BRPI0816437B1

BRPI0816437B1 - polipeptídeos purificados e métodos para a detecção de ehrlichia chaffeensis em uma amostra teste

Info

Publication number: BRPI0816437B1
Application number: BRPI0816437-1A
Authority: BR
Inventors: Thomas Patrick O'connor; Jill M. Slauenwhite
Original assignee: Idexx Laboratories, Inc
Priority date: 2007-09-21
Filing date: 2008-09-19
Publication date: 2021-02-02
Also published as: US20100190960A1; US7892568B2; US20090081695A1; MX2010002947A; EP2203469A4; CA2700474C; WO2009039413A3; WO2009039413A8; BRPI0816437A2; CA2700474A1; EP2203469A2; WO2009039413A2; US7741059B2; BRPI0816437B8

Abstract

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA A DETECÇÃO DE EHRLICHIA CHAFFEENSIS (p120). A presente invenção refere-se a métodos e composições para a detecção de Ehrlichia chaffeensis.

Description

Prioridade

[0001] Esse pedido reivindica o benefício de N° Ser. U.S.60/974.203, depositado em 21 de setembro de 2007, e N° Ser. U.S. 60/974.601, depositado em 24 de setembro de 2007, sendo que ambos estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

Antecedentes da Invenção

[0002] Ehrlichia são patógenos intracelulares obrigatórios queinfectam linfócitos circulantes em hospedeiros mamíferos. Ehrlichia canis e Ehrlichia chaffeensis são membros do mesmo subgrupo que infectam cães e seres humanos e podem causar erliquiose monocítica canina (CME) e erliquiose monocítica humana (HME), respectivamente. A doença canina é caracterizada por febre, linfadenopatia, perda de peso, e pancitopenia. Em seres humanos a doença é caracterizada por febre, dor de cabeça, mialgia e leucopenia. A detecção e tratamento precoces são importantes para o tratamento tanto de erliquiose canina como humana.

[0003] Ensaios de imunofluorescência indireta (IFA) e ensaios deimunoadsorvente ligado à enzima (ELISA) são frequentemente usados como auxiliares no diagnóstico dessas doenças. Esses ensaios medem ou, de outro modo, detectam a ligação de anticorpos anti-Ehrlichia do sangue, plasma, ou soro de um paciente a células infectadas, lisados celulares, ou proteínas de Ehrlichia purificadas. Entretanto, muitos ensaios para a detecção de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis ou fragmentos desses possuem utilidade severamente limitada, devido a problemas de sensibilidade e especificidade diretamente relacionados à natureza impura do antígeno de Ehrlichia usado nesses testes. Adicionalmente, animais vacinados contra E. canis podem mostrar um resultado positivo quando testados para E. chaffeensis devido à reação cruzada imunológica. São necessários reagentes específicos altamente purificados para formular ensaios mais precisos.

Sumário da Invenção

[0004] Uma modalidade da invenção proporciona um polipeptídeopurificado que compreende SEQ ID NO:1, onde o polipeptídeo consiste em menos de cerca de 50 aminoácidos de Ehrlichia chaffeensis contíguos de ocorrência natural; SEQ ID NO:2, onde o polipeptídeo consiste em menos de cerca de 50 aminoácidos de Ehrlichia chaffeensis contíguos de ocorrência natural; SEQ ID NO:4, onde o polipeptídeo consiste em menos de cerca de 50 aminoácidos de Ehrlichia chaffeensis contíguos de ocorrência natural; SEQ ID NO:5, onde o polipeptídeo consiste em menos de cerca de 50 aminoácidos de Ehrlichia chaffeensis contíguos de ocorrência natural. O polipeptídeo purificado pode consistir em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5. A invenção também proporciona um polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos purificados da invenção. Um polipeptídeo purificado da invenção pode ser ligado a um reagente indicador, um espaçador de aminoácido, um ligante de aminoácido, uma sequência sinal, uma sequência de interrupção de transferência, um domínio transmembrana, um ligante de purificação de proteína, um polipeptídeo heterólogo, um ou mais polipeptídeos adicionais que compreendem SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, ou uma combinação desses. O polipeptídeo purificado pode compreender um ou mais resíduos de aminoácido C na terminação amino ou terminação carbóxi ou ambas as terminações do polipeptídeo.

[0005] Outra modalidade da invenção proporciona um método dedetecção de anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra de teste. O método compreende colocar um polipeptídeo purificado que compreende a SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, ou 5 em contato com a amostra de teste, sob condições que permitam que complexos de polipeptídeo/anticorpo se formem. Quando o polipeptídeo purificado compreender a SEQ ID NO:1, 2, 4 ou 5, o polipeptídeo purificado consiste em menos de cerca de 50 aminoácidos de Ehrlichia chaffeensiscontíguos de ocorrência natural. Quando o polipeptídeo purificado compreender a SEQ ID NO:3, o polipeptídeo purificado consiste em menos de cerca de 575 aminoácidos de Ehrlichia chaffeensiscontíguos de ocorrência natural. Os complexos de polipeptídeo/anticorpo são detectados. A detecção dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que os anticorpos específicos para Ehrlichia chaffeensisestão presentes na amostra de teste, e a ausência dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que os anticorpos específicos para Ehrlichia chaffeensisnão estão presentes na amostra de teste. Os complexos podem ser colocados em contato com um reagente indicador antes da etapa de detecção. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo purificado é SEQ ID NOs: 1 2, 4, ou 5 e o método não detecta anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo de Ehrlichia canis. A quantidade de anticorpos na amostra de teste pode ser determinada. O polipeptídeo purificado pode ser ligado a um substrato. O polipeptídeo purificado pode ser ligado a um reagente indicador, um espaçador de aminoácido, um ligante de aminoácido, uma sequência sinal, uma sequência de interrupção de transferência, um domínio transmembrana, um ligante de purificação de proteína, um polipeptídeo heterólogo, um ou mais polipeptídeos adicionais que compreendem SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 ou uma combinação dessas.

[0006] Ainda outra modalidade da invenção proporciona um métodode detecção de uma infecção por Ehrlichia chaffeensis em um indivíduo. O método compreende obter uma amostra biológica do indivíduo; colocar um polipeptídeo purificado que compreende a SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 ou 5 em contato com a amostra biológica sob condições que permitem que os complexos de polipeptídeo/anticorpo se formem. Quando o polipeptídeo purificado compreender a SEQ ID NO:1, 2, 4 ou 5, o polipeptídeo purificado consiste em menos de cerca de 50 aminoácidos de Ehrlichia chaffeensiscontíguos de ocorrência natural. Quando o polipeptídeo purificado compreender a SEQ ID NO:3, o polipeptídeo purificado consiste em menos de cerca de 575 aminoácidos de Ehrlichia chaffeensiscontíguos de ocorrência natural. Os complexos de polipeptídeo/anticorpo são detectados. A detecção dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que oindivíduo possui uma infecção por Ehrlichia chaffeensis e a ausência dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que oindivíduo não possui uma infecção por Ehrlichia chaffeensis. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo purificado é SEQ ID NO:1, 2, 4, ou 5 e o método não detecta infecção por Ehrlichia canis no indivíduo.

[0007] Outra modalidade da invenção proporciona um anticorpo quese liga especificamente a um polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO:1, 2, 4 ou 5. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, ou um anticorpo de cadeia única.

[0008] Ainda outra modalidade da invenção proporciona um métodode detecção de um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra. O método compreende colocar os anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 1 2, 4, ou 5 em contato com a amostra sob condições que permitam que os complexos de polipeptídeo/anticorpo se formem; e detectar os complexos de polipeptídeo/anticorpo. A detecção dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensisestá presente na amostra e a ausência dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensisnão está presente na amostra. Os anticorpos podem ser anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno, ou anticorpos de cadeia única. Os anticorpos podem ser ligado a um substrato.

[0009] Portanto, a invenção proporciona métodos e composiçõespara detectar E. chaffeensis.

Breve Descrição dos Desenhos

[00010] As figuras 1A e 1B mostram os resultados de amostras de soro de cães que foram experimentalmente infectados com E. chaffeensis. p120B (SEQ ID NO:4) (mostrado como "IDX P120" nas figuras) e pl20-R (SEQ ID NO:3) (mostrado como "P120-R" nas figuras) ambos foram capazes de detectar anticorpos para E. chaffeensis no 7° dia após a infecção. Para CTUALJ canina no 7° dia a amostra era PCR positiva para E. chaffeensis e o título de IFA era 1:80. No 96° dia, que foi pós-reforço, o título de IFA era 1:5120. Para CURALN canina, no 7° dia a amostra era PCR positiva para E. chaffeensis e o título de IFA era 1:160. No 82° dia, que foi pós-reforço, o título de IFA era 1:1280.

Descrição Detalhada da Invenção Polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis

[00011] Como usado aqui, as formas no singular "um", "uma", e "o" incluem referências no plural, exceto onde o contexto indicar claramente em contrário. Um polipeptídeo é um polímero de dois ou mais aminoácidos covalentemente ligados por ligações amida. Um polipeptídeo pode ser modificado de maneira pós-traducional. Um polipeptídeo purificado é uma preparação polipeptídica que é substancialmente isenta de material celular, outros tipos de polipeptídeos, precursores químicos, produtos químicos usados na síntese do polipeptídeo, ou combinações desses. Uma preparação polipeptídica que é substancialmente isenta de material celular, meio de cultura, precursores químicos, produtos químicos usados na síntese do polipeptídeo, etc., possui menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, 1% ou mais dos outros polipeptídeos, meio de cultura, precursores químicos, e/ou outros produtos químicos usados na síntese. Portanto, um polipeptídeo purificado é cerca de 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais puro. Um polipeptídeo purificado não inclui extratos celulares não- purificados ou semipurificados ou misturas de polipeptídeos que são cerca de menos de 70% puras.

[00012] O termo "polipeptídeos"pode se referir a um ou mais de um tipo de polipeptídeo (um conjunto de polipeptídeos). Os "polipeptídeos" também podem se referir a misturas de dois ou mais tipos diferentes de polipeptídeos (uma mistura de polipeptídeos). Os termos "polipeptídeos"ou "polipeptídeo" também podem significar "um ou mais polipeptídeos". Uma modalidade da invenção proporciona um polipeptídeo purificado de Ehrlichia chaffeensis como mostrado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5.Um X significa qualquer aminoácido. TEREXEIESHQGETEKESGITESHQKEDEIVSQX SEQ ID NO:1

[00013] Em uma modalidade o X na posição 5 da SEQ ID NO: 1 é S ou N e o X na posição 34 é P ou S. KESGITESHQKEDEIVSQX SEQ ID NO: 2

[00014] Em uma modalidade o X na posição 19 da SEQ ID NO:2 é Sou P. MDIDNSNIST ADIRSNTDGL IDIIMRILGF GNKNIVQPQDLGSEIYQQEQ EDDTVSQPSL EPFVAESEVS KVEQEKTNPE VLIKDLQDVASHESGVSDQP AQVVTERENE IESHQGETEK ESGITESHQK EDEIVSQSSS EPFVAESEVSKVEQEETNPE VLIKDLQDVA SHESGVSDQPAQVVTEREXE IESHQGETEK ESGITESHQKEDEIVSQXSS EPFVAESEVS KVEQEETNPE VLIKDLQDVASHESGVSDQP AQVVTERESE IESHQGETEK ESGITESHQK EDEIVSQPSSEPFVAESEVS KVEQEETNPE VLIKDLQDVASHESGVSDQP AQVVTERESE IESHQGETEKESGITESHQK EDEIVSQPSS EPFVAESEVSKVEQEKTNPE ILVEDLPLGQ VIPVVVEKDEMFAPSFNPIV IKEEDKVCET CEQEFEIVKD SQTVKGSEDI ISPMQCLESM DSIVSTIFESGMLCPMSKPG QYVCGYEMYM YGFQDVKDLLGGLLSNVPVC CNVSLYFMEH NYFTNHENIN HNVVNDIV SEQ ID NO: 3 (p120-R)

[00015] Em uma modalidade o X na posição 189 é um S ou N e o X na posição 218 é um S ou P.

