TWI585105B - 抗tnf/抗il-23雙特異性抗體 - Google Patents
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Description
本發明屬於醫學領域,尤其屬於針對腫瘤壞死因子α(TNFα)及介白素-23(IL-23)之雙特異性抗體的新穎領域。本發明雙特異性抗體預期適用於治療自體免疫疾病,包括諸如克羅恩氏病(CD)及潰瘍性結腸炎(UC)之發炎性腸病(IBD)、中軸型脊椎關節病(AxSpA)、類風濕性關節炎(RA)及牛皮癬性關節炎(PsA)。
自體免疫疾病由人體產生對其自身組織之免疫反應引起。自體免疫疾病通常為慢性的且可使人虛弱且甚至危及生命。一般代表諸如CD及UC之一組病症的IBD為常見的慢性復發性自體免疫疾病,其病理特徵在於腸道炎症及上皮損傷。慢性自體免疫疾病之其他形式諸如RA、AxSpA及PsA,可能影響中軸骨及/或周邊骨骼。
介白素23(IL-23)咸信為對誘發慢性炎症所需之一系列發炎細胞之活化至關重要的雜二聚細胞激素。IL-23為IL-6、IL-17、GM-CSF及IL-22分泌之上游調節因子,其由與p40次單位(p40次單位由細胞激素IL-12共用)共價成對之p19次單位(IL23p19)組成。此外,已表明,IL-23在記憶/病原T細胞發炎反應方面起重要作用且在調節先天淋巴樣細胞發炎活性方面起一定作用。有跡象表明細胞激素IL-6、IL-17、GM-CSF及IL-22之IL-23調節與包括IBD、RA及其他自體免疫疾病之發炎疾病相關聯。
腫瘤壞死因子α(TNFα)為多效性同源三聚細胞激素,其主要由單
核細胞及巨噬細胞分泌,且亦已知由CD4+與CD8+末梢血液T淋巴細胞產生。TNFα以可溶及跨膜形式表現(膜結合型前驅物形式可藉由金屬蛋白酶TNFα轉化酶(TACE)以蛋白水解方式分解成可溶性同源三聚體)。TNFα咸信在免疫細胞之調節中起一定作用且在全身性炎症,尤其急性期發炎反應中為至關重要的。過量TNFα與各種形式之自體免疫疾病相關聯,包括RA、CD及牛皮癬。
當前針對諸如IBD之自體免疫疾病的經FDA批准之治療包括通常用於治療急性炎症之皮質類固醇及生物產品,該等生物產品中之多數(諸如REMICADE®、ENBREL®及HUMIRA®)嘗試靶向且中和體內之TNFα。經批准用於治療PsA之另一生物產品包括STELARA®,其嘗試靶向細胞激素IL-12與IL-23之共用p40次單位。當前治療已展現出在一小類患者中減少一些自體免疫疾病之症狀且減緩其進展的功效。然而,大多數患者對當前可供使用之治療無反應(舉例而言,在用TNFα中和法治療之CD患者中僅30%-50%出現緩解之誘導,且12個月治療後,在23%與46%之間的患者中出現對TNFα中和法之反應丟失)。因此,仍存在用於治療包括IBD(諸如CD及UC)、RA、AxSpA及PsA之自體免疫疾病的替代療法的需要。較佳地,該等替代療法將能夠在對當前可供使用之治療無反應之大多數患者中展現出功效。
該等替代療法的一個方法可包括共同投與兩種不同生物產品(例如抗體)。共同投藥需要注射兩種獨立產品或單次注射兩種不同抗體之共調配物。儘管兩次注射准許給藥量及給藥時序之靈活性,但針對患者之順應性及疼痛感而言為不便的。此外,儘管共調配物可能提供給藥量之一定靈活性,但找到在溶液(在相對較高濃度下)中具有可接受黏度且准許兩種抗體之化學及物理穩定性的調配條件通常極具挑戰性或為不可能的,這歸因於兩種抗體之不同分子特徵。此外,共同投藥及共調配涉及兩種不同藥物療法之附加成本,其可能增加患者及/
或支付者成本。因此,仍需要用於治療自體免疫疾病之替代療法且該等替代療法較佳將包含雙特異性抗體。
美國專利公開案第2012/0251541 A1號揭示一種類似抗體之結合蛋白,其具有含針對TNFα目標之抗原結合位點及針對IL23/IL12目標(例如共用的p40次單位)之抗原結合位點的交叉雙重可變(「cross-over dual variable;CODV」)組態。美國專利第7,872,102號揭示一種針對IL-23之p19次單位的抗體,其適用於治療諸如多發性硬化症之自體免疫疾病。美國專利第6,090,382號揭示針對人類TNFα之人類抗體。WO2011/070339揭示一種針對CD、RA、PsA、AxSpA及牛皮癬之抗TNFα抗體與抗IL-23p40抗體的共投與及共調配的方法。雖有此等揭示案,但特異性結合且中和TNFα及IL-23之p19次單位兩者的高親和力中和雙特異性抗體並未描述於此等申請案之任一者中。
此外,當構築本發明雙特異性抗體時,將遇到與化學及物理穩定性相關聯之顯著問題。在起始雙特異性抗體時需要諸多改變以充分解決大量問題,諸如使物理穩定性分子表現、穩定單鏈片段可變區(scFv)之VH/VL界面、提高熱及鹽依賴性穩定性、降低聚集、提高在高濃度下之溶解度及使雙特異性抗體之結合表面中的靜電分佈再平衡,同時保持分別針對兩種靶向抗原TNFα及IL-23之p19次單位之結合親和力。
因此,仍需要中和人類TNFα及人類IL-23之單一雙特異性抗體,其中該雙特異性抗體特異性靶向人類IL-23之p19次單位且不特異性中和IL-12(其與IL-23共用共同的p40次單位)。期望提供一種熱穩定的、物理穩定的、展現低聚集,且中和人類TNFα及人類IL23p19之雙特異性抗體。亦期望提供一種包括中和人類TNFα及人類IL23p19之單一雙特異性抗體的醫藥組合物,藉此避免尋找必須滿足兩種不同的獨立抗體之不同分子特徵的調配條件之挑戰。因此,本發明力圖解決上述問
題中之一或多者。
本發明提供一種雙特異性抗體,其具有結合腫瘤壞死因子α(TNFα)之免疫球蛋白G抗體(IgG)與兩個單鏈可變片段(scFv)的結合體,該等scFv結合IL-23之p19次單位(IL23p19)。根據本發明雙特異性抗體,IgG具有兩個重鏈(HC)及兩個輕鏈(LC),各HC具有含重鏈互補決定區(HCDR)1-3之重鏈可變區(HCVR1),且各LC具有含輕鏈互補決定區(LCDR)1-3之輕鏈可變區(LCVR1)。根據本發明雙特異性抗體,HCDR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:9;HCDR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:10;HCDR3之胺基酸序列為SEQ ID NO:11;LCDR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:15;LCDR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:16,且LCDR3之胺基酸序列為SEQ ID NO:17。本發明雙特異性抗體之scFv具有含HCDR4-6之重鏈可變區(HCVR2)及含LCDR4-6之輕鏈可變區(LCVR2)。根據本發明雙特異性抗體,HCDR4之胺基酸序列為SEQ ID NO:12;HCDR5之胺基酸序列為SEQ ID NO:13;HCDR6之胺基酸序列為SEQ ID NO:14;LCDR4之胺基酸序列為SEQ IDNO:18;LCDR5之胺基酸序列為SEQ ID NO:19,且LCDR6之胺基酸序列為SEQ ID NO:20。此外,本發明雙特異性抗體使各scFv經由共價連接於各IgG HC之C端及各scFv之HCVR2之N端的多肽連接子(連接子1(L1))獨立地連接至IgG抗體。此外,本發明雙特異性抗體使各scFv之HCVR2經由共價連接於HCVR2的C端及同一scFv之LCVR2的N端之第二多肽連接子(連接子2(L2))而共價連接於同一scFv之LCVR2。根據本發明雙特異性抗體,L1之胺基酸序列為SEQ ID NO:21且L2之胺基酸序列為SEQ ID NO:22。
本發明亦提供一種雙特異性抗體,其具有結合TNFα之IgG與兩個scFv的結合體,該等scFv結合IL23p19,其中IgG具有兩個重鏈及兩個輕鏈,各重鏈具有重鏈可變區(HCVR1)且各輕鏈具有輕鏈可變區
