JP3474574B2 - 結合特異性を有する組換ジスルフィド安定化ポリペプチドフラグメント - Google Patents

結合特異性を有する組換ジスルフィド安定化ポリペプチドフラグメント

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、ジスルフィド−安定化された（ds）組換ポ
リペプチド分子、例えば別のペプチドに対する結合能力
及び特異性を有する抗体分子の可変領域に関する。これ
らの分子及びその分子をコードする核酸配列を製造する
方法も説明する。
背 景 抗体は特定の同系抗原を認識且つそれに結合する分子
である。臨床診断、処置及び基礎科学研究において利用
するためのハイブリドーマ生産化モノクローナル抗体の
莫大な数の用途が述べられている。モノクローナル抗体
を利用する癌、ウィルス及び微生物感染、Ｂ細胞免疫不
全並びに免疫系のその他の病気及び障害の臨床処置が有
望のようである。イムノグロブリンのFvフラグメントは
抗原の高親和性結合にとって必要とされる抗体の最小の
機能成分であると考えられている。それらの小さなサイ
ズは、腫瘍をイメージ化する及び腫瘍に組換免疫毒素を
誘導する等の臨床用途に関して完全抗体よりも能力的に
一層有用なものとし、その理由は、サイズは腫瘍及び組
織への浸透力に大きく影響するからである。
Fvフラグメントは可変重鎖ドメイン（VH）及び可変軽
鎖ドメイン（VL）のヘテロダイマーである。完全IgGの
中にある重鎖及び軽鎖ドメインのヘテロダイマーは、例
えば、ジスルフィド結合により連結されている。これら
のFvフラグメントはではなく、それ故Fvは単独では不安
定である。Glockshuberら、Biochemistry 29:1362−136
7（1990）。ペプチドリンカーにより連結されているVH
及びVLを有する組換Fvは一般に安定である。例えば、Hu
stonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883（198
8）及びBirdら、Science 242:423−426（1988）を参照
のこと。これらは一本鎖Fvであり、特異性及び親和性を
維持していることが認められており、そして腫瘍をイメ
ージ化する及び例えば腫瘍療法のための組換免疫毒素を
作るのに有用であることが示されている。しかしなが
ら、研究者は、一部の一本鎖Fvは抗原に対する弱い親和
力を有し、そしてペプチドリンカーが結合を妨害するこ
とを見い出している。
Fvを安定化せしめる別の手法はGlockshuberら前掲に
より試されている。構造が既知である抗体の相補性決定
領域（CDR）の中にジスルフィド結合を、リガンド結合
に対して限られた影響しか及ぼさない又は全く影響を及
ぼさないように設ける。この手法は未知の構造を有する
他のFvを安定化するためには問題を抱えており、その理
由は各々のCDR領域の構造が抗体間で異なるから、及びC
DR同志を架橋するジスルフィド結合は抗原結合を妨害し
がちであるからである。それ故、標的抗原に対する親和
力を維持するであろうような、注目の抗体のFv領域を安
定化する別の手段が所望されるであろう。
発明の概要 本発明はリガンドに特異的に結合するポリペプチドに
関連し、ここでこのポリペプチドはリガンド結合成分の
第一可変領域を含んで成り、その第一可変領域はこのリ
ガンド結合成分の第二の別の可変領域にジスルフィド結
合を介して結合しており、この結合はこの第一及び第二
可変領域のフレームワーク領域を連結している。このポ
リペプチドは例えばラジオアイソトープ、酵素、毒素も
しくは薬剤にコンジュゲートさせるか、又は毒素、酵素
もしくは薬剤に組換融合させてよい。このポリペプチド
及びそれを含む薬理組成物をコードする核酸配列も開示
する。
このポリペプチドは、その第一可変領域が抗体の軽鎖
可変領域であり、そして第二可変領域が抗体の重鎖可変
領域であるものであることが好ましい。このポリペプチ
ドはまた、その第一可変領域がＴ細胞レセプターのα可
変鎖領域であり、そしてその第二可変領域がＴ細胞レセ
プターのβ可変領域であるものである。
２つの可変領域を有するリガンド結合性成分のジスル
フィド安定化ポリペプチドを製造するための方法は下記
の工程を含んで成る： （ａ）この第一可変領域に関する核酸を、42,43,44,45
又は46位においてシステインをコードするように突然変
異させ、そしてこの第二可変領域に関する核酸を、103,
104,105又は106位においてシステインをコードするよう
に突然変異させる（かかる位置はKabat and Wuにより公
開された番号付け法に従い、抗体の軽鎖及び重鎖領域の
それぞれに対応して決定される）；又は （ｂ）この第一可変領域に関する核酸を、43,44,45,46
又は47位においてシステインをコードするように突然変
異させ、そしてこの第二可変領域に関する核酸を、98,9
9,100又は101位においてシステインをコードするように
突然変異させる（かかる位置はKabat and Wuにより公開
された番号付け法に従い、抗体の重鎖又は軽鎖のそれぞ
れに対応して決定される）；次いで （ｃ）発現系においてこの第一可変領域に関する核酸及
びこの第二可変領域に関する核酸を発現させる；そして （ｄ）抗原に対する結合親和性を有する前記ポリペプチ
ドを回収する。
本発明はペプチドリンカーにより連結されているVH及
びVLを有する組換Fvに至る別の手段を提供する。かかる
組換一本鎖Fvは一般には安定であり、且つ特異的である
が、一部のものは抗原に対して弱まった親和力を有し、
そしてペプチドリンカーが結合を妨害しうる。Fvフラグ
メントの保存領域の中に位置するジスルフィド結合によ
り安定化された組換Fvポリペプチドを製造するための手
段及びこれらを含む組成物、例えば免疫毒素も記述す
る。
本発明の臨床投与は、大きめのフラグメント又は抗体
分子全体の利用に勝るいくつかの利点を提供する。好適
な形態における本発明のポリペプチドは、追加のジスル
フィド結合に基づきより強い安定性を有する。それらの
サイズの小ささに基づき、それらは循環するタンパク質
分解酵素の解裂部位の数を減らし、より強い安定性をも
たらす。それらは標的組織に一層速く到達し、そして身
体から一層速く浄化される。それらは免疫原性も低まっ
ている。更に、そのサイズの小ささは、薬剤ターゲッテ
ィング及びイメージング用途における他の分子への特異
的な複合を助長する。
本発明はまた、Ｖドメインのα及びβ鎖を鎖間ジスル
フィド結合により連結することによってＴ細胞レセプタ
ーの抗原結合性部分（Ｖドメイン）を安定化する手段を
提供する。Ｖドメインのかかる安定化は可溶性形態のこ
のフラグメントの単離及び精製に役立つであろう。この
分子は従って他のFvのそれと似たような用途において利
用できうる。これらは腫瘍細胞についての診断アッセイ
又は自己免疫疾患及びAIDSの如くの免疫を基礎とする疾
患の検査において利用できうる。それらはまた腫瘍細胞
にとっての標的として、又は自己免疫疾患もしくはその
他の免疫を基礎とする疾患における望ましくない免疫応
答を阻止するための手段としての治療的用途も有しう
る。
図面の簡単説明 図1:MAb B3（第一列）及びMAb McPC603（第二列）の
重鎖及び軽鎖可変領域の配列対比。２本の配列間の実線
及び点線はそれぞれ同一性及び類似性を示す。フレーム
ワーク（FR）と相補性決定（CDR）領域との間にはスペ
ースを挿入しており、それらは配列の下に表示してい
る。好適な鎖間ジスルフィド結合についてのCysへと変
更できる残基を枠で囲った。配列の上のＸ印は10個毎の
残基を示している。VH 95SerからTyrに至る突然変異部
位及び軽鎖におけるその擬対称性（pseudo−symmetry）
関連Tyr残基はその上のチェックマーク（レ）により表
示している。配列表において、MAb B3の重鎖はSeq.ID N
o.1、MAb McPC603の重鎖はSeq.ID No.2、MAb 3Bの軽鎖
はSeq.ID No.3、そしてMAb McPC603の軽鎖はSeq.ID No.
4である。フレームワーク（FR1−４）及び相補決定領域
（CDR1−３）の表示はKabatら前掲による。
図2:B3（dsFv）−免疫毒素の発現用プラスミド。pUL1
28の一本鎖ウラシル含有DNAを、Kunkel突然変異誘発に
よるB3（VH）のarg44及びB3（VL）のser105をcysに突然
変異するための鋳型とした。B3（VH cys44）についての
発現プラスミドpYR38−２を、VL−PE38KDELをコードす
るEcoR I−フラグメントの欠失により作った。pULI39を
コードするB3（VL cys105）−PE38KDELは、VL−cys105
含有Pst I−Hind IIIフラグメントをB3（VL）−PE38KDE
LをコードするpULI21にサブクローニングすることによ
り構築した。
図3:様々な癌腫細胞系に対するB3（dsFv）−PE38KDEL
及びB3（Fv）−PEKDELの特異的細胞障害能。（ａ）B3抗
原発現性A431細胞及びB3−陰性HUT−1002細胞に対するB
3（Fv）−PE38KDEL及びB3（dsFv）−PE38KDELの細胞障
害能の対比；（ｂ）様々な細胞系に対するB3（dsFv）−
PE38KDELの細胞障害能；（ｃ）過剰のMAb B3の添加によ
るA431細胞に対する細胞障害能の競合。A431細胞には結
合するが別の抗原（トランスフェリンレセプター）には
結合しない等量のアイソタイプ−対合コントロールMAb
HB21の添加は競合しないことに注意。
図4:MAb（モノクローナル抗体）McPC603（「60
3」）、MAb B3（「B3」）、MAb e23（「e23」）及びMAb
aTac（「aTac」）の重鎖及び軽鎖フレームワーク領域
（FR2及びFR4のそれぞれ）のアミノ酸配列対比。
詳細な説明 本発明は、リガンドに特異的に結合することができ、
且つ２つの可変領域（例えば軽鎖及び重鎖可変領域）で
あって各可変領域のフレームワーク領域にあるジスルフ
ィド結合を介して互いと結合し合っている領域を有する
安定なポリペプチドを開示する。これらのポリペプチド
は高安定性であり、そして高結合性親和力を有する。こ
れらは各領域に関する核酸配列をこのポリペプチドのフ
レームワークにおける特定の位置においてシステインが
コードされるように突然変異させることにより作られ
る。
一般的なイムノグロブリン構造 イムノグロブリンファミリーのメンバーは全て一式の
アンチパラレルβ鎖をイムノグロブリン様フォールドへ
と安定化する中心に位置するジスルフィド結合を特徴と
するイムノグロブリン様ドメインを共有する。ファミリ
ーのメンバー（例えはMHCクラスＩ、クラスII分子、抗
体及びＴ細胞レセプター）はイムノグロブリンの可変又
は定常ドメインのいづれかと相同性を共有しうる。抗体
の重鎖又は軽鎖はＮ末端（NH2）可変領域（Ｖ）及びＣ
末端（−COOH）定常領域（Ｃ）を有する。この重鎖可変
領域はVHと称され、そして軽鎖可変領域はVLと称され
る。VH及びVLフラグメントは結合して「Fv」と称され
る。この可変領域は分子の抗体が認識する抗原に結合す
る部分であり、一方、定常領域は抗体のエフェクター機
能（例えば補体の固定、オプソニン化）を決定する。全
長イムノグロブリン又は抗体「軽鎖」（一般に約25キロ
ダルトン（kd）、約214個のアミノ酸）はＮ末端側（一
般に約110個のアミノ酸）において可変領域遺伝子によ
り、そしてCOOH末端側において定常領域遺伝子によりコ
ードされる。全長イムノグロブリン又は抗体の「重鎖」
（一般に約50kd、約446個のアミノ酸）は可変領域（一
般に約116アミノ酸をコードする）及び定常領域遺伝子
