TWI722535B

TWI722535B - 測定蛋白質或肽濃度的方法及其用途

Info

Publication number: TWI722535B
Application number: TW108128630A
Authority: TW
Inventors: 史考特亞倫布萊德利; 衛斯理柯林頓二世傑克森; 威廉Ｆ四世韋斯
Original assignee: 美商美國禮來大藥廠
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2021-03-21
Also published as: TW202024623A; MX2021002013A; JP7126605B2; JP2021535374A; AU2019324120A1; US20210215625A1; AU2019324120B2; KR20210034045A; CA3110073C; CA3110073A1; CN112585469A; EP3841383A1; WO2020041053A1; BR112021000485A2; IL280366A; JP2022174065A; KR102489458B1

Abstract

本發明提供用於測定蛋白質及/或肽濃度或分子參數(諸如消光係數)之方法及其用途。

Description

測定蛋白質或肽濃度的方法及其用途

本發明係關於測定蛋白質或肽之濃度及/或分子特定參數(諸如消光係數)之方法及其用途。

溶液中之肽或蛋白質(例如抗體)濃度對於生物治療劑之研發及商業化以及許多其他研究領域為一種重要特性。舉例而言，需要準確及精確的濃度來確定藥物之功效及將資料整合至黏性封裝，以便能夠依據法規提送審查單位審查。

當前，有數種測定溶液內蛋白質濃度的方法。一類方法涉及測定分子特定參數，諸如UV消光係數(ε)或差示折射率增量(dn/dc)。其他方法包括(i)重量分析(Nozaki Y., Arch. Biochem. Biophys. 249(2), 437-446 (1986))、(ii)顯色方法(Bradford M. M., Anal. Biochem. 72(1-2), 248-254 (1976))、(iii)凱氏氮素分析(Jaenicke L., Anal. Biochem. 61(2), 623-627 (1974))及(iv)胺基酸分析(「AAA」) (Spackman D. H., 等人, Anal. Chem. 30(7): 1190-1206 (1958))。然而，此等方法依賴於蛋白質之經實驗方式衍生的特性(諸如配位體結合、降解或衍生化)，這些特性與蛋白質之固有特性完全不同，因此會導致不準確及不精確的結果。

舉例而言，使用UV消光係數(ε)方法，ε係由經驗計算預測；然而，結果僅為估計值而不是實際值(參見例如Edelhoch H., Biochemistry 6(7), 1948-1954 (1967))。除此之外，舉例而言，凍乾蛋白質之重量分析可能含有大量結合的水、鹽及/或其他調配物組分，導致不準確濃度計算。顯色方法視蛋白質之組成而定及需要校準曲線以提供絕對濃度。藉由AAA進行濃度測定時使用嚴苛的條件亦會引起問題及限制，例如該等條件可能引起數種關鍵胺基酸在水解及衍生化步驟期間降解、操作時間長及變化性高。(Sittampalam G. S., 等人, J. Assoc. of Official Anal. Chemists 71(4), 833-838 (1988))。上述所有問題在計算蛋白質或肽之濃度及分子特定參數時會導致準確性及精度下降，其可影響分子之功效、可發展性及商業化。

因此，需要新型、準確、絕對的蛋白質濃度方法，其與蛋白質結構及調配物組分無關、不依賴於分子相互作用或校準曲線來提供絕對濃度，方法較為準確及精確且避免了嚴苛的樣本製備。此類方法將適用於例如在意欲用於醫療用途之蛋白質或肽的製備中測定蛋白質或肽之濃度。

核磁共振(NMR)光譜分析為已用於量測化合物之濃度的定量技術。然而，使用NMR光譜分析用於量測複雜基質(諸如使用治療性抗體調配物)中之大蛋白質的絕對濃度既具有挑戰性，又存在與上文提及之彼等問題類似的問題。舉例而言，一個挑戰為NMR光譜係藉由來自存在於治療性調配物中之各種鹽、緩衝液、界面活性劑、張力劑及甚至水之強峰主導。另一此類問題為大部分蛋白質及抗體之高位結構在氫原子周圍形成獨特的磁場環境，其對所給定之胺基酸產生較大的¹ H化學位移窗。此等問題以及藉由使用NMR造成之其他固有挑戰(例如，蛋白質共振之固有較寬線寬)在計算蛋白質之濃度及分子特異性參數時導致準確性及精度下降。

本發明提供一種用於量測絕對蛋白質或肽濃度之新穎定量核磁共振光譜方法。無論溶液複雜度如何，本發明之qNMR光譜方法產生具有已充分判定之共振的蛋白質或肽之清晰光譜。第一步驟為使蛋白質變性(就小肽而言，此步驟為視情況選用的，但推薦)以便減小由二級、三級及四級結構引起之蛋白質共振的線寬及使得能夠整合。第二步驟為用柔光濾鏡獲得qNMR譜圖以消除水及其他調配物組分之共振。最終，將資料與參考標準進行比較以用於準確的濃度測定。此方法在本文中被稱為方法A。由方法A測定之濃度接著可用於測定蛋白質或肽之分子參數，諸如消光係數。

本發明因此提供一種獲得溶液中之蛋白質之濃度的方法，其中方法包含使蛋白質變性、用柔光濾鏡進行NMR光譜分析及使用參考標準計算蛋白質之濃度。本發明亦提供一種獲得溶液中之肽之濃度的方法，其中方法包含用柔光濾鏡進行NMR光譜分析及使用參考標準計算肽之濃度。在一些實施例中，方法進一步包含在用柔光濾鏡進行NMR光譜分析之前使肽變性。

本發明提供一種獲得溶液中之蛋白質之消光係數的方法，其中消光係數係藉由比爾-朗伯定律(Beer-Lambert Law)測定，且其中用於比爾-朗伯定律中之蛋白質濃度係在包含以下之方法中測定：使蛋白質變性、用柔光濾鏡進行NMR光譜分析及使用參考標準計算蛋白質之濃度。

本發明亦提供一種獲得溶液中之肽之消光係數的方法，其中消光係數係藉由比爾-朗伯定律測定，且其中用於比爾-朗伯定律中之肽濃度係在包含以下之方法中測定：使肽變性的視情況選用之步驟，隨後為用柔光濾鏡進行NMR光譜分析之步驟及使用參考標準計算蛋白質之濃度。在一些實施例中，方法包含在用柔光濾鏡進行NMR光譜分析之前使肽變性。

本發明提供一種在製備藥物物質或藥品中之測定蛋白質之濃度的方法，其中物質包含溶液中之蛋白質，且其中方法包含獲得蛋白質之分子參數。在一些實施例中，分子參數為消光係數，且消光係數係藉由比爾-朗伯定律測定，且用於比爾-朗伯定律中之蛋白質濃度係在包含以下之方法中測定：使蛋白質變性、用柔光濾鏡進行NMR光譜分析及使用參考標準計算蛋白質之濃度。

