ES2581880T3 - Método para diferenciar animales infectados de animales vacunados usando polipéptidos de Ehrlichia canis - Google Patents

Abstract

Un método para distinguir entre un animal que se ha infectado con E. canis de un animal que no se ha infectado con E. canis, el método que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica de un animal con uno o más polipéptidos purificados que comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 o sus combinaciones; y (b) detectar si los anticuerpos de la muestra se unen específicamente a los uno o más polipéptidos purificados; Donde si los anticuerpos de la muestra se une específicamente a uno o más polipéptidos purificados, entonces el animal se ha infectado con E. canis.

Description

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Los anticuerpos específicos para E. canis se pueden detectar en los fluidos o tejidos biológicos por cualquier método conocido en la técnica. Los métodos más simples son generalmente métodos de inmunoensayo. Uno de tales métodos es un método basado en la competición en el que las muestras de suero se preincuban con el antígeno de

E. canis que no es un elemento de la vacuna contra un E. canis (por ejemplo, antígeno DIVA de E. canis), y después se añaden a una fase sólida, tal placa de microtitulación, que tiene un anticuerpo monoclonal inmovilizado específico para el antígeno DIVA de E. canis. Los anticuerpos específicos para el antígeno DIVA de E. canis en la muestra evitarán la unión del antígeno DIVA de E. canis al anticuerpo inmovilizado. La detección de cualquier unión del antígeno DIVA de E. canis al anticuerpo inmovilizado se puede determinar mediante la adición de un segundo compañero de unión para el antígeno de E. canis, ya sea marcado directamente o capaz de marcarse a través de la unión a otro compañero de unión que tiene una marca. Una muestra positiva, es decir, una muestra que tiene anticuerpos específicos para el antígeno DIVA de E. canis, se asocia con una disminución de la señal de la marca.

En una forma de realización particular, los anticuerpos para un antígeno DIVA de E. canis en una muestra biológica se puede detectar mediante el contacto de la muestra con un antígeno DIVA de E. canis y la adición de la muestra a una placa de microtitulación recubierta con un anticuerpo monoclonal anti-antígeno DIVA. La unión del antígeno DIVA a la placa de microtitulación se puede detectar mediante la adición de un anticuerpo policlonal de conejo contra el antígeno DIVA y la adición de un anticuerpo policlonal anti-conejo de burro conjugado con HRP. Los anticuerpos de la muestra evitarán la unión del antígeno DIVA al anticuerpo inmovilizado, de este modo causa una disminución en la señal.

Otro método para la detección de anticuerpos específicos para el antígeno DIVA de E. canis es un ensayo sándwich donde una muestra biológica que se sospecha que contiene un anticuerpo específico para el antígeno DIVA de E. canis se pone en contacto con el antígeno DIVA de E. canis inmovilizado para formar un complejo inmunológico. La presencia de un anticuerpo específico para el antígeno DIVA de E. canis se determina por la detección de la unión de un compañero de unión marcado para el anticuerpo de E. canis, tal como un segundo anticuerpo.

En un aspecto de la invención, los antígenos DIVA de E. canis se pueden inmovilizar en un soporte sólido adecuado. Una muestra biológica se pone en contacto con el antígeno DIVA de E. canis, al cual se unen los anticuerpos anti-E. canis, si dichos anticuerpos están presentes en la muestra. La unión se puede detectar por cualquier medio adecuado, por ejemplo, enzimas, radionúclidos, particulados o marcadores fluorescentes. En una forma de realización adecuada, el reactivo de detección se puede asociar con una proteína que es la misma o similar a la que se utiliza para capturar los anticuerpos anti-E canis (si está presente). En una forma de realización particular, los anticuerpos anti-E. canis se pueden detectar mediante la inmovilización de un antígeno de E. canis en un soporte sólido. Las muestras biológicas se pueden poner en contacto con el soporte sólido y, después de la extracción de la muestra no unida, la unión de los anticuerpos de E. canis al antígeno se puede lograr con, por ejemplo, un anticuerpo IgG marcado.

Los antígenos DIVA de la invención también pueden comprender mimitopos de antígenos DIVA de la invención. Un mimitopo es un epítopo del péptido aleatorio que imita a un epítopo antigénico natural durante la presentación de epítopos. Los epítopos de péptidos aleatorios se pueden identificar mediante la generación o la selección de una biblioteca de epítopos de péptidos aleatorios. La biblioteca se pone en contacto con un anticuerpo. Se identifican mimitopos que son específicamente inmunorreactivos con el anticuerpo. Las bibliotecas de péptidos aleatorios, por ejemplo, se pueden desplegar en un fago o generar como bibliotecas combinatorias.

Los antígenos DIVA de E. canis, por ejemplo, polipéptidos, los polipéptidos, pueden ser naturales, es decir, se aíslan de una fuente natural, o pueden ser sintéticos (es decir, se sintetizan químicamente o producen de manera recombinante usando técnicas de ingeniería genética). Las proteínas naturales se pueden aislar de bacterias enteras por técnicas convencionales, tales como cromatografía de afinidad. Los anticuerpos policlonales o monoclonales se pueden utilizar para preparar una columna de afinidad adecuada por técnicas bien conocidas.

Las proteínas que son inmunológicamente de reacción cruzada con una proteína de E. canis natural se pueden sintetizar químicamente. Por ejemplo, los polipéptidos que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, más habitualmente menos de aproximadamente 80 aminoácidos, y típicamente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, se pueden sintetizar por el método de síntesis en fase sólida de Merrifield bien conocido, donde se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena en crecimiento. Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc, 85: 21492156. También se pueden utilizar las proteínas recombinantes. Estas proteínas se pueden producir mediante la expresión en células cultivadas de moléculas de ADN recombinante que codifican una porción deseada del genoma de E, canis. La porción del genoma de E. canis puede por sí mismo ser natural o sintético, con genes naturales obtenibles a partir de la bacteria aislada por técnicas convencionales.

Polinucleótidos de E. canis

Los polinucleótidos que se pueden usar en relación con la invención contienen menos que un genoma microbiano entero y puede ser ácidos nucleicos de cadena simple o doble. Un polinucleótido puede ser ARN, ADN, ADNc, ADN genómico, ARN o ADN sintetizado químicamente o sus combinaciones. Los polinucleótidos se pueden purificar libres de otros componentes, tales como proteínas, lípidos y otros polinucleótidos. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser 50%, 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% purificado. Los polinucleótidos codifican los polipéptidos

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descriptos anteriormente. En una forma de realización los polinucleótidos codifican polipéptidos mostrados en las SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, 22 o sus combinaciones. Los polinucleótidos incluyen los mostrados en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, o sus combinaciones. Los polinucleótidos pueden comprender secuencias de nucleótidos, tales como secuencias que codifican ligadores, secuencias señal, secuencias de transferencia-detención TMR, dominios de transmembrana, o ligandos útiles en la purificación de proteína tal como glutatión-S-transferasa, marca de histidina y proteína estafilocócica A.

Los polinucleótidos se pueden aislar. Un polinucleótido aislado es un polinucleótido que no es inmediatamente contiguo a una o ambas secuencias genómicas flanqueantes 5' y 3' a las que está naturalmente asociado. Un polinucleótido aislado puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, siempre que se eliminen o estén ausentes las secuencias de ácidos nucleicos naturales que se hallan inmediatamente flanqueantes de la molécula de ADN recombinante en un genoma natural. Los polinucleótidos aislados incluyen también moléculas de ácido nucleico no naturales Una molécula de ácido nucleico que existe entre cientos a millones de otras moléculas de ácido nucleico dentro de, por ejemplo, bibliotecas de ADNc o genómicas, o porciones de gel que contienen un digesto de restricción de ADN genómico no se consideran un polinucleótido aislado. La secuencia de nucleótidos completa para E. canis está disponible en, por ejemplo, GenBank como número de acceso NCBI: NZ AAEJO 1000001.

