TW201917135A - 抗ＴＮＦ／抗ＩＬ-２３ ＩｇＧ雙特異性抗體 - Google Patents

抗ＴＮＦ／抗ＩＬ-２３ ＩｇＧ雙特異性抗體 Download PDF

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Abstract

本發明提供IgG雙特異性抗體，其結合腫瘤壞死因子α (TNFα)與介白素-23之p19次單元(IL-23p19)且表徵為對於TNFα及IL-23兩者具有高親和力及同時中和性質。本發明之雙特異性抗體適用於治療各種自體免疫疾病，包括發炎性腸病，諸如克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎，牛皮癬，牛皮癬性關節炎及化膿性汗腺炎。

Description

抗TNF／抗IL-23　IgG雙特異性抗體
本發明涉及醫學領域，特定言之涉及能夠干擾兩個不同治療性靶標之IgG雙特異性抗體之新穎領域。本發明的IgG雙特異性抗體係針對腫瘤壞死因子α (TNFα)及介白素23之p19次單元(IL23p19)，且期望適用於治療自體免疫疾病，該自體免疫疾病包括：發炎性腸病(IBD)，諸如克羅恩氏病(Crohn's disease；CD)及潰瘍性結腸炎(UC))；牛皮癬(PS 0)；牛皮癬性關節炎(PsA)及化膿性汗腺炎(HS)。
自體免疫疾病由身體針對其自身組織產生免疫反應而引起。自體免疫疾病通常為慢性的且可致衰弱且甚至危及生命。一般表示諸如CD及UC之病症之群組的IBD為在病理學上表徵為腸道發炎及上皮細胞損傷的常見慢性復發性自體免疫疾病。其他形式之慢性自體免疫疾病，諸如Ps0、PSA及HS，可能會影響中軸及/或周邊骨骼。
介白素23 (IL-23)為在與誘導慢性發炎有關之一系列發炎細胞活化中被認為重要的雜二聚細胞介素。IL-23 (其為IL-6、IL-17、GM-CSF及IL-22之上游調節子)由與p40次單元(該p40次單元係與細胞介素IL-12共用的)共價成對的p19次單元(IL23p19)構成。另外，IL-23已表明為在記憶/病原T細胞發炎反應兩者中起重要作用以及在調節先天性淋巴樣細胞發炎活性中起作用。有跡象表明細胞介素IL-6、IL-17、GM-CSF及IL-22之IL-23調節與包括IBD的發炎疾病及其他自體免疫疾病相關。
腫瘤壞死因子α (TNFα)為主要由單核球及巨噬細胞分泌之多效性同源三聚細胞介素，且亦已知為由CD4+ 及CD8+ 末梢血液T淋巴球產生。TNFα以可溶形式及跨膜形式兩者表現(膜結合前體形式可藉由金屬蛋白酶TNF α轉化酶(TACE)以蛋白分解方式裂解成可溶同源三聚體)。TNFα被認為在調節免疫細胞中起作用且在全身性發炎中，尤其在急性期發炎反應中係重要的。過量之TNFα與各種形式之自體免疫疾病(包括Ps0及CD)相關聯。
當前經FDA批准之用於諸如IBD (包括UC及CD)之自體免疫疾病之治療劑包括通常用於治療急性發炎的皮質類固醇，以及生物製品(諸如REMICADE® 及HUMIRA® )。然而，當前用於IBD，諸如UC及CD的生物治療劑提供僅高於安慰劑速率10-30%的症狀緩解，且在相同患者中在相同速率下通常不會獲得內視鏡檢緩解及臨床緩解。除了較大百分比之患者對當前可用的治療無反應以外，在治療12個月之後，23%與46%之間的患者失去對TNFα中和之反應。
同樣地，僅少數PSA及Ps0患者用經批准之生物製劑(其包括REMICADE® 及HUMIRA® ，以及靶向細胞介素IL-12及IL-23之共用p40次單元的STELARA® )治療。當前治療已證明用於減輕一子組患者的一些形式之PS 0之症狀並減緩其進展的療效。類似地，用於PsA之當前生物治療劑已證明在子組患者中的療效，其中25至45%關節PsA患者在治療24週時獲得50分之美國風濕病學會得分。然而，無單一生物製劑證明在大量患者中之占絕對優勢的療效，且對當前生物製劑缺乏或失去反應仍然是一個問題。
除了諸如IBD (包括CD及UC)、Ps0、HS及PSA之自體免疫疾病對生活品質帶來的相當大的負面影響以外，當前治療方案可為相當艱難的。因此，仍存在對用於治療自體免疫疾病，包括IBD (諸如CD及UC)、Ps0、HS及PSA的替代療法之需求。較佳地，此類替代療法將解決當前治療選項未解決的問題中之一或多者，諸如證明在對當前可用的治療無反應之較大百分比之患者中的療效，在較大百分比之患者(當前不可接受治療)中提供充足反應，減少患者失去反應，及/或提供較不艱難的治療方案。
此類替代療法的一個方法可包括靶向多個靶標。靶向多個生物學靶標可藉由共投與或組合使用兩種不同生物製品(例如，能夠干擾不同治療性靶標之兩種抗體)實現。然而，共投與或組合使用獨立生物製品呈現實際及商業難題兩者。舉例而言，雖然獨立生物製品之兩種注射劑可准許劑量及時間安排之彈性，但對於患者及供應商的順應性及疼痛而言係不便的。另外，雖然共調配可提供一定的劑量彈性，但由於兩種抗體之不同分子特徵，獲得在溶液中(在相對較高濃度下)具有可接受之黏度且准許兩種抗體具有化學及物理穩定性的調配條件通常相當具有挑戰性或係不可能的。另外，共投與及共調配涉及可能增加患者及/或支付者費用的兩種不同藥物療法之附加成本。
雙特異性抗體，即能夠干擾兩個不同靶標之單藥劑，已提出作為用於解決共投與或共調配各別抗體藥劑所附帶限制之手段。雙特異性抗體將兩種各別抗體治療劑之結合活性整合成單一劑，因此提供患者潛在的成本及便利性益處。在一些情況下，雙特異性抗體亦可引起除共投與或共調配組合可獲得之活性以外的協同或新穎活性。然而，歸因於製造之複雜性及/或免疫原性，雙特異性抗體在大多數情況下並不理想。
已提出雙特異性抗體之多種型式。舉例而言，美國專利公開案第2012/0251541 A1號揭示靶向TNFα及IL23/IL12的具有交叉雙重可變構形之雙特異性抗體。類似地，美國專利第7,612,181號揭示靶向TNFα及IL23的具有雙重可變域構形之雙特異性抗體。其他雙特異性抗體型式涉及經由化學共軛(參見Brennan, M.,等人, Science, 1985. 229(4708): p. 81-3)或經由雙官能交聯劑(參見Glennie, M. J.,等人, J Immunol, 1987. 139(7): p. 2367-75)使兩種抗體或其片段共軛。其他雙特異性抗體型式包括由利用可撓性或結構化連接子繫栓之重鏈及輕鏈可變區構成的單鏈Fv (scFv)片段。結合特定靶標之一或多個scFv片段與結合獨立靶標之另一部分，例如獨立scFv或IgG抗體連接(例如，揭示抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體之美國專利第9,718,884 B2號)。然而，以上雙特異性抗體型式中之各者的限制在於其缺乏提供重鏈及輕鏈恆定域(亦即，分別地，CH1及CL )之穩定化相互作用的典型Fab架構，其可改良熱穩定性、溶解度，在製造期間減小不溶性聚集的可能，且/或改良藥物遞送特徵，諸如黏度。此外，以上雙特異性抗體型式中之各者與典型IgG結構偏離，此亦可導致藉助於呈現藉由典型IgG結構或變化之免疫複合形式未觀測到的新抗原決定基而免疫原性風險增加，以及效應子功能改變。
因此，仍存在對中和人類TNFα及人類IL-23兩者之單雙特異性抗體的需求，其中雙特異性抗體特異性靶向人類IL-23之p19次單元且不特異性中和IL-12 (其與IL-23共用共同p40次單元)。期望此類雙特異性抗體具有典型IgG (包括典型Fab)架構且為熱穩定及物理穩定的，在藥物遞送期間呈現低不溶性聚集、降低之黏度，中和人類TNFα及人類IL23p19，並且不呈現與新抗原決定基相關聯之免疫原性風險增加，該等新抗原決定基與同典型IgG結構偏離的雙特異性抗體相關聯。此外，期望此類雙特異性抗體之效應子功能在包含IgG1或IgG3重鏈時保持或增強。另外，期望提供包括中和人類TNFα及人類IL23p19兩者之單雙特異性抗體的醫藥組合物，從而避開尋找必須滿足兩種不同、獨立抗體之不同分子特徵的調配條件的難題。因此，本發明提供針對TNFα及IL23p19、保持免疫球蛋白G (「IgG」)抗體架構之雙特異性抗體(「IgG雙特異性抗體」)，以試圖解決上文所提及的問題中之一或多者，且向在當前可用的單獨TNFα及IL23治療中未能具有充分反應且/或無反應的彼等患者提供充分反應。
本發明藉由提供包含第一重鏈(HC1)第一輕鏈(LC1)對(HC1-LC1)、第二重鏈(HC2)第二輕鏈(LC2)對(HC2-LC2)及HC1-HC2界面之IgG雙特異性抗體來解決以上問題中之一或多者，其中HC1與LC1形成至少一個鏈間雙硫鍵，HC2與LC2形成至少一個鏈間雙硫鍵，且HC1與HC2形成至少兩個鏈間雙硫鍵，並且另外其中HC1-LC1與TNFα結合且HC2-LC2與IL23p19結合。本發明亦提供HC1-HC2界面，以及改良IgG雙特異性抗體之組裝的HC1-LC1對及HC2-LC2對。
根據本發明，提供一種HC1-HC2界面，其藉由將特異性突變引入各別重鏈之Fc域中達成不同重鏈(HC1及HC2)之經改良雜二聚。在本發明之特定實施例中，本發明之IgG雙特異性抗體包含具有第一人類重鏈IgG1 Fc域之HC1，該域包含：在殘基356處經置換之甘胺酸(對應於SEQ ID NO:1之殘基360處之甘胺酸)；在殘基357處經置換之天冬胺酸(對應於SEQ ID NO:1之殘基361處之天冬胺酸)；在殘基364處經置換之麩醯胺酸(對應於SEQ ID NO:1之殘基368處之麩醯胺酸)；及在殘基407處經置換之丙胺酸(對應於SEQ ID NO:1之殘基411處之丙胺酸)。本發明之IgG雙特異性抗體之實施例包含具有第二人類重鏈IgG1 Fc域之HC2，該域包含：在殘基349處經置換之絲胺酸(對應於SEQ ID NO:3之殘基347處之絲胺酸)；在殘基366處經置換之甲硫胺酸(對應於SEQ ID NO:3之殘基364處之甲硫胺酸)；在殘基370處經置換之酪胺酸(對應於SEQ ID NO:3之殘基368處之酪胺酸)；及在殘基409處經置換之纈胺酸(對應於SEQ ID NO:3之殘基407處之纈胺酸)。HC1及HC2之Fc域之殘基編號係基於EU編號規則；相關於SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:3之殘基編號係線性的。
另外，提供不同HC1-LC1及HC2-LC2對(或臂)，其藉由將特異性突變分別引入重鏈及輕鏈之Fab域中實現IgG雙特異性抗體之經改良組裝及雜二聚，但仍保持親和力。在特定實施例中，本發明之IgG雙特異性抗體包含HC1-LC1對，其包含Fab域，其中HC1包含：在殘基39處經取代之酪胺酸(對應於SEQ ID NO:1之殘基39處之酪胺酸)；在殘基105處經取代之精胺酸(對應於SEQ ID NO:1之殘基113處之精胺酸)；在殘基127處經取代之半胱胺酸(對應於SEQ ID NO:1之殘基135處之半胱胺酸)；在殘基228處經取代之天冬胺酸(對應於SEQ ID NO:1之殘基222處之天冬胺酸)；及在殘基230處經取代之甘胺酸(對應於SEQ ID NO:1之殘基224處之甘胺酸)，且其中LC1包含：在殘基38處經取代之精胺酸(對應於SEQ ID NO:2之殘基38處之精胺酸)；在殘基42處經取代之天冬胺酸(對應於SEQ ID NO:2之殘基42處之天冬胺酸)；及在殘基122處經取代之離胺酸(對應於SEQ ID NO:2之殘基122處之離胺酸)。此外，本發明之IgG雙特異性抗體之實施例包含HC2-LC2對，其包含Fab域，其中HC2包含：在殘基39處經取代之離胺酸(對應於SEQ ID NO:3之殘基39處之離胺酸)；在殘基62處經取代之麩胺酸(對應於SEQ ID NO:3之殘基62處之麩胺酸)；在殘基172處經取代之丙胺酸(對應於SEQ ID NO:3之殘基166處之丙胺酸)；及在殘基174處經取代之甘胺酸(對應於SEQ ID NO:3之殘基168處之甘胺酸)，且其中LC2包含在殘基1處經取代之精胺酸(對應於SEQ ID NO:4之殘基1處之精胺酸)；在殘基38處經取代之天冬胺酸(對應於SEQ ID NO:4之殘基38處之天冬胺酸)；在殘基135處經取代之酪胺酸(對應於SEQ ID NO:4之殘基136處之酪胺酸)；及在殘基176處經取代之色胺酸(對應於SEQ ID NO:4之殘基176處之色胺酸)。在本發明之IgG雙特異性抗體之甚至更特定實施例中，HC2包含在SEQ ID NO:3之殘基74處經取代之蘇胺酸(對應於SEQ ID NO:3之殘基74處之蘇胺酸)。HC1、LC1、HC2及LC2之Fab域之殘基編號係基於Kabat殘基編號規則；相關於SEQ ID NO: 1、2、3及4之殘基編號係線性的。
