ES2847203T3

ES2847203T3 - Detección y tratamiento de herpesvirus bovino

Info

Publication number: ES2847203T3
Application number: ES15753250T
Authority: ES
Inventors: Shafiqul I Chowdhury
Original assignee: Louisiana State University
Current assignee: Louisiana State University
Priority date: 2014-08-01
Filing date: 2015-07-31
Publication date: 2021-08-02
Anticipated expiration: 2035-07-31
Also published as: WO2016019244A1; PL3194968T3; US20240085418A1; EP3194968B1; US11268959B2; EP3194968A1; US10690669B2; US20190086406A1; EP3779445A1; US20210011017A1

Abstract

Un método para determinar si un animal está infectado con un herpesvirus bovino de tipo 1 (BoHV-1), vacunado con un virus triple mutante BoHV-1 recombinante (BoHV-1 tmv), o no está infectado con un herpesvirus bovino de tipo 1 (BoHV-1) que comprende: (a) poner en contacto una muestra de prueba del animal con al menos un polipéptido o péptido para formar una mezcla de ensayo, donde el al menos un polipéptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 4 o en donde el péptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 20, 21, 44, o 45; y (b) detectar o medir si un complejo entre el al menos un polipéptido o péptido y anticuerpos está presente en la mezcla de ensayo.

Description

DESCRIPCIÓN

Detección y tratamiento de herpesvirus bovino

Esta solicitud reivindica beneficio de la fecha de presentación de la solicitud de patente provisional en EE UU No.

62/032.098, presentada el 1 de agosto, 2014.

Antecedentes

El herpesvirus bovino de tipo 1 (BoHV-1) es un patógeno vírico de ganado que puede producir infecciones graves del aparato respiratorio conocidas como rinotraqueitis bovina infecciosa (RBI), aborto en vacas gestantes. BoHV-1 también es un contribuidor significativo al desarrollo del complejo de enfermedades respiratorias bovinas (CERB). El CERB es una enfermedad multifactorial en ganado que implica infección respiratoria vírica inicial que puede incluir BoHV-1, virus sincitial respiratorio bovino (BRSV) y virus de diarrea vírica bovina (BVDV) seguido por infección bacteriana secundaria y bronconeumonía grave. El CERB cuesta solo a la industria ganadera de los e E UU más de $1000 millones al año. La capacidad de BoHV-1 para inmunosuprimir al ganado infectado, para establecer una infección latente de por vida en los ganglios del trigémino (GT) de animales infectados, para reactivarse de latencia tras estrés, y para ser transportado de forma anterógrada desde los cuerpos celulares de neuronas en los ganglios del trigémino a los terminales axonales en el epitelio nasal y respiratorio superior seguido por replicación en las vías respiratorias superiores predispone a los animales infectados latentemente a CERB. Por tanto, se considera que BoHV-1 es un iniciador importante de CERB.

Actualmente, la única vacuna permitida en los países de la UE contra BoHV-1 es la vacuna BoHV-1 con gE delecionado entero. Al usar la vacuna marcadora con el gen gE delecionado, BoHV-1 se ha erradicado en gran parte en un número de países europeos. El ganado vacunado con la vacuna con gE delecionado se puede diferenciar del ganado infectado con BoHV-1 de tipo salvaje (wt) mediante varios ensayos y, en el campo, la vacuna de BoHV-1 con gE delecionado se está usando en combinación con un ensayo de marcador serológico comercializado por IDEXX. Puesto que la vacuna de BoHV-1 con gE delecionado es distinguible de BoHV-1 de tipo salvaje, es una vacuna “diferenciadora de animales infectados de vacunados” (DIVA). El estado DIVA para cualquier vacuna de BoVH-1 es importante para la aplicación del programa de erradicación de BoHV-1, y es necesario para comercializar una vacuna de BoHV-1 en Europa. Como resultado, la vacuna de BoHV-1 con gE delecionado es la única vacuna de BoHV-1 comercializada en Europa.

Los inventores han desarrollado una nueva vacuna de BoHV-1 llamada la vacuna BoHV-1 tmv. Los ensayos comparativos indican que la eficacia de la vacuna BoHV-1 tmv es significativamente mejor que la vacuna de BoHV-1 con gE delecionado. Los ensayos también indican que la prueba IDEEX que se usa actualmente para distinguir ganado vacunado con la vacuna con gE delecionado de ganado infectado con BoHV-1 de tipo salvaje (wt) no es adecuada para distinguir las terneras vacunadas con BoHV-1 tmv de terneras infectadas con BoHV-1 wt. Esto puede ser porque BoHV-1 tmv tiene una deleción carboxi terminal de los aminoácidos 452-575, pero retiene aproximadamente dos tercios de la región codificante de gE. Por tanto, los aminoácidos 1-451 de gE, incluyendo los dominios extracelular y transmembrana, están presentes en la vacuna BoHV-1 tmv de los inventores. Por tanto, es necesario un ensayo de marcador serológico que distinga animales vacunados con BoHV-1 tmv de animales infectados con BoHV-1 wt antes de que la vacuna de BoHV-1 tmv mejorada se pueda introducir en el campo.

Compendio

En el presente documento se describe un ensayo para la detección de un virus triple mutante BoHV-1 (BoHV-1 tmv) recombinante muy eficaz. Comparado con el BoVH-1 wt el virus triple mutante BoHV-1 carece de las funciones inmunosupresoras codificadas en UL49.5 (es decir, la vacuna BoHV-1 tmv no tiene los aminoácidos 30-32 y 80-96 de UL49.5). Además, la vacuna BoHV-1 tmv carece de la cola citoplásmica de gE (residuos 451-575 de gE CT), que está asociada con la función de virulencia. Además, la vacuna BoHV-1 tmv carece del marco abierto de lectura de Us9 de 435 pares de bases de longitud entero. Los resultados muestran que los virus con deleciones de la cola citoplásmica de gE y el marco abierto de lectura de Us9 no se reactivan de latencia en los ganglios del trigémino porque no se pueden transportar de forma anterógrada. Por tanto, la cepa BoHV-1 tmv no se puede diseminar en las secreciones nasales bovinas después de reactivación de latencia. Debido a estas y otras propiedades, la eficacia de la vacuna BoHV-1 tmv es significativamente mejor que el virus BoHV-1 con gE delecionado, y ensayos comparativos demuestran que este es el caso. Por ejemplo, la eficacia protectora de la vacuna BoHV-1 tmv contra exposición a BoHV-1 de tipo salvaje es significativamente mejor que la observada para el virus de la vacuna con gE delecionado.

Un aspecto de la invención es un método que comprende: (a) poner en contacto una muestra de prueba con al menos un polipéptido o péptido para formar una mezcla de ensayo, donde el al menos un polipéptido o péptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 4, 20, 21, 44 o 45; y (b) detectar o medir si un complejo entre el al menos un polipéptido o péptido y anticuerpos está presente en la mezcla de ensayo.

Otro aspecto de la invención es un dispositivo que comprende una superficie sólida y al menos un polipéptido o péptido que consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 4, 20, 21, 44

Otro aspecto de la invención es un casete de expresión o vector de expresión que incluye un segmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido o péptido que consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 4, 20, 21,44. Otro aspecto es un casete de expresión o vector de expresión que comprende un segmento de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO: 2 o 3.

Otro aspecto es un dispositivo que incluye una superficie sólida y al menos un polipéptido o péptido que consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 4, 20, 21, 44. Otro aspecto es un kit que incluye tal dispositivo, e instrucciones para usar el dispositivo.

Otro aspecto de la invención es un kit que incluye instrucciones para uso de los componentes del kit, y cualquiera de los siguientes componentes embalados por separado: (a) al menos un polipéptido o péptido que consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 4, 20, 21, 44, (b) una entidad de unión que se une específicamente a al menos un polipéptido o péptido que consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1,4, 20, 21, 44, (c) una entidad de unión secundaria que se une específicamente a al menos un polipéptido o péptido que consiste en una secuencia de cualquiera de s Eq ID NO: 1, 4, 20, 21, 44, (d) un marcador o un reactivo para desarrollar una señal de un marcador; o (e) cualquier combinación de los mismos.

Descripción de las figuras

Las figuras 1A-1F muestran el diseño y la estrategia de expresión para generar un fragmento polipeptídico de cola citoplásmica (CT) de gE basado en la secuencia de aminoácidos predicha de gE CT de BoHV-1. La figura 1A es un diagrama esquemático de la proteína de la envuelta de BoHV-1, gE, que muestra los dominios extracelular (Ecto), transmembrana (TM) y cola citoplásmica (CT). La figura 1B es la secuencia de aminoácidos predicha del dominio gE CT de BoHV-1 (BoVH-1 gE residuos 451-570; SEQ ID NO: 1). La figura 1C es la secuencia de nucleótidos de la región codificante de gE CT de BoHV-1, que se optimizó con codones para expresión en E. coli (SEQ ID NO: 2). La figura 1D es la secuencia de nucleótidos de la región codificante de gE CT de BoHV-1 fusionada en el extremo 3' con un segmento que codifica seis residuos de histidina (SEQ ID NO: 3). Esta construcción se colocó en el vector pET-43.1a. La figura 1E es la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) del antígeno BoVH-1 gE CT-His expresado en E. coli del vector de expresión pET-43.1a gE CT-His. El punto isoeléctrico (pI) y el peso molecular (MW) estimados del antígeno recombinante BoVH-1 gE CT-His también se muestran. La figura 1f es un diagrama esquemático del genoma del virus BoHV-1 Ul49.5 A30-32 CT-null/gE-CTA/Us9A (BoHV-1 tmv) que muestra (1) un esquema del genoma de BoHV-1 con las localizaciones de los marcos abiertos de lectura de Ul49.5 (gN), gE, Us9 y bICP22; (2) un esquema del genoma de BoHV-1 Ul49.5 A30-32 CT-null; y (3) un esquema del plásmido pBoHV-1 gE-CTA/Us9A que muestra la localización y los tamaños de las secuencias delecionadas (gE CT, Us9 y región intergénica Us9-bICP22), las secuencias flanqueantes antes de gE (ectodominio y transmembrana) y después de bICP22.

Las figuras 2A-2D muestran inmunotransferencias separadas por SDS-PAGE usadas para analizar el polipéptido recombinante BoHV-1 gE-CT His (SEQ ID NO: 4) y el anticuerpo monoclonal específico anti-BoHV-1 gE CT Acm 2H8F3 generado como se describe en el presente documento. La figura 2A muestra un gel de SDS-PAGE al 12% teñido con azul de Coomassie que contiene el polipéptido gE CT-His (SEQ ID NO: 1) electroforéticamente purificado (carril 1) y los resultados de inmunotransferencia del mismo carril que contiene gE CT-His después de la reacción con un anticuerpo anti-His (carril 2). La figura 2B muestra un gel de SDS-PAGE al 12% teñido con azul de Coomassie que contiene el polipéptido gE CT-His electroforéticamente purificado en condiciones reductoras (carril 1) y no reductoras (carril 2). Los marcadores de peso molecular se muestran en el carril (M). La figura 2C muestra una inmunotransferencia con el polipéptido gE CT-His (SEQ ID NO: 1) en ambos carriles (1) y (2) después de reacción con anticuerpos Acm 2H8F3 específicos de BoHV-1 gE CT marcados con fluorescencia. La figura 2D muestra una inmunotransferencia del polipéptido gE CT-His (SEQ ID NO: 1) purificado en ambos carriles (1) y (2) después de reacción con anticuerpos anti-GST marcados con fluorescencia.

La figura 3 muestra un gráfico de espectrometría de masas MALDI-TOF de la proteína gE CT-His.

La figura 4A-4B ilustra el análisis de inmunotransferencia del Acm 2HF83 para mostrar su reactividad contra lisados celulares infectados con BoHV-1 wt y BoHV-1 tmv. La figura 4A muestra una inmunotransferencia de lisados de células MDBK control e infectadas con BoHV-1 wt y BoHV-1 tmv separados en un SDS-PAGE al 10% después de reacción con el Acm 2HF83 específico de gE Ct. La figura 4B muestra un análisis de inmunotransferencia de una membrana de transferencia idéntica con un anticuerpo policlonal de conejo específico del ectodominio de gE. Nótese que una banda específica de gE CT de aproximadamente 68 kD no es reconocida por el Acm 2HF83 en la figura 4A, pero es reconocida por el anticuerpo policlonal de conejo específico del ectodominio de gE en la figura 4B.

La figura 5 ilustra gráficamente los resultados de mapeo de epítopos por ELISA. Se muestra la absorbancia a 450 nm observada para la reacción del anticuerpo Acm 2H8F3 conjugado con HRP para cada muestra de librería de péptidos. Los péptidos con números 1-39 (SEQ ID NO: 5-43) son 12-meros con secuencias separadas del polipéptido recombinante gE CT-His expresado en E. coli. El pocilio de péptido No. 40 contiene estreptavidina como un control blanco. El pocillo de péptido No. 41 contiene proteína recombinante gE CT-His expresada en E. coli, que se usó para la producción del anticuerpo Acm 2H8F3. Como se muestra, el anticuerpo Acm 2H8F3 se unió a los péptidos No. 16 y 17 (SEQ ID NO: 20 y 21).

La figura 6 es un diagrama esquemático del vector de expresión pET-43.1a(+).

Las figuras 7A-7F son dibujos esquemáticos de dispositivos que se pueden emplear para detectar y seguir la infección con BoHV-1 (y para identificar animales que se beneficiarían de la vacunación con la vacuna BoHV-1 tmv). La figura 7A es un dibujo esquemático de un dispositivo de detección de BoHV-1 de flujo lateral. La figura 7B es un dibujo esquemático de un dispositivo de detección de BoHV-1 de flujo lateral que ilustra el indicador de una señal (*****) después de ensayar una muestra de fluido corporal. La figura 7C es un dibujo esquemático de un dispositivo con dos nanohilos conductores eléctricos, por ejemplo, un biosensor conductométrico de transferencia de carga directa eléctrica. La figura 7D es un dibujo esquemático del dispositivo mostrado en la figura 7C que ilustra la transferencia de carga directa (*****) entre dos nanohilos conductores eléctricos después de ensayar una muestra de fluido corporal. La figura 7E es un dibujo esquemático de un dispositivo con un nanohilo más largo y uno más corto. La figura 7F es un dibujo esquemático de un dispositivo con un nanohilo más largo y uno más corto que ilustra que una señal (*****) se puede transmitir a lo largo de un nanohilo a un transmisor después de ensayar una muestra de fluido corporal.

