CN105315374A

CN105315374A - 二硫键稳定的多价抗体

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Publication number: CN105315374A
Application number: CN201510638852.8A
Authority: CN
Inventors: R·亚当斯; L·汉库克; S·P·海伍德
Original assignee: UCB Pharma SA
Current assignee: UCB Pharma SA
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2010-09-24
Publication date: 2016-02-10
Also published as: IN2012DN02535A; GB201005063D0; WO2011036460A1; ES2736649T3; EA201200526A1; JP2016106126A; CA2773286C; CN102549018B; JP2013505923A; CA2773286A1; JP5931730B2; US20120316324A1; TR201910213T4; EP2480577A1; CN102549018A; EP2480577B1; BR112012006492A2

Abstract

多价抗体融合蛋白，其包含对于目的抗原具有第一特异性的免疫球蛋白部分，例如Fab或Fabˊ片段，且进一步包含其为VH/VL对的对于第二目的抗原具有特异性的两个单域抗体(dAb)，其中所述两个单域抗体通过二硫键连接。还提供的是通过二硫键稳定的特定双特异性抗体融合蛋白及其他抗体片段。

Description

二硫键稳定的多价抗体

本申请是申请号为201080042387.7的专利申请的分案申请。

本发明涉及新的双特异性抗体融合蛋白质。此类抗体包含针对目的抗原的第一特异性，和针对第二目的抗原(例如用于延长它们的体内血清半衰期的血清载体蛋白)的第二特异性。还提供用于产生此类分子的方法和包含它们的药物组合物。

抗体的高特异性和亲合性使得它们成为理想的诊断和治疗试剂，特别是用于调节蛋白：蛋白相互作用。重组抗体技术领域的发展已导致抗体片段例如Fv、Fab、Fab'和F(ab')₂片段及其他抗体片段的产生。这些较小的分子保留了完整抗体的抗原结合活性并且还可以呈现与完整免疫球蛋白分子相比改善的组织穿透和药物动力学性质。甚至，从最近成功的产品(例如并且)来看，抗体片段经证明是多用途的治疗剂。虽然此类片段显现出许多优于完整免疫球蛋白的优点，但它们也受累于增加的血清清除率，因为它们缺乏赋予其体内长存在期的Fc结构域(Medasan等人，1997，J.Immunol.158:2211-2217)。

之前已经描述了具有双特异性的抗体，即其与两个不同的抗原结合(关于综述,参见Segal等人,1999,Curr.Opin.Immunol.11:558-562；Plückthun&Pack,1997,Immunotechnology,3:83-105；Fischer和Leger,2007,Pathobiology,74,3-14)。WO02/02773、US2007065440、US2006257406、US2006106203和US2006280734中也描述了双特异性抗体。之前的制备异-双特异性基于抗体的分子的方法通常使用化学交联或者蛋白质工程技术。化学交联受累于异-和同二聚体形成的低产量以及它们随后的色谱分离的要求。蛋白工程方法已经进行了非常详细的描述(例如knobs-into-holesengineering；Ridgway等人，1996，ProteinEng.9(7):617-621)或已经用于具有不适当的稳定性特征的分子(例如双抗体(diabody)，scFv)。在一些情况下，双特异性抗体还可受累于空间位阻问题，其使得两个抗原不能同时结合到各个抗体臂。

单可变结构域抗体又名单域抗体或dAb，相当于抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。Ward等人，1989，Nature，341，544-546已经描述了鼠单域抗体。也已经描述了人和"骆驼化(camelised)"人单域抗体(Holt等人，2003，TrendsinBiotechnology，21，484-490)。也已经从骆驼(骆驼和美洲驼)和软骨鱼(斑纹须鲨和铰口鲨)中获得了单域抗体。这些生物已经进化出高亲和力单V样结构域(骆驼中称为VhH，鲨鱼中称为V-NAR)，所述结构域装配到Fc-等价恒定结构域构架作为它们的免疫系统的完整和重要的元件(关于综述，参见Holliger&Hudson；2005，NatureBiotechnology，23(9):1126-1136)。

EP0368684中已经描述了单域抗体-酶融合物，WO2004/058820中也已经描述了单域效应子群融合物，其包含单可变结构域。WO2007/024715中已经描述了双可变结构域免疫球蛋白。EP1517921中已经描述了包含具有不同特异性的两个单域抗体的双特异性配体。

用于改进抗体片段例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂及其他抗体片段的半衰期的方法是已知的。一种方法将所述片段与聚合物分子缀合。因此，通过与聚乙二醇(PEG；参见，例如WO98/25791、WO99/64460和WO98/37200)缀合改善动物中Fab'、F(ab')₂片段的短的循环半衰期。另一种方法通过与和FcRn受体相互作用的试剂缀合来修饰抗体片段(参见例如WO97/34631)。另一个用于延长半衰期的方法使用结合血清白蛋白的多肽(参见例如Smith等人，2001，BioconjugateChem.12:750-756；EP0486525；US6267964；WO04/001064；WO02/076489；和WO01/45746)。然而，仍然需要产生具有长的体内半衰期的抗原结合免疫球蛋白，作为具有长的半衰期的免疫球蛋白的替代物，因为它们与FcRn受体相互作用，不必通过与PEG缀合进行化学修饰或与人血清白蛋白缀合。

多种蛋白质存在于血浆中并且包括甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白、α1酸糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白，或其任何片段。体内的血清载体蛋白循环具有以天计的半衰期，例如对于甲状腺素结合蛋白，5天或对于转甲状腺素蛋白，2天(Bartalena&Robbins，1993，ClinicsinLab.Med.13:583-598)，或碘化α1酸糖蛋白的周转的第二阶段，65小时(Bree等人，1986，Clin.Pharmacokin.11:336-342)。来自Gitlin等人(1964，J.Clin.Invest.10:1938-1951)的数据表明孕妇中，α1酸糖蛋白的半衰期是3.8天，转铁蛋白12天和纤维蛋白原2.5天。血清白蛋白是血管和血管外区室中丰富的蛋白，其在人体中具有大约19天的半衰期(Peters，1985，AdvProteinChem.37:161-245)。这与IgG1的半衰期(大约21天)相似(Waldeman&Strober，1969，Progr.Allergy，13:1-110)。

本发明提供了改善的双特异性抗体融合蛋白，其可以重组产生并且能够同时结合两个抗原，特别是两个不同/相异抗原。

因此，本发明提供双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分(例如Fab或Fab'片段)，并且进一步包含具有对第二目的抗原的特异性的单域抗体(dAb)，特别地其中第一抗原和第二抗原是不同的实体。

如本文使用的，单域抗体并非指单链Fv。单链Fv特征在于彼此连接的2个可变结构域，其形成独立实体，或仅通过其中的一个可变结构域与另一实体连接。

如本文使用的，多价是指具有两个或多个结合位点例如两个或三个结合位点(例如两个结合位点)的实体。各结合位点可以结合相同抗原上的相同表位或不同表位，或可以结合不同(相异)抗原。

本发明还提供双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分(例如Fab或Fab'片段)，并且进一步包含至少一个具有对第二目的抗原的特异性的单域抗体。

本发明的双特异性抗体融合物将能够选择性地结合两个目的抗原。

在一个实施方案中，第一和第二抗原是相同抗原。

在一个实施方案中，Fab或Fab'片段所结合的目的抗原可以是细胞相关蛋白，例如细胞(例如细菌细胞、酵母细胞、T细胞、内皮细胞或肿瘤细胞)上的细胞表面蛋白，或其可以是可溶性蛋白。目的抗原还可以是任何医学上相关的蛋白，例如在疾病或感染期间上调的那些蛋白，例如受体和/或它们相应的配体。细胞表面蛋白的具体实例包括粘着分子例如整联蛋白例如β1整联蛋白例如VLA-4、E-选择蛋白、P-选择蛋白或L-选择蛋白、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、CDW52、CD69、CD134(OX40)、ICOS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCP1、DPCR1、DPCR1、dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、连接素样2、NKCC1、PTK7、RAIG1、TCAM1、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌胚抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白(HMFG1和2)、MHCI类和MHCII类抗原、和VEGF，和当适当时，其受体。

可溶性抗原包括白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-16或IL-17)，病毒抗原(例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原)，免疫球蛋白(例如IgE)，干扰素(例如干扰素α、干扰素β或干扰素γ)，肿瘤坏死因子-α，肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子(例如G-CSF或GM-CSF)和血小板源性生长因子(例如PDGF-α和PDGF-β)和当适当时，其受体。其他抗原包括细菌细胞表面抗原、细菌毒素、病毒(例如流感病毒、EBV、HepA、B和C)、生物恐怖试剂、放射性核素和重金属、及蛇和蜘蛛毒和毒素。

在一个实施方案中，本发明的抗体融合蛋白质可以用于功能性地改变目的抗原的活性。例如，抗体融合蛋白质可以直接或间接地中和、拮抗或激动(agonise)所述抗原的活性。

在一个实施方案中，被本发明的双特异性抗体融合蛋白中的单域抗体结合的第二目的抗原可以是细胞相关蛋白，例如细胞(例如细菌细胞、酵母细胞、T细胞、内皮细胞或肿瘤细胞)上的细胞表面蛋白，或其可以是可溶性蛋白。目的抗原还可以是任何医学上相关的蛋白，例如在疾病或感染期间上调的那些蛋白，例如受体和/或它们相应的配体。细胞表面蛋白的特别的实例包括粘着分子例如整联蛋白例如β1整联蛋白例如VLA-4、E-选择蛋白、P-选择蛋白或L-选择蛋白、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、CDW52、CD69、CD134(OX40)、ICOS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCP1、DPCR1、DPCR1、dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、连接素样2、NKCC1、PTK7、RAIG1、TCAM1、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌胚抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白(HMFG1和2)、MHCI类和MHCII类抗原、和VEGF，和当适当时，其受体。

可以被单域抗体结合的其他抗原包括血清载体蛋白，允许细胞介导的效应子功能招募的多肽，和核素螯合蛋白。

因此，在一个实例中本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，所述蛋白包含具有针对目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分，并且进一步包含具有针对第二蛋白的特异性的单域抗体，后者提供招募效应子功能的能力，例如补体途径激活和/或效应子细胞招募。此外，本发明的融合蛋白可以用于通过与核素螯合蛋白结合的单域抗体螯合放射性核素。此类融合蛋白用于成像或用于治疗的放射性核素靶向方法。

因此，在一个实例中，提供分离的双特异性抗体融合蛋白质，其包含具有针对目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab'片段，所述片段与至少一个dAb融合，所述dAb具有针对招募多肽的特异性，所述dAb通过与所述招募多肽结合，直接或间接地提供招募细胞介导的效应子功能的能力。

可以直接招募效应子功能(effectorfunction)，因为效应子功能与细胞相关，所述细胞在它的表面上具有招募分子。当dAb与招募分子的结合引起例如可以直接或间接地招募效应子功能或可以经由信号传导途径活化的因子的释放时，可发生间接招募。实例包括TNFα、IL2、IL6、IL8、IL17、IFNγ、组胺、C1q、调理素及经典的和可选择的补体活化级联的其他成员，例如C2、C4、C3-转化酶，和C5至C9。

如本文使用的，"招募多肽"包括FcγR(例如FcγRI、FcγRII和FcγRIII)、补体途径蛋白(例如但不限于C1q和C3)、CD标志物蛋白(分化标志物群)(例如但不限于CD68、CD115、CD16、CD80、CD83、CD86、CD56、CD64、CD3、CD4、CD8、CD28、CD45、CD19、CD20和CD22)。其为CD标志物蛋白的其他招募多肽包括CD1,CD1d,CD2,CD5,CD8,CD9,CD10,CD11,CD11a,CD11b,CD11c,CD13,CD14,CD15,CD16,CD18,CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD24,CD25,CD26,CD27,CD28,CD29,CD30,CD31,CD32,CD33,CD34,CD35,CD36,CD37,CD38,CD40,CD43,CD44,CD45,CD46,CD49,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD52,CD53,CD54,CD55,CD56,CD58,CD59,CD61,CD62,D62E,CD62L,CD62P,CD63,CD64,CD66e,CD68,CD70,CD71,CD72,CD79,CD80,CD81,CD82,CD83,CD84,CD85,CD86,CD88,CD89,CD90,CD94,CD95,CD98,CD106,CD114,CD116,CD117,CD118,CD120,CD122,CD130,CD131,CD132,CD133,CD134,CD135,CD137,CD138,CD141,CD142,CD143,CD146,CD147,CD151,CD152,CD153,CD154,CD155,CD162,CD164,CD169,CD184,CD206,CD209,CD257,CD278,CD281,CD282,CD283和CD304，或保留直接或间接地招募细胞介导的效应子功能的能力的任何其片段。招募多肽还包括具有效应子功能的免疫球蛋白分子，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgA。

在一个实施方案中，dAb对其具有特异性的第二蛋白是补体途径蛋白，特别优选的是C1q。

在优选实施方案中，dAb对其具有特异性的第二蛋白是CD标志物蛋白，特别优选的是CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16和CD35。

因此，还提供分离的双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有特异性的抗体片段，所述片段与至少一个dAb融合，所述dAb对选自CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16和CD35的CD分子具有特异性。

在一个实施方案中，单域抗体为具有第一特异性的免疫球蛋白部分提供延长的半衰期。

因此，在一个实施方案中，提供双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab'片段，所述片段与至少一个单域抗体融合，所述单域抗体对血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子、或CD35/CR1具有特异性，所述单域抗体通过与所述血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1结合，为对所述目的抗原具有特异性的抗体片段提供延长的半衰期。

在一个实施方案中，提供分离的双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab'片段，所述片段与至少一个单域抗体融合，所述单域抗体对血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子、或CD35/CR1具有特异性，所述单域抗体通过与所述血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1结合，为对所述目的抗原具有特异性的抗体片段提供延长的半衰期。

如本文使用的，"血清载体蛋白"包括甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白、α1酸糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白、或任何其片段。

如本文使用的，"循环免疫球蛋白分子"包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、sIgA、IgM和IgD、或任何其片段。

CD35/CR1是在红细胞上存在的蛋白，其半衰期为36天(正常范围为28至47天；Lanaro等人，1971，Cancer，28(3):658-661)。

在优选实施方案中，dAb对其具有特异性的第二蛋白是血清载体蛋白，特别优选的是人血清载体蛋白。在非常优选的实施方案中，血清载体蛋白是人血清白蛋白。

因此，提供了双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab'片段，所述片段与对人血清白蛋白具有特异性的至少一种单域抗体融合。

在一个实施方案中，本发明提供分离的双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab'片段，所述片段与对人血清白蛋白具有特异性的至少一种单域抗体融合。

在一个实施方案中，对目的抗原具有特异性的抗体片段是Fab片段。在另一个实施方案中，对目的抗原具有特异性的抗体片段是Fab'片段。

因此,在一个优选的实施方案中，本发明的抗体融合蛋白是翻译融合蛋白，即基因融合物，其各个序列通过表达载体编码。可选地，已经使用化学方法(即通过化学缀合或化学交联)来将抗体融合蛋白的组分融合。所述化学方法是本领域已知的。

在一个实例中，抗体片段是具有天然或经修饰的绞链区的Fab'片段。当用于制备本发明的双特异性抗体融合蛋白质的抗体片段是Fab'片段时，通常在重链的C末端将所述片段延伸一个或多个氨基酸。因此，本发明的抗体融合物可以包括直接或经由连接体与dAb翻译融合(或化学融合)的Fab'片段。此外，适当的抗体Fab'片段的实例包括WO2005003170和WO2005003171中描述的那些。

在另一个实例中，抗体片段是Fab片段。因此，本发明的抗体融合物可以包括与连接体序列翻译融合(或化学融合)的Fab片段，所述连接体序列又与dAb翻译融合(或化学融合)。优选地，Fab片段是以链间半胱氨酸终止的Fab片段，如WO2005/003169中描述的。因此，在一个实例中，Fab片段在IgG1的位置233处终止。

本发明中使用的抗体Fab或Fab'片段可以来自任何物种，优选来源于单克隆抗体、人抗体，或是人源化片段。本发明所用的抗体片段可以来源于免疫球蛋白分子的任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亚类并且可以从任何物种(包括例如小鼠、大鼠、鲨鱼、兔子、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼、山羊或人)获得。

在一个实施方案中，抗体Fab或Fab'片段是单克隆、完全人、人源化或嵌合抗体片段。在一个实施方案中，抗体Fab或Fab'片段是完全人的或人源化的。

可以通过本领域已知的任何方法制备单克隆抗体，例如杂交瘤技术(Kohler&Milstein，Nature，1975，256，495-497)，三体杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，ImmunologyToday，1983，4，72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，"MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy"，pp.77-96，AlanR.Liss，Inc.，1985)。

还可以使用单淋巴细胞抗体法，通过克隆和表达免疫球蛋白可变区cDNA产生本发明使用的抗体，所述cDNA从选择用于产生特异性抗体的单淋巴细胞产生，通过例如Babcook，J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93(15)，7843-7848，WO92/02551，WO2004/051268和WO2004/106377描述的方法。

人源化抗体是具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区的来自非人物种的抗体分子(参见例如US5,585,089)。

