JP2023550998A - Cldn18.2抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、CLDN18.2を特異的に認識する能力を有する抗体、若しくはその抗原結合断片、又はキメラ抗原受容体を提供する。抗体若しくはその抗原結合断片、又はキメラ抗原受容体は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9に示す軽鎖可変領域のCDR配列、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号1に示す重鎖可変領域のCDR配列から選択される少なくとも1つのCDR配列、又はそれと少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年11月27日に中国国家知識産権局に出願された、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている中国特許出願第202011364033.6号の優先権を主張するものである。
本出願は、2020年11月27日に中国国家知識産権局に出願された、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている中国特許出願第202011364033.6号の優先権を主張するものである。
本発明は生命工学の分野に関する。詳細には、本発明はCLDN18.2抗体及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、CLDN18.2又はその抗原結合断片を特異的に認識する能力を有する抗体、キメラ抗原受容体、免疫細胞、核酸分子、発現ベクター、組換え細胞、医薬組成物、医薬的使用、CLDN18.2を検出するためのキット、CLDN18.2を検出するためのキットの使用、及びスクリーニング抗体の使用に関する。
胃癌は癌関連の死亡率の第三位であり、世界中で治癒が最も困難な癌のうちの1つであるとみなされている。進行性又は転移性の胃癌又は胃食道接合部(GEJ)腺癌を有する患者では、全生存の中央値(mOS)は10カ月を超えない。ヒト表皮成長因子受容体2(HER-2)標的治療及び免疫チェックポイント阻害剤は特定の集団にはよい知らせをもたらしているが、進行性胃癌における他の標的を見出すことは絶対に必要である。
クローディンは、その役割が細胞間の分子の交換を制御する密着帯を維持することである、タンパク質のファミリーである。これは胃、膵臓、及び肺組織中に広く分布しており、関連する組織疾患を診断及び処置するために使用することができる。CLDN18.2亜型は、胃組織中に少量でのみ特異的に発現され、他の正常組織では発現されない亜型であり、高度に選択的であり、胃癌細胞、膵癌細胞、及び他の癌細胞中で大量に発現される。したがって、これは腫瘍薬物療法の理想的な標的であり、CLDN18.2を標的療法に特異的にする。ヒトとマウスクローディン18.2タンパク質との間の高い度合の相同性が原因で(相同性は90%より高い)、慣用の免疫化手順では有効な免疫抗体を生成することができない。
Chanら、Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis、Oxford University Press、英国Oxford、2000
Peptide and Protein Drug Analysis、Reid, R.編、Marcel Dekker Inc.、2000
Epitope Mapping、Westwoodら編、Oxford University Press、英国Oxford、2001
Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Press、ニューヨーク州Cold Spring Harbor、2001
Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons、ニューヨーク、1994
CLDN18.2に対する特異性の高い抗体の開発が、腫瘍の診断及び処置に非常に有意義であること理解することができる。
上記課題を解決するために、本発明者らは、hクローディン18.2の完全長遺伝子を含有するプラスミドを使用してクローディン18.2遺伝子ノックアウトを有するC57マウスを免疫化し、異なる親和性及び結合エピトープを有する2つの抗クローディン18.2ネズミ抗体を、ハイブリドーマ融合技術を通じてスクリーニングした。2つの抗体の重鎖及び軽鎖可変領域は遺伝子シーケンシングによって得た。リンカーの助けを借りて、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を直列で接続させて、様々な続く応用のためのVL-リンカー-VH構造を形成した。
本発明の第1の態様では、本発明は、CLDN18.2を特異的に認識する能力を有する抗体又はその抗原結合断片を提供する。本発明の一実施形態によれば、抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖可変領域のCDR配列:配列番号1~3、配列番号7~9、重鎖可変領域のCDR配列:配列番号4~6、配列番号10~12から選択される少なくとも1つのCDR配列、又はそれと少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
SQSLLNSGNQKNYL(配列番号1).
YWAST(配列番号2).
CQNDYSYPFTF(配列番号3).
SQSLFNSGNQKNYL(配列番号7).
YWAST(配列番号8).
CQNDYSYPLTF(配列番号9).
SGYTFTSYWM(配列番号4).
MIHPNSGSTN(配列番号5).
CARRYYGSISPDYW(配列番号6).
SGYTFTDYNM(配列番号10).
YINPNNGGTS(配列番号11).
CVTTRYLAVW(配列番号12).
SQSLLNSGNQKNYL(配列番号1).
YWAST(配列番号2).
CQNDYSYPFTF(配列番号3).
SQSLFNSGNQKNYL(配列番号7).
YWAST(配列番号8).
CQNDYSYPLTF(配列番号9).
SGYTFTSYWM(配列番号4).
MIHPNSGSTN(配列番号5).
CARRYYGSISPDYW(配列番号6).
SGYTFTDYNM(配列番号10).
YINPNNGGTS(配列番号11).
CVTTRYLAVW(配列番号12).
本発明の実施形態によれば、上述の抗体は、CLDN18.2タンパク質分子又はその表面上に分子を有する細胞、組織、臓器等を特異的に標的としてそれと結合し、それによって抗原-抗体複合体を形成し、生物学的機能を発揮することができる。
本発明の一実施形態によれば、前述の抗体又は抗原結合断片は、以下の追加の技術的特長のうちの少なくとも1つを更に含み得る。
本発明の一実施形態によれば、抗体は、
それぞれ配列番号1、2、及び3に示す軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3配列、若しくは配列番号1、2、及び3と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列、又は
それぞれ配列番号7、8、及び9に示す軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3配列、若しくは配列番号7、8、及び9と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含む。
それぞれ配列番号1、2、及び3に示す軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3配列、若しくは配列番号1、2、及び3と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列、又は
それぞれ配列番号7、8、及び9に示す軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3配列、若しくは配列番号7、8、及び9と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含む。
本発明の一実施形態によれば、抗体は、
それぞれ配列番号4、5、及び6に示す重鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3配列、若しくは配列番号4、5、及び6と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列、又は
それぞれ配列番号10、11、及び12に示す重鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3配列、若しくは配列番号10、11、及び12と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含む。
それぞれ配列番号4、5、及び6に示す重鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3配列、若しくは配列番号4、5、及び6と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列、又は
それぞれ配列番号10、11、及び12に示す重鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3配列、若しくは配列番号10、11、及び12と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含む。
本発明の一実施形態によれば、ペプチドEと比較して、抗体又はその抗原結合断片は、ペプチドAを、CLDN18.2を特異的に認識する支配的エピトープとして使用し、ペプチドEの配列を配列番号14に示し、ペプチドAの配列を配列番号13に示す。
DLYNNPVTAVFNYQGLWRSC (配列番号14).
DQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGC (配列番号13).
DLYNNPVTAVFNYQGLWRSC (配列番号14).
DQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGC (配列番号13).
本発明の一実施形態によれば、配列番号1~3及び配列番号4~6の配列のうちのいずれか1つを有する抗体は、ペプチドAが位置するエピトープとのみ結合し、配列番号7~9及び配列番号10~12の配列のうちのいずれか1つを有する抗体は、ペプチドA及びEからなる複合エピトープと結合することができ、ペプチドAは支配的エピトープである。
本発明の一実施形態によれば、抗体は、重鎖フレームワーク領域配列及び軽鎖フレームワーク領域配列のうちの少なくとも1つを含み、重鎖フレームワーク領域配列及び軽鎖フレームワーク領域配列のうちの少なくとも1つの少なくとも一部は、ネズミ抗体、ヒト抗体、霊長類抗体、又はその突然変異体のうちの少なくとも1つに由来する。
本発明の一実施形態によれば、抗体は、配列番号15及び配列番号16のうちのいずれか1つに示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、並びに/又は、抗体は、配列番号17及び配列番号18のうちのいずれか1つに示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する。
DIVMTQSPSSLSVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIK(配列番号15).
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQNDYSYPLTFGAGTKLELR (配列番号16).
QVQLQQPGSELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRYYGSISPDYWGQGTTLTVSS(配列番号17).
EVQLQQSGPELVRPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVNKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVTTRYLAVWGTGTTVTVSS(配列番号18)
DIVMTQSPSSLSVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIK(配列番号15).
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQNDYSYPLTFGAGTKLELR (配列番号16).
QVQLQQPGSELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRYYGSISPDYWGQGTTLTVSS(配列番号17).
EVQLQQSGPELVRPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVNKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVTTRYLAVWGTGTTVTVSS(配列番号18)
本発明の一実施形態によれば、抗体は、配列番号15のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号17のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する。
本発明の一実施形態によれば、抗体は、配列番号16のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号18のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する。
本発明の一実施形態によれば、抗体は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のうちの少なくとも1つを含み、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のうちの少なくとも1つの少なくとも一部は、ネズミ抗体、ヒト抗体、霊長類抗体、又はその突然変異体のうちの少なくとも1つに由来する。
本発明の一実施形態によれば、抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域の両方が、ネズミIgG抗体又はその突然変異体に由来する。本発明の実施形態の抗体によれば、抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域の両方が、ヒトIgG4、IgG3、又はIgG1に由来する。
本発明の一実施形態によれば、抗体は、配列番号19及び配列番号20のうちのいずれか1つに示すアミノ酸配列を有する軽鎖を有する:
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQNDYSYPLTFGAGTKLELRRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(配列番号19).
DIVMTQSPSSLSVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(配列番号20).
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQNDYSYPLTFGAGTKLELRRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(配列番号19).
DIVMTQSPSSLSVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(配列番号20).
本発明の一実施形態によれば、抗体は、配列番号21及び配列番号22のうちのいずれか1つに示すアミノ酸配列を有する重鎖を有する:
EVQLQQSGPELVRPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVNKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVTTRYLAVWGTGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK(配列番号21).
QVQLQQPGSELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRYYGSISPDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK(配列番号22).
EVQLQQSGPELVRPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVNKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVTTRYLAVWGTGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK(配列番号21).
QVQLQQPGSELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRYYGSISPDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK(配列番号22).
本発明の一実施形態によれば、配列番号21のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号19のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗体は、m1B6抗体である。配列番号22のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号20のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗体は、m1E7抗体である。
本発明の一実施形態によれば、抗体は、単鎖抗体、キメラ抗体、多量体抗体、又はCDR移植抗体である。
本発明の一実施形態によれば、抗体は単鎖抗体であり、単鎖抗体は、配列番号23及び配列番号24のうちのいずれか1つに示すアミノ酸配列を有する:
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQNDYSYPLTFGAGTKLELRGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVRPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVNKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVTTRYLAVWGTGTTVTVSS(配列番号23).
DIVMTQSPSSLSVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGSELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRYYGSISPDYWGQGTTLTVSS(配列番号24).
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQNDYSYPLTFGAGTKLELRGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVRPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVNKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVTTRYLAVWGTGTTVTVSS(配列番号23).
DIVMTQSPSSLSVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGSELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRYYGSISPDYWGQGTTLTVSS(配列番号24).