Los polinucleótidos también pueden comprender fragmentos que codifican polipéptidos inmunogénicos. Los polinucleótidos pueden codificar polipéptidos de longitud completa, fragmentos de polipéptidos, y variantes de polipéptidos o de fusión.

Las secuencias degeneradas de nucleótidos que codifican polipéptidos, así como las secuencias de nucleótidos homólogas que son al menos aproximadamente 80, o aproximadamente 90, 96, 98, o 99% idénticas a las secuencias de polinucleótidos y los complementos de estos también se describen en la presente. El por ciento de identidad de secuencia se puede calcular como se describe en la sección "Polipéptidos". Las secuencias de nucleótidos degeneradas son polinucleótidos que codifican un polipéptido o fragmentos de estos, pero difieren en la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de polinucleótidos de tipo salvaje, debido a la degeneración del código genético. Las moléculas de ADN complementario (ADNc), homólogos de especies, y variantes de polinucleótidos de E. canis que codifican polipéptidos biológicamente funcionales de E. canis también son polinucleótidos de E. canis. Los polinucleótidos se pueden aislar a partir de secuencias de ácidos nucleicos presentes en, por ejemplo, una muestra biológica, tal como sangre, suero, saliva, o tejido de un individuo infectado. Los polinucleótidos también se pueden sintetizar en el laboratorio, por ejemplo, usando un sintetizador automático. Un método de amplificación tal como PCR se puede usar para amplificar polinucleótidos de ADN genómico o ADNc que codifica los polipéptidos.

Los polinucleótidos pueden comprender secuencias codificadoras para los polipéptidos de origen natural o pueden codificar secuencias alteradas que no se producen en la naturaleza. Si se desea, los polinucleótidos se pueden clonar en un vector de expresión que comprende elementos de control de expresión, que incluyen por ejemplo, orígenes de replicación, promotores, potenciadores, o de otros elementos reguladores que dirigen la expresión de los polinucleótidos en las células huésped. Un vector de expresión puede ser, por ejemplo, un plásmido, tal como pBR322, pUC, o ColE1, o un vector de adenovirus, tal como un vector de adenovirus Tipo 2 o vector Tipo 5. Opcionalmente, se pueden utilizar otros vectores, que incluyen pero sin limitación, virus Sindbis, virus de simio 40, vectores de alfavirus, vectores de poxvirus, y el citomegalovirus y vectores retrovirales, tales como el virus de sarcoma murino, virus de tumor mamario de ratón, virus de la leucemia murina de Moloney, y virus del sarcoma Rous. También se pueden usar minicromosomas tales como MC y MC1, bacteriófagos, fagémidos, cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales bacterianos, partículas de virus, partículas tipo virus, cósmidos (plásmidos en los que se han insertado sitios cos del fago lambda) y replicones (elementos genéticos que son capaces de replicación bajo su propio control en una célula).

Los métodos para preparar polinucleótidos unidos operativamente a una secuencia de control de la expresión y expresarlos en una célula huésped son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la Patente U. S. N.º

4.366.246. Un polinucleótido se une operativamente cuando se coloca adyacente a o cerca de uno o más elementos de control de expresión, que dirigen la transcripción y/o traducción del polinucleótido.

Los polinucleótidos se pueden usar, por ejemplo, como sondas o cebadores, por ejemplo cebadores de PCR, para detectar la presencia de los polinucleótidos de E. canis en una muestra, tal como una muestra biológica. La capacidad de tales sondas y cebadores para hibridarse específicamente con las secuencias de polinucleótidos de E. canis les permitirá ser de utilidad en la detección de la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. Las sondas y cebadores de polinucleótidos se pueden hibridar con las secuencias complementarias en una muestra tal como una muestra biológica, que incluye saliva, esputo, sangre, orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, exudado de la herida, o tejido. Los polinucleótidos de la muestra, por ejemplo, se pueden someter a electroforesis en gel u otras técnicas de separación de tamaño o se puede inmovilizar sin separación por tamaño. Las sondas de polinucleótidos o cebadores se pueden marcar. Los marcadores y métodos adecuados para marcar sondas y cebadores son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, marcas radiactivas incorporadas por traducción de mellas o por la quinasa, marcas de biotina, marcas fluorescentes, marcas quimioluminiscentes, marcas bioluminiscentes, marcas de quelante de metales y marcas enzimáticas. Los polinucleótidos de la muestra

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se ponen en contacto con las sondas o cebadores en condiciones de hibridación de rigurosidad adecuadas.

De acuerdo con la aplicación, se pueden usar condiciones variadas de hibridación para obtener grados variables de selectividad de la sonda o cebador hacia la secuencia blanco.

Para aplicaciones que requieren alta selectividad, se pueden utilizar condiciones relativamente rigurosas, tales como condiciones de baja sal y/o alta temperatura, tal como la proporcionada por una concentración de sal de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M de sal a temperaturas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C. Para aplicaciones que requieren menor selectividad, se pueden usar condiciones de hibridación menos rigurosas. Por ejemplo, condiciones de sal de aproximadamente 0,14 M a aproximadamente 0,9 M de sal, a temperaturas que varían de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 55 °C. La presencia de un complejo hibridado que comprende la sonda o cebador y un polinucleótido complementario de la muestra de prueba indica la presencia de E. canis o secuencia de polinucleótidos de una E. canis en la muestra.

Anticuerpos

Los anticuerpos son moléculas de anticuerpo que se unen de forma específica y estable al polipéptido de E. canis de la invención o fragmento de este. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de cadena simple (scFv), o un fragmento de un anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos son una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o la región variable de un anticuerpo intacto, donde la porción está libre de los dominios constantes de cadena pesada de la región Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y Fv.

Un anticuerpo puede ser cualquier clase de anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Un anticuerpo o fragmento de este se une a un epítopo de un polipéptido de la invención. Un anticuerpo se puede obtener in vivo en animales de laboratorio adecuados o in vitro usando técnicas de ADN recombinante. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Dean, Methods Mol. Biol

80: 23-37 (1998); Dean, Methods Mol Biol. 32: 361-79 (1994); Baileg, Methods Mol Biol. 32: 381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol 32: 389-99 (1994); Drenckhahn et al. Métodos Cell. Biol. 37: 7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol 10: 239-65 (1992); Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12: 125-68 (1992). Por ejemplo, los anticuerpos policlonales se pueden producir mediante la administración de un polipéptido de la invención a un animal, tal como un humano u otro primate, ratón, rata, conejo, cobayo, cabra, cerdo, perro, vaca, oveja, burro o caballo. Se recolecta el suero del animal inmunizado y los anticuerpos se purifican a partir del plasma mediante, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía, tal como cromatografía de afinidad. Las técnicas para producir y procesar anticuerpos policlonales son conocidas en la materia.

"Se une específicamente" o "específico para" se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de un antígeno en una población heterogénea de antígenos. Los anticuerpos se unen específicamente a un antígeno particular al menos dos veces más veces en el fondo y más típicamente más de 10 a 100 veces que el fondo. La unión específica se puede analizar usando, por ejemplo, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), o un ensayo de transferencia Western utilizando la metodología bien conocidos en la técnica.

Adicionalmente, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopos presentes en un antígeno, por ejemplo, un polipéptido de la invención, también se pueden producir fácilmente. Por ejemplo, las células B normales de un mamífero, tal como un ratón, que fue inmunizado con un polipéptido de la invención se pueden fusionar con, por ejemplo, con las células de mieloma de ratón sensibles a HAT para producir hibridomas. Los hibridomas que producen anticuerpos específicos anti-E. canis se pueden identificar usando RIA o ELISA y aislar por clonación en agar semi-sólido o por dilución limitante. Los clones que producen anticuerpos específicos anti-E. canis se aíslan mediante otra ronda de análisis. Los anticuerpos monoclonales se pueden analizar por especificidad usando técnicas estándar, por ejemplo, mediante la unión de un polipéptido de la invención a una placa de microtitulación y la medición de la unión del anticuerpo monoclonal mediante un ensayo ELISA. Las técnicas para producir y procesar anticuerpos monoclonales son conocidas en la materia. Ver, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). Los isotipos particulares de un anticuerpo monoclonal se pueden preparar directamente, mediante la selección entre la fusión inicial, o se pueden preparar secundariamente, a partir de un hibridoma parental que secreta un anticuerpo monoclonal de un isotipo diferente mediante el uso de una técnica de selección de hermanos para aislar variantes de cambio de clase. Ver Steplewski et al., P.N.A.S. U.S.A. 82:8653 1985; Spria et al., J. Immunolog. Meth. 74:307, 1984. Los anticuerpos monoclonales también pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes. Ver, por ejemplo, Patente U.S. N.º 4.474,893; Patente U.S. N.º 4,816.567. Ver, por ejemplo, Patente U.S. N.º 4,676,980. Los anticuerpos también pueden ser construidos químicamente. Ver, por ejemplo, Patente U.S. N.º 4,676,980.