(LCVR1)。根據本發明雙特異性抗體,HCVR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:5且LCVR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:7。此外,各scFv具有重鏈可變區(HCVR2)及輕鏈可變區(LCVR2)。根據本發明雙特異性抗體,HCVR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:6且LCVR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:8。此外,各scFv經由共價連接於各IgG HC之C端及各scFv之HCVR2的N端之多肽連接子(L1)獨立地連接至IgG抗體。此外,各scFv之HCVR2經由共價連接於HCVR2的C端及同一scFv之LCVR2的N端之第二多肽連接子(L2)共價連接於同一scFv之LCVR2。
本發明進一步提供一種雙特異性抗體,其具有結合TNFα之IgG與兩個scFv的結合體,該等scFv結合IL23p19,其中IgG具有兩個HC及兩個LC。根據本發明雙特異性抗體,HC之胺基酸序列為SEQ ID NO:23且LC之胺基酸序列為SEQ ID NO:2。此外,各scFv具有重鏈可變區(HCVR2)及輕鏈可變區(LCVR2)。根據本發明雙特異性抗體,HCVR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:6且LCVR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:8。此外,各scFv經由共價連接於各IgG HC之C端及各scFv之HCVR2的N端之多肽連接子(L1)獨立地連接至IgG抗體。此外,各scFv之HCVR2經由共價連接於HCVR2的C端及同一scFv之LCVR2的N端之第二多肽連接子(L2)共價連接於同一scFv之LCVR2。根據本發明雙特異性抗體,L1之胺基酸序列為SEQ ID NO:21且L2之胺基酸序列為SEQ ID NO:22。
例示性本發明雙特異性抗體之各個區域及連接子的關係如下(胺基酸編號應用線性編號;胺基酸至可變域之分配係基於在www.imgt.org可獲得之International Immunogenetics Information System®;胺基酸至CDR域之分配係基於熟知的Kabat及North編號慣例,如表1中所反映):
本發明進一步提供一種雙特異性抗體,其中HC中之每一者與LC中之每一者形成鏈間雙硫鍵;其中HC中之每一者與另一HC形成鏈間雙硫鍵;且其中scFv中之每一者在HCVR2與LCVR2之間形成鏈內雙硫鍵。根據表1中所示之例示性本發明雙特異性抗體,HC中之每一者
與LC中之每一者之鏈間雙硫鍵形成於HC之(SEQ ID NO:1之)半胱胺酸殘基148與LC之(SEQ ID NO:2之)半胱胺酸殘基214之間;至少兩個鏈間雙硫鍵形成於兩個HC之間,第一鏈間雙硫鍵形成於HC之(SEQ ID NO:1之)半胱胺酸殘基230與另一HC之(SEQ ID NO:1之)半胱胺酸殘基230之間,第二鏈間雙硫鍵形成於HC之(SEQ ID NO:1之)半胱胺酸殘基233與另一HC之(SEQ ID NO:1之)半胱胺酸殘基233之間;且scFv之鏈內雙硫鍵形成於HCVR2之(SEQ ID NO:1之)半胱胺酸殘基508與LCVR2之(SEQ ID NO:1之)半胱胺酸殘基699之間。
根據本發明之一些實施例,提供包含HC之糖基化的雙特異性抗體。根據表1中所示之例示性本發明雙特異性抗體,HC之糖基化發生於SEQ ID NO:1之天冬醯胺殘基301處。
本發明亦提供一種DNA分子,其包含編碼多肽鏈之聚核苷酸序列,該多肽鏈包含本發明雙特異性抗體之HC、scFv、L1及L2。根據本發明之一實施例,經編碼多肽鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO:1。
本發明亦提供一種DNA分子,其包含編碼第二多肽鏈之聚核苷酸序列,該第二多肽鏈包含本發明雙特異性抗體之LC。根據本發明之一實施例,第二經編碼多肽鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO:2。
本發明亦提供一種DNA分子,其包含編碼多肽鏈之聚核苷酸序列且包含編碼第二多肽鏈之第二聚核苷酸序列,該多肽鏈包含本發明雙特異性抗體之HC、scFv、L1及L2,該第二多肽鏈包含本發明雙特異性抗體之LC。根據本發明之一實施例,包含HC、scFv、L1及L2之經編碼多肽鏈的胺基酸序列為SEQ ID NO:1,且含有SEQ ID NO:3之DNA序列的表現載體編碼該多肽鏈。此外,根據本發明之一實施例,第二經編碼多肽鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO:2,且含有SEQ ID NO:4之DNA序列的表現載體編碼該第二多肽鏈。
本發明亦提供包含本發明DNA分子之哺乳動物細胞,其中該細
胞能夠表現本發明雙特異性抗體,該雙特異性抗體包含結合TNFα之IgG與兩個scFv的結合體,該等scFv結合IL23p19。
本發明亦提供經本發明DNA分子轉型之哺乳動物細胞,其中該細胞能夠表現本發明雙特異性抗體,該雙特異性抗體包含結合TNFα之IgG與兩個scFv的結合體,該等scFv結合IL23p19。
本發明亦提供用於產生本發明雙特異性抗體之方法,該方法包含:在使得雙特異性抗體得到表現之條件下培養本發明哺乳動物細胞;及回收經表現之雙特異性抗體。本發明亦提供藉由該方法產生之本發明雙特異性抗體。
本發明亦提供治療自體免疫疾病之方法,其包含向有需要之患者投與有效量之本發明雙特異性抗體。
本發明亦提供治療諸如CD及UC之IBD的方法,其包含向有需要之患者投與治療有效量之本發明雙特異性抗體。
本發明亦提供治療RA、AxSpA及PsA之方法,其包含向有需要之患者投與治療有效量之本發明雙特異性抗體。
本發明亦提供本發明雙特異性抗體,其用於療法中。
本發明亦提供本發明雙特異性抗體,其用於治療包括諸如CD及UC之IBD的自體免疫疾病。
本發明亦提供本發明雙特異性抗體,其用於治療包括RA、AxSpA及PsA之自體免疫疾病。
本發明亦提供一種醫藥組合物,其包含本發明雙特異性抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
本發明之另一實施例包含本發明雙特異性抗體在製造用於治療潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病之藥劑中的用途。
本發明之一額外實施例包含本發明雙特異性抗體在製造用於治療類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎及中軸型脊椎關節病之藥劑中的
用途。
當在本文中使用時,術語「雙特異性抗體」係指包含免疫球蛋白G抗體(IgG)與兩個單鏈可變片段(scFv)結合之分子。如本文中所提及,本發明雙特異性抗體包含藉由多肽連接子(L1)共價連接於IgG之HC的羧基端之一個scFv,及藉由多肽連接子(L1)共價連接於IgG之另一HC的羧基端之另一scFv。本發明雙特異性抗體之IgG及scFv特異性結合不同抗原(分別結合TNFα及IL-23之p19次單位)。
當在本文中使用時,術語「免疫球蛋白G抗體」(IgG)係指由四個多肽鏈構成之免疫球蛋白分子:藉由雙硫鍵互連之兩個重鏈(HC)及兩個輕鏈(LC)。四個多肽鏈中之每一者之胺基端部分包括主要負責抗原識別之具有約100至110個或110個以上胺基酸的可變區。四個多肽鏈中之每一者之羧基端部分定義主要負責效應功能之恆定區。各重鏈之羧基端部分經由多肽連接子(L1)共價連接於單鏈可變片段(scFv)中之一者。
