KR20210148216A - 항-클라우딘 18.2 항체 및 이의 응용 - Google Patents

항-클라우딘 18.2 항체 및 이의 응용 Download PDF

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KR20210148216A
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Abstract

본 개시 내용은 항-클라우딘 18.2 항체 및 이의 응용에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 항-클라우딘 18.2 항체; 항-클라우딘 18.2 항체의 CDR을 함유하는 마우스 유래 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 이의 항원 결합 단편, 및 의약으로서 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 개시 내용은 클라우딘 18.2 양성 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 항-클라우딘 18.2 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

항-클라우딘 18.2 항체 및 이의 응용
본 출원은 2019년 4월 1일에 출원된 특허 출원 제201910257853.6호의 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 개시 내용은 항체 약물 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시 내용은 클라우딘(Claudin) 18.2 항체 및 이의 응용에 관한 것이다.
본원의 설명은 단지 본 개시 내용에 관한 배경 정보를 제공하는 것으로, 반드시 선행 기술을 구성하는 것은 아니다.
클라우딘-18(CLDN18)은 인간 클라우딘 18 유전자에 의해 암호화되는 단백질로서, 세포에서 밀착연접(tight junction) 단백질 패밀리에 속한다. 클라우딘-18(Claudin-18)은 세포 층 사이의 분자 흐름을 제어할 수 있다.
클라우딘-18 단백질은 구조적으로 4개의 막관통 영역(transmembrane regions)과 2개의 세포외 루프(extracellular loops)를 포함하며, N 말단과 C 말단은 세포질 내부에 존재한다. 클라우딘-18에는 두 개의 스플라이싱 변이체인 클라우딘 18.1 및 클라우딘 18.2가 있다. 두 서열은 첫 번째 세포외 루프의 8개 아미노산에서만 서로 상이하다. 클라우딘 18.1은 클라우딘 18.2와 상이하게 발현되고 분포된다. 클라우딘 18.1은 정상적인 폐 세포에서 선택적으로 발현되는 반면, 클라우딘 18.2의 발현은 정상 세포에서 매우 제한되지만, 다양한 종양(위암, 폐암, 췌장암 등)에서 종종 이소 활성화(ectopically activated)되고 과발현된다. 클라우딘 18.2는 위암 및 기타 유형의 암에 대한 잠재적인 치료 표적으로 간주된다. 이 표적의 발견은 또한 위암 치료를 위한 새로운 옵션을 제공한다.
본 개시 내용은 항-클라우딘 18.2 항체를 제공한다.
일부 구현예에서, 전술한 항-클라우딘 18.2 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때,
i) 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)은 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역과 동일한 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역(light chain variable region)은 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역과 동일한 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하거나; 또는
ii) 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 제시된 중쇄 가변 영역과 동일한 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 6에 제시된 경쇄 가변 영역과 동일한 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전술한 항-클라우딘 18.2 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때,
iii) 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나; 또는
iv) 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
당업자는 i), ii), a), b) 등과 같은 항목 번호가 열거된 기술적 해결책 또는 요소를 더욱 명확하게 하고 쉽게 식별되도록 하기 위한 목적일 뿐, 다음의 기술적 해결책 또는 요소를 어떠한 점에서도 제한하지 않음을 이해할 것이다. 동일한 항목 번호가 사용된다고 하여 다음의 기술적 해결책 또는 요소가 동일하다는 것을 의미하지는 않는다.
전술한 바와 같은 항-클라우딘 18.2 항체의 일부 구현예에서, 항-클라우딘 18.2 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체이다.
일부 구현예에서, 전술한 항-클라우딘 18.2 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때,
(v) 중쇄 가변 영역은 서열번호 3 또는 24에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 동일성(identity)을 갖고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 4 또는 21에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 동일성을 갖거나; 또는
(vi) 중쇄 가변 영역은 서열번호 5 또는 31에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 6 또는 28에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 전술한 항-클라우딘 18.2 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때,
(1) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 3에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 3과 적어도 90%의 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 4에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 4와 적어도 90%의 동일성을 갖거나;
(2) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 24에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 24와 적어도 90%의 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 21에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 21과 적어도 90%의 동일성을 갖거나;
(3) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 5에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 5와 적어도 90%의 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 6과 적어도 90%의 동일성을 갖거나; 또는
(4) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 31에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 31과 적어도 90%의 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 28에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 28과 적어도 90%의 동일성을 갖는다.
전술한 항-클라우딘 18.2 항체의 일부 구현예에서, 항-클라우딘 18.2 항체는 인간화 항체이고, 인간화 항체는 인간 항체 프레임워크 영역 또는 이의 프레임워크 영역 변이체로부터 유래한 프레임워크 영역을 포함하고, 프레임워크 영역 변이체는 인간 항체 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 중쇄 프레임워크 영역 각각에 최대 10개의 역 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, 인간 항체 중쇄 프레임워크 영역은 서열번호 24의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역과 동일하거나, 인간 항체 경쇄 가변 영역은 서열번호 21의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역과 동일하거나; 또는 인간 항체 중쇄 프레임워크 영역은 서열번호 31의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역과 동일하거나, 인간 항체 경쇄 가변 영역은 서열번호 28의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역과 동일하다.
일부 구현예에서, 바람직하게는, 프레임워크 영역 변이체는 다음의 (a) 또는 (b)로부터 선택되는 돌연변이(들)를 포함한다:
(a) 경쇄 가변 영역에 포함된 22S, 85I 또는 87H 중 하나 이상의 아미노산 역 돌연변이(들), 및/또는 중쇄 가변 영역에 포함된 48I, 82T 및 69M으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 역 돌연변이(들); 또는
(b) 경쇄 가변 영역에 포함된 4L 및 22S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 역 돌연변이(들), 및/또는 중쇄 가변 영역에 포함된 38K, 40R, 48I, 66K, 67A, 69, 71L 및 73K로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 역 돌연변이(들).
전술한 항-클라우딘 18.2 항체의 일부 구현예에서, 프레임워크 영역 변이체는 다음의 (a-1) 또는 (b-1)로부터 선택되는 돌연변이(들)를 포함한다:
(a-1) 경쇄 가변 영역에 포함되는 아미노산 역 돌연변이 22S, 85I 및 87H, 및 중쇄 가변 영역에 포함되는 아미노산 역 돌연변이 48I 및 82T; 또는
(b-1) 경쇄 가변 영역에 포함되는 아미노산 역 돌연변이 4L.
전술한 항-클라우딘 18.2 항체의 일부 구현예에서,
(vii) 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 3에 제시된 바와 같고 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 4에 제시된 바와 같거나; 또는
(viii) 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 24, 25, 26 또는 27에 제시된 바와 같고 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 21, 22 또는 23에 제시된 바와 같거나; 또는
(ix) 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 5에 제시된 바와 같고 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같거나; 또는
(x) 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 31, 32, 33 또는 34에 제시된 바와 같고 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 28, 29 또는 30에 제시된 바와 같다;
전술한 항-클라우딘 18.2 항체의 일부 구현예에서, 항-클라우딘18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아래에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(xi) 서열번호 31에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 29에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열; 또는
(xii) 서열번호 26에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 23에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열.
전술한 항-클라우딘 18.2 항체의 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 다음의 표에 제시된 바와 같은 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 조합일 수 있다:
mAb1901 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 조합
가변 영역 VH1 VH2 VH3 VH4
VL1 VH1VL1 VH2VL1 VH3VL1 VH4VL1
VL2 VH1VL2 VH2VL2 VH3VL2 VH4VL2
VL3 VH1VL3 VH2VL3 VH3VL3 VH4VL3
mAb1902 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 조합
가변 영역 VH11 VH12 VH13 VH14
VL11 VH11VL11 VH12VL11 VH13VL11 VH14VL11
VL12 VH11VL12 VH12VL12 VH13VL12 VH14VL12
VL13 VH11VL13 VH12VL13 VH13VL13 VH14VL13
전술한 항-클라우딘 18.2 항체의 일부 구현예에서, 항체는 항체 불변 영역(들)을 추가로 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 불변 영역(들) 및 이의 변이체(들)로 구성된 군으로부터 선택되고, 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 항체 카파, 람다 쇄 불변 영역(들) 및 이의 변이체(들)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 특정 구현예에서, 항체는 서열번호 7에 제시된 바와 같은 중쇄 불변 영역 서열 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 경쇄 불변 영역 서열을 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 항체는 서열번호 35 또는 42에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 동일성을 갖는 중쇄 및 서열번호 36 또는 39에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 동일성을 갖는 경쇄; 또는
서열번호 37 또는 49에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 동일성을 갖는 중쇄, 및/또는 서열번호 38 또는 46에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 전술한 항-클라우딘 18.2 항체는 다음을 포함한다:
(c) 서열번호 35의 서열에 제시된 바와 같은 중쇄 및/또는 서열번호 36의 서열에 제시된 바와 같은 경쇄;
(d) 서열번호 42, 43, 44 또는 45의 서열에 제시된 바와 같은 중쇄 및/또는 서열번호 39, 40 또는 41의 서열에 제시된 바와 같은 경쇄;
(e) 서열번호 37의 서열에 제시된 바와 같은 중쇄 및/또는 서열번호 38의 서열에 제시된 바와 같은 경쇄; 또는
(f) 서열번호 49, 50, 51 또는 52의 서열에 제시된 바와 같은 중쇄 및/또는 서열번호 46, 47 또는 48의 서열에 제시된 바와 같은 경쇄.
전술한 항-클라우딘 18.2 항체의 일부 구현예에서, 항체는 인간 클라우딘 18.2에 결합하기 위하여 전술한 바와 같은 항-클라우딘 18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁한다.
일부 구현예에서, 전술한 항-클라우딘 18.2 항체는 다음을 포함한다:
서열번호 44의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 중쇄, 및 서열번호 41의 서열에 제시된 바와 같은 경쇄; 또는
서열번호 49의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 중쇄, 및 서열번호 47의 서열에 제시된 바와 같은 경쇄.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 또한 전술한 바와 같은 항-클라우딘 18.2 항체를 암호화(encoding)하는 핵산 분자(nucleic acid molecule)를 제공한다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 또한 전술한 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터(expression vector)를 제공한다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 또한 숙주 세포를 제공하며, 이는 전술한 바와 같은 핵산 분자 또는 전술한 바와 같은 발현 벡터를 포함하고, 바람직하게는 세포는 박테리아 세포, 진균 세포, 곤충 동물 세포 또는 포유동물 세포이다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 또한 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)를 제공하며, 이는 전술한 바와 같은 항-클라우딘 18.2 항체를 세포독성약물(cytotoxic drug)에 접합시켜 형성된다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 또한 세포독성약물에 공유 결합하는 전술한 바와 같은 항-클라우딘 18.2 항체를 포함하거나 이로 구성된 항체-약물 접합체를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 전술한 바와 같은 항-클라우딘 18.2 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 전술한 바와 같은 항-클라우딘 18.2 항체-약물 접합체의 제조 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 치료적 유효량의 전술한 항-클라우딘 18.2 항체, 또는 전술한 핵산 분자, 또는 전술한 항체-약물 접합체, 및 1종 이상의 제약상 허용 가능한 담체, 희석제, 완충제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 전술한 항-클라우딘18.2 항체를 테스트할 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하는 클라우딘18.2의 면역분석 또는 검출 방법(immunodetection or determination)을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 인간 클라우딘18.2의 면역분석(immunoassay)을 위한 시약(reagent)의 제조를 위한 전술한 항-클라우딘 18.2 항체의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 클라우딘18.2의 면역분석 또는 검출용의 전술한 항-클라우딘 18.2 항체를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 전술한 항-클라우딘 18.2 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 암 또는 종양의 치료 의약의 제조를 위한, 전술한 항-클라우딘 18.2 항체, 또는 전술한 핵산 분자, 또는 전술한 항체-약물 접합체, 또는 전술한 약학적 조성물의 용도를 제공하며, 이때, 암 또는 종양은 바람직하게는 클라우딘18.2 양성 암 또는 악성 종양이고, 더욱 바람직하게는 두경부 편평세포암(neck squamous cell cancer), 두경부암(head and neck cancer), 뇌암(brain cancer), 신경교종(glioma), 다형성교모세포종(glioblastoma multiforme), 신경모세포종(neuroblastoma), 중추신경계 암(central nervous system cancer), 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor), 인후두 암종(laryngopharyngeal carcinoma), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 식도암(esophageal cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 악성 흉막 중피종(malignant pleural mesothelioma), 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 간암(liver cancer), 간세포 종양(hepatocellular tumor), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 간 및 담낭암(liver and gallbladder cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 위암(gastric cancer), 소화기암(gastrointestinal cancer), 창자암(intestinal cancer), 결장암(colon cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 신장암(kidney cancer), 투명세포 신세포 암종(clear cell renal cell carcinoma), 난소암(ovarian cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 방광암(bladder cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testicular cancer), 피부암(skin cancer), 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 골암(bone cancer), 연골육종(chondrosarcoma), 골수종(myeloma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 골수증식성 종양(myeloproliferative tumor), 편평세포암(squamous cell carcer), 유잉 육종(Ewing sarcoma), 전신 경쇄 아밀로이드증(systemic light chain amyloidosis) 및 메르켈 세포암(Merkel cell carcer)이고; 림프종(lymphoma)은 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비 호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종(primary mediastinal large B-cell lymphoma), 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma), 소림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma), T 세포/조직구가 풍부한 거대 B 세포 림프종(large B-cell lymphoma rich in T-cells/histiocytes), 및 림프형질세포성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma)으로 구성된 군으로부터 선택되고; 폐암은 비 소세포 폐암(non-small cell lung cancer) 및 소세포 폐암(small cell lung cancer)으로 구성된 군으로부터 선택되고; 백혈병(leukemia)은 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 림프구성 백혈병(lymphocytic leukemia), 림프모구성 백혈병(lymphoblastic leukemia), 급성 림프모구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 및 골수성 백혈병(myeloid leukemia)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 클라우딘 18.2와 관련된 질환의 치료 방법을 제공하며, 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 전술한 항-클라우딘 18.2 항체, 또는 전술한 핵산 분자, 또는 전술한 항체-약물 접합체, 또는 전술한 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 이때, 질환은 바람직하게는 암 또는 종양이고; 더욱 바람직하게는 클라우딘18.2 양성 암 또는 악성 종양이고, 더욱 바람직하게는 두경부 편평세포암, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 다형성교모세포종, 신경모세포종, 중추신경계 암, 신경내분비 종양, 인후두 암종, 비인두암, 식도암, 갑상선암, 악성 흉막 중피종, 폐암, 유방암, 간암, 간세포 종양, 간세포 암종, 간 및 담낭암, 췌장암, 위암, 소화기암, 창자암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 투명세포 신세포 암종, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 골암, 연골육종, 골수종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 골수증식성 종양, 편평세포암, 유잉 육종, 전신 경쇄 아밀로이드증 및 메르켈 세포암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 림프종은 호지킨 림프종, 비 호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 소림프구성 림프종, T 세포/조직구가 풍부한 거대 B 세포 림프종, 및 림프형질세포성 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되고; 폐암은 비 소세포 폐암 및 소세포 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되고; 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프모구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 및 골수성 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 치료적 유효량은 조성물의 단위 용량에 포함된 전술한 항-클라우딘 18.2 항체 또는 전술한 항체-약물 접합체 0.1 mg 내지 3000 mg 또는 1 mg 내지 1000 mg을 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용은 클라우딘 18.2와 관련된 질환의 치료에 사용하기 위한, 전술한 항-클라우딘 18.2 항체, 또는 전술한 핵산 분자, 또는 전술한 항체-약물 접합체 또는 전술한 약학적 조성물을 제공하며, 이때, 질환은 바람직하게는 암 또는 종양이고; 더욱 바람직하게는 클라우딘18.2 양성 암 또는 악성 종양이고, 더욱 바람직하게는 두경부 편평세포암, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 다형성교모세포종, 신경모세포종, 중추신경계 암, 신경내분비 종양, 인후두 암종, 비인두암, 식도암, 갑상선암, 악성 흉막 중피종, 폐암, 유방암, 간암, 간세포 종양, 간세포 암종, 간 및 담낭암, 췌장암, 위암, 소화기암, 창자암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 투명세포 신세포 암종, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 골암, 연골육종, 골수종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 골수증식성 종양, 편평세포암, 유잉 육종, 전신 경쇄 아밀로이드증 및 메르켈 세포암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암 또는 종양이다. 더욱 바람직하게는, 림프종은 호지킨 림프종, 비 호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 소림프구성 림프종, T 세포/조직구가 풍부한 거대 B 세포 림프종, 및 림프형질세포성 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되고; 폐암은 비 소세포 폐암 및 소세포 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되고; 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프모구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 및 골수성 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 암은 위암, 식도암, 폐암 또는 췌장암이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항체-약물 접합체는 전술한 바와 같이 클라우딘 18.2의 고, 중, 및 저 발현을 나타내는 암에서 전술한 바와 같이 치료적 역할을 할 수 있다.
