TW201726731A - 對TNF-α、IL-17A及IL-17F具特異性之多重特異性抗體分子 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於對TNFα、IL-17A及IL-17F具特異性之多重特異性抗體分子、該等抗體分子之治療用途及用於製備該等抗體分子之方法。

Description

對TNF-α、IL-17A及IL-17F具特異性之多重特異性抗體分子
本發明係關於對人類TNF-α、人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之多重特異性抗體分子。本發明亦關於抗體分子的治療性用途及用於製備彼等的方法。
TNFa在類風濕性關節炎(RA)患者中作為疾病的關鍵驅動因素之作用係眾所周知的。事實上，抗-TNFa抗體已改觀患者護理。然而，儘管達成該成就，但因為許多患者沒有達成臨床緩解而仍存在顯著未被滿足的醫療需求。因此，治療RA之下一個臨床目的在於解決該未被滿足的臨床需求且提供可顯著提高達成臨床緩解之患者的比例之治療。最新的研究已強調RA患者中Th17/IL-17生物路徑似乎有所增強。已顯示，RA患者相比健康志願者其周邊血液中Th17細胞的百分比增加及在以抗-TNFa治療之後進一步增加(Alzabin等人，2012；Chen等人，2011；Aerts等人，2010)。在抗-TNFa治療之後對互補生物路徑的此種增強可部分地解釋為何許多患者對療法僅具有部分反應或為何一些患者雖然在一開始對治療有反應但仍復發。
現有一文獻針對IL-17在RA病理中的作用提供證據。IL-17家族細胞 激素由6個基於結構相似性之具有23-36kDa的分子質量及二聚體結構之成員組成。創始成員IL-17A(在文獻中常仍簡單地稱為IL-17)與其他成員：IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(亦稱為IL-25)及IL-17F共有16%-50%之胺基酸序列同一性。IL-17A及IL-17F共有最大同源性(50%)且與相同受體複合物結合，從而注意到此等2種細胞激素之間共有生物活性。另外，IL-17A及IL-17F不僅呈同質二聚體的形式存在，而且呈IL-17A/F異二聚體的形式存在。IL-17E(IL-25)與IL-17A具有最少的相似性。IL-17A及IL-17F之生物活性的重要性及相關性在於發現彼等共有相同的IL-17RA/IL-17RC受體複合物，其中IL-17A具有對IL-17RA之最大親和力，而IL-17F更強力地與IL-17RC結合。其他家族的利用IL-17RA之成員為IL-17E，其經由IL-17RA/IL-17RB受體複合物傳遞信號。
IL-17A及IL-17F係由CD4+ T細胞的Th17子集產生。另外，其他T細胞子集產生IL-17A及IL-17F，包括細胞激素CD8+ T細胞(Tc17)、gdT細胞及NK T細胞。經報導會分泌IL-17A之其他細胞群體包括嗜中性白血球、單核細胞、NK細胞、淋巴組織誘導樣(LTi-樣)細胞、腸潘氏(paneth)細胞及甚至B細胞及肥大細胞。另外，已報導上皮細胞會分泌IL-17F。
對IL-17細胞激素回應的細胞類型係藉由不同受體的表現反映。IL-17RA以特別高的水平在造血組織中普遍表現而IL-17RC在關節、肝臟、腎臟、甲狀腺及前列腺的非免疫細胞中較高度表現。此種差別性表現可解釋IL-17A及IL-17F生物活性差異，因為表現高含量的IL-17RC之細胞可對IL-17F更具反應而具有IL17-RA相比IL-17RC的更高表現之細胞可更容易對IL-17A回應。對IL-17A及F反應之特異性細胞類型包括纖維母細胞、上皮細胞、角質細胞、滑膜細胞及內皮細胞，亦報道IL-17A對T及B細胞及 巨噬細胞作用。
IL-17A及IL-17F為來自纖維母細胞、內皮細胞及上皮細胞之促發炎細胞激素、趨化細胞素及基質金屬蛋白酶(包括IL-6、IL-8及MMP-13)的誘導劑。已報導IL-17F的活性通常比L-17A小，然而，當將IL-17F與TNFa組合時，注意到增加的生物反應(Zrioual等人，2009)。與TNFa之此種加成或協同生物活性係針對IL-17A及IL-17F二者均觀察到且可歸因於漸增的mRNA穩定性。已顯示在現明確公開於文獻(Hot & Miossec 2011；Truchetet等人，2013)中之T細胞及IL-17在RA病理中的貢獻下RA患者中IL-17A及IL-17F二者的表現有所增加(Zrioual等人，2009)。以人類滑膜及骨外植體的工作已證實IL-17A增進軟骨及骨降解(Chabaud等人，2001)。小鼠膠原蛋白誘導型關節炎(CIA)模型中之進一步的研究亦已證實IL-17A的過度表現引起滑膜發炎及關節損傷且已顯示CIA受到IL-17A阻斷抑制及在缺少IL-17的小鼠中受到抑制(Lubberts 2001 & 2004；Nakae 2003)。
同時阻斷TNFa及IL-17兩個生物路徑的治療因此具有顯著提高反應速率且解決RA患者及由TNF-α及IL-17A及/或IL-17F介導之其他病理性疾病的治療中現存未滿足需求之潛力。
WO2014/044758(Covagen AG)揭示一種能夠抑制醣基化IL-17A且結合TNF-α之融合構築體。WO2013/063110(Abbvie Inc.)揭示一種能夠結合TNF及IL-17之多價DVD-Ig結合蛋白。WO2014/137961(Eli Lilly and Company)揭示抗-TNF及抗-IL-17A雙特異性抗體。然而，此等分子以往在IL-17F不被中和時可能僅達成有限的療效，及如上所述，IL-17F賦予IL-17A相似的生物活性，因此可用此等治療性分子達成IL-17生物路徑 之僅部分抑制。IL-17A及IL-17F二者的抑制與TNF-α的抑制之組合可提供優於僅TNF-α及IL-17A阻斷劑之經改良之療效。
本發明者已開發能夠抑制TNF-α、IL-17A及IL-17F的新穎多重特異性抗體，此將為患者提供一種新穎治療選擇。
本發明提供一種能夠結合特定言之TNF-α、IL-17A及IL-17F之多重特異性抗體分子，其包含對人類TNF-α具特異性之結合域及對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域，其中該抗體分子係能夠中和人類TNF-α、人類IL-17A及人類IL-17F的生物活性。在一個實施例中，該多重特異性抗體分子係三特異性的且另外含有對人類血清白蛋白具特異性之結合域。
圖1至7顯示根據本發明之抗體分子的胺基酸及核酸序列
圖8顯示Fab-2xdsscFv及Fab-dsscFv-dsFv格式
圖9顯示CA2109小鼠Fab(fwk18 FAB)IgG1(fwk18 IgG)之滴定曲線
圖10a顯示經放線菌素-D/及人類TNF-α及TrYbe 18B或對照化合物Enbrel處理之L929細胞之代表性細胞存活曲線。
圖10b顯示經放線菌素-D/及食蟹獼猴TNF-α及TrYbe 18B或對照化合物Enbrel處理之L929細胞之代表性細胞存活曲線。
圖11顯示TrYbe 18B抑制小鼠中人類TNF α誘導之嗜中性白血球增多症(neutrophilia)。
圖12顯示TrYbe 18B抑制小鼠中人類TNF α及人類IL-17A的組合誘導之嗜中性白血球增多症。
圖13顯示對不同批次的TrYbe 18B之SDS PAGE分析。
圖14顯示TrYbe 18B抑制活體外嗜中性白血球遷移。
圖15顯示對食蟹獼猴IV單次推注劑量的TrYbe 18B後TrYbe18B的血清濃度。
如本文中所使用，「抗原結合位點」或「結合位點」係指分子的一部分，其包含一或多個可變域的一部分或全部(例如可變域對的一部分或全部)，其與靶抗原特異性相互作用。
如本文中所使用，「結合域」係指分子的一部分，其包含一或多個可變域(例如可變域對VH及VL)，其與靶抗原及視情況一或多個恆定域(例如CH1域及/或CL域，為κ或λ中任一形式)特異性相互作用。結合域可包含單域抗體。在一個實施例中，各結合域係單價的。較佳地，各結合域包含不超過一個VH及一個VL。
如本文中所使用，「特異性地」欲指結合位點或結合域僅識別特異性抗原或結合位點或結合域具有比對非特異性抗原之親和力顯著更高的對特異性抗原之結合親和力，例如高5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍之結合親和力。
如本文中所使用，「多重特異性抗體」係指如本文中所述之具有兩種或更多種結合域(例如兩種或三種結合域)之抗體分子。
在一個實施例中，該構築體為雙特異性抗體。
如本文中所使用，「雙特異性抗體」係指具有兩種抗原結合位點之抗體分子，其中一種結合位點結合人類TNF-α及另一種結合位點結合人類IL-17A及人類IL-17F。
在一個實施例中，該抗體構築體為三特異性抗體。
如本文中所使用，「三特異性抗體」係指具有三種抗原結合位點之抗體分子。
在本發明之一個實施例中，提供一種能夠與人類TNF-α、人類IL-17A及人類IL-17F結合之多重特異性抗體分子，其中該抗體分子能夠中和人類TNF-α、人類IL-17A及人類IL-17F的生物活性。
在一個實施例中，該多重特異性抗體分子包含對人類TNF-α具特異性之第一結合域、對人類IL-17A具特異性之第二結合域及對人類IL-17F具特異性之第三結合域。
在一替代實施例中，該多重特異性抗體分子包含對人類TNF-α具特異性之第一結合域及對人類IL-17A及人類IL-17F二者皆具特異性之第二結合域。
在一個實施例中，該抗體分子包含三種結合域，且兩種結合域與同一抗原結合(包括與同一抗原上的相同抗原決定基或不同抗原決定基結合)，及第三結合域與另一(不同)抗原結合。在一個實例中，多重特異性抗體分子與抗原人類TNF-α、人類IL-17A及人類IL-17F結合，其中兩種結合域與人類TNF-α結合及第三結合域與人類IL-17A及人類IL-17F結合。在另一個實例中，多重特異性抗體分子與抗原人類TNF-α、人類IL-17A及人類IL-17F結合，其中兩種結合域每一者能夠與人類IL-17A及人類IL-17F結合及第三結合域與人類TNF-α結合。
在一個實施例中，根據本發明之抗體分子包含不超過一個對人類TNF-α具特異性之結合域及不超過一個對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域。因此，在該實施例中，該抗體分子與人類TNF-α單價結合 且與人類IL-17A及人類IL-17F單價結合。
在一個實施例中，本發明之多重特異性抗體分子包含與三種不同抗原獨立結合的三種結合域。在一個實施例中，該多重特異性抗體分子與抗原人類TNF-α、人類IL-17A及人類IL-17F結合，其中第一結合域與人類TNF-α結合，第二結合域與人類IL-17A結合及第三結合域與人類IL-17F結合。
在另一個實施例中，該多重特異性抗體分子與抗原人類TNF-α、人類IL-17A、人類IL-17F及人類血清白蛋白結合，其中第一結合域與人類IL-17A及人類IL-17F結合，第二結合域與人類TNF-α結合及第三結合域與能夠延長抗體分子之半衰期的抗原結合。與能夠延長抗體分子之半衰期的抗原結合的第三結合域可與人類血清載體蛋白、循環免疫球蛋白分子或CD35/CR1結合。
如本文中所使用，「血清載體蛋白」包括甲狀腺素結合蛋白、轉甲狀腺素蛋白、α1-酸醣蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原及白蛋白、或其任何片段。
如本文中所使用，「循環免疫球蛋白分子」包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、sIgA、IgM及IgD、或其任何片段。
CD35/CR1為存在於具有36天的半衰期(正常範圍為28至47天；Lanaro等人，1971，Cancer，28(3)：658-661)之紅血球細胞上的蛋白質。
在一個具體實施例中，該多重特異性抗體分子包含三種結合域或由三種結合域組成，其中第一結合域對人類TNF-α具特異性，第二結合域對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性及第三結合域對人類血清白蛋白具特 異性。
在一個實施例中，根據本發明之抗體分子包含不超過一個對人類TNF-α具特異性之結合域、不超過一個對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及不超過一個對人類血清載體蛋白(例如人類血清白蛋白)具特異性之結合域。因此，在該實施例中，該抗體分子與人類TNF-α單價結合，與人類IL-17A及人類IL-17F單價結合及與人類血清載體蛋白(例如人類血清白蛋白)單價結合。
包含結合至同一靶抗原(其中該靶抗原為同源多聚體(homomultimer)，例如人類TNF-α三聚體或人類IL-17二聚體)的多個結合域之抗體分子可更有可能活體內形成大抗體及抗原複合物。在其中抗體分子包含不超過一個結合至各靶抗原的結合域之本發明實施例中，該抗體可宜具有比彼等包含結合至同一靶抗原的多個結合域之抗體分子更低的活體內形成大抗體及抗原複合物之傾向。
本發明提供一種經改良之多重特異性抗體，其能夠與IL-17A及IL-17F二者以高親和力結合。特定言之，本發明之多重特異性抗體能夠與IL-17A及IL-17F二者特異性結合。特異性結合意指抗體具有對IL-17A及IL-17F多肽(包括IL-17A/IL-17F異二聚體)相比對其他多肽更大的親和力，且在一個實施例中，抗體不與IL-17之其他同功異型物(isoform)結合。本發明之多重特異性抗體能夠與IL-17A同型二聚體及IL-17F同型二聚體特異性結合。較佳地，本發明之多重特異性抗體亦與IL-17A/IL-17F異二聚體結合。
較佳地，本發明之多重特異性抗體中和IL-17A及IL-17F二者的活性。在一個實施例中，本發明之多重特異性抗體亦中和IL-17A/IL-17F異 二聚體的活性。因此，本發明之多重特異性抗體具有其等可抑制IL-17A及IL-17F二者之生物活性的有利性質。
如本文中所使用，術語「中和抗體」描述能夠中和IL-17A及IL-17F二者的生物信號傳遞活性(例如藉由阻斷IL-17A及IL-17F與其等受體中之一或多者結合及藉由阻斷IL-17A/IL-17F異二聚體與其受體中之一或多者結合)之抗體。應明瞭，如本文中所使用，術語「中和」係指減小生物信號傳遞活性，其可為部分或全部的。此外，應明瞭由抗體中和IL-17A及IL-17F活性的程度可相同或不同。在一個實施例中，將IL-17A/IL-17F異二聚體之活性的中和程度可與IL-17A或IL-17F活性的中和程度相同或不同。相關技術中已知用於確定中和之適合試驗且該等試驗中的某些在此提供於實例中。
較佳地，IL-17A及IL-17F多肽為人類的。在一個實施例中，抗體亦與石蟹獼猴IL-17A及IL-17F結合。
該多重特異性抗體亦宜能夠與TNF-α以高親和力結合。特定言之，本發明之多重特異性抗體能夠與TNF-α特異性結合。
較佳地，本發明之多重特異性抗體中和TNF-α的活性，例如藉由阻斷TNF-α與TNF-α的受體中之一或多者結合。應明瞭，如本文中所使用，術語「中和」係指減小生物信號傳遞活性，其可為部分或全部的。較佳地，TNF-α多肽為人類的。在一個實施例中，該抗體亦與食蟹獼猴TNF-α結合。相關技術中已知用於確定中和之適合的試驗且該等試驗中的某些在此提供於實例中。
因此，本發明亦提供該等抗體於治療及/或預防由TNF-α及IL-17A及/或IL-17F介導的疾病(諸如自體免疫或發炎性疾病或癌症)中之用途。
結合親和力(KD)可藉由標準實驗(例如表面電漿共振，諸如BIAcore)來測定。
在一個實施例中，該多重特異性抗體分子具有為200pM或更小，例如100pM或更佳，50pM或更佳，20pM或更佳，15pM或更佳或12pM或更佳的對人類TNF-α之結合親和力。在一個實施例中，該多重特異性抗體分子具有在50pM至1pM，20pM至1pM，15pM至1pM或12pM至1pM範圍內的對人類TNF-α之結合親和力。在一個實施例中，該多重特異性抗體分子具有在15pM至5pM或12pM至11pM範圍內的對人類TNF-α之結合親和力。
在一個實施例中，該多重特異性抗體分子具有為200pM或更小，例如100pM或更佳，50pM或更佳，20pM或更佳，10pM或更佳，8pM或更佳，5pM或更佳或2pM或更佳的對人類IL-17A之人類類結合親和力。在一個實施例中，該多重特異性抗體分子具有在50pM至1pM，20pM至1pM，10pM至1pM，8pM至1pM，5pM至1pM或2pM至1pM範圍內的對人類IL-17A之結合親和力。
在一個實施例中，該多重特異性抗體分子具有為200pM或更小，例如100pM或更佳，50pM或更佳，20pM或更佳，15pM或更佳或10pM或更佳的對人類IL-17F之結合親和力。在一個實施例中，該多重特異性抗體分子具有在50pM至1pM，20pM至1pM，15pM至1pM或10pM至1pM範圍內的對人類IL-17F之結合親和力。在一個實施例中，該多重特異性抗體分子具有在10pM至5pM或8pM至7pM範圍內的對人類IL-17F之結合親和力。
在一個實施例中，該多重特異性抗體分子具有為3nM或更佳，2nM 或更佳，1.9nM或更佳或1.8nM或更佳之對人類血清白蛋白之結合親和力。在一個實施例中，該多重特異性抗體分子具有在3nM至1pM，2nM至1nM，2nM至1.5nM或1.8nM至1.7nM範圍內的對人類血清白蛋白之結合親和力。
在本發明之一個態樣中，各結合域包含兩個抗體可變域，較佳為VH/VL對。在一個態樣中，各結合域包含不超過兩個抗體可變域。
本發明之多重特異性抗體分子可具有能夠與如上所述的兩種或更多種抗原(例如三種抗原)結合之任何適合的抗體格式。
在一個態樣中，該抗體分子格式係選自雙功能抗體、sc雙功能抗體(scdiabody)、三功能抗體、串聯scFv、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2、FabFvFv、FabFvFc、二Fab、二Fab’、三體(tribody)、串聯scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、sc雙功能抗體-Fc、sc雙功能抗體-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、Duobody及DVD-Ig。
在一個實施例中，該對人類TNF-α具特異性之結合域及該對IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域係獨立地選自Fab、scFv、Fv、dsFv及dsscFv。
在本發明之一個實施例中，該抗體分子不包含CH2域及/或CH3域。缺少CH2域及/或CH3域(亦稱為Fc域)的抗體分子在不需要歸屬於Fc域的功能性質(諸如補體結合)情況下係有利的。
抗體療法中存在Fc域(特別是活性Fc域，諸如IgG1同型Fc)會導致活體內與促發炎蛋白質(諸如FcGR)及補體相互作用。因此，在其中本發明之抗體分子不包含Fc域的實施例中，抗體相比含Fc域的抗體分子可具有 較少的活體內與促發炎蛋白質(諸如FcGR)及補體之相互作用。
包含結合至同一靶抗原(其中該靶抗原為同源多聚體)之多個結合域及Fc域二者的抗體可將形成大抗體：抗原複合物之傾向與形成大免疫複合物之多個活性Fc域組合。大免疫複合物可不適當地活體內沉積而導致免疫系統活化。在本發明之實施例中，其中該抗體包含不超過一個結合至各靶抗原的結合域且不包含Fc域，該抗體可具有減小的形成大免疫複合物之能力及因此具有較小的不適當沉積及活體內免疫活化之可能性。
在本發明之一個態樣中，該多重特異性抗體分子係呈包含以下或由以下組成之二聚體的形式提供：a)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；及b)式(II)之多肽鏈：V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1表示重鏈可變域；CH1表示重鏈恆定區的域，例如其域1；X表示鍵或連接子；Y表示鍵或連接子；V1表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv；VL1表示輕鏈可變域；CL表示來自輕鏈恆定區的域，諸如Cκ；V2表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv。
在一個實施例中，VH1與VL1共同形成對選自人類TNF-α、人類IL- 17A及人類IL-17F的第一抗原具特異性之結合域。在一個實施例中，VH1與VL1共同形成對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域。
在一個實施例中，V1包含對選自人類TNF-α、人類IL-17A及人類IL-17F的第二抗原具特異性之結合域。在一個實施例中，V1包含對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域。
在一個實施例中，V2包含對選自人類TNF-α、人類IL-17A及人類IL-17F的第二或第三抗原具特異性之結合域。在一個實施例中，V2包含對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域。
在一個實施例中，VH1及VL1包含對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及V1及/或V2包含對人類TNF-α具特異性之結合域。在其中V1及V2包含對人類TNF-α具特異性的結合域之實施例中，V1及V2可與人類TNF-α之相同或不同抗原決定基結合。
在一個實施例中，VH1及VL1包含對人類TNF-α具特異性之結合域及V1及/或V2包含對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域。在其中V1及V2包含對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性的結合域之實例中，V1及V2可與人類IL-17A及人類IL-17F之相同或不同抗原決定基結合。
在一個實施例中，該抗體分子包含如式(I)及式(II)中所定義之多肽鏈或由該多肽鏈組成且包含不超過一個對人類TNF-α具特異性之結合域及不超過一個對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域。
在本發明之一個態樣中，該多重特異性抗體分子能夠與一其他抗原結合，且包含對血清載體蛋白、循環免疫球蛋白分子或CD35/CR1具特異性之結合域，例如以用於提供抗體分子之延長的半衰期。
在一個實施例中，VH1/VL1具特異性的所述抗原為血清載體蛋白，諸 如人類類血清載體，諸如人類血清白蛋白。
在一個實施例中，V1具特異性的所述抗原為血清載體蛋白，諸如人類血清載體，諸如人類血清白蛋白。
在一個實施例中，V2具特異性的所述抗原為血清載體蛋白，諸如人類血清載體，諸如人類血清白蛋白。
在一個實施例中，僅VH1/VL1、V1或V2中之一者對血清載體蛋白，諸如人類血清載體，諸如人類血清白蛋白具特異性。
因此，在一個實施例中，該抗體分子包含如上述式(I)及式(II)中所定義之多肽鏈或由該多肽鏈組成，其中：a.VH1及VL1包含對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域；及b.V1包含對人類TNF-α具特異性之結合域及V2包含對血清載體蛋白(例如人類血清白蛋白)具特異性之結合域；或V2包含對人類TNF-α具特異性之結合域及V1包含對血清載體蛋白(例如人類血清白蛋白)具特異性之結合域。
在一個實施例中，該抗體分子包含如式(I)及式(II)中所定義之多肽鏈或由該多肽鏈組成且包含不超過一個對人類TNF-α具特異性之結合域、不超過一個對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及不超過一個對血清載體蛋白(例如人類血清白蛋白)具特異性之結合域。
該VH1-CH1部分與該VL-CL部分共同形成功能性Fab或Fab’片段。
VH1表示可變域，例如重鏈可變域。在一個實施例中，VH1表示重鏈可變域。在一個實施例中，VH1為嵌合可變域，也就是說，其包含衍生自至少兩個物種的成分，例如人類框架及非人類CDR。在一個實施例中， VH1為人類化的。在一個實施例中，VH1為人類的。
VL1表示可變域，例如輕鏈可變域。在一個實施例中，VL1表示輕鏈可變域。在一個實施例中，VL1為嵌合可變域，也就是說，其包含衍生自至少兩個物種的成分，例如人類框架及非人類CDR。在一個實施例中，VL1為人類化的。在一個實施例中，VL1為人類化的。在一個實施例中，VL為人類的。
一般而言，VH1與VL1共同形成抗原結合域。在一個實施例中，VH1與VL1形成同源對。
如本文中所使用，「同源對」係指來自活體內產生的單一抗體之可變域對，即，單離自主體的天然生成之可變域對。因此，同源對為VH及VL對。在一個實例中，同源對以可共同操作方式與抗原結合。
如本文中所使用，「可變區」係指抗體鏈中包含CDR及框架(特定言之適合的框架)的區域。
用於本發明中之可變區一般將衍生自可由相關技術中已知的任何方法產生的抗體。
如本文中所使用，「衍生自」係指所使用序列或與所使用序列高度相似的序列從初始遺傳物質(諸如抗體之輕鏈或重鏈)獲得的事實。
如本文中所使用，「高度相似」欲指於胺基酸序列全長上為95%相似或更大，諸如96、97、98或99%相似的胺基酸序列。
用於本發明中的如上文針對VH1及VL1所述之可變區可來自任何適合的來源且可為例如完全人類或人類化的。
在一個實施例中，該CH1域為來自抗體重鏈的天然生成之域1或其衍生物。
在一個實施例中，輕鏈中的CL片段為恆定κ序列或恆定λ序列或其衍生物。
如本文中所使用的天然生成之域之衍生物欲指天然生成之序列中一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸已被置換或刪除，例如以將域的性質最佳化，諸如藉由消除非所需性質但其中保留域之特徵性特徵的情況。
在一個實施例中，一或多個天然或經改造鏈間(即輕鏈及重鏈間)雙硫鍵存在於功能性Fab或Fab’片段中。
在一個實施例中，「天然」雙硫鍵存在於式(I)及(II)之多肽鏈中的CH1與CL之間。
當CL域衍生自κ或λ中任一者時，形成鍵之半胱胺酸的天然位置在人類cκ及cλ中為214(Kabat編號第4版1987)。
形成雙硫鍵之半胱胺酸在CH1中的確切位置取決於實際上所使用的特定域。因此，例如在人類γ-1中，雙硫鍵的天然位置位於位置233(Kabat編號第4版1987)。已知就其他人類類同型物(諸如γ2、3、4、IgM及IgD)而言形成鍵之半胱胺酸的位置，例如就人類類IgD及IgA2B的重鏈之人類IgM、IgE、IgG2、IgG3、IgG4及128而言位置127。
視情況，可在式I及II之多肽的VH與VL之間存在雙硫鍵。
在一個實施例中，根據本發明之多重特異性抗體在與天然生成於CH1與CL之間的位置等效或對應之位置具有雙硫鍵。
在一個實施例中，包含CH1之恆定區及諸如CL之恆定區具有在非天然生成之位置的雙硫鍵。此可藉由將半胱胺酸引入胺基酸鏈的所需位置中而改造至分子中。該非天然雙硫鍵為存於CH1與CL之間的天然雙硫鍵的附加或替代。在天然位置的半胱胺酸可由無法形成雙硫橋的胺基酸諸如絲胺 酸替代。
經改造半胱胺酸之引入可使用相關技術中已知的任何方法進行。此等方法包括(但不限於)PCR延伸重疊誘變、定點誘變或序列盒誘變(一般可參見Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY，1989；Ausbel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing & Wiley-Interscience，NY，1993)。定點誘變套組可從市面購得，例如QuikChange®定點誘變套組(Stratagene，La Jolla，CA)。序列盒誘變可基於Wells等人，1985，Gene，34：315-323進行。或者，突變體可藉由全基因合成法經退火、連接及PCR擴增及選殖重疊寡核苷酸而得到。
