BR112014011304B1

BR112014011304B1 - Anticorpos de ligação com albumina e fragmentos de ligação dos mesmos, proteína de fusão de anticorpo bi-específico, polinucleotídeo, célula hospedeira, processo de produção de anticorpo ou fragamento do mesmo, formulação farmacêutica e uso

Info

Publication number: BR112014011304B1
Application number: BR112014011304-1A
Authority: BR
Inventors: Ralph Adams; Pallavi Bhatta; Sam Philip Heywood; David Paul Humphreys
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2022-03-03
Also published as: HUE037142T2; BR112014011304A2; SI2776466T1; US20180134774A1; NO2839445T3; ES2649098T3; WO2013068571A1; CN103946237A; US20140302033A1; AU2012335496A1; EP2776466B1; MX351502B; DK2776466T3; PL2776466T3; HRP20171608T1; CA2856216A1; KR102048382B1; EA201400568A1; JP2014534978A; JP6411214B2

Abstract

ANTICORPOS DE LIGAÇÃO COM ALBUMINA E FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO DOS MESMOS. Um anticorpo de ligação com albumina se soro ou fragmento do mesmo, constituído por um domínio variável de cadeia pesada tendo a sequência dada em SEQ ID N0:2 e/ou contendo um domínio variável de cadeia leve tendo a sequência dada em SEQ ID N0:3 ou SEQ ID N0:4, especialmente contendo um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve tendo a sequência dada em SEQ ID N0:1 e SEQ ID N0:3 ou um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve tendo a sequência dada em SEQ ID N0:2 e SEQ ID N0:4. A apresentação também se aplica a polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou fragmentos, vetores contendo os mesmos e células hospedeiras capazes de expressar os polinucleotídeos. A apresentação inclui ainda composições farmacêuticas contendo os anticorpos ou fragmentos e a terapêutica usada de qualquer um deles.

Description

[0001] A invenção atual refere-se a anticorpos de ligação com albumina novos e fragmentos dos mesmos. Tais anticorpos poderão ser utilizados, por exemplo, para prolongar a meia vida do soro in vivo de fármacos ou proteínas conjugadas com os mesmos. Também são apresentados os métodos para a produção de tais moléculas e composições farmacêuticas contendo os mesmos.

[0002] A alta especificidade e a afinidade de anticorpos faz com que eles sejam agentes ideais de diagnóstico e terapêutica, especialmente para a modulação de interações de proteína: proteína. Os avanços no campo da tecnologia de anticorpos recombinante resultaram na produção de fragmentos de anticorpos, tais como os fragmentos Fv, Fab, Fab' e F(ab')2 e outros fragmentos de anticorpos. Estas moléculas menores retêm a atividade de ligação com o antígeno dos anticorpos inteiros e também pode exibir uma penetração de tecido e propriedades fármaco- cinéticas melhoradas em comparação com moléculas totalmente de imunoglobulina. Na realidade, os fragmentos de anticorpos provaram ser agentes terapêuticos versáteis, conforme é visto pelo sucesso recente de produtos, tais como ReoPro(marc reg.)R e Lucentis)marca reg.). Embora tais fragmentos pareçam exibir muitas vantagens em relação às imunoglobulinas integrais eles também sofrem uma velocidade aumentada de depuração do soro porque não possuem o domínio Fc que fornece um tempo de vida longo in vivo (Medasan et al., 1997, J. Immunol. 158:2211 - 2217).

[0003] São conhecidos os meios para se melhorar a meia vida dos fragmentos de anticorpos, tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 e outros fragmentos de anticorpo. Uma abordagem tem sido conjugar o fragmento com moléculas de polímero. Assim sendo, a meia vida curta de circulação de fragmentos Fab', F(ab')2 em animais tém sido melhorada pela conjugação com polietileno glicol (PEG; ver, por exemplo, a WO 98/25791, WO 99/64460 e a WO 98/37200). Outra abordagem tem sido modificar o fragmento do anticorpo por conjugação com um agente que interage com o receptor FcRn (ver, por exemplo, a WO 97/34631). Ainda outra abordagem para prolongar a meia vida tem sido usar polipeptídeos que se ligam com a albumina do soro (ver, por exemplo, Smith et al., 2001, Bioconjugate Chem. 12:750 - 756; EPO 486525; US 6267964; WO 04/001064; WO 02/076489; e WO 01/45746). A albumina do soro é uma proteína abundante em ambos os compartimentos vascular e extravascular com uma meia vida em homens de cerca de 19 dias (Peters, 1985, Adv Protein Chem. 37:161 - 245). Este é semelhante à meia vida de lgG1, que é de cerca de 21 dias (Waldeman & Strober, 1969, Progr. Allergy, 13:1-110).

[0004] Domínios de uma só variável que se ligam com albumina anti-soro têm sido descritos juntamente com os seus usos como conjugados para o aumento da meia vida de fármacos, incluindo fármacos NCE (entidade química), proteínas e peptídeos, por exemplo, ver Holt et al., Protein Engineering, Design & Selection, vol 21, 5, pp 283 - 288, WO 043119, WO 2008/096158, WO 05118642, WO 2006/0591056 e a WO 2011/006915. Outros anticorpos de albumina anti-soro e seus usos em formatos de anticorpo multi-especifico têm sido descritos nas WO 2009/040562, WO 2010/035012 e na WO 2011/086091. Especialmente, tem sido descritos dois domínios variáveis conhecidos como 645 gH1 e 645 gl_1 tendo as sequências dadas em SEQ ID NO:9 e SEO ID NO:10.

[0005] A invenção atual apresenta anticorpos de ligação com albumina melhorados, derivados daquela sequências. Vantajosamente, os anticorpos da apresentação atual têm afinidade comparável com o anticorpo inicial e além disso, poderão ter uma ou mais propriedades que torna os mesmos adequados para uso em um produto terapêutico, por exemplo, imunogenicidade, estabilidade aumentada, expressão melhorada ou semelhante.

[0006] De preferência, os anticorpos da invenção são ligados à albumina de soro humano.

[0007] Em uma realização, os anticorpos da invenção atual são ligados à albumina de soro cinomolgus, albumina de soro murina e/ou albumina de soro de rato.

[0008] Em uma realização, a invenção atual apresenta um anticorpo de ligação com albumina ou fragmento do mesmo constituído por uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência dada em SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:2.

[0009] Em uma realização, a invenção atual apresenta um anticorpo de ligação com albumina ou fragmento do mesmo constituído por uma região variável de cadeia leve tendo a sequência dada em SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4.

[0010] Em uma realização, a invenção atual apresenta um anticorpo de ligação com albumina ou fragmento do mesmo constituído por uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência dada em SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência dada em SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4.

[0011] Em uma realização, a região variável de cadeia pesada tem uma cisteina na posição 100 da cadeia leve e tem a sequência dada em SEQ ID NO:4.

[0012] As regiões variáveis do anticorpo da invenção atual poderão ser incorporadas em qualquer formato de anticorpo adequado. Tais anticorpos incluem anticorpos inteiros ou fragmentos funcionalmente ativos ou derivados do mesmo. Assim sendo, tais anticorpos de ligação com albumina poderão ser constituídos por uma molécula de anticorpo completa tendo cadeias pesadas e leves com comprimento integral ou um fragmento do mesmo e poderão ser, mas não são limitados a Fab, Fab modificado, Fab', F(ab’)2, Fv, anticorpos sozinhos de domínio variável, anticorpos scFv, bi, tri ou tetravalentes, dia-corpos Bis-scFv, tria-corpos, tetracorpos, tricorpos, DVD-lg, DART, BiTE e fragmentos de ligação com epitopo de qualquer dos acima (por exemplo, ver Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23 (9):1126 - 1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - On line 2 (3), 209 - 217). Os métodos de criação e fabricação destes fragmentos de anticorpo são bem conhecidos na arte (por exemplo, ver Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Anticorpos multi- valentes poderão conter especificidades múltiplas ou poderão ser mono-específicos (por exemplo, ver WO 92/22853, WO 99/37791 e WO 05/113605). Outros formatos multivalentes e/multi-específicos incluem aqueles descritos em WO 2009/040562, WO 2010/035012 e WO 2011/086091 incluindo o Fab-Fv e Fab-dsFv ilustrados aqui na figura 1A e 1B respectivamente.

[0013] Os domínios de região constante da molécula de anticorpo da invenção atual, se presentes, poderão ser escolhidos tendo referência com a função proposta da molécula de anticorpo, e especialmente, as funções de executor que possam ser requeridas. Por exemplo, os domínios de região constante poderão ser domínios humanos IfA, IgD, IgE, IgG ou IgM,. Especialmente, poderão ser utilizados domínios de região constante humanos IgG, especialmente dos isotipos lgG1 e lgG3 quando são requeridas as funções de executor do anticorpo. Alternativamente, poderão ser usados os isotipos iGg2 e iGg4 quando não são requeridas as funções do executor de anticorpo. Será visto que poderão ser também usadas as variantes de sequências destes domínios com região constante. Por exemplo, poderão ser usadas as moléculas lgG4 nas quais foi alterada a serina na posição 241 para prolina, conforme descrito em Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105 - 108. Será também entendido por uma pessoa adestrada na arte que os anticorpos poderão sofrer uma variedade de modificações pós-translacinais. O tipo e a extensão destas modificações, com freqüência depende da linha de células hospedeiras usadas para a expressão do anticorpo, assim como das condições de cultura. Tais modificações poderão incluir variações na glicosilação, oxidação de metionina, formação de diquetopiperazina, isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. Uma modificação freqüente é a perda do resíduo básico com terminal carboxila (como lisina ou arginina) devido à ação de carboxipeptidases (conforme descrito em Harris, R.J., Journal of Chromatography 705:129- 134,1995).

[0014] Em uma realização, a cadeia pesada de anticorpo é constituída por um domínio CH1 e a cadeia leve de anticorpo é constituída por um domínio CL, kappa ou lambda, qualquer deles.

