BR112021000485A2 - Métodos de determinação de concentração de proteína ou peptídeo e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a métodos para determinação de concentração de proteína e/ou peptídeo ou parâmetro molecular, tal como o coeficiente de extinção, e usos dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTO-

DOS DE DETERMINAÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA OU PEPTÍDEO E USOS DOS MESMOS”.

[0001] A presente invenção refere-se a métodos de determinação da concentração e/ou parâmetros moleculares específicos, tal como o coeficiente de extinção, de uma proteína ou peptídeo, e usos dos mes- mos.

[0002] A concentração de peptídeo ou proteína, por exemplo, um anticorpo, em solução é uma propriedade importante para o desenvol- vimento e comercialização de agentes terapêuticos biológicos bem como em muitas outras áreas de pesquisa. Por exemplo, uma concen- tração exata e precisa é necessária para determinação da eficácia do fármaco e integração dos dados em um pacote coeso para apresenta- ção regulamentar.

[0003] Atualmente, há várias abordagens para determinação da concentração de uma proteína dentro de uma solução. Uma abordagem do tipo envolve determinar parâmetros específicos de molécula, tal como o coeficiente de extinção de UV (ε) ou aumento de índice refrativo diferencial (dn/dc). Outras abordagens incluem (i) análise gravimétrica (Nozaki Y., Arch. Biochem. Biophys. 249(2), 437-446 (1986)), (ii) méto- dos cromogênicos (Bradford M. M., Anal. Biochem. 72(1-2), 248-254 (1976)), (iii) determinação de nitrogênio Kjeldahl (Jaenicke L., Anal. Bi- ochem. 61(2), 623-627 (1974)) e (iv) análise de aminoácido (“AAA”) (Spackman D. H. e outros, Anal. Chem. 30(7): 1190-1206 (1958)). Esses métodos, no entanto, se baseiam em propriedades experimentalmente derivadas da proteína tal como ligação, degradação ou derivatização de ligante oposto a uma propriedade intrínseca da proteína, e pode levar a resultados inexatos e imprecisos.

[0004] Por exemplo, com o método de coeficiente de extinção de

UV (ε), ε é previsto a partir de cálculos empíricos; o resultado, no en- tanto, é apenas uma estimativa e não o valor real (vide, por exemplo, Edelhoch H., Biochemistry 6(7), 1948-1954 (1967)). Além disso, análise gravimétrica de proteínas liofilizadas, por exemplo, pode conter uma quantidade significante de água ligada, sais e/outros componentes da formulação que podem levar a cálculos de concentração inexatos. Mé- todos cromogênicos dependem da composição da proteína e requerem curvas de calibragem para prover a concentração absoluta. Problemas e limitações também surgem do uso de condições severas na determi- nação da concentração realizada por AAA, por exemplo, o que pode causar degradação de vários aminoácidos-chave durante as etapas de hidrólise e derivação, tempos de execução longos e variabilidade alta. (Sittampalam G. S. e outros, J. Assoc. of Official Anal. Chemists 71(4), 833-838 (1988)). Todos os problemas mencionados acima levam a di- minuições em exatidão e precisão quando calculando concentração e parâmetros moleculares específicos de proteínas ou peptídeos que po- dem impactar a eficácia, capacidade de desenvolvimento e comerciali- zação de uma molécula.

[0005] Portanto, um método de concentração de proteína absoluta, preciso, novo, que seja indiferente para a estrutura da proteína e com- ponentes da formulação, não se baseie em interações moleculares ou curvas de calibragem para prover concentrações absolutas, seja mais exato e preciso e evite preparação de amostra severa é desejado. Tal método seria útil, por exemplo, na determinação da concentração de uma proteína ou peptídeo na preparação da proteína ou peptídeo que é pretendido para um uso terapêutico.

[0006] Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é uma técnica quantitativa que tem sido usada para medir a concentração de compostos. No entanto, o uso de espectroscopia de RMN para me- dição das concentrações absolutas de proteínas grandes em matrizes complexas, tal como com formulações terapêuticas de anticorpo, é de- safiador e apresenta problemas similares àqueles mencionados acima. Por exemplo, um desafio é que espectros de RMN são dominados por picos intensos de vários sais, tampões, tensoativos, agentes de tonici- dade e até mesmo água presente em formulações terapêuticas. Um ou- tro problema é que a estrutura de alta ordem da maioria das proteínas e anticorpos cria ambientes magnéticos únicos em torno dos átomos de hidrogênio que causa janelas de mudança química 1H maiores para um dado aminoácido. Esses problemas, junto com outros desafios ineren- tes apresentados pelo uso de RMN (por exemplo, larguras de linha ine- rentemente mais amplas para ressonâncias de proteína), levam a dimi- nuições em exatidão e precisão quando calculando a concentração e parâmetros moleculares específicos ou proteínas.

[0007] A presente invenção provê um método de espectroscopia de ressonância magnética nuclear quantitativo novo para medição da con- centração absoluta de proteína ou peptídeo. O método espectroscópico de qRMN da presente invenção produz espectros limpos da proteína ou peptídeo com ressonâncias bem resolvidas, sem importar a complexi- dade da solução. A primeira etapa é desnaturar a proteína (para um peptídeo pequeno, essa etapa é opcional, mas recomendada) a fim de diminuir as espessuras de linha das ressonâncias de proteína acarreta- das pelas estruturas secundária, terciária e quaternária e permitir inte- gração. A segunda etapa é adquirir um espectro de qRMN com um filtro de difusão para eliminar as ressonâncias de água e dos outros compo- nentes da formulação. Finalmente, os dados são comparados com um padrão de referência para determinação da concentração precisa. Esse método é aqui referido como Método A. A concentração determinada a partir do Método A pode então ser usada para determinar um parâmetro molecular, tal como o coeficiente de extinção, da proteína ou peptídeo.

[0008] A presente invenção então provê um método de obtenção da concentração de uma proteína em solução, em que o método compre- ende desnaturar a proteína, realizar espectroscopia de RMN com um filtro de difusão e calcular a concentração da proteína usando um pa- drão de referência. A presente invenção também provê um método de obtenção da concentração de um peptídeo em solução, em que o mé- todo compreende realização de espectroscopia de RMN com um filtro de difusão, e calcular a concentração do peptídeo usando um padrão de referência. Em algumas modalidades, o método compreende ainda desnaturar o peptídeo antes da realização da espectroscopia de RMN com um filtro de difusão.

[0009] A presente invenção provê um método de obtenção do coe- ficiente de extinção de uma proteína em solução, em que o coeficiente de extinção é determinado através da Beer-Lambert Law, e em que a concentração de proteína usada na Beer-Lambert Law é determinada em um método compreendendo desnaturar a proteína, realizar espec- troscopia de RMN com um filtro de difusão e calcular a concentração da proteína usando um padrão de referência.

[0010] A presente invenção também provê um método de obtenção do coeficiente de extinção de um peptídeo em solução, em que o coefi- ciente de extinção é determinado através da Beer-Lambert Law, e em que a concentração de peptídeo usada na Beer-Lambert Law é deter- minada em um método compreendendo uma etapa opcional de desna- turação do peptídeo, seguido pelas etapas de realização de espectros- copia de RMN com um filtro de difusão e cálculo da concentração da proteína usando um padrão de referência. Em algumas modalidades, o método compreende desnaturar o peptídeo antes da realização da es- pectroscopia de RMN com um filtro de difusão.

[0011] A presente invenção provê um método de determinação da concentração de uma proteína na preparação de uma substância de fár-

maco ou produto de fármaco, em que a substância compreende a pro- teína em solução, e em que o método compreende obter um parâmetro molecular da proteína. Em algumas modalidades, o parâmetro molecu- lar é o coeficiente de extinção, e o coeficiente de extinção é determinado pela Beer-Lambert Law, e a concentração de proteína usada na Beer- Lambert Law é determinada em um método compreendendo desnaturar a proteína, realizar a espectroscopia de RMN com um filtro de difusão e calcular a concentração da proteína usando um padrão de referência.

[0012] A presente invenção provê um método de determinação da concentração de um peptídeo na preparação de uma substância de fár- maco ou produto de fármaco, em que a substância compreende o pep- tídeo em solução, e em que o método compreende obter um parâmetro molecular do peptídeo. Em algumas modalidades, o parâmetro molecu- lar é o coeficiente de extinção, e o coeficiente de extinção é determinado pela Beer-Lambert Law, e a concentração de peptídeo usada na Beer- Lambert Law é determinada em um método compreendendo opcional- mente desnaturar o peptídeo, realizar espectroscopia de RMN com um filtro de difusão e calcular a concentração do peptídeo usando um pa- drão de referência. Em algumas modalidades, o método compreende desnaturar o peptídeo antes da realização da espectroscopia de RMN com um filtro de difusão.