在一個實施例中，CH1與CL之間的雙硫鍵完全不存在，例如鏈間半胱胺酸可用另一胺基酸諸如色胺酸替代。因此，在一個實施例中，分子的功能性Fab片段中不存在鏈間雙硫鍵。以引用方式併入本文中的揭示案諸如WO2005/003170描述如何提供不含鏈間雙硫鍵的Fab片段。
在一個實施例中，如上文所定義之包含如式(I)及式(II)中所定義之多肽鏈或由該等多肽鏈組成的抗體分子不包含CH2域及/或CH3域。
V1表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv，例如dsFv、scFv或dsscFv。
V2表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv，例如dsFv、scFv或dsscFv。
如本文中所使用，「單鏈可變片段」或「scFv」係指包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)或由該重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)組成的藉由該VH可變域與該VL可變域之間的肽連接子穩定的單鏈可變片段。該VH及VL可變域可在任何適合的方向，例如VH的C-端可連接至VL的N-端或 VL的C-端可連接至VH的N-端。
如本文中所使用，「經二硫化物穩定之單鏈可變片段」或「dsscFv」係指藉由介於VH可變域與VL可變域之間的肽連接子穩定且亦包含介於VH與VL之間的域間雙硫鍵之單鏈可變片段。
如本文中所使用，「經二硫化物穩定之可變片段」或「dsFv」係指不含介於VH可變域與VL可變域之間的肽連接子而是藉由介於VH與VL之間的域間雙硫鍵穩定之單鏈可變片段。
如本文中所使用，「單域抗體」或「sdAb」係指由單一單體可變抗體域(諸如VH或VL)或VHH組成之抗體片段。
在一個實施例中，V1及V2皆為dsFv。當V1及V2二者皆為dsFv時，V1及V2中的VH可變域或VL可變域中之任一者相同。在一個實施例中，V1及V2具有相同的VH可變域。在另一個實施例中，V1及V2具有相同的VL可變域。在一個實施例中，V1及V2中的VH及VL可變域相同。後者允許交聯，該交聯可能為一些標靶所需。
在一個實施例中，V1為dsFv及V2為scFv。在一個實施例中，V1為scFv及V2為dsFv。在一個實施例中，V1為dsscFv及V2為dsFv。在一個實施例中，V1為dsFv及V2為dsscFv。在一個實施例中，V1為dsscFv及V2為scFv。在一個實施例中，V1為scFv及V2為dsscFv。在一個實施例中，V1不為scFv。在一個實施例中，V2不為scFv。在一個實施例中，V1及V2二者皆不為scFv。
在其中V1及/或V2為dsFv或dsscFv的實施例中，V1之輕鏈及重鏈可變域及/或V2之輕鏈及重鏈可變域係藉由介於兩個經改造半胱胺酸殘基之間的雙硫鍵連接。介於V1及/或V2之可變域VH與VL之間的雙硫鍵係介於下 文所列殘基中之兩者之間(除非本文另外指明Kabat編號用於下文陳列中)。在參考Kabat編號的任何地方，相關參考文獻為Kabat等人，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美國衛生及公共服務部(US Department of Health and Human Services)，NIH，USA。
在一個實施例中，雙硫鍵係在選自包括下列之群的位置：●VH37+VL95，參見例如Protein Science 6，781-788 Zhu等人(1997)；●VH44+VL100，參見例如；Biochemistry 33 5451-5459 Reiter等人(1994)；或Journal of Biological Chemistry，第269卷，第28期，第18327-18331頁，Reiter等人(1994)；或Protein Engineering，第10卷，第12期，第1453-1459頁，Rajagopal等人(1997)；●VH44+VL105，參見例如J Biochem.118，825-831 Luo等人(1995)；●VH45+VL87，參見例如Protein Science 6，781-788 Zhu等人(1997)；●VH55+VL101，參見例如FEBS Letters 377 135-139 Young等人(1995)；●VH100+VL50，參見例如Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber等人(1990)；●VH100b+VL49；●VH98+VL 46，參見例如Protein Science 6，781-788 Zhu等人(1997)；●VH101+VL46； ●VH105+VL43，參見例如；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷，第7538-7542頁，Brinkmann等人(1993)；或Proteins 19，35-47 Jung等人(1994)，●VH106+VL57，參見例如FEBS Letters 377 135-139 Young等人(1995)
其中VH及VL值獨立地選自所給的V1或V2。
上文所列胺基酸對係在有利於改由半胱胺酸替代而可形成雙硫鍵的位置。半胱胺酸可藉由已知技術經改造至此等所需位置中。因此，在一個實施例中，根據本發明之經改造半胱胺酸係指在所給胺基酸位置的天然生成之殘基已經替代為半胱胺酸殘基的情況。
經改造半胱胺酸之引入可使用相關技術中已知的任何方法進行。此等方法包括(但不限於)PCR延伸重疊誘變、定點誘變或序列盒誘變(一般可參見，Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY，1989；Ausbel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing & Wiley-Interscience，NY，1993)。定點誘變套組可從市面購得，例如QuikChange®定點誘變套組(Stratagen，La Jolla，CA)。序列盒誘變可基於Wells等人，1985，Gene，34：315-323進行。或者，突變體可藉由全基因合成法經退火、連接及PCR擴增及選殖重疊寡核苷酸而得到。
因此，在一個實施例中，當V1及/或V2為dsFv或dsscFv時，V1之可變域VH及VL及/或V2之可變域VH及VL可藉由介於兩個半胱胺酸殘基之間的雙硫鍵連接，其中該對半胱胺酸殘基的位置係選自由以下組成之群： VH37及VL95、VH44及VL100、VH44及VL105、VH45及VL87、VH100及VL50、VH100b及VL49、VH98及VL46、VH101及VL46、VH105及VL43及VH106及VL57。
在一個實施例中，當V1及/或V2為dsFv或dsscFv時，V1之可變域VH及VL及/或V2之可變域VH及VL可藉由介於在CDR外的兩個半胱胺酸殘基(一者在VH中及一者在VL中)之間的雙硫鍵連接，其中該對半胱胺酸殘基的位置係選自由以下組成之群：VH37及VL95、VH44及VL100、VH44及VL105、VH45及VL87、VH100及VL50、VH98及VL46、VH105及VL43及VH106及VL57。
在一個實施例中，當V1為dsFv或dsscFv時，V1之可變域VH及VL係藉由介於兩個經改造半胱胺酸殘基(一者在位置VH44及另一者在VL100)之間的雙硫鍵連接。
在一個實施例中，當V2為dsFv或dsscFv時，V2之可變域VH及VL係藉由介於兩個經改造半胱胺酸殘基(一者在位置VH44及另一者在VL100)之間的雙硫鍵連接。
在一個實施例中，當V1及V2為dsFv或dsscFv時，V1及V2之可變域VH及VL係藉由介於兩個經改造半胱胺酸殘基(一者在位置VH44及另一者在VL100)之間的雙硫鍵連接。
在一個實施例中，當V1及V2皆為dsscFv時，V1及V2之可變域VH及VL係藉由介於兩個經改造半胱胺酸殘基(一者在位置VH44及另一者在VL100)之間的雙硫鍵連接。
在一個實施例中，當V1為dsFv、dsscFv或scFv時，V1之VH域係與X連接，例如經由肽鍵。
在一個實施例中，當V1為dsFv、dsscFv或scFv時，V1之VL域係與X連接，例如經由肽鍵。
在一個實施例中，當V2為dsFv、dsscFv或scFv時，V2之VH域係與Y連接，例如經由肽鍵。
在一個實施例中，當V2為dsFv、dsscFv或scFv時，V2之VL域係與Y連接，例如經由肽鍵。
熟練技術者當明瞭，當V1及/或V2表示dsFv時，該多重特異性抗體將包含編碼未連接至X或Y之對應游離VH或VL域的第三多肽。當V1及V2皆為dsFv時，則該「游離可變域」(即經由雙硫鍵連接至多肽其餘部分的域)將為兩個鏈所共有。因此，雖然經由X或Y融合或連接至多肽的實際可變域在各多肽鏈中可不同，但與其成對的游離可變域一般將彼此相同。
在一個實施例中，X為鍵。
在一個實施例中，Y為鍵。
在一個實施例中，X及Y二者皆為鍵。
在一個實施例中，X為連接子，較佳為肽連接子，例如用於連接部分CH1及V1之適合的肽。
在一個實施例中，Y為連接子，較佳為肽連接子，例如用於連接部分CL及V2之適合的肽。
在一個實施例中，X及Y二者皆為連接子。在一個實施例中，X及Y二者皆為肽連接子。
如本文中所使用，「肽連接子」係指由胺基酸組成的肽。熟習此項技術者將知曉一些適合的肽連接子。
在一個實施例中，X及/或Y肽連接子為50個胺基酸長度或更少，例 如20個胺基酸或更少，諸如約15個胺基酸或更少，諸如9個、10個、11個、12個、13個或14個胺基酸長度。
在一個實施例中，X及/或Y連接子係選自以序列1至67顯示的序列。
在一個實施例中，X及/或Y連接子係選自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2顯示之序列。
在一個實施例中，X具有序列SGGGGTGGGGS(SEQ ID NO：1)。
在一個實施例中，Y具有序列SGGGGTGGGGS(SEQ ID NO：1)。
在一個實施例中，X具有序列SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：2)。
在一個實施例中，Y具有序列SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：2)。
在一個實施例中，X具有SEQ ID NO：1給出的序列且Y具有SEQ ID NO：2給出的序列。
在一個實施例中，X具有SEQ ID NO：2給出的序列且Y具有SEQ ID NO：1給出的序列。
在一個實施例中，X具有SEQ ID NO：2給出的序列且Y具有SEQ ID NO：2給出的序列。
在一個實施例中，X具有SEQ ID NO：69或70給出的序列。在一個實施例中，Y具有SEQ ID NO：69或70給出的序列。在一個實施例中，X具有SEQ ID NO：69給出的序列且Y具有SEQ ID NO：70給出的序列。
用於X及/或Y之適合的連接子序列亦提供於下表1及2中。
(S)視情況在序列14至18中。
剛性連接子的實例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO：52)、PPPP(SEQ ID NO：53)及PPP。
在一個實施例中，肽連接子為白蛋白結合肽。
白蛋白結合肽的實例提供於WO2007/106120中且包括：
有利地，使用白蛋白結合肽作為連接子可增加多重特異性抗體分子的半衰期。
在一個實施例中，V1及V2中之至少一者為scFv或dsscFv。例如，V1為scFv或dsscFv及V2為scFv或dsscFv。
在一個實施例中，V1為dsscFv及V2為dsscFv。
在其中V1為scFv或dsscFv之實施例中，V1包含以下之多肽鏈或由以下之多肽鏈組成：a.式(III)：VH2-Z1-VL2且VH2係與X連接，例如經肽鍵；或b.式(IV)：VL2-Z1-VH2且VL2係與X連接，例如經肽鍵；其中VH2表示重鏈可變域，Z1表示連接子，例如肽連接子及VL2表示輕鏈可變域。
在其中V2為scFv或dsscFv之實施例中，V2包含以下之多肽鏈或由以下之多肽鏈組成：a.式(V)：VH3-Z2-VL3且VH3係與Y連接，例如經肽鍵；或b.式(VI)：VL3-Z2-VH3且VL3係與Y連接，例如經肽鍵；其中VH3表示重鏈可變域，Z2表示連接子，例如肽連接子且VL3表示輕鏈可變域。
在一個實施例中，scFv或dsscFv中的肽連接子Z1及/或Z2係在範圍約12至25個胺基酸長度(諸如15至20個胺基酸)內。
在一個實施例中，當V1為scFv或dsscFv時，將V1之可變域VH及VL連 接的連接子Z1具有序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：68)。
在一個實施例中，當V2為scFv或dsscFv時，將V2之可變域VH及VL連接的連接子Z2具有序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：68)。
在一個實施例中，當V1為scFv或dsscFv時，將V1之可變域VH及VL連接的連接子Z1具有序列SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：69)。
在一個實施例中，當V2為scFv或dsscFv時，V2之可變域VH及VL連接的連接子Z2具有序列SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：69)。
在一個實施例中，當V1為scFv或dsscFv時，將V1之可變域VH及VL連接的連接子Z1具有序列SGGGGSGGGGTGGGGS(SEQ ID NO：70)。
在一個實施例中，當V2為scFv或dsscFv時，將V2之可變域VH及VL之可變域連接的連接子Z2具有序列SGGGGSGGGGTGGGGS SEQ ID NO：70)。
因此，在一個態樣中，提供一種多重特異性抗體分子，其包含以下或由以下組成：a)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；及b)式(II)之多肽鏈：V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1表示重鏈可變域；CH1表示重鏈恆定區的域，例如其域1； X表示具有SEQ ID NO：2給出的序列之連接子；Y表示具有SEQ ID NO：2給出的序列之連接子；V1表示包含式(III)：VH2-Z1-VL2之多肽鏈或由其組成的dsscFv，其中VH2表示重鏈可變域，Z1表示具有SEQ ID NO：68給出的序列之連接子，VL2表示輕鏈可變域，VH2係與X連接，例如經肽鍵，及V1之可變域VH2及VL2係藉由介於兩個經改造半胱胺酸(一者在位置VH44及另一者在VL100)之間的鍵連接；VL1表示輕鏈可變域；CL表示來自輕鏈恆定區的域，諸如Cκ；V2表示包含式(V)：VH3-Z2-VL3之多肽鏈或由該多肽鏈組成之dsscFv，其中VH3表示重鏈可變域，Z2表示具有SEQ ID NO：68給出的序列之連接子，VL3表示輕鏈可變域，VH3係與Y連接，例如經肽鍵，及V2之可變域VH3及VL3係藉由介於兩個經改造半胱胺酸殘基(一者在位置VH44及另一者在位置VL100)之間的雙硫鍵連接；其中VH1及VL1包含對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域；及V1包含對人類TNF-α具特異性之結合域及V2包含對人類血清白蛋白具特異性之結合域；或V2包含對人類TNF-α具特異性之結合域及V1包含對人類血清白蛋白具特異性之結合域。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列之CDR、具有SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列之CDR、具有SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之CDR中之至少一者。在一個實施例中，該對人類TNF-α具特異性之結合域包含具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序 列、具有SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及具有SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR。在一個實施例中，該對人類TNF-α具特異性之結合域包含3個重鏈CDR且CDRH1之序列與SEQ ID NO：85給出的序列具有至少60%之同一性或相似性，CDRH2之序列與SEQ ID NO：86給出的序列具有至少60%之同一性或相似性及CDRH3之序列與SEQ ID NO：87給出的序列具有至少60%之同一性或相似性。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含具有SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：136給出的CDRL1序列之CDR、具有SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：139給出的CDRL2序列之CDR及具有SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之CDR中之至少一者。在一個實施例中，該對人類TNF-α具特異性之結合域包含具有SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：136給出的CDRL1序列、具有SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：139給出的CDRL2序列或具有SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR。在一個實施例中，該對人類TNF-α具特異性之結合域包含3個輕鏈CDR且CDRL1之序列與SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：136給出的序列具有至少60%之同一性或相似性，CDRL2之序列與SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：139給出的序列具有至少60%之同一性或相似性及CDRL3之序列與SEQ ID NO：90給出的序列具有至少60%之同一性或相似性。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對TNF-α具特異性之結合域包含具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、具有SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及具有SEQ ID NO：87給出的CDRH3 序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：88給出的CDRL1序列、具有SEQ ID NO：89給出的CDRL2序列及具有SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、具有SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及具有SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：136給出的CDRL1序列、具有SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：139給出的CDRL2序列及具有SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：96給出的序列；與SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：96給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：96給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列之重鏈可變域，其中CDRH1、CDRH2及CDRH2具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：87給出之CDRH3序列。
在一個實例中，對人類TNF-α具特異性之結合域為人類化的。在本發明之人類化抗體中，受體重鏈及輕鏈不必一定衍生自相同抗體且若需要則可包含具有衍生自不同鏈的框架區之複合鏈。
在一個實例中，本發明之TNF-α結合域的重鏈之一種此類適合的框架區係衍生自人類VH3 1-3 3-21 JH4受體框架。
因此，在一個實例中，對TNF-α具特異性之結合域包含重鏈可變 域，其包含一或多個選自SEQ ID NO：85給出的CDR-H1序列、SEQ ID NO：86給出的CDR-H2序列及SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之CDR，其中該重鏈框架區係衍生自人類受體框架VH3 1-3 3-21 JH4。
在本發明之人類化抗體中，框架區不一定完全具有與受體抗體之序列完全相同的序列。例如，非尋常殘基可經改變為該受體鏈類別或類型的更頻繁生成之殘基。或者，可改變受體框架區中的所選殘基使得彼等對應於在供體抗體中的相同位置發現的殘基(參見Reichmann等人，1998，Nature，332，323-324)。該等變化應保持至恢復供體抗體之親和力所需的最低程度。用於選擇可能需要改變之受體框架區中的殘基之方案陳述於WO91/09967中。
因此，在一個實施例中，重鏈及/或輕鏈框架中的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個殘基係經替代性胺基酸殘基置換。
因此，在一個實例中，對TNF-α具特異性之結合域包含重鏈可變域，其中在重鏈的可變域之位置24、48、49、71、73、78及93(Kabat編號)的殘基中之至少一者為供體殘基，參見例如SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：96給出的序列。
在一個實施例中，重鏈可變域之殘基24係經替代性胺基酸(例如蘇胺酸)置換。
在一個實施例中，重鏈可變域之殘基48係經替代性胺基酸(例如異白胺酸)置換。
在一個實施例中，重鏈可變域之殘基49係經替代性胺基酸(例如甘胺酸)置換。
在一個實施例中，重鏈可變域之殘基71係經替代性胺基酸(例如纈胺 酸)置換。
在一個實施例中，重鏈可變域之殘基73係經替代性胺基酸(例如離胺酸)置換。
在一個實施例中，重鏈可變域之殘基78係經替代性胺基酸(例如丙胺酸)置換。
在一個實施例中，重鏈可變域之殘基93係經替代性胺基酸(例如蘇胺酸)置換。
在一個實施例中，根據本發明之人類化抗-TNFα重鏈可變域中的殘基48為異白胺酸，殘基49為甘胺酸，71為纈胺酸，73為離胺酸，78為丙胺酸及殘基93為蘇胺酸。
因此，在一個實施例中，提供一種人類化TNF-α結合域，其中在重鏈的可變域之位置48、49、71、73、78及93(Kabat編號)各者處之殘基中的至少一者為供體殘基，參見例如SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：96給出的序列。
在一個實例中，提供一種人類化TNF-α結合域，其中至少在重鏈的可變域之位置24、48、49、71、73、78及93(Kabat編號)各者處的殘基為供體殘基。
在一個實例中，用於本發明之人類化TNF-α結合域的輕鏈之適合的框架區係衍生自人類受體框架VK1 2-1(U)A20 JK2。
因此，在一個實例中，對TNF-α具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：88或136給出的CDR-L1序列、SEQ ID NO：89、137、138或139給出的CDR-L2序列及SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之輕鏈可變域，其中該輕鏈框架區係衍生自人類受體框架VK1 2-1(U)A20 JK2。
在一個實例中，對TNF-α具特異性之結合域包含人類化輕鏈可變域，其中在輕鏈的可變域之位置65、71及87(Kabat編號)的殘基中之一或多者為供體殘基，參見例如SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：95給出的序列。
在一個實例中，提供一種人類化TNF-α結合域，其中至少在輕鏈的可變域之位置65、71及87(Kabat編號)各處的殘基為供體殘基，參見例如SEQ ID NO：91或95給出的序列。
在一個實施例中，輕鏈可變域之殘基65係經替代性胺基酸(例如蘇胺酸)置換。
在一個實施例中，輕鏈可變域中之殘基71係經替代性胺基酸(例如酪胺酸)置換。
在一個實施例中，輕鏈可變域中之殘基87係經替代性胺基酸(例如苯丙胺酸)置換。
在一個實施例中，根據本發明之人類化抗-TNF-α輕鏈可變區中的殘基65為蘇胺酸，殘基71為酪胺酸及殘基87為苯丙胺酸。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：95給出的序列；與SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：95給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：95給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列之輕鏈可變域，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3具有SEQ ID NO：88給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：89給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：91給出的序列之輕鏈可 變域及含有SEQ ID NO：92給出的序列之重鏈可變域。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：147給出的序列之輕鏈可變域及含有SEQ ID NO：92給出的序列之重鏈可變域。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：95給出之輕鏈可變域及含有SEQ ID NO：96給出的序列之重鏈可變域。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該抗體包含對TNF-α具特異性之dsscFv且該dsscFv包含SEQ ID NO：101給出的序列；與SEQ ID NO：101給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：I01給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列且CDRL1、CDRL2及CDRL3具有SEQ ID NO：88給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：89給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該抗體包含對人類TNF-α具特異性之scFv且scFv包含SEQ ID NO：99給出的序列；與SEQ ID NO：99給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：99給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列且CDRL1、CDRL2及CDRL3具有SEQ ID NO：88給出的CDRL1序 列、SEQ ID NO：89給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列。
