JP2003501440A

JP2003501440A - 反応活性なジスルフィド結合を含む化合物

Info

Publication number: JP2003501440A
Application number: JP2001502443A
Authority: JP
Inventors: ウォルフ，ジョン，エー．
Original assignee: マイラスコーポレーション
Priority date: 1999-06-07
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2003-01-14
Also published as: EP1102784A1; EP1102784A4; WO2000075162A1

Abstract

(57)【要約】生理学的条件下で反応活性なジスルフィド含有化合物であって、酸化型グルタチオンよりも迅速に切断されるジスルフィド結合、またはチオールから構成され、その構成成分チオールの１つがグルタチオンよりも低いpKaを有するジスルフィド結合、または遊離チオールからの分子内攻撃により活性化されるジスルフィド結合のいずれかである反応活性なジスルフィド結合を有するジスルフィド含有化合物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】背景二官能性分子は、通常、架橋剤と呼ばれ、２つの分子を共に連結させるのに用
いられる。二官能性分子はホモまたはヘテロ二官能基を含み得る。ジスルフィド
結合（RSSR’）は二官能性分子で用い得る。ジスルフィド結合形成の可逆性によ
り、それらは２つの分子の一過性の結合に有用なツールとなる。ジスルフィドは
、生物活性化合物と別の化合物とを結合させるのに用いられている（Thorpe, P.
E. J. Natl. Cancer Inst. 1987, 79, 1101）。そのジスルフィド結合は還元さ
れ、それにより該生物活性化合物を放出する。ジスルフィド結合はまた、ポリマ
ーの形成においても用い得る（Kishore, K., Ganesh, K. Advances in Polymer
Science,第21巻, Saegusa, T. 編, 1993）。

【０００２】ジスルフィド結合により２つの分子を結合させるための多くの市販の試薬があ
る。さらに、ジスルフィド結合が存在している二官能性試薬がある。典型的には
、これらの試薬は、3-メルカプトプロピオン酸をベースとするもの、すなわちジ
チオビスプロピオネートである。しかし、これらの結合が生理学的条件下で破壊
される速度は遅い。例えば、ジチオビスプロピオンイミデート（3-メルカプトプ
ロピオン酸の類似体）から誘導されたジスルフィドの半減期はin vivoで27時間
である（Arpicco, S., Dosio, F., Brusa, P., Crosasso, P., Cattel, L. Bioc
onjugate Chem. 1997, 8, 327）。例えば、結合分子の精製またはin vivoでの長
期循環が必要とされる場合には、安定なジスルフィド結合が望ましい場合が多い
。この理由から、切断されにくいジスルフィドを作製するための試みがなされて
きた。

【０００３】ジスルフィド還元の安定性（還元電位として測定される）および速度（速度定
数として測定される）の両者ともが、該ジスルフィドを構成するチオールの酸性
度に関連することが実証されている。還元の速度に影響を及ぼし得る別の要因は
立体相互作用および分子内ジスルフィド切断である。反応RSH＋R’SSR’→RSSR
’＋R’SHとRSH＋R’’SSR’’→RSSR’’＋R’’SHとの速度の差を見れば、log
k’’／k’＝β（pK_a ^R’−pK_a ^R’’）［式中、k’およびk’’はそれぞれR’SS
R’およびR’’SSR’’を用いた反応の速度定数であり、pK_a ^R’およびpK_a ^R’’
はチオール基R’SHおよびR’’SHの酸性度であり、βは経験的に0.72であると求
められている定数である］であることが実証される。この方程式から、比較的酸
性であるチオールから構成されるジスルフィドの還元が、それ程酸性ではないチ
オールから構成されるものよりも迅速に還元されることが予想されるであろう。
この知見を支持するものとして、ジスルフィドであるシステイン（pKa 8.3）お
よびシスタミン（pKa 8.2）が酸化型グルタチオン（pKa 8.9）よりも３〜15倍早
く還元されることが実証されている（Bulaj, G., Kortemme, T., Goldenberg, D
.P. Biochemistry 1998, 37, 8965）。

【０００４】ジスルフィド還元の安定性（熱力学；還元電位として測定される）（Keire D.
A. J. Org. Chem. 1992, 57, 123）および速度（速度論；速度定数として測定さ
れる）の両者がともに、該ジスルフィドを構成するチオールの酸性度に関連する
ことが実証されている（Szajewski, R.P., Whitesides, G.M. J. Am. Chem. Soc
. 1980, 102, 2011）。チオールの酸性度の増大は、以下の構造的要因の１つ以
上に依存する：シグマおよびパイ結合を介してチオレートを安定化する電子求引
基の存在（誘起効果）、空間または媒体を通してチオレートを安定化する電子求
引基の存在（場効果）、負の電荷が他の原子上に位置するようにするパイ結合（
共鳴安定化）、および内部でチオレートと相互作用し得る分子内の水素結合供与
基。例えば、システインは２つの原子がチオールから２つ目の原子にアミノ基を
有し、これはグルタチオンにおけるチオールから２つ目の原子であるアミド窒素
よりも電子求引性が高い。電子求引基におけるこの違いの結果として、システイ
ンのチオールは酸性度がグルタチオンよりも0.6pK単位高く、そして先に述べた
ように、システインは酸化型グルタチオンよりも３〜15倍早く還元される。比較
的酸性であるチオールのもう１つの例は5-チオ-2-ニトロ安息香酸（pKa５）であ
る。その酸性度は共鳴安定化および誘起効果によるものである。そのジスルフィ
ドは、全ての標準的なアルキルチオールにより迅速に還元され、そのチオレート
は色が着いているために、チオール濃度についてのアッセイが簡便になる。

【０００５】概要好ましい実施形態に記載されているものは、細胞への化合物の送達方法であっ
て、生理学的条件下で切断され得るジスルフィド結合を含む化合物をポリマーと
結合させ、次に該ポリマーを該細胞へと送達することを含む該方法である。該ポ
リマーは、第1のポリマーおよび第2のポリマーを含んでいてもよい。該第1のポ
リマーおよび該第2のポリマーは、核酸、タンパク質、遺伝子、アンチセンスポ
リマー、DNA／RNAハイブリッド、または合成ポリマーを含み得る。

【０００６】別の好ましい実施形態では、生物学的に活性な化合物をジスルフィド含有化合
物と結合させる。ここで、該ジスルフィド含有化合物は、（ａ）酸化型グルタチ
オンよりも迅速に切断されるジスルフィド結合、および（ｂ）チオールから構成
され、その構成成分チオールの１つがグルタチオンよりも低いpKaを有するジス
ルフィド結合、および（ｃ）遊離チオールからの分子内攻撃により活性化される
ジスルフィド結合、からなる群から選ばれる反応活性なジスルフィド結合を有す
ることを含む。

【０００７】別の好ましい実施形態では、生物に挿入するための化合物であって、（ａ）酸
化型グルタチオンよりも迅速に切断されるジスルフィド結合、および（ｂ）チオ
ールから構成され、その構成成分チオールの１つがグルタチオンよりも低いpKa
を有するジスルフィド結合、および（ｃ）遊離チオールからの分子内攻撃により
活性化されるジスルフィド結合、からなる群から選ばれる生理学的条件下で反応
活性であるジスルフィド結合を有する化合物が提供される。

【０００８】別の好ましい実施形態では、生物で用いるための、反応活性なジスルフィド結
合を有する化合物を形成するための方法であって、(i)酸化型グルタチオンより
も迅速に切断されるジスルフィド結合、および(ii)チオールから構成され、その
構成成分チオールの１つがグルタチオンよりも低いpKaを有するジスルフィド結
合、および(iii)遊離チオールからの分子内攻撃により活性化されるジスルフィ
ド結合、からなる群から選ばれるジスルフィド結合を有する化合物を形成するこ
と；該化合物を該生物に挿入すること、を含む上記方法が提供される。

【０００９】別の好ましい実施形態では、細胞に送達するために核酸を圧縮するための方法
であって、ジスルフィド結合を含むポリマーを該核酸と結合させ、該核酸を該細
胞に送達することを含む上記方法が記載されている。

【００１０】別の好ましい実施形態では、細胞に送達するために核酸を圧縮するための方法
であって、ポリマーを該核酸と結合させ、次に生理学的条件下で切断され得るジ
スルフィド結合を含む化合物を該核酸ポリマー複合体と結合させ、次に該複合体
を細胞に送達することを含む上記方法が記載されている。

【００１１】別の好ましい実施形態では、細胞に送達するために核酸を圧縮するための方法
であって、ジスルフィド結合を含むポリマーを該核酸と結合させ、次に別のポリ
マーを該ジスルフィド結合含有ポリマー−核酸複合体と結合させ、次に該複合体
を細胞に送達することを含む上記方法が記載されている。

【００１２】別の好ましい実施形態では、細胞に送達するために核酸を圧縮するための方法
であって、ポリマーを該核酸と結合させ、次に生理学的条件下で切断され得るジ
スルフィド結合を含む化合物を該核酸ポリマー複合体と結合させ、次に別のポリ
マーを該複合体と結合させ、次に該複合体を細胞に送達することを含む上記方法
が記載されている。

【００１３】別の好ましい実施形態では、生理学的条件下で切断され得るジスルフィド結合
を含み、かつヘテロ二官能性基またはホモ二官能性基を有する化合物が記載され
ている。そのような化合物は、ジスルフィド含有二官能性分子として記載されて
いる。

【００１４】Ａ_１−Ｓ−Ｓ−Ａ_２さらに詳細には、脂肪族ジスルフィド結合を含み、その硫黄原子の一方または
両方に対してアルファまたはベータで置換されている１つ以上の電気陰性基（電
気求引基）を有する化合物である。これらの基は構成成分チオールのpKaを低下
させるように作用する。

【００１５】

【化１】上記式中、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈は、それらの少なくとも１つが、
電気陰性原子、またはOH、OR（エーテル）、NH₂（第二級、第三級および第四級
アミンでもある）、SO₃ ^-、COOH、COOR（エステル）、COHN₂、CONR₂（置換アミド
）、ハロゲン（F、Cl、Br、I）、NO₂のような官能基である。Ｌは、ジスルフィ
ドと反応性のヘテロ二官能性基もしくはホモ二官能性基A₁およびA₂との結合をも
たらすリンカーまたはスペーサー基として定義される。Ｌは存在しても存在しな
くてもよく、アルカン、アルケン、アルキン、エステル、エーテル、グリセロー
ル、アミド、尿素、糖、多糖、ヘテロ原子（例えば、酸素、硫黄または窒素）を
含む群から選ばれ得る。該スペーサーは、正の荷電でも、負の荷電でも、中性の
電荷でも、両性イオン性であってもよい。A₁およびA₂は反応性の基であり、それ
らはホモ二官能性の二官能性分子内のように同一であっても、あるいはヘテロ二
官能性の二官能性分子内のように異なっていてもよい。好ましい実施形態では、
該ジスルフィド化合物は、アシル化またはアルキル化反応を受け得る反応性の基
を含む。そのような反応性の基としては（しかし、限定しようとするものではな
いが）イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、酸ハライド、O-ア
シル尿素、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミドエステル、ア
ミド、尿素、スルホニルクロライド、アルデヒド、ケトン、エーテル、エポキシ
ド、カーボネート、アルキルハライド、イミドエステル、カルボキシレート、ア
ルキルホスフェート、アリールハライド（例えば、ジフルオロ-ジニトロベンゼ
ン）または酸無水物が含まれる。

【００１６】官能基A1、A2がアミンである場合、A1、A2は（限定しようとするものではない
が）活性化カルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、
アルキルハライド、酸ハライド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ
ニルクロライド、アルデヒド、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエス
テル、アミド、カルボキシレートもしくはアルキルホスフェート、アリールハラ
イド（ジフルオロ-ジニトロベンゼン）または酸無水物と反応し得る。つまり、
官能基A1、A2がアミンである場合、アシル化剤またはアルキル化剤が該アミンと
反応し得る。

【００１７】官能基A1、A2がスルフヒドリルである場合、A1、A2は（限定しようとするもの
ではないが）ハロアセチル誘導体、活性化カルボン酸、マレイミド、アジリジン
誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体またはジスルフィド誘導
体［例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）誘導
体］と反応し得る。

【００１８】官能基A1、A2がカルボキシレートである場合、A1、A2は、該酸が活性化されて
いさいすれば、（限定しようとするものではないが）ジアゾアセテート、アルコ
ール、チオールまたはアミンと反応し得る。

【００１９】官能基A1、A2がヒドロキシルである場合、A1、A2は（限定しようとするもので
はないが）活性化カルボン酸、エポキシド、オキシランまたはアミン（カルボニ
ルジイミダゾールが用いられる）と反応し得る。

【００２０】官能基A1、A2がアルデヒドまたはケトンである場合、A1、A2は（限定しようと
するものではないが）ヒドラジン、ヒドラジド誘導体、アミン（シッフ塩基を形
成し、これは続いてNaCNBH₃のような還元剤により還元してもよいし、しなくて
もよい）、またはジオールと反応してアセタールまたはケタールを形成し得る。

【００２１】官能基A1、A2が活性化カルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、ア
シルアジド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロライド、ア
ルデヒド、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエステル、アルキルホス
フェート、アリールハライド（ジフルオロ-ジニトロベンゼン）、酸無水物、ア
ルキルハライドもしくは酸ハライド、p-ニトロフェニルエステル、o-ニトロフェ
ニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステ
ル、カルボニルイミダゾール、カルボニルピリミジニウムまたはカルボニルジメ
チルアミノピリミジニウムである場合、A1、A2は（限定しようとするものではな
いが）アミン、ヒドロキシル、ヒドラジン、ヒドラジドまたはスルフヒドリル基
と反応し得る。

【００２２】官能基A1、A2が活性カルボン酸、ハロアセチル誘導体、マレイミド、アジリジ
ン誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体またはジスルフィド誘
導体［例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）誘
導体］である場合、A1、A2は（限定しようとするものではないが）スルフヒドリ
ルと反応し得る。

【００２３】官能基A1、A2がアルデヒド、ケトン、エポキシド、オキシランまたはアミン（
カルボニルジイミダゾールまたはN,N’-ジスクシンイミジルカーボネートが用い
られる）である場合、A1、A2は（限定しようとするものではないが）ヒドロキシ
ルと反応し得る。

【００２４】官能基A1、A2がヒドラジン、ヒドラジド誘導体またはアミン（第一級または第
二級）である場合、A1、A2は（限定しようとするものではないが）アルデヒドま
たはケトンと反応し得る（そしてシッフ塩基を形成し、これはNaCNBH₃のような
還元剤で還元されてもよいし、されなくてもよい）。

【００２５】さらに、硫黄原子が芳香族環に直接結合している芳香族ジスルフィド結合を含
む化合物である。該環は、５つ以上の原子を含み得る。

【００２６】

【化２】 R₁-R₄、R₆-R₉− 該環上での置換パターンを変えることにより、該ジスルフィ
ド結合の還元電位を変えることができる。置換基は、OH、OR（エーテル）、NH₂
（第二級、第三級および第四級アミンでもある）、SO₃ ^-、COOH、COOR（エステル
）、CONH₂、CONR₂（置換アミド）、ハロゲン（F、Cl、Br、I）、NO₂、CH₃（また
はそれより長い分岐鎖または直鎖、飽和または不飽和の脂肪族基）を含む（しか
し、それらに限定されない）群から選ばれ得る。Ｌは、ジスルフィドと反応性の
ヘテロ二官能性基もしくはホモ二官能性基との結合をもたらすリンカーまたはス
ペーサー基として定義される。Ｌは存在しても存在しなくてもよく、アルカン、
アルケン、エステル、エーテル、グリセロール、アミド、糖、多糖、ヘテロ原子
（例えば、酸素、硫黄または窒素）を含む群から選ばれ得る。該スペーサーは、
正の荷電でも、負の荷電でも、中性の電荷でも、両性イオン性であってもよい。
R₅、R₁₀は反応性の基であり、それらはホモ二官能性の二官能性分子内のように
同一であるか、またはヘテロ二官能性の二官能性分子内のように異なっていても
よい。好ましい実施形態では、該ジスルフィド化合物は、アシル化またはアルキ
ル化反応を受け得る反応性の基を含む。そのような反応性の基としては、イソチ
オシアネート、イソシアネート、アシルアジド、N-ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル、スクシンイミドエステル、スルホニルクロライド、アルデヒド、エポキ
シド、カーボネート、イミドエステル、カルボキシレート、アルキルホスフェー
ト、アリールハライド（例えば、ジフルオロ-ジニトロベンゼン）または無水コ
ハク酸が含まれる。