本發明雙特異性抗體之IgG的輕鏈(LC)分類為κ或λ,且以如此項技術中已知之特定恆定區為特徵。根據本發明IgG之重鏈(HC)分類為γ,其定義同型(例如作為IgG)。同型可進一步分成子類(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。各HC類型以此項技術中已知的特定恆定區為特徵。各HC由N端重鏈可變區(「HCVR」)及重鏈恆定區(CH)構成。根據本發明,IgG之CH由三個域(CH1、CH2及CH3)構成。IgG之各輕鏈由輕鏈可變區(LCVR)及輕鏈恆定區(CL)構成。HCVR及LCVR區可進一步再分成高變區,高變區稱為互補決定區(CDR),穿插有稱為構架區(FR)的較保守之區。根據本發明之IgG之各HCVR及LCVR由三個CDR及四個FR組成,自胺基端至羧基端按以下次序排列:FR1-1、CDR1、FR1-2、CDR2、FR1-3、CDR3、FR1-4。在本文中,HC之3個
CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」且LC之3個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」。CDR含有與抗原形成特定相互作用之大部分殘基。抗體結合特定抗原之功能性能力很大程度上受六個CDR影響。
如本文中所提及,術語「單鏈可變片段」(scFv)係指包含經由多肽連接子(L2)連接之重鏈可變區(HCVR2)及輕鏈可變區(LCVR2)的多肽鏈。此外,如本文中所提及(且如以下示意圖所表示),各scFv之HCVR2:a.)在其N端處經由多肽連接子(L1)共價連接於IgG之一個HC的C端;且b.)在其C端處經由第二多肽連接子(L2)共價連接於同一scFv之LCVR2的N端。此外,本發明各scFv包括形成於同一多肽鏈之HCVR2的半胱胺酸殘基與LCVR2之半胱胺酸殘基之間的雙硫鍵(如以下示意圖所表示):
scFv之HCVR2及LCVR2可進一步再分成高變區,高變區稱為互補決定區(CDR),穿插有稱為構架區(FR)的較保守之區。根據本發明之IgG之各HCVR2及LCVR2各自由三個CDR及四個FR組成,自胺基端至羧基端按以下次序排列:FR2-1、CDR4、FR2-2、CDR5、FR2-3、CDR6、FR2-4。在本文中,scFv之HCVR2的3個CDR稱為「HCDR4、HCDR5及HCDR6」且scFv之LCVR2的3個CDR稱為「LCDR4、LCDR5及LCDR6」。CDR含有與抗原形成特定相互作用之大部分殘基。scFv結合特定抗原之功能性能力很大程度上受六個CDR影響。
根據本發明,IgG及scFv之各輕鏈/重鏈對之可變區分別形成雙特異性抗體之抗原結合位點。根據本發明,IgG具有兩個相同(但與scFv之抗原結合位點不同)的抗原結合位點,且各scFv具有抗原結合位點(其與另一scFv之抗原結合位點相同)。如本文所用,「抗原結合部分」或「抗原結合位點」或「抗原結合區」或「抗原結合片段」可互換地指IgG或scFv分子之可變區內含有與抗原相互作用且賦予雙特異性抗體針對抗原之特異性及親和力之胺基酸殘基的部分。此抗體部分包括維持抗原結合殘基之恰當構形所需的構架胺基酸殘基。較佳地,本發明雙特異性抗體之構架區來源於人類或實質上來源於人類。
如本文中可互換使用,「親本抗體(parent antibody)」或「親本抗體(parental antibody)」為由如下胺基酸序列編碼之抗體,該胺基酸序列用於例如經由胺基酸取代及結構更改來製備雙特異性抗體之IgG及scFv中之一者。親本抗體可為鼠類嵌合人類化抗體或人類抗體。
術語「Kabat編號」或「Kabat標記」在本文中可互換使用。此項技術中所公認之此等術語係指對可變性高於(亦即高變)抗體之重鏈及輕鏈可變區中的其他胺基酸殘基之胺基酸殘基進行編號的系統(Kabat等人,Ann.NY Acad.Sci.190:382-93(1971);Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號(1991))。
術語「North編號」或「North標記」在本文中可互換使用。此項技術中所公認之此等術語係指對可變性高於(亦即高變)抗體之重鏈及輕鏈可變區中的其他胺基酸殘基之胺基酸殘基進行編號的系統,且該編號系統至少部分基於含大量晶體結構之近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering),如North等人,A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations,Journal of Molecular Biology,406:228-256(2011)中所述。
本文中可互換使用之術語「患者」、「個體(subject)」及「個體(individual)」係指動物,較佳地,該術語係指人類。在某些實施例中,個體,較佳人類之特徵進一步在於將受益於IL-23及TNFα兩者之經降低含量或經降低生物活性的疾病或病症或病狀(例如自體免疫病症)。在另一實施例中,個體,較佳人類進一步描述為面臨患上將受益於IL-23及TNFα兩者之經降低含量或經降低生物活性的病症、疾病或病狀的風險。
當構築本發明雙特異性抗體時,將遇到與化學及物理穩定性相關聯之顯著問題。所遇到之問題包括不良表現至無表現、不良純化回收、低熱穩定性、高鹽依賴性聚集、雙功能抗體形成(及經由純化減少雙功能抗體之挑戰)、高溶液黏度、低結合親和力及交叉反應性。
舉例而言,構築根據本發明之雙特異性抗體之初始嘗試包括以下構築體,其中親本IL-23抗體(美國專利第7,872,102號中所述之IL-23抗體)包含IgG抗體部分且親本TNFα抗體(阿達木單抗(Adalimumab),參見例如美國專利第6,090,382號)包含雙特異性抗體之scFv部分。其他初始嘗試之構築體包括包含scFv部分之親本IL-23抗體,同時TNFα抗體包含雙特異性抗體之IgG部分。此外,初始構築體包括按各種組態與IgG部分結合之scFv部分,包括分別在重鏈及輕鏈之胺基端或羧基端處與IgG部分結合。此外,初始構築體包括在HCVR2及LCVR2之排列方面不同之scFv部分(例如IgG部分(C端或N端)-連接子1-LCVR2或HCVR2-連接子2-LCVR2或HCVR2中之另一者)。此外,親本IL-23抗體構築體包括重鏈生殖系構架VH 5-51及1-69及輕鏈生殖系構架VK 02、VK 12及VK B3之組合。親本TNFα抗體構築體(當包含IgG部分時)包括在恆定區(CH)內具有三個胺基酸突變(來自原生IgG4)之IgG4子類結構。將初始構築體選殖至人類IgG4-Fc哺乳動物表現載體中。然
而,(如上文所述之)最初產生的雙特異性構築體展現出一或多種上文所述之化學及/或物理問題。
計算雙特異性抗體之靜電表面,且識別且破壞帶電片。進行廣泛的蛋白質穩定性研究,且針對熱穩定性以及TNFα及IL-23結合(相對於各別親本抗體)特性篩選經構築之雙特異性抗體。
因此進行化學及物理修飾以改良本發明雙特異性抗體的化學及物理穩定性。在HCDR4、HCDR5、LCDR4、LCDR5及LCDR6中對呈scFv形式之親本IL-23抗體進行修飾以改良化學及物理穩定性。將經構築之HCVR及LCVR組合成根據下式之IL-23 scFv形式:TNFα IgG(C端)-L1-HCVR2-L2-LCVR2。為使IL-23 scFv穩定,在IL-23 scFv之HCVR2(G508C)與LCVR2(G699C)之間工程改造雙硫鍵(胺基酸之編號應用基於表1所示之例示性雙特異性抗體的線性編號)。此外,將雙特異性抗體之IgG部分中之親本TNFα抗體工程改造為IgG1子類以改良包括溶解度之生物化學特性且減少聚集。將包含此等化學及物理修飾的經工程改造之IL-23 scFv構築體及TNFα IgG構築體插入至IgG1表現載體中。
含有呈IgG1子類形式之TNFα IgG及具有六個CDR突變(相對於親本IL-23抗體:在K28P及T54V處之HCVR;及在L30G、L53K、E54L及M90Q處之LCVR,胺基酸編號之分配係基於熟知之Kabat編號慣例)(如表1中所反映之例示性雙特異性抗體所示:在K492P及T522V處之HCVR;及在L629G、L653K、E654L及M689Q處之LCVR,胺基酸之編號係基於線性編號)之IL-23 scFv的雙特異性抗體經鑑定為改良初始構築體中所顯示之表現、親和力(IL-23相對於親本分子之親和力)及熱穩定性問題。此外,此等突變引起食蟹獼猴體內清除率明顯降低。未在親本單一抗體之初始表徵中鑑別到以上修飾。