还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生本发明使用的抗体，并且此类方法包括Brinkman等人，J.Immunol.Methods，1995，182，41-50；Ames等人，J.Immunol.Methods1995，184，177-186；Kettleborough等人Eur.J.Immunol.，1994，24952-958；Persic等人，Gene，1997187，9-18；和Burton等人，AdvancesinImmunology，1994，57，191-280；WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982和WO95/20401；和US5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743；和5,969,108中公开的方法。并且，转基因小鼠或其他生物(包括其他哺乳动物)可以用来产生人源化抗体。

完全人抗体是其中重链和轻链的可变区和恒定区(当存在时)全部为人来源，或与人来源的序列(不必来自相同抗体)基本上同一的那些抗体。完全人抗体的实例可以包括例如通过上述噬菌体展示方法产生的抗体和由其中鼠免疫球蛋白可变和/或恒定区基因已经被它们的人对应物取代的小鼠生产的抗体(例如，EP0546073B1、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425、US5,661,016、US5,770,429、EP0438474B1和EP0463151B1中一般性描述的)。

本发明使用的抗体Fab或Fab'片段的起始材料可以使用任何适当的酶切割和/或消化技术(例如通过用胃蛋白酶处理)获自任何完整抗体，特别是完整单克隆抗体。可选地，或另外，可以通过使用重组DNA技术(包括操作和重表达编码抗体可变和/或恒定区的DNA)制备抗体起始材料。标准分子生物学技术可以用于修饰、添加或缺失期望的氨基酸或结构域。如本文使用的，对可变或恒定区的任何改变仍然包括在术语"可变"和"恒定"区内。

抗体片段的起始材料可以获自任何物种，包括例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、骆驼、美洲驼、山羊或人。抗体片段部分可以获自一种以上的物种，例如抗体片段可以是嵌合的。在一个实例中，恒定区来自一个物种而可变区来自另一个物种。抗体片段的起始材料还可以是经修饰的。在另一个实例中，使用重组DNA工程技术产生抗体片段的可变区。此类工程改造的形式包括例如通过插入、缺失或改变天然抗体的氨基酸序列从天然抗体可变区产生的那些。这个类型的特别的实例包括那些工程改造的可变区结构域，所述结构域包含至少一个CDR和任选地，来自一个抗体的一个或多个构架氨基酸和来自第二抗体的可变区结构域的其他部分。产生和制造这些抗体片段的方法是本领域公知的(参见，例如，Boss等人，US4,816,397；Cabilly等人，US6,331,415；Shrader等人，WO92/02551；Ward等人，1989，Nature，341，544；Orlandi等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3833；Riechmann等人，1988，Nature，322，323；Bird等人，1988，Science，242，423；Queen等人，US5,585,089；Adair，WO91/09967；Mountain和Adair，1992Biotechnol.Genet.Eng.Rev，10，1-142；Verma等人，1998，JournalofImmunologicalMethods，216，165-181)。

在本发明中，与Fab或Fab'片段融合的各个单域抗体可以直接或经由连接体连接。

本文使用的直接连接是指，Fab或Fab'的"最后一个"氨基酸通过肽键与单域抗体的"第一个"氨基酸相连(或反之亦然)。

用于将dAb与Fab或Fab′连接的适当的连接体区域的实例包括但不限于，柔性连接体序列和刚性连接体序列。柔性连接体序列包括在Huston等人1988，PNAS85：5879-5883；Wright&Deonarain，Mol.Immunol.，2007，44(11)：2860-2869；Alfthah等人，Prot.Eng.，1995，8(7)：725-731；Luo等人，J.Biochem.，1995，118(4)：825-831；Tang等人，1996，J.Biol.Chem.271(26)：15682-15686；和Turner等人，1997，JIMM205，42-54中公开的那些(关于代表性实例，参见表1)。

表1.柔性连接体序列

SEQ ID NO：	序列
		1	SGGGGSE
2	DKTHTS
		3	(S)GGGGS

45	(S)GGGGSGGGGS
		46	(S)GGGGSGGGGSGGGGS
47	(S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
		48	(S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
4	AAAGSG-GASAS
		5	AAAGSG-XGGGS-GASAS
49	AAAGSG-XGGGSXGGGS-GASAS
		50	AAAGSG-XGGGSXGGGSXGGGS-GASAS
51	AAAGSG-XGGGSXGGGSXGGGSXGGGS-GASAS
		6	AAAGSG-XS-GASAS
7	PGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHY
		8	ATTTGSSPGPT
9	ATTTGS
		-	GS
10	EPSGPISTINSPPSKESHKSP
		11	GTVAAPSVFIFPPSD
12	GGGGIAPSMVGGGGS
		13	GGGGKVEGAGGGGGS
14	GGGGSMKSHDGGGGS
		15	GGGGNLITIVGGGGS
16	GGGGVVPSLPGGGGS
		17	GGEKSIPGGGGS
18	RPLSYRPPFPFGFPSVRP
		19	YPRSIYIRRRHPSPSLTT
20	TPSHLSHILPSFGLPTFN
		21	RPVSPFTFPRLSNSWLPA
22	SPAAHFPRSIPRPGPIRT
		23	APGPSAPSHRSLPSRAFG
24	PRNSIHFLHPLLVAPLGA
		25	MPSLSGVLQVRYLSPPDL
26	SPQYPSPLTLTLPPHPSL
		27	NPSLNPPSYLHRAPSRIS
28	LPWRTSLLPSLPLRRRP
		29	PPLFAKGPVGLLSRSFPP
30	VPPAPVVSLRSAHARPPY
		31	LRPTPPRVRSYTCCPTP-
32	PNVAHVLPLLTVPWDNLR
		33	CNPLLPLCARSPAVRTFP

S)在序列3和45-48中是任选的。

因此，在一个实施方案中，连接体具有序列GGGGSGGGGS(SEQIDNO：224。在一个实施方案中，连接体具有序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO：225)。

刚性连接体的实例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQIDNO：34)，PPPP(SEQIDNO：35)和PPP。

其他连接体包括ASTKGP(SEQIDNO：228)、TVAAP(SEQIDNO：229)。

在一个实施方案中，肽连接体是白蛋白结合肽。白蛋白结合肽的实例提供于WO2007/106120中，并且包括：

表2

SEQ ID NO：	序列
		208	DLCLRDWGCLW
209	DICLPRWGCLW
		210	MEDICLPRWGCLWGD
211	QRLMEDICLPRWGCLWEDDE
		212	QGLIGDICLPRWGCLWGRSV
213	QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK
		214	EDICLPRWGCLWEDD
215	RLMEDICLPRWGCLWEDD
		216	MEDICLPRWGCLWEDD
217	MEDICLPRWGCLWED
		218	RLMEDICLARWGCLWEDD
219	EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG
		220	RAPESFVCYWETICFERSEQ
221	EMCYFPGICWM

在一个实施方案中，本发明的分子在加至白蛋白结合肽连接体的或作为白蛋白结合肽连接体的替代物的位置中包含白蛋白结合肽。在体内，该肽结合白蛋白，这增加了分子的半衰期。

白蛋白结合肽可以由一个或多个可变区(例如在Fab中和/或在结构域抗体中)、铰链、连接体、分子的N末端或C末端、或其组合、或不干扰分子的抗原结合性质的任何位置追加。

在一个实施方案中，抗体铰链序列或其部分用作连接体，例如上面的铰链序列。通常，本发明使用的抗体Fab'片段具有天然或经修饰的绞链区。此类绞链区用作连接dAb部分的天然连接体。天然绞链区是通常与抗体分子的C_H1结构域结合的绞链区。经修饰的绞链区是在长度和/或组成上与天然绞链区不同的任何铰链区。此类铰链区可以包括来自任何其他物种的绞链区，例如人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、骆驼、美洲驼或山羊绞链区。其他经修饰的绞链区可以包括来源于与C_H1结构域不同的种类或亚类的抗体的完整绞链区。因此，例如γ1种类的C_H1结构域可以连接至γ4种类的绞链区。可选地，经修饰的绞链区可以包括重复单元或天然铰链的部分，在所述重复单元中重复的各个单元来源于天然绞链区。在进一步的可选方案中，可以通过将一个或多个半胱氨酸或其他残基转换为中性残基(例如丙氨酸)，或通过将合适位置的残基转换为半胱氨酸残基而改变天然绞链区。通过此类方法，可以增加或减少绞链区中的半胱氨酸残基的数目。另外，可以控制铰链的其他特征，例如从轻链链间半胱氨酸至铰链半胱氨酸的距离，铰链半胱氨酸之间的距离和铰链中其他氨基酸的组成(其可以影响铰链的性质(例如柔性))，例如甘氨酸可以掺入铰链以增加旋转柔性或脯氨酸可以掺入以减少柔性。可选地，带电或疏水残基的组合可以掺入铰链以赋予多聚化性质，参见例如Richter等人，2001，Prot.Eng.14(10):775-783(关于带电或离子尾部例如酸性尾部作为连接体的用途)和Kostelny等人，1992，J.Immunol.5(1):1547-1553(关于亮氨酸拉链序列)。其他经修饰的绞链区可以是完全合成的并且可以设计为具有想要的性质(例如长度、组成和柔性)。

大量的经修饰的绞链区已经被描述，例如描述于US5,677,425、US6642356、WO9915549、WO2005003170、WO2005003169、WO2005003170、WO9825971和WO2005003171中，其通过引用并入本文。此类铰链通常在CH1区之后，但也可以并入轻链κ或λ片段的恒定区的末端；例如，参见表3。

表3.铰链连接体序列

SEQ ID NO：	序列
		36	DKTHTCAA

37	DKTHTCPPCPA
		38	DKTHTCPPCPATCPPCPA
39	DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
		40	DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY
41	DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
		42	DKTHTCCVECPPCPA
43	DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
		44	DKTHTCPSCPA

可以使用本领域已知的方法产生本发明所用的单可变结构域(也称为单域抗体或dAb)并且所述方法包括WO2005118642、Ward等人，1989Nature，341，544-546和Holt等人，2003，TrendsinBiotechnology，21，484-490中公开的那些。在一个实施方案中，本发明所用的单域抗体是重链可变结构域(VH)或轻链结构域(VL)。各个轻链结构域可以是κ或λ亚群的结构域。本领域已经描述了用于分离VH和VL结构域的方法，参见例如EP0368684和Ward等人(同上)。此类结构域可以来源于任何适当的物种或抗体起始材料。在一个实施方案中，单域抗体可以来源于啮齿类、人或其他物种。在一个实施方案中，单域抗体是人源化的。

在一个实施方案中，单域抗体来源于噬菌体展示文库，使用例如WO2005/118642、Jespers等人，2004，NatureBiotechnology，22，1161-1165和Holt等人，2003，TrendsinBiotechnology，21，484-490中描述的方法。优选此类单域抗体是完全人的但也可以来源于其他物种。在一个实施方案中，单可变结构域是嵌合的，其中构架是人的或基本上人来源的且CDR是非人来源的。应理解，分离后，单域抗体的序列可以进行修饰以改进单域抗体的特征(例如可溶性)，如Holt等人(同上)中描述的。

如本文使用的，基本上人的是指，保留原始材料的人的特征，所述特征可以与免疫原性有关。基本上人的材料包括其中构架序列中的一个氨基酸被添加、缺失或被另一个氨基酸取代。

在一个实施方案中，dAb是获自scFv噬菌体展示或获自转基因Humouse^TM或Velocimouse^TM或人源化啮齿类动物的人序列。

在一个实施方案中，dAb获自人或人源化啮齿类动物，骆驼或鲨鱼。此类dAb优选是人源化的。在一个实例中，单域抗体是基于骆驼免疫球蛋白的VHH结构域，如EP0656946描述的。在一个实例中，用目的抗原免疫骆驼或美洲驼并且当滴度适当时收集血液。可以通过单细胞PCR克隆编码dAb的基因，或可以通过EBV转化或通过与永生化的细胞系融合来永生化编码dAb的B细胞。

如上文描述的，本发明提供双特异性抗体融合蛋白，所述蛋白包含对目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab'片段，所述片段直接或经由连接体与至少一个单域抗体融合，所述单域抗体具有针对第二目的抗原的特异性。

因此，在一个实施方案中，抗体片段，例如Fab或Fab'片段在重链或轻链可变区的N-末端与dAb直接或经由连接体融合。可选地，抗体Fab或Fab'片段在重链或轻链的C-末端与dAb直接或经由连接体融合。在另一个实施方案中，抗体Fab或Fab'片段的重链和轻链各自在C-末端与dAb直接或经由连接体融合。连接可以是化学缀合，但最优选是翻译融合，即基因融合，其中通过表达载体依次编码各自的序列。

一般地，将单域抗体的N-末端直接或经由连接体与Fab或Fab'片段的重链或轻链的C-末端融合，并且当将单域抗体与Fab或Fab'的N-末端融合时，其经由其C末端进行融合，任选地经由连接体。

在一个实施方案中，本发明提供双特异性抗体融合蛋白质，所述蛋白包含或由对目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab'片段组成，所述片段与单域抗体在重链或轻链的N-末端融合，所述单域抗体具有针对第二目的抗原的特异性。

在一个实施方案中，本发明提供双特异性抗体融合蛋白质，所述蛋白包含或由对目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab'片段组成，所述片段与单域抗体在重链或轻链的C-末端融合，所述单域抗体具有针对第二目的抗原的特异性。

在一个实施方案中，本发明提供双特异性抗体融合蛋白质，所述蛋白包含或由对目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab'片段组成，所述片段与至少一个单域抗体在重链或轻链的C-末端融合，所述单域抗体具有针对第二目的抗原的特异性。

在一个实施方案中，本发明提供双特异性抗体融合蛋白，所述蛋白包含或由对目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab'片段组成，所述片段与两个单域抗体融合，其中一个单域抗体与Fab或Fab'片段的轻链的C-末端融合且另一个单域抗体与Fab或Fab'片段的重链的C-末端融合，所述单域抗体具有针对第二目的抗原的特异性。

在一个实施方案中，当Fab或Fab'片段的重链和轻链各自在C-末端包括单域抗体时，两个单域抗体是等同的，即具有对相同抗原的相同结合特异性。在一个实例中，它们结合相同抗原上的相同表位。例如，单域抗体可以都是相同VHdAb，相同VHHdAb或相同VLdAb。

优选，当Fab或Fab'片段的重链和轻链各自在C-末端包含单域抗体时，两个单域抗体是协同结合抗原的互补的VH/VL对，即它们是具有相同结合特异性的互补的VH/VL对。在一个例子中，VH/VL对是单特异性的。通常，它们是来源于相同抗体的VH/VL对。在一个例子中，VH/VL对是作为来自‘对文库’(例如Fab噬菌体展示文库)的对分离的可变结构域对。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体融合蛋白包含两个单域抗体(其是互补的VH/VL对)，VH单域抗体与重链恒定区(CH1)的C-末端融合且VL单域抗体与轻链恒定区(Cκ或Cλ)的C-末端融合。在一个实施方案中，当本发明的双特异性抗体融合蛋白包含两个单域抗体(其是互补的VH/VL对)时，VL单域抗体与重链恒定区(CH1)的C末端融合且VH单域抗体与轻链恒定区(Cκ或Cλ)的C末端融合。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体融合蛋白包含两个单域抗体(其是互补的VH/VL对)，VH单域抗体与重链的N末端融合，并且VL单域抗体与轻链的N末端融合。在一个实施方案中，当本发明的双特异性抗体融合蛋白包含两个单域抗体(其是互补的VH/VL对)时，VL单域抗体与重链的N末端融合，并且VH单域抗体与轻链的N末端融合。在一个实施方案中，当本发明的双特异性抗体融合蛋白包含通过一个或多个二硫键连接的两个单域抗体(例如其为通过一个或多个(例如1或2个)二硫键连接的互补的VH/VL对的两个单域抗体)时，例如VH单域抗体与重链恒定区(CH1)的C末端融合，且VL单域抗体与轻链恒定区(Cκ或Cλ)的C末端融合，特征在于所述VH/VL对之间存在二硫键。可选地，VL单域抗体与重链恒定区(CH1)的C末端融合，且VH单域抗体与轻链恒定区(Cκ或Cλ)的C末端融合，特征在于所述VH/VL对之间存在二硫键。

在一个实施方案中，VH单域抗体与重链的N末端融合，并且VL单域抗体与轻链的N末端融合，特征在于所述VH/VL对之间存在二硫键。可选地，VL单域抗体与重链的N末端融合，并且VH单域抗体与轻链的N末端融合，特征在于所述VH/VL对之间存在二硫键。

在一个实施方案中，本发明提供了多价抗体融合蛋白，其包含对于目的抗原具有第一特异性的Fab或Fab'片段，且进一步包含对于第二目的抗原具有特异性的VH/VL对，其中VH/VL对通过在2个半胱氨酸残基(一个在VH中并且一个在VL中)之间的二硫键连接。

据认为，二硫键为构建体提供额外的稳定作用，这可以是有利的。优选地，VH/VL对通过单个二硫键连接。

一般地，VH/VL对通过在2个工程改造的半胱氨酸(一个在VH中并且一个在VL中)之间的单个二硫键彼此连接。

用于引入工程改造的半胱氨酸的合适位置是本领域已知的，其中一些在下文列出。应当理解，可以存在其他合适的位置。

在一个实施方案中，二硫键位于下述之间(除非上下文另有说明，否则在下文列表中采用Kabat编号(Kabat等人，1987，inSequencesofProteinsofImmunologicalInterest，USDepartmentofHealthandHumanServices，NIH，USA))：