Los anticuerpos pueden ser quiméricos (ver, por ejemplo, la Patente U.S. N.º 5.482,856), humanizados (ver, por ejemplo, Jones et al, Nature 321: 522 (1986); Reichmann et al, Nature 332:323 (1988); Presta, Curr Op Struct Biol. 2: 593 (1992)), o anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanos se pueden obtener mediante, por ejemplo, inmortalización directa, despliegue en fagos, ratones transgénicos, o una metodología Trimera, ver, por ejemplo, Reisener et al., Trends Biotechnol. 16: 242-246 (1998).

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Los anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de E. canis (por ejemplo, los polipéptidos de E. canis mostrados en las SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22), son particularmente útiles para detectar la presencia de E. canis o antígenos de E. canis en una muestra, tal como una muestra de suero, sangre, orina o saliva de un animal infectado con E. canis tal como tal un ser humano o un perro. Un inmunoensayo para E. canis o antígeno de E. canis puede utilizar un anticuerpo o varios anticuerpos. Un inmunoensayo para E. canis o antígeno de E. canis puede utilizar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido hacia un epítopo de E. canis, una combinación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epítopos de un polipéptido de E. canis, anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epítopos de diferentes polipéptidos de E. canis, anticuerpos policlonales dirigidos hacia el mismo antígeno de E. canis, anticuerpos policlonales dirigidos hacia diferentes antígenos de E. canis, o una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales. Los protocolos de inmunoensayo se pueden basar en, por ejemplo, en ensayos de competición, reacción directa, o tipo sándwich usando, por ejemplo, anticuerpo marcado. Los anticuerpos se pueden marcar con cualquier tipo de marca conocida en la técnica, que incluye, por ejemplo, marcas fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas, enzimáticas, de metal coloidal, radioisótopos y bioluminiscentes.

Los anticuerpos o fragmentos de estos se pueden unir a un soporte y se utilizan para detectar la presencia de E. canis o un antígeno de E. canis, por ejemplo, un antígeno DIVA de E. canis o antígeno no DIVA de E. canis. Los soportes incluyen, por ejemplo, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita.

Los anticuerpos también se pueden usar para aislar organismos de E. canis o antígenos de E. canis por columnas de inmunoafinidad. Los anticuerpos se pueden fijar a un soporte sólido mediante, por ejemplo, adsorción o por enlace covalente de modo que los anticuerpos conserven su actividad immunoselectiva. Opcionalmente, se pueden incluir grupos espaciadores para que el sitio de unión al antígeno del anticuerpo permanezca accesible. Los anticuerpos inmovilizados luego se pueden usar para unirse a organismos de E. canis o antígenos de E. canis de una muestra, tal como una muestra biológica que incluye saliva, suero, esputo, sangre, orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, exudado de la herida, o tejido. Los organismos de E. canis o antígenos de E. canis unidos se recuperan de la matriz de la columna mediante, por ejemplo, un cambio en el pH.

Los anticuerpos también se pueden utilizar en estudios de inmunolocalización para analizar la presencia y la distribución de un polipéptido de la invención durante diversos eventos celulares o condiciones fisiológicas. Los anticuerpos también se pueden utilizar para identificar moléculas que participan en la inmunización pasiva y para identificar moléculas que participan en la biosíntesis de los antígenos no proteicos. La identificación de tales moléculas puede ser útil en el desarrollo de vacunas. Los anticuerpos que incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales y anticuerpos de cadena simple, se pueden usar para controlar el curso de mejora de una enfermedad causada por E. canis. Mediante la medición del aumento o disminución de los anticuerpos anti-E. canis para los antígenos de E. canis en una muestra de prueba en un animal, se puede determinar si un régimen terapéutico particular destinado a mejorar el trastorno es efectivo. Los anticuerpos se pueden detectar y/o cuantificar usando por ejemplo, ensayos de unión directa, tales como RIA, ELISA, o ensayos de transferencia Western.

Detección

Los métodos de la invención se pueden llevar a cabo usando, por ejemplo, técnicas de inmunoensayo bien conocidas por los expertos en la materia, que incluyen, pero sin limitación, el uso de microplacas y dispositivos de flujo lateral. En una forma de realización, uno o más antígenos DIVA de E. canis se inmovilizan sobre un soporte sólido en una localización distinta. La detección de los complejos antígeno-anticuerpo sobre el soporte sólido puede ser por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, la Patente U.S. N.º 5,726.010, describe un ejemplo de un dispositivo de flujo lateral útil en la presente invención. El dispositivo de la invención se puede usar para detectar uno o más anticuerpos a antígenos de E. canis.

La inmovilización de uno o más reactivos de captura de analitos, por ejemplo, polipéptidos de E. canis. En un dispositivo o soporte sólido se realiza de modo que un reactivo de captura de analitos no será lavado por la muestra, diluyente y/o procedimiento de lavado. Uno o más reactivos de captura de analito se pueden unir a una superficie mediante adsorción física (es decir, sin el uso de ligadores químicos) o por unión química (es decir, con el uso de ligadores químicos). La unión química puede generar una unión más fuerte de los reactivos de captura sobre una superficie y proporcionar una orientación y conformación definidas de las moléculas unidas a la superficie.

La invención se puede usan en relación con un dispositivo que es adecuado para un ensayo de flujo lateral. Por ejemplo, una muestra de prueba se añade a una matriz de flujo de una primera región (una zona de aplicación de la muestra). La muestra de prueba se transporta en una trayectoria de flujo de fluido por acción capilar a una segunda región de la matriz de flujo donde una marca es capaz de unirse y formar un primer complejo con un analito en la muestra de prueba. El primer complejo se lleva a una tercera región de la matriz de flujo donde un polipéptido de E. canis se inmoviliza en una ubicación distinta. Un segundo complejo se forma entre un polipéptido inmovilizado y el primer complejo que incluye el anticuerpo de la muestra. Por ejemplo, un primer complejo que comprende una partícula de sol de oro y un polipéptido de E. canis unido al anticuerpo anti-E. canis se unirán específicamente y formarán un segundo complejo con un segundo polipéptido de E. canis inmovilizado o con un segundo anticuerpo dirigido a los anticuerpos anti-E. canis. La marca que forma parte del segundo complejo se puede visualizar directamente.

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En otro aspecto, la invención se puede utilizar en relación con uno o más reactivos de unión específica marcados que se pueden mezclar con una muestra de prueba antes de la aplicación a un dispositivo. En este caso, no es necesario tener reactivos de unión específicos marcados depositados y secados en un lecho de reactivo de unión específica en el dispositivo. Un reactivo de unión específica marcado, si se añade a una muestra de prueba o se depositado previamente en el dispositivo, puede ser, por ejemplo, un anticuerpo marcado que se une específicamente un anticuerpo para E. canis.

Cualquiera o todas las formas de realización anteriores se puede proporcionar como un kit. En un ejemplo particular, tal kit puede incluir un dispositivo completo con reactivos de unión específica (por ejemplo, un reactivo de unión específica marcado no inmovilizado y un reactivo de captura de analito inmovilizado) y reactivo de lavado, así como de reactivo detector y reactivos de control positivo y negativo, si se desea o es apropiado. Además, se pueden incluir otros aditivos, tales como estabilizantes, buffer, y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden ser variadas, para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos se pueden proporcionar como polvos secos, habitualmente liofilizados, que en disolución proporcionarán una solución de reactivo que tiene las concentraciones apropiadas para combinarse con una muestra.