La figura 8 ilustra un dispositivo y un método de usar una tira reactiva para realizar un ensayo para detectar infección por BoHV-1 y/o animales que se beneficiarían de la vacunación con la vacuna BoVH-1 tmv.

Descripción detallada

En el presente documento se describen métodos y composiciones para detectar y distinguir animales infectados con BoHV-1 de animales vacunados y/o no infectados.

Herpesvirus bovino de tipo 1 (BoHV-1)

El herpesvirus bovino de tipo 1 (BoHV-1) es un patógeno de ganado que puede producir infección del aparato respiratorio grave conocida como rinotraqueitis bovina infecciosa (RBI), que puede producir abortos en vacas gestantes (Kaashoek et al., Vet Rec 139(17):416-21 (1996); Tikoo et al., Adv Virus Res 45:191-223 (1995); Jones & Chowdhury, Animal Health Res Rev 8(2):187-205 (2007); Patente en EE UU No. 6.221.360). BoHV-1 también es un componente importante del complejo de enfermedades respiratorias bovinas (CERB o “fiebre del transporte”). Durante la infección primaria, BoHV-1 se replica en el epitelio nasal y de las vías respiratorias superiores y transitoriamente deprime la inmunidad celular y evade el reconocimiento de células T CD8+ citotóxicas del huésped al disminuir la expresión en la superficie celular de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I). Esta inmunosupresión combinada con lesiones en las vías respiratorias superiores facilita infecciones bacterianas secundarias y neumonía. Tanto la enfermedad RBI como el CERB producen pérdidas considerables para la industria ganadera en el mundo y cuesta a la industria ganadera de los EE UU al menos $1000 millones al año (Tikoo et al., Adv Virus Res 45:191-223 (1995)).

Otro problema con la infección de BoHV-1 en ganado es que el virus establece una latencia de por vida en los ganglios del trigémino después de la infección primaria (Jones & Chowdhury, Animal Health Res Rev 8(2):187-205 (2007)). Durante la infección primaria, el virus entra en las terminaciones de nervios sensoriales (terminales axónicos) del nervio trigémino en la nasofaringe y es transportado arriba del axón de forma retrógrada a los cuerpos celulares neuronales en los ganglios del trigémino donde BoHV-1 establece latencia de por vida (id.). Periódicamente a lo largo de la vida del animal, el virus latente en los ganglios del trigémino se reactiva debido a inmunosupresión o estrés. Después de la reactivación, el virus es transportado hacia abajo del axón a los sitios de infección primarios en la nariz y/o el ojo. La infección vírica produce diseminación del virus nasal y ocular (id.), lo que facilita la transmisión del virus a otro animal. Por tanto, esta reactivación seguida por diseminación mantiene una infección vírica en curso en poblaciones de ganado susceptibles.

En células infectadas con BoHV-1, se encontró que la proteína de la envuelta U^l49.5 (un homólogo de BoHV-1 de la glucoproteína de envuelta N (gN)) bloqueaba el transportador asociado con la función de presentación de antígenos (TAP) requerida para la presentación de péptidos víricos en la superficie celular. Para fomentar la respuesta inmunitaria del huésped, las moléculas del MHC-I deben estar cargadas con péptidos víricos. Sin embargo, BoHV-1 U^l49.5 se une al complejo TAP, bloquea cambios conformacionales de TAP, y degrada TAP (Lipinska et al., J Virol 80(12):5822-32 (2006)). Consecuentemente, los péptidos no se cargan en las moléculas del MHC-I en el retículo endoplásmico, que se requiere para el transporte de MHC-I a la superficie celular y expresión en la superficie celular. Esto produce una disminución transitoria de MHC-I en un huésped susceptible y ayuda al virus a evadir la destrucción por las células T CD8+ en una fase temprana de la infección vírica del huésped.

Se han hecho mutantes de BoHV-1 y analizado para su uso como vacunas. Una vacuna comercialmente disponible se basa en una deleción del gen completo de la glucoproteína E (gE). Después de la infección intranasal, se determinó que los virus recombinantes BHV-1 tanto con gE delecionado (el gen gE entero delecionado) como el de los inventores de la cola citoplásmica (CT) de gE truncada estaban igualmente atenuados en terneras y tenían transporte axonal anterógrado defectuoso (Liu et al., J Virol 82(15):7432-42 (2008); Chowdhury et al., J. Neurovirol. 17:457-465 (2010)).

Por tanto, después de la reactivación inducida por dexametasona en los ganglios del trigémino, no se vio diseminación de virus nasal en terneras infectadas con cualquier virus recombinante (Liu et al., J Virol 82(15):7432-42 (2008)). De forma importante, las terneras infectadas con virus con la cola citoplásmica de gE de BHV-1 delecionada tienen títulos neutralizantes en sueros dos veces mayores relativo a las terneras infectadas con el virus con gE entero delecionado (id.).

gE de BoHV-1

El genoma de BoHH-1 consiste en una molécula de ADN bicatenaria lineal de aproximadamente 135,5 kb que codifica aproximadamente 70 proteínas. Doce de estas proteínas (gB, gC, gD, gE, gG, gI, gH, gK, gL, gM, UL49.5 y Us9) son proteínas de la envuelta, y las proteínas gB, gC, gD, gE, gG, gI, gH, gK, gL, gM, son proteínas de la envuelta glucosiladas. Las glucoproteínas de la envuelta gE y gI forman complejos y gE está implicada en la propagación intercelular vírica (propagación célula a célula). Se predice que el marco abierto de lectura (ORF) de gE de BoHV-1 contiene 575 residuos de aminoácidos (aa) con una secuencia señal cortable de 28 aminoácidos. La estructura de la glucoproteína E (gE) corresponde a una glucoproteína transmembrana de tipo I. La glucoproteína gE contiene tres dominios distintos: un dominio extracelular hidrofílico de 387 aminoácidos de longitud (ectodominio), un dominio transmembrana hidrofóbico de 33 aminoácidos de longitud, y un dominio citoplásmico/dominio tegumento muy cargado de 125 aminoácidos de longitud. La gE madura está fosforilada y glucosilada con una masa molecular aparente de aproximadamente 92 kD.

La vacuna BoHV-1 tmv previamente generada por los inventores es un virus triple mutante BoHV-1 que carece de las propiedades inmunosupresoras (deleción de los residuos de UL49.5 30-32 y 80-96), virulencia (deleción de los residuos de la cola citoplásmica de gE 452-575), y el transporte neuronal anterógrado (deleción de la cola citoplásmica de gE y el ORF entero de Us9 de 435 pb de longitud entera) (Chowdhury et al., Vaccine 32(39): 4909-4915 (2014)) (véase, la Fig. 1F). Aunque a la vacuna BoHV-1 tmv de los inventores le falta una parte C-terminal de la cola citoplásmica de la glucoproteína E, retiene y expresa los aminoácidos 1-451 N-terminales de gE, incluyendo los dominios extracelular y transmembrana de la glucoproteína E de BoVH-1.

Las composiciones, métodos, kits y dispositivos descritos en el presente documento son útiles para distinguir animales que están vacunados con la vacuna BoHV-1 tmv de los que están infectados con BoHV-1. Además, las composiciones, métodos, kits y dispositivos descritos en el presente documento también son útiles para distinguir animales que no están infectados con BoHV-1 de los que están infectados. Tales composiciones, métodos, kits y dispositivos pueden detectar anticuerpos y/o antígenos que están presentes en animales infectados con BoHV-1, pero no detectan ninguno de tales anticuerpos o antígenos en animales no infectados o en animales que están vacunados con la vacuna BoHV-1 tmv.

En particular, las composiciones, métodos, kits y dispositivos descritos en el presente documento detectan una porción de la glucoproteína E que no es parte de la vacuna BoHV-1 tmv -la cola citoplásmica de la glucoproteína E. La estructura de la glucoproteína E se muestra esquemáticamente en la figura 1A. La parte de la glucoproteína E que falta en la vacuna BoHV-1 tmv es la cola citoplásmica de la glucoproteína E (gE CT) aminoácidos 451-575, con la secuencia mostrada a continuación (SEQ ID NO: 1; Fig. 1B).

1 ASQKRTYDIL NPFGPVYTSL PTNEPLDVVV PVSDDEFSLD

41 EDSFADDDSD DDGPASNPPA DAYDLAGAPE PTSGFARAPA

81 NGTRSSRSGF KVWFRDPLED DAAPARTPAA PDYTWAARL

121 KSILR

El dominio de la cola citoplásmica que falta de la proteína gE de BoHV-1 es útil como un antígeno para desarrollar ensayos que detectan infección con BoHV-1, identificando de esta manera animales infectados. Los animales no infectados y los animales que han sido vacunados con la vacuna BoHV-1 tmv no desarrollan anticuerpos contra el dominio de la cola citoplásmica de la proteína gE de BoHV-1 y no se detectan con los ensayos basados en el antígeno gE CT descritos en el presente documento.

Un ácido nucleico que codifica la cola citoplásmica de la glucoproteína E de SEQ ID NO: 1 se muestra a continuación (SEQ ID NO: 2; Fig. 1C).

1 GCATCGCAAA AGCGTACCTA TGATATTCTG AACCCGTTTG

41 GTCCGGTCTA CACGAGCCTG CCGACGAACG AACCGCTGGA

61 TGTTGTTGTG CCTGTTAGTG ATGACGAATT TTCCCTGGAT

121 GAAGACTCAT TCGCCGATGA CGATTCGGAC GATGACGGTC

161 CGGCAAGCAA CCCGCCGGCA GATGCTTATG ATCTGGCAGG

201 ^TGCACCGGAACCGACCTCTG GTTTTGCACG TGCTCCGGCG

241 AATGGCACGC GTAGCTCTCG CTCCGGTTTT AAAGTCTGGT

281 TCCGCGATCC GCTGGAAGAT GACGCGGCCC CGGCGCGTAC

321 CCCGGCGGCA CCGGACTACA CCGTGGTTGC GGCCCGTCTG

361 AAGAGCATCC TGCGT

Un dominio de cola citoplásmica de BoHV-1 variante con una metionina N-terminal y una etiqueta de seis histidinas N-terminal también es útil como antígeno y es fácilmente detectable/aislable debido a la presencia de la etiqueta de histidinas. La secuencia de este polipéptido se muestra a continuación (SEQ ID NO: 4; Fig. 1E).

1 MHHHHHHASQ KRTYDILNPF GPVYTSLPTN EPLDVWPVS

41 DDEFSLDEDS FADDDSDDDG PASNPPADAY DLAGAPEPTS

81 GFARAPANGT RSSRSGFKVW FRDPLEDDAA PARTPAAPDY

121 TW AAR LKSI LR

Una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados para E. coli que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4 se muestra a continuación (SEQ ID NO: 3; Fig. 1D).

1 CATATGCATC ACCACCATCA CCACGCATCG CAAAAGCGTA

41 CCTATGATAT TCTGAACCCG TTTGGTCCGG TCTACACGAG

81 CCTGCCGACG AACGAACCGC TGGATGTTGT TGTGCCTGTT

121 AGTGATGACG AATTTTCCCT GGATGAAGAC TCATTCGCCG

161 ATGACGATTC GGACGATGAC GGTCCGGCAA GCAACCCGCC

201 GGCAGATGCT TATGATCTGG CAGGTGCACC GGAACCGACC

241 TCTGGTTTTG CACGTGCTCC GGCGAATGGC ACGCGTAGCT

281 CTCGCTCCGG TTTTAAAGTC TGGTTCCGCG ATCCGCTGGA

321 AGATGACGCG GCCCCGGCGC GTACCCCGGC GGCACCGGAC

361 TACACCGTGG TTGCGGCCCG TCTGAAGAGC ATCCTGCGTT

401 AATGACTCGA G

Las secuencias de los polipéptidos, péptidos y ácidos nucleicos descritas en el presente documento pueden variar algo de las secuencias enumeradas en el presente documento para el virión BoVH-1 de tipo salvaje. Además, las secuencias de los polipéptidos, péptidos y ácidos nucleicos empleadas en los métodos, composiciones, dispositivos, y kits descritos en el presente documento también pueden variar. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos y péptidos descritos en el presente documento pueden tener codones optimizados para la expresión en una variedad de células huéspedes (por ejemplo, en varias especies o cepas de células huéspedes procariotas o eucariotas). Por tanto, los polipéptidos, péptidos y ácido nucleicos empleados y/o detectados en el presente documento pueden tener al menos el 75% de identidad de secuencia, o al menos el 80% de identidad de secuencia, o al menos el 85% de identidad de secuencia, o al menos el 90%, o al menos el 95% de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NO: 1-45.

La identidad de secuencia y la variación de secuencia se pueden evaluar usando software de análisis de secuencia (por ejemplo, mediante las herramientas de NCBI, o el Paquete de Software de Análisis de Secuencias del Grupo Informático de Genética, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). El software se puede emplear para emparejar secuencias similares asignando grados de identidad de secuencia a varias sustituciones, deleciones, inserciones, y otras modificaciones. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos, por ejemplo, típicamente incluyen sustituciones en los siguientes grupos: el grupo de glicina, alanina; valina, isoleucina y leucina; el grupo de ácido aspártico, ácido glutámico, asparragina, y glutamina; el grupo de serina y treonina; el grupo de lisina y arginina; y el grupo de fenilalanina y tirosina.

Casetes o vectores de expresión

Los ácidos nucleicos con secuencias que son al menos el 95% idénticas a SEQ ID NO: 2 o 3 son útiles para expresar de forma eficaz la cola citoplásmica de la glucoproteína E, que se puede usar como antígeno (o para generar anticuerpos) para detectar infección con BoHV-1 y distinguir animales que han sido vacunados con la vacuna BoHV-1 tmv de los que necesitan ser vacunados.

Fragmentos de péptidos antigénicos de la cola citoplásmica de la glucoproteína E también son útiles como antígenos para la detección de infección con BoHV-1, y para generar anticuerpos para la detección de BoHV-1 e infección con BoHV-1. Los ejemplos de tales fragmentos antigénicos de la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 incluyen polipéptidos y/o péptidos con una secuencia que es al menos el 95% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 1, 4, 5-44 o 45. Estos polipéptidos y/o péptidos pueden estar codificados en casetes de expresión o vectores de expresión que incluyen uno o más segmentos de ácido nucleico.