の一つ（約330個のアミノ酸をコードする）により同様
にしてコードされる。一般に、「VL」はVL及びJL（Ｊ又
は連結領域）遺伝子セグメントによりコードされる軽鎖
部分を含み、そして「VH」はVH並びにDH（Ｄ又は変化領
域）及びJH遺伝子セグメントによりコードされる重鎖部
分を含むであろう。一般的には、Roittら、Immunology,
Chapter 6（第２版1989）及びPaul,Fundamental Immuno
logy;Raven Press（第２版1989）を参照のこと（共に引
用することで本明細書に組入れる）。
イムノグロブリンの軽鎖又は重鎖の可変領域は、４つ
の比較的保存されているフレームワーク領域又はFrが隣
接している相補性決定領域又はCDRとも呼ばれている３
つの超可変領域を含んで成る。数多くのフレームワーク
領域及びCDRが並べられている（引用することで本明細
書に組入れる「Sequences of Proteins of Immunologic
al Interest」E.Kabatら米国政府印刷局、NIH公開No.91
−3242（1991）〔Kabat and Wu〕を参照のこと）。様々
な軽鎖又は重鎖間のフレームワークの配列は比較的保存
されている。このCDR及びFRポリペプチドセグメントは
現存の抗体のFv領域又はそれらをコードするDNAの配列
分析を実験的に基礎として命名されている。課題の抗体
配列とKabat and Wu他に公開されているものとの整合に
より、課題の抗体又はその他のリガンド結合性成分につ
いてのフレームワーク領域及びCDRが決定できうる。構
成的な軽鎖及び重鎖の組合せたフレームワーク領域はCD
Rを配置及び整列することを担う。CDRは抗原のエピトー
プに対する結合を主に司り、そして一般にCDR1,CDR2及
びCDR3（可変領域鎖のＮ末端から出発して順に番号付
け）と称されている。
Ｔ細胞レセプター遺伝子の一般的な順列は抗体の重鎖
のそれと似ている。Ｔ細胞レセプター（TCR）は可変ド
メイン（Ｖ）及び定常ドメイン（Ｃ）の両方を有する。
Ｖドメインは抗原との結合に役立つ。抗体のフレームワ
ークCDR領域と相同性の領域がＶドメインの中にある。
イムノグロブリンＶ領域に対する相同性は整合によって
決定できうる。TCRのＶ領域は抗体のFvとの高いアミノ
酸配列相同性を有する。引用することで本明細書に組入
れるHedrickらNature（London）308:153−158（198
4）。
本明細書において用いる語CDRは、天然イムノグロブ
リン結合性部位の天然可変結合性領域（例えばFv）、Ｔ
細胞レセプター（例えばＶα及びＶβ）の結合親和性及
び特異性、又はかかる機能を擬態する合成ポリペプチド
の結合親和性及び特異性を規定するアミノ酸配列を意味
する。本明細書において用いる語「フレームワーク領
域」又は「FR」はCDRの中にあるアミノ酸配列を意味す
る。
ここで言及している「リガンド結合性成分」は特定の
リガンド又は抗原に特異的に結合するあるいはそれらを
認識することのできる可変ドメインを有する分子であ
る。特に注目される成分には、抗体及びＴ細胞レセプタ
ー、並びにFv,Fab,F（ab′）２等の如くのものの合成又
は組換結合性フラグメントが含まれる。適切な可変領域
にはVH,VL,Vα及びＶβ等が含まれる。
本発明の実施は好ましくは抗体のFv部又はTCRのＶ部
のみを利用する。天然イムノグロブリンタンパク質構造
のその他のセクション、例えばCH及びCLは存在している
必要はなく、そして通常は本発明のポリペプチドから意
識的に排除される。しかしながら、本発明のポリペプチ
ドは、下記に説明の通り、生物活性領域を規定する更な
るポリペプチド領域、例えば毒素もしくは酵素を含んで
成るか、又は毒素もしくは遠隔的に検出可能な物質が結
合することのできうる部位を含んで成りうる。
Fvフラグメントの調製 注目のFv抗体フラグメント又はその他のリガンド結合
性成分に関する情報が、所望のジスルフィド安定化フラ
グメント、例えばFvフラグメント（dsFv）を安定化する
ようにジスルフィド結合を適正に配置するために、必要
とされる。注目の可変領域のアミノ酸配列を、Kabat an
d Wu前掲による公開物における類似の配列との整合によ
り比較し、所望のポリペプチドフラグメントのフレーム
ワーク領域の中にジスルフィド結合を供するため、どの
配列を突然変異させれば重鎖及び軽鎖の可変領域の適正
な位置においてシステインがコードされることができる
かを決定する。システイン残基は共有ジスルフィド結合
を供するのに必要である。例えば、ジスルフィド結合を
設けて、VLとのFR4とVHのFR2とを連結する；又はVLのFR
2とVHのFR4とを連結する；ことができる。
配列を整合させた後、Kabat and Wuにより利用される
番号付け系における下記の位置と整合する注目の配列に
おけるアミノ酸の位置が同定される：重鎖可変領域の4
3,44,45,46及び47位（グループ１）並びに103,104,105
及び106位（グループ２）；並びに軽鎖可変領域の42,4
3,44,45及び46位（グループ３）並びに98,99,100及び10
1位（グループ４）。あるケースにおいて、これらの位
置の一部は欠失しており、整合におけるすき間を示して
いる。
次に、このように同定した位置のうちの２つにあるア
ミノ酸をコードする核酸配列を、それらの２つのアミノ
酸がシステイン残基に突然変異されるように変える。選
択すべきアミノ酸のペアーは好ましい順に下記の通りで
ある： VH 44−VL 100, VH 105−VL 43, VH 105−VL 42, VH 44−VL 101, VH 106−VL 43, VH 104−VL 43, VH 44−VL 99, VH 45−VL 98, VH 46−VL 98, VH 103−VL 43, VH 103−VL 44, VH 103−VL 45。
最も好ましくは、システインの置換は次の位置におい
て施す： VH 44−VL 100;又は VH 105−VL 43。
（表示VH 44−VL 100は、例えば、44位においてシス
テイン、そして100位においてシステインを有するポリ
ペプチドを意味する；その位置はKabat and Wuにより付
与される番号付けに従う）。
Kabat and Wuに従う位置の表示に関し、位置の番号付
けは規定の保存残基を意味し、そして所定の抗体におけ
る実際のアミノ酸位置ではないことに注目すべきであ
る。例えば、下記の実施例に記載のds（Fv）B3を作るの
に用いるCysL100（Kabat and Wu）は実際にはB3（VL）
の105位に相当する。
Ｔ細胞レセプターのＶα及びＶβの場合において、Ｔ
細胞レセプターに関してもKabat and Wuにおける番号付
け系を参照することができる。システインの置換はＶα
の41,42,43,44もしくは45位及びＶβの106,107,108,109
もしくは110位において施すか；又はＶαの104,105,10
6,107,108もしくは109位において及びＶβの41,42,43,4
4もしくは45位において施してよく、かかる位置はTCRに
ついてのKabat and Wuの番号付け系に従う。このような
参照を行ったとき、最も好適なシステイン置換はＶα42
−Ｖβ110及びＶα108−Ｖβ42である。Ｖβ位106,107
及びＶα位104,105はCDRの位置であるか、それらはジス
ルフィド結合が安定的に配置されうる位置でもある。
Kabat and Wuの番号付け系の参照によるシステイン置
換についてのアミノ酸の位置を同定する別の方法とし
て、注目の配列を図１に示すモノクローナル抗体（MA
b）B3（下記の参照）についての配列と整合させること
ができる。グループ１について上記したKabat and Wuの
VH位に対応するB3のアミノ酸の位置はそれぞれ43,44,4
5,46及び47である。グループ２についてはそれぞれ109,
110,111及び112である。グループ３について上記したKa
bat and WuのVL位に対応するB3のアミノ酸の位置はそれ
ぞれ47,48,49,50及び51である；グループ４については
それぞれ103,104,105及び106である。
あるいは、システイン残基にする突然変異部位は以下
に例示する注目すべき実際の抗体又はモデル抗体のいづ
れかを参考にすることにより同定できうる。抗体の如く
のタンパク質のモデルを作り上げるためのコンピュータ
ープログラムは一般に入手でき、そして当業者に公知で
ある（Kabat and Wu;Loewら、Int.J.Quant.Chem.,Quan
t.Biol.Symp.,15:55−66（1988）;BruccoleriらNature,
335:564−568（1988）;Chothiaら、Science,233:755−7
58（1986）を参照のこと；全て引用することで本明細書
に組入れる）。市販のコンピュータープログラムを、コ
ンピューターモニター上でこれらのモデルを表示するの
に、原子間の距離を計算するのに、及び種々のアミノ酸
の相互作用の性質を評価するのに利用できる（Ferrin
ら、J.Mol.Graphics,6:13−27（1988）を参照のこと、
引用することで本明細書に組入れる）。例えば、コンピ
ューターモデルはアクセス可能であり、且つ結合に関与
する帯電アミノ酸残基を推定せしめることができ、これ
によりコンホメーション的に制約された有機分子を合成
することができる。例えば、Saragoviら、Science,253:
792（1991）を参照のこと（引用することで本明細書に
組入れる）。他のケースにおいて、実験的に決定した抗
体の実際の構造を得ることができうる。
適切なアミノ酸残基のペアーは（１）８Å以下、好ま
しくは6.5Å以下の２個の残基間の距離（Brookhaven Pr
otein Data Bank由来のものの如くの入手可能な抗体の
結晶構造体より決定）を有する；且つ（２）可能な限り
CDR領域から離れている；べきである。一旦同定できた
ら、それらをシステインで置換することができる。上記
のものと相同性の位置にあるモデル化B3における残基ペ
アー間のＣα−Ｃα距離を以下の表１に示す。
一ペアーのシステイン置換の導入がほとんどの用途に
とって十分であろう。追加の置換があるケースにおいて
有用且つ所望されうる。
標的地点においてシステインをコードするようにする
遺伝子の改良は公知の技術、例えば部位特異的突然変異
誘発（Gillman and Smith,Gene,8:81−97（1979）及びR
oberts,S.ら、Nature,328:731−734（1987）を参照のこ
と；共に引用することで本明細書に組入れる）により、
引用することで本明細書に組入れるKunkelのProc.Natl.
Acad.Sci.USA 82:488−492（1985）に記載の方法によ
り、又は任意のその他の公知手段により容易に成し遂げ
ることができうる。
所望のVH及びVL配列（又はその他の相同性Ｖ配列）に
関する配列を有する独立ベクターを突然変異せしめたプ
ラスミドより作ることができうる。重鎖領域及び軽鎖領
域をコードする配列は、下記に記載のガイドラインを除
き、当業界に公知又は記載の任意の方法で独立の培養物
において生産及び発現される。発現ポリペプチドの中に
別の配列、例えば毒素に関する配列を組込むとき、それ
はVH又はVL配列にＮ末端もしくはＣ末端において連結す
るか、又は別のタンパク質配列の中に適当な位置におい
て挿入してよい。例えば、シュードモナス外毒素（PE）
由来の融合タンパク質に関しては、VH又はVLのいづれか
をその毒素のＮ−末端に連結するか、又はThenerら、J.