本発明の一実施形態によれば、配列番号23のアミノ酸配列を有する抗体を1B6抗体と呼び、配列番号24のアミノ酸配列を有する抗体を1E7抗体と呼ぶ。これらのうち、配列番号23及び配列番号24に示すアミノ酸配列を有する抗体は、VL-リンカー-VHとしてN末端からC末端に表すことができる。VLは軽鎖可変領域を表し、VHは重鎖可変領域を表す。リンカーは、VL及びVHを接続する連結鎖を表す。
本発明の一実施形態によれば、抗体はキメラ抗体1B6及び1E7であってよく、キメラ抗体1B6は、配列番号31の重鎖及び配列番号32の軽鎖を有する。
EVQLQQSGPELVRPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVNKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVTTRYLAVWGTGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号31)。
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQNDYSYPLTFGAGTKLELRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号32)。
EVQLQQSGPELVRPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVNKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVTTRYLAVWGTGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号31)。
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQNDYSYPLTFGAGTKLELRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号32)。
キメラ抗体1E7は、配列番号33の重鎖及び配列番号34の軽鎖を有する。
QVQLQQPGSELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRYYGSISPDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号33)。
DIVMTQSPSSLSVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号34)
QVQLQQPGSELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRYYGSISPDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号33)。
DIVMTQSPSSLSVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号34)
本発明の一実施形態によれば、抗原結合断片は、Fab断片、(Fab)2断片、scFv-Fc融合タンパク質、scFv-Fv融合タンパク質、Fv断片、及び最小認識単位のうちの少なくとも1つを含む。
本発明の第2の態様では、本発明はキメラ抗原受容体を提供する。本発明の一実施形態によれば、キメラ抗原受容体は細胞外領域を含み、細胞外領域は、単鎖抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、本発明の第1の態様において提供した抗体又はその抗原結合断片に従って決定される。本発明の一実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、抗体の抗原認識能力に基づいて生物学的役割を果たす薬物を調製するために使用することができる。
本発明の一実施形態によれば、キメラ抗原受容体は、膜貫通領域及び細胞内領域を更に含み、膜貫通領域はCD8膜貫通領域を含み、細胞内領域は、ICOS細胞内セグメント、4-1BB、及びCD3ζ鎖を含む。
本発明の一実施形態によれば、ICOS細胞内セグメントのN末端はCD8膜貫通領域のC末端と接続されており、ICOS細胞内セグメントのC末端は4-1BB細胞内セグメントのN末端と接続されており、4-1BB細胞内セグメントのC末端はCD3ζ鎖のN末端と接続されている。本発明者は、キメラ抗原受容体中の免疫刺激因子の膜貫通領域及び細胞内セグメントが上記配列中で接続されており、得られたキメラ抗原受容体がウイルス中で高い発現力価を有しており、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞がCLDN18.2を発現する腫瘍細胞に対して有意な特異的殺滅効果を有しており、非特異的殺滅及び細胞炎症性因子応答が弱かったことを見出した。
本発明の一実施形態によれば、キメラ抗原受容体の構造は、シグナルペプチド-抗クローディン18.2 scfv-CD8ヒンジ+CD8TM-ICOS-4-1BB-CD3ζであり、抗クローディン18.2 scfvのアミノ酸配列を、配列番号23及び配列番号24のうちのいずれか1つに示す。
本発明の一実施形態によれば、キメラ抗原受容体のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号25に示す。
MGVKVLFALICIAVAEA(配列番号25)
MGVKVLFALICIAVAEA(配列番号25)
本発明の一実施形態によれば、キメラ抗原受容体のCD8ヒンジのアミノ酸配列を配列番号26に示す。
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(配列番号26)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(配列番号26)
本発明の一実施形態によれば、キメラ抗原受容体のCD8TMのアミノ酸配列を配列番号27に示す。
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(配列番号27)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(配列番号27)
本発明の一実施形態によれば、キメラ抗原受容体のICOSのアミノ酸配列を配列番号28に示す。
CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL(配列番号28)
CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL(配列番号28)
本発明の一実施形態によれば、キメラ抗原受容体の4-1BBのアミノ酸配列を配列番号29に示す。
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号29)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号29)
本発明の一実施形態によれば、キメラ抗原受容体のCD3ζのアミノ酸配列を配列番号30に示す。
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号30)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号30)
本発明の第3の態様では、本発明は免疫細胞を提供する。本発明の一実施形態によれば、免疫細胞は、本発明の第2の態様において提案したキメラ抗原受容体を発現する。本発明の実施形態による免疫細胞は、in vivo及びin vitroで良好な殺滅効果を有する。
本発明の一実施形態によれば、前述の核酸免疫細胞は、以下の追加の技術的特長を更に含み得る。
本発明の一実施形態によれば、免疫細胞は、Tリンパ球、DC細胞、NK細胞、及びNKTリンパ球のうちの少なくとも1つを含む。本発明の実施形態による免疫細胞は、本発明の第1の態様において提供した抗体又は本発明の第2の態様において提供したキメラ抗原受容体を使用して、標的タンパク質、細胞、組織、臓器等を認識して殺滅し、その後、生物学的機能を行う。
本発明の第4の態様では、本発明は核酸分子を提供する。本発明の一実施形態によれば、核酸分子は、本発明の第1の態様において提供した抗体若しくはその抗原結合断片、又は本発明の第2の態様において提供したキメラ抗原受容体をコードしている。本発明の実施形態による核酸分子によってコードされている抗体又は抗原結合断片は、CLDN18.2を特異的に標的としてそれと結合することができ、高い抗原-結合活性を有する。
本発明の一実施形態によれば、前述の核酸分子は、以下の追加の技術的特長を更に含み得る。
本発明の一実施形態によれば、核酸分子はDNAである。
本発明の第5の態様では、本発明は発現ベクターを提供する。本発明の一実施形態によれば、発現ベクターは、本発明の第4の態様において提供した核酸分子を有する。本発明の実施形態による発現ベクターを適切なレシピエント細胞内に導入した後、これは、調節系の媒介の下で、CLDN18.2を特異的に認識する前述の抗体又はその抗原結合断片の発現を有効に実現することができ、それによって、in vitroでの抗体又は抗原結合断片の大量獲得が実現される。
本発明の一実施形態によれば、前述の核酸分子は、以下の追加の技術的特長を更に含み得る。
本発明の一実施形態によれば、発現ベクターは真核発現ベクター又はウイルスである。好ましくは、ウイルスはレンチウイルスである。本発明の一実施形態によれば、真核発現ベクターはCHO細胞であり得る。
本発明の第6の態様では、本発明は組換え細胞を提供する。本発明の一実施形態によれば、組換え細胞は、本発明の第4の態様において提供した核酸分子又は本発明の第5の態様において提供した発現ベクターを有する。ベクターは、核酸分子によってコードされている、本発明の第1の態様において提供した抗体若しくはその抗原結合断片、又は本発明の第2の態様において提供したキメラ抗原受容体を発現する。本発明の実施形態による組換え細胞は、CLDN18.2を特異的に認識する前述の抗体又は抗原結合断片のin vitro発現及び大量獲得のために使用することができる。
本発明の一実施形態によれば、前述の組換え細胞は、以下の追加の技術的特長のうちの少なくとも1つを更に含み得る。
本発明の一実施形態によれば、組換え細胞は真核細胞であり、任意選択で、組換え細胞は哺乳動物細胞である。本発明の実施形態による組換え細胞は、前述の発現ベクターを宿主細胞内に導入することによって得られ、ベクターは、電気形質導入、リポソーム、注入等の手段によって宿主細胞内に導入することができる。
本発明の第7の態様では、本発明は医薬組成物を提供する。本発明の一実施形態によれば、医薬組成物は、本発明の第1の態様において提供した抗体若しくはその抗原結合断片、本発明の第2の態様において提供したキメラ抗原受容体、本発明の第3の態様において提供した免疫細胞、本発明の第4の態様において提供した核酸分子、本発明の第5の態様において提供した発現ベクター、又は本発明の第6の態様において提供した組換え細胞を含む。本発明の実施形態による医薬組成物中に含有される抗体又は発現された抗体は、CLDN18.2を特異的に標的としてそれと結合することができ、強力な特異性を有しており、良好な標的化効果を発揮し、それによって、CLDN18.2分子の活性阻害、CLDN18.2分子を発現する細胞の殺滅等の医薬組成物中の他の薬物の生物学的効果が実現される。更に、本発明の実施形態による医薬組成物は、診断試薬と組み合わせた本発明の第1の態様において提案されたCLDN18.2を特異的に標的化することができる抗体に頼って、診断的役割を果たし、その後、診断的核種、ナノ材料等と組み合わせること等で生物のCLDN18.2部分の異常発現の診断において役割を果たして、生物中においてCLDN18.2を異常に発現している細胞、組織、及び臓器の視覚的観察を達成し、それによって医療労働者又は科学研究者が病変のより正確な判断を下すことを助けることができる。
本発明の第8の態様では、本発明は、CLDN18.2関連疾患を処置又は防止するための医薬の製造における、前述の抗体若しくはその抗原結合断片、キメラ抗原受容体、免疫細胞、核酸分子、発現ベクター、組換え細胞、及び/又は医薬組成物の使用を提供する。本発明の実施形態の応用によれば、医薬組成物は、胃癌、膵癌、肺癌等のCLDN18.2の異常発現を有する疾患を診断、処置、又は防止するために使用することができる。
本発明の実施形態によれば、上述の使用は、以下の追加の技術的特長のうちの少なくとも1つを更に含み得る。
本発明の一実施形態によれば、CLDN18.2関連疾患は腫瘍を含む。
本発明の一実施形態によれば、腫瘍は、クローディン18.2を発現する固形腫瘍を含む。任意選択で、固形腫瘍は、胃癌、膵癌、食道癌、及び肺癌を含む。
本発明の第8の態様では、本発明は、対象においてCLDN18.2関連疾患を診断、処置、又は防止する方法であって、対象に、治療上有効な量の、前述の抗体若しくはその抗原結合断片、キメラ抗原受容体、免疫細胞、核酸分子、発現ベクター、組換え細胞、及び/又は医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
本発明の一実施形態によれば、CLDN18.2関連疾患は腫瘍を含む。
本発明の一実施形態によれば、腫瘍はCLDN18.2を発現する固形腫瘍を含む。任意選択で、固形腫瘍は、胃癌、膵癌、食道癌、及び肺癌を含む。
本発明の第8の態様では、本発明は、対象においてCLDN18.2関連疾患を診断、処置、又は防止することにおいて使用するための、前述の抗体若しくはその抗原結合断片、キメラ抗原受容体、免疫細胞、核酸分子、発現ベクター、組換え細胞、及び/又は医薬組成物を提供する。
本発明の一実施形態によれば、CLDN18.2関連疾患は腫瘍を含む。
本発明の一実施形態によれば、腫瘍は、クローディン18.2を発現する固形腫瘍を含む。任意選択で、固形腫瘍は、胃癌、膵癌、食道癌、及び肺癌を含む。
本発明の第9の態様では、本発明は、CLDN18.2を検出するためのキットを提供する。本発明の一実施形態によれば、キットは、本発明の第1の態様において提供した抗体を含む。前述のCLDN18.2抗体は、CLDN18.2を特異的に標的としてそれと結合することができる。本発明の実施形態によるキットは、CLDN18.2の特異的検出を達成することができる。たとえば、抗体がフルオロフォアと結合している場合、蛍光検出装置を使用してCLDN18.2の限局化又はリアルタイム検出を実現することができ、ビオチン及び他のマーカーと結合している場合、CLDN18.2の定性的又は定量的検出を発色試薬によって達成することができ、また、抗体を抗抗体と組み合わせてサンドイッチ又は二重サンドイッチ方法を達成し、その後、シグナルの段階的増幅を達成して、CLDN18.2を検出することもできる。
本発明の第10の態様では、本発明は、CLDN18.2を検出する又はCLDN18.2関連疾患を診断するためのキットの製造における、前述の抗体、前述の核酸分子、前述の発現ベクター、又は前述の組換え細胞の使用を提供する。本発明の実施形態によれば、キットは、高い発現、低い発現、及び発現なし等のCLDN18.2の発現レベルを直接検出し、それによって疾患の診断を実現することができる。これはまた、診断的核種と組み合わせて等、他の診断試薬と組み合わせて、生物、組織、及び細胞の状態を得て、身体内のCLDN18.2を発現する細胞の数、組織の大きさ及び位置等の可視化することができる。