在本發明的其中抗體分子包含如上所定義的式(I)及式(II)之多肽鏈或由其組成之態樣中，抗體分子可包含具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：88或136給出的CDRL1序列、具有SEQ ID NO：89或137或138或139給出的CDRL2序列及具有SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR，其係在抗體分子中的位置VH1/VL1。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、具有SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及具有SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之該3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：88或136給出的CDRL1序列、具有SEQ ID NO：89或137或138或139給出的CDRL2序列及具有SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR係在本發明構築體中的位置V1。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、具有SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及以具有SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之該3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：88或136給出的CDRL1序列、具有SEQ ID NO：89或137或138或139給出的CDRL2序列及具有SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之該3個輕鏈CDR係在本發明構築體中的位置V2。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、具有SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及具有SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之該3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：88或136給出的CDRL1序列、具有SEQ ID NO：89或137或138或139給出的CDRL2序列及具有SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之該3個輕鏈CDR係在本發明構築體中的V1及V2。在一個實施例中， 具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、具有SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及具有SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之該3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：88或136給出的CDRL1序列、具有SEQ ID NO：89或137或138或139給出的CDRL2序列及具有SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之該3個輕鏈CDR係在本發明之構築體的位置VH1/VL1及V1。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、具有SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及具有SEQ I D NO：87給出的CDRH3序列之該3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：88或136給出的CDRL1序列、具有SEQ ID NO：89或137或138或139給出的CDRL2序列及具有SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之該3個輕鏈CDR係在本發明之構築體的位置VH1/VL1及V2。
在一個實施例中，在包含本發明式(I)及式(II)的多肽鏈之抗體分子中的TNF-α結合位點包含選自SEQ ID NO：92及SEQ ID NO：96之重鏈可變域及選自SEQ ID NO：91及SEQ ID NO：95之輕鏈可變域，特別地，重鏈及輕鏈分別為SEQ ID NO：92及91或SEQ ID NO：96及95。在一個實施例中，此等域係在本發明之構築體的位置VH1/VL1中。在一個實施例中，此等可變域係在位置V1。在一個實施例中，此等可變域係在位置V2。在一個實施例中，此等可變域係在位置V1及V2。在一個實施例中，此等可變域係在本發明之構築體中的位置VH1/VL1及V1。在一個實施例中，此等可變域係在本發明之構築體中的位置VH1/VL1及V2。當可變域係在本發明之構築體的兩個位置時，相同對的可變域可在各個位置或可使用兩個不同對的可變域。
在一個實施例中，在包含本發明式(I)及式(II)之多肽鏈的抗體分子中之TNF-α結合位點包含對人類TNF-α具特異性之dsscFv且該dsscFv包含 SEQ ID NO：101給出的序列。在一個實施例中，包含SEQ ID NO：101給出的序列之dsscFv係在位置V1及/或V2。在一個實施例中，包含SEQ ID NO：101給出的序列之dsscFv係在位置V1。在一個實施例中，包含SEQ ID NO：101給出的序列之dsscFv係在位置V2。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含3個重鏈CDR，其具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列。在一個實施例中，該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含3個重鏈CDR且該CDRH1之序列與SEQ ID NO：71給出的序列具有至少60%之同一性或相似性，該CDRH2之序列與SEQ ID NO：72給出的序列具有至少60%之同一性或相似性及該CDRH3之序列與SEQ ID NO：73給出的序列具有至少60%之同一性或相似性。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含3個輕鏈CDR，其具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列。在一個實施例中，該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域另外包含3個輕鏈CDR且該CDRL1之序列與SEQ ID NO：74給出的序列具有至少60%之同一性或相似性，該CDRL2之序列與SEQ ID NO：75給出的序列具有至少60%之同一性或相似性及該CDRL3之序列與SEQ ID NO：76給出的序列具有至少60%之同一性或相似性。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的 CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：78給出的序列；與SEQ ID NO：78給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：78給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列之重鏈可變域，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：77給出的序列；與SEQ ID NO：77給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：77給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列之輕鏈可變域。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：78給出的序列之重鏈可變域及含有SEQ ID NO：77給出的序列之輕鏈可變域。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類Il-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：82給出的序列；與SEQ ID NO：82給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序 列；或與SEQ ID NO：82給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列之重鏈可變域及重鏈恆定域，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類Il-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：81給出的序列；與SEQ ID NO：81給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：81給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列之輕鏈可變域及輕鏈恆定域，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含具有SEQ ID NO：82給出的序列之重鏈及具有SEQ ID NO：81給出的序列之輕鏈。
在本發明的其中抗體分子包含如上文所述的式(I)及式(II)之多肽鏈或由該多肽鏈組成之態樣中，該抗體分子可包含具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、具有SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及具有SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、具有SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及具有SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR，該3個重鏈CDR及該3個輕鏈CDR係在該抗體分子的位置VH1/VL1。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：74給出的 CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR係在本發明之構築體中的位置V1。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR係在本發明之構築體中的位置V2。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR係在本發明構築體中的位置V1及V2。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR係在本發明之構築體中的位置VH1/VL1及V1。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列的3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR係在本發明之構築體中的位置VH1/VL1及V2。
在一個實施例中，包含本發明的式(I)及式(II)之多肽鏈的抗體分子中之IL-17A及IL-17F結合位點包含SEQ ID NO：78給出的重鏈可變域及SEQ ID NO：77給出的輕鏈可變域。在一個實施例中，此等域係在本發明之構 築體中的位置VH1/VL1。在一個實施例中，此等可變域係在位置V1。在一個實施例中，此等可變域係在位置V2。在一個實施例中，此等可變域係在位置V1及V2。在一個實施例中，此等可變域係在本發明之構築體中的位置VH1/VL1及V1。在一個實施例中，此等可變域係在本發明之構築體中的位置VH1/VL1及V2。
在一個實施例中，包含本發明的式(I)及式(II)之多肽鏈的抗體分子中之IL-17A及IL-17F結合位點包含具有在位置VH1之SEQ ID NO：82給出的序列之重鏈及具有在位置VL1之SEQ ID NO：81給出的序列之輕鏈。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該抗體分子包含對人類血清白蛋白具特異性之結合域，該結合域包含具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR。在一個實施例中，該對人類血清白蛋白具特異性之結合域包含3個重鏈CDR且該CDRH1之序列與SEQ ID NO：103給出的序列具有至少60%之同一性或相似性，該CDRH2之序列與SEQ ID NO：104給出的序列具有至少60%之同一性或相似性及該CDRH3之序列與SEQ ID NO：105給出的序列具有至少60%之同一性或相似性。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該抗體分子包含對人類血清白蛋白具特異性之結合域，該結合域包含具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR。在一個實施例中，該對人類血清白蛋白具特異性之結合域另外包含3個輕鏈CDR且該CDRL1之序列與SEQ ID NO：106給出的序列具有至少60%之同一性或相似性，該 CDRL2之序列與SEQ ID NO：107給出的序列具有至少60%之同一性或相似性及該CDRL3之序列與SEQ ID NO：108給出的序列具有至少60%之同一性或相似性。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該抗體分子包含對人類血清白蛋白具特異性之結合域，該結合域包含SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR。
本發明亦提供一種如上文所定義之多重特異性抗體結合分子，其中該對人類血清白蛋白具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：114給出的序列；與SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：114給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：114給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列之重鏈可變域，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列。
本發明提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其中該對人類血清白蛋白具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：113給出的序列、與SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：113給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：113給出的序列具有至少80%之同一性或相似性之輕鏈可變域，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、 SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列。
本發明亦提供一種如上文所定義之多重特異性抗體結合分子，其中該對人類血清白蛋白具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：110給出的序列之重鏈可變域及含有SEQ ID NO：109給出的序列之輕鏈可變域。
本發明亦提供一種如上文所定義之多重特異性抗體結合分子，其中該對人類血清白蛋白具特異性之結合域包含含有SEQ ID NO：114給出的序列之重鏈可變域及含有SEQ ID NO：113給出的序列之輕鏈可變域。
本發明亦提供一種如上文所定義之多重特異性抗體結合分子，其中該抗體包含對人類血清白蛋白具特異性之dsscFv且該dsscFv包含SEQ ID NO：119給出的序列；與SEQ ID NO：119給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：119之序列具有至少80%之同一性或相似性的序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列、SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列，及CDRL1、CDRL2及CDRL3具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列。
本發明亦提供一種如上文所定義之多重特異性抗體結合分子，其中該抗體包含對人類血清白蛋白具特異性之scFv且該scFv包含SEQ ID NO：117給出的序列；與SEQ ID NO：117給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：117給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列及CDRL1、CDRL2及CDRL3具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列。
在本發明的其中抗體分子包含如上文所定義的式(I)及式(II)之多肽鏈或由該多肽鏈組成之態樣中，該抗體分子可包含具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR，該3個重鏈CDR及該3個輕鏈CDR係在抗體分子中的位置VH1/VL1。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列之該3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列之該3個輕鏈CDR係在本發明之構築體中的位置V1。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列之該3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列之該3個輕鏈CDR係在本發明之構築體中的位置V2。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列之該3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列之該3個輕鏈CDR係在本發明之構築體中的位置V1及V2。在一個實施例中，具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列 及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列之該3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列之該3個輕鏈CDR係在本發明之構築體中的位置VH1/VL1及V1。在一個實施例中，SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列之該3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列之該3個輕鏈CDR係在本發明之構築體中的位置VH1/VL1及V2。
在一個實施例中，本發明的包含式(I)及式(II)之多肽鏈的抗體分子中之人類血清白蛋白結合位點包含選自SEQ ID NO：110及SEQ ID NO：114之重鏈可變域及選自SEQ ID NO：109及SEQ ID NO：113之輕鏈可變域，特定言之，重鏈及輕鏈分別為SEQ ID NO：110及109或SEQ ID NO：114及113。在一個實施例中，此等域係在本發明之構築體中的位置VH1/VL1。在一個實施例中，此等可變域係在位置V1。在一個實施例中，此等可變域係在位置V2。在一個實施例中，此等可變域係在位置V1及V2。在一個實施例中，此等可變域係在本發明之構築體中的位置VH1/VL1及V1。在一個實施例中，此等可變域係在本發明之構築體中的位置VH1/VL1及V2。當可變域在本發明之構築體中的兩個位置時，可以是相同的可變域對在每個位置或可使用兩個不同的可變域對。
在一個實施例中，本發明的包含式(I)及(II)之多肽鏈的抗體分子中之人類血清白蛋白結合位點包含對人類血清白蛋白具特異性之dsscFv且該dsscFv包含SEQ ID NO：119給出的序列。在一個實施例中，該包含SEQ ID NO：119給出的序列之dsscFv係在位置V1及/或V2。在一個實施例中， 該包含SEQ ID NO：119給出的序列之dsscFv係在位置V1。在一個實施例中，該包含SEQ ID NO：119給出的序列之dsscFv係在位置V2。
在本發明之一個態樣中，如上文所定義之多重特異性抗體分子係呈包含以下或由以下組成之二聚體的形式提供：a)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；及b)式(II)之多肽鏈：V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1表示包含具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR之重鏈可變域；CH1表示重鏈恆定區的域，例如其域1；X表示鍵或連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；Y表示鍵或連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；V1表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv，其包含具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：88給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：89給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR；VL1表示包含具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR之輕鏈可變域； CL表示來自輕鏈恆定區的域，諸如Cκ；V2表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv，其包含具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR。
在本發明之一個態樣中，如上文所定義之多重特異性抗體分子係呈包含以下或由以下組成之二聚體的形式提供：a)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；及b)式(II)之多肽鏈：V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1表示包含具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR之重鏈可變域；CH1表示重鏈恆定區的域，例如其域1；X表示鍵或連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；Y表示鍵或連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；V1表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv，其包含具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列之3個輕鏈CDR及具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的 CDRL3序列之3個輕鏈CDR；VL1表示包含具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR之輕鏈可變域；CL表示來自輕鏈恆定區的域，諸如Cκ；V2表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv，其包含具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：88給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：89給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR。
在一個態樣中，提供一種包含以下或由以下組成之多重特異性抗體分子：a)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；及b)式(II)之多肽鏈：V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1表示具有SEQ ID NO：78給出的序列之重鏈可變域；CH1表示重鏈恆定區的域，例如其域1；X表示連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；Y表示連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；V1表示dsscFv，其包含具有SEQ ID NO：96給出的序列之重鏈可變域及具有SEQ ID NO：95給出的序列之輕鏈可變域； VL1表示具有SEQ ID NO：77給出的序列之輕鏈可變域；CL表示來自輕鏈恆定區的域，諸如Cκ；V2表示dsscFv，其包含具有SEQ ID NO：114給出的序列之重鏈可變域及具有SEQ ID NO：113給出的序列之輕鏈可變域。