Por ejemplo, un experto en la materia puede preparar un casete de expresión o vector de expresión que puede expresar uno o más polipéptidos o péptidos de la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 codificados. Se pueden transformar células huéspedes mediante el casete de expresión o vector de expresión, y los polipéptidos o péptidos expresados se pueden aislar de las mismas. Algunos procedimientos para hacer tales células huéspedes genéticamente modificadas se describen a continuación.

Promotores: Los ácidos nucleicos o segmentos de ácidos nucleicos que codifican la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 pueden estar operativamente unidos a un promotor, que proporciona la expresión de un ARNm que codifica los polipéptidos o péptidos de la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1. El promotor puede ser un promotor funcional en una célula huésped tal como un promotor vírico, un promotor bacteriano o un promotor de mamífero. El promotor puede ser un promotor heterólogo. Como se usa en el presente documento, “heterólogo” cuando se usa en referencia a un gen o ácido nucleico se refiere a un gen o ácido nucleico que se ha manipulado de alguna manera. Por ejemplo, un promotor heterólogo es un promotor que contiene secuencias que no están unidas de forma natural a una región codificante asociada. Por tanto, un promotor heterólogo no es el mismo que el promotor natural de BoHV-1 que dirige la expresión de la glucoproteína E.

Los ácidos nucleicos de la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 están operativamente unidos al promotor de modo que la región codificante de la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 está localizada después del promotor. La combinación operable del promotor con la región codificante de la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 es una parte clave del casete de expresión o vector de expresión.

Las regiones promotoras típicamente se encuentran en el ADN flanqueante antes de la secuencia codificante en células tanto procariotas como eucariotas. Una secuencia promotora proporciona regulación de la transcripción de la secuencia génica posterior y típicamente incluye desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 2.000 pares de bases de nucleótidos. Las secuencias promotoras también contienen secuencias reguladoras tal como secuencias potenciadoras que pueden influir el nivel de expresión génica. Algunas secuencias promotoras aisladas pueden proporcionar expresión génica de ADN heterólogos, que es un ADN diferente del ADN nativo u homólogo.

También se sabe que las secuencias promotoras son fuertes o débiles, o inducibles. Un promotor fuerte proporciona un alto nivel de expresión génica, mientras que un promotor débil proporciona un nivel muy bajo de expresión génica. Un promotor inducible es un promotor que proporciona la activación y desactivación de la expresión génica en respuesta a un agente exógenamente añadido, o a un estimulo medioambiental o de desarrollo. Por ejemplo, un promotor bacteriano tal como el promotor Plac se puede inducir para variar los niveles de expresión génica dependiendo del nivel de isotiopropilgalactósido añadido a las células transformadas. Los promotores también pueden proporcionar regulación específica de tejido o de desarrollo. Una secuencia promotora aislada que es un promotor fuerte para un ADN heterólogo es ventajosa porque proporciona un nivel suficiente de expresión génica para la fácil detección y selección de células transformadas y proporciona un alto nivel de expresión génica cuando se desea. En algunas formas de realización, el promotor es un promotor inducible y/o un promotor específico de tejido.

Los ejemplos de promotores que se pueden usar incluyen, pero no están limitados a, el promotor T7 (por ejemplo, opcionalmente con el operador lac), el promotor CaMV 35S (Odell et al., Nature. 313:810-812 (1985)), el promotor CaMV 19S (Lawton et al., Plant Molecular Biology. 9:315-324 (1987)), promotor nos (Ebert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:5745-5749 (1987)), promotor Adhl (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:6624-6628 (1987)), promotor de sacarosa sintasa (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:4144-4148 (1990)), promotor de a-tubulina, promotor de ubiquitina, promotor de actina (Wang et al., Mol. Cell. Biol. 12:3399 (1992)), cab (Sullivan et al., Mol. Gen. Genet.

215:431 (1989)), promotor de PEPCasa (Hudspeth et al., Plant Molecular Biology. 12:579-589 (1989)), el promotor CCR (cinamoil CoA:NADP oxidorreductasa, EC 1.2.1.44) aislado de Lollium perenne, (o un césped perenne) y/o los asociados con el complejo del gen R (Chandler et al., The Plant Cell. 1:1175-1183 (1989)).

Se pueden usar otros promotores constitutivos o inducibles con o sin elementos potenciadores asociados. Los ejemplos incluyen un promotor derivado de baculovirus, el promotor p10. También se pueden usar promotores vegetales o de levaduras.

Alternativamente, se pueden emplear secuencias promotoras específicas de tejido novedosas en la práctica de la presente invención. Se pueden identificar regiones codificantes de un tipo celular o tejido particular y los elementos de control de la expresión de esas regiones codificantes se pueden identificar usando técnicas disponibles para los expertos en la materia.

El ácido nucleico que codifica la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 o un péptido de la misma se puede combinar con el promotor por métodos disponibles para dar un casete de expresión, por ejemplo, como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Segunda Edición (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1989); Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Tercera Edición (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (2000)). Por ejemplo, se puede construir un plásmido que contenga un promotor tal como el promotor T7-lac u obtener de Snap Gene (véase, por ejemplo, el sitio web en snapgene.com/resources/plasmid_files/pet_and_duet_vectors_%28novagen%29/pET-43.1a%28+%29/). Estos y otros plásmidos se construyen para tener múltiples sitios de clonación que tienen especificidad para diferentes enzimas de restricción después del promotor. El ácido nucleico que codifica la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 o péptido de la misma se puede subclonar después del promotor usando enzimas de restricción y colocar para asegurar que el ADN se inserta en la orientación apropiada con respecto al promotor de modo que el ADN se puede expresar como un ARN sentido.

Los casetes de expresión que incluyen un promotor operativamente unido a una región codificante de un polipéptido 0 péptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 pueden incluir otros elementos tal como un segmento que codifica secuencias reguladoras 3' no traducidas, y sitios de restricción para la inserción, eliminación y manipulación de segmentos de los casetes de expresión. Las secuencias de ADN reguladoras 3' no traducidas pueden actuar como una señal para terminar la transcripción y permitir la poliadenilación del ARNm resultante. La secuencia de ADN reguladora 3' no traducida preferiblemente incluye desde aproximadamente 300 a 1.000 pares de bases de nucleótidos y contiene secuencias de terminación de transcripción y traducción procariotas o eucariotas. Se pueden emplear varios elementos 3' que están disponibles para los expertos en la materia. Estas secuencias reguladoras 3' no traducidas se pueden obtener como se describe en An (Methods in Enzymology. 153:292 (1987)). Muchas de tales secuencias reguladoras 3' no traducidas ya están presentes en plásmidos disponibles de fuentes comerciales tal como Clontech, Palo Alto, California. Las secuencias reguladoras 3' no traducidas pueden estar operativamente unidas al extremo 3' de una región codificante de polipéptido o péptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 por métodos disponibles.

Una vez que el ácido nucleico que codifica la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 o péptido de la misma está operativamente unido a un promotor (por ejemplo, y otros elementos seleccionados), el casete de expresión así formado se puede subclonar en un plásmido u otro vector (por ejemplo, un vector de expresión). Tales vectores de expresión pueden tener un origen de replicación procariota o eucariota, por ejemplo, para facilitar la replicación episomal en células bacterianas, de vertebrados y/o de levadura.

Los ejemplos de vectores que proporcionan una fácil selección, amplificación y transformación del casete de expresión en células procariotas y eucariotas incluyen pET-43.1a(+), vectores derivados de pUC tal como pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pUC23, pUC119, y pUC120, vectores derivados de pSK, vectores derivados de pGEM, vectores derivados de pSP, o vectores derivados de pBS. Las secuencias de ADN adicionales incluyen orígenes de replicación para proporcionar la replicación autónoma del vector, genes marcadores seleccionables adicionales, tal como resistencia a antibióticos o herbicidas, sitios de clonación múltiples únicos que proporcionan sitios múltiples para insertar secuencias de ADN, y/o secuencias que aumentan la transformación de células procariotas o eucariotas.

Con el fin de mejorar la identificación de células transformadas, se puede emplear un gen marcador seleccionable o cribable en el casete de expresión o vector de expresión. “Genes marcadores” son genes que imparten un fenotipo distinto a las células que expresan el gen marcador y por tanto permiten que tales células transformadas se distingan de células que no tienen el marcador. Tales genes pueden codificar o bien un marcador seleccionable o cribable, dependiendo de si el marcador confiere un rasgo que se puede 'seleccionar' por medios químicos, es decir, mediante el uso de un agente selectivo (por ejemplo, un antibiótico), o si es simplemente un rasgo que se puede identificar mediante observación o ensayo, es decir, por 'cribado' (por ejemplo, el rasgo del locus R). Por supuesto, se conocen en la técnica muchos ejemplos de genes marcadores adecuados y se pueden emplear en la práctica de la invención.

Incluidos en los términos de gen “marcador” seleccionable o cribable están genes que codifican un “marcador secretable” cuya secreción se puede detectar como un medio de identificar o seleccionar células transformadas. Los ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno secretable que se puede identificar por interacción con un anticuerpo, o enzimas secretables que se pueden detectar por su actividad catalítica. Las proteínas secretables están en un número de clases, incluyendo proteínas pequeñas difusibles detectables, por ejemplo, por ELISA; y proteínas que se insertan o atrapan en la pared celular (por ejemplo, proteínas que incluyen una secuencia líder tal como la encontrada en la unidad de expresión de extensina o PR-S de tabaco).

Los marcadores seleccionables posibles para uso en relación con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un gen de ampicilina, que codifica el antibiótico ampicilina. Otros ejemplos incluyen un gen neo (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:183-188 (1985)) que codifica resistencia a kanamicina y se puede seleccionar usando kanamicina, G418, y similares; un gen mutante de acetolactato sintasa (ALS) que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonilurea u otras sustancias químicas que inhiben ALS (Solicitud de patente europea 154.204 (1985)); un gen DHFR resistente a metotrexato (Thillet et al., J. Biol. Chem. 263:12500-12508 (1988)); a gen dalapón deshalogenasa que confiere resistencia al herbicida dalapón; un gen mutado de antranilato sintasa que confiere resistencia a 5-metil triptófano; un gen p-galactosidasa, que codifica una enzima para la que hay sustratos cromógenos; un gen de luciferasa (lux) (Ow et al., Science. 234:856-859.1986), que permite detección por bioluminiscencia; o un gen de acuorina (Prasher et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 126:1259-1268 (1985)), que se puede emplear en detección de bioluminiscencia sensible a calcio, o un gen proteína fluorescente verde o amarilla (Niedz et al., Plant Cell Reports.

14:403 (1995).

Los casetes de expresión y/o vectores de expresión se pueden introducir en una célula huésped receptora para crear una célula transformada por métodos disponibles. La frecuencia de aparición de células que absorben el ADN exógeno (extraño) puede ser baja, y es probable que no todas las células receptoras que reciban segmentos o secuencias de ADN produzcan una célula transformada en donde el ADN está establemente integrado en el cromosoma de la célula huésped y/o se expresa. Algunas pueden mostrar solo expresión génica inicial y transitoria. Sin embargo, células de virtualmente cualquier especie se pueden transformar establemente, y esas células se pueden utilizar para generar polipéptidos o péptidos antigénicos.

La transformación de las células huéspedes con casetes de expresión o vectores de expresión se puede realizar por cualquiera de un número de métodos disponibles para los expertos en la materia. Los ejemplos son: transformación por transferencia directa de ADN en las células huéspedes por electroporación, transferencia directa de ADN en las células huéspedes por precipitación con PEG, transferencia directa de ADN a células vegetales por bombardeo con microproyectiles, y cloruro de calcio/choque térmico.

Métodos tales como el bombardeo con microproyectiles o electroporación se pueden llevar a cabo con ADN “desnudo” donde el casete de expresión puede ser simplemente llevado en cualquier vector de clonación plásmido derivado de E. coli. En el caso de vectores víricos, es deseable que el sistema retenga las funciones de replicación, pero carezca de las funciones para inducción de la enfermedad.

Una vez el casete o vector de expresión del polipéptido o péptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E se ha construido e introducido en una célula huésped, las células huéspedes se pueden cribar para la capacidad de expresar el polipéptido o péptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E por métodos disponibles. Por ejemplo, cuando el polipéptido o péptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E tiene una etiqueta de poli-histidina, y el polipéptido o péptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E etiquetado con His se puede detectar o aislar mediante el uso de anticuerpo anti-etiqueta His. En otro ejemplo, los polipéptidos o péptidos de la cola citoplásmica de la glucoproteína E se pueden detectar usando anticuerpo que se unen a los polipéptidos o péptidos (por ejemplo, mediante inmunotransferencia o ELISA). Los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido o péptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E se pueden detectar por transferencia Southern o amplificación de ácidos nucleicos usando sondas y/o cebadores complementarios.

Ensayos inmunológicos

Los ensayos inmunológicos descritos en el presente documento pueden detectar infección con BoHV-1 al detectar antígenos o anticuerpos de BoHV-1 en muestras de prueba obtenidas de animales.

No se impone ninguna limitación particular sobre el tipo de método de ensayo inmunológico de la presente invención, siempre que el método implique la formación de una reacción de entidad de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo). Sin embargo, el método de ensayo preferiblemente incluye una etapa para la formación de un complejo entre un antígeno de la cola citoplásmica de BoHV-1 (o un antígeno peptídico del mismo), y al menos un anticuerpo o entidad de unión.

Los anticuerpos y antígenos en las muestras de prueba se pueden detectar por métodos disponibles en la técnica, tal como radioinmunoensayo, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunoensayo “sándwich”, inmunoensayos in situ (por ejemplo, usando marcadores de oro coloidal, enzimas o radioisótopos), inmunotransferencia, ensayo de aglutinación (por ejemplo, ensayo de aglutinación en gel, ensayo de hemaglutinación y etc.), ensayo de fijación del complemento, ensayo de inmunofluorescencia, ELISA sándwich, inmunoturbidimetría (TIA o LTlA (inmunoensayo turbidimétrico en látex)), inmunocromatografía, y ensayo de inmunoelectroforesis y similares.