Urology 149（1993）（引用することで本明細書に組入
れる）におけるTGFαの如くのように、PEのドメインIII
の中に挿入してよい。ジフテリア毒素由来の免疫毒素に
関しては、VH又はVLは毒素のＣ末端に連結するのが好ま
しい。
組換一本鎖抗体の発現において使用するものの如くの
ペプチドリンカーを、所望するならば２つの可変領域
（VH及びVL、Ｖα及びＶβ）を連結するのに採用してよ
く、そしてある種の分子においては安定性を積極的に高
めることができうる。本発明の二価又は多価ジスルフィ
ド安定化ポリペプチドは下記の実施例に記載の通り、２
以上の好ましくは同一のVH領域をペプチドリンカーで連
結し、次いでVLを付加することにより構築することがで
きる。ペプチドリンカー及びその用途は当業界に公知で
ある。例えば、引用することで本明細書に組入れるHust
onら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA前掲;Birdら、Science前
掲;Glockshuberら、前掲；米国特許第4,946,778号、米
国特許第5,132,405号、及び最近のStemmerら、Biotechn
iques 14:256−265（1993）を参照のこと。
本発明のタンパク質はE.コリ、他の細菌宿主、酵母並
び様々な高等真核細胞、例えばCOS,CHO及びHela細胞系
及びミエローマ細胞系等の様々な宿主細胞において発現
されうる。この組換タンパク質遺伝子は各宿主にとって
適切な発現コントロール配列に作動連結されているであ
ろう。E.コリに関しては、これにはプロモーター、例え
ばT7,trp,tac,lac又はラムダプロモーター、リボソーム
結合性部位、及び好ましくは転写終止シグナルが含まれ
る。真核細胞に関しては、このコントロール配列にはプ
ロモーター、そして好ましくはイムノグロブリン遺伝
子、SV40、サイトメガロウィルス等に由来するエンハン
サー、並びにポリアデニル化配列が含まれ、そしてスプ
ライスドナー及びアクセプター配列が含まれうる。本発
明のプラスミドは特定の宿主細胞の中に公知の方法、例
えばE.コリに関しては塩化カルシウム形質転換法、そし
て哺乳動物細胞に関してはリン酸カルシウム処理もしく
はエレクトロポレーションにより移入することができう
る。これらのプラスミドにより形質転換した細胞はプラ
スミド上に含まれている遺伝子、amp,gpt,neo及びhyg遺
伝子により付与される抗生物質耐性により選択されう
る。
E.コリの如くの細菌からの一本鎖抗体の発現及び／又
は適切に折りたたまれた形態へのリフォルディングのた
めの方法は記述され、且つ公知であり、そして本発明の
ポリペプチドに応用できる。Buchnerら、Analytical Bi
ochemistry 205:263−270（1992）;Pluckthun,Biotechn
ology,9:545（1991）;Huseら、Science,246:1275（198
9）及びWardら、Nature,341:544（1988）を参照のこと
（全て、引用することで本明細書に組入れる）。
往々にして、E.コリ又はその他の細菌由来の機能性タ
ンパク質は封入体から作られるものであり、従って強力
な変性剤を用いるタンパク質の可溶化及び事後リフォル
ディングを必要とする。可溶化工程においては、ジスル
フィド結合を溶解するために還元剤が存在していなけれ
ばならず、それは当業界に公知である。還元剤を有する
典型的なバッファーは:0.1Mのトリス、pH8、6Mのグアニ
ジン、2mMのEDTA、0.3MのDTE（ジチオスレイトール）で
ある。タンパク質ジスルフィド結合の再酸化は還元型及
び酸化型の低分子量チオール試薬の存在下で有効に触媒
されうる。これは引用することで本明細書に組入れるSa
xenaら、Biochemistry 9:5015−5021（1970）に、特にB
uchnerらAnal.Biochem.,前掲（1992）に記載されてい
る。
再生は一般に変性及び還元されたタンパク質をリフォ
ルディングバッファーの中に希釈（例えば100倍）する
ことにより成し遂げられる。典型的なバッファーは0.1M
のトリス、pH8.0、0.5MのＬ−アルギニン、8mMの酸化グ
ルタチオン（GSSG）及び2mMのEDTAである。
一本鎖抗体プロトコールについての必須の改良とし
て、重鎖及び軽鎖領域を別々に可溶化及び還元させ、次
いでリフォルディング溶液の中で結合させる。これらの
２種のタンパク質を、一方のタンパク質のモル過剰量が
他方より５倍の過剰量を超えないモル比で混合したとき
に好適な収量が得られる。
過剰の酸化グルタチオン又はその他の酸化性低分子量
化合物を、レドックスシャフリングを完了した後にこの
リフォルディング溶液に加えることが所望されうる。
ポリペプチドの精製 一旦発現させたら、この組換タンパク質は当業界の標
準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテ
ィーカラム、カラムクロマトグラフィー等に従って精製
できる（一般には、R.Scopes,Protein Purification,Sp
ringer−Verlag,N.Y.（1982）を参照のこと）。少なく
とも約90〜95％の均質性の実質的に純粋な組成物が好ま
しくは、そして薬理学的用途にとっては98〜99％又はそ
れより高い均質性が最も好ましい。所望通りに部分的又
は均質に至るまで精製できたら、これらのポリペプチド
は薬理学的目的のために外毒素を実質的に除去すべきで
あり、これにより治療用に利用できうる。
様々なdsFvフラグメント分子 上記のdsFvペプチドの説明は全ての種（例えばマウ
ス、ウサギ、ヤギ、ヒト）のキメラペプチド、ヒト型抗
体等の抗体の全てのクラス／グループを抱括しうるもの
と解されるべきである。「キメラ抗体」又は「キメラペ
プチド」は抗体又は抗体ペプチドであって、そのペプチ
ドの一部が第一の遺伝子源に由来する抗体もしくはペプ
チドにおける対応の配列に由来するもしくはそれに相同
性であるアミノ酸配列を有し、同時にその鎖の残りのセ
グメントが別の遺伝子源の対応の配列と相同性であるも
のを意味する。例えば、キメラ抗体は、フレームワーク
及び相補性決定領域が別の起源に由来している抗体を含
みうる。例えば、非ヒトCDRをヒト定常領域に連結され
たヒトフレームワーク領域に組込んで「ヒト型抗体」に
することができる。例えば、PCT出願公開番号WO 87/026
71、米国特許第4,816,567号、EP特許出願第0,173,494
号、Jonesら、Nature,321:522−525（1986）及びVerhoe
yenら、Science,239:1534−1536（1988）を参照のこと
（これらは全て引用することで本明細書に組入れる）。
同様に、VHの起源はVLの起源と異なっていてよい。
課題のポリペプチドは免疫毒素の如くの融合タンパク
質を作るのに利用できうる。免疫毒素は２つの機能的な
成分を特徴とし、そしてインビトロ又はインビボで特定
の細胞を殺傷するのに極めて有用である。一の機能的な
成分は、細胞に付着又は吸着したときに細胞にとって致
死的な細胞障害剤である。「搬送ビヒクル」として公知
の第二の機能的な成分は、毒性試薬を癌腫を含んで成る
細胞の如くの特殊な細胞タイプへと運ぶための手段を司
る。これらの２つの成分はPastanら、Ann.Rev.Biochem.
（1992）後掲に記載の如くのペプチドリンカーを介して
互いと組換融合させることができうる。これらの２つの
成分は任意の様々な公知の化学手段によって互いと化学
結合させることもできる。例えば、細胞障害剤がタンパ
ク質であり、そして第二の成分が完全イムノグロブリン
であるとき、その連結はヘテロ二価架橋剤、例えばSPD
P、カルボジイミド等を介してよい。様々な免疫毒素の
製造が当業界において公知であり、そして例えば「Mono
clonal Antibody−Toxin Conjugates:Aiming the Magic
Bullet」Thorpeら、Monoclonal Antibodies in Clinic
al Medicine,Academic Press、頁168−190（1982）及び
Waldmann,Science,252:1657（1991）において見い出せ
る（共に引用することで本明細書に組入れる）。
様々な細胞障害剤が免疫毒素における利用にとって適
当である。細胞障害剤には、放射性核種、例えばヨウ素
−131、イットリウム−90、レニウム−188及びビスマス
−212;いくつかの化学治療剤、例えばビンデシン、メト
トレキセート、アドリアマイシン及びシスプラチン；並
びに細胞障害性タンパク質、例えばリボソーム障害タン
パク質、例えばポークウィード抗ウィルスタンパク質、
シュードモナス外毒素Ａ、リシン、ジフテリア毒素、リ
シンＡ鎖、ゲロニン等、又は細胞表層において活性な試
薬、例えばホスホリパーゼ酵素（例えばホスホリパーゼ
Ｃ）を含みうる。（一般には、Pastanら、「Recombinan
t Toxins as Novel Therapentic Agents」Ann.Rev.Bioc
hem.61:331−354（1992）；「Chimeric Toxins」Olsnes
and Phil,Pharmac.Ther.,25:355−381（1982）及び「M
onoclonal Antibodies for Cancer Detection and Ther
apy」編Baldwin and Byers、頁159−179,224−266,Acad
emic Press（1985）を参照のこと；これらは引用するこ
とで本明細書に組入れる）。
これらのポリペプチドは薬剤、酵素、ホルモン、アイ
ソトープと結合できるキレート化剤、触媒性抗体及び病
気の診断又は処置にとって有用なその他のタンパク質の
如くの、上記のものの他の様々な薬剤にコンジュゲート
又は組換融合させることができる。
診断の目的のため、これらのポリペプチドはラベル化
又は非ラベル化のものであってよい。多種多様なラベ
ル、例えば放射性核種、蛍光物質、酵素、酵素基質、酵
素補因子、酵素インヒビター、リガンド（特にハプテ
ン）等を採用してよい。多種多様なイムノアッセイが有
用であり、そして当業者に周知である。
抗体Fvドメインに類似の分子−Ｔ細胞レセプター 本発明は抗体Fvドメインと高度の相同性を示す分子、
例えばＴ細胞レセプター（TCR）のリガンド特異的Ｖ領
域に適用できうる。かかる用途の例を以下に概略する。
TCR分子の抗原特異的Ｖ領域の配列2B4（Beckerら、Natu
re（London）317:430−434（1985））を、標準の配列整
列パッケージを用いて２種類の抗体分子、McPC603（以
下参照）及びJ539（Protein Data Bank entry 2FBJ）の
Fvドメインに対して整合させた。2B4のＶα配列をこれ
ら２種類の抗体のVH配列に対して整合させたとき、B3の
VH 44に対応するS1部位残基はＶα43Sであると同定でき
（Kabat and Wuの番号付け系においてはTCR42）、そし
てB3のVH 111に対応するS2部位残基はＶα104Qであると
同定できた（Kabat and Wuの番号付け系においてはTCR1
08）。このＶα配列を２種類の抗体のVL配列に対して整
合させたとき、同じ残基であるＶα43S及びＶα104Qが
同定できた。この時はB3のVL 48及びVL 105のそれぞれ
に対応する残基と整合させた。同様にして、2B4残基Ｖ
β42E及びＶβ107P（Kabatらの番号付け系においてTCR4
2及び110）をB3のVH 44及びVH 111、そして同時にB3のV
L 48及びVL 105に対応する抗体残基と整合させることが
できる。従って、このTCRにおけるこの２種類の最も好
ましい鎖間ジスルフィド結合部位はＶα43−Ｖβ107及
びＶα104−Ｖβ42である。これらの残基のペアーのう
ちの一組における２個の残基のシステインへの突然変異
はこの分子のα及びβ鎖間にジスルフィド結合を導入す
るであろう。このジスルフィド結合に由来する安定化
は、これらの分子を大量に単離・精製することを可能に
するであろう。
dsFvポリペプチドの結合親和性 本発明のポリペプチドはリガンドに特異的に結合する
ことができる。本発明にとって、リガンドに特異的に結
合するポリペプチドとは一般に抗原あるいは標的細胞上
のレセプターと反応する又はそれを認識もしくはそれと
結合することのできる分子を意味する。抗体又はその他
のポリペプチドは、もしその抗体又はペプチドが、標準
の抗体−抗原又はリガンド−レセプターアッセイ、例え
