JP2017528117A

JP2017528117A - 多重特異性抗体コンストラクト

Info

Publication number: JP2017528117A
Application number: JP2016575026A
Authority: JP
Inventors: バーッタ、パラヴィ; デイブ、エンマ; フィリップヘイウッド、サム; ポールハンフリーズ、デイヴィッド
Original assignee: ユーシービーバイオファルマエスピーアールエル
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2017-09-28
Also published as: GB201411420D0; CN106459217A; BR112016030424A2; CA2953638A1; RU2710730C2; US20170198062A1; ES2763525T3; EP3161008B1; RU2017102312A3; EP3161008A1; RU2017102312A; WO2015197789A1

Abstract

本開示は、ａ）式（Ｉ）：ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｘ−（Ｖ１）ｐのポリペプチド鎖；およびｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−（Ｖ２）ｑのポリペプチド鎖を含む、またはからなる多重特異性抗体分子および例えば、治療に使用するための、を含む医薬製剤に関する。本開示はまた、前記多重特異性抗体分子をコードするポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび前記ベクターおよび／またはポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞から本開示の多重特異性抗体分子を発現する方法が提供される。【選択図】図１

Description

本開示は、特定の多重特異性抗体コンストラクト、そのコンストラクトを含む医薬製剤、コンストラクトをコードするＤＮＡおよびそれを含むベクターに関する。本開示はまた、例えば、宿主細胞において、コンストラクトを発現する方法および医薬組成物としてそれを処方する方法に及ぶ。本開示はまた、多重特異性抗体コンストラクトおよび治療での製剤の使用に関する。

二重特異性抗体を作成するための多くのアプローチがあり、その多くは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらによって最初に記載されたフォーマットに基づいており（ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ１９９７年、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. １５、１５９−１６３）、全抗体、例えば、ＩｇＧ、または抗体断片、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２に対する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合を含む。

ＵＳ２００８／００５０３７０は、「安定化された」ｓｃＦｖを含む特定の二重特異性抗体分子を開示する。このタイプの分子は、それらが特異的である抗原に対して良好な結合親和性を有し、抗原結合部位の有意な閉塞は、そのフォーマットで起こらない。そのような二重特異性分子で使用されるｓｃＦｖのＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、ペプチドリンカーを使用して一緒に保存される。しかしながら、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ可変ドメインの特定の組み合わせについて、ペプチドリンカーは、ｓｃＦｖに十分な安定性を付与することができず、可変ドメインの「ゆらぎ（breathing）」および可変ドメインとの無差別な分子間対合をもたらし、したがって、その一本鎖Ｆｖ部分を介して発現中および精製後、多重体を形成する傾向がある。

本発明者らは、関連する多重特異性抗体分子を再改変して同等の機能性を有する抗体分子を提供する一方で、発現および／または精製後の多量体化を最小限に抑えるようにし、これは、得られる「モノマー」材料の収率を高めることを容易にし、精製、濃縮および治療での使用に適した安定性の製剤化後の分子を提供する。

したがって、１つの側面において、本開示は、
ａ）式（Ｉ）：Ｖ_Ｈ−ＣＨ_１−ＣＨ_２−ＣＨ_３−Ｘ−（Ｖ_１）_ｐのポリペプチド鎖；および
ｂ）式（ＩＩ）：Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ−Ｙ−（Ｖ_２）_ｑのポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子を提供し、
ここで、Ｖ_Ｈは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ_１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
ＣＨ_２は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン２を表し；
ＣＨ_３は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン３を表し；
Ｘは、結合またはリンカーを表し；
Ｙは、結合またはリンカーを表し；
Ｖ_１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖ、例えば、ｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖを表し；
Ｖ_Ｌは、可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインを表し；
Ｃ_Ｌは、定常領域、例えば、Ｃκなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し；
Ｖ_２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｄｓｓｃＦｖ、または、ｓｃＦｖ、例えば、ｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖを表し；
ｐは、０または１を表し；
ｑは、０または１を表し；
ここで、ｐの少なくとも１つは、１であり、および
ここで、Ｖ_１またはＶ_２の少なくとも１つは、ｄｓＦｖであり、および
ここで、Ｖ_１がｄｓＦｖであり、ｐが１であり、ｑが０である場合、該分子は、式（Ｉ）の２つの重鎖および式（ＩＩ）の２つの関連する軽鎖を有する二量体として提供される。

１つの態様において、Ｖ_２がｄｓＦｖであり、ｐが０であり、ｑが１である場合、該分子は、式（Ｉ）の２つの重鎖および式（ＩＩ）の２つの関連する軽鎖を有する二量体として提供される。
１つの態様において、Ｖ_１がｄｓＦｖであり、ｑが０であり、式（Ｉ）の少なくとも２つのポリペプチド鎖、例えば、Ｙ型分子中で組み立てられた（式（Ｉ）の）２つの重鎖および（式（ＩＩ））の２つの軽鎖を有する完全長抗体フォーマットがある。

１つの態様において、
ａ）式（Ｉａ）：Ｖ_Ｈ−ＣＨ_１−ＣＨ_２−ＣＨ_３−Ｘ−Ｖ_１のポリペプチド鎖；および
ｂ）式（ＩＩａ）：Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌのポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子を提供し、
ここで、Ｖ_Ｈ、ＣＨ_１、ＣＨ_２、ＣＨ_３、Ｘ、Ｖ_Ｌ、Ｃ_ＬおよびＶ_１は、上記で定義される。

式（Ｉａ）のポリペプチド中のＶ_１がｄｓＦｖである場合、多重特異性抗体は、Ｘに結合されない対応する遊離Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインをコードする第３のポリペプチドドを含むだろう。この「遊離可変ドメイン」は、一般的に、両方の重鎖で共通であり、ジスルフィド結合によりＸに結合される可変ドメインに結合する。したがって、ポリペプチドにＸを介して融合または結合される実際の可変ドメインは、「全長抗体」のフォームで２つの重鎖で異なってもよく、それと対になる遊離可変ドメインは、一般的に互いに同一であるだろう。典型的には、Ｘを介してポリペプチドの残りに融合される可変ドメインは、二量体の両方の重鎖において同一であるだろう。

１つの態様において、式（Ｉ）の２つのポリマーを含む二量体を提供し、ここで、各ポリペプチドにおけるＶ_１は、同一であり、任意に、式（ＩＩ）の２つのポリペプチドをさらに含む。
１つの態様において、
ａ）式（Ｉｂ）：Ｖ_Ｈ−ＣＨ_１−ＣＨ_２−ＣＨ_３のポリペプチド鎖；および
ｂ）式（ＩＩｂ）：Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ−Ｙ−Ｖ_２のポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子を提供し、
ここで、Ｖ_Ｈ、ＣＨ_１、ＣＨ_２、ＣＨ_３、Ｙ、Ｖ_Ｌ、Ｃ_Ｌ、ＹおよびＶ_２は、上記で定義される。

式（ＩＩｂ）のポリペプチドにおけるＶ_２がｄｓＦｖである場合、多重特異性抗体は、Ｙに結合されない対応する遊離Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインをコードする第３のポリペプチドを含むだろう。この「遊離可変ドメイン」は、両方の軽鎖に共通であり、ジスルフィド結合によりＹに結合される可変ドメインに結合するだろう。したがって、ポリペプチドにＹを介して融合されるまたは結合される実際の可変ドメインは、「完全長抗体」のフォームで２つの軽鎖と異なってもよく、それと対になる遊離可変ドメイン対は、一般的に、互いに同一であるだろう。典型的には、ポリペプチドの残りにＸを介して融合されるまたは結合される可変ドメインは、二量体の両方の軽鎖で同一であるだろう。

１つの態様において、
ａ）式（Ｉａ）：Ｖ_Ｈ−ＣＨ_１−ＣＨ_２−ＣＨ_３−Ｘ−Ｖ_１のポリペプチド鎖；および
ｂ）式（ＩＩｂ）：Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ−Ｙ−Ｖ_２のポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子を提供し、
ここで、Ｖ_Ｈ、ＣＨ_１、ＣＨ_２、ＣＨ_３、Ｙ、Ｖ_Ｌ、Ｃ_Ｌ、Ｘ、Ｙ、Ｖ_１およびＶ_２は、上記で定義される。

それぞれ式（Ｉａ）および（ＩＩｂ）のポリペプチドにおけるＶ_１およびＶ_２は、ＹまたはＸに結合されない対応する遊離Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインをコードする第３のポリペプチドを含むだろう。この「遊離可変ドメイン」は、一般的に、両方の重および軽鎖に共通であり、ジスルフィド結合によりＹまたはＸに結合される可変ドメインに結合するだろう。したがって、ポリペプチドにＸまたはＹを介して融合されるまたは結合される実際の可変ドメインは、「完全長抗体」のフォームで重または軽鎖と異なってもよく、それと対になる遊離可変ドメイン対は、一般的に、互いに同一であるだろう。

１つの態様において、ｐが０である場合、Ｘは存在しない。１つの態様において、ｑが０である場合、Ｙは存在しない。
有利には、本開示の多重特異性抗体分子は、精製後に見られる凝集の量を最小にし、医薬濃度でコンストラクトの製剤中のモノマーの量を最大にし、例えば、モノマーは、５０％、６０％、７０％または７５％以上であってもよく、例えば、精製されたタンパク質の８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％以上は、「モノマー」として存在する。

本発明の詳細な説明
本明細書中で使用される場合、「多重特異性抗体」は、２以上の結合ドメイン、例えば、２または３の結合ドメインを有する本明細書中で記載されるような抗体分子を指す。
１つの態様において、抗体コンストラクトは、三重特異性抗体である。
本明細書中で使用される場合、「三重特異性抗体」は、３つの抗原結合部位を有する抗体分子を指し、これは、独立して、同じまたは異なる抗原を結合し得る。

１つの態様において、コンストラクトは、二重特異性抗体である。
本明細書中で使用される場合、「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する分子を指し、これは、同一または異なる抗原を結合し得る。
１つの態様において、ドメインは全て、同一の抗原に結合し、抗原上で同じエピトープを結合すること、または抗原上で異なるエピトープを結合することを含む。
１つの態様において、３つの結合ドメインがあり、３つの結合ドメインのそれぞれは、異なる（区別できる）抗原を結合する。

１つの態様において、３つの結合ドメインがあり、２つの結合ドメインは、同じ抗原を結合し、同じ抗原上で同じエピトープまたは異なるエピトープを結合することを含み、第３の結合ドメインは、異なる（区別できる）抗原を結合する。
１つの態様において、本開示の多重特異性抗体分子は、２つの抗原結合部位のみを有する。多重特異性抗体分子が４つの抗原結合部位があるよに二量体化する場合、これらは、典型的に、依然として２つの異なる抗原にしか結合しないことが理解されるだろう。したがって、１つの態様において、１つの抗原を結合する結合ドメインの１つの対および第２の異なる抗原を結合する結合ドメインの他の対の４つの結合ドメインがある。

本明細書中で使用される場合、「抗原結合部位」は、分子の部分を指し、これは、可変領域の１対、特に、標的抗原と特異的に相互作用する同族対を含む。
本明細書中で使用される場合、結合ドメインは、単一ドメイン抗体、すなわち、可変領域および抗原結合部位を含む。
本明細書中で使用される場合、「特異的に」は、特異的である抗原のみを認識する結合部位または非特異的である抗原と比較して、有意に高い、例えば、５、６、７、８、９、１０倍より高い、結合親和性を有する結合部位を指すことを意図する。
結合親和性は、標準的なアッセイ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴によって測定され得る。

本明細書中で使用される場合、「タンパク質」は、１００アミノ酸以上のアミノ酸配列を指す。１つの態様において、本明細書中で使用される場合、「タンパク質」は、二次または三次構造を有するアミノ酸配列を指す。１つの態様において、タンパク質は、基本配列を含むアミノ酸の数ではなく、分子中の二次および／または三次構造のレベルによって決定される。

本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも１つの抗原認識部位（また、本明細書中で結合部位として言及される）を介して、標的抗原、例えば、炭化水素、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、ペプチドに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。
本明細書中で使用される場合、「抗体分子」は、抗体およびその結合断片を含む。

