JPH06505089A - アテローム性動脈硬化症のリスク予知法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アテローム性動脈硬化症のリスク予知性発明の背景 関連出願 本発明は１９８９年１２月２１日出顧による合衆国特許出願第０７／４５４，０ ６９号の部分継続出願である。

合衆国政府資金援助に関する記載 本発明に係わる研究費用は合衆国政府健康・保健省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ ｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ）の基金により賄わ れた。よって、合衆国政府は本発明に関して一定の権利を主張することができる 。

発明の分野 本発明は生体思考におけるアテローム性動脈硬化症のリスクを予知する方法に係 わるものである。

従来の技術 プラズマリポプロティンは複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）であり、リビッドとプロテ ィンが相対的に一定な割合で存在している。プラズマリポプロティンは、血液を 介して様々な体内器官の細胞機能を助けるコレステロール及びコレステロールエ ステルのごとき非水溶性リビッドを相対的に小型で一定の直径及び重量を持つ形 状にて有している。全ての細胞の成長にはコレステロールが必要とされるが、細 胞内の過度なコレステロールの蓄積はアテローム性動脈硬化症という病的状態を 招く、また、全体的な血清（ｓｅｒｕｍ）コレステロールがアテローム性動脈硬 化症と相関関係を有している可能性も指摘されている。

下記の表にあるごとく、人のプラズマリポプロティンは大別して密度（ｄｅｎｓ ｉｔｙ）及び粒子サイズの異なる４種類に分別される。

超低密度　低密度　高密度 キロミクロン　リポ　リポ　リポ （ｃｈｙｌｏ−プロティン　プロティンプロティンｍ１ｃｒｏｎ）　（ＶＬＤＬ ）（ＬＤＬ）　（ＨＤＬ）密度　＜　０．９４　０．９４−１．００６１．００ ６−１．０６３１．０６３−１．２１（ｇ／ｍｌ） 浮遊率（Ｓｆ）　＞４００　２０−４００　０−２０　（沈殿）粒子サイズ　７ ５−１．０００　３０−５０　２０−２２　７．５−５−１Ｏ（ｎ プロティン％　１−２　１０　２５　４５−５５（乾燥重量） トリアジル　８０−９５　５５−６５　１０　３グリセロ一ル％ （乾燥質量） す：ｙ　ｍ　ｊｔ％　３−８　１５−２０　２２　３０（乾燥質量） コレステロール　ｌ−３１０８３ 遊離％ （乾燥質量） コレステロール　２−４　５　３７　１５エステル化％ （乾燥質量） 人のプラズマリポプロティンは超遠心分離機内での高重力条件下における相対的 な浮遊率により物理的に分類される。４種類全てのリポプロティンの密度は１． ２１ｇ／ｍ１以下であるが、一方アルプミン及び−グロブリン等の他のプラズマ プロティンは密度が１．３３から１．３５ｇ／ｍｌの範囲である。スベドベルグ （Ｓｖｅｄｂｅｒｇ）浮遊率単位（Ｓｆ）でのリポプロティンの特徴的な浮遊率 は密度１゜０６３　ｇ　／　ｍ　１のＮａＣ１内にてセ氏２６度で決定される。

該ＮａＣ１内ではリポプロティンは浮揚し、単純プロティンは沈下する。

プラズマリポプロティンは種々な割合のプロティン及び興なる種類のリビッドを 含んでいる。超低密度のリポプロティンは特徴的なアミノ酸配列を有した４種の 異なるポリペプチド鎖を含んでいる。高密度リポプロティンは分子量１７，５０ ０及び２８，０００の２種の異なるポリペプチド鎖を有している。プラズマリポ プロティンのポリペプチド鎖は分子の表面に配列されており、よって、親水性特 性を付与しているものと信じられている。しかしながら、超低密度のリポプロテ ィン及びキロミクロン（ｃｈｙｌｏｍｉｃｒｏｎ）中にては表面を覆い尽くすほ どのプロティンが存在せず、内部に非極性（ｎｏｎｐｏｌａｒ）トリアシルグソ セロールを有しており、そのリンｌ１ｌＷｉ成分の極性ヘッド（ｐｏｌａｒ　ｈ ｅａｄ）もまたその表面の親水性基に寄与しているものと考えられる。　にュー ヨークのワース出版社による１９７５年版ｒバイオケミストリーｊ誌の３０１ペ ージに記載されたレーニンジャーの記事） 異なる種類のリポプロティンは異なる量のコレステロールを含有している。よっ て、血清コレステロールの測定値とは各リポプロティンが全血清リポプロティン 量に寄与する量の平均値である。

特定なリポプロティン種の密度はアテローム性動脈硬化症の進展の主な原因であ ると長く信じられてきた。研究によれば、低密度のリポプロティンは細胞内のコ レステロール蓄積の主原因であり、高密度のリポプロティンは細胞から余分なコ レステロールを除去する役割を担っていることが知られている。

血液プラズマ内の様々な種類のリポプロティンを分離することが望まれるが、臨 床研究所レベルにおいては高速と正確性を兼備し、しかも再現性を有する技術は 今日に至るまで開発されてはいなかった。最も頻繁に使用される方法は超高速遠 心分離技術を駆使したものであるが、結果を出すまでに時間がかかり過ぎ、しか も実大な費用を要するものである。