Un antígeno DIVA de E. canis, por ejemplo, un polipéptido, puede ser un reactivo de captura de analitos inmovilizado en una zona de reacción (fase sólida). Un segundo reactivo de captura de analitos, por ejemplo, un anticuerpo anti-IgG o anti-IgM, que se ha conjugado con una marca, se puede añadir a la muestra antes de añadir la muestra al dispositivo, o el segundo reactivo de captura del analito puede estar incorporado en el dispositivo. Por ejemplo, el reactivo de unión específica marcado se puede depositar y secar en una trayectoria de flujo de fluido que proporciona comunicación de fluido entre la zona de aplicación de la muestra y la fase sólida. El contacto del reactivo de unión específica marcado con la muestra de fluido produce la disolución del reactivo de unión específica marcado.

El dispositivo también puede incluir un reactivo líquido que transporta el material no unido (por ejemplo, muestra de fluido sin reaccionar y reactivos de unión específica no unidos) lejos de la zona de reacción (fase sólida). Un reactivo líquido puede ser un reactivo de lavado y solo sirve para eliminar el material no unido de la zona de reacción, o puede incluir un reactivo detector y servir tanto para eliminar el material no unido como para facilitar la detección del analito. Por ejemplo, en el caso de un reactivo de unión específica conjugado con una enzima, el reactivo detector incluye un sustrato que produce una señal detectable después de la reacción con el conjugado de enzimaanticuerpo en la zona reactiva. En el caso de un reactivo de unión específica marcado conjugado con una molécula radiactiva, fluorescente o absorbente de la luz, el reactivo detector actúa simplemente como una solución de lavado que facilita la detección de la formación del complejo en la zona reactiva por lavado del reactivo marcado no unido.

Dos o más reactivos líquidos pueden estar presentes en un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo puede comprender un reactivo líquido que actúa como un reactivo de lavado y un reactivo líquido que actúa como un reactivo detector y facilita la detección del analito.

Un reactivo líquido puede incluir además una cantidad limitada de un "inhibidor", es decir, una sustancia que bloquea el desarrollo del producto final detectable. Una cantidad limitada es una cantidad de inhibidor suficiente para bloquear el desarrollo del producto final hasta que la mayoría o todo el material no unido en exceso sea transporta lejos de la segunda región, momento en el que se produce producto final detectable.

Métodos de tratamiento, mejora o prevención de la enfermedad causada por E. canis

Un polipéptido de DIVA, polinucleótido o anticuerpo descriptos en la presente se pueden usar para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad causada por E. canis. Sin embargo, si un polipéptido de DIVA se usa para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad causada por E. canis, por lo tanto no se podría usar como un polipéptido de DIVA para la detección y diferenciación de los animales infectados, no vacunados, y vacunados porque el sistema inmunológico de un animal vacunado reconocerían el antígeno de DIVA usa do para la vacunación. Sin embargo, un polipéptido de DIVA que no reacciona de forma cruzada con los anticuerpos para el polipéptido de DIVA utilizado para el tratamiento, la mejora o la prevención de una enfermedad causada por E. canis todavía se puede usar como antígeno DIVA E. canis.

Por ejemplo, si la SEQ ID NO:2 o un fragmento de esta se usa como una vacuna, entonces la SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o sus combinaciones se pueden usar como un polipéptido de DIVA, si no reaccionan en forma cruzada con los anticuerpos específicos para la SEQ ID NO:2. En consecuencia, los polipéptidos de DIVA, polinucleótidos, y anticuerpos se pueden usar de dos maneras diferentes: (1) como composiciones para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad o infección causada por E. canis; y (2) como un antígeno DIVA de E. canis para la detección y diferenciación de los animales que están vacunados; no vacunados; infectados o no infectados con E. canis.

Los polipéptidos, polinucleótidos, y anticuerpos se pueden usar para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad causada por E. canis. Por ejemplo, un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal o fragmentos de este, se pueden administrar a un animal, tal como un ser humano. En una forma de realización un anticuerpo o fragmento de

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este se administra a un animal en una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmentos de este. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad efectiva para aliviar los síntomas de la infección con E. canis o la reducción de la cantidad de organismos de E. canis en un sujeto.

Los polipéptidos de la invención o polinucleótidos pueden estar presentes en una composición inmunogénica y se usa para inducir una respuesta inmune en un huésped. Una composición inmunogénica es capaz de inducir una respuesta inmune en un a animal. Una composición del polipéptido inmunogénico de la invención o composición de polinucleótido es particularmente útil para la sensibilización del sistema inmunitario de un animal de modo que, como resultado, se produce una respuesta inmune que mejora o previene el efecto de la infección con E. canis. La inducción de una respuesta inmune en un modelo animal puede ser útil para determinar, por ejemplo, dosis óptimas o vías de administración. La inducción de una respuesta inmune también se pude usar para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o infección causada por E. canis. Una respuesta inmune incluye las respuestas inmunes humorales o respuestas inmunes mediadas por células, o una combinación de estas. Una respuesta inmune también puede comprender la promoción de una respuesta del huésped generalizada, por ejemplo, mediante la promoción de la producción de defensinas.

La generación de un título de anticuerpos por un animal contra E. canis puede ser importante en la protección contra la infección y la eliminación de la infección. La detección y/o cuantificación de los títulos de anticuerpos después de la administración de un polipéptido o polinucleótido se puede usar para identificar epítopos que son particularmente efectivos en la obtención de los títulos de anticuerpos. Los epítopos responsables de una fuerte respuesta de anticuerpos a E. canis se pueden identificar mediante la obtención de anticuerpos dirigidos contra polipéptidos de E. canis de diferentes longitudes. Los anticuerpos obtenidos por un epítopo de polipéptido particular, entonces se pueden probar usando, por ejemplo, un ensayo ELISA para determinar cuáles polipéptidos contienen epítopos que son más efectivos para la generación de una respuesta potente. Los polipéptidos o proteínas de fusión que contienen estos epítopos o los polinucleótidos que codifican los epítopos se pueden construir y usar para provocar una respuesta de anticuerpo potente.

Un polipéptido, o un polinucleótido o anticuerpo de la invención se pueden administrar a un mamífero, tal como un ratón, conejo, cobayo, macaco, babuino, chimpancé, ser humano, vaca, oveja, cerdo, caballo, perro, gato, o a animales tales como pollos o patos, para obtener anticuerpos in vivo. La inyección de un polinucleótido tiene las ventajas prácticas de la simplicidad de construcción y modificación. Además, la inyección de un polinucleótido produce la síntesis de un polipéptido en el huésped. Por lo tanto, el polipéptido se presenta al sistema inmune del huésped con modificaciones postraduccionales nativa de la estructura y la conformación. Un polinucleótido se puede administrar a un sujeto como un "ADN desnudo".

La administración de un polinucleótido, polipéptido o anticuerpo puede ser por cualquier medio conocido en la técnica, que incluye inyección intramuscular, intravenosa, intrapulmonar, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal,

o subcutánea, aerosol, intranasal, bomba de infusión, supositorio, en mucosa, tópica, y oral, incluyendo la inyección con una pistola balístico biológica ("pistola de genes"). Un polinucleótido, polipéptido o anticuerpo puede estar acompañado de un portador proteico para la administración oral. Una combinación de métodos de administración también se puede utilizar para provocar una respuesta inmune. Los anticuerpos se pueden administrar en una dosis diaria de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 200 mg. En una forma de realización los anticuerpos se administran a una dosis diaria de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 mg.