·VH37+VL95C，参见例如ProteinScience6，781-788Zhu等人(1997)；

·VH44+VL100，参见例如，Biochemistry335451-5459Reiter等人(1994)；或JournalofBiologicalChemistry第269卷No.28第18327-18331页Reiter等人(1994)；或ProteinEngineering，第10卷no.12第1453-1459页Rajagopal等人(1997)；

·VH44+VL105，参见例如JBiochem.118，825-831Luo等人(1995)；

·VH45+VL87，参见例如ProteinScience6，781-788Zhu等人(1997)；

·VH55+VL101，参见例如FEBSLetters377135-139Young等人(1995)；

·VH100+VL50，参见例如Biochemistry291362-1367Glockshuber等人(1990)；

·VH100b+VL49；

·VH98+VL46，参见例如ProteinScience6，781-788Zhu等人(1997)；

·VH101+VL46或

·VH105+VL43，参见例如，Proc.Natl.Acad.Sci.USA第90卷第7538-7542页，Brinkmann等人(1993)；或Proteins19，35-47Jung等人(1994)。

·VH106+VL57，参见例如FEBSLetters377135-139Young等人(1995)。

上文列出的氨基酸对在有助于半胱氨酸替换的位置中，从而使得可以形成二硫键。半胱氨酸可以通过已知技术改造到这些位置上。

因此，在一个实施方案中，可变结构域对(VH/VL)通过在2个半胱氨酸残基(一个在VH中并且一个在VL中)之间的二硫键连接，其中半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH100b和VL49、VH98和VL46、VH101和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。

在一个实施方案中，可变结构域对(VH/VL)通过在2个半胱氨酸残基(一个在VH中并且一个在VL中)之间的二硫键连接，所述半胱氨酸残基在CDR之外，其中半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH98和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。

在一个实施方案中，可变结构域对(VH/VL)通过在2个半胱氨酸残基(一个在VH中并且一个在VL中)之间的二硫键连接，所述半胱氨酸残基在CDR之外，其中半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH98和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。

在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(VH/VL)通过在2个半胱氨酸残基之间的二硫键连接，其中VH的半胱氨酸残基在位置44上，并且VL的半胱氨酸残基在位置100上。

一般地，将半胱氨酸对改造到这些位置上，因此，在一个实施方案中，可变结构域对(VH/VL)通过在2个改造的半胱氨酸残基(一个在VH中并且一个在VL中)之间的二硫键连接，其中经改造的半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH100b和VL49、VH98和VL46、VH101和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。

在一个实施方案中，可变结构域对(VH/VL)通过在2个改造的半胱氨酸残基(一个在VH中并且一个在VL中)之间的二硫键连接，所述改造的半胱氨酸残基在CDR之外，其中经改造的半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH98和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。

在一个实施方案中，可变结构域对(VH/VL)通过在2个改造的半胱氨酸残基(一个在VH中并且一个在VL中)之间的二硫键连接，所述改造的半胱氨酸残基在CDR之外，其中经改造的半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH98和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。

在一个实施方案中，可变结构域对(VH/VL)通过在2个改造的半胱氨酸残基之间的二硫键连接，其中VH的经改造的半胱氨酸残基在位置44上，并且VL的经改造的半胱氨酸残基在位置100上。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了多价抗体融合蛋白，其包含对于目的抗原具有第一特异性的Fab或Fab'片段，且进一步包含其为对于第二目的抗原具有特异性的VH/VL对的两个单域抗体(dAb)，其中两个单域抗体通过在2个半胱氨酸残基(一个在VH中并且一个在VL中)之间的二硫键连接，其中半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH100b和VL49、VH98和VL46、VH101和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。

在一个实施方案中，本发明提供了多价抗体融合蛋白，其包含对于目的抗原具有第一特异性的Fab或Fab'片段，且进一步包含对于第二目的抗原具有特异性的VH/VL对，其中VH/VL对通过在2个半胱氨酸残基(一个在VH中并且一个在VL中)之间的二硫键连接，其中半胱氨酸残基对的位置选自VH37和VL95、VH44和VL100、VH44和VL105、VH45和VL87、VH100和VL50、VH100b和VL49、VH98和VL46、VH101和VL46、VH105和VL43以及VH106和VL57。

在一个或多个实施方案中，重链和轻链之间(例如CH结构域和CL或CK结构域之间)的二硫键不存在，例如因为形成键的一个或多个半胱氨酸被取代。可以用例如丝氨酸取代所述一个或多个半胱氨酸。

在一个或多个实施方案中，存在CH结构域和CL或CK结构域之间的重链和轻链之间的链间二硫键。

在一个实施方案中，提供F(ab)₂片段，其包含一个、两个、三个或四个单域抗体，例如两个分离的VH/VL对，其可以针对相同或不同的抗原。

在一个实施方案中，本发明的抗体融合蛋白不包含Fc结构域。在一个实施方案中，本发明的抗体融合蛋白不包含CH2或CH3结构域。

在本发明的双特异性融合蛋白中，单域抗体与第二抗原结合，所述第二抗原与Fab或Fab'片段组分所结合的抗原不同。

在一个实例中，本发明使用的dAb呈现对补体途径蛋白、CD标志物蛋白或FcγR的特异性。在这种情况下，dAb优选对CD分子特异。最优选，dAb呈现对选自CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16和CD35的CD分子的特异性。

在优选的实例中，本发明使用的dAb呈现对血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1的特异性，血清载体蛋白优选是人血清载体蛋白例如甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白、α1酸糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原或血清白蛋白。最优选，dAb呈现对人血清白蛋白的特异性。因此在一个实例中，用血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1(例如人血清白蛋白)免疫兔、小鼠、大鼠、骆驼或美洲驼并且当滴度适当时收集血液。可以通过单细胞PCR克隆编码dAb的基因，或可以通过EBV转化或通过与永生化细胞系融合来永生化编码dAb的B细胞。可选地，可以通过上文描述的噬菌体展示获得单域抗体。

在一个实施方案中，单域抗体结合人血清白蛋白。在一个实施方案中，单域抗体结合人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白和大鼠血清白蛋白。

在一个实施方案中，结合血清白蛋白的单域抗体是WO2005/118642(参见例如图1c和1d)中提供的dAb或WO2004/041862中提供的VHH或例如WO2006/122787的表III中描述的人源化纳米抗体(nanobody)。

在一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是重链VH单域抗体，其包含至少一个下列CDR：关于CDR-H1，具有图5(e)SEQIDNO:56或图5(k)SEQIDNO:62中给出的序列的CDR；关于CDR-H2，具有图5(f)SEQIDNO:57或图5(l)SEQIDNO:63中给出的序列的CDR和关于CDR-H3，具有图5(g)SEQIDNO:58或图5(m)SEQIDNO:64中给出的序列的CDR。

在另一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是重链VH抗体，其中VH结构域的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的至少两个选自下列：SEQIDNO:56或SEQIDNO:62所示的CDR-H1序列，SEQIDNO:57或SEQIDNO:63所示的CDR-H2序列和SEQIDNO:58或SEQIDNO:64所示的CDR-H3序列。例如，单域抗体可以包含VH结构域，其中CDR-H1具有SEQIDNO:56所示的序列和CDR-H2具有SEQIDNO:57所示的序列。可选地，单域抗体可以包含VH结构域，其中CDR-H1具有SEQIDNO:56所示的序列和CDR-H3具有SEQIDNO:58所示的序列。为了避免疑问，应理解，包括所有排列。

在另一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是重链VH单域抗体，其中VH结构域包含SEQIDNO:56所示的CDR-H1的序列，SEQIDNO:57所示的CDR-H2的序列和SEQIDNO:58所示的CDR-H3的序列。

在另一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是重链VH单域抗体，其中VH结构域包含SEQIDNO:62所示的CDR-H1的序列，SEQIDNO:63所示的CDR-H2的序列和SEQIDNO:64所示的CDR-H3的序列。

在一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是人源化重链VH单域抗体，dAbH1，其具有图5(a)中给出的序列(SEQIDNO:52)。包含G₄S连接体的适合的CH1-dAbH1融合物的实例在图6中给出(SEQIDNO:68)。

在一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是人源化重链VH单域抗体，dAbH2，其具有图5(c)中给出的序列(SEQIDNO:54)。包含G₄S连接体的适合的CH1-dAbH2融合物的实例在图6中给出(SEQIDNO:69)。

抗体可变结构域中的残基通常根据Kabat等人设计的系统进行编号。该系统在Kabat等人，1987，inSequencesofProteinsofImmunologicalInterest，USDepartmentofHealthandHumanServices，NIH，USA(下文"Kabat等人(同上)")中提出。除非另外指出，否则本说明书中使用该编号系统。

Kabat残基命名并非总是与氨基酸残基的线性编号直接对应。与严谨的Kabat编号相比，实际的线性氨基酸序列可以包含更少或额外的氨基酸，相当于基本可变结构域结构的结构组分(构架或互补决定区(CDR))的缩短或插入。通过将抗体序列中的同源残基与"标准"Kabat编号序列比对，可以对给定的抗体确定正确的残基Kabat编号。

根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)，残基50-65(CDR-H2)和残基95-102(CDR-H3)。然而，根据Chothia(Chothia，C.和Lesk，A.M.J.Mol.Biol.，196，901-917，(1987))，相当于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此，本文使用的“CDR-H1”包含残基26至35,如由Kabat编号系统和Chothia的拓扑学环定义的组合描述的。

根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)，残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)。

在一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是轻链VL单域抗体，其包含至少一个下列CDR：关于CDR-L1，具有图5(h)SEQIDNO:59或图5(n)SEQIDNO:65中给出的序列的CDR；关于CDR-L2，具有图5(i)SEQIDNO:60或图5(o)SEQIDNO:66中给出的序列的CDR和关于CDR-L3，具有图5(j)SEQIDNO:61或图5(p)SEQIDNO:67中给出的序列的CDR。

在另一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是轻链VL抗体，其中VL结构域的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的至少两个选自下列：SEQIDNO:59或SEQIDNO:65所示的CDR-L1序列，SEQIDNO:60或SEQIDNO:66所示的CDR-L2序列和SEQIDNO:61或SEQIDNO:67所示的CDR-L3序列。例如，单域抗体可以包含VL结构域，其中CDR-L1具有SEQIDNO:59所示的序列和CDR-L2具有SEQIDNO:60所示的序列。可选地，单域抗体可以包含VL结构域，其中CDR-L1具有SEQIDNO:59所示的序列和CDR-L3具有SEQIDNO:61所示的序列。为了避免疑问，应理解，包括所有排列。

在另一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是轻链VL结构域抗体，其中VL结构域包含SEQIDNO:59所示的CDR-L1的序列，SEQIDNO:60所示的CDR-L2的序列和SEQIDNO:61所示的CDR-L3的序列。

在另一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是轻链VL结构域抗体，其中VL结构域包含SEQIDNO:65所示的CDR-L1的序列，SEQIDNO:66所示的CDR-L2的序列和SEQIDNO:67所示的CDR-L3的序列。

在一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是人源化轻链VL单域抗体，dAbL1，其具有图5(b)中给出的序列(SEQIDNO:53)。包含G₄S连接体的适合的CH1-dAbL1融合物和Ck1-dAbL1融合物的实例在图6中给出(SEQIDNO:70和SEQIDNO:72)。

在一个实施方案中，本发明使用的结合人血清白蛋白的单域抗体是人源化轻链VL单域抗体，dAbL2，其具有图5(d)中给出的序列(SEQIDNO:55)。包含G₄S连接体的适合的CH1-dAbL2融合物和Ck1-dAbL2融合物的实例在图6中给出(SEQIDNO:71和SEQIDNO:73)。

在一个实施方案中，当Fab或Fab'片段的重链和轻链各自在C-末端包含单域抗体，并且两个单域抗体是如上文所述协同结合抗原的互补的VH/VL对时，VHdAb是dAbH1(SEQIDNO:52)和VLdAb是dAbL1(SEQIDNO:53)。

在一个实施方案中，当Fab或Fab'片段的重链和轻链各自在C-末端包含单域抗体，并且两个单域抗体是如上文所述协同结合抗原的互补的VH/VL对时，VHdAb是dAbH2(SEQIDNO:54)和VLdAb是dAbL2(SEQIDNO:55)。

在一个实施方案中，当Fab或Fab'片段的重链和轻链各自在C-末端包含单域抗体，并且两个单域抗体是如上文所述协同结合抗原的互补的VH/VL对时，VHdAb具有SEQIDNO:202中给出的序列，并且VLdAb具有SEQIDNO:203中给出的序列。

在一个实施方案中，当Fab或Fab'片段的重链和轻链各自在C-末端包含单域抗体，并且两个单域抗体是如上文所述协同结合抗原的互补的VH/VL对时，VHdAb具有SEQIDNO:204中给出的序列，并且VLdAb具有SEQIDNO:205中给出的序列。

在一个实施方案中，当Fab或Fab'片段的重链和轻链各自在N-末端包含单域抗体，并且两个单域抗体是如上文所述协同结合抗原的互补的VH/VL对时，VHdAb具有SEQIDNO:202中给出的序列，并且VLdAb具有SEQIDNO:203中给出的序列。

在一个实施方案中，当Fab或Fab'片段的重链和轻链各自在N-末端包含单域抗体，并且两个单域抗体是如上文所述协同结合抗原的互补的VH/VL对时，VHdAb具有SEQIDNO:204中给出的序列，并且VLdAb具有SEQIDNO:205中给出的序列。

在另一个方面中，本发明提供白蛋白结合抗体或其片段，其包含一个或多个上文提供和在图5(e-p)中的CDR，特别地包含具有SEDIDNO.56所示的序列的CDRH1，具有SEDIDNO.57所示的序列的CDRH2，具有SEDIDNO.58所示的序列的CDRH3，具有SEDIDNO.59所示的序列的CDRL1，具有SEDIDNO.60所示的序列的CDRL2，和/或具有SEDIDNO.61所示的序列的CDRL3。在一个实施方案中，白蛋白结合抗体或其片段包含具有SEDIDNO.62所示的序列的CDRH1，具有SEDIDNO.63所示的序列的CDRH2，具有SEDIDNO.64所示的序列的CDRH3，具有SEDIDNO.65所示的序列的CDRL1，具有SEDIDNO.66所示的序列的CDRL2，和/或具有SEDIDNO.67所示的序列的CDRL3。所述CDR可以并入任何适合的抗体构架和并入任何适合的抗体形式。此类抗体包括完整的抗体和具有功能活性的其片段或衍生物，其可以是但不限于单克隆、人源化、完全人或嵌合抗体。因此，此类白蛋白结合抗体可以包含具有全长重链和轻链的完整抗体分子或其片段，和可以是但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、单域抗体、scFv、二、三或四价抗体、双-scFv、双抗体、三链抗体(triabody)、三体(tribody)、四链抗体(tetrabody)和任何上述的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson，2005NatureBiotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson，2005，DrugDesignReviews-Online2(3)，209-217)。用于产生和制备这些抗体片段的方法是本领域公知的(参见例如Verma等人，1998，JournalofImmunologicalMethods，216，165-181)。多价抗体可以包含多特异性或可以是单特异性的(参见例如WO92/22853和WO05/113605)。应当理解，本发明的这方面还延伸至这些白蛋白结合抗体的变体。

应理解，此类白蛋白结合抗体，特别是单域抗体可以与任何其他抗体或蛋白或其他分子缀合，如在任何其他适合的背景中期望或使用的。在一个实例中，如上所述和在图5(a-d)和图24中所示的单域抗体dAbH1、dAbL1、dAbH2、dAbL2可以并入任何适合的抗体形式或在任何适合的背景中(例如融合或缀合)用作单域抗体。

在一个实施方案中，本发明的这方面的抗体包含图5(e)中给出的CDR-H1的序列，图5(f)给出的CDR-H2的序列和图5(g)中给出的CDR-H3的序列。

在一个实施方案中，本发明的这方面的抗体包含图5(k)中给出的CDR-H1的序列，图5(l)给出的CDR-H2的序列和图5(m)中给出的CDR-H3的序列。

在一个实施方案中，本发明的这方面的抗体包含图5(h)中给出的CDR-L1的序列，图5(i)给出的CDR-L2的序列和图5(j)中给出的CDR-L3的序列。

在一个实施方案中，本发明的这方面的抗体包含图5(n)中给出的CDR-L1的序列，图5(o)给出的CDR-L2的序列和图5(p)中给出的CDR-L3的序列。

在一个实施方案中，本发明提供了包含具有图5(a)-(d)或图24中给出的序列的VH结构域和/或VL结构域的Fv或scFv。在一个实施方案中，Fv或scFv包含具有SEQIDNO:202中给出的序列的VH和具有SEQIDNO:203中给出的序列的VH。在一个实施方案中，Fv或scFv包含具有SEQIDNO:204中给出的序列的VH和具有SEQIDNO:205中给出的序列的VL。