[0013] A presente invenção provê ainda um método de obtenção de um parâmetro molecular de uma proteína em solução, em que o método compreende desnaturar a proteína, realizar espectroscopia de RMN com um filtro de difusão, calcular a concentração da proteína usando um padrão de referência e determinar o parâmetro molecular da prote- ína a partir da concentração calculada. Em uma modalidade, a concen- tração calculada da proteína e uma propriedade do sistema determinada são usadas em uma equação correspondente para determinar o parâ-

metro molecular da proteína. Em algumas modalidades o parâmetro mo- lecular é o coeficiente de extinção e a equação correspondente é a Beer-Lambert Law.

[0014] A presente invenção também provê um método de obtenção de um parâmetro molecular de um peptídeo em solução, em que o mé- todo compreende opcionalmente desnaturar o peptídeo, e então realizar espectroscopia de RMN com um filtro de difusão, calcular a concentra- ção do peptídeo usando um padrão de referência e determinar o parâ- metro molecular da proteína a partir da concentração calculada. Em uma modalidade, a concentração calculada do peptídeo e uma proprie- dade do sistema determinada são usadas em uma equação correspon- dente para determinar o parâmetro molecular do peptídeo. Em algumas modalidades, o parâmetro molecular é o coeficiente de extinção e a equação correspondente é a Beer-Lambert Law.

[0015] A presente invenção provê um método de determinação de uma dose na preparação de uma substância de fármaco ou produto de fármaco, em que a substância compreende uma proteína em solução, em que o método compreende obter um parâmetro molecular de uma proteína a partir de uma batelada de referência, em que o parâmetro molecular é determinado em um método compreendendo desnaturar a proteína, realizar espectroscopia de RMN com um filtro de difusão, cal- cular a concentração da proteína usando um padrão de referência e de- terminar o parâmetro molecular da proteína a partir da concentração calculada. Em uma modalidade adicional, o método compreende prepa- ração de uma batelada de teste de substância de fármaco ou produto de fármaco, em que a dita concentração da proteína na batelada de teste é determinada a partir do parâmetro molecular. Em algumas mo- dalidades do tipo, a concentração de proteína é determinada usando, na equação correspondente, o parâmetro molecular e uma propriedade de sistema correspondente.

[0016] A presente invenção provê um método de determinação de uma dose na preparação de uma substância de fármaco ou produto de fármaco, em que a substância compreende um peptídeo em solução, em que o método compreende obter um parâmetro molecular do peptí- deo a partir de uma batelada de referência, em que o parâmetro mole- cular é determinado em um método compreendendo opcionalmente desnaturar o peptídeo, realizar espectroscopia de RMN com um filtro de difusão, calcular a concentração do peptídeo usando um padrão de re- ferência e determinar o parâmetro molecular do peptídeo a partir da con- centração calculada. Em uma modalidade adicional, o método compre- ende preparar uma batelada de teste de substância de fármaco ou pro- duto de fármaco, em que a dita concentração do peptídeo na batelada de teste é determinada a partir do parâmetro molecular. Em algumas modalidades do tipo, a concentração de peptídeo é determinada usando, na equação correspondente, o parâmetro molecular e uma pro- priedade do sistema correspondente.

[0017] A presente invenção também provê um método de determi- nação da concentração de uma proteína ou peptídeo na preparação de uma batelada de referência, em que a batelada de referência compre- ende a proteína ou peptídeo em solução, e em que o método compre- ende desnaturar a proteína ou opcionalmente desnaturar o peptídeo, realizar espectroscopia de qRMN com um filtro de difusão, calcular a concentração da proteína ou peptídeo usando um padrão de referência e uma técnica de referência, e determinar o parâmetro molecular da pro- teína ou peptídeo a partir da concentração calculada. Em uma modali- dade adicional, o método compreende ainda determinar a concentração de uma proteína ou peptídeo na preparação de uma batelada de teste, em que a dita concentração de peptídeo ou proteína na batelada de teste é determinada a partir do parâmetro molecular.

[0018] A presente invenção provê modalidades que são aplicáveis aos métodos descritos aqui. Uma modalidade do tipo compreende um método em que a proteína ou peptídeo é desnaturado com um agente caotrópico. Em algumas modalidades do tipo, o agente caotrópico é ureia-d4. Em outras modalidades do tipo, o agente caotrópico é cloreto de guanidínio-d6. Em algumas modalidades, o padrão de referência é um padrão de referência interno. Em modalidades preferidas, o padrão de referência é um padrão de referência externo. Em algumas modali- dades do tipo, o padrão de referência externo é um padrão primário de molécula pequena. Em uma modalidade particular, o padrão de referên- cia externo é ácido maleico. Em algumas modalidades do tipo, a técnica de referência externa é PULCON. Em algumas modalidades, a proteína é um anticorpo. Em algumas modalidades do tipo, o anticorpo é um an- ticorpo monoclonal. Em outras modalidades do tipo, o anticorpo é um anticorpo biespecífico. Em algumas modalidades, a solução compreen- dendo a proteína ou peptídeo sendo medido compreende D2O.

[0019] A presente invenção compreende também o uso do Método A, ou o parâmetro molecular determinado a partir da concentração ob- tida no Método A, em uma variedade de aplicações. Tais aplicações in- cluem determinar uma toxicologia, dose de produto de fármaco clínica e/ou comercial, um método de determinação de padrões de referência coletivos ou primários, um método de determinação da concentração de proteína ou peptídeo durante fabricação, um método separação em alí- quotas de uma proteína ou peptídeo, um método de separação em alí- quotas de uma proteína ou peptídeo em que a concentração de proteína ou peptídeo em alíquotas é similar à concentração desejada, um método compreendendo um teste em liberação de lote ou um método de formu- lação de uma substância de fármaco ou produto de fármaco.

[0020] A presente invenção compreende que o Método A pode ser usado para propósitos descritos aqui relativos a qualquer proteína ou peptídeo, tais como proteínas ou peptídeos nas áreas de agentes tera- pêuticos ou óleo. A título de exemplo (não pretendendo ser limitante), o Método A pode ser implementado em aplicações relacionadas a qual- quer um ou todos dos que seguem, incluindo quaisquer biossimilares dos mesmos, em que a proteína ou peptídeo é o ingrediente ativo que segue ou quaisquer biossimilares dos que seguem: dulaglutida (vendido em alguns países sob o nome Trulicity®), ixekizumabe (vendido em al- guns países sob o nome Taltz®), ramucirumabe (vendido em alguns pa- íses sob o nome Cyramza®), cetuximabe (vendido em alguns países sob o nome Erbitux®), olaratumabe (vendido em alguns países sob o nome Lartruvo®), necitumumabe (vendido em alguns países sob o nome Por- trazza®), anticorpos anti-CGRP tais como galcanezumabe (também co- nhecido como LY2951742), anticorpos anti-IL-23 tal como mirikizumabe (também conhecido como LY3074828), solanezumabe (também conhe- cido como LY2062430), tanezumabe, anticorpos anti-N3pG-A, anticor- pos anti-Tau, anticorpos anti-A42, anticorpos biespecíficos anti- BAFF/IL-1, anticorpos anti-CSF-1R, anticorpos anti-CXCR1/2, anticor- pos anti-IL-21, anticorpos biespecíficos anti-IL-23/CGRP, anticorpos anti-IL-33, anticorpos anti-PD-L1 e anticorpos anti-TIM-3.

[0021] A presente invenção também compreende que o Método A (i) é adequado para servir como a base para medição de outros parâ- metros intrínsecos de uma proteína ou peptídeo ou converter qualquer um dos métodos de concentração relativos atuais em um método abso- luto, (ii) pode ser usado para quantificar peptídeos que carecem de ami- noácidos e são difíceis de monitorar através de UV, (iii) permite que pre- paração de amostra e aquisição de dados sejam mais fáceis, mais rápi- das e mais seguras do que o método AAA atual, (iv) provê linearidade, precisão e exatidão das concentrações resultantes que são adequadas para uma variedade de proteínas e formulações e (v) pode ser usado para quantificar outros tipos de macromoléculas (por exemplo, políme- ros, tensoativos, etc.) na presença de contaminantes de molécula pe- quena.