１９８７年７月版ｒＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲＳＪ誌、第２１９−１号においてベ ル他は人の血液プラズマ及び分離されたキロミクロン、超低密度リポプロティン （ＶＬＤＬ）、低密度リポプロティン（ＬＤＬ）及び高密度リポプロティン（Ｈ ＤＬ）のシングルパルス（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｕｌｓｅ）及びバーンスピン！：１ −（Ｈａｈｎ　ｓｐｉｎ−ｅｃｈｏ）５００ＭＨｚ　Ｈ−Ｉ　ＮＭＲスペクトル を報告している。彼らはプラズマスペクトルのＣＨ２及びＣＨ３（ｌｉｔ肪酸） 並びにＮＭｅｎ”（リン［Ｉ１ｇ！ｌコリンヘッドグループ（ｈｅａｄ　ｇｒｏ ｕｐ））部位（ｒｅｇｉｏｎ）（それぞれ０．　８−１．　３及び３．　２５　 ｐ　ｐ　ｍ）における個々のリポプロティンの共鳴（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）につ いて特に言及した。プラズマ全体の計測は実施されず、またＨＤＬあるいはＬＤ Ｌの密度決定も、アテローム性動脈硬化症のリスクとの関連性にも言及はなかっ た。

よって、生体患者におけるアテローム性動脈硬化症のリスク予知が可能な、高速 であり、また正確であり、しがも再現性を有した方法に対する需要が厳然と存在 している。

発明の概要 本発明は生体患者におけるアテローム性動脈硬化症のリスクを予知する方法に係 わるものである。本発明に従えば、患者の体液サンプルは、水分の影響を抑えた （ｗａｔｅｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ）プロトン核磁気共鳴スベクトル（ｐｒｏ ｔｏｎ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＮＭＲ）ｓ ｐｅｃｔｒｕｍ）を発生させるためにプロトン核磁気スペクトロスコピー（ｓｐ ｅｃｔｒ。

５ｃｏｐｙ）処理を受ける。メチルあるいはメチレン共鳴エンベロープ（ｅｎｖ ｅｌＯｐｅ）に対して曲線解析処理が施され、超低密度＋７ボプロテイン、低密 度リポプロティン、高密度リポプロティン及びキロミクロンから得られた共鳴要 素（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の分類が行われる。高密度リポプロティン共鳴要素の 振幅が測定され、平均した通常値（ａ　ｍｅａｎ　ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｖａ ｌｕｅ）力τ算出される。測定された振幅は所定の標準値と比較され、「正常」 と「異常」に分類される。「異常」スペクトルはアテローム性動脈硬化症の高リ スクを示している。

ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びキロミクロンのコレステロール値は標準的なリポ プロティン生成物を利用して取得される。標準曲線力τ作成され、メチルあるい はメチレン共鳴要素の強度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）に対する高さのピー ク（ｐｅａｋ）値及びメチルあるし１はメチレン共鳴の強度に対するエリア（ａ ｒｅａ）のピーク値力１座標にプロット（ｐｌｏｔ）される、試験サンプルの結 果Ｉよ前記標準曲線と比較され、試験サンプル中のリポプロティン密度が得られ る。ト１ノグリセリドのレベル値はキロミクロンとＶＬＤＬ成分のビークエ１ノ ア値を加算することで決定される。リスクインデックス＋１解析された成分の高 さ及びエリアのピーク値を活用して決定される。

すなわち、本発明の目的の１つは生体患者のアテローム性動脈硬化症のリスクを 予知する方法の提供である。

本発明の他の目的はＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ成分及びキロミクロン並びにトリ グリセリドのレベル値の密度をｍｇ／ｄｌの単位で提供することである。

本発明のさらに別な目的並びに利点は添付図面及び以下記載の発明の解説から自 ずと明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１は本発明に従い健康対象体から得られた１プラズマサンプルの非水成分（水 分抑制したもの（ｗａｔｅｒ　５ｕｐｐｒｅｓｓｅｄ））の特徴的な３６０ＭＨ ｚ　ＮＭＲスペクトルである。

図２は水分抑制のないものを（ｗｉｔｈｏｕｔ　ｗａｔｅｒ　５ｕｐｐｒｅｓｓ ｉｏｎ）除いて図１にて使用したものと同一な装置及びパルス周波数を利用した 図１のプラズマサンプルのＮＭＲスペクトルである。

図３は図１のプラズマサンプルのメチル及びメチレン部の拡大図である。

図４はアテローム性動脈硬化症の高リスクを有した患者プラズマサンプルのメチ ル及びメチレン部のＮＭＲスペクトルである。

図５は本発明の方法実施に使用される装置の略図である。

図６は本発明の方法を使用して実施された研究結果である。

図７は曲線解析法を使用して取得されたメチレン部と４つのリボプロティン成分 のＮＭＲスペクトルである。

実施例の説明 まず始めに本発明の概略を解説し、その後にさらに詳細な解説を付すこととする 。

本発明は生体患者におけるアテローム性動脈硬化症のリスクを予知する方法に係 わるものである。

本発明の目的の一つであるアテローム性動脈硬化症の高リスク予知試験は特徴的 には生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で実施される０本発明による処理法は、いかな るリビツド含有体液、血液、あるいは骨髄プラズマにも応月可能である。すなわ ち、未処理血液、血清あるいはプラズマの使用が可能である。いかなる前記のご ときリビツド含有体液に対しても本発明の試験は可能であるが、今日まで研究の 対象は血液プラズマが中心であり、よって、本発明の好適実施例においてはプラ ズマを使用する。検査サンプルをファースト（ｆａｓｔｉｎｇ）処理するには及 ばない。