ば競合アッセイ、飽和アッセイ、又はELISAもしくはRIA
の如くの標準イムノアッセイによる測定又は決定に従
い、リガンドに結合する又はリガンドと結合できるな
ら、リガンドに対する結合親和性を有する又は特異的で
あると言える。この特異性の定義は、単独で又は組合せ
でリガンドと結合できるなら、リガンドに特異的な一本
鎖の重鎖及び／もしくは軽鎖、CDR、融合タンパク質、
又は重鎖及び／もしくは軽鎖のフラグメントに適用でき
る。
競合アッセイにおいて、リガンドに結合する抗体又は
ペプチドフラグメントの能力は、ペプチドが、リガンド
に結合することのわかっている化合物の結合力と競合す
るそのペプチドの能力を検定することにより決定でき
る。多種多様な競合アッセイが知られ、そして本明細書
に述べられている。他方、インヒビター抜きでの試験化
合物の結合能を測定するアッセイも利用してよい。例え
ば、リガンドと結合する分子又はその他の化合物の能力
は課題の分子をラベルすることにより検出するか、又は
その分子をラベルせず、様々なサンドイッチアッセイ方
式を利用して間接的に検出することができる。多種多様
な結合アッセイ、例えば競合結合アッセイが知られてい
る（例えば、米国特許第3,376,110、4,016,043号及びHa
rlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold
Spring Harbor Publications,N.Y.（1988）を参照のこ
と：引用することで本明細書に組入れる）。競合アッセ
イではなく、単独で一の成分に対する試験化合物の結合
能を測定するためのアッセイも有用である。例えば、リ
ガンドの存在を同定するのにイムノグロブリンポリペプ
チドを使用してよい。モノクローナル抗体アッセイ、例
えばELISAについての標準的手順を利用してよい（Harlo
w and Lane、前掲を参照のこと）。利用できうる様々な
シグナル生成系については、引用することで本明細書に
組入れる）。
以下の実施例は例示の目的のために提供し、そして本
発明を限定するものではない。
実施例 モノクローナル抗体（MAb）B3及びMAb e23のVH及びVL
の保存フレームワーク領域における抗原の結合能を損う
ことなくシステインへと突然変異させることができ、且
つジスルフィド安定化Fvを形成せしめることのできる残
基のモデル化及び同定を開示する。B3は数多くのヒトの
癌の上に存在する特異的な炭水化物と反応する（Pastan
ら、Cancer Res.51:3781−3787（1991）；引用すること
で本明細書に組入れる）。MAb e23は数多くのヒトの癌
腫上に存在するerbB2抗原と特異的に反応する。かかる
ジスルフィド安定化Fvを含む活性免疫毒素も説明する。
I.結合部位の構造に影響を及ぼすことのないMAbのVH及
びVL間のジスルフィド結合のデザイン A.デザイン手法 MAb B3の三次構造は知られていないため、我々は適当
なアミノ酸を交換又は欠失させることにより、MAb McPC
603（以下参照）の構造からB3（Fv）のモデルを作製し
た。MAb McPC603を選定し、なぜならそれは公開されて
いる全てのマウス抗体構造間で最高の総合的（Ｌ＋Ｈ）
な配列同一性及び類似性を有するからである。McPC603
のVH及びVLドメインのそれぞれ全部で44個（２個の欠失
を含む）及び40個（１個の欠失を含む）のアミノ酸を変
更した、挿入は必要としなかった。この構造を次にCHAR
MM（以下参照）を用いて段階的にエネルギー的に小さく
していった：まず水素原子のみ、次いで欠失領域、次い
で全ての突然変異残基、そして最後に分子全体を変え
た。
VHとVLとの間のジスルフィド連結に関して可能な位置
を選定するのに三つの基準を利用した。（ｉ）このジス
ルフィドはVH及びVLの構造的に保存されているフレーム
ワーク領域におけるアミノ酸を、ジスルフィド安定化が
B3（Fv）にとってのみならず、そのFv同志にとっても有
効となるように、連結すべきである。（ii）VHとVL間の
距離はFv構造上に歪みを及ぼすことなくジスルフィドの
形成を可能にするほど小さいべきである。（iii）ジス
ルフィドは抗原結合の妨害を回避するに足りるほどCDR
から十分に離れているべきである。これらの基準は以下
の２つの潜在的なジスルフィド架橋により満たされうる
が、しかし表１に示すようにこれら２つの部位のまわり
にも他の潜在的な部位がある。一の可能性はB3（VH）の
arg44及びB3（VL）のser105をシステインに置き換えて
これらの位置の間にジスルフィドを設けることにある。
他は、B3（VH）のgln111及びB3（VL）のser48をシステ
インに変えることにある（図１参照のこと）。これらの
２組のペアーはVH及びVL構造にほぼ近い擬二つ折り対称
性により互いと関係し合っている。各ケースにおいて、
推定のジスルフィド結合（VH 111,VL 105）に関与する
残基の一方の両側には、ジスルフィド結合の導入により
生ずる構造の局所的な歪の吸収を助けることのできる高
保存性Gly残基が隣接している。我々は、両方のジスル
フィド結合が存在している両方の可能性及び一方の可能
性についてのモデルをエネルギー最小限化した。更なる
研究のためにVH 44−VL 105連結を選び、その理由はこ
の連結を有するエネルギー精密化モデル構造はVH 111−
VL 48連結を有するものよりも若干優れたジスルフィド
結合幾何学を有するからである。いくつかのその他の抗
体に関しては、後者の連結の方が前者よりも好適であり
得た。
B.コンピューターモデル化 B3（Fv）構造の初期モデルを、GEMMとして知られるイ
ン・ハウス分子グラフィックを用い、適当な残基を欠失
及び突然変異させることにより、McPC603の可変ドメイ
ンの構造（Satowら、J.Mol.Biol.190:593−604（198
6））から、Brookhaven Protein Data Bank（Brookhave
n National Laboratory,Upton,Long Island,New York）
エントリー1 MCP（Abolaら、Crystallographic Databas
es−Information Content,Software Systems,Scientifi
c Applications pp.107−132（1987））により獲得し
た。このモデルの構造及び様々な突然変異体の構造をモ
レキュラー・ダイナミック・シミュレーション・プログ
ラムCHARMM（Brooksら、J.Comp.Chem.4:187−217（198
3）（引用することで本明細書に組入れる））バージョ
ン22を用いるadopted basis set Newton Ralphson（ABN
R）エネルギー最小化手順により精密化した。この手順
の詳細は以下の通りである： 1.エネルギー最小化 全ての構造精密化を、モレキュラー・ダイナミック・
シミュレーション・プログラムCHARMM（Brooksら、前
掲）を用いるABNR（adopted basis set Newton Ralphso
n）エネルギー最小化手順により行った。−Ｈパラメー
ターセットの全てを利用した。非結合カットオフ距離を
13.0Åとし、スイッチング関数（switching function）
をLennard−Jones電位に適用し、そして静電相互作用に
対するシフティング関数（shifting function）は10〜1
2Åとした。溶媒は含ませなかった。最後のランを除く
全ての精密化のために１の誘電率を利用し、最後のラン
は距離依存性誘電率を利用した。
2.野性型B3 Fvモデルの構築 まずB3 Fv構造のモデルを、モレキュラー・グラフィ
ックプログラムGEMMを用い、適当な残基を欠失及び突然
変異させることによって、McPC603のFvドメインの構造
（Satowら、前掲;Protein Data Bank entry 1MCP,Abola
ら、前掲）から獲得した。対応の残基を見つけるために
用いた配列整列法はKabat and Wu（前掲、図１）のそれ
とした。他の公知のマウスFab構造（例えばJ539及びR1
9.9;それぞれProtein Data Bankエントリー2FBJ及び2F1
9）からMcPC603構造を選定し、その理由はそのFv部がア
ミノ酸配列においてB3のそれと最高の総合的同一性及び
類似性を有しているからである。McPC603のVH及びVLド
メインのそれぞれ全部で44（２個の欠失を含む）及び40
（１個の欠失を含む）個のアミノ酸を変えたが、挿入は
必要としなかった。
この一次構造を次に以下のプロトコールに従って精密
化した：（１）水素原子（極性及び非極性の両者）をCH
ARMMを利用して付加し、そしてその位置を重量原子を固
定しておいて50段エネルギー最小化により精密化した。
（２）欠失領域のまわりのＣ−Ｎ結合の長さを短くする
ため、20kcal/mol/Åのマス重量ハーモニック力（mass
−weighted harmonic force）で拘束しておいた３つの
欠失領域（VL:28−37,VH:50−59,99−108）のそれぞれ
のまわりの10個のアミノ酸を除く全ての原子を固定して
20段エネルギー最小化を行った。この最小化は20段各々
について、15,10、次いで5kcal/mol/Åのハーモニック
拘束力で繰り返した。（３）全ての突然変異アミノ酸及
びその欠失領域のまわりの30個のアミノ酸を含ませるよ
うに、様々なアミノ酸の拡張リストを用いて段階（２）
の拘束最小化と同セットを繰り返した。（４）最後に、
拘束最小化と同セットをその構造中の全ての原子を精密
化するために繰り返した。この一連の精密化を経て得ら
れた構造をVH及びVLドメイン間のジスルフィド結合の導
入及びSerからTyrに至る突然変異のための出発構造を担
う（以下参照）。野生型B3 Fvの最終構造を距離依存性
誘電率を用い、更なる２式のエネルギー最小化を経て得
た（以下参照）。
3.Tyr突然変異モデルの構築 B3 Fvの新たに構築した構造の調査の際、VH 99位にあ
るSer側鎖（Kabat and Wu前掲においてはVH 91）付近に
おいて、B3 Fvモデル構造のFRコアのVH−VL接触面領域
において空洞の凹空間があることに注目した。Fabのそ
の他の結晶構造は対応の位置においてTyr又はPheのいづ
れかを有する。Kabatら（前掲）における配列データー
は、その位置はTyr又はPheのいづれかによってたいてい
占められていることも示す。即ち、B3におけるこの位置
にあるSerは異常のようである。更に、目視調査より、
この位置のTyrの側鎖は構造の残りの全てにほとんど変
化を与えることなく非常に好適にその付近の空洞空間を
占める、並びにこのことは疎水性及びファン・デル・ワ
ールス相互作用を高めることによってVH−VL会合を助長
するであろうこと、が明らかとなった。従って、我々は
Tyr突然変異構造を構築してエネルギー精密化した。
Tyr突然変異モデルを構築するのに物いたプロトコー
ルはB3 Fvモデルを構築するのに用いたものと同じよう
なものとした：（１）VHのSer残基をGEMMを用いてTyrに
置き換えた。（２）水素原子を20段エネルギー最小化に
より、他の全ての原子を固定しておいて、CHARMMを用い
て付加及びその位置を精密化した。（３）新たなTyr残
基の全ての原子を、他の原子を全て固定しておいて次の
20段最小化の際に変更させた。（４）最後に、この構造
の全ての原子を４連続セットの20段最小化により段階的
に緩和させ、各セットにおいて20,15,10、次いで5kcal/
mol/Åのマス重量ハーモニック拘束力を用いた。
4.VHとVLドメインとの間の可能なジスルフィド結合の位
置の選択 VH及びVLドメインの間にジスルフィド結合を導入する
ための可能な突然変異部位をまず一分子グラフィックプ
ログラムGEMMを用い、B3の一次モデルの目視調査により
一次的に同定した。選定基準は（１）Cysへと突然変異
すべき残基ペアーの両者が分子のFR−領域の中にあり、
少なくとも一方の残基は一次配列においてCDRから遠く
離れており、そして（２）２つの残基の間のＣα−Ｃα
距離が6.5Å以下である；ものとした。２つのペアーを
同定できた:VH 44R−VL 105S及びVH 111Q−VL 48S。B3
モデル構造を完全に精密化した後、Ｃα−Ｃα距離が特
定した値より小さいものであるVH及びVLドメインのFR領
域間の全て残基ペアーについて系統的に調査するために
プログラムCHARMMを用いた。この調査の結果を表１にま
とめ、それはＣα−Ｃα距離がB3の一次モデルで同定さ