在一個態樣中，提供一種包含以下或由以下組成之多重特異性抗體分子：a)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；及b)式(II)之多肽鏈：V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1表示具有SEQ ID NO：78給出的序列之重鏈可變域；CH1表示重鏈恆定區的域，例如其域1；X表示連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；Y表示連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；V1表示dsscFv，其包含具有SEQ ID NO：114給出的序列之重鏈可變域及具有SEQ ID NO：113給出的序列之輕鏈可變域；VL1表示具有SEQ ID NO：77給出的序列之輕鏈可變域；CL表示來自輕鏈恆定區的域，諸如Cκ；V2表示dsscFv，其包含具有SEQ ID NO：96給出的序列之重鏈可變域及具有SEQ ID NO：95給出的序列之輕鏈可變域。
在一個態樣中，提供一種多重特異性抗體分子，其包含以下或由以下組成： a)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；及b)式(II)之多肽鏈：V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1及CH1表示具有SEQ ID NO：82給出的序列之重鏈可變域及重鏈恆定域；X表示連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；Y表示連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；V1表示dsscFv，其包含具有SEQ ID NO：96給出的序列之重鏈可變域及具有SEQ ID NO：95給出的序列之輕鏈可變域；VL1及CL表示具有SEQ ID NO：81給出的序列之輕鏈可變域及輕鏈恆定域；V2表示dsscFv，其包含具有SEQ ID NO：114給出的序列之重鏈可變域及具有SEQ ID NO：113給出的序列之輕鏈可變域。
在一個態樣中，提供一種多重特異性抗體分子，其包含以下或由以下組成：a)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；及b)式(II)之多肽鏈：V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1及CH1表示具有SEQ ID NO：82給出的序列之重鏈可變域及重鏈 恆定域；X表示連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；Y表示連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；V1表示dsscFv，其包含具有SEQ ID NO：114給出的序列之重鏈可變域及具有SEQ ID NO：113給出的序列之輕鏈可變域；VL1及CL表示具有SEQ ID NO：81給出的序列之輕鏈可變域及輕鏈恆定域；V2表示dsscFv，其包含具有SEQ ID NO：96給出的序列之重鏈可變域及具有SEQ ID NO：95給出的序列之輕鏈可變域。
在一個態樣中，提供一種多重特異性抗體分子，其包含以下或由以下組成：a)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；及b)式(II)之多肽鏈：V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1及CH1表示具有SEQ ID NO：82給出的序列之重鏈可變域及重鏈恆定域；X表示連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；Y表示連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；V1表示dsscFv，其包含SEQ ID NO：101給出的序列；VL1及CL表示具有SEQ ID NO：81給出的序列之輕鏈可變域及輕鏈恆定域； V2表示dsscFv，其包含SEQ ID NO：119給出的序列。
在一個態樣中，提供一種多重特異性抗體分子，其包含以下或由以下組成：a)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；及b)式(II)之多肽鏈：V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1及CH1表示具有SEQ ID NO：82給出的序列之重鏈可變域及重鏈恆定域；X表示連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；Y表示連接子，例如具有SEQ ID NO：2給出的序列；V1表示dsscFv，其包含SEQ ID NO：119給出的序列；VL1及CL表示具有SEQ ID NO：81給出的序列之輕鏈可變域及輕鏈恆定域；V2表示dsscFv，其包含SEQ ID NO：101給出的序列。
本發明提供一種三特異性抗體分子，其包含對人類TNF-α具特異性之結合域、對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及對人類血清白蛋白具特異性之結合域，其中該抗體分子包含以下或由以下組成：a)包含以下或由以下組成之第一多肽：i SEQ ID NO：125給出的序列；ii 與SEQ ID NO：125給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或 iii 與SEQ ID NO：125給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列，其中該序列包含具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR、具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：88給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：89給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR；及b)包含以下或由以下組成之第二多肽：i SEQ ID NO：131給出的序列；ii 與SEQ ID NO：131給出的序列具有至少80%之同一性或相似性；或iii 與SEQ ID NO：131給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列，其中該序列包含3具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列之個輕鏈CDR、具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列SEQ ID NO：105給出的及CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR。
在一個實施例中，該抗體分子包含以下或由以下組成：具有SEQ ID NO：125給出的序列之第一多肽；及具有SEQ ID NO：131給出的序列之第二多肽。
本發明亦提供一種三特異性抗體分子，其包含對人類TNF-α具特異性之結合域、對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及對人類血清白蛋白具特異性之結合域，且包含以下或由以下組成：a)包含以下或由以下組成之第一多肽：i SEQ ID NO：127給出的序列；ii 與SEQ ID NO：127給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或iii 與SEQ ID NO：127給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列，其中該序列包含具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR、具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：88給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：89給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR；及；b)包含以下或由以下組成之第二多肽：i SEQ ID NO：131給出的序列；ii 與SEQ ID NO：131給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列；或iii 與SEQ ID NO：131給出的序列具有至少80%之同一性或相似性的序列，其中該序列包含具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR、具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列之3個重鏈CDR及具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列之3個輕鏈CDR。
在一個實施例中，該抗體分子包含以下或由以下組成：具有SEQ ID NO：127給出的序列之第一多肽及具有SEQ ID NO：131給出的序列之第二多肽。
本發明亦提供一種三特異性抗體分子，其包含對人類TNF-α具特異性之結合域、對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及對人類血清白蛋白具特異性之結合域，且包含以下或由以下組成：具有SEQ ID NO：121給出的序列之第一多肽；及具有SEQ ID NO：129給出的序列之第二多肽。
本發明亦提供一種三特異性抗體分子，其包含對人類TNF-α具特異性之結合域、對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及對人類血清白蛋白具特異性之結合域，且包含以下或由以下組成：具有SEQ ID NO：123給出的序列之第一多肽；及具有SEQ ID NO：129給出的序列之第二多肽。
本發明亦提供一種三特異性抗體分子，其包含對人類TNF-α具特異性之結合域、對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及對人類血清白蛋白具特異性之結合域，其包含由SEQ ID NO：126給出的多核苷酸序列編碼之第一多肽及由SEQ ID NO：132給出的多核苷酸序列編碼之第二多肽或由該等多肽組成。
本發明亦提供一種三特異性抗體分子，其包含對人類TNF-α具特異 性之結合域、對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及對人類血清白蛋白具特異性之結合域，其包含由SEQ ID NO：144給出的多核苷酸序列編碼之第一多肽及由SEQ ID NO：146給出的多核苷酸序列編碼之第二多肽或由該等多肽組成。
本發明亦提供一種三特異性抗體分子，其包含對人類TNF-α具特異性之結合域、對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及對人類血清白蛋白具特異性之結合域，其包含由SEQ ID NO：143給出的多核苷酸序列編碼之第一多肽及由SEQ ID NO：145給出的多核苷酸序列編碼之第二多肽或由該等多肽組成。
在一個實施例中，根據本發明的三特異性抗體分子包含以下或由以下組成：由選自SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：145之多核苷酸序列編碼的第一多肽及由選自SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：144或SEQ ID NO：143之多核苷酸序列編碼的第二多肽。如上文所定義之三特異性抗體分子較佳能夠中和人類TNF-α、人類IL-17A及人類IL-17F的生物活性。
本發明亦提供與本文中所揭示的序列具有80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似的序列。
如本文中所使用，「同一性」指示經比對之序列中的任何特定位置之胺基酸殘基在該等序列間係相同。
如本文中所使用，「相似性」指示在經比對之序列中的任何特定位置之胺基酸殘基在該等序列間係具有相似類型。例如，白胺酸可由異白胺酸或纈胺酸取代。可常彼此取代之其他胺基酸包括(但不限於)：- 苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸(具有芳族側鏈之胺基酸)； - 離胺酸、精胺酸及組胺酸(具有鹼性側鏈之胺基酸)；- 天冬胺酸及麩胺酸(具有酸性側鏈之胺基酸)；- 天冬醯胺酸及麩醯胺酸(具有醯胺側鏈之胺基酸)；及- 半胱胺酸及甲硫胺酸(具有含硫側鏈之胺基酸)。
可輕易地計算得同一性及相似性的程度(Computational Molecular Biology，Lesk,A.M.編，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects，Smith,D.W.編，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，第1章，Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje,G.，Academic Press，1987，Sequence Analysis Primer，Gribskov,M.及Devereux,J.編，M Stockton Press，New York，1991，BLASTTM軟體從NCBI獲得(Altschul,S.F.等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.& States,D.J.1993,Nature Genet.3：266-272.Madden,T.L.等人，1996，Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.& Madden,T.L.1997，Genome Res.7：649-656)。
用於本發明的多重特異性構築體之抗體可由相關技術中已知的任何適宜方法生產。
針對抗原多肽所生產之抗體可(在動物需要免疫接種的情況下)藉由使用熟知且常規的方案(參見例如Handbook of Experimental Immunology，D.M.Weir(編)，第4卷，Blackwell Scientific Publishers，Oxford，England，1986)對動物(較佳為非人類動物)投與該等多肽而獲得。可免疫 接種許多溫血動物諸如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、駱駝或豬。然而，小鼠、兔、豬及大鼠一般最適合。
單株抗體可藉由相關技術中已知的任何方法，諸如融合瘤技術(Kohler & Milstein，1975，Nature，256：495-497)、三元融合瘤(trioma)技術、人類B-細胞融合瘤技術(Kozbor等人1983，Immunology Today，4：72)及EBV-融合瘤技術(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，第77-96頁，Alan R Liss,Inc.，1985)來製備。
抗體亦可使用單淋巴細胞抗體方法藉由選殖並表現從單淋巴細胞產生的免疫球蛋白可變區cDNA來產生，免疫球蛋白可變區cDNA係藉由例如Babcook,J.等人1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15)：7843-78481；WO92/02551；WO2004/051268及WO2004/106377所述的方法，自經篩選以用於產生特異性抗體之單一淋巴細胞得到。
用於本發明中之抗體亦可使用相關技術中已知的各種噬菌體顯示方法來產生且包括彼等由以下各案所揭示者：Brinkman等人(J.Immunol.Methods，1995，182：41-50)、Ames等人(J.Immunol.Methods，1995，184：177-186)、Kettleborough等人(Eur.J.Immunol.1994，24：952-958)、Persic等人(Gene，1997 187 9-18)、Burton等人(Advances in Immunology，1994，57：191-280)及WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；及US 5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743；5,969,108及WO20011/30305。
在一個實施例中，根據本發明之多重特異性分子為人類化的。
如本文中所使用，人類化(其包括CDR-移植抗體)係指具有來自非人類物種的一或多個互補決定區(CDR)及來自人類免疫球蛋白分子的框架區之分子(參見，例如US 5,585,089；WO91/09967)。應明瞭，可僅需要轉移CDR的決定特異性之殘基替代整個CDR(參見例如Kashmiri等人，2005，Methods，36，25-34)。人類化抗體可視情況另外包含一或多個衍生自衍生CDR之非人類物種之框架殘基。
如本文中所使用，術語「人類化抗體分子」係指其中重鏈及/或輕鏈包含來自供體抗體(例如鼠單株抗體)的移植至受體抗體(例如人類抗體)的重鏈及/或輕鏈可變區框架中之一或多個CDR(若需要則包含一或多個經修飾之CDR)的抗體分子。回顧可參見Vaughan等人，Nature Biotechnology，16，535-539，1998。在一個實施例中，替代轉移整個CDR，僅將來自上文中所述CDR中之任何一者的特異性決定殘基中之一或多者轉移至人類抗體框架(參見例如Kashmiri等人，2005，Methods，36，25-34)。在一個實施例中，僅將來自上文中所述CDR中之一或多者的特異性決定殘基轉移至人類抗體框架。在另一個實施例中，僅將來自上文中所述CDR中之各者的特異性決定殘基轉移至人類抗體框架。
當CDR或特異性決定殘基係經移植時，考慮到衍生得到CDR之供體抗體的類別/類型，包括小鼠、靈長類動物及人類框架區，可使用任何適合的受體可變區框架序列。適當地，根據本發明之人類化抗體具有包含人類受體框架區之可變域以及其中所提供的CDR中之一或多者。
可用於本發明中之人類框架的實例為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及POM(Kabat等人，同上)。例如，KOL及NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈及EU、LAY及POM可用於重鏈及輕鏈二者。或 者，可使用人類生殖系序列；此等可在：http：//www.imgt.org/或http：//www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php下得到。
在本發明之人類化抗體分子中，受體重鏈及輕鏈不一定衍生自相同抗體且可(若需要)包含具有衍生自不同鏈之框架區的複合鏈。
該等框架區不一定恰好具有與受體抗體的序列完全相同的序列。例如，非尋常殘基可經改變成該受體鏈類別或類型的更頻繁生成之殘基。或者，受體框架區中的所選殘基可經改變使得彼等對應於在供體抗體中的相同位置所發現的殘基(參見Reichmann等人1998，Nature，332，323-324)。該等變化應保持至恢復供體抗體之親和力所必需的最低程度。用於選擇可能需要改變之受體框架區中的殘基之方案陳述於WO91/09967中。
框架之衍生物可具有1個、2個、3個或4個經替代性胺基酸(例如經供體殘基)置換之胺基酸。
供體殘基為來自供體抗體(即，最初衍生CDR的抗體)之殘基。供體殘基可經衍生自人類受體框架之適合的殘基(受體殘基)置換。
在一個實施例中，本發明之多重特異性抗體為全人類的，特定言之，可變域中之一或多者為全人類的。
全人類分子為其中重鏈及輕鏈二者之可變區及恆定區(若存在)全源自人類，或與源自人類的序列(不一定源自相同抗體)實質上相同之分子。全人類抗體的實例可包括例如藉由上述噬菌體顯示方法產生的抗體及由其中鼠免疫球蛋白可變區及視情況恆定區基因已經彼等人類對應物(例如如EP0546073、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425、US5,661,016、US5,770,429、EP 0438474及EP0463151中概述)置換的小鼠所產生的抗體。
在一個實施例中，本發明之多重特異性抗體分子係經處理以提供經改良之針對靶抗原之親和力。該等變體可藉由多種親和力成熟方案包括使CDR突變(Yang等人J.Mol.Biol.，254，392-403，1995)、鏈混組(chain shuffling)(Marks等人，Bio/Technology，10，779-783，1992)、使用大腸桿菌的突變株(Low等人，J.Mol.Biol.，250，359-368，1996)、DNA混組(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.，8，724-733，1997)、噬菌體顯示(Thompson等人，J.Mol.Biol.，256，77-88，1996)及有性PCR(Crameri等人Nature，391，288-291，1998)來獲得。Vaughan等人(同上)論述此等親和力成熟方法。
如此處在該情況中所使用的經改良之親和力係指優於起始分子的改良。
若需要，用於本發明中之多重特異性抗體構築體可共軛至一或多個效應分子。應明瞭，該效應分子可包含單一效應分子或經如此連接以便形成可連接至本發明之抗體的單一部分之兩個或更多個該等分子。在希望獲得連接至效應分子之抗體片段的情況下，此可藉由其中抗體片段直接或經由偶聯劑連接至效應分子的標準化學或重組DNA程序來製備。相關技術中熟知用於將該等效應分子共軛至抗體之技術(參見，Hellstrom等人Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人編，1987，第623-53頁；Thorpe等人1982，Immunol.Rev.，62：119-58及Dubowchik等人1999，Pharmacology and Therapeutics，83，67-123)。特定的化學程序包括(例如)彼等述於WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476及WO03031581中的程序。或者，在效應分子為蛋白質或多肽的情況下，可使用重組DNA程序，例如如WO86/01533及EP0392745中 所述，來達成連接。
如本文中所使用，術語「效應分子」包括(例如)生物活性蛋白質(例如酵素、其他抗體或抗體片段)、合成或天然生成之聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素(特別為放射性碘、放射性同位素)、螯合金屬、奈米粒子及報導子基團(諸如螢光化合物或可藉由NMR或ESR光譜偵測到的化合物)。
其他效應分子可包括經螯合之放射性核素，諸如111In及90Y、Lu177、鉍213、鉲252、銥192及鎢188/錸188；或藥物，諸如(但不限於)烷基磷酸膽鹼、拓撲異構酶I抑制劑、類紫杉醇(taxoid)及蘇拉明(suramin)。
其他效應分子包括蛋白質、肽及酵素。所關注的酵素包括(但不限於)蛋白質分解酵素、水解酶、裂解酶、異構酶、轉移酶。所關注的蛋白質、多肽及肽包括(但不限於)免疫球蛋白、毒素(諸如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素)、蛋白質(諸如胰島素、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生之生長因子或組織胞漿素原活化物)、血栓形成劑或抗血管生成劑(例如血管抑素或內皮抑素)或生物反應調節劑(諸如淋巴細胞活素、介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)、神經生長因子(NGF)或其他生長因子)及免疫球蛋白。
其他效應分子可包括可用於例如診斷中之可偵測物質。可偵測物質的實例包括各種酵素、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料、放射性核種、正電子發射金屬(用於正電子發射斷層攝影術)及非放射性順磁性金屬離子。可共軛至用作診斷的抗體之金屬離子一般參見US4,741,900。 穩定酵素包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合的輔基包括鏈黴親和素、抗生物素蛋白(avidin)及生物素；適合的螢光材料包括傘形酮(umbelliferone)、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪胺螢光素、丹磺醯氯及藻紅素；適合的發光材料包括魯米諾(luminol)；適合的生物發光材料包括螢光素酶、蟲螢光素(luciferin)及水母素(aequorin)；及適合的放射性核種包括125I、131I、111In及99Tc。
在另一個實施例中，效應分子可增加抗體於活體內的半衰期，且/或降低抗體的免疫原性且/或增進抗體跨上皮障壁遞送至免疫系統。此種類型之適合效應分子的實例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結合蛋白或白蛋白結合化合物，諸如彼等述於WO05/117984中者。
在效應分子為聚合物的情況下，其一般可為合成或天然生成之聚合物，例如視情況經取代之直鏈或分支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧伸烷基聚合物或分支鏈或非分支鏈多醣，例如同質-或異質-多醣。
可存在於上述合成聚合物上之具體可選取代基包括一或多個羥基、甲基或甲氧基。
合成聚合物的具體實例包括視情況經取代之直鏈或分支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其為視情況經取代之聚(乙二醇)，諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
具體的天然生成之聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
如本文中所使用，「衍生物」欲包括反應性衍生物，例如硫醇-選擇性反應性基團，諸如馬來醯亞胺及類似者。反應性基團可直接或經由連接 段與聚合物連接。應明瞭，該基團的殘基在一些情況中將呈介於抗體片段與聚合物之間之連接基團之形式形成產物的一部分。
聚合物的大小可視需要改變，但一般將在從500Da至50000Da，例如從5000至40000Da，諸如從20000至40000Da之平均分子量範圍內。聚合物大小可特定言之基於產物的所欲用途，例如定位至特定組織諸如腫瘤或延長循環半衰期之能力來選擇(回顧可參見Chapman，2002，Advanced Drug Delivery Reviews，54，531-545)。因此，例如，在產物欲離開循環並穿透組織(例如)以用於治療腫瘤的情況下，可有利地使用小分子量聚合物(例如具有約5000Da分子量)。對於產物留在循環中的應用，可有利地使用較高分子量之聚合物(例如具有在從20000Da至40000Da範圍之分子量)。