本發明提供一種在製備藥物物質或藥品中測定肽之濃度的方法，其中物質包含溶液中之肽，且其中方法包含獲得肽之分子參數。在一些實施例中，分子參數為消光係數，且消光係數係藉由比爾-朗伯定律測定，且用於比爾-朗伯定律中之肽濃度係在包含以下之方法中測定：視情況使肽變性、用柔光濾鏡進行NMR光譜分析及使用參考標準計算肽之濃度。在一些實施例中，方法包含在用柔光濾鏡進行NMR光譜分析之前使肽變性。

本發明進一步提供一種獲得溶液中之蛋白質之分子參數的方法，其中方法包含使蛋白質變性、用柔光濾鏡進行NMR光譜分析、使用參考標準計算蛋白質之濃度及由經計算之濃度測定蛋白質之分子參數。在一實施例中，蛋白質之經計算的濃度及經測定系統特性用於對應反應式中以測定蛋白質之分子參數。在一些實施例中，分子參數為消光係數及對應反應式為比爾-朗伯定律。

本發明亦提供一種獲得溶液中之肽之分子參數的方法，其中方法包含視情況使蛋白質變性及接著用柔光濾鏡進行NMR光譜分析、使用參考標準計算蛋白質之濃度及由經計算之濃度測定蛋白質之分子參數。在一實施例中，蛋白質之經計算的濃度及經測定系統特性用於對應反應式中以測定肽之分子參數。在一些實施例中，分子參數為消光係數且對應反應式為比爾-朗伯定律。

本發明提供一種在製備藥物物質或藥品中測定劑量之方法，其中物質包含溶液中之蛋白質，其中方法包含由參考批料獲得蛋白質之分子參數，其中分子參數係在包含以下之方法中測定：使蛋白質變性、用柔光濾鏡進行NMR光譜分析、使用參考標準計算蛋白質之濃度及由經計算之濃度測定蛋白質之分子參數。在又一實施例中，方法包含製備藥物物質或藥品之測試批料，其中測試批料中之蛋白質的該濃度係由分子參數測定。在一些此類實施例中，蛋白質濃度係在對應反應式中使用分子參數及對應系統特性來測定。

本發明提供一種在製備藥物物質或藥品中測定劑量之方法，其中物質包含溶液中之肽，其中方法包含由參考批料獲得肽之分子參數，其中分子參數係在包含以下之方法中測定：使肽變性、用柔光濾鏡進行NMR光譜分析、使用參考標準計算肽之濃度及由經計算之濃度測定肽之分子參數。在又一實施例中，方法包含製備藥物物質或藥品之測試批料，其中測試批料中之肽之該濃度係由分子參數測定。在一些此類實施例中，肽濃度係在對應反應式中使用分子參數及對應系統特性來測定。

本發明亦提供一種在製備參考批料中測定蛋白質或肽之濃度的方法，其中參考批料包含溶液中之蛋白質或肽，且其中方法包含使蛋白質變性或視情況使肽變性、用柔光濾鏡進行NMR光譜分析、使用參考標準及參考技術計算蛋白質或肽之濃度及由經計算之濃度測定蛋白質或肽之分子參數。在又一實施例中，方法進一步包含在製備測試批料中測定或肽之濃度，其中測試批料中之肽或蛋白質的該濃度係由分子參數測定。

本發明提供適用於本文中所描述之方法的實施例。一類實施例包含一種方法，其中用離液劑使蛋白質或肽變性。在一些此類實施例中，離液劑為脲-d ₄ 。在其他此類實施例中，離液劑為氯化胍-d ₆ 。在一些實施例中，參考標準為內部參考標準。在較佳實施例中，參考標準為外部參考標準。在一些此類實施例中，外部參考標準為小分子一級標準。在一具體實施例中，外部參考標準為順丁烯二酸。在一些此類實施例中，外部參考技術為PULCON。在一些實施例中，蛋白質為抗體。在一些此類實施例中，抗體為單株抗體。在其他此類實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，包含被量測之蛋白質或肽的溶液包含D₂ O。

本發明亦涵蓋方法A，或由方法A中獲得之濃度測定的分子參數在多種應用中之用途。此類應用包括測定毒理學、臨床及/或商業藥品劑量、一種測定公司或一級參考標準之方法、一種在製造期間測定蛋白質或肽之濃度的方法、一種等分蛋白質或肽之方法、一種等分蛋白質或肽之方法(其中經等分蛋白質或肽之濃度與所需濃度類似)、一種包含批次釋放之測試的方法或一種調配藥物物質或藥品之方法。

本發明涵蓋方法A可用於關於任何蛋白或肽(諸如治療劑或油領域中之蛋白質或肽)之本文中所描述的目的。藉助於實例(並不意欲為限制性的)，可將方法A實施於與以下中之任一者或所有相關的應用中，包括其任何此類生物類似藥，其中蛋白質或肽在以下或以下之任何此類生物類似藥中為活性成分：度拉魯肽(dulaglutide) (在一些國家以商品名Trulicity®出售)、伊科齊單抗(ixekizumab) (在一些國家以商品名Taltz®出售)、雷莫蘆單抗(ramucirumab) (在一些國家以商品名Cyramza®出售)、西妥昔單抗(在一些國家以商品名Erbitux®出售)、奧拉單抗(olaratumab) (在一些國家以商品名Lartruvo®出售)、耐昔妥珠單抗(necitumumab) (在一些國家以商品名Portrazza®出售)、抗CGRP抗體，諸如伽奈珠單抗(galcanezumab) (亦稱為LY2951742)、抗IL-23抗體，諸如米瑞奇單抗(mirikizumab) (亦稱為LY3074828)、蘇蘭珠單抗(solanezumab) (亦稱為LY2062430)、他尼珠單抗(tanezumab)、抗N3pG-Aβ抗體、抗Tau抗體，抗Aβ42抗體、抗BAFF/IL-17雙特異性抗體、抗CSF-1R抗體、抗CXCR1/2抗體、抗IL-21抗體、抗IL-23/CGRP雙特異性抗體、抗IL-33抗體、抗PD-L1抗體及抗TIM-3抗體。

本發明亦涵蓋方法A (i)適合於充當量測蛋白質或肽之其他固有參數或將現行相對濃度方法中之任一者轉化為絕對方法的基礎，(ii)可用於定量缺乏顯色胺基酸且難以藉由UV監測之肽，(iii)與現行AAA方法相比，使得更容易、快速及安全地進行樣本製備及資料獲取，(iv)提供適用於多種蛋白質及調配物之所得濃度的線性、精度及準確性，及(v)可用於在小分子污染物存在下定量其他類型之巨分子(例如，聚合物、界面活性劑等)。

本發明涵蓋本文中所描述之方法可利用亦在本文中所描述之數學等式。舉例而言，以公克/公升為單位之蛋白質濃度c _P 可由qNMR譜圖用以下等式計算：

(等式1)。

此等式之實施方式例如在本文中描述。

一般技術者將認識到，儘管在本文中例示了具體軟體程式，可使用其他程式以獲得相當的結果。

本申請案依據35 U.S.C. §119(e)主張2018年8月21日申請之美國臨時申請案序列號62/720,607及2018年9月6日申請之US臨時申請案序列號62/727,708的權益；其揭示內容係以引用之方式併入本文中。

