CN105555318A - 将胸膜液分类的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了将胸膜液分类的方法。这些方法一般地包括测定受试者胸膜液中的指示剂纳米粒子，比如脂质，特别是大型脂质的水平。脂质的水平可经核磁共振(NMR)，比如质子NMR？(1H-NMR)，通过测量相应于甲基质子、亚甲基质子、甲叉基质子的NMR信号或其组合来测定。采用磁共振光谱学(MRS)，可体外对得自受试者的胸膜液样品或体内实施胸膜液中大型脂质水平的测定。胸膜液可分类为渗出液或漏出液，灵敏度、选择性、或其组合为85%、90%、95%、99%或者更高，选择性为85%、90%、95%、99%。所述方法可与诊断和/或治疗患有疾病、障碍或病症的受试者结合。

Description

将胸膜液分类的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年7月18日递交的美国临时申请第61/847610号的权益。2013年7月18日递交的申请第61/847610号通过引用而全部结合到本文中。
发明领域
本发明通常涉及把胸膜液样品分类为漏出液或渗出液的方法以及这些方法辅助疾病诊断的用途。
发明背景
胸膜液(PF)为用作重要的生理润滑剂和机械屏障的胸膜腔的薄液层。PF的体积和流动受到严格调节。在疾病状态下，PF流动的动力学受到损害，导致PF异常积聚。这种病症称为胸腔积液。
在临床实践中，调查胸腔积液病因的第一步一般地是把PF分类为渗出性的(高蛋白)或漏出性的(低蛋白)。这种分类用于缩小根本原因的鉴别诊断(即病因学)。例如，渗出性胸腔积液的原因包括肺癌(原发性或继发性)、感染(肺结核、非结核性肺炎或积脓症)和自身免疫性疾病，而漏出性胸腔积液的原因包括充血性心力衰竭、慢性肾病和肝硬化。
PF可根据Light标准(Light,etal.,AnnInternMed.,77(4):507-513(1972))分类为渗出液和漏出液。简单地说，Light等实施了一项前瞻性研究，包括150个胸膜液样品(47个漏出液和103个渗出液)，并且得出结论，存在以下特征中的任何一种高度提示为渗出性胸腔积液：(1)胸膜液蛋白与血清蛋白的比率大于0.5；(2)胸膜液LDH大于200IU；或者(3)胸膜液LDH与血清LDH的比率大于0.6。这套标准已经临床应用多于40年。
然而，Porcel自2115名受试者总结出Light标准的诊断准确性，并且报道称灵敏度在96.7%-98.2%的范围内和特异性在69.4-77.7%的范围(Porcel,Respirology,16(l):44-52(2011))。其它的前瞻性研究报道了65-86%的甚至更低的诊断特异性。Light标准的非特异性会造成PF的错误分类。例如，漏出性PF可能会误诊为渗出性PF，导致受试者不必要的检测和治疗。在一项包括249名患者的研究中，漏出液基于临场表现的分类可能产生42-44%的误分类率(Romero-Candeira,etal.,Chest,122(5):1524-9(2002))。
为了提高PF分类的诊断准确性，在PF的实验室评价中考虑其它生化标志物/方法。其中例如，白蛋白梯度、NT-pro-BNP、BNP(Valdes,etal.,ArchBronconeumol,47(5):246-51(2011)、C-反应蛋白(CRP)(Porcel,etal.,Eur.J.Intern.Med.,23(5):447-50(2012))、细胞计数(红细胞和白细胞两者)、葡萄糖浓度、pH值、腺苷脱氨酶(ADA)活性(Chen,etal,Clin.Chim.Acta.,341(1-2):101-7(2004)、淀粉酶、胆固醇(Vaz,etal.,Curr.Opin.Pulm.Med.,7(4):183-6(2001);Valdes,etal.,Transl.Res.,155(4):178-84))、甘油三酯(Valdes,etal,Lung,188(6):483-9(2010))、无细胞DNA(Chan,etal.,ClinChem.,49(5):740-5(2003))、蛋白区带电泳(ChenandLam,ClinChem.,45(10):1882-5(1999))。然而，这些检测没有一个可以实现灵敏度和特异性两者大于90%。目前，没有单一的标志物具有令人满意的灵敏度和特异性两者。大多数标志物在牺牲其特异性的情况下具有高的灵敏度，反之亦然。
因此，本发明的一个目的是提供具有高的灵敏度和特异性两者的把胸膜液分类为漏出液或渗出液的方法。
本发明的另一个目的是提供诊断和治疗的方法，该方法包括具有高的灵敏度和特异性两者的把胸膜液分类为漏出液或渗出液。
发明概述
公开了将胸膜液分类的方法。这些方法一般地包括测定受试者胸膜液中的指示剂纳米粒子，特别是造影剂或脂质的水平。例如，所述方法可包括测定受试者胸膜液中的脂质，特别是大型脂质的水平。
与对照相比较具有较高水平的大型粒子脂质的胸膜液一般地确定为渗出液；而，与对照相比较具有较低水平的大型粒子脂质的胸膜液一般地确定为漏出液。对照可为通过将已知渗出液和漏出液的大型粒子脂质的水平求平均值确定的平均阈值。阈值可采用与用于测定胸膜液的大型脂质水平相同的测定大型脂质水平的方法进行测定。类似地，与对照相比较具有较高水平的指示剂纳米粒子的胸膜液一般地确定为渗出液；而，与对照相比较具有较低水平的指示剂纳米粒子的胸膜液一般地确定为漏出液。