適合的聚合物包括聚伸烷基聚合物，諸如聚(乙二醇)，或尤其為甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其具有在從約15000Da至約40000Da範圍內之分子量。
在一個實施例中，用於本發明中之抗體係連接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一個特定實例中，該抗體為抗體片段且該PEG分子可經由位於該抗體片段中的任何可用胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基，例如任何游離胺基、亞胺基、硫醇基、羥基或羧基連接。該等胺基酸可天然地生成於抗體片段中或可使用重組DNA方法(參見例如US5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971、WO2008/038024)而改造至片段中。在一個實施例中，本發明之抗體分子為經修飾之Fab片段，其中該修飾係在其重鏈的C-末端新增一或多個胺基酸以允許連接效應分子。適宜地，該等額外的胺基酸形成含有一或多個可連接效應分子的半胱胺酸殘基的經修飾之鉸鏈區。可使用 多個位點以連接兩個或更多個PEG分子。
適宜地，PEG分子係經由位於抗體片段中的至少一個半胱胺酸殘基之硫醇基共價連接。連接至經修飾之抗體片段的各聚合物分子可共價連接至位於片段中的半胱胺酸殘基之硫原子。共價連接將一般為雙硫鍵，或特定言之為硫-碳鍵。在使用硫醇基作為經適當活化之效應分子的連接點的情況下，可使用例如硫醇選擇性衍生物，諸如馬來醯亞胺及半胱胺酸衍生物。可使用經活化之聚合物作為製備如上所述的經聚合物修飾之抗體片段中的起始物質。經活化之聚合物可為含有硫醇反應性基團之任何聚合物，諸如α-鹵代羧酸或酯，例如碘乙醯胺、醯亞胺，例如馬來醯亞胺、乙烯碸或二硫化物。該等起始物質可從市面購得(例如購自Nektar，原名Shearwater Polymers Inc.，Huntsville，AL，USA)或可由市售起始物質使用習知化學程序來製得。特定的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可獲自Nektar，原名為Shearwater；Rapp Polymere；及SunBio)及M-PEG-SPA(可獲自Nektar，原名為Shearwater)。
在一個實施例中，分子中的F(ab')2、Fab或Fab'係經聚乙二醇化，即，其具有與其共價連接之PEG(聚(乙二醇))，例如依揭示於EP 0948544或EP1090037中之方法[亦可參見「Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and Biomedical Applications」，1992，J.Milton Harris(編)，Plenum Press，New York，「Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications」，1997，J.Milton Harris及S.Zalipsky(編)，American Chemical Society，Washington DC及「Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences」，1998，M.Aslam及A.Dent，Grove Publishers，New York；Chapman,A.2002，Advanced Drug Delivery Reviews 2002，54：531-545]。在一個實施例中，PEG係連接至鉸鏈區中的半胱胺酸。在一個實例中，經PEG修飾之Fab片段具有共價連接至經修飾之鉸鏈區中的單一硫醇基之馬來醯亞胺基。離胺酸殘基可共價連接至馬來醯亞胺基且該離胺酸殘基上的胺基中之各者可連接具有約20,000Da的分子量之甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，連接至Fab片段之PEG的總分子量可為約40,000Da。
特定的PEG分子包括經N,N'-雙(甲氧基聚(乙二醇)MW 20,000)修飾之離胺酸的2-[3-(N-馬來醯亞胺基)丙醯胺基]乙基醯胺，亦稱為PEG2MAL40K(可獲自Nektar，原名為Shearwater)。
PEG連接子之替代性來源包括NOF，NOF供應GL2-400MA2(其中下方結構中的m為5)及GL2-400MA(其中m為2)及n為約450： m為2或5。
也就是說，各PEG為約20,000Da。
以下類型的其他替代性PEG效應分子：
可從Dr Reddy、NOF及Jenkem獲得。
在一個實施例中，提供一種抗體分子，其係經聚乙二醇化(例如具有本文所述之PEG)，經由位於鏈中的胺基酸226(例如重鏈的胺基酸226(藉由連續編號))或附近之半胱胺酸胺基酸殘基連接。
在一個實施例中，提供一種編碼本發明分子之多核苷酸序列，諸如DNA序列。
在一個實施例中，提供一種多核苷酸序列，其編碼本發明分子之一或多種，諸如兩種或更多種，或三種或更多種多肽成分，例如：a)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；及b)式(II)之多肽鏈：V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1表示重鏈可變域；CH1表示重鏈恆定區的域，例如其域1；X表示鍵或連接子；Y表示鍵或連接子；V1表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv；VL1表示輕鏈可變域；CL表示來自輕鏈恆定區的域，諸如Cκ；V2表示dsFv、sdAb、scFV或dsscFv。
在一個實施例中，該多核苷酸諸如DNA包含於載體中。
熟練技術者當明瞭，當V1及/或V2表示dsFv時，該多重特異性抗體將包含編碼對應之未連接至X或Y的游離VH或VL域之第三多肽。因此，本發 明之多重特異性蛋白質可由一或多個，兩個或更多個或三個或更多個多核苷酸編碼且此等多核苷酸可併入一或多種載體中。
熟習此項技術者熟知可構建載體的一般方法、轉染方法及培養方法。在該態樣中，參考「Current Protocols in Molecular Biology」，1999，F.M.Ausubel(編)，Wiley Interscience，New York及Maniatis Manual，由Cold Spring Harbor Publishing生產。
亦提供一種宿主細胞，其包含一或多種選殖或表現載體，該等載體包含一或多個編碼本發明之多重特異性蛋白質之DNA序列。任何適合的宿主細胞/載體系統可用於表現編碼本發明抗體分子之DNA序列。可使用細菌(例如大腸桿菌)及其他微生物系統或亦可使用真核生物(例如哺乳動物)、宿主細胞表現系統。適合的哺乳動物宿主細胞包括CHO、骨髓瘤、NSO骨髓瘤細胞及SP2細胞、COS細胞或融合瘤細胞。
本發明亦提供一種用於製備根據本發明之多重特異性蛋白質的方法，其包括在適合用於引起蛋白質自編碼本發明多重特異性蛋白質之DNA表現的條件下培養含有本發明載體之宿主細胞，及分離該多重特異性蛋白質。
為產生包含重鏈及輕鏈二者的產物，細胞系可以兩種載體(編碼輕鏈多肽之第一載體及編碼重鏈多肽之第二載體)轉染。或者，可使用單一載體，該載體包含編碼輕鏈及重鏈多肽之序列。在一個實例中，細胞系可以兩種載體(每種載體皆編碼本發明抗體分子之多肽鏈)轉染。在V1及/或V2為dsFv的情況下，細胞系可以三種載體(每種載體皆編碼本發明多重特異性蛋白質之多肽鏈)轉染。
在一個實施例中，細胞系係以兩種載體轉染，每一種載體係編碼選 自以下之不同多肽：a)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；b)式(II)之多肽鏈：V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1表示重鏈可變域；CH1表示重鏈恆定區的域，例如其域1；X表示鍵或連接子；Y表示鍵或連接子；V1表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv；VL1表示輕鏈可變域；CL表示來自輕鏈恆定區的域，諸如Cκ；V2表示dsFv、sdAb、scFV或dsscFv。
在一個實施例中，當V1為dsFv及V1的VH域係與X連接時，細胞系可以編碼V1的VL域之第三載體轉染。
在一個實施例中，當V1為dsFv及V1的VL域係與X連接時，細胞系可以編碼V1的VH域之第三載體轉染。
在一個實施例中，當V2為dsFV及V2的VH域係與Y連接時，細胞系可以編碼V2的VL域之第三載體轉染。
在一個實施例中，當V2為dsFv及V2的VL域係與Y連接時，細胞系可以編碼V2的VH域之第三載體轉染。
在一個實施例中，當V1及V2二者皆為dsFv且V2的VL域係與Y連接及 V1的VL域係與X連接時，細胞系可以編碼V1及V2二者的共同VH域之第三載體轉染。
在一個實施例中，當V1及V2二者皆為dsFv且V2的VH域與Y連接及V1的VH域與X連接時，細胞系可以編碼V1及V2二者的共同VL域之第三載體轉染。
應明瞭，轉染至宿主細胞中的各載體之比率可經改變以使多重特異性抗體產物的表現最佳化。在一個使用兩種載體的實施例中，載體之比率可為1：1。在一個使用三種載體的實施例中，載體之比率可為1：1：1。應明瞭，熟練技術者能夠藉由常規測試轉染後的蛋白質表現水平而找到最佳比率。或者或另外，來自各載體之多重特異性構築體的各多肽鏈之表現水平可藉由使用相同或不同啟動子來控制。
應明瞭多肽成分中之兩者或更多者或在存在的情況下三者可由單一載體中的多核苷酸編碼。亦應明瞭在多肽成分中之兩者或更多者，特別為三者或更多者由單一載體中的多核苷酸的情況下，各編碼本發明之多肽成分的多核苷酸可藉由利用不同啟動子改變各多肽成分的相對表現。
在一個實施例中，載體包含在單一啟動子的控制下編碼本發明之多重特異性抗體分子之兩個或在存在的情況下三個多肽鏈之單一多核苷酸序列。
在一個實施例中，載體包含編碼本發明之多重特異性抗體分子之兩個或在存在的情況下三個多肽鏈之單一多核苷酸序列，其中編碼各多肽鏈之各多核苷酸序列係在不同啟動子的控制下。
根據本發明之多重特異性蛋白質係以良好水平自宿主細胞表現。因此，抗體及/或片段之性質似乎係最佳化且有利於商業處理。
有利地，本發明之多重特異性抗體分子將純化之後所看到聚集的量最小化及將醫藥濃度之構築體調配物中單體的量最大化，例如該單體可呈總蛋白質之50%、60%、70%或75%或更大，諸如80或90%或更大，諸如91、92、93、94、95、96、97、98或99%或更大存在。在一個實例中，本發明多重特異性抗體分子之純化樣品在4℃下儲存28天之後保留大於98%或99%之單體性。在一個實例中，本發明多重特異性抗體分子以5mg/ml含在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之純化樣品在4℃下儲存28天之後保留大於98%之單體性。
本發明之抗體分子及包含其之組合物可用於治療，例如用於治療及/或預防病理性病症。
本發明亦提供一種醫藥或診斷組合物，其包含本發明的抗體分子與醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑中之一或多者之組合。相應地，提供本發明抗體用於治療及用於製造藥物(特別為針對本文所揭示之適應症)之用途。
該組合物將通常呈將通常包含醫藥上可接受之載劑的無菌醫藥組合物之一部分之形式供應。本發明之醫藥組合物可另外包含醫藥上可接受之助劑。
本發明亦提供一種用於製備醫藥或診斷組合物的方法，其包括添加本發明抗體分子且將其與醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑中之一或多者混合在一起。
該抗體分子可為醫藥或診斷組合物中的單一活性組分或可伴隨其他活性組分，包括其他抗體組分，例如抗-IL-1β、抗-T細胞、抗-IFNγ或抗-LPS抗體、或非抗體組分(諸如黃嘌呤)。其他適合的活性組分包括能夠誘 導耐受性的抗體，例如，抗-CD3或抗-CD4抗體。
在另一實施例中，根據本發明之抗體、片段或組合物係與另一醫藥活性劑組合使用。
醫藥組合物適宜地包含治療有效量之本發明抗體分子。如本文中所使用，術語「治療有效量」係指治療、改善或預防目標疾病或病症，或顯示可偵測治療或預防效應所需要的治療劑的量。對於任何抗體而言，治療有效量可在細胞培養試驗或在動物模型中(通常在齧齒動物、兔、狗、豬或靈長類動物中)初步估算。動物模型亦可用於確定適當的濃度範圍及投藥途徑。該資訊可接著用於確定在人類中的有用的劑量及投藥途徑。
用於人類個體之準確的治療有效量將取決於疾病狀態的嚴重度、個體的一般健康、個體的年齡、體重及性別、飲食、投藥時間及頻率、藥物組合、反應敏感性及對療法的耐受/反應。該量可藉由常規實驗確定且在臨床醫師之判斷範圍內。一般而言，治療有效量將為從0.01mg/kg至50mg/kg，例如0.1mg/kg至20mg/kg。或者，該劑量可為1至500mg/天，諸如10至100、200、300或400mg/天。醫藥組合物可方便地呈包含預定量之本發明活性劑的單位劑型之形式存在。
組合物可個別地投與患者或可組合其他試劑、藥物或激素(例如同時、連續或分開)投與。
本發明抗體分子投與的劑量取決於待治療病症的性質、所存在的發炎的程度及抗體分子是否以預防方式使用或用於治療現有病症。
給藥頻率將取決於抗體分子的半衰期及其藥效的持續時間。若抗體分子具有短半衰期(例如2至10小時)，則可能需要每天提供一或多次劑量。或者，若抗體分子具有長半衰期(例如2至15天)，則可能僅需要每天 一次、每週一次或甚至每1或2個月一次提供劑量。
醫藥上可接受之載劑本身不應誘導產生對接受組合物的個體有害之抗體且不應具毒性。適合的載劑可為大、緩慢代謝之大分子，諸如蛋白質、多肽、脂質體、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物及非活性病毒顆粒。
可使用醫藥上可接受之鹽，例如無機酸鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽及硫酸鹽，或有機酸之鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽。
治療性組合物中的醫藥上可接受之載劑可另外包含液體，諸如水、鹽水、甘油及乙醇。此外，輔助物質諸如潤濕劑或乳化劑或pH緩衝物質可存於該等組合物中。該等載劑能夠使醫藥組合物調配成適合患者攝入的錠劑、丸劑、糖錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液及懸浮液。
適合的投藥形式包括適合用於非經腸投與之形式，例如，藉由注射或輸注，例如藉由一次全劑量注射或連續輸注。在產品係用於注射或輸注的情況下，其可採用在油性或水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液之形式且其可包含調配劑，諸如懸浮劑、防腐劑、穩定劑及/或分散劑。或者，抗體分子可呈乾燥形式，以用於在與適合的無菌液體一起使用之前復水。
當完成調配時，本發明之組合物即可直接投與個體。待治療的個體可為動物。然而，在一或多個實施例中，該等組合物適合投與人類個體。
在一個實施例中，於根據本發明之調配物中，最終調配物的pH與抗體或片段的等電點值不相似，例如若調配物的pH為7，則8-9或更高之pI可能適合。當不希望受理論約束時，認為此最終可提供具有改良穩定性之最終調配物，例如該抗體或片段保留在溶液中。
本發明之醫藥組合物可藉由很多途徑投與，包括(但不限於)口服、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、室內、經皮(transdermal)、經皮(transcutaneous)(例如參見WO98/20734)、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。亦可使用無針注射器(Hypospray)來投與本發明之醫藥組合物。通常，治療性組合物可製備成呈液體溶液或懸浮液之注射液。亦可製備適合用於注射之前在液體媒劑中形成溶液或懸浮液之固體形式。較佳地，本發明之抗體分子係經皮下投與、經吸入投與或經局部投與。
該等組合物之直接遞送將一般藉由注射(皮下、腹膜內、靜脈內或肌肉內、或遞送至組織間隙空間)來達成。該等組合物亦可投與至所關注的特定組織中。劑量治療可為單劑量方案或多劑量方案。
應明瞭組合物中的活性組分將為抗體分子。因此，其將容易在胃腸道中降解。因此，若組合物欲藉由使用胃腸道的途徑投與，則該組合物將需要包含保護抗體以防降解但在已被胃腸道吸收時釋放抗體之藥劑。
醫藥上可接受之載劑的深入討論可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，N.J.1991)中獲得。
在一個實施例中，調配物係呈局部投與(包括吸入)之調配物提供。
適合的可吸入製劑包括可吸入粉末、含有推進氣體之計量氣霧劑或不含推進氣體之可吸入溶液(諸如可噴霧溶液或懸浮液)。根據本發明含有活性物質之可吸入粉末可僅由上述活性物質組成或由上述活性物質與生理上可接受之賦形劑之混合物組成。
此等可吸入粉末可包括單醣(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二醣(例如乳糖、蔗糖、麥芽糖)、寡醣及多醣(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨糖醇、 甘露醇、木糖醇)、鹽(例如氯化鈉、碳酸鈣)或此等物質彼此的混合物。適宜地，使用單醣或二醣，使用乳糖或葡萄糖，特別但非排他地，以彼等水合物之形式。
用於沉積在肺中的顆粒需要粒度小於10微米，諸如1-9微米，例如從0.1至5μm，特別為從1至5μm。活性劑(諸如抗體或抗體片段)的粒度係首要的。
相關技術中已知可用於製備可吸入氣霧劑的推進氣體。適合的推進氣體係選自烴(諸如正丙烷、正丁烷或異丁烷)及鹵代烴(諸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、環丙烷或環丁烷之氯化及/或氟化衍生物)。上述推進氣體可單獨地或以其混合物形式使用。
特別適合的推進氣體為選自TG 11、TG 12、TG 134a及TG227之鹵化烷烴衍生物。上述鹵化烴中TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)及TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物特別適合。
含推進氣體之可吸入氣霧劑亦可包含其他組分，諸如共溶劑、穩定劑、表面活性劑、抗氧化劑、潤滑劑及用於調節pH之手段。技術中已知所有此等組分。
根據本發明的含推進氣體之可吸入氣霧劑可包含多達5重量%之活性物質。根據本發明的氣霧劑包含例如0.002至5重量%、0.01至3重量%、0.015至2重量%、0.1至2重量%、0.5至2重量%或0.5至1重量%之活性劑。
或者，肺部的局部投與亦可藉由投與液體溶液或懸浮液調配物，例如使用裝置，諸如噴霧器，例如連接至壓縮器之噴霧器(例如，連接至Pari Master(R)壓縮器之Pari LC-Jet Plus(R)噴霧器，由Pari Respiratory Equipment,Inc.，Richmond，Va.製造)。
在一個實施例中，該調配物係呈包含用於藉由噴霧傳遞的單位劑量之離散安瓿提供。
在一個實施例中，該抗體係呈凍乾形式(用於復水)或或者呈懸浮液調配物供應。
本發明之抗體可經遞送而分散於溶劑中，例如，呈溶液或懸浮液之形式。其可懸浮在適當的生理溶液，例如，生理鹽水、醫藥上可接受之溶劑或緩衝溶液中。技術中已知的緩衝溶液每1ml水可包含0.05mg至0.15mg己二胺四乙酸二鈉、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg無水檸檬酸及0.45mg至0.55mg檸檬酸鈉以便達成約4.0至5.0的pH。如上所述，可例如從冷凍抗體製得懸浮液。
治療性懸浮液或溶液調配物亦可包含一或多種賦形劑。賦形劑為相關技術所熟知且包括緩衝劑(例如，檸檬酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑及碳酸氫鹽緩衝劑)、胺基酸、脲、醇、抗壞血酸、磷脂、蛋白質(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化鈉、脂質體、甘露醇、山梨糖醇及甘油。溶液或懸浮液可囊封在脂質體或生物可降解微球體中。調配物將一般利用無菌製程呈實質上無菌形式利用無菌製程提供。
此可包括生產且過濾滅菌用於調配之緩衝溶劑溶液，將抗體無菌懸浮於無菌緩衝溶劑溶液中，及藉由一般技術者熟悉的方法將調配物分散至無菌容器中。
根據本發明之可噴霧調配物可例如呈包裝在箔套(foil envelope)中的單劑量單位(例如，密封塑料容器或小瓶)之形式提供。各小瓶包含某一單位體積劑量(例如，2ml)之溶劑/溶液緩衝液。
認為本發明之抗體適合經由噴霧遞送。
亦設想本發明之抗體可藉由使用基因療法來投與。為達成此點，將在控制適當DNA成分下編碼抗體分子之重鏈及輕鏈的DNA序列引入至患者中以使該等抗體鏈自DNA序列表現且在原位組裝。
本發明亦提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其係用於治療。
本發明亦提供一種如上文所定義之多重特異性抗體分子，其係用於控制發炎性疾病。較佳地，多重特異性抗體分子可用於減少發炎過程或防止發炎過程。
本發明亦提供本發明多重特異性抗體分子，其係用於治療或預防由TNF-α及IL-17A及/或IL-17F介導的病理性疾病或與TNF-α及IL-17A及/或IL-17F含量的增加有關的病理性疾病。較佳地，該病理性病症係選自由以下組成之群：感染(病毒性、細菌性、真菌性及寄生性)、與感染有關的內毒素性休克、關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、全身型幼年特發性關節炎(JIA)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、哮喘、慢性阻塞性呼吸道疾病(COAD)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、急性肺部損傷、骨盤發炎性疾病、阿茲海默氏症(Alzheimer's Disease)、克羅恩氏病(Crohn's disease)、發炎性腸病、大腸激燥症候群、潰瘍性結腸炎、卡索曼氏病(Castleman's disease)、僵直性脊椎炎及其他脊椎關節炎、皮肌炎、心肌炎、葡萄膜炎、突眼症(exophthalmos)、自體免疫甲狀腺炎、佩洛尼氏病(Peyronie's Disease)、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛疾病(Pilonidal disease)、腹膜炎、牛皮癬、異位性皮膚炎、血管炎、手術黏連(surgical adhesions)、中風、自體免疫糖尿病、I型糖尿病、萊姆關節炎(lyme arthritis)、腦膜腦炎、中樞及周邊神經系統之免疫介導炎症(諸如多發性 硬化症及格林-巴利症候群(Guillain-Barr syndrome))、其他自體免疫病症、胰腺炎、創傷(手術)、移植物抗宿主疾病、移植排斥、纖維性疾病(包括肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、硬皮病或全身性硬化症)、癌症(實體腫瘤(諸如黑色素瘤、肝母細胞瘤、肉瘤、鱗狀細胞癌、移行細胞癌、卵巢癌)及惡性血液病且特別為急性髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、胃癌及結腸癌)、心臟疾病(包括缺血性疾病，諸如心肌梗塞)以及動脈粥樣硬化、血管內凝血、骨吸收、骨質疏鬆症、牙周炎及胃酸缺乏症(hypochlorhydia)。
在一個實施例中，本發明之抗體係用於治療或預防選自由關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、全身型幼年特發性關節炎(JIA)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、哮喘、慢性阻塞性呼吸道疾病、慢性阻塞性肺部疾病、異位性皮膚炎、硬皮病、全身性硬化症、肺纖維化、發炎性腸病、僵直性脊椎炎及其他脊椎關節病及癌症組成之群的病理性病症。
在一個實施例中，本發明之抗體係用於治療或預防選自由關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、全身型幼年特發性關節炎(JIA)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、哮喘、慢性阻塞性呼吸道疾病、慢性阻塞性肺部疾病、異位性皮膚炎、硬皮病、全身性硬化症、肺纖維化、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、僵直性脊椎炎及其他脊椎關節病及癌症組成之群的病理性疾病。
在一個實施例中，本發明之抗體係用於治療或預防選自由關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、全身型幼年特發性關節炎(JIA)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、哮喘、慢性阻塞性呼吸道疾病、慢性阻塞性肺部疾病、異位性皮膚炎、硬皮病、全身性硬化症、肺纖維化、克羅恩 氏病、潰瘍性結腸炎、僵直性脊椎炎及其他脊椎關節病組成之群的病理性疾病。
在一個實施例中，本發明之抗體係用於治療或預防選自由關節炎、牛皮癬性關節炎、全身型幼年特發性關節炎(JIA)、克羅恩氏病、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、僵直性脊椎炎及其他脊椎關節病、牛皮癬、化膿性汗腺炎、貝西氏病(Behcet's disease)、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、哮喘、心肌炎、葡萄膜炎、異位性皮膚炎、血管炎、中樞及周邊神經系統之免疫介導炎症(諸如多發性硬化症及格林-巴利症候群)、其他自體免疫疾病、骨質疏鬆症、骨吸收、痛風、類肉瘤病、休格倫氏症候群(Sjogren syndrome)及壞疽性膿皮症組成之群的病理性病症。
在一個實施例中，該病理性病症為類風濕性關節炎。
在一個實施例中，該病理性病症為克羅恩氏病。
在一個實施例中，該病理性病症為潰瘍性結腸炎。
在一個實施例中，該病理性病症為葡萄膜炎。
在一個實例中，本發明之抗體係用於治療與發炎或免疫有關的疾病。在一個實例中，該與發炎或免疫有關的疾病係選自由類風濕性關節炎、克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎組成之群。
本發明亦提供根據本發明之抗體分子，其係用於治療或預防疼痛，特別為與發炎有關的疼痛。
本發明進一步提供根據本發明之抗體分子於製造用於治療或預防由TNF-α及IL-17A及/或IL-17F介導或與IL-17A及/或IL-17F含量的增加有關之病理性病症的藥物中之用途。較佳地，該病理性病症為上文所述醫學適應症中之一者。本發明另外提供根據本發明之抗體分子於製造用於治療或 預防疼痛(特別為與發炎有關的疼痛)的藥物中之用途。
本發明之抗體分子可用於其中希望減低TNF-α及IL-17A及/或IL-17F在人類或動物身體中之效應的任何療法中。TNF-α及IL-17A及/或IL-17F可循環於體內或可以非所欲之高含量存在於體內特定部位(例如發炎部位)。
根據本發明之抗體分子較佳用於控制發炎性疾病、自體免疫疾病或癌症。