れた２つの部位において最短であることを示している
が、存在しているその他の部位も潜在的な候補である。
VH位置43,101及び102、並びにVL位置96及び97はCDR領
域内にあるが、システインで置換されたときに結合特異
性を維持しながら安定なds結合を生み出すことがない。
5.ジスルフィド−結合化B3 Fvモデルの構築 これらの潜在的なジスルフィド結合部位を同定できた
ら、６つのジスルフィド結合モデルを作り上げた。これ
らのうちの３つは「s44」（VH 44R及びVL 105SがCysに
変えられ、且つジスルフィド結合を有するB3 Fv）、「s
111」（VH 111Q及びVL 48SがCysに変えられ、且つジス
ルフィド結合を有するB3 Fv）、並びに「s44,111」（両
方のジスルフィド結合を有するB3 Fv）とした。その他
の３つはTyr突然変異B3 yFvの対応のジスルフィド結合
型である。これらをy44,y111及びy44,111と表示した。
この６つのモデル構造全てを同一のプロトコールを用い
てエネルギー最小化により精密化した。これは、（１）
GEMMを用いる適当な残基の突然変異、（２）水素原子の
付加、（３）Cys残基を緩和させ、そして隣りの２つのG
ly残基を、他の全ての原子は固定しておいて100段エネ
ルギー最小化することによりジスルフィド結合を形成す
る、（４）４連続セットの20段エネルギー最小化により
この構造の全ての原子を精密化する（ここで、マス重量
ハーモニック拘束力は20,15,10、次いで5kcal/mol/Åと
した）。その後、全ての構造を以下の通りに最終精密化
に委ねた。
6. B3 Fvの野生型及び様々な変異体の最終モデルの作
製 B3 Fv及びその全ての変異体の構築モデルを更なる500
段最小化、それに続く別の500段手順に、総エネルギー
変化が0.01kcal/mol以下となったらexit基準がランを停
止させるようにして、委ねた。これらの最終計算は拘束
抜きで、そして距離依存性誘電率を利用して実施した。
表２に報告する値はこれらの計算の最後のサイクルに由
来する。
7. B3 Fvフラグメントのモデル B3 Fv構造の精密化モデルをMcPC603の（未精密化）結
晶構造（図示せず）と比較することができる。欠失残基
を除くこれら２つの構造のＣα原子間のrms偏り（devia
tion）は、FR−領域、CDR−領域及び全分子のそれぞれ
について0.75,1.18及び0.91Åであった。ほとんどの相
違は分子のループ並びにＣ及びＮ末端にある。これらの
構造間の相違の一部はおそらくは、一方がエネルギー精
密化されているのに対し、他方がそうでないことにも基
づく。McPC603構造は精密化しておらず、その理由はエ
ネルギー最小化構造が、特に精密化を溶媒の水抜きで実
施したときに、結晶構造ほど常に信頼できないからであ
る。
8. B3 FvのTyr突然変異体（B3 yFv） 上記した通り、我々はVH 95にあるSer残基をTyr残基
に置き換えたB3 Fvの突然変異体を構築した。Fvの安定
性に対するこの突然変異の効果は定量的にコンピュータ
ー計算することができず、その理由は解離してほどけた
Fvの形態の構造についての情報のなさにある。構造精密
化中に自然に得られた数字はこの分子の折りたたまれた
形態の様々なエネルギー値を表わす。Ser側鎖をTyrのそ
れと置き換えたとき、突然変異残基とこのタンパク質の
残りとのLennard−Jones電位エネルギーは、精密化前は
1.79kcal/molであり、水素原子のみの20段最小化を経る
と0.05kcal/molとなり、そして全ての原子の完全精密化
を経ると−20kcal/molとなった。これらの数字は、モデ
ル化したB3 Fv構造が、重大な立体的重複抜きでその位
置においてTyr残基を許容しうることを示す。全ての原
子の完全な精密化後の様々なエネルギー値を表２に示
す。Tyr突然変異は、野生型及び全てのCys突然変異体の
両者において、常にそのSer対応物より低いエネルギー
を有することがわかった。B3 FvとB3 yFvの主鎖原子間
のrms偏差は0.15Åであった。
9.ジスルフィド結合化B3 Fvフラグメントのモデル 潜在的な鎖間ジスルフィド結合形成のために選んだ２
つの部位はVH 44R−VL 105Sにある部位S1及びVH 111Q−
VL 48SにあるS2（それぞれ、Kabatら前掲の番号付け系
に従うと、VH 44−VL 100及びVH 105−VL 43）とする。
これらの部位はFR領域の中にあり、最も近いCDR領域か
ら２残基以上離れている。鎖間Ｃα−Ｃα距離は未精密
化モデルにおいて最短であり、そしてそれは精密化モデ
ルにおいて最短であった（表１）。各ペアーにおける一
方の残基VL 105及びVH 111には、高保存Gly残基が両側
に隣接していることにも注目すべきである。これらのGl
y残基は中央の残基に柔軟性を与え、そしてジスルフィ
ド結合が形成されるときに生じうる歪の一部を吸収する
ものと考えた。
我々は単一及び二重ジスルフィド結合型モデルの両方
を構築した。それぞれはVH 95においてSerからTyrに至
る突然変異を有するか又は有さない。ジスルフィド結合
の導入に基づく構造的変化は、残基当りの平均としてコ
ンピューター計算すると小さい−ジスルフィド結合変異
体の主鎖原子とその親分子のそれとの間のrms偏りは0.2
〜0.3Åであった。しかしながら、突然変異部位での有
意な変化が必然的に起こり、なぜならＣα−Ｃα距離は
0.5〜1.0Å減少するはずであるからである（表１及び３
を参照のこと）。しかしながら、大きな変化は鎖のほん
のわずかな距離しか伝わらないようであり、そして全て
数残基内で消失するか、又はFR領域の最初のループを経
て消失するようである。
10.ジスルフィド結合化モデルのエネルギー どの突然変異体の安定性も評価するのが難しく、その
理由は対応のほどけ形態の構造的情報の欠如による。完
全に精密化したモデルの様々なエネルギー値を表２に示
す。これらのエネルギー値を考慮するうえで、正確な値
は経験的なポテンシャルエネルギー及び溶媒を無視する
ことによってもたらされる誤差に関係する固有の不確定
性に委ねられる。これらの数値は定性的な考察のみのた
めに用いられるものである。
種B3 FvとB3 yFvの部位S1及びS2のエネルギーをまず
比較すると、突然変異前はS1部位はS2部位よりも実質的
に低いエネルギーを有することがわかりうる。このこと
は、もし突然変異体が同一のエネルギーを有するなら、
S1部位を突然変異させることのほうがS2部位を突然変異
させることよりも多くのエネルギーを費すことを意味す
る。しかしながら、これらのエネルギー値は極めて信頼
性のないものであり、その理由は、突然変異前に関与し
ている残基は全てが極性の高いArg,Ser及びGlnであり、
そしてそのエネルギー値は溶媒のなさにより敏感に影響
されるであろうからである。
他方、突然変異後にS1に存在するシステイン残基の内
部エネルギーはS2のあるものよりも約6kcal/mol低い
（単一及び二重ジスルフィド結合種の両方において）。
これはVH 95がSerであろうとTyrであろうと事実であ
る。これは小さなエネルギー差にすぎないが、この計算
値の信頼性は高く、なぜならそれは形式電荷をもたない
一の共有結合成分を含むからである。このエネルギーの
差の詳細な構成の調査は、そのほとんどが３〜4kcal/mo
leに相当する結合角エネルギーの差及び１〜2kcal/mole
に相当する捩り角のエネルギーの差に由来することを示
唆する。このことは、S2のジスルフィド結合がS1のそれ
より若干歪んでいることを示唆する。
分子の残りとの相互作用エネルギーは部位S1について
は約40kcal/mole、そして部位S2については約30kcal/mo
le生じ、S2が好適である。この分子のS1及びS2以外部位
の残りの部分のエネルギーにおいてはるかに大きい変化
があり、これはこの分子のこの部分においてコンホメー
ション変化が生ずることを意味している。しかしなが
ら、この構造変化及びエネルギー成分の詳細な調査は、
これらの相違のほんの一部のみしかジスルフィド結合の
導入の直接的な結果であると追跡することができないこ
とを示唆する。この相違の大半は、露出したループにあ
る分子の自然の柔軟性と、コンピューター計算したエネ
ルギー値が帯電した柔軟性側鎖原子の位置における小さ
な変化に対して感受性であるという事実との組合せに基
づくようである。しかしながら、一般に、分子のエネル
ギーはジスルフィド結合の導入により高まる及びそれは
２つのジスルフィド結合が形成されたときに一層比例的
に上昇する、ことが明らかである。ジスルフィド結合当
りの上昇度はS1部位のそれに匹敵する。即ち、エネルギ
ーはArg及びSerを２つCysに変換させることにより変化
する。VH−VL相互作用エネルギーは、一般にVH 95にあ
るTyr突然変異により、その度合いが上昇することもわ
かりうる。
11.ジスルフィド結合モデルの幾何学 ジスルフィド結合は全て右まわりであることが（righ
t−handed）見い出せる（表３）。部位S1において形成
されたシステイン残基は、分子の偽二つ折り対称性によ
り、部位S2において形成されたものとほぼ関係してい
る。しかしながら、その詳細な幾何学（表３）はそれら
が２つのタイプに属することを示唆する。８つのシステ
イン残基のうちの２つを除く全てが一方のタイプ（タイ
プＡ）であり、残りの２つは種s111及びs44,111におけ
るS2にあるものが異なるタイプ（タイプＢ）のものであ
る。引用することで本明細書に組入れるKatzらJ.Biol.C
hem.261:15480−15485（1986）は公知のタンパク質結晶
構造におけるシステイン残基を概説しており、そして右
まわり形態を６つの異なるクラスに分類している。我々
のモデルにおいて見い出せた２つのタイプはこれらのク
ラスのいづれにもぴたりとは収まらない。モデル化した
幾何学に最も良く収まる２つのクラスの二面角の値も表
３の中に含ませている。クラス６は、例８と共に、その
他のタンパク質構造の中に見い出せる右まわりシステイ
ン残基についての最も一般的な幾何学を表わしている。
むしろ部位S1にあるジスルフィド結合の内部二面角がこ
のクラスのそれに近い。他方、部位S2にあるジスルフィ
ド結合はそれが最も近いクラス（y111及びy44,111種に
おけるタイプＡ結合についてのクラス６、並びにs111及
びs44,111種におけるタイプＢ結合についてのクラス
３）からかなり偏っている内部二面角を有する。
他のジスルフィド結合からのタイプＢ幾何学の大きな
偏りはおそらくは、一番下がVH 95セリン残基であるB3
（Fv）におけるS2部位付近のキャビティーの存在に関係
する。この新たなジスルフィド結合はこのキャビティー
の側面にあり、そしてVH 48残基のＣβ原子はこのキャ
ビティーに向って引っ張られている。クラス３における
その他のものからのタイプＢのＣα−Ｃβ−Ｓ−Ｓ′と
Ｃβ−Ｓ−Ｓ′−Ｃβ二面角の大きな偏りは、主鎖のこ
の歪みに関係する。VH 95にあるTyr突然変異は、このキ
ャビティーをTyr側鎖で埋め、そして主鎖の歪みを復帰
させ、且つシステイン残基の幾何学をタイプＢからタイ
プＡへと変化させるようである。しかしながら、突然変
異後でさえも、S2部位にあるジスルフィド結合の幾何学
はS1部位よりもクラス６幾何学から一層偏るものであ
る。
この主鎖二面角の値（表４）は、S1での突然変異がS2
の主鎖の幾何学に何ら影響を及ぼさない、及びその逆も
真であることを示唆する。大きな角変化は重鎖における
突然変異残基に限定される。唯一の例外はs111及びs44,
111種についてのVH 110のΨ角における30゜の変化であ
り、それはこれらの種におけるS2付近のキャビティーの
存在におそらく関連する特徴である。VH 95におけるTyr
突然変異はこれ及びS2にあるその他の主鎖二面角を変え
る（VH 110及びVH 111のVL 48のΦ及びΨ並びにVH 110
のΨ）。
12.モデル化の所見 Fvフラグメントの重鎖及び軽鎖のそれぞれは、９スト
ランドのベーターバレルを形成する、並びに分子の中心
にある重鎖と軽鎖との間の接触面もバレル型であること
がよく知られている（Richardson Adv.Prot.Chem.34:16
7−339（1981））。この中央バレルの片面は重鎖由来の
４本のストランドより成り、一方、他の面は軽鎖由来の
４本のストランドより成る。これら２つの面は互いとそ
のバレルのまわりで２つの部位において連結されてお
り、それらはそのバレルの軸に沿って走るほぼ二つ折り
の対称性により関係し合っている（Daviesら、Ann.Rev.