胸膜液中的指示剂纳米粒子比如造影剂和大型脂质的水平可与表明渗出液或漏出液的标准值进行比较。例如，如果胸膜液中大型粒子脂质的水平在相应于渗出液的标准值的5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%之内，那么确定胸膜液为渗出液。如果胸膜液中大型粒子脂质的水平在相应于漏出液的标准值的5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%之内，那么确定胸膜液为漏出液。相应于渗出液的标准值可为两种或更多种已知渗出液的大型粒子脂质水平的平均值，和相应于漏出液的标准值可为两种或更多种已知漏出液的大型粒子脂质水平的平均值。类似地，如果胸膜液中指示剂纳米粒子的水平在相应于渗出液的标准值的5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%之内，那么确定胸膜液为渗出液。如果胸膜液中指示剂纳米粒子的水平在相应于漏出液的标准值的5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%之内，那么确定胸膜液为漏出液。
对照或标准值可采用与用于测定胸膜液中指示剂纳米粒子比如大型脂质水平相同的测定指示剂纳米粒子比如造影剂和大型脂质水平的方法进行测定。在优选的实施方案中，指示剂纳米粒子比如脂质的水平通过核磁共振(NMR)，比如质子NMR(1H-NMR)测定。在一些实施方案中，所述方法包括通过测量相应于一个或多个选自以下的脂质信号的NMR信号测定大型粒子脂质的水平：甲基质子(-CH3)、亚甲基质子((-CH2-)n)和甲叉基质子(-CH=CH-)。例如，脂质甲基质子(-CH3)对应于NMR光谱上0.84ppm±0.15的信号，脂质亚甲基质子((-CH2-)n)对应于NMR光谱上1.26ppm±0.15的信号，和脂质甲叉基质子(-CH=CH-)对应于NMR光谱上5.29ppm±0.15的信号。在其它优选的实施方案中，指示剂纳米粒子比如脂质的水平通过计算机断层扫描(CT)测定。对于CT方法，采用造影剂作为指示剂纳米粒子为优选的。
某些方法包括另外的包括但不限于根据Light标准分析的测定，或者测量：白蛋白梯度、NT-pro-BNP、BNP、C-反应蛋白(CRP)、胸膜液的细胞计数、葡萄糖浓度、pH值、腺苷脱氨酶(ADA)活性、淀粉酶、胆固醇、甘油三酯、无细胞DNA、蛋白区带电泳、或其任何组合。另外的测定或分析为除了大型脂质的测量以外。
在一个实施方案中，对得自受试者的胸膜液样品体外实施测定胸膜液中指示剂纳米粒子比如大型脂质的水平。在其它的实施方案中，采用磁共振波谱学(MRS)体内实施测定胸膜液中指示剂纳米粒子比如大型脂质的水平。在还其它的实施方案中，采用计算机断层扫描(CT)体内实施测定胸膜液中指示剂纳米粒子比如大型脂质的水平。胸膜液可分类为渗出液或漏出液，灵敏度为85%、90%、95%、99%或者更高，选择性为85%、90%、95%、99%或者更高，或其组合。
所公开的方法可与诊断受试者患有疾病、障碍或病症的方法相结合。例如，如果胸膜液确定为漏出液，那么受试者可诊断为心力衰竭、肝硬化或肾病。如果胸膜液确定为渗出液，那么受试者可诊断为肺炎、恶性肿瘤或血栓栓塞。
所公开的方法任选地包括一种或多种另外的诊断方法。另外的诊断方法包括但不限于胸膜液的细胞计数；差别葡萄糖(differentialglucose)或腺苷脱氨酶(ADA)分析；胸膜液的细胞学分析、细菌培养、pH测量、或其组合，或者支气管镜检、用于组织学检查的胸膜闭式穿刺活检、胸腔镜检查、螺旋CT、正电子发射断层扫描(PET)、或其任何组合。所述方法任选地包括治疗存在胸膜液或者所诊断的疾病或障碍的受试者。
附图简述
图1为采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)成像顺序得到的胸膜液渗出液和漏出液的代表性600MHz1H-核磁共振(1H-NMR)光谱的覆盖图(overlay)。
图2A和2B为胸膜液渗出液和漏出液的NMR光谱的主要成分分析(PCA)的得分图(2A)和负荷图(2B)。
图3A和3B为胸膜液渗出液和漏出液的NMR光谱的潜在结构投影的判别分析(PLS-DA)的得分图(3A)和负荷图(3B)。
图4A和4B为脂质1、2、3、脂质平均、乳酸酯和葡萄糖(4A)或者仅有脂质1和脂质2(4B)的接受者操作特征(ROC)曲线下面积，用于自胸腔积液的漏出性NMR光谱分辨渗出性。
图5为脂质1和脂质2NMR光谱信号的框-须图(Box-whiskerplot)，用于自胸腔积液的漏出性NMR光谱分辨渗出性。
发明详述
I.定义
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”本文可互换使用，并且指的是哺乳动物，包括但不限于人、啮齿动物(比如小鼠和大鼠)以及其它实验动物。
术语“生物标志物”指的是由生物体产生的表明疾病状态或与疾病状态相关的有机分子。生物标志物包括但不限于蛋白、脂质、代谢物、翻译后修饰的蛋白等。
术语“分类”指的是把一个事物分配给特定的种类或类别。例如，受试者可分类为渗出液或漏出液。
如在分类和诊断的情况下使用的术语“灵敏度”指的是因此正确确认的实际阳性的比例(例如正确地确认为患有病症的患病人群的百分数)。
如在分类和诊断的情况下使用的术语“选择性”和“特异性”指的是因此正确确认的阴性比例(例如正确地确认为未患有病症的健康人群的百分数)。
术语“大型脂质”、“大型粒子脂质”和“大型脂质粒子”指的是极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。
术语“指示剂纳米粒子”指的是可以在体外样品中或者在体内原位检测的纳米粒子。有用的指示剂纳米粒子包括平均直径8-100nm的纳米粒子。优选的指示剂纳米粒子包括平均直径8-70nm的纳米粒子。更优选的指示剂纳米粒子包括平均直径8-30nm的纳米粒子。优选的指示剂纳米粒子包括大型粒子脂质和造影剂。优选的造影剂包括胶束和脂质体，比如在Cormodeetal.,ContrastMediaMol.Imaging9:37-52(2014)中描述的那些。