【００２７】官能基R5、R10がアミンである場合、R5、R10は（限定しようとするものではな
いが）活性化カルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド
、アルキルハライド、酸ハライド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スル
ホニルクロライド、アルデヒド、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエ
ステル、アミド、カルボキシレートもしくはアルキルホスフェート、アリールハ
ライド（ジフルオロ-ジニトロベンゼン）または酸無水物と反応し得る。つまり
、官能基R5、R10がアミンである場合、アシル化剤またはアルキル化剤が該アミ
ンと反応し得る。

【００２８】官能基R5、R10がスルフヒドリルである場合、R5、R10は（限定しようとするも
のではないが）ハロアセチル誘導体、活性化カルボン酸、マレイミド、アジリジ
ン誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体またはジスルフィド誘
導体［例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）誘
導体］と反応し得る。

【００２９】官能基R5、R10がカルボキシレートである場合、R5、R10は、該酸が活性化され
ていさいすれば、（限定しようとするものではないが）ジアゾアセテート、アル
コール、チオールまたはアミンと反応し得る。

【００３０】官能基R5、R10がヒドロキシルである場合、R5、R10は（限定しようとするもの
ではないが）活性カルボン酸、エポキシド、オキシランまたはアミン（カルボニ
ルジイミダゾールが用いられる）と反応し得る。

【００３１】官能基R5、R10がアルデヒドまたはケトンである場合、R5、R10は（限定しよう
とするものではないが）ヒドラジン、ヒドラジド誘導体、アミン（シッフ塩基を
形成し、これは続いてNaCNBH₃のような還元剤により還元してもよいし、しなく
てもよい）、またはジオールと反応してアセタールまたはケタールを形成し得る
。

【００３２】官能基R5、R10が活性化カルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、
アシルアジド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロライド、
アルデヒド、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエステル、アルキルホ
スフェート、アリールハライド（ジフルオロ-ジニトロベンゼン）、酸無水物、
アルキルハライドもしくは酸ハライド、p-ニトロフェニルエステル、o-ニトロフ
ェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエス
テル、カルボニルイミダゾール、カルボニルピリジニウムまたはカルボニルジメ
チルアミノピリジニウムである場合、R5、R10は（限定しようとするものではな
いが）アミン、ヒドロキシル、ヒドラジン、ヒドラジドまたはスルフヒドリル基
と反応し得る。

【００３３】官能基R5、R10が活性化カルボン酸、ハロアセチル誘導体、マレイミド、アジ
リジン誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体またはジスルフィ
ド誘導体［例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB
）誘導体］である場合、R5、R10は（限定しようとするものではないが）スルフ
ヒドリルと反応し得る。

【００３４】官能基R5、R10がアルデヒド、ケトン、エポキシド、オキシランまたはアミン
（カルボニルジイミダゾールまたはN,N’-ジスクシンイミジルカーボネートが用
いられる）である場合、R5、R10は（限定しようとするものではないが）ヒドロ
キシルと反応し得る。

【００３５】官能基R5、R10がヒドラジン、ヒドラジド誘導体またはアミン（第一級または
第二級）である場合、R5、R10は（限定しようとするものではないが）アルデヒ
ドまたはケトンと反応し得る（そしてシッフ塩基を形成し、これはNaCNBH₃のよ
うな還元剤で還元されてもよいし、されなくてもよい）。

【００３６】さらに、複素環に直接結合しているジスルフィド結合を含む化合物である。該
複素環は芳香族性であっても脂肪族性であってもよい。該複素環は５つ以上の原
子を含み得り、それら中の１つ以上はヘテロ原子（O、N、S、P）であり、残りは
炭素原子である。

【００３７】

【化３】Ｈは、硫黄、酸素、窒素またはリンを含む群から選ばれるヘテロ原子である。
R₁-R₃、R₅-R₇−は、OH、OR（エーテル）、NH₂（第二級、第三級および第四級ア
ミンでもよい）、SO₃ ^-、COOH、COOR（エステル）、CONH₂、CONR₂（置換アミド）
、ハロゲン（F、Cl、Br、I）、NO₂、CH₃（またはそれより長い分岐鎖または直鎖
、飽和または不飽和の脂肪族基）を含む（しかし、それらに限定されない）群か
ら選ばれ得る置換基である。芳香族環上での置換パターンを変えることにより、
該ジスルフィド結合の還元電位を変えることができる。Ｌは、ジスルフィドと反
応性のヘテロ二官能性基もしくはホモ二官能性基との結合をもたらすリンカーま
たはスペーサー基として定義される。Ｌは存在しても存在しなくてもよく、アル
カン、アルケン、エステル、エーテル、グリセロール、アミド、糖、多糖、ヘテ
ロ原子（例えば、酸素、硫黄または窒素）を含む群から選ばれ得る。該スペーサ
ーは、正の荷電でも、負の荷電でも、中性の電荷でも、両性イオン性であっても
よい。R₄、R₈は反応性基であり、ホモ二官能性の二官能性分子内のように同一で
あるか、またはヘテロ二官能性の二官能性分子内のように異なっていてもよい。
好ましい実施形態では、該ジスルフィド化合物は、アシル化またはアルキル化反
応を受け得る反応性の基を含む。そのような反応性の基としては、イソチオシア
ネート、イソシアネート、アシルアジド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル
、スクシンイミドエステル、スルホニルクロライド、アルデヒド、エポキシド、
カーボネート、イミドエステル、カルボキシレート、アルキルホスフェート、ア
リールハライド（例えば、ジフルオロ-ジニトロベンゼン）または無水コハク酸
が含まれる。

【００３８】官能基R4、R8がアミンである場合、R4、R8は（限定しようとするものではない
が）活性化カルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、
アルキルハライド、酸ハライド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ
ニルクロライド、アルデヒド、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエス
テル、アミド、カルボキシレートもしくはアルキルホスフェート、アリールハラ
イド（ジフルオロ-ジニトロベンゼン）または酸無水物と反応し得る。つまり、
官能基R4、R8がアミンである場合、アシル化剤またはアルキル化剤が該アミンと
反応し得る。

【００３９】官能基R4、R8がスルフヒドリルである場合、R4、R8は（限定しようとするもの
ではないが）ハロアセチル誘導体、活性化カルボン酸、マレイミド、アジリジン
誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体またはジスルフィド誘導
体［例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）誘導
体］と反応し得る。

【００４０】官能基R4、R8がカルボキシレートである場合、R4、R8は、該酸が活性化されて
いさいすれば、（限定しようとするものではないが）ジアゾアセテート、アルコ
ール、チオールまたはアミンと反応し得る。

【００４１】官能基R4、R8がヒドロキシルである場合、R4、R8は（限定しようとするもので
はないが）活性化カルボン酸、エポキシド、オキシランまたはアミン（カルボニ
ルジイミダゾールが用いられる）と反応し得る。

【００４２】官能基R4、R8がアルデヒドまたはケトンである場合、R4、R8は（限定しようと
するものではないが）ヒドラジン、ヒドラジド誘導体、アミン（シッフ塩基を形
成し、これは続いてNaCNBH₃のような還元剤により還元してもよいし、しなくて
もよい）、またはジオールと反応してアセタールまたはケタールを形成し得る。

【００４３】官能基R4、R8が活性化カルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、ア
シルアジド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロライド、ア
ルデヒド、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエステル、アルキルホス
フェート、アリールハライド（ジフルオロ-ジニトロベンゼン）、酸無水物、ア
ルキルハライドもしくは酸ハライド、p-ニトロフェニルエステル、o-ニトロフェ
ニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステ
ル、カルボニルイミダゾール、カルボニルピリジニウムまたはカルボニルジメチ
ルアミノピリジニウムである場合、R4、R8は（限定しようとするものではないが
）アミン、ヒドロキシル、ヒドラジン、ヒドラジドまたはスルフヒドリル基と反
応し得る。

【００４４】官能基R4、R8が活性カルボン酸、ハロアセチル誘導体、マレイミド、アジリジ
ン誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体またはジスルフィド誘
導体（例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）誘
導体）である場合、R4、R8は（限定しようとするものではないが）スルフヒドリ
ルと反応し得る。

【００４５】官能基R4、R8がアルデヒド、ケトン、エポキシド、オキシランまたはアミン（
そこにおいてカルボニルジイミダゾールまたはN,N’-ジスクシンイミジルカーボ
ネートが用いられる）である場合、R4、R8は（限定しようとするものではないが
）ヒドロキシルと反応し得る。

【００４６】官能基R4、R8がヒドラジン、ヒドラジド誘導体またはアミン（第一級または第
二級）である場合、R4、R8は（限定しようとするものではないが）アルデヒドま
たはケトンと反応し得る（そしてシッフ塩基を形成し、これはNaCNBH₃のような
還元剤で還元されてもよいし、されなくてもよい）。

【００４７】さらに、イオウ原子の一方を介して環系（芳香族または非芳香族）に、そして
他方のイオウ原子を介して脂肪族炭素に直接結合しているジスルフィド結合を含
む化合物である。該環状環(cyclic ring)は５つ以上の原子を含み得る。

【００４８】

【化４】 R₁-R₄は、Ｈ、OH、OR（エーテル）、NH₂（第二級、第三級および第四級アミン
でもある）、SO₃ ^-、COOH、COOR（エステル）、CONH₂、CONR₂（置換アミド）、ハ
ロゲン（F、Cl、Br、I）、NO₂、CH₃（またはそれより長い分岐鎖または直鎖、飽
和または不飽和の脂肪族基）を含む（しかし、それらに限定されない）群から選
ばれる置換基である。芳香族環上での置換パターンは様々に変えて、該ジスルフ
ィド結合の還元電位を変化させてもよい。R₆-R₉は、Ｈ、OH、OR（エーテル）、N
H₂（第二級、第三級および第四級アミンでもある）、SO₃ ^-、COOH、COOR（エステ
ル）、CONH₂、CONR₂（置換アミド）、ハロゲン（F、Cl、Br、I）、NO₂、CH₃（ま
たはそれより長い分岐鎖または直鎖、飽和または不飽和の脂肪族基）を含む（し
かし、それらに限定されない）群から選ばれる置換基である。Ｌは、ジスルフィ
ドと反応性のヘテロ二官能性基もしくはホモ二官能性基との結合をもたらすリン
カーまたはスペーサー基として定義される。Ｌは存在しても存在しなくてもよく
、あるいはアルカン、アルケン、エステル、エーテル、グリセロール、アミド、
糖、多糖、ヘテロ原子（例えば、酸素、イオウまたは窒素）を含む群から選ばれ
てもよい。該スペーサーは、正の荷電でも、負の荷電でも、中性の電荷でも、両
性イオン性であってもよい。R₅、R₁₀はホモ二官能性の二官能性分子内のものと
同一であるか、またはヘテロ二官能性の二官能性分子内のものと異なっていても
よい反応性基である。好ましい実施形態では、該ジスルフィド化合物は、アクリ
ル化またはアルキル化反応を受け得る反応性の基を含む。そのような反応性の基
としては、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、N-ヒドロキシ
スクシンイミドエステル、スクシンイミドエステル、スルホニルクロライド、ア
ルデヒド、エポキシド、カーボネート、イミドエステル、カルボキシレート、ア
ルキルホスフェート、アリールハライド（例えば、ジフルオロ-ジニトロベンゼ
ン）またはコハク酸無水物が含まれる。

【００４９】官能基R5、R10がアミンである場合、R5、R10は（限定しようとするものではな
いが）活性カルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、
アルキルハライド、酸ハライド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ
ニルクロライド、アルデヒド、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエス
テル、アミド、カルボキシレートもしくはアルキルホスフェート、アリールハラ
イド（ジフルオロ-ジニトロベンゼン）または酸無水物と反応し得る。つまり、
官能基R5、R10がアミンである場合、アシル化剤またはアルキル化剤が該アミン
と反応し得る。

【００５０】官能基R5、R10がスルフヒドリルである場合、R5、R10は（限定しようとするも
のではないが）ハロアセチル誘導体、活性カルボン酸、マレイミド、アジリジン
誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体またはジスルフィド誘導
体（例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）誘導
体）と反応し得る。

【００５１】官能基R5、R10がカルボキシレートである場合、R5、R10は、該酸が活性化され
ていさいすれば、（限定しようとするものではないが）ジアゾアセテート、アル
コール、チオールまたはアミンと反応し得る。

【００５２】官能基R5、R10がヒドロキシルである場合、R5、R10は（限定しようとするもの
ではないが）活性カルボン酸、エポキシド、オキシランまたはアミン（そこにお
いてカルボニルジイミダゾールが用いられる）と反応し得る。

【００５３】官能基R5、R10がアルデヒドまたはケトンである場合、R5、R10は（限定しよう
とするものではないが）ヒドラジン、ヒドラジド誘導体、アミン（シッフ塩基を
形成し、これは続いてNaCNBH₃のような還元剤により還元してもよいし、しなく
てもよい）、またはジオールと反応してアセタールまたはケタールを形成し得る
。

【００５４】官能基R5、R10が活性カルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、ア
シルアジド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロライド、ア
ルデヒド、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエステル、アルキルホス
フェート、アリールハライド（ジフルオロ-ジニトロベンゼン）、酸無水物、ア
ルキルハライドもしくは酸ハライド、p-ニトロフェニルエステル、o-ニトロフェ
ニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステ
ル、カルボニルイミダゾール、カルボニルピリミジニウムまたはカルボニルジメ
チルアミノピリミジニウムである場合、R5、R10は（限定しようとするものでは
ないが）アミン、ヒドロキシル、ヒドラジン、ヒドラジドまたはスルフヒドリル
基と反応し得る。

【００５５】官能基R5、R10が活性カルボン酸、ハロアセチル誘導体、マレイミド、アジリ
ジン誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体またはジスルフィド
誘導体（例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）
誘導体）である場合、R5、R10は（限定しようとするものではないが）スルフヒ
ドリルと反応し得る。

【００５６】官能基R5、R10がアルデヒド、ケトン、エポキシド、オキシランまたはアミン
（そこにおいてカルボニルジイミダゾールまたはN,N’-ジスクシンイミジルカー
ボネートが用いられる）である場合、R5、R10は（限定しようとするものではな
いが）ヒドロキシルと反応し得る。

【００５７】官能基R5、R10がヒドラジン、ヒドラジド誘導体またはアミン（第一級または
第二級）である場合、R5、R10は（限定しようとするものではないが）アルデヒ
ドまたはケトンと反応し得る（そしてシッフ塩基を形成し、これはNaCNBH₃のよ
うな還元剤で還元されてもよいし、されなくてもよい）。

【００５８】さらに、イオウ原子の一方を介して複素環系に、そして他方のイオウ原子を介
して脂肪族炭素に直接結合しているジスルフィド結合を含む化合物である。該複
素環は５つ以上の原子を含み得り、その中の１つ以上はヘテロ原子（O、N、S、P
）またはヘテロ原子の組合せであり、残りは炭素原子である。

【００５９】

【化５】Ｈは、イオウ、酸素、窒素またはリンを含む群から選ばれるヘテロ原子である
。R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R10、R11、R12、R14において、それら
の中の少なくとも１つは、電気陰性原子、またはOH、OR（エーテル）、NH₂（第
二級、第三級および第四級アミンでもある）、SO₃ ^-、COOH、COOR（エステル）、
CONH₂、CONR₂（置換アミド）、ハロゲン（F、Cl、Br、I）、NO₂のような官能基
である。Ｌは、ジスルフィドと反応性のヘテロ二官能性基もしくはホモ二官能性
基A₁およびR9との結合をもたらすリンカーまたはスペーサー基として定義される
。Ｌは存在しても存在しなくてもよく、あるいはアルカン、アルケン、アルキン
、エステル、エーテル、グリセロール、アミド、尿素、糖、多糖、ヘテロ原子（
例えば、酸素、イオウまたは窒素）を含む群から選ばれてもよい。該スペーサー
は、正の荷電でも、負の荷電でも、中性の電荷でも、両性イオン性であってもよ
い。A1およびR9は、ホモ二官能性の二官能性分子内のものと同一であるか、また
はヘテロ二官能性の二官能性分子内のものと異なっていてもよい反応性基である
。好ましい実施形態では、該ジスルフィド化合物は、アクリル化またはアルキル
化反応を受け得る反応性の基を含む。そのような反応性の基としては（しかし、
限定しようとするものではないが）、イソチオシアネート、イソシアネート、ア
シルアジド、酸ハライド、O-アシル尿素、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル
、スクシンイミドエステル、アミド、尿素、スルホニルクロライド、アルデヒド
、ケトン、エーテル、エポキシド、カーボネート、アルキルハライド、イミドエ
ステル、カルボキシレート、アルキルホスフェート、アリールハライド（例えば
、ジフルオロ-ジニトロベンゼン）または酸無水物が含まれる。