[0022] A presente invenção compreende que os métodos descritos aqui podem utilizar as equações matemáticas também descritas aqui. Por exemplo, a concentração de proteína, CP, em unidades de gramas por litro pode ser calculada a partir do espectro de qRMN com a equa- ção que segue:

𝐴P 𝐻S 𝑐P = 𝑐S 𝑓𝐷𝐹 𝑓𝐸𝑅 𝑓𝐷𝐼𝐿 𝑓𝑈 (Eq. 1).

𝐴S 𝐻P Uma descrição detalhada dessa equação, por exemplo, é feita aqui.

[0023] Um versado de habilidade comum reconheceria que embora programas de software particulares sejam exemplificados aqui, outros programas podem ser usados para obter resultados comparáveis.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0024] Fig. 1. A sequência de pulso bppste para espectrômetros Agilent (tcc, Dbppste) e definição dos vários atrasos.

[0025] Fig. 2. Espectros de 1H RMN de mAb NIST. Espectro de 1H RMN de mAb NIST (A) em forma nativa com uma sequência de um pulso padrão, (B) o mesmo que A com escala vertical 5000x, (C) nativo com um filtro de difusão e (D) desnaturado com um filtro de difusão. Os picos marcados com um asterisco são do tampão de histidina. O número de varreduras foi 1024 para A-C e 64 para D.

[0026] Fig. 3. Medições de D em mAb NIST. Fig. 3a: espectros de RMN do padrão mAb desnaturado adquirido com a sequência de pulso bppste. Inserção: expansão do pico para as ressonâncias de I/L/V. In- serção: imagem ampliada de região indicada. Fig. 3b: Esquerda: espec- tros de RMN puros para as espécies de difusão diferentes conforme de- terminado através do algoritmo DECRA. Direita: gráfico Stejkal-Tanner e coeficientes de difusão do algoritmo DECRA.

[0027] Fig. 4. Medições de T1 e T2 em mAb NIST. Fig. 4a: dados representativos das medições de T1 e T2 usando a sequência de pulso bppste. Esquerda: espectros de RMN de parâmetros para o ajuste da sequência de pulso bppste para medição de T1. Direita: espectros de RMN de e parâmetros para o ajuste da sequência de pulso bppste para medição de T2. Fig. 4b: Gráfico para cálculos de T1 e T2.

[0028] Fig. 5. Espectros de DF-qRMN das 14 amostras de BSA NIST desnaturado. Inserção: imagem ampliada de região indicada.

[0029] Fig. 6. Concentrações de amostra de BSA NIST: Método A versus medição gravimétrica.

[0030] Fig. 7. Volume Parcial-Específico de BSA NIST: densidade de amostra versus concentração de BSA.

[0031] Fig. 8. Espectros de DF-qRMN das 14 amostras de anticorpo biespecífico desnaturado. Espectros de DF-qRMN das 14 amostras do anticorpo biespecífico desnaturado. O pico para água residual é mar- cado com um asterisco. Inserção: imagem ampliada de região indicada.

[0032] Fig. 9. Concentrações de amostra de anticorpo biespecífico: Método A versus medição gravimétrica. Definições:

[0033] Como aqui usado, “espectroscopia de ressonância magné- tica nuclear” (também referida como “espectroscopia de RMN”) se refere a uma técnica espectroscópica conhecida de um versado de habilidade comum na técnica, em que espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) podem ser usados para estudar a estrutura de moléculas orgâ- nicas. Como aqui usado, “espectroscopia de ressonância magnética nu- clear quantitativa” (também referida como “espectroscopia de qRMN”) se refere à obtenção de informação quantitativa sobre pureza ou con- centração de amostra a partir de um ou mais espectros de RMN. Tais espectros são aqui referidos como espectros de ressonância magnética nuclear quantitativa (qRMN). Espectroscopia de RMN pode incorporar o uso de um “filtro de difusão”, que pode ser usado para seletivamente amortecer o sinal de moléculas menores em uma mistura com base em seu tamanho (vide, por exemplo, Stilbs P., Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 19(1): 1-45 (1987)). Para equilibrar a atenuação dos picos de matriz e picos de proteína, a resistência do filtro de difusão pode ser determinada por um versado comum na técnica com base no contexto de cada experimento. Por exemplo, se o equilíbrio for muito fraco, então o filtro de difusão tem valor limitado. Se o equilíbrio for muito forte, o filtro de difusão começa a suprimir os sinais de proteína, o que reduz a razão sinal-para-ruído da medição. Essa redução pode então resultar em tempos de experimento mais longos. Como um outro exemplo, se um dos componentes da matriz não for completamente eliminado e ele apresentar um pico de interferência, então haverá uma contribuição para a área de pico da proteína, e ele deve ser subtraído a fim de obter os resultados mais precisos. Isso pode ser feito preparando uma amos- tra em branco contendo a matriz sem a proteína, administrar a amostra em branco com o filtro de difusão, determinar a área do pico de matriz restante e subtrair esse número da área obtida para a amostra de pro- teína.

[0034] Como aqui usado, um “padrão de referência” se refere a um composto cujo espectro de 1H-RMN provê pelo menos um pico distinto representando um número conhecido de prótons, e cuja pureza e con- centração são conhecidas com um grau de certeza alto. Um padrão de referência pode ser um padrão de referência interno, em que o padrão de referência está presente na solução contendo a proteína ou peptídeo de interesse, ou um padrão de referência pode ser externo, onde o pa- drão de referência é separado da solução contendo a proteína ou pep- tídeo de interesse. Um padrão de referência pode ser um padrão de referência primário de molécula pequena, que é um material que não é calibrado contra um outro padrão e ao invés é definido por qualidades tal como sua massa. Materiais de referência certificados de molécula pequena geralmente usados como padrões internos de 1H qRMN estão prontamente disponíveis e podem ser também usados como padrões internos [vide, por exemplo, Rigger e outros, M. J. AOAC International, 2017, 100, 1365-1375.].

[0035] Uma técnica de referência é um algoritmo matemático que usa dados do padrão de referência. Por exemplo, uma técnica de refe- rência externa é o algoritmo matemático que usa dados do padrão de referência externo. Um exemplo de tal é a técnica de determinação do comprimento do pulso-concentração da base (PULCON) (Wider G. e Dreier L. J., Am. Chem. Soc. 128(8), 2571-2576 (2006)).

[0036] Como aqui usado, espectros de “DF-qRMN” se referem a es- pectros de RMN aos quais um filtro de difusão foi aplicado, e dos quais informação quantitativa sobre a pureza ou concentração da proteína ou peptídeo de interesse pode ser obtida quando comparado com um pa- drão de referência.

[0037] Como aqui usado, um “parâmetro molecular” significa um va- lor escalar que se refere à maneira que alguma propriedade do sistema (por exemplo, absorbância, densidade, índice refrativo) muda em res- posta a mudanças em outras propriedades do sistema (por exemplo, temperatura, pressão ou composição). A equação (“equação correspon- dente”) usada para determinar um parâmetro molecular pode variar de- pendendo de qual propriedade ou quais propriedades do sistema são conhecidas. Um parâmetro molecular se refere a uma propriedade in- trínseca de uma proteína ou peptídeo.

[0038] Por exemplo, um coeficiente de extinção (ε) é um parâmetro molecular que descreve como a absorbância de uma solução muda em resposta a mudanças na concentração das espécies absorventes e o comprimento do percurso através do qual a luz viaja. O coeficiente de extinção de uma proteína ou peptídeo (mL/(mg . cm)] pode ser determi-

nado através de uma combinação de espectroscopia de ultravioleta-vi- sível (UV-Vis) e Método A como segue: A   cl (Beer-Lambert Law), em que A é a absorbância da solução de proteína ou peptídeo, l é o com- primento do percurso [cm] e c é a concentração de proteína ou peptídeo absoluta [mg/mL]. Como um outro exemplo, o volume específico parcial aparente ( v ) [mL/g] de uma proteína ou peptídeo pode ser determinado através de uma combinação de densitometria e Método A como segue:    0  1  v  0   c 1000  , em que  é a densidade da solução de prote- ína ou peptídeo [g/mL],  0 é a densidade da matriz de solução de prote- ína ou peptídeo [g/mL] e c é a concentração de proteína ou peptídeo absoluta [mg/mL]. Como um terceiro exemplo, o aumento refrativo (di- ferencial) ( dn dc ) de uma proteína ou peptídeo [mL/mg] pode ser deter- minado através de uma combinação de refractometria (diferencial) e Método A como segue: n  n 0   dn dc  c , em que n é o índice refrativo da solução de proteína ou peptídeo, n 0 é o índice refrativo da matriz da so- lução de proteína ou peptídeo e cé a concentração de proteína ou pep- tídeo absoluta [mg/mL].