本発明に従い、核磁気共鳴スペクトルを発生させるために患者の未処理血液ある いはプラズマのサンプルをプロトン核磁気共鳴スペクトロスコピーにかける。重 要な予知ｆｉｌを有するＮＭＲスペクトルの成分は本信号（ｗａｔｅｒ　ｓｉｇ ｎａｌ）のごとき他の要因により遮蔽（ｍａｓｋ）されている可能性があり、よ って遮蔽要因の排除処理を実施し、情報を有するＮＭＲスペクトルを得る。

超低密度リボプロティン、低密度リボプロティン、高密度リボプロティン及びキ ロミクロンから得られる共鳴要素の分類を行うためにメチルあるいはメチレン共 鳴エンベロープに対して曲線解析処理が施される。図７は曲線解析以前のメチレ ン共鳴ＮＭＲスペクトル１及び該スペクトルが４成分、すなわちキロミクロン２ 、ＶＬＤＬ３、ＬＤＬ４及びＨＤＬ５に分解された状態を示している。その後に 高密度リボプロティン共鳴要素の振幅、低密度リボプロティン共鳴要素の振幅、 及び超低密度リボプロティン共鳴要素の振幅が測定され、各々に対して平均正常 値が算出される。それらの測定された振幅は所定の標準値と比較され、「正常」 あるいは「異常」に分類される。　「異常」と判断されたスペクトルはアテロー ム性動脈硬化症の高リスクを示している。すなわち、高ＨＤＬは低リスクを表し 、高ＬＤＬは高リスクを表す。

本発明の１好適実施例においては、食事前あるいは食事後のプラズマサンプル（ あるいは血清サンプル）の水サプレッションが施されたプロトンＮＭＲスペクト ルが入手され、曲線解析プログラムを使用してメチルあるいはメチレン共鳴要素 におけるＶＬＤＬ＝　ＬＤＬ、ＨＤＬ及びキロミクロンの化学的シフト値（ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　５ｈｉｆｔ　ｖａｌｕｅ）が特定される。その後にＶＬＤＬ、Ｌ ＤＬ、ＨＤＬ及びキロミクロンのエリア、線幅（ｌｉｎｅ−ｗｉｄｔｈ）及び高 さくｈｅｉｇｈｔ）が決定される。ピークの高さはベースラインノイズ（ｂａｓ ｅｌｉｎｅ　ｎｏｉｓｅ）の中央部からピーク値の先端部までを定規あるいはコ ンピュータにて測定することで得られる。

次に、標準的なＬＤＬ生成物を使用してＬＤＬコレステロール値が取得される。

標準曲線が作成され、メチルあるいはメチレン共鳴要素の強度に対するピークの 高さ、並びにメチルあるいはメチレン共鳴要素の強度に対するピークのエリアが 座標にプロットされる。試験サンダルの結果は標準曲線と比較され、試験サンプ ルのＬＤＬコレステロール密度が取得される。

標準的なＨＤＬ生成物を使用してＨＤＬコレステロール値が取得される。標準曲 線が作成され、メチルあるいはメチレン共鳴要素の強度に対するピークの高さ、 並びにメチルあるいはメチレン共鳴要素の強度に対するピークのエリアが座標に プロットされる。試験サンプルの結果は標準曲線と比較され、試験サンプルのＨ ＤＬコレステロール密度が取得される。

標準的なＨＤＬ生成物を使用してＶＬＤＬコレステロール値が取得される。標準 曲線が作成され、メチルあるいはメチレン共鳴要素の強度に対するピークの高さ 、並びにメチルあるいはメチレン共鳴要素の強度に対するピークのエリアが座標 にプロットされる。試験サンプルの結果は標準曲線と比較され、試験サンプルの ＶＬＤＬコレステロール密度が取得される。

以下の式のうち１つを用い、メチルあるいはメチレン共鳴解析成分を使用してリ スクインデックスが決定される。

高さ　ＨＤＬ エリア　ＨＤＬ Ｃ）　高さくＶＬＤＬ＋ＨＤＬ＋ＬＤＬ）高さ　ＨＤＬ ｄ）　エリア（ＨＤＬ＋ＬＤＬ） ｅ）　ＣＨ３共鳴要素を使用して高さのＨＤＬ相対的正常イヒインテンシテ（（ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を決定する０１好適実施例において、プロトン周波数３６ ０ＭＨｚ　（８，４５Ｔ）あるいは４００ＭＨｚ　（９，４０７）でのリスクイ ンデックスイ１３゜９±４．５は正常なアテローム性動脈硬化症のリスクあるし ）番よ健康／正常状態を表し、１１．０±４．１はアテローム性動脈硬イヒ症の 高＋マスクを表す。

さらに、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びキロミクロンの密度をｍｇ／ｄｉの単位 で決定する。標準的なリボプロティン生成物を使用して各リボプロティンに対す る値が取得される。標準曲線力（作成され、メチルあるいはメチレン共鳴要素の いずれ力ｔを使用して各ＩＪボブロチイン部分のピークエリアに対して周知なリ ボプロティン密度力τプロットされる。試験サンプルの結果は標準曲線と比較さ れ、各「Ｊボブロチイン部分、すなわち、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びキロミ クロンの密度がｍｇ７ｄｌ単位にて決定される。トリグリセ１ノド密度番よキロ ミクロン成分のピークエリアをＶＬＤＬ成分のビーク１１１７に加算することで 決定される。ピーク部は算出用のコンピュータプログラムを使用して標準的数学 的手法を駆使して計測される。