【００６０】官能基A1、R9がアミンである場合、A1、R9は（限定しようとするものではない
が）活性カルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ア
ルキルハライド、酸ハライド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニ
ルクロライド、アルデヒド、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエステ
ル、アミド、カルボキシレートもしくはアルキルホスフェート、アリールハライ
ド（ジフルオロ-ジニトロベンゼン）または酸無水物と反応し得る。つまり、官
能基A1、R9がアミンである場合、アシル化剤またはアルキル化剤が該アミンと反
応し得る。

【００６１】官能基A1、R9がスルフヒドリルである場合、A1、R9は（限定しようとするもの
ではないが）ハロアセチル誘導体、活性カルボン酸、マレイミド、アジリジン誘
導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体またはジスルフィド誘導体
（例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）誘導体
）と反応し得る。

【００６２】官能基A1、R9がカルボキシレートである場合、A1、R9は、該酸が活性化されて
いさいすれば、（限定しようとするものではないが）ジアゾアセテート、アルコ
ール、チオールまたはアミンと反応し得る。

【００６３】官能基A1、R9がヒドロキシルである場合、A1、R9は（限定しようとするもので
はないが）活性カルボン酸、エポキシド、オキシランまたはアミン（そこにおい
てカルボニルジイミダゾールが用いられる）と反応し得る。

【００６４】官能基A1、R9がアルデヒドまたはケトンである場合、A1、R9は（限定しようと
するものではないが）ヒドラジン、ヒドラジド誘導体、アミン（シッフ塩基を形
成し、これは続いてNaCNBH₃のような還元剤により還元してもよいし、しなくて
もよい）、またはジオールと反応してアセタールまたはケタールを形成し得る。

【００６５】官能基A1、R9が活性カルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、アシ
ルアジド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロライド、アル
デヒド、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエステル、アルキルホスフ
ェート、アリールハライド（ジフルオロ-ジニトロベンゼン）、酸無水物、アル
キルハライドもしくは酸ハライド、p-ニトロフェニルエステル、o-ニトロフェニ
ルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル
、カルボニルイミダゾール、カルボニルピリミジニウムまたはカルボニルジメチ
ルアミノピリミジニウムである場合、A1、R9は（限定しようとするものではない
が）アミン、ヒドロキシル、ヒドラジン、ヒドラジドまたはスルフヒドリル基と
反応し得る。

【００６６】官能基A1、R9が活性カルボン酸、ハロアセチル誘導体、マレイミド、アジリジ
ン誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体またはジスルフィド誘
導体（例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）誘
導体）である場合、A1、R9は（限定しようとするものではないが）スルフヒドリ
ルと反応し得る。

【００６７】官能基A1、R9がアルデヒド、ケトン、エポキシド、オキシランまたはアミン（
そこにおいてカルボニルジイミダゾールまたはN,N’-ジスクシンイミジルカーボ
ネートが用いられる）である場合、A1、R9は（限定しようとするものではないが
）ヒドロキシルと反応し得る。

【００６８】官能基A1、R9がヒドラジン、ヒドラジド誘導体またはアミン（第一級または第
二級）である場合、A1、R9は（限定しようとするものではないが）アルデヒドま
たはケトンと反応し得る（そしてシッフ塩基を形成し、これはNaCNBH₃のような
還元剤で還元されてもよいし、されなくてもよい）。

【００６９】さらに、イオウ原子の一方を介して複素環系（芳香族性または非芳香族性）に
、そして他方のイオウ原子を介して芳香族環系に直接結合しているジスルフィド
結合を含む化合物である。該複素環は５つ以上の原子を含み得り、その中の１つ
以上はヘテロ原子（O、N、S、P）またはヘテロ原子の組合せであり、残りは炭素
原子である。

【００７０】

【化６】Ｈは、イオウ、酸素、窒素またはリンを含む群から選ばれるヘテロ原子である
。R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃において、それらの中
の少なくとも１つは、電気陰性原子、またはOH、OR（エーテル）、NH₂（第二級
、第三級および第四級アミンでもある）、SO₃ ^-、COOH、COOR（エステル）、CONH ₂ 、CONR₂（置換アミド）、ハロゲン（F、Cl、Br、I）、NO₂のような官能基であ
る。Ｌは、ジスルフィドと反応性のヘテロ二官能性基もしくはホモ二官能性基R₉ およびR₁₄との結合をもたらすリンカーまたはスペーサー基として定義される。
Ｌは存在しても存在しなくてもよく、あるいはアルカン、アルケン、アルキン、
エステル、エーテル、グリセロール、アミド、尿素、糖、多糖、ヘテロ原子（例
えば、酸素、イオウまたは窒素）を含む群から選ばれてもよい。該スペーサーは
、正の荷電でも、負の荷電でも、中性の電荷でも、両性イオン性であってもよい
。R₉およびR₁₄は、ホモ二官能性の二官能性分子内のものと同一であるか、また
はヘテロ二官能性の二官能性分子内のものと異なっていてもよい反応性基である
。好ましい実施形態では、該ジスルフィド化合物は、アクリル化またはアルキル
化反応を受け得る反応性の基を含む。そのような反応性の基としては（しかし、
限定しようとするものではないが）、イソチオシアネート、イソシアネート、ア
シルアジド、酸ハライド、O-アシル尿素、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル
、スクシンイミドエステル、アミド、尿素、スルホニルクロライド、アルデヒド
、ケトン、エーテル、エポキシド、カーボネート、アルキルハライド、イミドエ
ステル、カルボキシレート、アルキルホスフェート、アリールハライド（例えば
、ジフルオロ-ジニトロベンゼン）または酸無水物が含まれる。

【００７１】官能基R9、R14がアミンである場合、R9、R14は（限定しようとするものではな
いが）活性カルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、
アルキルハライド、酸ハライド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ
ニルクロライド、アルデヒド、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエス
テル、アミド、カルボキシレートもしくはアルキルホスフェート、アリールハラ
イド（ジフルオロ-ジニトロベンゼン）または酸無水物と反応し得る。つまり、
官能基R9、R14がアミンである場合、アシル化剤またはアルキル化剤が該アミン
と反応し得る。

【００７２】官能基R9、R14がスルフヒドリルである場合、R9、R14は（限定しようとするも
のではないが）ハロアセチル誘導体、活性カルボン酸、マレイミド、アジリジン
誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体またはジスルフィド誘導
体（例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）誘導
体）と反応し得る。

【００７３】官能基R9、R14がカルボキシレートである場合、R9、R14は、該酸が活性化され
ていさいすれば、（限定しようとするものではないが）ジアゾアセテート、アル
コール、チオールまたはアミンと反応し得る。

【００７４】官能基R9、R14がヒドロキシルである場合、R9、R14は（限定しようとするもの
ではないが）活性カルボン酸、エポキシド、オキシランまたはアミン（そこにお
いてカルボニルジイミダゾールが用いられる）と反応し得る。

【００７５】官能基R9、R14がアルデヒドまたはケトンである場合、R9、R14は（限定しよう
とするものではないが）ヒドラジン、ヒドラジド誘導体、アミン（シッフ塩基を
形成し、これは続いてNaCNBH₃のような還元剤により還元してもよいし、しなく
てもよい）、またはジオールと反応してアセタールまたはケタールを形成し得る
。

【００７６】官能基R9、R14が活性カルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、ア
シルアジド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロライド、ア
ルデヒド、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエステル、アルキルホス
フェート、アリールハライド（ジフルオロ-ジニトロベンゼン）、酸無水物、ア
ルキルハライドもしくは酸ハライド、p-ニトロフェニルエステル、o-ニトロフェ
ニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステ
ル、カルボニルイミダゾール、カルボニルピリミジニウムまたはカルボニルジメ
チルアミノピリミジニウムである場合、R9、R14は（限定しようとするものでは
ないが）アミン、ヒドロキシル、ヒドラジン、ヒドラジドまたはスルフヒドリル
基と反応し得る。

【００７７】官能基R9、R14が活性カルボン酸、ハロアセチル誘導体、マレイミド、アジリ
ジン誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体またはジスルフィド
誘導体（例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）
誘導体）である場合、R9、R14は（限定しようとするものではないが）スルフヒ
ドリルと反応し得る。

【００７８】官能基R9、R14がアルデヒド、ケトン、エポキシド、オキシランまたはアミン
（そこにおいてカルボニルジイミダゾールまたはN,N’-ジスクシンイミジルカー
ボネートが用いられる）である場合、R9、R14は（限定しようとするものではな
いが）ヒドロキシルと反応し得る。

【００７９】官能基R9、R14がヒドラジン、ヒドラジド誘導体またはアミン（第一級または
第二級）である場合、R9、R14は（限定しようとするものではないが）アルデヒ
ドまたはケトンと反応し得る（そしてシッフ塩基を形成し、これはNaCNBH₃のよ
うな還元剤で還元されてもよいし、されなくてもよい）。

【００８０】詳細な説明安定なジスルフィドを有する２官能性分子を合成するための従来の試みに反し
て、本発明の目的は、反応活性なジスルフィド分子を合成することである。in v
ivoではジスルフィドは主に、システインベースのチオールグルタチオン（γ−
グルタミルシスチルグリシン）により還元され、これは細胞中でミリモル濃度で
存在する。２官能性分子およびその構造体中のジスルフィド結合の反応活性を上
昇させるために、我々は、酸化型グルタチオンより速く還元される数種類のジス
ルフィド結合含有２官能性分子を合成した。

【００８１】ジスルフィド結合含有２官能性分子ホモまたはヘテロ２官能性を有する２官能性分子（一般に架橋剤と呼ばれる）
を使用して、２つの分子を結合させる。ジスルフィド結合（RSSR'）は、２官能
性分子内で使用される。ジスルフィド結合形成の可逆性により、これらは２つの
分子の一時的結合の有用な手段となる。生理学的には、ジスルフィドはグルタチ
オンにより還元される。

【００８２】生理学的条件下で反応活性なジスルフィド結合とは：ジスルフィド結合は、酸
化型グルタチオンまたはチオールから作製された任意のジスルフィド（構成成分
チオールの１つはグルタチオンより酸性（低pKa）である）より急速に分解され
るか、または遊離のチオールによる分子内攻撃により活性化される。この場合構
成成分とは、ジスルフィド結合で結合されるチオールを意味する。切断可能とは
、原子間の化学結合が破壊されることを意味する。

【００８３】本発明は、生理学的に反応活性なジスルフィド結合を含有する２官能性分子を
記載する。本発明はまた、２官能性分子（ポリマー、ペプチド、タンパク質、核
酸、ポリマー核酸複合体を含む）から調製される構造体を含む。構造体とは、２
官能性分子の反応中心の少なくとも１つの化学反応から得られる化合物であり、
２官能性分子の両方の反応中心の加水分解から生じる化学結合ではなく、新しい
化学結合が生じるものを意味する。構造体の形成後に、さらに化学修飾が起きて
もよい。架橋とは、２官能性試薬を有する２つまたはそれ以上の分子の化学的結
合を意味する。反応性末端は、ホモ２官能性分子中のように同一でも、ヘテロ２
官能性分子中のように異なってもよい。

【００８４】ポリマーポリマーは、モノマーと呼ばれる小さい単位の反復性結合により作られる分子
である。本出願ではポリマーという用語は、２〜約80モノマーを有するオリゴマ
ーも80以上のモノマーを有するポリマーも含む。ポリマーは、線状で、分岐した
ネットワークの星型、櫛型、またはハシゴ型のポリマーでもよい。ポリマーは、
単一のモノマーが使用されるホモポリマーでも、または２つまたはそれ以上のモ
ノマーが使用されるコポリマーでもよい。コポリマーのタイプには、交互反復性
(alternating)、ランダム、ブロック、およびグラフトコポリマーを含む。

【００８５】重合技術の当業者にとっては、記載の方法において使用可能な重合プロセスの
数種類の分類がある。重合は、連鎖でも段階的でもよい。この分類は、従来の付
加および縮合重合の用語より頻繁に使用される。「ほとんどの段階反応重合は縮
合プロセスであり、ほとんど連鎖反応重合は付加プロセスである」（M. P. Stev
ens Polymer Chemistry: An Introduction New York Oxford University Press
1990）。テンプレート重合は、娘ポリマーからポリマーを形成するのに使用する
ことができる。

【００８６】段階重合：段階重合では、重合は段階的に起きる。ポリマー生長は、モノマー
、オリゴマーおよびポリマーの間の反応により生じる。最初から最後まで同じ反
応であるため開始剤は必要ではなく、末端基もまだ反応性であるため、終末段階
というものはない。官能基が消費されるに連れて、重合速度は低下する。

【００８７】典型的には段階重合は、２つの異なる方法のいずれかにより行われる。１つは
、モノマーが同じ分子中に２つの反応性官能基（AとB）を有し、従ってA-Bが-[A
-B]-を与える。または他のアプローチは、２つの２官能性分子を有することであ
る。

【００８８】 A-A＋B-Bが-[A-A-B-B]-を与える。一般に、これらの反応は、アシル化または
アルキル化を含む。アシル化は、分子へのアシル基（-COR）の導入として定義さ
れる。アルキル化は、分子へのアルキル基の導入として定義される。

【００８９】官能基Aがアミンなら、Bは（特に限定されないが）イソチオシアネート、イソ
シアネート、アシルアジド、N-ヒドロキシスクシンイミド、塩化スルホニル、ア
ルデヒド（ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドを含む）、ケトン、エポ
キシド、カーボネート、イミドエステル、カルボジイミドで活性化されたカルボ
キシレート、アルキルホスフェート、アリールハライド（ジフルオロ−ジニトロ
ベンゼン）、酸無水物(anhydride)、または酸ハライド、p-ニトロフェニルエス
テル、o-ニトロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフル
オロフェニルエステル、カルボニルイミダゾール、カルボニルピリミジニウム、
またはカルボニルジメチルアミノピリジニウムがある。つまり、官能基Aがアミ
ンなら、官能基Bは、アシル化剤またはアルキル化剤またはアミノ化剤でもよい
。

【００９０】官能基Aがスルフヒドリルなら、官能基Bは（特に限定されないが）、ヨードア
セチル誘導体、マレイミド、アジリジン誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロ
ベンゼン誘導体、またはジスルフィド誘導体（例えば、ピリジルジスルフィドま
たは5-チオ-2-ニトロ安息香酸｛TNB｝誘導体）でもよい。

【００９１】官能基Aがカルボキシレートなら、官能基Bは（特に限定されないが）、ジアゾ
アセテートまたはアミン（この場合、カルボジイミドが使用される）でもよい。
他の添加物、例えばカルボン酸ジイミダゾール、ジメチルアミノピリジン（DMAP
）、N-ヒドロキシスクシニミド、またはカルボジイミドとDMAPを使用するアルコ
ールでもよい。

【００９２】官能基Aがヒドロキシルなら、官能基Bは（特に限定されないが）、エポキシド
、オキシラン、またはアミン（ここで、カルボニルジイミダゾールまたはN,N'-
ジスクシニミジルカーボネート、またはN-ヒドロキシスクシニミジルクロロギ酸
、または他のクロロギ酸が使用される）でもよい。

【００９３】官能基Aがアルデヒドまたはケトンなら、官能基Bは（特に限定されないが）、
ヒドラジン、ヒドラジン誘導体、アミン（シッフ塩基を生成しNaCNBH3のような
還元剤により還元されるかまたはされなくてもよい）またはヒドロキシル化合物
（ケタールもしくはアセタールを生成する）でもよい。

【００９４】さらに別のアプローチは、A-Aと別の物質が-[A-A]-を与えるような２官能性モ
ノマーを有することである。

【００９５】官能基Aがスルフヒドリルなら、これは、ヨード（I2）またはNaIO4（過ヨウ素
酸ナトリウム）または酸素（O2）のような酸化剤により、ジスルフィド結合に変
換される。官能基Aは、2-イミノチオレート（Traut's試薬）によりスルフヒドリ
ル基に変換されるアミンでもよく、これは次に、酸化されジスルフィドが生成す
る。ジスルフィド誘導体（例えば、ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニト
ロ安息香酸｛TNB｝誘導体）はまた、ジスルフィド結合生成を触媒するのに使用
することもできる。上記例のいずれかの官能基AまたはBはまた、光反応性基、例
えばアリールアジド（ハロゲン化アリールアジドを含む）、ジアゾ、ベンゾフェ
ノン、アルキンまたはジアジリン誘導体でもよい。

【００９６】アミン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシレート基の反応は、アミ
ド、アミジン、ジスルフィド、エーテル、エステル、エナミン、イミン、尿素、
イソチオ尿素、イソ尿素、スルホンアミド、カルバメート、アルキルアミン結合
（２級アミン）、炭素−窒素単結合（ここで、炭素はヒドロキシル基を含む）、
チオエーテル、ジオール、ヒドラゾン、またはスルホンと呼ばれる化学結合を与
える。