Biochem.44:639−667（1975））。各部位において、一
の鎖（B3 Fvに関してのVH 44−47又はVL 48−51）のβ
４ストランドのストレッチは、別の鎖（B3 Fvに関して
はVL 105−101又はVH 111−107）のβ９ストランドのス
トレッチの隣りで逆平行に走る。B3 Fvのモデル化構造
において、そしておそらくは全てのイムノグロブリンの
Fvにおいて、FR領域における主鎖原子間の最も近い鎖間
接触はこれらのストレッチ内又はこれらのストレッチの
中間フリンジ内のいづれかに認められる（表１）。公知
のタンパク質構造におけるシステイン残基のＣα−Ｃα
距離は4.2〜6.6Åに範囲するため（Katzら、J.Biol.Che
m.261:15480−15485（1986））、鎖間ジスルフィド結合
がFR領域においてこれらの部位以外で、その分子に強い
損傷性歪みを導入することなく形成されることは不可能
である。
この報告において研究した２つの可能なジスルフィド
結合性部位はこれらの部位各々における最短の接触点で
ある（表１）。VH 44−VL 106,VH 112−VL 48及びVL 11
1−VL 47にあるジスルフィド結合も良好な部位である。
短いＣα−Ｃα距離を有するその他のペアーはあまり好
ましくなく、その理由はそれらは三次元構造においてCD
Rループに近く、そしてそれ故分子の抗原結合機能を損
いがちであるからである。
しかしながら、McPC603のために彼らが用いた両方の
部位VH 108−VL 55及びVH 106−VL 56はCDR領域内の残
基を包括しており、そして明らかに我々が同定した２つ
の部位とは異なる。これらの部位はB3のVH 105−VL 54
及びVH 103−VL 55に相当し、そしてβ4/β９ストラン
ドのCDRの最端であり、その対立端はVH 111−VL 48のS2
部位に属している。この相違は少なくともある程度は、
潜在的なジスルフィド結合部位を探すために用いた異な
る手法に由来する。彼らはいづれもProでない鎖間残基
ペアーについて探しており、そしてその主鎖原子の全て
を、公知のタンパク質構造におけるかかる残基の全ての
リストにおけるシステイン残基のそれに幾何学的に類似
して（rmsにおいて２Å以内）アレンジしている。彼ら
はハプテン結合に直接関与はするが、他の点ではCDR領
域に属する残基を避けている。一方、我々はFR領域中の
部位のみを調べ、同時にそのＣα間の距離が短くなるこ
とのみを必要とする幾何学に基づく拘束で緩和させてい
る。突然変異部位にある歪みは必然的であり、そしてジ
スルフィド結合の形成の前の主鎖全体の類似性に基づく
主張はおそらくは限定しすぎであると考える。
計算した主鎖二面角の値（表４）は、ジスルフィド結
合が、主鎖の内部幾何学における大きな変化を伴うこと
なくこれらの部位において形成されうることを示唆して
いる。計算した主鎖二面角の値（表４）は、ジスルフィ
ド結合が、主鎖の内部幾何学における大きな変化を伴う
ことなく形成されることを示唆している。特に、最初は
歪みの一部を吸収するのに役立つものであろうと考えら
れていた隣りのGly残基の主鎖二面角の変化は小さい。
形成されたシステイン残基の内部幾何学（表３）はこれ
ら２つの部位のうちの少なくとも一方において、公知の
タンパク質構造におけるその他のシステイン残基の幾何
学に近いようである。計算したエネルギー値は、利用す
る経験的に潜在する機能にかかわる固有の不正確さを理
由に注意をもって利用せねばならない。なぜなら、計算
において溶媒を含ませておらず、そしてその計算は折り
たたまれた形質についてのみ可能であるからである（一
方、必要であるのは折りたたまれた形態とほどけた形態
との間の相違である）。にもかかわらず、その計算値は
（表２）、この２つの部位にジスルフィド結合を導入す
るためのエネルギー消費は基本的に、タンパク質表層の
この２つの残基の価値の特徴を帯電から非極性へと変換
するものであろう。これらは全て、これら２つの部位の
一方においてのジスルフィド結合の導入が可能であるこ
とを示唆する。
主鎖幾何学及びシステイン残基の内部幾何学、並びに
VH−VL相互作用エネルギーは、VH 95にあるSerからTyr
への突然変異が有利でありそうであることを示唆する。
このエネルギー所見は、種y44及びy111が二重ジスルフ
ィド結合化種とほぼ同等に適当、且つ好適であろうこと
を示唆する。最後に、システイン残基の幾何学と公知の
タンパク質構造におけるその他のそれとの対比は、y111
に対してのy44種の若干の優勢さを供する。
ここで見い出したジスルフィド結合が高保存型フレー
ムワーク領域内にあることの事実は有意義である。これ
らの部位にあるCys突然変異は、フレームワーク領域の
構造がタンパク質間で比較的類似している理由により有
効であると予測される。この予測の部分的な試験とし
て、我々は全ての公知のイムノグロブリンFv領域につい
ての結晶構造を利用してこれらの部位にあるＣα−Ｃα
距離をコンピューター計算した。これらのデーター（表
５）は、変動はあるにしても、Ｃα−Ｃα距離は、ヒト
起源由来のものの一部を含むタンパク質の全てにおい
て、これらの部位の少なくとも一方にあるジスルフィド
結合の形成のために適切に短いのが事実である。これら
の部位はコンピューターモデル化又は構造情報を必要と
することなく、単に配列整合により任意のイムノグロブ
リンについて見い出すことができうる。
II.B3（dsFv）免疫毒素の製造 B3（dsFv）−PE38KDELはシュードモナス外毒素（PE38
KDEL）のトランケート形態に連結されたMAb B3のFv領域
より成る組換免疫毒素であり、それにおいてVH−VLはジ
スルフィド結合によって互いに結合し合い、且つ安定化
されている。
A.B3（dsFv）−免疫毒素の発現のためのプラスミドの構
築 VH arg44及びVL ser105がシステインにより置き換え
られているds（Fv）−免疫毒素の発現のためのプラスミ
ドの作製のための親プラスミドは一本鎖の免疫毒素B3
（Fv）−PE38KDEL（tyrH95）をコードする。この分子に
おいて、MAb B3のVH及びVLドメインは（gly4ser）３ペ
プチドリンカーにより結合し合っており（B3 scFv）、
そしてシュードモナス外毒素（PE）の転移（トランスロ
ケーション）及びADP−リボシル化要素をコードするPE3
8KDEL遺伝子（Brinkmannら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
9:5867−5871（1991）（Brinkmann I）;HwangらCell 4
8:129−136（1987）（共に引用することで本明細書に組
入れる））に融合されている。B3（Fv）−PE38KDEL（ty
rH95）は、B3（VH）のセリン95（Kabatらに従うと位置V
H 91）がチロシンに変わっていることを除き、B3（Fv）
−PE38KDEL（Brinkmann I、前掲）と同じである。この
チロシン残基はほとんどのネズミVHドメインのフレーム
ワークにおいて保有されており、そしてVH−VL接触面に
おけるキャビティーを埋め、おそらくはVH−VLドメイン
相互作用に寄与している。我々は、B3（Fv）−PE38KDEL
及びB3（Fv）−PE38KDEL（tyrH95）の、再生する能力、
精製の際の挙動及び癌腫細胞系に対する細胞障害活性を
含む特性を比較し、そしてそれらが区別可能であること
を見い出した。
ds（Fv）−免疫毒素、B3（VH cys44）及びB3（VL cys
105）−PE38KDELの成分の発現のためのプラスミドを、B
3（VH）におけるarg44及びB3（VL）におけるser105をシ
ステインへと突然変異させるための鋳型として、pULI28
におけるＦ＋起点由来のウリジン含有一本鎖DNAを用い
る部位特異的突然変異誘発により作った（Kunkel,proc.
Natl.Acad.Sci.USA 82:488−492（1985））。突然変異
性オリゴヌクレオチドの配列については下記を参照のこ
と。B3（VH cys44）の発現のための最終プラスミドpYR3
8−２及びB3（VL cys105）−PE38KDELのためのpULI39
を、突然変異させたプラスミドのサブクローニングによ
り作った。クローニング手法の詳細を図２に示す。
プラスミドの構築： 我々の発現プラスミドの中に存在しているＦ＋起点由
来のウラシル含有一本鎖DNAをM13ヘルパーとの同時トラ
ンスフェクションにより獲得し、そして従来述べられて
いる通りにして（Kunkel,T.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
82:488−492（1985））部位特異的突然変異誘発のため
の鋳型として用いた。B3（Fv）の完全ヌクレオチド配列
は先に述べられている通りである（Brinkmann I、前
掲）。突然変異誘発用オリゴヌクレオチドは、 B3（VH）のarg44をcysに変えるための ５′−TATGCGACCCACTCGAGACACTTCTCTGGAGTCT−３′（Se
q.ID No.5）、 B3（VL）のser105をcysに置き換えるための TTTCCAGCTTTGTCCCACAGCCGAACGTGAATGG−３′（Seq.ID N
o.6）、及び B3（VH）遺伝子の３′末端に、EcoR I部位が後続する停
止コドンを導入するための ５′−CCGCCACCACCGGATCCGCGAATTCATTAGGAGACAGTGACCAG
AGTC−３′（Seq.ID No.7） とした。突然変異クローンの同定及びサブクローニング
を助長するためのこれらのオリゴヌクレオチドに導入す
べき制限部位（Xho I及びEcoR I）に下線を付した。
オリゴヌクレオチド ５′TCGGTTGGAAACTTTGCAGATCAGGAGCTTTGGAGAC 3′（Se
q.ID No.8）、 ５′TCGGTTGGAAACGCAGTAGATCAGAAGCTTTGGAGAC 3′（Se
q.ID No.9）、 ５′AGTAAGCAAACCAGGCGCACCAGGCCAGTCCTCTTGCGCAGTAATA
TATGGC3′（Seq.ID No.10）及び ５′AGTAAGCAAAACAGGCTCCCCAGGCCAGTCCTCTTGCGCAGTAATA
TATGGC3′（Seq.ID No.11）をB3（Fv）のVL 54,VL 55,V
H 103及びVH 105にシステインを導入するために用い、
それらは記載のジスルフィド安定化McPC603FvのVL 55,V
L 56,VH 106及びVH 108位に相当する（Glockshuberら、
前掲；表７参照のこと）。突然変異クローンは全てDNA
配列決定により確認した。B3（VL cys105）突然変異
を、引用することで本明細書に組入れるSambrookら、Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual（第２版）、Vol
1〜３、Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に従
う標準の技術によりB3（VL）−PE38KDEL免疫毒素をコー
ドするベクターにサブクローニングした。
B.封入体における発現、リフォルディング及び精製 B3（Fv）−PE38KDEL,B3（Fv）cysH44L105−PE38KDEL,
B3（VL cys105）−PE38DEL及びB3（VH cys44）を本質的
に記載の通りにして（Brinkmann I、前掲）、pUL19,pUL
I37,pULI39又はpYR38−２をそれぞれ含む独立のE.コリB
L21λDE3培養物の中で製造した。
組換B3（dsFv）−免疫毒素を製造するため、B3（VH c
ys44）をコードするプラスミドpYR38−２又はB3（VL cy
s105）−PE38KDELをコードするプラスミドpULI39のいづ
れかを含む独立のE.コリBL21（λDE3）培養物をIPTGで
誘導し、これにより細胞内封入体（IB）の中で全部で組
換タンパク質が総タンパク質の20〜30％で蓄積した。IB
を個別に単離し、溶解し、還元し、そしてレドックスシ
ャフリング及び凝集防止剤を含む再生バッファー中での
リフォルディングを経て、活性免疫毒素が得られた。ds
Fvについてのリフォルディングは一本鎖免疫毒素の調製
に関して既に述べられている通りにして（Buchnerら、A
nal.Biochem.205:263−270（1992）；引用することで本
明細書に組入れる）、２つの改良を伴って実施した：
（ｉ）リフォルディング溶液に一種のみの可溶化、且つ
還元化タンパク質（例えばB3（Fv）PE38KDEL）を加える
代わりに、我々はIB含有VH cys44又はVL cys105毒素を
別々に調製し、そしてそれらを２（VH）:1（VL−毒素）
のモル比でリフォルディングバッファー中で100μg/ml
の最終総タンパク質濃度となるように混合した。我々
は、VL−毒素よりも２〜５倍過剰量のVHが最良の再生免
疫毒素収量を供することを見い出した。再生溶液への等
モル量のVH及びVL−毒素の添加又は＞５倍過剰量のVHは
活性モノマー免疫毒素の収量の低下をもたらした;VHが
多すぎると、我々は凝集の上昇を観察した。（ii）レド
ックスシャフリングの後にリフォルディング溶液に過剰
量の酸化グルタチオンを加える「最終酸化」工程を完了
した。この酸化は適正に折りたたまれた機能性タンパク
質の収量を５倍以上高め、その理由はおそらくはVHとVL
とを接続するジスルフィド結合がFvの表層上で露出さ
れ、そしてそれがリフォルディングバッファー中の若干
還元性の条件でアクセス可能となっており、そして「最
終酸化」することなく還元状態であり続けるであろうこ
とのためである。
リフォルディングの後に活性免疫毒素を回収するた
め、我々はイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファ
ロース及びMono Qカラム）、それに続くサイズ排除クロ
マトグラフィーである、scFv−免疫毒素について樹立さ
れた精製系（Brinkmann I、前掲；引用することで本明
細書に組入れるBrinkmannら、J.Immunol.150:2774−278
（1993）（Brinkmann）;Buchnerら、前掲）を応用し
た。適正に折りたたまれた（dsFv）−免疫毒素は凝集体
から分離されるのみならず（これは容易に分離され
る）、（dsFv）−免疫毒素に近いクロマトグラフィー挙
動を有する「一本鎖ドメイン」VL−毒素からも分離され
る（Brinkmann II、前掲）。B3（dsFv）−PE38KDELのリ
フォルディングの後、Mono Q「モノマーピーク」は２種
のタンパク質を含む;dsFv−免疫毒素はVL−毒素よりも
若干早く溶出する。我々はB3（dsFv）−PE38KDELをほぼ
均質となるまで、クロマトグラフィーの連続サイクル、
早期の画分のプール、ピーク画分の再クロマトグラフィ
ー及び後期画分の廃棄により、精製した。活性dsFv−免
疫毒素の有意な損失にもかかわらず（廃棄した「後期」
画分がまだdsFv−タンパク質を含んでいた）、この手順
は、１リットルづつの細菌VH及びVL−毒素培養物から＞
8mgの純粋なdsFv−免疫毒素を獲得するのに十分に有効
であり、そして我々は我々の精製条件を改良することに
よりこの収量を大いに高めることができるものと予測す
る。
III.B3抗原発現性癌腫細胞系に対するB3（dsFv）−PE38
KDELの特異的な毒性 癌腫細胞系に対する種々の免疫毒素の活性（ng/mlで
示すIC50）を表６及び７に記載の通りにして決定した。
B3（scdsFv）−PE38KDEL分子は、（gly4ser）３リンカ
ーに加えて、鎖間ジスルフィドを形成するようにVH及び
VLにシステインが導入されている一本鎖免疫毒素であ
る。VH 44−VL 105はB3（dsFv）−PE38KDELに相当する
が、ただしB3（dsFv）においてリンカーペプチドは欠失
している。VH 105−VL 54及びVH 103−VL 55は、従来述
べられている「カスタムメード」VH 108−VL 55及びVH
106−VL 56ジスルフィド結合McPC603（Fv）（Glockshub
erら、前掲）においてシステイン残基が導入されている
位置である。
細胞障害能アッセイは、従来記述されている通りにし
て（Brinkmannら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8616−8
620（1991）（Brinkmann I）；引用することで本明細書
に組入れる）細胞タンパク質への3H−ロイシンの取り込
み量を測定することにより行った。IC50は免疫毒素との
16時間のインキュベーションを経てタンパク質合成を50
％阻害する免疫毒素の濃度である。
一本鎖免疫毒素B3（Fv）−PE38KDEL及び対応のジスル
フィド安定化B3（dsFv）−PE38KDELのFv媒介型特異的細
胞障害能の比較は、両タンパク質が同一の細胞スペクト
ルを認識し、そして同等の活性であることを示す（図
３、表６及び７）。B3（dsFv）−PE38KDELはB3（Fv）−
PE38KDELと同様に、B3−抗原発現性細胞に対してのみ細
胞障害性であり、そしてMAb B3と結合しない細胞（例え
ばHUT102）に対しては何ら作用を有さない。ヒトトラン
スフェリンレセプターである過剰のHB21ではなく、過剰
のMAb B3の添加は、この細胞障害能と競合でき、B3（ds
Fv）−PE38KDELの活性はB3−抗原に対する特異的結合能
に基づくことを確証せしめる（図3C）。この競合実験に
おいて、過剰のMAb B3又はHB21（1mg/mlの最終濃度に至
るまで）を毒素の添加の15分前に加えた。高濃度のMAb
B3が競合のために必要であり、その理由は癌腫細胞上に
存在している大量のB3抗原にある（Brinkmann I、前掲;
Brinkmann II、前掲;Paiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