在特定實施例中，本發明提供IgG雙特異性抗體，其包含： a) 第一重鏈(HC1)，其包含重鏈可變區(HCVR1)，其中HCVR1包含重鏈互補決定區(HCDR) 1至3，其中HCDR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:13，HCDR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:14，且HCDR3之胺基酸序列為SEQ ID NO:15； b) 第一輕鏈(LC1)，其包含輕鏈可變區(LCVR1)，其中LCVR1包含輕鏈互補決定區(LCDR) 1至3，其中LCDR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:16，LCDR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:17，且LCDR3之胺基酸序列為SEQ ID NO:18； c) 第二重鏈(HC2)，其包含重鏈可變區(HCVR2)，其中HCVR2包含重鏈互補決定區(HCDR) 4至6，其中HCDR4之胺基酸序列為SEQ ID NO:19，HCDR5之胺基酸序列SEQ ID NO:20，且HCDR6之胺基酸序列為SEQ ID NO:21；以及 d) 第二輕鏈(LC2)，其包含輕鏈可變區(LCVR2)，其中該LCVR2包含輕鏈互補決定區(LCDR) 4至6，其中LCDR4之胺基酸序列為SEQ ID NO:22，LCDR5之胺基酸序列為SEQ ID NO:23，且LCDR6之胺基酸序列為SEQ ID NO:24， 其中HC1與LC1形成至少一個鏈間雙硫鍵(HC1-LC1對)，HC2與LC2形成至少一個鏈間雙硫鍵(HC2-LC2對)，且HC1與HC2形成至少兩個鏈間雙硫鍵，並且其中HC1-LC1對與人類TNFα結合且HC2-LC2對與人類IL23p19結合。特定實施例包括HC2，其包含殘基74處之蘇胺酸(殘基編號基於Kabat規則)。
根據本發明之IgG雙特異性抗體之一些特定實施例， a) HC1包含殘基39處之酪胺酸、殘基105處之精胺酸、殘基127處之半胱胺酸、殘基228處之天冬胺酸及殘基230處之甘胺酸(殘基編號基於Kabat)， b) LC1包含殘基38處之精胺酸、殘基42處之天冬胺酸及殘基122處之離胺酸(殘基編號基於Kabat)， c) HC2包含殘基39處之離胺酸、殘基62處之麩胺酸、殘基172處之丙胺酸及殘基174處之甘胺酸(殘基編號基於Kabat)，且 d) LC2包含殘基1處之精胺酸、殘基38處之天冬胺酸、殘基135處之酪胺酸及殘基176處之色胺酸(殘基編號基於Kabat)。
根據一些此類實施例，HCVR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:9，LCVR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:10，HCVR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:11，且LCVR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:12。在更特定實施例中，HCVR2包含SEQ ID NO:11之殘基74處之蘇胺酸。
另外，根據本發明之IgG雙特異性抗體之一些實施例，HC1及HC2為人類IgG1重鏈，LC1為人類κ輕鏈且LC2為人類λ輕鏈可變區及人類輕鏈恆定區。根據特定實施例， a) HC1包含人類IgG Fc域，其包含殘基356處之甘胺酸、殘基357處之天冬胺酸、殘基364處之麩醯胺酸及殘基407處之丙胺酸(殘基編號基於EU編號規則)，且 b) HC2包含人類IgG Fc域，其包含殘基349處之絲胺酸、殘基366處之甲硫胺酸、殘基370處之酪胺酸及殘基409處之纈胺酸(殘基編號基於EU編號規則)。
在甚至更特定實施例中，HC1之胺基酸序列為SEQ ID NO:1，LC1之胺基酸序列為SEQ ID NO:2，HC2之胺基酸序列為SEQ ID NO:3，且LC2之胺基酸序列為SEQ ID NO:4。在甚至更特定實施例中，HC2包含SEQ ID NO:3之殘基74處之蘇胺酸。
本發明亦提供一種治療自體免疫疾病之方法，其包含向有需要之患者投與有效量的本發明之IgG雙特異性抗體。根據一些實施例，本發明提供一種治療IBD，諸如CD及UC之方法，其包含向有需要之患者投與治療有效量的本發明之IgG雙特異性抗體。根據其他實施例，本發明提供治療PS 0、PsA及HS中之一或多者的方法，其包含向有需要之患者投與治療有效量之本發明之IgG雙特異性抗體。
本發明亦提供一種用於療法中之本發明之IgG雙特異性抗體。根據一些實施例，本發明提供一種用於治療自體免疫疾病(包括IBD，諸如CD及UC)之本發明之IgG雙特異性抗體。本發明之其他實施例提供一種用於治療自體免疫疾病(包括PS 0、PsA及HS中之一或多者)之本發明之IgG雙特異性抗體。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本發明之IgG雙特異性抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
本發明之實施例亦包含一種本發明之IgG雙特異性抗體之用途，其用於製造用以治療UC及CD中之一或多者的藥劑。本發明之額外實施例包含一種本發明之IgG雙特異性抗體之用途，其用於製造用以治療PS 0、PsA及HS中之一或多者的藥劑。
本發明亦提供一種包含編碼多肽鏈之聚核苷酸序列的DNA分子，該多肽鏈包含本發明之IgG雙特異性抗體之HC1。根據更特定實施例，經編碼HC1之胺基酸序列為SEQ ID NO:1。根據一些此類實施例，DNA分子之核苷酸序列為SEQ ID NO:5。本發明之實施例亦提供一種包含編碼多肽鏈之聚核苷酸序列的DNA分子，該多肽鏈包含本發明之IgG雙特異性抗體之LC1。根據更特定實施例，經編碼LC1之胺基酸序列為SEQ ID NO:2。根據一些此類實施例，DNA分子之核苷酸序列為SEQ ID NO:6。另外，本發明之實施例亦提供一種包含編碼多肽鏈之聚核苷酸序列的DNA分子，該多肽鏈包含本發明之IgG雙特異性抗體之HC2。根據更特定實施例，經編碼HC2之胺基酸序列為SEQ ID NO:3。在一些特定實施例中，HC2包含SEQ ID NO:3之殘基74處之酪胺酸。根據一些此類實施例，DNA分子之核苷酸序列為SEQ ID NO:7。本發明之又其他實施例亦提供一種包含編碼多肽鏈之聚核苷酸序列的DNA分子，該多肽鏈包含本發明之IgG雙特異性抗體之LC2。根據更特定實施例，經編碼LC2之胺基酸序列為SEQ ID NO:4。根據一些此類實施例，DNA分子之核苷酸序列為SEQ ID NO:8。
根據本發明之DNA分子的一些實施例，編碼本發明之IgG雙特異性抗體之HC1的聚核苷酸序列亦包含編碼本發明之IgG雙特異性抗體之LC1的聚核苷酸序列。根據一些實施例，包含編碼本發明之IgG雙特異性抗體之HC2之聚核苷酸序列的DNA分子亦包含編碼本發明之IgG雙特異性抗體之LC2的聚核苷酸序列。根據又其他實施例，包含編碼本發明之IgG雙特異性抗體之HC1的聚核苷酸序列及編碼本發明之IgG雙特異性抗體之LC1的聚核苷酸序列的DNA分子進一步包含編碼本發明之IgG雙特異性抗體之HC2的聚核苷酸序列及編碼本發明之IgG雙特異性抗體之LC2的聚核苷酸序列。
本發明之實施例亦提供一種包含本發明之DNA分子的哺乳動物細胞，其中該細胞能夠表現本發明之IgG雙特異性抗體，該IgG雙特異性抗體包含HC1-LC1對及HC2-LC2對，其中該HC1-LC1對與人類TNFα結合且該HC2-LC2對與人類IL23p19結合。
本發明亦提供一種用於產生本發明之IgG雙特異性抗體的方法，該方法包含在使得表現IgG雙特異性抗體之條件下培養本發明之哺乳動物細胞，以及回收所表現的IgG雙特異性抗體。本發明亦提供一種由該方法產生的根據本發明之IgG雙特異性抗體。
定義 當在本文中使用時，術語「IgG雙特異性抗體」係指雜二聚IgG分子或其片段，其保留免疫球蛋白G (「IgG」)抗體架構且包含各別第一重鏈(HC1)、各別第一輕鏈(LC1)、各別第二重鏈(HC2)及各別第二輕鏈(LC2)，其中HC1與LC1形成至少一個鏈間雙硫鍵(形成HC1-LC1對，在本文中亦稱為「臂」或「HC1-LC1臂」)，HC2與LC2形成至少一個鏈間雙硫鍵(形成HC2-LC2對，在本文中亦稱為「臂」或「HC2-LC2臂」)，且HC1與HC2形成至少兩個鏈間雙硫鍵。在以下示意圖中提供本發明之IgG雙特異性抗體的表示：
本發明之IgG雙特異性抗體之HC1-LC1對展現對TNFα的選擇性單價結合，而本發明之IgG雙特異性抗體之HC2-LC2對展現對IL23p19的選擇性單價結合。
在本文中使用時，術語「免疫球蛋白G抗體」(IgG)係指由四條各別多肽鏈：兩條重鏈(HC1及HC2)及兩條輕鏈(LC1及LC2)如本文所述由雙硫鍵互連構成之免疫球蛋白分子。四條多肽鏈中之各者之胺基端部分包括主要負責抗原識別的約100-120個或更多個胺基酸之可變區。四條多肽鏈中之各者亦包含恆定區。
本發明之IgG雙特異性抗體之輕鏈(LC)分類為κ或λ，且表徵為如此項技術中已知之特定恆定區。根據本發明之IgG雙特異性抗體之特定實施例，LC2由人類κ可變域及人類λ恆定區構成，而LC1由人類κ可變域及恆定區構成。如本文中所提及，人類κ及人類λ係指包含各別LC可變域或恆定區之序列起點，且進一步包括本文中所揭示之經特異性工程改造之胺基酸修飾。根據本發明之IgG雙特異性抗體之重鏈(HC)分類為γ，其限定同型(例如，IgG)。同型可進一步分為子類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。各HC由N端重鏈可變區(「HCVR」)及負責效應子功能的重鏈恆定區(CH)構成。根據本發明，IgG之CH由三個域(CH1、CH2及CH3)構成。本發明之IgG雙特異性抗體之各輕鏈由輕鏈可變區(LCVR)及輕鏈恆定區(CL)構成。HCVR及LCVR區可進一步再分為高變區(稱為互補決定區(CDR))，與更保守之區(稱為構架區(FR))穿插。本發明之IgG雙特異性抗體之各HCVR及LCVR由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1-1、CDR1、FR1-2、CDR2、FR1-3、CDR3、FR1-4。如本文中所描述，HC1之3個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」；HC2之3個CDR稱為「HCDR4、HCDR5及HCDR6」；LC1之3個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」；且LC2之3個CDR稱為「LCDR4、LCDR5及LCDR6」。CDR含有與抗原形成特異性相互作用的大部分殘基。IgG雙特異性抗體之HC-LC對結合特定抗原之功能性能力主要受包含各HC-LC對的六個CDR影響。