本発明の第10の態様では、本発明は、前述の抗体、前述の核酸分子、前述の発現ベクター、又は前述の組換え細胞を含むキットを使用して、対象においてCLDN18.2を検出する又はCLDN18.2関連疾患を診断する方法を提供する。
本発明の第10の態様では、本発明は、CLDN18.2を検出する又はCLDN18.2関連疾患を診断するためのキットの調製において使用するための、前述の抗体、前述の核酸分子、前述の発現ベクター、又は前述の組換え細胞を提供する。
本発明の第11の態様では、本発明は、CLDN18.2中のペプチドA以外のエピトープを認識することができる抗体のスクリーニングにおける、前述の抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。本発明の実施形態によれば、抗体と抗原のペプチドAのエピトープとは、密に組み合わさって複合体を形成する。このとき、本発明の抗体は抗原のペプチドAのエピトープを遮断し、これは抗体のスクリーニングに使用することができる。スクリーニングした抗体は、抗原のペプチドA以外のエピトープと結合することができる。更に、ペプチドAのエピトープと結合する抗体もスクリーニングすることができ、ペプチドAのエピトープと結合するスクリーニングした抗体は、本発明の抗体よりも良好な抗原結合能力を有する。
本発明の第11の態様では、本発明は、抗体をスクリーニングする方法であって、前述の抗体又はその抗原結合断片を使用することを含み、抗体は、CLDN18.2中のペプチドA以外のエピトープを認識する、方法を提供する。
本発明の第11の態様では、本発明は、抗体のスクリーニングにおいて使用するための、前述の抗体又はその抗原結合断片であって、抗体は、CLDN18.2中のペプチドA以外のエピトープを認識する、抗体又はその抗原結合断片を提供する。
本発明の追加の態様及び利点を以下の説明中に部分的に与え、一部は、以下の説明から明白となる、又は本発明の実施を通じて理解されるであろう。
本発明の上記及び/又は追加の態様及び利点は、実施形態の説明から以下の図面と併せて、明白かつ理解が容易となるであろう。
例
本発明の実施形態を以下に詳述する。実施形態の例を添付の図面に示し、同じ又は類似の参照番号は、同じ若しくは類似の要素又は同じ若しくは類似の機能を有する要素を示す。添付の図面を参照して以下に記載する実施形態は例示的であり、本発明を説明することを意図し、本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。
本発明の実施形態を以下に詳述する。実施形態の例を添付の図面に示し、同じ又は類似の参照番号は、同じ若しくは類似の要素又は同じ若しくは類似の機能を有する要素を示す。添付の図面を参照して以下に記載する実施形態は例示的であり、本発明を説明することを意図し、本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。
更に、用語「第1の」及び「第2の」は説明目的でのみ使用し、相対的な重要性を示す若しくは暗示する、又は示した技術的特長の数を暗黙的に示すとして理解してはならない。したがって、「第1の」及び「第2の」を用いて定義した特長は、特長のうちの少なくとも1つを明示的又は暗示的に含み得る。本発明の説明中において、「複数」とは、そうではないと具体的に定義されない限りは、2、3等の少なくとも2つを意味する。
本明細書中において、ADCCとは抗体依存性細胞毒性をいう。IgG抗体がFabセグメントを通じて標的細胞の表面上の抗原決定基と特異的に結合する場合、そのFcセグメントは、FcγRを有するキラー細胞等のエフェクター細胞(NK細胞、単球-マクロファージ、好中球)と結合して、エフェクター細胞の殺滅活性を始動させ、標的細胞を直接殺滅することができる。
本明細書中において、CDCとは補体依存性細胞毒性をいい、すなわち、細胞毒性が補体に関与している。特異的抗体は、細胞膜表面上の対応する抗原と結合し、複合体を形成して補体の古典経路を活性化させ、形成された膜浸潤複合体は、標的細胞に対して溶解効果を発揮する。
抗体
本明細書中で使用する用語「抗体」とは、特異的な抗原と結合することができる免疫グロブリン分子である。これは、より軽い分子量を有する2本の軽鎖及びより重い分子量を有する2本の重鎖からなる。重(H)及び軽(L)鎖がジスルフィド結合によって連結されて、テトラペプチド鎖分子を形成する。これらのうち、ペプチド鎖のアミノ末端(N末端)のアミノ酸配列は大きく変動し、可変領域(V領域)と呼ばれる。カルボキシル末端(C末端)は変化が少なく比較的安定しており、定常領域(C領域)と呼ばれる。L及びH鎖のV領域はそれぞれVL及びVHと呼ばれる。
本明細書中で使用する用語「抗体」とは、特異的な抗原と結合することができる免疫グロブリン分子である。これは、より軽い分子量を有する2本の軽鎖及びより重い分子量を有する2本の重鎖からなる。重(H)及び軽(L)鎖がジスルフィド結合によって連結されて、テトラペプチド鎖分子を形成する。これらのうち、ペプチド鎖のアミノ末端(N末端)のアミノ酸配列は大きく変動し、可変領域(V領域)と呼ばれる。カルボキシル末端(C末端)は変化が少なく比較的安定しており、定常領域(C領域)と呼ばれる。L及びH鎖のV領域はそれぞれVL及びVHと呼ばれる。
可変領域中の一部の領域は、アミノ酸の組成及び配置順序においてより高い度合の変化を有する。これらは超可変領域(HVR)と呼ばれる。超可変領域は抗原と抗体が結合する場所であるため、これらは相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる。重及び軽鎖可変領域のどちらにも3つのCDRが存在する。
本発明では、hクローディン18.2の完全長遺伝子を含有するpCDNA3.4プラスミドを使用してCLDN18.2遺伝子ノックアウトC57マウスを免疫化し、異なる親和性及び結合エピトープを有する2つの抗CLDN18.2ネズミ抗体を、ハイブリドーマ融合技術を通じてスクリーニングした。抗体断片はCLDN18.2抗原と特異的に結合することができ、これは腫瘍等のCLDN18.2を異常に発現する疾患の処置を標的とすることができる。
一部の実施形態では、本発明は、CLDN18.2を特異的に認識することができる抗体又は抗原結合断片であって、配列番号1~3、配列番号7~9に示す軽鎖可変領域のCDR配列、配列番号4~6、配列番号10~12に示す重鎖可変領域のCDR配列から選択される少なくとも1つのCDR配列、又はそれと少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。他の実施形態では、本発明によって提供される抗体又は抗原結合断片は、上記重及び軽鎖と比較して保存的アミノ酸置換を有する。「抗原結合断片」とは、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体断片をいう(ROR2)。抗原結合断片の例としては、それだけには限定されないが、Fv断片、ジスルフィド結合安定化Fv断片(dsFv)、Fab断片、(Fab)2、scFv-Fc融合タンパク質、scFv-Fv融合タンパク質、Fv-Fc融合タンパク質、また、多特異性抗体、単一ドメイン抗体、VHHナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原結合断片から形成された最小認識単位のうちの少なくとも1つが挙げられる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸の、別のアミノ酸と生物学的、化学的、又は構造的に類似である残基を用いた置換えをいう。生物学的に類似とは、置換がCLDN18.2抗体又はCLDN18.2抗原の生物活性を破壊しないことを意味する。構造的類似度とは、アラニン、グリシン、若しくはセリン等のアミノ酸の類似の長さを有する側鎖、又は類似の大きさの側鎖をいう。化学的類似度とは、アミノ酸が同じ電荷を有する、又はどちらも親水性若しくは疎水性であることを意味する。たとえば、疎水性残基であるイソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンは互いに置換される。或いは、極性アミノ酸を使用することができる。たとえば、リジンをアルギニンで置換すること、アスパラギン酸をグルタミン酸で置換すること、アスパラギンをグルタミンで置換すること、スレオニンをセリンで置換すること等である。
一部の実施形態では、本発明は、配列番号17及び配列番号18のうちのいずれか1つに示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号15及び配列番号16のうちのいずれか1つに示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体又は抗原結合断片を提供する。本発明者らは、抗体配列アラインメントデータベース(NCBI、IMGT)又は関連ソフトウェアを通じて、上述の抗重鎖可変領域配列のCDR領域(配列番号4~6、配列番号10~12に示す)及び軽鎖可変領域配列のCDR領域(配列番号1~3、配列番号7~9に示す)を得ることができる。他の実施形態では、抗体又は抗原結合断片の重鎖可変領域配列は、配列番号17及び配列番号18に示すアミノ酸配列と比較して保存的アミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、抗体又は抗原結合断片の軽鎖可変領域配列は、配列番号15及び配列番号16のうちのいずれか1つに示すアミノ酸配列と比較して保存的アミノ酸置換を有する。もちろん、これらの保存的アミノ酸置換は、抗体又は抗原結合断片の生物学的機能を変化させない。一部の具体的な方法では、これらの保存的アミノ酸置換は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のCDR領域以外のアミノ酸で起こる場合がある。
本発明では、用語「m1B6」及び「m1E7」は、重及び軽鎖を含有するネズミ抗体として理解することができ、用語「1B6」及び「1E7」は、VH-リンカー-VLによって形成される単鎖抗体として理解することができる。用語「キメラ抗体1B6」及び「キメラ抗体1E7」は、ネズミ抗体m1B6及びm1E7の可変領域を保持し、定常領域をヒトIgG1で置き換えたキメラ抗体として理解することができる。
一部の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号21~22、配列番号31、配列番号33のうちのいずれか1つに示すアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号19~20、配列番号32、配列番号34のうちのいずれか1つに示すアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗CLDN18.2抗体を提供する。
一部の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号23~24に示すアミノ酸配列を有する抗CLDN18.2単鎖抗体を提供する。本発明の実施形態の単鎖抗体は、N末端からC末端にVL-リンカー-VHの構造を有する。VLは軽鎖可変領域を表し、VHは重鎖可変領域を表し、リンカーはVLとVHを接続する連結鎖を表す。
一部の実施形態では、本出願の抗CLDN18.2抗体は、低いEC50及びIC50値を伴う高いADCC活性及びCDC活性を有しており、これは標的細胞に対して有効に作用することができる。
一部の実施形態では、本出願の抗CLDN18.2抗体は、マウスモデルにおいて腫瘍成長を有効に阻害することができ、体重等の、マウスの他の物理的指標に影響を与えない。本出願の抗体は良好な抗腫瘍効果を有しており、副作用がより少ない。
免疫細胞、キメラ抗原受容体
用語「キメラ抗原受容体(CAR)」とは、所望の抗原(たとえば腫瘍抗原)に対する抗体に基づく特異性をT細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせて、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生じる分子である。
用語「キメラ抗原受容体(CAR)」とは、所望の抗原(たとえば腫瘍抗原)に対する抗体に基づく特異性をT細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせて、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生じる分子である。
CLDN18.2を特異的に認識することができる抗体又はその抗原結合断片を使用して、免疫細胞又はキメラ抗原受容体を調製することができる。
この目的を達成するために、本発明は、細胞外領域を含むキメラ抗原受容体であって、細胞外領域は単鎖抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、キメラ抗原受容体も提供する。ここで、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、CLDN18.2を特異的に認識することができる前述の抗体又はその抗原結合断片から選択される。単鎖抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に加えて、細胞外領域は、単鎖可変断片を支持するヒンジ領域も含む。
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体中の可変重及び軽鎖は短いペプチドによって一緒に連結されている。細胞外領域に加えて、キメラ抗原受容体は膜貫通領域及び細胞内領域を更に含む。これらの領域は、抗原認識のための細胞内シグナルカスケードを開始させることができる。
一部の実施形態では、細胞内領域は、CD3ζ、FcεRIγ、CD27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD40細胞内シグナル領域配列、若しくはその組合せから選択される、又は、膜貫通領域はCD8若しくはCD28膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、以下の順序で接続された抗体、膜貫通領域、及び細胞内領域を含む:本発明の抗体、CD8、及びCD3ζ;本発明の抗体、CD8、CD137、及びCD3ζ;若しくは本発明の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域、及びCD3ζ;又は本発明の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域、CD137、及びCD3ζ。
一部の実施形態では、膜貫通領域は、免疫共刺激因子膜貫通領域を含む。一部の実施形態では、免疫共刺激因子膜貫通領域は、更にCD8膜貫通領域又はICOS膜貫通領域であり得る。