8:3358−3362（1991））。scFv−及びdsFv−免疫毒素の
特異性及び活性は区別可能であることの発見は、結合性
領域がジスルフィド安定化B3（Fv）及びリンカー安定化
分子において同等に保存されていることを示唆する。
IV.ヒト血清中でのB3（Fv）及びB3（dsFv）−PE38KDEL
の安定性 dsFv−及びscFv−免疫毒素は培養癌腫細胞に対して同
等の活性を有するため、B3（dsFv）もそのscFv対応物B3
（Fv）−PE38KDELと同様に癌腫処置に有用であるはずで
ある（Brinkmann I、前掲）。免疫毒素の治療的有用性
に寄与する一の要因はその安定性にある。Fv−免疫毒素
の安定性を、それらをヒト血清の中で37℃で10μg/mlの
濃度でインキュベートすることにより決定した。様々な
長さのインキュベーションを経て残っている活性免疫毒
素をA431細胞に対する細胞障害能アッセイにより決定し
た。表８はヒト血清中でのscFv−及びdsFv−免疫毒素の
安定性の比較を示す。scFv−毒素B3（Fv）−PE38KDELは
１〜２時間安定であり、次いで失活し始める。驚くべき
ことにそれに反して、dsFv−毒素B3（dsFv）−PE38KDEL
は24時間以上完全に細胞障害性であり続ける。
各種の免疫毒素を10μｇにおいて、ヒト血清と、37℃
で表示の時間インキュベートし、次いでA431細胞に対す
る細胞障害活性についてアッセイした。
V.免疫毒素e23（Fvds）−PE38KDEL MAb e23は数多くのヒト癌腫上に存在しているerbB2抗
原に対して特異的な抗体である。e23（Fv）−PE40はe23
の一本鎖Fvより成り、そのVLはペプチドリンカーによっ
てVHに連結されており、そしてVHはシュードモナス外毒
素のトランケート形態に融合されている（PE40）。e23
（Fv）PE40は癌の治療において潜在的に有用であること
が示されている（Batraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
9:5867−5871（1992））。e23（Fv）−PE38KDELはe23
（Fv）−PE40の一本鎖誘導体であり、その免疫毒素の毒
素部はPE40の代わりにPE38KDELであり、より良い活性が
もたらされている。
A.ジスルフィドの位置 e23のFv領域は上記のB3（Fv）に記載と同じようにし
てジスルフィド結合により安定化されうる。我々は免疫
毒素e23（dsFv）−PE38KDELを作り、それは組成におい
てe23（scFv）−PE38KDELに相当するが、ただしVLとVH
との間のペプチドリンカーが排除され、ジスルフィド結
合に置き換えられている。ジスルフィドの導入のために
我々が利用した位置は、Kabat and Wuに従ってVH 44−V
L100位に相当し、実際のe23配列においてVH asn43及びV
L gly99位に相当する（図４参照のこと）。
B.プラスミドの構築 システインによるフレームワーク残基の交換、リンカ
ーペプチドの欠失及びe23（dsFv）免疫毒素の成分の個
々の発現のためのプラスミドの構築は、上記の標準突然
変異誘発及びクローニング技術により行った。VH asn43
及びVL gly99のシステインによる置換のために用いる突
然変異誘発用オリゴヌクレオチドは ５′−AGTCCAATCCACTCGAGGCACTTTCCATGGCTCTGC−３′
（Seq.ID No.12）（VH）及び ５′−TATTTCCAGCTTGGACCCACATCCGAACGTGGGTGG−３′
（Seq.ID No.13）（VL）とし、VLの末端の停止コドンは
次のプライマーにより導入した： ５′−AGAAGATTTACCAGAACCAGGAATTCATTATTTTATTTCCAGCT
TGGACC−３′（Seq.ID No.14）。
プラスミドの構築の詳細を図５に示す。B3（Fv）−免疫
毒素と異なり、e23（Fv）−免疫毒素の毒素部、e23（sc
Fv）及びe23（dsFv）−PE38KDELはVHに融合しており、F
vのVLドメインに融合しているのではないことに注目す
べきである。
C.e23（dsFv）−PE38KDELの製造 e23（VL cys99）及びe23（VH cys43）−PE38KDELであ
るe23（dsFv）−PE38KDELの成分をE.コリにおいて個別
に封入体で発現させ、上記の通りに単離及びリフォルデ
ィングした。活性タンパク質をイオン交換及びサイズ排
除クロマトグラフィーにより、本質的に上記の通りにし
て単離した。ところで、我々はB3（dsFv）免疫毒素の精
製と異なり、この調製品はさほど夾雑する「一本鎖ドメ
イン」免疫毒素を含まないことを見い出した。その理由
は、B3（dsFv）−免疫毒素の例においては、その毒素は
VLに融合しているが、e23dsFv免疫毒素においては、そ
の毒素はVHに融合しているからである。一本鎖VL−毒素
は、凝集しがちなVH毒素よりもはるかに可溶性であるこ
とが述べられている。そのため、B3（dsFv）の例におい
て、可溶性VL毒素はdsFv−免疫毒素調製品をひどく汚染
してしまうが、e23（dsFv）−例においては夾雑するVH
毒素は凝集及び沈降し、それ故dsFv−免疫毒素から容易
に辞去できうる。
D.e23のscFv及びdsFvの比較 前述の通り、Fv免疫毒素の特異的細胞障害能は免疫毒
素のFv部の特異的結合能を評価するのに利用できる。表
層上にerbB2を有する細胞に対するMAb e23由来のscFv及
びdsFv−免疫毒素の特異的細胞障害能の比較を表９に示
す（プロトコールの詳細については表６及び関連の説明
を参照のこと）。e23のdsFv−免疫毒素はscFv対応物と
少なくとも同等の活性であり、そして若干活性が強いこ
とがありうる。それ故、erbB2に対するe23のdsFvの特異
的結合能はe23（scFv）と同等又は優れている。
配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人:PASTAN,Ira LEE,Byungkook JUNG,Sun−Hee BRINKMANN,Ulrich （ii）発明の名称:Recombinant Disulfide−Stabiliz
ed Polypeptide Fragments Having Binding Specificit
y （iii）配列の数:14 （iv）連絡先： （Ａ）住所:Townsend and Townsend Khourie and C
rew （Ｂ）通り:Steuart Street Tower,One Market Pla
za （Ｃ）市:San Francisco （Ｄ）州:California （Ｅ）国:US （Ｆ）郵便番号:94105−1493 （ｖ）コンピューター読取形式： （Ａ）媒体のタイプ:Floppy disk （Ｂ）コンピューター:IBM PC compatible （Ｃ）作動システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Vers
ion ＃1.25 （vi）現出願データー： （Ａ）出願番号:US （Ｂ）出願日:14−JUN−1993 （Ｃ）分類： （viii）代理人／代理店情報： （Ａ）名称:Weber,Ellen L. （Ｂ）登録番号:32,762 （Ｃ）参照／事件番号:15280−152 （ix）通信情報： （Ａ）電話：（415）543−9600 （Ｂ）ファックス：（415）543−5043 （２）SEQ ID NO:1についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:118アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:1..30 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR1/備考＝「フレームワ
ーク領域１」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:31..35 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝CDR1/備考＝「相補性決
定領域１」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:36..49 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR2/備考＝「フレームワ
ーク領域２」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:50..66 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝CDR2/備考＝「相補性決
定領域２」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：改変部位 （Ｂ）位置:44 （Ｄ）他の情報:/備考＝「可能な鎖間ジスルフィド
結合のためCysへと変更できる残基」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:67..100 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR3/備考＝「フレームワ
ーク領域３」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:101..108 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝CDR3/備考＝「相補性決
定領域３」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:109..118 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR4/備考＝「フレームワ
ーク領域４」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：改変部位 （Ｂ）位置:111 （Ｄ）他の情報:/備考＝「可能な鎖間ジスルフィド
結合のためCysへと変更できる残基」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：改良部位 （Ｂ）位置:95 （Ｄ）他の情報:/備考＝「SerからTyrへの突然変
異」 （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:1: （２）SEQ ID NO:2についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:121アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:1..30 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR1/備考＝「フレームワ
ーク領域１」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:31..35 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝CDR1/備考＝「相補性決
定領域１」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:36..49 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR2/備考＝「フレームワ
ーク領域２」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：改変部位 （Ｂ）位置:44 （Ｄ）他の情報:/備考＝「可能な鎖間ジスルフィド
結合のためCysへと変更できる残基」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:50..68 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝CDR2/備考＝「相補性決
定領域２」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:69..103 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR3/備考＝「フレームワ
ーク領域３」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:104..111 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝CDR3/備考＝「相補性決
定領域３」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:112..121 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR4/備考＝「フレームワ
ーク領域４」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：改変部位 （Ｂ）位置:114 （Ｄ）他の情報:/備考＝「可能な鎖間ジスルフィド
結合のためCysへと変更できる残基」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：改良部位 （Ｂ）位置:97 （Ｄ）他の情報:/備考＝「SerからTyrへの突然変
異」 （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:2: （２）SEQ ID NO:3についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:112アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:1..23 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR1/備考＝「フレームワ
ーク領域１」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:24..39 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝CDR1/備考＝「相補性決
定領域１」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:40..54 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR2/備考＝「フレームワ
ーク領域２」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：改変部位 （Ｂ）位置:48 （Ｄ）他の情報:/備考＝「可能な鎖間ジスルフィド
結合のためCysへと変更できる残基」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:55..61 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝CDR2/備考＝「相補性決
定領域２」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:62..93 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR3/備考＝「フレームワ
ーク領域３」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:94..102 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝CDR3/備考＝「相補性決
定領域３」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:103..112 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR4/備考＝「フレームワ
ーク領域４」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：改変部位 （Ｂ）位置:105 （Ｄ）他の情報:/備考＝「可能な鎖間ジスルフィド
結合のためCysへと変更できる残基」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：改良部位 （Ｂ）位置:92 （Ｄ）他の情報:/備考＝「SerからTyrへの突然変
異」 （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:3: （２）SEQ ID NO:4についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:113アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：タンパク質 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:1..23 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR1/備考＝「フレームワ
ーク領域１」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:24..40 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝CDR1/備考＝「相補性決
定領域１」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:41..55 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR2/備考＝「フレームワ
