胞在滾瓶中在無核苷HyQ PF CHO液體大豆培養基(具有4.0mM L-麩醯胺酸及0.1%普洛尼克(Pluronic)F-68;HyClone)下以5×104個細胞/毫升之起始細胞密度生長。添加之顏色指示劑酚紅的顏色自紅色變成橙色後,培養再延續兩天,接著收穫。藉由離心移除細胞且含有表現之蛋白質的上清液儲存在-20℃下,直至蛋白質純化。
由Unicorn®軟體控制之Äkta® Explorer Systems(GE Life Sciences)用於層析。使用負載有ZnCl2之Fractogel EMD chelate®(Merck,Darmstadt),根據製造商提供之方案,執行固定金屬親和層析(IMAC)。管柱用緩衝劑A(20mM磷酸鈉緩衝劑(pH 7.2)、0.1M NaCl、10mM咪唑)平衡且細胞培養物上清液(1000ml)以4ml/min之流速施加於管柱(10ml)。管柱用緩衝劑A洗滌以移除未結合之樣品。根據以下程序,使用緩衝劑B(20mM磷酸鈉緩衝劑、0.1M NaCl、0.5M咪唑,pH 7.2)之兩步梯度溶離結合之蛋白質:
步驟1:10%緩衝劑B,5管柱體積
步驟2:100%緩衝劑B,5管柱體積
來自SA-21-CEAxCD3結合分子之IMAC純化的溶離型態示範性地展示於圖1。
將來自步驟2之溶離之蛋白質溶離份彙集以進一步純化,且使用具有PES膜及10kDa之分子量截止之Vivaspin(Sartorius-Stedim,Göttingen-Germany)離心單元濃縮至3ml最終體積。所有化學物質均為研究級且購自Sigma(Deisenhofen,Germany)或Merck(Darmstadt,Germany)。
尺寸排除層析SEC在HiLoad 16/60 Superdex 200製備級管柱(GE Lifesciences)上進行,該管柱經SEC緩衝劑(10mM檸檬酸、75mM離胺酸鹽酸鹽,pH 7.2)平衡,流速為1ml/min。將BiTE抗體單體及二聚體溶離份彙集且添加24%海藻糖儲備溶液以達到4%之最終海藻糖濃度。溶離之蛋白質樣品經受還原SDS-PAGE及抗His標籤西方印跡法以進行分析。
SEC蛋白質池(池_1=彙集之含有二聚BiTE蛋白質同功異型物的SEC溶離份,池_2=彙集之含有單體BiTE蛋白質的SEC溶離份)在具有1cm光路之聚碳酸酯吸收池(Eppendorf,Hamburg-Germany)中針對280nm吸收進行量測且基於各蛋白質之Vector NTI蛋白質分析因子計算蛋白質濃度。SA-21-CEAxCD3結合分子之SEC型態示範性地展示於圖2中。
細胞毒性活性:利用經刺激之人類T細胞的鉻釋放分析
富集CD8+ T細胞之經刺激之T細胞如下所述獲得:在37℃下將皮氏培養皿(145mm直徑,Greiner bio-one GmbH,Kremsmünster)用最終濃度為1μg/ml之市售抗-CD3特異性抗體(OKT3,Orthoclone)塗佈1小時。藉由使用PBS之一個洗滌步驟移除未結合之蛋白質。將3-5×107個人類PBMC添加至預塗佈之皮氏培養皿中120ml具有穩定化麩醯胺酸/10% FCS/IL-2 20U/ml(Proleukin®,Chiron)之RPMI 1640中且刺激2天。第三天,收集細胞且用RPMI 1640洗滌一次。添加IL-2至20U/ml之最終濃度且細胞再次在與以上相同的細胞培養基中培養一天。
CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)藉由使用Dynal-Beads,根據製造商之方案,消耗CD4+ T細胞及CD56+ NK細胞來富集。
人類CD33轉染之CHO標靶細胞用PBS洗滌兩次且在最終體積為100μl之具有50% FCS的RPMI中在37℃下用11.1MBq 51Cr標記60分鐘。隨後,經標記之標靶細胞用5ml RPMI洗滌3次,且接著用於細胞毒性分析。分析在96孔盤中在存在10% HSA(人類白蛋白,20%,CSL Behring GmbH:PZN-1468366)下的總體積為200μl的E:T比率為10:1之補充RPMI中進行。使用0.01-1μg/ml起始濃度之經純化之雙特異性抗體及其三倍稀釋液。分析培育時間為18小時。細胞毒性確定為上清液中釋放之鉻相對於最大程度溶解(添加曲拉通-X)與自發溶解(無效應細胞)之差異的相對值。所有量測一式四份進行。上清液中鉻活性之量測在Wizard 3" γ粒子計數管(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Köln,Germany)中進行。結果之分析用Windows之Prism 5(5.0版,GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)進行。藉由分析程式自S形劑量反應曲線計算之EC50值用於比較細胞毒性活性(參見圖3)。
<110> 德商安美基研究(慕尼黑)公司
<120> 包含N-端ABP之單鏈結合分子
<130> MIM14470PCT
<150> US 61/792,073
<151> 2013-03-15
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (31)
- 一種包含至少三個結合結構域之單鏈結合分子,其中(a)第一結合結構域能夠結合於血清白蛋白且位於第二結合結構域之N-端;(b)該第二結合結構域能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子;以及(c)第三結合結構域能夠結合於T細胞CD3受體複合物。
- 如請求項1之結合分子,其中該三個結構域自N-端至C-端按以下次序連續地位於一個多肽鏈上:該第一結合結構域;該第二結合結構域;及該第三結合結構域。
- 一種包含至少三個結合結構域之結合分子,該至少三個結合結構域以第一結構域、第二結構域及第三結構域之次序包含在一個多肽鏈中,其中(a)該第一結合結構域能夠結合於血清白蛋白且位於該第二結合結構域之N-端;(b)該第二結合結構域能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子;以及(c)該第三結合結構域能夠結合於T細胞CD3受體複合物;且其中自產生該結合分子之宿主細胞之培養物上清液分離的單體結合分子之產率為自產生在分子C-端包含能夠結合於血清白蛋白之結合結構域的結合分子之宿主細胞之培養物上清液分離的單體結合分子之產率的至少1.5倍。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中該等結合結構域中之 至少一者為scFv或單域抗體。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中該分子包含一或多種其他異源多肽。
- 如請求項5之結合分子,其進一步包含His-標籤。