Los portadores farmacéuticamente aceptables y diluyentes para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Pharmaceutical Sciences de Remington, Mack Publishing Co. (A.R. German) ed. (1985)). El portador no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el huésped. Tales portadores incluyen, pero sin limitación, macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos tales como Sepharose® funcionalizado con látex, agarosa, celulosa, perlas de de celulosa y similares, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina, y similares, copolímeros de aminoácidos, peptoides, lipitoides y partículas de virus no virulentas inactivas, o células bacterianas. Los liposomas, hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables, y bioadhesivos se pueden usar también como un portador para una composición de la invención.

Las sales farmacéuticamente aceptables también se pueden usar en composiciones de la invención, por ejemplo, sales minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, o sulfatos, así como sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, o benzoatos. Los sustratos proteicos especialmente útiles son albúminas séricas, hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide tetánico, y otras proteínas bien conocidas por los expertos en la técnica. Las composiciones de la invención también pueden contener líquidos o excipientes, tales como agua, solución salina, solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer, solución de Hank, glucosa, glicerol, dextrosa, maltodextrina, etanol, o. similares, solos o en combinación, así como sustancias tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de ajuste de tonicidad, detergente, o agentes reguladores de pH. También se pueden usar agentes activos adicionales, tales como agentes bactericidas.

Si se desea, las moléculas coestimuladoras, que mejoran la presentación del inmunógeno a los linfocitos, tales como

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Ejemplo 2

Preparación de E. canis fijadas con formalina con dos adyuvantes diferentes, protocolo para la inmunización de beagles con el antígeno E. canis y análisis de los sueros de los beagles inmunizados usando SNAP® 3Dx®.

La preparación de antígeno con adyuvante de hidróxido de aluminio es una técnica bien conocida por los expertos en la materia. Por ejemplo, ver "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, 1988, pp 99.

Para la inmunización en perros (beagles de laboratorio), se prepararon dos conjuntos de dosis con adyuvante de hidróxido de aluminio preparado como se describió anteriormente y dos conjuntos de dosis se prepararon con adyuvante de Ribi (Corixa Corp., Seattle WA) utilizando el protocolo descripto por el fabricante. Cada dosis contenía aproximadamente 20 mg de cultivo de células E. canis inactivadas con formalina de (peso seco).

Se seleccionaron beagles de laboratorio mantenidos en la perrera para la inmunización con antígenos inactivados con formalina de E. canis. Dos grupos de dos perros cada uno; cada grupo usando un adyuvante diferente se trataron con la preparación de E. canis fijadas con formalina (óxido de aluminio o Ribi). En el día 0, se halló que los 4 perros eran seronegativos usando el diagnóstico SNAP® 3Dx® así como el análisis de transferencia de Western usando organismos de E. canis.

El comité IACUC de Covance Research Products Inc. aprobó el protocolo para la inmunización de los beagles de laboratorio,. Los perros se estimularon en los días 0, 28 y 56, se controlan con extracciones de sangre semanales de 1 ml usando SNAP® 3Dx®. A todos los perros se les administró por vía subcutánea el artículo de prueba apropiado en la zona dorsoescapular. Los cuatro animales presentaron seronversión a una prueba positiva en SNAP®3Dx® E. canis en el día 42. Se tomaron sangrados de producción en los días 42 y 70 (aproximadamente 50 ml de sangre que produjo aproximadamente 25 ml de suero).

La Figura 1 muestra la evaluación del ensayo SNAP®3Dx® de beagles de laboratorio. Se utilizó el dispositivo SNAP® como describe el fabricante. La muestra "Pre" es desde el día 0. La muestra "post" es la muestra desde el día 42. La mancha positiva de E. canis es positiva los 4 perros para la muestra del día 42. Se observaron resultados similares para la muestra del día 70.

Los experimentos con una tercera vacuna que comprende un tercer adyuvante, BCG, (Calbiochem de EMD Biosciences, Inc. San Diego, CA) revelaron resultados similares. La preparación de la tercera vacuna fue idéntica a las preparaciones descriptas para la vacuna con adyuvante Ribi descripta anteriormente, excepto: 1) inactivación con formalina fue durante 24 horas a 4 ºC, y 2) se añadió 1 mg de BCG. El esquema de vacunación fue el día 0, día 14, se extrajo sangre en forma semanal y se analizó para determinar la reactividad con proteínas de E. canis.

Ejemplo 3

Enriquecimiento de E. canis del cultivo celular usando gradientes PERCOLL®.

Para el aislamiento de ADN y análisis de transferencia Western, E. canis fue enriquecido a partir del cultivo celular utilizando gradientes de densidad de PERCOLL®. El proceso de aislamiento de los patógenos intracelulares del cultivo de células, tales como Ehrlichia, es una técnica bien conocida para los expertos en la materia. Por ejemplo, ver Akira et al. (1982) Purification of Rickettsia tsutsugamushi by PERCOLL® density gradient centrifugation, Microbiol. Immunol., 26:321-328.

Un enriquecimiento típico de E. canis se inició con 1,5 litros de cultivo de células infectadas (ver anteriormente). Las células se centrifugaron 6000 x g, se retuvo el pellet celular y el sobrenadante se descartó. El pellet celular se resuspendió en 20 ml de PBS que fue seguido de una segunda centrifugación. El sobrenadante se descartó y se retuvo el sobrenadante. Después, el pellet se resuspendió en 20 ml de PBS, se sometió a sonicación durante 5 segundos a 20 kHz, la potencia se ajusta 1,5 usando un sonicador Branson. La muestra luego se centrifugó a 500 x g durante 5 minutos para sedimentar residuos grandes.

Se añadió PERCOLL® al sobrenadante a una concentración final de 32% (4,5 ml de PERCOLL® con 10 ml de muestra). La muestra se cargó en tubos de Oak Ridge compatibles con un rotor de 70 l Ti y se centrifugó durante 30 minutos a 63.000 x g. La banda opaca se recogió usando una pipeta Pasteur. La banda opaca es altamente por Ehrlichia (confirmado mediante la microscopía óptica de la muestra recolectada). Después de una dilución 1: 4 con PBS, la muestra se dividió en alícuotas y se centrifugó a 12.000 x g. El sobrenadante se descartó y el sedimento de Ehrlichia se almacenó a -80 °C.

Ejemplo 4

Análisis de suero o plasma de perros expuestos e infectados por transferencia Western

El uso de análisis en gel de SDS-PAGE 1-dimensional y análisis en gel de 2 dimensiones (primera dimensión isoelectroenfoque, segunda dimensión SDS-PAGE) es bien conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, ver Current Protocols in Molecular Biology, eds. F. M. Ausubel et al., John Wiley & Sons Inc., 1997, páginas 10.2.2

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10.3.11. El uso de las transferencias de Western para analizar las proteínas separadas por medio de estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, ver Current Protocols in Molecular Biology, eds. F. M. Ausubel et. al., John Wiley & Sons Inc., 1997, páginas 10,8.1-10,8.116.

El trabajo inicial se realizó mediante análisis de Western de las proteínas separadas con los geles 1D (datos no mostrados), seguido por análisis de Western de proteínas separadas usando los geles 2D. Las proteínas de E. canis recolectadas del cultivo de células se analizaron usando electroforesis en gel 2D (materiales y reactivos usados como describe el fabricante; Bio-Rad Life Sciences Research, Hercules, CA 94547). La cantidad de muestra para cargar por gel se determinó empíricamente (ver Figura 2). Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y se analizaron usando sueros caninos de beagles de laboratorio en el día 0, los perros se expuestos al antígeno de E. canis fijado en formalina (ver más arriba), o sueros de animales infectados con E. canis (ver Figuras 3, 4 y 5).

Los sueros y plasmas caninos positivo se aislaron de perros infectados con E. canis. La infección con E. canis se verificó mediante análisis Western de linfocitos recolectados de sangre entera de estos perros, y se confirmó por el uso del ensayo IDEXX SNAP®Dx® con sueros o plasmas caninos (disponible comercialmente de IDEXX Laboratories Inc., que se utiliza como describe el fabricante).