本發明雙特異性抗體在活體外或活體內結合人類TNFα及人類IL23p19且中和至少一種人類TNFα生物活性與至少一種人類IL-23生物活性。本發明雙特異性抗體在活體外在存在與不存在TNFα之情況下為IL-23之強力抑制劑。本發明雙特異性抗體在活體外在存在或不存在IL-23之情況下為可溶性及膜結合TNFα之強力抑制劑。
本發明雙特異性抗體進一步表徵為在37℃下具有在96±3.5pM之範圍內的與人類TNFα之結合親和力(KD)及在121±8.5pM之範圍內的與人類IL23p19之結合親和力(KD)。雙特異性抗體可有效中和可溶性以及膜結合TNFα,且此中和不受飽和量之人類IL-23的存在的影響。雙特異性抗體可有效中和人類IL-23,且此中和不受飽和量之人類TNFα的存在的影響。
能夠指導與之可操作連接的基因之表現的表現載體在此項技術中為熟知的。表現載體可編碼有助於自宿主細胞分泌多肽的信號肽。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽。第一多肽鏈(包含HC、scFv、L1及L2)與第二多肽鏈(包含LC)可在一個載體中由與其可操作連接之不同啟動子獨立表現,或替代性地,第一多肽鏈及第二多肽鏈可在兩個載體中由與其可操作連接之不同啟動子獨立表現,一個表現第一多肽鏈且一個表現第二多肽鏈。
宿主細胞包括用一或多個表現本發明之第一多肽鏈、第二多肽鏈或第一多肽鏈及第二多肽鏈的表現載體穩定或瞬時轉染、轉型、轉導或感染的細胞。產生本發明雙特異性抗體之宿主細胞株的產生與分離可使用此項技術中已知之標準技術實現。哺乳動物細胞為用於表現雙特異性抗體之較佳宿主細胞。特定哺乳動物細胞為HEK 293、NS0、DG-44及CHO。較佳地,將雙特異性抗體分泌至培養宿主細胞之培養基中,可自其回收或純化雙特異性抗體。
此項技術中熟知抗體之哺乳動物表現引起糖基化。通常,糖基化發生在抗體之Fc區中的高度保守N-糖基化位點。N-聚糖通常與天冬醯胺連接。舉例而言,表1中所示之例示性雙特異性抗體的各HC在SEQ ID NO:1之天冬醯胺殘基301處糖基化。
編碼第一多肽鏈(包含本發明之HC、scFv、L1及L2且具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列)之特定DNA聚核苷酸序列為:
(SEQ ID NO:3)。
編碼第二多肽鏈(包含本發明之LC,具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列)之特定DNA聚核苷酸序列為:
(SEQ ID NO:4)。
已將雙特異性抗體分泌至其中之培養基可藉由習知技術純化。舉例而言,可使用習知方法將培養基應用於蛋白A或G柱且自其溶離。可藉由常用技術,包括尺寸排阻、疏水相互作用、離子交換或羥基磷灰石層析,有效移除可溶性聚集體及多聚體。可立即冷凍產物,例如在-70℃下,或可凍乾產物。
在一些情況下,產生本發明雙特異性抗體之方法可能導致形成雙功能抗體。雙功能抗體為scFv之二價形式,其中HCVR2及LCVR2區表現於單一多肽鏈上,但並非可變域與同一多肽鏈之互補域配對,而為可變域與另一多肽鏈或不同分子之互補域配對。舉例而言,若雙特異性抗體包含兩個第一多肽(為方便起見,1A及1B,其中1A與1B中之每一者包含HC、scFv、L1及L2)及兩個第二多肽(為方便起見,2A及2B,其中2A及2B中之每一者包含LC),則1A之HCVR2與1B之LCVR2的互補域配對,而非與1A之LCVR2配對。如本文所述,自上文所述之雙特異性抗體純化出雙功能抗體可為有益的。雙功能抗體含
量在細胞表現後可大於10%且可在純化後降低至小於3%。
如本文所用,「治療(treatment)」及/或「治療(treating)」意欲指其中可存在本文所述之病症之進展減緩、中斷、遏制、控制或停止的全部方法,但未必指示全部病症症狀之完全消除。治療包括投與本發明雙特異性抗體來治療哺乳動物、尤其人類中將受益於TNFα及/或IL-23之降低量或TNFα及/或IL-23之降低生物活性的疾病或病狀,且包括:(a)抑制疾病之進一步進展,亦即遏制其發展;及(b)緩解疾病,亦即引起疾病或病症消退或緩解其症狀或併發症。
本發明雙特異性抗體預計可治療自體免疫疾病,包括IBD(諸如CD及UC)、AxSpA、RA及PsA。
本發明雙特異性抗體可併入至適用於向患者投與之醫藥組合物中。本發明雙特異性抗體可向患者單獨投與或與醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑一起以單一或多個劑量投與。該等醫藥組合物經設計成適於所選投與模式,且適當時使用醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑及/或賦形劑,諸如分散劑、緩衝劑、界面活性劑、防腐劑、增溶劑、等張劑、穩定劑及其類似者。該等組合物可根據揭示於例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy,第22版,Loyd V編,Pharmaceutical Press,2012中之習知技術設計,其提供如從業者一般已知的調配技術之概要。用於醫藥組合物之適合載劑包括與本發明雙特異性抗體組合時,保留分子活性且與患者之免疫系統無反應性的任何材料。本發明醫藥組合物包含雙特異性抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
包含本發明雙特異性抗體之醫藥組合物可使用標準投與技術向具有如本文所述之疾病或病症風險或展現出如本文所述之疾病或病症
的患者投與。
本發明醫藥組合物含有「有效」量或「治療有效」量(如在本文中可互換使用)之本發明雙特異性抗體。有效量係指達成所希望之治療結果(在劑量上及關於時間段及關於投藥手段)所必需的量。雙特異性抗體之有效量可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重,及抗體或抗體部分在個體體內引起所希望之反應的能力之因素而變化。有效量亦為治療有益作用超過雙特異性抗體之任何毒性或有害作用的量。
除非另外指出,否則整個實例中所提及之例示性雙特異性抗體係指如上文表1中所闡述之例示性本發明雙特異性抗體。
例示性雙特異性抗體基本上按下文進行表現及純化。藉由電穿孔,使用含有具有SEQ ID NO:3(編碼多肽鏈,包含IgG HC、scFv HCVR2及LCVR2及連接子L1及L2,且具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列)及SEQ ID NO:4(編碼第二多肽鏈,包含IgG LC,且具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列)之DNA的麩醯胺酸合成酶(GS)表現載體轉染中國倉鼠細胞株CHO(GS基因剔除,純系1D3)。該表現載體編碼SV早期(猴病毒40E)啟動子及GS基因。GS之表現允許生物化學合成麩醯胺酸,CHO細胞所需之胺基酸。轉染後,用50μM L-甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)對細胞進行成批選擇。利用MSX對GS之抑制來增加選擇之嚴密性。可相對於表現內源水準之GS的CHO野生型細胞選擇出將表現載體cDNA整合至宿主細胞基因組之轉錄活性區域中的細胞。以低密度塗覆經轉染之細胞池以使得穩定表現細胞接近於純系生長。針對雙特異性抗體表現篩選主要孔(masterwell),且隨後在用於生產之無血清的懸浮培養物中按比例擴大。將例示性雙特異性抗體已分泌至其中
之澄清培養基應用於已用諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)之相容緩衝液平衡的蛋白A親和柱。洗滌該柱以移除非特異性結合組分。所結合之雙特異性抗體例如藉由pH梯度(諸如0.1M磷酸鈉緩衝液pH 6.8至0.1M檸檬酸鈉緩衝液pH 2.5)溶離且用Tris pH 8緩衝液中和。雙特異性抗體溶離份諸如藉由SDS-PAGE或分析型尺寸排阻偵測,且隨後合併。可藉由常見技術,包括尺寸排阻、疏水相互作用、離子交換或羥基磷灰石層析有效移除可溶性聚集體及多聚體。使用常用技術濃縮及/或無菌過濾雙特異性抗體。此等層析步驟後例示性雙特異性抗體之純度大於98.6%(單體)。雙特異性抗體可在-70℃下立即冷凍或在4℃下儲存數月。