定義：如本文中所使用，「核磁共振光譜分析」(亦稱為「NMR光譜分析」)係指為一般熟習此項技術者已知之光譜技術，其中核磁共振(NMR)光譜可用於研究有機分子之結構。如本文中所使用，「定量核磁共振光譜分析」(亦稱為「qNMR光譜分析」)係指由一或多個NMR光譜獲得關於樣品純度或濃度之定量資訊。此類光譜在本文中稱為定量核磁共振(qNMR)光譜。NMR光譜分析可併入「柔光濾鏡」之使用，「柔光濾鏡」可用於基於混合物中較小分子之大小而選擇性減弱其信號(參見例如，Stilbs P., Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 19(1): 1-45 (1987))。為了平衡基質峰及蛋白質峰衰減，柔光濾鏡之強度可藉由一般技術者基於各實驗之上下文來測定。舉例而言，若平衡過弱，則柔光濾鏡的值受限。若平衡過強，則柔光濾鏡開始抑制蛋白質信號，蛋白質信號降低了量測結果之信號雜訊比。此降低接著可導致實驗時間較長。作為另一實例，若基質組分中之一者未完全消除且其呈現干擾峰，則將對蛋白質峰面積存在貢獻，且必須將其減去以便得到最準確的結果。此可藉由以下來進行：製備含有無蛋白質之基質的空白樣品，用柔光濾鏡操作空白樣品，測定剩餘基質峰之面積及由針對蛋白質樣品獲得之面積減去此數值。

如本文中所使用，「參考標準」係指化合物之¹ H-NMR譜圖提供至少一個表示已知質子數值的獨特峰，且已知其純度及濃度具有高確定度的化合物。參考標準可為內部參考標準，其中存在於含有所關注蛋白質或肽之溶液參考標準中，或參考標準可為外部參考標準，其中參考標準與含有所關注蛋白質或肽之溶液是分開的。參考標準可為小分子一級參考標準，其為未經另一標準校準且替代地藉由品質(諸如其質量)定義的材料。通常用作¹ H qNMR內部標準之經小分子認證的參考材料為可容易獲得的且可亦用作外部標準[參見例如Rigge等人, M. J. AOAC International, 2017, 100, 1365-1375.]。

參考技術為使用參考標準之資料的數學演算法。舉例而言，外部參考技術為使用外部參考標準之資料的數學演算法。此類之一個實例為基於脈衝長度之濃度測定(PULCON)技術(Wider G及Dreier L. J., Am. Chem. Soc. 128(8), 2571-2576 (2006))。

如本文中所使用，「DF-qNMR」光譜係指已應用柔光濾鏡，且當與參考標準相比時，可自其獲得關於所關注蛋白質或肽之純度或濃度之定量資訊的NMR光譜。

如本文中所使用，「分子參數」意謂將一些系統特性(例如吸光度、密度、折射率)變化回應於其他系統特性(例如溫度、壓力或組成)之變化而變化之方式相關的純量值。用於測定分子參數之等式(「對應等式」)可視已知之一或多者特性而變化。分子參數係指蛋白質或肽之固有特性。

舉例而言，消光係數(ε )為描述溶液吸光度如何回應於吸收物種濃度之變化及經由其光行進之路徑長度而變化的分子參數。蛋白質或肽之消光係數[mL/(mg · cm)]可藉由如下將紫外可見(UV-Vis)光譜與方法A組合來測定：A =εcl (比爾-朗伯定律)，其中A 為蛋白質或肽之吸光度，l 為路徑長度[cm]，及c 為絕對蛋白質或肽濃度[mg/mL]。作為另一實例，蛋白質或肽之部分視比容積(

) [mL/g]可藉由如下將密度測定法與方法A組合來測定：ρ=ρ₀ + (1-

ρ₀ ) (c/ 1000)，其中ρ 為蛋白質或肽溶液之密度[g/mL]，ρ₀ 為蛋白質或肽基質之密度[g/mL]，及c 為絕對蛋白質或肽濃度[mg/mL]。作為第三實例，蛋白質或肽[mL/mg]之(差示)折射率增量(dn/dc )可藉由如下將(差示)折射法與方法A組合來測定：n=n₀ + (dn/dc )c ，其中n 為蛋白質或肽溶液之折射率，n₀ 為蛋白質或肽溶液基質之折射率，及c 為絕對蛋白質或肽濃度[mg/mL]。

一般技術者可藉由吸光度/密度/折射率隨濃度(如由方法A測定之濃度)變化之多個量測結果的線性回歸測定所關注分子參數。分子參數(諸如消光係數)可用於藉由量測對應系統特性(諸如UV吸光度)及對與其相關之對應等式進行求解(例如，比爾-朗伯定律)來測定藥劑之濃度。

已知「單株抗體」之一般結構。IgG抗體為經由鏈內二硫鍵及鏈間二硫鍵交聯之四條多肽鏈(兩條相同「重」鏈及兩條相同「輕」鏈)的異四聚體。將各重鏈-輕鏈對之可變域締結，形成鍵結位點。可將重鏈可變區(V_H )及輕鏈可變區(V_L )再分為與較為保守區(稱為構架區(「FR」))穿插之高變區(稱為互補決定區(「CDR」))。各V_H 及V_L 係由自胺基末端至羧基末端按以下順序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR含有與抗原形成特異性相互作用之大部分殘基。

如本文中所使用，「雙特異性抗體」係指包括(但不限於)IgG-scFv格式(如在PCT/US2015/058719中所報導)及二價IgG格式(如在US 2018/0009908中所揭示)的二價抗體構築體。本發明亦涵蓋經人類工程改造之蛋白質或抗體(無論三級或四級結構)亦可用於本文中所描述之方法中。此類經人類工程改造之蛋白質或抗體的實例包括三特異性或四特異性抗體及融合蛋白質。

如本文中所使用，肽包含胺基酸之聚合鏈。此等胺基酸可為天然或合成胺基酸，包括經修飾之胺基酸。肽可具有較少二級及三級結構，但易於在溶液中聚集；因此，亦可用離液劑使肽變性。肽之變性可致使NMR光譜分析中信號雜訊比增大，藉此使整合較為容易。使肽變性亦可允許檢查較為濃縮之樣品，藉此縮短實驗時間。出於本文中所描述之方法的目的，當使肽變性時，對肽濃度之測定可為較準確的。就用離液劑變性而言，較佳的離液劑將視各肽之具體需求而定且可由一般熟習此項技術者以實驗方式確定。