【００９７】連鎖重合：連鎖重合では、限定された数の生長鎖へのモノマー単位の連続的付
加により、ポリマーの生長が起きる。開始機構と生長機構は異なり、通常は連鎖
停止工程がある。重合速度は、モノマーが枯渇するまで一定である。

【００９８】ビニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド
基を含有するモノマーは（特に限定されないが）、ラジカル性、アニオン性また
はカチオン性の連鎖反応を受ける。連鎖重合はまた、開環重合により行われる。
過酸化物、ヒドロキシ過酸化物、およびアゾ化合物（例えば、2,2'-アゾビス(ア
ミジノプロパン）ジヒドロクロリド（AAP））を含むいくつかの異なるタイプの
フリーラジカル開始剤が使用できる。

【００９９】モノマーのタイプ重合プロセスに多様なモノマーが使用できる。これらには、陽性に荷電した有
機モノマー、例えばアミン塩、イミジン、グアニジン、イミン、ヒドロキシルア
ミン、ヒドラジン、複素環（塩）（例えば、イミダゾール、ピリジン、モルホリ
ン、ピリミジン、またはピレン）がある。アミンは、アミンのpKaが４〜８の間
の生理学的範囲にあるという意味でpH感受性である。具体的なアミンには、スペ
ルミン、スペルミジン、N,N'-ビス（2-アミノエチル)-1,3-プロパンジアミン（A
EPD）、および3,3'-ジアミノ-N,N-ジメチルジプロピルアンモニウムブロミドが
ある。

【０１００】モノマーはまた、疎水性、親水性または両新媒性でもよい。両新媒性化合物は
、親水性（水溶性）および疎水性（非水溶性）部分の両方を含む。親水性基は、
化学残基が水を好むという定性的用語である。典型的には、このような化学基は
水溶性であり、水の水素結合ドナーまたはアクセプターである。親水性基の例に
は、以下の化学残基を有する化合物がある：炭水化物、ポリオキシエチレン、ペ
プチド、オリゴヌクレオチド、およびアミン、アミド、アルコキシアミド、カル
ボン酸、イオウ、またはヒドロキシルを含む基。疎水性基は、化学残基が水を嫌
うという定性的用語である。典型的には、このような化学基は非水溶性であり、
水素結合を形成しようとしない。炭化水素は、疎水性基である。

【０１０１】モノマーはまた、アクリジン、チアゾールオレンジ、または臭化エチジウムの
ような挿入剤(intercalating agents)でもよい。モノマーはまた（特に限定され
ないが）、アミン（１級、２級および３級）、アミド、カルボン酸、エステル、
ヒドロキシル、ヒドラジン、ハロゲン化アルキル、アルデヒド、およびケトンを
含む、重合の前又は後に修飾できる化学残基を含有してもよい。

【０１０２】モノマーとポリマーの他の成分ポリマーは、その有用性を上げる他の基を有する。これらの基は、ポリマー形
成の前にモノマー中に取り込むか、またはその形成後にポリマーに結合する。こ
れらの基には、ターゲティング基、シグナル、受容体またはマーカー分子、スペ
ーサー、立体安定剤、キレート剤、ポリカチオン、ポリアニオン、およびポリマ
ーがある。

【０１０３】ターゲティング基は、ポリマー−核酸複合体を特定の細胞または組織にターゲ
ティングするのに使用される。ターゲティング物質の例には、アシアロ糖タンパ
ク質またはガラクトース残基を使用してアシアロ糖タンパク質受容体を標的とす
る物質を含む。インスリン、EGF、またはトランスフェリンのようなタンパク質
は、ターゲティングに使用することができる。タンパク質とは、ポリペプチド中
の連続的アミノ酸残基のアルファアミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結
合により、互いに結合した２つまたはそれ以上の残基から構成される分子を意味
する。アミノ酸は、天然に存在するものでも合成のものでもよい。RGD配列を含
むペプチドは、多くの細胞をターゲティングするのに使用することができる。ペ
プチドとは、連続的アミノ酸残基のアルファアミノ基とカルボキシル基との間の
ペプチド結合により、互いに結合した、アミノ酸残基の線状の一連を意味する。
ポリペプチドには、タンパク質とペプチド、修飾タンパク質とペプチド、および
非天然のタンパク質とペプチドを含む。

【０１０４】細胞上のスルフヒドリル基またはジスルフィド基と反応する化学基はまた、多
くのタイプの細胞をターゲティングするのに使用することができる。葉酸や他の
ビタミンもターゲティングに使用することができる。他のターゲティング基には
、膜と相互作用する分子（例えば、脂肪酸、コレステロール、ダンシル化合物、
およびアンホテリシン誘導体）がある。

【０１０５】他のターゲティング基は、細胞のある部分への薬剤または核酸の送達を上昇さ
せるのに使用することができる。例えば、エンドソームを破壊する物質を使用す
ることができ、核をターゲティングするのに核局在化シグナル（NLS）を使用す
ることができる。細胞や特定の細胞受容体へ薬剤や遺伝子をターゲティングする
のに、多様なリガンドが使用されている。リガンドは、細胞膜内、細胞膜上、ま
たは細胞の近傍の標的を探す。受容体へのリガンドの結合は典型的には、エンド
サイトーシスを開始させる。リガンドはまた、エンドサイトーシスされない受容
体に結合するDNAの送達にも使用できるであろう。例えばインテグリン受容体に
結合するRGDペプチド配列を含有するペプチドを使用することができるであろう
。さらに、細胞へ複合体を結合させるのに、ウイルスタンパク質を使用すること
ができるであろう。複合体を細胞膜に直接挿入するのに、脂質やステロイドを使
用することができるであろう。ポリマーもまた、それ自身の中に切断可能な基を
含有することもできる。ターゲティング基に結合すると、ターゲティング基に対
する、複合体と受容体との相互作用が減少する。切断可能な基には（特に限定さ
れないが）、ジスルフィド結合、ジオール、ジアゾ結合、エステル結合、スルホ
ン結合、アセタール、ケタール、エノールエーテル、エノールエステル、エナミ
ンおよびイミン、アシルヒドラゾン、およびシッフ塩基がある。

【０１０６】好適な実施形態において、化学反応は、シグナルを核酸複合体に結合させるの
に使用することができる。本方法においてはシグナルとは、核酸複合体を修飾し
、それを、培養または全生物体中の細胞の位置（例えば組織細胞）または細胞内
の位置（例えば核）に向かわせることができる分子と定義される。外来遺伝子の
細胞または組織の位置を修飾することにより、外来遺伝子の発現を増強すること
ができる。

【０１０７】シグナルは、タンパク質、ペプチド、脂質、ステロイド、糖、炭水化物、核酸
または合成化合物でもよい。シグナルは、受容体への細胞の結合、核への細胞質
輸送、および核侵入またはエンドソームまたは他の細胞内小胞からの放出を増強
する。

【０１０８】核局在化シグナルは、核の近傍への遺伝子のターゲティング、および／または
核への侵入を増強する。このような核輸送シグナルは、タンパク質またはペプチ
ド（例えば、SV40ラージTagNLSまたはヌクレオプラスミンNLS）でもよい。これ
らの核局在化シグナルは、多様な核輸送因子、例えば、NLS受容体（カリオフェ
リンアルファ）と相互作用し、次にこれは、カリオフェリンベータと相互作用す
る。核輸送タンパク質自身はまた、核孔および核にターゲティングされるため、
NLSとして機能することができるであろう。

【０１０９】細胞内コンパートメントからの放出を増強するシグナル（放出シグナル）は、
エンドソーム（初期および後期）、リソソーム、ファゴソーム、小胞、小胞体、
ゴルジ装置、トランスゴルジネットワーク（TGN）、および筋小胞体のような細
胞内コンパートメントからの、DNA放出を引き起こすことができる。放出は、細
胞内コンパートメントから、細胞質へのまたは細胞器官（例えば、核）への移動
を含む。放出シグナルは、化学物質（例えば、クロロキン、バフィロマイシン、
またはBrefeldin AiおよびER保持シグナル（KDEL配列））、ウイルス成分（例え
ば、インフルエンザウイルス血球凝集素サブユニットHA-2ペプチドおよび他のタ
イプの両親媒性ペプチド）を含む。細胞受容体シグナルは、遺伝子または粒子と
細胞との結合を増強する任意のシグナルである。これは、細胞表面への遺伝子の
結合および／または細胞内コンパートメントとのその結合を増強させることによ
り行われる（例えば、細胞表面への結合を増強することによりエンドサイトーシ
スを増強するリガンド）。これは、アシアロ糖タンパク質またはガラクトース残
基を使用して、アシアロ糖タンパク質受容体にターゲティングする物質を含む。
他のタンパク質（例えば、インスリン、EGF、またはトランスフェリン）を、タ
ーゲティングに使用することができる。RGD配列を含むペプチドは、多くの細胞
をターゲティングするのに使用することができる。スルフヒドリルまたはジスル
フィド基と反応する化学基はまた、多くのタイプの細胞をターゲティングするの
に使用することができる。葉酸および他のビタミンも、ターゲティングに使用す
ることができる。他のターゲティング基には、膜と相互作用する分子（例えば、
脂肪酸、コレステロール、ダンシル化合物、およびアンホテリシン誘導体）があ
る。さらにウイルスタンパク質を、細胞に結合するのに使用することができるで
あろう。

【０１１０】レポーターまたはマーカー分子は、容易に検出できる化合物である。典型的に
は、これらは蛍光性化合物（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレ
ッド、cy5、cy3、またはダンシル化合物）である。これらは、UVまたは可視分光
法により、または抗体相互作用または電子スピン共鳴により検出することができ
る分子でもよい。ビオチンは、標識アビジンにより検出することができる別のレ
ポーター分子である。ビオチンはまた、標的とする基を付加するのに使用するこ
とができる。

【０１１１】スペーサーは、１つの部分を別の部分に結合させることを可能にする、当業者
に公知の任意のリンカーである。この部分は、親水性でも疎水性でもよい。好適
なスペーサー基には（特に限定されないが）、C1-C12アルキル、C1-C12アルケニ
ル、C1-C12アルキニル、C6-C18アラルキル、C6-C18アラルケニル、C6-C18アラル
キニル、エステル、エーテル、ケトン、アルコール、ポリオール、アミド、アミ
ン、ポリグリコール、ポリアミン、チオール、チオエーテル、チオエステル、リ
ン含有、および複素環がある。

【０１１２】立体安定化因子は、粒子と粒子との静電相互作用を立体的に障害することによ
り、最終的なポリマーの凝集を防ぐ長鎖親水基である。例としては、アルキル基
、PEG鎖、多糖、水素分子、アルキルアミンがある。静電相互作用は、正電荷と
負電荷の間の引力による、２以上の物質の非共有結合である。

【０１１３】ポリカチオンは、正味での正電荷を有するポリマー（例えば、ポリ-L-リシン
ヒドロブロマイド）である。ポリカチオンは、正電荷、中性電荷、または負電荷
を有するモノマー単位を含有することができるが、ポリマーの正味の電荷は正で
なければならない。ポリカチオンはまた、２以上の正電荷を有する非ポリマー性
分子を意味しうる。ポリアニオンは、正味で負電荷を有するポリマー（例えば、
ポリグルタミン酸）である。ポリアニオンは、正電荷、中性電荷、または負電荷
を有するモノマー単位を含有することができるが、ポリマーの正味の電荷は負で
なければならない。ポリアニオンはまた、２以上の負電荷を有する非ポリマー性
分子を意味しうる。ポリイオンという用語は、ポリカチオン、ポリアニオン、両
性イオン性ポリマー、および中性ポリマーを含む。両性イオンという用語は、同
じ分子の一部である酸性基と塩基性基との反応の生成物（塩）を意味する。

【０１１４】塩は、溶液中に溶解したとき陽イオンと陰イオンに解離するイオン性化合物で
ある。塩は、溶液のイオン強度を増加させ、従って核酸と他の陽イオンとの相互
作用を低下させる。

【０１１５】キレート剤は、多座配位子、すなわちイオン（特に、金属イオン、１級アミン
、または単一のプロトン）の配位域内に２以上の部位を有する分子である。キレ
ート剤の例は、クラウンエーテル、クリプテート、および非環状多座分子を含む
。クラウンエーテルは、(-X-(CR1-2)n)m単位（式中、n=1-3およびm=3-8である）
を含有する環状ポリエーテルである。XおよびCR1-2分子は、置換されていても、
または異なる酸化状態であってもよい。Xは、酸素、窒素または硫黄、炭素、リ
ンまたはこれらの任意の組合せでもよい。Rは、H、C、O、S、N、Pであり得る。
クリプテートと記載されるクラウンエーテルのサブセットは、第２の(-X-(CR1-2
)n)z鎖（式中、z=3-8である）を有する。鎖の最初のX原子は、(-X-(CR1-2)n)m単
位中のX原子であり、新しい鎖の末端CH2は、(-X-(CR1-2)n)m単位中の２番目のX
原子に結合している。(-X-(CR1-2)n)m単位（式中n=1-4およびm=1-8である）を含
有する非環状多座分子。XおよびCR1-2部分は、置換されていてもよいし、または
異なる酸化状態でもよい。Xは、酸素、窒素、または硫黄、炭素、リンまたはこ
れらの任意の組合せでもよい。ポリキレート剤は、イオン結合または共有結合に
より複数のキレート剤に結合するポリマーであり、スペーサーを含んでもよい。
ポリマーは、陽イオン性、陰イオン性、両性イオン性、中性であるか、または陽
イオン性、陰イオン性、両性イオン性、中性基を任意の組合せで含有して、正味
の電荷が陽イオン性、陰イオン性、中性であるものでもよく、さらに立体安定化
因子、ペプチド、タンパク質、シグナルを含有してもよいし、ミセル、逆転ミセ
ル、または単膜構造の形成のための両親媒性化合物を含有してもよい。好ましく
は両親媒性化合物は陽イオン性、陰イオン性、または両性イオン性であって、重
合可能な基を含み得る親水性セグメントと、重合可能な基を含み得る疎水性セグ
メントとを有し得る。

【０１１６】本発明は、生理学的条件下で切断することができるジスルフィド結合を利用し
た、in situおよびin vivoでの組織内の実質細胞中へのポリヌクレオチドおよび
生理活性化合物の導入であって、脈管内（米国特許出願番号第08/571,536号）、
動脈内、静脈内、経口、十二指腸内、空腸経由（または回腸もしくは結腸）、経
直腸、経皮、皮下、筋肉内、腹腔内、非経口的注入により、また組織、例えば、
肝臓、肺、心臓、筋肉、脾臓、膵臓、脳（脳室内を含む）、脊髄、神経節、リン
パ節、リンパ系、脂肪組織、甲状腺組織、副腎、腎臓、前立腺、血液細胞、骨髄
細胞、癌細胞、腫瘍、目の網膜、への直接注入、胆管経由、または粘膜（例えば
、口、鼻、のど、膣または直腸）経由により、または唾液腺または他の外分泌腺
の管路内へ、送達することによる方法を提供する。

【０１１７】「送達される」とは、ポリヌクレオチドが細胞と結び付けられるようになるこ
とを意味する。ポリヌクレオチドは、細胞の膜上または細胞質、核、もしくは他
の細胞内小器官の内部にあってもよい。細胞にポリヌクレオチドを送達するプロ
セスは、一般に「トランスフェクション」または「トランスフェクト」するプロ
セスと呼ばれ、また「形質転換」とも呼ばれる。ポリヌクレオチドは、治療的と
なるような細胞の変化を引き起こすのに使用できる。治療および研究目的でポリ
ヌクレオチドまたは遺伝物質を送達することは、一般に「遺伝子治療」と呼ばれ
る。送達されるポリヌクレオチドまたは遺伝物質は、一般に送達の前にトランス
フェクション試薬と混合される。

【０１１８】生物活性のある化合物は、生体成分と反応する能力を有する化合物である。さ
らに詳細には、本方法で使用される生物活性のある化合物は、生きている細胞に
関係する自然のプロセスを変化させるように設計される。本明細書の目的におい
て、細胞の自然のプロセスは、生物活性のある化合物の送達の前に、細胞と関係
しているプロセスである。本明細書において、ヒトが引き起こす、in vivoで細
胞中の分子を補助するタンパク質のような物質の細胞による産生または阻害は、
送達された生物活性のある化合物の例である。薬剤、タンパク質、ペプチド、ポ
リペプチド、ホルモン、サイトカイン、抗原、ウイルス、オリゴヌクレオチド、
および核酸は、生物活性のある化合物の例である。生物活性化合物は、本出願の
目的において、生物活性のある化合物と同義で使用される。