- 如請求項6之結合分子,其中該His-標籤位於該第三結合結構域之C-端。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中(a)該第一結合結構域能夠結合於人類及非人類靈長類動物血清白蛋白;(b)該第二結合結構域能夠結合於人類及非人類靈長類動物細胞上之該細胞表面分子,以及(c)該第三結合結構域能夠結合於人類及非人類靈長類動物細胞上之該T細胞CD3受體複合物。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中能夠結合於血清白蛋白之該第一結合結構域衍生自組合庫或抗體結合結構域。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中該第一結合結構域包含10至25個胺基酸殘基。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中能夠結合於血清白蛋白之該第一結合結構域包含胺基酸序列Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp,其中Xaa為任何胺基酸。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中能夠結合於血清白蛋白之該第一結合結構域衍生自單域抗體之CDR。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中該第一結合結構域以500nM之親和力(KD)結合於血清白蛋白。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中該第二結合結構域以100nM之親和力(KD)結合於標靶細胞上 之該細胞表面分子;以及該第三結合結構域以100nM之親和力(KD)結合於該T細胞CD3受體複合物。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中該結合分子在活體外分析中展示細胞毒性活性,該活體外分析係量測在10%人類血清白蛋白存在下效應細胞對標靶細胞之溶解。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中該分子由單一多肽鏈組成。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中(a)該第二結合結構域包含抗體來源之VL及VH鏈;及/或(b)該第三結合結構域包含抗體來源之VL及VH鏈。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中能夠結合於細胞表面分子之該第一結合結構域結合於腫瘤抗原。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其中能夠結合於該T細胞CD3受體複合物之該第二結合結構域能夠結合於人類及白鬢狨(Callithrix jacchus)、棉頂狨(Saguinus oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3ε鏈之抗原決定基,其中該抗原決定基為包含在由WO 2008/119567之SEQ ID NO:2、4、6或8組成之群中的胺基酸序列之一部分且包含至少胺基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(SEQ ID NO:37)。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其特徵為如SEQ ID NO:8、12、16、20、24、26、30或34中描繪之胺基酸序列。
- 如請求項1至3中任一項之結合分子,其用於預防、治療或改善選自由增生性疾病、發炎疾病、傳染性疾病及自體免疫疾病組成之群的疾病。
- 一種用於產生如請求項1至21中任一項之結合分子的方法,該方 法包含以下步驟:選擇包含能夠結合於標靶細胞上之細胞表面分子之結合結構域的結合分子,其在N-端包含能夠結合於血清白蛋白之結合結構域。
- 如請求項22之方法,其進一步包含以下步驟:向該分子添加能夠結合於T細胞CD3受體複合物之另一結合結構域。
- 一種核酸分子,其具有編碼如請求項1至21中任一項之結合分子的序列。
- 一種載體,其包含如請求項24之核酸序列。
- 一種宿主細胞,其經如請求項23之核酸序列或經如請求項25之載體轉型或轉染。
- 一種用於產生如請求項1至21中任一項之結合分子或藉由如請求項22或23之方法產生之結合分子的方法,該方法包含在允許如請求項1至21中任一項之結合分子或藉由如請求項22或23之方法產生之結合分子表現的條件下培養如請求項26之宿主細胞且自該培養物回收所產生之結合分子。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至21中任一項之結合分子或根據如請求項23之方法產生之結合分子。
- 一種根據如請求項22或23之方法產生的結合分子,其用於預防、治療或改善選自由增生性疾病、發炎疾病、傳染性疾病及自體免疫疾病組成之群的疾病。
- 一種如請求項1至21中任一項之結合分子或根據如請求項22或23之方法產生之結合分子的用途,其係用於製造供治療或改善選自由增生性疾病、發炎疾病、傳染性疾病及自體免疫疾病組成之群之疾病的藥劑。
- 一種套組,其包含如請求項1至21中任一項之結合分子或根據如請求項22或23之方法產生之結合分子、如請求項24之核酸分子、如請求項25之載體或如請求項26之宿主細胞。
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EP3377103B1 (en) * | 2015-11-19 | 2021-03-17 | Revitope Limited | Functional antibody fragment complementation for a two-components system for redirected killing of unwanted cells |
EA039859B1 (ru) | 2016-02-03 | 2022-03-21 | Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх | Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3 |
EP3411404B1 (en) | 2016-02-03 | 2022-11-09 | Amgen Research (Munich) GmbH | Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs |
KR20180103084A (ko) | 2016-02-03 | 2018-09-18 | 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 | Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물 |
US10100106B2 (en) | 2016-05-20 | 2018-10-16 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Single domain serum albumin binding protein |