本發明亦提供一種治療罹患由TNF-α及IL-17A及/或IL-17F介導的病症或處在該病症風險中之人類或動物個體的方法，該方法包括對個體投與有效量之本發明抗體分子。
根據本發明之抗體分子亦可用於診斷中，例如用於涉及TNF-α及IL-17A及/或IL-17F之疾病狀態的活體內診斷及成像中。
因此，提供根據本發明之多重特異性抗體，其係用於治療及利用該多重特異性抗體治療的方法中。
在一個實施例中，提供一種用於純化多重特異性抗體(特定言之根據本發明之抗體或片段)之方法。
在一個實施例中，提供一種用於純化多重特異性抗體(特定言之根據本發明之抗體或片段)之方法，其包括以下步驟：以非結合模式進行陰離子交換層析使得雜質保留於管柱上及抗體維持於未結合的溶離份中。該步驟可例如在pH約6-8下進行。
該方法可另外包括利用陽離子交換層析的初始捕捉步驟，例如在約4至5的pH下進行。
該方法可另外包括確保產物及方法相關雜質適當地從產物流離析的 額外層析步驟。
純化製程亦可包括一或多個超過濾步驟，諸如濃縮及透濾步驟。
如上述所使用的純化形式欲指至少90%純度，諸如91、92、93、94、95、96、97、98、99% w/w或更大純度。
實質上不含內毒素一般欲指每mg抗體產物具有1EU或更少(諸如每mg產物具有0.5或0.1EU)之內毒素含量。
實質上不含宿主細胞蛋白質或DNA一般欲指每mg抗體產物具有400μg或更少(視情況，諸如每mg具有100μg或更少，特定言之每mg具有20μg)之宿主細胞蛋白質及/或DNA含量。
本發明之抗體亦可用於診斷中，例如用於活體內診斷及疾病狀態的成像中。
在一個實施例中，提供一種篩選根據本發明之多重特異性蛋白質構築體之方法，其包括： a)當所給出的可變區對之V1或V2中任一者為dsscFv時，確定單體多重特異性蛋白質的產率 b)當已在(a)中測試過的相同可變區對之V1或V2中任一者為dsFv時，確定單體多重特異性蛋白質的產率及 c)將在(a)及(b)中得到的單體的產率進行比較並選擇具有最高單體產率之多重特異性蛋白質。
通常，該方法的步驟(a)及(b)中之「可變區對」為VH及VL對。一般而言，VH及VL共同形成抗原結合域(V1或V2)。該方法因此允許測試VH及VL對，因為本發明之構築體及最具單體性之構築體中之dsscFv及dsFv二者皆在步驟(c)中進行選擇。
通常，在該方法之步驟(a)及(b)中，產率係於純化後諸如於親和力層析後確定。單體產率可使用任何適合的方法諸如尺寸排除層析來確定。
在本說明書內文中，「包含」欲指包括。在技術上適合的情況下，可將本發明之實施例組合。實施例在本文中描述作包含特定特徵/元件。 本發明亦延伸至由或基本上由該等特徵/元件組成之個別實施例。
技術性參考文獻(諸如專利及申請案)係以引用的方式併入本文中。
本文中具體且明確列出的任何實施例可單獨地或以與一或多個其他實施例組合形式形成免責聲明的基礎。
本發明另外以僅以例示方式述於以下實例中，參考附圖，其中：
實例
實例1：中和抗人類TNF-α之可變區的分離：
進行以下免疫接種以便產生用於B細胞培養及抗體篩選的物質：
5隻斯潑累格多雷(Sprague Dawley)大鼠以3次注射與小分子苯并咪唑化合物(化合物1(如WO2013/186229及PCT/EP2015/074527中所述))預複合的人類TNF-α來免疫。產生血清且在ELISA中測試與人類TNF-α的結合。效價可在超過100,000倍稀釋下檢測到及因此被視為係B細胞培養所可接受的。
B細胞培養物係採用類似於Zubler等人(1985)及Lightwood等人(2013)所述的方法之方法來製備。簡言之，在37℃及5% CO2的氛圍中，含B細胞之脾細胞以約5000個細胞/孔的密度在具有補充10% FCS(PAA laboratories 1td)、2% HEPES(Sigma Aldrich)、1% L-麩醯胺酸(Gibco BRL)、1%青黴素/鏈黴素溶液(Gibco BRL)、0.1% β-巰基乙醇(Gibco BRL)、2-5%經活化之脾細胞培養上清液及經γ照射之鼠胸腺瘤細胞(5 x 104/孔)之200μl/孔RPMI 1640培養基(Gibco BRL)的條碼化96-孔組織培養板中培養七天。在此工程期間篩選出超過7000萬的B細胞。
使用基於均相螢光之結合檢測，使用塗覆生物素化人類TNF的10微米superavidin聚合珠粒(Bangs laboratories)作為靶抗原來源，來確定B細胞培養上清液中人類TNF-特異性抗體的存在。使用Matrix Platemate液體處理器將10ul上清液從條碼化96-孔組織培養板轉移至含有5000個經塗覆珠粒的條碼化384-孔黑壁分析板中。結合係以山羊抗大鼠或小鼠IgG Fcγ-特異性Cy-5共軛物(Jackson)顯示。在Applied Biosystems 8200細胞偵測細胞上讀取板。
或者，使用ELISA分析以識別陽性孔。將384-孔ELISA分析板塗覆2ug/ml TNF，接著添加10ul B細胞培養上清液至阻斷板。在培養1小時後，洗滌該等板且以山羊抗-大鼠Fc-特異性HRP共軛物(Jackson)顯示結合。
在初步篩選之後，使用Aviso Onyx命中-拾取機器人將陽性上清液固結至96-孔條碼化樣板上及使細胞培養板中的B細胞於-80℃下冷凍。然後在Biacore試驗中篩選樣板以便識別含有高親和力抗體的孔。
為識別能夠中和TNFα之生物活性的抗體，吾人使用樣板中的B細胞培養上清液，進行基於細胞之TNFα報導子分析。該分析利用HEK-293-CD40-BLUE細胞(Invivogen)，其等係經改造以回應許多經由包含人類TNFα的NFB路徑操作的刺激而分泌鹼性磷酸酶。含有抗體的上清液以1：2.5的單次稀釋直接用於該分析中。篩選出含有高親和力阻斷抗體的孔(在Biacore中低於100pM及在報導子分析中顯示>90%抑制)以用於進一步的發展。
為允許從所選的受關注的孔回收抗體可變區基因，必須進行反迴旋步驟以能夠鑑定所給的含有異質B細胞群體之孔中的抗原特異性B細胞。此係使用螢光焦點法來達成。簡言之，將來自陽性孔的分泌免疫球蛋白之B細胞與塗覆生物素化人類TNF的鏈黴親和素珠粒(New England Biolabs)及1：1200最終稀釋度的山羊抗-大鼠Fcγ片段-特異性FITC共軛物(Jackson)混合。在37℃下靜態培養1小時後，可根據螢光鹵素存於該B細胞周圍來鑑定抗原特異性B細胞。此等個別B細胞然後用Eppendorf顯微操縱器挑出使用Olympus顯微鏡鑑定且沉積至PCR管中。
藉由逆轉錄(RT)-PCR，使用重鏈及輕鏈可變區-特異性引子，從單細胞回收四種不同抗體(稱為2102、2101、2109及211)之抗體可變區基因。在Aviso Onyx液體處理機器人上進行兩輪PCR，其中巢式2° PCR併入限制位點係在3'及5'端，從而允許將大鼠可變區選殖至小鼠γ1 IgG或Fab(VH)或小鼠κ(VL)哺乳動物表現載體中。使用Fectin 293(Invitrogen)將重鏈及輕鏈構築體共轉染至HEK-293細胞中及重組抗體表現於48-孔板中之1ml體積中。在表現5-7天之後，收集上清液且將抗體經受進一步篩選。
於HEK-293-CD40-BLUE報導子分析中在多種濃度下篩選重組大鼠/小鼠嵌合IgG及Fab分子以能夠計算得EC50值並確定最大抑制百分比。測試Fab片段以確保抗體在為單價時具活性。亦在Biacore實驗中分析IgG以確定對人類TNF之結合親和力。Biacore實驗的分析格式係藉由經固定之抗-小鼠IgG-Fc捕捉小鼠IgG，然後將人類TNF滴定於經捕捉表面上。使用Biacore T200(GE Healthcare)來進行BIA(生物分子相互作用分析)。經由胺偶聯化學品將親和純化F(ab')2片段山羊抗-小鼠IgG，Fc特異性片段 (Jackson ImmunoResearch)固定於CM5感測器晶片上達到~5000反應單位(RU)的程度。HBS-EP緩衝液(10mM HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20，GE Healthcare)用作操作緩衝液，流速為10μL/min。使用10μL 0.5μg/mL的小鼠IgG注射液以進行藉由經固定之抗小鼠IgG-Fc的捕捉。人類TNF在20nM下以30μL/min之流速注射於所捕捉的小鼠IgG上兩次。表面係藉由2 x 10μL注射40mM HCl再生，藉由以10μL/min的流速5μL注射5mM NaOH散佈。使用T200評估軟體(1.0版)依標準程序分析減去背景之結合曲線。
使用HEK-293-CD40-BLUE報導子分析(Invivogen)來確定中和。顯示EC50及中和%。進行Biacore分析以確定結合動力學。顯示結合率(ka)、解離率(kd)及親和力常數(KD)。
圖9顯示CA2109大鼠/小鼠Fab(fwk18 FAB)IgG1(fwk18 IgG)之滴定曲線。使用如上所述的HEK-293-CD40-BLUE報導子分析(Invivogen)確定數據。
如上所述分離得的所有四種抗體(2101、2109、2111及2102)係基於對人類TNF(hTNF)及食蟹獼猴TNF(cTNF)之食蟹獼猴及人類TNF交叉反應性篩選為大鼠/人類嵌合Fab，如下表4a中所顯示。
Biacore實驗的分析格式係藉由經固定之抗-人類F(ab')捕捉大鼠/人類嵌合Fab，然後將人類或食蟹獼猴TNF滴定於經捕捉表面上。使用Biacore T200(GE Healthcare)來進行BIA(生物分子相互作用分析)。經由胺偶聯 化學品將親和純化F(ab')2片段山羊抗-人類IgG-F(ab')2特異性片段(Jackson ImmunoResearch)固定於CM5感測器晶片上達到~5000反應單位(RU)的程度。HBS-EP緩衝液(10mM HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20，GE Healthcare)用作操作緩衝液，流速為10μL/min。使用10μL 0.5μg/mL的大鼠/人類嵌合注射液以進行藉由經固定之人類IgG-F(ab')2的捕捉。人類或食蟹獼猴TNF(分別在5nM或3.125nM下)以30μL/min之流速注射於所捕捉的大鼠/人類嵌合Fab上。表面係藉由2 x 10μL注射50mM HCl再生，藉由以10μL/min的流速5μL注射5mM NaOH散佈。使用T200評估軟體(1.0版)依標準程序分析減去背景之結合曲線。
發現抗體2102對食蟹獼猴TNF具有低得多的親和力。該抗體在人類類化期間亦損失親和力，因此未做任何其他的發展。
基於該研究，CA2109因其食蟹獼猴/人類交叉反應性、高親和力(表4)及強力中和活性(圖9及表4)而被選為主要候選者。該抗體基於此等性質 而被選擇用於人類化。
類似於CA2109，選擇具有相似親和力及中和性質之兩種其他抗體用於人類化，此等抗體為2101及2111。然而，2101在人類化後未保留對TNF的親和力，因此該抗體未做任何其他的發展。抗體2109及抗體2111皆成功地人類化且接著轉化成scFv格式並在L929 TNF抑制分析(述於下文實例6中之分析)中篩選以證實中和活性。抗體2111在該分析中與scFv一樣沒有保留活性，因此不適合用於多重特異性TrYbe抗體分子中。僅抗體2109與scFv一樣保留食蟹獼猴-人類交叉反應性、高親和力及中和能力及熱穩定性。抗體CA2109的人類化更詳細描述於下。
實例2：抗-TNF-α抗體CA2109的人類化
抗體CA2109係藉由移植互補決定區(CDR)至人類生殖系框架上而人類類化。圖6及7中顯示大鼠抗體(供體)序列與人類生殖系(受體)框架之比對，及所設計的人類化序列。
所選的輕鏈生殖系受體序列為人類VK1 2-1(U)A20 V-區加上JK2 J-區(V BASE，http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。所選的重鏈生殖系受體序列為人類VH3 1-3 3-21 V-區加上JH4 J-區(V BASE，http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。從供體移植至受體序列的CDR係如Kabat(Kabat等人1987)所定義，但使用Chothia/Kabat組合定義的CDR-H1除外。
設計編碼初始V-區序列之基因且藉由自動合成方法由Entelechon GmbH構築，並藉由寡核苷酸定點誘變修飾以生產出移植形式gL1、gL18、gH1及gH2。將gL18基因序列次選殖至包含編碼人類C-κ恆定區(Km3同功異型物)之DNA的UCB Celltech人類輕鏈表現載體pMhCK δ中。將gH2序列次選殖至包含編碼人類重鏈γ-1 CH1恆定區之DNA的UCB Celltech表現載體pMhg1Fab中。
為保留全部活性並維持高熱穩定性，保留在人類化重鏈之位置48(異白胺酸)、49(甘胺酸)、71(纈胺酸)、73(離胺酸)、78(丙胺酸)及93(蘇胺酸)(Kabat編號)處的供體殘基。類似地，保留在人類化輕鏈之位置65(蘇胺酸)、71(酪胺酸)及87(苯丙胺酸)(Kabat編號)處的供體殘基。另外，藉由使在位置31、50及52處的天冬醯胺酸殘基分別突變成絲胺酸、天冬胺酸及絲胺酸來移除輕鏈中的3個脫醯胺位點。最終的所選可變移植序列gL18及gH2顯示於圖6及7及SEQ ID NO：91及92中。在以下實例中，抗體2109係指此等人類化序列，而非初始大鼠親本序列。
實例3：Fab496.g3-(HC)dsscFv(HL)2109及Fab496.g3-(LC)dsscFv(HL)645質體的構築及在哺乳動物細胞中的表現
抗人類IL-17A及人類IL-17F之抗體CA028_00496.g3(在此亦稱為抗體496.g3)的產生先前已述於WO2008/047134及WO2012/095662中。該抗體以pM親和力結合人類IL-17A、IL-17F及IL-17A/F異二聚體。抗體496.g3的Fab格式之CDR、重鏈及輕鏈可變區及輕鏈及重鏈之胺基酸及編碼抗體496.g3的Fab格式之CDR、重鏈及輕鏈可變區及輕鏈及重鏈之DNA序列顯示於圖1中。496.g3(IL-17A/F結合)Fab恆定區包含人類C-κ恆定區(K1m3同功異型物)及人類γ-1 CH1恆定區及鉸鏈(G1m17同功異型物)。
抗-人類白蛋白抗體645的產生先前已述於WO2013/068571中。抗體645之CDR、重鏈及輕鏈可變區、scFv及dsscFV格式之胺基酸及編碼抗體645之CDR、重鏈及輕鏈可變區、scFv及dsscFV格式之DNA序列顯示於圖3中。
抗體496.g3及抗體645之dsscFv各包含在殘基44(重鏈)與100(輕 鏈)(使用Kabat編號系統)之間的穩定之雙硫鍵。
抗體645HL之dsscFv係藉由11個胺基酸的輕鏈連接子(SGGGGSGGGGS)連接至抗體496.g3之Fab cκ片段及抗體CA2109 HL之dsscFv係藉由11個胺基酸的重鏈連接子SGGGGTGGGGS[在此亦稱為S，2xG4S](SEQ ID NO：2)或SGGGGTGGGGS[在此亦稱為S，G4T,G4S](SEQ ID NO：1)連接至抗體496.g3之Fab CH1片段。
利用暫態表現以表現Fab496.g3-(HC)dsscFv(HL)2109(SEQ ID NO：127)(以連接子SGGGGTGGGGS將Fab HC與dsscFv2109連接)及Fab496.g3-(LC)dsscFv(HL)645(SEQ ID NO：131)(以連接子SGGGGSGGGGS將Fab LC與dsscFv645連接)。從先前在密碼子層級最佳化以於大腸桿菌中表現的質體限制選殖編碼整個輕鏈及重鏈Fab片段之基因。從pTrYbe HC#1切除編碼645dsHL scFv之AgeI-EcoRI基因片段且選殖至pED489中以在UCB內部表現載體pNAFL(Dhami，2012)中產生「輕鏈單基因載體」496.g3 LC-645 dsHL scFv。藉由DNA2.0合成編碼2109 dsHL scFv之DNA(BspEI-EcoRI片段)且選殖至pTrYbe HC#1(Dhami，2012)中以在UCB內部表現載體pNAFH(Dhami，2012)中產生「重鏈單基因載體」496.g3 Fab-2109 dsHL scFv。在兩種單基因載體於HEK293細胞中的暫態共表現後，從細胞培養上清液純化包含具有重鏈連接子SGGGGTGGGGS之Fab496.g3-(HC)dsscFv(HL)2109及Fab496.g3-(LC)dsscFv(HL)645之TrYbe蛋白質。經純化之TrYbe呈現高單體含量(89%)及高熱穩定性(Tm 71℃)，及因此進行生產穩定細胞系的發展。
使用穩定表現以自哺乳動物CHO細胞系以約1g/L之生產率水平及約70%單體來表現Fab496.g3-(HC)dsscFv(HL)2109(SEQ ID NO：125)(以連 接子SGGGGSGGGGS將Fab HC與dsscFv2109連接)及Fab496.g3-(LC)dsscFv(HL)645(SEQ ID NO：131)(以連接子SGGGGSGGGGS將FabLC與dsscFv645連接)，其在此亦稱為抗體分子Trybe 18B。進行下游純化製程以便產生經純化之TrYbe18B。
實例4 Fab496.g3-(HC)dsHLscFv2109(LC)dsHLscFv645(Trybe 18B)之Biacore親和力及同時抗原標靶結合
包含Fab496.g3-(HC)dsscFv(HL)2109(SEQ ID NO：125)(以連接子SGGGGSGGGGS將Fab HC與dsscFv2109連接)及Fab496.g3-(LC)dsscFv(HL)645(SEQ ID NO：131)(以連接子SGGGGSGGGGS將FabLC與dsscFv645連接)之抗體分子(其在此亦稱為抗體分子Trybe 18B，如依實例3中的方法製得)之抗人類TNF-α、人類IL-17A、人類IL-17F及人類血清白蛋白之親和力依下述方法進行測試：
實驗格式係藉由經固定之抗-人類IgG-F(ab')2捕捉TrYbe 18B，然後將人類TNF、人類IL-17A、人類IL-17F及人類血清白蛋白滴定於經捕捉表面上。使用Biacore T200(GE Healthcare)進行BIA(生物分子相互作用分析)。經由胺偶聯化學品將親和純化F(ab')2片段山羊抗-人類IgG，F(ab')2特異性片段(Jackson ImmunoResearch)固定於CM5感測器晶片上達到~5000反應單位(RU)的捕捉程度。HBS-EP緩衝液(10mM HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20，GE Healthcare)用作操作緩衝液，流速為10μL/min。使用10μL 0.5μg/mL的TrYbe 18B注射液以進行藉由經固定之抗-人類IgG-F(ab')2的捕捉。人類TNF、人類IL-17A、人類IL-17F及HSA在各種濃度(分別為5nM至0.15625nM、5nM至0.15625nM、10nM至0.3125nM及100nM至3.125 nM)下以30μL/min的流速滴定於所捕捉的TrYbe 18B上。表面係藉由2 x 10μL注射50mM HCl再生，藉由以10μL/min的流速5μL注射5mM NaOH散佈。使用T200評估軟體(1.0版)依標準程序分析減去背景之結合曲線。由擬合演算法確定動力學參數。結果顯示於表5中。
進行另一分析以測定抗體分子TrYbe 18B與食蟹獼猴TNF、食蟹獼猴IL-17A、食蟹獼猴IL-17F及食蟹獼猴白蛋白之結合。分析格式係藉由經固定之抗-人類IgG-F(ab')2捕捉TrYbe 18B，然後將食蟹獼猴TNF、IL-17A、IL-17F及白蛋白滴定於經捕捉表面上。使用Biacore T200(GE Healthcare)來進行BIA(生物分子相互作用分析)。經由胺偶聯化學品將親和純化F(ab')2片段山羊抗-人類IgG，F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch)固定於CM5感測器晶片上達到~5000反應單位(RU)的捕捉程度。HBS-EP緩衝液(10mM HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20，GE Healthcare)用作操作緩衝液，流速為10μL/min。使用10μL 0.5μg/mL的TrYbe 18B注射液以進行藉由經固定之抗-人類IgG-F(ab')2的捕捉。將食蟹獼猴TNF、IL-17A、IL-17F及白蛋白在各種濃度(分別為5nM至0.15625nM、10nM至0.3125nM、40nM至1.25nM及100nM至3.125nM)下以30μL/min的流速滴定於所捕捉的TrYbe 18B上。表面係藉由2 x 10μL注射50mM HCl再生，藉由以10 μL/min的流速5μL注射5mM NaOH散佈。使用T200評估軟體(1.0版)依標準程序分析減去背景之結合曲線。由擬合演算法確定動力學參數。結果顯示於表6中。
評估人類IL-17A、人類TNF及人類血清白蛋白與TrYbe 18B的同時結合。TrYbe 18B構築體係藉由經固定之抗-人類IgG-F(ab')2捕捉至感測器晶片，然後將僅hIL-17A、僅hTNF、僅HSA、或hIL-17A、hTNF及HSA之混合溶液分別滴定於所捕捉的TrYbe 18B上。
使用Biacore T200(GE Healthcare)來進行BIA(生物分子相互作用分析)。如上述針對TrYbe 18B結合人類TNF、IL-17A、IL-17F及HSA的Biacore動力學的方法中所陳述，將TrYbe 18B構築體捕捉至感測器晶片表面。將100nM HSA、20nM hIL-17A、20nM hTNF、或最終濃度之100nM HSA、20nM hIL-17A、20nM hTNF之混合溶液分別滴定於所捕捉的TrYbe 18B上。
組合型hIL-17A/hTNF/HSA溶液之結合反應等同於單獨注射液之反應的總和，如表7中所顯示。此證實TrYbe 18B能夠與人類IL-17A、人類TNF及HSA同時結合。
進行另一分析以測定食蟹獼猴IL-17A、TNF及白蛋白與TrYbe 18B的同時結合。TrYbe 18B構築體係藉由經固定之抗-人類IgG-F(ab')2捕捉至感測器晶片，然後將僅食蟹獼猴IL-17A、僅食蟹獼猴TNF、僅食蟹獼猴HSA、或食蟹獼猴IL-17A、TNF及白蛋白之混合溶液分別滴定於所捕捉的TrYbe 18B上。
使用Biacore T200(GE Healthcare)來進行BIA(生物分子相互作用分析)。如上述針對TrYbe 18B結合食蟹獼猴TNF、IL-17A、IL-17F的Biacore動力學的方法中所陳述，將TrYbe 18B構築體捕捉至感測器晶片表面。將100nM CSA、20nM食蟹獼猴IL-17A、20nM食蟹獼猴TNF、或最終濃度之100nM HSA、20nM食蟹獼猴IL-17A、20nM食蟹獼猴TNF之混合溶液分別滴定於所捕捉的TrYbe 18B上。
組合型食蟹獼猴IL-17A/食蟹獼猴TNF/CSA溶液之結合反應等同於單獨注射液之反應的總和，如表8中所顯示。此證實TrYbe 18B能夠與食蟹獼猴IL-17A、食蟹獼猴TNF及CSA同時結合。
實例6 Fab496.g3-(HC)dsHLscFv2109(LC)dsHLscFv645(Trybe 18B)抗TNF(人類及食蟹獼猴)之基於活體外細胞的活性
包含Fab496.g3-(HC)dsscFv(HL)2109(SEQ ID NO：125)(以連接子SGGGGSGGGGS將Fab HC與dsscFv2109連接)及Fab496.g3-(LC)dsscFv(HL)645(SEQ ID NO：131)(以連接子SGGGGSGGGGS將FabLC與dsscFv645連接)之抗體分子(其在此亦稱為抗體分子Trybe 18B，如依實例3中的方法製得)在活體外細胞分析中進行抗人類TNF-α活性之測試。L929細胞系為對TNF-α之細胞毒性效應敏感之鼠纖維肉瘤細胞系。TNF經由TNF受體產生刺激，該等TNF受體結合人類、食蟹獼猴或鼠TNF-α以誘導細胞凋亡。細胞經放線菌素D共處理，此舉增加被TNF-α殺死的易感性。藉由經由螢光素酶反應(CellTiter-Glo，Promega)偵測ATP含量(其係隨著存活率的提高而減小)來測定L929細胞在經放線菌素-D/TNF-α及TrYbe 18B處理後的存活率。
L929細胞在1小時的預培養後用2.35μg/ml放線菌素D及100pg/ml之人類TNF α在TrYbe 18B(濃度範圍8.12E-9M至1.23E-13M)或對照化合物Enbrel(濃度範圍1.3E-9M-2E-14M)的存在下以30μl的最終體積於384孔平底板進行處理。在37℃，5% CO2下經過24小時之後，藉由CellTiter-Glo(Promega Ltd)測定細胞存活率。圖10a顯示經放線菌素-D/及人類TNF-α及TrYbe 18B或對照化合物Enbrel處理之L929細胞之代表性細胞存活率曲線。
L929細胞亦在1小時的預培養後用2.35μg/ml放線菌素D及20pg/ml之食蟹獼猴TNF α在TrYbe 18B(濃度範圍8.12E-9M至1.23E-13M)或對照化合物Enbrel(濃度範圍1.3E-9M-2E-14M)的存在下以30μl的最終體積於 384孔平底板中進行處理。在37℃，5% CO2下經過24小時之後，藉由CellTiter-Glo(Promega Ltd)測定細胞存活率。圖10b顯示經放線菌素-D/及食蟹獼猴TNF-α及TrYbe 18B或對照化合物Enbrel處理之L929細胞之代表性細胞存活率曲線。
當受到人類或食蟹獼猴TNF-α刺激時，TrYbe 18B能夠以劑量依賴方式完全地抑制TNF-α的殺死效應；EC50平均值為5.87pM(人類，N=3)及EC50平均值為4.97pM(食蟹獼猴，N=2)。TrYbe 18B不與鼠TNF交叉反應及因此不抑制鼠TNF-α的殺死效應(N=3)。
實例7 Fab496.g3-(HC)dsHLscFv2109(LC)dsHLscFv645(Trybe 18B)抗IL-17A及IL-17F之基於活體外細胞的活性
包含Fab496.g3-(HC)dsscFv(HL)2109(SEQ ID NO：125)(以連接子SGGGGSGGGGS將Fab HC與dsscFv2109連接)及Fab496.g3-(LC)dsscFv(HL)645(SEQ ID NO：131)(以連接子SGGGGSGGGGS將FabLC與dsscFv645連接)之抗體分子(其在此亦稱為抗體分子Trybe 18B，如依實例3中的方法製得)在活體外細胞分析中進行抗人類及食蟹獼猴IL-17A及F活性之測試。
IL-17A及IL-17F與IL-1β的組合誘導鼠纖維母細胞細胞系NIH 3T3釋放IL-6。此構成測試抗-IL-17A及抗-IL-17F分子的中和能力之分析系統的基礎。
在37℃下將述於WO2012/095662中之TrYbe 18B或抗-IL17A/F抗體CA028_00496.g3(濃度範圍5000ng/mL至19.5ng/mL)與重組人類IL-17A(30ng/mL)及重組人類IL-1β(50pg/mL)預培養4小時。然後將TrYbe/抗體蛋白質複合物轉移至在96-孔平底板中的NIH-3T3細胞。在37℃，5% CO2，100%濕度下培養3天之後，收集無細胞上清液且藉由MSD測定IL-6的含量。
在37℃下將TrYbe 18B或抗-IL17A/F抗體CA028_00496.g3(濃度範圍5000ng/mL至19.5ng/mL)與重組人類IL-17F(300ng/mL)及重組人類IL-1β(50pg/mL)預培養4小時。然後將TrYbe/抗體蛋白質複合物轉移至在96-孔平底板中的NIH-3T3細胞。在37℃，5% CO2，100%濕度下培養3天之後，收集無細胞上清液且藉由MSD測定IL-6的含量。