【０１１９】「核酸」という用語は、少なくとも２つのヌクレオチドを含有するポリマーを
意味する当該分野の用語である。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（DN
A）またはリボース（RNA）、塩基、リン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン
酸基を介して互いに結合している。「塩基」は、プリンとピリミジンを含み、こ
れらは、天然の化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル
、イノシン、およびプリンとピリミジンの合成誘導体、または天然の類似体を含
む。ヌクレオチドは、核酸ポリマーのモノマー単位である。「ポリヌクレオチド
」は、ここでは80を超えるモノマー単位を有することで、「オリゴヌクレオチド
」とは区別される（オリゴヌクレオチドは、2〜80ヌクレオチドを含む）。核酸
という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）とリボ核酸（RNA）を含む。DNAは、ア
ンチセンス、プラスミドDNA、プラスミドDNAの一部、ベクター（P1、PAC、BAC、
YAC、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体DNA、またはこれらの群
の誘導体でもよい。RNAは、オリゴヌクレオチドRNA、tRNA（トランスファーRNA
）、snRNA（小核RNA）、rRNA（リボゾームRNA）、mRNA（メッセンジャーRNA）、
アンチセンスRNA、リボザイム、キメラ配列、またはこれらの群の誘導体でもよ
い。「アンチセンス」は、DNAおよび／またはRNAの機能を妨害するポリヌクレオ
チドである。これは、発現を抑制し得る。天然の核酸はリン酸骨格を有し、人工
核酸は、他のタイプの骨格および塩基を含有することがある。これらには、PNA
（ペプチド核酸）、ホスホチオネート、および天然核酸のリン酸骨格の他の変異
体がある。さらにDNAとRNAは、１本鎖、２本鎖、３本鎖、または４本鎖でもよい
。「発現カセット」とは、タンパク質を発現することができる、天然のまたは組
換えで作成されたポリヌクレオチド分子を意味する。DNA発現カセットは典型的
には、プロモーター（転写を開始させる）および１以上のタンパク質をコードす
る配列を含む。場合により、発現カセットは、転写エンハンサー、非コード配列
、スプライシングシグナル、転写停止シグナル、およびポリアデニル化シグナル
を含む。RNA発現カセットは典型的には、翻訳開始コドン（翻訳を開始させる）
、および１以上のタンパク質をコードする配列を含む。場合により、発現カセッ
トは、翻訳停止シグナル、ポリアデノシン配列、内部リボゾーム侵入部位（IRES
）、および非コード配列を含む。

【０１２０】「裸のポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチドが、トランスフェ
クション試薬、またはポリヌクレオチドが心筋細胞に送達されるのに必要な他の
ビヒクルに結合していないことを示す。「トランスフェクション試薬」または「
送達ビヒクル」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに結合するかま
たはこれと複合体を形成する、先行技術で使用される１つのまたは複数の化合物
であり、細胞への侵入を仲介する。トランスフェクション試薬はまた、細胞への
ポリヌクレオチドの結合またはインターナリゼーションも仲介する。トランスフ
ェクション試薬の例には、陽イオン性リポソームおよび脂質、ポリアミン、リン
酸カルシウム沈降物、ヒストンタンパク質、ポリエチレンイミン、およびポリリ
ジン複合体（ポリエチレンイミンとポリリジンはいずれも毒性である）がある。
典型的には、トランスフェクション試薬は、正味の陽性電荷を有し、これがポリ
ヌクレオチドの陰性電荷に結合する。トランスフェクション試薬は、その陽性電
荷（膜の陰性電荷に結合する）または細胞で受容体に結合するリガンドを介して
、細胞へのポリヌクレオチドの結合を仲介する。例えば、陽イオン性リポソーム
またはポリリジン複合体は、正味の陽性電荷を有し、これがDNAまたはRNAへの結
合を可能にする。先行技術において、遺伝子を細胞に導入するのに、他の送達ビ
ヒクルも使用される。これらには、粒子上でポリヌクレオチドと複合体を形成し
、次にこれが細胞中に加速されるものがある。これは、「バイオリスティック」
または「銃」法と呼ばれる。

【０１２１】イオン性（静電性）相互作用は、陽性電荷と陰性電荷との、または部分的陽性
電荷と部分的陰性電荷との引力による、２つまたはそれ以上の物質の非共有結合
である。

【０１２２】濃縮核酸：ポリマーを濃縮する方法は、その直線的長さを低減させることとし
て定義され、圧縮とも呼ばれる。ポリマーを濃縮することはまた、ポリマーが占
める容量を減少させることを意味する。核酸を濃縮する例は、細胞中に存在する
DNAの濃縮である。ヒトの細胞のDNAは、長さが約1mであるが、約10ミクロンの直
径を有する細胞核中に適合するように濃縮される。細胞は、ヒストンや他の染色
体タンパク質を含む一連のパッケージング機構によりDNAを濃縮（または圧縮）
してヌクレオソームやクロマチンを形成する。これらの構造中のDNAは、ヌクレ
アーゼ（DNase）の作用に対して部分的に耐性になる。ポリマーを濃縮するプロ
セスは、生物の細胞中にこれらを送達するのに使用することができる。送達され
たポリマーは、内因性遺伝物質とは別に、細胞質または核内に留まることができ
る。あるいはポリマーは、内因性遺伝物質と再結合（一部になる）することがで
きる。例えばDNAは、相同的組換えまたは非相同的組換えにより染色体DNA中に挿
入される。

【０１２３】脈管内：脈管内投与経路は、送達すべきポリマーまたはポリヌクレオチドが、
細胞に直接注入されるより均等に分散されかつ効率的に発現されることを可能に
する。本明細書において脈管内とは、体内で組織または臓器に連結している脈管
と呼ばれる管状構造内を意味する。管状構造の空隙内で、体液は体の各部を行き
来する。体液の例には、血液、リンパ液、または胆汁がある。脈管の例には、動
脈、細動脈、毛細管、細静脈、洞様毛細血管、静脈、リンパ管、および胆管があ
る。脈管内投与は、動脈または静脈のような血管を介する送達を含む。

【０１２４】粘膜を含む投与経路は、経鼻、気管支、肺への吸入、または眼からの投与を含
む。

【０１２５】バッファーは、弱酸または弱塩基およびこれらの塩から作成される。バッファ
ーは、溶液中に追加の酸または塩基が加えられた時、pHの変化に対抗する。生物
学的、化学的、または生化学的反応は、イオン結合および／または共有結合の生
成または切断を含む。生体分子とは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵
素、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ウイルス、抗原、炭水化物（およ
び結合体）、脂質、および糖を意味する。酵素は、化学反応を触媒する特定の機
能のために、生きた生物の細胞から生成するタンパク質である。化学反応は、共
有結合またはイオン結合の生成または切断として定義される。化学反応の結果と
して、ポリマーが形成される。ポリマーは、３つ以上のモノマーを含有する化合
物として定義される。モノマーは、それ自身にまたは他のモノマーに結合でき、
従ってポリマーを形成することができる化合物である。

【０１２６】経皮とは、皮膚層を通過して薬剤送達が起きる、哺乳動物の皮膚への適用であ
る。

【０１２７】炭化水素とは、炭素と水素原子を含有することを意味し、ハロ炭化水素とは、
炭素、ハロゲン（F, Cl, Br. I）、および水素原子を含有することを意味する。

【０１２８】アルキルは、sp³混成炭素原子を含有することを意味する。アルケニルは、２
つ以上のsp²混成炭素原子を含有することを意味する。アルキニルは、２つ以上
のsp混成炭素原子を含有することを意味する。アラルキルは、sp³混成炭素原子
以外に、１つ以上の芳香環を含有することを意味する。アラルケニルは、２つ以
上のsp²混成炭素原子以外に１つ以上の芳香環を含有することを意味する。アラ
ルキニルは、２つ以上のsp混成炭素原子以外に１つ以上の芳香環を含有すること
を意味する。ステロイドは、天然のおよび非天然のステロイドとステロイド誘導
体を含む。

【０１２９】ステロイド誘導体は、ステロール、ヒドロキシル部分が修飾（例えば、アシル
化）されているステロール、ステロイドホルモン、またはこれらの類似体を意味
する。

【０１３０】炭水化物は、天然のおよび非天然の糖（例えば、グルコース）、および糖誘導
体（糖誘導体は、糖部分上の１つ以上のヒドロキシル基が修飾（例えば、アシル
化）されている系、または１つまたはそれ以上のヒドロキシル基が存在しない系
を意味する）を含む。

【０１３１】ポリオキシエチレンは、2〜6個（n=2-3000）の酸化エチレン単位（-(CH₂CH₂O) _n- ）を有するポリマー、またはこれらの誘導体を意味する。

【０１３２】 Rは、任意の適合性のある基、例えば水素、アルキル、アルケニル、アルキニ
ル、アラルキル、アラルケニル、またはアラルキニルを意味し、ヘテロ原子（N,
O, S）およびカルボニル基を含んでよい。

【０１３３】化合物は、２つ以上の元素で構成される物質である。

【０１３４】電子吸引基は、電気陰性原子すなわち電子を引きつける原子からなる化学基ま
たは原子である。共鳴安定化は、パイ結合を介して複数の原子上に電荷を分布さ
せる能力である。分子の誘起効果とは、近くの電気陰性または電気陽性原子によ
る結合の分極が引き起こす電気密度のシフトである。

【０１３５】立体障害は、同じ分子上の隣接基のために、化学反応が妨害または遅延される
ことである。

【０１３６】活性化カルボキシレートは、求核物質と反応して新しい共有結合を形成するカ
ルボン酸誘導体である。求核物質には、窒素、酸素およびイオウを含有する化合
物であって、尿素、アミド、カーボネート、エステル、およびチオエステルを生
成する化合物を含む。カルボン酸は、種々の物質（カルボジイミド、カーボネー
ト、ホスホニウム、ウロニウムを含む）により活性化されて、活性化カルボキシ
レート、アシル尿素、アシルホスホネート、およびカーボネートを生成する。カ
ルボン酸の活性化を、ヒドロキシおよびアミン含有化合物と組合せて用いると、
活性化カルボキシレート、N-ヒドロキシスクシニミドエステル、ヒドロキシルベ
ンゾトリアゾールエステル、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-エンド-2,3-ジカル
ボキシイミドエステル、p-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエ
ステル、4-ジメチルアミノピリジニウムアミドおよびアシルイミダゾールを生成
することができる。

【０１３７】求核物質は、１つ以上の電子富化部位（例えば非共有電子対、極性結合の陰性
末端、またはパイ電子）を有する化学種である。

【０１３８】実施例実施例1：5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾエート）プロピニトリルの合成 5,5'-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（500mg、1.26mmol、アルドリッチケミ
カル社（Aldrich Chemical Company））を、4.0mlのジオキサン中に取った。ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（540mg、2.6mmol、アルドリッチケミカル社（Al
drich Chemical Company））と3-ヒドロキシプロピオニトリル（240μl、188mg
、2.60mmol、アルドリッチケミカル社（Aldrich Chemical Company））を加えた
。反応混合物を室温で一晩攪拌した。沈殿物を遠心分離して除去し、減圧下で溶
媒を濃縮した。残渣を飽和重炭酸ナトリウム、水、およびブラインで洗浄し、硫
酸マグネシウム上で乾燥した。

【０１３９】溶媒を除去（アスピレーター）して、696mgの黄色／橙色の泡状物を得た。残
渣を、正常相のHPLC（Alltech econosil, 250×22nm）、流速＝9.0ml/分、移動
相＝クロロホルム中1％エタノール、保持時間＝13分を使用して精製した。溶
媒を除去（アスピレーター）して、233mg（36.8％）の5,5'-ジチオビス（2-ニト
ロベンゾエート）プロピオニトリルを黄色の油状物として得た。TLC（シリカ：
クロロホルム中5％メタノール、Rf＝0.51）。H¹ NMR δ8.05 (d, 4H), 7.75 (m,
4H), 4.55 (t, 4H), 2.85 (t, 4H)。

【０１４０】実施例2：ジメチル5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾエート）プロピオンイミデート2HClの合成 5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾエート）プロピオニトリル（113mg, 0.226m
mol）を500μlの無水クロロホルム中に取った。無水メタノール（20.0μl, 0.49
4mmol, アルドリッチケミカル社（Aldrich Chemical Company））を加えた。得
られた溶液を氷浴で0℃に冷却し、HClガスを溶液中に10分間バブリングさせた。
得られた溶液を、-20℃のフリーザー中に48時間置いた。この間に黄色の油状物
が生成した。この油状物をクロロホルムで十分に洗浄し、減圧下で乾燥して、13
7mg（95.8％）のジメチル5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾエート）プロピオン
イミデート2HClを黄色の泡状物として得た。

【０１４１】実施例3：DNA鋳型へのN-(2-アミノエチル)-1,3-プロパンジアミンとジメチル5,5 '-ジチオビス（2-ニトロベンゾエート）プロピオンイミデート2HClの重合操作：鋳型重合を、25mMヘペス緩衝液（pH8.0）中で行った。N-(2-アミノエチル)-1,
3-プロパンジアミン（48μg、0.3mM、アルドリッチケミカル社（Aldrich Chemic
al Company））を、pCIIuc DNAの0.5ml溶液（25mg、リン酸中0.075mM、2.6μg/
μl pCIIuc；Danko, I., Williams, P., Herweijer, H. ら、Hum. Mol. Genetic
s (1997)（印刷中）に従って調製した）に加えた。ジメチル5,5'-ジチオビス（2
-ニトロベンゾエート）プロピオンイミデート2HCl（500μg, 0.78mM）を加え、
溶液をボルテックス混合した。反応物を室温で１時間インキュベートした。この
インキュベーション中、細かい黄色の沈殿物の生成が観察された。反応物を遠心
分離して、沈殿物を除去した。反応物の一部（10μl）を10mMのジチオスレイト
ール（10μl）で還元して、ポリマーを形成しているジスルフィド結合を破壊し
た。無傷のポリマーと還元ポリマーの一部（0.5μg）を、1％アガロースゲルで
分析した。

【０１４２】実施例4：DNA/ポリ-L-リシン/ジメチル5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾエート）プロピオンイミデート2HCl複合体の生成プラスミドDNA（25μg）を、0.5mlの25mMヘペス緩衝液（pH8.0）中のポリ-L-
リシンヒドロブロマイド（95μg、MW 35kDa、アルドリッチケミカル社（Aldrich
Chemical Company））と一緒にして、pDNA/ポリ-L-リシンヒドロブロマイド複
合体を調製し、溶液をボルテックス混合した。得られた溶液を3つに分けた。１
つは、室温で2時間インキュベートした。第２サンプルに、ジメチル5,5'-ジチオ
ビス（2-ニトロベンゾエート）プロピオンイミデート2HCl（472mg、1.5mmol）を
加え、溶液を混合し、室温で２時間インキュベートした。第３のサンプルには、
ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート（1.1mg、1.5mmol）を加え、溶
液を混合し、室温で２時間インキュベートした。２時間後、サンプルを12000rpm
で５分間遠心分離した。

【０１４３】 90度光散乱測定を行った（Shimadzo RF-1501蛍光分光光度計）。波長設定は、
入射光と散乱光の検出の両方について700nmとした。両方の光線のスリットを10n
mに固定した。得られた複合体の粒子サイズを、光散乱により測定した（Brookha
ven ZetaPlus Particle Sizer）。散乱光の初期強度を測定後、15μlの５M NaCl
溶液を複合体に加え、散乱光の強度を追跡した。

【０１４４】非ケージ化粒子に塩を添加すると、溶液の濁度が即座に上昇し、これは凝集を
示していた。非ケージ化サンプルもまた、明らかに濁った。ジメチル3,3'-ジチ
オビスプロピオンイミデートを使用してケージ化した粒子に塩を添加すると、濁
度が約33％増加した。ジメチル5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾエート）プロ
ピオンイミデート2HClケージ化複合体に塩を添加しても、濁度は見た目では上昇
しなかった。ジメチル5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾエート）プロピオンイ
ミデート2HClケージ化粒子のサイズを、150mM NaCl（生理学的濃度）中で測定し
た（Brookhaven Zeta Plus Particle Sizer）。平均粒子径は、89.7nmであり、
粒子の総数の67％は、100nm未満であった。

【０１４５】本例は、ジメチル5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾエート）プロピオンイミ
デート2HClがDNAをケージ化したことを示す。生成した粒子は、生理学的塩中で
安定であり、サイズは100nm未満であった。