根據本發明之IgG雙特異性抗體之各HC-LC對的可變區形成抗原結合位點。根據本發明，IgG雙特異性抗體具有兩個抗原結合位點，一個包含HC1-LC1對且一個包含HC2-LC2對。如本文所用，「抗原結合部分」或「抗原結合位點」或「抗原結合區」或「抗原結合片段」分別可互換地指IgG雙特異性抗體之在HC1-LC1或HC2-LC2對之可變區內含有胺基酸殘基的彼部分，該等胺基酸殘基與抗原相互作用且賦予IgG雙特異性抗體對於各別抗原之特異性及親和力。此IgG雙特異性抗體可變區亦包括保持抗原結合殘基之恰當構形所必需的構架胺基酸殘基。較佳地，本發明之IgG雙特異性抗體之構架區具有人源性或大體上具有人源性。
如在本文中可互換使用之「親本抗體(parent antibody/parental antibody)」為由胺基酸序列編碼之抗體，其用於例如經由胺基酸取代及結構改變製備本發明之IgG雙特異性抗體的一個HC-LC對。親本抗體可為鼠類抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。
術語「Kabat」、「Kabat編號」或「Kabat標記」在本文中可互換使用。此項技術中公認的此等術語係指為與抗體之重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基相比更為可變(亦即，高變)的胺基酸殘基編號之系統(Kabat,等人,Ann . NY Acad . Sci . 190:382-93 (1971); Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest ,第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991))。
術語「North編號」或「North標記」在本文中可互換使用。此項技術中公認的此等術語係指為與抗體之重鏈及輕鏈可變區中之胺基酸殘基相比更為可變(亦即，高變)的胺基酸殘基編號之系統，且該系統至少部分地基於使用大量晶體結構之親和傳播聚類(affinity propagation clustering)，如(North等人,A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations , Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011)中所描述。
術語「EU編號」或「EU標記」在本文中可互換使用。此項技術中公認的此等術語係指基於在www.imgt.org可用的國際免疫遺傳學資訊系統® (International Immunogenetics Information System® )對於重鏈恆定域之胺基酸殘基編號的系統。EU編號描述於Kabat,等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest ,第5卷,第五版.第2719頁 (1992)中。
在本文中可互換使用之術語「患者」、「受試者」及「個體」係指動物，較佳人類。在某些實施例中，受試者，較佳人類，進一步表徵為患有將受益於IL-23及TNFα中之一者或較佳兩者之含量降低或其生物活性降低的疾病或病症或病狀(例如，自體免疫病症)。在另一實施例中，受試者，較佳人類，進一步表徵為具有罹患將受益於IL-23及TNFα兩者之含量降低或其生物活性降低之病症、疾病或病狀的風險。
IgG 雙特異性抗體工程改造 本發明之IgG雙特異性抗體為雜二聚抗體，其中抗體之各HC-LC對或臂展現與其同源抗原的選擇性單價結合，此係歸因於形成抗體之兩個不同HC及兩個不同LC：抗體的一個臂(HC-LC對)結合人類TNFα，且另一個臂結合人類IL-23之p19次單元。然而，產生具有IgG架構之雙特異性抗體的能力已成為抗體工程改造中存在已久的難題。用於產生IgG雙特異性抗體的一個方案需要共表現編碼兩個不同HC-LC對之核酸，其在表現時組裝以形成包含兩個不同Fab的單抗體。然而，在此途徑之情況下仍存在難題。特定言之，各所要Fab之所表現的多肽必須組裝有良好特異性以減少失配副產物之產生，且所得雜四聚體必須組裝有良好穩定性。藉由將修飾引入HC-HC界面區域中導引特定HC-HC對之組裝的步驟已揭示於此項技術中。(參見Klein等人, mAbs, 第4卷, 第6期,第1-11頁, 2012；Carter等人, J. Immunol. Methods, 第248卷,第7-15頁, 2001；Gunasekaran,等人, J. Biol. Chem., 第285卷,第19637-19646頁, 2010；Zhu等人, Protein Science, 第6卷,第781-788頁, 1997；及Igawa等人, Protein Eng. Des. Sel., 第23卷第667-677頁, 2010)。然而，在工程改造具有不同HC-HC界面之雜二聚雙特異性抗體中仍存在難題，且本發明之IgG雙特異性抗體已經工程改造以解決此等難題並驅動其恰當組裝。
構築根據本發明之IgG雙特異性抗體的初步嘗試可包括親本抗TNFα抗體(例如，阿達木單抗(adalimumab)，如美國專利第6,090,382號中所描述)及親本抗IL-23抗體(例如，如美國專利第7,872,102號中所描述)，或可包括靶向TNFα及IL-23之親本雙特異性抗體(例如，如美國專利公開案第2016/0122429 A1號中所描述)。然而，即使考慮到如上文所描述之親本抗體，構築根據本發明之IgG雙特異性抗體的初步嘗試仍會遭遇本文中所描述之化學及物理問題中之一或多者。進行包括化學及物理蛋白質工程改造的廣泛工程改造以獲得本發明之IgG雙特異性抗體。
舉例而言，如上文所描述之親本抗TNFα及抗IL-23抗體具有人類κ輕鏈恆定區。鑑別對本發明之IgG雙特異性抗體之抗IL-23臂的修飾，從而使輕鏈恆定區變為人類λ輕鏈恆定區，使得改良本發明之IgG雙特異性抗體之組裝。然而，對本文所提供之IgG雙特異性抗體之抗TNFα臂之輕鏈恆定區的修飾(自人類κ輕鏈(如在親本抗TNFα抗體中)變為人類λ輕鏈)並不產生改良之穩定性。另外，鑑別在本文所提供之IgG雙特異性抗體之抗TNFα臂及抗IL-23臂兩者的Fab域及Fc域兩者中經工程改造之大量修飾，該等修飾改良化學及物理穩定性並驅動雜二聚組裝。舉例而言，使得HC2之Fab域具有殘基74處之蘇胺酸(殘基編號基於Kabat)的經工程改造之修飾經由將親本抗IL-23抗體併入IgG雙特異性抗體中之結構提高穩定性且改良藥物遞送特徵，諸如黏度。
另外，本發明之IgG雙特異性抗體之實施例含有來源於人類IgG1 的Fc部分。熟知IgG1 可與Fc-γ受體家族(FcγR)之蛋白質以及C1q結合。與此等受體之相互作用可誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)。在一些實施例中，本發明之IgG雙特異性抗體與親本TNFα抗體(阿達木單抗，如美國專利第6,090,382號中所描述)相比具有增強的CDC活性。
IgG 雙特異性抗體結合 本發明之IgG雙特異性抗體結合人類TNFα及人類IL23p19兩者且在活體外及/或活體內中和至少一種人類TNFα生物活性及至少一種人類IL-23生物活性。在於活體外存在及不存在TNFα時，本發明之IgG雙特異性抗體為IL-23之強效抑制劑。在於活體外存在及不存在IL-23時，本發明之IgG雙特異性抗體為可溶TNFα及膜結合TNFα兩者之強效抑制劑。
本發明之IgG雙特異性抗體進一步表徵為在37℃下針對人類TNFα之結合親和力(KD )為49 ± 9.0 pM範圍內，及針對人類IL23p19之KD 為245 ± 8 pM範圍內。IgG雙特異性抗體有效地中和可溶TNFα以及膜結合TNFα，且此中和不受飽和量之人類IL-23存在的影響。IgG雙特異性抗體有效地中和人類IL-23，且此中和不受飽和量之人類TNFα存在的影響。
IgG 雙特異性抗體表現 能夠導引其可操作地連接之基因之表現的表現載體為此項技術中所熟知。表現載體可編碼促進來自宿主細胞之多肽之分泌的信號肽。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽。所表現的多肽中之各者可獨立於其可操作地連接之不同啟動子在一個載體中表現，或替代地，可獨立於其可操作地連接之不同啟動子在多個載體中表現。表現載體在宿主生物體中典型地可以游離基因體或宿主染色體DNA之整體部分形式複製。通常，表現載體將含有選擇標記(例如四環素、新黴素及二氫葉酸還原酶)以准許偵測經所需DNA序列轉化之彼等細胞。適用於製備本發明之融合化合物之例示性適合載體包括可獲自Lonza Biologics之載體，諸如pEE 6.4及pEE 12.4 (例如用於表現第二聚核苷酸序列)。
編碼本發明之IgG雙特異性抗體之例示性HC1 (具有胺基酸序列SEQ ID NO:1)的特定DNA聚核苷酸序列係由SEQ ID NO:5提供(由SEQ ID NO:5提供之DNA聚核苷酸序列亦編碼N端信號肽及在轉譯後裂解之C端離胺酸)。編碼本發明之IgG雙特異性抗體之例示性LC1 (具有胺基酸序列SEQ ID NO:2)的特定DNA聚核苷酸序列係由SEQ ID NO:6提供(由SEQ ID NO:6提供之DNA聚核苷酸序列亦編碼N端信號肽)。編碼本發明之IgG雙特異性抗體之例示性HC2 (具有胺基酸序列SEQ ID NO:3)的特定DNA聚核苷酸序列係由SEQ ID NO:7提供(由SEQ ID NO:7提供之DNA聚核苷酸序列亦編碼N端信號肽及在轉譯後裂解之C端離胺酸)。編碼本發明之IgG雙特異性抗體之例示性LC2 (具有胺基酸序列SEQ ID NO:4)的特定DNA聚核苷酸序列係由SEQ ID NO:8提供(由SEQ ID NO:8提供之DNA聚核苷酸序列亦編碼N端信號肽)。
宿主細胞係指經表現本發明之IgG雙特異性抗體之HC1、HC2、LC1及LC2多肽鏈的一或多種表現載體穩定或短暫地轉染、轉化、轉導或感染之細胞。產生本發明之IgG雙特異性抗體之宿主細胞株的形成及分離可使用此項技術中已知之標準技術實現。哺乳動物細胞較佳為表現本發明之IgG雙特異性抗體之宿主細胞。特定哺乳動物細胞為HEK 293、NS0、DG-44及CHO。較佳地，IgG雙特異性抗體分泌於培養宿主細胞之培養基中，可藉由習知技術自該培養基中回收或純化IgG雙特異性抗體。舉例而言，可使用習知方法將培養基施加至蛋白質A或G管柱並自該管柱溶離。可藉由包括尺寸排阻、疏水性相互作用、離子交換或羥磷灰石層析之常見技術有效移除可溶聚集體及多聚體。產物可立即冷凍，例如在-70℃，冷藏，或可凍乾。可採用各種蛋白純化之方法，且此等方法為本領域中已知且描述於例如 Deutscher,Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)及Scopes,Protein Purification: Principles and Practice ，第3版, Springer, NY(1994)中。
治療用途 如本文所用，「治療(treatment/treating)」意欲指其中可減緩、中斷、遏制、控制或終止本文中所描述之病症之進展的所有方法，但未必指示完全消除所有病症症狀。治療包括投與本發明之IgG雙特異性抗體，其用於將受益於TNFα及/或IL-23之含量降低或其生物活性降低的治療哺乳動物，特定言之人類的疾病或病狀，且包括：(a)抑制疾病的進一步進展，亦即，遏制其發展；及(b)緩解疾病，亦即，使得疾病或病症消退或減輕其症狀或併發症。
期望本發明之IgG雙特異性抗體治療自體免疫疾病，包括IBD (諸如CD及UC)、Ps0、PsA及HS。