Las muestras de prueba para detectar antígenos o anticuerpos de BoHV-1 pueden incluir tejidos o fluidos corporales recogidos de un animal tal como sangre completa, fracciones sanguíneas, suero, secreciones nasales, moco, saliva, orina, heces, fluidos pulmonares, tejidos pulmonares, y similares. La muestra de prueba puede estar parcialmente purificada, filtrada, fraccionada (por ejemplo, un sobrenadante o precipitado), o sin purificar. Por ejemplo, una muestra de prueba conveniente es sangre completa o suero.

En algunos casos, se pueden usar ensayos para detectar anticuerpos contra la cola citoplásmica de BoHV-1 (o un péptido de la misma), donde los anticuerpos están presentes en muestras de suero obtenidas de animales infectados con BoHV-1.

Por ejemplo, la unión a anticuerpo se puede detectar mediante el uso de ELISA donde los anticuerpos que pueden estar presentes en una muestra de prueba se unen a un polipéptido o péptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E (por ejemplo, cualquier polipéptido o péptido con s Eq ID NO: 1, 4-44, o 45). Tales anticuerpos se pueden detectar en fluidos corporales, incluyendo, pero no limitado a, muestras de suero o plasma. Se puede usar un dispositivo para detectar por ELISA, por ejemplo, donde un antígeno se inmoviliza en una superficie sólida tal como una tira reactiva, dispositivo de flujo lateral, chip o placa de microtitulación. El antígeno puede ser un polipéptido o péptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E (por ejemplo, cualquier polipéptido o péptido con s Eq ID NO: 1, 4-44, o 45 o combinaciones de los mismos). Cuando los anticuerpos están presentes en la muestra de prueba, esos anticuerpos reaccionan con el antígeno inmovilizado, y bloquean la unión de una entidad de unión indicador marcador marcado. La entidad de unión indicador marcador es específica para el antígeno inmovilizado (es decir, el polipéptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 o péptido del mismo) y se une al antígeno inmovilizado.

Como se describe en los ejemplos, se desarrolló un ELISA competitivo donde sueros de prueba se incubaron en pocillos recubiertos con antígeno de cola citoplásmica de glucoproteína E-His (gE CT-His). Después de lavar los sueros no unidos, el anticuerpo marcador indicador se añadió, las placas se incubaron otra vez para permitir cualquier unión que se pudiera producir entre el antígeno gE CT-His que recubre los pocillos y el anticuerpo marcador indicador. Los pocillos se lavan después y se observa la señal de un anticuerpo marcador indicador con HRP. Los sueros de prueba que contienen anticuerpos contra BoHV-1 (es decir, sueros de animales infectados con BoHV-1) tienen una señal de HRP menor que sueros sin tales anticuerpos (es decir, animales no infectados), porque los anticuerpos que los animales infectados producen están sin marcar y bloquearán la posterior unión del anticuerpo marcador indicador al antígeno gE CT-His.

Por tanto, un método para detectar infección con BoHV-1 puede incluir (a) incubar una muestra de prueba en un dispositivo que incluye un antígeno de BoHV-1 (por ejemplo, gE CT) inmovilizado a una superficie sólida; (b) eliminar la muestra de prueba no unida; (c) poner en contacto el antígeno inmovilizado en la superficie sólida con una entidad de unión indicador marcador marcado; (d) eliminar la entidad de unión indicador marcador marcado; y (e) cuantificar la cantidad de entidad de unión indicador marcador marcado unida al antígeno inmovilizado. Altos niveles de anticuerpos en una muestra de prueba producen una señal menor de la entidad de unión indicador marcador marcado porque los anticuerpos en la muestra de prueba bloquean la unión al antígeno de las entidades de unión indicadores marcadores marcados. Por tanto, una muestra de prueba que muestra una señal fuerte indica que el animal del que se obtuvo la muestra no está infectado con BoHV-1. Tales animales se pueden vacunar con la vacuna BoHV-1 tmv, si no se han vacunado ya así.

Otro método para detectar infección con BoHV-1 puede incluir (a) incubar una muestra de prueba en un dispositivo que incluye un antígeno de BoHV-1 (por ejemplo, gE CT); y (b) observar si una señal es detectable, donde la señal indica que se ha formado un complejo entre el antígeno y los anticuerpos en la muestra de prueba. El método puede incluir opcionalmente cuantificar la cantidad de señal.

La cantidad de entidad de unión indicador marcador marcado unida al antígeno se puede cuantificar obteniendo una señal cuantificada del marcador unido a la entidad de unión indicador marcador unida. Por ejemplo, cuando una entidad de unión indicador marcador está unida a un marcador coloreado o a un marcador que puede dar lugar a una señal visualmente detectable, la señal se puede cuantificar midiendo la cantidad de luz transmitida o emitida (por ejemplo, fluorescencia o luminiscencia), o la cantidad de luz absorbida. Los ejemplos proporcionados describen el uso de un anticuerpo marcado con peroxidasa de rábano (HRP), que es útil como una entidad de unión indicador marcador marcado para este tipo de ensayo. Cuando se emplea tal entidad de unión indicador marcador marcado con HRP, la cantidad de entidad de unión indicador marcador marcado unido al antígeno inmovilizado se puede determinar incubando el dispositivo en un sustrato de HRP para detectar la absorbancia del producto coloreado que se forma por la acción de la enzima HRP. Tales sustratos de HRP pueden incluir sal de diamonio del ácido 2,2'-azinobis [3-etilebenzotiazolina-6-sulfónico] (absorción a 410 nm y 650 nm), diclorhidrato de o-fenilendiamina (absorción máxima de 492 nm), o 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (máximos de absorción a 370 nm y 652 nm, que cambia a un máximo de absorción de 450 nm cuando se añade ácido sulfúrico o fosfórico para parar la reacción de HRP).

Por ejemplo, cuando las densidades ópticas de las muestras de prueba se miden y comparan a controles negativos se pueden usar los siguientes algoritmos para calcular o bien una razón muestra/control negativo (S/N) o un porcentaje de inhibición usando los siguientes algoritmos:

DO muestra

R azón^/^ = (-Do control negatiivo )

Si la razón S/N era menor que o igual a 0,6, la muestra se clasificó como positiva para la presencia de anticuerpos anti-BoHV-1 (es decir, el animal del que se obtuvo el suero estaba infectado con BoHV-1). Si la razón S/N era mayor de 0,7, la muestra se clasificó como negativa para anticuerpos anti-BoHV-1 (es decir, el animal del que se obtuvo el suero no estaba infectado con BoHV-1). Si la razón S/N era entre 0,6-0,7, entonces la muestra se clasificó como sospechosa. La prueba se puede repetir usando muestras nuevas cuando se detecta una muestra sospechosa, o el animal se puede vacunar o tratar la infección con BoHV-1.

En otro ejemplo, se puede emplear un método ELISA sándwich, donde una entidad de unión primaria (por ejemplo, anticuerpo monoclonal anti-gE CT) se inmoviliza sobre un sustrato sólido (por ejemplo, una placa de 96 pocillos), y una muestra biológica (sangre, suero, plasma, un frotis faríngeo, orina) se puede añadir al sustrato para contacto y unión con la entidad de unión inmovilizada. Después de incubación, la placa se lava con un tampón apropiado, y después una entidad de unión secundaria marcada (por ejemplo, una entidad de unión anti-gE CT marcada) se hace reaccionar con el complejo. Cuando, por ejemplo, el marcador es HRP, biotina, avidina (o estreptavidina) marcada con peroxidasa y se añade un sustrato de reacción apropiado (por ejemplo, TBM) para desarrollo de color. Después de un cierto periodo de tiempo, la determinación colorimétrica se lleva a cabo a una longitud de onda específica (por ejemplo, 450 nm).

Anticuerpos y/o entidades de unión

Como se usa en el presente documento, “entidades de unión” incluye cualquier molécula que se pueda unir específicamente a un dominio citoplásmico de gE o péptido del mismo. Cada entidad de unión se une a su dominio citoplásmico de gE diana o péptido del mismo con especificidad. Las entidades de unión son típicamente regiones de unión de moléculas de afinidad disponibles en las ciencias biológicas incluyendo, pero no limitadas a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, cremalleras de leucina, histonas, regiones determinantes de complementariedad (c Dr ), fragmentos variables monocatenarios (scFv), receptores, ligandos, aptámeros, lectinas, sondas de ácidos nucleicos y similares. Las entidades de unión pueden incluir regiones de unión que se generan, por ejemplo, de versiones de tamaño completo de una molécula de afinidad, fragmentos de una molécula de afinidad, o la porción más pequeña de la molécula de afinidad que proporciona unión que es útil en la detección de una diana de interés (un dominio citoplásmico de gE o péptido del mismo).

Los métodos, composiciones, dispositivos y kits descritos en el presente documento pueden incluir entidades de unión que son miembros de la familia de inmunoglobulinas de proteínas, o derivados de las mismas. Por ejemplo, la entidad de unión puede ser una inmunoglobulina completa o anticuerpo, un fragmento, un fragmento variable monocatenario (scFv), una región variable de la cadena pesada o ligera, una secuencia de péptido CDR, y/o similares.

Como se usa en el presente documento, “anticuerpo” se refiere a una molécula de inmunoglobulina, y fragmentos de la misma, que son inmunológicamente reactivos con un antígeno particular. El término “anticuerpos” se refiere a una pluralidad de tales moléculas y no está limitado a poblaciones homogéneas de un único tipo de anticuerpo. El término “anticuerpo” también incluye formas genéticamente manipuladas tal como anticuerpos quiméricos, anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos Fv monocatenarios recombinantes (scFv), y fragmentos Fv estabilizados con disulfuro (dsFv) (véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 5.747.654). El término “anticuerpo” también incluye formas de unión a antígeno de anticuerpos (por ejemplo, Fab', F(ab')2, Fab, Fv e IgG. Véase también, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). El término “anticuerpo” incluye un fragmento inmunológicamente activo de una molécula de inmunoglobulina tal como el fragmento Fab o F(ab')2 generados, por ejemplo, por corte del anticuerpo con una enzima tal como pepsina o coexpresión de una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo en bacterias, levadura, célula de insecto o célula de mamífero. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo IgG, IgD, IgA, IgE o IgM.

Los anticuerpos para uso en los métodos, composiciones, kits y dispositivos descritos en el presente documento se pueden obtener comercialmente o se pueden generar por métodos disponibles. Los métodos de hacer entidades de unión, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos están disponibles en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (1988), específicamente incorporado al presente documento mediante referencia en su totalidad). Por ejemplo, los anticuerpos adecuados para uso en los dispositivos se pueden obtener inmunizando un animal tal como un conejo, cabra, oveja, caballo, o cobaya. tales anticuerpos están presentes en la sangre (por ejemplo, suero) de los animales inmunizados.

Los fragmentos de anticuerpos se pueden preparar por hidrólisis proteolítica del anticuerpo o por expresión de ácidos nucleicos que codifican el fragmento de anticuerpo en un huésped adecuado. Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener por digestión con pepsina o papaína de anticuerpos enteros por métodos convencionales. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos de anticuerpos por corte enzimático de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S descrito como F(ab')2. Este fragmento se puede cortar adicionalmente usando un agente reductor de tiol, y opcionalmente usando un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo resultantes del corte de los enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes Fab' de 3,5S. Alternativamente, el corte enzimático usando pepsina produce dos fragmentos monovalentes Fab' y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, en las patentes en EE UU No. 4.03.945 y No. 4.331.647, y referencias contenidas en las mismas.

Un número de proteínas pueden servir como andamiajes de proteínas a los que se pueden adherir dominios de unión y de esta manera formar una entidad de unión adecuada. Los dominios de unión se unen o interaccionan con dominios citoplásmicos de gE mientras que el andamiaje de proteínas simplemente mantiene y estabiliza los dominios de unión de modo que se puedan unir. Se puede usar un número de andamiajes de proteína. Por ejemplo, se pueden usar proteínas de cápside de fagos. Véase una revisión en Clackson & Wells, Trends Biotechnol. 12:173-184 (1994). Las proteínas de cápside de fagos se han usado como andamiajes para presentar secuencias peptídicas aleatorias, incluyendo inhibidor de tripsina pancreático bovino (Roberts et al., PNAS 89:2429-2433 (1992)), hormona de crecimiento humana (Lowman et al., Biochemistry 30:10832-10838 (1991)), Venturini et al., Protein Peptide Letters 1:70-75 (1994)), y el dominio de unión a IgG de Streptococcus (O'Neil et al., Techniques in Protein Chemistry V (Crabb, L,. ed.) pp. 517-524, Academic Press, San Diego (1994)). Estos andamiajes muestran un bucle o región aleatorizada única que se puede modificar para incluir los dominios de unión para el dominio citoplásmico de gE o un péptido del mismo.

También se ha usado el dominio de fibronectina de tipo III como un andamiaje de proteína para servir como plataforma de entidad de unión. La fibronectina de tipo III es parte de una gran subfamilia (familia Fn3 o familia Ig de tipo s) de la superfamilia de inmunoglobulinas. Se proporcionan secuencias, vectores y procedimientos de clonación para usar tal dominio de fibronectina de tipo III como porción de andamiaje de proteína de una entidad de unión (por ejemplo, que incluye péptidos CDR), por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de Patente en EEUU 20020019517. Véase también Bork, P. & Doolittle, R. F. (1992) Proposed acquisition of an animal protein domain by bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8990-8994; Jones, E. Y. The immunoglobulin superfamily Curr. Opinion Struct. Biol. 3, 846-852 (1993); Bork, P., Hom, L. & Sander, C. (1994) The immunoglobulin fold. Structural classification, sequence patterns and common core. J. Mol. Biol. 242, 309-320; Campbell, I. D. & Spitzfaden, C. (1994) Building proteins with fibronectin type III modules Structure 2, 233-337; Harpez, Y. & Chothia, C. (1994).