[0039] Uma pessoa de habilidade comum pode determinar o parâ- metro molecular de interesse através de regressão linear de medições múltiplas de absorbância/densidade/índice refrativo como uma função de concentração (concentração conforme determinado a partir do Mé- todo A). Um parâmetro molecular, tal como o coeficiente de extinção, pode ser usado para determinar a concentração de um medicamento através da medição da propriedade de sistema correspondente, tal como absorbância de UV, e resolução da equação correspondente que se relaciona com a mesma (por exemplo, Beer-Lambert Law).

[0040] A estrutura geral de um “anticorpo monoclonal” é conhecida. Um anticorpo IgG é hetero-tetrâmero de quatro cadeias de polipeptídeo (duas cadeias “pesadas” idênticas e duas cadeias “leves” idênticas) que são reticuladas por meio de ligações dissulfeto intra- e intercadeia. As regiões variáveis de cada par de cadeia pesada-cadeia leve se asso- ciam para formar sítios de ligação. A região variável de cadeia pesada (VH) e a região variável de cadeia leve (VL) podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões de determinação de complementaridade (“CDRs”), interespaçadas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura principal (“FR”). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal carbóxi na ordem que segue: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As CDRs contêm a maioria dos resíduos que formam interações específicas com o antígeno.

[0041] Como aqui usado, “anticorpo biespecífico” se refere a um construto de anticorpo bivalente que inclui, mas não está limitado a, um formato IgG-scFv (como reportado no PCT/US2015/058719) e formatos IgG bivalentes (como descrito na US 2018/0009908). A presente inven- ção também compreende que qualquer proteína ou anticorpo engenhei- rado por humano, sem importar a estrutura terciária ou quaternária, pode ser também usado nos métodos descritos aqui. Exemplos de tais proteínas ou anticorpos engenheirados por humano incluem anticorpos triespecíficos ou tetraespecíficos e proteínas de fusão.

[0042] Como aqui usado, um peptídeo compreende uma cadeia po- limérica de aminoácidos. Esses aminoácidos podem ser aminoácidos naturais ou sintéticos, incluindo aminoácidos modificados. Peptídeos podem ter estrutura menos secundária e terciária, mas são propensos a agregar em solução; portanto, um peptídeo também pode ser desna- turado com um agente caotrópico. Desnaturação de um peptídeo pode resultar em um aumento na razão sinal-para-ruído em espectroscopia de RMN, dessa maneira tornando a integração mais fácil. Desnaturação de um peptídeo também permitiria o exame de amostras mais concen- tradas, dessa maneira levando a tempos experimentais mais curtos.

Para os propósitos dos métodos descritos aqui, a determinação da con- centração de peptídeo pode ser mais precisa quando o peptídeo é des- naturado. Para desnaturação com um agente caotrópico, o agente cao- trópico preferido dependerá das exigências particulares de cada peptí- deo e pode ser determinado experimentalmente por uma pessoa de ha- bilidade comum na técnica.

[0043] Uma pessoa de habilidade comum na técnica reconheceria que uma proteína compreende uma ou mais cadeias de aminoácidos de peptídeo poliméricas. Esses aminoácidos podem ser aminoácidos natu- rais ou sintéticos, incluindo aminoácidos modificados. Uma proteína pode ser uma proteína recombinante. A estrutura primária de uma pro- teína é compreendida de sua sequência linear de subunidades de ami- noácido monoméricas. A estrutura secundária de uma proteína inclui o padrão de ligações hidrogênio dando origem a características estrutu- rais tridimensionais de segmentos locais de cadeia de aminoácido, tais como hélices α e folhas β. A estrutura terciária de uma proteína des- creve o formato geral de uma proteína como definido pelas coordenadas atômicas tridimensionais. Estrutura quaternária se refere à disposição de duas ou mais subunidades de proteína em um complexo. Uma pro- teína pode ser “desnaturada”, em que um estresse externo ou agente caotrópico é adicionado à solução contendo a proteína e a proteína se desdobra. Uma proteína desnaturada, portanto, perdeu a maioria de suas características estruturais secundárias, terciárias e quaternárias. Exemplos de agentes caotrópicos incluem ureia-d4 e cloreto de guanidí- nio-d6.

[0044] Também como aqui usado, uma “solução” se refere a um peptídeo ou proteína em uma mistura aquosa engenheirada por humano que contém componentes em adição à água. Uma “batelada” se refere a uma quantidade específica de um fármaco ou outro material que é uma proteína ou peptídeo e é pretendido ter caráter e qualidade unifor- mes, dentro de limites especificados, e é produzido de acordo com uma ordem de fabricação única durante o mesmo ciclo de fabricação. Um “lote” se refere a uma batelada, ou uma porção identificada específica de uma batelada, tendo caráter e qualidade uniformes dentro de limites especificados; ou, no caso de um produto de fármaco produzido através de processo contínuo, ele é uma quantidade identificada específica pro- duzida em uma unidade de tempo ou quantidade de uma maneira que assegure que ele tenha caráter e qualidade uniformes dentro de limites especificados. Uma “batelada de referência” se refere a material de re- ferência primário da casa estabelecido e caracterizado apropriada- mente, em que o material compreende uma proteína ou peptídeo, e em que o material é preparado a partir de lote(s) representativos de produ- ção e materiais clínicos. O Método A é usado para determinar a concen- tração e parâmetro molecular, tal como o coeficiente de extinção, de uma proteína ou peptídeo em solução na batelada de referência. O pa- râmetro molecular, tal como o coeficiente de extinção, obtido a partir da batelada de referência, é então usado para determinar a concentração de proteína ou peptídeo em um lote subsequente (aqui referido como “batelada de teste”).

[0045] Como aqui usado, “produto de fármaco” é uma forma de do- sagem acabada, por exemplo, comprimido, cápsula ou solução, que contém uma substância de fármaco, geralmente, mas não necessaria- mente, em associação com um ou mais outros ingredientes. Uma “subs- tância de fármaco” é um ingrediente ativo que pretende conceder ativi- dade farmacológica ou outro efeito direto no diagnóstico, cura, mitiga- ção, tratamento ou prevenção de doença ou afetar a estrutura ou qual- quer função do corpo humano, mas não inclui intermediários usados na síntese de tal ingrediente. Como aqui usado, uma substância de fár- maco compreende uma proteína ou peptídeo. O Método A pode ser usado para vários propósitos relacionados a produto de fármaco ou substância de fármaco compreendendo uma proteína ou peptídeo, tal como através da fabricação do produto de fármaco ou substância de fármaco.

[0046] Uma “dose” se refere a uma quantidade de proteína ou pep- tídeo na matriz que elicitará a resposta biológica ou médica desejada. A substância pode ser liofilizada ou em uma solução aquosa. Para prepa- rar uma substância pretendida para um uso terapêutico, um versado de habilidade comum na técnica compreenderia que uma concentração exata e precisa da proteína ou peptídeo é necessária. Os métodos des- critos aqui proveem um meio novo para obtenção da concentração de proteína ou peptídeo através da determinação do coeficiente de extin- ção ou outro parâmetro molecular da proteína ou peptídeo em uma ba- telada de referência e então uso desse coeficiente de extinção ou outro parâmetro molecular para determinar a concentração de proteína ou peptídeo em bateladas de teste subsequentes.

[0047] Separar em alíquotas significa remover uma porção de um volume maior em um recipiente e adicioná-la a um recipiente separado. Um recipiente pode ser qualquer item, tal como um recipiente, frasco pequeno, balão de vidro ou dispositivo, que seja adequado para conter uma proteína ou peptídeo, liofilizado ou em solução.

[0048] Um teste em uma liberação de lote se refere a uma determi- nação de laboratório apropriada de conformação satisfatória às especi- ficações finais para o produto de fármaco (compreendendo uma prote- ína ou peptídeo), incluindo a resistência (concentração) de cada ingre- diente ativo, antes da liberação (liberação pelo fabricante no mercado). O teste em liberação de lote pode ser, por exemplo, um teste de UV em liberação de lote. A concentração da proteína ou peptídeo pode ser de- terminada a partir do coeficiente de extinção da proteína ou peptídeo, em que o coeficiente de extinção é determinado a partir do Método A em uma batelada de referência.