术语“相应”和“相应于”指的是与别的事物具有直接关系的事物。例如，相应于渗出胸膜液的标准或阈值为在渗出胸膜液中发现或与渗出胸膜液发现的数值有关的数值。相应于脂质信号的NMR信号为与由所指定的脂质产生的NMR信号匹配或类似的NMR信号。
II.将胸膜液分类的方法
一些感染和疾病引起流体在肺与胸腔之间或在肺与隔膜之间的空间积聚。这种积液称为胸腔积液。胸腔积液可分类为渗出性的(高蛋白)或漏出性的(低蛋白)。通常，与漏出性胸膜液相比较，渗出性胸膜液中的脂质水平也较高。已经发现，胸膜液中脂质水平的量化可用于以高度的特异性和灵敏度把流体分类为渗出液或漏出液。进一步地，也已经发现，渗出性胸腔积液由胸膜的大孔径造成。基于此，还发现合适大小的纳米粒子可用于表明胸腔积液的分类。如以下更详细讨论的那样，根据所公开的方法把胸膜液分类为渗出液或漏出液可用于改善疾病诊断与治疗方案。
所公开的方法包括测定胸膜液中指示剂纳米粒子比如脂质的水平。更具体地讲，所述方法包括测定具有一定粒度的指示剂纳米粒子比如脂质的水平。测定胸膜液中指示剂纳米粒子比如脂质的水平可包括测定一定粒度的指示剂纳米粒子的估计值、精确的绝对值、或相对值，并把它们与标准进行比较。指示剂纳米粒子比如脂质的水平可进行体内测量，或者指示剂纳米粒子比如脂质的水平可采用得自受试者的胸膜液样品进行体外测量。一旦测定，指示剂纳米粒子比如脂质的水平一般地与对照进行比较，以确定流体为渗出液还是漏出液。通常，脂质的水平，特别是具有大粒度的脂质，在渗出性胸膜液比在漏出性胸膜液中更高。这一观察也可用于比较与脂质粒子类似大小的指示剂纳米粒子的水平与对照测量的大型粒子脂质的对照水平。
A.测量胸膜液的脂质含量
在一个实施方案中，胸膜液的脂质水平采用质子核磁共振(1H-NMR)光谱测量。NMR基于磁场中的原子核吸收和再发射电磁辐射的原理，并且已经开发了广泛范围的用于量化生物流体中的各种生物分子的技术。参见，例如Cheung,etal.,Acad.Radiol.,18:377-383(2011),Petersen,etal.,ClinicalChemistry,51(8):1457-1461(2005),Otvos,etal.,ClinicalChemistry,38(9):1632-1638(1992),和Otvos,etal.,ClinicalChemistry,37(3):377-386(1991)，其描述了采用NMR量化和分析(profiling)流体样品中的脂质和脂蛋白的方法和技术。
以下实例显示经1H-NMR的脂质分析可用于把流体分类为渗出液或漏出液。经NMR分析产生的脂质信号相应于不同粒度的饱和和不饱和脂质。在以下实例中，脂质甲基质子(-CH3;0.84ppm,本文也称为脂质1)、亚甲基质子((-CH2-)n;1.26ppm,本文也称为脂质2)和甲叉基质子(-CH=CH-;5.29ppm,本文也称为脂质3)的脂质信号积分，与先前报道的脂质信号模式一致(参见Otvos,etal.,Clin.Chem.,37(3):377-386(1991),Petersen,etal.,Clin.Chem.,51(8):1457-1461(2005),和Cheung,etal.,Acad.Radiol,18:377-383(2011)。
脂质信号采用t检验进行分析，并且在渗出液与漏出液之间全部显示统计上的显著差异(p-值<0.0001)。这些数据显示，PF中脂质分子的脂质信号可采用1H-NMR光谱测定，并且其相对信号可用于把PF分类为渗出液或漏出液。
所公开的方法可包括采用NMR测量一个或多个脂质信号积分或模式。例如，所述方法可包括测量脂质甲基质子(-CH3)、亚甲基质子((-CH2-)n)和甲叉基质子(-CH=CH-)、或其组合的信号积分或模式。脂质甲基质子(-CH3)通常发现于NMR光谱的约0.84ppm±多达约0.15。脂质亚甲基质子((-CH2-)n)通常发现于NMR光谱的约1.26ppm±多达约0.15。脂质甲叉基质子(-CH=CH-)通常发现于NMR光谱的约5.29ppm±多达约0.15。
以下实例显示脂质甲基质子(-CH3)、亚甲基质子((-CH2-)n)和甲叉基质子(-CH=CH-)的曲线下面积(AUC)分别为0.958(95%置信区间(CI):0.913-0.984)、0.946(95%CI:0.898-0.976)和0.946(95%CI:0.898-0.976)(图4A-4B和图5)。取3个脂质信号一起的均值，即脂质(平均值)，显示AUC为0.960(95%CI=0.916-0.976)(图4A)。实例显示，采用最佳截止值，脂质甲基质子(-CH3)、亚甲基质子((-CH2-)n)、甲叉基质子(-CH=CH-)和脂质(平均值)给出灵敏度为86.0%(95%CI=79.0%-91.4%)、89.7%(95%CI=83.3%-94.3%)、91.2%(95%CI=85.1%-95.4%)和85.3%(95%CI=78.2%-90.8%)，和特异性分别为100%(95%CI=82.4%-100%)、89.5%(95%CI=66.9%-98.7%)、89.5%(95%CI=66.9%-98.7%)和100%(95%CI=82.4%-100%)。