在37℃下將TrYbe 18B或抗-IL17A/F抗體CA028_00496.g3(濃度範圍5000ng/mL至19.5ng/mL)與重組食蟹獼猴IL-17A(30ng/mL)及重組人類IL-1β(50pg/mL)預培養4小時。然後將TrYbe/抗體蛋白質複合物轉移至在96-孔平底板中的NIH-3T3細胞。在37℃，5% CO2，100%濕度下培養3天之後，收集無細胞上清液且藉由MSD測定IL-6的含量。
在37℃下將TrYbe 18B或抗-IL17A/F抗體CA028_00496.g3(濃度範圍5000ng/mL至19.5ng/mL)與重組食蟹獼猴IL-17F(300ng/mL)及IL-1β(50pg/mL)預培養4小時。然後將三體/抗體蛋白質複合物轉移至在96-孔平底板中的NIH-3T3細胞。在37℃，5% CO2，100%濕度下培養3天之後，收集無細胞上清液且藉由MSD測定IL-6的含量。
在37℃下將TrYbe 18B或抗-IL17A/F抗體CA028_00496.g3(濃度範圍5000ng/mL至19.5ng/mL)與重組食蟹獼猴IL-17F(300ng/mL)及IL-1β(50pg/mL)預培養4小時。然後將三體/抗體蛋白質複合物轉移至在96-孔平底板中的NIH-3T3細胞。在37℃，5% CO2，100%濕度下培養3天之後，收集無細胞上清液且藉由MSD測定IL-6的含量。
在NIH 3T3生物分析中，TrYbe 18B以濃度依賴性方式同時抑制人類 及食蟹獼猴IL-17A及IL-17F誘導的IL-6釋放(資料未顯示)。TrYbe 18B具有等同於對照抗體CA028_00496.g3的效力(資料未顯示)。
實例8 Fab496.g3-(HC)dsHLscFv2109(LC)dsHLscFv645(Trybe 18B)抗TNF-α之活體外活性
包含Fab496.g3-(HC)dsscFv(HL)2109(SEQ ID NO：125)(以連接子SGGGGSGGGGS將Fab HC與dsscFv2109連接)及Fab496.g3-(LC)dsscFv(HL)645(SEQ ID NO：131)(以連接子SGGGGSGGGGS將FabLC與dsscFv645連接)之抗體分子(其在此亦稱為如以實例3中的方法所製得的抗體分子Trybe 18B)在活體內分析中進行測試TNF-α的抑制作用之測試。
在小鼠中腹膜投與外源人類TNF α引起與嗜中性白血球症有關的局部發炎反應。該反應主要藉由小鼠TNF受體I(TNFRI)的活化及在後來於由NF-κB介導的轉錄後釋放嗜中性趨化細胞數而引起。該種由人類TNF α誘導的嗜中性白血球症模式可用於測定TrYbe 18B抗人類TNF α在獨立於人類IL-17A/F之生理系統中之活體內療效及效力。由於人類TNF α為該模式中唯一的發炎刺激，因此假設以TrYbe 18B進行的預防性治療將抑制人類TNF α誘導的腹膜嗜中性白血球症。
Balb/c小鼠以PBS或漸增濃度之TrYbe 18B(0.1、1或10mg/kg)靜脈內處理。在PBS或TrYbe 18B處理1小時後，小鼠以PBS或人類TNF α(0.3μg/kg)腹膜內激發。4小時後，人道終止小鼠的生命且收集腹腔灌洗液以供流式細胞儀評估針對嗜中性白血球症。結果為n=8隻/組的平均值(+/- SEM)。使用單因子ANOVA與杜納事後檢驗(Dunnett's post-test)(****=p0.0001)來計算統計學比較。
圖11顯示TrYbe 18B能夠劑量依賴地抑制人類TNF α誘導的嗜中性白 血球症，其中在1及10mg/kg下幾乎完全消除反應(分別為96%及100%抑制)。由於該系統中不存在人類IL-17A/F，此表明TrYbe 18B之抗-人類TNF α dsscFv在活體內有效且強力。
實例9 Fab496.g3-(HC)dsHLscFv2109(LC)dsHLscFv645(Trybe 18B)抗TNF-alpha及IL-17A之活體內活性
包含Fab496.g3-(HC)dsscFv(HL)2109(SEQ ID NO：125)(以連接子SGGGGSGGGGS將Fab HC與dsscFv2109連接)及Fab496.g3-(LC)dsscFv(HL)645(SEQ ID NO：131)(以連接子SGGGGSGGGGS將FabLC與dsscFv645連接)之抗體分子(其在此亦稱為抗體分子Trybe 18B，如依實例3中的方法製得)在活體內分析中進行測試TNF-α及IL-17A的抑制作用之測試。
重要地，顯示TrYbe 18B抗體可抑制源自同時存在的兩種細胞激素之生物反應。以往的研究已顯示人類TNF α及IL-17A之組合活體內產生大於任何一種單獨的刺激之總和之協同嗜中性反應。因此，測試TrYbe 18B抗人類TNF α與人類IL-17A的組合與之活體內有效性及效力。為進一步鑑別在該模式中的人類TNF α及人類IL-17A之協同貢獻，使用抗人類TNF α(101.4)及人類IL-17A/F(抗體CA028_00496.g3)之單特異性抗體。
Balb/c小鼠以PBS、抗體CA028_00496.g3(30mg/kg)、101.4(30mg/kg)或漸增濃度之TrYbe 18B(0.1、1或10mg/kg)靜脈內處理。在投與抗體1小時後，小鼠以PBS、人類IL-17A(10μg/kg)、人類TNF α(0.3μg/kg)、或人類IL-17A(10μg/kg)與人類TNF α(0.3μg/kg)之組合腹膜內激發。4小時後，人道終止小鼠的生命且收集腹腔灌洗液以供流式細胞儀評估嗜中性白血球症。結果為n=8隻/組的平均值(+/- SEM)。使用單因子 ANOVA與杜納事後檢驗(*=p0.05,**=p0.01=***=p0.001=****=p0.0001)來計算統計學比較。
圖12顯示人類IL-17A與人類TNF α的組合之腹膜內投與誘導遠大於任何一種單獨投與的刺激之總和之局部嗜中性反應。此外，在該模式中抑制人類TNF α(使用過量的抗-TNF α抗體101.4)使得組合型IL-17A/TNF α誘導的反應減低至類似於在僅投與IL-17A後所觀察到程度的程度。類似地，抑制人類IL-17A/F(使用過量的抗體CA028_00496.g3)可僅抑制組合型IL-17A/TNF α誘導的反應至在僅投與TNF α後所觀察到的相同程度。相反地，TrYbe 18B能夠劑量依賴地抑制IL-17A/TNF α誘導的嗜中性白血球症至超過藉由抗體CA028_00496.g3或101.4中任一者所達成程度的程度(在10mg/kg TrYbe 18B下的96%抑制相對於分別利用30mg/kg 101.4及抗體CA028_00496.g3的81%及67%抑制)。總而言之，在活體內模型中，該數據顯示TrYbe 18B能夠同時抑制人類TNF α及人類IL-17A二者。
實例10 Fab496.g3-(HC)dsHLscFv2109(LC)dsHLscFv645(Trybe 18B)之生物物理表徵
包含Fab496.g3-(HC)dsscFv(HL)2109(SEQ ID NO：125)(以連接子SGGGGSGGGGS將Fab HC與dsscFv2109連接)及Fab496.g3-(LC)dsscFv(HL)645(SEQ ID NO：131)(以連接子SGGGGSGGGGS將FabLC與dsscFv645連接)之抗體分子(其在此亦稱為抗體分子Trybe 18B，如依實例3中的方法製得)及包含Fab496.g3-(HC)dsscFv(HL)2109(SEQ ID NO：127)(以連接子SGGGGTGGGGS將Fab HC與dsscFv2109連接)及Fab496.g3-(LC)dsscFv(HL)645(SEQ ID NO：131)(以連接子SGGGGSGGGGS將Fab LC與dsscFv645連接)之抗體分子(其在此亦稱為 抗體分子Trybe 18T，如依實例3中的方法製得)在生物物理表徵實驗中進行測試。
分析三個批次的抗體分子(參見表9)。該研究可測定TrYbe 18B分子之總體生物化學及生物物理特徵。
此外，分析來自穩定批次2的純化以不同於親本TrYbe 18B分子的方式溶離得到的溶離份(A3)以證實同一性且因此能夠解釋TrYbe 18B分子之意外雜質及/或生物物理特徵。
該等批次的純度係藉由尺寸排除HPLC(SEC HPLC)(資料未顯示)及SDS PAGE(在非還原及還原條件下)來測定(圖13)。
如藉由SEC HPLC判斷，在相同滯留時間下溶離的所有樣品具有小於2.2%高分子量物種(暫態批次：0.56%；穩定批次1：0.59%；穩定批次2：2.2%)。暫態樣品含有低分子量污染物，如寬峰比主峰更晚溶離所指示。
圖13顯示TrYbe 18B的不同批次之使用SDS PAGE 4-20% Novex Tris/甘胺酸(Invitrogen)進行的SDS PAGE分析。在(A)非還原(+N-乙基馬來醯亞胺(NEM)及(B)還原條件下分析。泳道1=參見Blue Invitrogen標記物；泳道2=A3(來自穩定批次2之純化的溶離份)；泳3=暫態批次；泳道4=穩定批次1；泳道5=穩定批次2。所有三個批次藉由SDS PAGE顯示相似的純度，~130kDa的帶(在非還原條件下)歸因於完全組裝、經雙硫鍵成 對的抗體分子及~50kDa的雙峰(在還原條件下)與經分別還原之重鏈及輕鏈一致。在非還原條件下，存在~50kDa的帶，此相當於A3(泳道2)所觀察到的帶。A3藉由完整質譜分析(50.8kDa)及N端序列分析(主要的輕鏈)證實為經半胱胺酸封端之輕鏈。所關注的樣品之50kDa的帶(非還原凝膠)被認為是輕鏈，因為質譜分析未識別到任何重鏈。此在後來藉由由Ponseau S染色墨點轉漬法切下的帶之N端序列分析得到證實；僅識別到輕鏈N端(AIQLTQSPSS)。
pI測量：
方法1：30μl 1mg/ml蛋白質樣品、0.35%甲基纖維素、4% pH3-10兩性電解質(Pharmalyte)、1μl的每種合成pI標記物(4.65及9.77)及HPLC級水達到100μl最終體積。然後，使用iCE3 IEF分析儀(ProteinSimple)，在1500V下預聚焦1分鐘，接著在3000V下聚焦5分鐘，來分析該混合物。然後，使用Empower軟體(來自Waters)來整合經校準之電泳圖。
方法2：30μl 2mg/ml蛋白質樣品、105ul 1%甲基纖維素、12ul pH3-8兩性電解質(Pharmalyte)、1.5μl的每種合成pI標記物(4.65及9.77)及HPLC級水達到300μl最終體積。然後，如方法1所述，使用iCE3來分析該混合物。
TrYbe T及18B的所有批次之實驗pI皆高(範圍9.2-9.4)且因此在預期的調配物pH(~pH 5)下不可能具有約零的總分子電荷(約零的總分子電荷會使聚集風險增大)。
發現溶離份A3的pI主要為8.31(48.6%)。
分子穩定性：
分子穩定性藉由熔融溫度(Tm)(解摺疊之測定)及攪拌效應(藉由物理 應力解摺疊接著聚集)來測定。
TrYbe T及18B的所有批次的示差掃描熱量法(DSC)分析可區分兩個主要的域。較低的解摺疊事件歸因於2109 scFv。緩衝液種類及pH似乎不影響熔融溫度。
Thermofluor分析得到類似於源自DSC分析的Tm值的Tm值(觀測到)，然而，不容易區別不同域。僅穩定批次1及穩定批次2獲得較高解摺疊域之證實。可區分暫態批次之較早解摺疊轉變(48-50℃)，此極有可能歸因於過量輕鏈的存在。
ND表示分析未完成(由於材料之可利用性的緣故)
總而言之，從上述分析證實TrYbe T及18B的三個批次間不存在顯著差異。
TrYbe 18B具有高pI，但相比習知格式(IgG及Fab'分子)呈現中等低的Tm，似乎是由該分子之2109scFv成分的CDR所決定。所有批次皆包含過量輕鏈而較大可能地造成所觀測到的異質性/不穩定性，然而，其可藉由純化移除。
實例11 Fab496.g3-(HC)dsHLscFv2109(LC)dsHLscFv645(Trybe 18B)抗IL-17A及IL-17F之基於活體外細胞的活性
除了IL-17A及IL-17F同功異型物以外的TNF α為由Th17細胞所產生的主要細胞激素且已知間接地誘導嗜中性白血球藉由非造血性組織諸如關節滑膜細胞的活化而募集。在該研究中，將TrYbe18B於嗜中性白血球遷移之複雜活體外模型中之療效與靶向IL-17AF的組合型個別抗體及靶向TNF α的Enbrel進行比較。
RA滑膜細胞之活化：第1天：將所培養的RA滑膜細吧(繼代6)以104個細胞/孔接種於24孔transwell板的較低區室中且在37℃下培養24小時。第2天：第二天，將滑膜細胞用源自Th17細胞(EWBE-037388)的經含或不含其他抗-TNF α中和Enbrel的IL-17A(抗體497，如WO2008/001063中所述)或IL-17F或IL-17AF(抗體CA028_00496.g3)特異性抗體預阻斷(1小時的室溫)之上清液(在1：10稀釋度下)活化。亦將Th17與陰性對照A33 IgG或TrYbe18B預培養以中和IL-17A+F及TNF α。培養在總體積為0.5ml之對照或刺激培養基中進行。所測試的所有抗體係過量(10ug/ml)使用的，以完全地中和存於Th17上清液中的靶細胞激素。然後在遷移分析之前將經刺激之纖維母細胞再培養24小時。
嗜中性白血球遷移分析：第3天：為從人類全血分離人類白血球(白細胞)，在室溫下將40ml ACK溶胞緩衝液與10ml人類血液混合10分鐘以 有效地溶解RBC。然後將白細胞於400g下離心10分鐘且另外於20ml PBS中洗兩次，接著以106個細胞/ml再懸浮於空白RPMI培養基(Gibco)中進行計數。將5x105個白細胞(0.5ml)接種於transwell之上方區室上且在37℃下培養6小時。分離穿過3.0uM滲透膜遷移至下方區室中的白細胞並用抗-人類CD18特異性抗體(Ebioscience)標記30分鐘(2ul/測試，於冰上)以識別嗜中性白血球。然後，抗體染色樣品用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)pH7.4洗一次，接著在BD LSRII Fortessa X20流式細胞計數分析儀上進行FACS擷取。將所有樣品再懸浮於200μL外加Sigma參考珠粒的PBS中。使用單因子Anova與杜納事後檢驗，使用IgG(-抗-TNF α)作為比較物，進行統計分析。
使用TrYbe18B或IL-17特異性同功異型物中任一者及TNF α阻斷抗體，可在複雜臨床前活體外分析中測定IL-17及TNF α於調節人類嗜中性白血球的遷移中之個別及集體影響。使用來自Th17細胞的上清液所活化的RA滑膜細胞明顯地增加嗜中性白血球的趨化細胞素反應(圖14)。相對於與同型物相匹配的陰性對照，嗜中性白血球遷移受到特異性IL-17A阻斷顯著抑制。在RA滑膜細胞活化之前僅中和Th17上清液中的IL-17F不改變嗜中性白血球遷移能力。相反地，IL-17A及IL-17F之雙重抑制會抑制嗜中性白血球遷移至相比單單IL-17A抑制更大的程度。使用Enbrel預阻斷TNF α亦顯著影響嗜中性白血球趨化性，嗜中性白血球趨化性另外受到額外IL-17同型物特異性中和抗體抑制。重要的是，使用TrYbe18B三特異性阻斷IL-17A、IL-17F及TNF證實與使用個別抗體以中和此等細胞激素相似之針對嗜中性白血球遷移之抑制。
在該研究中，吾人證實經由中和IL-17AF及TNF α(使用個別阻斷劑 (抗-IL-17AF+Enbrel)或經由使用TrYbe18B進行的三特異性阻斷)可達成嗜中性白血球遷移之最佳抑制。
實例12活體內TrYbe 18B之藥物動力學(PK)分析
對四隻雄性食蟹獼猴投與10mg/kg靜脈內(IV)單次推注劑量之TrYbe18B及歷時28天以選定時間間隔收集血清樣品。使用免疫分析法(其證實IL17A/F及TNF結合區二者皆存在)，分析樣品中TrYbe18B的濃度。實施兩區室PK分析。
TrYbe18B之血清濃度係與有能力結合至FcRn且藉由FcRn再循環之大分子量蛋白質一致(圖15)。該性質由其白蛋白結合域賦予TrYbe18B。TrYbe18B在IV給藥之後的初始濃度係與具有類似於血漿體積之中央區室體積的分子一致。濃度以雙指數方式衰減，其中終點(β)半衰期為約5.6天(表11)。慢終點半衰期符合TrYbe18B之相對低清除率；與結合至FcRn且藉由FcRn再循環一致。慢清除率亦證實TrYbe之活體內穩定性，因為分子之結合性成分中任一者的實質清除率將表現為增加的表觀清除率。
CL=清除率
Cmax=最大血清濃度
SD=標準偏差
<110> 比利時商UCB生物製藥公司
<120> 對TNF-α、IL-17A及IL-17F具特異性之多重特異性抗體分子
<130> PF0054-WO
<150> GB1522391.0
<151> 2015-12-18
<160> 147
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白結合肽
<400> 67
<210> 68
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白結合肽
<400> 68
<210> 69
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可撓連接子
<400> 69
<210> 70
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可撓連接子
<400> 70
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體496g3-CDRH1之CDR序列
<400> 71
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體496g3-CDRH2之CDR序列
<400> 72
<210> 73
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體496g3-CDRH3之CDR序列
<400> 73
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體496g3-CDRL1之CDR序列
<400> 74
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體496g3-CDRL2之CDR序列
<400> 75
<210> 76
<21-1> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體496g3-CDRL3之CDR序列
<400> 76
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體496g3之輕鏈可變區
<400> 77
<210> 78
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體496g3之重鏈可變區
<400> 78
<210> 79
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體496g3之輕鏈可變區的DNA
<400> 79
<210> 80
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體496g3之重鏈可變區的DNA
<400> 80
<210> 81
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體496g3之輕鏈(VL-CL)
<400> 81
<210> 82
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體496g3之重鏈(VH-CH1)
<400> 82
<210> 83
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體496g3之輕鏈的DNA(不含信號序列)
<400> 83
<210> 84
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體496g3之重鏈的DNA(不含信號序列)
<400> 84
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 CDRH1之CDR序列
<400> 85
<210> 86
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 CDRH2之CDR序列
<400> 86
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 CDRH3之CDR序列
<400> 87
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 CDRL1之CDR序列
<400> 88
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 CDRL2之CDR序列
<400> 89
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 CDRL3之CDR序列
<400> 90
<210> 91
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 gL18之輕鏈可變區
<400> 91
<210> 92
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 gH2之重鏈可變區
<400> 92
<210> 93
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體2109 gL18之輕鏈可變區的DNA
<400> 93
<210> 94
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體2109 gH2之重鏈可變區的DNA
<400> 94
<210> 95
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 gL18之輕鏈可變區
<400> 95
<210> 96
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 gH2之重鏈可變區
<400> 96
<210> 97
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體2109 gL18之輕鏈可變區的DNA
<400> 97
<210> 98
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體2109 gH2之重鏈可變區的DNA
<400> 98
<210> 99
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 gH2gL18之scFv(VH-VL)
<400> 99
<210> 100
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體2109 gH2gL18之scFv(VH-VL)的DNA
<400> 100
<210> 101
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 gH2gL18之dsscFv(VH-VL)
<400> 101
<210> 102
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體2109 gH2gL18之dsscFv(VH-VL)的DNA
<400> 102
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645 CDRH1之CDR序列
<400> 103
<210> 104
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645 CDRH2之CDR序列
<400> 104
<210> 105
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645 CDRH3之CDR序列
<400> 105
<210> 106
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645 CDRL1之CDR序列
<400> 106
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645 CDRL2之CDR序列
<400> 107
<210> 108
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645 CDRL3之CDR序列
<400> 108
<210> 109
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645之輕鏈可變區
<400> 109
<210> 110
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645之重鏈可變區
<400> 110
<210> 111
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體645之輕鏈可變區的DNA
<400> 111
<210> 112
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體645之重鏈可變區的DNA
<400> 112
<210> 113
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645之輕鏈可變區
<400> 113
<210> 114
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645之重鏈可變區
<400> 114
<210> 115
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體645之輕鏈可變區的DNA
<400> 115
<210> 116
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體645之重鏈可變區的DNA
<400> 116
<210> 117
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645之scFv(VH-VL)
<400> 117
<210> 118
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體645之scFv(VH-VL)的DNA
<400> 118
<210> 119
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體645之dsscFv(VH-VL)
<400> 119
<210> 120
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗體645之dsscFv(VH-VL)的DNA
<400> 120
<210> 121
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 496.g3 HC-2109VHVL
<400> 121
<210> 122
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼496.g3 HC-2109VHVL的DNA
<400> 122
<210> 123
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 496.g3 HC-2109VHVL
<400> 123
<210> 124
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼496.g3 HC-2109VHVL的DNA