醫藥組合物 本發明之IgG雙特異性抗體可併入適合於向患者投與之醫藥組合物中。本發明之IgG雙特異性抗體可單獨或與醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑一起以單劑量或多劑量形式向患者投與。此類醫藥組合物經設計以適合於所選擇之投與模式，且視需要使用醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑及/或賦形劑，諸如分散劑、緩衝劑、界面活性劑、防腐劑、增溶劑、等張劑、穩定劑及其類似者。可根據例如提供如從業者一般已知之調配技術之概要的Remington,The Science and Practice of Pharmacy ，第22版，Loyd V編，Pharmaceutical Press, 2012中所揭示之習知技術來設計該等組合物。用於醫藥組合物之適合載劑包括在與本發明之IgG雙特異性抗體組合時保持分子之活性且不與病患之免疫系統反應的任何物質。本發明之醫藥組合物包含IgG雙特異性抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
可使用標準投與技術向處於如本文中所描述之疾病或病症之風險下或患有該等疾病或病症的患者投與包含本發明之IgG雙特異性抗體之醫藥組合物。
本發明之醫藥組合物含有如在本文中可互換使用之「有效」量或「治療有效」量的本發明之IgG雙特異性抗體。有效量係指達成所要治療結果所必需之量(在一定劑量下，及對於一定時間段而言，及對於投與方法而言)。本發明之IgG雙特異性抗體之有效量可根據諸如以下之因素而變化：個體之疾病病況、年齡、性別及體重，以及抗體或抗體部分引起個體之所要反應的能力。有效量亦為IgG雙特異性抗體之治療有益效應超過其任何毒性或有害效應的量。
實例
IgG 雙特異性抗體表現及純化 本發明之例示性IgG雙特異性抗體包含兩個HC及兩個LC，其中HC1之胺基酸序列為SEQ ID NO:1，LC1之胺基酸序列為SEQ ID NO:2，HC2之胺基酸序列為SEQ ID NO:3，且LC2之胺基酸序列為SEQ ID NO:4，其中HC2包含SEQ ID NO:3之殘基74處之蘇胺酸，且其中HC1與LC1形成至少一個鏈間雙硫鍵(形成HC1-LC1對)，HC2與LC2形成至少一個鏈間雙硫鍵(形成HC2-LC2對)，且HC1與HC2形成至少兩個鏈間雙硫鍵，並且另外其中HC1-LC1對與TNFα結合且HC2-LC2對與IL23p19結合。
本發明之例示性經工程改造IgG雙特異性抗體之各個區的關係呈現於表1中。另外，例示性IgG雙特異性抗體之抗TNFα (HC1-LC1)臂及抗IL-23 (HC2-LC2)臂兩者的Fab域及Fc域兩者中經工程改造之修飾提供於表2中，該等修飾改良化學及物理穩定性並驅動雜二聚組裝。表1中之胺基酸殘基之編號應用線性編號；可變域之胺基酸指配係基於在www.imgt.org可用的國際免疫遺傳學資訊系統® ；CDR域之胺基酸指配應用North及Kabat編號規則之組合且意欲涵蓋藉由各別方法獲得的最廣泛胺基酸殘基覆蓋範圍。表2中之胺基酸之編號應用具有對應Kabat或EU殘基值的線性編號，該等殘基值可不同於例示性IgG雙特異性抗體之殘基位置(提供於表1中)但適用於標識例如在其他IgG雙特異性抗體中之各別修飾位置。表 1 ： 本發明之例示性經工程改造 IgG 雙特異性抗體之胺基酸區。 表 2 ： 例示性 IgG 雙特異性抗體中改良化學及物理穩定性並驅動雜二聚組裝之經工程改造之胺基酸修飾。
此外，例示性IgG雙特異性抗體之HC1及HC2經表現在C端具有離胺酸(例如，HC1 (SEQ ID NO:1)之殘基451，且HC2 (SEQ ID NO:3)之殘基445)。例示性IgG雙特異性抗體之HC1及HC2之C端離胺酸可在轉譯後截短。HC1及HC2之C端離胺酸可提供表現本發明之IgG雙特異性抗體之益處。另外，例示性IgG雙特異性抗體之HC2經表現在SEQ ID NO:3之殘基1處具有麩醯胺酸。然而，N端麩醯胺酸可在表現期間轉化為焦麩胺酸。
雖然相對於生殖系參考序列描述本文中所揭示之經工程改造修飾，但熟習此項技術者將認識到，倘若經限定胺基酸根據Kabat或EU殘基編號規則(如本文中所闡述)位於最終經工程改造IgG雙特異性抗體中之指示位置處，則可採用替代生殖系序列(例如，同型之異型)。
本發明之例示性IgG雙特異性抗體可基本上如下表現及純化。適當宿主細胞(諸如HEK 293或CHO)經使用理想預定HC:LC載體比率分泌例示性IgG雙特異性抗體之表現系統或編碼HC (例如，分別為SEQ ID NO:1及3)及LC (例如，分別為SEQ ID NO:2及4)兩者之單載體系統短暫或穩定地轉染。例示性IgG雙特異性抗體已分泌於其中之澄清培養基使用許多常用技術中之任一者來純化。舉例而言，將例示性IgG雙特異性抗體已分泌於其中之澄清培養基塗覆至已用相容緩衝液(諸如20mM TRIS (pH 8.0))平衡之蛋白質A親和管柱。用20mM Tris (pH 7.0)洗滌管柱以移除非特異性結合組分，接著用高鹽洗液洗滌以進一步移除非特異性組分。管柱反向平衡於20mM Tris (pH7.0)中，且隨後經結合例示性IgG雙特異性抗體例如藉由諸如20mM檸檬酸鹽(pH 3.0)之pH梯級或梯度溶離並用Tris (pH 8)緩衝液中和。例示性IgG雙特異性抗體藉由280 nm下之吸光度偵測並相應地收集。將捕獲蛋白質-A之物質的特徵化產生4.94 mg/mL之效價，其具有低LC錯裝(3.1%)、低HC-LC錯配組合物(3.1%)、低半抗體組合物(7.4%)及低HMW聚合物(1.5%)。可藉由包括疏水性相互作用層析之常見技術有效移除經錯裝之例示性IgG雙特異性抗體、可溶聚集體及多聚體。舉例而言，利用使用疏水性相互作用層析之第二純化管柱，LC錯裝及低HMW聚合物形成之含量分別減少至0.6%及1%。例示性IgG雙特異性抗體使用常見技術濃縮且/或無菌過濾。在此等層析步驟之後，例示性IgG雙特異性抗體之純度可達到大於98.0%之值(單體)。例示性IgG雙特異性抗體可緊接著在-70℃下冷凍或在4℃下儲存數月。
例示性 IgG 雙特異性抗體之 溶解度及穩定性分析 對本發明之例示性IgG雙特異性抗體之初步研究顯示出人意料的有益屬性，包括IgG雙特異性抗體之雜二聚組裝；以及出人意料且有益的穩定性、溶解度及黏度屬性。
穩定性 在於10mM組胺酸，pH 6.0，± 150 mM NaCl + 0.02% (v/v)聚山梨醇酯-80中調配之高濃度(50及100 mg/mL)下評估例示性IgG雙特異性抗體之穩定性。在25℃下培育濃縮之樣本4週時間。培育後，使用尺寸排阻層析法(SEC)分析樣本之(i)高分子量百分比(HMW%)；且根據標準程序使用毛細管等電聚焦(cIEF)分析樣本(ii)在電荷分佈中之改變。經由對層析之能值功率分析且使用在單體峰值之前溶離之峰的AUC與總AUC之比率來計算HMW百分比。在分析之後，本發明之例示性IgG雙特異性抗體產生小於或等於0.6% (0.1%為50 mg/mL)之HMW %及1.9%之主峰的變化%。此等結果指示例示性IgG雙特異性抗體具有類似於或優於單價抗體療法之化學穩定性，且具有足以促進溶液調配物之產生的化學穩定性。
溶解度 需要足夠高的溶解度來實現所需的及/或方便的給藥。舉例而言，將1.0 mL注射至100 kg患者中之1 mg/kg給藥劑量將需要100 mg/ml之溶解度。藉由使用30 KDa分子量截止過濾器(例如，Amicon U.C.過濾器，Millipore，目錄號UFC903024)將15 mg例示性IgG雙特異性抗體濃縮至約100 µl之體積來分析本發明之例示性IgG雙特異性抗體之溶解度。使用Cary 50分光光度計(Agilent)藉由A280下之UV吸光度量測樣本之最終濃度。根據大體上如所描述之程序，例示性IgG雙特異性抗體顯示在pH 6 10 mM組胺酸緩衝液中大於132 mg/mL (及在PBS pH 7.4中大於134 mg/mL)之溶解度。此等結果指示例示性IgG雙特異性抗體呈現處於或優於單價抗體療法且足以實現高濃度給藥的溶解度。
黏度 在25℃下在10 mM組胺酸pH 6.0中調配的大致濃度100 mg/mL下分析例示性IgG雙特異性抗體之黏度，該組胺酸包括150 mM NaCl及0.02% (v/v)聚山梨醇酯-80。使用Viscosizer TD毛細管儀(Malvern Instruments)進行黏度量測，重複兩次。在約100 mg/mL下例示性IgG雙特異性抗體呈現與單價抗體療法相當或優於其的黏度(6.8cP)。經對比，本發明之IgG雙特異性抗體之構築體呈現17.2cP之黏度(在約100 mg/mL，25℃下)，其中HC2之殘基74處之蘇胺酸經工程改造為呈親本抗IL-23抗體形式之麩胺酸(例如，T74E，Kabat)。
例示性 IgG 雙特異性抗體與 IL - 23 及 TNFα 之結合親和力 例示性IgG雙特異性抗體與人類IL-23及人類TNFα之結合親和力及結合化學計量使用表面電漿子共振分析在底塗有1X HBS-EP+ (Biacore P/N BR-1006-69)操作緩衝液且分析溫度設定為37℃之Biacore T200儀器 (GE Healthcare，Piscataway NJ)上測定。在全部四種流動細胞上含有固定蛋白質A (使用標準NHS-EDC胺偶合產生)之CM4晶片(Biacore P/N BR-100534)用以採用捕獲方法。IgG雙特異性抗體樣本藉由以5 µg/mL稀釋至操作緩衝液中製備，且在流動細胞上捕獲約100-150 RU。人類IL-23藉由稀釋至操作緩衝液中以150.00、75.00、37.50、18.75、9.38、4.69、2.35、1.18、0.59及0 (空白組) nM之最終濃度製備。人類TNFα藉由稀釋至操作緩衝液中以50.0、25.0、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.19及0 (空白組) nM之最終濃度製備。
各分析週期由以下組成：(1)在流動細胞(Fc3)上捕獲抗體樣本；(2)在流動細胞上以80 µL/min注射各人類IL-23濃縮物200秒，接著返回至緩衝液流900秒以監測解離相；(3)在流動細胞上以80 µL/min注射各人類TNFα濃縮物200秒，接著返回至緩衝液流900秒以監測解離相；(4)在所有流動細胞上藉由以50 µL/min注射10 mM甘胺酸，pH 2.0持續30秒來再生晶片表面；及(5)用50 µL (60秒) HBS-EP+操作緩衝液注射平衡晶片表面。使用減去標準參考方法(使用Biacore T200評估軟體1.0版擬合至1:1結合模型)處理資料，以測定締合速率(kon ，單位M- 1 s- 1 )、解離速率(koff ，單位s- 1 )及RUmax (單位RU)。由關係式KD =kon /koff 計算平衡解離常數(KD )，且以莫耳為單位。結果提供於表3中。表 3 ： 在 37 ℃下 例示性 IgG 雙特異性抗體與人類 IL - 23 及人類 TNFα 之 結合親和力。
此等結果表明本發明之例示性IgG雙特異性抗體在37℃下以高親和力結合人類IL-23及人類TNFα。
例示性 IgG 雙特異性抗體與人類 IL - 23 及 TNFα 之同步結合 BIAcore T200儀器用以測定本發明之例示性IgG雙特異性抗體是否可同步結合人類IL-23及人類TNFα。除了如所提及的以外，所有試劑及材料均購自GE Healthcare (Piscataway, NJ)。所有量測均在25℃下進行。HBS-EP+操作緩衝液用作操作緩衝液及樣本緩衝液兩者。使用胺偶合套組，蛋白質A固定於CM4感測器晶片之流動細胞1及2上。例示性IgG雙特異性抗體首先在流動細胞上捕獲(產生約95個反應單位(ΔRU)之例示性IgG雙特異性抗體捕獲，接著以50 nM注射人類TNFα或以150 nM注射人類IL-23，持續200秒(以使第一抗原之結合飽和，且測定起始RU捕獲量)。在結合第一抗原之後，注射在50 nM下之人類TNFα或在150 nM下之人類IL-23中之另一者，持續200秒(以使第二抗原之結合飽和，且測定額外RU捕獲量)。一個流動細胞維持為僅蛋白質A對照。隨後使用10 mM甘胺酸pH 2再生晶片表面。以各別抗原之反向次序重複相同方法。結果表明本發明之例示性IgG雙特異性抗體可同步結合人類IL-23及人類TNFα，如藉由與例示性IgG雙特異性抗體結合的兩個配位體之反應單位增加(來自TNFα之初始18.5 RU，且隨後為來自IL-23之額外32.5 RU) (n = 2)所展示。