[0015] Será visto que tais anticorpos de ligação com albumina ou fragmentos dos mesmos poderão ser conjugados com quaisquer outros anticorpos ou fragmentos dos mesmos, outras proteínas, tais como enzimas, hormônios, citoquinas, peptídeos ou outras moléculas ou fármacos, conforme seja desejado. Os anticorpos de ligação com albumina da invenção atual são especialmente úteis em prolongar a meia vida do soro dessas entidades conjugadas com os mesmos.

[0016] Em um exemplo, o anticorpo de ligação com albumina da invenção atual é ligado, covalentemente ou não covalentemente, a um composto terapêutico ou de diagnóstico escolhido. Compostos terapêuticos adequados poderão incluir, por exemplo, agonistas ou antagonistas receptores, inibidores de enzima, quelatores de metal, agentes anti-virais, agentes antifúgicos, fármacos cardiovasculares e fármacos quimo-terapêuticos.

[0017] Em uma realização, um anticorpo de ligação com albumina ou fragmento do mesmo de acordo com a invenção atual é fundido ou é conjugado com um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo que é ligado a um antígeno de interesse.

[0018] Em uma realização, um antígeno de interesse ligado pelo segundo anticorpo ou fragmento de anticorpo poderá ser uma proteína associada a célula, por exemplo, uma proteína de superfície de célula sobre células como as células bacterianas, células de fermento, células T, células endoteliais ou células de tumor, ou ele poderá ser uma proteína solúvel. Antígenos de interesse também poderão ser quaisquer proteínas medicamente relevantes, tais como aquelas proteínas direcionadas para cima durante a doença ou infecção, por exemplo, receptores e/ou os seus ligandos correspondentes. Exemplos específicos de proteínas de superfície de células incluem moléculas de adesão, por exemplo, integrinos como integrinos β1 por exemplo, VLA-4, selectina E, selectina P ou selectina L, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45.CDW52, CD69, CD134 (0X40), ICOs, BCMP7, CD137, CD27L, CDP1, DPCR1, DPCR1, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, K1AA0634, K1AA0659, K1AA1246, K1AA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, semelhante a nectina 2, NKCC1, PTK7, RA1G1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCM84, BCMP11, DTD, antígeno carcino- embriônico (CEA), globulina de gordura de leite humano (HMFG1 e 2), antígenos MHC Classe 1 e MHC Classe II, e VEGF, e quando apropriado, receptores dos mesmos.

[0019] Antígenos solúveis interleuquinas, tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-8, IL-12, IL-16 ou IL-17, antígenos virais, por exemplo, um vírus sincital respiratório ou antígenos de citomegalovirus, imunoglobulinas como IgE, interferons como interferon α, interferon β ou interferon y, fator α de necrose de tumor, fator β de necrose de tumor, fatores de estimulação de colônia, tais como G-CSF ou GM-CSF, e fatores de crescimento derivados de plaquetas como PDSGF-α e PDGF-β, e quando apropriado, receptores dos mesmos. Outros antígenos incluem antígenos de superfície de célula bacteriana, toxinas bacterianas, vírus como o de influenza, EBV, HepA, B e C, agentes de bio-terrorismo, radionucleídeos e metais pesados, e venenos e toxinas de cobra e aranha.

[0020] Em uma realização, o anticorpo ou fragmento do mesmo poderá ser utilizado para alterar funcionalmente a atividade do antígeno de interesse. Por exemplo, o anticorpo poderá neutralizar, antagonizar ou agonizar a atividade do referido antígeno, diretamente ou indiretamente.

[0021] O anticorpo ou fragmento do mesmo conjugado com o anticorpo de ligação com albumina da invenção atual pode ser de qualquer espécie, e mais de preferência, é derivado de um anticorpo monoclonal, um anticorpo totalmente humano ou um anticorpo humanizado. O fragmento de anticorpo para uso na invenção atual pode ser derivado de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD ou IgA) ou subclasse de molécula de imunoglobulina e poderá ser obtido de qualquer espécie, que inclui por exemplo, camundongos, ratos, tubarão, coelho, porco, hamster, camelo, lhama, cabra ou um ser humano.

[0022] Em uma realização, o anticorpo é o fragmento Fab ou Fab' que é monoclonal, totalmente humano, humanizado ou um fragmento de anticorpo quimérico. Em uma realização, os fragmentos de anticorpo Fab ou Fab' são totalmente humanos ou humanizados.

[0023] Os anticorpos monoclonais poderão ser preparados por qualquer método conhecido na arte, como a técnica hibridoma (Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256, 495 - 497), a técnica trioma, a técnica hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72) e a técnica hibridoma EBV (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", pp. 77 - 96, Alan R. Liss, Inc., 1985).

[0024] Os anticorpos para uso na invenção poderão também ser gerados usando-se métodos de anticorpos de um só linfócito, através de clonagem por expressão de cDNAs de região variável de imunoglobulinas gerados de linfócitos sozinhos escolhidos para a produção de anticorpos específicos, por exemplo, pelos métodos descritos por Babcook, J. et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 1996, 93 (15), 7843 - 7848, WO 92/02551, WO 2004/051268 e WO 2004/106377.

[0025] Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não humanas tendo uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) das espécies não humanas e uma região de estrutura básica de uma molécula de imunoglobulina humana (por exemplo, ver a US 5.585.089).

[0026] Os anticorpos para uso na invenção atual também podem ser gerados por vários métodos de apresentação de fagos conhecidos na arte e incluem aqueles apresentados por Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 1995, 182, 41- 50; Ames et al., J. Immunol. Methods, 1995, 184, 177 - 186 Kettleborough et al. Eur. J. Immunol., 1994, 24, 952 - 958; Persic et al., Gene, 1997, 187, 9-18; e Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57, 191 - 280; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743; e 5.969.108. Os camundongos transgênicos também, e outros organismos, incluindo outros mamíferos, poderão ser utilizados para gerarem anticorpos humanizados.

[0027] Os anticorpos totalmente humanos são aqueles anticorpos nos quais as regiões variáveis e as regiões constantes (quando presentes) de ambas as cadeias leves e pesadas, são todas de origem humana, ou substancialmente idênticas a sequências de origem humana, não necessariamente do mesmo anticorpo. Exemplos de anticorpos totalmente humanos poderão incluir anticorpos produzidos, por exemplo, pelos métodos de apresentação de fagos descritos acima e os anticorpos produzidos por camundongos nos quais os genes de região variável e/ou constante da imunoglobulina murina foram substituídos pelas suas contra-partes humanas, por exemplo, conforme descrito em termos gerais na EP 0546073 B1 , US 5.545.806, US 5.569.825,US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016, US 5.770.429, EP 0438474 B1 e EP046315 1 B1.

[0028] O fragmento de anticorpo, por exemplo, o material inicial de Fab ou Fab' para uso na invenção atual poderá ser obtido de qualquer anticorpo integral, especialmente um anticorpo monoclonal integral, usando-se quaisquer técnicas de divagem enzimática e/ou de digestão adequadas, por exemplo, pelo tratamento com pepsina. Alternativamente, ou adicionalmente, o material inicial de anticorpo poderá ser preparado pelo uso de técnicas de DNA recombinante envolvendo a manipulação e re-expressão de regiões variáveis e/ou constantes de anticorpo de codificação de DNA. As técnicas de biologia molecular standard poderão ser usadas para modificar, adicionar ou eliminar aminoácidos ou domínios conforme seja desejado. Quaisquer alterações nas regiões variáveis ou constantes são ainda incluídas nos termos de região "variável" e "constante" conforme usado aqui.

[0029] O material inicial de fragmento de anticorpo poderá ser obtido de quaisquer espécies, incluindo, por exemplo, camundongos, ratos, coelhos, hamster, camelo, lhama, bode ou seres humanos. As partes do fragmento de anticorpo poderão ser obtidas de mais de uma espécie, por exemplo, os fragmentos de anticorpo poderão ser quiméricos. Em um exemplo, as regiões constantes são de uma espécie e as regiões variáveis são de outra. O material inicial de fragmento de anticorpo poderá também ser modificado. Em outro exemplo, a região variável do fragmento de anticorpo foi criada usando-se técnicas de engenharia de DNA.

[0030] Tais versões engenheiradas incluem aquelas criadas, por exemplo, a partir de regiões variáveis de anticorpo natural por meio de inserções, eliminações ou alterações nas, ou para as sequências de aminoácidos de anticorpos naturais. Exemplos específicos deste tipo incluem aqueles domínios de região variável engenheirada contendo pelo menos um CDR, e opcionalmente, um ou mais aminoácidos de estrutura de um anticorpo e o restante do domínio de região variável de um segundo anticorpo. Os métodos para a criação e fabricação destes fragmentos de anticorpo são bem conhecidos na arte (por exemplo, ver Boss et al., US 4.816.397; Cabilly et al., US 6.331.415; Shrader et al., WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; Bird et al, 1988, Science, 242, 423; Queen et al., US 5.585.089; Adair, WO 91/09967; Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10, 1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165 - 181).

[0031] Em um exemplo, um domínio variável de ligação com albumina da invenção atual é fundido em um só anticorpo de domínio dAb. Os domínios de uma só variável também conhecidos como anticorpos de um só domínio ou dAbs para uso na invenção atual podem ser gerados usando-se métodos conhecidos na arte e incluem aqueles apresentados na WO 2005/118642, Ward et al., 1989, Nature, 341, 544 - 546 e Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484 - 490. Em uma realização, um anticorpo de um só domínio para uso na invenção atual é um domínio variável de cadeia pesada (VH) ou um domínio de cadeia leve (VL). Cada um dos domínios leves poderá ser do subgrupo kappa ou lambda. Foram descritos na arte os métodos para isolar os domínios VH e VL, por exemplo, na EP0368684 e Ward et al., supra. Tais domínios poderão ser derivados de quaisquer espécies ou material inicial de anticorpo adequados. Em uma realização, o anticorpo de um só domínio poderá ser derivado de um roedor, um ser humano ou outra espécie. Em uma realização, o anticorpo de um só domínio é de um ser humano.