本明細書中で使用される場合、「抗体断片」は、上記のいずれかのＦａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、２価、３価または４価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびエピトープ結合断片を含む抗体結合断片を指すが、これらに限定されない（例えば、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ, ２００５年, ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ. ２３（９）：１１２６−１１３６；ＡｄａｉｒおよびＬａｗｓｏｎ, ２００５年, ＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎＲｅｖｉｅｗｓ − Ｏｎｌｉｎｅ２（３）, ２０９−２１７参照）。これらの抗体断片を作成するまたは製造する方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら１９９８年, ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ, ２１６：１６５−１８１参照）。本開示における使用のための他の抗体断片は、国際特許出願ＷＯ０５／００３１６９、ＷＯ０５／００３１７０およびＷＯ０５／００３１７１で記載されるＦａｂおよびＦａｂ’断片を含む。多価抗体は、複数の特異性、例えば、二重異性を含みうる、または単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２およびＷＯ２０１０／０３５０１２参照）。

本明細書中で使用される場合、「結合断片」は、ペプチドまたは抗原に特異的な断片を特徴付けるのに十分な親和性を有する標的ペプチドまたは抗原を結合することができる断片を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖のＶＬ（可変軽鎖）ドメインおよび定常ドメイン（ＣＬ）、および重鎖のＶＨ（可変重鎖）ドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む軽鎖断片を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ断片は、一般的に、ヒンジ領域を含まないが、Ｆａｂ’は、ヒンジ領域を含む。

本開示の抗体分子の定常領域ドメインは、抗体分子の提案された機能、特に必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭドメインであってもよい。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメインが使用されてもよく、特に抗体分子が治療用途に意図され、抗体エフェクター機能が要求される場合、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプを使用し得る。あるいは、抗体分子が治療目的であり、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプが使用される。

１つの態様において、本開示のコンストラクトで使用される定常ドメインは、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびそれらの組み合わせ、特にアイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４から独立して選択される。
これらの定常領域ドメインの配列変異体もまた、使用され得ることが理解されるだろう。例えば、位置２４１でセリンが、Ａｎｇａｌら１９９３年, ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, １９９３年, ３０：１０５−１０８で開示されるように、プロリンに変化されたＩｇＧ４分子が、使用され得る。したがって、抗体がＩｇＧ４抗体である態様において、抗体は、突然変異Ｓ２４１Ｐを含み得る。

抗体は、様々な翻訳後修飾を受け得ることも当業者によって理解されるだろう。これらの修飾のタイプおよび程度は、しばしば抗体並びに培養条件を発現するために使用される宿主細胞株に依存する。そのような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化およびアスパラギン酸脱アミド化でのバリエーションを含み得る。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によりカルボキシ末端塩基性残基（リシンまたはアルギニンなど）の損失である（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ７０５：１２９−１３４, １９９５年のＨａｒｒｉｓ, ＲＪ. Ｊｏｕｒｎａｌに記載されるように）。したがって、抗体重鎖のＣ末端リシンは、存在しなくてもよい。

Ｖ_１が、本開示の化合物においてｄｓＦｖである場合、式（Ｉ）（または本明細書中で記載されるような別の式）のポリペプチドは、式（Ｉ）の融合ポリペプチドの一部である可変ドメインへのジスルフィド結合を介して結合される単一可変ドメインを含むことは、当業者にとって明らかであるだろう。

Ｖ_２が、本開示の化合物においてｄｓＦｖである場合、式（Ｉ）（または本明細書中で記載されるような別の式）のポリペプチドは、式（Ｉ）の融合ポリペプチドの一部である可変ドメインへのジスルフィド結合を介して結合される単一可変ドメイン（Ｖ_２の成分）を含むことは、当業者にとって明らかであるだろう。

本明細書中で使用される場合、融合ポリペプチドは、連続ポリペプチド鎖であり、一般的に、例えば、組換え技術によって調製される天然に一緒に見出されない成分を含む。

１つの態様において、本開示に係る多重特異性抗体分子は、以下の重および軽鎖の二量体として提供される：
それぞれ式（Ｉ）および（ＩＩ）、ここで、Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ部位と一緒のＶ_Ｈ−ＣＨ_１部位は、機能的ＦａｂまたはＦａｂ’断片を形成する；または
それぞれ式（Ｉａ）および（ＩＩａ）、ここで、Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ部位と一緒のＶ_Ｈ−ＣＨ_１部位は、機能的ＦａｂまたはＦａｂ’断片を形成する；または
それぞれ式（Ｉｂ）および（ＩＩｂ）、ここで、Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ部位と一緒のＶ_Ｈ−ＣＨ_１部位は、機能的ＦａｂまたはＦａｂ’断片を形成する；または
それぞれ式（Ｉａ）および（ＩＩｂ）、ここで、Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ部位と一緒のＶ_Ｈ−ＣＨ_１部位は、機能的ＦａｂまたはＦａｂ’断片を形成する。

別の態様において、本開示に係る多重特異性抗体分子は、以下の重および軽鎖の２Ｘ二量体を含む四量体として提供される：
それぞれ式（Ｉ）および（ＩＩ）、ここで、Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ部位と一緒のＶ_Ｈ−ＣＨ_１−ＣＨ_２−ＣＨ_３部位は、例えば、機能的ＩｇＧを形成する；または
それぞれ式（Ｉａ）および（ＩＩａ）、ここで、Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ部位と一緒のＶ_Ｈ−ＣＨ_１−ＣＨ_２−ＣＨ_３部位は、例えば、機能的ＩｇＧを形成する；または
それぞれ式（Ｉｂ）および（ＩＩｂ）、ここで、Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ部位と一緒のＶ_Ｈ−ＣＨ_１−ＣＨ_２−ＣＨ_３部位は、例えば、機能的ＩｇＧを形成する；または
それぞれ式（Ｉａ）および（ＩＩｂ）、ここで、Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ部位と一緒のＶ_Ｈ−ＣＨ_１−ＣＨ_２−ＣＨ_３部位は、例えば、機能的ＩｇＧを形成する。

Ｖ_Ｈは、可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメインを表す。１つの態様において、Ｖ_Ｈは、重鎖可変ドメインを表す。１つの態様において、Ｖ_Ｈは、キメラ可変ドメインであり、すなわち、それは、少なくとも２つの種、例えば、ヒトフレームワークおよび非ヒトＣＤＲに由来する成分を含む。１つの態様において、Ｖ_Ｈは、ヒト化される。１つの態様において、Ｖ_Ｈは、ヒトである。

Ｖ_Ｌは、可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインを表す。１つの態様において、Ｖ_Ｌは、軽鎖可変ドメインを表す。１つの態様において、Ｖ_Ｌは、キメラ可変ドメインであり、すなわち、少なくとも２つの種、例えば、ヒトフレームワークおよび非ヒトＣＤＲに由来する成分を含む。１つの態様において、Ｖ_Ｌは、ヒト化される。１つの態様において、Ｖ_Ｈは、ヒト化される。１つの態様において、Ｖ_Ｈは、ヒトである。
通常、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、一緒に抗原結合ドメインを形成する。１つの態様において、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、同族対（cognate pair）を形成する。

本明細書中で使用される場合、「同族対」は、インビボで発生された単一抗体からの可変ドメインの対、すなわち宿主から単離される可変ドメインの自然に生じる対合を指す。したがって、同族対は、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ対である。１つの例において、同族対は、共同的に、抗原を結合する。同族対は、しばしば宿主内で成熟された親和性であるので、したがって、それらが特異的である抗原に対する高い親和性を有し得ることが有利であり得る。
本明細書中で使用される場合、「可変領域」は、ＣＤＲおよびフレームワーク、特に適切なフレームワークを含む抗体鎖での領域を指す。

本開示で使用される可変領域は、通常、抗体に由来し、これは当該分野で公知の任意の方法によって発生され得る。
本明細書中で使用される場合、「に由来する」は、使用される配列または使用される配列に非常に類似する配列は、抗体の軽または重鎖などの元の遺伝物質から得られたという事実を指す。

本明細書中で使用される場合、「自然に発生するドメインの誘導体」は、自然に発生する配列中の１、２、３、４または５つのアミノ酸が、置換または欠失されている場合、例えば、望ましくない特性を排除することによってなどドメインの特性を最適化することを指すことを意図され、ここで、ドメインを特徴付ける特徴（複数可）は保持される。修飾の例は、グリコシル化部位、ＧＰＩアンカー、または溶媒暴露リジンを除去するものである。これらの修飾は、保存的アミノ置換で関連するアミノ酸残基を置換することによって達成されることができる。

１つの態様において、本開示の抗体分子またはその抗体／断片成分は、標的抗原（単数）または抗原（複数）に対する改善された親和性を提供するように処理される。そのような変異体は、ＣＤＲを変異すること（ＹａｎｇらＪ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２５４, ３９２−４０３, １９９５年）、鎖シャッフリング（ＭａｒｋｓらＢｉｏ/Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, １０, ７７９−７８３, １９９２年）、大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）の突然変異株の使用（ＬｏｗらＪ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２５０, ３５９−３６８, １９９６年）、ＤＮＡシャッフリング（ＰａｔｔｅｎらＣｕｒｒ. Ｏｐｉｎ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ８, ７２４−７３３, １９９７年）、ファージディスプレイ（ｈｏｍｐｓｏｎらＪ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２５６, ７７−８８, １９９６年）および性的ＰＣＲ（ＣｒａｍｅｒｉらＮａｔｕｒｅ, ３９１, ２８８−２９１, １９９８年）を含む親和性成熟プロトコルによって得られることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上記）は、親和性成熟のこれらの方法を議論する。

本明細書中で使用される場合、「高度に類似」は、その全長に渡って、９５％以上類似する、例えば、９６、９７、９８または９９％類似するアミノ酸配列を指すことを意図する。
本発明での使用のための可変領域は、本明細書中で上記に記載される場合、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌに関して、任意の適切な供給源からであり得、例えば、完全ヒトまたはヒト化であり得る。
１つの態様において、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌによって形成される結合ドメインは、第１の抗原に特異的である。
１つの態様において、Ｖ_１によって形成される結合ドメインは、第２の抗原に特異的である。
１つの態様において、Ｖ_２によって形成される結合ドメインは、第２または第３の抗原に特異的である。
１つの態様において、ＣＨ_１ドメインは、抗体重鎖またはその誘導体から自然に発生するドメイン１である。１つの態様において、ＣＨ_２ドメインは、抗体重鎖またはその誘導体から自然に発生するドメイン２である。１つ態様において、ＣＨ_３ドメインは、抗体重鎖またはその誘導体から自然に発生するドメイン３である。
１つの態様において、Ｃ_Ｌ断片は、軽鎖において、定常κ配列または定常λ配列またはその誘導体である。

本明細書中で使用される場合、自然に発生するドメインの誘導体は、自然に発生する配列中の１、２、３、４または５つのアミノ酸が、置換または欠失されているところを指し、例えば、望ましくない特性を排除するなどしてドメインの特性を最適化することを意図するが、ここで、ドメインの特徴（複数可）を特徴付けることが保持される。
１つの態様において、１つ以上の天然のまたは改変された鎖間（すなわち、軽および重鎖間）ジスルフィド結合は、多重特異性抗体分子の機能的ＦａｂまたはＦａｂ’断片に存在する。

１つの態様において、「天然の」ジスルフィド結合は、式（Ｉ）および（ＩＩ）；または式（Ｉａ）および（ＩＩａ）；または式（Ｉｂ）および（Ｉｂ）；または式（Ｉａ）および（ＩＩｂ）のポリペプチド鎖中のＣＨ_１およびＣ_Ｌの間に存在する。
Ｃ_Ｌドメインが、κまたはλのいずれかに由来する場合、システインを形成する結合のための天然の位置は、ヒトｃκおよびｃλにおいて２１４である（Ｋａｂａｔ番号第４版１９８７年）。

ＣＨ_１でシステインを形成するジスルフィド結合の正確な位置は、実際に使用される特定のドメインに依存する。したがって、例えば、ヒトγ−１において、ジスルフィド結合の天然の位置は、位置２３３に位置する（Ｋａｂａｔ番号第４版１９８７年）。γ２、３、４、ＩｇＭおよびＩｇＤなどの他のヒトアイソタイプに対するシステインを形成する結合の位置は公知であり、例えば、ヒトＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４について位置１２７およびヒトＩｇＤおよびＩｇＡ２Ｂの重鎖の位置１２８である。
任意に、式ＩおよびＩＩのポリペプチドのＶ_ＨおよびＶ_Ｌの間のジスルフィド結合があってもよい。
１つの態様において、本開示に係る多重特異性抗体は、ＣＨ_１およびＣ_Ｌの間に自然に生じる同等または対応する位置におけるジスルフィド結合を有する。