在一个实施方案中，scFv的VH和VL为VHVL取向(N至C末端)。在一个实施方案中，VH和VL为VLVH取向(N至C末端)。

如上所述，scFv或Fv片段可以进一步掺入任何合适的抗体形式。例如，它们可以与一种或多种其他抗体片段融合或缀合。

在下列抗体形式中，来自本文序列表的各个序列可以位于对应于天然位置或非天然位置的位置。天然位置针对所列的标记的CDRH1位置H1中的相关序列、针对所列的标记的CDRH2位置H2中的相关序列、所列的标记的CDRH3位置H3中的相关序列、所列的标记的CDRL1位置L1中的相关序列、所列的标记的CDRL2位置L2中的相关序列、和所列的标记的CDRL3位置L3中的相关序列。还设想其组合例如H1和H2,H1和H3,H1和L1,H1和L2,H1和L3,H2和L1,H2和L2,H2和L3,H2和H3,H3和L1,H3和L2,H3和L3,H1和H2和H3,H1和H2和L1,H1和H2和L2,H1和H2和L3,H2和H3和L1,H2和H3和L2,H2和H3和L3,H3和L1和L2,H3和L1和L3,H3和L2和L3,L1和L2和L3,H1和H2和H3和L1,H1和H2和H3和L2,H1和H2和H3和L3,H2和H3和L1和L2,H2和H3和L1和L3,和H2和H3和L2和L3,H3和L1和L2和L3,H1和H2和H3和L1和L2,H1和H2和H3和L2和L3,H1和H2和H3和L1和L3,L1和L2和L3和H1和H2,L1和L2和L3和H1和H3,L1和L2和L3和H2和H3,H1和H2和H3和L1和L2和L3。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：222、223、90－93的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：94－99的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：100－105的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：106－111的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：112－117的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：118－123的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：124－129的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：130－135的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：136－141的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：142－147的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：148－153的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：154－159的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：160－165的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：166－171的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：172－177的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：178－183的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：184－189的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：190－195的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含选自序列IDNO：196－201的序列，例如1、2、3、4、5或6个序列。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列IDNO：202。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列IDNO：203。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列IDNO：202和203。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列IDNO：204。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列IDNO：205。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列IDNO：204和205。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列IDNO：206。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列IDNO：207。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含序列IDNO：206和207。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含SEQIDNO：202中给出的序列，其中在位置84处的A已被D置换。

在一个实施方案中，本公开内容的抗体融合蛋白包含SEQIDNO：204中给出的序列，其中在位置84处的A已被D置换。

当本发明的双特异性融合蛋白的单域抗体与白蛋白结合时，单域抗体对白蛋白的结合亲和力将足以延长Fab或Fab'的体内半衰期。已报道，对白蛋白的小于或等于2.5μM的亲和力将延长体内半衰期(Nguyen，A.等人(2006)ProteinEngineering，Design&Selection，19(7)，291-297)。本发明的单域抗体分子优选具有适用于它们的目的和它们结合的抗原的结合亲和力。在一个实例中，单域抗体具有高结合亲和力，例如pM(picomolar)。在一个实例中，单域抗体具有针对抗原的结合亲和力，其为nM或μM。可以使用本领域已知的任何适合的方法测量亲和力，包括本文实施例中描述的使用天然或重组抗原的BIAcore。

优选，本发明的结合白蛋白的单域抗体分子具有大约2μM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的单域抗体分子具有大约1μM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的单域抗体分子具有大约500nM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的单域抗体分子具有大约200nM或更好的结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的域抗体分子具有大约1nM或更好的结合亲和力。应当理解,可以使用本领域已知的任何适合的方法改变本发明提供的和本领域已知的单域抗体的亲和力。因此，本发明还涉及本发明的结构域抗体分子的变体，其具有针对白蛋白的改进的亲和力。此类变体可以通过大量亲和力成熟方案获得，包括突变CDR(Yang等人，J.Mol.Biol.，254，392-403，1995)，链改组(Marks等人，Bio/Technology，10，779-783，1992)，使用大肠杆菌的突变株(Low等人，J.Mol.Biol.，250，359-368，1996)，DNA改组(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.，8，724-733，1997)，噬菌体展示(Thompson等人,J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等人,Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(同上)论述了这些亲和力成熟方法。

双特异性融合蛋白的单域抗体可以根据需要提供为单体、二聚体或三聚体。想要的产品可以通过调整材料所经历的下游加工步骤获得。在一个实施方案中，经加工的材料以基本上均质的单体形式提供。在一个实施方案中，经加工的材料以基本上均质的二聚体形式提供。在一个实施方案中，经加工的材料以基本上均质的三聚体形式提供。

本发明还提供编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的分离的DNA序列。本发明的DNA序列可以包含合成的DNA(例如通过化学加工产生的)，cDNA，基因组DNA或其任何组合。

可以通过本领域技术人员公知的方法获得编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。例如编码抗体片段、连接体和/或dAb的部分或全部的DNA序列可以如期望的从确定的DNA序列或根据对应的氨基酸序列合成。

分子生物学的标准技术可以用于制备编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。想要的DNA序列可以使用寡核苷酸合成技术完全或部分地合成。需要时，可使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。

本发明还涉及包含本发明的一个或多个DNA序列的克隆或表达载体。因此，提供包含一个或多个编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列的克隆或表达载体。在一个优选实施方案中，克隆或表达载体包含编码完整双特异性抗体融合蛋白的单个DNA序列。因此，克隆或表达载体包含DNA，其依次编码转录单元以便产生翻译融合蛋白。

事实上，本领域技术人员理解，本发明的融合蛋白可在N-末端或C-末端具有dAb，因此编码转录单元的dAbDNA将分别在编码翻译融合物的DNA序列内的最前或最后。因此，翻译融合物可以包含N-末端dAb和C-末端Fab或Fab'。此外，翻译融合物可以包含N-末端Fab或Fab'和C-末端dAb。

应理解，Fab或Fab'的重链和轻链可以并入相同或不同的载体。在一个实施方案中，一个载体可以包含翻译融合物，所述翻译融合物包含Fab或Fab'重链和C-末端dAb，并且另一个载体可以包含翻译融合物，所述翻译融合物包含Fab或Fab'轻链和C-末端dAb。

例如，当想要产生在抗体片段的N-末端具有dAb部分的双特异性抗体融合蛋白时，载体将按以下顺序包含DNA转录单元：编码dAb部分的DNA转录单元，任选地编码连接体序列的DNA转录单元，和编码抗体片段的DNA转录单元。当想要产生在抗体片段的C-末端具有dAb部分的双特异性抗体融合蛋白时，载体将按以下顺序包含DNA转录单元：编码抗体片段的DNA转录单元，任选地编码连接体序列的DNA转录单元，和编码dAb部分的DNA转录单元，所述dAb部分对血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子，或CD35/CR1，例如人血清白蛋白具有特异性。因此，本发明的翻译融合物可以以不同的构建形式存在，包括，例如但不限于，dAb-连接体-Fab，Fab-连接体-dAb，dAb-Fab，Fab-dAb，Fab'-dAb，dAb-Fab'，dAb-连接体-Fab'，Fab'-连接体-dAb。当使用两个载体时，例如第一载体可以包含与dAb融合的Fab或Fab'的重链和第二载体可以包含与dAb融合的Fab或Fab'的轻链。

如本领域技术人员公知的，包含在本发明的翻译融合物内的抗体片段的DNA编码可以作为构建体中的转录单元整合入载体，例如转录单元可以包含轻链编码，接着是重链编码，或反之亦然；参见，特别地，Humphreys等人，2002，ProteinExpressionandPurification，26:309-320。

优选，根据本发明的载体包含合适的前导序列，例如抗体前导序列。此类前导序列是本领域公知的。

构建载体的一般方法，转染和转化方法和培养方法是本领域技术人员公知的。在这方面，可参考"CurrentProtocolsinMolecularBiology"，1999，F.M.Ausubel(ed)，WileyInterscience，NewYork和ColdSpringHarborPublishing生产的ManiatisManual。

还提供包含一个或多个克隆或表达载体的宿主细胞，所述载体包含一个或多个编码本发明的双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。任何适合的宿主细胞/载体系统都可以用于表达编码双特异性抗体融合蛋白的DNA序列。可以使用细菌，例如大肠杆菌及其他微生物系统或还可以使用真核(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。适合的哺乳动物宿主细胞包括NS0、CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。因此，在一个实施方案中，本发明的融合蛋白在大肠杆菌中表达。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白在哺乳动物细胞中表达。

本发明还提供用于产生双特异性抗体融合蛋白的方法，其包括在适于从编码所述双特异性抗体融合蛋白的DNA序列表达蛋白的条件下，培养包含本发明的载体的宿主细胞。本发明进一步提供用于分离双特异性抗体融合蛋白的方法。

在生产后，可以纯化本发明的双特异性抗体融合蛋白，必要时，使用本领域已知的任何适合的方法。可使用例如，但不限于层析技术，例如离子交换、尺寸排阻、蛋白G或疏水相互作用层析。

可以通过本领域已知的常规方法例如尺寸排阻层析和非还原性SDS-PAGE证实双特异性抗体融合蛋白的大小。可以使用此类技术以例如证实蛋白不是二聚化的和/或未丢失部分，例如dAb部分。如果检测到二聚体并且需要均质的单体产品，那么可以使用如上所述的常规层析技术从二聚体种类中纯化单体双特异性抗体融合蛋白。

本发明的双特异性抗体融合蛋白可用于治疗疾病或病症，包括炎性疾病和病症，免疫疾病和病症，纤维化病症和癌。

术语“炎性疾病”或“病症”和“免疫疾病或病症”包括类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、斯蒂尔病(still'sdisease)、MuckleWells病、银屑病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、SLE(系统性红斑狼疮)、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、多发性硬化、脉管炎、I型糖尿病、移植和移植物抗宿主病。

术语"纤维化病症"包括特发性肺纤维化(IPF)、系统性硬化(或硬皮病)、肾纤维化、糖尿病性肾病、IgA肾病、高血压、终末期肾病、腹膜纤维化(持续非卧床腹膜透析)、肝硬化、年龄相关的黄斑变性(ARMD)、视网膜病、心肌反应性纤维化、疤痕、瘢痕疙瘩、烧伤、皮肤溃疡、血管成形术、冠状动脉架桥术、关节形成术和白内障手术。

术语"癌"包括由上皮引起的恶性新赘生物(在皮肤或更通常地身体器官例如乳房、卵巢、前列腺、肺、肾、胰腺、胃、膀胱或肠的内衬中发现)。癌倾向于侵袭邻近的组织并且扩散(转移)至远端器官，例如：至骨、肝、肺或脑。

因此，根据本发明的另外的方面，提供了药物组合物，其包括与一个或多个药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合的本发明的抗体融合物。还提供本发明的抗体融合蛋白用于制备用于治疗疾病或病症的药物的用途。最优选的，所述疾病或病症是炎性疾病或病症。

根据本发明的药物组合物可以采取适于口服、口腔、胃肠外、皮下、经鼻、局部、眼睛或直肠施用的形式，或适于通过吸入或喷射施用的形式。

需要时，例如如果抗体融合蛋白的单域抗体与白蛋白结合，那么可能期望使用本领域已知的任何适合的方法将人或重组血清白蛋白与双特异性融合蛋白一起预配制。

当药物制剂是液体，例如溶液或悬浮液时，所述制剂可以进一步包含白蛋白例如人血清白蛋白，特别地重组白蛋白例如重组人血清白蛋白。适合的量可以在小于总制剂的2％w/w的范围内，特别地小于1、0.5或0.1％w/w。这可以有助于稳定制剂中的抗体组分。药物组合物可以进行冻干以用于随后用水性溶剂重构。

在一个实施方案中，提供单位剂量容器，例如小瓶，其包含根据本发明的冻干的"抗体"。

关于口服施用，药物组合物可以采取例如片剂、锭剂或胶囊的形式，其通过传统方法使用药学上可接受的赋形剂例如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充物(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或乙醇酸钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)来制备。可以通过本领域公知的方法包被片剂。用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或它们可以以干的产品的形式存在，所述产品在使用之前用水或其他适合的媒介物重构。此类液体制剂可以通过传统方法用药学上可接受的添加剂，例如悬浮剂、乳化剂、非水性媒介物或防腐剂制备。制剂还可以视情况包含缓冲盐、增香剂、着色剂或甜味剂。

用于口服施用的制剂可以适当地进行配制以控制释放活性化合物。

关于口腔施用，组合物可以采取以传统方法配制的片剂或锭剂的形式。

本发明的双特异性抗体可以配制用于通过注射(例如通过弹丸注射或输注)肠胃外施用。用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如在玻璃安瓿瓶或多剂量容器(例如玻璃小瓶)中。用于注射的组合物可以采取例如油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且可以包含配制剂例如悬浮剂、稳定剂、防腐剂和/或分散剂。可选地，活性成分可以以粉末形式存在，其在使用之前用适合的媒介物(例如无菌无热原水)构建。

除上述制剂之外，本发明的双特异性抗体还可以配制为长效制剂。此类长效制剂可以通过植入或通过肌内注射施用。

关于经鼻施用或通过吸入施用，根据本发明的化合物可以方便地以气雾剂形式递送，其用加压包装或喷雾器喷射，借助于适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、一氟三氯甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体或气体混合物。

需要时,组合物可以置于包装或分配装置(其可以包含一个或多个包含活性成分的单位剂量形式)中。包装或分配装置可以附有施用说明书。

关于局部施用，根据本发明的化合物可以方便地配制到适合的软膏中，所述软膏包含悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体的活性组分。特别的载体包括例如，矿物油、液态石油、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乳化蜡和水。可选地，根据本发明的化合物可配制到适合的洗液中，所述洗液包含悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体的活性组分。特别的载体包括例如，矿物油、山梨聚糖单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、苯甲醇、2-辛基十二烷醇和水。

在一个实施方案中，制剂作为用于局部施用(包括吸入)的制剂提供。

适合的可吸入制剂包括可吸入粉剂、包含推进气体的计量气雾剂或无推进气体的可吸入溶液。根据本公开内容的包含活性物质的可吸入粉剂可以只由上述活性物质组成或由上述活性物质和生理学可接受的赋形剂的混合物组成。

这些可吸入粉剂可以包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)，二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)，寡糖和多糖(例如葡聚糖)，多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或其相互的混合物。适当地使用单糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，特别地但不仅限于它们的水合物形式。

用于在肺中沉积的颗粒要求颗粒尺寸小于10微米，例如1-9微米，例如0.1至5μm，特别地1至5μm。活性成分(例如抗体或片段)的颗粒大小是最重要的。

可用于制备可吸入气雾剂的推进气体是本领域已知的。适合的推进气体选自烃(例如正丙烷、正丁烷或异丁烷)和卤代烃(例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物)。上述的推进气体可以单独使用或混合使用。

特别适合的推进气体是卤代烷烃衍生物，其选自TG11、TG12、TG134a和TG227。在上述的卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别适合的。

包含推进气体的可吸入气雾剂还可包含其他成分，例如助溶剂、稳定剂、表面活性试剂(表面活性剂)、抗氧化剂、润滑剂和用于调整pH的试剂。所有这些成分是本领域已知的。

根据本发明的包含推进气体的可吸入气雾剂可以包含以重量计多达5％的活性物质。根据本发明的气雾剂包含，例如，以重量计0.002至5％，以重量计0.01至3％，以重量计0.015至2％，以重量计0.1至2％，以重量计0.5至2％或以重量计0.5至1％的活性成分。

可选地，还可以通过施用液体溶液或悬浮液制剂局部施用至肺，例如使用装置例如喷雾器，例如连接至压气机的喷雾器(例如由PariRespiratoryEquipment，Inc.,Richmond,Va制造的连接至PariMaster(R)压气机的PariLC-JetPlus(R)喷雾器)。

本发明的抗体形式可以分散在溶剂中递送(例如以溶液或悬浮液的形式)。其可以在合适的生理溶液(例如生理盐水)或其他的药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中悬浮。本领域中已知的缓冲溶液可以包含0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠，8.0mg至9.0mgNaCl，0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯，0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠/1ml水，以使pH为大约4.0至5.0。悬浮液可以用于，例如冻干的抗体。

治疗悬浮液或溶液制剂还可以包含一种或多种赋形剂。赋形剂是本领域公知的并且包括缓冲剂(例如柠檬酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、醋酸缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。溶液或悬浮液可以封装在脂质体或可生物降解的微球中。通常使用无菌制造工艺以基本上无菌的形式提供制剂。

这可以包括通过本领域技术人员熟知的方法，通过过滤用于所述制剂的缓冲溶剂/溶液、在无菌缓冲溶剂溶液中无菌悬浮抗体和将制剂分装入无菌容器来生产和灭菌。

可以例如以包装在箔包层中的单剂量单位(例如密封的塑料容器或小瓶)的形式提供根据本公开内容的可喷射(nebulizable)制剂。各个小瓶包含在一定体积例如2ml溶剂/溶液缓冲液中的单位剂量。

据认为，本公开内容的抗体形式适合于经由喷雾作用递送。

关于眼部施用，根据本发明的化合物可以方便地配制为在等渗、pH经调整的无菌盐水中的微离子化(microionized)悬浮液(具有或不具有防腐剂例如杀细菌或杀真菌剂，例如硝酸苯汞、苯扎氯铵或醋酸氯己定)。可选地，用于眼部施用的化合物可以配制到软膏(例如矿脂)中。