図１は健康体の水サプレッションしたプロトンスペクトルを示しており、図２は 水サブレッジ３ンを施していなＩ、ｚ同一サンプルのプロトンスペクトルを示し ている。図２におし１て水分の截頭共鳴線番二番よル己号Ａが付されている１１ 　２ｐｐｍ及び３ｐｐｍ（共鳴周波数）間の共鳴線はリポプロテインリビッドの メチルあるいはメチレン基（ｇｒｏｕｐ）から生じている。この位置のプロトン スペクトル拡大図は図３において示されている。図４はアテローム性動脈硬化症 の高リスクを有した患者のプラズマサンプルのメチルあるいはメチレン部位のＮ ＭＲスペクトルを示している。

本発明の１好適実施例において、プロトンＮＭＲスペクトロスコピーは水信号を 排除した人の血液プラズマに対して実施される。取得された水サプレッションが 施されたプロトンＮＭＲスペクトルはプラズマリポプロテインリビッドの共鳴要 素により形状が左右される。水サプレッション処理しなければこれらの非水共鳴 要素は実質的に水分により無効化されてしまう、信号平均化処理はたとえ水共鳴 の存在下であろうとも強磁場において非水体液成分と関連性を有した共鳴の観測 を可能とする。しかしながら、現代のＮＭＲスペクトロメータはほとんど完璧に 水プロトン共鳴をサプレッションすることができる。プラズマの水サプレッショ ンが施されたプロトンＮＭＲスペクトルは本質的にはプラズマリポプロティン及 び少数の低分子量分子である。プラズマプロティンプロトンは未解析共鳴の広域 部を有しており、明瞭さが不十分である。よって、さらに可変性に富んだリポプ ロティンプロトンの明瞭な共鳴要素がこの広域背景に重ねられる。

従って、その好適実施例においては本発明は数多くの従来式水サプレッション技 術、すなわち、水プロトンＮＭＲ信号のサプレッション技術の１つを利用してい る。水プロトンＮＭＲ信号をサプレッションするために多数の技術が案出された 。これらは２つの分類に大別が可能である。すなわち、　（１）水プロトン信号 の励起を避ける試み、たとえば、急速スキャン相関スペクトロスコピー及び選択 的励起技術、並びに（２）観測される電波周波数（ｒｆ）パルスが利用されたと きに水プロトン磁化を極少にする技術、たとえば、インバージョン（ｉｎｖｅｒ ｓｉｏｎ）リカバリー技術及び飽和（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）である。これら及 び他の溶剤サプレッション技術は１９８３年度版「磁気共鳴ジャーナル」誌第５ ５号の２８３から３００ページにかけてのＰ、Ｊ、ボアによる「フーリエ変換核 磁気共鳴における溶剤サプレッション」と題した記事及びそのｌｌ注に記載され ている。

溶剤プロトン信号と対象の部分あるいは見本の信号とを区別することができない 理由で、従来型ＮＭＲ装置を使用する際には水サプレッション技術が望ましいが 、充分に高感度の装置であれば水サプレッションの必要性はない。

本発明の実施においてはいかなる従来型の現代式ＮＭＲスペクトロメータでも使 用が可能であろう。しかしながら、本好適実施例においては一定磁場強度での磁 石を有したＮＭＲスペクトロメータが使用されている。ＮＭＲ信号はフーリエ変 換され、メチルあるいはメチレン基のプロトン共鳴要素に対する平均正常ＨＤＬ 共鳴要素の振幅は対象のＮＭＲパラメータとなる。

図５はプロトンＮＭＲスペクトロスコピー処理が可能であり、水のＮＭＲ信号を サプレッションするタイプであることが望ましい（しかし必須ではない）核磁気 共鳴（ＮＭＲ）スペクトロメータ２を図示している。該スペクトロメータ２は試 験管（ｔｕｂｅ）６に含まれる人のプラズマサンプル４の検査用として採用され ている。スペクトロメータ２はサンプル４のＮＭＲスペクトルのＨＤＬ　ＮＭＲ 共鳴線を選択し、そのように選択された共鳴要素の平均正常化振幅の計測を行う 手段を含んでいる。

スペクトロメータ２は通常型の構造に加えて１つの値あるいは値の範囲を蓄積す る手段１０を含んでいる。本好適実施例においては、平均正常化ＨＤＬ共ａ１要 素振幅は正常な患者から予期される値あるいは値の範囲を表示するイ１あるいは 値の範囲と比較される。正常な患者とはアテローム性動脈硬化症のリスクが高く はない患者を指す。本発明においてはスペクトロメータ２はさらに蓄積された情 報を基にして計測されたＨＤＬ共鳴要素振幅を「正常」あるいは「異常」として 分類する手段を有している。本処理は比較、引き算あるいは他の適当な数学的手 法を用いて行う。

本好適実施例においては選択あるいは測定手段８は平均正常ＨＤＬ共鳴要素振幅 を計測するために予備調整されている。これにはサンプル４のＮＭＲスペクトル からの水信号をサプレッションする処理が含まれている。あるいはスペクトル２ の感度が充分ならば直接的処理も可能である。