[0032] Em uma realização, o anticorpo de um só domínio é derivado de uma coletânea de apresentação de fagos, usando os métodos descritos, por exemplo, na WO 2005/118642, Jespers et al., 2004, Nature Biotechnology, 22, 1161 - 1165 e Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484 - 490. De preferência, tais anticorpos de um só domínio são totalmente humanos mas poderão também ser derivados de outras espécies. Em uma realização, o domínio de uma só variável é quimérico pelo fato da estrutura ser humana ou de origem substancialmente humana e os CDRs serem de origem não humana. Será visto que a sequência do anticorpo de um só domínio, tão logo for isolada, poderá ser modificada para melhorar as características do anticorpo de um só domínio, por exemplo, a solubilidade, como descrito em Holt et al., supra.

[0033] Conforme utilizado aqui, substancialmente humana, refere-se ao caráter humano do material original que é retido, o que poderia ser relevante para a imunogenicidade. Material substancialmente humano seria incluído onde um aminoácido na sequência da estrutura é adicionado, eliminado ou substituído por outro aminoácido.

[0034] Em uma realização, o dAb é uma sequência humana obtida de uma apresentação do fago scFv ou de um roedor humanizado trangênico Humouse (marca reg.) ou Velocimouse (marca reg.).

[0035] Em uma realização, o dAb é obtido de um roedor humano ou humanizado, ou um camelo, ou um tubarão. Tal dAb, de preferência, será humanizado. Em um exemplo, o anticorpo de um só domínio é um domínio VHH com base em imunoglobulina de camelo, conforme descrito na EP 0656946. Em um exemplo, um camelo ou uma lhama é imunizado com um antígeno de interesse e o sangue é coletado quando a titulação é apropriada. O gene de codificação do dAb poderá ser clonado por meio de PCR de uma só célula, ou a célula B de codificação do dAb poderá ser imortalizada pela transformação EBV, ou por fusão em uma linha de célula imortal.

[0036] Em um exemplo, um ou mais dos domínios variáveis de anticorpo da invenção atual são incorporados em um formato de anticorpo multivalente, conforme descrito na WO 2009/040562, WO 2010/035012 ou na WO 2011/086091. Tais formatos podem ser mono-específicos, bi-específicos ou tri-específicos. Assim sendo, em uma realização preferida, as proteínas de fusão de anticorpo da invenção são proteínas de fusão de translação, i.e., fusões genéticas, a sequência de cada uma delas sendo codificada por um vetor de expressão.

[0037] Alternativamente, os componentes da proteína de fusão de anticorpo poderão ser fundidos usando-se meios químicos, i.e. por conjugação química ou reticulação química. São conhecidos na arte esses meios químicos.

[0038] Exemplos de tais proteínas de fusão por translação, com e sem ligações de disulfeto, são ilustradas nas figuras 1A e 1B.

[0039] Assim sendo, em uma realização, é apresentada uma proteína de fusão de anticorpo multi-especifico constituída por um fragmento de anticorpo Fab ou Fab' com especificidade para um antígeno de interesse, o referido fragmento sendo fundido em pelo menos uma sequência de domínio com uma só variável que tem uma especificidade para albumina de soro humano tendo a SEQ apresentada na SEQ ID NO: 1,2, 3 ou 4.

[0040] Em um exemplo, os domínios variáveis de anticorpo de ligação com albumina da invenção atual são fundidos com fragmentos de anticorpos, tais como os fragmentos de Fab' que possuem uma região de flexão ativa ou modificada. Quando o fragmento de anticorpo para uso na preparação de tal proteína de fusão da invenção for um fragmento Fab', o referido fragmento geralmente é ampliado na extremidade C da cadeia pesada por meio de um ou mais aminoácidos. Assim sendo, um anticorpo de fusão da invenção pode ser constituído por uma translação de fragmento de Fab' fundida (ou quimicamente fundida) a uma região variável de ligação com albumina, diretamente ou através de um dispositivo de união. Além disso, exemplos de fragmentos de anticorpo Fab' adequados incluem aqueles descritos na WO 2005 003170 e na WO 2005 003171.

[0041] Em outro exemplo, os fragmentos de anticorpo são fragmentos Fab. Assim sendo, uma fusão de anticorpo da invenção pode ser constituída por uma translação de fragmento Fab fundido (ou fundidoa quimicamente) a uma sequência de união, que por seu lado é fundida por translação (ou fundida quimicamente) a uma ou mais regiões variáveis de ligação com albumina. De preferência, o fragmento Fab é um fragmento Fab que termina nas cisteínas de inter-cadeia, conforme descrito na WO 2005/003169.

[0042] Na invenção atual, cada domínio variável de anti-albumina fundido com um fragmento de Fab ou Fab' poderá ser ligado diretamente ou através de um dispositivo de união.

[0043] Ligado diretamente, conforme usado aqui, significa que é feita referência ao fato do "último" aminoácido do Fab ou Fab' ser unido por umum dispositivo de ligação com peptídeos ao "primeiro" aminoácido e do domínio ou com uma só variável de um anticorpo de ligação com albumina da invenção atual (ou na realidade, vice-versa).

[0044] Exemplos de regiões de dispositivos de união adequados para ligação de um domínio variável com um Fab ou Fab' incluem, mas não são limitados a sequências de ligação flexíveis e sequências de ligação rígida. As sequências de ligação flexível incluem aquelas apresentadas em Huston et al., 1988, PNAS 85:5879 - 5883; Wright & Deonarain, Mol. Immunol., 2007, 44 (11): 2860 - 2869; Alfthan et al., Prot. Eng., 1995, 8 (7): 725 - 731; Luo et al., J. Biochem., 1995, 118 (4): 825 - 831; Tang et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 (26): 15.682 - 15.686; e Turner et al., 1997, JIMM 205,42 - 54 (ver a Tabela 1 para exemplos representativos)

[0045] Tabela 1. Sequências de dispositivo de união flexível

(S) é opcional nas sequências 23 a 27.

[0046] Exemplos de dispositivos de união rígidos incluem as sequências de peptídeos GAPAPAAPAPA (SEQ ID NO:61), PPPP (SEQ ID NO:62) e PPP.

[0047] Em uma realização, uma sequência de flexão de anticorpo ou de parte da mesma é usada como um dispositivo de união, por exemplo, a sequência de flexão superior. Tipicamente, os fragmentos de anticorpo Fab' para uso na invenção atual possuem uma região de flexão nativa ou modificada. Tais regiões de flexão são utilizadas como uma união natural com o radical do domínio variável de ligação com albumina. A região de flexão nativa é a região de flexão normalmente associada com o domínio CH1 da molécula do anticorpo. Uma região de flexão modificada é qualquer união que é diferente em comprimento e/ou composição da região de flexão nativa. Tais dispositivos de união podem incluir regiões de flexão com qualquer espécie, como uma região de flexão de ser humano, camundongo, rato, coelho, hamster, camelo, lhama ou bode. Outras regiões de flexão modificadas poderão ser constituídas por uma região completa de flexão derivada de um anticorpo de uma classe ou subclasse diferente daquela do domínio CH1. Assim sendo, por exemplo, um domínio CH1 da classe y1 poderá ser ligado a uma região de flexão da classe y4. Alternativamente, a região de flexão modificada poderá ser constituída por parte de uma unidade de flexão natural ou de repetição na qual cada unidade na repetição é derivada de uma região de flexão natural. Em uma outra alternativa, a região de flexão natural poderá ser gerada pela conversão de uma ou mais cisteína ou outros resíduos em resíduos neutros, tais como alanina, ou pela conversão de resíduos colocados de forma adequada em resíduos de cisteína. Através de tais meios, o número de resíduos de cisteína na região de flexão poderá ser aumentado ou reduzido. Além disso, podem ser controladas outras características da flexão, tais como a distância entre a cisteína da flexão e a cisteína de cadeia leve, a distância entre a “cisteína de flexão” e a composição dos outros aminoácidos na ligação que poderiam afetar as propriedades da flexão, como flexibilidade, por exemplo, poderão ser incorporadas glicinas no dispositivo de união para aumentar a flexibilidade rotacional, ou poderão ser incorporadas prolinas para reduzir a flexibilidade. Alternativamente, poderão ser incorporadas no dispositivo de união combinações de resíduos com carga ou hidrófobos para conferir propriedades de multimerização, por exemplo, ver Ritcher et al., 2001, Prot. Eng. 14 (10):775 - 783 para o uso de rabos com carga ou iônicos, por exemplo, rabos acidulados como dispositivos de ligação e Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 5 (1 ):1547 - 1553 para sequências de fechamento de leucina. Outras regiões de flexão modificadas poderão ser inteiramente sintéticas e poderão ser projetadas para possuírem as propriedades desejadas, tais como o comprimento, a composição e a flexibilidade.

[0048] Várias regiões de flexão modificadas foram descritas, por exemplo, nas US 5.677.425, US 6.642.356, WO 9915549, WO 2005-003170, WO 2005-003169, WO 2005 003170, WO 9825971 e WO 2005- 003171 e estes são incorporados aqui como referência. Tais uniões geralmente são em sequência da região CH1, mas poderão também ser incorporadas no final da região constante de um fragmento kappa ou lambda de cadeia leve; ver a Tabela 3 para exemplos.

[0049] Tabela 3. Sequências de dispositivo de ligação com a flexão

[0050] Os domínios variáveis de anticorpo da invenção atual são um par complementar VH/VL que é ligado cooperativamente com o antígeno, i.e., eles são um par de VH/VL complementar que tem a mesma especificidades de ligação. De fato eles são um par VH/VL derivado do mesmo anticorpo.

[0051] Em uma realização, o domínio VH é fundido com a extremidade C da região constante da cadeia pesada (CH1) e o domínio VL é fundido com a extremidade C da região constante da cadeia leve (C kappa ou C lambda).

[0052] Em uma realização, o VH e o VL são ligados por uma ligação de disulfeto que se considera que fornece a estabilização adicional para a construção, o que pode ser vantajoso.

[0053] Em uma ou mais realizações a ligação de disulfeto entre as regiões constantes de cadeia leve e pesada, por exemplo, em um Fab, como entre o domínio CH e os domínios CL ou CK não está presente, por exemplo, porque uma ou mais cisteínas que formam a ligação são substituídas. As referidas uma ou mais cisteínas poderão ser substituídas, por exemplo, por serina.

[0054] Em uma ou mais realizações, está presente uma ligação de disulfeto inter- cadeia entre a cadeia leve e a pesada entre o domínio CH e o domínio Cl ou CK.