Puede ser útil emplear una entidad de unión que se una a un dominio citoplásmico de gE o péptido del mismo con especificidad. Por ejemplo, la entidad de unión puede tener una afinidad para un dominio citoplásmico de gE o péptido del mismo donde la afinidad es de aproximadamente 1*107 M'1 a aproximadamente 1*101° M-1, o de aproximadamente 1*108 M’1 a aproximadamente 1*109 M-1. Por ejemplo, la afinidad puede ser al menos aproximadamente 1*107 M-1, al menos aproximadamente 1*108 M-1, al menos aproximadamente 1*109 M-1, o al menos aproximadamente 1*101° M-1. La afinidad de una entidad de unión se puede medir detectando y cuantificando la formación de un complejo entidad de unión-dominio citoplásmico de gE (o un complejo entidad de unión-péptido del dominio citoplásmico de gE), en general denominado como un complejo antígeno-anticuerpo [Ag-Ac]. La formación de tal complejo antígenoanticuerpo [Ag-Ac] se ilustra mediante la siguiente reacción.

La formación de tal complejo Ag-Ac está por tanto en equilibrio con su disociación, y la constante de asociación en equilibrio (KA) del complejo se puede calcular como sigue:

KA = 1/kd = [Ag-Ac]/[Ag][Ac]

Como se usa en el presente documento, el término “se une específicamente” o “específicamente se une”, en referencia a la interacción de una entidad de unión o anticuerpo con un dominio citoplásmico de gE o péptido del mismo, significa que la entidad de unión o anticuerpo se une con un antígeno particular (por ejemplo, dominio citoplásmico de gE o péptido del mismo con cualquiera de SEQ ID NO: 5-45) sin unirse sustancialmente a otras proteínas de BoHV-1 o péptidos de las mismas (incluyendo la porción no de la cola citoplásmica de la proteína gE).

Por ejemplo, en algunas formas de realización, se pueden emplear entidades de unión en los métodos, composiciones, kits y dispositivos descritos en el presente documento que se unen con mayor afinidad o selectividad al péptido del dominio citoplásmico de gE (tal como uno con SEQ ID NO: 45, o cualquiera de SEQ ID NO: 5-44) que la afinidad o selectividad de la entidad de unión para un dominio citoplásmico de gE de longitud completa (por ejemplo, con SEQ ID NO: 1 o 4), o viceversa. Por ejemplo, se pueden emplear entidades de unión en los métodos, composiciones, kits y dispositivos descritos en el presente documento que se unen al péptido del dominio citoplásmico de gE (tal como uno con cualquiera de SEQ ID NO: 5-45) con al menos el 50% o más afinidad (o selectividad), o el 60% más afinidad (o selectividad), o el 70% más afinidad (o selectividad), o el 80% más afinidad (o selectividad), o el 85% más afinidad (o selectividad), o el 90% más afinidad (o selectividad), o el 95% más afinidad (o selectividad), que a un dominio de cola citoplásmica de gC con SEQ ID NO: 1 o 4.

De forma similar, por ejemplo, de realización, se pueden emplear entidades de unión en los métodos, composiciones, kits y dispositivos descritos en el presente documento que se unen con mayor afinidad o selectividad a un dominio de cola citoplásmica de gE con SEQ ID NO: 1 o 4, que a un péptido con cualquiera de SEQ ID NO: 5-45. Por ejemplo, la entidad de unión se puede unir al dominio de cola citoplásmica de gE con SEQ ID NO: 1 o 4 con al menos el 50% o más afinidad (o selectividad), o el 60% más afinidad (o selectividad), o el 70% más afinidad (o selectividad), o el 80% más afinidad (o selectividad), o el 85% más afinidad (o selectividad), o el 90% más afinidad (o selectividad), o el 95% más afinidad (o selectividad), que la entidad de unión se une a un péptido con cualquiera de SEQ ID NO: 5-45.

Las entidades de unión se pueden separar de impurezas antes de la incorporación a las composiciones, kits o dispositivos. Por ejemplo, las entidades de unión se pueden purificar o aislar usando métodos de purificación tales como técnicas electroforéticas, moleculares, inmunológicas y cromatográficas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, hidrofóbica, de afinidad y HPLC de fase inversa, y cromatoenfoque y similares. El grado de purificación necesario variará dependiendo de los contaminantes presentes con las entidades de unión. En algunos casos no será necesaria purificación (por ejemplo, cuando las entidades de unión están comercialmente disponibles y proporcionadas en forma purificada).

Los anticuerpos dirigidos contra el dominio citoplásmico de gE con SEQ ID NO: 1 o 4, o contra un péptido del dominio citoplásmico de gE con cualquiera de SEQ ID NO: 5-45 con frecuencia son anticuerpos monoclonales.

Un anticuerpo monoclonal es una población de moléculas que tienen un sitio de unión a antígeno común que se une específicamente con un epítopo antigénico particular. Un anticuerpo monoclonal se puede obtener seleccionando una célula productora de anticuerpos de un mamífero que ha sido inmunizado con un antígeno seleccionado tal como un dominio citoplásmico de gE con SEQ ID NO: 1 o 4, o un péptido del mismo con cualquiera de SEQ ID NO: 5-45, y fusionando la célula productora de anticuerpos, por ejemplo, una célula B, con un mieloma para generar un hibridoma productor de anticuerpos. Un anticuerpo monoclonal también se puede obtener por cribado de una genoteca combinatoria recombinante tal como una genoteca de presentación en fagos de anticuerpos. Véase, por ejemplo, PHAGE DISPLAY — A LABORATORY MANUAL, Barbas, et al., eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001; y Kontermann & Dübel, ANTIBODY ENGINEERING, Heidelberg: Springer-Verlag. Berlín, 2001. Las técnicas para preparar células de hibridoma secretoras de anticuerpos monoclonales también se describen, por ejemplo, por Kohler y Milstein, Nature 256:495-97 (1975) y Kozbor et al. Immunol Today 4: 72 (1983).

Un anticuerpo monoclonal contra un dominio citoplásmico de gE o un péptido del mismo también se puede preparar usando otros métodos disponibles en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden obtener por cribado de una genoteca de inmunoglobulinas combinatoria recombinante usando un dominio citoplásmico de gE seleccionado o péptido del mismo (por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NO: 1, 4, 5-44 o 45). Las inmunoglobulinas que selectivamente se unen a un dominio citoplásmico de gE seleccionado o péptido del mismo se pueden producir por expresión recombinante de células que codifican la inmunoglobulina de interés.

Los anticuerpos se pueden evaluar para afinidad a un dominio citoplásmico de gE seleccionado o péptido del mismo usando procedimientos estándar incluyendo, por ejemplo, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) para determinar el título de anticuerpo, y cromatografía con proteína A para obtener una fracción de IgG que contiene el anticuerpo.

Otro método para generar anticuerpos implica un método de anticuerpo de linfocito seleccionado (SLAM). La tecnología SLAM permite la generación, aislamiento y manipulación de anticuerpos monoclonales sin necesitar generar un hibridoma. La metodología principalmente implica el crecimiento de células formadoras de anticuerpos, la selección física de células formadoras de anticuerpos específicamente seleccionadas, el aislamiento de los genes que codifican el anticuerpo y la posterior clonación y expresión de esos genes.

Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos se pueden mutar para optimizar la afinidad, selectividad, potencia de unión u otra propiedad deseable de un anticuerpo. Un anticuerpo mutante se refiere a una variante de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo. En general, uno o más de los residuos de aminoácidos en el anticuerpo mutante es diferente del que está presente en el anticuerpo de referencia. Tales anticuerpos mutantes necesariamente tienen menos del 100% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos de referencia. En general, los anticuerpos mutantes tienen al menos el 75% de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácido del dominio variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de referencia. Preferiblemente, los anticuerpos mutantes tienen al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, incluso más preferiblemente al menos el 90%, y lo más preferiblemente al menos el 95% de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de referencia.

Marcadores

Se puede usar una variedad de diferentes marcadores en los métodos, composiciones, entidades de unión, kits y dispositivos descritos en el presente documento. Los marcadores pueden estar covalentemente unidos a cualquiera de las entidades de unión, cebadores o sondas descritos en el presente documento. Alternativamente, los marcadores se pueden asociar de forma no covalente con una sonda o cebador hibridado que está unido específicamente a un ácido nucleico diana (por ejemplo, un ARNm que codifica un dominio citoplásmico de gE o un péptido del mismo). Similarmente, un marcador puede estar unido de forma no covalente o indirecta a una entidad de unión. Por ejemplo, el marcador puede ser un sustrato de enzima que cambia a un producto detectable (por ejemplo, coloreado) cuando se expone a una enzima. Alternativamente, el marcador puede ser una enzima que genera una señal coloreada cuando se expone a un sustrato.

Los denominados “marcadores directos” son marcadores detectables que están unidos directamente a o incorporados en una entidad de unión que después se puede unir a un dominio citoplásmico de gE o péptido del mismo. En contraste, los denominados “marcadores indirectos” están unidos a un complejo formado entre un dominio citoplásmico de gE o péptido del mismo, y una entidad de unión después de la formación del complejo. Por ejemplo, un marcador indirecto puede estar unido a un anticuerpo secundario que se une a un epítopo diferente en un dominio citoplásmico de gE o péptido del mismo, que un anticuerpo primario. En otro ejemplo, el marcador puede estar unido a un anticuerpo secundario que se une a un anticuerpo primario que ya está unido a un dominio citoplásmico de gE o péptido del mismo.

Los ejemplos de marcadores incluyen, pero no están limitados a, fluoróforos, cromóforos, radióforos, enzimas, sustratos enzimáticos, etiquetas enzimáticas, anticuerpos, marcadores de quimioluminiscencia, electroluminiscencia y afinidad. Un experto en la materia reconocerá que estos y otros marcadores se pueden usar con éxito en esta invención. Los ejemplos de marcadores enzimas incluyen enzimas tal como ureasa, fosfatasa alcalina, o peroxidasa, por mencionar unas pocas. Se pueden emplear sustratos indicadores colorimétricos para proporcionar un medio de detección visible al ojo humano o espectrofotométricamente. Los ejemplos de fluoróforos incluyen, pero no están limitados a, Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5, 6-FAM, Fluoresceína, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rodamina Green, Rodamina Red, ROX, TAMRA, TET, tetrametilrodamina, y Texas Red.

Los medios de detectar tales marcadores los conocen bien los expertos en la materia. Por ejemplo, los marcadores fluorescentes se pueden detectar usando un microscopio, fotodetector o fluorímetro para detectar la luz emitida. En ejemplos aún adicionales, los marcadores enzimáticos se pueden detectar proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima en el sustrato, y los marcadores colorimétricos se detectan simplemente visualizando el marcador o producto de reacción coloreado; o mediante el uso de un espectrofotómetro.

Dispositivo de ensayo inmunológico

Un dispositivo para detectar infección con BoHV-1 se muestra en la figura 7.

La figura 7A muestra un diagrama esquemático de un dispositivo con una carcasa elongada 10 que contiene una tira de flujo lateral 20. La tira de flujo lateral 20 se extiende sustancialmente en la longitud entera de la carcasa 10. La tira de flujo lateral 20 está dividida en un área de aplicación de la muestra 40 colocada debajo de un puerto de introducción de la muestra 30, un sitio de conjugación antígeno-anticuerpo 50, un área de captura 60, y una almohadilla absorbente distal 70. El sitio de conjugación antígeno-anticuerpo 50 puede tener antígenos móviles 55 (por ejemplo, una cola citoplásmica de la glucoproteína E o un péptido de la misma). La tira de flujo 20 también puede tener un refuerzo 80. El antígeno móvil 55 en el sitio de conjugación antígeno-anticuerpo 50 puede ser antígenos marcados (tal como antígeno conjugado con oro) que puede reaccionar con y unirse a anticuerpos en una muestra de prueba de un animal. Una ruta de flujo a lo largo de la tira de flujo lateral 20 pasa del área de aplicación de la muestra 40, a través del sitio de conjugación antígeno-anticuerpo 50, al área de captura 60. Las entidades de unión inmovilizadas tal como un anticuerpo que reconoce una región constante de anticuerpos bovinos, están colocados en el área de captura 60. Los antígenos móviles 55 pueden unir uno o más anticuerpos que pueden estar presentes en una muestra de prueba y el flujo líquido puede transportar un conjugado formado entre un antígeno móvil y un anticuerpo al área de captura 60, donde entidades de unión inmovilizadas pueden capturar los conjugados antígeno-anticuerpo y concentrar el marcador en el área de captura 60.

Los antígenos móviles 55 sin un anticuerpo unido pasan a través del área de captura 60 y finalmente se recogen en la almohadilla absorbente distal 70.

La tira de flujo lateral 20 también puede incluir un área de verificación de la reacción o control 90. Tal área de control 90 (por ejemplo, configurada como una línea) puede estar ligeramente distal respecto al área de captura 60. El área de verificación de la reacción o control 90 ilustra a un usuario que la prueba se ha realizado. Antes de que se realice la prueba, el área de verificación de reacción o control 90 no es visible. Sin embargo, cuando la prueba se realiza colocando una muestra líquida en el área de aplicación de la muestra 40, el área de verificación de la reacción o control 90 se puede volver visible según fluye la muestra a través del área de captura 60 y a la almohadilla absorbente distal 70. Por ejemplo, el área de verificación de la reacción o control 90 se puede volver visible debido a una sustancia química que reacciona con cualquier componente de la muestra o simplemente debido a la presencia de humedad en la muestra.

Los resultados cuantitativos se pueden verificar basado en la magnitud de la señal identificable del área de captura 60 después de la aplicación de una muestra a un puerto de introducción de muestra 30. Por ejemplo, en la figura 7B una señal representada por una serie de asteriscos (*****) está presente en el área de captura 60. La señal se puede identificar por inspección visual del dispositivo, y/o la señal se puede registrar y/o procesar por un detector o un dispositivo inteligente. Tal dispositivo inteligente puede ser un pequeño ordenador de bolsillo, un portátil, un netbook, un ordenador de sobremesa, o un teléfono inteligente. Por ejemplo, el sujeto puede mostrar y/o registrar los resultados tomando una fotografía del dispositivo de detección después del ensayo mediante el uso de un dispositivo inteligente. El dispositivo inteligente se puede configurar para interpretar los resultados detectando el tipo y/o potencia de una señal en el área de captura 60 de un dispositivo de detección.