[0049] Os Exemplos que seguem ilustram mais a invenção e pro- veem métodos e procedimentos típicos para realização de várias moda- lidades particulares da presente invenção. No entanto, é compreendido que os Exemplos são mostrados a título de ilustração e não limitação, e que várias modificações podem ser feitas por um versado de habilidade comum na técnica.

EXEMPLOS Preparação de Amostras

[0050] Padrão de referência: qualquer composto com um espectro de 1H-RMN que proveja pelo menos um pico distintivo representando um número conhecido de prótons, pureza e concentração conhecidas com um grau de certeza alto e estabilidade química e física em solução pode ser usado para facilitar o cálculo da concentração absoluta a partir dos espectros de DF-qRMN. Por exemplo, ácido maleico pode ser usado como um padrão de referência de quantificação externo. Para preparar o ácido maleico como um padrão de referência externo, ácido maleico certificado (11,183 mg, 0,096347 mmol) é posto em um balão de vidro volumétrico de 5 mL e dissolvido em D2O. Uma alíquota é trans- ferida para um tubo, tal como um tubo de RMN de 4 mm de precisão Wilmad 435, de modo que a altura da amostra seja 40 mm.

[0051] Amostras de Proteína: cloreto de guanidínio-d6 (0,6 g, 6 mmol) é posto em um balão de vidro volumétrico de 1 mL. O frasco é posto em uma balança, e 400 μl de solução de proteína são adiciona- dos. A solução é gentilmente sonificada e vortexada até que todos os sólidos sejam dissolvidos. D2O é adicionado para obter o volume final. Uma alíquota é transferida para um tubo, tal como um tubo de RMN de 4 mm de precisão Wilmad 435, de modo que a altura da amostra no tubo seja 40 mm.

[0052] Amostras de Peptídeo: ureia-d4 (0,13 g, 2 mmol) é posta em um balão de vidro volumétrico de 1 mL. O frasco é posto em uma ba- lança, e ~1 mL de solução de proteína é adicionado. A solução é então suavemente sonificada e vortexada até que todos os sólidos sejam dis- solvidos. D2O é adicionado para obter o volume final. Uma alíquota é transferida para um tubo, tal como um tubo de RMN de 4 mm de preci- são Wilmad 435, de modo que a altura da amostra no tubo seja 40 mm. Cálculos

[0053] A concentração de proteína, cP, em unidades de gramas por litro é calculada a partir do espectro de DF-qRMN com a equação que segue:

𝐴P 𝐻S 𝑐P = 𝑐S 𝑓𝐷𝐹 𝑓𝐸𝑅 𝑓𝐷𝐼𝐿 𝑓𝑈 (Eq. 1)

𝐴S 𝐻P onde cS é a concentração do padrão de referência, AP é a área do pico de proteína selecionado no espectro de DF-qRMN (tipicamente aquele dos grupos metila valina, isoleucina e leucina entre 1,0-1,4 ppm, mas poderia ser qualquer pico resolvido), HS é o número de prótons contri- buindo para o pico padrão de referência, AS é a área do pico padrão de referência, HP é o número de prótons contribuindo para o pico de proteína e os vários f’s são funções que dependem das condições experimentais específicas. ƒDF explica a atenuação da área de pico da proteína devido ao filtro de difusão ser derivado da equação Stejskal- Tanner (Johnson, C. S. e outros, Concepts in Magnetic Resonance Part A 2012, 40A, 39-65). Para a sequência de pulso bppste (Pelta, M. D e outros, Magn. Reson. Chem. 1998, 36, 706-714) usada aqui, ela é dada por:  2 2 g2 2 [−  −3 ] 𝑓𝐷𝐹 = 2 𝑒 T1 𝑒 T2 𝑒 𝐷 3 2 (Eq. 2) onde γ é a razão magnetogírica para 1H, g é a força de gradiente de campo de pulso, δ é o comprimento do gradiente de campo de pulso, Δ é o atraso de difusão, T1 é o tempo de relaxação nuclear da rede de spin para os prótons da proteína de interesse, T2 é o tempo de relaxa- ção nuclear spin-spin para os prótons da proteína de interesse, D é o coeficiente de difusão de tradução da proteína, 1 é o tempo entre os segundo e terceiro pulsos de 90º na sequência de pulso bppste (vide Figura 1), 2 é o tempo total entre os primeiro e segundos pulsos de 90º (e entre o terceiro pulso de 90º e aquisição) e 3 é o tempo total entre os pulsos de gradiente de campo de pulso dos pares de pulso bipolar. Para a sequência de pulso fornecida em instrumentos Agilent, esses termos são definidos pelos parâmetros de instrumento que seguem: τ1 = ∆ − δ − 2t gs − 4𝜃P − 2t rg (Eq. 3) τ2 = 2(δ + 2t gs + 2𝜃P + 2t rg ) (Eq. 4) τ3 = t gs + 2𝜃P + t rg (Eq. 5) onde tgs é o atraso de estabilização de gradiente, trg é o tempo de disparo do receptor precedendo o pulso e Θ é a largura do pulso a 90º. Para outras sequências de pulso de difusão, a expressão para fDF será diferente. fER contém os parâmetros de instrumento necessários para referência externa. Na forma mais básica:

SS GS 𝑓𝐸𝑅 = (Eq. 6)

SP GP onde S e G são o número de varreduras e o ganho de receptor, respectivamente, usados para coletar os espectros de RMN individuais da proteína e padrão de referência. Quando usando a metodologia PULCON, ela se torna: 𝑇P 𝜃P SS GS 𝑓𝐸𝑅 = (Eq. 7) 𝑇S 𝜃S SP GP onde T é a temperatura da amostra durante a aquisição dos espectros de RMN. fDIL representa diluição de amostra de proteína inicial para aquela da amostra de RMN final. Se o volume final for obtido volumetricamente, e a alíquota da amostra inicial for feita gravimetricamente, então esse fator é dado por: volF 𝑓𝐷𝐼𝐿 = 𝑑I (Eq. 8) wtI onde volF é o volume de solução final (isto é, a solução da amostra de RMN) e wtI e dI são o peso e a densidade da alíquota da solução de proteína inicial. Alternativamente, se diluição for feita através de adição gravimétrica de ambas a solução de proteína inicial e D2O, então: 𝑤𝑡𝐷2𝑂 ∙𝑑𝐼 𝑓𝐷𝐼𝐿 = 1 + (Eq. 9) 𝑑𝐷2𝑂 ∙𝑤𝑡𝐼 onde wtD2O e dD2O são o peso e a densidade de D2O. Finalmente, fU converte as unidades de concentração a partir daquelas do padrão de referência de quantificação, geralmente milimoar, nas unidades típicas de gramas por litro (ou equivalentemente, miligramas por mililitro). Nesse caso:

𝑀𝑃 𝑓𝑈 = (Eq. 10) 1000 onde MP é o peso molecular da proteína.

[0054] O primeiro termo exponencial na Eq. 2 descreve atenuação de sinal devido à relaxação nuclear T1, o segundo devido à relaxação nuclear T2 e o terceiro devido à difusão molecular. De todos os termos na equação, essas três quantidades (T1, T2 e D) são as únicas desco- nhecidas; todas as outras são parâmetros de sequência de pulso/instru- mento ou uma constante física (γ). T1, T2 e D dependem da molécula e das condições da solução, e devem ser medidos para cada única amos- tra. Isso pode ser feito com três experimentos separados usando a mesma sequência de pulso que o filtro de difusão. A medição de D é um experimento bem conhecido, em que espectros múltiplos são adquiridos com força de gradiente aumentada (Stejskal, E. O. e Tanner, J. E., J. Chem. Phys., 1965, 42, 288-292). Isso mantém os termos T1 e T2 da Eq. 2 constantes, fazendo com que a atenuação de sinal seja governada apenas por D. D é então calculado aplicando um algoritmo adequado, tal como DECRA (Windig, W.; Antalek, B. Chemom. Intell. Lab. Syst., 1997, 37, 241-254). Para medir T1 com a sequência de pulso bppste Agilent, espectros múltiplos são adquiridos usando combinações do atraso de difusão e força de gradiente (gzlvl1), de modo que: ∆′1 𝑔𝑧𝑙𝑣𝑙1𝑛 = 𝑔𝑧𝑙𝑣𝑙11 × √ (Eq. 11) ∆′𝑛 onde ’ é o atraso de difusão correto dado por:  3 ′ =  − − (Eq. 12) 3 2 Isso mantém os termos T2 e D da Eq. 2 constantes, fazendo com que a atenuação de sinal seja governada apenas pela relaxação T1. O T1 eficaz para os prótons do pico de proteína selecionado é então calcu- lado a partir do ajuste monoexponencial de AP vs. 1.