一般熟習此項技術者將認識到，蛋白質包含胺基酸之一或多個聚合性肽鏈。此等胺基酸可為天然或合成胺基酸，包括經修飾之胺基酸。蛋白質可為重組蛋白質。蛋白質之一級結構係由其單體胺基酸次單位之直鏈序列構成。蛋白質之二級結構包括產生胺基酸鏈之局部片段之三維結構特徵的氫鍵型式，諸如α螺旋及β薄片。蛋白質之三級結構描述如由三維原子座標定義之蛋白質的總體形狀。四級結構係指複合物中之兩個或更多個蛋白質次單位的排列。可使蛋白質「變性」，其中將外部壓力或離液劑添加至含有蛋白質之溶液中且蛋白質變為未摺疊的。經變性蛋白質因此喪失了大部分其二級、三級及四級結構特徵。離液劑之實例包括脲-d ₄ 及氯化胍-d ₆ 。

亦在本文中所使用，「溶液」係指含有除水以外之組分的經人類工程改造之水性混合物中的肽或蛋白質。「批料」係指藥物或為蛋白質或肽之其他材料的特定數量且意欲在指定限制內具有均一特徵及品質，且係在製造之同一週期期間根據單一製造順序產生。「批次」係指在指定限制內具有均一特徵及品質的批料或批料之特定經鑑別部分；或在藉由連續製程產生之藥品的情況下，其為以保證其在指定限制內具有均一特徵及品質的方式在單位時間或數量中產生的特定經鑑別量。「參考批料」係指已建立及經適當表徵之內部一級參考材料，其中材料包含蛋白質或肽，且其中材料係由代表生產及臨床材料之批次製備。方法A用於測定參考批料中之溶液中的蛋白質或肽之分子參數，諸如消光係數。接著將獲自參考批料之分子參數(諸如消光係數)用於測定後續批次(本文中稱為「測試批料」)中之蛋白質或肽的濃度。

如本文中所使用，「藥品」為一般含有藥物物質，但不必然與一或多種其他成分相關聯之成品劑型，例如，錠劑、膠囊或溶液。「藥物物質」為意欲在疾病之診斷、治癒、緩和、治療或預防方面提供藥理學活性或其他直接作用，或影響人體之結構或任何功能的活性成分，但不包括用於合成此類成分之中間產物。如本文中所使用，藥物物質包含蛋白質或肽。可將方法A用於與包含蛋白質或肽之藥品或藥物物質相關的各種目的，諸如在整個藥品或藥物物質之製造中。

「劑量」係指將引出所需生物或醫學反應之基質中的蛋白質或肽之量。可將物質凍乾或於水溶液中。為製備意欲用於治療用途之物質，熟習此項技術者將理解需要蛋白質或肽之準確及精確的濃度。本文中所描述之方法提供以下之新穎手段：藉由測定參考批料中之蛋白質或肽的消光係數或其他分子參數來獲得蛋白質或肽濃度，且接著使用此消光係數或其他分子參數來測定後續測試批料中之蛋白質或肽的濃度。

等分試樣意謂移除一個器皿中之較大體積的一部分且將其添加至單獨器皿中。器皿可為適合於容納凍乾或於溶液中之蛋白質或肽的任何物品，諸如容器、小瓶、燒瓶或裝置。

批次釋放之測試係指對藥品(包含蛋白質或肽)之最終規格的滿意符合度之適當實驗室測定，包括釋放(藉由製造商釋放至市場上)之前的各活性成分之強度(濃度)。批次釋放之測試可為例如批次釋放之UV測試。蛋白質或肽之濃度可由蛋白質或肽之消光係數測定，其中參考批料中之消光係數係由方法A測定。

以下實例進一步說明本發明及提供用於進行本發明之各種具體實施例的典型方法及程序。然而，應理解以下實例係以說明而非限制之方式闡述，且一般熟習此項技術者可做出各種修改。

實例 樣本之製備 參考標準 ：可將具有¹ H-NMR譜圖之任何化合物用於促進由DF-qNMR光譜計算絕對濃度，¹ H-NMR譜圖之任何化合物提供至少一個獨特峰表示已知質子數值、具有高確定度之已知純度及濃度及在溶液中之化學及物理穩定性。舉例而言，順丁烯二酸可用作外部定量參考標準。為製備作為外部參考標準之順丁烯二酸，將經認證之順丁烯二酸(11.183 mg，0.096347 mmol)置放於5 mL量瓶中且溶解於D₂ O中。將等分試樣轉移至試管，諸如Wilmad 435 (精度為4 mm) NMR試管，使得樣品高度為40 mm。

蛋白質樣品 ：將氯化胍-d ₆ (0.6 g，6 mmol)置放於1 mL量瓶中。將燒瓶置放至天平上，且添加400 μL蛋白質溶液。接著平緩地將溶液經音波處理及渦旋直至所有固體溶解。添加D₂ O以達成最終體積。將等分試樣轉移至試管，諸如Wilmad 435(精度4 mm) NMR試管，使得試管中之樣品高度為40 mm。

肽樣品：將脲-d ₄ (0.13 g，2 mmol)置放於1 mL量瓶中。將量瓶置放至天平上，且添加約1 mL蛋白質溶液。接著平緩地將溶液經音波處理及渦旋直至所有固體溶解。添加D₂ O以達成最終體積。將等分試樣轉移至試管，諸如Wilmad 435 (精度4 mm) NMR試管，使得試管中之樣品高度為40 mm。

計算舉例而言，以公克/公升為單位之蛋白質濃度c _P 可由DF-qNMR譜圖用以下等式計算：

(等式1) 其中c _S 為參考標準之濃度，A _P 為DF-qNMR譜圖中所選蛋白質峰之面積(通常為1.0 ppm與1.4 ppm之間的纈胺酸、異白胺酸及白胺酸之甲基峰，但可為任何經判定峰)，H _S 為促成參考標準峰之質子數目，A _S 為參考標準峰之面積，H _P 為促成蛋白質峰之質子數目，及各種f 's為依賴於特定實驗條件之函數。f_DF 解釋蛋白質峰面積衰減，此係由於柔光濾鏡係由Stejskal-Tanner等式衍生(Johnson, C. S.等人, Concepts in Magnetic Resonance Part A 2012, 40A, 39-65)。就本文中所使用之bppste脈衝序列(Pelta, M. D等人, Magn. Reson. Chem. 1998, 36, 706-714)而言，其係由以下給出：

(等式2) 其中γ為¹ H之回轉磁比，g為脈衝場梯度強度，δ為脈衝場梯度長度，Δ為擴散延遲，T₁ 為所關注蛋白質之質子的自旋晶格核弛緩時間，T₂ 為所關注蛋白質之質子之自旋間核弛緩時間，D 為蛋白質之轉譯擴散係數，τ₁ 為bppste脈衝序列中之第二與第三個90°脈衝之間的時間(參見圖1)，τ₂ 為第一與第二個90°脈衝之間(且在第三個90°脈衝與獲取之間)的總時間及τ₃ 為雙極脈衝對之脈衝場梯度脈衝之間的總時間。就Agilent儀器上所供應之脈衝序列而言，此等術語係由以下儀器參數定義：