例示性 IgG 雙特異性抗體之抗體清除率 在投與5 mg/kg例示性IgG雙特異性抗體(靜脈內(N = 2)；或皮下(N = 2))之雄性食蟹獼猴中評估例示性IgG雙特異性抗體之血清藥物動力學。在pH 7.2的PBS溶液中製備例示性IgG雙特異性抗體。
在投與之前，自各食蟹獼猴收集約1.5 mL血液。在投與之後，在投與後1 (僅靜脈內)、6、12、24、48、72、96、168及240小時收集血液(約1.5 mL)。自股骨靜脈靜脈內收集血液樣本至血清分離器試管(例如，不含抗凝血劑)中並處理成血清。
利用親和純化F(ab')2 片段山羊抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)作為塗覆於ELISA培養盤(Thermo Scientific™ Immulon® 4HBX)上之捕獲試劑藉由總人類IgG ELISA來分析血清樣本。將血清樣本(100 µL)添加至ELISA培養盤之個別孔中且在25℃下培育60分鐘。培育後，將100 µL (10,000倍稀釋)小鼠抗人類IgG Fc-HRP (Southern Biotech)添加至ELISA培養盤之孔中以用於偵測例示性IgG雙特異性抗體。未結合酶經由洗滌來移除，且將100 µL TMB微孔過氧化酶受質系統(Microwell Peroxidase Substrate System) (KPL)添加至ELISA培養盤之個別孔中。藉由添加100 µL TMB終止溶液(KPL)來終止顯色且在波長校正設定為630 nm之450 nm下量測該等孔之光學密度。
例示性IgG雙特異性抗體之標準曲線藉由將已知量之例示性IgG雙特異性抗體稀釋至100%食蟹獼猴血清(BioreclamationIVT)中，接著在PBS (Thermo Scientific™ Pierce™ )中5倍稀釋於阻斷劑酪蛋白(casein)中而產生。例示性雙特異性抗體之標準曲線範圍為7.8-500 ng/mL。
藥物動力學參數(清除值)使用自時間零(投與例示性IgG雙特異性抗體)至投與(例示性IgG雙特異性抗體)後240小時之免疫反應性相對於時間曲線來計算，且使用Phoenix (WinNonLin 6.3，Connect 1.3)經由非隔室分析來測定。根據基本上如所描述之程序，本發明之例示性IgG雙特異性抗體在食蟹獼猴中具有0.31 mL/hr/kg (IV)及0.35 mL/hr/kg (皮下)之抗體清除率。結果表明，在食蟹獼猴中本發明之例示性IgG雙特異性抗體與親本IL-23抗體(美國專利第7,872,102號中所描述)相比具有約減小5倍之抗體清除率，且與抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體(美國專利公開案第2016/0122429 A1號中所描述)相比具有等效抗體清除率(親本IL-23抗體及抗TNF/抗-IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體之結果提供於美國專利公開案第2016/0122429 A1號中)。
例示性 IgG 雙特異性抗體之效應子功能 IgG抗體與特異性抗原結合導致靶細胞之助噬作用，其可隨後經由IgG之Fc部分補充及活化攜帶FcγR之免疫效應細胞或補體蛋白質。此可分別導致兩種不同的Fc介導之效應子功能反應：ADCC (抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)及CDC (補體依賴性細胞毒性)。ADCC涉及含有使得靶細胞裂解之裂解酶(諸如穿孔蛋白及顆粒酶)的細胞毒素顆粒之釋放。CDC涉及導致形成攻膜複合物(MAC)從而導致靶細胞裂解之補體蛋白質的連續補充及活化。在由人類表現之四個IgG子類別中，IgG1及IgG3在引發Fc介導之效應子功能反應時有效，而IgG2及IgG4為ADCC及CDC之不良誘導劑。本發明之例示性IgG雙特異性抗體表明ADCC活性處於與親本抗TNFα抗體(阿達木單抗，如美國專利第6,090,382號中所描述)之活性相當的水平且CDC活性處於與親本抗TNFα抗體相比提高的水平。
ADCC
用於 FcγR 結合之表面電漿子共振 使用表面電漿子共振分析在底塗有1X HBS-EP+ (Biacore P/N BR-1006-69)操作緩衝液且分析溫度設定為37℃之Biacore T200儀器(GE Healthcare，Piscataway NJ)上將例示性IgG雙特異性抗體與人類FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32a)、FcγRIIb (CD32b)及FcγRIIIa (CD16a)之結合親和力與親本抗TNFα抗體(阿達木單抗，如美國專利第6,090,382號中所描述)之結合親和力進行比較。在全部四種流動細胞上含有固定蛋白質A (使用標準NHS-EDC胺偶合產生)之CM5晶片(Biacore P/N BR-100-50)用以採用捕獲方法。IgG雙特異性抗體樣本藉由以約5 µg/mL稀釋至操作緩衝液中製備，且在流動細胞上捕獲約300 RU。藉由連續兩倍稀釋至操作緩衝液中以200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56及0.78 nM之最終濃度製備人類FcγRI (由短暫CHO細胞產生且使用IMAC及尺寸排阻層析純化)。藉由連續兩倍稀釋至操作緩衝液中以10,000.0、5,000、2,500、1,250、625、313、157、78及39 nM之最終濃度製備人類FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIIIa (由短暫CHO細胞產生且使用IMAC及尺寸排阻層析純化)。
各分析週期由以下組成：(1)在流動細胞上捕獲抗體樣本；(2)在流動細胞上以40 µL/min注射各人類FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIIIa濃縮物60秒，接著返回至緩衝液流120秒以監測解離相；(3) 藉由在所有流動細胞上以50 µL/min注射10 mM甘胺酸，pH 2.0持續30秒來再生晶片表面；及(4)用50 µL (60秒) HBS-EP+操作緩衝液注射平衡晶片表面。使用減去標準參考方法(使用Biacore T200 Scrubber 2評估軟體1.0版擬合至1:1結合模型)處理資料，以測定平衡解離常數(KD )，其由關係式KD = koff /kon 計算，且以莫耳單元為單位。結果提供於表4中。表 4 ：例示性 IgG 雙特異性抗體及親本抗 TNFα 抗體與 FcγRI 、 FcγRIIa 、 FcγRIIb 及 FcγRIIIa 之結合親和力。 此等結果表明本發明之例示性IgG雙特異性抗體以與親本抗TNFα抗體之程度相當的程度結合人類FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32a)、FcγRIIb (CD32b)及FcγRIIIa (CD16a)。
活體外誘導 FcγRIIIa 介導之效應子功能 使用穩定地表現不可裂解形式之人類膜TNFα的CHO細胞株來評估例示性IgG雙特異性抗體及親本抗TNFα抗體(阿達木單抗，如美國專利第6,090,382號中所描述)誘導Fc介導之效應子功能之能力。簡言之，用180 µL分析培養基(具有0.1 mM NEAA、1 mM丙酮酸鈉、2 mM L-麩醯胺酸、100 U/mL青黴素-鏈黴素及0.5% w/v BSA之RPMI 1640 (無酚紅))稀釋60 µL之(i)例示性IgG雙特異性抗體(30 µg/mL)或(ii)親本抗TNFα抗體(30 µg/mL)。將50 µL各別抗體-培養基溶液添加至96深孔反應培養盤，重複三次。
將穩定轉染不可裂解的人類TNFα之CHO細胞常規地培養至0.2×106 與3×106 個細胞/毫升之間的細胞密度。細胞在400×g下離心5分鐘，丟棄生長培養基，且細胞再懸浮於分析培養基中至1×106 個細胞/毫升之最終細胞密度。50 μL細胞施配於96深孔反應培養盤(含有抗體)之各孔中。培養盤在37℃下培育1小時。
在RPMI1640培養基中培養穩定地表現人類FcγRIIIa (V158)及NFAT螢光素酶報導基因之Jurkat NFAT-FF細胞株。細胞在300×g下離心5分鐘，丟棄生長介質，且細胞再懸浮於分析培養基中至6×106 個細胞/毫升之最終細胞密度。將50 μL細胞添加至96深孔反應培養盤(含有先前培育之CHO細胞及抗體)之各孔中，且隨後培養盤在37℃下再培育4小時。
培育後，使培養盤達到室溫10分鐘，隨後添加100 μL One-glo Ex (Promega，E8110)並溫和攪動一分鐘。培養盤在室溫下培育10分鐘，且使用Enspire多模式讀取器(Perkin Elmer)讀取螢光，其中每孔讀取時間為0.1秒。經由Prism v6 (Graph pad)分析結果。本發明之例示性IgG雙特異性抗體之構築體(其中例示性IgG雙特異性抗體中HC2之殘基74處之蘇胺酸經工程改造成麩胺酸(例如，T74E，Kabat，如在親本抗IL-23抗體中))用作內標且指配EC50值為1。結果(9次分析運行之表示)提供於表5中。表 5 ： FcγRIIIa 介導之效應子功能之誘導
此等結果表明，本發明之例示性IgG雙特異性抗體表明FcγRIIIa介導之效應子功能處於與親本抗TNFα抗體之效應子功能相當的水準。
CDC
C1q ELISA 結合分析 使用ELISA評估例示性IgG雙特異性抗體以及親本抗TNFα抗體(阿達木單抗，如美國專利第6,090,382號中所描述)及IgG1同型對照抗體與人類補體組分C1q之結合。在10 µg/mL至0.19 µg/mL之濃度範圍下，將100 μL的含(i)例示性IgG雙特異性抗體、(ii)親本抗TNFα抗體或(iii)IgG1同型對照之DPBS (Dulbecco's HyClone)中之一者添加至96孔微量培養盤之孔中。在4℃下將培養盤與塗佈劑一起培育隔夜(以用抗體塗佈孔)，接著在室溫下阻斷(酪蛋白，200 μL)兩小時，且隨後用洗滌緩衝液(具有0.05% Tween 20之1×TBE)洗滌三次。
將100 µL含人類C1q(10 µg/mL) (MS Biomedical)之酪蛋白阻斷反應劑添加至各孔中且在室溫下培育培養盤3小時。培育後，將培養盤洗滌三次，接著以100 µL/孔(以1:800稀釋)添加含綿羊抗人類C1q-HRP (Abcam #ab46191)之酪蛋白阻斷劑。在RT下培育培養盤1小時。培育後，用洗滌緩衝液洗滌培養盤6次，並以100 µL/孔將TMB受質(Pierce)添加至各孔中。將培養盤培育7分鐘，接著將100 µL的1.0N HCl添加至各孔中以終止反應。緊接著使用設定為450 nm之比色微量培養盤讀取器量測光學密度。根據基本上如所描述之程序，本發明之例示性IgG雙特異性抗體、親本抗TNFα抗體及IgG1同型對照抗體均展現與人類補體組分C1q之結合。
活體外誘導人類補體介導之效應子功能 使用穩定地表現不可裂解形式之人類膜TNFα的CHO細胞株來評估例示性IgG雙特異性抗體及親本抗TNFα抗體(阿達木單抗，如美國專利第6,090,382號中所描述)誘導人類補體介導之效應子功能之能力。簡言之，用180 µL分析培養基(RPMI 1640)稀釋60 µL (i)例示性IgG雙特異性抗體(30 µg/mL)或(ii)親本抗TNFα抗體(30 µg/mL)。將50 µL各別抗體-培養基溶液添加至96深孔反應培養盤，重複三次。