１つの態様において、ＣＨ_１を含む定常領域およびＣ_Ｌなどの定常領域は、非天然に発生する位置にあるジスルフィド結合を有する。これは、必要な位置（単数）または位置（複数）で、システイン（複数可）をアミノ酸鎖中に導入することによって分子中に改変され得る。この非天然ジスルフィド結合は、ＣＨ_１とＣ_Ｌの間に存在する天然のジスルフィド結合に加わる、または代わるものである。天然の位置のシステイン（複数可）は、ジスルフィド架橋を形成することができないセリンなどのアミノ酸によって置換されることができる。

改変されたシステインの導入は、当該分野で公知の任意の方法を使用して実施されることができる。これらの方法は、ＰＣＲ伸長重複突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発法またはカセット式変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）、ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（研究室マニュアル）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ, ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ, ＮＹ, １９８９年；Ａｕｓｂｅｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における現在のプロトコル）、ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ＆Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ, ＮＹ, １９９３年参照）。部位特異的突然変異誘発法キットは、市販されており、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ, ＬａＪｏｌｌａ, ＣＡ）である。カセット式変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら, １９８５年, Ｇｅｎｅ, ３４：３１５−３２３に基づいて実施されることができる。あるいは、突然変異体は、アニーリング、ライゲーションおよびＰＣＲ増幅および重複オリゴヌクレオチドのクローニングによる全遺伝子合成によって作成されることができる。

１つの態様において、ＣＨ_１およびＣ_Ｌの間のジスルフィド結合は、完全に存在せず、例えば、鎖間システインは、セリンなどの別のアミノ酸によって置換され得る。したがって、１つの態様において、多重特異性抗体分子の機能的ＦａｂまたはＦａｂ’位置における鎖間ジスルフィド結合は存在しない。参照により本明細書中に組み込まれるＷＯ２００５／００３１７０などの開示は、鎖間ジスルフィド結合なしのＦａｂ断片を提供する方法を記載する。

１つの態様において、本発明の化合物／コンストラクトは、例えば、ＣＨ_１およびＣＨ_２の間の天然の位置に、ヒンジ領域を含む。１つの態様において、ヒンジの配列は、天然または改変されている。本明細書中で使用される場合、天然のヒンジ配列は、抗体の任意のアイソタイプに天然に発生する配列である（たとえそのヒンジが天然に発生するアイソタイプとは異なるアイソタイプに含まれる場合であっても）。改変されたヒンジは、１〜５つのアミノ酸が置換、欠失またはそれらの組み合わせである場合である。１つの態様において、ヒンジは、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４からである。

１つの態様において、本発明の化合物／コンストラクトは、ヒンジを含まず、例えば、ＣＨ_１は、指向されたＣＨ_２に融合され、またはリンカー、例えば、本明細書中で開示されるリンカーまたはＧ４Ｓ単位に基づいて結合される。
１つの態様において、ＣＨ_３は、任意の変異を含まない。
１つの態様において、抗体分子は、任意の「knob(s) into hole(s)」突然変異を含まない。
１つの態様において、本発明の抗体分子は、「knob(s) into hole(s)」突然変異を含む。

本明細書中で使用される場合、「ノブズイントゥーホールズ（knob(s) into hole(s)）」または「ノブズアンドホールズ（knob(s) and hole(s)）」は、第１のポリペプチドの界面で突起しているものおよび第２のポリペプチドの界面における対応する穴を指し、突起しているものは、ヘテロ多量体の形成を促進し、ホモ多量体形成を妨げるために、空洞内に配置されることができる。これに関して、ＵＳ８２１６８０５が参照され、これは、二重特異性抗体などのヘテロ多量体ポリペプチドを調製するこの方法の使用を記載し、その内容は、本明細書中に組み込まれる。

１つの態様において、ｐが１であり、Ｖ_１がｄｓＦｖであり、ｑが０である場合、式（Ｉ）の少なくとも２つのポリペプチド鎖がある。
Ｖ_１は、ｓｄＡｂ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖ、例えば、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂまたはｄｓｓｃＦｖを表す。１つの態様において、Ｖ_１は、ｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖまたはｓｃＦｖを表す。１つの態様において、Ｖ_１は、ｄｓｓｃＦｖを表す。１つの態様において、Ｖ_１は、ｄｓＦｖを表す。
Ｖ_２は、ｓｄＡｂ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖ、例えば、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、またはｄｓｓｃＦｖを表す。１つの態様において、Ｖ_１は、ｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖまたはｓｃＦｖを表す。１つの態様において、Ｖ_２は、ｄｓｓｃＦｖを表す。１つの態様において、Ｖ_２は、ｄｓＦｖである。

１つの態様において、Ｖ_１およびＶ_２は、ｄｓＦｖを表し、例えば、可変軽鎖ドメインは、ポリペプチドの残基へのジスルフィド結合によってのみ結合されるドメインであり、Ｖ_１およびＶ_２については、一致または高度に類似する。
１つの態様において、Ｖ_２はｄｓＦｖを表し、Ｖ_１は存在しないか、またはｄｓＦｖ以外である。１つの態様において、Ｖ_１はｄｓＦｖを表し、Ｖ_２は存在しないか、またはｄｓＦｖ以外である。１つの態様において、Ｖ_２はｄｓＦｖを表し、Ｖ_１はｓｃＦｖである。１つの態様において、Ｖ_１はｄｓＦｖを表し、Ｖ_２はｓｃＦｖである。１つの態様において、Ｖ_２はｄｓＦｖを表し、Ｖ_１はｄｓｓｃＦｖである。１つの態様において、Ｖ_１はｄｓＦｖを表し、Ｖ_２はｄｓｓｃＦｖである。１つの態様において、Ｖ_１およびＶ_２は、独立してｄｓｓｃＦｖを表す。１つの態様において、Ｖ_２はｄｓｓｃＦｖを表し、Ｖ_１はｓｃＦｖである。１つの態様において、Ｖ_１はｄｓｓｃＦｖを表し、Ｖ_２はｓｃＦｖである。

本明細書中で使用される場合、「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む、またはからなる一本鎖可変断片を指し、これは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ可変ドメインの間のペプチドリンカーによって安定化される。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ可変ドメインは、任意の適切な配向性であり得、例えば、Ｖ_ＨのＣ末端は、Ｖ_ＬのＮ末端に結合され得る、またはＶ_ＬのＣ末端は、Ｖ_ＨのＮ末端に結合され得る。

本明細書中で使用される場合、「ジスルフィド安定化一本鎖可変断片」または「ｄｓｓｃＦｖ」は、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ可変ドメインの間のペプチドリンカーによって安定化される一本鎖可変断片を指し、またＶ_ＨおよびＶ_Ｌのドメイン間ジスルフィド結合を含む。
本明細書中で使用される場合、「ジスルフィド安定化可変断片」または「ｄｓＦｖ」は、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌの可変ドメインの間のペプチドリンカーを含まず、代わりに、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌの間のドメイン間ジスルフィド結合によって安定化される一本鎖可変断片を指す。
本明細書中で使用される場合、「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」は、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌなどの単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。

１つの態様において、ｐおよびｑは両方１である。１つの態様において、ｐは１であり、ｑは０である。１つの態様において、ｐは０であり、ｑは１である。
１つの態様において、Ｖ_１および／またはＶ_２が、ｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_１の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌおよび／またはＶ_２の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌ間のジスルフィド結合は、以下に列挙される残基の２つの間である（文脈が他を示さない限り、Ｋａｂａｔ番号付けは、以下の一覧で用いられる）。Ｋａｂａｔ番号付けに言及するときは常に、その関連文献は、Ｋａｂａｔら、１９８７年、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）、米国のＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（免疫学的目的のタンパク質の配列）である。

１つの態様において、ジスルフィド結合は、以下を含む群から選択される位置にある：
・Ｖ_Ｈ３７＋Ｖ_Ｌ９５Ｃ例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ６, ７８１−７８８Ｚｈｕら（１９９７年）参照；
・Ｖ_Ｈ４４＋Ｖ_Ｌ１００例えば、；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３５４５１−５４５９Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４年）；またはＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ. ２６９Ｎｏ. ２８ｐｐ.１８３２７−１８３３１Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４年）；またはＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, ｖｏｌ.１０ｎｏ.１２ｐｐ.１４５３−１４５９Ｒａｊａｇｏｐａｌら（１９９７年）参照；
・Ｖ_Ｈ４４＋Ｖ_Ｌ１０５例えば、ＪＢｉｏｃｈｅｍ. １１８, ８２５−８３１Ｌｕｏら（１９９５年）参照；
・Ｖ_Ｈ４５＋Ｖ_Ｌ８７例えばＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ６, ７８１−７８８Ｚｈｕら（１９９７年）参照；
・Ｖ_Ｈ５５＋Ｖ_Ｌ１０１例えばＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ３７７１３５−１３９Ｙｏｕｎｇら（１９９５年）参照；
・Ｖ_Ｈ１００＋Ｖ_Ｌ５０例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９１３６２−１３６７Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（１９９０年）参照；
・Ｖ_Ｈ１００ｂ＋Ｖ_Ｌ４９;
・Ｖ_Ｈ９８＋Ｖ_Ｌ４６例えばＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ６, ７８１−７８８Ｚｈｕら（１９９７年）参照；
・Ｖ_Ｈ１０１＋Ｖ_Ｌ４６；
・Ｖ_Ｈ１０５＋Ｖ_Ｌ４３例えば；Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡＶｏｌ. ９０ｐｐ.７５３８−７５４２Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（１９９３年）；またはＰｒｏｔｅｉｎｓ１９, ３５−４７Ｊｕｎｇら（１９９４年）参照、
・Ｖ_Ｈ１０６＋Ｖ_Ｌ５７例えばＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ３７７１３５−１３９Ｙｏｕｎｇら（１９９５年）参照
および分子中に位置する可変領域対におけるそれらに対応する位置。

１つの態様において、ジスルフィド結合は、Ｖ_１および／またはＶ_２の位置Ｖ_Ｈ４４およびＶ_Ｌ１００の間に形成される。
上記に列記したアミノ酸対は、システインによる置換に寄与する位置にあるので、ジスルフィド結合が形成されることができる。システインは、既知の技術によってこれらの所望の位置に改変されることができる。したがって、１つの態様において、本開示に係る改変されたシステインは、所定のアミノ酸位置で天然の残基が、システイン残基で置換されているところを指す。

改変されたシステインの導入は、当該技術で公知の任意の方法を使用して実施されることができる。これらの方法は、ＰＣＲ伸長重複突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発法またはカセット式変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）、ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（研究室マニュアル）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ, ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ, ＮＹ, １９８９年；Ａｕｓｂｅｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における現在のプロトコル）、ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ＆Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ, ＮＹ, １９９３年参照）。部位特異的突然変異誘発法キットは、市販されており、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ, ＬａＪｏｌｌａ, ＣＡ）である。カセット式変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら, １９８５年, Ｇｅｎｅ, ３４：３１５−３２３に基づいて実施されることができる。あるいは、突然変異体は、アニーリング、ライゲーションおよびＰＣＲ増幅および重複オリゴヌクレオチドのクローニングによる全遺伝子合成によって作成されることができる。

したがって、１つの態様において、Ｖ_１および／またはＶ_２がｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、各Ｖ_１および／またはＶ_２の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって結合され得、ここで、システイン残基の対の位置は、Ｖ_Ｈ３７およびＶ_Ｌ９５、Ｖ_Ｈ４４およびＶ_Ｌ１００、Ｖ_Ｈ４４およびＶ_Ｌ１０５、Ｖ_Ｈ４５およびＶ_Ｌ８７、Ｖ_Ｈ１００およびＶ_Ｌ５０、Ｖ_Ｈ１００ｂおよびＶ_Ｌ４９、Ｖ_Ｈ９８およびＶ_Ｌ４６、Ｖ_Ｈ１０１およびＶ_Ｌ４６、Ｖ_Ｈ１０５およびＶ_Ｌ４３、およびＶ_Ｈ１０６およびＶ_Ｌ５７からなる群から独立して選択される。

１つの態様において、Ｖ_１および／またはＶ_２がｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_１の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌおよび／またはＶ_２の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって結合され得、これは、ＣＤＲの外側であり、ここで、システイン残基の対の位置は、Ｖ_Ｈ３７およびＶ_Ｌ９５、Ｖ_Ｈ４４およびＶ_Ｌ１００、Ｖ_Ｈ４４およびＶ_Ｌ１０５、Ｖ_Ｈ４５およびＶ_Ｌ８７、Ｖ_Ｈ１００およびＶ_Ｌ５０、Ｖ_Ｈ９８およびＶ_Ｌ４６、Ｖ_Ｈ１０５およびＶ_Ｌ４３、およびＶ_Ｈ１０６およびＶ_Ｌ５７からなる群から独立して選択される。