Para el análisis de transferencia Western, las proteínas se separaron usando geles 1D SDS-PAGE o 2D isoelectroenfoque/SDS-PAGE seguido de electro-transferencia de las proteínas de los geles a la nitrocelulosa. Las transferencias de nitrocelulosa se incubaron en una solución de bloqueo de leche en polvo no grasa 2,5% disuelta en solución salina regulada con Tris (pH 7,5), Tween® 20 0,05%. Los sueros o plasmas caninos se diluyeron al título tal como se describe en el buffer que contiene un lisado de E. coli para bloquear la unión no específica con sueros de ternero normal de 30% y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C no específica. Después de lavar 3 veces en TBS-TWEEN® (0,05%), las transferencias se transfirieron en un buffer que contiene suero de ternera fetal 50%, TBS-Tween © Kathon 50% (0,05% y 0,5%, respectivamente) para evitar la unión no específica de una anticuerpo policlonal anti-Fc canino de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (Jackson Immuno Research, West Grove, PA 19390). El conjugado de anticuerpo policlonal anti-Fc canino de conejo se diluyó 1: 5000. Los geles se lavaron 3 veces con TBS TWEEN® (0,05%), una vez con TBS, y la presencia de HRP se detectó usando reactivos de detección de transferencia Western ECl (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855-1.327) utilizado como describe el fabricante. Las imágenes digitales de una película de rayos X expuesta se capturaron usando una GelDoc 2000 (Bio-Rad Inc.).

Ejemplo 5

Aislamiento de ADN de E. canis y construcción de una biblioteca de expresión lambda y análisis de la biblioteca de expresión lambda de E. canis para determinar clones que tienen actividad de DIVA.

La preparación y análisis de las bibliotecas de expresión de lambda es una técnica bien conocida para los expertos en la materia. Por ejemplo, ver Current Protocols in Molecular Biology, eds. F. M. Ausubel et al., John Wiley & Sons Inc., 1997, páginas 5.1 a 5.8.6. Para la construcción de la biblioteca de expresión, se purificó el ADN genómico de E. canis aislado del cultivo de células por centrifugación en gradiente de PERCOLL® (ver arriba). El ADN se purificó usando un kit de purificación de ADN genómico de Qiagen Sciences (Germantown, MD). Se usó un kit del vector EcoRI/CIAP predigerido Lambda ZAP® II (Stratagene Corp., La Jolla, CA 92037) como especifica el fabricante para la construcción de la biblioteca. El ADN genómico de E. canis se digirió parcialmente con TSP509 y se aislaron fragmentos que varían de 2 hasta 6 kb mediante electroforesis en gel de agarosa y se ligó en el vector lambda. Los fagos se empaquetaron y cultivaron como especifica el fabricante.

Se analizaron aproximadamente 120.000 placas lambda individuales para determinar la unión a sueros aislados de perros identificados como positivos para la infección con E. canis, pero negativos para reactividad con sueros de animales expuestos a un E. canis cultivado en cultivo celular (ver anteriormente). De la prueba inicial se identificaron 84 placas individuales como portadoras de actividad.

Las placas lambda se sometieron a dos rondas de purificación en placa y analizaron de nuevo para verificar la reactividad positiva con sueros de animales infectados con E. canis, de reactividad negativa cuando se analizaron con sueros de los animales expuestos.

Las placas lambda aislados se analizaron para determinar la reactividad cruzada con sueros de animales identificados como seropositivos para Anaplasma phagocytophilia, Borrelia burgdorferi (agente causante de la enfermedad de Lyme), Rickettsia rickettsii (agente causante de la fiebre de las Montañas Rocosas), Leptospira interrogans y Dirofilaria inunitis (agente causante del parásito del corazón canino).

Al final del proceso de análisis, se halló que 43 placas lambda reaccionan con los sueros de los animales infectados con E. canis que no reaccionaron con los sueros expuestos o sueros de perros infectados con otros patógenos caninos (ver anteriormente).

Usando la característica ZAP® del vector de clonación de acuerdo con las instrucciones del fabricante, los insertos en el vector lambda se convirtieron en plásmidos. Los plásmidos se transformaron en la cepa de E. coli XL-1 azul para la expresión de las proteínas y el análisis de las proteínas codificadas por transferencia Western. Los extremos

de los insertos de ADN de E. canis se sometieron a análisis de la secuencia de ADN usando los cebadores de secuenciación T7 y T3.

La información de secuencia de las reacciones T7 y T3 para los 43 clones se sometió a un análisis de BLAST en el sitio web NCBI. Los resultados se tabularon en un formato de Excel. Sobre la base de la identidad de secuencia 5 entre el clon y la secuencia del genoma aleatoria disponibles para E. canis (NCBI: NZ_AAEJ01000001), se identificaron segmentos de ADN genómico de cada clon. Los clones individuales que comparten genes comunes se agruparon para su posterior análisis por transferencia Western usando mezclas de sueros caninos infectados y expuestos a bacterias. Sobre la base de los patrones de bandas similares, se eliminaron los clones duplicados. Se eliminaron todos los clones que muestran reactividad para los dos conjuntos de sueros. Como resultado de este

10 análisis, se seleccionaron 23 clones para una evaluación adicional. La agrupación de los clones y el antígeno común por grupo se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1.

Antígeno común

Número de clon

antígeno 120 kDa

2, 10, 17, 33, 35, 79

Proteínas de shock térmico

4, 9, 24, 66

ATPasa

7, 84

Proteína ribosómica LI

21, 47, 65

Antígeno 200 kDa

26, 55, 76

Proteína hipotética

75

Piruvato deshidrogenasa

5

Proteína ribosómica (50S)

6

Desconocido

57

Regulador transcripcional

82

Ejemplo 6

15 Análisis de transferencia Western usando muestras de suero canino E. canis positivo individuales

Los 23 clones se analizaron en geles de SDS-PAGE individuales. Cada gel se transfirió a nitrocelulosa y se sometió a transferencia Western utilizando muestras individuales de suero canino de perros que solo fueron positivos para las infecciones con E. canis mediante pruebas ELISA/SNAP®. El suero canino se diluyó 1:500 en el mismo diluyente descripto en el Ejemplo 4 que contiene lisado de E, coli y se detectó la reactividad usando técnicas de peroxidasa de

20 rábano colorimétricas estándares (Opti-4CN, Bio-Rad). Se evaluó un total de trece muestras de suero canino individuales. Las transferencias se compararon entre las muestras para determinar el número de perros que muestran reactividad a una banda predominante o conjunto de bandas por clon. Los resultados se resumen en la Tabla 2 y la Figura 6 (los clones enumerados en negrita se representan en la figura).

Tabla 2.

Antígeno común

Número de clon Reactores positivos

Antígeno 120 kDa

2, 10, 17, 33, 35 13/13

Proteínas de shock térmico

9 12/13

ATPasa

7, 84 12/13

Proteína ribosómica L1

21, 47, 65 12/13

Antígeno 200 kDa

26, 55, 76 12/13

Los 23 clones también se analizaron por transferencia Western usando suero canino mezclado que habían dado positivo en otras enfermedades infecciosas transmitidas por vectores. Se evaluaron las muestras que dieron positivo

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por ELISA o SNAP® para las siguientes infecciones individuales: parásito del corazón, Lyme, Anaplasma Phagocytophilum, o E. ewingii. Ninguno de los clones identificados en la tabla anterior mostró reactividad cruzada con sueros caninos positivo para estas otras infecciones transmitidas por vectores.

Ejemplo 7

Identificación de segmentos génicos relevantes que codificanlos antígenos DIVA de E. canis.

a. antígeno 120 kDa

Este antígeno fue descripto anteriormente por Yu et al. (J Clin Microbiol. 2000 Jan;38(1):369-74; ver también, McBride et al., 2000 Infec. Immun. 68:13) y se demostró que es útil en el diagnóstico de las infecciones por E. canis en perros. Este antígeno se ha descripto como antígeno de E. canis “p120" y "p140". Ver, id. Yu et al. explican que una proteína recombinante expresada por el gen p120 tiene un tamaño molecular de 1401 (13a en un gel de dodecilsulfato de sodio, que es mayor que la masa molecular predicha de la proteína. Ver, Yu et al., página 373. The Walker group (Yu et al., y McBride et al.) se refieren a la proteína tanto p120 como p140 de E. canis. Por lo tanto, esta descripción utiliza p120 y p140 indistintamente para describir esta proteína. El número de acceso para el gen de p120/140 de E. canis es AF112369 y la proteína asociada es AAD34330. Ver también, el acceso N.º YP302666. Los clones 2, 10, 17 y 33 contienen segmentos de longitud completa del gen del antígeno 120 kDa. El clon 35 puede contener un truncamiento de este gen. (Ver, SEQ ID NOs: 1 y 2).