AU2017267793B2 (en) | 2016-05-20 | 2024-01-25 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Single chain variable fragment CD3 binding proteins |
US11623958B2 (en) | 2016-05-20 | 2023-04-11 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Single chain variable fragment CD3 binding proteins |
WO2018091621A1 (en) * | 2016-11-17 | 2018-05-24 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and pharmaceutical compositions for increasing endogenous protein level |
MX2019006043A (es) | 2016-11-23 | 2019-09-26 | Harpoon Therapeutics Inc | Proteína de unión de antígeno prostático específico de membrana. |
BR112019010602A2 (pt) | 2016-11-23 | 2019-12-17 | Harpoon Therapeutics Inc | proteínas trispecíficas para psma e métodos de uso |
EP3589662A4 (en) | 2017-02-28 | 2020-12-30 | Harpoon Therapeutics, Inc. | INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN |
KR102376863B1 (ko) | 2017-05-12 | 2022-03-21 | 하푼 테라퓨틱스, 인크. | 메소텔린 결합 단백질 |
JP7209936B2 (ja) | 2017-05-12 | 2023-01-23 | ハープーン セラピューティクス,インク. | Msln標的三重特異性タンパク質及びその使用方法 |
CR20200195A (es) | 2017-10-13 | 2020-08-14 | Harpoon Therapeutics Inc | Proteínas de unión a antigenos de maduraciòn de celulas b |
KR102569133B1 (ko) | 2017-10-13 | 2023-08-21 | 하푼 테라퓨틱스, 인크. | 삼중특이적 단백질 및 사용 방법 |
JP7425049B2 (ja) * | 2018-09-25 | 2024-01-30 | ハープーン セラピューティクス,インク. | Dll3結合タンパク質および使用方法 |
WO2020086635A1 (en) | 2018-10-23 | 2020-04-30 | Amgen Inc. | Automatic calibration and automatic maintenance of raman spectroscopic models for real-time predictions |
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Family Cites Families (114)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3180193A (en) | 1963-02-25 | 1965-04-27 | Benedict David | Machines for cutting lengths of strip material |
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
US3691016A (en) | 1970-04-17 | 1972-09-12 | Monsanto Co | Process for the preparation of insoluble enzymes |
CA1023287A (en) | 1972-12-08 | 1977-12-27 | Boehringer Mannheim G.M.B.H. | Process for the preparation of carrier-bound proteins |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US4195128A (en) | 1976-05-03 | 1980-03-25 | Bayer Aktiengesellschaft | Polymeric carrier bound ligands |
US4330440A (en) | 1977-02-08 | 1982-05-18 | Development Finance Corporation Of New Zealand | Activated matrix and method of activation |
CA1093991A (en) | 1977-02-17 | 1981-01-20 | Hideo Hirohara | Enzyme immobilization with pullulan gel |
US4229537A (en) | 1978-02-09 | 1980-10-21 | New York University | Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands |
US4263428A (en) | 1978-03-24 | 1981-04-21 | The Regents Of The University Of California | Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same |
JPS6023084B2 (ja) | 1979-07-11 | 1985-06-05 | 味の素株式会社 | 代用血液 |
IE52535B1 (en) | 1981-02-16 | 1987-12-09 | Ici Plc | Continuous release pharmaceutical compositions |
US4475196A (en) | 1981-03-06 | 1984-10-02 | Zor Clair G | Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system |
US4447233A (en) | 1981-04-10 | 1984-05-08 | Parker-Hannifin Corporation | Medication infusion pump |