[0055] Em um exemplo, a invenção atual apresenta uma proteína de fusão de anticorpo bi-específico constituída por: uma cadeia pesada, em sequência do terminal N, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH1), um domínio CH1 e um segundo domínio variável de cadeia pesada e (VH2). uma cadeia leve constituída, em sequência do terminal N, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL1), um domínio Cl e um segundo domínio variável de cadeia leve (VL2), onde as referidas cadeias pesada e leve são alinhadas de tal forma que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação com o antígeno e VH2 e VL2 forma um segundo sítio de ligação com antígeno, e onde o antígeno ligado pelo segundo sítio de ligação de antígeno é albumina de soro humano e onde o segundo domínio variável de cadeia pesada (VH2) tem a sequência dada em SEQ ID NO:1 e o segundo domínio variável de cadeia leve (VL2) tem a sequência dada em SEQ ID N0:3.

[0056] Em uma realização, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve de ligação com albumina são ligadas por uma ligação de disulfeto. Assim sendo, em um exemplo, a invenção atual apresenta uma proteína de fusão de anticorpo biespecifico constituída por: uma cadeia pesada contendo, em sequência do terminal N, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH1) um domínio CH1 e um segundo domínio variável de cadeia pesada (VH2), uma cadeia leve constituída, em sequência do terminal N, por um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL1), um domínio CL e um segundo domínio variável de cadeia leve (VL2), onde as referidas cadeias pesadas e leves são alinhadas de tal forma que VH1 e VL1 formam um primeiro sitio de ligação com antígeno e VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação com o antígeno, onde o antígeno ligado pelo segundo sítio de ligação com antígeno é albumina de soro humano, onde o segundo domínio variável de cadeia pesada (VH2) tem a sequência dada em SEQ ID NO:2 e o segundo domínio variável de cadeia leve (VL2) tem a sequência dada em SEQ ID NO;4 e o segundo domínio variável de cadeia pesada (VH2) e o segundo domínio variável de cadeia leve (VL2) são ligados por uma ligação de disulfeto. em um exemplo, a invenção atual apresenta uma proteína de fusão de anticorpo multi-especifico constituída por: uma cadeia pesada contendo, em sequência do terminal N, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH1), um domínio CH1, um segundo domínio variável de cadeia pesada (VH2) e um terceiro domínio variável de cadeia pesada (VH3), uma cadeia leve constituída, em sequência do terminal N, por um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL1), um domínio CL, um segundo domínio variável de cadeia leve (VL2) e um terceiro domínio variável de cadeia leve (VL3), onde as referidas cadeias pesada e leve são alinhadas de tal forma que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação com o antígeno VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação com o antígeno VH3 e VL3 forma um terceiro sítio de ligação com antígeno, onde a ligação com o antígeno pelo segundo ou terceiro sítios de ligação com antígeno é de albumina de soro humano e onde o segundo ou terceiro domínio variável de cadeia pesada têm a sequência dada em SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2 e o segundo ou terceiro domínio variável de cadeia leve tem a sequência dada em SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4.

[0057] Será visto que poderão ser dispositivos de ligação entre um ou mais dos domínios listados acima. Especialmente, poderá haver um dispositivo de ligação entre CL e VL2 e CH1 e CH2 e onde presente, um dispositivo de ligação entre VL2 e VL3 e VH2 e VH3.

[0058] Dispositivos de ligação adequados já foram descritos aqui acima. Dispositivos de ligação adicionais são apresentados na figura 2 (e) e (f), SEQ ID NOs 5 e 6.

[0059] Em uma realização, o anticorpo é um scFv. Em uma realização, o anticorpo é um scFv onde os domínios variáveis (VH e VL) são ligados pelo dispositivo de ligação apresentado na SEQ ID NO: 17.

[0060] Os domínios variáveis de anticorpos da invenção atual são ligados a albumina com uma afinidade de ligação suficiente para prolongar a meia vida do conjugado, como um Fab ou Fab' in vivo. Foi relatado que uma afinidade por albumina menor ou igual a uma afinidade de 2,5 μM prolonga a meia vida in vivo (Nguyen, A. et al (2006) Protein Engineering Design & Selection, 19(7), 291 - 297). Em um exemplo, o par de anticorpo de domínio variável da invenção atual tem uma alta afinidade de ligação, por exemplo, 3nM nanomolar. Em um exemplo, os anticorpos de domínio único têm uma afinidade de ligação por antígeno que é nanomolar ou micromolar. A afinidade poderá ser medida usando-se qualquer método adequado conhecido na arte, incluindo ressonância Plasmon de superfície usando albumina de soro natural ou recombinante.

[0061] De preferência o anticorpo de ligação com albumina da invenção atual tem uma afinidade de ligação por albumina de soro humano de cerca de 1 μM ou melhor. Em uma realização, o anticorpo tem uma afinidade de ligação de cerca de 500 M ou menos. Em uma realização, o anticorpo tem uma afinidade de ligação de cerca de 200 ou menos. Em uma realização, o anticorpo tem uma afinidade de ligação de cerca de 100 nM ou menos. Em uma realização, o anticorpo tem uma afinidade de ligação de cerca de 50 nM ou menos. Em uma realização, o anticorpo tem uma afinidade de ligação de cerca de 20 nM ou menos. Em uma realização, o anticorpo tem uma afinidade de ligação de cerca de 10 Nm ou menos. Em uma realização, o anticorpo tem uma afinidade de ligação de cerca de 5 Nm ou menos. Em uma realização, o anticorpo tem uma afinidade de ligação de cerca de 2 nM ou menos. Em uma realização, o anticorpo tem uma afinidade de ligação de cerca de 1 Nm ou menos. Será visto que a afinidade de anticorpos apresentada pela invenção atual poderá ser alterada usando-se qualquer método adequado conhecido na arte. A invenção atual, portanto, também se refere a variante de moléculas de anticorpo da invenção atual, que têm uma afinidade melhorada por albumina. Tais variantes podem ser obtidas por vários protocolos de maturação de afinidade, incluindo a maturação de CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392 - 403, 1995), mistura de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779 - 783, 1992), uso de famílias de agentes de mutação de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359 - 368, 1996), mistura de DNA (Pattern et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724 - 733, 1997), apresentação de fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77 - 88, 1996) e PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288 - 291, 1998). Vaughan et al., (supra) discute estes métodos de maturação de afinidade.

[0062] A invenção atual também apresenta uma sequência de DNA isolado que codifica uma proteína de anticorpo ou de fusão de ligação com albumina da invenção atual. As sequências de DNA da invenção atual poderão conter DNA sintético, por exemplo, produzido por processamento químico, cDNA, DNA genômico, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0063] As sequências de DNA que codificam as proteínas de fusão de anticorpo com especificidade dupla da invenção atual podem ser obtidas por métodos bem conhecidos por aqueles adestrados na arte. Por exemplo, as sequências de DNA que codificam parte ou todos os fragmentos de anticorpos, dispositivos de ligação e/ou dAbs poderão ser sintetizadas conforme seja desejado a partir da sequência de DNA determinada ou com base nas sequências de aminoácidos correspondentes.

[0064] As técnicas standard de biologia molecular poderão ser utilizadas para a preparação de sequências de codificação de DNA para a proteína de fusão de anticorpo de especificidade dupla da invenção atual. As sequências de DNA desejadas poderão ser sintetizadas completamente ou parcialmente usando-se técnicas de síntese de oligonucleotídeo. Poderão ser utilizadas técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR) e de mutagênese direcionadas para um sítio, conforme seja apropriado.

[0065] A invenção atual se refere ainda a um vetor de clonagem ou expressão constituído por uma ou mais sequências de DNA da invenção atual. Assim sendo, é apresentado um vetor de clonagem de expressão constituído por uma ou mais sequências de DNA que codificam uma proteína de fusão de anticorpo com dupla especificidade da invenção atual. Em uma realização preferida, o vetor de clonagem ou expressão contém uma sequência única de DNA que codifica a proteína inteira de fusão de anticorpo com especificidade dupla. Assim sendo, o vetor de clonagem ou expressão contém unidades de transcrição codificadas por DNA em sequência, de tal forma que seja produzida uma proteína de fusão por translação.

[0066] Na realidade, ficará entendido por aqueles adestrados na arte que uma proteína de fusão da invenção pode ter o domínio variável de ligação com albumina na extremidade N ou na extremidade C e, portanto, a unidade de transcrição codificada por DNA de ligação com albumina será a primeira ou a última, respectivamente, dentro da sequência de DNA que codifica a fusão por translação. Assim sendo, uma fusão por translação poderá conter um domínio variável com terminal N e um Fab ou Fab' com terminal C. Além disso, uma fusão por translação poderá conter um Fab ou Fab' com terminal N e um domínio variável de ligação com albumina com terminal C.

[0067] Será visto que a cadeia pesada e a cadeia leve de anticorpo ou fragmento do mesmo poderá ser incorporada no mesmo ou em setores diferentes. Em uma realização, um vetor poderá conter uma fusão por translação contendo uma cadeia pesada e outro vetor poderá conter uma fusão por translação contendo uma cadeia leve.

[0068] O código de DNA para um fragmento de anticorpo contido dentro de uma fusão de translação da invenção pode ser incorporado em um vetor como uma unidade de transcrição em configurações conforme é conhecido pela pessoa adestrada na arte, por exemplo, uma unidade de transcrição pode conter códigos para a cadeia leve sucedido pelo código da cadeia pesada, ou vice-versa; ver, especialmente, Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26:309320.

[0069] De preferência, um vetor de acordo com a invenção atual contém uma sequência líder apropriada, como uma sequência líder de anticorpo. Tais sequências líder são bem conhecidas na arte.

[0070] Os métodos gerais pelos quais podem ser construídos vetores, métodos de transfecção e transformação e os métodos de cultura, são bem conhecidos por aqueles adestrados na arte. A este respeito, é feita referência a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York e o manual Maniatis produzido pela Cold Spring Harbor Publishing.