１つの態様において、Ｖ_１がｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_１の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、２つの改変されたシステイン残基の間のジスルフィド結合によって結合され、１つは位置Ｖ_Ｈ４４、もう１つはＶ_Ｌ１００である。
１つの態様において、Ｖ_２がｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖの場合、Ｖ_２の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、２つの改変されたシステイン残基の間のジスルフィド結合によって結合され、１つは位置Ｖ_Ｈ４４、もう１つはＶ_Ｌ１００である。

１つの態様において、Ｖ_１がｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖである場合、Ｖ_１のＶ_Ｈドメインは、Ｘに結合する。１つの態様において、Ｖ_１がｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖである場合、Ｖ_１のＶ_Ｌドメインは、Ｘに結合する。１つの態様において、Ｖ_２がｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖである場合、Ｖ_２のＶ_Ｈドメインは、Ｙに結合する。１つの態様において、Ｖ_２がｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖである場合、Ｖ_２のＶ_Ｌドメインは、Ｙに結合する。

１つの態様において、Ｘは、結合である。１つの態様において、Ｙは、結合である。１つの態様において、ＸおよびＹの両方は、結合である。
１つの態様において、Ｘはリンカー、好ましくは、ペプチドリンカー、例えば、タンパク質ＣＨ_３およびＶ_１を結合するのに適したペプチドである。１つの態様において、Ｙはリンカー、好ましくは、ペプチドリンカー、例えば、タンパク質Ｃ_ＬおよびＶ_２を結合するのに適したペプチドである。１つの態様において、ＸおよびＹの両方は、リンカー、好ましくは、ペプチドリンカーである。

本明細書で使用される場合、用語「ペプチドリンカー」は、アミノ酸配列を有するペプチドを指す。適切なペプチドリンカーの範囲は、当業者に知られているであろう。
１つの態様において、ペプチドリンカーは、合成起源のもの、すなわち、合成化学技術によって調製され得る。
１つの態様において、ペプチドリンカーは、長さが５０アミノ酸以下、例えば、２０アミノ酸以下、例えば、長さが９、１０、１１、１２、１３または１４アミノ酸である。１つの態様において、ペプチドリンカーは、長さが５〜１５アミノ酸である。
１つの態様において、リンカーは、配列１〜６７で示される配列から選択される。

１つの態様において、リンカーは、配列番号１または配列番号２で示される配列から選択される。
１つの態様において、Ｘは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）を有する。
１つの態様において、Ｙは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）を有する。
１つの態様において、Ｘは、配列ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号２）を有する。
１つの態様において、Ｙは、配列ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号２）を有する。

（Ｓ）は、配列１４〜１８において任意である。
Ｘは、アミノ酸である。
剛性リンカーの例としては、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号５２）、ＰＰＰＰ（配列番号５３）およびＰＰＰが挙げられる。
１つの態様において、ペプチドリンカーは、アルブミン結合ペプチドである。

アルブミン結合ペプチドの例は、ＷＯ２００７／１０６１２０で提供され、以下のものが挙げられる：

有利には、リンカーとしてアルブミン結合ペプチドの使用は、多重特異性抗体分子の半減期を増加させ得る。
１つの態様において、リンカーＸおよび／またはＹは、プロテアーゼ切断部位、すなわち、プロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列またはチーフを含まない。特に、１つの態様において、リンカーＸおよび／またはＹは、フリン特異的プロテアーゼ切断部位を含まない。
１つの態様において、Ｘおよび／またはＹで使用されるリンカーは、長さが４〜１６アミノ酸の範囲であり、例えば、モノマー（Ｇ_４Ｓ）の倍数である。

１つの態様において、Ｖ_１がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、リンカー、例えば、可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌを結合するために適切なペプチドがある。１つの態様において、Ｖ_１がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_１の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌを結合するリンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）を有する。１つの態様において、Ｖ_２がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、リンカー、例えば、可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌを結合するために適切なペプチドがある。１つの態様において、Ｖ_２がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_２の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌを結合するリンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）を有する。

１つの態様において、Ｖ_１がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_１の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌを結合するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６９）を有する。１つの態様において、Ｖ_２がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_２の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌを結合するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６９）を有する。
１つの態様において、Ｖ_１がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_１の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌを結合するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号７０）を有する。１つの態様において、Ｖ_２がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ_２の可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_Ｌを結合するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号７０）を有する。

本開示はまた、本明細書中に開示される配列に８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％類似する配列を提供する。
本明細書中で使用される場合、「同一性」は、アラインされた配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基は、配列間で同一であることを示す。

本明細書中で使用される場合、「類似性」は、アラインされた配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基は、配列の間の類似するタイプのものであることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシンまたはバリンに対して置換され得る。しばしば相互に置換されることができる他のアミノ酸は、次のものが挙げられるが、それらに限定されない：
フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
リシン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；および
システインおよびメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。

同一性および類似性の程度は、容易に計算されることができる（ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（計算分子生物学）, Ｌｅｓｋ, Ａ.Ｍ., ｅｄ., ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ。ＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｅＰｒｏｊｅｃｔｓ（情報学およびゲノムプロジェクト）, Ｓｍｉｔｈ, Ｄ.Ｗ., ｅｄ., ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ, ニューヨーク、１９９３年；ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ（配列データのコンピュータ分析）, Ｐａｒｔ１, Ｇｒｉｆｆｉｎ, Ａ.Ｍ.およびＧｒｉｆｆｉｎ, Ｈ.Ｇ., ｅｄｓ., ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ, ニュージャージー, １９９４年；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における配列分析）, ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ, Ｇ., ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ, １９８７年, ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｉｍｅｒ（配列分析プライマー）, Ｇｒｉｂｓｋｏｖ, Ｍ.およびＤｅｖｅｒｅｕｘ, Ｊ., ｅｄｓ., ＭＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ, ニューヨーク、１９９１年、ＢＮＣＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（登録商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ, Ｓ.Ｆら、１９９０年, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ, Ｗ. ＆Ｓｔａｔｅｓ, Ｄ.Ｊ. １９９３年、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ. ３：２６６−２７２. Ｍａｄｄｅｎ, Ｔ.Ｌ.ら、１９９６年、Ｍｅｔｈ. Ｅｎｚｙｍｏｌ. ２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ, Ｓ.Ｆ.ら、１９９７年, ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ. ２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ, Ｊ. ＆Ｍａｄｄｅｎ, Ｔ.Ｌ. １９９７年、ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ. ７：６４９−６５６,）。

本明細書中で使用される場合、用語「変異体」は、対応する野生型ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸またはヌクレオチド配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を含むペプチドまたはタンパク質を指す。変異体は、対応する野生型ペプチドまたはタンパク質に対して少なくとも８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９８％または９９％配列同一性を含み得る。しかしながら、変異体は、その対応する野生型ペプチドまたはタンパク質に実質的に類似の機能を示すなら、変異体は、８０％未満の配列づ異性を含むことが可能である。

本発明で使用のための抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって作製され得る。抗原ポリペプチドに対して生じる抗体は、動物の免疫化が必要な場合に、動物、好ましくは、非ヒト動物にポリペプチドを投与することによって、周知で慣習的なプロトコル（例えば、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, Ｄ. Ｍ. Ｗｅｉｒ（ｅｄ.）, Ｖｏｌ４, ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ｏｘｆｏｒｄ, Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６年参照）を使用して、得られうる。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダまたはブタなどの多くの温血動物が免疫され得る。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタおよびラットが、通常最も適している。
モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ, １９７５年, Ｎａｔｕｒｅ, ２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら１９８３年, ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ, ４：７２）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ（モノクロナール抗体および癌療法）, ｐｐ７７−９６, ＡｌａｎＲＬｉｓｓ, Ｉｎｃ., １９８５年）など、当該分野で公知の任意の方法によって調製され得る。

抗体はまた、単一リンパ球抗体法を使用して、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ, Ｊ.ら、１９９６年, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ９３（１５）：７８４３−７８４８１；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８およびＷＯ２００４／１０６３７７によって記載される方法によって特定の抗体の生産について選択される単一リンパ球から生じる免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングおよび発現することによって作製され得る。

本発明で使用のための抗体は、当該分野で公知の様々なファージディスプレイ方法を使用して作製されることができ、Ｂｒｉｎｋｍａｎら（Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｍｅｔｈｏｄｓ, １９９５年, １８２：４１−５０）、Ａｍｅｓら（Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｍｅｔｈｏｄｓ, １９９５年, １８４：１７７−１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（Ｅｕｒ. Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １９９４年, ２４：９５２−９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら（Ｇｅｎｅ, １９９７年１８７９−１８）Ｂｕｒｔｏｎら（ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, １９９４年, ５７：１９１−２８０）およびＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；およびＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５,４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３；５，９６９,１０８、およびＷＯ２００１１／３０３０５によって開示されるものが挙げられる。

１つの態様において、本開示に係る多重特異性分子は、ヒト化される。
本明細書中で開示されるヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体を含む）は、非ヒト種からの領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を決定する１つ以上の相補性を有する分子を指す（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７参照）。全体のＣＤＲよりむしろＣＤＲの残基を決定する特異性を移すことが必要であるにすぎないことが理解されるだろう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ, ３６, ２５−３４参照）。ヒト化抗体は、任意に、ＣＤＲが由来した非ヒト種由来の１つ以上のフレームワーク残基をさらに含む。

本明細書中で使用される場合、用語「ヒト化抗体分子」は、重および／または軽鎖は、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重および／または軽鎖可変領域フレームワーク中に移植されるドナー抗体（例えば、マウスモノクロナール抗体）からの１つ以上のＣＤＲ（必要な場合、１つ以上の修飾ＣＤＲを含む）を含む抗体分子を指す。総説として、Ｖａｕｇｈａｎら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, １６, ５３５−５３９, １９９８年参照。１つの態様において、全体のＣＤＲが転写されるよりも、本明細書中で上記に記載されるＣＤＲの任意の１つからの残基を決定する特異性の１つ以上のみが、ヒト抗体フレームワークに転写される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年, Ｍｅｔｈｏｄｓ, ３６, ２５−３４参照）。１つの態様において、本明細書中で上記に記載される１つ以上のＣＤＲからの残基を決定する特異性のみが、ヒト抗体フレームワークに転移される。別の態様において、本明細書中で上記に記載されるＣＤＲのそれぞれからの残基を決定する特異性のみが、ヒト抗体フレームワークに転移される。

ＣＤＲまたは特異性決定残基が移される場合、任意の適切なアクセプターの可変領域フレームワーク配列は、マウス、霊長類およびヒトフレームワーク領域を含む、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプに関して使用され得る。適切には、本発明に係るヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレーム領域並びに本明細書中で提供されるＣＤＲの１つ以上を含む可変ドメインを有する。

本開示で使用されることができるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹおよびＰＯＭである（前記Ｋａｂａｔら）。例えば、ＫＯＬおよびＮＥＷＭは、重鎖のために使用されることができ、ＲＥＩは、軽鎖のために使用されることができ、ＥＵ、ＬＡＹおよびＰＯＭは、重鎖および軽鎖の両方のために使用されることができる。あるいは、ヒト生殖系列配列が使用され得、これらは、http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.phpで利用できる。

本開示のヒト化抗体分子において、アクセプターの重および軽鎖は、同じ抗体に由来することが必ずしも必要ではなく、所望であれば、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含み得る。

フレームワーク領域は、アクセプター抗体の配列と全く同じ配列を有する必要はない。例えば、異常な残基は、そのアクセプター鎖のクラスまたはタイプのより頻繁に生じる残基に変化され得る。あるいは、アクセプターフレームワーク領域で選択された残基は、それらがドナー抗体中の同じ位置で検出される残基に相当するように変更され得る（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ, ３３２, ３２３−３２４参照）。そのような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小限に保たれるべきである。変更される必要のあるアクセプターフレームワーク領域中の残基を選択するためのプロトコルは、ＷＯ９１／０９９６７に記載される。

フレームワークの誘導体は、代替アミノ酸、例えば、ドナー残基で置換される１，２、３または４つのアミノ酸を有し得る。
ドナー残基は、ドナー抗体からの残基、すなわち、ＣＤＲがもともと由来する抗体である。ドナー残基は、ヒト受容体フレームワーク（アクセプター残基）に由来する適切な残基で置換され得る。
１つの態様において、本開示の多重特異性抗体は、完全にヒトであり、特に、可変ドメインの１つ以上は、完全にヒトである。