[00016] Cada SEQ ID NOs: 1-3 pode possuir um resíduo C N- terminal. Alternativamente, o resíduo C N-terminal pode estar ausente. O polipeptídeo P 120B é SEQ ID NO:1 com um resíduo C amino terminal onde o X na posição 5 da SEQ ID NO: 1 é S e o X na posição 34 da SEQ ID NO:1 é P (ou seja,CTERESEIESHQGETEKESGITESHQKEDEIVSQP; SEQ ID NO:4). O polipeptídeo p 120BK é SEQ ID NO:2com um resíduo C amino terminal onde o X na posição 19 da SEQ ID NO:2 é P (ou seja, CKESGITESHQKEDEIVSQP; SEQ ID NO:5).

[00017] Uma modalidade da invenção proporciona um polipeptídeo purificado que compreende a ID NO:1-5, onde o polipeptídeo consiste em menos de cerca de 650, 625, 600, 575, 550, 548, 525, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 ou menos (ou qualquer faixa entre 650 e 10)aminoácidos de Ehrlichia chaffeensiscontíguos de ocorrência natural. Em uma modalidade da invenção um polipeptídeo purificado compreende a SEQ ID NO: 1-5, onde o polipeptídeo compreende mais de cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 525, 548, 550, 575, 600, 625, ou 650 aminoácidos de Ehrlichia chaffeensiscontíguos de ocorrência natural (ou qualquer faixa entre cerca de 10 e 650 aminoácidos). Em uma modalidade da invenção um polipeptídeo purificado consiste em menos de cerca de 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 525, 548, 550, 575, 600, 625, 650 aminoácidos de Ehrlichia chaffeensiscontíguos de ocorrência natural (ou qualquer faixa entre 30 e 650) (ou seja, o polipeptídeo purificado não inclui todo o polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis pl20 de ocorrência natural. Os aminoácidos de Ehrlichia chaffeensis de ocorrência natural são quaisquer polipeptídeos naturalmente produzidos por um organismo Ehrlichia chaffeensis. Ou seja, um polipeptídeo purificado compreende um polipeptídeo mostrado na SEQ ID NOs:1-5, porém consiste em menos de cerca de 650, 625, 600, 575, 550, 548, 525, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, ou 20 aminoácidos de Ehrlichia chaffeensiscontíguos de ocorrência natural (ou qualquer faixa entre 650 e 20 aminoácidos).

[00018] O fato de os polipeptídeos SEQ ID NOs: 1-5 serem menores do que o polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis p120 de comprimento total é importante, pois polipeptídeos menores podem possuir maior especificidade e/ou sensibilidade do que os ensaios com polipeptídeos de comprimento total. Adicionalmente, esses polipeptídeos menores podem ser menos dispendiosos de se fabricar, e podem ser obtidos com maior pureza do que o polipeptídeo de comprimento total.

[00019] Uma modalidade da invenção proporciona um polipeptídeo purificado que é menor que cerca de 548, 525, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, ou 20 aminoácidos de Ehrlichia chaffeensis contíguos de ocorrência natural e maior que cerca de 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 525, ou 548 aminoácidos contíguos da SEQ ID NOs: 1-5 (ou qualquer faixa entre 548 e 20 aminoácidos).

[00020] Uma modalidade da invenção proporciona um polipeptídeo purificado que compreende ao menos cerca de 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50 ou mais aminoácidos contíguos da SEQ ID NOs: 1-5. Portanto, um polipeptídeo da invenção pode possuir, por exemplo, cerca de 19 a cerca de 40; cerca de 19 a cerca de 50; cerca de 19 a cerca de 100; ou cerca de 19 a cerca de 150 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo compreende de cerca de 85 resíduos de aminoácido a cerca de 160 resíduos de aminoácido da SEQ ID NO:3; de cerca de 90 resíduos de aminoácido a cerca de 150 resíduos de aminoácido da SEQ ID NO:3; ou de cerca de 100 resíduos de aminoácido a cerca de 140 da SEQ ID NO:3.

[00021] Os polipeptídeos variantes são ao menos cerca de 79% ou 80%, ou cerca de 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% idênticos às sequências de polipeptídeomostradas na SEQ ID NOs: 1-5 e também são polipeptídeos da invenção. Por exemplo, um polipeptídeo variante da SEQ ID NO:1 pode ser cerca de ao menos 97% (cerca de 1 alteração de aminoácido), 94% (cerca de 2 alterações de aminoácido), 91% (cerca de 3 alterações de aminoácido), 88% (cerca de 4 alterações de aminoácido), 85% (cerca de 5 alterações de aminoácido), 82% (cerca de 6 alterações de aminoácido), ou cerca de 79% (cerca de 7 alterações de aminoácido) idêntico à SEQ ID NO:1. Um polipeptídeo variante da SEQ ID NO:2 pode ser cerca de ao menos 95% (cerca de 1 alteração de aminoácido), 89% (cerca de 2 alterações de aminoácido), 84% (cerca de 3 alterações de aminoácido), ou 79% (cerca de 4 alterações de aminoácido) idêntico à SEQ ID NO:2. Um polipeptídeo variante da SEQ ID NO:4 pode ser cerca de ao menos 97% (cerca de 1 alteração de aminoácido), 94% (cerca de 2 alterações de aminoácido), 91% (cerca de 3 alterações de aminoácido), 89% (cerca de 4 alterações de aminoácido), 85% (cerca de 5 alterações de aminoácido), 83% (cerca de 6 alterações de aminoácido), ou cerca de 80% (cerca de 7 alterações de aminoácido) idêntico à SEQ ID NO:4. Um polipeptídeo variante da SEQ ID NO:5 pode ser cerca de ao menos 95% (cerca de 1 alteração de aminoácido), 90% (cerca de 2 alterações de aminoácido), 85% (cerca de 3 alterações de aminoácido), ou 80% (cerca de 4 alterações de aminoácido) idêntico à SEQ ID NO:5.

[00022] Os polipeptídeos variantes possuem uma ou mais variações de aminoácido conservativas ou outras modificações menores e mantêm a atividade biológica, ou seja, são equivalentes biologicamente funcionais. Um equivalente biologicamente ativo possui função substancialmente equivalente quando comparado ao polipeptídeo tipo selvagem correspondente. Em uma modalidade da invenção um polipeptídeo possui cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou menos substituições de aminoácido conservativas.

[00023] A porcentagem de identidade de sequência possui um significado reconhecido na técnica e há inúmeros métodos para calcular a identidade entre duas sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo. Veja, por exemplo, Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequência Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987); and Gribskov & Devereux, Eds., Sequência Analysis Iniciador, M Stockton Press, New York, (1991). Métodos para alinhamento de polinucleotídeos ou polipeptídeos são codificados em programas de computador, inclusive o pacote de programa GCG (Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al, J. Molec. Biol. 215:403 (1990)), e programa Bestfit (Wisconsin Sequência Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) que utiliza o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman {Adv. App. Math., 2:482-489 (1981)). Por exemplo, o programa de computador ALIGN que emprega o algoritmo FASTA pode ser usado, com uma pesquisa de intervalos afins a com uma penalidade de intervalo aberto de -12 e uma penalidade de extensão de intervalo de -2.

[00024] Quando se utiliza qualquer um dos programas de alinhamento de sequência para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, cerca de 95% idêntica a uma sequência de referência, os parâmetros são estabelecidos de modo que a porcentagem de identidade seja calculada pelo comprimento total do polinucleotídeo de referência e esses intervalos na identidade de até 5% do número total de nucleotídeos no polinucleotídeo de referência são permitidos.

[00025] Os polipeptídeos variantes podem ser geralmente identificados ao modificar uma das sequências de polipeptídeo da invenção, e avaliar as propriedades do polipeptídeo modificado para determinar se esse é um equivalente biológico. Uma variante é um equivalente biológico se esse reagir substancialmente como um polipeptídeo da invenção em um ensaio como um ensaio imuno- histoquímico, um Ensaio de imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA), uma radioimunoensaio (RIA), ensaio imunoenzimático ou um ensaio western blot, por exemplo, possuir 90 a 110% da atividade do polipeptídeo original. Em uma modalidade, o ensaio é um ensaio de competição onde o polipeptídeo biologicamente equivalente é capaz de reduzir a ligação do polipeptídeo da invenção a um antígeno ou anticorpo reativo correspondente por cerca de 80, 95, 99, ou 100%. Um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tipo selvagem correspondente também se liga especificamente ao polipeptídeo variante.

[00026] Uma substituição conservativa é uma onde um aminoácido é substituído por outro aminoácido que possui propriedades similares, de modo que um versado na técnica de química de peptídeos possa esperar que a estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptídeo seja substancialmente inalterada. Em geral, os seguintes grupos de aminoácidos representam alterações conservativas: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; e (5) phe, tyr, trp, his.

[00027] Um polipeptídeo da invenção pode compreender adicionalmente uma sequência sinal (ou líder) que dirige de maneira cotraducional ou pós-traducional a transferência da proteína. O polipeptídeo também pode compreender um ligante ou outra sequência para facilidade de síntese, purificação ou identificação do polipeptídeo (por exemplo, poli-His), ou para aumentar a ligação do polipeptídeo a um suporte sólido. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado com uma região Fc de imunoglobulina ou albumina sérica bovina.

[00028] Um polipeptídeo pode ser covalente ou não-covalentemente ligado a uma sequência de aminoácido à qual o polipeptídeo não é normalmente associado em natureza, ou seja, uma sequência de aminoácido heteróloga. Uma sequência de aminoácido heteróloga pode ser de um organismo não-Ehrlichia chaffeensis, uma sequência sintética, ou uma sequência de Ehrlichia chaffeensisnão geralmente localizada na terminação carbóxi ou amino de um polipeptídeo da invenção. Adicionalmente, um polipeptídeo pode ser covalente ou não- covalentemente ligado a compostos ou moléculas exceto aminoácidos, como reagentes indicadores. Um polipeptídeo pode ser covalente ou não-covalentemente ligado a um espaçador de aminoácido, um ligante de aminoácido, uma sequência sinal, uma sequência de interrupção de transferência, um domínio transmembrana, um ligante de purificação de proteína, ou uma combinação desses. Um polipeptídeo também pode ser ligado a uma porção (ou seja, um grupo funcional que pode ser um polipeptídeo ou outro composto) que aumenta uma resposta imune (por exemplo, citocinas como IL-2), uma porção que facilita a purificação (por exemplo, marcadores de afinidade como um marcador de seis histidinas, trpE, glutationa, proteína de ligação à maltose), ou uma porção que facilita a estabilidade de polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol; grupos de proteção de terminação amino como acetila, propila, succinila, benzila, benziloxicarbonila ou t-butiloxicarbonila; grupos de proteção de terminação carboxila como amida, metilamida, e etilamida). Em uma modalidade da invenção um ligante de purificação de proteína pode ser um ou mais resíduos de aminoácido C, por exemplo, na terminação amino ou terminação carbóxi ou ambas as terminações de um polipeptídeo da invenção. Um espaçador de aminoácido é uma sequência de aminoácidos que não está associada a um polipeptídeo da invenção em natureza. Um espaçador de aminoácido pode compreender cerca de 1, 5, 10, 20, 100, ou 1.000 aminoácidos.