因此，通过经NMR测量脂质甲基质子(-CH3)、亚甲基质子((-CH2-)n)、甲叉基质子(-CH=CH-)或其组合，可以确定胸膜液为渗出液和漏出液，灵敏度为80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%，和特异性为80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。例如，在一些实施方案中，通过测量脂质甲基质子(-CH3)，可以确定胸膜液为渗出液和漏出液，灵敏度为至少86.0%和特异性为100%。在一些实施方案中，通过测量脂质亚甲基质子((-CH2-)n)，可以确定胸膜液为渗出液和漏出液，灵敏度为至少89.7%和特异性为89.5%。在一些实施方案中，通过测量脂质甲叉基质子(-CH=CH-)，可以确定胸膜液为渗出液和漏出液，灵敏度为至少91.2%和特异性为89.5%。在一些实施方案中，通过测量脂质甲基质子、亚甲基质子和甲叉基质子，可以确定胸膜液为渗出液和漏出液，灵敏度为至少85.3%和特异性为100%。
脂质分析也可包括测量其它脂质质子。例如，所述方法可包括测量烯丙基质子(-CH2-C=C-CH2-;2.0ppm)、二烯丙基质子(=C-CH2-C=;2.8ppm)和含有胆碱化合物的质子(CCC;3.2ppm)。由于具有甲基质子、亚甲基质子和甲叉基质子的NMR光谱信号，相信烯丙基质子、二烯丙基质子和含有胆碱化合物的质子相同或者在渗出性胸膜液中比在漏出性胸膜液中高。在一些实施方案中，测量另外脂质的另外水平，比如甲叉基质子、烯丙基质子、二烯丙基质子、含有胆碱化合物的质子或其组合，进一步提高测定的特异性或灵敏度。
以上技术可用于测量大型粒子脂质和所引入的含有脂质比如胶束和脂质体的指示剂纳米粒子的脂质。指示剂纳米粒子也可包括标记或其它可检测的。例如，指示剂纳米粒子可为造影剂。造影剂通常可采用非侵入性成像技术比如计算机断层扫描进行体内检测。
采用除天然存在的脂质粒子外的指示剂纳米粒子通常需要引入指示剂纳米粒子。通常，指示剂纳米粒子可静脉内引入，并可在检测或样品采集之前一次足够地引入，以使得指示剂纳米粒子能够到达胸膜和通过(如果这种通路在受试者是可能的话)。许多用于引入标记的或可检测组分的技术和用于其检测的方法为已知的，并可适用于所公开的方法和指示剂纳米粒子。
1.体外技术
可对得自受试者的样品体外实施将胸膜液分类的方法。自受试者获得胸膜液的方法为本领域已知的。在肺与胸腔之间或在肺与隔膜之间的空间积聚的许多胸膜液称为胸腔积液。胸腔积液可例如基于胸部x光片检测。流体样品可以称为胸腔穿刺术的程序用针取出。例如，典型的程序可包括把空注射器上的针通过胸壁插入胸膜液袋。通常这种胸膜液袋在皮肤表面以下约1英寸，并可自受试者背部进入。
制备用于脂质分析的流体样品为本领域已知的。在以下实施例中提供制备NMR样品的示例性方法。样品可收集或转移至无菌容器中。可将样品离心，以得到检测用的澄明上清液。示例性的离心步骤为在4℃下3000rpm10分钟。样品可例如在-20℃、-80℃或-120℃下冷冻储存。在分析的时候，把样品与适合于NMR分析的缓冲液混合。示例性的缓冲液为在含有0.1%三甲基甲硅烷基丙酸(TMSP)的100%D2O中的1.5MKH2PO4。样品与缓冲液的示例性混合为4份样品与1份缓冲液的比例(即480μL样品与120μL缓冲溶液)。NMR可用小体积样品实施。示例性的NMR样品为约550μL(包括样品与缓冲液两者)。
NMR提供一些超过测量脂质的备选方法的优点。如以上讨论的那样，适合于NMR的样品可通过直接混合胸膜液与缓冲液来制备，并且一般地不需要任何化学反应。NMR仪器可配备其中可平行分析多个样品的自动样品输送系统。
然而，在一些实施方案中，采用除了NMR外的多种用于测量脂质的其它体外技术中的一种，或者作为NMR的备选。用于定量或分析生物样品中的脂质的其它技术为本领域已知的。所述方法包括物理分离技术，比如梯度凝胶电泳、超速离心法和色谱法。物理分离技术方法可能昂贵和耗时。价格不太贵，但也有点不太准确的方法包括选择性沉淀。样品制备方法以及这些技术定量和分析脂质和脂蛋白的应用为本领域已知的。
2.体内技术
将胸膜液分类的方法也可体内实施。在一个优选的实施方案中，胸膜液的脂质水平采用体内磁共振光谱学(MRS)测定。磁共振光谱学(MRS)为已用于在组织的表征中补充更常见的磁共振成像(MRI)的分析技术。两种技术采用来自氢质子(1H)的信号，但是MRI采用信息产生组织的2维图像，而MRS采用1H信号测定目标代谢物的相对浓度。MRS用于例如测量在肿瘤和神经退行性病症下大脑中的代谢变化。参见，例如Glunde,etal.,NMRBiomed.,24(6):673-690(2011)。用于肿瘤和大脑监测领域的技术可能适合于体内分析受试者的胸膜液，和流体的脂质水平可采用以上讨论的脂质谱峰测定。
B.确定胸膜液分类
一旦测量指示剂纳米粒子比如脂质的水平，即确定了胸膜液的分类。把绝对或相对的数据值与标准或对照进行比较，以确定流体是否是渗出性和漏出性的。
1.数据分析
a.绝对定量
如在Cheung,etal.,Acad.Radiol.,18:377-383(2011),Petersen,etal.,ClinicalChemistry,51(8):1457-1461(2005),Otvos,etal.,ClinicalChemistry,38(9):1632-1638(1992),和Otvos,etal.,ClinicalChemistry,37(3):377-386(1991)中讨论的那样，NMR可用于分析和定量脂质和脂蛋白的绝对值。通常发现采用NMR测定的绝对值与采用其它测量方法包括超速离心法测量的数值很好相关。因此，在一些实施方案中，胸膜液的脂质水平测量为相应于流体样品的实际脂质水平的估计值或精确的绝对定量值。
绝对量化(AQ)(也称为绝对定量)意味着浓度以生化单位表示。胸膜液样品中的相应代谢物具有一定的共振频率、谱线宽度(在最大峰值高度一半的全宽)、谱线形状(例如洛伦兹或高斯)、相位和面积。这些峰由于共振频率的差异而分开，共振频率的差异由不同原子核的化学环境差异造成。胸膜液中脂质的分子结构由以上讨论的脂质的特征峰模式来反映。峰的面积直接与有助于它的原子核的数量和与原子核所属的代谢物的浓度成正比。然而，峰面积也受其它因素的影响，包括T1和T2弛豫时间。