完全なヒト分子は、重および軽鎖の両方の可変領域および定常領域（存在する場合）は、全てヒト起源であるか、または必ずしも同じ抗体からではない、ヒト起源の配列に実質的に同一のものである。完全ヒト抗体の例としては、例えば、上記のファージディスプレイ方法によって生産される抗体、およびマウス免疫グロブリン可変および任意に定常領域遺伝子がそれらのヒト対応物、例えば、ＥＰ０５４６０７３、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ０４３８４７４およびＥＰ０４６３１５１において、一般的用語で記載されるようなものによって置換されているマウス産生抗体が挙げられる。

１つの態様において、本開示の多重特異性抗体分子は、目的の２つ、３つ以上の異なる抗原を選択的に結合することができる。
１つの態様において、Ｖ_Ｈ／Ｖ_Ｌ、またはＶ_１またはＶ_２によって形成される抗原結合ドメインによって結合される目的の抗原は、独立して、細胞関連タンパク質、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞または腫瘍細胞、および可溶性タンパク質などの細胞上の細胞表面タンパク質から選択される。

目的の抗原はまた、疾患または感染中に上方調節されるそれらのタンパク質、例えば、受容体および／またはそれらの対応するリガンドなどの任意の医学的に関連するタンパク質であり得る。抗原の特定の例としては、Ｔ細胞またはＢ細胞シグナル伝達受容体、共刺激分子、チェックポイント阻害剤、ナチュラルキラー細胞受容体、免疫グロブリン受容体、ＴＮＦＲファミリー受容体、Ｂ７ファミリー受容体、接着分子、インテグリン、サイトカイン／ケモカイン受容体、ＧＰＣＲ、成長因子受容体、キナーゼ受容体、組織特異性抗原、癌抗原、病原体認識受容体、補体受容体、ホルモン受容体または可溶性分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエン、成長因子、ホルモンまたは酵素またはイオンチャネル、エピトープ、それらの断片および翻訳後修飾フォームなどの細胞表面受容体が挙げられる。

１つの態様において、本開示の抗体タンパク質は、目的の抗原（複数可）の活性を機能的に変化させるために使用され得る。例えば、抗体融合タンパク質は、前記抗原の活性を直接的または間接的に中和、拮抗または作動させ得る。
１つの態様において、Ｖ_１およびＶ_２は、同じ抗原に特異的であり、例えば、その中の同じまたは異なるエピトープを結合する。
１つの態様において、Ｖ_１は、ヒト血清アルブミンに特異的である。１つの態様において、Ｖ_２は、ヒト血清アルブミンに特異的である。１つの態様において、Ｖ_１およびＶ_２は、同じ抗原、例えば、同じ抗原上の同じエピトープなどのヒト血清アルブミンに特異的である。１つの態様において、Ｖ_１およびＶ_２は、２つの異なる抗原に特異的である。
１つの態様において、Ｖ_Ｈ／Ｖ_ＬまたはＶ_１またはＶ_２によって結合される目的の抗原は、補体経路活性化および／またはエフェクター細胞補充などの、エフェクター機能を補充する能力を提供する。

エフェクター機能の補充は、エフェクター機能が細胞に関連し、前記細胞がその表面に補充分子を有するという点で、直接的であり得る。間接的補充は、補充ポリペプチドに対する本開示に係る分子における抗原結合ドメイン（Ｖ_１またはＶ_２など）への抗原の結合は、例えば、次に、直接的または間接的にエフェクター機能を補充しうる、またはシグナル伝達経路の活性化によるものであってもよい因子の放出を引き起こす場合に、起こりうる。例としては、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＦＮγ、ヒスタミン、Ｃ１ｑ、オプソニンおよびＣ２、Ｃ４、Ｃ３コンバターゼ、Ｃ５〜Ｃ９などの古典的および代替補体活性化カスケードの他のメンバーが挙げられる。

本明細書中で使用される場合、「補充ポリペプチド」は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃγＲ、Ｃ１ｑおよびＣ３、ＣＤマーカータンパク質（分化マーカーのクラスター）または直接的または間接的に細胞媒介エフェクター機能を補充する能力を保持するその断片などの補体経路たんぱく質が挙げられるが、それらに限定されない。補充ポリペプチドはまた、エフェクター機能を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥおよびＩｇＡなどの免疫グロブリン分子が挙げられる。

１つの態様において、本開示に係る多重特異性抗体分子中の抗原結合ドメイン（Ｖ_１またはＶ_２など）は、補体経路タンパク質に特異性を有し、Ｃ１ｑが特に好ましい。
さらに、本開示の多重特異性抗体分子は、核種キレート化剤タンパク質に結合する単一ドメイン抗体により放射性核種をキレート化するために使用され得る。そのような融合タンパク質は、イメージングまたは治療への放射性核種ターゲティングアプローチでの使用である。

１つの態様において、本開示に係る分子内での抗原結合ドメイン（Ｖ_１またはＶ_２など）は、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、またはＣＤ３５／ＣＲ１に特異性を有し、例えば、前記血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子またはＣＤ３５／ＣＲ１に結合することによって、目的の前記抗原に対する特異性を有する抗体断片に延長した半減期を提供する。
本明細書中で使用される場合、「血清担体タンパク質」としては、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲンおよびアルブミン、またはその任意の断片が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「循環免疫グロブリン分子」としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ｓＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＤ、またはその任意の断片が挙げられる。

ＣＤ３５／ＣＲ１は、３６日の半減期を有する赤血球上に存在するタンパク質である（２８〜４７日の通常の範囲：Ｌａｎａｒｏら、１９７１年、Ｃａｎｃｅｒ, ２８（３）：６５８−６６１）。
１つの態様において、Ｖ_Ｈ／Ｖ_Ｌが特異性を有する目的の抗原は、ヒト血清担体などの血清担体タンパク質である。
１つの態様において、Ｖ_１が特異性を有する目的の抗原は、ヒト血清担体などの血清担体タンパク質である。
１つの態様において、Ｖ_２が特異性を有する目的の抗原は、ヒト血清担体などの血清担体タンパク質である。

１つの態様において、本開示の多重特異性抗体分子は、標的抗原または抗原（複数）に対する改善された親和性を提供するように処理される。そのような変異体は、ＣＤＲを変異すること（ＹａｎｇらＪ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２５４, ３９２−４０３, １９９５年）、鎖シャッフリング（ＭａｒｋｓらＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, １０, ７７９−７８３, １９９２年）、大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２５０, ３５９−３６８, １９９６年）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら, Ｃｕｒｒ. Ｏｐｉｎ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ., ８, ７２４−７３３, １９９７年）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２５６, ７７−８８, １９９６年）および性的ＰＣＲ（ＣｒａｍｅｒｉらＮａｔｕｒｅ, ３９１, ２８８−２９１, １９９８年）を含むいくつかの親和性成熟プロトコルによって得られることができる。Ｖａｕｇｈａｎらは、親和性成熟のこれらの方法を議論している。
この文脈において、本明細書中で使用される場合、改善された親和性は、出発分子を超える改善を指す。

所望の場合、本開示で使用のための多重特異性抗体コンストラクトは、１つ以上のエフェクター分子（複数可）に結合され得る。エフェクター分子は、本発明の抗体に結合されることができる単一の部分を形成するように結合された単一エフェクター分子または２つ以上そのような分子を含み得ることが理解されるだろう。エフェクター分子に結合される抗体断片を得ることが望ましい場合、これは、抗体断片が、直接またはエフェクター分子へのカップリング剤を介して結合される標準化学的または組換えＤＮＡ手順によって調製され得る。そのようなエフェクター分子を抗体に結合させるための技術は、当該技術分野において周知である（ＨｅｌｌｓｔｒｏｍらＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ, 第２版, Ｒｏｂｉｎｓｏｎら, １９８７年, ｐｐ. ６２３−５３；Ｔｈｏｒｐｅら１９８２年, Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｒｅｖ., ６２：１１９−５８およびＤｕｂｏｗｃｈｉｋら１９９９年、ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙおよびＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ, ８３, ６７−１２３参照）。特定の化学的手順は、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９/０１４７６およびＷＯ０３０３１５８１で記載されるものが挙げられる。あるいは、エフェクター分子は、タンパク質またはポリペプチドである場合、例えば、ＷＯ８６／０１５３３およびＥＰ０３９２７４５で記載されるように、リンケージは、組換えＤＮＡ手順を使用して達成され得る。

本明細書中で使用される場合、用語「エフェクター分子」としては、例えば、生物学的に活性なタンパク質、例えば、酵素、他の抗体または抗体断片、合成または天然発生ポリマー、核酸およびその断片、例えば、ＤＮＡ，ＲＮＡおよびその断片、放射性核種、特に、放射性ヨウ素、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子および蛍光化合物またはＮＭＲまたはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物などのレポーター基が挙げられる。

他のエフェクター分子としては、１１１Ｉｎおよび９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２およびタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種；またはアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイドおよびスラミンなどの薬物が挙げられるが、それらに限定されない。
他のエフェクター分子は、タンパク質、ペプチドおよび酵素を含む。目的の酵素としては、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トラスフェラーゼが挙げられるが、それらに限定されない。目的のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドとしては、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモーナス外毒素、またはジフテリア毒素などの毒、インスリン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲンアクチベーターなどのタンパク質、血栓剤または抗血管新生剤、例えば、アンギオテンシンまたはエンドスタチン、またはリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）または他の成長因子および免疫グロブリンなどの生物学的応答修飾物質が挙げられるが、それらに限定されない。

他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能な物質を含みうる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影に使用するため）、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断薬として使用するために抗体に結合されることができる金属イオンについては、一般的に、ＵＳ４，７４１，９００を参照されたい。適切な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族としては、ストレプトアビジンおよびビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルレセイン、ダンシルクロリドおよびフィコエリトリンが挙げられ；適切な発光物質としては、ルミノールが挙げられ；適切な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；および適切な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎおよび９９Ｔｃが挙げられる。

別の態様において、エフェクター分子は、インビボで抗体の半減期を増加させ、および／または抗体の免疫原性を低下させ、および／または免疫系に対する上皮バリアを通る抗体の送達を増強しうる。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されているようなアルブミン結合タンパク質またはアルブミン結合化合物が挙げられる。
エフェクター分子がポリマーである場合、それは、一般的に、合成または自然に発生するポリマー、例えば、任意に置換された直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマーまたは分枝または非分枝多糖類、例えば、ホモ−またはヘテロ−ポリサッカライドであり得る。

上記合成ポリマーに存在し得る特定の任意の置換基は、１つ以上の水酸基、メチル基またはメトキシ基を含む。
合成ポリマーの特定の例としては、任意に置換された直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）またはその誘導体、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体など任意に置換されたポリ（エチレングリコール）が挙げられる。
特定の自然に生じるポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲンまたはそれらの誘導体が挙げられる。

本明細書中で使用される場合、「誘導体」は、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのようなチオール選択的反応性基を含むことが意図される。反応性基は、ポリマーに直接またリンカーセグメントを介して結合され得る。そのような基の残基は、場合によっては、抗体断片およびポリマーの間の結合基として生成物の一部を形成するだろうことが理解されるだろう。

ポリマーのサイズは、所望の場合、変えることができ、一般的に、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば、５０００〜４００００Ｄａ、例えば２００００〜４００００Ｄａの平均分子量範囲であるだろう。ポリマーサイズは、特に、生成物の意図される使用、例えば、腫瘍などの特定の組織に局在するか、または循環半減期を延長する能力に基づいて選択され得る（レビューのために、Ｃｈａｐｍａｎ, ２００２, ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ, ５４, ５３１−５４５参照）。したがって、例えば、生成物が循環を離れて、組織に浸透することが意図される場合、例えば、腫瘍の治療での使用のために、例えば、約５０００Ｄａの分子量を有する低分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。生成物が、循環中に留まる用途では、例えば、２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有する、より高い分子量を使用することが有利であり得る。
適切なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）または、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体、および特に、約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するなどのポリアルキレンポリマーが挙げられる。

１つの態様において、本開示で使用のための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合される。１つの特定の例において、抗体は、抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、水酸基またはカルボキシル基であり得る。そのようなアミノ酸は、抗体断片中で自然に生じ得る、または組換えＤＮＡ法を使用して断片中に改変され得る（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４参照）。１つの態様において、本発明の抗体分子は、修飾Ｆａｂ断片であり、ここで、その修飾は、エフェクター分子の結合を可能にするためのその重鎖のＣ末端への１つ以上のアミノ酸の追加である。適切には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子が結合し得る１つ以上のシステイン残基を含む修飾されたヒンジ領域を形成する。複数の部位は、２つ以上のＰＥＧ分子を結合するために使用されることができる。