【０１４６】実施例5：インビトロのジスルフィド結合の被還元性の証明 pDNA（pCI Luc）／ポリエチレンイミン（25kDa、アルドリッチケミカル社（Al
drich Chemical Company））／ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート
とpDNA／ポリエチレンイミン／ジメチル5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾエー
ト）プロピオンイミデート2HCl複合体を、25mMヘペス緩衝液（pH8.0）中で調製
した。すべての複合体は、pDNA／ポリエチレンイミン比を1/3で調製した。ジメ
チル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデートとジメチル5,5'-ジチオビス（2-ニト
ロベンゾエート）プロピオンイミデート2HClは、以下の比で加えた：0, 3, 6, 1
2, および25。複合体を室温で0.5時間インキュベートし、12,000rpmで５分間遠
心分離してからトランスフェクションを行った。トランスフェクションは35mmウ
ェル中で行った。トランスフェクションの時、約50％コンフルエンスのHepG2単
層を、PBS（リン酸緩衝化生理食塩水）で１回洗浄し、次に無血清培地（Opti-ME
M、ギブコビーアールエル（Gibco BRL））中で保存した。複合体をOpti-MEM中に
希釈し、滴下して5.0μg DNA／ウェルで細胞に加えた。37℃で４時間インキュベ
ート後、複合体を含有する培地を細胞から吸引し、完全増殖培地、10％胎児ウシ
血清補足DMEM（シグマ（Sigma））と交換した。さらに42時間インキュベーショ
ン後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ発現について測定した（Wolff, J. A., Ma
lone, R. W., Williamns, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A. および Felgn
er, P. L. in vivoでのマウス筋肉への直接遺伝子導入、Science 1465-1468 199
0）。Lumat LB9507を使用した（EG&G Berthold, Bad-Wildbad, ドイツ）。

【０１４７】 pDNA／ポリエチレンイミン／ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート
とpDNA／ポリエチレンイミン／ジメチル5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾエー
ト）プロピオンイミデート2HCl 粒子を、Hep G2細胞中にトランスフェクション
した。pDNA／ポリエチレンイミン複合体はまた、対照としてトランスフェクショ
ンした。次に細胞溶解物をルシフェリンの発現について分析した。結果は、ジメ
チル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート複合体は、ベースライン（<200 RLU
）より低い発現結果を与え、ジメチル5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾエート
）プロピオンイミデート2HCl／pDNA／ポリエチレンイミン複合体は、120,000 RL
Uという高い発現レベルを与えることを示す。

【０１４８】ジメチル5,5'-ジチオビス（2-ニトロベンゾエート）プロピオンイミデート2HC
l複合体中に存在する生理学的反応活性ジスルフィド結合は、培養細胞で還元す
ることができ、ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート複合体中のジス
ルフィド結合は還元できなかった。

【０１４９】実施例6：5,5'-ジチオビス［（3''-ブロモプロピル）-2-ニトロベンゾエート］
の合成 5,5'-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸）（500mg、1.26mmol、アルドリッチケミ
カル社（Aldrich Chemical Company））と3-ブロモプロパノール（368mg、2.65m
mol、アルドリッチケミカル社（Aldrich Chemical Company））を、7.0mlのTHF
中に取った。ジシクロヘキシルカルボジイミド（545mg、2.65mmol、アルドリッ
チケミカル社（Aldrich Chemical Company））を加え、反応混合物を周囲温度で
一晩攪拌した。沈殿物をろ過して除去し、溶液を減圧下で濃縮して、430mg（54
％）の5,5'-ジチオビス［（3''-ブロモプロピル）-2-ニトロベンゾエート］を黄
色の油状物として得た。

【０１５０】実施例7：5,5'-ジチオビス［（3''-アンモニオ-｛N,N-ジメチル-N-プロピオニトリル｝プロピルブロミド）-2-ニトロベンゾエート］の合成 5,5'-ジチオビス［（3''-ブロモプロピル）-2-ニトロベンゾエート］を2.0ml
のTHFに取り、3-ジメチルアミノプロピオニトリル（193mg、1.96mmol、アルドリ
ッチケミカル社（Aldrich Chemical Company））を加えた。周囲温度で３日間後
、溶液からEt₂Oで塩を沈殿させ、逆相HPLC（C-18 Aquasil 200×20 mm）で20〜8
0％メタノール勾配で20分かけて精製した（15分で溶出）。減圧下で溶媒を除去
して、15.2mg（3％）の5,5'-ジチオビス［（3''-アンモニオ-｛N,N-ジメチル-N-
プロピオニトリル｝プロピルブロミド）2-ニトロベンゾエート］を得た。H¹-NMR
（CD₃OD）δ8.4-8.6 (m, 6H), 5.0 (t, 4H), 4.35 (t, 4H), 4.1 (m, 4H), 2.85
(m, 4H), 3.75 (m, 16H)。

【０１５１】ジメチル5,5'-ジチオビス［（3''-アンモニオ-（N,N-ジメチル-N-プロピオイミ
デート）プロピルクロリド）2-ニトロベンゾエート］塩酸塩の合成実施例8：5,5'-ジチオビス［（3''-アンモニオ-（N,N-ジメチル-N-プロピオイミデート）プロピルクロリド）2-ニトロベンゾエート］の合成 5,5'-ジチオビス［（3''-アンモニオ-｛N,N-ジメチル-N-プロピオニトリル｝
プロピルブロミド）2-ニトロベンゾエート］（15.2mg、0.018mmol）を1mlのメタ
ノールに取った。溶液をHClで0℃で飽和させた。得られた溶液を-20℃に１週間
維持した。Et₂Oを加え、沈殿物をろ過して集め、8.3mg（47％）のジメチル5,5'-
ジチオビス［（3''-アンモニオ-（N,N-ジメチル-N-プロピオイミデート）プロピ
ルクロリド）2-ニトロベンゾエート］塩酸塩を得た。

【０１５２】実施例9：N,N'-ビス（t-BOC)-L-シスチンの合成アセトン（10ml）と水（10ml）中のL-シスチンの溶液（１gm、4.2mmol、アル
ドリッチケミカル社（Aldrich Chemical Company））に、2-（tert-ブトキシカ
ルボニルオキシイミノ）-2-フェニルアセトニトリル（2.5ｇm、10mmol、アルド
リッチケミカル社（Aldrich Chemical Company））とトリエチルアミン（1.4ml
、10mmol、アルドリッチケミカル社（Aldrich Chemical Company））を加えた。
反応物を室温で一晩攪拌した。次に回転蒸発により水とアセトンを除去して、黄
色の固形分を得た。次にジBOC化合物を、シリカゲル上のフラッシュクロマトグ
ラフィーで酢酸エチル0.1％酢酸で溶出して単離した。

【０１５３】実施例10：L-シスチン-1,4-ビス（3-アミノプロピル）ピペラジンコポリマーの
合成酢酸エチル（20ml）中のN,N'-ビス（t-BOC)-L-シスチンの溶液（85mg、0.15mm
ol）に、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（108mg、0.5mmol）とN-ヒドロ
キシスクシニミド（60mg、0.5mmol）を加えた。２時間後、綿栓で溶液をろ過し
、1,4-ビス（3-アミノプロピル）ピペラジン（54μl、0.25mmol）を加えた。反
応物を室温で16時間攪拌した。回転蒸発により酢酸エチルを除去し、得られた固
形分をトリフルオロ酢酸（9.5ml）、水（0.5ml）およびトリイソプロピルシラン
（0.5ml）中に溶解した。２時間後、回転蒸発によりトリフルオロ酢酸を除去し
、水溶液を、水（２×２リットル）に対して15,000MWカットオフチューブで24時
間透析した。次に透析チューブから溶液を取り出し、５μMナイロンシリンジフ
ィルターでろ過し、次に凍結乾燥して、30mgのポリマーを得た。

【０１５４】実施例11：グアニジノ-L-シスチンの合成スクリュー栓をしたバイアル中のシスチン（1gm、4.2mmol）を含む水酸化アン
モニウム（10mL）溶液に、O-メチルイソウレア-水素-スルファート（1.8gm、10m
mol）を加えた。バイアルをシールし、60℃に16時間加熱した。その後、溶液を
冷却し、水酸化アンモニウムを回転蒸発により除去した。その後、固体を水（20
ml）に溶解し、綿栓を通して濾過した。その後、生成物をイオン交換クロマトグ
ラフィーによりBio-Rex 70樹脂を使い塩酸（100mM）で溶出して単離した。

【０１５５】実施例12：グアニジノ-L-シスチン1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポ
リマーの合成グアニジノ-L-シスチン（64mg、0.2mmol）を含む水溶液（10 mL）に、N,N'-ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（82mg、0.4mmol）およびN-ヒドロキシスクシン
イミド（46mg、0.4mmol）を含むジオキサン（5mL）を徐々に加えた。16時間後、
溶液を綿栓を通して濾過し、そして1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン（40
μL、0.2mmol）を加えた。室温で16時間攪拌して反応を行い、その後、水溶液を
15,000MWカットオフチューブ中で水（2 X 2L）に対して24時間透析した。その後
、溶液を透析チューブから取り出し、5μMナイロンシリンジフィルターを通して
濾過し、その後、凍結乾燥してポリマー5mgを得た。

【０１５６】実施例13：pDNA-L-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー複合体およびDNA-グアニジノ-L-シスチン1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジ
ンコポリマー複合体の粒子サイズ pDNA(10μg/mL)を含む0.5mL 25mM HEPESバッファーpH 7.5溶液に、L-シスチン
-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマーまたはグアニジノ-L-シスチ
ン1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー10μg/mLを加えた。DNAと
ポリマーとの複合体のサイズを測定した。両方のポリマーについて、粒子のサイ
ズは約60nmであった。

【０１５７】実施例14：DNAのL-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマーとの縮合およびグルタチオン添加によるDNAの脱縮合フルオレセイン標識したDNAを使って、L-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピ
ル)ピペラジンコポリマーとの複合体へのDNA縮合を測定した。Mirus' LabelIT^TM フルオレセインキットを使い、pDNAを1フルオレセイン/100塩基のレベルになる
ように修飾した。その蛍光を蛍光分光光度計（島津RF-1501蛍光分光光度計）を
使って、励起波長495nmおよび発光波長530nmで測定した（参照により本明細書に
組み入れられる、Trubetskoy, V.S., Slattum, P.M., Hagstrom, J.E., Wolff,
J.A., Budker, V.G., "Quantitative Assessment of DNA Condensation（DNA縮
合の定量的評価）" Anal. Biochem (1999)）。

【０１５８】 0.5mLの25mM HEPESバッファーpH7.5中のフルオレセイン標識したDNA（10μg/m
L）の蛍光強度は300単位であった。L-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピ
ペラジンコポリマー10μg/mLを加えると、強度は100単位に低下した。このDNAポ
リカチオンサンプルに、1mMグルタチオンを加えて蛍光強度を測定した。DNAサン
プル単独のときに観察されたレベルへの強度の増加が測定された。この蛍光の増
加の半減期は8分間であった。

【０１５９】この実験は、生理学的反応活性ジスルフィドを含有するポリマーとのDNAの複
合体は生物学的還元剤グルタチオンの存在下で切断可能であることを示す。

【０１６０】実施例15：DNA-L-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー
複合体およびDNA-グアニジノ-L-シスチン1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジ
ンコポリマー複合体のマウス尾静脈注射 ICRマウスの尾静脈へのプラスミド送達を記載したように実施した。PCIL_UC DN
A（50μg）を含む2.5mL H₂Oに、L-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラ
ジンコポリマー、グアニジノ-L-シスチン1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジ
ンコポリマー、またはポリ-L-リシン（34,000MW、Sigma Chemical Company）（5
0μg）を加えた。その後、該サンプルを、マウスの尾静脈中に30ゲージ、0.5イ
ンチ針を使って注射した。注射の1日後に動物を犠牲にし、ルシフェラーゼアッ
セイを実施した。

【０１６１】ポリカチオン ng/肝臓ポリ-L-リシン 6.2 L-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー 439 グアニジノ-L-シスチン1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー 487 実験は、生理学的反応活性ジスルフィドを含有するポリマーとのDNAの複合体
は分解可能であり、それによってルシフェラーゼ遺伝子が発現されることを示す
。

【０１６２】実施例16：DNA-L-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー
複合体およびDNA-グアニジノ-L-シスチン1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジ
ンコポリマー複合体のラット筋内注射ラット脚内へのプラスミド送達を、記載されたように実施した（Wolff, J.A.,
Malone, R.W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G. Jani, A.およびFelgner
, P.L., Direct gene transfer into mouse muscle in vivo（マウス筋内へのin
vivoでの直接遺伝子導入）， Science, 1465-1468, 1990）。pCIL_UC DNA（100
μg/mL、2.5mL）に、L-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリ
マーまたはグアニジノ-L-シスチン1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポ
リマー（100μg/mL）を加え、その後、ラットの脚筋肉内に注射した。7日後、動
物を犠牲にし、ルシフェラーゼアッセイを実施した。

【０１６３】DNA複合体ルシフェラーゼ量(ng)／脚ポリカチオンなし 3.3 L-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー 4.5 グアニジノ-L-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー 6.
5 実験は、生理学的反応活性ジスルフィドを含有するポリマーとのDNAの複合体
は分解可能であり、それによってルシフェラーゼ遺伝子が発現されることを示す
。

【０１６４】実施例17：DNA-L-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー
複合体およびpDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-
アミノプロピル)ピペラジンコポリマー複合体およびpDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン-フォレートコポリマー複合体の、マウス腸管腔内への注射 pDNA溶液を腸間膜の脈管構造に注射して、腸管細胞をトランスフェクトした。
小腸の3cmの区画を鉗子ではさみ、血管への流入および流出を遮断した。50μg p
CI Lucおよび50μgポリ(エチレンイミン)（Aldrich Chemical Co. MW 25,000MW
）、L-シスチン-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー、pDNA(pCI
Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラ
ジンコポリマー、およびpDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,
4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン-フォレートコポリマー複合体を含む250μ
l容量溶液を、マウスの腸管腔内に注射した。3分後、鉗子を外した。DNA送達の1
日後、マウスを犠牲にし、注射した腸の区画を切り取り、3cm区画に切断し、ル
シフェラーゼ発現についてアッセイした。腸の様々な領域（十二指腸、空腸、回
腸）を標的とした。

【０１６５】ルシフェラーゼ量（pg）複合体十二指腸空腸回腸 DNA-ポリ(エチレンイミン) 0.5 3.0 1.7 DNA-L-シスチン-1,4-ビス (3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー 6.2 3.7 2.8 pDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス (2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス (3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー 42 20 226 pDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス (2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス (3-アミノプロピル)ピペラジン -フォレートコポリマー 36 1.9 51 実験は、反応活性ジスルフィドを含有するポリマーとのDNAの複合体は分解可
能であり、それによってルシフェラーゼ遺伝子が発現されることを示す。

【０１６６】実施例18：5,5'-ジチオビス[スクシンイミジル(2-ニトロベンゾエート)]の合成 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)（50.0mg、0.126mmol、Aldrich Chemical
Company）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（29.0mg、0.252mmol、Aldrich C
hemical Company）を1.0mLジクロロメタン中に取った。ジクロロヘキシルカルボ
ジイミド（52.0mg、0.252mmol）を加え、反応混合物を一夜、室温で攪拌した。1
6時間後、反応混合物をEtOAc/H₂O中で分配した。有機層を2 x H₂O、1 x ブライ
ンで洗浄し、乾燥し（MgSO₄）、そして減圧下で濃縮した。残留物をCH₂Cl₂中に
取り、濾過し、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより（13
0 x 30 mm、EtOA_C:CH₂Cl₂ 1:9溶出剤）精製して42 mg（56%）5.5'-ジチオビス[
スクシンイミジル(2-ニトロベンゾエート)]を白色固体として得た。H¹NMR(DMSO)
; δ7.81-7.77(d,2H), 7.57-7.26(m,4H), 3.69(s,8H)実施例19：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマーの合成 1,4−ビス(3−アミノプロピル)ピペラジン（10μL、0.050 mmol、Aldrich Che
mical Company）を1.0 mLメタノール中に取り、HCl（2 mL、Et₂O中1M、Aldrich
Chemical Company）を加えた。Et₂Oを加え、得たHCl塩を濾過して回収した。塩
を1mL DMF中に取り、5,5'-ジチオビス[スクシンイミジル(2-ニトロベンゾエート
)]（30mg、0.050mmol）を加えた。得られた溶液を80℃に加熱し、ジイソプロピ
ルエチルアミン（35μL、0.20mmol、Aldrich Chemical Company）を滴下して加
えた。16時間後、溶液を冷却し、3mL H₂Oで希釈し、12,000〜14,000MWカットオ
フチューブ中で水（2 X 2L）に対して24時間透析した。その後、溶液を透析チュ
ーブから取り出し、凍結乾燥により乾燥して23mg（82%）の5,5'-ジチオビス(2-
ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマーを得た。