본 개시 내용에 제공된 클라우딘 18.2 항체 및 항체-약물 접합체는 세포 표면 항원에 대한 친화도가 우수하고, 세포 내 이입 효율이 양호하고, 종양 억제 효율이 강하며, 제약상 적용 범위가 더 넓어, 의약으로서 임상적 용도에 적합하다.
도 1: 세포 수준에서 인간 클라우딘 18.2에 대한 인간화 항체의 결합에 대한 FACS 테스트 결과.
도 2: NUGC4 세포에서 인간화 항체의 세포 내 이입 분석(endocytosis assay).
도 3a 내지 도 3c: 상이한 발현 수준의 클라우딘 18.2를 갖는 NUGC4 세포에서 항체의 ADCC 효과 검출. 도 3a는 야생형 NUGC4 세포(저 발현의 클라우딘18.2)에 대한 항체의 ADCC 효과의 검출을 보여준다. 도 3b는 중 발현의 클라우딘18.2의 NUGC4 세포에 대한 항체의 ADCC 효과의 검출을 보여준다. 도 3c는 고 발현의 클라우딘18.2의 NUGC4 세포에 대한 항체의 ADCC 효과의 검출을 보여준다.
용어
본 개시 내용이 더욱 용이하게 이해되도록, 특정 기술 및 과학 용어를 아래에 구체적으로 정의한다. 본원에서 명시적으로 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 다른 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용과 관련된 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본 개시 내용에서 사용되는 아미노산에 대한 세 문자 부호 및 한 문자 부호는 문헌[J. Biol. Chem, 243, p. 3558 (1968)]에 기술되어 있다.
용어 "세포독성약물(cytotoxic drug)"은 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 초래하는 물질을 지칭한다. 세포독성 약물은 세포를 죽이는 데 사용될 수 있는 화합물, 예컨대, 독소, 화학요법제 및 기타를 포함한다.
용어 "독소(toxin)"는 세포의 성장 또는 증식(growth or proliferation)에 유해한 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질을 지칭하며, 이러한 물질은 캄프토테신 유도체(camptothecin derivatives), 예컨대, 엑사테칸(exatecan), 메이탄시노이드(maytansinoids) 및 이의 유도체(CN101573384), 예컨대, DM1, DM3, DM4, 오를리스타틴 F(Orlistatin F, AF) 및 이의 유도체, 예컨대, MMAF, MMAE, 3024(WO 2016/127790 A1, 화합물 7), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 외독소(exotoxin), 리신 A 쇄(ricin A chain), 아브린 A 쇄(abrin A chain), 모데신(modeccin), α-사르신(α-sarcin), 알류티테스 포르디이(Aleutites fordii) 독성 단백질, 디안틴 독성 단백질(dianthin toxic protein), 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 독성 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin), 및 트리코테센(trichothecenes)을 비롯한, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물로부터의 소분자 독소 및 이의 유도체일 수 있다.
용어 "화학요법 약물(chemotherapeutic drug)"은 종양 치료에 사용할 수 있는 화합물이다. 이러한 정의는 또한 암 성장을 촉진할 수 있는 호르몬 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제할 수 있는 항호르몬제를 포함하며, 일반적으로 전신 또는 전신 요법의 형태이다. 이들은 호르몬 자체일 수 있다. 화학요법 약물의 예에는 티오테파(thiotepa)와 같은 알킬화제(alkylating agents); 사이클로스파미드(cyclosphamide, CYTOXAN™); 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan) 및 피포술판(piposulfan)과 같은 알킬술폰산염(Alkyl sulfonate); 베나오도파(benaodopa), 카르보쿠온(carboquone), 메투레도파(meturedopa) 및 우레도파(uredopa)와 같은 아지리딘(aziridine); 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌 포스포르아미드(triethylene phosphoramide), 트리에틸렌 티오포스포르아미드(triethylene thiophosphoramide) 및 트리메틸올로멜라민(trimethylolomelamine)을 포함하는 아지리딘(aziridine) 및 메틸아멜라민(methylamelamine); 클로람부실(chlorambucil), 클로르나파진(chlornaphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 메클로레타미녹사이드(mechlorethaminoxide)와 같은 질소 머스타드(nitrogen mustards); 멜팔란(melphalan), 노벤비친(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라무스틴(uramustine); 카르무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 라니무스틴(ranimustine)과 같은 니트로스우레아(nitrosureas); 클래리트로마이신(clarithromycin), 악티노마이신(actinomycin), 아우트라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 칼리케아미신(calicheamicin), 카라비신(carabicin), 크로모마이신(chromomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 악티노마이신 D(actinomycin D), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥시-L-노르류신(6-diazo-5-oxy-L-norleucine), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycin), 미코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycin), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 켈라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin)과 같은 항생제; 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 메토트렉세이트(methotrexate), 5-FU와 같은 항대사물질; 데노프테린(denopterin), 메토트렉세이트(methotrexate), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate)와 같은 엽산 유사체(folic acid analogs); 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토프테린(6-mercaptopteri), 티오메토프테린(thiomethopterin), 티오구아노프테린(thioguanopterin)과 같은 메토트렉세이트 유사체(methotrexate analogs); 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아주리딘(6-azuridine), 카르모푸르(carmofur), 시타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘(dideoxyuridine), 독시투루리딘(doxitluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플루오로우리딘(fluorouridine), 5-FU와 같은 피리미딘 유사체(pyrimidine analogs); 칼루스테론(calusterone), 드로모스타놀롱 프로피오네이트(dromostanolong propionate), 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone)과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 미토탄(mitotane), 트리로스탄(trilostane)과 같은 항아드레날린제; 프롤린산(frolinic acid)과 같은 엽산 보충제; 글루쿠론(glucurone); 알도포스파미드글리코시드(aldophosphamideglycoside); 아미노레불린산(aminolevulinic acid); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(biasntrene); 에다트락세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 콜히친(colchicine); 디아지쿠온(diaziquone); 엘포미틴(elfomithine); 엘립티늄 아세테이트(elliptinium acetate); 에토글루시드(etoglucid); 질산갈륨(gallium nitrate); 하이드록시우레아(hydroxyurea); 렌티난(lentinan); 로니다민(lonidamine); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피다몰(mopidamol); 니트라크린(nitracrine); 핀토스타틴(pintostatin); 페나멧(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 포도필린산(podophyllinic acid); 2-에틸하이드라지드(2-ethylhydrazide); 프로카바진(procarbazine); PSK®; 라족산(razoxane); 시조피란(sizofiran); 스피로게르마늄(spirogermanium); 알테르나리아 테누이스(Alternaria tenuis) 케토산; 트리이민 퀴논(triimine quinone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민(2,2',2"- trichlorrotriethylamine); 우레탄(urethan); 빈블라스틴 아미드(vinblastine amide); 다카르바진(dacarbazine); 만니톨 머스타드(mannitol mustard); 미토브로니톨(mitobronitol); 디브로모 유오니무스 알코올(dibromo euonymus alcohol); 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노시드(arabinoside, "Ara-C"); 시클로포스파미드(cyclophosphamide); 티오테파(thiotepa); 탁산(taxanes), 예컨대, 파클리탁셀(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지 주 프린스턴 소재) 및 도세탁셀(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니 소재); 클로람부실(chlorambucil); 젬시타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌(6-thioguanine); 메르캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate); 시스플라틴(cisplatin) 및 카르보플라틴(carboplatin)과 같은 백금 유사체(platinum analogs); 빈블라스틴(vinblastine); 백금(platinum); 에토포시드(etoposide, VP-16); 이포스페이트(ifosphate); 미토마이신 C(mitomycin C); 미톡산트론(mitoxantrone); 빈크리스틴(vincristine); 비노렐빈(vinorelbine); 나벨빈(navelbine); 노반트론(novantrone); 테니포시드(teniposide); 다우노루비신(daunorubicin); 아미노프테린(aminopterin); 젤로다(xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS2000(Topoisomerase inhibitor RFS2000); 디플루오로메틸오르니틴(Difluoromethylornithine, DMFO); 레티노산 에스페라미신(Retinoic acid esperamicins); 카페시타빈(capecitabine); 및 상기 물질 중 임의의 것의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 이 정의에는 종양에 대한 호르몬의 영향을 조절하거나 억제할 수 있는 항호르몬제도 포함된다. 예를 들어, 항에스트로겐에는 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene), 아로마타제 억제제 4(5)-이미다졸(aromatase inhibitor 4(5)-imidazole), 4-하이드록실 타목시펜(4-hydroxyl tamoxifen), 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), LY117018, 오나프리스톤(onapristone), 및 토레미펜(toremifene, Fareston); 및 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 비칼루타미드(bicalutamide), 류프롤리드(leuprolide) 및 고세렐린(goserelin)과 같은 항안드로겐; 및 임의의 상기 물질의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체"는 면역글로불린을 지칭하며, 완전한 항체는 사슬간 이황화 결합(들)에 의해 2개의 동일한 경쇄에 연결된 2개의 동일한 중쇄에 의해 형성된 4개의 펩티드 사슬 구조이다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 상이한 아미노산 조성 및 배열을 나타내며, 따라서 상이한 항원성을 제시한다. 따라서, 면역글로불린은 5개 유형으로 나눌 수 있거나, 또는 면역글로불린 이소형, 즉, IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 명명될 수 있고, 상응하는 중쇄는 각각 μ, δ, γ, α 및 ε이다. 힌지 영역의 아미노산 조성과 중쇄 이황화 결합의 수와 위치에 따라 동일한 유형의 Ig를 상이한 하위 유형으로 더 나눌 수 있다. 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나눌 수 있다. 경쇄는 상이한 불변 영역을 기초로 하여 κ 또는 λ 쇄로 나눌 수 있다. Ig의 5개 유형 각각은 카파 쇄 또는 람다 쇄를 가질 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 인접한 약 110개의 아미노산 서열은 매우 가변적이며, 가변 영역(Fv 영역)으로 알려져 있고; C 말단 근처의 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정적이고, 불변 영역으로 알려져 있다. 가변 영역은 3개의 과가변 영역(HVR) 및 상대적으로 보존된 서열의 4개의 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 항체의 특이성을 결정하는 세 개의 과가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로도 알려져 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(VL) 및 각각의 중쇄 가변 영역(VH)은 세 개의 CDR 영역 및 네 개의 FR 영역으로 구성되며, 순차적 순서는 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 다음의 순서이다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 경쇄의 세 개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고, 중쇄의 세 개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다.