本発明に使用され得る特徴的なスペクトロメータはブルーカーＡＭ−３６０及び ブルーカーＡＭ−５００である。もちろん本分野の熟練技術者であれば本発明の 方法を別の同様な装置を用いて実施可能であることは承知していることであろう 。

正確なサンプル準備及び処理は正確なプラズマ計測実行の不可欠な要素である。

血液は１５％のＮａｚ−ＥＤＴＡの７０ｕ１の溶液を含んでいるチューブ（ｔｕ ｂｅ）内に集められ、遠心分離機処理までセ氏４度で保管される。プラズマは分 離され、ＮＭＲ分析までセ氏４度にて保管される。凍結はリボプロテインリビッ ドの構造的結合を破壊するのでプラズマサンプルは決して冷凍されない。多少な りとも溶血が見られるサンプルは排除される。

スペクトルはセ氏２０度からセ氏２２度で取得されることが望ましく、セ氏２１ 度での取得が最適である。比較的広域のプロトン周波数が使用可能である。たと えば、６０ＭＨｚ以上であるが、３６０ＭＨ２が最適である。費用が問題でなけ れば、５００ＭＨｚが好ましいこともある。サンプルは水共鳴部の半分の高さで 全幅が４Ｈｚ以下となるまで、プロトンフリーインダクションデケイ（ｆｒｅｅ 　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｄｅｃａｙ）の部分（ａｒｅａ）に対して個々にシム処 理（ｓｈｉｍ）される。言うまでもなく注意深いシム処理は良好なＮＭＲ実験技 術の必須要件である。

以下記載の例を基にして、本発明に限定を加えることなくさらに詳細に説明する 。

例１ 本発明の方法を従来通りのリビッドプロフィール（ｐｒｏｆｉｌｅ）分析の対象 となっている１７人の患者グループに適用した。血液は１５％のＮａ＊ＥＤＴＡ の７０ｕｌの溶液を含む非シリコン処理されたバ′　キュテナ−（ｖａｃｕｔａ ｉｎｅｒ）チューブに採取され、遠心分離種処理までセ氏４度で保管された。プ ラズマが分離され、ＮＭＲ分析までセ氏４度で保管された。凍結はリボプロテイ ンリビッドの構造的　−結合を破壊するのでプラズマサンプルは冷凍されなかっ た。多少でも溶血が見られたサンプルは排除された。

全スペクトルはプロトン（Ｈ−１）ＮＭＲ用に３６０ＭＨｚにて作動させる８、 ４５７プル一カーＡＭスペクトロメータを使用してセ氏２１度にて取得された。

全ての研究は５ｍｍ０Ｄサンプルチユーブにュージャージー州ビンランド市ウィ ルマッド社製の＃５０７ＰＰ及び＄５２８ＰＰ）内にて実施された。０．６ｍｌ のプラズマを含む各サンプルは半分の高さにおける水共鳴要素の全幅（ＦＷＨＨ ）が４Ｈ２以下となるまでプロトンフリーインダクションデケイ（Ｆより）の部 分（ａｒｅａ）で個々にシム処理された。内的品質管理処理はＥＤＴＡ共鳴要素 の線幅において見られた。サンプル準備及びシム処理において全てが良好に処理 されていれば、ＥＤＴＡ共鳴（指数的拡張（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｂｒｏａ ｄｉｎｇ）せず）の線幅（ＦＷＨＨ）は２Ｈｚ以下でなければならず、実際にも 頻繁に１．０Ｈｚから１．５Ｈｚの範囲であった。この達成においては、はとん どのＨ−４１０−プは放射エネルギー（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）の減衰を避けるた めに再調整を要する。使用グローブは９０°電波周波数パルスが２０ｍ５ｅｃと なるまで調整された。８．４５７スベクトロメータにおいてはプローブは約２Ｍ Ｈｚに調整されることとなった。サンプルはＺシムコイル（ｃｏｉｌ）のシム処 理中及びデータ取得処理中にスピンされた０本発明におけるＨ−１スペクトルは 水をサブレッジ冒ンするために予備飽和処理（ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）を 行い、存在するラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）メチルプロトンを無効化（ｎｕｌ ｌ）するためにインバージョンリカバリー配列処理（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ−ｒｅ ｃｏｖｅｒｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を行って取得された。予備飽和パルスは＋、 ｏｓｅｃであり、１８０”と１９０”パルス間で約０．８ｓｅｃの遅れが見られ た。８つのＦＩＤは信号平均化（ｓｉｇ−ｎａｌ　ａｖｅｒａｇｅｄ）され、さ らにフーリエ変換され、ある指数（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）を掛けて（ｍｕｌ ｔｉｐｌｙ）２Ｈｚの線拡張が実施された。０．５から１．６ｐｐｍのスペクト ル部分は調整（ｐｈａｓｅｄ）され、座標プｏ−７ト（ｐｌｏｔ）端部のベース ラインレベル（ｂａｇｅｌｉｎｅ　１ｅｖｅｌ）は同一となった。この結果、ス ペクトルの他の（プロットしていない）部分は不完全調整（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ 　ｐｈａｓｉｎｇ）の状態となった。