(等式3)

(等式4)

(等式5) 其中t_gs 為梯度穩定化延遲時間，t_rg 為脈前之接收器閘控時間，及Θ 為90°脈衝寬度。就其他擴散脈衝序列而言，f_DF 之表現將不同。f_ER 含有為外部參考所必需的儀器參數。在以下最基礎形式中：

(等式6) 其中S及G分別為用於收集蛋白質及參考標準之個別NMR光譜的掃描及接收器增益之數目。當使用PULCON方法時，其變為

(等式7) 其中T 為NMR光譜之獲取期間的樣品溫度。f_DIL 解釋了初始蛋白質樣品之稀釋佔最終NMR樣品之稀釋。若以體積方式獲得最終體積，及初始樣品之等分試樣係以重力方式進行，則此因素係藉由以下給出：

(等式8) 其中vol_F 為最終溶液(亦即，NMR樣品溶液)之體積，及wt_I 及d _I 為初始蛋白質溶液之等分試樣的重量及密度。可替代地，若稀釋係藉由將初始蛋白質溶液與D₂ O兩者之重量相加進行，則

(等式9) 其中wt_D2O 及d _D2O 為D₂ O之重量及密度。最終，f_U 將來自定量參考標準之彼等濃度單位(通常為毫莫耳)轉化為公克/公升之典型單位(或等效地，毫克/毫升)。在此情況下，

(等式10) 其中M _P 為蛋白質之分子量。

等式2中之第一指數術語描述由T₁ 核弛緩所致之信號衰減，第二指數術語描述由T₂ 核弛緩所致之信號衰減，及第三指數術語描述由分子擴散所致之信號衰減。在等式中之所有術語中，此等三個數量(T₁ 、T₂ 及D )為僅有的未知量；所有其他數量均為脈衝序列/儀器參數或物理常數(γ )。T₁ 、T₂ 及D 視分子及溶液條件而定，且必須針對各獨特樣品進行量測。此可用三個單獨實驗進行，實驗使用同一脈衝序列作為柔光濾鏡。量測D 為熟知的實驗，其中用增加梯度強度獲得多個光譜(Stejskal、E. O.及Tanner, J. E., J. Chem. Phys., 1965, 42, 288-292)。此使等式2之T₁ 及T₂ 術語保持恆定，使得信號衰減單獨藉由D 操縱。D 接著係藉由應用適合之演算法，諸如DECRA來計算(Windig, W.; Antalek, B. Chemom. Intell. Lab. Syst., 1997, 37, 241-254)。為了用Agilent bppste脈衝序列量測T₁ ，使用擴散延遲與梯度強度(gzlvl1)之組合來獲得多個光譜，使得

(等式11) 其中Δ'為藉由以下給出之正確擴散延遲：

(等式12)。

此使等式2之T₂ 及D 術語保持恆定，使得信號衰減單獨藉由T₁ 馳緩操縱。接著由A _P 對τ₁ 之單指數擬合計算所選蛋白質峰之質子的有效T₁ 。

為了用Agilent bppste脈衝序列量測T₂ ，使用梯度穩定化延遲、擴散延遲與梯度強度之組合來獲得多個光譜，使得

(等式13) 及gzlvl1_n 係如上文所示測定。此使等式之T₁ 及D 部分保持恆定，使得信號衰減藉由T₂ 弛緩單獨操縱。接著由A _P 對τ₂ 之單指數擬合計算所選蛋白質峰之質子的有效T₂ 。

方法 A 資料獲取 Agilent DD2 600 MHz NMR光譜儀係配備有Agilent¹ H-¹⁹ F/¹⁵ N-³¹ P PFG OneProbe。探針溫度及脈衝場梯度分別用乙二醇及於D₂ O中之1% H₂ O之樣品校準。在30.0℃下用雙極脈衝對刺激之回波(bppste)脈衝序列來獲得NMR譜圖。掃描數目為64。獲取參數包括20 ppm光譜寬度、1.363 s獲取時間、30 s弛緩延遲、150 ms擴散延遲、0.569 T/m強度(最大值之92%)之1.4 ms梯度脈衝及1 ms梯度穩定化延遲。

為了量測轉譯擴散係數(D)，獲取參數包括1 s弛緩延遲、200 ms擴散延遲、2.0 ms擴散梯度長度、0.5 ms梯度穩定化延遲及具有對數間距、梯度強度為0.228至0.569 T/m (約最大值之37%至92%)範圍內的七個值。自旋-晶格核弛緩時間(T₁ )係用bppste脈衝序列來量測，其使用20 ppm光譜寬度、1.363 s獲取時間、3.637 s弛緩延遲、2.0 ms擴散梯度長度及0.5 ms梯度穩定化延遲。使用以下五對擴散延遲及梯度強度：(100 ms，0.569 T/m)；(203 ms，0.400 T/m)；(408 ms，0.281 T/m)；(804 ms，0.200 T/m)及(1202 ms，0.164 T/m)。

自旋間核弛緩時間(T₂ )亦係用bppste脈衝序列量測，其使用20 ppm光譜寬度、1.363 s獲取時間、1 s弛緩延遲、1.4 ms擴散梯度長度。使用以下六組梯度穩定化延遲、擴散延遲及梯度強度：(1 ms，150.001 ms，0.570 T/m)；(2 ms，150.002 ms，0.571 T/m)；(4 ms，150.004 ms，0.573 T/m)；(8 ms，150.008 ms，0.577 T/m)；(12 ms，150.012 ms，0.581 T/m)及(16 ms，150.016 ms，0.575 T/m)。

資料分析 DF-qNMR、T₁ 及T₂ 資料係以MNova v 11.0 (Mestrelab Research, S. L., Santiago de Compostela, Spain)處理，及用DOSYToolbox v2.5對擴散資料進行處理及分析(Nilsson, M. J. Magn. Reson. 2009, 200, 296-302)。將FID零填充一次及在傅立葉變換(Fourier transform)前將其乘以2.93 Hz之指數窗函數。使用可在DOSYToolbox中獲得之DECRA演算法獲得擴散係數。藉由回歸分析，由bppste脈衝序列計算T₁ 及T₂ 之值，其使用MATLAB 2016b (MathWorks, Inc., Natick, Ma)。白胺酸、異白胺酸及/或纈胺酸甲基之峰面積係藉由解卷積在MNova或CRAFT中使用線性擬合常式獲得。