본 개시 내용의 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 및 인간화 항체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "뮤린 항체"는 당해 분야의 지식 및 기술에 따라 제조되는 항-인간 클라우딘18.2 단클론 항체를 지칭한다. 제조하는 동안, 테스트 대상체에 클라우딘18.2 또는 이의 에피토프를 항원으로서 주사를 놓은 다음, 원하는 서열 또는 기능적 특징을 보유하는 항체를 발현하는 하이브리도마를 단리한다. 본 개시 내용의 바람직한 구현예에서, 뮤린 클라우딘18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 뮤린 κ, λ 쇄 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 더 포함하거나, 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 더 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 뮤린 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 함께 융합하여 얻어지는 항체이며, 이러한 항체는 뮤린 항체 유도성 면역 반응을 완화할 수 있다. 키메라 항체를 확립하기 위하여, 먼저, 특정 뮤린 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 확립하고, 가변 영역 유전자를 뮤린 하이브리도마로부터 클로닝한다. 그 후, 필요에 따라 인간 항체로부터 불변 영역 유전자를 클로닝한다. 뮤린 가변 영역 유전자를 인간 불변 영역 유전자에 연결시켜, 이후에 인간 벡터에 삽입될 수 있는 키메라 유전자를 형성한다. 최종적으로 키메라 항체 분자를 진핵생물 또는 원핵생물 시스템에서 발현시킨다. 본 개시 내용의 바람직한 구현예에서, 키메라 항체의 항체 경쇄는 인간 카파, 람다 쇄 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 더 포함한다. 클라우딘18.2 키메라 항체의 항체 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역을 포함하거나, 아미노산 돌연변이(들)(예컨대 L234A 및/또는 L235A 돌연변이, 및/또는 S228P 돌연변이)가 있는 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
CDR 이식 항체로도 알려져 있는 용어 "인간화 항체"는 인간 항체 가변 영역 프레임워크 내로 비 인간 CDR 서열을 이식하여 생성된 항체, 즉, 상이한 유형의 인간 생식선 항체 프레임워크 서열에서 생성된 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 다수의 이종 단백질 성분을 보유하는 키메라 항체에 의해 유도되는 이종 유래의 반응을 피할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열은 생식선 항체 유전자 서열을 아우르는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식선 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식선 서열 데이터베이스(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase에서 이용 가능함)에서 찾을 수 있고, 문헌[Kabat, EA, et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.]에서도 찾을 수 있다. 감소된 면역원성에 의해 초래된 활성의 감소를 피하기 위하여, 인간 항체 가변 영역의 프레임워크 서열은 활성을 유지하기 위한 최소한의 역돌연변이 또는 역 돌연변이를 거칠 수 있다. 또한, 본 개시 내용의 인간화 항체는 CDR 친화도 성숙이 효모 디스플레이에 의해 수행되는 인간화 항체를 지칭한다.
본 개시 내용의 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 뮤린 κ, λ 쇄로부터 유래한 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함하거나, 인간 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로부터 유래한 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함하며; 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래한 중쇄 불변 영역, 또는 아미노산 돌연변이(들)(예컨대, L234A 및/또는 L235A 돌연변이, 및/또는 S228P 돌연변이)가 있는 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 변이체를 포함한다.
본원에서 기술되는 바와 같이, 인간 항체의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역의 "변이체"는 항체 가변 영역의 구조 및 기능이 변경되지 않은 선행 기술에 개시된 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 변이체를 지칭한다. 예시적인 변이체는 중쇄 불변 영역의 부위 지정 유전자 조작 및 아미노산 치환에 의해 수득한 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역 변이체를 포함한다. 구체적인 치환은 예를 들어, YTE 돌연변이, L234A 및/또는 L235A 돌연변이, S228P 돌연변이, 및/또는 (항체 중쇄가 노브-Fc 및 홀-Fc의 조합을 갖게 하는) 노브 인투 홀(knob-into-hole) 구조를 초래하는 돌연변이이다. 이들 돌연변이는 항체 가변 영역의 기능을 변화시키지 않고 항체에 새로운 특성을 부여하는 것으로 밝혀졌다.
"인간 항체(HuMAb)", "인간으로부터 유래한 항체", "전체 인간 항체(fully human antibody)" 및 "완전 인간 항체(completely human antibody)"는 상호교환적으로 사용되고, 인간으로부터 유래한 항체 또는 항원 자극에 반응하여 특이적인 인간 항체를 생산하도록 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 "조작된(engineered)" 유전자 변형 유기체로부터 수득한 항체일 수 있다. 일부 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소가, 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌(endogenous heavy and light chain loci)가 파괴를 위해 표적화된 배아 줄기 세포주로부터 유래한 세포 계통으로 도입된다. 유전자이식 유기체(Transgenic organism)는 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 유기체는 인간 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하는 데 이용될 수 있다. 또한, 인간 항체는 중쇄 및 경쇄가 1개 이상의 인간 DNA 기원으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화(encoded)된다. 또한, 완전 인간 항체는 유전자 또는 염색체 형질주입 방법 및 파지 디스플레이 기술에 의해 구축될 수 있거나, 또는 시험관 내에서 활성화된 B 세포로부터 구축될 수 있는데, 이들 모두는 당해 분야에 공지되어 있다.
용어 "전장 항체(full-length antibody)", "전체 항체(full antibody)", "전 항체(whole antibody)" 및 "완전 항체(complete antibody)"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 아래에 정의된 항원 결합 단편과 구별되는 바와 같이, 실질적으로 완전한 형태의 항체를 지칭한다. 용어는 구체적으로 경쇄 및 중쇄의 불변 영역을 함유하는 항체를 지칭한다. 본 개시 내용의 "항체"는 "전장 항체" 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 전장 항체는 아래 표의 경쇄 및 중쇄 조합에 제시된 바와 같이, 경쇄 가변 영역을 경쇄 불변 영역과 연결하고, 중쇄 가변 영역을 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 포함한다. 당업자는 실제적인 필요에 따라 다양한 항체 기원으로부터 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 항체 유래의 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역을 선택할 수 있다.
용어 "항원 결합 단편" 또는 "기능적 단편"은 항원(예를 들어, 클라우딘18.2)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 전장 항체의 단편을 사용하여 항원 결합 기능을 달성할 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역의 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편에 의해 형성된 2가 단편인 F(ab')2 단편, (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 한 암(arm)의 VH 및 VL 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) 쇄간 이황화 결합을 통해 VH 및 VL에 의해 형성된 항원 결합 단편인 dsFv; 및 (vi) scFv, dsFv, 및 Fab와 같은 단편을 함유하는 디아바디(diabody), 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체를 포함한다. 또한, Fv 단편의 VL 도메인과 VH 도메인은 합성 링커에 의해 연결되어 VL과 VH 도메인을 짝지어 형성된 1가 분자인 단일 단백질 쇄를 생성한다(단쇄 Fv(single chain Fv, scFv)로 지칭됨; 예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242: 423-426]; 및 문헌[Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA85:5879-5883] 참고). 또한, 이러한 단쇄 항체는 항체의 "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"의 용어에 포함된다. 이러한 항체 단편은 당해 분야에 공지된 종래의 기법을 이용하여 수득되고, 온전한 항체에 대한 것과 동일한 방법을 사용하여 기능적 단편이 스크리닝된다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 파괴에 의해 생산할 수 있다. 항체는 상이한 이소형, 예를 들어, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체의 형태일 수 있다.
Fab는 IgG 항체 분자를 파파인과 동일한 활성을 갖는 효소로 처리하여 수득한 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
F(ab')2는 IgG를 펩신과 동일한 활성을 갖는 효소로 소화시켜 수득한 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
Fab'은 전술한 F(ab')2를 절단하여 수득한 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
또한, Fab'은 Fab' 단편을 암호화하는 DNA를 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주에 도입하여 생산할 수 있다.
용어 "단쇄 항체", "단쇄 Fv" 또는 "scFv"는 링커에 의해 항체 경쇄 가변 도메인(또는 영역; VL)에 연결된 항체 중쇄 가변 도메인(또는 영역; VH)을 포함하는 분자를 지칭한다. 이러한 scFv 분자는 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH의 일반 구조를 갖는다. 본 개시 내용에서 사용할 수 있는 기타 링커는 다음의 문헌, 예컨대, 문헌[Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]; 문헌[Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731]; 문헌[Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106]; 문헌[Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061]; 문헌[Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56] 및 문헌[Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.](그러나 이에 한정되지 않음)에 기술되어 있다.
디아바디는 scFv 또는 Fab가 이량체화된 항체 단편이고, 2가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가의 항원 결합 활성에서, 2개의 항원은 동일하거나 상이할 수 있다.
이중특이적 및 다중특이적 항체는 2개 이상의 항원 또는 항원 결정기에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
dsFv는 각각의 VH 및 VL의 하나의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 다음, 치환된 폴리펩티드를 2개의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 통해 연결하여 수득된다. 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산 잔기는 공지된 방법에 따라 항체의 3차원 구조 예측을 기반으로 선택될 수 있다(예를 들어, 문헌[Protein Engineering, 7, 697 (1994)]).
용어 "아미노산 차이" 또는 "아미노산 돌연변이"는 본래의 단백질 또는 폴리펩티드와 비교하여, 본래의 단백질 또는 폴리펩티드를 기준으로 1, 2, 3개 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드 변이체의 아미노산 변화 또는 돌연변이를 지칭한다.
용어 "항체 프레임워크" 또는 "FR 영역"은 VL 또는 VL의 가변 도메인의 일부분을 지칭하며, 이 가변 도메인의 항원 결합 루프(CDR)에 대한 스캐폴드로서 작용한다. 본질적으로, 이는 CDR이 없는 가변 도메인이다.
용어 "상보성 결정 영역(complementarity determining region)", "CDR" 또는 "과가변 영역(hypervariable region)"은 주로 항원 결합에 기여하는 항체 가변 도메인에 존재하는 여섯 개의 과가변 영역 중 하나를 지칭한다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2, HCDR3)과 각각의 경쇄 가변 영역의 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 있다. CDR의 아미노산 서열 경계는 "Kabat" 넘버링 기준(문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)] 참고), "Chothia" 넘버링 기준(문헌[Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273:927-948] 참고) 및 ImmunoGenTics(IMGT) 넘버링 기준(문헌[Lefranc MP, Immunologist, 7, 132-136 (1999)]; 문헌[Lefranc, MP, etc., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]) 등을 포함한, 다양한 잘 알려진 체계 중 임의의 것에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 전통적인 형식의 경우, Kabat 기준에 따르면, 중쇄 가변 도메인(VH)의 CDR 아미노산 잔기는 31~35(HCDR1), 50~65(HCDR2) 및 95~102(HCDR3)로 넘버링되고, 경쇄 가변 도메인(VL)의 아미노산 잔기는 24~34(LCDR1), 50~56(LCDR2), 및 89~97(LCDR3)로 넘버링된다. Chothia 기준에 따르면, VH의CDR 아미노산 잔기는 26~32(HCDR1), 52~56(HCDR2) 및 95~102(HCDR3)로 넘버링되고, VL의 아미노산 잔기는 26~32(LCDR1), 50~52(LCDR2) 및 91~96(LCDR3)으로 넘버링된다. Kabat 및 Chothia를 모두 조합하여 CDR을 정의하면, CDR은 인간 VH의 아미노산 잔기 26~35(HCDR1), 50~65(HCDR2) 및 95~102(HCDR3), 및 인간 VL의 아미노산 잔기 24~34(LCDR1), 50~56(LCDR2) 및 89~97(LCDR3)로 구성된다. IMGT 기준에 따르면, VH의CDR 아미노산 잔기는 대략 26~35(CDR1), 51~57(CDR2) 및 93~102(CDR3)로 넘버링되고, VL의 CDR 아미노산 잔기는 대략 27~32(CDR1), 50~52(CDR2) 및 89~97(CDR3)로 넘버링된다. IMGT 기준에 따르면, 항체의 CDR 영역은 IMGT/DomainGap 정렬 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다.
용어 "에피토프(epitope)" 또는 "항원 결정기(antigenic determinant)"는 면역글로불린 또는 항체가 결합하는 항원의 부위(예를 들어, Claudin18.2 분자의 특이적 부위)를 지칭한다. 에피토프는 전형적으로 고유한 3차 형태 내에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 인접(contiguous) 또는 비 인접(non-contiguous) 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996)] 참고.
용어 "특이적으로 결합하다", "선택적으로 결합하다", "선택적 결합" 또는 "특이적 결합"은 항원 상의 소정의 에피토프에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 약 10-8M 미만, 예를 들어, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 미만 또는 훨씬 더 낮은 값의 친화도(KD)로 결합한다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호 작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. 일반적으로, 본 개시 내용의 항체는 약 10-7 M 미만, 예를 들어, 약 10-8 M 또는 10 -9 M 미만의 해리 평형 상수(KD)로 클라우딘 18.2 또는 이의 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 본 개시 내용의 항체의 세포 표면 항원에 대한 친화도는 FACS 방법으로 KD 값을 측정함으로써 결정하였다.