將穩定轉染不可裂解之人類TNFα之CHO細胞培養至0.2×106 與3×106 個細胞/毫升之間的細胞密度。細胞在300×g下離心5分鐘，丟棄生長培養基，且細胞再懸浮於分析培養基中至1×106 個細胞/毫升之最終細胞密度。50 μL細胞施配於96深孔反應培養盤(含有抗體)之各孔中。培養盤在37℃下培育1小時。
藉由在37℃下快速解凍且隨後以1:5稀釋於分析緩衝液中來製備來自人類血清(Quidel，目錄號A113)之補體。將50 μL經稀釋補體添加至分析孔中並在37℃下培育培養盤2小時。培育後，使培養盤達到室溫10分鐘，接著添加100 μL Cell Titre Glo (Promega，G775A)並溫和攪動一分鐘。培養盤在室溫下培育10分鐘，且使用Enspire多模式讀取器(Perkin Elmer)讀取螢光，其中每孔讀取時間為0.1秒。經由Prism v6 (Graph pad)分析結果。對劑量反應曲線進行四參數對數曲線擬合以評估EC50值。本發明之例示性IgG雙特異性抗體之構築體(其中例示性IgG雙特異性抗體中HC2之殘基74處之蘇胺酸經工程改造成麩胺酸(例如，T74E，Kabat，如在親本抗IL-23抗體中))用作內標且指配EC50值為1，其中例示性IgG雙特異性抗體表明相對EC50值為0.74 ± 0.05。親本抗TNFα抗體未表明可觀測的CDC活性，因此可計算EC50值。結果為4次分析運行之表示。根據大體上如上文所描述之程序，抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體(美國專利公開案第2016/0122429 A1號)亦未表明在兩小時時可觀測的CDC活性，因此可計算EC50值。
此等結果表明，本發明之活體外例示性IgG雙特異性抗體表明與親本抗TNFα抗體及抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體之效應子功能(CDC活性)相比增強的人類補體介導之效應子功能。
免疫複合體形成 抗體與TNFα之免疫複合體大小(例如，分子量)與免疫原性風險相關。根據製造商指示，使用組成梯度多角度光散射(CG-MALS)儀器(Wyatt Technology, Santa Barbara, CA)測定與TNFα複合之(i.)例示性IgG雙特異性抗體、(ii.)抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體(美國專利公開案第2016/0122429 A1號)及(iii.)親本抗TNFα抗體(阿達木單抗，如美國專利第6,090,382號中所描述)中之各者之重均分子量。各別抗體:TNFα複合體係在約0.5與約5.0之間的莫耳比下，在10 µg/mL之固定抗體濃度下在PBS中在pH 7.2下測定。根據大體上如本文所描述之程序，與TNFα複合之例示性IgG雙特異性抗體表明最大免疫複合體重均分子量為約400 kDa。相對而言，與TNFα複合之抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體及親本抗TNFα抗體兩者皆表明最大免疫複合體重均分子量大於1300 kDa。此等結果表明，本發明之例示性IgG雙特異性抗體與抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體及親本抗TNFα抗體相比具有大體上減小之免疫複合體大小。
來自正常供體之血清之免疫原性反應性分析 例示性IgG雙特異性抗體及抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體(美國專利公開案第2016/0122429 A1號)之預先存在的反應性在正常人類血清中評估(n = 60)。免疫原性抗藥物抗體(ADA)反應性係使用Chen等人,Affinity capture elution bridging assay : A novel immunoassay format for detection of anti - therapeutic protein antibodies , J. of Immunological Methods, 431 (2016) 45-51中詳述之親和力捕捉溶離橋型式(ACE-橋)免疫分析評估。
簡言之，如Chen等人詳細描述，預先存在之反應性(亦即免疫球蛋白、補體或其他蛋白)係在60個正常人類血清樣本中評估。在塗佈有抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體或例示性IgG雙特異性抗體之培養盤上捕捉稀釋之血清隔夜。在第二天，反應性蛋白經酸處理溶離，並用含有經生物素及釕標記之抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體或經標記例示性IgG雙特異性抗體的主混合物中和。隨後在經抗生物素蛋白鏈菌素塗佈之培養盤上再捕獲複合體，並在中尺度平台上使用釕偵測信號。層(Tier) 1中之偵測係基於僅二價分子(ADA)將能夠橋接兩種經標記試劑並產生正信號之原理。隨後在層2中，在添加至該偵測步驟中之過量未經標記抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體存在下，確認該信號。在正常人類血清中不存在ADA；因此，預先存在之反應性應為最小且極接近分析背景。
根據大體上如Chen等人所描述及本文中所論述之程序，例示性IgG雙特異性抗體證明在正常人類血清中之最小預先存在反應性(層2切割點為33.2%)，而抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體證明在正常人類血清中之顯著預先存在反應性，層2切割點為91.9%。此等結果證明，本發明之例示性IgG雙特異性抗體與抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體相比在活體外正常人類血清中具有減小之預先存在的抗藥物抗體反應性。
來自 Kit225 細胞之 IL - 23 介導之 Stat 3 磷酸化之活體外抑制 Kit225細胞為天然表現IL-23受體之人類T細胞淋巴球性白血病細胞株。細胞株進一步經工程改造以在STAT3結合報導子的控制下表現螢光素酶。Kit225細胞與人類IL-23之一起培育導致由IL-23R/JAK激酶介導之Stat3磷酸化之快速增加，其可使用市售ELISA (例如，Bright-Glo, Promega, P/N E1501)量測。
將Kit225細胞常規地培養於分析培養基(含有10% FBS、10 ng/ml人類IL-2之RPMI 1640) (R&D System, P/N 202-IL)及1×青黴素外加嘌呤黴素(200 pg/mL)中。在分析當天，收集細胞，用較大體積之不含血清RPMI 1640培養基洗滌，隨後以1×106 /mL再懸浮於Opti-MEM I培養基中。將每孔50,000個Kit225細胞(在50 µL中)添加至U形底經培養96孔培養盤之孔中。96孔培養盤置於培育箱中，且使細胞在37℃，5% CO2 下饑餓3小時。
評估以1:3稀釋劑量範圍在100 nM至0.5 pM之例示性IgG雙特異性抗體。將各測試濃度之例示性IgG雙特異性抗體在37℃下與3 ng/ml重組人類IL-23一起預培育一小時。分析培養基用於「單獨培養基」與「與3 ng/ml IL-23之培養基」對照。將抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體(美國專利公開案第2016/0122429 A1號)用作分析中之陽性對照，且在與雙特異性抗體相同的莫耳範圍下測試。對照抗體亦在37℃下與(3 ng/ml)重組人類IL-23一起預培育一小時。預培育後，將抗體/IL-23混合物轉移至Kit225細胞，且在37℃，5% CO2 下培育4小時。
在分析結束時，將1×裂解緩衝液添加至各孔中。將最終細胞裂解物與提供於ELISA (Bright-Glo, Promega P/N E1501)中之螢光素酶分析反應劑混合。根據製造商指示對培養盤讀數。結果表示為濃度，其中50% IL-23誘導之Stat 3磷酸化由IgG雙特異性抗體或陽性對照抑制(IC50 )，且使用資料之4參數S形擬合(GraphPad Prism)計算。
結果表明本發明之例示性雙特異性抗體以濃度依賴性方式抑制Kit225細胞中之人類IL-23誘導之螢光素酶活性。該抑制與用陽性對照抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體所觀測到的抑制相當(其中例示性IgG雙特異性抗體之IC50 為0.066 ± 0.019 pM，95%置信區間，相對於陽性對照抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體之IC50 為0.097 ± 0.012 pM，95%置信區間(來自三個獨立實驗之平均IC50 ± SEM))。陰性對照抗體在任何測試濃度下不抑制Kit225細胞中之Stat 3磷酸化。本發明之例示性IgG雙特異性抗體有效地中和IL-23。
L929 細胞中之可溶性 TNFα 誘導之細胞毒性之活體外抑制 L929細胞為天然表現TNF受體之小鼠纖維肉瘤細胞。L929細胞與人類TNFα之一起培育由於過量形成活性氧中間物而導致快速細胞死亡。可使用MTT細胞毒性分析量測細胞死亡，其中活細胞中之粒線體丁二酸酯去氫酶將四唑鎓鹽還原為甲䐶產物，其可用微量培養盤讀取器(Molecular Devices SpectriMax 190)偵測。
評估40 nM至0.002 nM (三倍稀釋)之劑量範圍。將各測試濃度之例示性IgG雙特異性抗體(100 μL)添加至含有200 pg/mL重組人類TNFα及6.25 µg/mL放射菌素-D之孔中。在重複孔/處理中執行測試。將抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體(美國專利公開案第2016/0122429 A1號)用作分析中之陽性對照，且將人類IgG1同型對照抗體用作陰性對照。在與例示性雙特異性抗體相同的莫耳劑量範圍下測試對照抗體。將含有抗體混合物之培養盤在室溫下培育60分鐘。
L929細胞常規地培養於分析培養基(1×DMEM Cellgro，10% FBS，1% Pen-Strep，1% MEM必需胺基酸，1% L-麩醯胺酸，1%丙酮酸鈉)中。在分析當天，細胞用1×PBS (無Ca++ 或Mg++ )沖洗，且用0.25%胰蛋白酶+ EDTA自培養燒瓶中剝離。胰蛋白酶用分析培養基滅活。L929細胞在RT下以215×g離心5分鐘。將細胞離心塊(pellet)再懸浮於分析培養基中。用血球計量測細胞密度，且將10,000個L929細胞(100 μL)添加至96孔培養盤中並置放於組織培養培育箱 (37℃，95%相對濕度，5% CO2 )中隔夜。將抗體/TNFα/放射菌素-D混合物轉移至具有L929黏附細胞之96孔培養盤並培育(37℃，95%相對濕度，5% CO2 ) 18小時。移除分析培養基且將MTT受質混合物添加至孔(120 μL)中。將培養盤置放在37℃，95%相對濕度，5% CO2 下3小時。藉由在微量培養盤讀取器(Molecular Devices SpectraMax 190)上在490 nm下對培養盤讀數判定細胞死亡。結果表示為濃度，其中50% TNFα誘導之反應由例示性IgG雙特異性抗體或陽性對照抗體抑制(IC50 ) (三個獨立實驗之平均值± SEM)，使用資料之4參數S形擬合(GraphPad Prism)計算。
根據基本上如所描述之程序，本發明之例示性IgG雙特異性抗體(IC50 = 0.32 ± 0.02 nM)以與用陽性對照(IC50 = 0.13 ± 0.03 nM)觀測到的方式相當的濃度依賴性方式抑制人類TNFα誘導之L929細胞殺滅。陰性對照抗體並不抑制人類TNFα。結果表明本發明之例示性IgG雙特異性抗體有效地中和可溶性人類TNFα。