[00029] Se desejado, um polipeptídeo da invenção pode ser parte de uma proteína de fusão, que também pode conter outras sequências de aminoácido, como ligantes de aminoácido, espaçadores de aminoácido, sequências de sinal, sequências de interrupção de transferência TMR, domínios transmembrana, bem como ligantes úteis em purificação de proteína, como glutationa-S-transferase, marcador de histidina, e proteína Staphylococcal A. Mais de um polipeptídeo da invenção pode estar presente em uma proteína de fusão da invenção. Um polipeptídeo da invenção pode ser ligado de maneira operável a proteínas não- Ehrlichia chaffeensis ou proteínas não-Ehrlichia chaffeensis p120 para formar proteínas de fusão. Uma proteína de fusão da invenção pode compreender um ou mais polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis da invenção, fragmentos desses, ou combinações desses. Uma proteína de fusão não ocorre em natureza. O termo "ligado de maneira operável"significa que o polipeptídeo da invenção e os outros polipeptídeos são fundidos em sintonia uns com os outros na terminação N ou terminação C dos polipeptídeo da invenção.

[00030] Os polipeptídeos da invenção podem estar sob a forma multimérica. Ou seja, um polipeptídeo pode compreender uma ou mais cópias de um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis da invenção ou uma combinação dessas. Um polipeptídeo multimérico pode ser um antígeno peptídico múltiplo (MAP). Veja, por exemplo, Tarn, J. Immunol. Methods, 196:17-32 (1996).

[00031] Os polipeptídeos da invenção podem compreender um antígeno que é reconhecido por um anticorpo específico para Ehrlichia chaffeensis. O antígeno pode compreender um ou mais epítopos (ou seja, determinantes antigênicos). Um epítopo pode ser um epítopo linear, epítopo sequencial ou um epítopo conformacional. Os epítopos dentro de um polipeptídeo da invenção podem ser identificados por diversos métodos. Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 4.554.101; Jameson & Wolf, CABIOS 4:181-186 (1988). Por exemplo, umpolipeptídeo da invenção pode ser isolado e classificado. Uma série de peptídeos curtos, que juntos transpõem toda uma sequência de polipeptídeo, pode ser preparada por clivagem proteolítica. Começando, por exemplo, com fragmentos de polipeptídeo de 30-mer (ou fragmentos menores), cada fragmento pode ser testado para a presença de epítopos reconhecida em um ELISA. Por exemplo, em um ensaio ELISA um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis, como um fragmento de polipeptídeo de 30-mer, é ligado a um suporte sólido, como os poços de uma placa de plástico de múltiplos poços. Uma população de anticorpos é marcada, adicionada ao suporte sólido e deixada se ligar ao antígeno não-marcado, sob condições onde a absorção não-específica é bloqueada, e qualquer anticorpo não ligado e outras proteínas são lavados. A ligação de anticorpo é detectada, por exemplo, por uma reação que converte um substrato incolor em um produto de reação colorido. Os fragmentos progressivamente menores e sobrepostos podem ser então testados a partir de um 30-mer identificado para mapear o epítopo de interesse.

[00032] Um polipeptídeo da invenção pode ser produzido de maneira recombinante. Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção pode ser introduzido em um vetor de expressão recombinante, que pode ser expresso em um sistema de célula hospedeira de expressão adequada utilizando técnicas bem-conhecidas. Uma variedade de sistemas de expressão bacteriana, de levedura, plantas, mamíferos, e insetos está disponível na técnica e qualquer tal sistema de expressão pode ser usado. Opcionalmente, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo pode ser traduzido em um sistema de tradução isento de célula. Um polipeptídeo também pode ser quimicamente sintetizado ou obtido a partir de células de Ehrlichia chaffeensis.

[00033] Um polipeptídeo imunogênico da invenção pode compreender uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NOs: 1-5 ou fragmentos dessa. Um polipeptídeo imunogênico pode obter anticorpos ou outras respostas imunes (por exemplo, respostas de célula T do sistema imune) que reconhecem epítopos de um polipeptídeo que possui SEQ ID NOs: 1- 5. Um polipeptídeo imunogênico da invenção também pode ser um fragmento de um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NOs: 1-5. Um fragmento de polipeptídeo imunogênico da invenção pode possuir cerca de 6, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, ou mais aminoácidos de comprimento (ou qualquer faixa entre 6 e 500). Um fragmento de polipeptídeo imunogênico da invenção pode possuir cerca de 500, 400, 300, 200, 150, 100, 90, 80, ,70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 6, ou menosaminoácidos de comprimento (ou qualquer faixa entre 500 e 6).

Polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis

[00034] Os polinucleotídeos da invenção contêm menos de um genoma microbiano completo e podem ser ácidos nucleicos de cadeia simples ou dupla. Um polinucleotídeo pode ser RNA, DNA, cDNA, DNA genômico, RNA ou DNA quimicamente sintetizado ou combinações desses. Os polinucleotídeos podem ser purificados isentos de outros componentes, como proteínas, lipídeos e outros polinucleotídeos. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser 50%, 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% purificado. Uma molécula de ácido nucleicoexistente entre centenas a milhares de outras moléculas de ácido nucleico, por exemplo, dentro de bibliotecas de cDNA ou genômicas, ou pedaços de gel contendo uma digestão de restrição de DNA genômico não deve ser considerada um polinucleotídeo isolado. Os polinucleotídeos da invenção codificam os polipeptídeos da invenção descritos acima. Em uma modalidade da invenção os polinucleotídeos p120 codificam um polipeptídeo mostrado na SEQ ID NOs: 1-5 ou fragmentos desse.

[00035] Os polinucleotídeos da invenção podem consistir em menos de cerca de 1.500, 1.000, 500, 400, 360, 300, 250, 200, 150, 120, 100, 90, 75, 60, 57, ou 54 (ou qualquer faixa entre 1.500 e 54)polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensiscontíguos de ocorrência natural. Os polinucleotídeos da invenção podem consistir em mais de cerca de 54, 57, 60, 75, 90, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 360, 400, 500, 1.000, 1.500 (ou qualquer faixa entre 54 e 1.500), ou mais polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensiscontíguos de ocorrência natural. Os polinucleotídeos purificados podem compreender nucleotídeos heterólogos adicionais (ou seja, nucleotídeos que não são de Ehrlichia chaffeensis) e ainda aminoácidos de Ehrlichia chaffeensis adicionais desde que esses não ocorram naturalmente de maneira contígua com polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis p120. Os polinucleotídeos da invenção podem compreender outras sequências de nucleotídeo, como sequências que codificam ligantes, sequências de sinal, sequências de interrupção de transferência TMR, domínios transmembrana, ou ligantes úteis na purificação de proteína como glutationa-S-transferase, marcador de histidina, e proteína A de Staphylococcus. Uma modalidade da invenção proporciona um polinucleotídeo purificado que compreende ao menos cerca de 6, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500 ou mais nucleotídeos contíguos de codificação de SEQ ID NOs: 1-5.

[00036] Os polinucleotídeos da invenção podem ser isolados. Um polinucleotídeo isolado é um polinucleotídeo de ocorrência natural que não é imediatamente contíguo com uma ou ambas as sequências genômicas flanqueadoras 5’ e 3’ que estão naturalmente associadas a esse. Um polinucleotídeo isolado pode ser, por exemplo, uma molécula de DNA recombinante de qualquer comprimento, desde que as sequências de ácido nucléico naturalmente encontradas que flanqueiam imediatamente a molécula de DNA recombinante em um genoma de ocorrência natural sejam removidas ou estejam ausentes. Os polinucleotídeos isolados incluem moléculas de ácido nucleico de ocorrência não-natural. Os polinucleotídeos da invenção também podem compreender fragmentos que codificam polipeptídeos imunogênicos. Os polinucleotídeos da invenção podem codificar polipeptídeos de comprimento total, fragmentos de polipeptídeo, e polipeptídeos variantes ou de fusão.

[00037] As sequências de nucleotídeo degeneradas que codificam os polipeptídeos da invenção, bem como as sequências de nucleotídeo homólogas que são ao menos cerca de 80, ou cerca de 90, 96, 98, ou 99% idênticas às sequências de polinucleotídeo da invenção e os complementos desse também são polinucleotídeos da invenção. A porcentagem de identidade de sequência pode ser calculada como descrito na seção "Polipeptídeos". As sequências de nucleotídeo degeneradas são polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo da invenção ou fragmentos desse, porém se diferem em sequência de ácido nucleico da sequência de polinucleotídeo tipo selvagem, devido à degeneração do código genético. As moléculas de DNA complementar (cDNA), homólogos de espécies, e variantes de polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis que codificam polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis biologicamente funcionais também são polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis.

[00038] Os polinucleotídeos da invenção podem ser isolados das sequências de ácido nucleico presentes, por exemplo, em uma amostra biológica, como sangue, soro, saliva, ou tecido de um indivíduo infectado. Os polinucleotídeos também podem ser sintetizados no laboratório, por exemplo, utilizando um sintetizador automático. Um método de amplificação como PCR pode ser usado para amplificar os polinucleotídeos tanto de DNA genômico como cDNA que codificam os polipeptídeos. Os polinucleotídeos da invenção podem compreender sequências de codificação para polipeptídeos de ocorrência natural ou podem codificar sequências alteradas que não ocorrem na natureza. Se desejado, os polinucleotídeos podem ser clonados em um vetor de expressão que compreende elementos de controle de expressão, inclusive, por exemplo, origens de réplica, promotores, intensificadores, ou outros elementos reguladores que conduzem a expressão dos polinucleotídeos da invenção em células hospedeiras. Um vetor de expressão pode ser, por exemplo, um plasmídeo, como pBR322, pUC, ou ColEl, ou um vetor adenovírus, como um vetor Tipo 2 adenovírus ou vetor Tipo 5. Opcionalmente, outros vetores podem ser usados, inclusive, porém sem caráter limitativo, vírus Sindbis, vírus símios 40, vetores de alfavírus, vetores de poxvírus, e citomegalovírus e vetores retrovirais, como vírus do sarcoma murino, vírus do tumor mamário do camundongo, vírus da leucemia murina de Moloney, e vírus do sarcoma de Rous. Minicromossomas como MC e MC1, bacteriófagos, fagemídeos, cromossomos artificiais de levedura, cromossomos artificiais bacterianos, partículas de vírus, partículas similares a vírus, cosmídeos (plasmídeos nos quais os sítios cos de fago lambda foram inseridos) e replicons (elementos genéticos que são capazes de replicação sob seu próprio controle em uma célula) também podem ser usados.

[00039] Métodos de preparação de polinucleotídeos operavelmente ligados a uma sequência de controle de expressão e que os expressam em uma célula hospedeira são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patente N° U.S. 4.366.246. Um polinucleotídeo da invenção é operavelmente ligado quando esse for posicionado adjacente ou próximo a um ou mais elementos de controle de expressão, que dirigem a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo.

[00040] Os polinucleotídeos da invenção podem ser usados, por exemplo, como sondas ou iniciadores, por exemplo, iniciadores de PCR, para detectar a presença de polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra de teste, como uma amostra biológica. As sondas são moléculas capazes de interagir com um ácido nucleico-alvo, tipicamente de maneira específica de sequência, por exemplo, através de hibridização. Os iniciadores são um subconjunto de sondas que podem suportar uma manipulação enzimática e que podem se hibridizar com um ácido nucleico alvo de modo que a manipulação enzimática ocorra. Um iniciador pode ser produzido a partir de qualquer combinação de nucleotídeos ou derivados de nucleotídeo ou análogos disponíveis na técnica que não interferem na manipulação enzimática.

[00041] Uma sonda ou iniciador pode possuir cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos contíguos que codificam os polipeptídeos mostrados na SEQ ID NOs: 1-5.