용어 "경쟁(competition)"이 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질의 맥락에서 사용될 때, 이는 경쟁이 항원 결합 단백질 사이에서 일어남을 의미하며, 이는 분석법에 의해 결정되는데, 이때, 테스트되는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 기능적 단편)이 공통 항원(예를 들어, 클라우딘18.2 항원 또는 이의 단편)에 대한 기준 항원 결합 단백질(예를 들어, 리간드 또는 기준 항체)의 특이적 결합을 방지하거나 억제한다(예를 들어, 감소시킨다). 항원 결합 단백질이 또 다른 단백질과 경쟁하는지를 결정하기 위하여 다양한 유형의 경쟁적 결합 분석을 사용할 수 있다. 이러한 분석은 예를 들어, 고체상 직접 또는 간접 방사성면역분석(solid phase direct or indirect radioimmunoassay, RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소면역분석(solid phase direct or indirect enzyme immunoassay, EIA), 샌드위치 경쟁 분석(예를 들어, 문헌[Stahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253] 참고); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Kirkland et al, 1986, J. Immunol. 137: 3614-3619] 참고), 고체상 직접 라벨링 분석, 고체상 직접 라벨링 샌드위치 분석(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참고); I-125 라벨을 이용한 고체상 직접 라벨링 RIA(예를 들어, 문헌[Morel et al, 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15] 참고); 고체상 직접 비오틴-아비딘(예를 들어, 문헌[Cheung, et al, 1990, Virology 176: 546-552] 참고); 및 직접 라벨링 RIA(문헌[Moldenhauer et al, 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82])이다. 전형적으로, 분석은 라벨링되지 않은 테스트 항원 결합 단백질 및 라벨링된 기준 항원 결합 단백질 둘 다가 로딩되는 고체 표면 또는 세포에 결합할 수 있는 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 테스트 항원 결합 단백질의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 라벨의 양을 측정하여 결정한다. 일반적으로, 테스트 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. (항원 결합 단백질과 경쟁하는) 경쟁 분석에 의해 확인된 항원 결합 단백질은 다음을 포함한다: 기준 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프와 결합하는 항원 결합 단백질; 및 기준 항원 결합 단백질이 결합하는 에피토프에 충분히 가까운 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질. 여기서 2개의 에피토프는 서로 공간적으로 간섭하여 결합을 방해한다. 경쟁적 결합을 결정하는 방법에 관한 추가의 상세 내용은 본원의 실시예에 제공된다. 전형적으로, 경쟁하는 항원 결합 단백질이 과량으로 존재하는 경우, 이는 공통 항원에 대한 기준 항원 결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 40~45%, 45~50%, 50~55%, 55~60%, 60~65%, 65~70%, 70~75% 또는 75%, 또는 훨씬 더 많이 억제할 것이다(예를 들어, 감소시킬 것이다). 일부 예에서, 결합은 적어도 80~85%, 85~90%, 90~95%, 95~97%, 또는 97% 또는 훨씬 더 많이 억제된다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 또는 RNA 분자를 지칭한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 또는 단일 가닥 mRNA 또는 변형된 mRNA이다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동 가능하게 연결된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다.
아미노산 서열 "동일성"은 아미노산 서열들이 정렬(필요한 경우 갭을 도입)되어 최대 백분율의 서열 동일성을 달성할 경우, 제1 및 제2 서열 사이에 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 지칭하며, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 부분으로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성의 백분율을 결정하기 위하여, 정렬은 당해 기술 범위 내에서 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 결정할 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, 벡터는 "플라스미드"이고, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 연결될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 이때, 추가의 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 연결될 수 있다. 본원에 개시된 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있거나(예를 들어, 박테리아 복제 기원이 있는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터), 또는 숙주 세포로 도입 시 숙주 세포의 게놈으로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다(예를 들어, 비 에피솜 포유동물 벡터).
항체 및 항원 결합 단편의 제조 및 정제 방법은 당해 분야, 예를 들어, 문헌[Antibodies: a Laboratory Manual,, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15]에 주지되어 있다. 예를 들어, 마우스를 인간 클라우딘18.2 또는 이의 단편으로 면역화할 수 있고, 그 후, 생성된 항체를 재생시키고, 정제하고, 당해 분야에 주지된 종래의 방법을 이용하여 아미노산 서열에 대해 시퀀싱할 수 있다. 또한, 항원 결합 단편은 종래의 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 개시 내용의 항체 또는 항원 결합 단편을 조작하여 하나 이상의 인간 프레임워크 영역을 비 인간 항체로부터 유래한 CDR 영역에 도입한다. 인간 FR 생식선 서열은 MOE 소프트웨어를 이용하여 ImMunoGeneTics(IMGT) 인간 항체 가변 생식선 유전자 데이터베이스에 대해 정렬시켜, 웹사이트 http://imgt.cines.fr를 통해 IMGT로부터, 또는 문헌[The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351]으로부터 얻을 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 박테리아, 미생물, 식물 또는 동물 세포를 포함할 수 있다. 형질전환되기 쉬운 박테리아는 장내세균과, 예를 들어, 에쉐리키아 콜라이 또는 살모넬라 균주; 간균과, 예를 들어, 바실루스 서브틸리스; 폐렴구균; 연쇄구균 및 헤모필루스 인플루엔자의 구성원을 포함한다. 적합한 미생물은 사카로마이세스 세레비지애 및 피키아 파스토리스를 포함한다. 적합한 동물 숙주 세포주는 CHO(중국 햄스터 난소 세포주), 293 세포 및 NS0 세포를 포함한다.
본 개시 내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 종래의 방법에 의해 제조 및 정제할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열을 클로닝하고 발현 벡터로 재조합할 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 숙주 세포 내로 안정적으로 형질주입될 수 있다. 더욱 권고되는 선행 기술로서, 포유류 발현 시스템은 특히 Fc 영역의 고도로 보존된 N 말단 부위에, 항체의 당화를 초래할 수 있다. 인간 클라우딘 18.2에 특이적으로 결합하는 항체를 발현시켜 안정적인 클론을 수득하였다. 양성 클론은 항체 생산을 위한 생물반응기에서 확장시킬 수 있다. 항체가 분비된 배양 배지는 종래의 기술에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 완충액으로 조정한 단백질 A 또는 G 세파로스 FF 컬럼에서 정제를 수행할 수 있다. 비 특이적인 결합 성분은 세척하여 제거된다. 결합된 항체를 pH 구배에 의해 용리시키고, 항체 단편을 SDS-PAGE로 검출한 다음, 모은다. 일반적인 기법을 이용하여 항체를 여과하고 농축시킬 수 있다. 일반적인 기법, 예컨대, 크기 배제 또는 이온 교환에 의해 가용성 혼합물 및 다량체를 효과적으로 제거할 수 있다. 그 후, 그에 따른 생성물은 즉시 예를 들어 -70℃에서 냉동되거나, 동결건조될 수 있다.
"투여", "투약" 또는 "치료"는, 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용되는 바와 같이, 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체와 외인성 약제, 치료제, 진단제, 또는 조성물을 접촉시키는 것을 지칭한다. "투여", "투약" 또는 "치료"는 예컨대, 치료적, 약물동역학적, 진단적, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 처리는 시약을 세포와 접촉시키는 것뿐만 아니라 시약을 유체와 접촉시키는 것을 포함하며, 유체는 결국 세포와 접촉되어 있다. "투여", "투약" 또는 "치료"는 또한 시약, 진단제, 결합 화합물, 또는 다른 세포를 사용한, 예를 들어, 세포의, 시험관 내 또는 생체 외 처리를 의미한다. 인간, 수의학 또는 연구 대상에 적용되는 "치료"는 치료적 처치, 예방적 또는 방지적 조치, 연구 및 진단적 적용을 지칭한다.
"치료하다"는 치료제, 예컨대, 본 개시 내용의 임의의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을, 치료제가 공지된 치료적 활성을 갖는 1종 이상의 질환 증상을 나타내는 환자에게 체내로 또는 체외로 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 작용제는 치료되는 환자 또는 집단에서 1종 이상의 질환 증상을 완화하거나, 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도로 이러한 증상(들)의 퇴행을 유도하거나 진행을 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다. ("치료적 유효량"으로도 지칭되는) 임의의 특정 질환 증상을 완화시키기에 효과적인 치료제의 양은 다양한 인자, 예컨대, 환자의 질환 상태, 연령, 및 체중, 그리고 약물이 환자에서 원하는 반응을 유도하는 능력에 따라 다를 수 있다. 질환 증상이 완화되었는지는 의료진 또는 다른 숙련된 보건의료 제공자가 전형적으로 사용하는 임의의 임상적 측정에 의해 평가하여 그 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가할 수 있다. 본 개시 내용의 구현예(예를 들어, 치료 방법 또는 제조품)는 모든 환자에서 표적 질환 증상(들)을 완화시키는 데 효과적이지 않을 수 있지만, 당해 분야에 공지된 임의의 통계학적 검정, 예컨대, 스튜던트 t 검정, 카이 제곱 검정, 만-휘트니(Mann and Whitney)에 따른 U 검정, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정(H 검정), 존키어-테르프스트라(Jonckheere-Terpstra) 검정 및 윌콕슨(Wilcoxon) 검정에 의해 결정할 때 통계적으로 유의한 수의 환자에서 표적 질환 증상(들)을 완화한다.
"보존적 변형" 또는 "보존적 치환 또는 대체"는 비슷한 특징(예컨대, 전하, 곁사슬 크기, 소수성/친수성, 백본 구조 및 경직도 등)을 갖는 다른 아미노산으로 단백질의 아미노산을 치환하는 것을 지칭하며, 그 결과 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않고 변경이 빈번하게 일어날 수 있다. 당업자는 일반적으로 폴리펩티드의 비 필수 영역의 단일 아미노산 치환이 실질적으로 생물학적 활성을 바꾸지 않음을 이해한다(예를 들어, 문헌[Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224, 4th edition] 참고). 또한, 구조적으로나 기능적으로 유사한 아미노산으로의 치환은 생물학적 활성을 파괴할 가능성이 낮다. 예시적인 보존적 치환은 아래 표, "예시적인 아미노산의 보존적 치환"에 기술되어 있다.
예시적인 아미노산의 보존적 치환
본래 잔기 보존적 치환
Ala (A) Gly; Ser
Arg(R) Lys; His
Asn (N) Gln; His; Asp
Asp (D) Glu; Asn
Cys (C) Ser; Ala; Val
Gln(Q) Asn; Glu
Glu (E) Asp; Gln
Gly (G) Ala
His (H) Asn; Gln
Ile (I) Leu; Val
Leu (L) Ile; Val
Lys (K) Arg; His
Met (M) Leu; Ile; Tyr
Phe (F) Tyr; Met; Leu
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp (W) Tyr; Phe
Tyr (Y) Trp; Phe
Val (V) Ile; Leu
"유효량(Effective amount)" 또는 "유효 용량(effective dose)"은 임의의 하나 이상의 유익하거나 원하는 결과를 얻는 데 필요한 의약, 화합물, 또는 약학적 조성물의 양을 지칭한다. 예방적 적용의 경우, 유익하거나 원하는 결과에는 병태가 발달하는 동안, 병태의 생화학적, 조직학적 및 행동 징후, 이의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하여, 위험의 제거 또는 감소, 중증도의 감소, 또는 질환 발병의 지연이 포함된다. 치료적 적용의 경우, 유익하거나 원하는 결과에는 임상 결과, 예를 들어, 본 개시 내용의 표적 항원과 관련된 다양한 병태의 발병률 감소 또는 병태의 1종 이상의 증상의 개선, 병태를 치료하는 데 필요한 다른 작용제의 투여량 감소, 또 다른 작용제의 효능 증진, 및/또는 환자에서 본 개시 내용의 표적 항원과 관련된 병태의 진행의 지연이 포함된다.
"외인성(Exogenous)"은 상황에 따라 유기체, 세포, 또는 인간 외부에서 생성되는 물질을 지칭한다.
"내인성(Endogenous)"은 상황에 따라 세포, 유기체, 또는 인체에서 생성되는 물질을 지칭한다.
"동일성"은 두 폴리뉴클레오티드 서열 사이 또는 두 폴리펩티드 서열 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 비교되는 두 서열에서의 한 위치를 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛이 차지할 경우, 예를 들어, 두 개의 DNA 분자 각각의 한 위치를 아데닌이 차지할 경우, 이 분자들은 해당 위치에서 상동성(homologous)이다. 두 서열 사이의 동일성 백분율은 두 서열에 의해 공유되는 일치하거나 상동인 위치의 수를 비교되는 위치의 수로 나눈 다음, 100을 곱한 값의 함수이다. 예를 들어, 두 개의 서열이 최적으로 정렬된 경우, 두 서열의 10개의 위치 중 6개가 일치하거나 상동인 경우, 두 서열은 60% 상동이다. 두 서열의 100개의 위치 중 95개가 일치하거나 상동인 경우, 두 서열은 95% 상동이다. 일반적으로, 두 서열이 정렬될 때, 최대 동일성 백분율을 제공하도록 비교가 이루어진다. 예를 들어, 비교는 BLAST 알고리즘에 의해 수행될 수 있으며, 이때, 알고리즘의 파라미터는 각 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각 서열 간의 최대 일치를 제공하도록 선택된다. 다음의 참고문헌은 서열 분석에 자주 사용되는 BLAST 알고리즘을 언급한다: BLAST 알고리즘(BLAST ALGORITHMS): Altschul, SF et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, TL et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, SF et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. et al. (1997) Genome Res. 7:649-656. NCBI BLAST로부터 이용 가능한 것과 같은 다른 종래의 BLAST 알고리즘 또한 당업자에게 주지되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 모든 이러한 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 1차 대상 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 계대 수와 상관 없이 포함한다. 또한, 모든 자손은 의도적인 또는 의도적이지 않은 돌연변이로 인해 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 이해하여야 한다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것들과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손 또한 포함된다. 별개의 명칭이 의도되는 경우, 문맥으로부터 명백히 이해될 것이다.