在 NIST 抗體 RM 8761 上使用方法 A 為透過NMR說明定量大量配製蛋白質的挑戰，用10% D₂ O處理NIST RM 8761之樣品(可商購自National Institute of Standards and Technology (NIST)之10 g/L抗體，12.5 mM L-組胺酸HCl，pH為6.0；參見例如，Schiel等人, Anal. and Bioanal. Chem., 410(8): 2127-2139 (2018))及獲得¹ H 1D NMR譜圖(圖2)。由於水信號如此強烈及廣泛，使得其掩蓋了抗體之信號。在譜圖中亦觀測到組胺酸賦形劑峰。為了得到蛋白質之有效譜圖，必須消除此等顯性峰。對此應用理想之一種NMR技術為「柔光濾鏡」，其中峰係基於對應分子之擴散係數(及因此其大小)會從譜圖消除。在與用雙極脈衝對刺激之回波(bppste)擴散脈衝序列之柔光濾鏡相同的NIST mAb樣品上獲得之¹ H-NMR譜圖亦顯示於圖2中。柔光濾鏡可有效地移除調配物之非所需信號，而不會引入基線假像或相變形。

然而，在大多數情況下，由於蛋白質共振之特性廣泛線寬，沒有足夠的解析率來進行準確峰鑑別及整合。此主要係由蛋白質之高價態結構(HOS)所致。由於蛋白質之二級、三級及四級結構所產生之獨特磁性環境，單一類型的胺基酸(將以其他方式具有極類似化學位移)顯示出廣泛的化學位移分佈。因此，HOS可藉由使蛋白質變性來移除。將變性劑添加至蛋白質溶液中，引起樣品之體積擴大。為了真實地定量，添加較多溶劑以達成精確體積，例如使用量瓶。此為等式1中f _DIL 之基礎。

用6 M氯化胍-d ₆ 製備之NIST RM 8761樣品經柔光濾鏡後之¹ H-NMR顯示於圖2中。觀測到線寬減小及隨後信號雜訊比增大。對應於異白胺酸、白胺酸及/或纈胺酸之甲基的1.0 ppm至1.4 ppm之間之峰群組具有接近基線之解析率，使得其能夠經整合以用於定量分析。

柔光濾鏡可有效地將蛋白質信號與基質分離；然而，柔光濾鏡致使所量測NMR峰面積缺乏固有定量。常規qNMR實驗使用簡單的NMR脈衝序列，其由以下三個基礎要素組成：核弛緩延遲、一個射頻脈衝及資料獲取時段。當使用足夠長的核弛緩延遲時，所得之NMR峰面積精確及可再現地與所觀測原子核之數目成比例；因此，實驗為定量的。包括此處所採用之擴散序列的所有其他NMR脈衝序列需要藉由各種延遲分離之多個射頻脈衝。因此，所得之光譜由自均衡值衰減峰之因子所致而不再為本質上定量的。然而，若已知彼等因子及可計算衰減之程度，則可使得柔光濾鏡為定量的。此為等式1中之f _DF 的基礎。

外部參考標準較佳優於內部參考標準，因為前者避免兩個分子及/或NMR譜圖中之峰的重疊之間之潛在相互作用，儘管可使用內部標準物。已報導了數種外部標準方法，包括PULCON技術(例如，基於脈衝長度濃度測定)。此技術與來自兩個個別光譜(一個為參考標準之光譜及另一光譜為分析物)之絕對區域相關，即使溶液條件及實驗參數不同。因此，外部參考標準不需要具有與所關注分析物類似的特性或甚至為蛋白質。此外，並非像AAA之情況，每一胺基酸需要一個標準，此方法僅需要單一標準。

為了證明方法A之準確性及精度，評估NIST RM 8761樣品之三個獨立複製物。充分的信號雜訊比係在此10 g/L蛋白質調配物上獲得，其使用僅64次掃描及37分鐘總獲取時間。對應於1,476個質子之蛋白質(1.0 ppm至1.4 ppm)中之I/L/V之甲基的信號群組具有接近基線的解析率。此等結果能夠實現定量之準確整合。為了促進濃度計算，亦用如上文所描述之bppste脈衝序列來量測此峰群組之T₁ 、T₂ 及D，所進行之資料獲取及分析顯示於圖3及圖4中。

一個複製物上所有四個NMR實驗之總實驗時間為110 min。各複製物之濃度接著係由等式9計算，其使用完整的未經糖基化分子量(148,041 Da)及基於等分試樣之重量及所量測之樣品密度的稀釋因數。平均濃度經測定為10.02 g/L，其中RSD為0.55%。此與10 g/L之標記值一致。

此等資料證明方法A可用於準確及精確地測定抗體之濃度。

在 NIST 牛血清白蛋白 ( BSA ) 上使用方法 A 將NIST (BSA)標準參考材料927e (67.38 g/L，20 mM氯化鈉，用1.0 mol/L氫氧化鈉調節至pH為6.5至6.8，可商購自National Institute of Standards and Technology)以重量方式稀釋至四個額外蛋白質濃度(表1，樣品B1至B4)。分析十四個總樣品，包括以中間濃度(B3)之六個複製物，以最高(B5)及最低(B1)濃度中之每一者的三個複製物，及以中間濃度(B2及B4)下之單一複製物。各複製物之NMR樣品係如上文所描述製備。方法A資料獲取及分析係如上文所描述進行。所得之十四個DF-qNMR光譜疊加顯示於圖5中。

此等資料證明來自水之峰已幾乎消除，基線未受擾，及蛋白質中之I/L/V之甲基的信號群組具有接近基線的解析率。各樣品之濃度係由等式1使用66,398 Da之分子量計算及報導於表1中。就所有五種濃度而言，藉由方法A量測之值與由重量稀釋所計算之值類似。如下表1中所示，全部三組複製物之RSD小於1%。表 1. NIST BSA 樣品之結果

樣品	方法A 濃度(g/L)	RSD	重量濃度(g/L)	差值
B1	9.297	0.61%	9.525	2.39%
B2	23.90	--	23.91	0.04%
B3	37.53	0.81%	38.11	1.54%
B4	52.50	--	52.82	0.60%
B5	66.18	0.82%	67.38	1.78%

如圖6中所示，方法A濃度對重量濃度之曲線圖得到R² =0.9997之回歸線，從而指示在整個濃度檢查範圍中的線性。

此等資料證明方法A可用於準確及精確地測定中等大小蛋白質在整個寬濃度範圍中之濃度。

圖7展現樣品密度隨蛋白質濃度而變化之曲線圖，如藉由方法A所測定。關聯兩個量的等式為ρ=ρ₀ + (1-

ρ₀ )(c/ 1000)，如上文所定義。回歸線之斜率得到BSA的部分比容積(

)為0.718 mL/g。

在雙特異性抗體上使用方法 A 具有五種不同濃度及14個總樣品之雙特異性抗體(由美國專利9,718,884之表1中的序列所給出)的樣品係如上文所描述來製備。方法A資料獲取及分析係如上文所描述進行。根據基本上上文所描述之程序，獲得以下資料。

圖8顯示所得之DF-qNMR光譜，其在總體外觀及品質方面與BSA之彼等總體外觀及品質類似(上文所顯示)。濃度係用等式1計算，其使用完整、未經糖基化蛋白質之理論分子量(約200,000 Da)及概述於下表2中。表 2. 雙特異性抗體之結果 .