[00042] A hibridização de ácidos nucleicos é bem entendida na técnica e discutida aqui. Tipicamente, uma sonda pode ser feita a partir de qualquer combinação de nucleotídeos ou derivados de nucleotídeo ou análogos disponíveis na técnica. A capacidade de tais sondas e iniciadores se hibridizarem especificamente com as sequências de polinucleotídeo de Ehrlichia chaffeensisirá permitir que esses sejam úteis na detecção da presença de sequências complementares em uma determinada amostra de teste. As sondas e iniciadores de polinucleotídeo da invenção podem se hibridizar com sequências complementares em uma amostra de teste como uma amostra biológica, inclusive saliva, sangue, plasma, soro, urina, fezes, fluido cérebro-espinhal, fluido amniótico, secreção de ferida, ou tecido. Os polinucleotídeos da amostra podem ser, por exemplo, submetidos à eletroforese em gel ou outras técnicas de separação de tamanho podem ser imobilizados sem separação de tamanho. As sondas ou iniciadores de polinucleotídeo podem ser marcados. Os marcadores adequados, e métodos de marcação de sondas e iniciadores, são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, marcadores radioativos incorporados por tradução por cortes ou por quinase, marcadores de biotina, marcadores fluorescentes, marcadores quimiluminescentes, marcadores bioluminescentes, marcadores quelantes de metal e marcadores de enzima. Os polinucleotídeos da amostra entram em contato com as sondas ou iniciadores sob condições de hibridização severas adequadas.

[00043] Dependendo da aplicação, condições variadas de hibridização podem ser usadas para atingir graus variados de seletividade da sonda ou iniciador próximos à sequência-alvo. Para aplicações que exigem alta seletividade, condições relativamente severas podem ser usadas, como baixas condições de sal e/ou de alta temperatura, como proporcionadas por uma concentração salina de cerca de 0,02 M a cerca de 0,15 M de sal a temperaturas de cerca de 50°C a cerca de 70°C. Para aplicações que exigem menos seletividade, condições de hibridização menos severas podem ser usadas. Por exemplo, as condições salinas de cerca de 0,14 M a cerca de 0,9M de sal, a temperaturas que variam de cerca de 20°C a cerca de 55°C. A presença de um complexo hibridizado que compreende a sonda ou iniciador e um polinucleotídeo complementar da amostra de teste indica a presença de polinucleotídeo de Ehrlichia chaffeensis na amostra.

Anticorpos

[00044] Os anticorpos da invenção são moléculas de anticorpo que se ligam especificamente a um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis da invenção, polipeptídeos variantes da invenção, ou fragmentos desses. Um anticorpo da invenção pode ser específico para um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis, por exemplo, um anticorpo específico para uma ou mais entre as SEQ ID NOs: 1-5. Em outra modalidade da invenção um anticorpo é específico para um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis e não é específico para um polipeptídeo de Ehrlichia canis (por exemplo, um anticorpo específico para SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-5). Em outra modalidade da invenção um anticorpo é específico para um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis e Ehrlichia canis (por exemplo, um anticorpo específico para SEQ ID NO:3). Um versado na técnica pode determinar facilmente se um anticorpo é específico para um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis ou E. canis utilizando os ensaios descritos aqui. Um anticorpo da invenção pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo de cadeia única (scFv), ou um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo. Os fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos são uma parte de um anticorpo intacto que compreende o sítio de ligação ao antígeno ou região variável de um anticorpo intacto, onde a parte é isenta dos domínios de cadeia pesada constantes da região Fc do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno incluem fragmentos Fab, Fab’, Fab’- SH, F(ab’)2 e Fv.

[00045] Um anticorpo da invenção pode ser qualquer classe de anticorpo, inclusive, por exemplo, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Um anticorpo ou fragmento desse se liga a um epítopo de um polipeptídeo da invenção. Um anticorpo pode ser produzido in vivo em animais de laboratório adequados ou in vitro utilizando técnicas de DNA recombinante. Meios para preparar e caracterizar anticorpos são bem- conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:38999 (1994); Drenckhahn et al. Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993);Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992). Por exemplo, os anticorpos policlonaispodem ser produzidos ao administrar um polipeptídeo da invenção a um animal, como um ser humano ou outro primata, camundongo, rato, coelho, porquinho-da-Índia, cabra, porco, cão, vaca, ovelha, jumento ou cavalo. O soro do animal imunizado é coletado e os anticorpos são purificados a partir do plasma, por exemplo, por precipitação com sulfato de amônio, seguida por cromatografia, como cromatografia de afinidade. As técnicas para produzir e processar os anticorpos policlonais são bem-conhecidas.

[00046] Os termos "se liga especificamente", "se ligam especificamente" ou "específico para" significam que um primeiro antígeno, por exemplo, um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis, reconhece e se liga a um anticorpo da invenção com maior afinidade do que a outras moléculas não-específicas. Os termos "se liga especificamente", "se ligam especificamente" ou "específico para"também significam que um primeiro anticorpo, por exemplo, um anticorpo contra SEQ ID NOs: 1-5, reconhece e se liga à SEQ ID NOs: 1-5, com maior afinidade do que a outras moléculas não-específicas. Uma molécula não-específica é um antígeno que não compartilha nenhum epítopo comum com o primeiro antígeno. Em uma modalidade preferida da invenção uma molécula não-específica não é derivada de Ehrlichia sp., e em particular não é derivada de Ehrlichia chaffeensis ou Ehrlichia canis. "Ehrlichia sp" se refere a todas as espécies do gênero Ehrlichia. Por exemplo, um anticorpo contra um primeiro antígeno (por exemplo, um polipeptídeo) ao qual se liga de maneira mais eficaz do que a um antígeno não-específico pode ser descrito como ligando-se especificamente ao primeiro antígeno. Em uma modalidade, um anticorpo ou parte de ligação ao antígeno desse se liga especificamente a um polipeptídeo da SEQ ID NOs: 1-5 ou fragmentos desse quando esse se liga com uma afinidade de ligação Ka de 1071/mol ou mais. A ligação específica pode ser testada utilizando, por exemplo, um ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), ou um ensaio de western blot utilizando uma metodologia bem- conhecida na técnica.

[00047] Os anticorpos da invenção incluem anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno desses que (a) competem com um anticorpo de referência para ligação à SEQ ID NOs: 1-5 ou fragmentos de ligação ao antígeno desse; (b) se ligam ao mesmo epítopo da SEQ ID NOs: 1-5 ou fragmentos de ligação ao antígeno desses como um anticorpo de referência; (c) se ligam à SEQ ID NOs: 1-5 ou fragmentos de ligação ao antígeno desses com substancialmente o mesmo Kd como um anticorpo de referência; e/ou (d) se ligam à SEQ ID NOs: 1-5 ou fragmentos desses com substancialmente a mesma dissociação como um anticorpo de referência, onde o anticorpo de referência é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno desse que se liga especificamente a um polipeptídeo da SEQ ID NOs: 1-5 ou fragmentos de ligação ao antígeno desse com uma afinidade de ligação Ka de 1071/mol ou mais.

[00048] Adicionalmente, os anticorpos monoclonais contra epítopos presentes em um polipeptídeo da invenção também podem ser facilmente produzidos. Por exemplo, as células B normais de um mamífero, como um camundongo, que foi imunizado com um polipeptídeo da invenção podem ser fundidas, por exemplo, com células do mieloma do camundongo sensíveis a HAT para produzir hibridomas. Os hibridomas que produzem anticorpos específicos para Ehrlichia podem ser identificados utilizando RIA ou ELISA e isolados por clonagem em ágar semissólido ou limitando a diluição. Os anticorpos específicos para Ehrlichia que produzem clones são isolados por outra sessão de triagem. Os anticorpos monoclonais podem ser examinados para especificidade utilizando técnicas padrão, por exemplo, ligando um polipeptídeo da invenção a uma placa de microtitulação e medindo a ligação do anticorpo monoclonal por um ensaio ELISA. As técnicas para produzir e processar anticorpos monoclonais são bem-conhecidas. Veja, por exemplo, Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975). Os isotipos particulares de um anticorpo monoclonal podem ser diretamente preparados, ao selecioná-los a partir da fusão inicial, ou preparados de forma secundária, a partir de um hibridoma parental que secreta um anticorpo monoclonal de um isotipo diferente utilizando uma técnica de sib seleção para isolar variantes rearranjados. Veja, Steplewski et al., P.N.A.S. U.S.A. 82:8653 1985; Spria et al., J.Immunolog. Meth. 74:307, 1984. Os anticorpos monoclonais da invenção também podem ser anticorpos monoclonais recombinantes. Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 4.474.893; Patente U.S. N° 4.816.567. Os anticorpos da invenção também podem ser quimicamente construídos. Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 4.676.980.

[00049] Os anticorpos da invenção podem ser quiméricos (veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.482.856), humanizados (veja, por exemplo, Jones et al, Nature 321 :522 (1986); Reichmann et al, Nature 332:323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992)), anticorposcaninizados, caninos ou humanos. Os anticorpos humanos podem ser feitos, por exemplo, por imortalização direta, apresentação de fagos, camundongos transgênicos, ou uma metodologia Trimera, veja, por exemplo, Reisener et al, Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998).

[00050] Os anticorpos que se ligam especificamente a antígenos de Ehrlichia chaffeensis para a exclusão de antígenos de E. canis (por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 2, 4, e 5) são particularmente úteis para detectar a presença de antígenos de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra, como uma amostra de soro, sangue, plasma, urina, fezes, célula, tecido ou saliva de um animal. Os anticorpos que se ligam especificamente a antígenos de Ehrlichia chaffeensis e E. canis (por exemplo, SEQ ID NO:3) são particularmente úteis para detectar a presença de antígenos de Ehrlichia chaffeensis e E. canis em uma amostra. Um imunoensaio pode utilizar um anticorpo ou diversos anticorpos. Um imunoensaio pode utilizar, por exemplo, um anticorpo monoclonal específico para um epítopo, uma combinação de anticorpos monoclonais específicos para epítopos de um polipeptídeo, anticorpos monoclonais específicos para epítopos de polipeptídeos diferentes, anticorpos policlonais específicos para o mesmo antígeno, anticorpos policlonais específicos para antígenos diferentes, ou uma combinação de anticorpos monoclonais e policlonais. Os protocolos de imunoensaio podem estar baseados, por exemplo, em competição, reação direta, ou ensaio tipo sanduíche utilizando, por exemplo, anticorpo marcado. Os anticorpos da invenção podem ser marcados com qualquer tipo de marcador conhecido na técnica, inclusive, por exemplo, marcadores fluorescentes, quimiluminescentes, radioativos, enzima, metal coloidal, radioisótopo e marcadores bioluminescentes. Em uma modalidade da invenção, os anticorpos da invenção se ligam especificamente a antígenos de Ehrlichia chaffeensis e não se ligam especificamente a antígenos de Ehrlichia canis (por exemplo, anticorpos específicos para SEQ ID NOs: 1-2 ou 4-5). Em outra modalidade da invenção, osanticorpos da invenção se ligam especificamente a antígenos deEhrlichia chaffeensis e se ligam especificamente a antígenos deEhrlichia canis (por exemplo, anticorpos específicos para SEQ ID NO:3).

[00051] Os anticorpos da invenção ou fragmentos de ligação ao antígeno desses podem ser ligados a um suporte e usados para detectar a presença de antígenos de Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis. Os suportes incluem, por exemplo, vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita.