在10mM檸檬酸鹽pH 6.0中調配例示性雙特異性抗體。將雙特異性抗體濃縮至1mg/mL、50mg/mL及100mg/mL(使用Amicon U.C.過濾器,Millipore,目錄號UFC903024)。在4℃與25℃中之一個溫度下培育濃縮至1mg/mL之樣本,持續4週時間,且在4℃與25℃中之一個溫度下與25或150mM NaCl一起培育濃縮至50及100mg/mL之樣本,持續4週時間。
培育後,用尺寸排阻層析(SEC),使用TSKgel Super SW3000(Tosoh Bioscience產品編號18675)柱分析樣本之高分子量百分比(HMW%)。將50mM磷酸鈉+350mM NaCl,pH 7.0用作移動相,以0.4mL/min運作15分鐘。將5μL體積(5μg)之經濃縮抗體注射至柱內且在214nm下進行偵測。針對高濃度樣本,將1μL體積(50μg或100μg)注射至柱內且在280nm下進行偵測。使用ChemStation分析層析圖且使用單體峰前所溶離出之峰的AUC與總AUC之比計算高分子量(HMW)%。結果概述於表2中。
表2:藉由SE-HPLC所量測,歷經4週,高分子量物質相對於初始對照
亦藉由毛細管等電聚焦(cIEF)分析,使用Beckman-PA800 plus系統,根據製造商說明書分析濃縮至1mg/mL之樣本的樣本降解。結果概述於表3中。
亦藉由液相層析-質譜(LC-MS)分析,使用Thermo Scientific離子阱LC-MS系統,根據製造商說明書分析濃縮至1mg/mL且在40℃下儲存之樣本來鑑別肽鍵裂解。無雙特異性抗體區域顯示出大於2%之肽鍵裂解。僅第一經編碼多肽鏈(例示性雙特異性抗體之SEQ ID NO:1)之鉸鏈區(1.8%)及連接子L1(1.1%)顯示出大於1%之肽鍵裂解。
在一週培育期後,在4℃、-5℃及-10℃下分析例示性雙特異性抗體之溶解性。對濃縮至100mg/mL與150mg/mL之間(使用Amicon U.C.過濾器,Millipore,目錄號UFC903024)且在包括150mM NaCl之pH 6.0 10mM檸檬酸鹽中所調配之雙特異性抗體評定溶解性。例示性雙特異性抗體在培育期後展現出良好溶解性且無相分離。
在室溫下分析例示性雙特異性抗體之黏度。對濃縮至100mg/mL(使用Amicon U.C.過濾器,Millipore,目錄號UFC903024)且在包括150mM NaCl之pH 6.0 10mM檸檬酸鹽中所調配之雙特異性抗體評定黏度。例示性雙特異性抗體展現良好黏度,在100mg/mL下為4.2cp,而其他初始嘗試之構築體顯示不可接受之高黏度(>9cP)。
歸因於弱雙特異性抗體表現、雙特異性抗體降解/截割、在相對較高濃度下不可接受之高溶液黏度及低親和力(相對於親本抗體),包含親本TNFα抗體及親本IL-23之雙特異性抗體的初步研究為不可能的。然而,例示性本發明雙特異性抗體之初步研究展現出出人意料之有益特性,包括雙特異性抗體之表現及出人意料之有益化學及物理穩定性及溶解性。如初步資料所顯示,本發明雙特異性抗體展現低HMW聚集、良好溶解性、溶液中之良好黏度、包括低降解水準及低肽鍵裂解之增加的物理穩定性,且維持針對TNFα及IL-23之p19次單位兩者之親和力。
在Biacore T100儀器上使用表面電漿子共振分析法測定例示性雙特異性抗體與人類IL-23及人類TNFα之結合親和力及結合化學計量,該儀器用HBS-EP+(10mM Hepes pH7.4+150mM NaCl+3mM EDTA+0.05%(w/v)界面活性劑P20)操作緩衝液激發(prime)且分析溫度設定在37℃。在全部四個流槽(Fc)上使用含有固定蛋白A(使用標準NHS-EDC胺類偶合所產生)之CM5晶片(Biacore P/N BR-100530)以採用捕捉方法。藉由在操作緩衝液內稀釋製備10μg/mL之抗體樣本。藉由在操作緩衝液內稀釋製備最終濃度為20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.62及0(空白)nM之人類IL-23。藉由在操作緩衝液內稀釋製備最終濃度為50.0、25.0、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.19及0(空白)nM之人類TNFα。
各分析週期由以下步驟組成:(1)在各別流槽(Fc2及Fc3)上捕捉抗體樣本;(2)在全部Fc上,以80μL/min注射各人類IL-23濃度,持續200秒,隨後返回至緩衝液流,持續1800秒以監測解離相;(3)在全部Fc上,以50μL/min注射各人類TNFα濃度,持續250秒,隨後返回至緩衝液流,持續1200秒以監測解離相;(4)藉由在全部流槽上以80
μL/min注射10mM甘胺酸,pH 1.5,持續60秒,再生出晶片表面;及(5)藉由注射10μL(60秒)HBS-EP+平衡晶片表面。使用標準雙重參考處理資料且使用Biacore T100評估軟體2.0.3版,與1:1結合模型擬合,從而確定締合速率(kon,M-1s-1單位)、解離速率(koff,s-1單位)及Rmax(RU單位)。由關係式KD=koff/kon計算平衡解離常數(KD),且KD以莫耳單位計。
此等結果表明例示性本發明雙特異性抗體在37℃下以高親和力結合人類IL-23及人類TNFα。
使用BIAcore T100儀器來測定人類IL-23及人類TNFα是否可與雙特異性抗體同時結合。除非有所指出,否則所有試劑與材料皆購自BIAcore AB(Upsala,Sweden)。所有量測在37℃下進行。HBS-EP+緩衝液(150mM氯化鈉、3mM EDTA、0.05%(w/v)界面活性劑P-20及10mM HEPES,pH 7.4)用作操作緩衝液及樣本緩衝液。使用胺類偶合套組將蛋白A固定於CM5感測器晶片之流槽1及流槽2上。例示性雙特異性抗體(稀釋至1μg/ml)首先捕捉於流槽2上(以80μl/min注射4秒,得到95.3反應單位(△RU)之雙特異性抗體捕捉),隨後注射100nM人類TNFα 5分鐘以飽和TNFα結合位點(觀測到32.4△RU之結合信號)。流槽1為僅含蛋白A之對照。結合TNFα(流槽2)後,隨後注射100nM人類IL-23 5分鐘且觀測到額外結合信號(57.3△RU)。隨後使用10mM甘胺酸pH 1.5再生晶片表面。重複同一方法,但改為人類IL-23先,人
類TNFα後之相反次序。此等結果表明例示性本發明雙特異性抗體可同時結合人類IL-23及人類TNFα,如藉由與雙特異性抗體結合之兩個配位體的反應單位增加(來自TNFα之初始32.4 RU及隨後來自IL-23之額外57.3 RU)所示。
Kit225細胞為天然表現IL-23受體之人類T細胞淋巴球性白血病細胞株。Kit225細胞與人類IL-23之培育使得由IL-23R/JAK激酶介導之Stat3之磷酸化快速增加,其可使用市售ELISA量測。
Kit225細胞常規培養於分析培養基(含有10%FBS、10ng/ml人類IL-2及1×青黴素(penicillin)加嘌呤黴素(puromycin)之RPMI 1640)中。在分析日搜集細胞,用大量無血清RPMI 1640培養基洗滌,隨後以5×106個/毫升再懸浮於無血清RPMI 1640中。將500,000個Kit225細胞/孔(呈100μL)添加至U形底96孔培養盤之孔中。將96孔盤置放於培育箱中且在37℃下使細胞饑餓3小時。
藉由1:3稀釋評估100nM至0.5pM之例示性雙特異性抗體劑量範圍(雙特異性抗體之Mw為200kDa)。用(2ng/ml)重組人類IL-23在37℃下預培育各測試濃度之例示性雙特異性抗體30分鐘。分析培養基用於「單獨培養基」及「含2ng/ml IL-23之培養基」對照。靶向IL-23之p19次單位的IL-23中和抗體(美國專利第7,872,102號中所述之親本IL-23抗體)在分析中用作陽性對照且在與雙特異性抗體相同之莫耳範圍下進行測試。亦用(2ng/ml)重組人類IL-23在37℃下預培育對照抗體30分鐘。預培育後,將抗體/IL-23混合物轉移至Kit225細胞中且在37℃下培育15分鐘。