Tal dispositivo de flujo lateral puede ser lo suficientemente pequeño para el transporte en un bolsillo, paquete de laboratorio móvil, mochila, o cartera. Por ejemplo, los dispositivos de flujo lateral pueden tener de aproximadamente 1 a 3 pulgadas de longitud y de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 1,5 pulgadas de ancho. En general, los dispositivos de flujo lateral son finos, tienen una profundidad de solo aproximadamente 0,1 a 0,75 pulgadas.

Otro dispositivo que se puede usar para detectar infección con BoHV-1 es un biosensor conductométrico de transferencia de carga directa. Tales biosensores conductométricos de transferencia de carga directa son similares en estructura a los dispositivos de flujo lateral y se pueden proporcionar en un embalaje que es pequeño, por ejemplo, no mayor que un paquete de chicles. Los biosensores conductométricos de transferencia de carga directa pueden emplear antígeno inmovilizado y polianilina (sal emeraldina) como un transductor para la detección. El antígeno puede ser un polipéptido de cola citoplásmica de glucoproteína E o péptido del mismo) que se puede unir a anticuerpos anti-BoHV-1 que pueden estar presentes en una muestra de prueba. El flujo de carga de electrones es ayudado mediante polianilina conductora, para generar una señal electrónica que se puede registrar por un sistema de recogida de datos.

La arquitectura del biosensor puede ser similar a un dispositivo de flujo lateral. La polialinina unida al antígeno móvil puede primero capturar anticuerpos anti-BoHV-1 en una muestra de prueba, si están presentes, para formar un complejo entre las moléculas de antígeno móviles y los anticuerpos. El complejo puede fluir por acción capilar a un sitio de captura en el dispositivo donde se puede formar un complejo con anticuerpos inmovilizados que se unen a los anticuerpos anti-BoHV-1. Tal interacción proporciona un flujo de electrones directo para generar una señal de resistencia que se puede observar y/o registrar. El dispositivo es fácil de usar, y proporciona resultados rápidos, pero sensibles. Véase, por ejemplo, Pal et al., Biosens. Bioelectron. 22(9-10): 2329-36 (2007) (que se incorpora al presente documento mediante referencia en su totalidad).

Por ejemplo, se pueden sintetizar partículas (por ejemplo, nanopartículas) magnéticas recubiertas de polianilina eléctricamente activas (EAPM) recubriendo la superficie de núcleos de óxido de hierro gamma con monómeros de anilina que son eléctricamente activos. Se puede hacer que los monómeros de anilina sean eléctricamente activos, por ejemplo, por dopado con ácido. Las moléculas de antígeno se adsorben o unen covalentemente a las partículas EAPM. Las partículas EAPM combinadas con el antígeno móvil se pueden incorporar a un biosensor configurado similar a un dispositivo de flujo lateral. El flujo capilar del complejo entre anticuerpos de la muestra de prueba y el antígeno-partículas EAPM. La detección del complejo formado entre los anticuerpos y el antígeno-partículas EAPM se produce según el complejo fluye en una región de captura donde la transferencia de carga directa se puede producir a través de las partículas EAPM.

Por tanto, para formar este tipo de dispositivo, dos o mas electrodos se pueden serigrafiar en un sustrato sólido (por ejemplo, papel, nitrocelulosa u otro sustrato conveniente), donde la distancia entre los electrodos es suficiente para aislar cada electrodo del otro hasta que se produce la transferencia de carga a través de las partículas EAPM en la región de captura entre los electrodos. La superficie de un soporte sólido (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa) se puede modificar por un agente entrecruzador tal como glutaraldehído para inmovilizar una entidad de unión (por ejemplo, que reacciona con anticuerpos en la muestra de prueba). El antígeno móvil partículas EAPM con cualquier anticuerpo unido se extraen por acción capilar a la región de captura. La polianilina actúa como un transductor de señal eléctrica que señaliza la unión entre el antígeno móvil-anticuerpo partículas EAPM y las entidades de unión inmovilizadas. Tal respuesta eléctrica se puede medir por medida en modo pulso, que proporciona una medida cuantitativa de la cantidad de anticuerpos anti-BoHV-1 unidos al sitio de captura.

Por ejemplo, la figura 7C es un diagrama esquemático de un diagrama esquemático de un biosensor conductométrico de transferencia de carga directa con dos electrodos 65 y 67, que pueden transferir una carga a través de las partículas EAPM en la región de captura 60 entre los electrodos. La figura 7D ilustra esquemáticamente la recogida de partículas EAPM (*****) en la región de captura 60 entre los electrodos.

La infección de BoHV-1 se puede identificar por inspección visual del dispositivo y/o por la transferencia de carga entre los electrodos que proporciona una señal eléctrica que comunica si está presente o no infección con BoHV-1. La señal también se puede transmitir a través de un transmisor 95 a un receptor o dispositivo inteligente (por ejemplo, un pequeño ordeñador de bolsillo, un portátil, un netbook, un ordenador de sobremesa, o un teléfono inteligente), que puede recibir los resultados, registrar los resultados, y alertar al personal de que se ha detectado una infección con BoHV-1.

Otro dispositivo de detección que se puede emplear para detectar infección con BoHV-1 utiliza identificación de radiofrecuencia (RFID), donde etiquetas (“marcadores inteligentes”) proporcionan una señal a un lector de mano o estacionario. Tales dispositivos de detección de RFID se pueden proporcionar en un embalaje que tiene aproximadamente el mismo tamaño que un paquete de chicles o más pequeño. Las etiquetas de radiofrecuencia pueden ser de varias formas, tamaños, e intervalos de lectura. Por ejemplo, las etiquetas pueden ser muy pequeñas, y las tiras de detección con las etiquetas pueden ser finas y flexibles. En algunos casos, los dispositivos de identificación de radiofrecuencia pueden tener etiquetas en una tira de papel o plástico. Tales etiquetas de RFID pueden contener chips de silicio y, en algunas formas de realización, antenas. Las etiquetas pasivas no requieren fuente de alimentación interna, mientras que las etiquetas activas requieren una fuente de alimentación interna.

La configuración de un dispositivo de detección de BoHV-1 que contiene RFID puede ser similar a un dispositivo de flujo lateral. Por ejemplo, el dispositivo de RFID puede tener un puerto de muestra en el que se carga la muestra. Tal muestra puede comprender, por ejemplo, saliva, sangre completa, plasma, suero, orina, linfa, etc. La muestra puede fluir a un sitio de conjugación antígeno-anticuerpo donde los anticuerpos en una muestra de prueba se pueden unir a antígenos marcados con RFID móviles. La muestra pasa (por ejemplo, por flujo capilar) a una zona de captura e identificación de RFID, en la que los complejos RFID-antígeno-anticuerpo se inmovilizan, por ejemplo, por unión a una entidad de unión inmovilizada que se une a anticuerpos bovinos (por ejemplo, a la región constante de anticuerpos bovinos). La región de captura se somete después a interrogación de RFID por un detector de RFID. Los antígenos marcados con RFID sin reaccionar (es decir, no unidos a un anticuerpo de la muestra de prueba) y otros componentes de la muestra pasan a través de la zona de captura e identificación de RFID a una zona de “residuos” protegida de radiofrecuencia, que puede tener protección para prevenir que la etiquetas RFID en la misma sean detectadas por el detector de RFID. La detección de una etiqueta RFID particular por el detector de RFID es indicativa de que están presentes anticuerpos anti-BoHV-1 en la muestra. Véase, por ejemplo, el documento US 20120269728 por Jen et al., que se incorpora específicamente al presente documento mediante referencia en su totalidad.

La figura 7E es un diagrama esquemático que ilustra un dispositivo de detección que tiene etiquetas RFID como marcadores en antígenos 55. El dispositivo puede tener un sitio de conjugación antígeno-anticuerpo no protegido 50, y una protección 75 sobre la almohadilla absorbente distal 70, de modo que la recogida de etiquetas RFID en el área de captura 60 puede transmitir una señal de radio (representada por *****, véase la figura 7F). Tal señal indica que están presentes anticuerpos anti-BoHV-1 en la muestra de prueba y han sido detectados por el dispositivo.

Un detector o lector puede recibir una señal de etiqueta activa o pasiva de la tira reactiva de RFID. Un sistema de lector pasivo etiqueta activa (PRAT) tiene un lector pasivo que solo recibe señales de radio de etiquetas activas (operada por batería, transmisión solo). El intervalo de recepción de un lector de sistema PRAT se puede ajustar de 1-2.000 pies, lo que permite alguna flexibilidad en el campo. El detector o lector puede ser un dispositivo inteligente.

Un sistema de lector activo etiqueta pasiva (ARPT) tiene un lector activo, que transmite señales interrogadoras y también recibe respuestas de autenticación de etiquetas pasivas. Un sistema de lector activo etiqueta activa (ARAT) usa etiquetas activas despertadas con una señal interrogadora del lector activo. Una variación de este sistema puede implicar el uso de una etiqueta pasiva asistida por batería (BAP) que actúa como una etiqueta pasiva, pero tiene una pequeña batería para alimentar la señal de información de retorno de la etiqueta. El detector o lector puede ser un dispositivo inteligente, que puede recibir señales de radio a través de transmisión y/o recepción Bluetooth.

Otro dispositivo que se puede usar para determinar la presencia de infección con BoHV-1 es una muestra líquida en una tira reactiva. Las tiras reactivas se pueden proporcionar en un rollo, donde una sección del rollo se corta para el ensayo. Alternativamente, las tiras reactivas se pueden proporcionar en un embalaje que tiene aproximadamente el mismo tamaño que un paquete de chicles o más pequeño. La tira reactiva puede tener uno o más antígeno de gE CT (por ejemplo, uno o más con SEQ ID NO: 1, 4-44 y/o 45) inmovilizados en la misma. Se puede aplicar un fluido corporal a la tira reactiva y se puede detectar una señal cuando están presentes anticuerpos anti-BoHV-1 en el fluido corporal. Para aumentar la señal, la tira se puede colocar opcionalmente en una solución de revelado. La señal indica que la muestra es de un animal infectado con BoHV-1.

La figura 8 muestra un ejemplo de un rollo de tiras reactivas 100. El rollo de tiras reactivas 100 tiene uno o más tipos de antígenos inmovilizados 110 que pueden unirse específicamente a anticuerpos anti-BoHV-1 que pueden estar presentes en una muestra de prueba. Un sujeto puede cortar un segmento de tira reactiva 105 del rollo de tiras reactivas 100. La muestra de prueba (por ejemplo, un fluido corporal tal como suero, sangre, saliva, moco, u orina) se puede aplicar en cualquier sitio a lo largo del segmento de tira reactiva 105. Se puede detectar una señal de la tira reactiva cuando una muestra de prueba contiene anticuerpos contra BoHV-1. Se puede usar un líquido de enjuague 120 (por ejemplo, agua o PBS) para eliminar los materiales no unidos después de que la muestra se haya aplicado al segmento de tira reactiva 105. El segmento de tira reactiva 105 se puede opcionalmente sumergir en una o más soluciones de revelado 130 que se pueden proporcionar con el rollo de tiras reactivas 100. La señal se puede detectar directamente o la tira se puede opcionalmente enjuagar en un líquido de enjuague 140 (por ejemplo, agua o PBS). La señal (por ejemplo, un color) indica que la muestra es de un animal infectado con BoHV-1. El rollo de tiras reactivas 100 puede ser material rectangular elongado enrollado en un rollo. Segmentos 105 del rollo de tiras reactivas 100 se retiran fácilmente o cortan del rollo sin perdida o cambios en las propiedades de detección de los materiales que hacen el rollo de tiras reactivas 100. En ciertos ejemplos, el rollo de tiras reactivas 100 puede estar compuesto de papel, nitrocelulosa u otros materiales inertes porosos. Las tiras reactivas también pueden estar en forma de tiras cortas (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 3 pulgadas de longitud), que se proporcionan en un embalaje que tiene aproximadamente el mismo tamaño que un paquete de chicles o más pequeño.

Las tiras reactivas pueden ser flexibles y fáciles de transportar como tiras individuales en un pequeño paquete, o como un rollo continuo de material de tira reactiva. La tira reactiva puede variar de anchura, espesor, y longitud. Por ejemplo, la tira reactiva puede tener de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1 pulgada de anchura. La tira reactiva puede ser tan gruesa como una pieza de papel o algo más gruesa, por ejemplo, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,5 pulgadas de espesor. Las tiras individuales pueden tener de aproximadamente 1 pulgada a 3 pulgadas de longitud. Un material de tira reactiva en rollo continuo puede ser de longitud variable, por ejemplo, una longitud que permite el transporte fácil en un bolsillo o bolso cuando está enrollado.

La(s) solución(es) de revelado pueden contener reactivos que reconocen el complejo antígeno-anticuerpo y que proporcionan una señal visualmente detectable que identifica que tal complejo se ha formado. Por ejemplo, una solución de revelado puede contener una entidad de unión o anticuerpo secundario que se une a anticuerpos anti-BoHV-1 para formar un complejo ternario con un antígeno-anticuerpo inmovilizado en la tira reactiva. La entidad de unión o anticuerpo secundario puede estar unido a un marcador visualmente detectable, o puede estar unido a una entidad que puede generar una señal visualmente detectable tras exposición a un sustrato. Por ejemplo, la entidad de unión o anticuerpo secundario puede estar unido a una enzima que produce una señal visualmente detectable tras exposición a un sustrato para la enzima.

Los resultados cuantitativos se verificar basado en la magnitud de la señal identificable del segmento de la tira reactiva 105 que se ha tratado como se ha descrito anteriormente. Se puede usar un dispositivo inteligente para mostrar, registrar, graficar y/o interpretar los resultados. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento pueden incluir una etapa de fotografiar los resultados mostrados en el dispositivo de detección usando un dispositivo inteligente. El dispositivo inteligente puede registrar, procesar, y mostrar los resultados, así como interpretaciones gráficas de los resultados.

Por tanto, se pueden usar una variedad de dispositivos para evaluar muestras de prueba para infección con BoHV-1.