通常，为了绝对量化，测定相关代谢物的准确峰面积，并且仔细校准用于把峰面积转换为代谢物信号涉及的代谢物浓度。
b.相对定量
指示剂纳米粒子浓度(比如脂质浓度)也可作为比率(例如相对于标准比如样品中的另一种代谢物)而不是作为绝对浓度(也称为相对量化)定性呈现。一种最简单的方法是内部内源性标示法。用这种方法，源于内源性代谢物的一个测量的峰，用作浓度标准。通过采用参比代谢物的值(其浓度在渗出性和漏出性流体不变)把峰比率(可能对于因素比如弛豫进行校正)转换成浓度。
用于绝对和相对数据定量的数据分析可包括一些本领域已知的技术，并且包括例如积分和峰拟合。参见，例如Jansen,etal.,Radiology,240:318-332(2006)，其提供了可用于体外和体内NMR数据的绝对和相对量化，用于系统校准和数据分析的方法和技术。
2.与对照比较
一旦数据被量化，将其与对照或标准进行比较，以确定流体是否是渗出性和漏出性的。对照可为绝对值或绝对值的范围。对照可为相对值或相对值的范围。例如，渗出性流体的对照值或数值范围可通过测量已知为渗出性流体的一个或多个样品中的脂质水平来测定。同样地，漏出性流体的对照值或数值范围可通过测量已知为漏出性流体的一个或多个样品中的脂质水平来测定。引入的或人工指示剂纳米粒子可例如与真正的对照(在未受影响的受试者观察到的指示剂纳米粒子水平)或与比较性对照比如未受影响的受试者的脂质水平进行比较。
本领域的技术人员会理解如何基于受试样品的性质制备或选择合适的对照。例如，如果受试样品的数值为基于脂质1分析(profile)，对照值或数值范围可基于已知为渗出性流体和漏出性流体的对照样品的脂质1分析。同样地，如果受试样品的数值为基于脂质1、2和3分析，对照值或数值范围可基于已知为渗出性流体和漏出性流体的对照样品的脂质1、2和3分析。
对照的数值或数值范围可采用本领域已知的任何合适的方法测定，包括本文讨论的那些，比如电泳、超速离心法和NMR。对照值可例如采用体内MRS进行体外或体内测定。在一个优选的实施方案中，对照样品的数值以相同的方式或者采用如用于测定受试样品的数值的技术和方案测定。
在一些实施方案中，如果测试值在对照渗出性流体的5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%之内，则确定受试流体为渗出性流体。在一些实施方案中，如果测试值在对照漏出性流体的5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%之内，则确定受试流体为漏出性流体。
在一些实施方案中，对照为单一阈值或数值范围。例如，在一些实施方案中，如果测试值高于阈值则确定受试流体为渗出性的，和如果测试值低于阈值则确定受试流体为漏出性流体。在一些实施方案中，如果测试值高于阈值5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%则确定受试流体为渗出性的，和如果测试值低于阈值5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%则确定受试流体为漏出性流体。在一些实施方案中，阈值为对照渗出性流体和对照漏出性流体的平均值。阈值为用作比较，比如把数值分类为高于或低于阈值的临界值的数值。标准或标准值为用作比较，比如把数值分类为高于或低于标准值的标准的数值。对照或对照值为用作比较，比如把数值分类为高于或低于对照值的对照的数值。
在一些实施方案中，受试流体通过确定为不是渗出性流体来确定为漏出性流体。在一些实施方案中，受试流体通过确定为不是漏出性流体来确定为渗出性流体。
C.组合方法
在一些实施方案中，所公开的分类方法的方法与将胸膜液分类的其它方法结合。例如，在一些实施方案中，所述方法包括测量一种或多种另外的用于将胸膜液分类的生物标志物。生物标志物为除了被测量的大型脂质以外。如果受试样品采用本文公开的方法和通过按照本领域已知的方法测量至少一种其它的生物标志物确定为渗出性或漏出性的，则受试样品选为渗出性流体或漏出性流体。其中实例生物标志物包括但不限于Light标准、白蛋白梯度、NT-pro-BNP、BNP(Valdes,etal.,ArchBronconeumol,47(5):246-51(2011)、C-反应蛋白(CRP)(Porcel,etal.,Eur.J.Intern.Med.,23(5):447-50(2012))、细胞计数(红细胞和白细胞两者)、葡萄糖浓度、pH值、腺苷脱氨酶(ADA)活性(Chen,etal,Clin.Chim.Acta.,341(1-2):101-7(2004)、淀粉酶、胆固醇(Vaz,etal.,Curr.Opin.Pulm.Med.,7(4):183-6(2001);Valdes,etal.,Transl.Res.,155(4):178-84))、甘油三酯(Valdes,etal,Lung,188(6):483-9(2010))、无细胞DNA(Chan,etal.,ClinChem.,49(5):740-5(2003))、蛋白区带电泳(ChenandLam,ClinChem.,45(10):1882-5(1999))。按照已知方法用于把流体分类为渗出性胸膜液的标准和数值为本领域已知的。参见，例如自Porcel,Respirology,16:44-52(2011)复制的以下表1。
表1确认渗出性胸腔积液的测试的诊断准确性的测量1
1这是我们数据库未发表的更新。
2该数字代表多于我们实验室的正常血清LDH上限的三分之二。
CI，置信区间；LR，似然比；PF，胸膜液；PF/S，胸膜液与血清比率；S-PF，血清与胸膜液之间的梯度。
III.采用所分类胸膜液的方法
把胸膜液分类为渗出性流体或漏出性流体可用于缩小某些疾病、障碍和病症的根本原因。因此，将胸膜液分类的方法可集成到诊断方案、治疗方案或其组合。