L929 細胞中之膜結合人類 TNFα 誘導之細胞毒性之活體外抑制 為了研究本發明之IgG雙特異性抗體抑制膜結合TNFα之能力，使用先前展示之一組突變來使TNFα之已知裂解位點失活，以使得在不存在TNFα裂解的情況下在細胞表面上表現生物活性TNFα (Mueller等人1999)。不可裂解TNFα構築體穩定地轉染至中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中。此等細胞表現膜結合TNFα，如藉由流式細胞測量術所展示。L929細胞與表現人類不可裂解結合TNFα之CHO細胞之一起培育導致快速L929細胞死亡。
製備100 nM至0.005 nM劑量範圍(三倍稀釋)之抗體。表現膜結合人類TNFα之CHO細胞常規地維持在選擇培養基(AM2001培養基，一種不具有MSX、8 mM麩醯胺酸、GS增補劑、HT增補劑與500 µg/mL G418之內部CHO生長培養基)。在分析當天，對細胞計數，用1×PBS (無Ca++ 或Mg++ )沖洗，在215×g下離心5 min並以50,000個細胞/毫升連同放射菌素-D (6.25 µg/mL最終濃度)再懸浮於L929分析培養基中。將500個細胞(10 μL)之細胞懸浮液添加至各濃度之抗體混合物中。將各測試濃度之例示性IgG雙特異性抗體(100 μL)添加至含有表現膜結合人類TNFα之500個CHO細胞(10 μL)之細胞懸浮液的孔中。在重複孔/處理中執行測試。將抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv雙特異性抗體(美國專利公開案第2016/0122429 A1號)用作分析中之陽性對照，且將人類IgG1同型對照抗體用作陰性對照。在與例示性雙特異性抗體相同的莫耳劑量範圍下測試對照抗體。將含有抗體及CHO細胞混合物之培養盤在37℃，95%相對濕度，5% CO2 下培育60分鐘。
將含有抗體及膜結合人類TNFα CHO細胞之混合物轉移至具有L929黏附細胞之96孔培養盤，並在37℃，95%相對濕度，5% CO2 下培育18小時。使用如上文針對可溶性TNFα L929分析所描述之MTT細胞毒性分析來量測細胞死亡。結果表示為濃度，其中TNFα誘導之反應之50%由例示性IgG雙特異性或陽性對照抗體抑制(IC50 ) (3個獨立實驗之平均值± SEM)。
根據基本上如所描述之程序，本發明之例示性IgG雙特異性抗體以濃度依賴性方式由人類不可裂解膜結合TNFα CHO細胞抑制L929細胞之殺滅，其中IC50 為3.99 ± 0.57 nM。此抑制與用陽性對照雙特異性抗體(IC50 = 1.9 ± 0.3 nM)觀測到的抑制相當，而陰性對照抗體並不抑制人類TNFα。此等結果表明本發明之例示性IgG雙特異性抗體有效地中和膜結合人類TNFα。
活體內人類 IL - 23 誘導之 mIL - 22 產生之抑制 人類IL-23之投與活體內誘導正常Balb C小鼠中之小鼠IL-22 (mIL-22)表現。此活體內人類IL-23誘導之mIL-22表現由本發明之IgG雙特異性抗體(其不與小鼠IL-23或小鼠TNFα交叉反應)阻斷。
7-9週齡之正常Balb C小鼠(每組N = 5)用50奈莫耳/公斤之例示性IgG雙特異性抗體、抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv陽性對照雙特異性抗體(美國專利公開案第2016/0122429 A1號)或陰性對照抗體(人類IgG1同型抗體)腹膜內注射。在注射之後三天，小鼠藉由腹膜內注射50 nmol/kg之人類IL-23刺激。IL-23刺激後五小時，殺死小鼠並收集血漿。根據製造商之指示藉由商業ELISA (eBioscience，目錄號88-7422-86)分析所收集之血漿的小鼠IL-22表現。結果提供於表6中。表 6 ：活體內人類 IL - 23 誘導之 mIL - 22 產生之抑制
結果表明本發明之例示性IgG雙特異性抗體以與用陽性對照雙特異性抗體觀測到的水準相當的水準阻斷人類IL-23誘導之mIL-22表現之增加。此抑制與在原生小鼠中所觀測到的小鼠IL-22含量相當(p ＜ 0.0001，ANOVA接著Turkey's多重比較測試)，而陰性對照抗體並不抑制人類IL-23誘導之mIL-22表現之增加。本發明之雙特異性抗體有效地中和人類IL-23。
活體內人類 IL - 23 誘導之牛皮癬之抑制 人類IL-23之投與誘導活體內正常Balb C小鼠之牛皮癬。此活體內人類IL-23誘導之牛皮癬由本發明之IgG雙特異性抗體(其不與小鼠IL-23或小鼠TNFα交叉反應)阻斷。
在第零天、第二天及第四天，正常Balb C小鼠(每組N = 5)用300 ng重組人類IL-23皮內注射至左耳中。在第零天，經rhIL23注射之小鼠亦用(每組N = 5) 100奈莫耳/公斤之例示性IgG雙特異性抗體、抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv陽性對照雙特異性抗體(美國專利公開案第2016/0122429 A1號)或陰性對照抗體(人類IgG1同型抗體)注射(腹膜內)。在第五天，殺死小鼠，且皮膚切片經蘇木精及伊紅染色。皮膚切片用顯微鏡檢測，且組織病理學結果記錄為：皮膚炎症；棘皮症；角膜內炎症及痂；及表皮壞死及潰爛。結果分級為0 (正常)；1 (極小)；2 (輕度)；3 (中度)；或4 (顯著)。總嚴重程度分數由個別結果之嚴重程度分數之總和來計算。結果提供於表7中。表 7 ：活體內人類 IL - 23 誘導之牛皮癬之抑制。
結果表明本發明之例示性IgG雙特異性抗體以優於用陽性對照雙特異性抗體觀測到的水準及與原生小鼠相當的水準(p ＜ 0.0001，ANOVA接著Turkey's多重比較測試)阻斷人類IL-23誘導之牛皮癬，而陰性對照抗體並不抑制小鼠之人類IL-23誘導之牛皮癬。
活體內人類 TNFα 誘導之 CXCL1 產生之抑制 人類TNFα之投與活體內誘導普通Balb C小鼠之血漿中小鼠CXCL1含量之快速且短暫的增加。此活體內人類TNFα誘導之小鼠CXCL1含量之增加由本發明之IgG雙特異性抗體(其不與小鼠IL-23或小鼠TNFα交叉反應)阻斷。
普通Balb C小鼠(N = 5)用以下腹膜內注射：(a) 100奈莫耳/公斤之例示性IgG雙特異性抗體；(b) 100奈莫耳/公斤之抗TNF/抗IL23p19 IgG-scFv陽性對照雙特異性抗體(美國專利公開案第2016/0122429 A1號)；或(c) 100奈莫耳/公斤之陰性對照抗體(人類IgG1同型抗體)。在注射之後三天，小鼠藉由腹膜內注射18 nmol/kg之人類TNFα刺激。TNFα刺激後兩小時殺死小鼠並收集血漿。根據製造商之指示藉由商業MSD分析(Masol Scale Discovery，P/N. K152QTG-1)來分析所收集之血漿的小鼠CXCL1含量。結果提供於表8中。表 8 ： 活體內人類 TNFα 誘導之 CXCL1 產生之抑制。
結果表明本發明之例示性IgG雙特異性抗體相對於接收陰性對照抗體之動物顯著抑制人類TNFα誘導之CXCL1產生(p ＜ 0.0001，ANOVA接著Turkey's多重比較測試)。用例示性IgG雙特異性抗體減少CXCL1產生優於用陽性對照觀測到的減少。因此，本發明之例示性IgG雙特異性抗體在小鼠中有效地中和由人類TNFα誘導之生物作用。
抗 CD40 抗體誘導之鼠類結腸炎模型中鼠類 IL - 23 及鼠類 TNFα 之雙重中和 本發明之IgG雙特異性抗體不結合鼠類IL-23 (mIL23)或鼠類TNFα (mTNFα)。因此，為了測試在嚙齒動物模型中之雙重靶向TNFα及IL-23之治療潛能，產生代替雙特異性抗體。代替IgG雙特異性抗體由經工程改造嵌合抗TNFα mIgG2a抗體(靶向小鼠中之等效mTNFα抗原決定基之阿達木單抗之經工程改造嵌合代替抗體，此係由於本發明之IgG雙特異性抗體之HC1-LC1對靶向人類中之TNFα)構成，已在抗TNFα IgG2a抗體及經工程改造之抗IL-23p19 scFv之兩條重鏈之C端處融合(自靶向小鼠中之等效IL23p19抗原決定基之代替鼠類抗體進行工程改造，此係由於本發明之IgG雙特異性抗體之HC2-LC2對靶向人類中之IL23p19)。使用表面電漿子共振量測與代替雙特異性抗體之mIL23及mTNFα之結合親和力，分別為1.51 nM及0.08 nM。
藉由將代替雙特異性抗體之治療效果(結腸重量:長度)與僅抗TNFα單抗體及僅抗IL-23單抗體之治療效果進行比較，來測試抗CD40抗體誘導之鼠類結腸炎模型中針對結腸炎雙重靶向TNFα及IL-23之治療潛能。在注射鼠類抗CD40抗體後，Rag1基因剔除小鼠罹患嚴重的急性結腸炎，其導致消耗病、腸胃症狀(包括下痢及肛門炎症)及在注射後4天內體重減輕高達10-20%。
為了測定雙重靶向TNFα及IL-23之治療潛能，在注射抗CD40抗體之前三天，向Rag1基因剔除小鼠投與以下中之一者：(a)代替雙特異性抗體(1.4 mg/kg)；(b)抗TNFα抗體(1 mg/kg)；(c)抗IL-23抗體(0.3 mg/kg)；或(d)對照IgG2a抗體(1 mg/kg) (此等劑量之抗體注射導致活體內類似含量之抗體暴露)。在注射之後三天，向小鼠投與每小鼠200 µg之鼠類抗CD40抗體。在投與抗CD40抗體之後四天，殺死小鼠並量測結腸重量及長度(大於未投與抗CD40抗體之小鼠的結腸重量與長度之比率判定為結腸炎症之量測)。結果提供於表9中。表 9 ：比率 ( 結腸重量 : 長度 ) 之變化。
結果表明藉由代替雙特異性抗體雙重阻斷TNFα及IL-23與僅抗IL-23抗體及抗TNFα抗體療法相比對於抑制結腸炎更優良(與僅抗IL-23抗體相比p ＜ 0.0001；與僅抗TNF抗體相比p ＜ 0.0004，ABOVA接著使用Dunett's方法與對照組進行比較)。用代替雙特異性抗體對結腸炎的抑制與用對照組小鼠(不投與抗CD40抗體)觀測到的抑制相當。因此，藉由代替雙特異性抗體雙重阻斷TNF及IL-23有效地抑制小鼠之結腸炎。
鼠類 GPI 誘導之類風濕性關節炎模型中鼠類 IL - 23 及鼠類 TNFα 之雙重中和 在投與葡萄糖-6-磷酸鹽-異構酶(GPI)後，DBA/1小鼠罹患表徵為腳爪快速腫脹之類風濕性關節炎。GPI為糖分解路徑中之蛋白質，且針對GPI之自體抗體已證實於人類類風濕性關節炎患者以及鼠類模型兩者中。靶向僅TNFα或Th17路徑之療法已證實減少鼠類模型之關節腫脹之療效(Matsumoto 2008，Iwanami 2008)。
為了證實在以早期治療模式投與時鼠類IL-23及鼠類TNFα (藉由上文所描述之代替雙特異性抗體)之雙重中和之療效，DBA/1小鼠用400 µg重組人類GPI及完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)注射(1:1 v/v，尾端底部處之2個皮下注射位點)。在投與GPI後八天，向小鼠投與(藉由每週兩次腹膜內注射)以下中之一者：(a)對照鼠類IgG2a抗體(90 µg)；(b)代替雙特異性抗體(上文所描述) (4.2 µg) +對照鼠類IgG2a抗體(87 µg)；(c)代替雙特異性抗體(12.6 µg) +對照鼠類IgG2a抗體(81 µg)；或(d)代替雙特異性抗體(42 µg) +對照鼠類IgG2a抗體(60 µg)。在投與GPI後三週(第21天)，使小鼠安樂死。
開始於投與GPI當天(第0天)且其後第2、4、7、8、9、10、11、12、14、16、18及21天，基於0-3計分系統(0 =正常；1 =紅斑及主要關節之輕微腫脹；2 =主要關節之中度至重度腫脹；及3 =整個腳爪之重度腫脹)對各腳爪進行關節腫脹之嚴重程度計分。臨床分數表示全部4個腳爪之總分(最大分數為12)。藉由梯形方法計算隨時間推移自第1天至第21天(研究結束)之臨床分數之曲線下面積(AUC)。臨床分數AUC資料(表10中展示為平均值± SEM))用處理組之單向ANOVA模型擬合。所關注之測試p值比較來源於基於模型之T測試。結果提供於表10中。表 10 ： 經代替雙特異性抗體 ( 以 各種劑量 ) 或對照抗體治療之 GPI 誘導之關節炎小鼠之臨床分數。 ( 自基於模型之 t 測試 ， p ＜ 0 . 05 ) 。