[00052] Os anticorpos da invenção podem ser adicionalmente usados para isolar organismos ou antígenos de Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis por colunas de imunoafinidade. Os anticorpos podem ser fixados a um suporte sólido, por exemplo, por adsorção ou por ligação covalente de modo que os anticorpos mantenham sua atividade imunosseletiva. Opcionalmente, os grupos espaçadores podem ser incluídos de modo que o sítio de ligação ao antígeno do anticorpo permaneça accessível. Os anticorpos imobilizados podem ser então usados para se ligar a organismos de Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis ou antígenos de Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis de uma amostra, como uma amostra biológica inclusive saliva, soro, sangue, urina, fezes, fluido cérebro-espinhal, fluido amniótico, secreção de ferida, ou tecido. Os organismos de Ehrlichia ou antígenos de Ehrlichia ligados são recuperados da matriz de coluna, por exemplo, por uma alteração em pH.

[00053] Os anticorpos da invenção também podem ser usados em estudos de imunolocalização para analisar a presença e distribuição de um polipeptídeo da invenção durante vários eventos celulares ou condições fisiológicas. Os anticorpos também podem ser usados para identificar as moléculas envolvidas em imunização passiva e para identificar as moléculas envolvidas na biossíntese de antígenos não- proteicos. A identificação de tais moléculas pode ser útil no desenvolvimento de vacina. Os anticorpos da invenção, inclusive, por exemplo, anticorpos monoclonais e anticorpos de cadeia única, podem ser usados para monitorar o processo de melhora de uma doença causada por Ehrlichia chaffeensis. Ao medir o aumento ou redução de anticorpos específicos para Ehrlichia chaffeensis em uma amostra de teste de um animal, pode-se determinar se um regime terapêutico particular voltado para a melhora do distúrbio é eficaz. Os anticorpos podem ser detectados e/ou quantificados utilizando, por exemplo, ensaios de ligação direta, como RIA, ELISA, ou ensaios de western blot.

Métodos de Detecção

[00054] Os métodos da invenção podem ser usados para detectar anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno específicos para antígenos de Ehrlichia chaffeensis, antígenos de Ehrlichia canis, polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis, polipeptídeos de E. canis ou combinações desses em uma amostra de teste, como uma amostra biológica, uma amostra ambiental, ou uma amostra laboratorial. Uma amostra de teste pode compreender potencialmente polinucleotídeos de Ehrlichia sp., polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis, polinucleotídeos de Ehrlichia canis, polipeptídeos de Ehrlichia sp., polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis, polipeptídeos de Ehrlichia canis, anticorpos específicos para Ehrlichia sp., anticorpos específicos para Ehrlichia chaffeensis, e/ou anticorpos específicos para Ehrlichia canis, combinações desses, anticorpos não-relacionados, polipeptídeo, polinucleotídeos, ou nenhum desses. Uma amostra biológica pode incluir, por exemplo, soro, saliva, urina, fezes, sangue, células, plasma, ou tecido de um mamífero como um cavalo, gato, cão ou ser humano. A amostra de teste pode ser não-tratada, precipitada, fracionada, separada, diluída, concentrada ou purificada.

[00055] Em uma modalidade, os métodos da invenção compreendem colocar um ou mais polipeptídeos da invenção em contato com uma amostra de teste sob condições que permitam que os complexos de polipeptídeo/anticorpo, ou seja, imunocomplexos, se formem. Ou seja, os polipeptídeos da invenção se ligam especificamente a anticorpos específicos para Ehrlichia chaffeensis e/ou antígenos de E. canis localizados na amostra. Em uma modalidade da invenção um ou mais polipeptídeos da invenção se ligam especificamente a anticorpos que são específicos para antígenos de Ehrlichia chaffeensis e não se ligam especificamente a antígenos de Ehrlichia canis (por exemplo, SEQ ID NOs: 1-2 e 4-5). Um versado na técnica conhece os ensaios e condições que são usados para detectar a ligação de complexo de anticorpo/polipeptídeo. A formação de um complexo entre polipeptídeos e anticorpos na amostra é detectada. A formação de complexos de anticorpo/polipeptídeo é uma indicação que polipeptídeos Ehrlichia chaffeensis e/ou polipeptídeos de Ehrlichia canis estão presentes na amostra. A ausência de detecção dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que os polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis e/ou polipeptídeos de Ehrlichia canisnão estão presentes na amostra.

[00056] Os anticorpos da invenção podem ser usados em um método de diagnóstico de infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis obtendo uma amostra de teste, por exemplo, de um ser humano ou animal suspeito de possuir uma infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis. A amostra de teste entra em contato com os anticorpos da invenção sob condições que permitem a formação de complexos de anticorpo-antígeno (ou seja, imunocomplexos). Um versado na técnica está ciente das condições que permitem e são apropriadas para a formação de complexos de antígeno/anticorpo. A quantidade de complexos de anticorpo-antígeno pode ser determinada pela metodologia conhecida na técnica. Um nível que é maior que aquele formado em uma amostra de controle negativo indica uma infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis. Uma amostra de controle negativo é uma amostra que não compreende nenhum polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis e/ou Ehrlichia canis ou anticorpos específicos para Ehrlichia chaffeensis e/ou Ehrlichia canis. Em uma modalidade da invenção o controle negativo não contém nenhum polipeptídeo de Ehrlichia sp. ou anticorpos específicos para Ehrlichia sp. Em uma modalidade da invenção um anticorpo é específico para antígenos de Ehrlichia chaffeensis e não é específico para antígenos de Ehrlichia canis. Alternativamente, um polipeptídeo da invenção pode entrar em contato com uma amostra de teste. Os anticorpos específicos para Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis em uma amostra de teste positiva irão formar complexos de antígeno-anticorpo sob condições adequadas. A quantidade de complexos de anticorpo-antígeno pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica.

[00057] Em uma modalidade da invenção, a infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou Ehrlichia canis pode ser detectada em um indivíduo. Uma amostra biológica é obtida do indivíduo. Um ou mais polipeptídeos purificados que compreendem SEQ ID NOs: 1-5 ou outros polipeptídeos da invenção entram em contato com a amostra biológica sob condições que permitem que os complexos de polipeptídeo/anticorpo se formem. Os complexos de polipeptídeo/anticorpo são detectados. A detecção dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que o mamífero possui uma infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou Ehrlichia canis. A ausência de detecção dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que o mamífero não possui uma infecção por Ehrlichia chaffeensis ou uma infecção por Ehrlichia canis.

[00058] Devido ao fato de a SEQ ID NO: 3 ser específica tanto para anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis e anti-Ehrlichia canis, a infecção detectada pode ser infecção por Ehrlichia chaffeensis, infecção por Ehrlichia canis, ou infecção tanto por Ehrlichia chaffeensis como por Ehrlichia canis. Devido ao fato de as SEQ ID NOs: 1, 2, 4, e 5 serem específicas para anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis, a infecção detectada é uma infecção por Ehrlichia chaffeensis. A falta de detecção dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que o indivíduo não possui uma infecção por Ehrlichia chaffeensis ou uma infecção por Ehrlichia canis.

[00059] Em uma modalidade da invenção, a infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou Ehrlichia canis pode ser detectada em um indivíduo em cerca de 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias ou mais após o indivíduo adquirir a infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou Ehrlichia canis. Em uma modalidade da invenção, a infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou Ehrlichia canis pode ser detectada em um indivíduo em cerca de 21 dias, 20 dias, 19 dias, 18 dias, 17 dias, 16 dias, 15 dias, 14 dias, 13 dias, 12 dias, 11 dias, 10 dias, 9 dias, 8 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias, ou menos após o indivíduo adquirir a infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou Ehrlichia canis.

[00060] Em uma modalidade da invenção, o complexo de polipeptídeo/anticorpo é detectado quando um reagente indicador, como um conjugado de enzima, que é ligado ao anticorpo, catalisa uma reação detectável. Opcionalmente, um reagente indicador que compreende um composto de geração de sinal que pode ser aplicado ao complexo de polipeptídeo/anticorpo sob condições que permitem a formação de um complexo de polipeptídeo/anticorpo/indicador. O complexo de polipeptídeo/anticorpo/indicador é detectado. Opcionalmente, o polipeptídeo ou anticorpo pode ser marcado com um reagente indicador antes da formação de um complexo de polipeptídeo/anticorpo. O método pode compreender opcionalmente um controle positivo ou negativo.

[00061] Em uma modalidade da invenção, um ou mais anticorpos da invenção são fixados a uma fase sólida ou substrato. Uma amostra de teste que compreende potencialmente uma proteína compreendendo um polipeptídeo da invenção é adicionada ao substrato. Um ou mais anticorpos que se ligam especificamente a polipeptídeos da invenção são adicionados. Os anticorpos podem ser os mesmos anticorpos usados na fase sólida ou podem ser de uma fonte ou espécie diferente e podem ser ligados a um reagente indicador, como um conjugado de enzimas. As etapas de lavagem podem ser realizadas antes de cada adição. Um cromóforo ou substrato de enzima é adicionado e permite- se que a cor se desenvolva. A reação de cor é interrompida e a cor pode ser quantificada utilizando, por exemplo, um espectrofotômetro.

[00062] Em outra modalidade da invenção, um ou mais anticorpos da invenção são fixados a uma fase sólida ou substrato. Uma amostra de teste que compreende potencialmente uma proteína compreendendo um polipeptídeo da invenção é adicionada ao substrato. Os segundos anticorpos antiespécie que se ligam especificamente a polipeptídeos da invenção são adicionados. Esses segundos anticorpos são de uma espécie diferente dos anticorpos de fase sólida. Os terceiros anticorpos antiespécie que são adicionados que se ligam especificamente aos segundos anticorpos e que não se ligam especificamente aos anticorpos de fase sólida são adicionados. Os terceiros anticorpos podem compreender um reagente indicador como um conjugado de enzima. As etapas de lavagem podem ser realizadas antes de cada adição. Um cromóforo ou substrato de enzima é adicionado e permite-se que a cor se desenvolva. A reação de cor é interrompida e a cor pode ser quantificada utilizando, por exemplo, um espectrofotômetro

[00063] Os ensaios da invenção incluem, porém sem caráter limitativo, aqueles baseados em competição, reação direta ou ensaios tipo sanduíche, inclusive, porém sem caráter limitativo, ensaio de imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA), western blot, IFA, radioimunoensaio (RIA), hemaglutinação (HA), imunoensaio de fluorescência por polarização (FPIA), e ensaios em placa de microtitulação (qualquer ensaio realizado em um ou mais poços de uma placa de microtitulção). Um ensaio da invenção compreende um ensaio de ligação cromatográfico de fluxo reversível, por exemplo, um ensaio SNAP®. Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.726.010.

[00064] Os ensaios podem utilizar fases sólidas ou substratos ou podem ser realizados por imunoprecipitação ou quaisquer outros métodos que não utilizam fases sólidas. Quando uma fase sólida ou substrato for usado, um ou mais polipeptídeos da invenção são direta ou indiretamente fixados a um suporte sólido ou um substrato como um poço de microtitulação, microesfera magnética, microesfera não- magnética, coluna, matriz, membrana, manta fibrosa composta de fibras sintéticas ou naturais (por exemplo, vidro ou materiais à base de celulose ou polímeros termoplásticos, como, polietileno, polipropileno, ou poliéster), estrutura sinterizada composta de materiais particulados (por exemplo, vidro ou vários polímeros termoplásticos), ou película de membrana fundida composta de nitrocelulose, náilon, polissulfona ou similares (geralmente de natureza sintética). Em uma modalidade da invenção um substrato é sinterizado, partículas finas de polietileno, comumente conhecido como polietileno poroso, por exemplo, polietileno poroso de 10-15 mícrons junto a Chromex Corporation (Albuquerque, NM). Todos esses materiais de substrato podem ser usados em formatos adequados, como películas, folhas, ou placas, ou esses podem ser revestidos ou ligados ou laminados para veículos inertes adequados, como papel, vidro, películas plásticas, ou tecidos. Métodos adequados para imobilizar peptídeos em fases sólidas incluem interações iônicas, hidrofóbicas, covalentes e similares.