"단리된"은 분자에 다른 생물학적 분자, 예컨대, 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 기타 물질, 예컨대, 세포 잔해 및 성장 배지가 실질적으로 없음을 지칭한다. 일반적으로, 용어 "단리된"은, 이들이 본원에 기술된 화합물의 실험적 또는 치료적 용도를 유의미하게 방해하는 양으로 존재하지 않는 한, 이러한 물질의 완전한 부재 또는 물, 완충제 또는 염의 부재를 의미하고자 한 것이 아니다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는 뒤따르는 사건 또는 상황이 일어날 수 있지만 반드시 일어나지는 않음을 의미하며, 설명은 사건 또는 상황이 일어나는 경우와 일어나지 않는 경우를 포함한다.
"약학적 조성물"은 본 개시 내용에 따른 하나 이상의 화합물 또는 생리적으로/제약상 허용 가능한 염 또는 이의 전구약물 및 기타 화학적 성분, 예컨대, 생리적으로/제약상 허용 가능한 담체 및 부형제를 포함하는 혼합물을 지칭한다. 약학적 조성물은 유기체에 대한 투여를 촉진하고, 활성 성분의 흡수를 용이하게 하여, 생물학적 활성을 발휘하는 것을 목적으로 한다.
용어 "제약상 허용 가능한 담체"는 항체 또는 항원 결합 단편의 전달을 위한 제형에 사용하기에 적합한 임의의 불활성 물질을 지칭한다. 담체는 부착방지제, 결합제, 코팅제, 붕해제, 충전제 또는 희석제, 보존제(예컨대, 항산화제, 항균제 또는 항진균제), 감미제, 흡수지연제, 습윤제, 유화제, 완충제 등일 수 있다. 적합한 제약상 허용 가능한 담체의 예에는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 덱스트로스, 식물유(예컨대, 올리브유), 식염수, 완충제, 완충 식염수, 및 등장화제, 예컨대, 당, 폴리올, 소르비톨 및 염화나트륨이 포함된다.
또한, 본 개시 내용은 표적 항원(예컨대, 클라우딘18.2) 양성 세포와 관련된 질환을 치료하기 위한 작용제를 포함하며, 작용제는 본 개시 내용의 항-클라우딘18.2항체 또는 이의 항체 결합 단편을 활성 성분으로 포함한다.
본 개시 내용의 클라우딘 18.2 관련 질환은 클라우딘 18.2와 관련이 있는 한 특별한 제한이 없다. 예를 들어, 본 개시 내용의 분자에 의해 유도되는 치료 반응은 (1) 본 개시 내용의 분자가 인간 클라우딘 18.2에 결합하는 것을 통해 클라우딘 18.2가 이의 수용체/리간드에 결합하는 것을 방지하는 것, 또는 (2) 클라우딘 18.2를 과발현하는 종양 세포를 살상하는 것을 포함한다. 따라서, 본 개시 내용의 분자는, 치료적 적용에 적합한 제제 및 제형에 포함될 경우, 종양 또는 암, 바람직하게는 흑색종, 결장암, 유방암, 폐암, 위암, 장암, 신장암, 비 소세포 폐암, 방광암 등을 앓는 사람에게 매우 유용하다.
또한, 본 개시 내용은 표적 항원(예를 들어, 클라우딘18.2)의 면역검출 또는 결정 방법, 표적 항원(예를 들어, 클라우딘18.2)의 면역검출 또는 결정 시약, 표적 항원(예를 들어, 클라우딘18.2)을 발현하는 세포의 면역검출 또는 결정 방법 및 활성 성분으로서 표적 항원(예를 들어, 인간 클라우딘18.2)을 특이적으로 인식하고 세포 외 아미노산 서열 또는 이의 3차 구조에 결합하는 본 개시 내용의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 표적 항원(예를 들어, 클라우딘18.2) 양성 세포와 관련된 질환의 진단을 위한 진단제에 관한 것이다.
본 개시 내용에서, 표적 항원(예를 들어, 클라우딘18.2)의 양을 검출 또는 측정하는 방법은 임의의 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 이는 면역분석법 또는 면역검출 방법을 포함한다.
면역분석법 또는 면역검출 방법은 항체 또는 항원의 양을 라벨링된 항원 또는 항체로 검출하거나 측정하는 방법이다. 면역분석법 또는 면역검출 방법의 예는 방사능 물질 라벨링된 면역항체 방법(RIA), 효소면역분석(EIA 또는 ELISA), 형광면역분석(FIA), 발광면역분석, 웨스턴 블롯팅, 물리화학적 방법 등을 포함한다.
전술한 클라우딘18.2 양성 세포와 관련된 질환은 본 개시 내용의 항체 또는 항체 단편을 이용하여 클라우딘18.2를 발현하는 세포를 검출하거나 측정함으로써 진단할 수 있다.
폴리펩티드를 발현하는 세포는 공지된 면역검출 방법에 의해, 바람직하게는 면역침전, 형광 세포 염색, 면역조직 염색 등에 의해 검출할 수 있다. 또한, FMAT8100HTS 시스템(Applied Biosystem)을 이용한 형광 항체 염색 방법과 같은 방법을 이용할 수 있다.
본 개시 내용에서, 표적 항원(예를 들어, 클라우딘18.2)에 대해 검출되거나 측정되는 샘플은, 그것들이 표적 항원(예를 들어, 클라우딘18.2)을 발현하는 세포를 포함할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 췌액, 소변, 대변, 조직액 또는 배양 배지이다.
요구되는 진단 방법에 따라, 본 개시 내용의 단클론 항체 또는 항체 단편을 포함하는 진단제는 또한 항원-항체 반응을 수행하기 위한 시약 또는 반응을 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 항원-항체 반응을 수행하기 위한 시약은 완충제, 염 등을 포함한다. 검출을 위한 시약은 면역분석법 또는 면역검출 방법에서 일반적으로 사용되는 시약, 예를 들어 단클론 항체, 이의 항체 단편 또는 접합체를 인식하는 라벨링된 2차 항체 및 라벨에 상응하는 기질을 포함한다.
본 개시 내용의 하나 이상의 구현예의 세부 사항은 위의 명세서에 기재되어 있다. 바람직한 방법 및 물질을 아래에 설명하였지만, 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 물질이 본 개시 내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 명세서 및 청구범위를 통해, 본 개시 내용의 다른 특징, 목적 및 장점이 명백해질 것이다. 명세서 및 청구범위에서, 단수형은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 측면을 포함한다. 본원에서 명시적으로 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 명세서에 인용된 모든 특허 및 간행물은 참조로 포함된다. 다음의 실시예는 본 개시 내용의 바람직한 구현예를 더욱 완전히 예시하기 위해 제시된다. 이러한 예는 어떠한 방식으로든 본 개시 내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 본 개시 내용의 범위는 청구범위에 의해 정의된다.
실시예
실시예 1: 클라우딘 18.2를 고 발현하는 세포주의 구축
리포펙타민 3000 형질주입 시약을 사용하여 pCDH-hClaudin18.2 렌티바이러스 발현 벡터 플라스미드 및 pVSV-G, pCMV-dR8.91 렌티바이러스 시스템 패키징 벡터를 바이러스 패키징 세포 293T로 형질주입(transfection)시켰다. 바이러스를 함유하는 배양 배지의 상청액을 수집하고, 여과하고 초고속(ultra-high-speed)으로 원심분리하였다. 농축된 바이러스를 사용하여 인간 위 인환세포 암종 세포주 NUGC4(human gastric signet ring cell carcinoma cell line NUGC4)를 감염시키고, 2 내지 3주 동안 퓨로마이신으로 스크리닝한 후, FACS 단일 세포 분류법으로 분류하였다.
클라우딘 18.2의 발현 수준을 종양 IHC 점수에 따라 결정하였다. IHC 점수가 3인 종양과 동등한 클라우딘 18.2의 발현 수준을 갖는 세포는 고 발현 세포로 간주하고, IHC 점수가 2인 종양과 동등한 클라우딘 18.2의 발현 수준을 갖는 세포는 중 발현 세포로 간주한다. 렌티바이러스에 감염된 NUGC4 세포 표면에서의 클라우딘18.2 발현을 FACS 검출로 검출하고, 클라우딘18.2 발현이 가장 높은 NUGC4/hClaudin18.2 단클론 세포주를 선택하였다. 동시에 야생형 NUGC4 세포 표면에서의 클라우딘 18.2 발현을 FACS로 검출하였고, 중 발현의 클라우딘 18.2의 NUGC4 클론 세포주를 선택하였다. 야생형 NUGC4는 저 발현의 클라우딘 18.2를 나타내는 세포였다.
선택된 단클론 세포주를 확장 및 배양하고, 후속 분석을 위하여 냉동 및 보관하였다.
클라우딘 18.2 서열 Genbank: NP_001002026: (서열번호 1)
MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV.
클라우딘 18.2 DNA 서열: (서열번호 2)