Este gen se amplificó a partir de ADN genómico de E. canis y se subclonó en un sistema de expresión pET con una marca 6-His de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los resultados de la secuenciación de este plásmido coincidieron exactamente con la secuencia del gen que codifica la proteína mostrada en la SEQ NO:ID 2, desde los aminoácidos 58 a 589. Los lisados de proteínas de las bacterias BL21 inducidas para expresar esta proteína se analizaron por transferencia Western con sueros caninos infectados y se compararon con transferencias Western analizadas con sueros de animales expuestos a organismos de adaptados en cultivo. En consonancia con los resultados anteriores, solamente los sueros de perros infectados reconocieron esta proteína del peso molecular esperado (datos no mostrados).

P120 tiene un motivo de 36 aminoácidos que se repite 14 veces. Ver, SEQ ID NO: 15. La porción repetida (región subrayada en la SEQ ID NO: 15 es un péptido de 60 kD). La SEQ ID NO: 16 muestra las 14 repeticiones alineadas. La SEQ ID NO: 17 muestra la secuencia de consenso de las 14 repeticiones.

Una forma de realización proporciona un polipéptido que comprende:

KEEX1TPEVX2AEDLQPAVDX3SX4EHSSSEVGX5KVSX6TS (SEQ ID NO:17).

dondeX1 = S oN

X2 = K o R

X3= G, D, oS

X4= V o I

X5= E oK

X6 = E oK

Otra forma de realización de la invención proporciona un polipéptido multimérico donde la SEQ ID NO:17 se repite dos o más veces. El polipéptido multimérico también puede comprender uno o polipéptidos heterólogos.

En otra forma de realización, la invención proporciona un polipéptido de la SEQ ID NO:21, XPEVKAEDLQPAVDGSVEHX, donde cada una de las X tiene = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 aminoácidos.

En otra forma de realización, la invención proporciona un polipéptido de la SEQ ID NO:22, CKEESTPEVKAEDLQPAVDGSVEHSSSEVGXKVSETS; donde X = K o E.

b. Antígeno 200 kDa

Este antígeno fue descripto anteriormente por McBride et al. (J Clin Microbiol 2001 Jan; 39(1):315-22) y se demostró que es útil en el diagnóstico de ehrlichiosis. El número de acceso para este gen es AF252298 y AAK01145 la proteína asociada. Una porción de esta secuencia de la proteína se asocia con una patente publicada (SEQ ID NO: 2 de Patente U.S. N.º 6.355,777, número de acceso AAE96254). Los autores han identificado una región diferente de esta proteína que sirve como antígeno de diagnóstico para la ehrlichiosis y un reactivo DIVA. La porción del gen se extiende desde el nucleótido 1081 de AF252298 hasta el nucleótido final 4266. (Ver SEQ ID NOs: 3 y 4).

Este gen se amplificó a partir de ADN genómico de E. canis y se subclonó en un sistema de expresión pET con una

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el clon 10, como se determina por el peso molecular de la proteína identificada en el gel (ver SEQ ID NOs: 13 y 14).

Ejemplo 8

Evaluación de péptidos P140 de E. canis

Los sueros de beagles inmunizados con E. canis fijados en formalina (muestras de vacuna) de E. canis se analizaron usando un inmunoensayo basado en la placa de microtitulación preparada usando péptidos sintéticos derivados de la proteína p140 de E. canis (también conocido como p120, ver el Ejemplo 7).

La preparación de E. canis fijado con formalina y la inmunización de beagles se describieron en los Ejemplos 1 y 2. Las muestras de beagles inmunizados se analizaron usando inmunoensayos basados en la placa de microtitulación preparada usando péptidos sintéticos (SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID Nº: 20) en formatos de ensayos indirectos y directos.

Formato de ensayo indirecto

Las muestras se analizaron usando inmunoensayos basados en placa de microtitulación preparadas usando los péptidos sintéticos (SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20). Los péptidos individuales se inmovilizaron en los pocillos de microtitulación por adsorción directa. Se añadió una dilución de la muestra de prueba (1:100) al pocillo de microtitulación y el anticuerpo no unido se eliminó por lavado. El anticuerpo unido al péptido inmovilizado se detectó por reacción con un conjugado anti-especie, en este caso, canino, de peroxidasa de rábano (HRPO) (dilución 1: 2000), el lavado y la adición de un sustrato HRPO. La absorbancia (A650) de los pocillos de microtitulación individuales se determinó usando un lector de placa de microtitulación.

Formato de ensayo directo

Los péptidos individuales (SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20) se conjugaron a la albúmina de suero bovino y se inmovilizaron en los pocillos de microtitulación por adsorción directa. Los péptidos sintéticos (SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20) se conjugaron con un reactivo indicador, peroxidasa de rábano (HRPO). La muestra de prueba y el péptido del inmunoensayo/indicador se añadieron a un pocillo de microtitulación recubierto con el péptido correspondiente, que se incubó y se lavó. El anticuerpo unido al péptido inmovilizado y el péptido/reactivo indicador se detectó mediante la adición de un reactivo sustrato HRPO. La absorbancia (A650) de los pocillos de microtitulación individuales se determinó usando un lector de placas de microtitulación.

Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 3. El control positivo (PC, ID 1049: 16E) y control negativo (NC, 3818: 57B) eran muestras de suero positivo y negativo conocidas de E. canis, respectivamente. Todas las muestras se analizaron mediante la prueba SNAP® 4Dx® disponible en el comercio para el anticuerpo anti-E. canis. Los resultados para las muestras temporales secuenciales de 6 perros (CVYDEH, CWMBDC, CVXCSM, CWMAXK, CVSCVA y CVXCAP) que reciben el antígeno de E. canis tratado con formaldehído formulado usando diferentes adyuvantes se muestran para el día 0 hasta el día 42 después de la inmunización. Los resultados de la prueba SNAP® 4Dx® demuestran que se indujo una respuesta de anticuerpos en los animales vacunados. Ninguna de las muestras de suero de animales vacunados fue reactiva en el formato de ensayo directo. Varias muestras (por ejemplo, de perro CWMAXK) tenían altas reacciones de fondo en el formato de ensayo indirecto.

Los resultados demuestran que el anticuerpo inducido como resultado de la inmunización usando la vacuna fijada con formaldehído fue significativamente no reactiva para los péptidos sintéticos derivados de la proteína p140 de E. canis. (SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20).

Tabla 3. Reacción de los sueros de perros inmunizados con antígeno de E. canis tratados con formaldehído medidos usando ensayos de microtitulación preparados usando péptidos derivados de la proteína p140 de E. canis. (SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20).