A.疾病诊断
本文公开的胸膜液分类方法可单独或与其它诊断方法组合使用，以诊断患有疾病或病症的受试者。
1.漏出液
漏出液可能由静水和肿胀压力失衡造成。它们可能由临床病症比如心力衰竭、肝硬化、肾病综合征、肺不张、腹膜透析、缩窄性心包炎、上腔静脉阻塞和尿胸(urinothorax)造成。因此，在一些实施方案中，具有漏出性流体的受试者诊断为心力衰竭、肝硬化、肾病综合征、肺不张、腹膜透析、缩窄性心包炎、上腔静脉阻塞或尿胸。
在优选的实施方案中，诊断患有疾病、病症或障碍的受试者的方法包括把胸膜液分类为漏出性的并确认一个或多个一般地与疾病有关的临床症状。在大多数情况下，漏出性流体与心力衰竭、肝硬化或肾病有关。因此，在优选的实施方案中，所述方法包括确定受试者是否具有心力衰竭、肝硬化或肾病中的一个或多个另外症状并因此诊断他/她。症状为除了胸膜液的分类以外。
2.渗出液
渗出液可发生于影响胸膜液积聚的局部因素改变时。肺炎、恶性肿瘤和血栓栓塞是美国大多数渗出性积液的原因。
如果受试流体确定为渗出液则可实施的另外测试在Porcel,etal.,Am.Fam.Physician,1;73(7):1211-1220(2006)中得到讨论，并且包括但不限于细胞计数与分化、葡萄糖、腺苷脱氨酶(ADA)和细胞学分析。如果感染是所关心的，则应测试细菌培养物和pH。
主要的WBC群体通过胸膜损伤机制和与损伤发作有关的胸腔穿刺术的时机确定。因此，发现富含嗜中性粒细胞的流体提高了对肺炎旁胸腔积液(急性过程)的怀疑，由此淋巴细胞占主导地位的流体分析提示癌症或肺结核(慢性过程)。
低胸膜液pH值对于患有类肺炎和恶性胸腔积液的患者具有预后和治疗意义。在患有类肺炎积液的患者pH值低于7.20表明需要排出流体。在患有恶性胸腔积液的患者，胸膜液pH值低于7.30与生存期较短和对化学胸膜固定术较差的反应有关。当胸膜液pH值不能得到时，胸膜液葡萄糖浓度低于60mg每dL可用于确认复杂性类肺炎积液。
ADA为在淋巴细胞分化中起重要作用的酶。胸膜液ADA水平高于40U每L(667nkat每L)对于结核性胸膜炎的诊断具有90-100%的灵敏度和85-95%的特异性。如果仅考虑淋巴细胞性渗出液，特异性上升高于95%。在其中结核病患病率低的区域，胸膜ADA的阳性预测值下降，但是阴性预测值仍然高。
对需氧和厌氧细菌两者的培养将在约40%的类肺炎积液(如果流体为严重脓性的则为70%)确认负责的微生物。
在约60%的恶性胸腔积液中，细胞学为阳性。阴性测试结果与因素比如肿瘤类型(例如对间皮瘤、肉瘤和淋巴瘤通常为阴性)、胸膜腔的肿瘤负荷和细胞学家的专业知识有关。诊断率可能会通过另外的胸腔穿刺有所改善。
B.其它诊断程序
在一些实施方案中，本文公开的将胸膜液分类的方法与另外的诊断程序，比如在Porcel,etal.,Am.Fam.Physician,1;73(7):1211-1220(2006)中讨论的那些结合。例如，当与骨盆和下肢的CT静脉造影术结合时，螺旋CT可用于诊断深部静脉血栓形成，并可区分恶性与良性胸膜疾病。表明恶性疾病的CT结论为存在胸膜结节或结节性胸膜增厚、周向或纵膈胸膜增厚、或者胸壁或膈膜浸润。正电子发射断层扫描(PET)也已用于在良性与恶性胸膜疾病之间进行区分。另外的诊断方法为除了胸膜液分类以外。
每当支气管内恶性肿瘤有可能时，如由一个或多个以下性质提示的那样，支气管镜检是有用的：胸片或CT扫描上的肺浸润或块状物、咳血、大量胸腔积液或纵隔向积液侧转移。
当怀疑是肺结核或恶性肿瘤时，传统上用于组织学检查的胸膜闭式穿刺活检已被推荐用于未确诊的渗出性积液。胸膜活检组织的组织学(80%灵敏度)和培养(56%灵敏度)的组合在多达90%的患者建立了结核病的诊断。该诊断也受到胸膜液中高ADA水平的强烈提示，如以上讨论的那样。
对于胸膜恶性肿瘤的诊断，细胞学优于盲目胸膜活检。当胸膜活检与某种形式的图像引导一起使用，以确认特定的增厚或结节状态的区域时，其诊断率一般地更高。
胸腔镜检查在多于90%患有胸膜恶性肿瘤和细胞学阴性的患者为诊断性的。因此，其在胸腔积液细胞学-阴性，疑似患有胸膜恶性肿瘤的患者为优选的诊断程序。胸腔镜检查还在程序期间提供有效胸膜固定术的可能性。
C.治疗方法
在一些实施方案中，本文公开的分类和诊断方法与治疗方法结合。漏出性积液通常对潜在病症的治疗(例如利尿疗法)有响应。在一些方法中，胸膜液分类为漏出液或渗出液，受试者被诊断患有潜在病症，并且受试者采用本领域已知用于治疗潜在病症的组合物或方法进行治疗。
IV.将胸膜液分类的系统
还提供了将胸膜液分类的系统。该系统可处理来自受试者的样品，并分析样品的本文公开的一种或多种脂质的水平，并应用本文描述的一种或多种规则。一般地，所述系统包括用于检测或量化脂质的装置、计算机、以及用于报告受试者是否有漏出液或渗出液输出装置。所述系统也可用于评价胸膜液的治疗功效。例如，一个实施方案提供具有以下步骤的方法：给予具有胸膜液的受试者药物，并且确定胸膜液是否减少(表明药物是否有效)，或者胸膜液是否保持相同或增加(表明药物无效)。
另一个实施方案提供一种计算机实施的方法，通过向计算机输入按照所公开的方法测定的浓度测试值选择用于治疗的受试者，通过如本文讨论的那样比较测试值与对照报告胸膜液是漏出液还是渗出液。
测试数据可经NMR获得。所述方法可用于辅助诊断与胸膜液积聚有关的疾病。示例性的系统为实验室信息系统。
实施例
脂质粒子的胸腔积液NMR信号为渗出性胸腔积液的生物标志物
材料和方法
样品制备
把样品收集至无菌的普通瓶中，随后在4℃下以3000rpm离心10分钟，以得到澄明的上清液。在分析的时候，把480μL样品与120μL缓冲溶液(在含有0.1%三甲基甲硅烷基丙酸(TMSP)的100%D2O中的1.5MKH2PO4)混合。混合样品，并把每个的550μL新鲜转移至5mmNMR管用于NMR分析。