1 AGAATTGCGC TGTCCACTTG TCGTGTGGCT CTGTGTCGAC ACTGTGCGCC ACCATGGCCG
61 TGACTGCCTG TCAGGGCTTG GGGTTCGTGG TTTCACTGAT TGGGATTGCG GGCATCATTG
121 CTGCCACCTG CATGGACCAG TGGAGCACCC AAGACTTGTA CAACAACCCC GTAACAGCTG
181 TTTTCAACTA CCAGGGGCTG TGGCGCTCCT GTGTCCGAGA GAGCTCTGGC TTCACCGAGT
241 GCCGGGGCTA CTTCACCCTG CTGGGGCTGC CAGCCATGCT GCAGGCAGTG CGAGCCCTGA
301 TGATCGTAGG CATCGTCCTG GGTGCCATTG GCCTCCTGGT ATCCATCTTT GCCCTGAAAT
361 GCATCCGCAT TGGCAGCATG GAGGACTCTG CCAAAGCCAA CATGACACTG ACCTCCGGGA
421 TCATGTTCAT TGTCTCAGGT CTTTGTGCAA TTGCTGGAGT GTCTGTGTTT GCCAACATGC
481 TGGTGACTAA CTTCTGGATG TCCACAGCTA ACATGTACAC CGGCATGGGT GGGATGGTGC
541 AGACTGTTCA GACCAGGTAC ACATTTGGTG CGGCTCTGTT CGTGGGCTGG GTCGCTGGAG
601 GCCTCACACT AATTGGGGGT GTGATGATGT GCATCGCCTG CCGGGGCCTG GCACCAGAAG
661 AAACCAACTA CAAAGCCGTT TCTTATCATG CCTCAGGCCA CAGTGTTGCC TACAAGCCTG
721 GAGGCTTCAA GGCCAGCACT GGCTTTGGGT CCAACACCAA AAACAAGAAG ATATACGATG
781 GAGGTGCCCG CACAGAGGAC GAGGTACAAT CTTATCCTTC CAAGCACGAC TATGTGTAAT
841 GCTCTAAGAC CTCTCAGCAC GGGCGGAAGA AACTCCCGGA GAGCTCACCC AAAAAACAAG
901 GAGATCCCAT CTAGATTTCT TCTTGCTTTT GACTCACAGC TGGAAGTTAG AAAAGCCTCG
961 ATTTCATCTT TGGAGAGGCC AAATGGTCTT AGCCTCAGTC TCTGTCTCTA AATATTCCAC
1021 CATAAAACAG CTGAGTTATT TATGAATTAG AGGCTATAGC TCACATTTTC AATCCTCTAT
1081 TTCTTTTTTT AAATATAACT TTCTACTCTG ATGAGAGAAT GTGGTTTTAA TCTCTCTCTC
1141 ACATTTTGAT GATTTAGACA GACTCCCCCT CTTCCTCCTA GTCAATAAAC CCATTGATGA
1201 TCTATTTCCC AGCTTATCCC CAAGAAAACT TTTGAAAGGA AAGAGTAGAC CCAAAGATGT
1261 TATTTTCTGC TGTTTGAATT TTGTCTCCCC ACCCCCAACT TGGCTAGTAA TAAACACTTA
1321 CTGAAGAAGA AGCAATAAGA GAAAGATATT TGTAATCTCT CCAGCCCATG ATCTCGGTTT
1381 TCTTACACTG TGATCTTAAA AGTTACCAAA CCAAAGTCAT TTTCAGTTTG AGGCAACCAA
1441 ACCTTTCTAC TGCTGTTGAC ATCTTCTTAT TACAGCAACA CCATTCTAGG AGTTTCCTGA
1501 GCTCTCCACT GGAGTCCTCT TTCTGTCGCG GGTCAGAAAT TGTCCCTAGA TGAATGAGAA
1561 AATTATTTTT TTTAATTTAA GTCCTAAATA TAGTTAAAAT AAATAATGTT TTAGTAAAAT
1621 GATACACTAT CTCTGTGAAA TAGCCTCACC CCTACATGTG GATAGAAGGA AATGAAAAAA
1681 TAATTGCTTT GACATTGTCT ATATGGTACT TTGTAAAGTC ATGCTTAAGT ACAAATTCCA
1741 TGAAAAGCTC ACTGATCCTA ATTCTTTCCC TTTGAGGTCT CTATGGCTCT GATTGTACAT
1801 GATAGTAAGT GTAAGCCATG TAAAAAGTAA ATAATGTCTG GGCACAGTGG CTCACGCCTG
1861 TAATCCTAGC ACTTTGGGAG GCTGAGGAGG AAGGATCACT TGAGCCCAGA AGTTCGAGAC
1921 TAGCCTGGGC AACATGGAGA AGCCCTGTCT CTACAAAATA CAGAGAGAAA AAATCAGCCA
1981 GTCATGGTGG CCTACACCTG TAGTCCCAGC ATTCCGGGAG GCTGAGGTGG GAGGATCACT
2041 TGAGCCCAGG GAGGTTGGGG CTGCAGTGAG CCATGATCAC ACCACTGCAC TCCAGCCAGG
2101 TGACATAGCG AGATCCTGTC TAAAAAAATA AAAAATAAAT AATGGAACAC AGCAAGTCCT
2161 AGGAAGTAGG TTAAAACTAA TTCTTTAAAA AAAAAAAAAA GTTGAGCCTG AATTAAATGT
2221 AATGTTTCCA AGTGACAGGT ATCCACATTT GCATGGTTAC AAGCCACTGC CAGTTAGCAG
2281 TAGCACTTTC CTGGCACTGT GGTCGGTTTT GTTTTGTTTT GCTTTGTTTA GAGACGGGGT
2341 CTCACTTTCC AGGCTGGCCT CAAACTCCTG CACTCAAGCA ATTCTTCTAC CCTGGCCTCC
2401 CAAGTAGCTG GAATTACAGG TGTGCGCCAT CACAACTAGC TGGTGGTCAG TTTTGTTACT
2461 CTGAGAGCTG TTCACTTCTC TGAATTCACC TAGAGTGGTT GGACCATCAG ATGTTTGGGC
2521 AAAACTGAAA GCTCTTTGCA ACCACACACC TTCCCTGAGC TTACATCACT GCCCTTTTGA
2581 GCAGAAAGTC TAAATTCCTT CCAAGACAGT AGAATTCCAT CCCAGTACCA AAGCCAGATA
2641 GGCCCCCTAG GAAACTGAGG TAAGAGCAGT CTCTAAAAAC TACCCACAGC AGCATTGGTG
2701 CAGGGGAACT TGGCCATTAG GTTATTATTT GAGAGGAAAG TCCTCACATC AATAGTACAT
2761 ATGAAAGTGA CCTCCAAGGG GATTGGTGAA TACTCATAAG GATCTTCAGG CTGAACAGAC
2821 TATGTCTGGG GAAAGAACGG ATTATGCCCC ATTAAATAAC AAGTTGTGTT CAAGAGTCAG
2881 AGCAGTGAGC TCAGAGGCCC TTCTCACTGA GACAGCAACA TTTAAACCAA ACCAGAGGAA
2941 GTATTTGTGG AACTCACTGC CTCAGTTTGG GTAAAGGATG AGCAGACAAG TCAACTAAAG
3001 AAAAAAGAAA AGCAAGGAGG AGGGTTGAGC AATCTAGAGC ATGGAGTTTG TTAAGTGCTC
3061 TCTGGATTTG AGTTGAAGAG CATCCATTTG AGTTGAAGGC CACAGGGCAC AATGAGCTCT
3121 CCCTTCTACC ACCAGAAAGT CCCTGGTCAG GTCTCAGGTA GTGCGGTGTG GCTCAGCTGG
3181 GTTTTTAATT AGCGCATTCT CTATCCAACA TTTAATTGTT TGAAAGCCTC CATATAGTTA
3241 GATTGTGCTT TGTAATTTTG TTGTTGTTGC TCTATCTTAT TGTATATGCA TTGAGTATTA
3301 ACCTGAATGT TTTGTTACTT AAATATTAAA AACACTGTTA TCCTACAGTT.
실시예 2: 항-인간 클라우딘18.2 단클론 항체의 제조
1 면역화
마우스를 면역화하여 항-인간 클라우딘 18.2 단클론 항체를 제조하였다.
6 내지 8주령의 암컷 SJL 흰 마우스(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., 동물 생산 면허 번호: SCXK (Beijing) 2012-0001)를 실험에 사용하였다. 급이 환경: SPF 수준. 마우스를 구입한 후, 1주일 동안 실험실 환경, 12/12시간의 명암 주기, 20~25℃의 온도, 40~60%의 습도에서 유지시켰다. 그 후, 환경에 적응시킨 마우스를 다음의 계획에 따라 면역화하였다. 면역 항원은 huClaudin18.2-HEK293 세포(인간 클라우딘 18.2 플라스미드로 안정적으로 형질주입된 HEK-293 세포주)였다.
면역화 프로토콜: 세포로 1차 면역화하기 전에, 마우스에 1마리당 0.1 ml의 TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No. T2684)를 복강 내(IP) 주사하였다. 30분 후, 각 마우스에 0.1 ml의 식염수로 1×108/ml의 농도로 희석된 세포액을 복강 내(IP) 주사하였다. 피펫팅으로 세포를 고르게 분산시킨 후, 제0일, 제14일, 제28일, 제42일 및 제56일에 접종하였다. 제21일, 제35일, 제49일, 및 제63일에 혈액 샘플을 채취하였고, 마우스 혈청 내 항체 역가를 ELISA 방법에 의해 결정하였다. 4 내지 5회의 면역화 후, 정체기(plateau)가 되는 경향이 있는 높은 혈청 항체 역가를 가진 마우스를 비장세포(splenocyte)와의 융합을 위하여 선택하였다. 비장세포와의 융합 3일 전, 1 x 107개의 세포를 부스터 면역화를 위하여 복강 내(IP) 주사하였다.
2. 비장세포와의 융합
PEG 매개성 융합 절차를 이용하여 비장 림프구를 골수종 Sp2/0 세포(ATCC®CRL-8287TM)와 융합시켜 하이브리도마 세포를 수득하였다. 하이브리도마 세포를 완전 배지(20%의 FBS, 1×HAT, 1×OPI를 포함하는 IMDM 배지)에 0.5×106 내지 1×106개/ml의 밀도로 재현탁시키고, 96웰 플레이트에 100 μl/웰로 시딩하고(seeded), 3 내지 4일 동안 5%의 CO2에서 37℃에서 인큐베이션하고, HAT 완전 배지를 100 μl/웰로 첨가하고, 클론이 형성될 때까지 3 내지 4일 동안 더 유지하였다. 상청액을 제거하고, 200 μl/웰의 HT 완전 배지(20% FBS, 1×HT 및 1×OPI를 포함하는 IMDM 배지)를 첨가하고, 37℃, 5%의 CO2에서 3일 동안 인큐베이션한 다음, ELISA 검출을 수행하였다.
3 하이브리도마 세포의 스크리닝
하이브리도마 세포의 성장 밀도에 따라, 배양 상청액을 결합 ELISA 방법에 의해 검출하였다. huClaudin18.2-HEK293 세포에 대하여 강한 결합능을 갖지만, HEK293 세포에는 결합하지 않는 세포를 선택한 후, 확장시키고 적시에 동결보존하였다. 단일 세포 클론이 얻어질 때까지 2~3회 서브클로닝을 수행하였다.
각각의 서브클로닝 후의 세포를 또한 세포 결합 분석에 의해 테스트하였다. 하이브리도마 클론을 위의 분석을 통해 스크리닝하여 수득하였다. 무혈청 세포 배양법에 의해 항체를 추가로 제조하였다. 정제 실시예에 따라 항체를 정제하고, 시험예에 사용하였다.
실시예 3: 뮤린 항체의 인간화
높은 시험관 내 활성을 갖는 단클론 하이브리도마 세포주 mAb1901 및 mAb1902를 선택하였다. 단클론 항체 서열을 클로닝한 다음, 인간화, 재조합 발현 및 활성에 대해 평가하였다.
하이브리도마로부터 서열을 클로닝하는 과정은 다음과 같았다. 대수성장기의 하이브리도마 세포를 수집하였다. RNA를 키트 설명서에 따라 Trizol(Invitrogen, 15596 -018)로 추출하고, PrimeScript™ 역전사효소(Takara, cat # 2680A)로 역전사시켰다. 역전사로 수득한 cDNA를 마우스 Ig-프라이머 세트(Novagen, TB326 Rev. B 0503)를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 증폭된 생성물을 시퀀싱 회사에 보냈다. 수득한 DNA 서열에 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 3 내지 6에 제시되어 있다.
mAb1901 뮤린 중쇄 가변 영역 (서열번호 3)
EVQLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPEMGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTSVTVSS.
mAb1901 뮤린 경쇄 가변 영역 (서열번호 4)
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYHCQNDLYYPLTFGAGTKLELK.
mAb1902 뮤린 중쇄 가변 영역 (서열번호 5)
EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSSSTAYMQLSSLPSEDSAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTLTVSS.
mAb1902 뮤린 경쇄 가변 영역 (서열번호 6)
DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIK.
위의 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 후술하는 바와 같이 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 및 인간 카파 경쇄 불변 영역에 연결되어 키메라 항체 ch1901 및 ch1902를 형성하였다.
불변 영역을 다음의 서열로부터 선택하였다:
인간 IgG1 항체 중쇄 불변 영역 (서열번호 7)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
인간 카파 경쇄 불변 영역: (서열번호 8)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
뮤린 단클론 항체를 당해 분야의 여러 문헌에 개시된 바와 같이 인간화하였다. 간략하게는, 모 (뮤린 항체) 불변 도메인을 인간 불변 도메인으로 교체하고, 뮤린 및 인간 항체의 상동성에 기초하여 인간 생식선 항체 서열을 선택하여 CDR 이식(grafting)을 수행하였다. 본 발명에서는, 인간화를 위하여 양호한 활성의 후보 분자를 선택하였고, 결과는 다음과 같다.
1. 뮤린 항체의 CDR 영역
표 4의 VH/VL CDR 아미노산 잔기를 결정하고, Kabat 넘버링 기준에 의해 주석을 달았다.
뮤린 항체의 CDR 서열은 표 4에 제시되어 있다:
뮤린 항체의 CDR 서열
항체 mAb1901
HCDR1 DYGIH (서열번호 9)
HCDR2 YISRGSSTIYYADTVKG (서열번호 10)
HCDR3 GGYDTRNAMDY (서열번호 11)
LCDR1 KSSQSLLNSGNQKNYLA (서열번호 12)
LCDR2 GASTRAS (서열번호 13)
LCDR3 QNDLYYPLT (서열번호 14)
항체 mAb1902
HCDR1 SYWMH (서열번호 15)
HCDR2 MIHPNSGSTNYNEKFKGR (서열번호 16)
HCDR3 LKTGNSFDY (서열번호 17)
LCDR1 KSSQSLLNSGNQKNYLT (서열번호 18)
LCDR2 WASTRES (서열번호 19)
LCDR3 QNAYTYPFT (서열번호 20)
2. 인간 생식선 FR 영역 서열의 선택
수득한 뮤린 항체 VH/VLCDR의 전형적인 구조에 기초하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 항체 생식선 데이터베이스와 비교하여 높은 상동성을 갖는 인간 생식선 주형을 수득하였다. 인간 생식선 경쇄 프레임워크 영역은 인간 카파 경쇄 유전자로부터 유래되었다.
2.1 mAb1901의 인간화 및 역 돌연변이 설계
mAb1901 뮤린 항체의 인간화를 위하여 적절한 인간 항체 생식선을 선택하였다. 뮤린 항체 mAb1901의 CDR 영역을 선택된 인간화 주형에 이식하여 인간화 가변 영역을 수득하였다. 서열번호 24에 제시된 바와 같은 인간화 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 21에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열을 IgG 불변 영역과 조합하여 온전한 항체를 형성하였다. 동시에, 인간화 항체의 V 영역의 FR 영역을 역 돌연변이시켰으며, 예시적인 역 돌연변이 및 조합은 다음과 같다.
인간화 mAb1901 항체 및 역 돌연변이 *
mAb1901 인간화 항체 경쇄 가변 영역 mAb1901 인간화 항체 중쇄 가변 영역
VL1 없음 VH1 없음
VL2 N22S VH2 N82T
VL3 N22S, V85I, Y87H VH3 V48I, N82T
VH4 I69M, N82T
*표의 모든 아미노산 위치는 Kabat 넘버링 기준에 따라 넘버링된다. 중쇄 가변 영역의 N82T의 경우, 82는 Kabat 기준에 따른 위치 82A를 나타낸다.
mAb1901 인간화 항체 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 서열
가변 영역 명칭 (서열번호) 서열
VL1(서열번호 21) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDLYYPLTFGQGTKLEIK
VL2(서열번호 22) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDLYYPLTFGQGTKLEIK
VL3(서열번호 23) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAIYHCQNDLYYPLTFGQGTKLEIK
VH1(서열번호 24) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYISRGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSS
VH2(서열번호 25) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYISRGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSS
VH3(서열번호 26) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSS
VH4(서열번호 27) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSS
상기 표에 나타난 상응하는 중쇄 가변영역은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역에 연결되어 전장 항체의 중쇄를 형성할 수 있고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 8에 제시된 바와 같은 인간 κ 경쇄 불변 영역에 연결되어 전장 항체의 경쇄를 형성할 수 있다. 다른 구현예에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 또한 다른 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역에 개별적으로 연결되어 전장 항체를 형성할 수 있다.
2.2 mAb1902의 인간화 및 역 돌연변이 설계
mAb1902 뮤린 항체의 인간화를 위하여 적절한 인간 항체 생식선을 선택하였다. 뮤린 항체 mAb1902의 CDR 영역을 선택된 인간화 주형에 이식하여 인간화 가변 영역을 수득하였다. 인간화 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 31에 제시된 바와 같고, 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 21에 제시된 바와 같다. 그 후, IgG 불변 영역과 재조합하여 온전한 항체를 형성하였다. 동시에, 인간화 항체의 V 영역의 FR 영역을 역 돌연변이시켰으며, 예시적인 역 돌연변이 방법 및 조합은 다음과 같다.