在分析結束時,對培養盤進行離心(在4℃下,3000rpm,2分鐘)且隨後丟棄上清液。將裂解緩衝液(100μL,含有磷酸鹽/蛋白酶抑制劑)添加至細胞中且隨後在冰上培育5分鐘。培育後,對細胞進行離心
(在4℃下,3000rpm,5分鐘)。離心後,將100μL上清液轉移至96孔盤(預塗佈有抗Stat 3抗體)中用於培育隔夜(4℃)。在藉由ELISA量測Stat 3磷酸化當日,在室溫下使96孔盤升溫且根據製造商說明書(Cell Signaling Inc.,目錄號7146)進行ELISA以測定Stat 3磷酸化程度。ELISA反應後,在微定量盤式讀取器(Molecular Devises SpectraMax 190)上在450nm下讀取96孔盤。結果表示為50%之經IL-23誘導之Stat 3磷酸化經雙特異性抗體或陽性對照抑制之濃度(IC50),且該濃度使用資料之4參數S形擬合(GraphPad Prism)計算。
結果表明,例示性本發明雙特異性抗體以濃度依賴性方式抑制Kit225細胞中由人類IL-23誘導之Stat 3磷酸化。該抑制與用陽性對照IL-23p19抗體所觀察到之結果相當(雙特異性抗體之IC50為158±26pM,與其相對,陽性對照IL-23p19抗體為75±7pM(來自三次獨立實驗之平均IC50±SEM))。陰性對照抗體在所測試之任何濃度下均不抑制Kit225細胞中之Stat 3磷酸化。例示性本發明雙特異性抗體可有效中和IL-23。
L929細胞為天然表現TNF受體之小鼠纖維肉瘤細胞。使L929細胞與人類TNFα一起培育導致快速細胞死亡,這歸因於形成過量反應性氧中間體。可使用MTT細胞毒性分析法量測細胞死亡,其中活細胞中之粒線體琥珀酸去氫酶(succinate dehydrogenase)將四唑鎓鹽還原成甲產物,其可用微定量盤式讀取器(Molecular Devices SpectriMax 190)偵測。
評估20nM至10pM之劑量範圍(雙特異性抗體之Mw為200kDa)。將各測試濃度之例示性雙特異性抗體(100μL)添加至含有200pg/mL重組人類TNFα及6.25μg/mL放線菌素D之孔中。每次處理,以一式兩孔進行測試。在分析中,使用TNFα抗體,即含IgG1同型之阿達木單抗
(親本TNFα抗體,參見例如美國專利第6,090,382號)作為陽性對照。人類IgG1同型對照抗體用作陰性對照。在與例示性雙特異性抗體相同之莫耳劑量範圍下測試對照抗體。將含有抗體混合物之培養盤在室溫下培育60分鐘。
在分析培養基(1×DMEM Cellgro、10%FBS、1%青黴素-鏈黴素(Pen-Strep)、1%MEM必需胺基酸、1%L-麩醯胺酸、1%丙酮酸鈉)中常規培養L929細胞。在分析日,用1×PBS(無Ca++或Mg++)沖洗細胞且用0.25%胰蛋白酶+EDTA將細胞與培養瓶分開。用分析培養基使胰蛋白酶失去活性。在室溫下以215×g使L929細胞離心5分鐘。將細胞集結粒再懸浮於分析培養基中。用血球計量測細胞密度且將10,000個L929細胞(呈100μL)添加至96孔盤中且置放於組織培養恆溫箱(37℃,95%相對濕度,5%CO2)中隔夜。將抗體/TNFα/放線菌素D混合物轉移至含L929黏附細胞之96孔盤中且培育(37℃,95%相對濕度,5%CO2)18小時。移除分析培養基且將MTT受質混合物添加至孔(120μL)中。將培養盤置放在37℃,95%相對濕度,5%CO2下3小時。藉由在微定量盤式讀取器(Molecular Devices SpectraMax 190)上在490nm下讀取培養盤來測定細胞死亡。結果表示為50%之經TNFα誘導之反應經雙特異性抗體或陽性對照抗體抑制之濃度(IC50)(三次獨立實驗之平均值±SEM),該濃度使用資料之4參數S形擬合(GraphPad Prism)計算。
結果表明,例示性本發明雙特異性抗體以濃度依賴性方式以233±20pM之IC50抑制人類TNFα誘導殺死L929細胞。此抑制與陽性對照抗體阿達木單抗(IC50=250±24pM)所觀察到之結果相當,而陰性對照抗體不抑制人類TNFα。例示性本發明雙特異性抗體可有效中和人類TNFα。
為研究雙特異性抗體抑制膜結合TNFα之能力,使用此前所說明
的一組突變使TNFα之已知裂解位點失去活性,從而允許生物活性TNFα在不存在TNFα裂解之情況下在細胞表面上表現(Mueller等人,1999)。將不可裂解之TNFα構築體穩定轉染至中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中。此等細胞表現膜結合TNFα,如藉由流動式細胞測量術所示。使L929細胞與表現人類不可裂解之結合TNFα之CHO細胞一起培育導致L929細胞快速死亡。
將表現膜結合人類TNFα之CHO細胞常規維持於選擇培養基(AM2001培養基,無MSX之內部CHO生長培養基,8mM麩醯胺酸,GS補充劑,含500μg/mL G418之HT補充劑)中。在分析日,對細胞進行計數,用1×PBS(無Ca++或Mg++)沖洗,以215×g離心5分鐘且以50,000個細胞/毫升與放線菌素D(6.25μg/mL最終濃度)一起再懸浮於L929分析培養基中。將500個細胞(呈10μL)之細胞懸浮液添加至各濃度之抗體混合物中,其在37℃,95%相對濕度,5%CO2下培育60分鐘。將含有抗體、膜結合人類TNFα CHO細胞、放線菌素D之混合物轉移至含L929黏附細胞之96孔盤中且在37℃,95%相對濕度,5%CO2下培育18小時。使用如上文針對可溶性TNFα L929分析所述之MTT細胞毒性分析法量測細胞死亡。結果表示為50%之經TNFα誘導之反應經雙特異性抗體或陽性對照抗體抑制之濃度(IC50)(三次獨立實驗之平均值±SEM)。
結果表明,例示性本發明雙特異性抗體以濃度依賴性方式以755±297pM之IC50抑制人類不可裂解之膜結合TNFα CHO細胞殺死L929細胞。此抑制與陽性對照抗體(含IgG1同型之阿達木單抗,IC50=581±201pM)所觀察到之結果相當,而陰性對照抗體不抑制人類TNFα。例示性本發明雙特異性抗體可有效中和膜結合人類TNFα。
投與人類IL-23誘導小鼠IL-22(mIL-22)在正常Balb C小鼠活體內
之表現。藉由本發明雙特異性抗體(其不與小鼠IL-23或小鼠TNFα交叉反應)阻斷此經人類IL-23誘導之mIL-22活體內表現。
向正常Balb C小鼠(N=8)腹膜內注射50nmol/kg例示性雙特異性抗體(分子量200kDa)或陰性對照抗體(人類IgG1同型抗體,50nmol/kg,分子量150kDa)。注射後三天,藉由腹膜內注射50nmol/kg人類IL-23攻擊小鼠。IL-23攻擊後5小時,將小鼠處死且收集血漿。根據製造商說明書,藉由市售ELISA(eBioscience,目錄號88-7422-86),針對小鼠IL-22表現分析所收集之血漿。
結果表明,例示性本發明雙特異性抗體阻斷人類IL-23誘導增加mIL-22表現。此抑制與未經處理之小鼠體內所觀察到之小鼠IL-22含量相當(p<0.0001,ANOVA,隨後塔基多重比較檢定(Turkey's Multiple Comparison test)),而陰性對照抗體不抑制人類IL-23誘導增加mIL-22之表現。本發明雙特異性抗體可有效中和人類IL-23。
投與人類TNFα活體內誘導出普通Balb C小鼠血漿中之小鼠CXCL1含量快速且暫時增加。藉由例示性本發明雙特異性抗體(其不與小鼠IL-23或小鼠TNFα交叉反應)活體內阻斷此人類TNFα誘導之小鼠CXCL1含量增加。
向普通Balb C小鼠(N=8)腹膜內注射:(a)18nmol/kg雙特異性抗體;(b)18nmol/kg陽性對照抗TNFα抗體(具有IgG1同型之阿達木單抗);或(c)18nmol/kg陰性對照抗體(人類IgG1同型抗體)。注射後三天,藉由腹膜內注射18nmol/kg人類TNFα攻擊小鼠。TNFα攻擊後兩小時,將小鼠處死且收集血漿。根據製造商說明書,藉由市售MSD分
析(Masol Scale Discovery,目錄號K152QTG-1),針對小鼠CXCL1含量分析所收集之血漿。