[0055] Para medir T2 com a sequência de pulso bppste Agilent, es- pectros múltiplos são adquiridos com combinações do atraso de estabi- lização de gradiente, atraso de difusão e força de gradiente, de modo que: ∆𝑛 = ∆1 + (t rg,𝑛 − t rg,1 ) (Eq. 13) e gzlvl ln é determinado como mostrado acima. Isso mantém as por- ções de T1 e D da equação constantes, fazendo com que a atenuação de sinal seja governada apenas pela relaxação T2. O T2 eficaz para os prótons do pico de proteína selecionado pode ser calculado a partir de um ajuste monoexponencial de AP vs. 22. Aquisição de Dados do Método A

[0056] Um espectrômetro de RMN de 600 MHz Agilent DD2 é equi- pado com uma Agilent 1H-19F/15N-31P PFG OneProbe. A temperatura da sonda e gradientes de campo de pulso são calibrados com amostras de etileno glicol e H2O 1% em D2O, respectivamente. O espectro de RMN é adquirido a 30,0o C com a sequência de pulso eco estimulada com par de pulso bipolar (bppste). O número de varreduras é 64. Parâmetros de aquisição incluem uma largura espectral de 20 ppm, um tempo de aquisição de 1,363 s, um atraso de relaxação de 30 s, um atraso de difusão de 150 ms, pulsos de gradiente de 1,4 ms que são fortes 0,569 T/m (92% de máximo) e um atraso de estabilização de gradiente de 1 ms.

[0057] Para medir o coeficiente de difusão de tradução (D), parâmetros de aquisição incluem um atraso de relaxação de 1 s, um atraso de difusão de 200 ms, um comprimento de gradiente de difusão de 2,0 ms, um atraso de estabilização de gradiente de 0,5 ms e sete valores da força de gradiente variando de 0,228 a 0,569 T/m (ca. 37- 92% de máximo) com espaçamento logarítmico. O tempo de relaxação nuclear da rede de spin (T1) é medido com a sequência de pulso bppste usando uma largura espectral de 20 ppm, um tempo de aquisição de 1,363 s, um atraso de relaxação de 3,637 s, um comprimento de gradiente de difusão de 2,0 ms e um atraso de estabilização de gradiente de 0,5 ms. Cinco pares do atraso de difusão e força de gradiente (100 ms, 0,569 T/m); (203 ms, 0,400 T/m); (408 ms, 0,281 T/m); (804 ms, 0,200 T/m); e (1202 ms, 0,164 T/m) – são usados.

[0058] O tempo de relaxação nuclear spin-spin (T2) é também me- dido com a sequência de pulso bppste usando uma largura espectral de 20 ppm, um tempo de aquisição de 1,363 s, um atraso de relaxação de 1 s, um comprimento de gradiente de difusão de 1,4 ms. Seis conjuntos do atraso de estabilização de gradiente, atraso de difusão e força de gradiente são usados – (1 ms, 150,001 ms, 0,570); (2 ms, 150,002 ms, 0,571 T/m); (4 ms, 150,004 ms, 0,573 T/m); (8 ms, 150,008 ms, 0.577 T/m); (12 ms, 150,012 ms, 0,581 T/m); e (16 ms, 150,016 ms, 0,575 T/m). Análise de Dados

[0059] Os dados de DF-qRMN, T1 e T2 são processados em MNova v 11.0 (Mestrelab Research, S. L., Santiago de Compostela, Espanha) e os dados de difusão são processados e analisados com DOSYToolbox v2.5 (Nilsson, M. J. Magn. Reson. 2009, 200, 296-302). Os FIDs são preenchidos com zero uma vez e multiplicados por uma função de janela exponencial de 2,93 Hz antes da transformada de Fourier. Os coeficientes de difusão são obtidos usando o algoritmo DECRA disponível em DOSYToolbox. Os valores de T 1 e T2 são calculados a partir da sequência de pulso bppste através de análise de regressão usando MATLAB 2016b (MathWorks, Inc., Natick, Ma). As áreas de pico das metilas leucina, isoleucina e/ou valina são obtidas através de desconvolução usando a rotina de ajuste de linha em MNova ou CRAFT. Uso do Método A em anticorpo RM 8761 NIST

[0060] Para ilustrar os desafios de quantificação de proteínas for- muladas, grandes, através de RMN, uma amostra RM 8761 NIST (10 g/L de anticorpo, HCl de L-histidina 1,25 mM, pH 6,0, comercialmente disponível do National Institute of Standards and Technology (NIST); vide, por exemplo, Schiel e outros, Anal. and Bioanal. Chem., 410(8): 2127-2139 (2018)) é tratada com D2O 10% e o espectro de 1H 1D RMN é obtido (Figura 2). O sinal de água é tão intenso e amplo que ele obscurece os sinais do anticorpo. Os picos de excipiente de histidina são também observados no espectro. Para obter um espectro viável da proteína, esses picos dominantes devem ser eliminados. Uma técnica de RMN que é ideal para essa aplicação é um “filtro de difusão”, onde os picos são eliminados do espectro com base nos coeficientes de difusão, e então tamanho, das moléculas correspondentes. O espectro 1 de H-RMN adquirido na mesma amostra de mAb NIST com a sequência de pulso de difusão eco estimulada com par de pulso bipolar (bppste) como um filtro de difusão é também mostrado na Figura 2. O filtro de difusão é eficaz na remoção dos sinais indesejados da formulação sem introduzir artefatos de linha basal ou distorções de fase.

[0061] No entanto, na maioria dos casos, há resolução insuficiente para identificação e integração de pico precisas devido às larguras de linha amplas caracteristicas das ressonâncias de proteína. Isso é devido principalmente à estrutura de ordem superior (HOS) da proteína. Um tipo único de aminoácido, que de outro modo teria mudanças químicas muito similares, mostra uma distribuição de mudança química ampla devido a ambientes magnéticos únicos resultantes das estruturas secundária, terciária e quaternária da proteína. Portanto, o HOS é removido através de desnaturação da proteína. Adição de desnaturante à solução de proteína faz com que o volume da amostra expanda. Para ser verdadeiramente quantitativo, mais solvente é adicionado para obter um volume preciso, por exemplo, usando um balão de vidro volumétrico. Isso é a base para fDIL na Eq. 1.

[0062] A 1H-RMN filtrada por difusão da amostra RM 8761 NIST pre- parada com cloreto de guanidínio-d6 6 M é mostrada na Figura 2. Dimi- nuição na largura de linha e subsequente aumento em sinal-para-ruído são observados. Os grupos de pico entre 1,0-1,4 ppm, que correspon- dem aos grupos metila isoleucina, leucina e/ou valina, têm resolução próximo da linha basal, permitindo que eles sejam integrados para aná- lise quantitativa.

[0063] O filtro de difusão é eficaz no isolamento dos sinais de pro- teína a partir da matriz; no entanto, o filtro de difusão resulta em uma falta de quantificação inerente das áreas de pico de RMN medidas. Ex- perimentos de qRMN de rotina usam uma sequência de pulso de RMN simples, que consiste em três elementos básicos: um atraso de relaxa- ção nuclear, um pulso de radiofrequência e um período de aquisição de dados. Quando um atraso de relaxação nuclear suficientemente longo é usado, a área de pico de RMN resultante é precisamente e reproduzi- velmente proporcional ao número de núcleos observados; portanto, o experimento é quantitativo. Todas as outras sequências de pulso de RMN, incluindo a sequência de difusão empregada aqui, requerem pul- sos de radiofrequência múltiplos separados por vários atrasos. Conse- quentemente, os espectros resultantes não são mais intrinsicamente quantitativos devido a fatores que atenuam os picos a partir do valor de equilíbrio. No entanto, se esses fatores forem conhecidos e o grau de atenuação puder ser calculado, então o filtro de difusão pode ser tor- nado quantitativo. Isso é a base para fDF na Eq. 1.