Kits

Para proporcionar a los expertos en la materia herramientas para usar la presente invención, el polipéptido o péptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E (por ejemplo, cualquier polipéptido o péptido con SEQ ID NO: 1, 4-44, 45, o una combinación de los mismos) se puede ensamblar en kits para el diagnóstico, detección o confirmación de BoHV-1. La presencia de anticuerpos reactivos a un polipéptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E o péptido del mismo (por ejemplo, cualquier polipéptido o péptido con SEQ ID NO: 1, 4-44, 45, o una combinación de los mismos) se usa para identificar animales infectados con BoHV-1 y/o animales que se beneficiarían de vacunación con la vacuna BoHV-1 tmv. La información proporcionada también se usa para dirigir el curso de tratamiento. Por ejemplo, si se encuentra que un sujeto tiene anticuerpos contra polipéptidos de la cola citoplásmica de la glucoproteína E (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o 4) o péptidos de los mismos (por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NO: 5-45), proporciona antígenos útiles para la detección de anticuerpos que están circulando en animales con BoHV-1.

Los kits pueden incluir un medio soporte para los dispositivos y reactivos, así como otros componentes de los kits. Tal soporte puede ser una caja, una bolsa, una cartera, un cartón plástico (tal como plástico moldeado u otro embalaje transparente), envoltorio (tal como, un envoltorio, de papel, o metálico plástico sellado o sellable), u otro recipiente. En algunos ejemplos, los componentes del kit estarán encerrados en una única unidad de embalaje, tal como una caja u otro recipiente, unidad de embalaje que puede tener compartimentos en los que se pueden colocar uno o más componentes del kit. En otros ejemplos, un kit incluye uno o más recipientes, por ejemplo, viales, tubos, y similares que pueden contener por separado, por ejemplo, una o sondas de ácido nucleico, una o más entidades de unión, uno o más dispositivos, así como muestras o soluciones de control positivo y/o negativo.

Por ejemplo, al menos uno de los recipientes puede incluir al menos un antígeno de BoHV-1 tal como un polipéptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o 4) o un péptido del mismo (por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NO: 5-45). En otra forma de realización, al menos uno de los recipientes puede incluir al menos una entidad de unión que se une con especificidad o selectividad al polipéptido de la cola citoplásmica de la glucoproteína E de BoHV-1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o 4) o un péptido del mismo (por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NO: 5-45). Las entidades de unión pueden estar marcadas detectablemente. Por ejemplo, las entidades de unión pueden estar embaladas por separado de los marcadores, y el marcador se puede añadir a las entidades de unión durante o después de realizar un ensayo para detectar BoHV-1.

Los kits también pueden contener viales, agujas, jeringas, dispositivos para la punción digital, hisopos de alcohol, cuadrados de gasa, bolas de algodón, vendas, guantes de látex, bandejas de incubación con número variable de pocillos, selladores de placa adhesivos, hojas de descripción de datos, que pueden ser útiles para el manejo, recogida y/o procesamiento de muestras biológicas. Los kits también pueden contener opcionalmente implementos útiles para introducir las muestras en una cámara de ensayo o un dispositivo de captura de células incluyendo, por ejemplo, cuentagotas, pipetas desechables, tubos capilares, peras de succión (por ejemplo, para tubos capilares), y similares. También pueden estar presentes otros componentes en el kit tal como medios de eliminación para descartar dispositivos usados y/o otros elementos usados con el dispositivo (tal como muestras del paciente, etc.). Tales medios de eliminación pueden incluir, sin limitación, recipientes que pueden contener pérdida de materiales desechados, tal como bolsas, cajas o recipientes de plástico, metal u otras impermeables.

Los kits pueden incluir instrucciones para realizar un ensayo tal como un inmunoensayo.

El uso de los métodos, composiciones, dispositivos y kits descritos en el presente documento facilita la detección temprana de infección con BoHV-1, e identifica animales que deberían ser vacunados y/o tratados para la infección.

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran algunos de los materiales, métodos y experimentos usados en el desarrollo de la invención.

Ejemplo 1: Materiales y Métodos

Este ejemplo describe algunos de los materiales y métodos usados en desarrollar la invención.

Células y cepa de virus.

La línea celular de riñón bovino Madin-Darby (MDBK) obtenida de la Colección Americana de Cultivo Tipo (Manassas, Va.) se mantuvo en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (SBF) inactivado con calor al 5-10% (HyClone Laboratories, Inc., South Logan, Utah). La cepa de BHV-1 cobre (Colorado-1), obtenida de la Colección Americana de Cultivo Tipo (Cat# CRL-1390; Manassas, Va.), se propagó y tituló en células MDBK como se describe por Chowdhury (Microbiol 52(1-2):13-23 (1996)).

El virus BoHV-1 tmv que contiene deleciones de los residuos 30-32 y 80-96 de UL49.5, los residuos 452-575 de la cola citoplásmica (CT) de gE, y el gen Us9 entero, así como el virus BoHV-1 con gE delecionado con una deleción del marco abierto de lectura entero de gE, se construyeron como se describe por Wei & Chowdhury, PloS one 6(10):e25742 (2011); y Brum et al. J Neurovirol 15(2):196-201 (2009)). La cepa de BoHV-1 cobre (Colorado-1) (ATCC Cat# CRL-1390; Manassas, Va.) se usó como la cepa de tipo salvaje de referencia.

Anticuerpos monoclonales/policlonales

Se usaron Acm anti-etiqueta His de ratón (Genscript Cat # A00186) y/o anticuerpo específico de gE CT de cabra (Chowdhury et al., Vaccine 32(39):4909-4915 (2014)) anticuerpo policlonal de cabra anti-ratón conjugado con HRP (Thermo Scientific) para confirmar la reactividad y especificidad de la proteína recombinante y Acm, respectivamente.

Construcción de un plásmido pET-43.1a que expresa el dominio gE CT

La secuencia de aminoácidos de los residuos 451-575 de la cola citoplásmica (CT) de gE se muestra en la figura 1B (SEQ ID NO: 1). Se sintetizó un segmento de ácido nucleico con codones optimizados de E. coli (SEQ ID NO: 2) que codifica el dominio del polipéptido gE CT de SEQ ID NO:1 (Fig. 1C). Este segmento de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 se modificó para generar el ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 que incluye, en el extremo 5', un sitio de restricción NdeI seguido por un codón de metionina y seis codones de histidina. En el extremo 3', la construcción SEQ ID NO: 3 tiene un codón de terminación seguido por un sitio de restricción XhoI (Fig. 1D). Por tanto, el ácido nucleico SEQ ID NO:3 codifica el polipéptido gE CT-His modificado (SEQ ID NO: 4) mostrado en la figura 1E. El fragmento NdeI/XhoI de 411 pb de longitud (SEQ ID NO: 3) se insertó en los sitios NdeI-XhoI de pET-43.1a (Novagen) para crear la construcción pET-43.1a gE CT-His. El peso molecular de gE CT-His expresado en E. coli y purificado se verificó por SDS-PAGE.

Producción y caracterización de anticuerpo monoclonal de ratón específico de gE CT.

La proteína gE CT-His (SEQ ID NO: 4) se expresó de la construcción pET-43.1a gE CT-His en E. coli. La purificación de proteína, inmunización de ratones, producción de hibridomas, purificación del Acm 2H8F3 del líquido ascítico y la conjugación del Acm con HRP (peroxidasa de rábano) se realizaron mediante Genscript.

Purificación de gE CT-His de E. coli, análisis de inmunotransferencia y generación de anticuerpo monoclonal de ratón (Acm).

La proteína gE CT-His (SEQ ID NO: 4) expresada en E. coli se obtuvo de cuerpos de inclusión, se solubilizó con urea 8M y se purificó en dos etapas mediante el uso de una columna de Ni y Superdex 200 (GE Healthcare). La proteína gE CT-His expresada en E. coli así purificada se ensayó después para reactividad con un anticuerpo anti-His (Genscript cat. # A00186). Se inmunizaron ratones con la proteína gE CT-His purificada. Se seleccionaron hibridomas específicos de gE CT, anti-His negativos, para procesamiento adicional. Se seleccionaron hibridomas que producen anticuerpos específicos para gE CT para la producción de ascitis de ratón. Se generó de esta manera el anticuerpo monoclonal 2H8F3.

Análisis de inmunotransferencia de proteína recombinante gE CT-His con Acm específico de gE CT.

Las muestras de proteína antigénica gE CT-His se separaron en un SDS-PAGE (10% o 12%) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó en leche desnatada al 5% en PBS y/o TBS durante 1 h a temperatura ambiente (RT), se lavó con Tween 20 al 0,05% en PBS (PBST) o TBS (TBST) y se incubó con anticuerpo (0,5 |jg/ml diluido en PBS o TBS durante 2-3 horas o durante la noche a temperatura ambiente). Después de lavar, la membrana se incubó con anticuerpo secundario de cabra anti ratón HRP o con anticuerpo secundario IRDye800CW de cabra anti-IgG de ratón a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar, la membrana se visualizó o bien con sustrato de inmunotransferencia ECL de Pierce/autorradiografía o con escáner Odyssey (LI-COR, Odyssey V3.0).

Síntesis de péptidos biotinilados, solapantes, y mapeo de epítopos por ELISA.

Treinta y nueve péptidos 12-meros solapantes (Tabla 1) que abarcan los 125 residuos de aa enteros de gE CT (Fig. 1A-1B) se sintetizaron y biotinilaron (Genscript).

Tabla 1: Péptidos para mapeo de epítopos

Los péptidos biotinilados (20 pg/ml) se inmovilizaron en placas de microtitulación de 96 pocillo previamente recubiertas con 100 pl de estreptavidina (NEB, Cat # A00160) 10 pg/ml. Además, una placa de microtitulación se recubrió con proteína antigénica purificada gE CT-His (2 pg/ml) en 100 pl de tampón de recubrimiento a 4°C durante la noche. Las placas se bloquearon después con el tampón de bloqueo (leche desnatada al 5% en PBS) a 37°C durante 2 horas. Después de lavar la placa con tampón de lavado (PBS con Tween al 0,05%), se añadieron 100 pl de Acm 2H8F3 1 pg/ml a las placas y se incubaron a 37°C durante 2 horas. Las placas se lavaron con tampón de lavado (PBST) y después se incubaron con 100 pl de anticuerpo secundario (anti-IgG de ratón [HRP] de cabra 0,1 pg/ml) a 37°C durante 1 hora. Después de lavar, la reacción se desarrolló con 100 pl de sustrato TMB durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se paró añadiendo 100 pl de HCl 1 M. La absorbancia de cada pocillo se midió a 450 nm usando un espectrofotómetro. Un pocillo sin recubrir se usó como un control blanco. La librería de péptidos incubada con el anticuerpo secundario solo se usó como un control negativo.

Infección de terneras

Los protocolos de infección de animales, manejo, recogida de muestras y eutanasia fueron aprobados previamente por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la LSU. Para determinar las propiedades diferenciales del marcador serológico de BoHV-1 tmv en terneras infectadas/vacunadas comparadas con las terneras infectadas con BoHV-1 con gE delecionado y BoHV-1 wt, se seleccionaron doce terneras mestizas de 4 meses de edad, negativas para BoHV-1 y BVDV y se asignaron aleatoriamente en tres grupos. El primer grupo consistía en tres terneras infectadas con BoHV-1 de tipo salvaje. El segundo grupo consistía en cuatro terneras inmunizadas con la vacuna BoHV-1 con gE delecionado. El tercer grupo consistía en cinco terneras inmunizadas con la vacuna BoVH-1 tmv. Las terneras en cada grupo se mantuvieron en el gran animalario en aislamiento de la LSU bien aisladas entre sí en salas separadas, donde se mantuvieron 2-3 terneras por sala. Las terneras en cada grupo se infectaron por vía intranasal con 1 x 107 UFP por narina del respectivo virus o vacuna. Por tanto, cada ternera recibió 2 * 107 UFP de virus/vacuna. Después de la infección, se recogieron muestras nasales en días alternos hasta el día 10 post-infección. Se recogieron muestras de suero los días 0, y 28 días post-infección, después se hicieron alícuotas y se almacenaron a -80°C hasta el análisis posterior.

Ensayos ELISA competitivo

Se realizó ELISA competitivo para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos contra gE CT entre los tres grupos de suero de ternera: suero de terneras infectadas con BoHV-1 de tipo salvaje (WT), suero de terneras vacunadas con BoHV-1 tmv, y suero de terneras vacunas con gE delecionado (gEA). Esto se logró recogiendo muestras de suero de terneras WT, BoHV-1 y gEA el día 0 (antes de la infección) y 28 días post-infección (dpi), después ensayando la presencia de anticuerpos anti-gE.

Una placa de ELISA (Costar, #3590) se recubrió durante la noche a 4°C con 200 pl/pocillo (aprox. 100 ng) de antígeno proteico gE CT-His en tampón de recubrimiento (Na2CO3 30 mM/NaHCO3 70 mM pH 9,6). Después de lavar con Tween 20 al 0,05%-PBS pH 7,4 (PBST) seguido por 1xPBS pH 7,4 (PBS), las placas se bloquearon con seroalbúmina bovina (BSA) al 1% en PBS a 37°C durante 2 horas. Después de lavar, las placas se incubaron durante la noche a 4°C con 100 pl de sueros de ternera diluidos 1:1 en PSBT al 0,1%. Al día siguiente, las placas se lavaron e incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 pl de anticuerpos Acm 2H8F3 específicos de gE CT de BoHV-1 conjugados a HRP diluido 1:10.000 en PBST al 0,05%/pocillo. Las placas se lavaron y se añadieron 150 pl de sustrato TMB a cada pocillo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos, y después se añadieron 75 pl de H2SO4 1 M para parar la reacción. Se leyó la densidad óptica (DO) de cada pocillo a 450 nm usando un lector de placas de microtitulación (SpectraMax M2, Molecular Devices con Soft Max Pro 4.8).

Análisis estadístico : Se usó el procedimiento mezcla SAS® (versión 9.4, SAS Institute, Cary, NC) para analizar los datos de ELISA competitivo con un análisis de medidas repetidas de varianza en un modelo de efectos mixtos. Los efectos fijados incluían muestra, DPI y la interacción muestra*DPI. El efecto aleatorio en el modelo era Ternera (muestra). Cuando se encontraron diferencias globales, se hicieron comparaciones post hoc con pruebas de la “t” por pares de medias de mínimos cuadrados. Todas las comparaciones se consideraron significativas a p < 0,05.