关于直肠施用，根据本发明的化合物可以方便地配制为栓剂。可以通过将活性组分与适合的无刺激的赋形剂混合来制备所述栓剂，所述赋形剂在室温下是固体但在直肠温度下是液体，因此栓剂在直肠中融化以释放活性组分。此类材料包括例如，可可脂，蜂蜡和聚乙二醇。

预防或治疗具体病况所需的本发明的化合物的量将根据所选化合物和要治疗的患者的病况而变化。然而，通常，用于口服或口腔施用的日剂量可以为约10ng/kg至1000mg/kg，一般地100ng/kg至100mg/kg，例如约0.01mg/kg至40mg/kg体重，用于肠胃外施用的日剂量可以为约10ng/kg至50mg/kg体重,和用于经鼻施用或通过吸入或喷射施用的日剂量可以为约0.05mg至约1000mg，例如约0.5mg至约1000mg。

本发明的各个实施方案的优选特征经适当修正后适于各个其他实施方案。所有出版物，包括但不限于本说明书中引用的专利和专利申请通过引用并入本文，如同明确地和分别地指明各个单独的出版物通过引用并入本文，如同充分陈述的那样。

在本说明书的背景中，包含意味着包括。

当技术上合适时，可以组合本发明的实施方案。

本文的实施方案描述为包含某些特征/要素。本公开内容还扩展至由或基本上由所述特征/要素组成的分开的实施方案。

现将参照下列实施例描述本发明，所述实施例仅仅是示例性的并且不应以任何方式解释为限定本发明的范围。

附图列表：

图1：Fab-dAb的图示，其中dAb位于C-末端。

图2A：Fab-didAb的图示。

图2B：在dAb之间具有额外的二硫键稳定作用的Fab-didAb的图示。

图3：FabA-dAbL3(CK-SG₄SE)(1)和FabA-dAbL3(CK-G[APAPA]₂)(2)的SDSPAGE分析。

图4：FabA-dAbL3(CK-SG₄SE)(1)和FabA-dAbL3(CK-G[APAPA]₂)(2)的Western印迹分析。

图4a：FabB-didAb的SDSPAGE

泳道M＝SeeBlue标志物

泳道1&2＝IgG对照

泳道3＝FabB

泳道4＝FabB-didAb,-dAbL1(CK-G4Sx2)&dAbH1(CH1-G4Sx2)

泳道5＝FabB-didAb,-dAbL2(CK-G4Sx2)&dAbH2(CH1-G4Sx2)

图5：结构域抗体dAbH1、dAbH2、dAbL1和dAbL2和来源于各个抗体的CDR的序列。

图6：包含与结构域抗体融合的FabB重链或轻链可变结构域的FabB-dAb构建体。

图7：Fab'A重链和轻链序列和FabA重链序列。

图8a、8b&8c：鼠源化的(Murinised)Fab-didAb的氨基酸序列。

图8a展示多种鼠dAb中的CDR的氨基酸序列。

图8b展示mFabD-mdidAb的氨基酸序列：

dAbL1(CK-G4Sx2)

dAbH1(CH1-G4Sx2)

dAbL2(CK-G4Sx2)&

dAbH2(CH1-G4Sx2)

图8c展示mFabD-mdidAb的氨基酸序列:

dAbL1(CK-G4Sx2)&

dAbH1(CH1-G4Sx2)mFabC-mdAbH1

dAbL2(CK-G4Sx2)&

dAbH2(CH1-G4Sx2

图9展示FabB-didAb的SDSPAGE

泳道1&4为Fab'B

泳道2&5为FabB-didAb,-dAbL1(CK-G4Sx2)&-dAbH1(CH1-G4Sx2)

泳道3&6为FabB-didAb,-dAbL2(CK-G4Sx2)&-dAbH2(CH1-G4Sx2)

图10展示Thermofluor热稳定性测定的图示。

图11展示HSA-FITC信号/与活化的小鼠T细胞结合的HSA-FITC混合物的曲线。

图12展示聚集稳定性测定的曲线。

图13展示皮下给药和静脉内给药后随时间变化的体内浓度特征。

图14A、B和C展示某些CD4+细胞和CD8+细胞读数(readout)。

图15展示FabB-645Fv的SDS-PAGE分析。

图16展示FabB-645Fv的尺寸排阻分析。

图17展示具有不同连接体长度的FabB-645Fv的热像图。

图18展示某些FabB构建体的SDS-PAGE分析。

图19展示多种FabB-645Fv构建体的尺寸排阻分析。

图20至24展示某些形式的序列。

图25显示构建体Fab-645dsFV的SDSpage分析，其中VH/VL对位于Fab的C末端并且是二硫键稳定的。

图26显示图25的构建体的尺寸排阻分析。

图27A显示根据本公开内容的构建体的thermofluor分析。

图27B显示Tm对pH的曲线图。

图28显示根据本公开内容的构建体的体外测定，其基于在人PCMB上的人OX40配体结合的抑制。

图29A-C显示根据本公开内容的构建体的体内功效，且特别是对于CD4+和CD8+、血液、腹膜和脾细胞的作用。

图30A-D显示根据本公开内容的一些形式的序列。

图31显示一些构建体的表达数据。

图32A-C显示一些构建体的结合数据。

关键词

-645Fv等同于didAbL1和H1(除非另外指出，否则用于各个dAB的连接体是相同的)。

648Fv等同于didAbL2和H2(除非另外指出，否则用于各个dAB的连接体是相同的)。

-645dsFv等同于didAbL1和H1(除非另外指出，否则用于各个dAB的连接体是相同的)，其中L1和H1通过二硫键稳定。

-648dsFv等同于didAbL2和H2(除非另外指出，否则用于各个dAB的连接体是相同的)，其中L2和H3通过二硫键稳定。

FabΔ是缺失链间半胱氨酸键(即CH和CL或CK之间)的Fab。

实验：

缩写：除非上下文另外指出，否则"m"作为前缀是指鼠(murine)。

除非上下文另外指出，否则"h"作为前缀是指人。

FabA、FabB、FabC和FabD组分在下文中以不同的形式提供。

实施例1.对人血清白蛋白特异的dAb的产生

使用重组DNA技术产生符合读框的DNA编码转录单元，所述转录单元编码具有针对人血清白蛋白的特异性的dAb。

期望时，可以使用重组DNA技术产生符合读框的DNA编码转录单元，所述转录单元编码具有针对募集蛋白的特异性的dAb。

实施例⒉抗体片段的产生

为了将dAb与轻链的C-末端融合，合成编码人κ轻链恒定区(具有κ恒定区的Km3同种异形)，肽连接体和dAb的DNA并且将其作为SacI-PvuII限制性片段克隆入UCB-Celltech内部表达载体pTTOD(Fab)(pTTO-1的衍生物，描述于Popplewell等人，MethodsMol.Biol.2005；308:17-30中)，所述表达载体pTTOD(Fab)包含编码人γ-1CH1恒定区的DNA。这产生双顺反子基因排列，其由经由连接体与dAb融合的人源化轻链的基因，和随后的人源化重链Fab片段的基因组成，两个基因都在tac启动子的控制下。还在Gly4Ser连接体上游编码唯一的BspE1位点，或在富含Ala-Pro的连接体的上游编码AscI位点。

为了将dAb与重链的C-末端融合，合成编码人CH1片段(γ1同种型的)(其后为连接体编码序列和dAb)的DNA。将其作为ApaI-EcoRI限制性片段亚克隆入UCB-Celltech内部表达载体pTTOD(Fab)(pTTO-1的衍生物，Popplewell等人，同上)，所述表达载体包含编码人γ-1CH1恒定区的DNA。这产生双顺反子基因排列，其由人源化轻链的基因，非编码基因间序列和随后的经由连接体与dAb融合的重链组成，两个基因都在tac启动子控制下。将重组表达质粒转化到大肠杆菌菌株W3110中，其中通过添加IPTG诱导表达。最初，以小规模(5ml培养体积)进行表达实验且在OD(600nm)为大约0.5时添加200uMIPTG，诱导2小时后收获细胞并且在30℃在Tris/EDTA中进行过夜提取。将澄清的提取物用于通过Biacore的亲和力分析。选择产生期望的表达产量和活性的构建体以用于发酵。

适用于下列实施例的方法

在下面的实施例中，dAb与其融合的抗体链表示为CK或LC(对于cκ轻链)和表示为CH1或HC(对于重链恒定结构域CH1)。

用于在大肠杆菌中表达的FabA-dAb融合质粒的构建

通过将dAbL3或dAbH4融合至FabA轻链或重链的恒定区的C-末端构建Fab-dAb融合蛋白。柔性(SGGGGSE(SEQIDNO:1))或刚性(G(APAPA)₂(SEQIDNO:34))连接体用于将dAb与cκ区(SEQIDNO:75)连接，而连接体DKTHTS(SEQIDNO:2)用于将dAb与CHI区(SEQIDNO:76)连接。将编码恒定区-dAb融合物的DNA序列合成制备为片段，以使得能够亚克隆入内部pTTOD载体的FabA序列中。

通过将合成的基因的SacI-ApaI片段亚克隆入能够表达FabA的质粒的相应位点构建轻链-dAb融合物，所述合成的基因编码经由(SGGGGSE(SEQIDNO:1))或刚性(G(APAPA)₂(SEQIDNO:34))连接体与dAbL3或dAbH4融合的C-末端cκ。通过将合成的基因的ApaI-EcoRI片段亚克隆入能够表达FabA的质粒的相应位点构建重链-dAb融合物，所述合成的基因编码经由DKTHTS连接体与dAbL3或dAbH4融合的C-末端CHI。

Fab'A来源于IL-1β结合抗体，其重链和轻链序列分别提供于SEQIDNO:74和75中，如图7所示的。在Fab'A中，当轻链与dAb连接时，将重链的铰链改变为DKTHTS，即便没有dAb与重链(SEQIDNO:76)连接。

FabA包含相同的轻链序列(SEQIDNO:75)和截短的重链序列，所述重链序列在链间半胱氨酸终止(SEQIDNO:77)。dAbL3和dAbH4分别是结合人血清白蛋白的轻链和重链结构域抗体。

用于在大肠杆菌中表达的FabA-didAb融合质粒的构建

通过将编码CH1-dAb融合物的ApaI-EcoRI片段亚克隆入已有的Fab-dAb质粒构建在轻链和重链上都具有dAbL3或dAbH4的FabA-didAb，其中dAb经由柔性连接体与轻链融合。

用于在哺乳动物细胞中表达的FabB-dAb融合质粒的构建

FabB-dAb，FabB-dAbH1(CH1-G₄Sx2)，FabB-dAbH2(CH1-G₄Sx2)，FabB-dAbL1(CH1-G₄Sx2)，FabB-dAbL2(CH1-G₄Sx2)都通过PCR进行装配，然后克隆入在HCMV-MIE启动子和SV40EpolyA序列控制下的哺乳动物表达载体。将这些载体与包含FabB轻链的相似载体配对，用于在哺乳动物细胞中进行表达(参见下文)。

FabB来源于结合细胞表面共刺激分子的抗体。如实施例3描述的，获得dAbH1、dAbH2、dAbL1和dAbL2。

FabB-dAb和didAb的哺乳动物表达

根据厂商的说明书，使用Invitrogen的293fectin转染试剂，用重链和轻链质粒转染HEK293细胞。简言之，将2μg重链质粒+2μg轻链质粒与10μl293fectin+340μlOptimem培养基一起在RT下温育20分钟。然后，将混合物添加至悬浮液中的5x10⁶个HEK293细胞并且在37℃在振荡下温育4天。

Biacore

通过表面等离子共振(SPR)确定Fab-dAb构建体的相互作用的结合亲和力和动力学参数，所述表面等离子共振在使用CM5传感器芯片和HBS-EP(10mMHEPES(pH7.4)，150mMNaCl，3mMEDTA，0.05％v/v表面活性剂P20)运行缓冲液的BiacoreT100上进行。用人F(ab')₂特异性山羊Fab(JacksonImmunoResearch，109-006-097)或内部产生的抗人CH1单克隆抗体将Fab-dAb样品捕获至传感器芯片表面。通过标准胺偶联化学实现捕获抗体的共价固定。

各个测定循环由下列步骤组成：首先用1分钟注射捕获Fab-dAb，然后进行由抗原的3分钟注射组成的结合阶段，之后监控解离5分钟。各个循环后，通过40mMHCl的2x1分钟注射，随后5mMNaOH的30秒注射来再生捕获表面。使用的流速为10μl/分钟(用于捕获)，30μl/分钟(用于结合和解离阶段)，和10μl/分钟(用于再生)。

关于动力学测定，进行抗原的滴定(对于人血清白蛋白，一般62.5nM-2μM；对于IL-1β，1.25-40nM)，空白流动池用于参照扣除，且包括缓冲液空白注射以减去仪器噪音和偏差。

使用BiacoreT100评估软件，通过所得的传感图(sensorgram)至标准1:1结合模型的同时全局拟合，确定动力学参数。

为了检验同时结合，在捕获的Fab-dAb上注射5μMHSA或100nMIL-1β或5μMHSA和100nMIL-1β的混合溶液的3分钟注射。

从大肠杆菌纯化Fab-dAb

周质提取

将在周质内包含Fab-dAb的大肠杆菌沉淀重悬浮在具有100mMTris/HCl，10mMEDTA，pH7.4的起始培养体积中。然后在4℃，250rpm下温育这些悬浮液16小时。在10000xg，4℃下，离心重悬浮的沉淀1小时。移出上清并且进行0.45μm过滤。

蛋白G捕获

通过蛋白G层析从过滤的上清捕获Fab-dAb。简言之，将所述上清以20分钟停留时间应用于在20mM磷酸盐，150mMNaClpH7.1中平衡的GammabindPlusSepharose(GEHealthcare)柱。用20mM磷酸盐，150mMNaClpH7.1清洗柱子并且用0.1M甘氨酸/HClpH2.8洗脱结合的材料。收集洗脱峰并且用1M醋酸钠调整pH至约pH5。浓缩pH经调整的洗脱液并且使用10kMWCO膜渗滤入50mM醋酸钠pH4.5。

离子交换

进一步通过阳离子交换层析在pH4.5下用NaCl洗脱梯度纯化Fab-dAb。简言之，将经渗滤的蛋白G洗脱液用于在50mM醋酸钠pH4.5中平衡的Source15S(GEHealthcare)柱。用50mM醋酸钠pH4.5清洗柱子并且用20个柱体积的在50mM醋酸钠pH4.5中的从0至1MNaCl的线性梯度洗脱结合的材料。在整个梯度洗脱过程中，收集第三个柱体积的级分。通过A280和SDS-PAGE分析所述级分并且合并相关的级分。

凝胶过滤

需要时，进一步通过凝胶过滤纯化Fab-dAb。简言之，将FabA-dAbL3(CK-SG₄SE)的合并的离子交换洗脱级分应用于在50mM醋酸钠，125mMNaClpH5.0中平衡的Superdex200(GEHealthcare)柱并且用50mM醋酸钠，125mMNaClpH5.0的同溶剂梯度进行洗脱。在整个梯度洗脱过程中，收集1/120个柱体积的级分。通过A280和SDS-PAGE分析所述级分并且合并相关的级分。对于未经凝胶过滤的Fab-dAb，浓缩合并的离子交换洗脱级分并且使用10kMWCO膜渗滤入50mM醋酸钠，125mMNaClpH5.0中。

SDS-PAGE

需要时，用水稀释样品，然后向10μl样品中添加10μL2X样品运行缓冲液。对于非还原的样品，此时添加2μL100mM的NEM；对于还原的样品，添加2μL10X还原剂。涡旋样品，在85℃温育5分钟，冷却并且以12500rpm离心30秒。将制备的样品装载到4-20％丙烯酰胺Tris/甘氨酸SDS凝胶上并且在125V下电泳100分钟。将凝胶转移到用于Western印迹分析的PVDF膜上或用CoomassieBlue蛋白染色剂染色。

Western印迹分析

在12mMTris，96mM甘氨酸pH8.3中在150mA下将凝胶转移到PVDF膜，进行16小时。用在PBS+0.1％Tween20中的2％Marvel^TM(封闭缓冲液)封闭PVDF膜1小时。

抗轻链

HRP-兔抗人κ轻链，在封闭缓冲液中1/5000稀释，1小时。

抗重链

小鼠抗人重链，在封闭缓冲液中1/7000稀释，1小时。随后HRP-山羊抗小鼠，在封闭缓冲液中1/2000稀释，1小时。

抗His标签

兔抗His6，在封闭缓冲液中1/1000稀释，1小时。随后HRP-山羊抗兔IgG，在封闭缓冲液中1/1000稀释，1小时。

用100mlPBS+0.1％Tween20清洗所有印迹6次，每次清洗10分钟。在暴露于AmershamHyperfilm之前，用ECL试剂显现印迹1分钟，或用金属加强的DAB试剂显现印迹20-30分钟，随后用水。

高温反相HPLC

在2.1mmC8Poroshell柱上在80℃，以2ml/分钟的流速和18-38％B的梯度(在4分钟期间)分析样品(2μg)。A＝在水中的0.1％TFA，B＝在80:20IPA:MeOH中的0.065％TFA。通过在214nm处的吸收进行检测。