結果表明,相對於接受陰性對照抗體之動物,例示性本發明雙特異性抗體顯著抑制人類TNFα誘導產生CXCL1(p<0.0001,ANOVA,隨後塔基多重比較檢定)。雙特異性抗體對CXCL1產生之減少量與用陽性對照抗體所觀察到之結果相當。因此,例示性本發明雙特異性抗體可有效中和小鼠中由人類TNFα誘導之生物效應。
為比較雙特異性抗體之血清藥物動力學與親本IL-23抗體(美國專利第7,872,102號中所述之IL-23抗體)之血清藥物動力學,向雄性食蟹獼猴投與5mg/kg例示性雙特異性抗體(靜脈內(N=2);或皮下(N=2))或5mg/kg親本IL-23抗體(靜脈內(N=3))。在10mM檸檬酸鹽(pH 6.0)、150mM NaCl、0.02%Tween 80之溶液中製備例示性雙特異性抗體。在磷酸鹽緩衝鹽水(pH約7.4)溶液中製備親本IL-23抗體。
投與前,自各食蟹獼猴收集大約1.5mL血液。投與後,在投與後1小時(僅靜脈內)、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、168小時、240小時、336小時、432小時、504小時、600小時及672小時收集血液(大約1.5mL)。自股靜脈靜脈內收集血液樣本至血清分離管內(例如不含抗凝血劑)且對血清進行處理。
藉由全部人類IgG ELISA,利用親和純化F(ab')2片段山羊抗人類IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)作為塗佈於ELISA培養盤(Thermo ScientificTM Immulon® 4HBX)上之捕捉試劑來分析血清樣
本。將血清樣本(100μL)添加至ELISA培養盤之個別孔內且在25℃下培育60分鐘。培育後,將100μL(10,000倍稀釋)小鼠抗人類IgG Fc-HRP(Southern Biotech)添加至ELISA培養盤之孔內以用於偵測例示性雙特異性抗體,且將100μL(10,000倍稀釋)小鼠抗人類IgG4 Fc-HRP(Southern Biotech)添加至ELISA培養盤之孔內以用於偵測親本IL-23抗體。經由洗滌移除未結合酶且將100μL TMB微孔過氧化酶受質系統(KPL)添加至ELISA培養盤之個別孔內。藉由添加100μL TMB停止溶液(KPL)停止顯色且在450nm下,在設定為630nm之波長校正下,量測孔之光學密度。
藉由在100%食蟹獼猴血清(BioreclamationIVT)內分別稀釋已知量之例示性雙特異性抗體及親本IL-23抗體,隨後在PBS(Thermo ScientificTM PierceTM)中在阻斷劑酪蛋白中進行5倍稀釋,分別產生例示性雙特異性抗體及親本IL-23抗體之標準曲線。親本IL-23抗體之標準曲線範圍為1.95-125ng/mL(分別具有50ng/mL之定量上限及5ng/mL之定量下限);例示性雙特異性抗體之標準曲線範圍為15.63-1000ng/mL(分別具有450ng/mL之定量上限及50ng/mL之定量下限)。
藥物動力學參數(清除率值)使用自零時(投與抗體)至投藥(例示性雙特異性抗體)後168小時或投藥(親本IL-23抗體)後672小時之免疫反應性對比時間之曲線來計算且經由非隔室分析(non-compartmental analysis),使用Phoenix(WinNonLin 6.3,Connect 1.3)測定。結果概述於表8中。
結果表明,在食蟹獼猴體內,例示性雙特異性抗體之抗體清除率為親本IL-23抗體之約1/5。
本發明雙特異性抗體不結合鼠IL-23(mIL23)或鼠TNFα(mTNFα)。因此,為測試在嚙齒動物模型中雙重靶向TNFα及IL-23之治療潛力,產生替代雙特異性抗體(替代雙特異性)。替代雙特異性抗體由經工程改造之嵌合抗TNFα mIgG2a抗體(在小鼠體內靶向等效mTNFα抗原決定基之阿達木單抗的經工程改造之嵌合替代抗體,如本發明雙特異性抗體之IgG在人體內之靶向一樣)構築,在抗TNFα IgG2a抗體及經工程改造之抗IL-23p19 scFv(自靶向小鼠體內之等效IL23p19抗原決定基之替代鼠類抗體工程改造,如本發明雙特異性抗體之scFv在人體內之靶向一樣)之重鏈的C端融合。使用表面電漿子共振量測到替代雙特異性抗體對mIL23及mTNFα之結合親和力分別為1.51nM及0.08nM。
在經抗CD40抗體誘導之鼠類結腸炎模型中,藉由比較替代雙特異性抗體之治療效果(結腸重量與長度)與單獨抗TNFα單一抗體及單獨抗IL-23單一抗體之治療效果來測試針對結腸炎之雙重靶向TNFα及IL-23的治療潛力。在注射鼠類抗CD40抗體後,Rag1基因剔除小鼠患上嚴重急性結腸炎,其引起消耗病、包括腹瀉之腸胃症狀及肛門炎症,且注射後4天內體重減輕高達10-20%。
為測定雙重靶向TNFα及IL-23之治療潛力,注射抗CD40抗體前三天,向Rag1基因剔除小鼠投與以下抗體中之一者:(a)替代雙特異性抗體(1.4mg/kg);(b)抗TNFα抗體(1mg/kg);(c)抗IL-23抗體(0.3mg/kg);或(d)對照IgG2a抗體(1mg/kg)(此等劑量之抗體注射引起活體內相似程度之抗體曝露)。注射後三天,以每隻小鼠200μg向小鼠投與鼠類抗CD40抗體。投與抗CD40抗體後四天,處死小鼠且量測結
腸重量及長度(結腸重量與長度之比確定為結腸炎症大於未投與抗CD40抗體之小鼠的量度)。
結果表明,藉由替代雙特異性抗體雙重阻斷TNFα及IL-23在抑制結腸炎方面優於單獨的抗IL-23抗體及抗TNFα抗體療法(與單獨抗IL-23抗體相比,p<0.0001;與單獨抗TNF抗體相比,p<0.0004,ABOVA,隨後使用鄧尼特法(Dunett's method)與對照進行比較)。替代雙特異性抗體對結腸炎之抑制與藉由對照小鼠(未投與抗CD40抗體)所觀察到之結果相當。因此,藉由替代雙特異性抗體雙重阻斷TNF及IL-23可有效抑制小鼠之結腸炎。
在投與葡萄糖-6-磷酸異構酶(GPI)後,DBA/1小鼠患上以腳爪快速腫脹為特徵之類風濕性關節炎。GPI為糖分解路徑中之蛋白質且已在人類類風濕性關節炎患者以及鼠類模型中展示抗GPI之自體抗體。單獨靶向TNFα或Th17路徑之療法已在鼠類模型中展現出減輕關節腫脹之功效(Matsumoto 2008,Iwanami 2008)。
為證明當在早期治療模式中投與時雙重中和鼠IL-23及鼠TNFα之功效(藉由上文所述之替代雙特異性抗體),向DBA/1小鼠注射400μg重組人類GPI及弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant;CFA)(1:1 v/v,在尾巴根部的2個皮下注射位點)。投與GPI後8天,(藉由每週兩次腹膜內注射)向小鼠投與以下抗體中之一者:(a)對照鼠IgG2a抗體(90μg);(b)替代雙特異性抗體(4.2μg)+對照鼠IgG2a抗體(87μg);
(c)替代雙特異性抗體(12.6μg)+對照鼠IgG2a抗體(81μg);或(d)替代雙特異性抗體(42μg)+對照鼠IgG2a抗體(60μg)。投與GPI後三週(第21天),使小鼠安樂死。
在投與GPI之日(第0天)開始及之後第2天、第4天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第14天、第16天、第18天及第21天,針對關節腫脹之嚴重程度,基於0-3評分系統(0=正常;1=紅斑及主要關節之輕微腫脹;2=中度至重度主要關節腫脹;及3=整個腳爪之嚴重腫脹)對各腳爪進行評分。臨床評分表示全部4個腳爪之總評分(最大評分為12)。關於自第1天至第21天(研究結束)之時間內的臨床評分,藉由梯形法計算曲線下面積(AUC)。將臨床評分AUC資料(表10中以平均值±SEM所示)與治療組之單因子ANOVA模型進行擬合。所關注之比較的測試p值源自基於T檢定之模型。
結果表明,藉由替代雙特異性抗體雙重阻斷TNFα及IL-23以濃度依賴性方式減輕類風濕性關節炎之關節腫脹。在第9天(用對照抗體或替代雙特異性抗體中之一者開始處理後之日),用替代雙特異性抗體處理之小鼠的平均臨床評分低於經對照抗體處理之小鼠。藉由替代雙特異性抗體之最大臨床評分以劑量依賴性方式衰減,其中針對全部三個劑量之經替代雙特異性抗體處理之小鼠的臨床評分AUC顯著低於經對照抗體處理之小鼠(12.6μg及42μg之替代雙特異性抗體濃度達成最大衰減百分比)。