一部の実施形態では、細胞内領域は、免疫刺激因子の細胞内セグメント及びCD3ζ鎖を含む。
一部の実施形態では、免疫刺激因子の細胞内セグメントは、CD3ζ配列に由来する細胞内シグナル伝達ドメインと融合したICOS又は4-IBB又はOX-40を更に含む。
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、単鎖単一ベクター(レトロウイルスベクター等)又は二本鎖単一ベクター(レトロウイルスベクター等)上でCD3ζ内部ドメインを用いて融合された2つの共刺激分子を更に含む。切断された二本鎖の単一ベクターは2本の鎖を発現し、そのうちの1本が、共刺激分子及びCD3ζ内部ドメインと融合したscFvを含有する。
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、サイトカイン受容体及び化学走性受容体を更に含む。
上述のキメラ抗原受容体が免疫細胞を調製することができるという事実に基づいて、免疫細胞は上述のキメラ抗原受容体を発現することができる。
一部の実施形態では、免疫細胞は、Tリンパ球、DC細胞、NK細胞、及びNKTリンパ球のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、表面上にCLDN18.2を有する癌細胞を特異的に殺滅することができ、in vivo及びin vitroで良好な殺滅効果を有する。
CARを発現するT細胞は、CAR T細胞又はCAR修飾T細胞と呼ばれる。
本発明の実施形態のCAR(その機能的部分及び機能的変異体を含む)は、当分野で知られている方法によって得ることができる。CARは、ポリペプチド又はタンパク質を調製するための任意の適切な方法によって調製することができる。ポリペプチド及びタンパク質の新規合成のための適切な方法は、Chanら、Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis、Oxford University Press、英国Oxford、2000、Peptide and Protein Drug Analysis、Reid, R.編、Marcel Dekker Inc.、2000、Epitope Mapping、Westwoodら編、Oxford University Press、英国Oxford、2001、及び米国特許第5,449,752号等の参考文献中に記載されている。更に、ポリペプチド及びタンパク質は、本明細書中に記載の核酸を使用して、標準の組換え方法を使用して組換え生成することができる。たとえば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Press、ニューヨーク州Cold Spring Harbor、2001及びAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons、ニューヨーク、1994を参照されたい。更に、本発明の一部のCAR(機能的部分及び機能的変異体を含む)は、植物、細菌、昆虫、哺乳動物、たとえばラット、ヒト等の供給源から単離及び/又は精製することができる。分離及び精製方法は当分野で周知である。或いは、本明細書中に記載のCAR(その機能的部分及び機能的変異体を含む)は、Synpep社(カリフォルニア州Dublin)、Peptide Technologies Corp.社(メリーランド州Gaithersburg)、及びMultiple Peptide Systems社(カリフォルニア州San Diego)等の会社によって商業的に合成することができる。この観点から、本発明のCARを、合成、組換え、単離、及び/又は精製することができる。
一部の実施形態では、免疫細胞は、外因性サイトカインのコード配列も有する、又は、これは、CD3ζを含有しないが、CD28の細胞内シグナルドメイン、CD137の細胞内シグナルドメイン、若しくは両者の組合せを含有する別のキメラ抗原受容体も発現する、又は、これは、ケモカイン受容体も発現し、好ましくは、ケモカイン受容体はCCRを含む、又は、これは、PD-1発現若しくはPD-L1を遮断するタンパク質を低下させることができるsiRNAも発現する、又は、細胞中の内在性PD-1が遺伝子編集技術によってノックアウトされている、又は、これは、安全性スイッチも発現する。
本発明の別の態様では、本発明は、本発明の抗体及びそれと連結された機能的分子を含む多機能性免疫コンジュゲートであって、機能的分子は、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を阻害する分子、免疫細胞の表面マーカー又は検出可能なマーカーを標的とする分子から選択される、機能性免疫コンジュゲートも提供する。一部の実施形態では、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子は、T細胞の表面マーカーと結合する抗体であり、これは、T細胞の参加と本発明の抗体が関与している二官能性抗体を形成する。
本明細書中で使用する用語「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによってそれだけには限定されないが増殖等の共刺激応答を媒介する、T細胞等の免疫細胞上の相同的結合パートナーをいう。共刺激分子は、有効な免疫応答を促進する、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、それだけには限定されないが、MHC I分子、BTLA及びTollリガンド受容体、並びにOX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4-1BB(CD137)が挙げられる。共刺激分子の例としては、それだけには限定されないが、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19が挙げられる。
用語「scFv」とは、軽鎖を含む少なくとも1つの可変領域抗体断片及び重鎖を含む少なくとも1つの可変領域抗体断片を含む、融合タンパク質をいい、軽鎖及び重鎖可変領域は連続的であり(たとえば、短い柔軟なポリペプチドリンカー等の合成リンカーを介して)、単鎖ポリペプチドとして発現させることができ、scFvは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持している。指定しない限りは、本明細書中で使用するscFvは、VL及びVH可変領域を任意の順序で有していてよく(たとえばポリペプチドのN末端及びC末端に対して)、scFvはVL-リンカー-VHを含み得る、又はVH-リンカー-VLを含み得る。
本明細書中で使用する用語「エピトープ」及び他の文法的形態とは、抗体、B細胞、T細胞、又は操作した細胞によって認識され得る抗原の一部をいうことができる。たとえば、エピトープは、TCRによって認識される腫瘍エピトープ若しくは病原体エピトープであり得る、又は、これは、1つの抗原中の複数のエピトープを認識することができる。エピトープは、突然変異させることもできる。
核酸分子、発現ベクター、組換え細胞
これらの抗体又はキメラ抗原受容体を調製する又は得る過程において、これらの抗体又はキメラ抗原受容体を発現する核酸分子を様々なベクターと連結させ、様々な細胞中で発現させて、対応する抗体又はキメラ抗原受容体を得ることができる。
これらの抗体又はキメラ抗原受容体を調製する又は得る過程において、これらの抗体又はキメラ抗原受容体を発現する核酸分子を様々なベクターと連結させ、様々な細胞中で発現させて、対応する抗体又はキメラ抗原受容体を得ることができる。
この目的を達成するために、本発明は、前述の抗体若しくはその抗原結合断片又はキメラ抗原受容体をコードしている単離した核酸分子も提供する。
一部の好ましい実施形態では、核酸分子は、哺乳動物細胞中における発現をより容易にするために、種に最適化されている。
本発明は、前述の単離した核酸分子を含む発現ベクターも提供する。単離したポリヌクレオチドがベクターと接続されている場合、ポリヌクレオチドは、制御要素がポリヌクレオチドの翻訳及び発現を制御することができる限りは、ベクター上の制御要素と直接又は間接的に接続させることができる。もちろん、これらの制御要素は、担体自体から直接来る、又は外因性である、すなわち担体自体からではないことができる。もちろん、ポリヌクレオチドは、制御要素と作動可能に連結させることができる。ここで、「作動可能に連結した」とは、転写制御配列及び翻訳制御配列等のベクター中の制御要素が、外因性遺伝子の転写及び翻訳を調節するというその予想される機能を行うことができるような、外因性遺伝子とベクターとの接続をいう。もちろん、抗体の重鎖及び軽鎖をコードするために使用するポリヌクレオチドを様々なベクター内に独立して挿入することができ、同じベクター内に挿入することが一般的である。一般的に使用されるベクターは、たとえば、プラスミド、バクテリオファージ等であり得る。
本発明は、発現ベクターを含有する組換え細胞も提供する。発現ベクターを哺乳動物細胞内に導入して組換え細胞を構築し、その後、これらの組換え細胞を使用して、本発明によって提供される抗体又は抗原結合断片を発現させることができる。組換え細胞を培養することによって、対応する抗体を得ることができる。これらの使用可能な哺乳動物細胞は、たとえばCHO細胞であり得る。
医薬組成物、キット、及び医薬的使用、並びにキットの調製における使用
本発明は、上述の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される担体を含み、上述のキメラ抗原受容体、免疫細胞、核酸分子、発現ベクター、組換え細胞も含み得る、医薬組成物も提供する。
本発明は、上述の抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容される担体を含み、上述のキメラ抗原受容体、免疫細胞、核酸分子、発現ベクター、組換え細胞も含み得る、医薬組成物も提供する。
本明細書中において提供するCLDN18.2抗体は、対象への投与に適した医薬組成物内に取り込ませることができる。一般に、これらの医薬組成物は、本明細書中において提供するCLDN18.2抗体を含む。
一部の実施形態では、これらの医薬組成物は、特異的標的剤形に適切な、任意の溶媒、固体賦形剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、若しくは他の液体賦形剤、分散剤、香味料若しくは懸濁剤、界面活性剤、等張化剤、シックナー、乳化剤、保存料、固体結合剤、流動促進剤、又は潤滑剤等を含む薬学的に許容される担体を更に含む。任意の望ましくない生物学的効果を生じる、又は他の様式で薬学的に許容される組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することによって等、本明細書中に開示した化合物と不適合である任意の慣用の賦形剤でない限りは、その使用が本発明の範囲内にあることが企図される。
たとえば、本発明の抗体は、非経口投与(たとえば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)に適切な医薬組成物内に取り込ませることができる。これらの医薬組成物は、様々な形態で調製することができる。たとえば、それだけには限定されないが、液体溶液(たとえば注射溶液及び輸液溶液)、分散体又は懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソーム、並びに坐薬を含む、液体、半固体、及び固体剤形である。典型的な医薬組成物は注射溶液又は輸液溶液の形態である。抗体は、静脈輸液若しくは注射、又は筋肉内若しくは皮下注射によって投与することができる。
もちろん、本明細書中におけるCLDN18.2抗体は、必要に応じてキット又は他の診断試薬の一部とすることもできる。本発明の一実施形態によれば、本発明は、上述のCLDN18.2抗体を含むキットも提供する。本発明によって提供されるキットは、たとえば、免疫ブロッティング、免疫沈降等のために使用することができ、これは、CLDN18.2抗原と検出する抗体との特異的結合特性の使用を含む。これらのキットは、拮抗剤、CLDN18.2抗体、若しくは薬物参照物質、タンパク質精製カラム、免疫グロブリン親和性精製緩衝液、細胞アッセイ希釈剤、指示書、又は文献等のうちの、任意の1つ又は複数を含有し得る。CLDN18.2抗体は、様々な種類の診断的試験において使用することができ、たとえば、これは、様々な疾患若しくは薬物、毒素、又は他のタンパク質の存在をin vitro又はin vivoで検出することができる。たとえば、対象の血清又は血液を、関連する疾患について試験することができる。癌又は腫瘍等、これらの癌又は腫瘍は、任意の非制御の細胞成長であり得る。
一部の実施形態では、CLDN18.2抗体は、任意の検出試薬又は治療剤と組み合わせて、たとえば診断的核種、ナノ材料等と組み合わせて使用して、標的部位に関する情報を得るために、核種の放射活性を通じて標的部位を検出するために使用することができる。これはまた、核種の放射活性を使用して標的細胞、組織等を特異的に殺滅するために、治療的核種と組み合わせて使用することもできる。
上述の疾患を診断又は処置又は防止するために本発明によって提供されるCLDN18.2抗体を使用する場合、本発明によって提供されるCLDN18.2抗体を対象に提供することができる。この目的を達成するために、本発明は、上述の疾患を処置する方法であって、本発明によって提供される抗体又はその抗原結合断片を、必要としている対象に投与する工程を含む方法を提供する。
本明細書中で使用する用語「処置」及び「防止」、並びにそれらに由来する言葉は、必ずしも100%又は完全な処置又は防止を暗示しない。むしろ、様々な度合の処置又は防止が存在し、当業者は、処置又は防止が潜在的な利点又は治療効果を有すると考えている。この観点から、本発明の方法は、哺乳動物において癌の任意の量の任意のレベルの処置又は防止を提供することができる。更に、本発明の方法によって提供される処置又は防止は、癌の1つ又は複数の疾患又は症状の処置又は防止等、処置又は防止している疾患の処置又は防止を含み得る。更に、本文書の目的のために、「防止」は、疾患又はその症状又は患者の発症の遅延を包含することができる。
本発明を、具体的な実施形態を参照して以下に説明する。これらの実施形態は説明的のみであり、いかなる様式でも本発明を制限しないことに注意されたい。具体的な技術又は条件が実施例中に示されていない場合は、当分野の文献又は製品説明中に記載されている技術又は条件を行う。使用した試薬又は装置が製造者によって指定されていない場合、これらはすべて、市販されている慣用の製品である。
抗クローディン18.2のモノクローナルスクリーニング及び活性同定
1.1 抗クローディン18.2モノクローナル抗体のスクリーニング:
マウス免疫及びハイブリドーマのスクリーニング:
クローディン18.2遺伝子ノックアウトを有するC57マウスを、hクローディン18.2の完全長遺伝子を含有するpCDNA3.4プラスミドで免疫化した。それぞれのマウスを、60μgのプラスミドを用いて筋肉内注射によって免疫化し、合計10匹のマウスを免疫化した。免疫化間隔は2週間であった。血液を7日目に、3回のプラスミド免疫化後に収集し、血清を100倍希釈した。高発現のhクローディン18.2を有する293T細胞を使用してマウスの免疫応答を検出した。明白な免疫応答を有するマウスを。高発現のhクローディン18.2を有する293T細胞を使用することによる尾部静脈又は腹腔内インパルス免疫化のために選択し(図1)、それぞれのマウスの接種量は1E+07個の細胞であった。3~4日後、マウス脾臓を採取し、70μmメッシュを用いて粉砕し、その後、PEGによってSP2/0細胞と融合し、播種し、高発現のhクローディン18.2を有するCHO細胞をハイブリドーマスクリーニングのために使用した。
1.1 抗クローディン18.2モノクローナル抗体のスクリーニング:
マウス免疫及びハイブリドーマのスクリーニング:
クローディン18.2遺伝子ノックアウトを有するC57マウスを、hクローディン18.2の完全長遺伝子を含有するpCDNA3.4プラスミドで免疫化した。それぞれのマウスを、60μgのプラスミドを用いて筋肉内注射によって免疫化し、合計10匹のマウスを免疫化した。免疫化間隔は2週間であった。血液を7日目に、3回のプラスミド免疫化後に収集し、血清を100倍希釈した。高発現のhクローディン18.2を有する293T細胞を使用してマウスの免疫応答を検出した。明白な免疫応答を有するマウスを。高発現のhクローディン18.2を有する293T細胞を使用することによる尾部静脈又は腹腔内インパルス免疫化のために選択し(図1)、それぞれのマウスの接種量は1E+07個の細胞であった。3~4日後、マウス脾臓を採取し、70μmメッシュを用いて粉砕し、その後、PEGによってSP2/0細胞と融合し、播種し、高発現のhクローディン18.2を有するCHO細胞をハイブリドーマスクリーニングのために使用した。
1.2 高発現のhクローディン18.2及びhクローディン18.1-CHOを有する細胞系の調製:
高発現のhクローディン18.2-CHO及びhクローディン18.1-CHOを有する細胞系をそれぞれ、それぞれ約5E+06個の細胞で収集し、細胞生存度は95%を超えていた。細胞を500gで3分間の遠心分離によって収集し、等体積の事前に冷却した1%のBSAを含有するPBSで洗浄し、3回遠心分離し、その後、事前に冷却した1%のBSAを含有するPBS中に、1E+07個の細胞/mLの密度で再懸濁させた。それぞれの種類の細胞を、4つのフロー検出チューブ内に、100μL/チューブの量で分割した。
高発現のhクローディン18.2-CHO及びhクローディン18.1-CHOを有する細胞系をそれぞれ、それぞれ約5E+06個の細胞で収集し、細胞生存度は95%を超えていた。細胞を500gで3分間の遠心分離によって収集し、等体積の事前に冷却した1%のBSAを含有するPBSで洗浄し、3回遠心分離し、その後、事前に冷却した1%のBSAを含有するPBS中に、1E+07個の細胞/mLの密度で再懸濁させた。それぞれの種類の細胞を、4つのフロー検出チューブ内に、100μL/チューブの量で分割した。
1.3 m1B6/m1E7抗クローディン18.2モノクローナルハイブリドーマ上清の処理:
2つのアリコート分割した細胞を、hクローディン18.2-CHO-NC、hクローディン18.2-CHO-マウス二次抗体、hクローディン18.2-CHO-m1B6、hクローディン18.2-CHO-m1E7として付番した。100μLの事前に冷却した1%のBSAを含有するPBSを、NCによって付番した試料及びマウス二次抗体に加え、十分に混合した。100μLの対応するm1B6/m1E7モノクローナルハイブリドーマ細胞系上清を、m1B6/m1E7ラベルに対応するフローチューブに加え、十分に混合した。すべての試料を4℃で30分間反応させた後、細胞を500gで3分間の遠心分離によって収集し、等体積の事前に冷却した1%のBSAを含有するPBSで洗浄し、3回遠心分離し、その後、後に使用するために細胞を収集した。
2つのアリコート分割した細胞を、hクローディン18.2-CHO-NC、hクローディン18.2-CHO-マウス二次抗体、hクローディン18.2-CHO-m1B6、hクローディン18.2-CHO-m1E7として付番した。100μLの事前に冷却した1%のBSAを含有するPBSを、NCによって付番した試料及びマウス二次抗体に加え、十分に混合した。100μLの対応するm1B6/m1E7モノクローナルハイブリドーマ細胞系上清を、m1B6/m1E7ラベルに対応するフローチューブに加え、十分に混合した。すべての試料を4℃で30分間反応させた後、細胞を500gで3分間の遠心分離によって収集し、等体積の事前に冷却した1%のBSAを含有するPBSで洗浄し、3回遠心分離し、その後、後に使用するために細胞を収集した。
マウス二次抗体希釈液の調製:PE標識したGAM-IgG-PE標識(ab97024)を、事前に冷却した1%のBSAを含有するPBSを用いて、1:500の比で、合計2mLで希釈した。混合物を完全に混合し、後に使用するために4℃で保管した。希釈したマウス二次抗体希釈液hクローディン18.2-CHO-マウス二次抗体、hクローディン18.2-CHO-m1B6、hクローディン18.2-CHO-m1E7を、200μL/チューブの量に従って採取した。hクローディン18.1-CHO-マウス二次抗体、hクローディン18.1-CHO-m1B6、及びhクローディン18.1-CHO-m1E7で処理した細胞を再懸濁させた。hクローディン18.2-CHO-NC及びhクローディン18.1-CHO-NCに200μLの事前に冷却した1%のBSAを含有するPBSを加えて細胞を再懸濁させた後、すべての処理した試料を4℃で30分間、静的に反応させ、その後、細胞を遠心分離によって、500gで3分間毎に収集し、等体積の事前に冷却した1%のBSAを含有するPBSで洗浄し、3回遠心分離し、その後、後に使用するために収集した。
1.4 フロー検出:
hクローディン18.2-CHO-NC及びhクローディン18.1-CHO-NC試料を使用してフロー電位を確認した。hクローディン18.2-CHO-マウス二次抗体及びhクローディン18.1-CHO-マウス二次抗体試料を使用して陰性検出値を確認した。hクローディン18.2-CHO-m1B6及びhクローディン18.2-CHO-m1E7を検出するための確立されたフロー鋳型。hクローディン18.1-CHO-m1B6及びhクローディン18.1-CHO-m1E7試料のフローサイトメトリー結果により、m1B6/m1E7は非常に良好な特異的応答を有していたことが示され、結果を図2に示す。
hクローディン18.2-CHO-NC及びhクローディン18.1-CHO-NC試料を使用してフロー電位を確認した。hクローディン18.2-CHO-マウス二次抗体及びhクローディン18.1-CHO-マウス二次抗体試料を使用して陰性検出値を確認した。hクローディン18.2-CHO-m1B6及びhクローディン18.2-CHO-m1E7を検出するための確立されたフロー鋳型。hクローディン18.1-CHO-m1B6及びhクローディン18.1-CHO-m1E7試料のフローサイトメトリー結果により、m1B6/m1E7は非常に良好な特異的応答を有していたことが示され、結果を図2に示す。
抗クローディン18.2m1B6/m1E7モノクローナル抗体の親和性及び特異性検出
抗クローディン18.2m1B6/m1E7腹水の生成及び精製
10匹の雌BALB/cマウスを採り、それぞれに0.5mLのパラフィン油を腹腔内に注射した。10日後に、マウスは後に使用する準備ができていた。10匹のマウスを、それぞれのケージに5匹の2つのケージに分割した。マウス1匹あたり前処理した1B6/1E7モノクローナル細胞系の1E+06個の細胞を、腹腔内に注射した。10~12日後、マウスによって生成された腹水を収集し、後に使用するためにそれぞれの細胞系を約10mLの腹水から収集した。
抗クローディン18.2m1B6/m1E7腹水の生成及び精製
10匹の雌BALB/cマウスを採り、それぞれに0.5mLのパラフィン油を腹腔内に注射した。10日後に、マウスは後に使用する準備ができていた。10匹のマウスを、それぞれのケージに5匹の2つのケージに分割した。マウス1匹あたり前処理した1B6/1E7モノクローナル細胞系の1E+06個の細胞を、腹腔内に注射した。10~12日後、マウスによって生成された腹水を収集し、後に使用するためにそれぞれの細胞系を約10mLの腹水から収集した。
収集した腹水を12000gで10分間遠心分離して上清を収集し、その後、50%の飽和硫酸アンモニウムを加えた。混合物を完全に混合し、30分間、4℃で精緻し、その後、10000gで10分間遠心分離して、沈殿物を収集した。沈殿物を等体積のPBS中に再懸濁させ、0.45μmのフィルター膜を用いて濾過し、使用の準備ができた。
PBSを使用して、タンパク質Aアフィニティークロマトグラフィーカラム(5mLの事前に充填されたカラム)を4mL/分の流速で平衡化した。5カラム体積の平衡化の後、事前に処理したm1B6/m1E7を載せ、4mL/分の速度で精製した。試料を載せた後、PBSを使用して、検出ベースラインが安定するまですすぎを続け、その後、0.1MのpH3.5の酢酸を溶出に使用した。溶出ピークを収集し、1Mのトリス緩衝液を使用して溶出液のpHをpH7.4に調節した。精製後、タンパク質Aクロマトグラフィーカラムを0.1MのNaOH緩衝液で5CV洗浄し、pHが中性となるまでPBSで洗浄し、その後、それぞれの試験のベースラインが安定するまで精製水で洗浄した。タンパク質Aカラムは20%のエタノールを用いて保管した。m1B6/m1E7溶出試料を25kDの透析バッグに移し、後に使用するためにPBS内に透析した。
クローディン18.1細胞を過剰発現するCHO及びクローディン18.2細胞を過剰発現するCHOを調製し、300gで5分間遠心分離し、その後、PBS中に再懸濁させ、このステップを2回繰り返した。最後に、PBSを用いて濃度を3E+06個の細胞/mLに調節した。2つの抗体を2.5μg/mLから2倍勾配で、10勾配を用いて0.005μg/mLまで希釈した。クローディン18.1細胞を過剰発現するCHO及びクローディン18.2細胞を過剰発現するCHOを、それぞれ100μLで透明な96丸底ウェルの2列中に配置し、その後、抗体を順序正しく細胞に加え、1:1で均等に混合した。それぞれをブランクウェル及び陰性ウェルと設定した。混合物を4℃の冷蔵庫に入れ、1時間インキュベートした。インキュベート後、混合物を大容量のベンチトップ高速遠心分離機中、500gで3分間遠心分離した、その後、PBS中に再懸濁させ、このステップを3回繰り返した。PE標識したヤギ抗マウス二次抗体を1:500の濃度まで希釈し、100μLをそれぞれのウェルに加えた。ブランクウェルには何も加えなかった。混合物を4℃の冷蔵庫に入れ、30分間インキュベートした。インキュベート後、混合物を大容量のテーブルトップ高速遠心分離機中、500gで3分間遠心分離した、その後、PBS中に再懸濁させ、このステップを3回繰り返した。最後に、180μLのPBSをそれぞれのウェルに加え、BDverseフローサイトメーターを試験に使用した。m1B6のEC50は約0.06μg/mLであり、m1E7のEC50は約0.1μg/mLであった。これはクローディン18.1と交差反応せず、20μg/mLの濃度はクローディン18.1と交差反応しなかったため、これは良好な特異性を有していた。結果は図3及び図4に示す通りであった。
抗クローディン18.2 scfv-FC融合タンパク質の活性検出
Beijing Qingke Biotechnology Co.、Ltd.社に1B6及び1E7ハイブリドーマ細胞系の配列決定を委託した。抗クローディン18.2 scFv-Fc融合タンパク質の発現ベクターを分子クローニングによって構築した。構築した発現ベクターを293F細胞内に一過的に形質転換させて、抗クローディン18.2 scFv-FC融合タンパク質を発現させた。培地上清を収集し、12000gで10分間遠心分離し、その後、後に使用する準備ができた。タンパク質Aクロマトグラフィーカラムを使用して、タンパク質Aアフィニティークロマトグラフィーカラム(5mLの事前に充填されたカラム)をPBSで、4mL/分の流速で平衡化した。5カラム体積の平衡化の後、事前に処理したm1B6/m1E7(Fc融合タンパク質形態)を載せ、4mL/分の速度で精製した。試料を載せた後、PBSを使用して、検出ベースラインが安定するまですすぎを続け、その後、0.1MのpH3.5の酢酸を溶出に使用した。溶出ピークを収集し、1Mのトリス緩衝液を使用して溶出液のpHをpH7.4に調節した。精製後、タンパク質Aクロマトグラフィーカラムを0.1MのNaOH緩衝液で5CV洗浄し、pHが中性となるまでPBSで洗浄し、その後、それぞれの試験のベースラインが安定するまで精製水で洗浄した。タンパク質Aカラムは20%のエタノールを用いて保管した。1B6/1E7溶出試料を25kDの透析バッグに移し、後に使用するためにPBS内に透析した。
Beijing Qingke Biotechnology Co.、Ltd.社に1B6及び1E7ハイブリドーマ細胞系の配列決定を委託した。抗クローディン18.2 scFv-Fc融合タンパク質の発現ベクターを分子クローニングによって構築した。構築した発現ベクターを293F細胞内に一過的に形質転換させて、抗クローディン18.2 scFv-FC融合タンパク質を発現させた。培地上清を収集し、12000gで10分間遠心分離し、その後、後に使用する準備ができた。タンパク質Aクロマトグラフィーカラムを使用して、タンパク質Aアフィニティークロマトグラフィーカラム(5mLの事前に充填されたカラム)をPBSで、4mL/分の流速で平衡化した。5カラム体積の平衡化の後、事前に処理したm1B6/m1E7(Fc融合タンパク質形態)を載せ、4mL/分の速度で精製した。試料を載せた後、PBSを使用して、検出ベースラインが安定するまですすぎを続け、その後、0.1MのpH3.5の酢酸を溶出に使用した。溶出ピークを収集し、1Mのトリス緩衝液を使用して溶出液のpHをpH7.4に調節した。精製後、タンパク質Aクロマトグラフィーカラムを0.1MのNaOH緩衝液で5CV洗浄し、pHが中性となるまでPBSで洗浄し、その後、それぞれの試験のベースラインが安定するまで精製水で洗浄した。タンパク質Aカラムは20%のエタノールを用いて保管した。1B6/1E7溶出試料を25kDの透析バッグに移し、後に使用するためにPBS内に透析した。