[00065] Em um tipo de formato de ensaio, um ou mais polipeptídeos podem ser revestidos sobre uma fase sólida ou substrato. Uma amostra de teste suspeita de conter anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis ou fragmentos de ligação ao antígeno desses é incubada com um reagente indicador que compreende um composto de geração de sinal conjugado com um anticorpo ou fragmentos de anticorpo específicos para Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis durante um tempo e sob condições suficientes para formar complexos de antígeno/anticorpo de anticorpos da amostra de teste nos polipeptídeos da fase sólida ou o composto de reagente indicador conjugado com um anticorpo específico para Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis nos polipeptídeos da fase sólida. A redução de ligação do reagente indicador conjugado com anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis na fase sólida pode ser quantitativamente medida. Uma redução mensurável no sinal comparado com o sinal gerado, por exemplo, a partir de uma amostra de teste de Ehrlichia chaffeensis confirmada negativa indica a presença de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis na amostra de teste. Esse tipo de ensaio pode quantificar a quantidade de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis em uma amostra de teste.

[00066] Em outro tipo de formato de ensaio, um ou mais polipeptídeos da invenção são revestidos sobre um suporte ou substrato. Um polipeptídeo da invenção é conjugado com um reagente indicador e adicionado a uma amostra de teste. Essa mistura é aplicada ao suporte ou substrato. Se os anticorpos específicos para Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis estiverem presentes na amostra de teste esses irão se ligar a um ou mais polipeptídeos conjugados com um reagente indicador e ao um ou mais polipeptídeos imobilizados sobre o suporte. O complexo de polipeptídeo/anticorpo/indicador pode ser então detectado. Esse tipo de ensaio pode quantificar a quantidade de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis em uma amostra de teste.

[00067] Em outro tipo de formato de ensaio, um ou mais polipeptídeos da invenção são revestidos sobre um suporte ou substrato. A amostra de teste é aplicada ao suporte ou substrato e incubada. Os componentes não ligados da amostra são lavados por lavagem do suporte sólido com uma solução de lavagem. Se os anticorpos específicos para Ehrlichia chaffeensis estiverem presentes na amostra de teste, esses irão se ligar ao polipeptídeo revestido sobre a fase sólida. Esse complexo de polipeptídeo/anticorpo pode ser detectado utilizando um segundo anticorpo específico de espécie que é conjugado com um reagente indicador. O complexo indicador de polipeptídeo/anticorpo/anticorpo antiespécie pode ser detectado. Esse tipo de ensaio pode quantificar a quantidade de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis em uma amostra de teste.

[00068] A formação de um complexo de polipeptídeo/anticorpo ou um complexo de polipeptídeo/anticorpo/indicador pode ser detectada, por exemplo, por métodos radiométricos, colorimétricos, fluorométricos, separação por tamanho, ou de precipitação. Opcionalmente, a detecção de um complexo de polipeptídeo/anticorpo é realizada pela adição de um anticorpo secundário que é acoplado a um reagente indicador que compreende um composto de geração de sinal. Os reagentes indicadores que compreendem compostos de geração de sinal (marcadores) associados a um complexo de polipeptídeo/anticorpo podem ser detectados utilizando os métodos descritos acima e incluem agentes cromogênicos, catalisadores como compostos fluorescentes de conjugados de enzima como fluoresceína e rodamina, compostos quimiluminescentes como dioxetanos, acridinas, fenantridinas, rutênio, e luminol, elementos radioativos, marcadores visuais diretos, bem como cofatores, inibidores, partículas magnéticas, e similares. Exemplos de conjugados de enzima incluem fosfatase alcalina, peroxidase de raiz- forte, beta-galactosidase e similares. A seleção de um marcador particular não é importante, porém será capaz de produzir um sinal por si só ou em conjunto com uma ou mais substâncias adicionais.

[00069] A formação do complexo é indicativa da presença deanticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis em uma amostra de teste. Portanto, os métodos da invenção podem ser usados para diagnosticar infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis em um animal.

[00070] Os métodos da invenção também podem indicar a quantidade ou proporção de anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis em uma amostra de teste. Com muitos reagentes indicadores, como conjugados de enzima, a quantidade de anticorpos presentes é proporcional ao sinal gerado. Dependendo do tipo de amostra de teste, essa pode ser diluída com um reagente tampão adequado, concentrado, ou em contato com uma fase sólida sem qualquer manipulação. Por exemplo, é geralmente preferido testar amostras de soro ou plasma que foram anteriormente diluídas, ou espécimes concentrados como urina, para determinar a presença e/ou quantidade de anticorpo presente.

[00071] A invenção compreende adicionalmente kits de ensaio (por exemplo, artigos de fabricação) para detectar anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis ou fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno, ou polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis em uma amostra. Um kit compreende um ou mais polipeptídeos da invenção e meios para determinar a ligação do polipeptídeo a anticorpos anti-Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis ou fragmentos de anticorpo na amostra. Um kit ou artigo de fabricação também pode compreender um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpo da invenção e meios para determinar a ligação dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo a polipeptídeos de Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis na amostra. Um kit pode compreender um dispositivo que contém um ou mais polipeptídeos ou anticorpos da invenção e instruções para o uso do um ou mais polipeptídeos ou anticorpos para, por exemplo, a identificação de uma infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis em um mamífero. O kit também pode compreender um material de embalagem que compreende uma etiqueta indicando que o um ou mais polipeptídeos ou anticorpos do kit podem ser usados para a identificação de infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis. Outros componentes como tampões, controles, e similares, conhecidos pelos versados na técnica, podem ser incluídos em tais kits de teste. Os polipeptídeos, anticorpos, ensaios, e kits da invenção são úteis, por exemplo, no diagnóstico de casos individuais de infecção por Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis em um paciente, bem como estudos epidemiológicos de infecções por Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis.

[00072] Os polipeptídeos e ensaios da invenção podem ser combinados com outros polipeptídeos ou ensaios para detectar a presença de Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis juntamente com outros organismos. Por exemplo, os polipeptídeos e ensaios da invenção podem ser combinados com reagentes que detectam a dirofilariose e/ou Borrelia burgdorferi e/ou Anaplasma platys e/ou Anaplasma phagocytophilum.

[00073] Os polinucleotídeos da invenção podem ser usados para detectar a presença de polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra. Os polinucleotídeos podem ser usados para detectar os polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra por uma reação de hibridização simples e também podem ser usados, por exemplo, em reações em cadeia de polimerase (PCR) como uma reação PCR em tempo real. Os métodos e composições da invenção também podem ser usados para detectar diferencialmente a presença de Ehrlichia chaffeensis de outros Ehrlichia sp., como Ehrlichia canis.

[00074] Os ensaios PCR são bem descritos na técnica, inclusive, por exemplo, Patente U.S. No4.683.195; Patente U.S. N° 4.683.202; Patente U.S. N° 4.965.188. Geralmente, os iniciadores de polinucleotídeo são anelados em filamentos desnaturados de um ácido nucleico-alvo. Os produtos de extensão de iniciador são formados por polimerização de desoxinucleosídeo trifosfatos por uma polimerase. PCR então envolve ciclos repetitivos de desnaturação de ácido nucleico modelo, anelamento e extensão de iniciador dos iniciadores anelados pela ação de uma polimerase termoestável. O processo resulta em amplificação exponencial dos ácidos nucleicos modelo de Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis na amostra de teste, que permite a detecção de polinucleotídeos-alvo existente em concentrações muito baixas em uma amostra.

[00075] Os ensaios de PCR em tempo real estão baseados na detecção de um sinal, por exemplo, um sinal repórter fluorescente. Esse sinal aumenta em proporção direta à quantidade de produto PCR em uma reação. PCR em tempo real é qualquer técnica de amplificação que torna possível monitorar a evolução de uma reação de amplificação em progresso. Veja, Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection, Perkin Elmer Applied Biosystems (1999); PCR Protocols (Academic Press New York, 1989). Ao registrar a quantidade de emissão de fluorescência em cada ciclo, é possível monitorar a reação PCR durante a fase exponencial onde o primeiro aumento significativo na quantidade de produto PCR está correlacionada com a quantidade inicial de modelo-alvo. Quanto maior for o número de cópia de partida do alvo de ácido nucleico, mais rápido será observado um aumento significativo em fluorescência.

[00076] Uma modalidade da invenção proporciona um método para detectar e/ou quantificar os polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis em uma amostra de teste. Os iniciadores senso e iniciadores antissenso podem ser adicionados a uma amostra de teste sob condições adequadas para uma reação em cadeia de polimerase. Os iniciadores se hibridizam com polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis de modo que um produto de amplificação seja formado se polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis estiverem presentes na amostra de teste. Os produtos de amplificação são detectados e a presença e/ou quantidade de polinucleotídeos de Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canisé determinada. Os produtos de amplificação podem ser detectados com uma sonda de polinucleotídeo que é hibridizada, sob condições adequadas para uma reação em cadeia de polimerase, com uma sequência de polinucleotídeo Ehrlichia chaffeensis e/ou E. canis. O produto de amplificação pode ser quantificado medindo um sinal de detecção da sonda e comparando o dito sinal de detecção com um segundo sinal de detecção de sonda de um padrão de quantificação. O padrão de quantificação pode ser extraído em paralelo com a amostra de teste.

Métodos de Tratamento, Melhora, ou Prevenção de uma Doença Causada por E. chaffeensis ou E. canis

[00077] Os polipeptídeos, polinucleotídeos, e anticorpos da invenção podem ser usados para tratar, melhorar, ou prevenir uma doença causada por E. chaffeensis e/ou E. canis.

[00078] Por exemplo, um anticorpo, como um anticorpo monoclonal da invenção ou fragmentos de ligação ao antígeno desse, pode ser administrado a um animal, como um ser humano ou cão. Em uma modalidade da invenção um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno desse é administrado a um animal em uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno desse. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade eficaz para aliviar os sintomas de uma infecção por E. chaffeensis e/ou E. canis ou para reduzir a quantidade de organismos de E. chaffeensis e/ou E. canis em um indivíduo.

[00079] Os polipeptídeos ou polinucleotídeos da invenção podem estar presentes em uma composição imunogênica e usados para obter uma resposta imune em um hospedeiro. Uma composição imunogênica ou imunógeno é capaz de induzir uma resposta imune em um animal. Uma composição de polipeptídeo ou polinucleotídeo imunogênica da invenção é particularmente útil para sensibilizar um sistema imune de um animal de modo que, como resultado, uma resposta imune seja produzida para melhorar ou prevenir o efeito de infecção por E. chaffeensis e/ou E. canis. A obtenção de uma resposta imune em um modelo animal pode ser útil para determinar, por exemplo, doses ou vias de administração ótimas. A obtenção de uma resposta imune também pode ser usada para tratar, prevenir, ou melhorar uma doença ou infecção causada por E. chaffeensis e/ou E. canis. Uma resposta imune inclui respostas imunes humorais ou respostas imunes mediadas por célula, ou uma combinação dessas. Uma resposta imune também pode compreender a promoção de uma resposta do hospedeiro generalizada, por exemplo, promovendo a produção de defensinas.

[00080] Uma modalidade da invenção proporciona um imunógeno que compreende um polipeptídeo da invenção e uma ou mais regiões adicionais ou porções covalentemente ligadas ao polipeptídeo na terminação carboxila ou terminação amino. Cada região ou porção pode, por exemplo, aumentar a resposta imune, facilitar a purificação do imunógeno, ou facilitar a estabilidade de polipeptídeo.