樣品	方法A 濃度(g/L)	RSD	所估計濃度(g/L)	差值
C1	9.427	0.25%	9.277	-1.61%
C2	24.59	--	24.61	0.09%
C3	41.62	1.25%	39.67	-4.92%
C4	54.43	--	55.02	1.07%
C5	78.37	0.85%	74.01	-5.89%

如圖9中所示，方法A濃度對重量濃度之曲線圖得到R² =0.996之回歸線。

此等資料證明方法A可用於測定雙特異性抗體在整個極寬濃度範圍中之濃度。

在約 5000 Da 肽上使用方法 A 稀釋小肽之樣品(約5,000 Da；由PCT/US2017/041922之實例中4的序列給出)係在存在離液劑及不存在離液劑之情況下如上文所描述製備。變性劑(2 M)之較低濃度為可接受的，此係由於肽本身以隨機螺旋形式存在且濃度低。基本條件為樣品穩定性所需；因此，使用脲-d ₄ 。方法A資料獲取及分析係如上文所描述進行，例外為對各次獲取進行624次掃描，而非64次掃描。以下程序基本上如上文所述，獲得以下資料。觀測到殘餘水信號之輕微相扭曲，但此並不阻礙資料分析。離液劑之添加產生較好的水抑制作用、較銳利之峰及隨後較高解析率及敏感性。各複製物之濃度係由等式1計算。平均總蛋白質濃度測定為0.65 g/L，RSD為3.6%。此與藉由質量平衡所獲得之值(0.63 g/L)類似。此等資料證明方法A可用於小肽之稀釋樣品。

說明性實施例以下包含根據本發明之說明性實施例之清單，該等實施例表示本發明之各種實施例。

此等說明性實施例並不意欲為窮盡性的或將本發明限制至所揭示之精確形式，而實際上，提供此等說明性實施例以輔助進一步描述本發明，使得其他熟習此項技術者可利用其教示內容。 1. 一種測定溶液中之蛋白質或肽之濃度的方法，其中方法包含： (i) 使蛋白質變性或視情況使肽變性； (ii) 用柔光濾鏡進行qNMR光譜分析；及 (iii) 使用參考標準及參考技術計算蛋白質或肽之濃度。 2. 如實施例1之方法，其中使肽變性。 3. 如實施例1或實施例2之方法，其中用離液劑使蛋白質或肽變性。 4. 如實施例3之方法，其中離液劑為氯化胍-d ₆ 或脲-d ₄ 。 5. 如實施例1至4中任一項之方法，其中參考標準為外部參考標準。 6. 如實施例5之方法，其中外部參考標準為小分子一級標準。 7. 如實施例5之方法，其中外部參考標準為順丁烯二酸。 8. 如實施例1至7中任一項之方法，其中溶液包含D₂ O。 9. 如實施例1至8中任一項之方法，其中參考技術為PULCON。 10. 如實施例1至9中任一項之方法，其中蛋白質為抗體。 11. 如實施例10之方法，其中抗體為單株抗體。 12. 如實施例10之方法，其中抗體為雙特異性抗體。 13. 一種測定溶液中之蛋白質或肽之分子參數的方法，其中該方法包含： (i) 使蛋白質變性或視情況使肽變性； (ii) 用柔光濾鏡進行qNMR光譜分析； (iii) 使用參考標準及參考技術計算蛋白質或肽之濃度；及 (iv) 由經計算之濃度測定蛋白質或肽之分子參數。 14. 如實施例13之方法，其中使肽變性。 15. 如實施例13或實施例14之方法，其中分子參數為消光係數。 16. 如實施例15之方法，其中消光係數係藉由比爾-朗伯定律(Beer-Lambert Law)來測定。 17. 如實施例13至16中任一項之方法，其中用離液劑使蛋白質或肽變性。 18. 如實施例17之方法，其中離液劑為氯化胍-d ₆ 或脲-d ₄ 。 19. 如實施例13至18中任一項之方法，其中參考標準為外部參考標準。 20. 如實施例19之方法，其中外部參考標準為小分子一級標準或順丁烯二酸。 21. 如實施例20之方法，其中外部參考標準為小分子一級標準。 22. 如實施例20之方法，其中外部參考標準為順丁烯二酸。 23. 如實施例13至22中任一項之方法，其中溶液包含D₂ O。 24. 如實施例13至23中任一項之方法，其中參考技術為PULCON。 25. 如實施例13、15至24中任一項之方法，其中蛋白質為抗體。 26. 如實施例25之方法，其中抗體為單株抗體。 27. 如實施例25之方法，其中抗體為雙特異性抗體。 28. 一種測定參考批料中蛋白質或肽之分子參數的方法，其中該方法包含： a. 使蛋白質變性或視情況使肽變性； b. 用柔光濾鏡進行qNMR光譜分析； c. 使用參考標準及參考技術計算蛋白質或肽之濃度；及 d. 由經計算之濃度測定蛋白質或肽之分子參數。 29. 如實施例28之方法，其進一步包含測定測試批料中蛋白質或肽之濃度，其中測試批料中肽或蛋白質之濃度係由分子參數測定。 30. 如實施例28或實施例29之方法，其中分子參數為消光係數。 31. 如實施例30之方法，其中消光係數係藉由比爾-朗伯定律來測定。 32. 如實施例28至31中任一項之方法，其中使肽變性。 33. 如實施例28至32中任一項之方法，其中用離液劑使蛋白質或肽變性。 34. 如實施例33之方法，其中離液劑為氯化胍-d ₆ 或脲-d ₄ 。 35. 如實施例28至34中任一項之方法，其中參考標準為外部參考標準。 36. 如實施例35之方法，其中外部參考標準為小分子一級標準。 37. 如實施例35之方法，其中外部參考標準為順丁烯二酸。 38. 如實施例28至37中任一項之方法，其中溶液包含D₂ O。 39. 如實施例28至38中任一項之方法，其中參考技術為PULCON。 40. 如實施例28至31、33至39中任一項之方法，其中蛋白質為抗體。 41. 如實施例40之方法，其中抗體為單株抗體。 42. 如實施例40之方法，其中抗體為雙特異性抗體。 43. 如實施例13至42中任一項之方法，其中方法進一步包含使用分子參數以在調配蛋白質或肽中測定蛋白質或肽之濃度。 44. 如實施例13至42中任一項之方法，其中方法進一步包含使用分子參數以在批次釋放之測試中測定蛋白質或肽之濃度。 45. 如實施例44之方法，其中批次釋放之測試為批次釋放之UV測試。 46. 如實施例13至42中任一項之方法，其中方法進一步包含使用分子參數以在批次之製備中測定蛋白質或肽之濃度。 47. 如實施例13至42中任一項之方法，其中方法進一步包含使用分子參數以在測定蛋白質或肽之劑量中測定蛋白質或肽之濃度。 48. 如實施例13至42中任一項之方法，其中方法進一步包含使用分子參數以在製造期間測定蛋白質或肽之濃度。 49. 如實施例1至48中任一項之方法，其中蛋白質或肽為以下中之活性成分：度拉魯肽、伊科奇單抗、雷莫蘆單抗、西妥昔單抗、奧拉單抗、耐昔妥珠單抗、伽奈珠單抗或米瑞奇單抗。