ELISA

使用夹心ELISA测量Fab-dAb的产量。简言之，用抗CH1抗体捕获Fab-dAb，然后用抗κ-HRP显示。

FACS

将样品(mFabD-didAb's)与5μg/ml经FITC(异硫氰酸荧光素)标记的HSA一起温育45分钟。然后将样品/HSA-FITC温育物添加至活化的小鼠CD4+T细胞并且进一步温育45分钟。用PBS清洗细胞并且通过FACS(荧光活化细胞分选)测量细胞相关的荧光。

实施例3

产生抗白蛋白抗体

用重组chromapure人血清白蛋白(购买自Jackson)免疫1/2lop兔。兔接受100ugHSA蛋白的3次皮下免疫，第一次免疫在完全弗氏佐剂中并且随后的免疫在不完全弗氏佐剂中。使用WO04/051268中描述的方法分离结合人、小鼠和大鼠血清白蛋白的抗体1和2、646、647、和649。分离抗体1和2的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的基因并且在克隆(经由反转录PCR)后进行测序。

将轻链移植序列亚克隆入兔轻链表达载体pVRbcK，所述表达载体包含编码兔C-κ恒定区的DNA。将重链移植序列亚克隆入兔重链表达载体pVRbHFab，所述表达载体包含编码兔Fab'重链恒定区的DNA。将质粒共转染到CHO细胞中并且针对白蛋白结合和亲和力筛选所生产的抗体(表1)。根据厂商说明书，使用Lipofectamine^TM2000方案转染CHO细胞(InVitrogen,catalogueNo.11668)。

产生人源化的结构域抗体dAbL1、dAbH1、dAbL2和dAbH2

使用人V-区受体构架和构架区中的供体残基设计人源化的VL和VH区。针对抗体1和2的每一个，分别设计一个移植的VL区(L1(SEQIDNO:53)和L2(SEQIDNO:55))和一个VH区(H1(SEQIDNO:52)和H2(SEQIDNO:54))，并且通过寡核苷酸装配和PCR诱变来构建基因。移植的结构域抗体和它们的CDR在图5中展示。

表1：抗白蛋白抗体的亲和力

实施例4：在哺乳动物细胞中表达的FabB-dAb的分析

如在方法中描述的，产生FabB-dAb构建体，并且直接在BIAcore中测试来自包含FabB-dAb的经转染的HEK293细胞的上清。

进行动力学分析以评估HSA与FabB-dAb构建体的相互作用。这些构建体由融合至FabB的CH1的C末端的dAbL1、dAbH2或dAbL3组成(参见图6)。与FabB-dAbL3(K_D＝392nM)相比，FabB-dAbL1对HSA具有较高的亲和力(K_D＝170nM)。FabB-dAbH2表现出对HSA具有最弱的亲和力，K_D＝1074nM，参见表2。

表2：

测定HSA与融合至dAbL1、dAbH2或dAbL3的FabB的结合的亲和力和动力学参数。显示的数据为平均值±SEM。(对于FabB-dAbL1和FabB-dAbH2，n＝4。对于FabB-dAbL3，n＝2)。

FabB-dAb蛋白的SDS-PAGE和western印迹分析证实，产生的FabB-dAb具有预期的大小。

实施例5：哺乳动物细胞中表达的FabB-didAb的分析

如在方法中描述的，产生FabB-didAb构建体，并且直接在BIAcore中测试来自包含didAb的经转染的HEK293细胞的上清。

使用didAb构建体进行进一步分析，在所述构建体中单dAb分别融合至Fab的重链和轻链C末端。与仅单个dAb相比，其中didAb来源于天然重链和轻链可变结构域对的构建体在亲和力方面表现出明显的提高(表2和3)。由两个相同dAbL1组成的didAb融合物在亲和力方面没有表现出优于单个dAbL1的提高(数据未显示)。

表3

测定HSA与融合至dAbL1&dAbH1或dAbL2&dAbH2的FabB的结合的亲和力和动力学参数。

FabB-didAb蛋白的SDS-PAGE证实，FabB-didAb良好表达并且具有预期的大小(参见图4a)。注意该SDSPAGE凝胶是由细胞表达的总蛋白。

实施例6

纯化的FabA-dAb的分析

如在方法中描述的，构建用于在大肠杆菌中表达Fab-dAb，Fab'A-dAbL3(CK-SG₄SE)Fab'A-dAbL3(CK-G[APAPA]₂)的质粒。将Fab-dAb表达入大肠杆菌周质并且如在方法中描述的，纯化至均质。通过高温反相HPLC、SDS-PAGE和Western印迹分析评估Fab-dAb的纯度。还通过Biacore评估Fab-dAb的抗原结合。

高温反相HPLC

如在方法中描述的，进行高温反相HPLC以给出FabA-dAbL3(CK-SG₄SE)和FabA-dAbL3(CK-G[APAPA]₂)中包含的所有种类的定量分析。存在的各个种类的百分比在表4中展示。

表4：Fab-dAb批次中存在的种类的定量

种类	Fab'A-dAbL3(CK-SG₄SE)	Fab'A-dAbL3(CK-G[APAPA]₂)
			峰1	0.6％	1.8％
峰2	0.6％	0.0％
			峰3	1.0％	0.3％
峰4	0.9％	0.8％
			Fab-dAb峰	85.5％	92.9％
Di Fab-dAb峰	11.5％	4.2％

SDS-PAGE

在非还原的和还原的条件下制备Fab-dAb样品并且在凝胶上进行电泳，如在方法中描述的。对凝胶进行考马斯染色。Fab-dAb样品、Fab'A-dAbL3(CK-SG₄SE)和Fab'A-dAbL3(CK-G[APAPA]₂)的条带特征与通过高温反相HPLC观察到的特征良好对应(图3)。

Western印迹

Fab-dAb样品进行非还原的SDS-PAGE，随后进行使用抗轻链和抗重链抗体的Western印迹分析，如在方法中描述的。这证实，dAb在Fab的轻链上和2个样品中的重链都未被修饰(图4)。还显示，通过考马斯染色的、非还原的SDS-PAGE检测到的所有条带是Fab-dAb相关产品。

Biacore

如在方法中描述的，通过SPR进行的动力学分析用于评估人血清白蛋白与Fab'A-dAbL3(CK-SG₄SE)和Fab'A-dAbL3(CK-G[APAPA]₂)的结合。表5中的结果证实，2个构建体都能够以大约1μM的相似亲和力(K_D)结合人血清白蛋白。

表5

构建体	k_a(x10⁴M^-1s^-1)	k_d(x10^-2s^-1)	K_D(x10^-9M)
				Fab’A-dAbL3(CK-SG₄SE)	3.44	1.42	411
Fab’A-dAbL3(CK-G[APAPA]₂)	9.61	2.85	296

进一步的动力学分析证实，所有融合构建体保留了原始FabA对IL-1β的相互作用特征(表6)，并且在动力学和亲和力参数中仅观察到微小的差异。

表6

构建体	k_a(x10⁵M^-1s^-1)	k_d(x10^-5s^-1)	K_D(x10^-12M)
				Fab’A-dAbL3(CK-SG₄SE)	1.90	4.21	221
Fab’A-dAbL3(CK-G[APAPA]₂)	2.17	3.99	184
				Fab’A	2.02	6.46	320

通过下列来评估各个构建体同时结合人血清白蛋白和IL-1β抗原的潜力：将各个构建体捕获至传感器芯片表面，然后进行5μM人血清白蛋白或100nMIL-1β，或5μM人血清白蛋白和100nMIL-1β的混合溶液的分开的3分钟注射。对于每一个Fab-dAb构建体，对组合的HSA/IL-1β溶液观察到的响应几乎与独立的注射的响应的总和相同，参加表7。这表示Fab-dAb能够同时结合IL-1β和人血清白蛋白，并且IL-1β或人血清白蛋白的结合不相互抑制。原始FabA仅与IL-1β结合，而与人血清白蛋白的结合可以忽略。

表7

上表显示在分别注射HSA或IL-1β，或注射预混合的HSA和IL-1β后对各个构建体观察到的结合响应(RU)。在各个情况下，终浓度为5μM(HSA)和100nM(IL-1β)。单独的HSA和IL-1β的响应的总和在括号中显示。

实施例7.FabAdidAb

大肠杆菌中FabA-didAb的表达

在大肠杆菌中表达以C-末端组氨酸标签(HIS6标签)终止的FabA-dAb和FabA-didAb融合物。在周质提取后，经由C-末端His6标签纯化dAb融合蛋白。通过使用抗CH1和抗cκ抗体的非还原凝胶的Western印迹分析来分析Fab表达。FabA-dAb和FabA-didAb表达为全长蛋白并且显示与2种抗体检测试剂反应。

大肠杆菌中表达的FabA-didAb的分析

进行进一步分析以表征HSA与融合至一个或多个dAb的FabA构建体的结合。对多种构建体进行结合测定，在所述构建体中dAbL3或dAbH4与FabA的轻链或重链融合(参见表8，构建体的详细情况和结合数据的概要)。虽然观察到仅在轻链或重链上携带dAbH4的构建体以相对弱的亲和力(分别≈9μM和3μM)与HSA结合，但对于携带dAbL3的构建体(作为单个融合物(在轻链或重链上)或伴随在相对链上的第二dAb(dAbL3或dAbH4))，观察到较高的亲和力结合。

表8

测定HSA与在轻链(LC)或重链(HC)或两者上携带dAbL3或dAbH4的FabA的结合的亲和力和动力学参数，如所指示的。没有检测到HSA与原始FabA的结合(nb)。HSA与具有(HC上的dAbH4)或(LC上的dAbH4)的FabA结合的相互作用动力学太快以致无法测定，因此，从稳态结合确定亲和力(KD)。

实施例8

FabB-didAb的表达和纯化

哺乳动物表达

在转染之前，将CHO-XE细胞在EarlsBalancedSaltsSolution(EBSS)中清洗，沉淀和在EBSS中重悬浮(2x10⁸细胞/ml)。将重链和轻链质粒以400ug总浓度添加至细胞。针对800μl细胞/DNA混合物的内部电穿孔仪的优化的电学参数用于转染。将经转染的细胞直接转移至补充有glutamax、HT和抗真菌抗生素溶液的1LCD-CHO培养基。在37℃振荡温育细胞24小时，然后转变到32℃。在第4天添加3mM丁酸钠。在第14天通过以1500xg离心以除去细胞，收获上清。通过ELISA测定表达水平。

哺乳动物表达的上清的浓缩

使用Minisette浓缩器，将包含约55μg/mlFabB-didAb的哺乳动物上清(如通过ELISA评估的)从1.8L浓缩至200ml，所述浓缩器配有10kDa分子量截留的聚醚砜(PES)膜。

蛋白G纯化

将浓缩的上清应用于经20mM磷酸盐，150mMNaClpH7.1平衡的GammabindPlusSepharose(GEHealthcare)柱。用20mM磷酸盐，150mMNaClpH7.1清洗柱子并且用0.1M甘氨酸/HClpH2.7洗脱结合的材料。收集洗脱峰并且用2MTris/HClpH8.8调节pH至约pH7。将pH经调节的洗脱液浓缩至1mg/ml并且使用10kD分子量截留的PES膜渗滤入20mM磷酸盐，150mMNaClpH7.1。

SDS-PAGE

需要时，用水稀释样品，然后向26μl样品添加10μL4XLDS样品运行缓冲液。对于非还原的样品，添加4μL100mMNEM；对于还原的样品，添加4μL10X还原剂。涡旋样品，在85℃温育5分钟，冷却并且以12500rpm离心30秒。将制备的样品装载到4-20％丙烯酰胺Tris/甘氨酸SDS凝胶上并且在125V下电泳110分钟。用CoomassieBlue蛋白染色剂对凝胶染色。

ELISA

使用夹心ELISA测量Fab-didAb的产量。简言之，用抗CH1抗体捕获Fab-didAb，然后用抗κ-HRP显示。

SDS-PAGE

如在方法中描述的，在非还原的和还原的条件下制备FabB和FabB-didAb样品并且将其在凝胶上分离和染色。参见图9。

实施例9

FabB-Fv的Thermofluor热稳定性测定

将样品(1μl约1mg/ml的样品，8μlPBS和1μlSyproorange荧光染料的30x储备液)在384孔板中以一式四份运行。使用7900HT快速实时PCR系统将板从20℃加热至99℃并且测量荧光(在490nm处激发，在530nm处发射)。结果在表D和图10中显示。

表9

实施例10

FabB-Fv的聚集稳定性测定

将1mg/ml的在PBS中的样品在25℃1400rpm下涡旋温育。在595nm处测量吸光度。该吸光度由颗粒散射的光引起并且可以与样品聚集有关。FabB-645Fv(G₄Sx2)和FabB-648Fv(G₄Sx2)和单独的FabB一样抵抗聚集。它们都比IgG对照更抗聚集(图12)。

实施例11

Fab-Fv与HSA的结合的pH依赖性

如在方法中描述的，测定Fab-Fv构建体与HSA的相互作用的结合亲和力，除了通过混合40mM柠檬酸、150mMNaCl、3mMEDTA、0.05％v/v表面活性剂P20和80mM磷酸氢二钠、150mMNaCl、3mMEDTA、0.05％v/v表面活性剂P20(以产生想要的pH)来产生pH5.0、5.5、6.0和7.0的运行缓冲液。

FabB-645Fv(G₄Sx2)对HSA的亲和力不受7.4(标准测定pH)至5.0的pH的影响。FabB-648Fv(G₄Sx2)对HSA的亲和力受pH的影响并且在pH7.4和pH5.0之间亲和力损失大约10倍。

表10

实施例12

FabB-Fv的体内小鼠PK

在皮下(sc)或静脉内(iv)以10mg/kg单次施用后，测定雄性BALB/c小鼠中FabB-645Fv(G₄Sx2)和FabB-648Fv(G₄Sx2)的药物动力学。针对每一个构建体和给药途径，对6只小鼠给药。在下列时间点从尾静脉收集系列血液样品(30μL)：皮下施用后1、4、8、24、48、72、102和168小时和静脉内施用后30分钟、1、8、24、48、72、96和168小时。将收集的血液分配入用于血清分离的具有凝块激活剂的SarstedtmicrovetteCB300Z，并且在室温下静置至少20分钟。然后将microvette在20℃，10,000rpm下离心5分钟。取出血清并且在分析前冷冻保藏。通过ELISA评估血清样品中FabB-645Fv(G₄Sx2)或FabB-648Fv(G₄Sx2)的浓度。简言之，用PBS中的hOX40-Fc包被NuncMaxisorbImmunomodule平板并且用在PBS中的1％BSA进行封闭。在PBS中的1％BSA中稀释血清样品和标准品并且应用于平板，进行1小时。用PBS清洗平板并且应用在PBS中的1％BSA中的山羊抗人κHRP缀合物的显示抗体，进行1小时。清洗平板然后用TMB底物显现，然后用2.5M硫酸终止。测量在630nm处的吸光度，并根据标准曲线确定浓度。

FabB-645Fv(G₄Sx2)和FabB-648Fv(G₄Sx2)在血浆中都具有延长的半衰期，图13。FabB-645Fv(G₄Sx2)的半衰期为71小时sc和62小时iv并且FabB-648Fv(G₄Sx2)的半衰期为25小时sc和30小时iv。

实施例13

FabB-Fv的体内功效研究

进行研究以调查FabB-645Fv和FabB-648Fv是否是体内有效的。简言之，其包括HuSCID小鼠中的稳定状态给药并且读出(readout)是T细胞移植的阻止。

在第-2天以2.475mg/kg的负荷剂量皮下施用给CB17SCID小鼠FabB-645Fv或FabB-648Fv或FabB-PEG40k或PBS。在随后的每天直至并且包括第10天，以0.75mg/kg的维持剂量皮下施用FabB-645Fv或FabB-648Fv或FabB-PEG40k或PBS。各个给药组由9-10只小鼠组成。在第-1天，用0.87mg/小鼠的大鼠抗小鼠TM-β1抗体处理所有小鼠以消除天然杀伤细胞活性。在0天，所有小鼠接受8x10⁶个人外周血单核细胞的腹膜内注射。在第14天，处死小鼠并且获取血液、脾和腹腔灌洗物。通过FACS就CD4+和CD8+T细胞分析样品。通过使用Dunnett's检验后比较的单因素方差分析来分析数据组。所有的测试构建体FabB-645Fv、FabB-648Fv和FabB-PEG40k在所有的测试区室(即血液，腹膜和脾)中同样有效。图14A、B和C。

实施例14

改变645Fv对白蛋白的亲和力的FabB-645Fv突变

通过诱变PCR在FabB-645dsFv(S3xG₄S)的645Fv部分的重链的CDR中将点突变引入选择的残基。例如I50A为用Ala置换Ile50。多种突变在表11中给出。如在方法中描述的，通过BIAcore评估Fab-645Fv突变体对人白蛋白的亲和力。所有突变不改变或减少对人白蛋白的亲和力。