ーク領域２」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：改変部位 （Ｂ）位置:49 （Ｄ）他の情報:/備考＝「可能な鎖間ジスルフィド
結合のためCysへと変更できる残基」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:56..62 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝CDR2/備考＝「相補性決
定領域２」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:63..94 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR3/備考＝「フレームワ
ーク領域３」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:95..103 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝CDR3/備考＝「相補性決
定領域３」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：領域 （Ｂ）位置:104..113 （Ｄ）他の情報:/ラベル＝FR4/備考＝「フレームワ
ーク領域４」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：改変部位 （Ｂ）位置:106 （Ｄ）他の情報:/備考＝「可能な鎖間ジスルフィド
結合のためCysへと変更できる残基」 （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：改良部位 （Ｂ）位置:93 （Ｄ）他の情報:/備考＝「SerからTyrへの突然変
異」 （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:4: （２）SEQ ID NO:5についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:34塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:5: （２）SEQ ID NO:6についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:34塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:6: （２）SEQ ID NO:7についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:48塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:7: （２）SEQ ID NO:8についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:37塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:8: （２）SEQ ID NO:9についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:37塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:9: （２）SEQ ID NO:10についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:52塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:10: （２）SEQ ID NO:11についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:52塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:11: （２）SEQ ID NO:12についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:36塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:12: （２）SEQ ID NO:13についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:36塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:13: （２）SEQ ID NO:14についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:50塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノム） （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:14:
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ジュン，スン−ヒー アメリカ合衆国，メリーランド 20814, ベセスダ，プークス ヒル ロード ３，アパートメント 812 (72)発明者 ブリンクマン，ウルリッヒ アメリカ合衆国，メリーランド 20895, ケンジントン，ブルックフィールド ド ライブ 4203 (56)参考文献 特表 平３−500005（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（1992）Ｖｏ ｌ．149，Ｎｏ．１，ｐ．120−126 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A61K 38/00 A61K 39/395 A61P 35/00 C07K 14/725 C07K 16/00 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (31)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】リガンドに特異的に結合するポリペプチド
    であって、リガンド結合成分の第一可変領域を含んで成
    り、この第一可変領域がこのリガンド結合成分の第二の
    異なる可変領域にジスルフィド結合を介して結合してお
    り、この結合がこの第一可変領域と第二可変領域のフレ
    ームワーク領域を連結しており、更にこのリガンド結合
    成分はイムノグロブリン又はＴ細胞レセプターであり、
    そして更に前記ジスルフィド結合は前記第一可変領域内
    の第一システインと前記第二可変領域内の第二システイ
    ンとの間にあり、ただし当該第一システイン及び第二シ
    ステインは以下から選ばれる位置に存在する、ポリペプ
    チド： （ａ）当該第一システインが当該第一可変領域の100位
    にあるとき、当該第二システインは当該第二可変領域の
    44位に位置する；及び （ｂ）当該第一システインが当該第一可変領域の43位に
    あるとき、当該第二システインは当該第二可変領域の10
    5位に位置し、ここでかかる位置はKabat and Wuの「Suq
    uences of Proteins of Immunological Interest」、米
    国政府印刷局、NIH公開番号91−3242（1991）により公
    開された番号付け系に従って決定されたものである。
  2. 【請求項２】前記ポリペプチドが抗体の定常領域を実質
    的に含まない、請求項１記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】前記ポリペプチドがラジオアイソトープ、
    酵素、毒素、キレート化剤又は薬剤にコンジュゲートさ
    れている、請求項１記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】前記ポリペプチドが毒素、酵素又はその他
    の薬剤に組換的に融合されている、請求項１記載のポリ
    ペプチド。
  5. 【請求項５】前記第一可変領域が100位においてシステ
    インを含み、そして前記第二可変領域が44位においてシ
    ステインを含み、かかる位置は抗体の軽鎖及び重鎖の各
    々に対応して、Kabat and Wuの「Sequences of Protein
    s of Immunological Interest」、米国政府印刷局、NIH
    公開番号91−3242（1991）により公開された番号付け系
    に従って決定されたものである、請求項１記載のポリペ
    プチド。
  6. 【請求項６】前記第一可変領域が43位においてシステイ
    ンを含み、そして前記第二可変領域が105位においてシ
    ステインを含み、かかる位置は抗体の軽鎖及び重鎖の各
    々に対応して、Kabat and Wuの「Sequences of Protein
    s of Immunological Interest」、米国政府印刷局、NIH
    公開番号91−3242（1991）により公開された番号付け系
    に従って決定されたものである、請求項１記載のポリペ
    プチド。
  7. 【請求項７】前記第一可変領域が抗体の軽鎖可変領域
    （VL）であり、そして前記第二可変領域が抗体の重鎖可
    変領域（VH）である、請求項１記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】前記第一可変領域がＴ細胞レセプターのα
    可変鎖領域であり、そして前記第二可変領域がＴ細胞レ
    セプターのβ可変鎖領域である、請求項１記載のポリペ
    プチド。
  9. 【請求項９】リガンドに特異的に結合するポリペプチド
    を製造する方法であって、ここでこのポリペプチドはリ
    ガンド結合成分の第一可変領域を含んで成り、この第一
    可変領域はこのリガンド結合成分の第二可変領域に、こ
    れら２つの可変領域のフレームワーク領域におけるジス
    ルフィド結合を介して連結されており、ここでこの方法
    は： （ａ）この第一可変領域に関する核酸を43位においてシ
    ステインをコードするように突然変異させ、そしてこの
    第二可変領域に関する核酸を、105位においてシステイ
    ンをコードするように突然変異させる、ここでかかる位
    置はKabat and Wuの「Sequences of Proteins of Immun
    ological Interest」、米国政府印刷局、NIH公開番号91
    −3242（1991）により公開された番号付け法に従い、抗
    体の軽鎖及び重鎖領域のそれぞれに対応して決定された
    ものである；又は （ｂ）この第二可変領域に関する核酸を、44位において
    システインをコードするように突然変異させ、そしてこ
    の第一可変領域に関する核酸を、100位においてシステ
    インをコードするように突然変異させる、ここでかかる
    位置はKabat and Wuの「Sequences of Proteins of Imm
    unological Interest」、米国政府印刷局、NIH公開番号
    91−3242（1991）により公開された番号付け法に従い、
    抗体の軽鎖又は重鎖のそれぞれに対応して決定されたも
    のである；次いで （ｃ）発現系においてこの第一可変領域に関する核酸及
    びこの第二可変領域に関する核酸を発現させる；そして （ｄ）抗原に対する結合親和性を有する前記ポリペプチ
    ドを回収する； ことを含んで成る、方法。
  10. 【請求項１０】前記方法が前記ポリペプチドを精製する
    ことを更に含んで成る、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】請求項１記載のポリペプチドをコードす
    る核酸。
  12. 【請求項１２】毒素又は薬剤をコードする核酸を更に含
    む、請求項11記載の核酸。
  13. 【請求項１３】前記ポリペプチドに毒素もしくは薬剤又
    は毒性配列がペプチドリンカーによって連結されてい
    る、請求項12記載の核酸。
  14. 【請求項１４】前記第一可変領域及び前記第二可変領域
    がそれぞれMAb B3のVL及びVHに由来する、請求項１記載
    のポリペプチド。
  15. 【請求項１５】前記VH領域の44位のアルギニン及び前記
    VL領域の100位のセリンがシステインにより置き換えら
    れており、ここでかかる位置はKabat and Wuの「Sequen
    ces of Proteins of Immunological Interest」、米国
    政府印刷局、NIH公開番号91−3242（1991）により公開
    された番号付け系に従って決定されたものである、請求
    項14記載のポリペプチド。
  16. 【請求項１６】前記VH領域の105位のグルタミン及び前
    記VL領域の43位のセリンがシステインに置き換えられて
    おり、ここでかかる位置はKabat and Wuの「Sequences
    of Proteins of Immunological Interest」、米国政府
    印刷局、NIH公開番号91−3242（1991）により公開され
    た番号付け系に従って決定されたものである、請求項14
    記載のポリペプチド。
  17. 【請求項１７】前記VH領域の95位のセリンがチロシンに
    置き換えられている、請求項15記載のポリペプチド。
  18. 【請求項１８】前記VH領域の95位のセリンがチロシンに
    置き換えられている、請求項14記載のポリペプチド。
  19. 【請求項１９】43又は100位においてシステインを含む
    抗体の軽鎖可変領域（VL）をコードする核酸を含んで成
    る核酸であって、かかる位置がKabat and Wuの「Sequen
    ces of Proteins of Immunological Interest」、米国
    政府印刷局、NIH公開番号91−3242（1991）により公開
    された番号付け系に従って決定されたものである、請求
    項11記載の核酸。
  20. 【請求項２０】前記VLの100位においてシステインをコ
    ードする、請求項19記載の核酸。
  21. 【請求項２１】前記VLの43位においてシステインをコー
    ドする、請求項19記載の核酸。
  22. 【請求項２２】44又は105位においてシステインを含む
    抗体の重鎖可変領域（VH）をコードする核酸を含んで成
    る核酸であって、ここでかかる位置がKabat and Wuの
    「Sequences of Proteins of Immunological Interes
    t」、米国政府印刷局、NIH公開番号91−3242（1991）に
    より公開された番号付け系に従って決定されたものであ
    る、請求項11記載の核酸。
  23. 【請求項２３】前記VHの44位においてシステインをコー
    ドする、請求項22記載の核酸。
  24. 【請求項２４】前記VHの105位においてシステインをコ
    ードする、請求項22記載の核酸。
  25. 【請求項２５】腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬理組
    成物であって、請求項１記載のポリペプチドを含んで成
    り、そして更にこのポリペプチドが毒素をも含んで成
    る、薬理組成物。
  26. 【請求項２６】前記VLとVHとがペプチドリンカーにより
    更に連結されている、請求項７記載のポリペプチド。
  27. 【請求項２７】前記第一可変領域及び前記第二可変領域
    が各々MAb e23のVL及びVHに由来する、請求項１記載の
    ポリペプチド。
  28. 【請求項２８】前記VHの44位のアミノ酸残基及び前記VL
    の100位のアミノ酸残基がシステインにより置き換えら
    れ、かかる位置はKabat and Wuの「Sequences of Prote
    ins of Immunological Interest」、米国政府印刷局、N
    IH公開番号91−3242（1991）により公開された番号付け
    系に従って決定されたものである、請求項27記載のポリ
    ペプチド。
  29. 【請求項２９】前記VHの105位のアミノ酸残基及び前記V
    Lの43位のアミノ酸残基がシステインにより置き換えら
    れ、かかる位置はKabat and Wuの「Sequences of Prote
    ins of Immunological Interest」、米国政府印刷局、N
    IH公開番号91−3242（1991）により公開された番号付け
    系に従って決定されたものである、請求項27記載のポリ
    ペプチド。
  30. 【請求項３０】腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬理組
    成物であって、請求項14記載のポリペプチドを含んで成
    り、そして更にこのポリペプチドが毒素をも含んで成
    る、薬理組成物。
  31. 【請求項３１】腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬理組
    成物であって、請求項27記載のポリペプチドを含んで成
    り、そして更にこのポリペプチドが毒素をも含んで成
    る、薬理組成物。
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