US4485045A (en) | 1981-07-06 | 1984-11-27 | Research Corporation | Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes |
US4640835A (en) | 1981-10-30 | 1987-02-03 | Nippon Chemiphar Company, Ltd. | Plasminogen activator derivatives |
EP0088046B1 (de) | 1982-02-17 | 1987-12-09 | Ciba-Geigy Ag | Lipide in wässriger Phase |
US4439196A (en) | 1982-03-18 | 1984-03-27 | Merck & Co., Inc. | Osmotic drug delivery system |
US4447224A (en) | 1982-09-20 | 1984-05-08 | Infusaid Corporation | Variable flow implantable infusion apparatus |
US4487603A (en) | 1982-11-26 | 1984-12-11 | Cordis Corporation | Implantable microinfusion pump system |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4486194A (en) | 1983-06-08 | 1984-12-04 | James Ferrara | Therapeutic device for administering medicaments through the skin |
US4544545A (en) | 1983-06-20 | 1985-10-01 | Trustees University Of Massachusetts | Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting |
HUT35524A (en) | 1983-08-02 | 1985-07-29 | Hoechst Ag | Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance |
DE3474511D1 (en) | 1983-11-01 | 1988-11-17 | Terumo Corp | Pharmaceutical composition containing urokinase |
US4496689A (en) | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
US4596556A (en) | 1985-03-25 | 1986-06-24 | Bioject, Inc. | Hypodermic injection apparatus |
US4751180A (en) | 1985-03-28 | 1988-06-14 | Chiron Corporation | Expression using fused genes providing for protein product |
DE3675588D1 (de) | 1985-06-19 | 1990-12-20 | Ajinomoto Kk | Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist. |
US4935233A (en) | 1985-12-02 | 1990-06-19 | G. D. Searle And Company | Covalently linked polypeptide cell modulators |
EP0272253A4 (en) | 1986-03-07 | 1990-02-05 | Massachusetts Inst Technology | METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY. |
GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
US4791192A (en) | 1986-06-26 | 1988-12-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein with polyethyleneglycol |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
EP0307434B2 (en) | 1987-03-18 | 1998-07-29 | Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. | Altered antibodies |
ATE120761T1 (de) | 1987-05-21 | 1995-04-15 | Creative Biomolecules Inc | Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung. |
US4941880A (en) | 1987-06-19 | 1990-07-17 | Bioject, Inc. | Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly |
US4790824A (en) | 1987-06-19 | 1988-12-13 | Bioject, Inc. | Non-invasive hypodermic injection device |
US5476996A (en) | 1988-06-14 | 1995-12-19 | Lidak Pharmaceuticals | Human immune system in non-human animal |
GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
US5175384A (en) | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
EP0402226A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Institut National De La Recherche Agronomique | Transformation vectors for yeast yarrowia |
US5683888A (en) | 1989-07-22 | 1997-11-04 | University Of Wales College Of Medicine | Modified bioluminescent proteins and their use |