Muestra

Resultado 4Dx® E. canis Resultados (A650) de la placa indirecta Resultados de la placa directa (A650)

SEQ ID NO:18

SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20

1049:16E (PC)

0,72 2,071 2,075 1,867 2,049 1,821 1,495

3818:57B (NC)

N 0,051 0,058 0,050 0,034 0,033 0,035

CVYDEH día 0

N 0,050 0,062 0,045 0,034 0,034 0,035

día 7

N 0,048 0,052 0,042 0,033 0,032 0,036

día 14

N 0,051 0,055 0,048 0,036 0,034 0,038

día 21

N 0,044 0,062 0,051 0,035 0,034 0,040

día 28

0,04 (vw+) 0,054 0,073 0,055 0,036 0,033 0,034

día 35

0,07 (vw+) 0,049 0,058 0,047 0,033 0,035 0,039

día 42

N 0,051 0,059 0,053 0,034 0,035 0,040

CWMBDC día 0

0,08 0,054 0,085 0,082 0,035 0,033 0,038

día 7

0,20 0,064 0,078 0,072 0,038 0,035 0,035

día 14

0,30 0,058 0,081 0,085 0,038 0,033 0,040

día 21

0,24 0,051 0,101 0,078 0,037 0,040 0,039

día 28

0,22 0,049 0,082 0,073 0,034 0,036 0,033

día 35

0,17 0,043 0,068 0,081 0,033 0,040 0,035

día 42

0,11 0,044 0,071 0,074 0,031 0,034 0,031

CVXCSM día 0

N 0,049 0,082 0,051 0,033 0,035 0,034

día 7

N 0,038 0,076 0,052 0,034 0,033 0,037

día 14

N 0,044 0,069 0,049 0,033 0,032 0,038

día 21

0,10 (w+) 0,038 0,054 0,045 0,035 0,035 0,036

día 28

0,10 (w+) 0,044 0,060 0,049 0,036 0,033 0,035

día 35

0,08 (vw+) 0,040 0,062 0,053 0,034 0,035 0,041

día 42

0,05 (vw+) 0,041 0,057 0,049 0,033 0,035 0,036

CWMAXK día 0

0,07 (vw+) 0,043 0,078 0,054 0,034 0,039 0,037

día 7

0,41 0,082 0,475 0,413 0,034 0,034 0,045

día 14

0,44 0,049 0,782 0,607 0,034 0,035 0,044

día 21

0,36 0,092 0,587 0,440 0,033 0,037 0,038

día 28

0,39 0,063 0,407 0,258 0,037 0,034 0,038

día 35

0,41 0,056 0,286 0,212 0,036 0,034 0,037

día 42

0,35 0,048 0,196 0,155 0,034 0,034 0,041

CVSCVA día 0

0,10 (w+) 0,039 0,084 0,084 0,033 0,033 0,038

día 7

0,37 0,040 0,107 0,066 0,032 0,032 0,036

día 14

0,14 0,053 0,151 0,062 0,035 0,033 0,039

día 21

0,33 0,057 0,131 0,072 0,035 0,033 0,034

día 28

0,29 0,049 0,104 0,058 0,035 0,034 0,036

día 35

0,36 0,043 0,108 0,079 0,034 0,039 0,040

día 42

0,32 0,047 0,117 0,044 0,033 0,036 0,037

CVXCAP día 0

N 0,041 0,065 0,040 0,032 0,035 0,032

imagen8

Tabla 4. Muestras de campo positivas y negativas de E. canis analizadas usando el formato de ensayo indirecto construido usando péptidos P140 (SEQ 1D NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20).

Muestra

4Dx® Resultados Absorbancia a 650 nM

SEQ ID NO:18

SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20

1049:16E (PC)

2,292 2,735 2,584

3818:57B (NC)

0,051 0,065 0,045

EC+

HP 127 0,07 0,042 0,050 0,038

EC+

HP 143 0,08 2,867 2,825 2,731

EC+

HP 147 0,09 2,370 2,661 2,658

EC+

HP 151 0,21 2,176 2,093 2,535

EC+

HP 161 0,18 1,708 2,178 2,551

EC+

HP 165 0,08 2,690 2,492 2,525

EC+

HP 172 0,07 0,229 0,902 2,197

EC+

HP 185 0,38 2,497 2,622 2,704

EC+

HP 186 0,26 2,899 2,979 2,794

EC+

HP 188 0,40 2,482 2,578 2,898

EC+

HP 190 0,21 2,484 2,534 2,632

EC+

HP 192 0,18 1,473 2,132 2,526

EC+

HP 194 0,43 2,583 2,429 2,539

EC+

HP 197 0,22 2,150 2,239 2,537

EC+

HP 201 0,36 2,449 2,472 2,519

EC+

HP 206 0,10 2,477 2,247 2,549

EC+

HP 207 0,08 2,030 2,359 2,369

EC+

HP 209 0,20 0,262 0,218 1,102

EC+

HP 213 0,21 1,471 1,662 2,406

EC+

HP 215 0,19 2,144 2,431 2,721

EC-

HP 116 0,02 0,110 0,065 0,070

EC-

HP 119 0,02 0,102 0,091 0,079

EC-

HP 120 0,01 0,058 0,063 0,045

EC-

HP 121 0,02 0,054 0,064 0,057

EC-

HP 122 0,03 0,053 0,059 0,040

EC-

HP 124 0,02 0,055 0,061 0,052

EC-

HP 128 0,02 0,068 0,072 0,054

EC-

HP 129 0,02 0,056 0,057 0,044

EC-

HP 130 0,01 0,049 0,048 0,039

EC-

HP 131 0,01 0,051 0,053 0,043

EC-

HP 132 0,03 0,057 0,061 0,038

EC-

HP 134 0,02 0,059 0,084 0,114

EC-

HP 137 0,03 0,043 0,046 0,037

EC-

HP 138 0,01 0,055 0,063 0,048

EC-

HP 139 0,01 0,064 0,062 0,056

EC-

HP 140 0,00 1,574 2,444 2,491

EC-

HP 142 0,02 0,065 0,068 0,069

EC-

HP 144 0,02 0,080 0,079 0,081

EC-

HP 145 0,01 1,564 1,934 2,095

EC-

HP 148 0,01 0,037 0,043 0,043

Tabla 5. Muestras de campo positivas y negativas de E. canis analizadas usando el formato de ensayo directo construido usando péptidos P140 (SEQ 1D NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20).

Muestra

3Dx® SNAP S-Bkg Absorbancia a 650 nM

SEQ ID NO:18

SEQ ID NO:18

SEQ ID NO:18

1049:16E (PC)

0,72 2,753 2,079 2,018

3818:57B (NC)

Neg 0,034 0,035 0,036

1049:16A

E. canis pos 0,28 0,201 0,173 1,448

1049:16G

E. canis pos 0,50 0,034 0,034 0,039

1049:16Q

E. canis pos 0,39 2,308 1,933 2,151

1049:16U

E. canis pos 0,56 0,627 2,038 2,254

1061:03B

E. canis pos 0,49 0,083 0,338 0,889

1061:031

E. canis pos 0,27 2,766 2,593 1,646

1177:21D

E. canis pos 0,15 0,042 0,046 0,126

1177:21G

E. canis pos 0,41 1,087 1,675 1,835

1177:21K

E. canis pos 0,34 0,681 1,930 2,010

1177:630

E. canis pos 0,41 0,146 0,112 1,587

1183:85A

E. canis pos 0,49 2,768 2,757 2,476

1256:311

E. canis pos 0,23 0,044 0,086 0,143

813:91F

E. canis pos 0,41 1,239 1,570 1,993

813:911

E. canis pos 0,41 0,212 0,517 1,646

EC 10

E. canis pos 0,37 0,236 0,302 0,465

Los resultados demuestran que el anticuerpo inducido como resultado de la infección natural fue reactivo para los péptidos sintéticos derivados de la proteína p140 de E. canis. (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 and SEQ ID NO:20).

Secuencias

SEQ ID NO:1 Secuencia nucleotídica del antígeno de 120kDa ORIGEN

imagen9

SEQ ID NO:2 Secuencia proteica del antígeno de 120kDa 10 ORIGEN

imagen10

imagen11

SEQ ID NO:5 Secuencia nucleotídica del fragmento del clon 84 -ATPasa ORIGEN

imagen12

SEQ ID NO:6 Secuencia proteica del fragmento del clon 84 -ATPasa ORIGEN

imagen13

SEQ ID NO:7 Secuencia nucleotídica del framento del clon 7 -ATPasa 10 ORIGEN

imagen14

imagen15

imagen16

SEQ ID NO:13 Secuencia nucleotídica de la proteína secretora VirD4 de tipo IV ORIGEN

imagen17

SEQ ID NO:14 Secuencia proteica de la proteína secretora VirD4 de tipo IV ORIGEN

imagen18

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2