NMR试验
全部NMR光谱在298K下，于BrukerAvance600MHzNMR分光仪(BrukerBiospin,Rheinstetten,德国)上获得。样品经SampleXpress自动加载。在4s的弛豫延迟期间用预饱和抑制水共振。Bruker‘cpmgprld’脉冲程序的数据(即弛豫编辑的Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列)用于增强小分子量化合物的检测。用64次扫描获得记录，在32k数据点中包括12019.230Hz的光谱宽度。相位和基线自动校正，并参照内标物TSP(0.000ppm)，采用TopSpin(版本3.1,BrukerBioSpin,Rheinstetten,德国)。所有光谱采用Amix(版本3.9.11,BrukerBioSpin)还原为数据，并对化学位移1.33ppm的CH3信号的乳酸酯峰进行内部校准。NMR光谱的赋值与BBIOREFCODE-2-0-0数据库(BrukerBiospin,Rheinstetten,德国)、人类代谢组数据库(版本3.0)(Wishart,etal.,NucleicAcidsRes41(数据库问题(Databaseissue)):D801-807(2013))ChenomxNMR套件及文献匹配。
数据处理与统计分析
采用先进的记录(bucketing)作为1H-NMRBucket方法(AMIX)，在0.5-10.0ppm范围内实施光谱的记录。去除子区域4.45-4.90ppm，以减少自水信号引入的变化。数据通过总信号强度归一化，并采用SNV过滤(SIMCA-P13)(Umetrics,Umea,瑞典)进行过滤。数据使用SIMCA-P13软件，采用PCA和OPLS-DA进行分析。其它统计分析采用MedCalc(版本12.2.1.0)实施。
结果
胸膜液得自155名患者。PF样品采用修改的Light标准以及相匹配的临床诊断作为参照标准进行分类。简而言之，对于修改的Light标准，如果存在至少一个以下项目则PF视为渗出液：胸膜液蛋白与血清蛋白的比率大于0.5；胸膜液乳酸脱氢酶(LDH)和血清LDH的比率大于0.6；或者胸膜液LDH大于血清中正常值上限的0.6或三分之二倍。使用这个标准，有136个渗出性胸腔积液样品和19个漏出性胸腔积液样品。采用NMR光谱，发现渗出性胸腔积液的脂质信号显著增大，特别是相应于CH3和(CH2)n的脂质。
胸腔积液的代表性CPMGNMR光谱显示在图1中。与渗出液的生化性质一致，渗出液的NMR光谱显示比漏出液更为强烈和复杂的信号。PCA和OPLS-DA的得分图显示明确的来自漏出性PF的渗出液聚集(图2A-2B和图3A-3B)。自负荷图，在0.84ppm、1.26ppm和5.29ppm观察到3个独特的脂质信号，分别标记为脂质1、脂质2和脂质3。PF的这些脂质信号模式类似采用NMR光谱在血浆见到的那些(Otvos,etal.,Clin.Chem.,37(3):377-386(1991),(Petersen,etal.,Clin.Chem.,51(8):1457-1461(2005))。在0.84ppm的脂质1信号相应于脂质的CH3，在1.26ppm的脂质2信号相应于脂质的(CH2)n，和在5.29ppm的脂质3相应于脂质的-CH=CH-。
脂质1、2和3的曲线下面积(AUC)分别为0.958(95%置信区间(CI):0.913-0.984)、0.946(95%CI:0.898-0.976)和0.946(95%CI:0.898-0.976)(图4A-4B和图5)。取3个脂质信号一起的均值，即脂质(平均值)，显示AUC为0.960(95%CI=0.916-0.976)(图4A)。采用最佳截止值，脂质1、2、3和脂质(平均值)给出灵敏度为86.0%(95%CI=79.0%-91.4%)、89.7%(95%CI=83.3%-94.3%)、91.2%(95%CI=85.1%-95.4%)和85.3%(95%CI=78.2%-90.8%)，和特异性分别为100%(95%CI=82.4%-100%)、89.5%(95%CI=66.9%-98.7%)、89.5%(95%CI=66.9%-98.7%)和100%(95%CI=82.4%-100%)。脂质信号采用t检验进行分析，并且在渗出液与漏出液之间全部显示统计上的显著差异(p-值<0.0001)。
在渗出性PF见到的相对高的脂质水平认为是毛细血管渗透性增大的结果，这使得大型脂质粒子能够通过，向胸膜腔迁移并自血浆循环在胸膜液积聚。相比之下，在漏出性胸腔积液，毛细血管渗透性保持不变，并且因此，大型脂质粒子通过毛细血管并向胸膜腔迁移受到限制或阻止。这些数据显示，PF的脂质分子的脂质信号可采用1H-NMR光谱测定，并且其相对信号可用于把PF分类为渗出液或漏出液。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。本文引用的出版物以及引用它们的材料通过参考而具体结合。
本领域的技术人员将认识到，或者能够采用不超过常规试验确定本文描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案打算通过以下权利要求包括在内。

Claims (33)

1.一种将胸膜液分类的方法，所述方法包括测定受试者胸膜液中指示剂纳米粒子的水平，其中与对照相比较含有较高水平指示剂纳米粒子的胸膜液确定为渗出液，和与对照相比较含有较底水平指示剂纳米粒子的胸膜液确定为漏出液，其中所述对照为通过将已知渗出液和漏出液的指示剂纳米粒子的水平进行平均确定的平均阈值。
2.权利要求1的方法，其中所述阈值采用与用于测定胸膜液的指示剂纳米粒子水平相同的测定指示剂纳米粒子水平的方法进行确定。