適切には、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合される。修飾抗体断片に結合した各ポリマー分子は、断片に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合され得る。共有結合は、一般的に、ジスルフィド結合、または特に、硫黄−炭素結合であるだろう。チオール基が結合点として適切に使用される場合、活性化されるエフェクター分子、例えば、マレイミドおよびシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体が使用され得る。活性化されたポリマーは、上記のようなポリマー修飾抗体断片の調製で、出発物質として使用され得る。活性化されたポリマーは、α−ハロカルボン酸またはエステル、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホンまたはジスルフィドなどのチオール反応性基を含む任意のポリマーであってもよい。そのような出発物質は、商業的に得られうる（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前は、ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓＩｎｃ., Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ, ＡＬ, ＵＳＡから）、または従来の化学的手順を使用して市販の出発物質から調製され得る。特定のＰＥＧ分子は、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ；ＲａｐｐＰｏｌｙｍｅｒｅ；およびＳｕｎＢｉｏから入手可能）およびＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）を含む。

１つの態様において、分子中のＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦａｂまたはＦａｂ’は、ＰＥＧ化され、すなわち、ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を共有結合させており、例えば、ＥＰ０９４８５４４またはＥＰ１０９００３７で開示される方法に従う［また「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, ＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ポリ（エチレングリコール）化学、バイオ技術的および生物医学的適用）」、１９９２年, Ｊ. ＭｉｌｔｏｎＨａｒｒｉｓ（ｅｄ）、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ, ＮｅｗＹｏｒｋ,、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ポリ（エチレングリコール）化学、および生物学的適用）」、１９９７年, Ｊ. ＭｉｌｔｏｎＨａｒｒｉｓおよびＳ. Ｚａｌｉｐｓｋｙ（ｅｄｓ）, ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ, ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣおよび「ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎＣｏｕｐｌｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｔｈｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（生物医科学のためのバイオコンジュゲーションタンパク質のカップリング技術）」、１９９８年, Ｍ. ＡｓｌａｍおよびＡ. Ｄｅｎｔ, ＧｒｏｖｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ, Ａ. ２００２, ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ２００２, ５４：５３１−５４５参照］。１つの態様において、ＰＥＧは、ヒンジ領域のシステインに結合される。１つの例において、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域において単一のチオール基に共有結合するマレイミド基を有する。リジン残基は、マレイミド基に共有結合されてもよく、リジン残基上のアミノ基のそれぞれは、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーに結合され得る。したがって、Ｆａｂ断片に結合したＰＥＧの総分子量は、約４０，０００Ｄａであり得る。

特定のＰＥＧ分子として、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、以前は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）分子量２０，０００修飾リジンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミド）が挙げられる。
ＰＥＧリンカーの代替供給源は、ＧＬ２−４００ＭＡ２（ここで、以下の構造中のｍは、５である）およびＧＬ２−４００ＭＡ（ここで、ｍは２である）を供給するＮＯＦを含み、ｎは、約４５０である：

すなわち、各ＰＥＧは、約２０，０００Ｄａである。

さらに、以下のタイプの代替ＰＥＧエフェクター分子は、ＤｒＲｅｄｄｙ、ＮＯＦおよびＪｅｎｋｅｍから入手可能である：

１つの態様において、ＰＥＧ化され（例えば、本明細書中に記載されるＰＥＧと一緒に）、（連続した番号付けによる）鎖中のアミノ酸２２６またはその周囲で、例えば重鎖のアミノ酸２２６で、システインアミノ酸残基を介して結合される抗体分子を供給する。
１つの態様において、本発明の分子をコードするポリヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡ配列を提供する。

１つの態様において、本開示の分子の１つ以上、例えば、２つ以上または３つ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
１つの態様において、ポリヌクレオチドは、「ノブズイントゥーホールズ（穴の中にノブ）」突然変異を含まない。
本明細書中で使用される場合、「突然変異」は、対応する野生型配列と比較して、１つ以上の自然に発生するまたは改変核酸／アミノ酸配列変化を含む核酸またはアミノ酸配列を指す。

１つの態様において、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドは、ベクター中に含まれる。
ベクターが構築され得る一般的な方法、トランスフェクション方法および培養方法は、当業者に周知である。これに関しては、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における最新のプロトコル）」、１９９９年, Ｆ. Ｍ. Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ）, ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ, ＮｅｗＹｏｒｋおよびＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって製造されたＭａｎｉａｔｉｓＭａｎｕａｌ（マニアティスマニュアル）を参照されたい。
また、本発明の抗体をコードする１つ以上のＤＮＡ配列を含むクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。任意の適切な宿主細胞／ベクター系は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用され得る。細菌、例えば、大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）および他の微生物系が使用されてもよく、または真核生物、例えば、哺乳動物、宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞を含む。

上記本明細書中で記載されるように、本発明の多重特性タンパク質は、３つのポリペプチド鎖、重および軽鎖およびＶ_１および／またはＶ_２であるｄｓＦｖを作成するためのジスルフィド結合を介して結合する第３の「遊離」可変ドメインを含む。したがって、本開示はまた、本発明の多重特異性抗体分子の３つのポリペプチド鎖をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現を導くのに適切な条件下で、本発明のベクター（複数可）を含む宿主細胞を培養すること、および多重特性抗体分子を単離することを含む本発明に係る多重特性抗体分子の生産のための方法を提供する。そのような方法の１つの例において、１つのポリペプチド鎖は、Ｖ_１および／またはＶ_２の可変ドメイン、すなわち、ジスルフィド結合を介するＶ_１および／またはＶ_２のその相補的可変ドメインＶ_ＨまたはＶ_Ｌと対合する「遊離」可変ドメインからなる。また、この方法によって得られたまたは得られる多重特異性抗体を提供する。

重および軽鎖の両方を含む生成物の生産のために、細胞株は、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターの２つのベクターでトランスフェクトされ得る。あるいは、単一ベクターを使用してもよく、ベクターは、軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。１つの例において、細胞株は、本発明の抗体分子のポリペプチド鎖をコードするそれぞれ３つのベクターでトランスフェクトされ得る。あるいは、単一ベクターが使用され得、３つのポリペプチド鎖をコードする配列を含む。

１つの態様において、細胞株は、本明細書中で開示されるものから選択される異なるポリペプチドをコードするそれぞれ２つのベクター、例えば、
ａ）式（Ｉ）：Ｖ_Ｈ−ＣＨ_１−ＣＨ_２−ＣＨ_３−Ｘ−（Ｖ_１）_ｐのポリペプチド鎖；および
ｂ）式（ＩＩ）：Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ−Ｙ−（Ｖ_２）_ｑのポリペプチド鎖、
でトランスフェクトされ、
ここで、Ｖ_Ｈは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ_１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
ＣＨ_２は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン２を表し；
ＣＨ_３は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン３を表し；
Ｘは、結合またはリンカーを表し；
Ｙは、結合またはリンカーを表し；
Ｖ_１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖを表し；
Ｖ_Ｌは、可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインを表し；
Ｃ_Ｌは、定常領域、例えば、Ｃκなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し；
Ｖ_２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖを表し；
ｐは、０または１を表し；
ｑは、０または１を表し；
ここで、Ｖ_１またはＶ_２の少なくとも１つがｄｓＦｖであり、および
Ｖ_１がｄｓＦｖであり、ｐが１であり、ｑが０である場合、該分子は、式（Ｉ）の２つの重鎖および式（ＩＩ）の２つの関連する軽鎖を有する二量体として提供される。

１つの態様において、ｐが１であり、Ｖ_１がｄｓＦｖであり、ｑが０である場合、式（Ｉ）の少なくとも２つのポリペプチド鎖がある。
１つの態様において、Ｖ_１がｄｓＦｖであり、Ｖ_１のＶ_ＨドメインがＸに結合される場合、細胞株は、Ｖ_１のＶ_Ｌドメインをコードする第３のベクターでトランスフェクトされ得る。
１つの態様において、Ｖ_１がｄｓＦｖであり、Ｖ_１のＶ_ＬドメインがＸに結合される場合、細胞株は、Ｖ_１のＶ_Ｈドメインをコードする第３のベクターでトランスフェクトされ得る。
１つの態様において、Ｖ_２がｄｓＦｖであり、Ｖ_２のＶ_ＨドメインがＹに結合される場合、細胞株は、Ｖ_２のＶ_Ｌドメインをコードする第３のベクターでトランスフェクトされ得る。
１つの態様において、Ｖ_２がｄｓＦｖであり、Ｖ_２のＶ_ＬドメインがＹに結合される場合、細胞株は、Ｖ_２のＶ_Ｈドメインをコードする第３のベクターでトランスフェクトされ得る。

宿主細胞中にトランスフェクトされる各ベクターの比率は、多重特異性抗体生成物の発現を最適化するために変えることができることが理解されるだろう。１つの態様において、ベクターの比率は、１：１：１である。当業者は、トランスフェクション後のタンパク質発現レベルの日常的な試験に最適な比を見つけることができることが理解されるだろう。

ポリペプチド成分の２つ以上または、特に３つ以上は、単一ベクターでポリヌクレオチドによって、望ましい場合、本開示のポリヌクレオチド成分をコードする各ポリヌクレオチドに対する異なるプロモーターを利用することによって、コードされ得ることが理解されるだろう。
１つの態様において、ベクターは、単一プロモーターの制御下で、本発明の多重特異性抗体分子の全ての３つのポリペプチド鎖をコードする単一ポリヌクレオチド配列を含む。

１つの態様において、ベクターは、本開示の多重特異性抗体分子の全ての３つのポリペプチド鎖をコードする単一のポリヌクレオチド配列を含み、ここで、各ポリペプチド鎖をコードする各ポリヌクレオチド配列は、異なるプロモーターの制御下にある。
本開示に係る抗体および断片は、宿主細胞からの良好なレベルで発現される。したがって、抗体および／または断片の特性は、最適化され、商業的処理につながるようである。

有利には、本開示の多重特異性抗体分子は、精製後に見られる凝集の量を最小化し、医薬濃度でコンストラクトの製剤中のモノマーの量を最大化し、例えば、モノマーは、精製されたタンパク質の５０％、６０％、７０％または７５％以上、例えば、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％以上が「モノマー」として存在する。
本開示の抗体およびそれを含む組成物は、治療、例えば、病理学的状態の治療および／または予防、特に本明細書中で記載される場合、有用である。

病理学的状態または疾患は、例えば、感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性および寄生虫性）、感染症に関連する内毒素ショック、リウマチ性関節炎などの関節炎、重度の喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペーロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、パイロン病、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、紅斑性狼瘡（全身性エリテマトーデスなど）およびギラン・アレー症候群などの中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症性疾患、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵炎、心的外傷（手術）、移植片宿主病、移植による拒絶反応、心筋梗塞ならびにアテローム性動脈硬化症などの虚血性疾患を含む心疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗しょう症、変形性関節症、歯周炎および低塩酸症からなる群から選択され得る。

本開示はまた、疼痛、特に炎症に関連する疼痛の治療または予防における使用のための本発明に係る多重特異性抗体分子を提供する。
本開示は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて本開示の抗体分子を含む薬学組成物または診断組成物をさらに提供する。
該組成物は、通常、薬学的に許容許容可能な担体を含むだろう滅菌の医薬組成物の一部として通常、供給されるだろう。本開示の医薬組成物は、薬学的に許容可能なアジュバントをさらに含む。
本開示はまた、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体と一緒に本開示の抗体分子を添加および混合することを含む医薬組成物または診断用組成物の調製方法を提供する。

抗体分子は、医薬組成物または診断用組成物中の唯一の活性成分であってもよく、または他の抗体成分、例えば、ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ、または抗ＬＰＳ抗体、またはキサンチンなどの非抗体成分を含む他の活性成分によって達成され得る。他の適切な活性成分として、耐性を誘導することができる抗体、例えば、抗ＣＤ３または抗ＣＤ４抗体が挙げられる。
さらなる態様において、本開示に係る抗体、断片または組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤と組み合わせて使用される。
医薬組成物は、本発明またはその多重の抗体の治療有効量を適切に含む。