為比較當在早期治療模式中投與時鼠IL-23及鼠TNFα之雙重中和(藉由替代雙特異性抗體)之功效與單一鼠IL-23及單一鼠TNFα治療,向DBA/1小鼠注射400μg重組人類GPI及CFA(1:1 v/v,在尾巴根部的2個皮下注射位點)。投與GPI後8天,(藉由每週兩次腹膜內注射)向小鼠投與以下抗體中之一者:(a)對照鼠IgG2a抗體(30μg);(b)鼠類抗IL-23抗體(30μg,小鼠體內靶向等效IL23p19抗原決定基之經工程改造的替代鼠類抗體,如本發明雙特異性抗體之scFv);(c)鼠類抗TNFα抗體(30μg,小鼠體內靶向等效mTNFα抗原決定基之阿達木單抗的經工程改造之嵌合替代抗體,如本發明雙特異性抗體之IgG在人體內之靶向一樣);或(d)替代雙特異性抗體(42μg,上文所述)。投與GPI後12天(第12天),使小鼠安樂死。
在投與GPI之日(第0天)開始及之後第2天、第4天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天及第12天,針對關節腫脹之嚴重程度,基於0-3評分系統(0=正常;1=紅斑及主要關節之輕微腫脹;2=中度至重度主要關節腫脹;及3=整個腳爪之嚴重腫脹)對各腳爪進行評分。臨床評分表示全部4個腳爪之總評分(最大評分為12)。關於自第8天(免疫接種抗體)至第12天(研究結束)之時間內的臨床評分,藉由梯形法計算曲線下面積(AUC)。將臨床評分AUC資料(表11中以平均值±SEM所示)與處理組之單因子ANOVA模型進行擬合。所關注之比較的測試p值源自基於T檢定之模型。將各個別小鼠自第8天至第12天之臨床評分與具有處理組、量測天數及其相互作用之因素的重複量測模型進行擬合。亦應用自回歸結構模型化(以對數天內重複量測之同一動物的相關性做出解釋)。藉由構築針對布利斯測試(Bliss test)相互作用之比較來評定各自之協同作用。
表11:用替代雙特異性抗體、鼠類抗IL-23抗體、鼠類抗TNFα抗體或
結果表明,藉由替代雙特異性抗體雙重阻斷TNFα及IL-23在減輕類風濕性關節炎之關節腫脹方面優於單獨的抗IL-23抗體及抗TNFα抗體療法。在第9天(用替代雙特異性抗體、抗IL-23抗體、抗TNFα抗體或對照抗體中之一者開始治療後之日),用替代雙特異性抗體處理之小鼠的平均臨床評分低於其他處理組。因此,藉由替代雙特異性抗體雙重阻斷TNFα及IL-23可有效減輕小鼠之類風濕性關節炎之關節腫脹。
第一經編碼多肽;IgG HC、L1、scFv HCVR2、L2及scFv LCVR2(SEQ ID NO:1)
第二經編碼多肽;IgG LC(SEQ ID NO:2)
編碼第一多肽之DNA序列(SEQ ID NO:3)
編碼第二多肽之DNA序列(SEQ ID NO:4)
IgG重鏈可變區1(SEQ ID NO:5)
scFv重鏈可變區2(SEQ ID NO:6)
IgG輕鏈可變區1(SEQ ID NO:7)
scFv輕鏈可變區2(SEQ ID NO:8)
HCDR1(SEQ ID NO:9)AASGFTFDDYAMH
HCDR2(SEQ ID NO:10)AITWNSGHIDYADSVEG
HCDR3(SEQ ID NO:11)AKVSYLSTASSLDY
HCDR4(SEQ ID NO:12)KASGYPFTRYVMH
HCDR5(SEQ ID NO:13)YINPYNDGVNYNEKFKG
HCDR6(SEQ ID NO:14)ARNWDTGL
LCDR1(SEQ ID NO:15)RASQGIRNYLA
LCDR2(SEQ ID NO:16)YAASTLQS
LCDR3(SEQ ID NO:17)QRYNRAPYT
LCDR4(SEQ ID NO:18)KASDHIGKFLT
LCDR5(SEQ ID NO:19)YGATSKLT
LCDR6(SEQ ID NO:20)QQYWSTPFT
多肽連接子1(SEQ ID NO:21)GGGGSGGGGSGGGGS
多肽連接子2(SEQ ID NO:22)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
IgG重鏈(SEQ ID NO:23)
<110> 美國禮來大藥廠
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Claims (13)
- 一種雙特異性抗體,其包含結合腫瘤壞死因子α(TNFα)之免疫球蛋白G抗體(IgG)與兩個單鏈可變片段(scFv)之結合體,該等scFv結合IL-23之p19次單位(IL23p19),其中,a.)該IgG包含兩個重鏈(HC)及兩個輕鏈(LC),各HC包含重鏈可變區(HCVR1),且各LC包含輕鏈可變區(LCVR1),其中HCVR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:5,且LCVR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:7;且b.)各scFv包含重鏈可變區(HCVR2)及輕鏈可變區(LCVR2),其中HCVR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:6,且LCVR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:8,其中各scFv經由共價連接於各IgG HC之C端及各scFv之HCVR2之N端的多肽連接子(L1)獨立地結合至該IgG抗體,且各scFv之該HCVR2經由共價連接於該HCVR2之C端及該同一scFv之LCVR2之N端的第二多肽連接子(L2)共價連接於該同一scFv之該LCVR2,其中L1之胺基酸序列為SEQ ID NO:21,且L2之胺基酸序列為SEQ ID NO:22。
- 如請求項1之雙特異性抗體,其中各HC之胺基酸序列為SEQ ID NO:23,各LC之胺基酸序列為SEQ ID NO:2,各scFv之HCVR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:6,各scFv之LCVR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:8,L1之胺基酸序列為SEQ ID NO:21,且L2之胺基酸序列為SEQ ID NO:22。
- 如請求項1或2之雙特異性抗體,其用於療法中。
- 如請求項1或2之雙特異性抗體,其用於治療潰瘍性結腸炎。
- 如請求項1或2之雙特異性抗體,其用於治療類風濕性關節炎。
- 一種DNA分子,其包含:(i)編碼多肽鏈之聚核苷酸序列,該多肽鏈包含如請求項1或2之雙特異性抗體的一個HC、一個scFv、一個多肽連接子及一個第二多肽連接子;及(ii)編碼多肽鏈之聚核苷酸序列,該多肽鏈包含如請求項1或2之雙特異性抗體的一個LC。
- 如請求項6之DNA分子,其中包含一個HC、一個scFv、一個多肽連接子及一個第二多肽連接子之該經編碼之多肽鏈的胺基酸序列為SEQ ID NO:1,且包含一個LC之該經編碼之多肽鏈的胺基酸序列為SEQ ID NO:2。
- 一種哺乳動物細胞,其包含如請求項6或7之DNA分子。
- 如請求項8之哺乳動物細胞,其中該細胞能夠表現如請求項1或2之雙特異性抗體。
- 一種用於產生如請求項1或2之雙特異性抗體的方法,其包含:a.)在使得該雙特異性抗體得到表現之條件下培養如請求項8之哺乳動物細胞;及b.)回收該經表現之雙特異性抗體。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1或2之雙特異性抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
- 一種如請求項1或2之雙特異性抗體的用途,其用於製造用於治療潰瘍性結腸炎之藥劑。
- 一種如請求項1或2之雙特異性抗體的用途,其用於製造用於治療類風濕性關節炎之藥劑。
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