US5013556A (en) | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5312335A (en) | 1989-11-09 | 1994-05-17 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
US5064413A (en) | 1989-11-09 | 1991-11-12 | Bioject, Inc. | Needleless hypodermic injection device |
US5292658A (en) | 1989-12-29 | 1994-03-08 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center | Cloning and expressions of Renilla luciferase |
US6150584A (en) | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US6673986B1 (en) | 1990-01-12 | 2004-01-06 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
DE69120146T2 (de) | 1990-01-12 | 1996-12-12 | Cell Genesys Inc | Erzeugung xenogener antikörper |
US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
FR2664073A1 (fr) | 1990-06-29 | 1992-01-03 | Thomson Csf | Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture. |
US6300129B1 (en) | 1990-08-29 | 2001-10-09 | Genpharm International | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US6255458B1 (en) | 1990-08-29 | 2001-07-03 | Genpharm International | High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin |
US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
WO1993012227A1 (en) | 1991-12-17 | 1993-06-24 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5814318A (en) | 1990-08-29 | 1998-09-29 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5789650A (en) | 1990-08-29 | 1998-08-04 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
ES2246502T3 (es) | 1990-08-29 | 2006-02-16 | Genpharm International, Inc. | Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. |
US5770429A (en) | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5877397A (en) | 1990-08-29 | 1999-03-02 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US5874299A (en) | 1990-08-29 | 1999-02-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
WO1992003917A1 (en) | 1990-08-29 | 1992-03-19 | Genpharm International | Homologous recombination in mammalian cells |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
EP0575319B1 (en) | 1991-03-11 | 1999-11-10 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Cloning and expression of renilla luciferase |
WO1992022670A1 (en) | 1991-06-12 | 1992-12-23 | Genpharm International, Inc. | Early detection of transgenic embryos |
WO1992022645A1 (en) | 1991-06-14 | 1992-12-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic immunodeficient non-human animals |
AU2515992A (en) | 1991-08-20 | 1993-03-16 | Genpharm International, Inc. | Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs |
ES2136092T3 (es) | 1991-09-23 | 1999-11-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados. |
EP0648265A4 (en) | 1992-06-18 | 1996-12-04 | Genpharm Int | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS HAVING AN ARTIFICIAL YEAST CHROMOSOME. |
US5383851A (en) | 1992-07-24 | 1995-01-24 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
ATE381614T1 (de) | 1992-07-24 | 2008-01-15 | Amgen Fremont Inc | Bildung von xenogenen antikörpern |
AU678787B2 (en) | 1992-10-23 | 1997-06-12 | Immunex Corporation | Methods of preparing soluble, oligomeric proteins |