本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」は、標的の疾患または状態を治療、改善または予防するため、または検出可能な治療または予防効果を示すために必要な治療剤の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイまたは動物モデルのいずれかで、通常、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタまたは霊長類で最初に推定されることができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために使用され得る。次にそのような情報は、ヒトで有用な用量および投与経路を決定するために使用されることができる。

ヒト対象に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重篤度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ（複数可）、反応感受性および治療に対する耐性／応答に依存するだろう。この量は、日常的な実験によって決定されることができ、臨床医の判断の範囲内である。一般的に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであるだろう。あるいは、用量は、１日当たり１〜５００ｍｇ、例えば、１日当たり１０〜１００、２００、３００または４００ｍｇであり得る。医薬組成物は、本発明の活性薬剤の所定量を含む単位用量フォームで従来通り提供され得る。

組成物は、患者に個々に投与されてもよく、または他の薬剤、薬物またはホルモンと一緒に（例えば、同時に、連続してまたは別々に）投与されてもよい。
本開示の抗体分子が投与される用量は、治療される状態の性質、存在する炎症の程度および抗体が予防的に使用されるか、既存の状態を治療するかに依存する。
用量の頻度は、抗体分子の半減期およびその効果の持続時間に依存するだろう。抗体分子が短い半減期（例えば、２〜１０時間）を有する場合、１日１回以上の投与を与えることが必要であり得る。あるいは、抗体分子が長い半減期（例えば、２〜１５日）を有する場合、１日１回、１週間に１回、または１、２ヶ月ごとに１回だけの投与のみで足り得る。

薬学的に許容可能な担体は、組成物を受ける個体に有害な抗体の生産をそれ自体誘導するべきではなく、毒性であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子などのゆっくり代謝される巨大分子であってもよい。
薬学的に許容可能な塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、りん酸塩および硫酸塩などの鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。

治療組成物中の薬学的に許容可能な担体は、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体をさらに含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝物質などの補助物質は、そのような組成物中に存在し得る。そのような担体は、患者による摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁液として処方される医薬組成物を可能にする。
投与のための適切なフォームは、例えば、注射または注入によって、例えば、ボーラス注入法または連続注入による適切な非経口投与のフォームを含む。生成物が注射または注入用である場合、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液または乳濁液のフォームをとってもよく、懸濁剤、保存剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含み得る。あるいは、抗体分子は、適切な滅菌液体との使用前の再構成のために、乾燥フォームであり得る。

処方されると、本発明の組成物は、対象に直接投与されることができる。治療される対象は、動物であることができる。しかしながら、１つ以上の態様において、組成物は、ヒト対象への投与のために適合される。
１つの態様において、本開示に係る製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体または断片の等電点の値に類似せず、製剤のｐＨが７である場合、８〜９またはそれ以上のｐＩが適切であり得る。理論に縛られることを望まないが、これは、最終的に、改善された安定性を有する最終製剤を提供し得ることが考えられ、例えば、抗体または断片が溶液中に残ったままである。

本開示の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、経皮的（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内または直腸経路を含む任意の多くの経路によって投与され得るが、それらに限定されない。皮下噴霧器はまた、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る。典型的には、治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製され得る。注射前の液体賦形剤中の溶液、または懸濁液に適した固体フォームはまた、調製され得る。好ましくは、本発明の抗体分子は、皮下、吸入または局所投与される。

組成物の直接送達は、一般的に、注射、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内によって達成され、または組織の間質腔に送達される。組成物はまた、目的の特定の組織中に投与されることができる。投薬治療は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであってもよい。
組成物中の活性成分は、抗体分子であることが理解されるだろう。このように、消化管における分解を受けやすいだろう。したがって、組成物が、消化管を使用する経路によって投与される場合、組成物は、分解から抗体を保護するが、消化管から吸収された後に抗体を放出する薬剤を含む必要があるだろう。

薬学的に許容可能な担体の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬学）（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ, Ｎ.Ｊ. １９９１年）で利用可能である。
１つの態様において、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
適切な吸入可能な製剤は、吸入可能な粉末、噴射剤ガスを含む計量エアロゾルまたは噴射剤ガスを含まない吸入可能な溶液（噴霧可能な溶液または懸濁液など）を含む。活性物質を含む本開示に係る吸入可能な粉末は、上記活性物質単独または生理学的に許容可能な賦形剤との上記活性物質の混合物からなり得る。

これらの吸入可能な粉末は、単糖類（例えば、グルコースまたはアラビノース）、二糖類（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖および多糖類（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）または互いにこれらの混合物を含み得る。単糖類または二糖類は、好適に使用され、ラクトースまたはグルコースの使用は、特に限定されないが、それらの水和物のフォームで使用される。
肺での沈着のための粒子は、１０ミクロン未満、１〜９ミクロン、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍなどを必要とする。活性剤（抗体または抗体断片など）の粒径は、最も重要である。

吸入可能なエアロゾルを調製するために使用されることができる噴霧ガスは、当該技術分野において公知である。適切な噴霧ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタンまたはイソブタンなどの炭化水素またはメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパンまたはシクロブタンの塩化および／またはフッ素化誘導体などのハロ炭化水素の間から選択される。上記の噴霧ガスは、それら自体またはその混合物で使用され得る。
特に、適切な噴霧ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａおよびＴＧ２２７の間から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）およびＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）およびそれらの混合物が特に適している。

噴霧ガス含有吸入可能なエアロゾルはまた、共溶媒、安定剤、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｓ、ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、抗酸化剤、潤滑剤およびｐＨ調整手段などの他の成分を含み得る。全てのこれらの成分は、当該分野で公知である。
本発明に係る噴霧ガス含有吸入可能なエアロゾルは、活性物質の重量で５％までを含み得る。本発明に係るエアロゾルは、例えば、活性の０.００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％または０．５〜１重量％を含む。
あるいは、肺への局所投与は、液体溶液または懸濁製剤の投与によってであり得、例えば、圧縮機に接続される噴霧器（例えば、ＰａｒｉＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＥｑｕｉｐｍｅｎｔ, Ｉｎｃ., Ｒｉｃｈｍｏｎｄ, Ｖａによって製造されるＰａｒｉＭａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮機に接続されるＰａｒｉＬＣ−ＪｅｔＰｌｕｓ（登録商標）噴霧器）などのデバイスを使用する。

１つの態様において、製剤は、噴霧による送達のための単位用量を含む別個のアンプルとして提供される。
１つの態様において、抗体は、凍結乾燥のフォームで、再構成のためにまたは懸濁液製剤として代わりに供給される。
本開示の抗体は、例えば、溶液または懸濁液のフォームで、溶媒中に分散されて送達されることができる。適切な生理学的溶液、例えば、生理食塩水、薬学的に許容可能な溶媒または緩衝用溶液に懸濁されることができる。当該分野で公知の緩衝溶液は、水１ｍｌ当たり０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｍｇ〜０．２５ｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、および０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含むので、約４．０〜５．０のｐＨを達成し得る。上記のように、懸濁液は、例えば、凍結乾燥された抗体から作製されることができる。

組成物は、場合により、本発明の抗体の集団の特徴を改変することができる分子それによって、例えば、抗体の機能の低下、安定化、遅延、調節および／または活性化ををさらに含む。

治療用懸濁液または溶液製剤はまた、１つ以上の賦形剤を含むことができる。賦形剤は、当該分野で周知であり、緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液および重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを含む。溶液または懸濁液は、リポソームまたは生物分解性ミクロオスフェアに封入されることができる。製剤は、一般的に、滅菌製造プロセスを用いて実質的に無菌のフォームで供給されるだろう。
これは、製剤に使用される緩衝化溶媒溶液のろ過、滅菌緩衝化溶媒溶液中の抗体の無菌懸濁液、および当業者によく知られている方法による無菌容器への製剤の調剤による生成物および殺菌を含み得る。

本開示に係る噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープで包装された単回投与単位（例えば、密閉されたプラスチック容器またはバイアル）として提供され得る。各バイアルは、溶媒／溶液緩衝液の体積、例えば、２ｍｌの単位用量を含む。
本開示の抗体は、噴霧による送達に適していると考えられる。
また、本発明の抗体は、遺伝子治療の使用によって投与され得ると予測される。これを達成するために、適切なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重および軽鎖をコードするＤＮＡ配列が、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、その場で組み立てられるように、患者に導入される。

１つの態様において、多重特異性抗体（特に、本発明に係る抗体または断片）を精製する方法を提供する。
１つの態様において、不純物がカラム上に保持され、抗体が非結合画分で維持されるような非結合モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを実施するステップを含む多重特異性抗体（特に、本発明に係る抗体または断片）を精製する方法を提供する。そのステップは、例えば、ｐＨ約６〜８で実施され得る。

本発明の方法は、例えば、約４〜５のｐＨで実施される陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する初期補足ステップをさらに含み得る。
本発明の方法は、生成物を確実にする追加のクロマトグラフィーステップ（複数可）をさらに含んでもよく、不純物に関連する方法は、生成物ストリームから適切に分離される。
精製方法はまた、濃縮および透析ろ過ステップなどの、１以上の限外ろ過ステップを含み得る。
上記で使用されるような精製されたフォームは、少なくとも９０％の純度、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ以上の純度を意味することが意図される。
エンドトキシンを実質的に含まないとは、一般的に、抗体生成物１ｍｇ当たり１ＥＵ以下、例えば、生成物１ｍｇ当たり０．５または０．１ＥＵのエンドトキシン含量を指すことが意図される。
宿主細胞タンパク質またはＤＮＡを実質的に含まないとは、一般的に、適宜、抗体生成物の１ｍｇ当たり４００μｇ以下、例えば、１ｍｇ当たり１００μｇ以下、特に１ｍｇ当たり２０μｇの宿主細胞タンパクおよび／またはＤＮＡ含量を指すことを意図される。
本発明の抗体分子はまた、診断、例えば、インビボ診断および病態の画像化で使用され得る。

本明細書の文脈における「含む」は、包含することを意味することを意図する。技術的に適切な場合、本発明の態様が組み合わせられ得る。態様は、特定の特徴／要素を含むものとして本明細書中に記載される。本開示はまた、前記特徴／要素からなる、または本質的になる態様を分離することを示す。特許および出願のような技術的参考文献は、参照により本明細書中に組み込まれる。
本明細書中に具体的かつ明確に記載される任意の態様は、単独または１以上のさらなる態様との組み合わせのいずれかでディスクレーマー（「一部除く」）の基礎を形成し得る。

本開示は、添付図面に言及する以下の実施例においてのみ例示としてさらに記載される。

図１は、本開示の様々な多重特異性抗体コンストラクトを示す。ＩｇＧ−ｄｓＦｖフォーマット。

図２は、本開示の様々なプロテイン−Ａ精製重鎖（ＨＣ）結合コンストラクトのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。（Ａ）非還元サンプル。（Ｂ）還元サンプル。

図３は、本開示の様々なプロテイン−Ａ精製軽鎖（ＬＣ）結合コンストラクトのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。（Ａ）非還元サンプル。（Ｂ）還元サンプル。

抗原１に対する抗体／断片は、標識化＃１である。
抗原２に対する抗体／断片は、標識化＃２である。
抗原３に対する抗体／断片は、標識化＃３である。
抗原４に対する抗体／断片は、標識化＃４である。

実施例１：本開示の抗体分子の発生（ＩｇＧ−ｄｓＦｖ）
哺乳動物細胞における発現のためのプラスミドの構築
ＩｇＧ＃２−ｄｓＦｖ＃１抗体コンストラクトについて
ＩｇＧ＃２−ｄｓＦｖ＃１の発現に対するプラスミド（図１参照）は、フレキシブルリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［また、本明細書中でＳ、２ｘＧ４Ｓと呼ばれる］（配列番号１）を使用する＃２軽鎖のＫｍ３アロタイプヒトκ定常領域のＣ末端に＃１ｖＬまたは＃１ｖＨを融合させることによって、またはフレキシブルリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）を使用して＃２重鎖のγ１アイソタイプヒトγ−１ＣＨ３定常領域のＣ末端に＃２＃１ｖＬまたは＃１ｖＨを融合することによって構築された。また、点突然変異が、＃１ｖＬおよび＃１ｖＨの両方のフレームワーク領域において選択された残基のＤＮＡ配列中に導入された。突然変異（重鎖Ｇ４４Ｃおよび軽鎖Ｇ１００Ｃ）は、Ｆｖ＃３の重および軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を作製するために導入された。突然変異（重鎖Ｇ４４Ｃおよび軽鎖Ｑ１００Ｃ）は、１＃Ｆｖの重および軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を作製するために導入された。