クローディン18.2細胞を過剰発現するCHOを調製し、300gで5分間遠心分離し、その後、PBS中に再懸濁させ、このステップを2回繰り返した。最後に、PBSを用いて濃度を3E+06個の細胞/mLに調節した。3つの抗体、m1B6/m1E7/IMAB362-FCを40μg/mLから4倍勾配で、6勾配を用いて0.04μg/mLまで希釈した。クローディン18.1細胞を過剰発現するCHO及びクローディン18.2細胞を過剰発現するCHOを、それぞれ100μLで透明な96丸底ウェルの2列中に配置し、その後、抗体を順序正しく細胞に加え、1:1で均等に混合した。それぞれをブランクウェル及び陰性ウェルと設定した。混合物を4℃の冷蔵庫に入れ、1時間インキュベートした。インキュベート後、混合物を大容量のベンチトップ高速遠心分離機中、500gで3分間遠心分離した、その後、PBS中に再懸濁させ、このステップを3回繰り返した。PE標識したヤギ抗ヒト二次抗体を1:500の濃度まで希釈し、100μLをそれぞれのウェルに加えた。ブランクウェルには何も加えなかった。混合物を4℃の冷蔵庫に入れ、30分間インキュベートした。インキュベート後、混合物を大容量のテーブルトップ高速遠心分離機中、500gで3分間遠心分離した、その後、PBS中に再懸濁させ、このステップを3回繰り返した。最後に、180μLのPBSをそれぞれのウェルに加え、BDverseフローサイトメーターを試験に使用した。m1B6-FCのEC50は約0.5μg/mLであり、m1E7-FCのEC50は約2.6μg/mLであり、IMAB362-FCのEC50は約2.0μg/mLであった。m1B6はより高い親和性を有しており、m1E7は既存の臨床的抗体と同じ親和性を有していた。結果は図5に示す通りであった。
抗クローディン18.2抗体1B6/1E7のエピトープ同定
hクローディン18.2の様々なペプチドを以下のアミノ酸配列に従って合成した:18.2EL1-A:DQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGC、18.2EL1-B:YQGLWRSCVRESSGFTECRG、18.2EL1-C:CRGYFTLLGLPAmLQAVR、18.2EL1-D:VRESSGFTECRGYFTLLGLP,18.2EL1-E:DLYNNPVTAVFNYQGLWRSC,18.2EL1-F:DQWSTQDLYNNPVTC,18.2EL1-G:AVFNYQGLWRSC,18.2EL1-H:CVRESSGFTE,18.2EL1-I:CRGYFTLLGL。9個の合成ペプチドを水:アセトニトリル=3:1に超音波によって溶かし、溶解後の最終濃度は1mg/mLであった。後に使用するために、それぞれのペプチドを100μL/1.5mLのEPチューブ内に分割した。m1B6を2μg/mLまで合計1mLに希釈し、m1E7mAbを4μg/mLまで合計1mLに希釈し、IMAB362を20μg/mLまで合計1mLに希釈した。希釈した3つの抗クローディン18.2抗体を、アリコート分割したペプチドと、1:1の体積比で十分に混合した。対照群を設定し、希釈したm1B6、m1E7、IMAB362を、PBSと、1:1の体積比で十分に混合した。上述の混合系を4℃の冷蔵庫に30分間入れた。
hクローディン18.2の様々なペプチドを以下のアミノ酸配列に従って合成した:18.2EL1-A:DQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGC、18.2EL1-B:YQGLWRSCVRESSGFTECRG、18.2EL1-C:CRGYFTLLGLPAmLQAVR、18.2EL1-D:VRESSGFTECRGYFTLLGLP,18.2EL1-E:DLYNNPVTAVFNYQGLWRSC,18.2EL1-F:DQWSTQDLYNNPVTC,18.2EL1-G:AVFNYQGLWRSC,18.2EL1-H:CVRESSGFTE,18.2EL1-I:CRGYFTLLGL。9個の合成ペプチドを水:アセトニトリル=3:1に超音波によって溶かし、溶解後の最終濃度は1mg/mLであった。後に使用するために、それぞれのペプチドを100μL/1.5mLのEPチューブ内に分割した。m1B6を2μg/mLまで合計1mLに希釈し、m1E7mAbを4μg/mLまで合計1mLに希釈し、IMAB362を20μg/mLまで合計1mLに希釈した。希釈した3つの抗クローディン18.2抗体を、アリコート分割したペプチドと、1:1の体積比で十分に混合した。対照群を設定し、希釈したm1B6、m1E7、IMAB362を、PBSと、1:1の体積比で十分に混合した。上述の混合系を4℃の冷蔵庫に30分間入れた。
クローディン18.2細胞を過剰発現するCHOを収集し、その後、300gで5分間遠心分離し、等体積のPBSに再懸濁させた。遠心分離及び再懸濁のステップを2回繰り返した。最後に、PBSを用いて濃度を3E+06個の細胞/mLに調節した。100μLの細胞懸濁液(2つのブランク対照ウェル及び1つの陰性対照ウェル)を、透明な96丸底ウェルのそれぞれのウェルに加え、300gで5分間遠心分離して、上清を除去し、後に使用するために細胞ペレットを保存した。
インキュベートした抗体ペプチド混合系を対応する細胞ペレットに加え、細胞と十分に混合し、標識した。その後、混合物を4℃の冷蔵庫に入れ、30分間インキュベートした。インキュベートが終わった後、混合物を300gで5分間遠心分離し、PBS中に再懸濁させた。このステップを3回繰り返した。PE標識したヤギ抗マウス二次抗体を1:500の濃度まで希釈し、100μLをそれぞれのウェルに加えた。ブランクウェルには何も加えなかった。混合物を4℃の冷蔵庫に入れ、30分間インキュベートした。インキュベート後、混合物を300gで5分間遠心分離し、その後、PBS中に再懸濁させ、このステップを3回繰り返した。最後に、180μLのPBSをそれぞれのウェルに加え、BDフローサイトメーターを使用して細胞蛍光強度を検出した。m1B6はペプチドA及びEからなる複合エピトープと結合し、ペプチドAがその支配的エピトープであった。m1E7は、Aペプチドが位置するエピトープとのみ結合した。IMAB362はA、C、及びEペプチドからなる複合エピトープと結合し、ペプチドEがその支配的エピトープであった。結果は図6に示す通りであった。
抗クローディン18.2 CAR-Tのin vitro腫瘍殺滅活性検出
抗クローディン18.2 CAR-T細胞を構築した(m1B6/m1E7/IMAB362)。CAR構造は、シグナルペプチド-抗クローディン18.2 scfv-CD8ヒンジ+CD8TM-ICOS-4-1BB-CD3ζを含む上述の通りであり、抗クローディン18.2 scfvのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示す1B6又は1E7の配列であった。他の構造(シグナルペプチド、CD8ヒンジ等)のアミノ酸配列を配列番号25~30に示す。
抗クローディン18.2 CAR-T細胞を構築した(m1B6/m1E7/IMAB362)。CAR構造は、シグナルペプチド-抗クローディン18.2 scfv-CD8ヒンジ+CD8TM-ICOS-4-1BB-CD3ζを含む上述の通りであり、抗クローディン18.2 scfvのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号23及び配列番号24に示す1B6又は1E7の配列であった。他の構造(シグナルペプチド、CD8ヒンジ等)のアミノ酸配列を配列番号25~30に示す。
293T細胞を6E+06個の細胞/10cmの細胞培養皿の量に従って播種し、後に使用するために終夜、37℃及び5%のCO2で培養した。播種した細胞が95%~99%の集密度に達したかどうかを翌日に観察した。
レンチウイルスパッケージングシステムを表1(Table 1)に従って調製した(それぞれが10cmのパッケージングシステムであり、m1B6/m1E7/IMAB362/GFPレンチウイルスをそれぞれ調製した)。
A/Bを調製した後、チューブAの混合物をチューブBに移した。生じた混合物を穏やかかつ完全に混合し、その後、10~20分間、暗所で静置した。後に使用するために、10%のFBSを含有する9mLのDMEM培地を加え、完全に混合した。
293T細胞(10cmの細胞培養皿)を事前に調製し、培地上清を除去した。対応するA/B混合生成物を対応する細胞培養皿に穏やかに移し、対応するラベルを作製した。37℃及び5%のCO2で6時間培養した後、混合物を、Ficollリンパ球分離溶液によって分離した健康なヒトT細胞を含有する新鮮なT細胞で置き換え、24ウェルプレート中において1E+06個の細胞/ウェルで培養した。同時に、T細胞を刺激するためにCD3/CD28抗体をカップリングした磁気ビーズ(Invitrogen社)を加えた。48時間後、対応するレンチウイルスを加えて感染させた。IL-2(300U/mL)をウイルス感染中に加え、CAR-T細胞を6日目又は7日目まで拡大させてCAR遺伝子発現を検出し、続く実験において使用した。
CAR-T及びエフェクター細胞(H460/18.2-H460)の有効標的比を1:3、1:1、3:1、9:1に設定し、エフェクター細胞を収集し、遠心管中において400gで5分間遠心分離した。上清を廃棄した。生じた混合物を適切な量のPBSで一度洗浄し、遠心分離し、上清を除去し、その後、0.5mLのCTS完全培地を加え、混合物を再懸濁させた。CAR-Tに対応する細胞密度及び陽性率を検出した。後に使用するために、細胞をCTS完全培地で適切な密度に調節した。適切な量の希釈したエフェクター細胞を96ウェルの細胞検出プレートに加え、400gで5分間遠心分離して上清を除去した。様々な密度の100μLのCAR-Tを対応するウェルに加え、細胞を穏やかに再懸濁させ、十分に混合し、その後、100μLのCTSをそれぞれのウェルに加えた。混合物を20時間インキュベートし、その後、以下のように試験した。
20時間インキュベートした後、20μLの溶解緩衝液をVccウェル及びTMRウェルに加え、十分に混合した。混合物を37℃で30分間溶解した。
混合物を400gで5分間、室温で遠心分離し、100μLの上清を96ウェルプレートに移した。試料をサイトカイン放出のためにも採取した。
100μLの作業溶液をそれぞれのウェルに加えた。
混合物を30分間、暗所、室温でインキュベートした。
50μLの停止溶液をそれぞれのウェルに加え、490nmの吸光度を測定した。
比較すると、1B6/1E7によって構築されたCAR-Tがin vitroで明白な殺滅効果を有しており、有意な用量-効果関係を有していたことが見出された。IMAB362によって構築されたCAR-Tと比較して、これはより強力な殺滅効果及びCAR陽性率を有していた。結果は図7及び図8に示す通りであった。
抗クローディン18.2 CAR-T(クローディン18.2 NCI-H460細胞)のin vivo殺滅活性検出
クローディン18.2 NCI-H460細胞及びNCI-H460細胞をRPMI-1640培地(10%のFBSを含有)中で培養し、37℃、5%の二酸化炭素インキュベーター内に入れた。細胞が必要数まで成長した後、細胞を対数増殖期中に採取した。元の培地を廃棄し、混合物を3分間トリプシン処理した。その後、10%のFBSを含有するRPMI-1640培地を用いて消化を停止させ、細胞を収集し、1000rpmで5分間遠心分離した。細胞計数後、無血清RPMI-1640培地及びMatrigelの混合物(1:1の比)を用いて細胞密度を5E+07個の細胞/mLに調節した。固定したNOD/SCID雌マウスを捕らえ、細胞懸濁液をマウスの右背部内に皮下、100μL/マウスで注射した。クローディン18.2 NCI-H460モデルでは、腫瘍が約150mm3まで成長した際に動物に群で投与し、NCI-H460モデルでは、腫瘍が約250mm3まで成長した際に動物に群で投与した。それぞれのモデルを、ビヒクル群、抗クローディン18.2-1B6 CAR-T群の、それぞれ6匹の動物の合計2群へと分割した。抗クローディン18.2-1B6 CAR-T細胞を収集し、PBS溶液を用いて細胞密度を1E+08個の細胞/mLに調節した。細胞懸濁液を腫瘍内に50μL/マウスで注射した。ビヒクル群では、腫瘍にPBS溶液を50μL/マウスで注射した。腫瘍の長さ及び幅を2日に1回又は週に2回測定し、腫瘍体積を計算した(腫瘍体積=腫瘍長さ*腫瘍幅*腫瘍幅/2)。腫瘍成長阻害率(TGI)を計算した。TX>T0である場合、TGI=[1-TX/CX]*100%であり、TX<T0である場合、TGI=[1-(TX-T0)/T0]*100%である。TX及びCXは測定日の腫瘍体積であり、T0及びC0は投与日の腫瘍体積であった。統計分析はSPSS16.0を用いて行った。
クローディン18.2 NCI-H460細胞及びNCI-H460細胞をRPMI-1640培地(10%のFBSを含有)中で培養し、37℃、5%の二酸化炭素インキュベーター内に入れた。細胞が必要数まで成長した後、細胞を対数増殖期中に採取した。元の培地を廃棄し、混合物を3分間トリプシン処理した。その後、10%のFBSを含有するRPMI-1640培地を用いて消化を停止させ、細胞を収集し、1000rpmで5分間遠心分離した。細胞計数後、無血清RPMI-1640培地及びMatrigelの混合物(1:1の比)を用いて細胞密度を5E+07個の細胞/mLに調節した。固定したNOD/SCID雌マウスを捕らえ、細胞懸濁液をマウスの右背部内に皮下、100μL/マウスで注射した。クローディン18.2 NCI-H460モデルでは、腫瘍が約150mm3まで成長した際に動物に群で投与し、NCI-H460モデルでは、腫瘍が約250mm3まで成長した際に動物に群で投与した。それぞれのモデルを、ビヒクル群、抗クローディン18.2-1B6 CAR-T群の、それぞれ6匹の動物の合計2群へと分割した。抗クローディン18.2-1B6 CAR-T細胞を収集し、PBS溶液を用いて細胞密度を1E+08個の細胞/mLに調節した。細胞懸濁液を腫瘍内に50μL/マウスで注射した。ビヒクル群では、腫瘍にPBS溶液を50μL/マウスで注射した。腫瘍の長さ及び幅を2日に1回又は週に2回測定し、腫瘍体積を計算した(腫瘍体積=腫瘍長さ*腫瘍幅*腫瘍幅/2)。腫瘍成長阻害率(TGI)を計算した。TX>T0である場合、TGI=[1-TX/CX]*100%であり、TX<T0である場合、TGI=[1-(TX-T0)/T0]*100%である。TX及びCXは測定日の腫瘍体積であり、T0及びC0は投与日の腫瘍体積であった。統計分析はSPSS16.0を用いて行った。
NOD/SCIDマウスにおけるクローディン18.2 NCI-H460細胞によって確立した移植腫瘍モデルでは、抗クローディン18.2-1B6 CAR-Tは、腫瘍内投与後に腫瘍成長を有意に阻害することができた。実験の終わりに、腫瘍成長阻害率は134.78%に達した。2つの群間の腫瘍体積を統計的に分析し、有意な統計的差異P<0.01が存在した。
NOD/SCIDマウスにおけるNCI-H460細胞によって確立した移植腫瘍モデルでは、抗クローディン18.2-1B6 CAR-Tは、腫瘍内投与後に腫瘍成長を阻害することができなかった。実験の終わりに、腫瘍成長阻害率は2.17%であった。2つの群間の腫瘍体積を統計的に分析し、統計的差異は存在しなかった。結果は図9に示す通りであった。
抗クローディン18.2 CAR-T(クローディン18.2 Calu-6細胞)のin vivo殺滅活性検出