結果表明藉由代替雙特異性抗體雙重阻斷TNFα及IL-23以濃度依賴性方式減輕類風濕性關節炎之關節腫脹。在第9天(在開始用對照抗體或代替雙特異性抗體中之一者處理之後當天)，經代替雙特異性Ab處理之小鼠之平均臨床分數低於經對照抗體處理之小鼠。最大臨床分數以劑量依賴型方式由代替雙特異性抗體衰減，其中經全部三個劑量之代替雙特異性抗體處理之小鼠的臨床分數AUC顯著低於經對照抗體處理之小鼠(代替雙特異性抗體濃度12.6 µg及42 µg達到最大衰減百分比)。
鼠類 GPI 誘導之類風濕性關節炎模型中鼠類 IL - 23 及鼠類 TNFα 之雙重中和與僅鼠類 IL - 23 及僅鼠類 TNFα 之中和的比較 為了在以早期治療模式投與時將鼠類IL-23及鼠類TNFα (藉由代替雙特異性抗體)之雙重中和與僅鼠類IL-23及僅鼠類TNFα治療之療效進行比較，DBA/1小鼠用400 µg His標記之重組人類GPI及CFA注射(1:1 v/v，尾端底部處之2個皮下注射位點)。在投與GPI後八天，向小鼠投與(藉由每週兩次腹膜內注射)以下中之一者：(a)對照鼠類IgG2a抗體(30 µg)；(b)鼠類抗IL-23抗體(30 µg，自靶向小鼠中之等效IL23p19抗原決定基之代替鼠類抗體進行工程改造，此係由於本發明之IgG雙特異性抗體之HC2-LC2對靶向人類中之IL23p19)；(c)鼠類抗TNFα抗體(30 µg，靶向小鼠中之等效mTNFα抗原決定基之阿達木單抗之經工程改造嵌合代替抗體，此係由於本發明之IgG雙特異性抗體之HC1-LC1對靶向人類中之TNFα)；或(d)代替雙特異性抗體(42 µg，上文所描述)。在投與GPI後十二天(第12天)，使小鼠安樂死。
開始於投與GPI當天(第0天)且其後第2、4、7、8、9、10、11及12天，基於0-3計分系統(0 =正常；1 =紅斑及主要關節之輕微腫脹；2 =主要關節之中度至重度腫脹；及3 =整個腳爪之重度腫脹)對各腳爪進行關節腫脹之嚴重程度計分。臨床分數表示全部4個腳爪之總分(最大分數為12)。藉由梯形方法計算隨時間推移自第8天(用抗體免疫接種)至第12天(研究結束)之臨床分數的曲線下面積(AUC)。臨床分數AUC資料(表11中展示為平均值± SEM)用處理組之單向ANOVA模型擬合。所關注之測試p值比較來源於基於模型之T測試。8至12天之各單獨小鼠之臨床分數用具有處理組、量測天數及其相互作用之因素的重複量測模型來擬合。亦應用自回歸結構建模(以說明經歷數天反覆量測之相同動物之相關性)。各自之協同作用藉由對布利斯測試(Bliss test)之相互作用構築對比度來評估。結果提供於表11中。表 11 ： 經代替雙特異性抗體、鼠類抗 IL - 23 Ab 、 鼠類抗 TNF α Ab 或對照抗體處理之 GPI 誘導之關節炎小鼠的臨床分數。 ( 自基於模型之 t 測試， p ＜ 0 . 05 ) 。
結果表明藉由代替雙特異性抗體雙重阻斷TNFα及IL-23與僅抗IL-23抗體及抗TNFα抗體療法相比對於減少類風濕性關節炎之關節腫脹更優良。在第9天(在開始用代替雙特異性抗體、抗IL-23抗體、抗TNFα抗體或對照抗體中之一者處理之後當天)，經代替雙特異性抗體處理之小鼠之平均臨床分數低於其他處理組。因此，藉由代替雙特異性雙重阻斷TNFα及IL-23有效地減輕小鼠之類風濕性關節炎之關節腫脹。序列 例示性 IgG HC1 ( TNFα ) ( SEQ ID NO : 1 ) 其中殘基451處之Xaa為K或不存在。例示性 IgG LC1 ( TNFα ) ( SEQ ID NO : 2 ) 例示性 IgG HC2 ( IL23p19 ) ( SEQ ID NO : 3 ) 其中殘基1處之Xaa為Q或焦麩胺酸；殘基74處之Xaa為T或E；且殘基445處之Xaa為K或不存在。例示性 IgG LC2 (IL23p19) (SEQ ID NO:4) 編碼例示性 IgG HC1 之 DNA 序列 ( SEQ ID NO : 5 ) 編碼例示性 IgG LC1 之 DNA 序列 ( SEQ ID NO : 6) 編碼例示性 IgG HC2 之 DNA 序列 ( SEQ ID NO : 7) 編碼例示性 IgG LC2 之 DNA 序列 ( SEQ ID NO : 8) 例示性 IgG HCVR1 (SEQ ID NO:9) 例示性 IgG LCVR1 (SEQ ID NO:10) 例示性 IgG HCVR2 (SEQ ID NO:11) 其中殘基1處之Xaa為Q或焦麩胺酸；且殘基74處之Xaa為T或E。例示性 IgG LCVR2 (SEQ ID NO:12) 例示性 HCDR1 (SEQ ID NO:13) AASGFTFDDYAMH例示性 HCDR2 (SEQ ID NO:14) AITWNSGHIDYADSVEG例示性 HCDR3 (SEQ ID NO:15) AKVSYLSTASSLDY例示性 LCDR1 (SEQ ID NO:16) RASQGIRNYLA例示性 LCDR2 (SEQ ID NO:17) YAASTLQS例示性 LCDR3 (SEQ ID NO:18) QRYNRAPYT例示性 HCDR4 (SEQ ID NO:19) KASGYPFTRYVMH例示性 HCDR5 (SEQ ID NO:20) YINPYNDGVNYNEEFKG例示性 HCDR6 (SEQ ID NO:21) ARNWDTGL例示性 LCDR4 (SEQ ID NO:22) KASDHIGKFLT例示性 LCDR5 (SEQ ID NO:23) YGATSKLT例示性 LCDR6 (SEQ ID NO:24) QQYWSTPFT

Claims (19)

  1. 一種免疫球蛋白G (IgG)雙特異性抗體，其包含， a.)第一重鏈(HC1)，其包含重鏈可變區(HCVR1)，其中HCVR1包含重鏈互補決定區(HCDR) 1、2及3，其中HCDR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:13，HCDR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:14，且HCDR3之胺基酸序列為SEQ ID NO:15； b.)第一輕鏈(LC1)，其包含輕鏈可變區(LCVR1)，其中LCVR1包含輕鏈互補決定區(LCDR) 1、2及3，其中LCDR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:16，LCDR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:17，且LCDR3之胺基酸序列為SEQ ID NO:18； c.)第二重鏈(HC2)，其包含重鏈可變區(HCVR2)，其中HCVR2包含HCDR 4、5及6，其中HCDR4之胺基酸序列為SEQ ID NO:19，HCDR5之胺基酸序列為SEQ ID NO:20，且HCDR6之胺基酸序列為SEQ ID NO:21，以及 d.)第二輕鏈(LC2)，其包含輕鏈可變區(LCVR2)，其中LCVR2包含LCDR 4、5及6，其中LCDR4之胺基酸序列為SEQ ID NO:22，LCDR5之胺基酸序列為SEQ ID NO:23，且LCDR6之胺基酸序列為SEQ ID NO:24， 其中HC1與LC1形成至少一個鏈間雙硫鍵，HC2與LC2形成至少一個鏈間雙硫鍵，且HC1與HC2形成至少兩個鏈間雙硫鍵，並且其中該IgG雙特異性抗體與人類TNFα及人類IL-23之p19次單元(IL23p19)結合。
  2. 如請求項1之IgG雙特異性抗體，其中HC2包含殘基74 (Kabat)之蘇胺酸。
  3. 如請求項1及2中任一項之IgG雙特異性抗體，其中 a) HC1包含殘基39 (Kabat)之酪胺酸、殘基105 (Kabat)之精胺酸、殘基127 (Kabat)之半胱胺酸、殘基228 (Kabat)之天冬胺酸及殘基230 (Kabat)之甘胺酸， b) LC1包含殘基38 (Kabat)之精胺酸、殘基42 (Kabat)之天冬胺酸及殘基122 (Kabat)之離胺酸， c) HC2包含殘基39 (Kabat)之離胺酸、殘基62 (Kabat)之麩胺酸、殘基172 (Kabat)之丙胺酸及殘基174 (Kabat)之甘胺酸，且 d) LC2包含殘基1 (Kabat)之精胺酸、殘基38 (Kabat)之天冬胺酸、殘基135 (Kabat)之酪胺酸及殘基176 (Kabat)之色胺酸。
  4. 如請求項3之IgG雙特異性抗體，其中HCVR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:9，LCVR1之胺基酸序列為SEQ ID NO:10，HCVR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:11，且LCVR2之胺基酸序列為SEQ ID NO:12。
  5. 如請求項4之IgG雙特異性抗體，其中HCVR2包含SEQ ID NO:11之殘基74之蘇胺酸。
  6. 如請求項1至5中任一項之IgG雙特異性抗體，其中HC1及HC2為人類IgG1重鏈，LC1為人類κ輕鏈，且LC2為人類κ輕鏈可變域及人類λ輕鏈恆定區。
  7. 如請求項6之IgG雙特異性抗體，其中 a) HC1包含殘基356 (EU)之甘胺酸、殘基357 (EU)之天冬胺酸、殘基364 (EU)之麩醯胺酸及殘基407 (EU)之丙胺酸，且 b) HC2包含殘基349 (EU)之絲胺酸、殘基366 (EU)之甲硫胺酸、殘基370 (EU)之酪胺酸及殘基409 (EU)之纈胺酸。
  8. 如請求項7之IgG雙特異性抗體，其中HC1之胺基酸序列為SEQ ID NO:1，LC1之胺基酸序列為SEQ ID NO:2，HC2之胺基酸序列為SEQ ID NO:3，且LC2之胺基酸序列為SEQ ID NO:4。
  9. 如請求項8之IgG雙特異性抗體，其中HC2包含SEQ ID NO:3之殘基74之蘇胺酸。
  10. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項之IgG雙特異性抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  11. 一種如請求項1至9中任一項之IgG雙特異性抗體之用途，其用於製造用以治療自體免疫疾病之藥劑。
  12. 一種如請求項1至9中任一項之IgG雙特異性抗體之用途，其用於製造用以治療牛皮癬、牛皮癬性關節炎及化膿性汗腺炎中之一者的藥劑。
  13. 一種如請求項1至9中任一項之IgG雙特異性抗體之用途，其用於製造用以治療發炎性腸病之藥劑。
  14. 一種如請求項1至9中任一項之IgG雙特異性抗體之用途，其用於製造用以治療克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎中之一者的藥劑。
  15. 如請求項1至9中任一項之IgG雙特異性抗體，其用於療法。
  16. 如請求項1至9中任一項之IgG雙特異性抗體，其用於治療自體免疫疾病。
  17. 如請求項1至9中任一項之IgG雙特異性抗體，其用於治療牛皮癬、牛皮癬性關節炎及化膿性汗腺炎中之一者。
  18. 如請求項1至9中任一項之IgG雙特異性抗體，其用於治療發炎性腸病。
  19. 如請求項1至9中任一項之IgG雙特異性抗體，其用於治療克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎中之一者。
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