【０１６７】実施例20：pDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-ア
ミノプロピル)ピペラジンコポリマー複合体の粒子サイズ測定 50μg pDNAを含むリンゲル液（0.85%塩化ナトリウム、0.03%塩化カリウム、0.
03%塩化カルシウム）3mLに、170μg 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-
ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマーを加えた。粒子サイズ測定（Broo
khaven Instruments社、ゼータプラス粒子サイズ測定器（ZetaPlus Particle Si
zer）、I90、532nm）は該複合体に対して92nmの有効径を示した。50μg pDNAを
含むリンゲル液サンプル3mLは粒子形成を示さなかった。

【０１６８】 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン
コポリマーはpDNAと縮合して、小さい粒子を形成する。

【０１６９】実施例21：pDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-ア
ミノプロピル)ピペラジンコポリマー複合体のマウス尾静脈注射４つの複合体を次の通り調製した：複合体I：pDNA（pCI Luc、200μg）をH₂O 1mL中に取り、注射前に9mLリンゲル液
で希釈する。

【０１７０】複合体II：pDNA（pCI Luc、200μg）をポリ-L-リシン（378μg、MW3400、Sigma
Chemical Company）を含むH₂O 1mLと混合し、注射前に9mLリンゲル液で希釈する
。

【０１７１】複合体III：pDNA（pCI Luc、200μg）を5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,
4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー(400μg)を含むH₂O 1mLと混合
し、注射前に9mLリンゲル液で希釈する。

【０１７２】複合体IV：pDNA（pCI Luc、200μg）をヒストンH1（1.2mg、Sigma Chemical Com
pany）を含むH₂O 1mLと混合し、注射前にリンゲル液9mLで希釈する。

【０１７３】複合体の2.5mLおよび250μLの尾静脈注射を実施した（本明細書に参照により
組み入れられる、Zhang, G., Budker, V., Wolff, J., High Levels of Foreign Gene Expression in Hepatocytes from Tail Vein Injections of Naked Plasm id DNA（裸のプラスミドDNAの尾静脈注射から得られる肝細胞中の高いレベルの
外来遺伝子発現） Human Gene Therapy , July, 1999）。報告した結果は肝発現
に対するものである。ルシフェラーゼ発現を先に報告されたように測定した（Wo
lff, J.A., Malone, R.W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G. Jani, A.お
よびFelgner, P.L., Direct gene transfer into mouse muscle in vivo（マウ
ス筋内へのin vivoでの直接遺伝子導入）， Science, 1465-1468, 1990）。Luma
t LB 9507（EG&G Berthold, Bad-Wildbad. ドイツ）ルミノメーターを使った。

【０１７４】 2.5mL注射から得た結果複合体I： 1,976,000 複合体II： 128,000 複合体III： 5,025,000 複合体IV： 1,960 250μL注射から得た結果複合体I： 985 複合体III： 1,140 結果は、pDNA/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピ
ル)ピペラジンコポリマー複合体のルシフェラーゼ発現の増加したレベルが、pCI
LucDNAそのもの、pCI Luc DNA/ポリ-L-リシン複合体、およびpCI LucDNA/ヒス
トンH1複合体を上回ることを示した。これらの結果はまた、pDNAがpDNA/5,5'-ジ
チオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマ
ー複合体から遊離され、転写に利用可能であることも示す。250μL注射の結果は
、pDNA/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペ
ラジンコポリマー複合体とpCI LucDNAの両方に類似したものであった。

【０１７５】実施例22：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン-トリス(2-アミノエチル)アミンコポリマーの合成 1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン（2.4μL、0.012mmol、Aldrich Chemi
cal Company）およびトリス(2-アミノエチル)アミン（0.51μL、0.0034mmol、Al
drich Chemical Company）を0.5mLメタノール中に取り、HCl（1mL、Et₂O中1M、A
ldrich Chemical Company）を加えた。Et₂Oを加えて生じたHCl塩を濾過して回収
した。5,5'-ジチオビス[スクシンイミジル(2-ニトロベンゾエート)]（10mg、0.0
16mmol）を加え、該混合物を0.4mL DMSOおよび0.4mL THF中に取った。得られた
溶液を室温で攪拌し、ジイソプロピルエチルアミン（5.9μL、0.042mmol、Aldri
ch Chemical Company）を滴下して加えた。16時間後、溶液を3mL H₂Oで希釈し、
12,000〜14,000MWカットオフチューブ中で、水（2 X 2L）に対して48時間透析し
た。その後、溶液を透析チューブから取り出し、凍結乾燥して2.7mg(30%)の5,5'
-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン-トリ
ス(2-アミノエチル)アミンコポリマーを得た。

【０１７６】実施例23：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレンペンタミンコポリマーの合成テトラエチレンペンタミン（3.2μL、0.017mmol、Aldrich Chemical Company
）を1.0mLジクロロメタン中に取り、HCL（1mL、Et₂O中1M、Aldrich Chemical Co
mpany）を加えた。Et₂Oを加えて生じたHCl塩を濾過して回収した。該塩を1mL DM
F中に取り、5,5'-ジチオビス[スクシンイミジル(2-ニトロベンゾエート)]（10mg
、0.017mmol）を加えた。得た溶液を80℃に加熱し、ジイソプロピルエチルアミ
ン（15μL、0.085mmol、Aldrich Chemical Company）を滴下して加えた。16時間
後、溶液を冷却し、3mL H₂Oで希釈し、12,000〜14,000MWカットオフチューブ中
で、水（2 X 2L）に対して24時間透析した。その後、溶液を透析チューブから取
り出し、凍結乾燥して5.8mg（62%）の5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-テト
ラエチレンペンタミンコポリマーを得た。

【０１７７】実施例24：pDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレンペンタミンコポリマー複合体のマウス尾静脈への注射複合体は次のように調製した：複合体I：pDNA（pCI Luc、200μg）を300μL DMSOに加え、その後、2.5mLリンゲ
ル液を加えた。

【０１７８】複合体II：pDNA（pCI Luc、200μg）を300μL DMSOに加え、その後、5,5'-ジチ
オビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレンペンタミンコポリマー（336μg）を
加え、続いて2.5mLリンゲル液を加えた。

【０１７９】複合体の2.5mL尾静脈注射を先に記載したように実施した。報告した結果は肝
発現に対するものであり、2匹のマウスの平均である。ルシフェラーゼ発現を先
に報告されたように測定した（Wolff, J.A., Malone, R.W., Williams, P., Cho
ng, W., Acsadi, G. Jani, A.およびFelgner, P.L., Direct gene transfer int
o mouse muscle in vivo（マウス筋内へのin vivoでの直接遺伝子導入）， Scie
nce, 1465-1468, 1990）。Lumat LB 9507（EG&G Berthold, Bad-Wildbad. ドイ
ツ）ルミノメーターを使った。

【０１８０】 250μL注射複合体I： 25,200,000 複合体II： 21,000,000 結果は、pDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレン
ペンタミンコポリマー複合体は、pCI Luc DNAそのものの2.5mL注射とほぼ等価で
あることを示した。これは、pDNAは複合体から遊離され、転写に利用可能である
ことを示す。

【０１８１】実施例25：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレンペンタミン-ト
リス(2-アミノエチル)アミンコポリマーの合成テトラエチレンペンタミン（2.3μL、0.012mmol、Aldrich Chemical Company
）およびトリス(2-アミノエチル)アミン（0.51μL、0.0034mmol、Aldrich Chemi
cal Company）を0.5mLメタノール中に取り、HCL（1mL、Et₂O中1M、Aldrich Chem
ical Company）を加えた。Et₂Oを加えて生じたHCl塩を濾過して回収した。該塩
を1mL DMF中に取り、5,5'-ジチオビス[スクシンイミジル(2-ニトロベンゾエート
)]（10mg、0.017mmol）を加えた。得た溶液を80℃に加熱し、ジイソプロピルエ
チルアミン（15μL、0.085mmol、Aldrich Chemical Company）を滴下して加えた
。16時間後、溶液を冷却し、3mL H₂Oで希釈し、12,000〜14,000MWカットオフチ
ューブ中で、水（2 X 2L）に対して24時間透析した。その後、溶液を透析チュー
ブから取り出し、凍結乾燥して6.9mg（77%）の5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香
酸)-テトラエチレンペンタミン-トリス(2-アミノエチル)アミンコポリマーを得
た。

【０１８２】実施例25：pDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレンペンタミン-トリス(2-アミノエチル)アミンコポリマー複合体のマウス尾静脈注
射複合体は次のように調製した：複合体I：pDNA（pCI Luc、200μg）を300μL DMSOに加え、その後、2.5mLリンゲ
ル液を加えた。

【０１８３】複合体II：pDNA（pCI Luc、200μg）を300μL DMSOに加え、その後、5,5'-ジチ
オビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレンペンタミン-トリス(2-アミノエチル)
アミンコポリマー（324μg）を加え、続いて2.5mLリンゲル液を加えた。

【０１８４】複合体の2.5mL尾静脈注射を先に記載したように実施した。報告した結果は肝
発現に対するものであり、2匹のマウスの平均である。ルシフェラーゼ発現を先
に報告されたように測定した（Wolff, J.A., Malone, R.W., Williams, P., Cho
ng, W., Acsadi, G. Jani, A.およびFelgner, P.L., Direct gene transfer int
o mouse muscle in vivo（マウス筋内へのin vivoでの直接遺伝子導入）， Scie
nce, 1465-1468, 1990）。Lumat LB 9507（EG&G Berthold, Bad-Wildbad. ドイ
ツ）ルミノメーターを使った。

【０１８５】 250μL注射複合体I： 25,200,000 複合体II： 37,200,000 pDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレンペンタミ
ン-トリス(2-アミノエチル)アミンコポリマー複合体は、pCI Luc DNAそのものの
2.5mL注射よりも有効であり、そのことは、pDNAが複合体から遊離され、転写に
利用可能であることを示す。

【０１８６】実施例26：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-N,N'-ビス(2-アミノエチル)-1, 3-プロパンジアミンコポリマーの合成 N,N'-ビス(2-アミノエチル)-1,3-プロパンジアミン（2.8μL、0.017mmol、Ald
rich Chemical Company）を1.0mLジクロロメタン中にとり、HCL（1mL、Et₂O中に
1M、Aldrich Chemical Company）を加えた。Et₂Oを加えて生じたHCl塩を濾過し
て採取した。該塩を1mL DMF中にとり、5,5'-ジチオビス[スクシンイミジル(2-ニ
トロベンゾエート)]（10mg、0.017mmol）を加えた。得られた溶液を80℃に加熱
し、ジイソプロピルエチルアミン（12μL、0.068mmol、Aldrich Chemical Compa
ny）を滴下して加えた。16時間後、溶液を冷却し、3mL H₂Oで希釈し、12,000〜1
4,000MWカットオフチューブ中で、水（2 X 2L）に対して24時間透析した。その
後、溶液を透析チューブから取出し、凍結乾燥して5.9mg（66%）の5,5'-ジチオ
ビス(2-ニトロ安息香酸)-N,N'-ビス(2-アミノエチル)-1,3-プロパンジアミンコ
ポリマーを得た。

【０１８７】実施例27：pDNA（pCI Luc）/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-N,N'-ビス(2- アミノエチル)-1,3-プロパンジアミンコポリマー複合体のマウス尾部静脈への注射複合体は次のように調製した：複合体I：pDNA（pCI Luc、200μg）を300μL DMSOに加え、その後、2.5mLリンゲ
ル液を加えた。

【０１８８】複合体II：pDNA（pCI Luc、200μg）を300μL DMSOに加え、その後、5,5'-ジチ
オビス(2-ニトロ安息香酸)-N,N'-ビス(2-アミノエチル)-1,3-プロパンジアミン
コポリマー（474μg）を加え、続いて2.5mLリンゲル液を加えた。

【０１８９】複合体の2.5mL尾部静脈注射を先に記載したように実施した。報じた結果は肝
発現に対するものであり、2匹のマウスの平均である。ルシフェラーゼ発現は先
に報じたように測定した。

【０１９０】結果： 2.5mL注射複合体I： 25,200,000 複合体II： 341,000 pDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレンペンタミ
ンコポリマー複合体は、ルシフェラーゼ発現をもたらし、pDNAが複合体から遊離
され、転写にアクセス可能であることを示す。

【０１９１】実施例28：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-N,N'-ビス(2-アミノエチル)-1, 3-プロパンジアミン-トリス(2-アミノエチル)アミンコポリマーの合成 N,N'-ビス(2-アミノエチル)-1,3-プロパンジアミン（2.0μL、0.012mmol、Ald
rich Chemical Company）およびトリス(2-アミノエチル)アミン（0.51μL、0.00
34mmol、Aldrich Chemical Company）を0.5mLメタノール中にとり、HCL（1mL、E
t₂O中に1M、Aldrich Chemical Company）を加えた。Et₂Oを加えて生じたHCl塩を
濾過して採取した。該塩を1mL DMF中にとり、5,5'-ジチオビス[スクシンイミジ
ル(2-ニトロベンゾエート)]（10mg、0.017mmol）を加えた。得られた溶液を80℃
に加熱し、ジイソプロピルエチルアミン（12μL、0.068mmol、Aldrich Chemical
Company）を滴下して加えた。16時間後、溶液を冷却し、3mL H₂Oで希釈し、12,
000〜14,000MWカットオフチューブ中で、水（2 X 2L）に対して24時間透析した
。その後、溶液を透析チューブから取出し、凍結乾燥して6.0mg（70%）の5,5'-
ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-N,N'-ビス(2-アミノエチル)-1,3-プロパンジア
ミン-トリス(2-アミノエチル)アミンコポリマーを得た。

【０１９２】実施例29：pDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-N,N'-ビス(2-アミノエチル)-1,3-プロパンジアミン-トリス(2-アミノエチル)アミンコポリマー
複合体のマウス尾部静脈への注射複合体は次のように調製した：複合体I：pDNA（pCI Luc、200μg）を300μL DMSOに加え、その後、2.5mLリンゲ
ル液を加えた。

【０１９３】複合体II：pDNA（pCI Luc、200μg）を300μL DMSOに加え、その後、5,5'-ジチ
オビス(2-ニトロ安息香酸)-N,N'-ビス(2-アミノエチル)-1,3-プロパンジアミン-
トリス(2-アミノエチル)アミンコポリマー（474μg）を加え、続いて2.5mLリン
ゲル液を加えた。

【０１９４】複合体の2.5mL尾部静脈注射を先に記載したように実施した。報じた結果は肝
発現に対するものであり、2匹のマウスの平均である。ルシフェラーゼ発現を先
に報じたように測定した。

【０１９５】結果： 2.5mL注射複合体I： 25,200,000 複合体II： 1,440,000 結果は、pDNA(pCI Luc)/5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-N,N'-ビス(2-ア
ミノエチル)-1,3-プロパンジアミン-トリス(2-アミノエチル)アミンコポリマー
複合体は、2.5mL注射のpCI Luc DNAより効果が低かったことを示す。該複合体は
効果は低いが、ルシフェラーゼ発現は、pDNAが複合体から遊離され、転写にアク
セス可能であることを示す。

【０１９６】実施例30：pDNA（pCI Luc）/生理学的反応活性ジスルフィド結合を含有するポリマーのマウスに対する筋内注射 7つの複合体を次の通り調製した：複合体I：pDNA(pCI Luc、40μg)を586μLグルコース(290mM)-HEPES(5mM、pH 8)
に加えた。

【０１９７】複合体II：pDNA(pCI Luc、40μg)を577μLグルコース(290mM)-HEPES(5mM、pH 8)
に加えた。この溶液に、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミ
ノプロピル)ピペラジンコポリマー(9μL、200μg)を加えた。

【０１９８】複合体III：pDNA(pCI Luc、40μg)を573μLグルコース(290mM)-HEPES(5mM、pH 8
)に加えた。この溶液に、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミ
ノプロピル)ピペラジンコポリマー(13μL、200μg)を加えた。

【０１９９】複合体IV：pDNA(pCI Luc、40μg)を574μLグルコース(290mM)-HEPES(5mM、pH 8)
に加えた。この溶液に、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレンペ
ンタミンコポリマー(12μL、70μg）を加えた。

【０２００】複合体V：pDNA(pCI Luc、40μg)を576μLグルコース(290mM)-HEPES(5mM、pH 8)
に加えた。この溶液に、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレンペ
ンタミン-トリス(2-アミノエチル)アミンコポリマー(10μL、65μg）を加えた。

【０２０１】複合体VI：pDNA(pCI Luc、40μg)を581μLグルコース(290mM)-HEPES(5mM、pH 8)
に加えた。この溶液に、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-N,N'-ビス(2-アミ
ノエチル)-1,3-プロパンジアミンコポリマー(5μL、94μg）を加えた。