クローディン18.2 Calu-6細胞をRPMI-1640培地(10%のFBSを含有)中で培養し、37℃、5%の二酸化炭素インキュベーター内に入れた。細胞が必要数まで成長した後、細胞を対数増殖期中に採取した。元の培地を廃棄し、混合物を3分間トリプシン処理した。その後、10%のFBSを含有するRPMI-1640培地を用いて消化を停止させ、細胞を収集し、1000rpmで5分間遠心分離した。細胞計数後、無血清RPMI-1640培地及びMatrigelの混合物(1:1の比)を用いて細胞密度を2.5E+07個の細胞/mLに調節した。固定したNCG雌マウスを捕らえ、細胞懸濁液をマウスの右背部内に皮下、100μL/マウスで注射した。腫瘍が約150mm3まで成長した際に、動物に群で投与した。実験を、ビヒクル群、T細胞群、クローディン18.2 CAR-T(1B6)群の、それぞれ8匹の動物の合計3群へと分割した。クローディン18.2 CAR-T(1B6)細胞及びT細胞を収集し、PBS溶液を用いて細胞密度を1E+08個の細胞/mLに調節した。細胞懸濁液を尾部静脈内に200μL/マウスで注射した。ビヒクル群では、PBS溶液を静脈内で尾部静脈中に200μL/マウスで注射した。腫瘍の長さ及び幅を週に2回測定し、腫瘍体積を計算した(腫瘍体積=腫瘍長さ*腫瘍幅*腫瘍幅/2)。腫瘍成長阻害率(TGI)を計算した。TX>T0である場合、TGI=[1-TX/CX]*100%であり、TX<T0である場合、TGI=[1-(TX-T0)/T0]*100%である。TX及びCXは測定日の腫瘍体積であり、T0及びC0は投与日の腫瘍体積であった。統計分析はSPSS16.0を用いて行った。
クローディン18.2 Calu-6細胞をRPMI-1640培地(10%のFBSを含有)中で培養し、37℃、5%の二酸化炭素インキュベーター内に入れた。細胞が必要数まで成長した後、細胞を対数増殖期中に採取した。元の培地を廃棄し、混合物を3分間トリプシン処理した。その後、10%のFBSを含有するRPMI-1640培地を用いて消化を停止させ、細胞を収集し、1000rpmで5分間遠心分離した。細胞計数後、無血清RPMI-1640培地及びMatrigelの混合物(1:1の比)を用いて細胞密度を2.5E+07個の細胞/mLに調節した。固定したNCG雌マウスを捕らえ、細胞懸濁液をマウスの右背部内に皮下、100μL/マウスで注射した。腫瘍が約150mm3まで成長した際に、動物に群で投与した。実験を、ビヒクル群、T細胞群、クローディン18.2 CAR-T(1B6)群の、それぞれ8匹の動物の合計3群へと分割した。クローディン18.2 CAR-T(1B6)細胞及びT細胞を収集し、PBS溶液を用いて細胞密度を1E+08個の細胞/mLに調節した。細胞懸濁液を尾部静脈内に200μL/マウスで注射した。ビヒクル群では、PBS溶液を静脈内で尾部静脈中に200μL/マウスで注射した。腫瘍の長さ及び幅を週に2回測定し、腫瘍体積を計算した(腫瘍体積=腫瘍長さ*腫瘍幅*腫瘍幅/2)。腫瘍成長阻害率(TGI)を計算した。TX>T0である場合、TGI=[1-TX/CX]*100%であり、TX<T0である場合、TGI=[1-(TX-T0)/T0]*100%である。TX及びCXは測定日の腫瘍体積であり、T0及びC0は投与日の腫瘍体積であった。統計分析はSPSS16.0を用いて行った。
NCGマウスにおけるクローディン18.2 Calu-6細胞によって確立した移植腫瘍モデルでは、クローディン18.2 CAR-T(1B6)は、腫瘍内投与後に腫瘍成長を有意に阻害することができた。実験の終わりに、腫瘍成長阻害率は106.56%であった。クローディン18.2 CAR-T(1B6)群、ビヒクル群、及びT細胞群を統計的に分析し、有意な統計的差異P<0.01が存在した。結果は図10に示す通りであった。
抗クローディン18.2キメラ抗体のADCC活性検出
本実施例では、CD16受容体及びNFAT(活性化T細胞核内因子)反応要素を安定に形質移入したジャーカット-NFAT-Luc-CD16ルシフェラーゼレポーター遺伝子細胞系を使用した。試験抗体(キメラ抗体1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362のFab断片が、標的細胞BXPC-3-クローディン18.2、Capan-1-クローディン18.2、及びSK-GT-クローディン18.2上の抗原と結合した際、抗体のFcセグメントがエフェクター細胞ジャーカット-NFAT-ルシフェラーゼ-CD16細胞の表面(FcγRIIIA)に結合し、ジャーカット-NFAT-ルシフェラーゼ-CD16細胞中においてNFAT関連シグナル伝達経路の活性化を引き起こし、これが立ち代わってルシフェラーゼ発現レベルの増加をもたらした。抗クローディン18.2抗体のADCC活性は、様々な濃度(100μg/mL、20μg/mL、4μg/mL、0.8μg/mL、0.16μg/mL、0.032μg/mL、0.0064μg/mL、0.00128μg/mL、0.000256μg/mL、0.0000512μg/mL)の試験抗体(キメラ抗体1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362の作用下で、エフェクター細胞ジャーカット-NFAT-ルシフェラーゼ-CD16のルシフェラーゼ発現レベルを検出することによって評価した。結果は図11に示す通りであった。図11では、半ピーク濃度のEC50は抗体のADCC活性を反映していた。半ピーク濃度のEC50が小さければ小さいほど、抗体のADCC活性はより強力であった。実験結果により、標的細胞BXPC-3-クローディン18.2では、抗体濃度が増加するにつれて、試験抗体(キメラ抗体1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362の平均値はプラトー値に達するまで徐々に増加し、ピーク濃度に半分達したことが示された。半ピーク濃度EC50は、それぞれ0.002114μg/mL、0.002698μg/mL、及び0.003450μg/mLである。標的細胞Capan-1-クローディン18.2では、抗体濃度の増加に伴って、試験抗体(1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362の平均値はプラトー値に達するまで徐々に増加し、半ピーク濃度EC50は、それぞれ0.002676μg/mL、0.002634μg/mL、及び0.003482μg/mLであり、標的細胞SK-GT-クローディン18.2では、抗体濃度の増加に伴って、試験抗体(キメラ抗体1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362の平均値はプラトー値に達するまで徐々に増加し、半ピーク濃度EC50は、それぞれ0.004466μg/mL、0.007070μg/mL、及び0.009061μg/mLである。試験した抗体1B6及び1E7のADCC活性が対照抗体IMAB362よりも良好であったことを見ることができる。
本実施例では、CD16受容体及びNFAT(活性化T細胞核内因子)反応要素を安定に形質移入したジャーカット-NFAT-Luc-CD16ルシフェラーゼレポーター遺伝子細胞系を使用した。試験抗体(キメラ抗体1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362のFab断片が、標的細胞BXPC-3-クローディン18.2、Capan-1-クローディン18.2、及びSK-GT-クローディン18.2上の抗原と結合した際、抗体のFcセグメントがエフェクター細胞ジャーカット-NFAT-ルシフェラーゼ-CD16細胞の表面(FcγRIIIA)に結合し、ジャーカット-NFAT-ルシフェラーゼ-CD16細胞中においてNFAT関連シグナル伝達経路の活性化を引き起こし、これが立ち代わってルシフェラーゼ発現レベルの増加をもたらした。抗クローディン18.2抗体のADCC活性は、様々な濃度(100μg/mL、20μg/mL、4μg/mL、0.8μg/mL、0.16μg/mL、0.032μg/mL、0.0064μg/mL、0.00128μg/mL、0.000256μg/mL、0.0000512μg/mL)の試験抗体(キメラ抗体1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362の作用下で、エフェクター細胞ジャーカット-NFAT-ルシフェラーゼ-CD16のルシフェラーゼ発現レベルを検出することによって評価した。結果は図11に示す通りであった。図11では、半ピーク濃度のEC50は抗体のADCC活性を反映していた。半ピーク濃度のEC50が小さければ小さいほど、抗体のADCC活性はより強力であった。実験結果により、標的細胞BXPC-3-クローディン18.2では、抗体濃度が増加するにつれて、試験抗体(キメラ抗体1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362の平均値はプラトー値に達するまで徐々に増加し、ピーク濃度に半分達したことが示された。半ピーク濃度EC50は、それぞれ0.002114μg/mL、0.002698μg/mL、及び0.003450μg/mLである。標的細胞Capan-1-クローディン18.2では、抗体濃度の増加に伴って、試験抗体(1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362の平均値はプラトー値に達するまで徐々に増加し、半ピーク濃度EC50は、それぞれ0.002676μg/mL、0.002634μg/mL、及び0.003482μg/mLであり、標的細胞SK-GT-クローディン18.2では、抗体濃度の増加に伴って、試験抗体(キメラ抗体1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362の平均値はプラトー値に達するまで徐々に増加し、半ピーク濃度EC50は、それぞれ0.004466μg/mL、0.007070μg/mL、及び0.009061μg/mLである。試験した抗体1B6及び1E7のADCC活性が対照抗体IMAB362よりも良好であったことを見ることができる。
抗クローディン18.2キメラ抗体のCDC活性検出
本実施例では、抗クローディン18.2抗体のCDC活性は、様々な濃度(90μg/mL、30μg/mL、10μg/mL、3.33μg/mL、1.11μg/mL、0.37μg/mL、0.123μg/mL、0.041μg/mL)の試験抗体(キメラ抗体1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362の作用下で、CCK8方法によって、標的細胞KATOIII-3-クローディン18.2の細胞生存度を検出することによって評価した。結果は図12に示す通りであった。図12では、OD450値は細胞生存度を反映していた。OD450値が小さければ小さいほど、細胞生存度はより悪化した。半分阻害濃度のIC50は抗体のCDC活性を反映していた。半分阻害濃度のIC50が小さければ小さいほど、抗体のCDC活性はより強力であった。実験結果により、抗体濃度の増加に伴って、試験抗体(キメラ抗体1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362のOD450値はゼロに近づくまで徐々に減少し、半分阻害濃度のIC50は、2.656μg/mL、1.567μg/mL、及び4.889μg/mLであったことが示された。試験した抗体1B6及び1E7のCDC活性が対照抗体IMAB362よりも良好であったことを見ることができる。
本実施例では、抗クローディン18.2抗体のCDC活性は、様々な濃度(90μg/mL、30μg/mL、10μg/mL、3.33μg/mL、1.11μg/mL、0.37μg/mL、0.123μg/mL、0.041μg/mL)の試験抗体(キメラ抗体1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362の作用下で、CCK8方法によって、標的細胞KATOIII-3-クローディン18.2の細胞生存度を検出することによって評価した。結果は図12に示す通りであった。図12では、OD450値は細胞生存度を反映していた。OD450値が小さければ小さいほど、細胞生存度はより悪化した。半分阻害濃度のIC50は抗体のCDC活性を反映していた。半分阻害濃度のIC50が小さければ小さいほど、抗体のCDC活性はより強力であった。実験結果により、抗体濃度の増加に伴って、試験抗体(キメラ抗体1B6、1E7)及び対照抗体IMAB362のOD450値はゼロに近づくまで徐々に減少し、半分阻害濃度のIC50は、2.656μg/mL、1.567μg/mL、及び4.889μg/mLであったことが示された。試験した抗体1B6及び1E7のCDC活性が対照抗体IMAB362よりも良好であったことを見ることができる。
抗クローディン18.2抗体皮下異種移植片腫瘍の抗腫瘍有効性試験
マウスにおける抗クローディン18.2抗体の抗腫瘍有効性を評価するために、BXPC3~18.2皮下異種移植片腫瘍モデルを使用して抗体1E7及び1B6の抗腫瘍有効性を評価した。対数増殖期のヒト膵癌細胞BXPC3~18.2を採取し、遠心分離した。細胞を計数した後、無血清RPMI-1640培地及びMatrigelの混合物(1:1の比)を用いて細胞密度を約5.0*107/mLに調節した。0.1mL/マウスの体積を皮下でヌードマウスの背部内に注射した。平均腫瘍体積が約100mm3に達した際、薬物をランダムな群で投与した。マウスに静脈内及び腹腔内で交互に投与した。IMAB362、キメラ抗体1E7、及び1B6は、10mg/kgで投与した。それぞれのマウスに、10uL/gで6週間の間、最初の3週間は週に2回、次の3週間は週に1回投与した。投与の0日目から開始して、腫瘍の大きさ及びマウスの体重を週に2回測定して、腫瘍体積及び体重の変化の傾向を計算した。腫瘍成長阻害率(TGI)を試験評価指標として使用した。(TGI)%=[1-T/C]×100%であり、式中、T及びCは実験の終わりでの腫瘍体積であった。統計分析はSPSS16.0ソフトウェアを使用して行った。一元配置分散分析(一元配置ANOVA)試験を群間の比較のために使用した。P<0.05(*)は統計的有意性を示した。
マウスにおける抗クローディン18.2抗体の抗腫瘍有効性を評価するために、BXPC3~18.2皮下異種移植片腫瘍モデルを使用して抗体1E7及び1B6の抗腫瘍有効性を評価した。対数増殖期のヒト膵癌細胞BXPC3~18.2を採取し、遠心分離した。細胞を計数した後、無血清RPMI-1640培地及びMatrigelの混合物(1:1の比)を用いて細胞密度を約5.0*107/mLに調節した。0.1mL/マウスの体積を皮下でヌードマウスの背部内に注射した。平均腫瘍体積が約100mm3に達した際、薬物をランダムな群で投与した。マウスに静脈内及び腹腔内で交互に投与した。IMAB362、キメラ抗体1E7、及び1B6は、10mg/kgで投与した。それぞれのマウスに、10uL/gで6週間の間、最初の3週間は週に2回、次の3週間は週に1回投与した。投与の0日目から開始して、腫瘍の大きさ及びマウスの体重を週に2回測定して、腫瘍体積及び体重の変化の傾向を計算した。腫瘍成長阻害率(TGI)を試験評価指標として使用した。(TGI)%=[1-T/C]×100%であり、式中、T及びCは実験の終わりでの腫瘍体積であった。統計分析はSPSS16.0ソフトウェアを使用して行った。一元配置分散分析(一元配置ANOVA)試験を群間の比較のために使用した。P<0.05(*)は統計的有意性を示した。