[0071] É também apresentada uma célula hospedeira contendo um ou mais vetores de clonagem ou expressão contendo uma ou mais sequências de DNA que codificam uma proteína de fusão de anticorpo com especificidade dupla da invenção atual. Qualquer sistema de célula/vetor hospedeira poderá ser usada para a expressão das sequências de DNA que codificam a proteína de fusão de anticorpo com especificidade dupla. Poderão ser usadas bactérias, por exemplo, de E. coli, e outros sistemas microbianos, e também poderão ser usados sistemas de expressão de célula hospedeira eucarióticos, por exemplo, de mamíferos. As células hospedeiras de mamíferos adequadas incluem células de NSO.CHO, mieloma ou hibridoma. Assim sendo, em uma realização, a proteína de fusão da invenção atual é expressa em E. coli. Em outra realização, a proteína de fusão da invenção atual é expressa em células de mamíferos.

[0072] A invenção atual também apresenta um processo para a produção de um anticorpo de ligação com albumina ou proteína de fusão, constituído pela cultura de uma célula hospedeira contendo um vetor da invenção atual em condições adequadas para a expressão da proteína da sequência de DNA que codifica o referido anticorpo de ligação com albumina. A invenção apresenta ainda métodos para o isolamento do anticorpo de ligação com albumina.

[0073] Quando produzido, um anticorpo de ligação com albumina da invenção atual poderá ser purificado, onde for necessário, usando-se qualquer método adequado conhecido na arte. Por exemplo, mas sem limitação, poderão ser usadas técnicas de cromatografia, tais como de troca de íons, exclusão de tamanho, proteína G ou cromatografia de interação hidrófoba.

[0074] O tamanho do anticorpo ou da proteína de fusão de anticorpo poderá ser confirmado por métodos convencionais conhecidos na arte, tais como cromatografia de exclusão de tamanho e SDS-PAGE de não redução. Tais técnicas podem ser usadas, por exemplo, para confirmar que a proteína não foi dimerisada e/ou não tem uma porção faltante. Se forem detectados dímeros e é requerido um produto monomérico ou homogêneo, então a proteína de fusão de anticorpo monomérico poderá ser purificada longe das espécies diméricas usando-se técnicas de cromatografia convencional conforme descrito acima. Na invenção atual, as regiões variáveis melhoradas apresentadas nas SEQ ID NOs 1 a 4 resultam na produção de mais monômeros.

[0075] Os anticorpos, conjugados e proteínas de fusão da invenção são úteis no tratamento de doenças ou distúrbios que incluem doenças e distúrbios inflamatórios, doenças e distúrbios imune, distúrbios fibróticos e câncer.

[0076] O termo "doença inflamatória" ou "distúrbio" e "doença ou distúrbio imune" incluem artrite reumatóide, artrite psoriática, doença da inércia, doença Muckle Wells, psoríase, doença de Crohn, colite ulcerativa, SLE (Lupus sistêmico eritematoso), asma, rinite alérgica, dermatite tópica, esclerose múltipla, vasculite, diabetes melitus do tipo I, doença de transplante e de enxerto-versus-hospedeiro.

[0077] O termo "distúrbio fibrótico" inclui a fibrose pulmonar idiopática (IPF), esclerose sistêmica (ou escleroderma), fibrose dos rins, nefropatia peritoneal (dialise peritonial ambulatória contínua), cirrose do fígado, degeneração macular relacionada com a idade (ARMD), retinopatia, fibrose reativa cardíaca, cicatrização, queloides, queimaduras, úlceras da pele, angioplastia, cirurgias de "by-pass" e coronária, artroplastia e cirurgia de catarata.

[0078] O termo "câncer" inclui um crescimento novo maligno que aparece do epitélio, encontrado na pele ou, mais comumente, na cobertura de órgãos do corpo, como por exemplo: seios, ovário, próstata, pulmão, rim, pâncreas, estômago, bexiga ou intestino. O câncer tende a ser infiltrado no tecido adjacente e se espalhar (metastase) para órgãos distantes, por exemplo: para os ossos, fígado, pulmão ou cérebro.

[0079] Assim sendo, de acordo com um outro aspecto da invenção, é apresentada uma composição farmacêutica que contém um anticorpo, fusão de anticorpo ou conjugado da invenção em associação com um ou mais veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. É também apresentado o uso de uma proteína de fusão de anticorpo da invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio. Mais de preferência, a doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio inflamatório.

[0080] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção poderão ter uma forma adequada para administração oral, bucal, parenteral, subcutânea, nasal, tópica, oftalmológica ou retal, ou uma forma adequada para administração por inalação ou insuflação.

[0081] Quando apropriado, por exemplo, se o anticorpo ou anticorpos de domínio único da proteína de fusão de anticorpo se ligam a albumina, poderá ser desejável formular previamente a proteína de fusão com especificidade dupla com albumina de soro humano ou recombinante, usando-se qualquer método adequado conhecido na arte.

[0082] Quando a formulação farmacêutica é um liquido, por exemplo, uma solução ou suspensão, então a formulação poderá ainda ser constituída por albumina, por exemplo, albumina de soro humano, especialmente albumina recombinante, como a albumina de soro humano recombinante. Quantidades adequadas poderão estar na faixa de menos de 2%, peso/peso, da formulação total, especialmente, menos de 1, 0,5, ou 0,1%, peso/peso. Isto poderá ajudar a estabilizar o componente de anticorpo na formulação. A composição farmacêutica poderá ser liofilizada para reconstituição posterior, com um solvente aquoso.

[0083] Em uma realização, é apresentado um recipiente de dose única, como um frasco, contendo um "anticorpo" liofílizado de acordo com a invenção.

[0084] Para administração oral, as composições farmacêuticas poderão ter a forma, por exemplo, de tabletes, losangos ou cápsulas preparadas por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinil pirrolidona ou hidroxi propil metil celulose); cargas, (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidro-fosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou glicolato de sódio); ou agentes umidificantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os tabletes poderão ser revestidos por métodos bem conhecidos na arte. As preparações líquidas para administração oral poderão tomar a forma, por exemplo, de soluções, xaropes ou suspensões, ou elas poderão ser apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado, antes do uso. Tais preparações líquidas poderão ser preparadas por meios convencionais, com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de colocação em suspensão, agentes de emulsificação, veículos não aquosos ou conservantes. A preparação poderá também conter sais de solução tampão, agentes de sabor, agentes de colorir ou agentes adoçantes, conforme seja apropriado.

[0085] As preparações para administração oral poderão ser formuladas adequadamente a para produzirem uma liberação controlada do composto ativo.

[0086] Para a administração bucal, as composições poderão ter a forma de tabletes ou losangos formulados na forma convencional.

[0087] Os anticorpos, fusão e/ou conjugados da invenção poderão ser formulados para administração parenteral por injeção, por exemplo, por injeção ou infusão de pílulas. As formulações para injeção poderão ser apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas de vidro ou recipientes com doses múltiplas, por exemplo, frascos de vidro. As composições para injeção poderão estar na forma de suspensões, soluções ou emulsões e têm veículos oleosos ou aquosos, e poderão conter agentes de formulação, tais como agentes de colocação em suspensão, de estabilização, conservação e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo poderá estar na forma de pó para constituição como um veículo adequado, por exemplo, água isenta de pirogenio, antes do uso.

[0088] Alem das formulações descritas acima, os anticorpos da invenção poderão também ser formulados como uma preparação para depósito. Tais formulações de ação prolongada poderão ser administradas através de implantação ou através de injeção intramuscular.

[0089] Para a administração nasal ou administração por inalação, os compostos de acordo com a invenção atual poderão ser fornecidos convenientemente na forma de uma apresentação de "spray" de aerossol para invólucros pressurizados ou um nebulizador, com o uso de um propelente adequado, por exemplo, diclorodifluormetano, fluortriclorometano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono ou outro gás adequado ou mistura de gases.

[0090] As composições poderão ser, se desejado, apresentadas em uma embalagem ou dispositivo de aplicação que poderia conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo do o ingrediente ativo. A embalagem ou dispositivo de aplicação poderá ser acompanhada por instruções para a administração.

[0091] Para a administração tópica, os compostos de acordo com a invenção atual poderão ser formulados convenientemente em uma pomada adequada que contenha o componente ativo em suspensão ou dissolvido em um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Veículos específicos incluem, por exemplo, óleo mineral, petróleo líquido, propileno glicol, polioxietileno, polioxipropileno, cera emulsificante e água. Alternativamente, os compostos de acordo com a invenção atual poderão ser formulados em uma loção adequada que contém o componente ativo em suspensão ou dissolvido em um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Veículos específicos incluem, por exemplo, óleo mineral, sorbitan monoestearato, polisorbato 60, cera de cetil ésteres, cetearil álcool, álcool benzílico, 2-octildodecanol e água.

[0092] Em uma realização, a formulação é fornecida como uma formulação para administração tópica, incluindo inalação.

[0093] Preparações inaláveis adequadas incluem pós inaláveis, aerossóis contendo gases propelentes ou soluções inaláveis isentas de gases propelentes. Os pós inaláveis de acordo com a apresentação contendo a substância ativa poderão consistir somente das substâncias ativas mencionadas acima ou de uma mistura das substâncias ativas mencionadas acima com um excipiente fisiologicamente aceitável.

[0094] Estes pós inaláveis poderão incluir monossacarídeos (por exemplo, glicose ou arabinose), dissacarídeos (por exemplo, lactose, sacarose, maltose), oligo e polissacarídeos (por exemplo, dextranos), poli-álcoois (por exemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sais (por exemplo, cloreto de sódio, carbonato de cálcio) ou misturas destes, um com o outro.

[0095] Mono- ou dissacarídeos são usados adequadamente, especialmente mais não exclusivamente o uso de lactose como glicose, na forma dos seus hidratos.

[0096] Partículas para deposição no pulmão requerem um tamanho de partícula menor do que dez microns, tais como 1-9 microns, por exemplo, 0,1 a 5 micrometros, especialmente, 1 a 5 micrometros. O tamanho de partícula do ingrediente ativo (como o anticorpo ou fragmento) é de extrema importância.