인간화 mAb1902 항체 및 이의 역 돌연변이 설계 *
mAb1902 인간화 항체 경쇄 가변 영역 mAb1902 인간화 항체 중쇄 가변 영역
VL11 없음 VH11 없음
VL12 M4L VH12 I69L, R71L, T73K
VL13 M4L, N22S VH13 M48I, R66K, V67A, I69L, R71L, T73K
VH14 R38K, A40R, M48I, R66K, V67A, I69L, R71L, T73K
*표의 모든 아미노산 위치는 Kabat 넘버링 기준에 따라 넘버링된다.
mAb1902 인간화 항체 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 서열
가변 영역 명칭 (서열번호) 서열
VL11(서열번호 28) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYTYPFTFGQGTKLEIK
VL12(서열번호 29) DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYTYPFTFGQGTKLEIK
VL13(서열번호 30) DIVLTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYTYPFTFGQGTKLEIK
VH11(서열번호 31) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWMGMIHPNSGSTNYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSS
VH12(서열번호 32) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWMGMIHPNSGSTNYNEKFKGRVTLTLDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSS
VH13(서열번호 33) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSS
VH14(서열번호 34) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQRLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSS
상기 표에 나타난 상응하는 중쇄 가변영역은 서열번호 7에 제시된 바와 같은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역에 연결되어 전장 항체의 중쇄를 형성할 수 있고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 8에 제시된 바와 같은 인간 κ 경쇄 불변 영역에 연결되어 전장 항체의 경쇄를 형성할 수 있다.
예로서, 항체 전장 서열은 다음과 같다.
키메라 항체 ch1901:
ch1901 중쇄: (서열번호 35)
EVQLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPEMGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
ch1901 경쇄 (서열번호 36)
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYHCQNDLYYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC;
키메라 항체 ch1902:
ch1902 중쇄 (서열번호 37)
EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSSSTAYMQLSSLPSEDSAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
ch1902 경쇄 (서열번호 38)
DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNAYTYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
인간화 mAb1901 항체
중쇄
경쇄		 H1 H2 H3 H4
L1 h1901-1 h1901-2 h1901-3 h1901-4
L2 h1901-5 h1901-6 h1901-7 h1901-8
L3 h1901-9 h1901-10 h1901-11 h1901-12
전장 항체의 경쇄 및 중쇄 서열은 다음과 같다:
mAb1901 인간화 항체 경쇄 및 중쇄 서열
경쇄/중쇄 명칭 (서열번호) 서열
L1 (서열번호 39) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDLYYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
L2 (서열번호 40) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDLYYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
L3 (서열번호 41) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAIYHCQNDLYYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
H1 (서열번호 42) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYISRGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
H2 (서열번호 43) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYISRGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
H3 (서열번호 44) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWIAYISRGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
H4 (서열번호 45) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYISRGSSTIYYADTVKGRFTMSRDNAKNSLYLQMTSLRAEDTAVYYCARGGYDTRNAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
인간화 mAb1902 항체
중쇄
경쇄		 H11 H12 H13 H14
L11 h1902-1 h1902-2 h1902-3 h1902-4
L12 h1902-5 h1902-6 h1902-7 h1902-8
L13 h1902-9 h1902-10 h1902-11 h1902-12
전장 항체의 경쇄 및 중쇄 서열은 다음과 같다:
mAb1901 인간화 항체 경쇄 및 중쇄 서열
경쇄/중쇄 명칭 (서열번호) 서열
L11 (서열번호 46) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYTYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
L12 (서열번호 47) DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYTYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
L13 (서열번호 48) DIVLTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAYTYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
H11 (서열번호 49) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWMGMIHPNSGSTNYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
H12 (서열번호 50) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWMGMIHPNSGSTNYNEKFKGRVTLTLDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
H13 (서열번호 51) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
H14 (서열번호 52) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQRLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKGKATLTLDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKTGNSFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
본 개시 내용의 양성 대조군 항체는 IMAB-362(WO2016166122로부터 이용 가능)였다:
IMAB-362 중쇄 (서열번호 53)
1 QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWINWVKQR PGQGLEWIGN
51 IYPSDSYTNY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTRSW
101 RGNSFDYWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK.
IMAB-362 경쇄 (서열번호 54)
1 DIVMTQSPSS LTVTAGEKVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP
51 KLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT ISSVQAEDLA VYYCQNDYSY
101 PFTFGSGTKL EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA
151 KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC
201 EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC.
위에 언급한 항체를 종래의 유전자 클로닝 및 재조합 발현 방법에 의해 클로닝하고, 발현 및 정제하였다.
시험관 내 생물학적 평가
시험예 1: 세포 수준에서의 ELISA 결합 분석
세포 기반의 ELISA 분석을 사용하여 클라우딘 18.2 항체의 결합 특성을 검출하였다. 클라우딘 18.2를 안정적으로 발현하는 NUGC4 세포를 96-웰 세포 플레이트(Corning, 3599)에서 세포 성장 밀도가 90%가 될 때까지 배양하고, 4%의 파라포름알데히드를 첨가하여 1시간 동안 세포를 고정시켰다. 플레이트를 PBST 완충액(0.05%의 Tween-20을 함유하는 PBS, pH 7.4)으로 3회 세척한 후, PBS로 희석한 5%의 탈지유(Bright 탈지분유) 200 μl/웰을 차단액으로 첨가하여 차단하고, 37℃의 인큐베이터에서 2.5시간 또는 4℃에서 밤새(16 내지 18시간) 인큐베이션하였다. 차단 후 차단액을 버리고 플레이트를 PBST 완충액으로 3회 세척하고, 샘플 희석액(1%의 탈지유를 함유하는 PBS, pH 7.4)으로 희석한 테스트 항체 50 μl/웰을 첨가하고, 37℃에 두고, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 종료된 후, 플레이트를 PBST로 5회 세척하고, 샘플 희석액으로 희석한, 100 μl/웰의 HRP 라벨링된 염소 항-인간 2차 항체(Jackson Immuno Research, Cat No. 109-035-003)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 6회 세척한 후, 50 μl/웰의 TMB 발색 기질(KPL, Cat No. 52 52-00-03)을 첨가하고, 실온에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션하고, 50 μl/웰의 1 M의 H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 흡광도 값을 450 nm에서 MD Versa Max TM 미세플레이트 판독기로 판독하고, 클라우딘18.2에 결합하는 클라우딘18.2 항체를 나타내는 EC50 값을 계산하였다(결과는 아래 표에 제시하였다).
항체의 결합 활성
항체 IMAB362 ch1901 ch1902
Emax 1.175 1.399 1.272
EC50(nM) 0.108 0.098 0.074
[표 14-1]
Figure pct00001
[표 14-2]
Figure pct00002
시험예 2: 세포 수준에서 항체의 결합 분석
1×106개/ml의 세포 현탁액을 클라우딘 18.2를 안정적으로 발현하는 NUGC4 세포 및 FACS 완충액(PBS(Sigma, P4417-100TAB) 중 2%의 소 태아 혈청(Gibco, 10099141), pH7.4)으로 제조하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트(Corning, 3795)에 100 μl/웰로 첨가하였다. 원심분리하여 상청액을 제거한 후, FACS 완충액으로 희석한 다양한 농도의 테스트 클라우딘 18.2 항체를 50 μl/웰로 첨가하고, 암소에서 4℃의 냉장고에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3회 동안 300 g에서 원심분리 및 FACS 완충액으로의 세척 후, 작업 농도의 알렉사 플루오르 488이 코팅된 항-인간 IgG(H+L)(invitrogen, A-11013)를 첨가하고, 40분 동안 암소에서 4℃의 냉장고에서 인큐베이션하였다. 원심분리 및 300 g에서 FACS 완충액으로의 3회 세척 후, BD FACS CantoII 유세포 분석기에서 기하 평균 형광 강도를 측정하고, 클라우딘 18.2를 안정적으로 발현하는 NUGC4 세포에 대한 클라우딘 18.2 항체 결합을 보여주는 EC50을 계산하였다. 결과를 도 1에 나타내었다.
시험예 3: 항체의 세포 내 이입 분석
DyLight 488 NHS 에스테르(thermofisher, 46403)로 사전 라벨링된 테스트 클라우딘 18.2 항체를 5 μg/ml의 최종 농도로 클라우딘 18.2를 안정적으로 발현하는 1×106개/ml NUGC4 세포에 첨가하고, 암소에서 1시간 인큐베이션하는 동안 얼음 위에 두었고, 원심분리하고, 사전 냉각된 FACS 완충액(PBS 중 2%의 소 태아 혈청, pH 7.4)으로 3회 세척하고, 상청액을 제거한 후, 사전에 가온한 완전 배지를 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 세포 인큐베이터에 두었다. 각각 0, 0.5, 1, 2, 및 4시간 후에 세포를 꺼내고, 암소의 얼음 위에 두었다. 모든 샘플을 수집하고, 저온에서 300 g에서 원심분리한 후, 용출 완충액(0.05 M 글리신, 0.1 M 염화나트륨, pH1.7)을 첨가하고, 실온에서 7분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 원심분리하고, 300 g에서 FACS 완충액으로 1회 세척하고, BD FACS CantoII 유세포 분석기에서 기하 평균 형광 강도를 측정하고, 클라우딘 18.2를 안정적으로 발현하는 NUGC4 세포에 대한 클라우딘 18.2 항체의 세포 내 이입 효율을 계산하였다. 결과는 인간화 항체가 유리한 세포 내 이입 효율을 가짐을 보여준다(도 2 참고).
시험예 4: 유세포 분석법에 기초한 항체 친화도 결정
테스트 당일, HEK293/hClaudin18.2 세포를 웰당 1×105 내지 2×105개 세포로 U자 바닥 96-웰 플레이트에 수집하였다. 클라우딘 18.2 항체를 초기 농도 5 μg/ml, 2×의 기울기 희석(12개의 농도 점)으로 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군은 IMAB362였고, 항체가 없는 웰을 음성 대조군으로 설정하였다. 원심분리하여 항체를 제거한 후 100 μl/웰의 FITC 항-인간 IgG Fc 항체(200x)를 첨가하고, 암소에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, PBS+2% FBS로 2회 세척하고, 유세포 분석 검출을 준비하였다. BD FACS CantoII를 시작하고 예열하였으며, BD FACSDiva 소프트웨어에 의해 새로운 분석을 확립하였다. HEK293/hClaudin18.2 음성 대조군 샘플을 검출하고, FSC 및 SSC 전압을 적절한 값으로 조정하고 저장하였다. Quantum™ FITC-5 MESF 키트의 설명서에 따라 블랭크 샘플 B와 표준 곡선 1을 각각 검출하였다. FITC 전압을 적절한 값으로 조정하여 저장하였다. U자 바닥 96-웰 플레이트의 샘플을 저장된 전압에서 검출하고 데이터를 기록하였다. Flowjo 소프트웨어를 사용하여 실험 데이터를 분석하여 기하 평균값을 얻었고, MESF-기하 평균 표준 곡선을 Quantum™ FITC-5 MESF 키트의 설명서에 따라 적합화하였다. HEK293/hClaudin18.2 세포에 결합하는 클라우딘18.2 항체의 몰 농도 및 유리 항체의 농도를 FITC 항-인간 IgG Fc 항체의 농도 형광 값에 기초하여 계산하고, 항체의 Bmax 및 해리 상수 KD를 Scatchard 도표화 방법을 이용하여 계산하였다. 결과를 표 15에 나타내었다.
세포 수준에서 인간화 항체의 친화도
항체 IMAB362 h1901-11 h1902-5
KD(nM) 10.2 6.8 1.64
시험예 5: 항체의 ADCC 효과의 평가
다양한 NUGC4 세포(클라우딘 18.2의 고, 중 및 저 발현)를 소화시키고, 1000 rpm에서 원심분리하고, 계수를 위해 재현탁시켰다. 세포를 10% FBS(New Zealand Ultra-low IgG Fetal Bovine Serum, Gibco, 1921005PJ)을 함유하는 페놀 레드가 없는 RPMI 1640(Gibco, CAT# 11835-030)에 3×105개 세포/ml로 재현탁시켰다. 25 μl의 세포를 96-웰 플레이트(Corning, 3903)의 각 웰에 7500개 세포/웰로 첨가하였다. 항체를 상기 언급한 페놀 레드가 없는 배지에 희석하여 3× 항체 희석액을 제조하고, 25 μl/웰의 항체를 세포 플레이트에 첨가하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다.
이펙터 세포(FcrR3A-V158-NFAT-RE-Jurkat 세포)를 수집하고, 1000 rpm에서 원심분리하고, 계수를 위해 재현탁시켰다. 세포를 10% FBS(New Zealand Ultra-low IgG Fetal Bovine Serum)를 함유하는 페놀 레드가 없는 RPMI 1640에 3×106개 세포/ml로 재현탁시키고, 25 μl의 세포를 분석 플레이트에 첨가하고(7.5x104개 세포/웰), 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하였다.
75 μl/웰의 Bright-Glo(Promega, E2610)를 분석 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 미세플레이트 판독기(PerkinElmer, VITOR3)로 화학발광을 검출하였다.
결과는 항체 h1901-11 및 h1902-5가 모두 낮은 수준, 중간 수준 및 높은 수준의 클라우딘 18.2를 발현하는 NUGC4 세포에서 매우 강한 ADCC 활성을 나타냄을 보여준다(표 16 및 도 3a 내지 도 3c 참고).