[00081] A geração de um título de anticorpo por um animal contra E. chaffeensis e/ou E. canis pode ser importante na proteção contra infecção e depuração de infecção. A detecção e/ou quantificação de títulos de anticorpo após a liberação de um polipeptídeo ou polinucleotídeo pode ser usada para identificar epítopos que são particularmente eficazes na produção de títulos de anticorpo. Os epítopos responsáveis por uma resposta de anticorpo forte a E. chaffeensis e/ou E. canis podem ser identificados obtendo anticorpos contra polipeptídeos de E. chaffeensis e/ou E. canis de comprimentos diferentes. Os anticorpos obtidos por um epítopo de polipeptídeo particular podem ser então testados utilizando, por exemplo, um ensaio ELISA para determinar quais polipeptídeos contêm epítopos que são mais eficazes na geração de uma resposta forte. Os polipeptídeos ou proteínas de fusão que contêm esses epítopos ou polinucleotídeos que codificam os epítopos podem ser então construídos e usados para obter uma resposta de anticorpo forte.

[00082] Um polipeptídeo, polinucleotídeo, ou anticorpo da invenção pode ser administrado a um mamífero, como um camundongo, coelho, porquinho-da-Índia, macaco, babuíno, chimpanzé, ser humano, vaca, ovelha, porco, cavalo, cão, gato ou a animais como galinhas ou patos, para obter anticorpos in vivo. A injeção de um polinucleotídeo possui vantagens práticas de simplicidade de construção e modificação. Ademais, a injeção de um polinucleotídeo resulta na síntese de um polipeptídeo no hospedeiro. Assim, o polipeptídeo é apresentado ao sistema imune do hospedeiro com modificações pós-traducionais, estrutura, e conformação nativas. Um polinucleotídeo pode ser liberado a um indivíduo como "DNA descoberto".

[00083] A administração de um polinucleotídeo, polipeptídeo, ou anticorpo pode ser realizada através de qualquer meio conhecido na técnica, inclusive injeção intramuscular, intravenosa, intrapulmonar, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, ou subcutânea, aerossol, intranasal, bomba de infusão, supositório, pela mucosa, tópica, e oral, inclusive injeção utilizando biobalística ("pistola de genes"). Um polinucleotídeo, polipeptídeo, ou anticorpo pode ser acompanhado por um transportador de proteína para administração oral. Uma combinação de métodos de administração também pode ser usada para obter uma resposta imune. Os anticorpos podem ser administrados em uma dose diária de cerca de 0,5 mg a cerca de 200 mg. Em uma modalidade da invenção os anticorpos são administrados em uma dose diária de cerca de 20 a cerca de 100 mg.

[00084] Os veículos e diluentes farmaceuticamente aceitáveis e veículos e diluentes veterinariamente aceitáveis para uso terapêutico são bem-conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. (1985)). O próprio veículo não deveria induzir a produção de anticorpos nocivos ao hospedeiro. Tais veículos incluem, porém sem caráter limitativo, macromoléculas grandes lentamente metabolizadas, como proteínas, polissacarídeos como látex funcionalizado SEPHAROSE®, agarose, celulose, microesferas de celulose e similares, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos como ácido poliglutâmico, polilisina, e similares, copolímeros de aminoácido, peptoides, lipitoides, e partículas de vírus não-virulento inativas, partículas ou células bacterianas. Lipossomas, hidrogéis, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradáveis, e bioadesivos também podem ser usados como um veículo para uma composição da invenção.

[00085] Os sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser usados nas composições da invenção, por exemplo, sais minerais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, ou sulfatos, bem como sais de ácidos orgânicos como acetatos, proprionatos, malonatos ou benzoatos. Os substratos de proteína especialmente úteis são albuminas séricas, hemocianina de molusco, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, toxoide tetânico, e outras proteínas bem-conhecidas pelos versados na técnica. As composições da invenção também podem conter líquidos ou excipientes, como água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer, solução de Hank, glicose, glicerol, dextrose, malodextrina, etanol, ou similares, separadamente ou em combinação, bem como substâncias como agentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes de ajuste de tonicidade, detergente, ou agentes de tamponamento de pH. Agentes ativos adicionais, como agentes bactericidas também podem ser usados.

[00086] Se desejado, moléculas coestimuladoras, que aumentam a *apresentação de imunógeno a linfócitos, como B7-1 ou B7-2, ou citocinas como MIP 1α, GM-CSF, IL-2, e IL- 12, podem ser incluídas em uma composição da invenção. Opcionalmente, adjuvantes também podem ser incluídos em uma composição. Os adjuvantes são substâncias que podem ser usadas para aumentar de maneira não- específica uma resposta imune específica. Geralmente, um adjuvante e um polipeptídeo da invenção são misturados antes da administração ao sistema imune, ou administrados separadamente, porém são administrados ao mesmo local do animal. Os adjuvantes podem incluir, por exemplo, adjuvantes oleosos (por exemplo, adjuvantes completos e incompletos de Freund), sais minerais (por exemplo, Alk(SO4)2; AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4), Sílica, Alum, Al(OH)3, e Ca3(PO4)2), polinucleotídeos (ou seja, ácidos Poli IC e Poli AU), e algumas substâncias naturais (por exemplo, cera D de Mycobacterium tuberculosis, bem como substâncias encontrados em Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis e membros do gênero Brucella. Os adjuvantes que podem ser usados incluem, porém sem caráter limitativo, MF59-0, hidróxido de alumínio, N-acetil-muramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637), referido como não-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D- isoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835 A, referido como MTP-PE), e RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, monofosforil lipídeo A, dimicolato de trealose e esqueleto da parede celular (MPL+TDM+CWS) em uma emulsão de 2% de esqualeno/TWEEN® 80 (polissorbato).

[00087] As composições da invenção podem ser formuladas em comprimidos passíveis de ingestão, comprimidos orais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, drágeas, formulações injetáveis, enxaguatórios bucais, dentrifícios e similares. A porcentagem de um ou mais polipeptídeos, polinucleotídeos, ou anticorpos da invenção em tais composições e preparações pode variar de 0,1% a 60% do peso da unidade.

[00088] A administração de polipeptídeos, polinucleotídeos, ou anticorpos pode obter uma resposta imune no animal que continua durante ao menos 1 semana, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano ou mais. Opcionalmente, uma resposta imune pode ser mantida em um animal fornecendo uma ou mais injeções de reforço do polipeptídeo, polinucleotídeo, ou anticorpos em 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, ou mais após a primeira injeção. Se desejado, as moléculas co- estimuladoras ou adjuvantes também podem ser proporcionadas antes, após ou juntamente com as composições.

[00089] Uma composição da invenção que compreende um polipeptídeo, polinucleotídeo, anticorpo, ou uma combinação desses é administrada de maneira compatível com a composição particular usada e em uma quantidade que é eficaz para obter uma resposta imune como detectada, por exemplo, por um ELISA. Um polinucleotídeo pode ser injetado de maneira intramuscular a um mamífero, como um babuíno, chimpanzé, cão, ou ser humano, em uma dose de 1 ng/kg, 10 ng/kg, 100 ng/kg, 1000 ng/kg, 0,001 mg/kg, 0,1 mg/kg, ou 0,5 mg/kg. Um polipeptídeo ou anticorpo pode ser injetado de maneira intramuscular a um mamífero em uma dose de 0,01, 0,05, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 5 ou 10 mg/kg.

[00090] Os polipeptídeos, polinucleotídeos, ou anticorpos, ou uma combinação desses podem ser administrados a um animal que não está infectado por E. chaffeensis e/ou E. canis ou podem ser administrados a um animal infectado por E. chaffeensis e/ou E. canis. Uma quantidade imunologicamente eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz significa a administração daquela quantidade a um indivíduo, em uma dose única ou como parte de séries, eficaz para o tratamento, melhora, ou prevenção de infecção por E. chaffeensis e/ou E. canis. As dosagens particulares de polinucleotídeo, polipeptídeos, ou anticorpos em uma composição irão depender de muitos fatores inclusive, porém sem caráter limitativo, espécie, idade, sexo, medição simultânea, condição geral do mamífero ao qual a composição é administrada, e o modo de administração da composição. Uma quantidade eficaz da composição da invenção pode ser facilmente determinada utilizando apenas experimentação rotineira.

[00091] Todas as patentes, pedidos de patente, e outras publicações científicas ou técnicas referidos aqui estão incorporados a título de referência em sua totalidade. A invenção descrita adequadamente de maneira ilustrativa aqui pode ser praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não são especificamente revelados aqui. Assim, por exemplo, em cada caso aqui qualquer um dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente em", e "consistindo em" pode ser substituído por cada um entre os outros dois termos, enquanto mantém seu significado normal. Os termos e expressões que foram empregados são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há a intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou partes dessas, porém é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Assim, deve ser entendido que embora a presente invenção seja especificamente descrita pelas modalidades, características opcionais, a modificação e variação dos conceitos descritos aqui podem ser utilizadas pelos versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas dentro escopo dessa invenção conforme definido pelas descrições e reivindicações em anexo.

[00092] Ademais, quando as características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos Markush ou outro agrupamento de alternativas, os versados na técnica irão reconhecer que a invenção também é descrita em termos de qualquer elemento individual ou subgrupo de elementos do grupo Markush ou outro grupo.

EXEMPLOS Exemplo 1 Placas de Ensaio ELISA Direto e Protocolos

[00093] Os polipeptídeos mostrados na SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5 foram conjugados com BSA e o conjugado foi revestido sobre placas IMMULON® 4. O tampão de revestimento possui 0,05M de carbonato de sódio, pH 9,6. 100 uL/poço de polipeptídeo diluído foram pipetados sobre as placas. As placas foram revestidas e incubadas durante a noite a 2°C a 8°C. A solução de polipeptídeo foi aspirada das placas e as placas foram lavadas 4X com tampão de lavagem HW PetChek® (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook ME). 300 uL/poço de 1% de BSA em 0,1M de Tris pH 7,6 foram adicionados às placas. As placas foram incubadas, revestidas, durante 6 horas à RT. A BSA foi aspirada e 300 uL/poço de 2,5% de sacarose em 0,1M de Tris pH 7,6 foram adicionados às placas. As placas foram incubadas, revestidas, durante a noite a 2°C a 8°C. A sacarose foi aspirada das placas e as placas foram espremidas para remover o excesso de líquido. As placas foram secas em uma câmara de vácuo durante 4 horas. As placas foram armazenadas com dessecantes em bolsas plásticas duplas a 2°C a 8°C.

[00094] Os polipeptídeos mostrados na SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5 foram conjugados com HRPO. Polipeptídeo diluído:HRPO foiadicionado a cada poço (100 uL/poço) e os controles e amostra (puros) foram adicionados (50 uL/poço). Um controle positivo para E.chaffeensis foi usado juntamente com um controle negativo. As placas foram suavemente espremidas e incubadas durante 1 hora à RT. As placas foram lavadas 6X com tampão de lavagem HW PetChek®. 100 uL/poço de substrato TMB foram adicionados aos poços e as placas foram incubadas durante 10 min. 50 uL/poço de solução de parada foram adicionados aos poços. As placas foram lidas a A650. O corte negativo foi determinado como valor 2 x controle negativo O. D.