Ｈ−ＩＮＭＲスペクトロスコープ処理の結果は図６に示されている。

これらの結果は以下の式を利用したデータの分析により得られた。

高さくＬＤＬ＋ＨＤＬ） 高さ　ＨＤＬ 例２ 本発明の方法はプラズマサンプルに適用された。血液は１５％のＮａ宜ＥＤＴＡ の７０ｕ１の溶液を含む非シリコン処理バキュテナーチューブに採取され、遠心 分離種処理までセ氏４度で保管された。プラズマは分離され、ＮＭＲ分析までセ 氏４度にて保管された。凍結はりポルロテインリビッドの構造的結合を破壊する のでプラズマサンプルは冷凍されなかった。多少なりとも溶血が見られるサンプ ルは排除された。

全ての水サプレッション処理されたプロトンＮＭＲスペクトルは、８．４５Ｔブ ル一カーＡＭスペクトロメータを用い、ゼロフィリング（ｚｅｒｏ−ｆｉｌｌｉ ｎｇ）を１６にあるいは３２にポイント（ｐａｉｎｔ）にし、セ氏１６から１８ 度の状態で３６０ＭＨｚにて作動させて取得された。全ての研究は５ｍｍ０Ｄサ ンプルチユーブにュージャージー州ビンランド市のウィルマッド社の＄５０７Ｐ Ｐあるいは＄５２８ＰＰ）内にて実施された。各サンプルは０．６ｍｌのプラズ マを含み、水共鳴要素の半分の高さの全幅（ＦＷＨＨ）が４Ｈ２以下となるまで プロトンフリーインダクションデケイ（ＦＩＤ）部分で個々にシム処理された。

内的品質管理処理はＥＤＴＡ共鳴要素の線幅にて見られた。サンプル準備及びシ ム処理に問題がなければ、ＥＤＴＡ共鳴要素（指数的拡張せず）線幅は２Ｈｚ以 下のはずであり、実際にもしばしば１．０から１．５Ｈｚの間であった。この達 成には、はとんどのＨ−１プローブは放射エネルギーの減衰を避けるために再調 整を要する。使用プローブは９０°電波周波数パルスが２０ｍ５ｅｃとなるまで 調整された。

８．４５７スベクトロメータにおいてはプローブは約２ＭＨｚに調整されること となった。サンプルはＺシムコイルのシム処理中及びデータ取得中にスピンされ た０本発明においてはＨ−１スペクトルは水をサプレッション処理するために予 備飽和処理を行い、存在するラクテートメチルプロトンを無効化するためにイン バージョンリカバリー配列処理を行って取得された。予備飽和パルスは４．０Ｓ ｅＣであり、１８０６と１９０°パルス間で約０．８ｓｅｃの遅れが見られた。

８つのＦＩＤは信号平均化され、さらにフーリエ変換され、ある指数を掛けて２ Ｈｚの線拡張を得た。０．５から１．６ｐｐｍのスペクトル部分は調整され、座 標プロット端部のベースラインレベルは同一となった。この結果、スペクトルの 他の（プロットしていない）部分は不完全調整の状態となった。

メチル及びメチレン共鳴のＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びキロミクロンの化学的 シフト値が特定された。ニューヨーク州シラキュース市のＮＭＲｉ社からのＮＭ Ｒｔｗｏのごとき曲線解析プログラムが、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びキロミ クロンのメチル及びメチレン共鳴の初期（ｉｎｉｔｉａｌ）スペクトル及び化学 的シフト値を使用しての成分残留物（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｒｅｓｉｄｕｅ）解 析に使用された。各解析成分のエリア、線幅及び高さが取得された。

次に、標準的なＬＤＬ生成物を使用してＬＤＬコレステロール値が取得された。

標準曲線が作成され、メチルあるいはメチレン共鳴要素の強度に対するピークの 高さ、並びにメチルあるいはメチレン共鳴要素の強度に対するピークのエリアが 座標にプロットされた。試験サンプル結果は標準曲線と比較され、試験サンプル のＬＤＬコレステロ−ル密度が取得された。

さらに、標準的なＨＤＬ生成物を使用してＨＤＬコレステロール値が取得された 。標準曲線が作成され、メチルあるいはメチレン共鳴要素の強度に対するピーク の高さ、並びにメチルあるいはメチレン共鳴要素の強度に対するピークのエリア が座標にプロットされた。試験サンプル結果は標準曲線と比較され、試験サンプ ルのＨＤＬコレステロール密度が取得された。

次に、標準的なＨＤＬ生成物を使用してＶＬＤＬコレステロール値がか取得され た。標準曲線が作成され、メチルあるいはメチレン共鳴要素の強度に対するピー クの高さ、並びにメチルあるいはメチレン共鳴要素の強度に対するピークのエリ アが座標にプロットされた。試験サンプル結果は標準曲線と比較され、試験サン プルのＶＬＤＬコレステロール密度が取得された。

リスクインデックスが以下記載式の１つを利用し、メチルあるいはメチレン共鳴 要素の解析成分を使用して決定された。

高さ　ＨＤＬ エリア　ＨＤＬ Ｃ）　高さくＶＬＤＬ＋ＨＤＬ＋ＬＤＬ）高さ　ＨＤＬ ｄ）　エリア（ＨＤＬ＋ＬＤＬ） ｅ）　ＣＨ２共鳴要素を使用して高さのＨＤＬ相対的正常化インテンシテイを決 定する。

ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びキロミクロンのｍ　ｇ　／　ｄ　１単位での密度 は、メチレンあるいはメチル共鳴スペクトルを使用し、各解析成分のピークエリ アを測定することで決定された。リポプロティン部分の周知密度がピークエリア に対してプロットされたところに標準曲線が作成され、試験結果と比較されて、 試験サンプル中のＶＬＤＬ、ＬＤＬ％　ＨＤＬ及びキロミクロンの密度が決定さ れた。トリグリセリド密度はキロミクロンのピークエリアをＶＬＤＬ成分のピー クエリアに加えることで決定された。ピークエリアは計算用コンピュータプログ ラムを使用して標準的な数学的手法により計測された。

本発明は本質的な特徴から逸脱することなく他の形態にても実施が可能であろう 。よって、本明細書中の実施例はあくまでも説明のためであり、本発明の制限を 意図したものではなく、本発明の範囲は前記の説明中ではなく、本明細書の「特 許請求の範囲」にあり、請求項の範囲あるいはそれらの同格物に対する全ての変 更は本発明の範喝に含まれるものである。

ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、６ 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、　ＡＵ 、　ＢＲ，ＣＡ、　ＦＩ、ＪＰ（７２）発明者　マクドナ、ジャン アメリカ合衆国　マサチューセッツ州 ０２１６７　チェスナツト　ヒル、ブリシラロード　６６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生体患者におけるアテローム性動脈硬化症のリスクを予知する方法であって 、以下記載のステップからなることを特徴とするアテローム性動脈硬化症リスク 予知方法： （ａ）検査対象患者からのファースト処理されていない（ｎｏｎ−ｆａｓｔｉｎ ｇ）血液成分サンプルをプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーにか け、不都合な信号が抑制処理されている核磁気共鳴スペクトルを発生させるステ ップ（ｂ）メチレン共鳴エンベロープに対して曲線解析処理を行うステップ （ｃ）ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びキロミクロンから得られた共鳴要素を分類 するステップ （ｄ）高密度リポプロテイン共鳴要素振幅を測定するステップ（ｅ）所定の標準 値と対比することにより前記測定された振幅を「正常」振幅、あるいはアテロー ム性動脈硬化症の高リスクを意味する「異常」振幅のいずれかに分類するステッ プ。 ２．前記ステップ（ｂ）における前記曲線解析処理はメチル共鳴エンベロープに 対して行われることを特徴とする請求項１に記載されている方法。 ３．血液をプロトンＮＭＲスペクトロスコピーにかける前記ステップ（ａ）は水 信号を抑制する処理過程を含んでいることを特徴とする請求項１に記載されてい る方法。 ４．前記ステップ（ａ）は患者から赤血球を除去した血液サンプルを採取し、該 血液サンプル内のプラズマをＮＭＲスペクトロスコピーにかける過程を有してい ることを特徴とする請求項１に記載されている方法。 ５．前記プロトン共鳴の周波数は６０ＭＨｚ以上であることを特徴とする請求項 １に記載されている方法。 ６．前記ステップ（ｄ）は測定された正常ＨＤＬ共鳴要素振幅の数学的計算手段 を有していることを特徴とする請求項１に記載されている方法。 ７．前記プロトンＮＭＲはセ氏２１度にて取得されたものであることを特徴とす る請求項１に記載されている方法。 ８．前記ステップ（ａ）の前記血液成分サンプルはファースト処理されたサンプ ルであることを特徴とする請求項１に記載されている方法。 ９．前記プロトン共鳴周波数は３６０ＭＨｚ以上であることを特徴とする請求項 ４に記載されている方法。 １０．３．９±４．５である平均正常化高密度リポプロテイン共鳴要素振幅値は アテローム性動脈硬化症の正常なリスクを表示していることを特徴とする請求項 ６に記載されている方法。 １１．１１．０±４．１である平均正常化高密度リポプロテイン共鳴要素振幅値 はアテローム性動脈硬化症の高いリスクを表示していることを特徴とする請求項 ６に記載されている方法。 １２．アテローム性動脈硬化症のリスクを予知する方法であって、以下記載のス テップからなることを特徴とするアテローム性動脈硬化症リスク予知方法： （ａ）ファースト処理されていないプラズマあるいは血清サンプルの水分抑制処 理されたプロトンＮＭＲスペクトルを取得するステップ（ｂ）メチレン共鳴要案 内のＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びキロミクロンの化学的シフト値を特定するス テップ（ｃ）当初（ｉｎｉｔｉａｌ）スペクトル並びに前記ステップ（ｂ）の化 学的シフト情報を使用し、成分残余物（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ ）を解析する曲線解析処理を行うステップ（ｄ）ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及び キロミクロン成分のエリア、線幅及び高さを得るステップ （ｅ）標準的なＬＤＬ生成物を使用し、メチル共鳴要素の強度に対応するピーク