【０２０２】複合体VII：pDNA(pCI Luc、40μg)を570μLグルコース(290mM)-HEPES(5mM、pH 8
)に加えた。この溶液に、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-N,N'-ビス(2-ア
ミノエチル)-1,3-プロパンジアミン-トリス(2-アミノエチル)アミンコポリマー(
16μL、94μg）を加えた。

【０２０３】複合体150μLの直接筋注射は、先に記載されたように実施した（本明細書に参
照により組み入れられる、Budker, V., Zhang, G., Danko, I., Williams, P.,
およびWolff, J., "The Efficient Expression Of Intravascularly Delivered
DNA In Rat Muscle（静脈内送達されたDNAのラット筋における効率的発現）", G
ene Therapy 5, 272-6(1998)；Wolff, J.A., Malone, R.W., Williams, P., Cho
ng, W., Acsadi, G. Jani, A.およびFelgner, P.L., Direct gene transfer int
o mouse muscle in vivo（マウス筋内へのin vivoでの直接遺伝子導入）， Scie
nce, 1465-1468, 1990、を参照）。注射の7日後に、動物を犠牲にし、筋を収穫
した。サンプルをluxバッファー（1mL）中でホモジナイズし、4000 RPMで15分間
遠心分離した。ルシフェラーゼ発現を先に報じた通り測定した。左四頭筋（left
quadracep）：右四頭筋に対する結果を報じた（複合体IVは左四頭筋のみに注射
した）。

【０２０４】結果： pCI Luc DNA／生理学的反応活性ジスルフィド結合を含有するポリマーから調
製した複合体は直接筋注射で有効である。ルシフェラーゼ発現は、pDNAが複合体
から遊離され、転写にアクセス可能であるということを示している。5,5'-ジチ
オビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコポリマー
を用いて調製した複合体が最も効率的であり、pDNAの2〜10倍高いルシフェラー
ゼ発現レベルがもたらされた。

【０２０５】実施例31：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-ペンタエチレンヘキサミンコポリマーの合成ペンタエチレンヘキサミン（4.2μL、0.017mmol、Aldrich Chemical Company
）を1.0mLジクロロメタン中にとり、HCL（1mL、Et₂O中の1M、Aldrich Chemical
Company）を加え、Et₂Oを加えて生じたHCl塩を濾過して採取した。該塩を1mL DM
F中にとり、5,5'-ジチオビス[スクシンイミジル(2-ニトロベンゾエート)]（10mg
、0.017mmol）を加えた。得られた溶液を80℃に加熱し、ジイソプロピルエチル
アミン（12μL、0.068mmol、Aldrich Chemical Company）を滴下して加えた。16
時間後、溶液を冷却し、3mL H₂Oで希釈し、12,000〜14,000MWカットオフチュー
ブ中で、水（2 X 2L）に対して24時間透析した。その後、溶液を透析チューブか
ら取出し、凍結乾燥して5.9mg（58%）の5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-ペ
ンタエチレンヘキサミンコポリマーを得た。

【０２０６】実施例32：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-ペンタエチレンヘキサミン-ト
リス(2-アミノエチル)アミンコポリマーの合成ペンタエチレンヘキサミン（2.9μL、0.012mmol、Aldrich Chemical Company
）およびトリス(2-アミノエチル)アミン(0.51μL、0.0034mmol Aldrich Chemica
l Company)を0.5mLメタノール中にとり、HCL（1mL、Et₂O中に1M、Aldrich Chemi
cal Company）を加え、Et₂Oを加えて生じたHCl塩を濾過して採取した。該塩を1m
L DMF中にとり、5,5'-ジチオビス[スクシンイミジル(2-ニトロベンゾエート)]（
10mg、0.017mmol）を加えた。得られた溶液を80℃に加熱し、ジイソプロピルエ
チルアミン（12μL、0.068mmol、Aldrich Chemical Company）を滴下して加えた
。16時間後、溶液を冷却し、3mL H₂Oで希釈し、12,000〜14,000MWカットオフチ
ューブ中で、水（2 X 2L）に対して24時間透析した。その後、溶液を透析チュー
ブから取出し、凍結乾燥して6.0mg（64%）の5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸
)-ペンタエチレンヘキサミン-トリス(2-アミノエチル)アミンコポリマーを得た
。

【０２０７】実施例33：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-N-(3-アミノプロピル)-1,3-プ
ロパンジアミンコポリマーの合成 5,5'-ジチオビス[スクシンイミジル(2-ニトロベンゾエート)]（2.5mg、0.0042
mmol）をDMF 10μL中にとった。N-(3-アミノプロピル)-1,3-プロパンジアミン(0
.6μL、0.004mmol、Aldrich Chemical Company)の10μLをHEPES 250mM、pH 7.5
の10μLと共に加えた。1時間後、溶液を減圧下で濃縮した。得られた残留物を0.
42mL DMSO中に溶解した。該溶液のSDS-PAGE上の分析は、ポリ-L-リシン臭化水素
酸（分子量1000、7500、15000）と比較して、該ポリマーが約3500〜8000の分子
量範囲にあることを示した。

【０２０８】実施例34：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン-葉酸コポリマーの合成葉酸-PEG(3400 MW)-NH₂を公知の方法（Lee, R.J., Low, P.S., Biochimica et
Biophysica Acta 1233, 1995, 134-144）により調製した。葉酸-PEG-NH₂をスク
シニル化N-(3-(BOC)アミノプロピル)-1,3-プロパンアミン(BOC)アミンを用いて
アシル化した。BOC保護基を除去して葉酸モノマーを得た。

【０２０９】 1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン(5.0μL、0.023mmol、Aldrich Chemic
al Company)および葉酸モノマー(5.0mg、0.0012mmol)を0.4mLメタノール中にと
り、HCL（1mL、Et₂O中に1M、Aldrich Chemical Company）を加えた。得られた懸
濁液を減圧下で濃縮し、白色固体を得た。該塩を0.5mL DMF中にとり、5,5'-ジチ
オビス[スクシンイミジル(2-ニトロベンゾエート)]（14mg、0.025mmol）を加え
た。得られた溶液を80℃に加熱し、ジイソプロピルエチルアミン（18μL、0.10m
mol、Aldrich Chemical Company）を滴下して加えた。16時間後、溶液を冷却し
、3mL H₂Oで希釈し、12,000〜14,000MWカットオフチューブ中で、水（2 X 2L）
に対して24時間透析した。その後、溶液を透析チューブから取出し、凍結乾燥し
て13mg（68%）の5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピ
ル)ピペラジン-葉酸コポリマーを得た。

【０２１０】実施例35：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-ポリ-グルタミン酸(8量体)コポリマーの合成 H₂N-EEEEEEEE-NHCH₂CH₂NH₂（5.0mg, 0.0052mmol、Genosis）を0.1mL HEPES(25
0mM、pH 7.5)中にとり、5,5'-ジチオビス[スクシンイミジル(2-ニトロベンゾエ
ート)]（3.1mg、0.0052）を0.2mL DMSOと共に加え、混合物を一夜、室温で攪拌
した。16時間後、溶液を70℃に10分間加熱し、室温に冷却し、DMSOを用いて1.10
mLに希釈した。

【０２１１】実施例36：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-ポリ-グルタミン酸(8量体)コポリマーを用いる複合体形成フルオレセイン標識したDNAを、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-ポリ-グ
ルタミン酸(8量体)コポリマーとの複合体中のDNA縮合の測定に使った。pDNAを、
Mirus' LabelIT^TMフルオレセインキットを使い1 フルオレセイン/20塩基のレベ
ルに修飾した。蛍光を蛍光分光光度計（島津RF-1501蛍光分光光度計）を使って
、励起波長497nmおよび発光波長520nmで測定した。

【０２１２】フルオレセイン標識したDNA（10μg）を含む1mL HEPES（25mM、pH 7.5）に、
ポリオルニチン（18μg、Sigma Chemical Company）を加えた。混合物を5分間室
温に保ち、蛍光を測定した（参照により本明細書に組み入れられる、Trubetskoy
, V.S., Slattum, P.M., Hagstrom, J.E., Wolff, J.A., Budker, V.G., "Quant
itative Assessment of DNA Condensation（DNA縮合の定量的評価）" Anal. Bio
chem (1999)）。蛍光強度はDNA縮合により低下するので、結果は、ポリオルニチ
ンがDNAを圧縮することを示す。得られた複合体に、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ
安息香酸)-ポリ-グルタミン酸(8量体)コポリマー（60μg）を加え、蛍光を再び
測定した。サンプルの蛍光はさらに低下した。

【０２１３】 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-ポリ-グルタミン酸(8量体)コポリマーを
サンプルに加えると、蛍光は低下し、３重複合体の形成を示した。5,5'-ジチオ
ビス(2-ニトロ安息香酸)-ポリ-グルタミン酸(8量体)コポリマーのポリオルニチ
ンに対する競合は観察されなかった（蛍光の増加）。

【０２１４】実施例37： 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-ポリ-グルタミン酸(8量体)コ
ポリマーによる3T3細胞のトランスフェクション 3つの複合体を作製した。

【０２１５】複合体I) 300μL-Opti-MEMにLT-1^TM（12μg、Mirus Corporation）を加え、続
いてpDNA（pCI Luc、4μg）を加えた。

【０２１６】複合体II) 300μL-Opti-MEMにLT-1^TM（12μg、Mirus Corporation）を加え、続
いてpDNA（pCI Luc、4μg）、そして5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-ポリ-
グルタミン酸(8量体)コポリマー（4μg）を加えた。

【０２１７】複合体III) 300μL-Opti-MEMにLT-1^TM（12μg、Mirus Corporation）を加え、
続いてpDNA（pCI Luc、4μg）、そしてポリ-グルタミン酸（4μg、MW 49000、Si
gma Chemical Company）を加えた。

【０２１８】トランスフェクションは35mmウエル中で実施した。トランスフェクションの時
に、約50%集密度の3T3細胞を、１回PBS（リン酸バッファー生理食塩水）で洗浄
し、続いて無血清培地（2.0mL、Opti-MEM、Gibco BRL）中に保存した。各ウエル
に150μLの複合体を加えた。37℃で3.25時間のインキュベーションした後、複合
体を含有する培地を細胞から吸引し、完全増殖培地、10%ウシ胎児血清を含むDME
M（Sigma）と置き換えた。さらに48時間のインキュベーションの後、細胞を収穫
し、溶解物をルシフェラーゼ発現に対して先に報じられたように（Wolff, J.A.,
Malone, R.W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G. Jani, A.およびFelgner
, P.L., Direct gene transfer into mouse muscle in vivo（マウス筋内へのin
vivoでの直接遺伝子導入）， Science, 1465-1468, 1990）アッセイした。Luma
t LB 9507（EG&G Berthold, Bad-Wildbad. ドイツ）ルミノメーター（luminomet
er）を使った。

【０２１９】結果：複合体I： RLU=17,000,000 複合体II： RLU=14,000,000 複合体III： RLU=26,000,000 トランスフェクション実験におけるポリ-グルタミン酸（4μg、MW 49000、Sig
ma Chemical Company）の添加はpDNA発現を改善した。5,5'-ジチオビス(2-ニト
ロ安息香酸)-ポリ-グルタミン酸(8量体)コポリマー（4μg）の添加はpDNA発現を
改善しなかったが発現を損なうことはなかった。

【０２２０】実施例38：5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)を含有するコポリマーのグルタ
チオンによる還元の実証 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン
コポリマー（100μg）を含むHEPES（25mM、pH 8）溶液0.5mLに、グルタチオン（
最終濃度2mM）を加えた。サンプルの吸収をλ412で（切断したジスルフィドは最
大吸収をλ412に有する；Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques（バイオコ
ンジュゲート技術）, Academic Press, New York, New York, 1996, pp 88、を
参照）、時間に対して測定した（Beckman DU-7分光光度計）。

【０２２１】 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレンペンタミンコポリマー（
50μg）を含むHEPES（25mM、pH 8）溶液0.5mLに、グルタチオン（最終濃度2mM）
を加えた。サンプルの吸収をλ412で（切断したジスルフィドは最大吸収をλ412
に有する；Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques（バイオコンジュゲート
技術）, Academic Press, New York, New York, 1996, pp 88、を参照）、時間
に対して測定した（Beckman DU-7分光光度計）。

【０２２２】 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-ポリ-グルタミン酸(8量体)コポリマー（
50μg）を含むHEPES（25mM、pH 8）溶液0.5mLに、グルタチオン（最終濃度2mM）
を加えた。サンプルの吸収をλ412で（切断したジスルフィドは最大吸収をλ412
に有する；Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques（バイオコンジュゲート
技術）, Academic Press, New York, New York, 1996, pp 88、を参照）、時間
に対して測定した（Beckman DU-7分光光度計）。

【０２２３】各サンプルはグルタチオンを添加すると、λ412での吸収が急速に増加し、ジ
スルフィド結合の切断を示した。半減期は次の通りであった： 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジンコ
ポリマー t_1/2＝42秒 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-テトラエチレンペンタミンコポリマー t₁ _/2 ＝75秒 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)-ポリ-グルタミン酸(8量体)コポリマー t₁ _/2 ＝24秒実験は、生理学的還元剤グルタチオンによる5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香
酸)-を含有するコポリマーのジスルフィド結合の急速な切断を実証する。

【０２２４】以上は、本発明の原理の説明としてだけ考えられる。さらに、当業者であれば
多数の修飾と改変を容易に行うことができるので、本発明を、示しかつ記載した
構成と方法に厳密に限定することは望ましくない。従って、全ての適当な改変お
よび均等物は本発明の範囲内に含まれる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ジスルフィド含有化合物に結合している生物学的に活性な化
合物であって、該ジスルフィド含有化合物が、（ａ）酸化型グルタチオンよりも
迅速に切断されるジスルフィド結合、および（ｂ）チオールから構成され、その
構成成分チオールの１つがグルタチオンよりも低いpKaを有するジスルフィド結
合、および（ｃ）遊離チオールからの分子内攻撃により活性化されるジスルフィ
ド結合、からなる群から選ばれる反応活性なジスルフィド結合を有するものであ
る生物学的に活性な化合物。
【請求項２】前記ジスルフィド含有化合物がポリマーを含む、請求項１に
記載の化合物。
【請求項３】前記ポリマーがポリカチオン、ポリアニオン、中性ポリマー
および両親媒性ポリマーからなる群から選ばれる、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】前記生物学的に活性な化合物がポリヌクレオチドである、請
求項１に記載の化合物。
【請求項５】前記生物学的に活性な化合物がポリペプチドである、請求項
１に記載の化合物。
【請求項６】前記ジスルフィド含有化合物がリガンドを含む、請求項１に
記載の化合物。
【請求項７】生物に挿入するための化合物であって、（ａ）酸化型グルタ
チオンよりも迅速に切断されるジスルフィド結合、および（ｂ）チオールから構
成され、その構成成分チオールの１つがグルタチオンよりも低いpKaを有するジ
スルフィド結合、および（ｃ）遊離チオールからの分子内攻撃により活性化され
るジスルフィド結合、からなる群から選ばれる生理学的条件下で反応活性なジス
ルフィド結合を有する化合物。
【請求項８】前記化合物が両親媒性化合物を含む、請求項７に記載の化合
物。
【請求項９】前記化合物がポリマーを含む、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】前記ポリマーがポリカチオン、ポリアニオン、中性ポリマ
ーおよび両親媒性ポリマーからなる群から選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】前記化合物がリガンドを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】生物で用いるための、反応活性なジスルフィド結合を有す
る化合物を形成するための方法であって、ａ）(i)酸化型グルタチオンよりも迅速に切断されるジスルフィド結合、およ
び(ii) チオールから構成され、その構成成分チオールの１つがグルタチオンよ
りも低いpKaを有するジスルフィド結合、および(iii)遊離チオールからの分子内
攻撃により活性化されるジスルフィド結合、からなる群から選ばれるジスルフィ
ド結合を有する化合物を形成すること、ｂ）該化合物を該生物に挿入することを含む、方法。
【請求項１３】前記化合物がポリマーを含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】前記ポリマーがポリカチオン、ポリアニオン、中性ポリマ
ーおよび両親媒性ポリマーからなる群から選ばれる、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】前記の反応活性なジスルフィド結合を有する化合物が生物
学的に活性な化合物と結合している、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】前記生物学的に活性な化合物がポリヌクレオチドである、
請求項15に記載の方法。
【請求項１７】前記生物学的に活性な化合物がポリペプチドである、請求
項15に記載の方法。
【請求項１８】前記ジスルフィドが二官能性分子である、請求項12に記載
の方法。