<400> 124
<210> 125
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 496.g3 HC-2109dsVHVL
<400> 125
<210> 126
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼496.g3 HC-2109dsVHVL的DNA
<400> 126
<210> 127
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 496.g3 HC-2109dsVHVL
<400> 127
<210> 128
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼496.g3 HC-2109dsVHVL的DNA
<400> 128
<210> 129
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 496.g3 LC-645VHVL
<400> 129
<210> 130
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼496.g3 LC-645VHVL的DNA
<400> 130
<210> 131
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 496.g3 LC-645dsVHVL
<400> 131
<210> 132
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼496.g3 LC-645dsVHVL的DNA
<400> 132
<210> 133
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109之大鼠可變重鏈序列
<400> 133
<210> 134
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有JH4之人類生殖系受體框架VH3序列1-3 3-21
<400> 134
<210> 135
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 gH1之重鏈可變區
<400> 135
<210> 136
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 CDRL1之CDR序列
<400> 136
<210> 137
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 CDRL2之CDR序列
<400> 137
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 CDRL2之CDR序列
<400> 138
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 CDRL2之CDR序列
<400> 139
<210> 140
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠抗體2109之輕鏈可變區
<400> 140
<210> 141
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類VK1 2-1(U)A20 JK2受體框架
<400> 141
<210> 142
<211> 107
<2.12> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體2109 gL1之輕鏈可變區
<400> 142
<210> 143
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼496.g3 HC-2109dsVHVL的DNA
<400> 143
<210> 144
<211> 1480
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼496.g3 HC-2109dsVHVL的DNA
<400> 144
<210> 145
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼496.g3 LC-645dsVHVL的DNA
<400> 145
<210> 146
<211> 1447
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼496.g3 LC-645dsVHVL的DNA
<400> 146
<210> 147
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體CA2109 gL18之輕鏈可變區
<400> 147

Claims (65)

  1. 一種多重特異性抗體分子，其包含對人類TNF-α具特異性之結合域及對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域，其中該抗體分子能夠中和人類TNF-α、人類IL-17A及人類IL-17F的生物活性。
  2. 如請求項1之多重特異性抗體分子，其中該抗體具有200pM或更佳的對人類TNF-α之結合親和力。
  3. 如請求項1或2之多重特異性抗體分子，其中該抗體具有100pM或更佳的對人類IL-17A之結合親和力。
  4. 如請求項3之多重特異性抗體分子，其中該抗體具有20pM或更佳的對人類IL-17A之結合親和力。
  5. 如請求項1至4中任一項之多重特異性抗體分子，其中該抗體具有100pM或更佳的對IL-17F之結合親和力。
  6. 如請求項5之多重特異性抗體分子，其中該抗體具有20pM或更佳的對IL-17F之結合親和力。
  7. 如請求項1至6中任一項之多重特異性抗體分子，其中該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域亦結合IL-17A/IL-17F異二聚體。
  8. 如請求項1至7中任一項之多重特異性抗體分子，其中各結合域包含兩個抗體可變域。
  9. 如請求項8之多重特異性抗體分子，其中該兩個抗體可變域為VH/VL對。
  10. 如請求項1至9中任一項之多重特異性抗體分子，其中該分子形式係選自雙功能抗體(diabody)、sc雙功能抗體(scdiabody)、三功能抗體(triabody)、串聯scFv、FabFv、Fab'Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2、二Fab、二Fab'、三體(tribody)、串聯scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、sc雙功能抗體-Fc、sc雙功能抗體-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、Duobody及DVD-Ig。
  11. 如請求項1至9中任一項之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域及該對IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域係獨立地選自Fab、scFv、Fv、dsFv及dsscFv。
  12. 如請求項1至9中任一項之多重特異性抗體分子，其包含以下或由以下組成：c)式(I)之多肽鏈：V H1 -CH 1 -X-V 1 ；及d)式(II)之多肽鏈： V L1 -C L -Y-V 2 ；其中：VH1表示重鏈可變域；CH1表示重鏈恆定區的域，例如其域1；X表示鍵或連接子；Y表示鍵或連接子；V1表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv；VL1表示單鏈可變域；CL表示輕鏈恆定區的域，諸如Cκ；V2表示dsFv、sdAb、scFv或dsscFv。
  13. 如請求項12之多重特異性抗體分子，其中V1及V2中之至少一者為scFv或dsscFv。
  14. 如請求項13之多重特異性抗體分子，其中V1為scFv或dsscFv及V2為scFv或dsscFv。
  15. 如請求項14之多重特異性抗體分子，其中V1為dsscFv及V2為dsscFv。
  16. 如請求項12至15中任一項之多重特異性抗體分子，其中V1為scFv或dsscFv，且V1包含下列之多肽鏈：a.式(III)：VH2-Z1-VL2且VH2係與X連接，例如經肽鍵；或 b.式(IV)：VL2-Z1-VH2且VL2係與X連接，例如經肽鍵；其中VH2表示重鏈可變域，Z1表示肽連接子及VL2表示輕鏈可變域。
  17. 如請求項12至16中任一項之多重特異性抗體分子，其中V2為scFv或dsscFv，且V2包含下列之多肽鏈：a.式(V)：VH3-Z2-VL3且VH3係與Y連接，例如經肽鍵；或b.式(VI)：VL3-Z2-VH3且VL3係與Y連接，例如經肽鍵；其中VH3表示重鏈可變域，Z2表示肽連接子及VL3表示輕鏈可變域。
  18. 如請求項16或17之多重特異性抗體，其中Z1及/或Z2為12至25個胺基酸長度的肽連接子，例如SEQ ID NO：68給出的序列。
  19. 如請求項12至18中任一項之多重特異性抗體分子，其中X為肽連接子，例如SEQ ID NO：1或2給出的序列。
  20. 如請求項12至19中任一項之多重特異性抗體分子，其中Y為肽連接子，例如SEQ ID NO：1或2給出的序列。
  21. 如請求項19或20之多重特異性抗體分子，其中X為SEQ ID NO：2給出的序列及Y為SEQ ID NO：2給出的序列。
  22. 如請求項19或20之多重特異性抗體分子，其中X為SEQ ID NO：1給出的序列及Y為SEQ ID NO：2給出的序列。
  23. 如請求項12至22中任一項之多重特異性抗體分子，其中V1及V2中之至少一者為dsscFv或dsFv；且V1之輕鏈及重鏈可變域及/或V2之輕鏈及重鏈可變域係藉由介於兩個經改造之半胱胺酸殘基之間的雙硫鍵連接。
  24. 如請求項12至23中任一項之多重特異性抗體分子，其中V1及V2中之至少一者為dsscFv或dsFv；且V1及/或V2之重鏈及輕鏈可變域係藉由介於兩個半胱胺酸殘基之間的雙硫鍵連接，其中該對半胱胺酸殘基的位置係選自包括以下或由以下組成之群：VH37及VL95、VH44及VL100、VH44及VL105、VH45及VL87、VH100及VL50、VH100b及VL49、VH98及VL46、VH101及VL46、VH105及VL43、及VH106及VL57，其中該VH及VL值係獨立地選自所給的V1或V2。
  25. 如請求項24之多重特異性抗體分子，其中該對經改造之半胱胺酸殘基的位置為VH44及VL100。
  26. 如請求項12至25中任一項之多重特異性抗體分子，其中VH1及VL1包含對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及V1及/或V2包含對人類TNF-α具特異性之結合域。
  27. 如請求項1至26中任一項之多重特異性抗體分子，其包含三個結合 域。
  28. 如請求項27之多重特異性抗體分子，其中該三個結合域各結合不同抗原。
  29. 如請求項28之多重特異性抗體分子，其中該抗體分子包含對人類血清載體蛋白具特異性之結合域。
  30. 如請求項29之多重特異性抗體分子，其中該人類血清載體蛋白係選自由甲狀腺素-結合蛋白、轉甲狀腺素蛋白(transthyretin)、α1-酸醣蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原及白蛋白、或其任何片段組成之群。
  31. 如請求項12至30中任一項之多重特異性抗體分子，其中：a.VH1及VL1包含對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域；及b.V1包含對人類TNF-α具特異性之結合域及V2包含對人類血清載體蛋白(例如人類血清白蛋白)具特異性之結合域；或V2包含對人類TNF-α具特異性之結合域及V1包含對人類血清載體蛋白(例如人類血清白蛋白)具特異性之結合域。
  32. 如請求項1至31中任一項之多重特異性抗體分子，其中該抗體分子包含不超過一個對人類TNF-α具特異性之結合域及不超過一個對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域。
  33. 如請求項1至32中任一項之多重特異性抗體分子，其中該抗體分子不包含CH2域及/或CH3域。
  34. 如請求項1至33中任一項之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列之CDR、具有SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列之CDR、具有SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列之CDR中之至少一者。
  35. 如請求項34之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含3個重鏈CDR，其具有SEQ ID NO：85給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：86給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：87給出的CDRH3序列。
  36. 如請求項1至35中任一項之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含具有SEQ ID NO：88給出的CDRL1序列之CDR、具有SEQ ID NO：89給出的CDRL2序列之CDR及具有SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列之CDR中之至少一者。
  37. 如請求項36之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含3個輕鏈CDR，其具有SEQ ID NO：88給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：89給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：90給出的CDRL3序列。
  38. 如請求項1至37中任一項之多重特異性抗體分子，其中該對人類 TNF-α具特異性之結合域包含重鏈可變域，其包含SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：96給出的序列；與SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：96給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：96給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH2具有請求項35中所給出的序列。
  39. 如請求項1至38中任一項之多重特異性抗體分子，其中該對人類TNF-α具特異性之結合域包含輕鏈可變域，其包含SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：95給出的序列；與SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：95給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：95給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3具有請求項37中所給出的序列。
  40. 如請求項1至39中任一項之多重特異性抗體，其中該抗體包含對人類TNF-α具特異性之dsscFv且該dsscFv包含SEQ ID NO：101給出的序列；與SEQ ID NO：101給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：101給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有請求項35中所給出的序列及CDRL1、CDRL2及CDRL3具有請求項37中所給出的序列。
  41. 如請求項1至39中任一項之多重特異性抗體，其中該抗體包含對人類TNF-α具特異性之scFv且該scFv包含SEQ ID NO：99給出的序列；與SEQ ID NO：99給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：99給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有請求項35中所給出的序列及CDRL1、CDRL2及CDRL3具有請求項37中所給出的序列。
  42. 如請求項1至41中任一項之多重特異性抗體分子，其中該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含3個重鏈CDR，其具有SEQ ID NO：71給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：72給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：73給出的CDRH3序列。
  43. 如請求項1至42中任一項之多重特異性抗體分子，其中該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含3個輕鏈CDR，其具有SEQ ID NO：74給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：75給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：76給出的CDRL3序列。
  44. 如請求項1至43中任一項之多重特異性抗體分子，其中該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含重鏈可變域，其包含SEQ ID NO：78給出的序列；與SEQ ID NO：78給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：78給出的序列具有80%同一性或相似性的序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有請求項42中所給出的序列。
  45. 如請求項1至44中任一項之多重特異性抗體分子，其中該對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域包含輕鏈可變域，其包含SEQ ID NO：77給出的序列；與SEQ ID NO：77給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：77給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3具有請求項43中所給出的序列。
  46. 如請求項1至45中任一項之多重特異性抗體分子，其中該抗體包含重鏈，其包含SEQ ID NO：82給出的序列；與SEQ ID NO：82給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：82給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有請求項42中所給出的序列。
  47. 如請求項1至46中任一項之多重特異性抗體分子，其中該抗體包含輕鏈，其包含SEQ ID NO：81給出的序列；與SEQ ID NO：81給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：81給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3具有請求項43中所給出的序列。
  48. 如請求項1至47中任一項之多重特異性抗體分子，其中該抗體分子包含對人類血清白蛋白具特異性之結合域，該結合域包含3個重鏈CDR，其具有SEQ ID NO：103給出的CDRH1序列、SEQ ID NO：104給出的CDRH2序列及SEQ ID NO：105給出的CDRH3序列。
  49. 如請求項1至48中任一項之多重特異性抗體分子，其中該抗體分子包 含對人類血清白蛋白具特異性之結合域，該結合域包含3個輕鏈CDR，其具有SEQ ID NO：106給出的CDRL1序列、SEQ ID NO：107給出的CDRL2序列及SEQ ID NO：108給出的CDRL3序列。
  50. 如請求項1至49中任一項之多重特異性抗體分子，其中該對人類血清白蛋白具特異性之結合域包含重鏈可變域，其包含SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：114給出的序列；與SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：114給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：114給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有請求項48中所給出的序列。
  51. 如請求項1至50中任一項之多重特異性抗體分子，其中該對人類血清白蛋白具特異性之結合域包含輕鏈可變域，其包含SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：113給出的序列、與SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：113給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：113給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中CDRL1、CDRL2及CDRL3具有請求項49中所給出的序列。
  52. 如請求項1至51中任一項之多重特異性抗體，其中該抗體包含對人類血清白蛋白具特異性之dsscFv且該dsscFv包含SEQ ID NO：119給出的序列；與SEQ ID NO：119給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：119之序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有請求項48中所給出的序列及CDRL1、 CDRL2及CDRL3具有請求項49中所給出的序列。
  53. 如請求項1至51中任一項之多重特異性抗體，其中該抗體包含對人類血清白蛋白具特異性之scFv且該scFv包含SEQ ID NO：117給出的序列；與SEQ ID NO：117給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：117給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中CDRH1、CDRH2及CDRH3具有請求項48中所給出的序列及CDRL1、CDRL2及CDRL3具有請求項49中所給出的序列。
  54. 一種三特異性抗體分子，其包含對人類TNF-α具特異性之結合域、對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及對人類血清白蛋白具特異性之結合域，其中該抗體分子包含以下或由以下組成：a.包含SEQ ID NO：125給出的序列；與SEQ ID NO：125給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：125給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中該等CDR具有請求項35、37及42所給出的序列或由該等序列組成之第一多肽；及b.包含SEQ ID NO：131給出的序列；與SEQ ID NO：131給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：131給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中該等CDR具有請求項43、48及49中所給出的序列或由該等序列組成之第二多肽。
  55. 一種三特異性抗體分子，其包含對人類TNF-α具特異性之結合域、對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及對人類血清白蛋白具特 異性之結合域，且包含以下或由以下組成：a.包含SEQ ID NO：127給出的序列；與SEQ ID NO：127給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：127給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中該等CDR具有請求項35、37及42中所給出的序列或由該等序列組成之第一多肽；及b.包含SEQ ID NO：131給出的序列；與SEQ ID NO：131給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列；或與SEQ ID NO：131給出的序列具有至少80%同一性或相似性的序列，其中該等CDR具有請求項43、48及49中所給出的序列或由該等序列組成之第二多肽。
  56. 如請求項54或55之三特異性抗體分子，其中該抗體分子能夠中和人類TNF-α、人類IL-17A及人類IL-17F之生物活性。
  57. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至56中任一項之多重特異性抗體分子或其多肽鏈。
  58. 一種載體，其包含如請求項57之多核苷酸。
  59. 一種宿主細胞，其包含一或多種分別如請求項57或58之多核苷酸或載體。
  60. 一種宿主細胞，其包含兩種載體，各載體包含編碼如請求項1至56中任一項之多重特異性抗體分子的不同多肽鏈之多核苷酸。
  61. 一種方法，其包括自請求項59或60之宿主細胞表現多重特異性抗體分子。
  62. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至56中任一項之多重特異性抗體分子及至少一種賦形劑。
  63. 如請求項1至56中任一項之多重特異性抗體分子或如請求項62之醫藥組合物，其係用於治療。
  64. 一種治療有需要患者之方法，其包括投與治療有效量的如請求項1至56中任一項之多重特異性抗體分子或如請求項62之醫藥組合物。
  65. 一種三特異性抗體分子，其包含對人類TNF-α具特異性之結合域、對人類IL-17A及人類IL-17F具特異性之結合域及對人類血清白蛋白具特異性之結合域，且包含由SEQ ID NO：126給出的多核苷酸序列編碼之第一多肽及由SEQ ID NO：132給出的多核苷酸序列編碼之第二多肽或由該等多肽組成。
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