[0097] Os gases propelentes que podem ser usados para a preparação de aerossóis inaláveis são conhecidos da arte. Gases propelentes adequados são escolhidos de hidrocarbonetos, tais como o n-propano, n-butano ou isobutano e hidrocarbonetos halogenados, como derivados clorados e/ou fluoretados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano ou ciclobutano. Os gases propelentes mencionados acima poderão ser usados sozinhos ou em mistura com os mesmos.

[0098] Gases propelentes especialmente adequados são derivados alcano halogenados escolhidos entre TG 11, TG 12, TG 134a e TG227. Dos hidrocarbonetos halogenados mencionados acima, são especialmente adequados o TG134a (1,1,1,2-tetrafluoretano) e o TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluorpropano) e misturas dos mesmos.

[0099] Os aerossóis inaláveis contendo gás propelente poderão também conter outros ingredientes tais como co-solventes, estabilizantes, agentes ativos na superfície (tensoativos), antioxidantes, lubrificantes e meios para ajuste do pH. Todos estes ingredientes são conhecidos na arte.

[00100] Os aerossóis inaláveis contendo gás propelente de acordo com a invenção poderão conter até 5% em peso da substância ativa. Os aerossóis de acordo com a invenção contêm, por exemplo, 0,002 a 5% em peso, 0,01 a 3% em peso, 0,015 a 2% em peso, 0,1 a 2% em peso, 0,5 a 2% em peso ou 0,5 a 1% em peso de ingrediente ativo.

[00101] Alternativamente, as administrações tópicas para o pulmão também poderão ser por administração de uma formulação de dissolução ou de suspensão líquida, por exemplo, utilizando um dispositivo como um nebulizador, por exemplo, um nebulizador ligado a um compressor (por exemplo, o nebulizador Pari LC-Jet Plus (R) ligado a um compressor Pari Master (R) fabricado pela Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

[00102] Os formatos de anticorpo da invenção podem ser fornecidos dispersados em um solvente, por exemplo, na forma de uma solução ou uma suspensão. Ela pode estar em suspensão em uma solução fisiológica apropriada, por exemplo, solução salina ou outro solvente farmacologicamente aceitável ou uma solução tampão. Soluções tampão conhecidas na arte poderão conter 0,05 mg a 0,15 mg de edetato dissódico, 8,0 mg a 9,0 mg NaCI, 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anidro, e 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sódio por ml de água, para se obter um pH de cerca de 4,0 a 5,0. Uma suspensão pode utilizar, por exemplo, um anticorpo liofilizado.

[00103] As suspensões terapêuticas ou formulações em solução também podem conter um ou mais excipientes. Os excipientes são bem conhecidos na arte e incluem soluções tampão (por exemplo, solução tampão de citrato, solução tampão de fosfato, solução tampão de acetato e solução tampão de bicarbonato), aminoácidos, ureia, álcoois, ácido ascórbico, fosfolipídeos, proteínas (por exemplo, albumina do soro), EDTA, cloreto de sódio, liposomas, manitol, sorbitol, e glicerol. As soluções ou suspensões podem ser encapsuladas em liposomas ou micro-esferas biodegradáveis. A formulação, geralmente será fornecida em uma forma substancialmente estéril, utilizando processos de fabricação estéreis.

[00104] Isto poderá incluir a produção e esterilização por filtração do solvente/solução tamponada usada para a formulação, suspensão ascética do anticorpo na solução de solvente tamponada estéril e a administração da formulação em receptáculos estéreis, por métodos familiares àqueles com conhecimento normal na arte.

[00105] A formulação nebulizável de acordo com a apresentação atual poderá ser fornecida, por exemplo, como unidades de dose única (por exemplo, recipientes plásticos ou frascos selados) embalados em envelopes com dobras. Cada frasco contém uma dose unitária em um volume, por exemplo, de 2 ml de solvente/solução tampão.

[00106] Os formatos de anticorpos da apresentação atual são considerados como adequados para administração via nebulização.

[00107] Para a administração oftalmológica, os compostos de acordo com a invenção atual poderão ser formulados convenientemente como suspensões micronizadas em solução salina estéril, isotônica, com pH ajustado, com ou sem um conservante, como um agente bactericida ou fungicida, por exemplo, nitrato de fenil- mercúrio, cloreto de benzilalcônio ou acetato de clorexidina. Alternativamente, para compostos de administração oftamológica, eles poderão ser formulados em um creme, como petrolato.

[00108] Para a administração retal, os compostos de acordo com a invenção atual poderão ser formulados convenientemente como supositórios. Estes podem ser preparados misturando- se o componente ativo com um excipiente não irritante adequado que é sólido na temperatura ambiente mas é líquido na temperatura do reto, e assim sendo, se derreterá no reto para liberar o componente ativo. Tais materiais incluem, por exemplo, manteiga de cacau, cera de abelha e polietileno glicóis.

[00109] A quantidade de um composto da invenção requerida para a profilaxia ou tratamento de uma condição especifica variará dependendo do composto escolhido e da condição do paciente a ser tratado. Em geral, no entanto, as dosagens dárias poderão variar de cerca de 10 ng/kg a 1000 mg/kg, tipicamente de 100 ng/kg a 100 mg/kg, por exemplo, ao redor de 0,01 mg/kg a 40 mg/kg de peso do corpo para administração oral ou bucal, de cerca de 10 ng/kg a 50 mg/kg de peso do corpo para administração parenteral, e de cerca de 0,05 mg a cerca de 1000 mg, por exemplo, de cerca de 0,5 mg a cerca de 1000 mg para administração nasal ou administração por inalação ou insuflação.

[00110] As características preferidas de cada realização da invenção são conforme cada uma das outras realizações, mutatis mutandis. Todas as publicações, incluindo mas não limitadas a patentes e solicitações de patentes citadas nesta especificação são incorporadas aqui como referência, como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada como referência aqui como se tivesse sido integralmente apresentada.

[00111] Consistindo de, no contexto da especificação atual, se destina a significar incluindo.

[00112] Quando forem realizações tecnicamente apropriadas da invenção, elas poderão ser combinadas.

[00113] As realizações são descritas aqui como incluindo certas características/elementos. A apresentação também se aplica a realizações separadas que consistem de, ou consistem essencialmente das referidas características/elementos.

[00114] A invenção será agora descritas com referência aos seguintes exemplos, que são meramente ilustrativos e não devem ser considerados de forma alguma como limitantes do escopo da invenção atual. Lista de figuras:

[00115] Figura 1A: representação em diagrama de um Fab-Fv

[00116] Figura 1B: representação em diagrama de um Fab-dsFv

[00117] Figuras 2 a 5: sequências da invenção atual

[00118] Figura 6: mostra a ligação de Fab-dsFv A26 marcada com Alexa Fluor 488 em células CD4+OX40+ T humanas ativadas

[00119] Figuras 7: mostra ug/ml de construções de anticorpos produzidos por expressão transiente em células HEK293

[00120] Figura 8: mostra SDS-PAGE de scFv estabilizada por dissulfeto de Fab.

[00121] Figura 9: mostra tabela de dados relativos à afinidade de ligação com albumina de soro humano de várias construções

[00122] Figura 10: mostra a tabela de dados de antígeno de ligação com Fab de afinidade de várias construções

[00123] Figura 11: mostra ug/ml de construções de anticorpos produzidos por expressão transiente em células CHO

[00124] Figura 12: mostra dados de termo-estabilidade para várias construções expressadas em células CHO Manipulações de DNA e métodos gerais

[00125] Foram usadas famílias competentes de E. coli para transformações e crescimento de culturas de rotina.As enzimas de restrição e modificação de DNA foram obtidas da Roche Diagnostics Ltd. and New England Biolabs. As preparações de Plasmideos foram executadas usando-se kits de purificação Maxi Plasmid (QIAGEN, catálogo número 12165). Reações de sequências de DNA foram executadas usando-se o kit de término de sequência ABI Prism Big Dye (catálogo nr. 4304149) e operado em um seqüenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystems). Os dados foram analisados usando-se o programa Sequencher (Genecodes). Os oligonucleotideos foram obtidos da Sigma ou Invitrogen. Os genes de codificação das sequências da região V inicial foram construídos por uma abordagem de síntese automática pela DNA 2.0, e modificados para gerarem as versões enxertadas por meio de mutagenese direcionada por oligonucleotídeo. A concentração de Fab-Fv foi determinada pelo método HPLC com base na proteína G. EXEMPLO 1

[00126] Geração e análise de enxertos de humanização diferentes de 645 em A26Fab-645dsFv

[00127] Anteriormente nós descrevemos o formato do anticorpo Fab-dsFv (figura 1B) e um anticorpo de anti-albumina humanizado conhecido como "645gH1gLI" na WO 2010/035012. Nós também descrevemos anteriormente a geração de um anticorpo anti-OX40 antagonistico hmanizado conhecido como "A26" na WO 2010 096418. Nós descrevemos aqui a geração de um novo enxerto humanizado melhorado de anticorpo "645" conhecido como 645dsgH5gL4 e a geração de uma molécula de anticorpo Fab-dsFv incorporando aquele enxerto no componente Fv e as regiões variáveis "A26" no componente Fab.

[00128] As sequências de 645 gHI são apresentadas na figura 3 (a) e (b), SEQ ID NOS 9 e 10.

[00129] Construção dos plasmídeos A26Fab-645dsFv(gH1gL1) e A26Fab- 645dsFv(gH5gL4).

[00130] A região de codificação total da cadeia leve de A26Fab-645dsFv(gL1) (SEQ ID NO: 12) foi clonada em um vetor de expressão de mamífero UCB sob o controle do promotor HCMV-MIE e a sequência SV40E poliA. A região variável de cadeia leve de 645dsFv(gL1) (SEQ ID NO: 10) foi mutada para 645dsFv(gL4) (SEQ ID NO:4) por um método PCR de superposição. A região de codificação total da cadeia pesada de A26Fab-645dsFv(gH1) (SEQ ID NO:11) foi clonada em um vetor de expressão de mamífero UCB sob o controle do promotor HCMV-MIE e a sequência SV40E poli A. A região variável de cadeia pesada de 645dsFv(gH1) (SEQ ID NO:9) foi mutada para a 645dsFv(gH5) (SEQ ID NO:2) por um método de superposição PCR. As construções foram verificadas através de seqüenciação.