圖 1 為Agilent光譜儀之bppste脈衝序列(亦稱為Dbppste)及各種延遲之分界。圖 2 為NIST mAb之¹ H NMR光譜。(A)呈具有一個標準脈衝序列之原生形式，(B)與A相同、垂直尺度為5000x，(C)用柔光濾鏡原生及(D)用柔光濾鏡變性的NIST mAb之¹ H NMR譜圖。用星號標記之峰來自組胺酸緩衝液。A至C之掃描數目為1024及D之掃描數目為64。圖 3 為NIST mAb上之D 量測。圖3a：用bppste脈衝序列獲得之變性mAb標準之NMR光譜。插圖：I/L/V共振之峰的擴增。插圖：指示區之放大影像。圖3b：左側：如由DECRA演算法測定之不同擴散物種的純NMR光譜。右側：來自DECRA演算法之Stejkal-Tanner曲線圖及擴散係數。圖 4 為NIST mAb上之T₁ 及T₂ 量測。圖4a：使用bppste脈衝序列之來自T₁ 及T₂ 量測的代表性資料。左側：用於量測T₁ 之bppste脈衝序列設定的NMR光譜及其參數。右側：用於量測T₂ 之bppste脈衝序列設定的NMR光譜及其參數。圖4b：T₁ 及T₂ 計算之曲線圖。圖 5 為經變性NIST BSA之14個樣品的DF-qNMR光譜。插圖：指示區之放大影像。圖 6 為NIST BSA樣品濃度：方法A對重量量測。圖 7 為NIST BSA部分比容積：樣品密度對BSA濃度。圖 8 為經變性雙特異性抗體之14個樣品的DF-qNMR光譜。經變性雙特異性抗體之14個樣品的DF-qNMR光譜。殘餘水之峰係用星號標記。插圖：指示區之放大影像。圖 9 為雙特異性抗體樣品濃度：方法A對重量量測。

Claims

一種測定溶液中蛋白質或肽之濃度的方法，其中該方法包含：a.使該蛋白質變性或視情況使該肽變性；b.用柔光濾鏡進行定量核磁共振(qNMR)光譜分析；及c.使用參考標準及參考技術計算該蛋白質或肽之濃度。
如請求項1之方法，其中該肽係經變性。
如請求項2之方法，其中該蛋白質或肽係以離液劑變性。
如請求項3之方法，其中該離液劑為氯化胍-d ₆或脲-d ₄。
如請求項1之方法，其中該參考標準為外部參考標準。
如請求項5之方法，其中該外部參考標準為小分子一級標準。
如請求項5之方法，其中該外部參考標準為順丁烯二酸。
如請求項1之方法，其中該溶液包含D₂O。
如請求項1之方法，其中該參考技術為基於脈衝長度之濃度測定(PULCON)。
如請求項1之方法，其中該蛋白質為抗體。
如請求項10之方法，其中該抗體為單株抗體。
如請求項10之方法，其中該抗體為雙特異性抗體。
一種測定溶液中蛋白質或肽之分子參數的方法，其中該方法包含：a.使該蛋白質變性或視情況使該肽變性；b.用柔光濾鏡進行定量核磁共振(qNMR)光譜分析；c.使用參考標準及參考技術計算該蛋白質或肽之濃度；及d.由該經計算之濃度測定該蛋白質或肽之該分子參數。
如請求項13之方法，其中該肽係經變性。
如請求項13之方法，其中該分子參數為消光係數。
如請求項15之方法，其中該消光係數係藉由比爾-朗伯定律(Beer-Lambert Law)來測定。
如請求項13之方法，其中該蛋白質或肽係以離液劑變性。
如請求項17之方法，其中該離液劑為氯化胍-d ₆或脲-d ₄。
如請求項13之方法，其中該參考標準為外部參考標準。
如請求項19之方法，其中該外部參考標準為小分子一級標準。
如請求項20之方法，其中該小分子一級標準係順丁烯二酸。
如請求項20之方法，其中該外部參考標準為順丁烯二酸。
如請求項13之方法，其中該溶液包含D₂O。
如請求項13之方法，其中該參考技術為基於脈衝長度之濃度測定(PULCON)。
如請求項13之方法，其中該蛋白質為抗體。
如請求項25之方法，其中該抗體為單株抗體。
如請求項25之方法，其中該抗體為雙特異性抗體。
一種測定參考批料中蛋白質或肽之分子參數的方法，其中該方法包含：a.使該蛋白質變性或視情況使該肽變性； b.用柔光濾鏡進行定量核磁共振(qNMR)光譜分析；c.使用參考標準及參考技術計算該蛋白質或肽之濃度；及d.由該經計算之濃度測定該蛋白質或肽之該分子參數。
如請求項28之方法，其中該分子參數為消光係數。
如請求項29之方法，其中該消光係數係藉由比爾-朗伯定律來測定。
如請求項28之方法，其中該肽係經變性。
如請求項31之方法，其中該蛋白質或肽係以離液劑變性。
如請求項32之方法，其中該離液劑為氯化胍-d ₆或脲-d ₄。
如請求項28之方法，其中該參考標準為外部參考標準。
如請求項34之方法，其中該外部參考標準為小分子一級標準。
如請求項34之方法，其中該外部參考標準為順丁烯二酸。
如請求項28之方法，其中該溶液包含D₂O。
如請求項28之方法，其中該參考技術為基於脈衝長度之濃度測定 (PULCON)。
如請求項28之方法，其中該蛋白質為抗體。
如請求項39之方法，其中該抗體為單株抗體。
如請求項39之方法，其中該抗體為雙特異性抗體。
如請求項13至41中任一項之方法，其中該方法進一步包含使用該分子參數以在調配該蛋白質或肽中測定該蛋白質或肽的濃度。
如請求項13至41中任一項之方法，其中該方法進一步包含使用該分子參數以在批次釋放之測試中測定該蛋白質或肽之濃度。
如請求項43之方法，其中該批次釋放之測試為批次釋放之UV測試。
如請求項13至41中任一項之方法，其中該方法進一步包含使用該分子參數以在批次之製備中測定該蛋白質或肽之濃度。
如請求項13至41中任一項之方法，其中該方法進一步包含在測定該蛋白質或肽之劑量時使用該分子參數以測定該蛋白質或肽之濃度。
如請求項13至41中任一項之方法，其中該方法進一步包含使用該分子參數以在製造期間測定該蛋白質或肽之濃度。
如請求項1至41中任一項之方法，其中該蛋白質或肽為以下中之活性成分：度拉魯肽(dulaglutide)、伊科奇單抗(ixekizumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、奧拉單抗(olaratumab)、耐昔妥珠單抗(necitumumab)、伽奈珠單抗(galcanezumab)或米瑞奇單抗(mirikizumab)。