Exemplo 2 Placas de Ensaio ELISA Indireto e Protocolos

[00095] Os polipeptídeos mostrados na SEQ ID NOs: 5, 4 e 3 foram revestidas em placas Immulon® 1. O tampão de revestimento possui 0,05M de carbonato de sódio, pH 9,6. 100 uL/poço de polipeptídeo diluído foram adicionados às placas e as placas foram incubadas, revestidas, durante a noite à temperatura ambiente (RT). Os polipeptídeos foram aspirados e as placas foram lavadas 2X com tampão de lavagem HW PetChek®. 200 uL/poço 2% de TWEEN® (polissorbato) 20/2,5% de sacarose em 0,1M de Tris pH 7,6 foram adicionados aos poços e as placas foram incubadas, revestidas, durante 2 horas à RT. A solução de bloqueio foi aspirada e as placas foram espremidas para remover o excesso de líquido. As placas foram secas em bolsas de mylar durante a noite à RT com 2 (27g) dessecantes/6 placas. As placas foram armazenadas a 2°C a 8°C.

[00096] Os controles e amostras diluídos foram pipetados dentro dos poços a 100 uL/poço. Um controle positivo para E. chaffeensis foi usado juntamente com um controle negativo. As placas incubadas durante 30 minutos à RT. As placas foram lavadas 5X com tampão de lavagem HW PetChek®. 100 uL/poço de HRPO de coelho anticão diluído foram adicionados aos poços e incubados durante 30 min à RT. As placas foram lavadas 5X com tampão de lavagem HW PetChek®. 50 uL/poço de substrato TMB foram adicionados às placas e essas foram incubadas durante 10 min. 50 uL/poço de solução de parada foram adicionados. As placas foram lidas a A650. O corte negativo foi determinado como valor 2 x controle negativo O. D.

Exemplo 3 Ensaios de Polipeptídeo p120

[00097] p120B (SEQ ID NO:4) foi usado em ensaios diretos comodescrito acima para avaliar amostras de cães vacinados contra E. canis (os cães foram vacinados como descrito na Publicação de Patente US N° 20060234322). Esses ensaios foram realizados para determinar se p120B (SEQ ID NO:4) poderia proporcionar um resultado positivo em cães vacinados contra E. canis. As amostras de teste foram retiradas dos cães após a segunda vacinação de reforço. As placas foram revestidas em 0,5 ug/mL e o peptídeo:HRPO foi usado em uma concentração de 1 ug/mL. O ensaio SNAP® 4Dx® foi usado para mostrar que uma resposta de anticorpo anti-E. canis foi induzida nos cães vacinados. Esse ensaio classifica o antígeno da dirofilariose, anticorpo contra Ehrlichia canis, anticorpo contra Borrelia burgdorferi, e anticorpo contra Anaplasma phagocytophilum. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Os resultados positivos para anticorpo contra E. canis no teste SNAP® 4Dx® indicam que uma resposta de anticorpo foi induzida após a vacinação, p120B (SEQ ID NO:4) não proporciona um resultado positivo quando testado com amostras de cães vacinados contra E. canis em ensaios diretos. Portanto, p120B (SEQ ID NO:4) é específico para infecção por E. chaffeensis e não reage com soro de cães vacinados contra E. canis. Tabela 1

[00098] p120B (SEQ ID NO:4) e p120-R (SEQ ID NO:3) foramusados em um ensaio indireto como descrito acima em amostras de teste de cães experimentalmente infectados por E. canis. Esse ensaio foi realizado para determinar se p120B (SEQ ID NO:4) e p120-R (SEQ ID NO:3) poderiam proporcionar um resultado positivo em amostras de cães infectados por E. canis. As placas foram revestidas a 0,5 ug/mL. A diluição de amostra foi de 1:50 para p120B (SEQ ID NO:4) e 1:100 para pl20-R (SEQ ID NO:3). O conjugado de coelho anticão:HRPO foi usado em uma diluição de 1:1000 para p120B (SEQ ID NO:4) e uma diluição de 1:2000 para p120-R (SEQ ID NO:3). Os resultados são mostrados na Tabela 2. Tabela 2

[00099] p 120B (SEQ ID NO:4) não proporciona um resultado positivo quando testado com amostras de cães infectados por E. canis. Portanto, p120B (SEQ ID NO:4) é específico para E. chaffeensis e não para E. canis. P120-R (SEQ ID NO:3), entretanto, aparece para reagir de forma cruzada com E. canis. Portanto, p120-R (SEQ ID NO:3) é específico tanto para E. chaffeensis como para E. canis.

[000100] p120B (SEQ ID NO:4) e p120-R (SEQ ID NO:3) foram usados em um ensaio indireto como descrito acima em amostras de teste de cães experimentalmente infectados por E. chaffeensis em diversos pontos de tempo após a infecção. As placas foram revestidas em 0,5 ug/mL. A diluição de amostra foi de 1:50 para p120B (SEQ ID NO:4) e 1:100 para p120-R (SEQ ID NO:3). O conjugado de coelho anticão:HRPO foi usado em uma diluição de 1:1000 para p120B (SEQ ID NO:4) e uma diluição de 1:2000 para p120-R (SEQ ID NO:3). Os resultados são mostrados na Tabela 3 e figuras 1A e 1B. p120B (SEQ ID NO:4) e p120-R (SEQ ID NO:3) foram capazes de detectar anticorpos contra E. chaffeensis ao menos no 7° dia após a infecção. Tabela 3

Continuação...

[000101] Os polipeptídeos sintéticos p120B (SEQ ID NO:4) e p120BK (SEQ ID NO:5) foram usados em ensaios diretos e indiretos como descrito acima para testar uma amostra de um cão conhecida como positiva para anticorpo E. chaffeensis.

[000102] Para o ensaio direto, os conjugados de peptídeo-BSA foram revestidos sobre placas em 0,5 ug/mL. Os conjugados de peptídeo:HRPO foram usados em 1 ug/mL. Os resultados são mostrados na Tabela 4. Tanto p120B como p120BK mostraram resultados de teste positivos com a amostra do cão E. chaffeensis positivo (ID 21349M), porém não com as amostras de cães de controle E. chaffeensis-negativo (NC). Portanto, tanto p120B como p120BK foram capazes de detectar anticorpos E. chaffeensis no cão E. chaffeensis-positivo.

[000103] Para o ensaio indireto, os peptídeos foram revestidos sobre placas em 0,5 ug/mL. A diluição da amostra foi de 1/100. O conjugado de coelho anticão: HRPO conjugado foi utilizado a uma diluição de 1:2000. Os resultados são apresentados na Tabela 5. Tanto p120B como p120BK mostraram resultados de testes positivos com a amostra do cão E.chaffensis positivo (ID 21349M), porém não com as com as amostras de cães de controle E. chaffeensis negativo (NC). Portanto, tanto para p120B como para p120BK foram capazes de detectar anticorpos E. chaffeensis no cão E. chaffeensis positivo. Tabela 4

Tabela 5

Claims

1. Polipeptídeo purificado, caracterizado pelo fato de que consiste em: (a) SEQ ID NO:1; (b) SEQ ID NO:2; (c) SEQ ID NO:4; ou (d) SEQ ID NO:5; em que o polipeptídeo purificado está ligado a um reagente indicador, um espaçador de aminoácidos, uma sequência sinal, uma sequência de parada de transferência, um domínio transmembrana, um ligante de purificação de proteína, um polipeptídeo heterólogo, um ou mais polipeptídeos adicionais compreendendo SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 ou uma combinação dos mesmos; e em que, opcionalmente, o polipeptídeo purificado compreende um ou mais resíduos de aminoácidos C no terminal amino ou terminal carbóxi ou ambos os terminais do polipeptídeo.

2. Polipeptídeo purificado, caracterizado pelo fato de que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:5, em que o polipeptídeo purificado está ligado a um reagente indicador, um espaçador de aminoácidos, uma sequência sinal, uma sequência de parada de transferência, um domínio transmembrana, um ligante de purificação de proteína, um polipeptídeo heterólogo, um ou mais polipeptídeos adicionais compreendendo SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 ou uma combinação dos mesmos.

3. Método para detecção de anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra teste, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar um polipeptídeo purificado que consiste em SEQ ID NO: 1, 2, 4, ou 5 em contato com a amostra teste, sob condições que permitem que os complexos de polipeptídeo/anticorpo se formem; em que o polipeptídeo purificado está opcionalmente ligado a um reagente indicador, um espaçador de aminoácidos, uma sequência sinal, uma sequência de parada de transferência, um domínio transmembrana, um ligante de purificação de proteína, um polipeptídeo heterólogo, um ou mais polipeptídeos adicionais compreendendo SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 ou uma combinação dos mesmos; e em que, opcionalmente, o polipeptídeo purificado compreende um ou mais resíduos de aminoácidos C no terminal amino ou terminal carbóxi ou ambos os terminais do polipeptídeo, e em que o polipeptídeo purificado não se liga especificamente a anticorpos de Ehrlichia canis na amostra teste; (b) detectar os complexos de polipeptídeo/anticorpo; em que a detecção dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que os anticorpos específicos para Ehrlichia chaffeensisestão presentes na amostra teste.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda colocar os complexos da etapa (a) em contato com um reagente indicador antes da execução da etapa (b), em que o reagente indicador é usado para detectar os complexos de polipeptídeo/anticorpo.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que não detecta anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo de Ehrlichia canis.

6. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a quantidade de anticorpo na amostra teste é determinada.

7. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo purificado é ligado a um substrato.

8. Método para detecção de uma infecção por Ehrlichia chaffeensis em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma amostra biológica do indivíduo; (b) colocar um polipeptídeo purificado que consiste em SEQ ID NO: 1, 2, 4 ou 5 em contato com a amostra biológica sob condições que permitem que os complexos de polipeptídeo/anticorpo se formem; em que o polipeptídeo purificado está opcionalmente ligado a um reagente indicador, um espaçador de aminoácidos, uma sequência sinal, uma sequência de parada de transferência, um domínio transmembrana, um ligante de purificação de proteína, um polipeptídeo heterólogo, um ou mais polipeptídeos adicionais compreendendo SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 ou uma combinação dos mesmos; e em que, opcionalmente, o polipeptídeo purificado compreende um ou mais resíduos de aminoácidos C no terminal amino ou terminal carbóxi ou ambos os terminais do polipeptídeo; e (c) detectar os complexos de polipeptídeo/anticorpo; em que a detecção dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que o indivíduo possui uma infecção por Ehrlichia chaffeensis, e em que o método não detecta infecção por Ehrlichia canis no indivíduo.

9. Método para detecção de um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensis em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 1 2, 4, ou 5 em contato com a amostra sob condições que permitem que os complexos de polipeptídeo/anticorpo se formem; (b) detectar os complexos de polipeptídeo/anticorpo; em que a detecção dos complexos de polipeptídeo/anticorpo é uma indicação que um polipeptídeo de Ehrlichia chaffeensisestá presente na amostra.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os anticorpos são anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno, ou anticorpos de cadeia única.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os anticorpos são fixados a um substrato.

12. Polipeptídeo purificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que está ligado a um substrato.

13. Polipeptídeo purificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a anticorpos específicos para Ehrlichia chaffeensis e não se liga especificamente a anticorpos específicos para E. canis.

14. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo purificado compreende um ou mais polipeptídeos consistindo na SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5 ou combinações das mesmas.

15. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o contato dos complexos da etapa (b) com um reagente indicador antes da realização da etapa (c), em que o reagente indicador é usado para detectar os complexos de polipeptídeo/anticorpo.

16. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a quantidade de anticorpo na amostra teste é determinada.

17. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo purificado está ligado a um substrato.

18. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo purificado está ligado a um reagente indicador, um espaçador de aminoácidos, uma sequência sinal, uma sequência de parada de transferência, um domínio transmembrana, um ligante de purificação de proteínas ou uma proteína heteróloga.

19. Método, de acordo com a reivindicação 128, carac-terizado pelo fato de que o polipeptídeo purificado compreende um ou mais polipeptídeos consistindo em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5 oucombinações dos mesmos.