実験の結果を図13及び図14に示した。抗体IMAB362、キメラ抗体1E7、及び1B6はすべて、BXPC3~18.2皮下異種移植片腫瘍モデルの腫瘍体積に対して特定の阻害効果を有していた。抗体IMAB362及びキメラ抗体1B6は、腫瘍成長に対して同じ阻害効果を有していた。TGIは36~39%であった。キメラ抗体1E7は、BXPC3~18.2腫瘍の成長の阻害に対してより良好な効果を有していた。TGI=51%。対照群と比較して、差異は統計的に有意であった。抗体IMAB362及び1B6、1E7は、腫瘍担持マウスの体重増加に対して効果がなかった。
本明細書全体にわたって、「実施形態」、「一部の実施形態」、「一実施形態」、「別の実施例」、「実施例」、「具体的実施例」、又は「一部の実施例」への言及は、実施形態又は実施例に関連して記載した特定の特長、構造、材料、又は特徴が、本開示の少なくとも1つの実施形態又は実施例中に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる上記用語の出現は、必ずしも本開示の同じ実施形態又は実施例を言及するものではない。更に、特定の特長、構造、材料、又は特徴を、1つ又は複数の実施形態又は実施例中において、任意の適切な様式で組み合わせ得る。更に、当業者は、互いに矛盾しない限りは、様々な実施形態、実施例、又はそれらの特長を組み込む及び合わせることができる。
説明的な実施形態を示し、記載したが、当業者には、上記実施形態が本開示を制限すると解釈してはならず、また、本開示の精神、原理、及び範囲から逸脱せずに、実施形態に変化、代替、及び改変を行うことができることが理解されよう。
Claims (40)
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9に示す軽鎖可変領域のCDR配列、
配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12に示す重鎖可変領域のCDR配列
のうちの少なくとも1つ又はそれと少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるCDR配列を含む、CLDN18.2を認識する能力を有する抗体又はその抗原結合断片。 - 抗体が、
それぞれ配列番号1、2、及び3に示す軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3配列、若しくは配列番号1、2、及び3と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列、又は
それぞれ配列番号7、8、及び9に示す軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3配列、若しくは配列番号7、8、及び9と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 抗体が、
それぞれ配列番号4、5、及び6に示す重鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3配列、若しくは配列番号4、5、及び6と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列、又は
それぞれ配列番号10、11、及び12に示す重鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3配列、若しくは配列番号10、11、及び12と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - ペプチドEと比較して、抗体又は抗原結合断片が、ペプチドAを、CLDN18.2を特異的に認識する支配的エピトープとして使用し、ペプチドEの配列が配列番号14のアミノ酸配列を有し、ペプチドAの配列が配列番号13のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 重鎖フレームワーク領域配列及び軽鎖フレームワーク領域配列のうちの少なくとも1つ
を含み、重鎖フレームワーク領域配列及び軽鎖フレームワーク領域配列のうちの少なくとも1つの少なくとも一部が、ネズミ抗体、ヒト抗体、霊長類抗体、又はその突然変異体のうちの少なくとも1つに由来する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 抗体が、配列番号15若しくは配列番号16に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、
並びに/又は、
抗体が、配列番号17若しくは配列番号18に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する、
任意選択で、抗体が、配列番号15に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号17に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する、
任意選択で、抗体が、配列番号16に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号18に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する、
請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 抗体が、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のうちの少なくとも1つを含み、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のうちの少なくとも1つの少なくとも一部が、ネズミ抗体、ヒト抗体、霊長類抗体、又はその突然変異体のうちの少なくとも1つに由来する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域の両方が、ネズミIgG抗体又はその突然変異体に由来する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号19、配列番号20、配列番号32、又は配列番号34に示すアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号21、配列番号22、配列番号31、又は配列番号33に示すアミノ酸配列を有する重鎖を有する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 抗体が、単鎖抗体、キメラ抗体、多量体抗体、又はCDR移植抗体である、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 抗体が単鎖抗体であり、単鎖抗体が配列番号23又は配列番号24に示すアミノ酸配列を有する、請求項11に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 抗原結合断片が、Fab断片、(Fab)2断片、scFv-Fc融合タンパク質、scFv-Fv融合タンパク質、Fv断片、及び最小認識単位のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 単鎖抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む細胞外領域を含むキメラ抗原受容体であって、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片に従って決定される、キメラ抗原受容体。
- キメラ抗原受容体が、膜貫通領域及び細胞内領域を更に含み、膜貫通領域がCD8膜貫通領域を含み、細胞内領域がICOS、4-1BB、及びCD3ζ鎖の細胞内セグメントを含む、請求項14に記載のキメラ抗原受容体。
- ICOSの細胞内セグメントのN末端がCD8膜貫通領域のC末端と接続されており、ICOSの細胞内セグメントのC末端が4-1BBの細胞内セグメントのN末端と接続されており、4-1BBの細胞内セグメントのC末端がCD3ζ鎖のN末端と接続されている、請求項15に記載のキメラ抗原受容体。
- 請求項14に記載のキメラ抗原受容体を発現し、任意選択で、Tリンパ球、DC細胞、NK細胞、及びNKTリンパ球のうちの少なくとも1つを含む免疫細胞。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項14に記載のキメラ抗原受容体をコードしている核酸分子。
- DNAである、請求項18に記載の核酸分子。
- 請求項18又は19に記載の核酸分子を有する発現ベクター。
- 真核発現ベクター又はウイルスであり、好ましくはウイルスがレンチウイルスである、請求項20に記載の発現ベクター。
- 請求項18又は19に記載の核酸分子、又は請求項20若しくは21に記載の発現ベクターを有する組換え細胞であって、核酸分子によってコードされている請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項14に記載のキメラ抗原受容体を発現する組換え細胞。
- 真核細胞であり、任意選択で哺乳動物細胞である、請求項22に記載の組換え細胞。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、
請求項14から16のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、
請求項17に記載の免疫細胞、
請求項18若しくは19に記載の核酸分子、
請求項20若しくは21に記載の発現ベクター、又は
請求項22若しくは23に記載の組換え細胞
を含む医薬組成物。 - CLDN18.2関連疾患を診断、処置又は防止するための医薬の製造における、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、請求項14から16のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項17に記載の免疫細胞、請求項18若しくは19に記載の核酸分子、請求項20若しくは21に記載の発現ベクター、請求項22若しくは23に記載の組換え細胞、又は請求項24に記載の医薬組成物の使用。
- CLDN18.2関連疾患が腫瘍を含む、請求項25に記載の使用。
- 腫瘍がCLDN18.2を発現する固形腫瘍を含み、任意選択で、固形腫瘍が胃癌、膵癌、食道癌、及び肺癌を含む、請求項26に記載の使用。
- 対象においてCLDN18.2関連疾患を診断、処置、又は防止する方法であって、対象に、治療上有効な量の、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、請求項14から16のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項17に記載の免疫細胞、請求項18若しくは19に記載の核酸分子、請求項20若しくは21に記載の発現ベクター、請求項22若しくは23に記載の組換え細胞、又は請求項24に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法。
- CLDN18.2関連疾患が腫瘍を含む、請求項28に記載の方法。
- 腫瘍がCLDN18.2を発現する固形腫瘍を含み、任意選択で、固形腫瘍が胃癌、膵癌、食道癌、及び肺癌を含む、請求項29に記載の方法。
- 対象においてCLDN18.2関連疾患を診断、処置、又は防止することにおいて使用するための、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、請求項14から16のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項17に記載の免疫細胞、請求項18若しくは19に記載の核酸分子、請求項20若しくは21に記載の発現ベクター、請求項22若しくは23に記載の組換え細胞、又は請求項24に記載の医薬組成物。
- CLDN18.2関連疾患が腫瘍を含む、請求項31に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、キメラ抗原受容体、免疫細胞、核酸分子、発現ベクター、組換え細胞、又は医薬組成物。
- 腫瘍がCLDN18.2を発現する固形腫瘍を含み、任意選択で、固形腫瘍が胃癌、膵癌、食道癌、及び肺癌を含む、請求項32に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、キメラ抗原受容体、免疫細胞、核酸分子、発現ベクター、組換え細胞、又は医薬組成物。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体を含む、CLDN18.2を検出するためのキット。
- CLDN18.2を検出する又はCLDN18.2関連疾患を診断するためのキットの調製における、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項14から16のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項17に記載の免疫細胞、請求項18又は19に記載の核酸分子、請求項20又は21に記載の発現ベクター、及び請求項22又は23に記載の組換え細胞の使用。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項14から16のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項17に記載の免疫細胞、請求項18又は19に記載の核酸分子、請求項20又は21に記載の発現ベクター、及び請求項22又は23に記載の組換え細胞を含むキットを使用して、対象においてCLDN18.2を検出する又はCLDN18.2関連疾患を診断する方法。
- CLDN18.2を検出する又はCLDN18.2関連疾患を診断するためのキットの調製において使用するための、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項14から16のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項17に記載の免疫細胞、請求項18又は19に記載の核酸分子、請求項20又は21に記載の発現ベクター、及び請求項22又は23に記載の組換え細胞。
- 抗体のスクリーニングにおける請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用であって、抗体が、CLDN18.2中のペプチドA以外のエピトープを認識する、使用。
- 抗体をスクリーニングする方法であって、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を使用することを含み、抗体が、CLDN18.2中のペプチドA以外のエピトープを認識する、方法。
- 抗体又はその抗原結合断片が、抗体のスクリーニングにおいて使用するためのものであり、抗体が、CLDN18.2中のペプチドA以外のエピトープを認識する、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
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