3.一种将胸膜液分类的方法，所述方法包括测定受试者胸膜液中指示剂纳米粒子的水平，其中所述指示剂纳米粒子为大型脂质，并把大型脂质的水平与相应于渗出液和漏出液的标准值进行比较，其中如果大型粒子脂质的水平在相应于渗出液的标准值的5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%之内，那么确定所述胸膜液为渗出液，和如果大型粒子脂质的水平在相应于漏出液的标准值的5%、10%、15%、20%、25%、50%或75%之内，那么确定所述胸膜液为漏出液。
4.权利要求3的方法，其中相应于渗出液的所述标准值为两种或更多种已知渗出液的大型粒子脂质水平的平均，和相应于漏出液的所述标准值为两种或更多种已知漏出液的大型粒子脂质水平的平均。
5.权利要求3-4中任一项的方法，其中所述标准值采用与用于测定胸膜液中大型脂质水平相同的测定大型脂质水平的方法进行确定。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述指示剂纳米粒子包括造影剂纳米粒子或大型粒子脂质。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述指示剂纳米粒子的水平通过核磁共振(NMR)测定。
8.权利要求7的方法，其中所述NMR为质子NMR(1H-NMR)。
9.权利要求8的方法，其中测定所述指示剂纳米粒子的水平包括测量相应于一个或多个选自甲基质子(-CH3)、亚甲基质子((-CH2-)n)和甲叉基质子(-CH=CH-)的脂质信号的NMR信号。
10.权利要求9的方法，其中所述脂质甲基质子(-CH3)对应于NMR光谱上0.84ppm±0.15的信号，脂质亚甲基质子((-CH2-)n)对应于NMR光谱上1.26ppm±0.15的信号，和脂质甲叉基质子(-CH=CH-)对应于NMR光谱上5.29ppm±0.15的信号。
11.权利要求9-10中任一项的方法，所述方法包括测量相应于两个或更多个选自甲基质子(-CH3)、亚甲基质子((-CH2-)n)和甲叉基质子(-CH=CH-)的脂质信号的NMR信号。
12.权利要求11的方法，所述方法包括测量相应于甲基质子(-CH3)、亚甲基质子((-CH2-)n)和甲叉基质子(-CH=CH-)的NMR信号。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述指示剂纳米粒子的水平通过计算机断层扫描(CT)进行测定。
14.权利要求1-13中任一项的方法，所述方法进一步包括实施一种或多种另外的生物标志物的另外的测定或分析，以把流体分类为渗出液或漏出液。
15.权利要求14的方法，其中所述一种或多种另外的生物标志物的另外的测定或分析包括Light标准的分析、或者测量白蛋白梯度、NT-pro-BNP、BNP、C-反应蛋白(CRP)、细胞计数、葡萄糖浓度、pH值、腺苷脱氨酶(ADA)活性、淀粉酶、胆固醇、甘油三酯、无细胞DNA、蛋白区带电泳、或其任何组合。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中对得自受试者的胸膜液样品体外实施所述测定胸膜液中指示剂纳米粒子的水平。
17.权利要求1-15中任一项的方法，其中采用磁共振波谱(MRS)体内实施所述测定胸膜液中指示剂纳米粒子的水平。
18.权利要求1-15中任一项的方法，其中采用计算机断层扫描(CT)体内实施所述测定胸膜液中指示剂纳米粒子的水平。
19.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述胸膜液确定为渗出液或漏出液，灵敏度为85%、90%、95%、99%或者更高。
20.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述胸膜液确定为渗出液或漏出液，选择性为85%、90%、95%、99%或者更高。
21.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述胸膜液确定为渗出液或漏出液，灵敏度为85%、90%、95%、99%或者更高，和选择性为85%、90%、95%、99%或者更高。
22.权利要求1-21中任一项的方法，所述方法进一步包括诊断患有疾病、障碍或病症的受试者。
23.权利要求22的方法，其中如果所述胸膜液确定为漏出液，那么所述受试者诊断患有心力衰竭、肝硬化或肾病。
24.权利要求22的方法，所述方法进一步包括实施一种或多种另外的诊断方法。
25.权利要求23-24中任一项的方法，所述方法进一步包括治疗受试者。
26.权利要求25的方法，其中所述治疗包括利尿疗法。
27.权利要求26的方法，其中所述治疗进一步包括治疗受试者的心力衰竭、肝硬化或肾病。
28.权利要求22的方法，其中如果所述胸膜液确定为渗出液，那么所述受试者诊断患有肺炎、恶性肿瘤或血栓栓塞。
29.权利要求27-28中任一项的方法，所述方法进一步包括实施一种或多种另外的诊断方法。
30.权利要求29的方法，其中所述另外的诊断方法包括细胞计数；差别葡萄糖或腺苷脱氨酶(ADA)分析；胸膜液的细胞学分析、细菌培养、pH测量、或其组合。
31.权利要求28-30中任一项的方法，所述方法进一步包括治疗受试者。
32.权利要求22-31中任一项的方法，所述方法进一步包括实施支气管镜检、用于组织学检查的胸膜闭式穿刺活检、胸腔镜检查、螺旋CT、正电子发射断层扫描(PET)、或其组合。
33.一种在受试者中辅助诊断疾病、障碍或病症的方法，所述方法包括根据权利要求1-32中任一项的方法把受试者的胸膜液分类为渗出液或漏出液。
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