US5981175A (en) | 1993-01-07 | 1999-11-09 | Genpharm Internation, Inc. | Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome |
CA2161351C (en) | 1993-04-26 | 2010-12-21 | Nils Lonberg | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
AU694745B2 (en) | 1993-09-10 | 1998-07-30 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Uses of green fluorescent protein |
US5625825A (en) | 1993-10-21 | 1997-04-29 | Lsi Logic Corporation | Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network |
WO1995021191A1 (en) | 1994-02-04 | 1995-08-10 | William Ward | Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein |
US5643763A (en) | 1994-11-04 | 1997-07-01 | Genpharm International, Inc. | Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating |
US6214388B1 (en) | 1994-11-09 | 2001-04-10 | The Regents Of The University Of California | Immunoliposomes that optimize internalization into target cells |
US5777079A (en) | 1994-11-10 | 1998-07-07 | The Regents Of The University Of California | Modified green fluorescent proteins |
EP0823941A4 (en) | 1995-04-28 | 2001-09-19 | Abgenix Inc | HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES |
US5811524A (en) | 1995-06-07 | 1998-09-22 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof |
AU718138B2 (en) | 1995-08-29 | 2000-04-06 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Chimeric animal and method for constructing the same |
US5874304A (en) | 1996-01-18 | 1999-02-23 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Humanized green fluorescent protein genes and methods |
US5804387A (en) | 1996-02-01 | 1998-09-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP) |
US5876995A (en) | 1996-02-06 | 1999-03-02 | Bryan; Bruce | Bioluminescent novelty items |
US5925558A (en) | 1996-07-16 | 1999-07-20 | The Regents Of The University Of California | Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates |
US5976796A (en) | 1996-10-04 | 1999-11-02 | Loma Linda University | Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes |
DK1500329T3 (da) | 1996-12-03 | 2012-07-09 | Amgen Fremont Inc | Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa |
WO1998026277A2 (en) | 1996-12-12 | 1998-06-18 | Prolume, Ltd. | Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents |
EP1064360B1 (en) | 1998-03-27 | 2008-03-05 | Prolume, Ltd. | Luciferases, gfp fluorescent proteins, their nucleic acids and the use thereof in diagnostics |
PT1071752E (pt) | 1998-04-21 | 2003-11-28 | Micromet Ag | Polipeptidos especificos para cd19xcd3 e suas utilizacoes |
US6833268B1 (en) | 1999-06-10 | 2004-12-21 | Abgenix, Inc. | Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions |
US20060228364A1 (en) * | 1999-12-24 | 2006-10-12 | Genentech, Inc. | Serum albumin binding peptides for tumor targeting |
ATE337403T1 (de) | 1999-12-24 | 2006-09-15 | Genentech Inc | Verfahren und verbindungen zur verlängerung der halbwertzeiten bei der ausscheidung von biowirksamen verbindungen |
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PL2361936T3 (pl) * | 2010-02-25 | 2016-10-31 | Cząsteczka wiążąca antygen i jej zastosowania | |
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