[0064] Um padrão de referência externo é preferido com relação a um padrão de referência interno porque o primeiro evita interações po- tenciais entre as duas moléculas e/ou sobreposição dos picos no espec- tro de RMN, embora um padrão interno possa ser usado. Vários méto- dos de padrão externo foram reportados, incluindo a técnica PULCON (por exemplo, Pulse Length-Base Concentration Determination). Essa técnica se relaciona a áreas absolutas de dois espectros individu- ais, uma do padrão de referência e a outra do analito, mesmo se as condições de solução e parâmetros experimentais forem diferentes. Portanto, o padrão de referência externo não precisa ter características similares ao analito de interesse ou até mesmo ser uma proteína. Ainda, ao invés de necessitar um padrão para cada aminoácido, como é o caso para AAA, esse método necessita apenas um padrão único.

[0065] Para demonstrar a exatidão e a precisão do Método A, três réplicas independentes da amostra RM 8761 NIST são avaliadas. Sinal- para-ruído amplo é obtido nessa formulação de proteína de 10 g/L usando apenas 64 varreduras e um tempo de aquisição total de 37 min. O grupo de sinais para os grupos metila I/L/V na proteína (1,0 – 1,4 ppm), que corresponde a 1,476 prótons, tem resolução quase na linha basal. Esses resultados permitem integração precisa para quantifica- ção. Para facilitar o cálculo da concentração, T1, T2 e D são também medidos para esse grupo de pico com a sequência de pulso bppste como acima descrito, aquisição e análise de dados realizadas são mos- tradas na Figura 3 e na Figura 4.

[0066] O tempo de experimento total para todos os quatro experi- mentos de RMN em uma réplica é 110 min. A concentração de cada réplica é então calculada a partir da Eq. 9 usando o peso molecular não glicosilado, intacto, (148,041 Da) e um fator de diluição baseado no peso da alíquota e na densidade da amostra medida. A concentração média é determinada ser 10,02 g/L com um RSD de 0,55%. Isso está de acordo com o valor classificado de 10 g/L.

[0067] Esses dados demonstram que o Método A pode ser usado para determinar com exatidão e precisão a concentração de um anti- corpo. Uso do Método A em albumina de soro bovino (BSA) NIST

[0068] Material de referência padrão BSA NIST 927e (67,38 g/L, cloreto de sódio 20 mM, pH ajustado para 6,5-6,8 com 1,0 mol/L de hi- dróxido de sódio, comercialmente disponível do National Institute of Standards and Technology) é diluído gravimetricamente para quatro concentrações de proteína adicionais (Tabela 1, amostras B1-B4). Qua- torze amostras totais são analisadas, incluindo seis réplicas na concen- tração média (B3), três réplicas em cada uma das concentrações mais altas (B5) e mais baixas (B1), e réplicas únicas nas concentrações in- termediárias (B2 e B4). A amostra de RMN para cada réplica é prepa- rada como descrito acima. A aquisição e análise de dados do Método A são realizadas como descrito acima. Os quatorze espectros de DR- qRMN são mostrados superpostos na Figura 5.

[0069] Esses dados demonstram que o pico de água foi quase eli- minado, a linha basal não é perturbada e o grupo de sinais para os grupos metila I/L/V na proteína tem resolução quase de linha basal. A concentra- ção para cada amostra é calculada a partir da Eq. 1 usando um peso mo- lecular de 66,398 Da e reportada na Tabela 1. Para todas as cinco con- centrações, o valor medido através do Método A é similar ao valor calcu- lado a partir de diluição gravimétrica. Como mostrado abaixo na Tabela 1, o RSD é menos de 1% para todos os três conjuntos de réplicas. Tabela 1. Resultados para as Amostras de BSA NIST Amostra Conc. do Método RSD Conc. Diferença A (g/L) Gravimétrica (g/L) B1 9,297 0,61% 9,525 2,39% B2 23,90 -- 23,91 0,04% B3 37,53 0,81% 38,11 1,54%

B4 52,50 -- 52,82 0,60% B5 66,18 0,82% 67,38 1,78%

[0070] Como mostrado na Figura 6, um gráfico das concentrações do Método A vs as concentrações gravimétricas forneceu uma linha de regressão com R2 = 0,9997, indicando linearidade na faixa de concen- tração examinada.

[0071] Esses dados demonstram que o Método A pode ser usado para determinar com exatidão e precisão a concentração de uma prote- ína de tamanho médio em uma faixa de concentração ampla.

[0072] A Figura 7 demonstra um gráfico da densidade de amostra como uma função da concentração de proteína, conforme determinado através do Método A. A equação que se refere às duas quantidades é    0  1  v  0   c 1000  , como definido acima. A inclinação da linha de regressão dá o volume parcial-específico ( v ) de BSA, que foi verificado ser 0,718 mL/g. Uso do Método A em um Anticorpo Biespecífico

[0073] Amostras de um anticorpo biespecífico (dadas pelas sequên- cias na Tabela 1 da Patente dos Estados Unidos 9.718.884), com cinco concentrações diferentes e 14 amostras no total, são preparadas como acima descrito. Aquisição e análise de dados do Método A são realiza- das como acima descrito. De acordo com os procedimentos essencial- mente descritos acima, os dados que seguem foram obtidos.

[0074] A Figura 8 mostra os espectros de DF-qRMN resultantes, que são similares em aparência e qualidade no geral àqueles de BSA (mostrado acima). As concentrações foram calculadas com a Eq. 1, usando o peso molecular teórico da proteína não glicosilada, intacta (~200.000 Da), e sumarizadas na Tabela 2 abaixo. Tabela 2. Resultados para o anticorpo biespecífico Amostra Conc. do Método RSD Conc. Diferença A (g/L) Estimada (g/L) C1 9,427 0,25% 9,277 -1,61%

C2 24,59 -- 24,61 0,09% C3 41,62 1,25% 39,67 -4,92% C4 54,43 -- 55,02 1,07% C5 78,37 0,85% 74,01 -5,89%

[0075] Como mostrado na Figura 9, um gráfico das concentrações do Método A versus as concentrações gravimétricas proveu uma linha de regressão com R2=0,996.

[0076] Esses dados demonstram que o Método A pode ser usado para determinar a concentração de um anticorpo biespecífico em uma faixa de concentração bastante ampla. Uso do método A em um peptídeo de ~5000 Da

[0077] Amostras de um peptídeo pequeno, diluído (ca. 5.000 Da; dado pela sequência no Exemplo 4 do PCT/US2017/041922), são pre- paradas com e sem agente caotrópico como descrito acima. A concen- tração menor de desnaturante (2M) é aceitável uma vez que o peptídeo existe nativamente como uma bobina aleatória e a concentração é baixa. Condições básicas são requeridas para estabilidade da amostra; portanto, ureia-d4 é usada. Aquisição e análise de dados do Método A são realizadas como acima descrito com a exceção que havia 624 var- reduras para cada aquisição ao invés de 64 varreduras. Seguindo os procedimentos essencialmente como descrito acima, os dados que se- guem foram obtidos. Uma distorção de fase leve foi observada para o sinal de água residual, mas isso não impediu análise dos dados. Adição do agente caotrópico produziu supressão de água melhor, picos mais nítidos e subsequentemente mais resolução e sensibilidade. A concen- tração de cada réplica foi calculada a partir da Eq. 1. A concentração de proteína total média foi determinada ser 0,65 g/L com um RSD de 3,6%. Isso era similar ao valor obtido pelo equilíbrio de massa (0,63 g/L). Es- ses dados demonstram que o Método A pode ser usado para uma amostra diluída de um peptídeo pequeno.

MODALIDADES ILUSTRATIVAS

[0078] O que segue compreende uma lista de modalidades ilustra- tivas de acordo com a presente invenção que representam várias mo- dalidades da presente invenção.

[0079] As modalidades ilustrativas não pretendem ser exaustivas ou limitar a invenção às formas precisas descritas, mas ao contrário, essas modalidades ilustrativas são providas para auxiliar na descrição adicio- nal da presente invenção de modo que outros versados na técnica po- dem utilizar seus ensinamentos.

1. Um método de determinação da concentração de uma proteína ou peptídeo em solução, em que o método compreende: (i) desnaturar a proteína ou opcionalmente desnaturar o peptí- deo; (ii) realizar espectroscopia de qRMN com um filtro de difusão; e (iii) calcular a concentração da proteína ou peptídeo usando um padrão de referência e uma técnica de referência.