[00131] Expressão de mamífero de A26Fab-645dsFv(gH1gL1) e A26Fab- 645dsFv(gH5gL4)

[00132] Células HEK 293 foram transfectadas com os plasmídeos de cadeia leve e pesada usando-se o reagente de transfecção Invitrogen 293 de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 25 μg dos plasmídeos de cadeia pesada e 25 g dos plasmídeos de cadeia leve foram incubadas com 100 μl de fectina 293 e 1700 μl de meio Optipro durante 20 min nas RT. A mistura foi então adicionada a 50 x106 células HEK293 em uma suspensão de 50 ml e incubadas durante 6 dias com agitação a 37 0 C. Depois de 6 dias, o sobrenadante foi recolhido por centrifugação a 1500 xg durante 10 min para a remoção das células e então 0,22 μm filtrados de forma estéril.

[00133] Purificação da proteína G de A26Fab-645dsFv(gH1gl_1) e A26Fab- 645dsFv(gH5gL4)

[00134] 50 ml do sobrenadante filtrado de 0,22 μm foram concentrados até aproximadamente 2 ml usando-se concentradores Amicon Ultra-15 com uma membrana de interrupção de peso molecular de 10kDa e centrifugação a 4000 xg em um rotor "swing out". 1,8 ml do sobrenadante concentrado foram aplicados a 1 ml/min em uma coluna de 1 ml Gammabind Plus Sepharose (GE Healthcare) e equilibrada em 20 mM de fosfato, em 40 mM de NaCI pH 7,4. A coluna foi lavada com 20 mM de fosfato,40 mM de NaCI pH 7,4 e o material de aderência foi eluído com 0,1 M de glicina/HCI pH 2,7. O pico de eluíção foi recolhido e o pH foi ajustado para aproximadamente um pH 7 com 2M Tris/HCI pH 8,5. A eluíção com pH ajustado foi concentrada e dia-filtrada em 20 mM de fosfato, 150 mM NaCI pH 7,4 usando-se concentradores Amicon Ultra-15 com uma membrana de interrupção de peso molecular 10kDa e centrifugação a 4000 xg em um rotor "swing out", até um volume final de aproximadamente 0,3 ml.

[00135] Análise de exclusão de tamanho de A26Fab-645dsFv(gH1gl_1) e A26Fab- 645dsFv(gH5gL4)

[00136] Amostras da proteína G purificada foram analisadas por meio de HPLC de exclusão de tamanho. As amostras foram separadas sobre uma coluna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) desenvolvida com um gradiente isocrático de PBS pH 7,4 a 1 ml/min. A detecção do pico foi em 280 nm e o peso molecular aparente foi calculado por comparação com uma curva standard de proteínas com peso molecular conhecido contra o volume de eluíção. A alteração do enxerto de humanização de 645dsFv de gH1gl_1 para gH5gl_4 resultou em um aumento na percentagem de monômero de A26Fab-645dsFv expressado de 59% a 71%, um aumento de 12%, sem nenhuma alteração na estabilidade térmica do dsFv (dados não mostrados) ou na afinidade de ligação do dsFv para HSA (dados não mostrados). Exemplo 2

[00137] 2.1 cinética BIAcore para A26Fab-dsFv(645gH5gl_4) de ligação com 0X40

[00138] Neste e em todos os exemplos subsequentes, o A26Fab- dsFv(645gH5gl_4) tinha a sequência da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO:7 (figura 2 (g)) e a sequência de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO:8 (figura 2 (h)), i.e., a cadeia pesada contida no dispositivo de ligação G4S, G4T, G4S apresentado em SEQ ID NO:5, figura 2 (e).

[00139] A BIA (Análise de Interação Biomolecular) foi executada usando-se um BIAcore T200 (GE Healthcare). O fragmento de IgG anti-humano de F(ab')2, fragmento específico F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch) foi imobilizado sobre um CM5 Sensor Chip por meio de química de acoplamento com amina para um nível de captura de aproximadamente 5000 unidades de resposta (RUs). A solução tampão HBS-EP (10mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCI, 3 mM EDTA, 0,05% de tensoativo P20, GE Healthcare) foi utilizada como a solução tampão de operação com uma vazão de 10 μl/min. Uma injeção de 10 μl de A26 Fab’ a 0,5 μg/ml ou A26Fab-dsFv a 1 μg/ml foi usada para capturar o lgG-F(ab’)2 anti-humano imobilizado. 0X40 humano foi titulado nas várias concentrações de A26 capturado (25 nM a 1,5625nM) com uma vazão de 30 μl/min. A superfície foi regenerada por 2 x 10 μl de injeção de 50 mM HCI, seguido por uma injeção de 5 μl de 5 mM NaOH com uma vazão de 10 μl/min. As curvas de ligação de subtração de fundo foram analisadas usando-se o programa de avaliação T200 (versão 1,0) seguindo-se procedimentos standard. Os parâmetros cinéticos foram determinados a partir do algoritmo de encaixe.

Média de 4 determinações

[00140] 2.2 Cinética BIAcore para albumina de ligação com A26Fab- dsFv(645gH5gl_4)

[00141] A BIA (Análise de Interação Biomolecular) foi executada usando-se um BIAcore T200 (GE Healthcare). O fragmento de IgG anti-humano de F(ab')2, fragmento específico F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch) foi imobilizado sobre um CM5 Sensor Chip por meio de química de acoplamento com amina para um nível de captura de aproximadamente 5000 unidades de resposta (RUs). A solução tampão HBS-EP (10mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCI, 3 mM EDTA, 0,05% de tensoativo P20, GE Healthcare) foi utilizada como a solução tampão de operação com uma vazão de 10 μl/min. A solução tampão HBS-EP (10mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCI, 3 mM EDTA, 0,05% de tensoativo P20, GE Healthcare) foi utilizada como a solução tampão de operação com uma vazão de 10 μl/min. Uma injeção de 10 μl de Fab-Fv1 a 0,75 μg/ml foi usada para capturar o lgG-F(ab')2 anti-humano imobilizado. Albumina de soro humano (HSA), albumina de soro de camundongo (MSA) e albumina de soro Cynomolgus (CSA) foram tituladas no Fab-Fv em varias concentrações (50nM a 6,25nM) com uma vazão de 30 μl/min. A superfície foi regenerada por meio de injeção 2 x 10 μl de 50 mM HCI, seguido por uma injeção de 5 μl de 5 mM NaOH com uma vazão de 10 μl/min. As curvas de ligação por subtração de fundo foram analisadas usando-se o programa de avaliação T200 (versão 1,0) seguindo-se os procedimentos standard. Os parâmetros cinéticos foram determinados a partir do algoritmo de encaixe.

Média de 3 determinações

[00142] 2.3 Demonstração de A26Fab-dsFv(645gH5gL4) ligando-se a 0X40 e albumina simultaneamente

[00143] Foi avaliada a ligação simultânea de OX 40 humano e albumina de soro humano com A 26 Fab-dsFv. A construção A26Fab-dsFv foi capturada na superfície do chip sensor conforme mostrado no método para a cinética Biacore para a ligação A26 Fab-dsFv e albumina. 50 nM HAS, 25 nM 0X40 ou uma solução misturada com a concentração final de 50nM HSA e 25nM 0X40 foram titulados separadamente sobre o A26 Fab-dsFv capturado. A resposta de ligação para a solução combinada HSA/OX40 era equivalente a soma das respostas das injeções independentes. Isto confirma que o Fab-dsFv é capaz de se ligar simultaneamente com ambos 0X40 e HSA humano.

[00144] 2.4 Afinidade com base em célula de A26 Fab-dsFv (645gH5gL4) Métodos:

[00145] A26 Fab-Fv de ligação com células T humanas ativadas CD4+OX40+

[00146] PBMC foram isoladas por separação sobre um gradiente Ficoll e ativadas com 4 μg/ml de PHA-L durante 3 dias a 37 ° C, 5% de CO2 , 100% de umidade. As células CD4+T foram isoladas por meio de seleção negativa usando-se contas magnéticas (0 kit II de isolamento de célula CD4+T para seres humanos; Milteny Biotec). Foram incubadas aproximadamente 1 x 105 células na presença de anticorpos em qualquer das soluções tampão Facs (PBS/0,2% BSA/0,09% NaN3) ou solução tampão Facs suplementada com 5% HSA a 4 ° C. A concentração final do anticorpo variou de 48 nM - 0,0005 nM)). As células foram lavadas em PBS antes da análise por meio de citometria de fluxo usando-se um FACScalibur (Becton Dickinson). Foram produzidos dois conjuntos de dados de titulação em ambas as condições de solução tampão, um com A26 Fab-dsFv e a segunda com um Fab-Fv de controle irrelevante para determinar a ligação não especifica. O número de mol de anticorpo de ligação foi calculado usando-se valores interpolados de uma curva standard gerada pelo uso de contas, constituída por quantidades diferentes, mas conhecidas de corante fluorescente. Os valores de fluorescência média foram determinados nas análises citométricas de fluxo de células e contas. A ligação não especifica foi subtraída dos valores A26 Fab-dsFv e a curva de ligação especifica assim gerada foi analisada por regressão não linear usando-se uma equação de ligação no local (Graphpad Prism ®) para se determinar KD.Para a determinação da afinidade de A26 Fab-dsFv com o antígeno expresso na superfície da célula, foram executadas experiências de ligação por saturação usando-se células ativadas CD4+OX40+ T, e A26 Fab-dsFv marcada com Alexa Fluor 488. A ligação especifica de anticorpo com o receptor em equilíbrio ao longo de uma faixa de concentrações de anticorpo foi usada para a determinação de KD, considerando-se que somente uma fração muito pequena de anticorpo foi ligada ao receptor em qualquer ponto da curva de ligação.