상이한 발현 수준의 클라우딘 18.2를 갖는 NUGC4 세포에서 항체의 ADCC 효과
NUGC4에서 클라우딘 18.2의 발현 수준 h1901-11 h1902-5 IMAB362
저 발현 IC50(ng/ml) 22.42 35.46 183.4
중 발현 IC50(ng/ml) 15.35 30.00 210.4
고 발현 IC50(ng/ml) 26.17 32.16 132.6
Sequence listing <110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD.; 　　　 SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> ANTI-CLAUDIN 18.2 ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF <130> 702029CPCP <140> PCT/CN2020/082369 <141> 2020-03-31 <150> 201910257853.6 <151> 2019-04-01 <160> 54 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <223> Claudin18.2 protein <400> 1 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu 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240 gccggggcta cttcaccctg ctggggctgc cagccatgct gcaggcagtg cgagccctga 300 tgatcgtagg catcgtcctg ggtgccattg gcctcctggt atccatcttt gccctgaaat 360 gcatccgcat tggcagcatg gaggactctg ccaaagccaa catgacactg acctccggga 420 tcatgttcat tgtctcaggt ctttgtgcaa ttgctggagt gtctgtgttt gccaacatgc 480 tggtgactaa cttctggatg tccacagcta acatgtacac cggcatgggt gggatggtgc 540 agactgttca gaccaggtac acatttggtg cggctctgtt cgtgggctgg gtcgctggag 600 gcctcacact aattgggggt gtgatgatgt gcatcgcctg ccggggcctg gcaccagaag 660 aaaccaacta caaagccgtt tcttatcatg cctcaggcca cagtgttgcc tacaagcctg 720 gaggcttcaa ggccagcact ggctttgggt ccaacaccaa aaacaagaag atatacgatg 780 gaggtgcccg cacagaggac gaggtacaat cttatccttc caagcacgac tatgtgtaat 840 gctctaagac ctctcagcac gggcggaaga aactcccgga gagctcaccc aaaaaacaag 900 gagatcccat ctagatttct tcttgctttt gactcacagc tggaagttag aaaagcctcg 960 atttcatctt tggagaggcc aaatggtctt agcctcagtc tctgtctcta aatattccac 1020 cataaaacag ctgagttatt tatgaattag aggctatagc tcacattttc aatcctctat 1080 ttcttttttt aaatataact ttctactctg atgagagaat gtggttttaa tctctctctc 1140 acattttgat gatttagaca gactccccct cttcctccta gtcaataaac ccattgatga 1200 tctatttccc agcttatccc caagaaaact tttgaaagga aagagtagac ccaaagatgt 1260 tattttctgc tgtttgaatt ttgtctcccc acccccaact tggctagtaa taaacactta 1320 ctgaagaaga agcaataaga gaaagatatt tgtaatctct ccagcccatg atctcggttt 1380 tcttacactg tgatcttaaa agttaccaaa ccaaagtcat tttcagtttg aggcaaccaa 1440 acctttctac tgctgttgac atcttcttat tacagcaaca ccattctagg agtttcctga 1500 gctctccact ggagtcctct ttctgtcgcg ggtcagaaat tgtccctaga tgaatgagaa 1560 aattattttt tttaatttaa gtcctaaata tagttaaaat aaataatgtt ttagtaaaat 1620 gatacactat ctctgtgaaa tagcctcacc cctacatgtg gatagaagga aatgaaaaaa 1680 taattgcttt gacattgtct atatggtact ttgtaaagtc atgcttaagt acaaattcca 1740 tgaaaagctc actgatccta attctttccc tttgaggtct ctatggctct gattgtacat 1800 gatagtaagt gtaagccatg taaaaagtaa ataatgtctg ggcacagtgg ctcacgcctg 1860 taatcctagc actttgggag gctgaggagg aaggatcact tgagcccaga agttcgagac 1920 tagcctgggc aacatggaga agccctgtct ctacaaaata cagagagaaa aaatcagcca 1980 gtcatggtgg cctacacctg tagtcccagc attccgggag gctgaggtgg gaggatcact 2040 tgagcccagg gaggttgggg ctgcagtgag ccatgatcac accactgcac tccagccagg 2100 tgacatagcg agatcctgtc taaaaaaata aaaaataaat aatggaacac agcaagtcct 2160 aggaagtagg ttaaaactaa ttctttaaaa aaaaaaaaaa gttgagcctg aattaaatgt 2220 aatgtttcca agtgacaggt atccacattt gcatggttac aagccactgc cagttagcag 2280 tagcactttc ctggcactgt ggtcggtttt gttttgtttt gctttgttta gagacggggt 2340 ctcactttcc aggctggcct caaactcctg cactcaagca attcttctac cctggcctcc 2400 caagtagctg gaattacagg tgtgcgccat cacaactagc tggtggtcag ttttgttact 2460 ctgagagctg ttcacttctc tgaattcacc tagagtggtt ggaccatcag atgtttgggc 2520 aaaactgaaa gctctttgca accacacacc ttccctgagc ttacatcact gcccttttga 2580 gcagaaagtc taaattcctt ccaagacagt agaattccat cccagtacca aagccagata 2640 ggccccctag gaaactgagg taagagcagt ctctaaaaac tacccacagc agcattggtg 2700 caggggaact tggccattag gttattattt gagaggaaag tcctcacatc aatagtacat 2760 atgaaagtga cctccaaggg gattggtgaa tactcataag gatcttcagg ctgaacagac 2820 tatgtctggg gaaagaacgg attatgcccc attaaataac aagttgtgtt caagagtcag 2880 agcagtgagc tcagaggccc ttctcactga gacagcaaca tttaaaccaa accagaggaa 2940 gtatttgtgg aactcactgc ctcagtttgg gtaaaggatg agcagacaag tcaactaaag 3000 aaaaaagaaa agcaaggagg agggttgagc aatctagagc atggagtttg ttaagtgctc 3060 tctggatttg agttgaagag catccatttg agttgaaggc cacagggcac aatgagctct 3120 cccttctacc accagaaagt ccctggtcag gtctcaggta gtgcggtgtg gctcagctgg 3180 gtttttaatt agcgcattct ctatccaaca tttaattgtt tgaaagcctc catatagtta 3240 gattgtgctt tgtaattttg ttgttgttgc tctatcttat tgtatatgca ttgagtatta 3300 acctgaatgt tttgttactt aaatattaaa aacactgtta tcctacagtt 3350 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> DOMAIN <223> mAb1901 murine antibody heavy chain variable region <400> 3 Glu Val Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala 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Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 47 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> L12 <400> 47 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 51 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> H13 <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 52 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> H14 <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Lys Thr Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 53 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> IMAB-362 heavy chain <400> 53 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 54 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> CHAIN <223> IMAB-362 light chain <400> 54 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220

Claims (17)

  1. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-클라우딘 18.2 항체로서,
    i) 중쇄 가변 영역은 서열번호 3에 제시된 중쇄 가변 영역과 동일한 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역과 동일한 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하거나; 또는
    ii) 중쇄 가변 영역은 서열번호 5에 제시된 중쇄 가변 영역과 동일한 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 6에 제시된 경쇄 가변 영역과 동일한 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 것인 항-클라우딘 18.2 항체.
  2. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때,
    iii) 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나; 또는
    iv) 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 것인 항-클라우딘 18.2 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 뮤린 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체인 항-클라우딘 18.2 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때,
    v) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 3 또는 24와 적어도 90%의 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 4 또는 21과 적어도 90%의 동일성을 갖거나; 또는
    vi) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 31과 적어도 90%의 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 6 또는 28과 적어도 90%의 동일성을 갖고;
    바람직하게는:
    1) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 3에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 3과 적어도 90%의 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 4에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 4와 적어도 90%의 동일성을 갖거나;
    2) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 24에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 24와 적어도 90%의 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 21에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 21과 적어도 90%의 동일성을 갖거나;
    3) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 5에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 5와 적어도 90%의 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 6에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 6과 적어도 90%의 동일성을 갖거나; 또는
    4) 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 31에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 31과 적어도 90%의 동일성을 갖고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 28에 제시된 바와 같거나 또는 서열번호 28과 적어도 90%의 동일성을 갖는 것인 항-클라우딘 18.2 항체.
  5. 제4항에 있어서, 인간 항체로부터 유래한 프레임워크 영역 또는 이의 프레임워크 영역 변이체를 포함하는 인간화 항체이고, 프레임워크 영역 변이체는 인간 항체 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 중쇄 프레임워크 영역에 1 내지 10개의 역 돌연변이(들)를 갖고;
    바람직하게는, 프레임워크 영역 변이체는 아래의 a) 또는 b)로부터 선택되는 돌연변이(들)를 포함하고:
    a) 경쇄 가변 영역에 포함된 22S, 85I 및 87H로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 역 돌연변이(들), 및/또는 중쇄 가변 영역에 포함된 48I, 82T 및 69M으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 역 돌연변이(들); 또는
    b) 경쇄 가변 영역에 포함된 4L 및 22S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 역 돌연변이(들), 및/또는 중쇄 가변 영역에 포함된 38K, 40R, 48I, 66K, 67A, 69L, 71L 및 73K로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 역 돌연변이(들);
    더욱 바람직하게는, 프레임워크 영역 변이체는 아래의 a-1) 또는 b-1)로부터 선택되는 돌연변이(들)를 포함하고:
    a-1) 경쇄 가변 영역에 포함되는 아미노산 역 돌연변이 22S, 85I 및 87H, 및 중쇄 가변 영역에 포함되는 역 돌연변이 48I 및 82T; 또는
    b-1) 경쇄 가변 영역에 포함되는 역 돌연변이 4L;
    중쇄 가변 영역에 포함되는 역 돌연변이 82T,
    이때, "82"는 Kabat 기준에 따른 위치 82A를 나타내는 것인 항-클라우딘 18.2 항체.
  6. 제3항에 있어서, 아래에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-클라우딘 18.2 항체:
    vii) 서열번호 3에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 4에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    viii) 서열번호 24, 25, 26 또는 27에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 21, 22 또는 23에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    ix) 서열번호 5에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 6에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    x) 서열번호 31, 32, 33 또는 34에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 28, 29 또는 30에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열;
    바람직하게는, 아래에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-클라우딘 18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    xi) 서열번호 31에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 29에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    xii) 서열번호 26에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 23에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 영역 서열.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역(들) 및 이의 변이체(들)로 구성된 군으로부터 선택되고,
    바람직하게는, 경쇄 불변 영역은 인간 항체 κ 및 λ 쇄 불변 영역(들) 및 이의 변이체(들)로 구성된 군으로부터 선택되고;
    더욱 바람직하게는, 서열번호 7에 제시된 바와 같은 중쇄 불변 영역 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 경쇄 불변 영역을 포함하고;
    가장 바람직하게는, 서열번호 35 또는 42와 적어도 90%의 동일성을 갖는 중쇄 및 서열번호 36 또는 39와 적어도 90%의 동일성을 갖는 경쇄; 또는
    서열번호 37 또는 49와 적어도 90%의 동일성을 갖는 중쇄 및 서열번호 38 또는 46과 적어도 90%의 동일성을 갖는 경쇄를 포함하는 것인 항-클라우딘 18.2 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    c) 서열번호 35에 제시된 바와 같은 중쇄 및 서열번호 36에 제시된 바와 같은 경쇄;
    d) 서열번호 42, 43, 44 또는 45에 제시된 바와 같은 중쇄 및 서열번호 39, 40 또는 41에 제시된 바와 같은 경쇄;
    e) 서열번호 37에 제시된 바와 같은 중쇄 및 서열번호 38에 제시된 바와 같은 경쇄; 또는
    f) 서열번호 49, 50, 51 또는 52에 제시된 바와 같은 중쇄 및 서열번호 46, 47 또는 48에 제시된 바와 같은 경쇄;
    를 포함하는 항-클라우딘 18.2 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 44에 제시된 바와 같은 중쇄 및 서열번호 41에 제시된 바와 같은 경쇄; 또는
    서열번호 49에 제시된 바와 같은 중쇄 및 서열번호 47에 제시된 바와 같은 경쇄;
    를 포함하는 항-클라우딘 18.2 항체.
  10. 단리된 항-클라우딘 18.2 항체로서, 인간 클라우딘 18.2에 대한 결합에 대해 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항-클라우딘 18.2 항체와 경쟁하는 단리된 항-클라우딘 18.2 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항-클라우딘 18.2 항체를 암호화하는 하나의 핵산 분자.
  12. 제11항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  13. 항체-약물 접합체로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항-클라우딘 18.2 항체를 세포독성약물에 접합시켜 형성되는 항체-약물 접합체.
  14. 약학적 조성물로서, 치료적 유효량의, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항-클라우딘 18.2 항체, 또는 제11항에 따른 핵산 분자, 또는 제13항에 따른 항체-약물 접합체, 및 1종 이상의 제약상 허용 가능한 담체, 희석제, 완충제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 클라우딘18.2의 면역분석 또는 검출을 위한 방법으로서,
    제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항-클라우딘 18.2 항체를 테스트할 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항-클라우딘 18.2 항체를 포함하는 키트.
  17. 클라우딘 18.2와 관련된 질환의 치료 방법으로서, 대상체에게 치료적 유효량의, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항-클라우딘 18.2 항체, 또는 제11항의 핵산 분자, 또는 제13항의 항체-약물 접합체 또는 제14항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 바람직하게는, 질환은 종양이고;
    더욱 바람직하게는, 질환은 두경부 편평세포암, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 다형성교모세포종, 신경모세포종, 중추신경계 암, 신경내분비 종양, 인후두 암종, 비인두암, 식도암, 갑상선암, 악성 흉막 중피종, 폐암, 유방암, 간암, 간세포 종양, 간세포 암종, 간 및 담낭암, 췌장암, 위암, 소화기암, 창자암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 투명세포 신세포 암종, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 골암, 연골육종, 골수종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 쿠르켄베르그(Krukenberg) 종양, 골수증식성 종양, 편평세포암, 유잉 육종, 전신 경쇄 아밀로이드증 및 메르켈 세포암으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    더욱 바람직하게는, 림프종은 호지킨 림프종, 비 호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, 외투 세포 림프종, 소림프구성 림프종, T 세포/조직구가 풍부한 거대 B 세포 림프종, 및 림프형질세포성 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    폐암은 비 소세포 폐암 및 소세포 폐암으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프모구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 및 골수성 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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