の高さがプロットされている標準曲線を作成するステップ （ｆ）標準的なＬＤＬ生成物を使用し、メチル共鳴要素の強度に対応するピーク のエリアがプロットされている標準曲線を作成するステップ （ｇ）前記ステップ（ａ）の前記プラズマあるいは血清サンプル結果を前記ステ ップ（ｅ）及び（ｆ）にて取得された前記標準曲線と対比させ、ＬＤＬコレステ ロール密度を取得するステップ（ｈ）標準的なＨＤＬ生成物を使用し、メチル共 鳴要素の強度に対応するピークの高さがプロットされている標準曲線を作成する ステップ （ｉ）標準的なＨＤＬ生成物を使用し、メチル共鳴要素の強度に対応するピーク のエリアがプロットされている標準曲線を作成するステツプ （ｊ）前記ステップ（ａ）の前記プラズマあるいは血清サンプル結果を前記ステ ップ（ｈ）及び（ｉ）にて取得された前記標準曲線と対比させ、ＨＤＬコレステ ロール密度を取得するステップ（ｋ）標準的なＶＬＤＬ生成物を使用し、メチル 共鳴要素の強度に対応するピークの高さがプロットされている標準曲線を作成す るステップ （１）標準的なＶＬＤＬ生成物を使用し、メチル共鳴要素の強度に対応するピー クのエリアがプロットされている標準曲線を作成するステップ （ｍ）前記ステップ（ａ）の前記プラズマあるいは血清サンプル結果を前記ステ ップ（ｋ）及び（１）にて取得された前記標準曲線と対比させ、ＶＬＤＬコレス テロール密度を取得するステップ（ｎ）メチル共鳴要素の解析成分からリスクイ ンデックスを取得する手段を含むステップ １３．前記ステップ（ａ）のプラズマあるいは血清サンプルはファースト処理さ れているサンプルであることを特徴とする請求項１２に記載されている方法。 １４．前記ステップ（ｂ）（ｅ）（ｆ）（ｈ）（ｉ）（ｋ）（ｌ）及び（ｎ）は メチレン共鳴要素を使用して実施されることを特徴とする請求項１２に記載され ている方法。 １５．リスクインデックスを取得する前記手段は下記の式を計算して算出するこ とをさらに特徴とする請求項１２に記載されている方法。 高さ（ＬＤＬ＋ＨＤＬ） 高さ　ＨＤＬ １６．リスクインデックスを取得する前記手段は下記の式を計算して算出するこ とをさらに特徴とする請求項１２に記載されている方法。 エリア（ＶＬＤＬ＋ＨＤＬ＋ＬＤＬ） エリア　ＨＤＬ １７．リスクインデックスを取得する前記手段は下記の式を計算して算出するこ とをさらに特徴とする請求項１２に記載されている方法。 高さ（ＶＬＤＬ＋ＨＤＬ＋ＬＤＬ） 高さ　ＨＤＬ １８．リスクインデックスを取得する前記手段は下記の式を計算して算出するこ とをさらに特徴とする請求項１２に記載されている方法。 エリア（ＨＤＬ＋ＬＤＬ） エリア　ＬＤＬ １９．リスクインデックスを取得する前記手段はＣＨ３共鳴要素を使用し、高さ のＨＤＬ相対的正常化インテンシティを取得する手段をさらに有していることを 特徴とする請求項１２に記載されている方法。 ２０．プラズマあるいは血清サンプルの前記水サプレッション処理されたプロト ンＮＭＲスペクトルはセ氏１６度から１８度にて取得されることを特徴とする請 求項１２に記載されている方法。 ２１．リポプロテイン密度を計測する方法であって、以下記載のステップからな ることを特徴とするリポプロテイン密度計測方法：（ａ）ファースト処理されて いないプラズマあるいは血清サンプルの水サプレッション処理されたプロトンＮ ＭＲスペクトルを取得するステップ （ｂ）メチル共鳴要素内のＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びキロミクロンの化学的 シフト値を特定するステップ（ｃ）当初スペクトル並びに前記ステップ（ｂ）の 化学的シフト情報を使用し、成分残余物を解析する曲線解析処理を行うステップ （ｄ）ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びキロミクロン成分のエリアを得るステップ （ｅ）標準的なＬＤＬ生成物を使用し、メチル共鳴要素の強度に対応するピーク のエリアがプロットされている標準曲線を作成するステップ （ｆ）前記ステップ（ａ）の前記プラズマあるいは血清サンプル結果を前記ステ ップ（ｅ）にて取得された前記標準曲線と対比させ、ＬＤＬコレステロール密度 をｍｇ／ｄｌ単位にて取得するステップ（ｇ）標準的なＨＤＬ生成物を使用し、 メチル共鳴要素の強度に対応するピークのエリアがプロットされている標準曲線 を作成するステップ （ｈ）前記ステップ（ａ）の前記プラズマあるいは血清サンプル結果を前記ステ ップ（ｇ）にて取得された前記標準曲線と対比させ、ＨＤＬコレステロール密度 をｍｇ／ｄｌ単位にて取得するステップ（ｉ）標準的なＶＬＤＬ生成物を使用し 、メチル共鳴要素の強度に対応するピークのエリアがプロットされている標準曲 線を作成するステップ （ｊ）前記ステップ（ａ）の前記プラズマあるいは血清サンプル結果を前記ステ ップ（ｉ）にて取得された前記標準曲線と対比させ、ＶＬＤＬコレステロール密 度を取得するステップ（ｋ）前記ステップ（ｄ）にて取得されたＶＬＤＬ及びキ ロミクロンのエリアを加算し、トリグリセリド密度をｍｇ／ｄｌ単位にて決定す るステップ。 ２２．前記ステップ（ｂ）（ｅ）（ｇ）及び（ｉ）はメチレン共鳴要素を使用し て実施されることを特徴とする請求項２１に記載されている方法。 ２３．前記ステップ（ａ）のプラズマあるいは血清サンプルはファースト処理さ れているサンプルであることを特徴とする請求項２１に記載されている方法。