表11

Fv重链突变	白蛋白	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(nM)
					I50A	HSA	3.12E+04	1.90E-03	60.9
T56A	HSA	4.65E+04	3.78E-04	8.12
					T95A	HSA	2.81E+04	2.64E-03	94.0
V96A	HSA	2.81E+04	6.42E-04	22.9
					P97A	HSA	4.60E+04	1.26E-02	275
G98A	HSA	4.73E+04	2.71E-04	5.73
					Y99A	HSA	4.71E+04	4.79E-04	10.2

S100A	HSA	3.94E+04	1.44E-03	36.6
					T100aA	HSA	3.60E+05	1.86E-02	51.6
Y100cA	HSA	1.23E+04	1.07E-03	87.0
					I50A和T95A	HSA	2.12E+04	9.94E-03	468
I50A和G98A	HSA	1.79E+04	6.96E-03	389
					I50A和Y99A	HSA			>3500
T56A和T95A	HSA	2.84E+04	8.57E-04	30.1
					T56A和G98A	HSA	2.40E+04	3.68E-03	153
T56A和Y99A	HSA	2.24E+04	1.49E-02	664

实施例15

在Fab和Fv之间1-5个Gly4Ser连接体的长度

用于在哺乳动物细胞中表达的FabB-645Fv融合质粒的构建

通过PCR装配在Fab的C末端和Fv的N-末端之间具有SGGGGS、SGGGGSGGGGS、SGGGGSGGGGSGGGGS、SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS或SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS连接体的FabB-645Fv，然后将其克隆入在HCMV-MIE启动子和SV40EpolyA序列控制下的哺乳动物表达载体。将相关重链和轻链质粒配对，用于在哺乳动物细胞中表达。

FabB-645Fv(1-5xG₄S)的哺乳动物表达

按照厂商的说明书，使用Invitrogen的293fectin转染试剂用重链和轻链质粒转染HEK293细胞。简言之，将24μg重链质粒+24μg轻链质粒和120μl293fectin+4080μlOptimem培养基一起在RT下温育20分钟。然后将混合物添加至60mL悬浮液中的60x10⁶个HEK293细胞，并且在37℃下振荡温育4天。所有构建体同样良好表达。

蛋白G纯化

通过离心澄清哺乳动物表达悬浮液并且使用10kDa分子量截留离心浓缩器将上清浓缩至约1.8mL。在16000xg下对浓缩的上清离心10分钟以除去任何沉淀物，然后以1ml/分钟将1.5mL加载至1mlHiTrap蛋白G柱(GEHealthcare)。用20mM磷酸盐，40mMNaClpH7.4清洗柱子并且用0.1M甘氨酸/HClpH2.7洗脱结合的物质。收集洗脱峰(2mL)并且用250μL1M乙酸钠调节pH至约pH5。使用10kDa分子量截留离心浓缩器，将pH经调节的洗脱液渗滤入20mM磷酸盐，150mMNaClpH7.1中并且浓缩至约250μL。所有构建体具有相似的纯化特征并且终浓度为0.5-1.1mg/ml。

FabB-645Fv(1-5xG₄S)对白蛋白的亲和力

如在方法中描述的，测定纯化的FabB-645Fv(1-5xG₄S)构建体对人和小鼠白蛋白的亲和力。在Fab的C末端和Fv的N-末端之间的1至5xGly4Ser的Fv的不同连接体长度对645Fv对人或小鼠白蛋白的亲和力没有影响。

表12

纯化的FabB-645Fv(1-5xG₄S)的SDS-PAGE分析

在非还原和还原的条件下制备FabB-645Fv(1-5xG₄S)样品并且在凝胶上分离和染色，如在方法中描述的。参见图15。

纯化的FabB-645Fv(1-5xG₄S)的尺寸排阻分析

在Superdex20010/300GLTricorn柱(GEHealthcare)上分析FabB-645Fv(1-5xG₄S)样品的大小，用20mM磷酸盐150mMNaClpH7.4的同溶剂梯度以1ml/分钟进行。

在Fab的C-末端和Fv的N-末端之间的1xG₄S或2xG₄S的连接体长度减少单体FabB-645Fv的量而增加二聚体和更高的多聚体的量。1xG₄S连接体长度时单体的量最少。在Fab的C-末端和Fv的N-末端之间的3xG₄S、4xG₄S或5xG₄S的连接体长度增加单体FabB-645Fv的量而减少二聚体和更高的多聚体的量，且对于所有三个连接体长度，水平相似。图16。

表13

纯化的FabB-645Fv(1-5xG₄S)的Thermofluor热稳定性分析

将样品(1μl约1mg/ml的样品，8μlPBS和1μlSyproorange荧光染料的30x储备液)在384孔板中以一式四份运行。使用7900HT快速实时PCR系统将板从20℃加热至99℃并且测量荧光(在490nm处激发，在530nm处发射)。结果在表14和图17中显示。

表14

实施例16

Fab-Fv中的Fv的二硫键稳定

用于在哺乳动物细胞中表达的FabB-645dsFv(2xG₄S)、FabB-648dsFv(2xG₄S)、FabΔB-645dsFv(2xG₄S)和FabΔB-648dsFv(2xG₄S)融合质粒

通过诱变PCR在Fv的重链和轻链的构架区中在选择的残基处将点突变引入FabB-645Fv(2xG₄S)和FabB-648Fv(2xG₄S)DNA序列。引入以产生Fv的重链和轻链之间的链间二硫键的突变为重链G44C和轻链G100C。除了增加半胱氨酸以在Fv中产生链间二硫键外，还通过诱变PCR通过将半胱氨酸改变为丝氨酸来除去Fab的重链和轻链之间的天然链间二硫键。包含链间二硫键的Fv称为dsFv，缺少链间二硫键的Fab称为FabΔ。然后将所有这些构建体的DNA克隆入在HCMV-MIE启动子和SV40EpolyA序列控制下的哺乳动物表达载体。将相关重链和轻链质粒配对，用于在哺乳动物细胞中表达。

FabB-645dsFv(2xG₄S)、FabB-648dsFv(2xG₄S)、FabΔB-645dsFv(2xG₄S)和FabΔB-648dsFv(2xG₄S)的哺乳动物表达

根据厂商的说明书，使用Invitrogen的293fectin转染试剂，用重链和轻链质粒转染HEK293细胞。简言之，将24μg重链质粒+24μg轻链质粒和120μl293fectin+4080μlOptimem培养基一起在RT下温育20分钟。然后将混合物添加至60mL悬浮液中的60x10⁶个HEK293细胞，并且在37℃下振荡温育4天。所有构建体同样良好表达。

FabB-645dsFv(2xG₄S)、FabB-648dsFv(2xG₄S)、FabΔB-645dsFv(2xG₄S)和FabΔB-648dsFv(2xG₄S)的蛋白G纯化

通过离心澄清哺乳动物表达悬浮液并且使用10kDa分子量截留离心浓缩器将上清浓缩至约1.8mL。在16000xg下对浓缩的上清离心10分钟以除去任何沉淀物，然后以1ml/分钟将1.5mL加载至1mlHiTrap蛋白G柱(GEHealthcare)。用20mM磷酸盐，40mMNaClpH7.4清洗柱子并且用0.1M甘氨酸/HClpH2.7洗脱结合的物质。收集洗脱峰(2mL)并且用250μL1M乙酸钠调节pH至约pH5。使用10kDa分子量截留离心浓缩器，将pH经调节的洗脱液渗滤入20mM磷酸盐，150mMNaClpH7.1中并且浓缩至约250μL。所有构建体具有相似的纯化特征并且终浓度为0.5-0.8mg/ml。

FabB-645dsFv(2xG₄S)、FabB-648dsFv(2xG₄S)、FabΔB-645dsFv(2xG₄S)和FabΔB-648dsFv(2xG₄S)对白蛋白的亲和力

如在方法中描述的，测定纯化的FabB-645dsFv(2xG₄S)、FabB-648dsFv(2xG₄S)、FabΔB-645dsFv(2xG₄S)、FabΔB-648dsFv(2xG₄S)构建体对人和小鼠白蛋白的亲和力。Fv的二硫键稳定没有影响或轻微增加Fv对人或小鼠白蛋白的亲和力。

表15

纯化的FabB-645dsFv(2xG₄S)、FabB-648dsFv(2xG₄S)、FabΔB-645dsFv(2xG₄S)和FabΔB-648dsFv(2xG₄S)的SDS-PAGE分析

在非还原和还原的条件下制备纯化的FabB-645dsFv(2xG₄S)、FabB-648dsFv(2xG₄S)、FabΔB-645dsFv(2xG₄S)、FabΔB-648dsFv(2xG₄S)样品并且在凝胶上分离和染色，如在方法中描述的。参见图18。

纯化的FabB-645dsFv(2xG₄S)、FabB-648dsFv(2xG₄S)、FabΔB-645dsFv(2xG₄S)和FabΔB-648dsFv(2xG₄S)的尺寸排阻分析

在Superdex20010/300GLTricorn柱(GEHealthcare)上分析纯化的FabB-645dsFv(2xG₄S)、FabB-648dsFv(2xG₄S)、FabΔB-645dsFv(2xG₄S)、FabΔB-648dsFv(2xG₄S)样品的大小，用20mM磷酸盐150mMNaClpH7.4的同溶剂梯度以1ml/分钟进行。

与其中Fv不具有链间二硫键的Fab-Fv相比较，将链间二硫键导入645Fv或648Fv的Fv增加单体Fab-Fv种类的量。除去来自Fab-Fv的Fab部分的天然链间二硫键对存在的单体种类的量仅有小的影响。图19。

表16

纯化的FabB-645dsFv(2xG₄S)、FabB-648dsFv(2xG₄S)、FabΔB-645dsFv(2xG₄S)和FabΔB-648dsFv(2xG₄S)的Thermofluor热稳定性分析

将样品(1μl约1mg/ml的样品，8μlPBS和1μlSyproorange荧光染料的30x储备液)在384孔板中以一式四份运行。使用7900HT快速实时PCR系统将板从20℃加热至99℃并且测量荧光(在490nm处激发，在530nm处发射)。

与其中Fv不具有链间二硫键的Fab-Fv相比较，将链间二硫键导入645Fv或648Fv的Fab-Fv的Fv部分增加了Fv的热稳定性。除去来自Fab-Fv的Fab部分的天然链间二硫键降低Fab-Fv的Fab部分的热稳定性。

表17

n.d.＝未确定的。分析软件不能解析该拐点。

用于FabD的Biacore方法

通过表面等离子共振(SPR)确定Fab-dAb和Fab-didAb构建体的相互作用的结合亲和力和动力学参数，所述表面等离子共振在使用CM5传感器芯片和HBS-EP(10mMHEPES(pH7.4)，150mMNaCl，3mMEDTA，0.05％v/v表面活性剂P20)运行缓冲液的BiacoreT100上进行。用人F(ab')₂特异性山羊Fab(JacksonImmunoResearch，109-006-097)或内部产生的抗人CH1单克隆抗体将人Fab样品捕获至传感器芯片表面。用小鼠F(ab')₂特异性山羊Fab(JacksonImmunoResearch,115-006-072)捕获小鼠Fab样品。通过标准胺偶联化学实现捕获抗体的共价固定。

各个测定循环由下列步骤组成：首先用1分钟注射捕获Fab-dAb或Fab-didAb构建体，然后进行由抗原的3分钟注射组成的结合阶段，之后监控解离5分钟。各个循环后，通过40mMHCl的2x1分钟注射，随后5mMNaOH的30秒注射来再生捕获表面。使用的流速为10μl/分钟(用于捕获)，30μl/分钟(用于结合和解离阶段)，和10μl/分钟(用于再生)。

关于动力学测定，进行抗原的滴定(对于人或小鼠血清白蛋白，一般62.5nM-2μM；对于IL-1β，1.25-40nM；对于细胞表面受体D，20-1.25nM)，空白流动池用于参照扣除，且包括缓冲液空白注射以减去仪器噪音和偏差。

使用BiacoreT100评估软件，通过所得的传感图至标准1:1结合模型的同时全局拟合，确定动力学参数。

为了检验同时结合，在捕获的Fab-dAb上注射5μMHSA或100nMIL-1β或5μMHSA和100nMIL-1β的混合溶液的3分钟注射。以相同的方式，使用2μMHSA或MSA和20nM小鼠细胞表面受体D的终浓度评估白蛋白和细胞表面受体D的同时结合。

实施例17

mFabC-mdidAb和mFabD-mdidAb的哺乳动物表达

根据厂商的说明书，使用Invitrogen的293fectin转染试剂，用重链和轻链质粒转染HEK293细胞。简言之，将2μg重链质粒+2μg轻链质粒与10μl293fectin+340μlOptimem培养基一起在RT下温育20分钟。然后，将混合物添加至悬浮液中的5x10⁶个HEK293细胞并且在37℃在振荡下温育6天。

ELISA

使用夹心ELISA测量mFab-mdidAb的产量。简言之，用抗CH1抗体捕获mFab-mdidAb，然后用抗κ-HRP显示。

表18

实施例18

进行进一步的动力学分析以评估血清白蛋白和人OX40与纯化的FabB-didAb,-dAbL1(CK-G4Sx2)&-dAbH1(CH1-G4Sx2)和FabB-didAb,-dAbL2(CK-G4Sx2)&-dAbH2(CH1-G4Sx2)融合物的相互作用(表19)。FabB-didAb,-dAbL1(CK-G4Sx2)&-dAbH1(CH1-G4Sx2)和FabB-didAb,-dAbL2(CK-G4Sx2)&-dAbH2(CH1-G4Sx2)都保留了原始FabB对人OX40的亲和力(表20)。

通过下列评估FabB-didAb，-dAbL1(CK-G4Sx2)&-dAbH1(CH1-G4Sx2)和FabB-didAb,-dAbL2(CK-G4Sx2)&-dAbH2(CH1-G4Sx2)构建体同时结合人或小鼠血清白蛋白和人OX40的潜力：将各个Fab-didAb构建体捕获至传感器芯片表面，然后进行2μM白蛋白(人或小鼠)或50nM人OX40，或2μM白蛋白和50nMOX40的混合溶液的分开的3分钟注射。对于每一个Fab-didAb构建体，都观察到了HSA结合。对于每一个Fab-didAb构建体，对组合的白蛋白/OX40溶液观察到的响应几乎与独立的注射的响应的总和相同(概述于表21)。这表明Fab-didAb能够同时结合OX40和血清白蛋白。原始FabB仅结合OX40，没有显著结合人或小鼠白蛋白。

表19

测定的HSA和MSA结合Fab-didAb融合物的亲和力和动力学参数。

表20

hOX40-Fc结合FabB和FabB-didAb融合物的亲和力和动力学参数。

表21

上表显示在分别注射HSA或MSA或hOX40-Fc，或注射预混合的白蛋白和hOX40-Fc后，对各个构建体观察到的结合响应(RU)。在各个情况下，终浓度为2μM(白蛋白HSA)和50nM(hOX40-Fc)。单独的白蛋白和hOX40-Fc的响应的总和在括号中显示。

实施例19

进行进一步的动力学分析以评估血清白蛋白和小鼠细胞表面受体D与mFabD-mdidAb,-mdAbL1(CK-G₄Sx2)&mdAbH1(CH1-G₄Sx2)和mFabD-mdidAb,-mdAbL2(CK-G₄Sx2)&mdAbH2(CH1-G₄Sx2)的相互作用(表22)。mFabD-mdidAb对HSA都表现出相对高的亲和力结合(分别地K_D＝2.78nM和8.97nM)。mFabD-mdidAb,-mdAbL2(CK-G₄Sx2)&mdAbH2(CH1-G₄Sx2)还以相似的亲和力(K_D＝22nM)结合MSA，然而没有观察到mFabD-mdidAb,-mdAbL1(CK-G₄Sx2)&mdAbH1(CH1-G₄Sx2)与MSA的结合。2个mFabD-mdidAb都保留了原始mFabD对小鼠细胞表面受体D的亲和力(表23)。

通过下列评估mFabD-mdidAb，-mdAbL1(CK-G₄Sx2)&mdAbH1(CH1-G₄Sx2)和mFabD-mdidAb,-mdAbL2(CK-G₄Sx2)&mdAbH2(CH1-G₄Sx2)同时结合人或小鼠血清白蛋白和小鼠细胞表面受体D的潜力：将各个mFab-mdidAb构建体捕获至传感器芯片表面，然后进行2μM白蛋白(人或小鼠)或20nM小鼠细胞表面受体D，或2μM白蛋白和20nM细胞表面受体D的混合溶液的分开的3分钟注射。再次，对于2种mFab-mdidAb构建体，都观察到HSA结合，而仅mFabD-mdidAb,-mdAbL2(CK-G₄Sx2)&mdAbH2(CH1-G₄Sx2)结合MSA。对于每一个mFab-mdidAb构建体，对组合的白蛋白/细胞表面受体D溶液观察到的响应几乎与独立的注射的响应的总和相同(概述于表24)。这表明mFab-mdidAb能够同时结合细胞表面受体D和血清白蛋白。原始mFabD仅结合细胞表面受体D，没有显著结合人或小鼠白蛋白。

表22

测定的HSA和MSA结合mFabD-mdidAb,-mdAbL1(CK-G₄Sx2)&mdAbH1(CH1-G₄Sx2)和mFabD-mdidAb,-mdAbL2(CK-G₄Sx2)&mdAbH2(CH1-G₄Sx2)的亲和力和动力学参数。