Ejemplo 2: El anticuerpo específico de la cola citoplásmica de gE distingue células infectadas con virus BoHV-1 de tipo salvaje de infectadas con BoHV-1 tmv

Como se muestra en la figura 1E, se predice que el peso molecular de la proteína recombinante gE CT-His expresada en E. coli es de 14,3 kD usando la calculadora proporcionada por ExPASy.org. Los experimentos de inmunotransferencia con el anticuerpo anti-His indicaban que la proteína gE CT-His expresada en E. coli de la construcción pET-43.1a gE CT-His tenía un peso molecular ligeramente mayor que el predicho de 14,3 kD (Fig. 2A). Por tanto, se realizó análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF para evaluar la masa real de la proteína expresada. Tal análisis mostró que el peso molecular de la proteína gE CT-His expresada era muy similar al peso molecular predicho (Fig. 3).

Posteriormente, se generó un anticuerpo monoclonal de ratón específico de BoHV-1 gE CT (Acm 2H8F3) usando tecnología Genscript inmunizando ratones con la proteína gE CT-His como antígeno. Análisis de inmunotransferencia adicional demostró que la misma proteína gE CT-His expresada en E. coli mostrada en las figuras 2A-2B es reconocida por el Acm 2H8F3 (Fig. 2C), pero no por un anticuerpo específico anti-GST (Fig. 2D).

Además, el anticuerpo Acm 2H8F3 reaccionaba específicamente con una banda de 94 kD que corresponde a gE de tipo salvaje de BoHV-1 que había sido expresada por células infectadas con virus BoHV-1 de tipo salvaje. Sin embargo, el anticuerpo Acm 2H8F3 no reaccionaba con una banda de 68 kD expresada por células infectadas con BoHV-1 tmv (Fig. 2E) porque la vacuna BoHV-1 tmv carece del dominio CT de gE.

Estos resultados demuestran que el anticuerpo Acm 2H8F3 específicamente reconoce un epítopo localizado en los 125 aminoácidos de la cola citoplásmica de gE. De forma más significativa, estos resultados también indican que las células infectadas con BoHV-1 tmv se pueden distinguir de células infectadas con virus BoHV-1 de tipo salvaje, por ejemplo, usando el anticuerpo Acm 2H8F3 para detectar BoHV-1 de tipo salvaje o usando la cola citoplásmica de gE como antígeno para detectar anticuerpos que pueden estar en el suero de animales infectados con el virus BoHV-1.

Ejemplo 3: Epítopo reconocido por el anticuerpo Acm 2H8F3

Para mapear el epítopo que el especificado por el Acm 2H8F3 específicamente reconoce en el dominio CT de gE de BoHV-1, se generaron treinta y nueve péptidos 12-meros solapantes (Tabla 1) que abarcan los 125 aminoácidos enteros de la cola citoplásmica de la proteína gE (SEQ ID NO: 1) y se analizó la unión con el anticuerpo específico de gE CT Acm 2H8F3.

Se realizó ELISA con placas donde cada pocillo se recubrió con un péptido 12-mero separado. Una placa se hizo reaccionar con el anticuerpo específico de gE CT Acm 2H8F3. Una segunda placa con los pocillos recubiertos por el péptido de la librería se incubó con el anticuerpo secundario solo como un control negativo. Además, el pocillo número 40 contenía estreptavidina (sin péptido) como control blanco y el pocillo 41 contenía el polipéptido gE CT-His recombinante expresado en E. coli (SEQ ID NO: 4).

Los resultados del ensayo ELISA presentados en la tabla 2 y la figura 3 muestran que el Acm 2H8F3 reaccionaba específicamente con los dos péptidos solapantes:

Péptido 496DDSDDDGPASN507 (SEQ ID NO:20; péptido 16 en la Tabla 1) y

Péptido 499SDDDGPASNPPA510 (SEQ ID NO:21; péptido 17 en la Taba 1).

Por tanto, el epítopo unido por el anticuerpo Acm 2H8F3 mapea en las posiciones de aminoácidos de gE 499-507.

Tabla 2: Resultados de ELISA de mapeo de epítopo para el Acm 2H8F3.

El análisis de las dos secuencias peptídicas (SEQ ID NO: 20-21) demuestra que los nueve aminoácidos 499SDDDGPASN507 (SEQ ID NO: 44) son comunes entre los dos péptidos solapantes. Basado en estos resultados el epítopo reconocido por el anticuerpo Acm 2H8F3 en el dominio CT de gE es 499ESDDDGPASN507 (SEQ ID NO: 45). El anticuerpo Acm 2H8F3 se denomina en el presente documento como el anticuerpo marcador indicador conjugado a HRP.

Ejemplo 4: Ensayo serológico para d istingu ir terneras infectadas con BoHV-1 WT de terneras infectas con BoHV-1 tm v y/o virus con gE delecionado

El ensayo ELISA directo descrito anteriormente se optimizó usando una serie de concentraciones de antígeno de recubrimiento y diluciones de Acm 2H8F3 conjugado a HRP. Basado en estos análisis (datos no mostrados), se seleccionó que la cantidad óptima de antígeno de recubrimiento gE CT-His y Acm 2H8F3 conjugado a HRP (anticuerpo marcador indicador) era 100 ng de antígeno gE CT-His y dilución 1:10.000 de Acm conjugado a HRP, respectivamente.

Se realizó el método de ELISA competitivo como sigue. Se incubaron sueros de ternera inactivados obtenidos antes de la infección (día 0) y a los 28 días post-infección en pocillos microtitulación separados recubiertos con el antígeno gE CT-His. Después de tal incubación, se añadió el anticuerpo marcador indicador conjugado a HRP y las placas de ELISA se incubaron otra vez. Los pocillos se lavaron después, y se determinó la densidad óptica a 450 nm de cada pocillo de muestra. Se usaron suero fetal de ternera no infectada inactivado (comercialmente disponible, Atlas biologicals), y suero de ternera específico para BoHV-1 wt hiperinmune (BoHV-1 HI) producido por múltiples inmunizaciones intramusculares de refuerzo usando BoHV-1 purificado como antígeno) como controles negativo y positivo, respectivamente.

La densidad óptica medida de las muestras de prueba y controles a 450 nm se usó para calcular o una razón muestra/control negativo (S/N) o un porcentaje de inhibición usando los siguientes algoritmos:

(DO control negativo 4450 — DO muestra 4450\

Porcentaje de inhibición = (---------------— -----------;--------- :--------------------------) x 100

V DO control negativo A450 )

DO muestra A450 \

R azón^/^ = ^

Do control negativo 4450/

Si la razón S/N era menor que o igual a 0,6, la muestra se clasificó como positiva para la presencia de anticuerpos anti-BoHV-1 (es decir, el animal del que se obtuvo el suero estaba infectado con BoHV-1). Si la razón S/N era mayor de 0,7, la muestra se clasificó como negativa para anticuerpos anti-BoHV-1 (es decir, el animal del que se obtuvo el suero no estaba infectado con BoHV-1). Si la razón S/N era entre 0,6-0,7, entonces la muestra se clasificó como sospechosa.

Resultados

Los resultados del ELISA competitivo se resumen en la tabla 4, que muestra los resultados de ELISA competitivo/bloqueante evaluados de muestras de suero de ternera antes de la infección (día 0) o a los 28 días post infección (día 28) donde los sueros se obtuvieron de terneras infectadas/vacunadas con BoHV-1 wt, BoHV-1 gEA y BoHV-1 tmv. Los valores de la razón S/N y el % de inhibición mostrados en la tabla 4 se calcularon de la D.O. media de tres ensayos de ELISA replicados para cada muestra de suero se muestran.

Tabla 4: Resultados de ELISA competitivo serológico

En estos ensayos de ELISA competitivo, los sueros del día 0 obtenidos antes de la infección de las tres terneras eran negativos para anticuerpos anti-BoHV-1 (razón SN > 0,7). Dos de las tres terneras infectadas con BoHV-1 wt eran positivas para anticuerpos anti-BoVH-1 (razón SN < 0,6). Sin embargo, el suero de una ternera infectada con BoHV-1 wt tuvo una razón SN algo mayor (razón SN 0,7) (Tabla 4).

Los resultados del ensayo de ELISA también mostraron que tres de cuatro terneras infectadas con el virus con gE delecionado comercialmente disponible resultaron negativas a 28 dpi mientras que una tuvo una razón SN ligeramente menor (0,685).

Sin embargo, las cinco terneras infectadas con BoHV-1 tmv dieron negativo en el ELISA competitivo tanto el día 0 como 28 días post-infección.

El análisis estadístico reveló que había una interacción significativa global para muestra*DPI (p = 0,021) con respecto a razón SN. Las comparaciones post hoc indicaron que había diferencias significativas el día 28 post-infección entre terneras infectadas con BoHV-1 wt frente a infectadas con virus BoHV-1 gE (p = 0,0006) y BoHV-1 tmv (p = 0,025).

Referencias:

1. Jones C, Chowdhury S: Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease com plex . Vet Clin North Am Food Anim Pract, 26(2):303-321.

2. Jones C, Chowdhury S: A review o f the biology o f bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development o f improved vaccines. Anim Health Res Rev 2007, 8(2):187-205.

3. Koppers-Lalic D, Reits EA, Ressing ME, Lipinska AD, Abele R, Koch J, Marcondes Rezende M, Admiraal P, van Leeuwen D, Bienkowska-Szewczyk K et al: Varicelloviruses avoid T cell recognition by UL49.5-mediated inactivation o f the transporter associated with antigen processing. Proc Natl Acad Sci U S A 2005, 102(14):5144-5149.

4. Nataraj C, Eidmann S, Hariharan MJ, Sur JH, Perry GA, Srikumaran S: Bovine herpesvirus 1 downregulates the expression o f bovine MHC class I molecules. Viral Immunol 1997, 10(1):21-34.

5. Chowdhury SI, Wei H, Weiss M, Pannhorst K, Paulsen DB: A trip le gene mutant o f BoHV-1 administered intranasally is significantly more efficacious than a BoHV-1 glycoprotein E-deleted virus against a virulent BoHV-1 challenge. Vacóme 2014, 32(39):4909-4915.

6. Butchi NB, Jones C, Perez S, Doster A, Chowdhury SI: Envelope protein Us9 is required fo r the anterograde transport o f bovine herpesvirus type 1 from trigeminal ganglia to nose and eye upon reactivation. J Neurovirol 2007, 13(4):384-388.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar si un animal está infectado con un herpesvirus bovino de tipo 1 (BoHV-1), vacunado con un virus triple mutante BoHV-1 recombinante (BoHV-1 tmv), o no está infectado con un herpesvirus bovino de tipo 1 (BoHV-1) que comprende:

(a) poner en contacto una muestra de prueba del animal con al menos un polipéptido o péptido para formar una mezcla de ensayo, donde el al menos un polipéptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 4 o en donde el péptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 20, 21, 44, o 45; y

(b) detectar o medir si un complejo entre el al menos un polipéptido o péptido y anticuerpos está presente en la mezcla de ensayo.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el al menos un polipéptido o péptido está inmovilizado en una superficie sólida.

3. El método de la reivindicación 2, donde la superficie sólida comprende un chip, tira, papel, placa de microtitulación, bola, tubo de ensayo, portaobjetos, gel o filtro.

4. El método de la reivindicación 2 o 3, donde la superficie sólida comprende vidrio, plástico, celulosa, etilcelulosa, metilcelulosa, papel, nitrocelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, poliestireno, polietileno, polidiacetileno lipídico (PDA), polidimetilsiloxano, poliacrilamida, nailon, rayón, algodón, teflón, mica, Sephadex, Sepharosa, poliacrilonitrilo, papel de fibra de vidrio, oro, silicio, sílice, o combinaciones de los mismos.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde detectar o medir comprende poner en contacto el complejo, o un polipéptido, un péptido, o un anticuerpo en el complejo con una entidad de unión.

6. El método de la reivindicación 5, donde la entidad de unión comprende al menos un marcador que emite una señal detectable.

7. El método de la reivindicación 6, donde el al menos un marcador se selecciona de una enzima, fluoróforo, cromóforo, radioisótopo, sustrato enzimático, etiqueta enzimática, anticuerpo, molécula quimioluminiscente, molécula electroluminiscente, magnetismo, transmisor de electrones, molécula densa a los electrones, marcador de afinidad, o una combinación de los mismos.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde detectar o medir comprende medir una cantidad de color, producto enzimático, radioactividad, quimioluminiscencia, electroluminiscencia, electricidad, o una combinación de las mismas.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde detectar o medir comprende medir la densidad óptica de la mezcla de ensayo, o una señal producida por un marcador presente en la mezcla de ensayo.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde detectar o medir comprende medir la densidad óptica de al menos una mezcla de ensayo para producir una densidad óptica de la mezcla de ensayo, y comparar la densidad óptica de la mezcla de ensayo con una densidad óptica de uno o más control negativo, uno o más control positivo, o ambos.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde detectar o medir comprende medir la densidad óptica de al menos una mezcla de ensayo para producir una densidad óptica de la mezcla de ensayo, y comparar la densidad óptica de la mezcla de ensayo con una densidad óptica de uno o más control negativo, usando uno o ambos de los siguientes algoritmos:

en donde:

DO control negativo es la densidad óptica del control negativo; y

DO muestra es la densidad óptica de la densidad óptica de la muestra de ensayo.

12. Un casete de expresión o vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido o péptido en donde el polipéptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 4 o en donde el péptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 20, 21, 44, o 45.

13. Un casete de expresión o vector de expresión según la reivindicación 12 que comprende un segmento de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO: 2 o 3.

14. Un dispositivo que comprende una superficie sólida y al menos un polipéptido o péptido en donde el polipéptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 4 o en donde el péptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 20, 21, 44, o 45.

15. Un kit que comprende el dispositivo de la reivindicación 14, e instrucciones para usar el dispositivo.

16. Un kit que comprende instrucciones para el uso de los componentes del kit, y los siguientes componentes embalados por separado:

(a) al menos un polipéptido o péptido en donde el polipéptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 4 o en donde el péptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 20, 21,44, o 45;

(b) una entidad de unión que se une específicamente a al menos un polipéptido o péptido en donde el polipéptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 4 o en donde el péptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 20, 21,44, o 45;

(c) una entidad de unión secundaria que se une específicamente a al menos un polipéptido o péptido en donde el polipéptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 1 o 4 o en donde el péptido consiste en una secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 20, 21, 44, o 45;

(d) un marcador o un reactivo para desarrollar una señal de un marcador.