2. O método da modalidade 1, em que o peptídeo é desnatu- rado.

3. O método a modalidade 1 ou modalidade 2, em que a pro- teína ou peptídeo é desnaturado com um agente caotrópico.

4. O método da modalidade 3, em que o agente caotrópico é cloreto de guanidínio-d6 ou ureia-d4.

5. O método de qualquer uma das modalidades 1-4, em que o padrão de referência é um padrão de referência externo.

6. O método da modalidade 5, em que o padrão de referência externo é um padrão primário de molécula pequena.

7. O método da modalidade 5, em que o padrão de referência externo é ácido maleico.

8. O método de qualquer uma das modalidades 1-7, em que a solução compreende D2O.

9. O método de qualquer uma das modalidades 1-8, em que a técnica de referência é PULCON.

10. O método de qualquer uma das modalidades 1-9, em que a proteína é um anticorpo.

11. O método da modalidade 10, em que o anticorpo é um anti- corpo monoclonal.

12. O método da modalidade 10, em que o anticorpo é um anti- corpo biespecífico.

13. Um método de determinação de um parâmetro molecular de uma proteína ou um peptídeo em solução, em que o método com- preende: (i) desnaturar a proteína ou opcionalmente desnaturar o peptídeo; (ii) realizar espectroscopia de qRMN com um filtro de difu- são; e (iii) calcular a concentração da proteína ou peptídeo usando um padrão de referência e uma técnica de referência; e (iv) determinar o parâmetro molecular da proteína ou pep- tídeo a partir da concentração calculada.

14. O método da modalidade 13, em que o peptídeo é desnaturado.

15. O método da modalidade 13 ou modalidade 14, em que o parâme- tro molecular é o coeficiente de extinção.

16. O método da modalidade 15, em que o coeficiente de extinção é determinado através da Beer-Lambert Law.

17. O método de qualquer uma das modalidades 13-16, em que a pro- teína ou peptídeo é desnaturado com um agente caotrópico.

18. O método da modalidade 17, em que o agente caotrópico é cloreto de guanidínio-d6 ou ureia-d4.

19. O método de qualquer uma das modalidaides 13-18, em que o pa- drão de referência é um padrão de referência externo.

20. O método da modalidade 19, em que o padrão de referência ex- terno é um padrão primário de molécula pequena ou ácido maleico.

21. O método da modalidade 20, em que o padrão de referência ex- terno é um padrão primário de molécula pequena.

22. O método da modalidade 20, em que o padrão de referência ex- terno é ácido maleico.

23. O método de qualquer uma das modalidades 13-22, em que a so- lução compreende D2O.

24. O método de qualquer uma das modalidades 13-23, em que a téc- nica de referência é PULCON.

25. O método de qualquer uma das modalidades 13, 15-24, em que a proteína é um anticorpo.

26. O método da modalidade 25, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

27. O método da modalidade 25, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.

28. Um método de determinação de um parâmetro molecular de uma proteína ou peptídeo em uma batelada de referência, em que o mé- todo compreende: a. desnaturar a proteína ou opcionalmente desnaturar o peptídeo; b. realizar espectroscopia de qRMN com um filtro de difu- são; c. calcular a concentração da proteína ou peptídeo usando um padrão de referência e uma técnica de referência; e d. determinar o parâmetro molecular da proteína ou pep- tídeo a partir da concentração calculada.

29. O método da modalidade 28, compreendendo ainda determinar a concentração da proteína ou peptídeo em uma batelada de teste, em que a dita concentração de peptídeo ou proteína na batelada de teste é determinada a partir do parâmetro molecular.

30. O método da modalidade 28 ou modalidade 29, em que o parâme- tro molecular é o coeficiente de extinção.

31. O método da modalidade 30, em que o coeficiente de extinção é determinado através da Beer-Lambert Law.

32. O método de qualquer uma das modalidades 28-31, em que o pep- tídeo é desnaturado.

33. O método de qualquer uma das modalidades 28-32, em que a pro- teína ou peptídeo é desnaturado com um agente caotrópico.

34. Método da modalidade 33, em que o agente caotrópico é cloreto de guanidínio-d6 ou ureia-d4.

35. O método de qualquer uma das modalidades 28-34, em que o pa- drão de referência é um padrão de referência externo.

36. O método da modalidade 35, em que o padrão de referência ex- terno é um padrão primário de molécula pequena.

37. O método da modalidade 35, em que o padrão de referência ex- terno é ácido maleico.

38. O método de qualquer uma das modalidades 28-37, em que a so- lução compreende D2O.

39. O método de qualquer uma das modalidades 28-38, em que a téc- nica de referência é PULCON.

40. O método de qualquer uma das modalidades 28-31, 33-39 em que a proteína é um anticorpo.

41. O método da modalidade 40, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

42. O método da modalidade 40, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.

43. O método de qualquer uma das modalidades 13-42, em que o mé- todo compreende ainda uso do parâmetro molecular para determinar a concentração da proteína ou peptídeo na formulação da proteína ou peptídeo.

44. O método de qualquer uma das modalidades 13-42, em que o mé- todo compreende ainda uso do parâmetro molecular para determinar a concentração da proteína ou peptídeo em um teste em liberação de lote.

45. O método da modalidade 44, em que o teste em liberação de lote é um teste de UV em liberação de lote.

46. O método de qualquer uma das modalidades 13-42, em que o mé- todo compreende ainda usar o parâmetro molecular para determinar a concentração da proteína ou peptídeo na preparação de um lote.

47. O método de qualquer uma das modalidades 13-42, em que o mé- todo compreende ainda usar o parâmetro molecular para determinar a concentração da proteína ou peptídeo na determinação de uma dose da proteína ou peptídeo.

48. O método de qualquer uma das modalidades 13-42, em que o mé- todo compreende ainda usar o parâmetro molecular para determinar a concentração da proteína ou peptídeo durante fabricação.

49. O método de qualquer uma das modalidades 1-48, em que a prote- ína ou peptídeo é o ingrediente ativo em dulaglutide, ixekizumabe, ra- mucirumabe, cetuximabe, olaratumabe, necitumumabe, galcanezu- mabe ou mirikizumabe.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de determinação da concentração de proteína ab- soluta de uma proteína em solução, caracterizado pelo fato de que com- preende as etapas de: a. desnaturar a proteína; b. realizar espectroscopia de qRMN na proteína desnaturada, em que a dita etapa de realização de espectroscopia de qRMN inclui uso de um filtro de difusão; e c. calcular a concentração de proteína absoluta da proteína usando um padrão de referência e uma técnica de referência.

2. Método de determinação de um parâmetro molecular de uma proteína em solução, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. desnaturar a proteína; b. realizar espectroscopia de qRMN na proteína desnaturada, em que a dita etapa de realização de espectroscopia de qRMN inclui uso de um filtro de difusão; c. calcular a concentração de proteína absoluta da proteína compreendendo uso de um padrão de referência e uma técnica de re- ferência; e d. determinar o parâmetro molecular da proteína a partir da concentração da proteína calculada.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o parâmetro molecular da proteína compreende coefi- ciente de extinção, índice refrativo ou volume específico parcial.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o coeficiente de extinção é determinado através da Beer-Lambert Law.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 e 4, caracterizado pelo fato de que a proteína é desnaturada com um agente caotrópico.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o agente caotrópico é cloreto de guanidínio-d6 ou ureia- d4.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 a 6, caracterizado pelo fato de que o padrão de referência é um padrão de referência externo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o padrão de referência externo é um padrão primário de molécula pequena.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o padrão de referência externo é ácido maleico.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 a 7, 8 e 9, caracterizado pelo fato de que a solução compreende D2O.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 a 7, 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a técnica de referência é PULCON.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 7, 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o parâmetro molecular é aquele de uma proteína em uma batelada de referência.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o parâmetro molecular da proteína na batelada de re- ferência é usado para determinar a concentração de proteína absoluta da proteína em uma batelada de teste.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 7, 8 a 11, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uso do parâmetro molecular para determinar a concentração de proteína da proteína em um teste em liberação de lote, na preparação de um lote, durante a fabricação, na determinação de uma dose da proteína, para separação em alíquotas da proteína ou para formulação da proteína.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o teste em liberação de lote compreende um teste de UV.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 a 7, 8 a 11, 12 e 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo biespecífico, um anticorpo triespecífico ou um anticorpo tetraespecífico.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 a 7, 8 a 11, 12 e 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma proteína de fusão.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 a 7, 8 a 11, 12 e 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a proteína é um peptídeo.

20. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concreti- zações ou quaisquer categorias de reivindicação aplicáveis, por exem- plo, produto, processo ou uso, englobadas pela matéria inicialmente re- velada, descrita ou ilustrada no pedido de patente.