[00147] A ligação de equilíbrio é descrita usando-se a seguinte equação:

[00148] Receptor |ivre + Anticorpo iivre «-► Receptor-Anticorpo

[00149] A velocidade de associação de anticorpo com o receptor = kiigado x [Receptor |jVre] x [Anticorpo iiVre]

[00150] A velocidade de dissociação do complexo receptor-anticorpo = kdesiigado x [Receptor-Anticorpo]

[00151] Em equilíbrio, as velocidades de associação e dissociação são iguais e pode ser derivada uma equação que descreve a isotermia de ligação; em uma marcação semi-log a ligação é sigmoidal. O KD é definido pela kdesiigado/kiigado θ pode ser calculado da curva de ligação como a concentração na qual ocorre a ligação máxima da metade.

[00152] A ligação de A26 Fab-Fv marcado com Alexa Fluor 488 com células CD4+OX40+T humanas ativadas foi medida por citometria de fluxo ao longo de uma faixa de concentração de 5-log.

[00153] Na figura 4 é mostrada uma curva de ligação representativa para o A26 Fab-Fv.

[00154] O valor KD médio obtido em células ativadas de 5 doadores diferentes é 145 pM.

[00155] Exemplo 3 Expressão de 645gL4gH5 como um scFv

[00156] Construção do plasmídeo

[00157] O scFv foi expresso de um dos dois plasmídeos de expressão de mamífero modificados UCB relacionados muito proximamente; pVKΔPvull foi usado para a clonagem e expressão de scFv na orientação LH. Todos os scFv foram designados para conter um peptídeo de ligação de aminoácido 20, (GGGGS)4 (SEQ ID NO:17) e um identificador 10xHis de terminal C. Os plasmídeos aceitadores scFv 326 HL e 240LH codificam sítios de restrição únicos nas extremidades FW1-FW4 de vH (Pvull e Xhol) e vL (EcoRV e BsiWI) viabilizando a clonagem de restrição das regiões variáveis scFv subseqüentes em uma ligação em duas etapas. Os genes que codificam o 645gH5 vH e 645gL4 vL foram sintetizados por DNA 2.0, com tremores de cisteínas nas posições Kabat vH44 e vL100 para a geração de (ds)scFv estabilizado por disulfeto. Estes genes da região V foram clonados nos plasmídeos do aceitador scFv usando Pvull e Xhol (vH) ou EcoRV e BsiWI (vL) e foi verificada uma ligação bem-sucedida através de seqüenciação de DNA. Expressão e purificação

[00158] Células HEK 293 F (culturas de 50 ml a 106 células/ml) foram transfectadas com 50 μg de DNA de plasmídeos e foi feita a cultura a 37 ° C em meio FreeStyle TM. Os sobrenadantes foram recolhidos 6 dias depois da transfecção e o scFv foi purificado por meio de purificação de batelada Nf+-NTA. A proteína purificada foi concentrada e trocada em solução tampão para PBS para a caracterização biofísica subseqüente. Ensaio de termo-estabilidade

[00159] O ensaio termo-flúor foi executado para se avaliar as estabilidades térmicas de moléculas purificadas. As proteínas purificadas (0,1 mg/ml) foram misturadas com corante SYPRO® laranja (Invitrogen), e a mistura administrada em quadruplicata em uma lâmina de poço ótico 384 PCR. As amostras foram analisadas sobre um sistema 7900HT Fast Real-Time PCR (Agilent Technologies) em uma faixa de temperatura de 20 ° C a 99 ° C, com uma velocidade de aumento de 1,1 ° C/min. As alterações de intensidade de fluorescência por poço foram registradas contra a temperatura e os pontos de inflexão das curvas resultantes foram utilizados para gerar a Tm.

[00160] HPLC de exclusão de tamanho

[00161] As proteínas purificadas (10 μ e 50 μg) foram analisadas por HPLC de exclusão de tamanho em uma coluna Tricorn Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). Um gradiente isocrático de PBS pH 7,4 foi utilizado com uma vazão de 1 ml/min, com detecção UV a 214 nm e 280 nm. Sumário dos resultados

[00162] 645gH5gL4 HLds produziu 97% de monômero e uma Tm em ° C de 75,6.

[00163] 645gH5gL4 HL produziu 86% de monômero e uma TM em 0 C de 75,6. Exemplo 4

[00164] Construção de fusões FabA-dsscFv

[00165] Plasmídeos para expressão em células de mamíferos.

[00166] Uma só cadeia de (scFv) foi construída ligando-se os domínios de região variável de cadeia leve e pesada de um anticorpo de ligação com albumina de soro humano (SEQ ID: 1 e 3 ou 2 e 4) através de um dispositivo de ligação flexível (SEQ ID:17) na orientação HL. Foram introduzidos pontos de mutações na sequências de DNA em resíduos escolhidos na região de trabalho de ambas, a cadeia pesada e a cadeia leve do Fv. As mutações introduzidas para criarem uma ligação de disulfeto inter-cadeia entre as cadeias pesada e leve do Fv eram a cadeia pesada G44C e a cadeia leve G100C para formar um sdFv ligado por disulfeto (dsscFv). As proteínas de fusão FabA-dsscFv foram construídas pela fusão de um dsscFv com o terminal C da região constante de qualquer das regiões leve (com o alotipo Km3 da região constante kappa), ou a cadeia pesada de FabA ( isotipo yl, região constante CH1- gama humana 1). Um dispositivo de ligação flexível (SEQ ID NO:18 e 5) foi usado para ligar o scFv na região cKappa (SEQ ID NO:19) ou região CHI (SEQ ID NO:20), respectivamente. A FabA-dsscFv (CL-dsscFv), FabA-dsscFv(CH1-dsscFv), cadeia leve FabA e cadeia pesada FabA foram fabricadas quimicamente e então foram clonadas em setores de expressão de mamífero sob o controle do promotor HCMV- MIE e sequência SV40E poliA.

[00167] Nas figuras 7 a 13 são mostrados vários dados para estas construções. Os dados de termo-estabilidade para as construções produziu uma Tm para cada um deles de cerca de 82 ° C.

[00168] Constituindo, no contexto da especificação atual, se destina a significar incluindo.

[00169] Quando as realizações da invenção forem tecnicamente apropriadas elas poderão ser combinadas.

[00170] As realizações são descritas aqui como se fossem constituídas por certas características/elementos. A apresentação também se aplica a realizações separadas, que consistem de ou consistindo essencialmente das referidas características/elementos.

[00171] Será entendido, é claro, que a invenção atual foi descrita somente por exemplos, e isto não significa de forma alguma que ela é limitante, e que podem ser feitas modificações de detalhes dentro do escopo das reivindicações apresentadas posteriormente aqui. As características preferidas de cada realização da invenção são conforme cada uma das outras realizações, mutatis mutandis. Todas as publicações, incluindo, mas não limitadas a patentes e solicitações de patentes citadas nesta especificação, são incorporadas aqui como referência, como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada aqui como referência, como sendo integralmente apresentada.

Claims

1. Anticorpo humanizado de ligação com albumina de soro ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de ser constituído por um domínio variável de cadeia pesada tendo a sequência dada em SEQ ID NO:1 e um domínio variável de cadeia leve tendo a sequência dada em SEQ ID NO:3; em que o dito anticorpo compreende domínios de região constante humanos IgG; e em que o dito fragmento é selecionado do grupo que consiste em Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2, Fv, scvFv, Bis-scFv, diacorpo, triacorpo, tricorpo, DVD-Ig e BiTE.

2. Anticorpo humanizado de ligação com albumina de soro ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de ser constituído por um domínio variável de cadeia pesada tendo a sequência dada em SEQ ID NO:2 e um domínio variável de cadeia leve tendo a sequência dada em SEQ ID NO:4; em que o dito anticorpo compreende domínios de região constante humanos IgG; e em que o dito fragmento é selecionado do grupo que consiste em Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2, Fv, scvFv, Bis-scFv, diacorpo, triacorpo, tricorpo, DVD-Ig e BiTE.

3. Proteína de fusão de anticorpo bi-específico, caracterizada pelo fato de compreender: uma cadeia pesada compreendendo, em sequência do terminal N, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH1), um domínio CH1, e um segundo domínio variável de cadeia pesada (VH2), uma cadeia leve compreendendo, em sequência do terminal N, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL1), um domínio CL e um segundo domínio variável de cadeia leve (VL2), onde as referidas cadeias pesada e leve são alinhadas de tal forma que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação com antígeno e VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação com antígeno, onde o antígeno que é ligado pelo segundo sítio de ligação com antígeno é albumina de soro humano e onde o segundo domínio variável de cadeia pesada (VH2) tem a sequência dada em SEQ ID NO:1 e o segundo domínio variável de cadeia leve (VL2) tem a sequência dada em SEQ ID NO:3, e o segundo domínio variável de cadeia pesada (VH2) e o segundo domínio variável de cadeia leve (VL2) opcionalmente são ligados por uma ligação de disulfeto.

4. Proteína de fusão de anticorpo bi-especifico, caracterizada pelo fato de compreender: uma cadeia pesada compreendendo, em sequência do terminal N, um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH1), um domínio CH1 e um segundo domínio variável de cadeia pesada (VH2), uma cadeia leve compreendendo, em sequência do terminal N, um primeiro domínio variável de cadeia leve (VL1), um domínio CL e um segundo domínio variável de cadeia leve (VL2), onde as referidas cadeias pesada e leve são alinhadas de tal forma que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação com antígeno e VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação com antígeno, onde o antígeno ligado pelo segundo sítio de ligação com antígeno é albumina de soro humano, onde o segundo domínio variável de cadeia pesada (VH2) tem a sequência dada em SEQ ID NO:2, e o segundo domínio variável de cadeia leve (VL2) tem a sequência dada em SEQ ID NO:4 e o segundo domínio variável de cadeia pesada (VH2) e o segundo domínio variável de cadeia leve (VL2) opcionalmente são ligados por uma ligação de disulfeto.

5. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de codificar um anticorpo ou fragmento conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 4, em que o dito polinucleotídeo compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO:15.

6. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender um polinucleotídeo como definido na reivindicação 5, em que a dita célula hospedeira é uma célula microbiana.

7. Processo de produção de um anticorpo ou fragmento como definido em qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de compreender a expressão do mesmo a partir de uma célula hospedeira conforme definida na reivindicação 6.

8. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um anticorpo ou fragmento conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 4.

9. Uso de um anticorpo ou fragmento conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser utilizado na fabricação de um medicamento.