表23

小鼠细胞表面受体D-Fc结合mFabD,mFabD-mdidAb,-mdAbL1(CK-G₄Sx2)&mdAbH1(CH1-G₄Sx2)和mFabD-mdidAb,-mdAbL2(CK-G₄Sx2)&mdAbH2(CH1-G₄Sx2)的亲和力和动力学参数。

表24

上表显示在分别注射HSA或MSA或小鼠细胞表面受体D-Fc，或注射预混合的白蛋白和小鼠细胞表面受体D-Fc后，对各个构建体观察到的结合响应(RU)。在各个情况下，终浓度为2μM(白蛋白HSA)和20nM(小鼠细胞表面受体D-Fc)。单独的白蛋白和小鼠细胞表面受体D-Fc的响应的总和在括号中显示。

实施例20

进行进一步的分析以评估mFabD-mdidAb,-mdAbL1(CK-G₄Sx2)&mdAbH1(CH1-G₄Sx2)或mFabD-mdidAb,-mdAbL2(CK-G₄Sx2)&mdAbH2(CH1-G₄Sx2)与血清白蛋白和细胞表面上表达的小鼠细胞表面受体D的同时的相互作用。2种mFabD-mdidAb都能够同时结合FITC标记的HSA和活化的小鼠T细胞的细胞表面上表达的细胞表面受体X(图11)。mFabD能够结合活化的小鼠T细胞的细胞表面上表达的细胞表面受体X(数据未显示)，但不结合FITC标记的HSA。

实施例21

FabB-645dsFv(3xG4S)的表达和纯化

哺乳动物表达

在转染前，将1.4x1010个CHO-SV细胞在EarlsBalancedSaltsSolution(EBSS)中清洗，然后沉淀。将7mg重链和7mg轻链质粒DNA加至细胞。添加EBBS缓冲液至10ml的终体积。在内部电穿孔仪上使用优化的电学参数电穿孔800μl上述每比色杯。将经转染的细胞直接转移至补充有glutamax、HT和抗真菌抗生素溶液的7x1LCD-CHO培养基。在37℃振荡温育细胞24小时，然后转变到32℃。在第4天添加3mM丁酸钠。在第10或14天通过以1500xg离心，除去细胞，收获上清。通过蛋白G测定来测定表达水平。

哺乳动物上清液的浓缩

使用配备2x10kDa分子量截留聚醚砜(PES)膜的Minisette浓缩器，将含有15μg/mlFabB-645dsFv(3xG4S)的合并的哺乳动物上清液从6.5L浓缩到800ml。

蛋白G纯化

将浓缩的上清液以135cm/小时应用到在20mM磷酸盐、150mMNaClpH7.4中平衡的50mlGammabindPlusSepharose(GEHealthcare)柱。用20mM磷酸盐、150mMNaClpH7.4洗涤柱，并且用0.1M甘氨酸/HClpH2.7洗脱结合的材料。收集洗脱峰，并且用2MTris/HClpH8.8将pH调整至～pH7。将pH经调整的洗脱液浓缩至7ml，且使用具有10kDa分子量截留膜的AmiconUltra-15浓缩器和在甩开转头中以4000xg离心，渗滤到20mM磷酸盐、150mMNaClpH7.4中。

Superdex200纯化

将经浓缩和渗滤的蛋白G洗脱液施加到在20mM磷酸盐、150mMNaClpH7.4中平衡的XK26/60Superdex200(GEHealthcare)柱。用20mM磷酸盐、150mMNaClpH7.4的同溶剂梯度以30cm/小时冲洗柱。收集5ml级分，且通过用20mM磷酸盐、150mMNaClpH7.4的同溶剂梯度以1ml/min冲洗的Superdex20010/300GLTricorn柱(GEHealthcare)进行分析。合并仅含有单体的级分，并且使用具有10kDa分子量截留膜的AmiconUltra-15浓缩器和在甩开转头中以4000xg离心，浓缩至～10mg/ml。

FabB-645dsFv(3xG4S)的SDS-PAGE分析

用PBS将FabB-645dsFv(3xG4S)稀释至0.32mg/ml，并且向26μl中加入10μL4XLDS(Invitrogen)样品运行缓冲液。对于非还原的样品，加入4μL100mMNEM，并且对于还原的样品，加入4μL10X还原剂(Invitrogen)。将样品涡旋，在100℃温育3分钟，冷却且以12500rpm离心30秒。将制备的样品(10μl/2μg)装载到4-20％丙烯胺Tris/GlycineSDS凝胶上，并且在125V运行110分钟。用考马斯蓝蛋白质染剂将凝胶染色，并且用7.5％乙酸进行脱色。参见图25。在还原和非还原条件下，FabB-645dsFv(3xG4S)基本上都是一个条带。在非还原凝胶的主条带上方和下方的2个小条带是其中仍未形成链间二硫键中的一个或另一个的情况。在还原凝胶的主条带上方的1个小条带是不可还原的FabB-645dsFv(3xG4S)。参见图25。

FabB-645dsFv(3xG4S)的尺寸排阻分析

用PBS将FabB-645dsFv(3xG4S)稀释至0.5mg/ml。将100μl该样品注射到Superdex20010/300GLTricon柱(GEHealthcare)上，并且用PBS的同溶剂梯度以1ml/分钟冲洗。通过在280nm和214nm处的吸光度检测峰。参见图26。在色谱图中存在单个、对称峰，滞留时间为13.44计量分钟。使用由在相同条件下运行的BioRad凝胶过滤标准(151-1901)的滞留时间制备的标准曲线，将这个峰滞留时间转换为表观分子量。FabB-645dsFv(3xG4S)的表观分子量是87kDa。

FabB-645dsFv(3xG4S)的热稳定性分析

为了测量热稳定性，用PBS将FabB-645dsFv(3xG4S)稀释至1mg/ml。在384孔板中，一式四份地向1μl该稀释样品中加入8μlPBS和1μlSypro橙色荧光染料的30x原液。使用7900HT快速实时PCR系统将板从20℃加热到99℃，并且测量荧光(在490nm激发，在530nm发射)。参见图27A。FabB-645dsFv(3xG4S)是热稳定分子，具有超过70℃的Tm。

为了测量在pH范围下的热稳定性，在pH2.2-8.0(以0.2增量)用缓冲液将10mg/ml的FabB-645dsFv(3xG4S)稀释至0.11mg/ml。通过混合0.1M柠檬酸和0.2M磷酸氢二钠且加入NaCl以平衡离子强度来制备pH缓冲液。向45μl各pH稀释样品中加入5μlSypro橙色荧光染料的30x原液。在384孔板中一式四份地分析这些样品的10μl等分试样。使用7900HT快速实时PCR系统将板从20℃加热到99℃，并且测量荧光(在490nm激发，在530nm发射)。随后针对pH标绘Tm。参见图27B。FabB-645dsFv(3xG4S)的gA26Fab和645dsFv结构域具有在pH4.5-8.0上在很大程度上不受pH影响的Tm。低于pH4.5，两种结构域的Tm都降低，直至在pH4.0，2个分开的解折叠事件无法区分，这个单一事件具有65℃的Tm。该无法区分的单一解折叠事件的Tm随着pH的降低继续降低，但在pH2.2时仍超过50℃。

FabB-645dsFv(3xG4S)的体外功效

通过基于细胞的OX40配体阻断测定评估FabB-645dsFv(3xG4S)的体外功效。简言之，分离人PBMC，并且通过与5μg/mlPHA-L(植物血凝素-L)在37℃/5％CO₂下一起温育24-72小时来进行激活。细胞随后在PBS/0.09％叠氮化钠中洗涤，且以0.25x10⁶个细胞/孔铺板到96孔培养板中。在PBS/5％HSA中制备FabB-645dsFv(3xG4S)的稀释物。还在PBS/5％HSA中制备4μg/ml生物素化的CD252-CD8融合蛋白的溶液。将50μl的各种FabB-645dsFv(3xG4S)稀释物加入50μlCD252-CD8融合蛋白中，并且将混合物与激活的T细胞一起在4℃温育30分钟。在该温育后，细胞在PBS/0.09％叠氮化钠中洗涤。随后将激活的T细胞与100μl在PBS中的链霉亲和素-PE一起在4℃温育30分钟。再次在PBS/0.09％叠氮化钠中洗涤细胞，且随后将其重悬浮于缓冲液中，并且通过流式细胞术进行分析。已显示，FabB-645dsFv(3xG4S)阻断OX40配体与在人PBMC的表面上表达的OX40的结合，具有～3.5nM的EC50，参见图28。

FabB-645dsFv(3xG4S)的体内功效

为了研究体内剂量应答关系，用FabB-645dsFv(3xG4S)进行研究。简言之，这涉及在HuSCID小鼠中以0.3、3和30μg/ml稳态给药，且获取T细胞移入的预防的读数。

在第-2天以2.475mg/kg或0.2475mg/kg或0.02475mg/kg的负荷剂量皮下施用给CB17SCID小鼠FabB-645dsFv(3xG4S)PBS。在随后的每天直至并且包括第14天，以0.75mg/kg或0.075mg/kg或0.0075mg/kg的维持剂量皮下施用FabB-645dsFv(3xG4S)或PBS。各个给药组由9-10只小鼠组成。在第-1天，用0.87mg/小鼠的大鼠抗小鼠TM-β1抗体处理所有小鼠以消除天然杀伤细胞活性。在0天，所有小鼠接受8x10⁶个人外周血单核细胞的腹膜内注射。在第14天，处死小鼠并且获取血液、脾和腹腔灌洗物。通过FACS就CD4+和CD8+T细胞分析样品。通过使用Dunnett's检验后比较的单因素方差分析来分析数据组。参见图29A、B和C。30和3μg/ml给药在所有区室中是同样有效的，而0.3μg/ml给药在血液和脾中在统计学上是有效的，但未达到由30和3μg/ml给药产生的最高水平。

实施例22

645Fv-652Fabs的构建、表达和抗原结合

645Fv-652Fab质粒的构建

由第三方承包商(DNA2.0)完成645Fv-652Fab(L-3xG4S，H-3xG4S)、645Fv-652Fab(L-TVAAP，H-ASTKGP)、645dsFv-652Fab(L-3xG4S，H-3xG4S)、645dsFv-652Fab(L-TVAAP，H-ASTKGP)的全基因合成。关于645Fv-652Fabs的氨基酸序列，参见图30A、B、C和D。将所有基因克隆到UCB拥有专利权的在HCMV-MIE启动子和SV40EpolyA序列的控制下的哺乳动物表达载体内。

645Fv-652Fabs的哺乳动物表达

根据制造商的说明书，使用Invitrogen的293fectin转染试剂，用重链和轻链质粒转染HEK293细胞。简言之，使2μg重链质粒和2μg轻链质粒与10μl293fectin和340μlOptimem培养基一起在RT温育20分钟。随后将混合物加入悬液中的5x10⁶个HEK293细胞中，并且在37℃振荡温育4天。在4天后，通过以1500xg离心，去除细胞，收集上清液，并且随后进行0.22μm无菌过滤。

645Fv-652Fab的定量

使用夹心ELISA测量哺乳动物上清液中的Fv-Fab的浓度。用抗CH1抗体捕获样品中的Fv-Fab，并且用抗κ-HRP缀合物检测。用TMB显色检测抗体，并且根据标准曲线计算未知样品的浓度。所有645Fv-652Fabs具有相似的表达水平，但二硫键稳定的Fv形式以非二硫键稳定的形式的水平的55％-75％表达，参见图31。

645Fv-652Fab的抗原结合

Biacore方法

使用CM5传感器芯片，通过在Biacore3000上进行的表面等离子共振(SPR)，测定Fv-Fab构建体的相互作用的动力学常数和结合应答。运行缓冲液HBS-EP由pH7.4的10mMHEPES、150mMNaCl、3mMEDTA、0.05％v/v表面活性剂P20组成。使用内部产生的抗人CH1单克隆抗体，将样品捕获到传感器芯片表面上。通过标准胺偶联化学实现捕获抗体的共价固定。

测定循环由下述组成：捕获Fv-Fab构建体1分钟，随后为结合期(对于HSA，3分钟或对于hIL13，6分钟)，然后监控解离5分钟(HSA)或20分钟(hIL13)。各个循环后，通过40mMHCl的2x1分钟注射，随后5mMNaOH的30秒注射来再生捕获表面。使用的流速为10μl/分钟(用于捕获)，30μl/分钟(用于结合和解离阶段)，和10μl/分钟(用于再生)。

通过抗原的滴定执行动力学测定(对于HSA，50nM-0.3125nM的二倍稀释物；对于hIL13，单一浓度-20nM)。空白流动池和缓冲液空白注射使得能够双重参考数据。

使用Biacore3000，4.1Evaluation软件，通过所得到的传感图与标准1:1结合模型的同时总体拟合来测定动力学参数。

为了测定同时结合，在捕获的FvFab上注射分开的50nMHSA或20nMhIL13或50nMHSA和20nMhIL13的混合溶液的6分钟注射。

Biacore亲和力实验

执行动力学分析，以评估HSA和hIL13与645Fv-652Fab(L-3xG4S，H-3xG4S)、645Fv-652Fab(L-TVAAP，H-ASTKGP)、645dsFv-652Fab(L-3xG4S，H-3xG4S)和645dsFv-652Fab(L-TVAAP，H-ASTKGP)的相互作用的亲和力，参见图30A和30B。所有Fv-Fab以同等亲和力和结合水平结合HSA。645Fv-652Fab(L-3xG4S，H-3xG4S)和645dsFv-652Fab(L-3xG4S，H-3xG4S)以～0.1nM的亲和力结合hIL13，而645Fv-652Fab(L-TVAAP，H-ASTKGP)和645dsFv-652Fab(L-TVAAP，H-ASTKGP)以约0.6nM的亲和力结合。与TVAAP/ASTKGP连接体相比较，hIL13对于具有3xG4S连接体的Fv-Fabs的亲和力的差异主要在于结合速率。hIL13和HSA对于二硫键稳定的和非二硫键稳定的Fv-Fabs的亲和力是相当的。hIL13对于所有构建体的结合水平也是相当的。

评估了Fv-Fabs645Fv-652Fab(L-3xG4S，H-3xG4S)、645Fv-652Fab(L-TVAAP，H-ASTKGP)、645dsFv-652Fab(L-3xG4S，H-3xG4S)和645dsFv-652Fab(L-TVAAP，H-ASTKGP)对于HSA和hIL13的同时结合。将各Fv-Fab构建体捕获至传感器芯片表面，随后进行50nMHSA或20nMhIL13或50nMHSA和20nMhIL13的混合溶液的分开的6分钟注射。对于各个Fv-Fab构建体，针对组合的HSA/hIL13溶液的结合应答等价于独立注射的应答的总和，参见图32C。这证实，Fv-Fabs能够同时结合hIL13和HSA。

图32C显示在HSA或hIL13的分开注射或预混合的HSA和hIL13的注射后，对于各构建体观察到的结合应答(RU)。在各情况下，终浓度是50nMHSA和20nMhIL13。单独的HSA和hIL13应答的总和示于括号中。

Claims

1.一种多价抗体融合蛋白，其包含对于目的抗原具有第一特异性的Fab或Fab'片段，且进一步包含其为对于第二目的抗原具有特异性的VH/VL对的两个单域抗体(dAb)，其中所述两个单域抗体通过在2个半胱氨酸残基之间的二硫键连接，所述2个半胱氨酸残基一个在VH中并且一个在VL中，其中VH中的半胱氨酸位于位置44上并且VL中的半胱氨酸位于位置100上，并且其中所述第二抗原是白蛋白，所述VH单域抗体包含SEQIDNO:62所示的CDR-H1，SEQIDNO:63所示的CDR-H2，和SEQIDNO:64所示的CDR-H3；并且所述VL单域抗体包含SEQIDNO:65所示的CDR-L1，SEQIDNO:66所示的CDR-L2，和SEQIDNO:67所示的CDR-L3。

2.根据权利要求1的多价抗体融合蛋白，其中所述两个单域抗体是协同结合所述第二抗原的互补VH/VL对。

3.根据权利要求1或2的多价抗体融合蛋白，其中所述第一抗原和第二抗原是不同的实体。

4.根据权利要求1的多价抗体融合蛋白，其中所述V_HdAb与所述Fab或Fab'重链直接或间接连接。

5.根据权利要求1的多价抗体融合蛋白，其中所述V_LdAb与所述Fab或Fab'轻链直接或间接连接。

6.根据权利要求4或权利要求5的多价抗体融合蛋白，其中所述V_HdAb与所述Fab或Fab'重链的C末端直接或间接连接，并且所述V_LdAb与所述Fab或Fab'轻链的C末端直接或间接连接。

7.根据权利要求1的多价抗体融合蛋白，其中所述VH和/或VL结构域经由SEQIDNO:224或SEQIDNO:225中给出的序列的连接体与所述Fab或Fab'片段连接。

8.根据权利要求1的多价抗体融合蛋白，其中所述第二抗原是人血清白蛋白。

9.根据权利要求1的多价抗体融合蛋白，其中所述VH单域抗体序列为SEQIDNO:204，并且所述VL单域抗体序列为SEQIDNO:205。