１＃ｄｓｖＬ遊離ドメインおよび＃１ｄｓｖＨ遊離ドメインをコードする遺伝子断片は、化学的に製造され、上記で詳細したように、融合して以下のものを生成した：
ＩｇＧ＃２Ｌｉｇｈｔ−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ｄｓｖＬ＃１［プラスミドＡ］；
ＩｇＧ＃２Ｌｉｇｈｔ−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ｄｓｖＨ＃１［プラスミドＢ］；
ＩｇＧ＃２Ｈｅａｖｙ−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ｄｓｖＬ＃１［プラスミドＣ］；および
ＩｇＧ＃２Ｈｅａｖｙ−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ｄｓｖＨ＃１［プラスミドＤ］。

ＩｇＧ＃２−ｄｓｓｃＦｖ＃１およびＩｇＧ＃２−ｓｃＦｖ＃１抗体コンストラクトについて
ＩｇＧ＃２−ｄｓｓｃＦｖ＃１およびＩｇＧ＃２−ｓｃＦｖ＃１の発現のためのプラスミドが、次のように構築された。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）は、フレキシブルリンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［また、本明細書中で４ｘＧ４ｓと呼ばれる］（配列番号６８）を介して＃１ｖＨのＣ末端に＃１ｖＬのＮ末端を結合することによって構築された。ｄｓｓｃＦｖを生成するために、点突然変異が＃１ｖＬ中フレームワーク残基Ｇ１００Ｃおよび＃１ｖＨ中Ｇ４４ＣでＤＮＡ配列中に導入されて、ｓｃＦｖに結合されたジスルフィドを作成した（ｄｓｓｃＦｖ）。

ｓｃＦｖ＃１およびｄｓｓｃＦｖ＃１をコードする遺伝子断片が、化学的に製造され、
＃２Ｌｉｇｈｔ−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ｄｓｓｃＦｖ＃１（ｄｓｖＨ−４ｘＧ４Ｓ−ｄｓｖＬ）［プラスミドＥ１］；
＃２Ｌｉｇｈｔ−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ｄｓｓｃＦｖ＃１（ｄｓｖＬ−４ｘＧ４Ｓ−ｄｓｖＨ）［プラスミドＥ２］；
＃２Ｌｉｇｈｔ−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ｓｃＦｖ＃１（ｖＨ−４ｘＧ４Ｓ−ｖＬ）［プラスミドＦ１］；および
＃２Ｌｉｇｈｔ−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ｓｃＦｖ＃１（ｖＬ−４ｘＧ４Ｓ−ｖＨ）［プラスミドＦ２］；を生成させるためにフレキシブルリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）を使用して＃２軽鎖のＫｍ３アロタプヒトκ定常領域
または
＃２Ｈｅａｖｙ−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ｄｓｓｃＦｖ＃１（ｄｓｖＨ−４ｘＧ４Ｓ−ｄｓｖＬ）［プラスミドＧ１］；
＃２Ｈｅａｖｙ−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ｄｓｓｃＦｖ＃１（ｄｓｖＬ−４ｘＧ４Ｓ−ｄｓｖＬ）［プラスミドＧ２］；
＃２Ｈｅａｖｙ−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ｓｃＦｖ＃１（ｖＨ−４ｘＧ４Ｓ−ｖＬ）［プラスミドＨ１］；および
＃２Ｈｅａｖｙ−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）−ｓｃＦｖ＃１（ｖＬ−４ｘＧ４Ｓ−ｖＨ）［プラスミドＨ２］；を生成させるために、フレキシブルリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）を使用して＃２重鎖のγ１アイソタイプヒトγ１ＣＨ_３定常領域のいずれかのＣ末端に融合された。

全てのＩｇＧ融合フォーマットは、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターおよびＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下で哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた。ＩｇＧ＃２軽鎖［プラスミドＪ］、ＩｇＧ＃２重鎖［プラスミドＩ］、ｄｓｖＬ＃１遊離ドメイン［プラスミドＫ］およびｄｓｖＨ＃１遊離ドメイン［プラスミドＬ］が化学的に製造され、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターおよびＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下で哺乳動物発現ベクター中に個々にクローニングされた。

ＩｇＧ＃２（ＬＣ）−ｄｓＦｖ＃１、ＩｇＧ＃２（ＨＣ）−ｄｓＦｖ＃１、ＩｇＧ＃２（ＬＣ）−ｄｓｓｃＦｖ＃１、ＩｇＧ＃２（ＨＣ）−ｄｓｓｃＦｖ＃１、ＩｇＧ＃２（ＬＣ）−ｓｃＦｖ＃１およびＩｇＧ＃２（ＨＣ）−ｓｃＦｖ＃１のＨＥＫ２９３発現。
ＨＥＫ２９３細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３フェクチントランスフェクション試薬をメーカーの説明通り使用して関連するプラスミドでトランスフェクトされた。プラスミドは、表４で示されるように、混合されて異なるコンストラクトを発現した。

トランスフェクションに使用されたプラスミドの比率は変化した：２つのプラスミドの組み合わせは１：１であった一方、３つのプラスミドの組み合わせについて、異なる比率が試験された。全部で５０μｇのプラスミドＤＮＡを、１２５μｌの２９３フェクチン＋４．２５ｍｌＯｐｔｉｍｅｍ培地で、２０分間、室温でインキュベートした。次に、その混合物を、１×１０^６細胞／ｍｌで懸濁液中で５０ｍｌのＨＥＫ２９３細胞に加え、３７℃で振盪しながらインキュベートした。上清を、１５００ｇで遠心分離によって１０日目に採取して細胞を除去し、その上清を、０．２２μｍフィルターに通した。発現レベルを、プロテイン−ＧＨＰＬＣによって決定した。

表５は、プロテイン−ＧＨＰＬＣ分析の結果を示す。見てわかるように、全ての構コンストラクトの発現のレベルは、互いに同等であり、７〜２２μｇ／ｍｌの範囲をカバーする。ＩｇＧ−ｄｓＦｖは７〜２２μｇ／ｍｌで発現し、ＩｇＧ−ｄｓｓｃＦｖは９〜１７μｇ／ｍｌで発現し、ＩｇＧ−ｓｃＦｖは１０〜１６μｇ／ｍｌで発現した。文献に、一緒にｖＬおよびｖＨをもたらすためのｖＬおよびｖＨの間のリンカーまたは二量化モチーフのいずれかを欠くＦｖ領域の発現は、結合したＦｖよりも実質的に低い発現レベルを有することが報告されている。驚くべきことに、これは、コンストラクトの各タイプの発現レベルの間に観察される有意差がなかったこのデータでは観察されなかった。非結合ｖＨを含むｖＬ結合タンパク質は、非結合ｖＬを含むｖＨ結合タンパク質（７〜８μｇ／ｍｌ）と比較して高い発現レベル（１０〜２２μｇ／ｍｌ）を示した。

ＨＥＫ２９３発現ＩｇＧ＃２−ｄｓＦｖ＃１、ＩｇＧ＃２−ｄｓｓｃＦｖ＃１およびＩｇＧ＃２−ｓｃＦｖ＃１のプロテイン−Ａ精製
約５０ｍｌのＨＥＫ２９３上清を、３０ｋＤａの分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用して、約２ｍｌへと約２５倍に濃縮した。濃縮した上清を、２０ｍＭリン酸塩、４０ｍＭＮａＣｌｐＨ７．４中で平衡化された１ｍｌＨｉＴｒａｐＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。カラムを２０ｍＭリン酸塩、４０ｍＭＮａＣｌｐＨ７．４で洗浄し、結合物質を、０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ３．４で溶出した。溶出ピークを集め、２ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ８．５で約ｐＨ７．０に調整した。ｐＨ調整された溶出液を濃縮し、３０ｋＤａの分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用してＰＢＳｐＨ７．４にｂｕｆｆｅｒ置換した。

実施例２−ＩｇＧ−ｄｓＦｖ分子の分析
プロテイン−Ａ精製、ＨＥＫ２９３発現ＩｇＧ＃２−ｄｓＦｖ＃１、ＩｇＧ＃２−ｄｓｓｃＦｖ＃１およびＩｇＧ＃２−ｓｃＦｖ＃１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
サンプル（２μｇ）を、ＰＢＳを用いて、９．７５μｌの体積に希釈し、３．７５μｌ４×ＬＳＤサンプル緩衝液および１．５μｌ１００ｍＭのＮ−エチルマレイミド（非還元サンプル）または１．５μｌの１０×ＮｕＰＡＧＥ還元剤（還元サンプル）を添加した。サンプルをボルテックスし、７０℃で１０分間インキュベートし、冷却し、１２５００ｒｐｍで３０秒間、遠心分離した。調製したサンプルを４〜２０％アクリルアミドＴｒｉｓ／グリシンＳＤＳゲル上に充填し、約１００分間、１２５Ｖ、一定電圧で流した。ＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）分子量ラダーを使用した。ゲルをＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅタンパク質染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、蒸留水で脱染した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表２および３に示す。還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の予想バンドサイズを表６に示す。ＩｇＧフォ^−マットをサイズ比較のために横に並べた。

ＩｇＧについて、非還元ゲルは、約１４７ｋＤａでバンドを示すと予想されたが、還元ゲルは、約５０ｋＤａおよび２４ｋＤａで、上部バンドが約２倍の染色を有するバンドを示すと予想された。
ＩｇＧ（ＨＣ）−ｓｃＦｖおよびＩｇＧ（ＨＣ）−ｄｓｓｃＦｖについて、非還元ゲルは、約２０１ｋＤａでバンドを示すと予想されたが、還元ゲルは、約７７ｋＤａおよび２４ｋＤａで上部バンドが約３倍の染色を有するバンドを示すと予想された。
ＩｇＧ（ＨＣ）−ｓｃＦｖについて、非還元ゲルは、約２０１ｋＤａでバンドを示すと予想されたが、還元ゲルは、約６４ｋＤａ、約２４ｋＤａおよび１２ｋＤａで上部から下部バンドでおおよそ比率３：２：１の染色を有するバンドを示すと予想された。

ＩｇＧ（ＬＣ）−ｓｃＦｖおよびＩｇＧ（ＬＣ）−ｄｓｓｃＦｖについて、非還元ゲルは、約２０１ｋＤａでバンドを示すと予想されたが、還元ゲルは、約５０ｋＤａで両方のバンドでだいたい等しい染色を有するダブレットを示すと予想された。
ＩｇＧ（ＬＣ）−ｄｓＦｖについて、非還元ゲルは、約２０１ｋＤａでバンドを示すと予想されたが、還元ゲルは、約５０ｋＤａ、約３７ｋＤａおよび１２ｋＤａで上部から下部バンドでおおよそ比率３：２：１の染色を有するバンドを示すと予想された。

還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、コンストラクトが移動位置および染色強度の両方に関して正確に発現されていたことを示すバンドパターンを示した。唯一の例外は、ＩｇＧ＃２（ＨＣ）−ｄｓＦｖ＃１（ＨＣ−ｖＨ結合）（トランスフェクション比１：１：２ＨＣ−ｖＨ：ＬＣ：ｖＬ）であり、これは、約５５ｋＤａおよび約４５ｋＤａで余分なバンド（図２Ｂ、レーン１０）、およびＩｇＧ＃２（ＬＣ）−ｄｓＦｖ＃１（ＬＣ−ｖＨ結合）（比率１：１：１ＬＣ−ｖＨ：ＨＣ：ｖＬ）（図３Ｂ、レーン６）を含み、これは約６５ｋＤａで余分なバンドを含んだ。しかしながら、同様の余分バンドはまた、親ＩｇＧ＃２−ｓｃＦｖ＃１（ＨＣ−ＨＬｓｃＦｖ）タンパク質（約６５ｋＤａおよび約５５ｋＤａの余分なバンド、図２Ｂ、レーン５）および親ＩｇＧ＃２−ｄｓｓｃＦｖ＃１（ＬＣ−ＨＬｓｃＦｖ）タンパク質（約６５ｋＤａの余分なバンド、図３Ｂ、レーン３）において観察された。

したがって、ＨＣ−ｖＨ結合タンパク質およびＬＣ−ｖＨ結合タンパク質は、いくつかのマイナー分解／凝集と一致しているさらなるバンドを有し、ＨＣ−ｖＬ結合タンパク質およびＬＣ−ｖＬ結合タンパク質は、期待されるバンドパターンを示した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、多量体化と一致したＩｇＧ−ｄｓｓｃＦｖについてバンディングパターン＞２００ｋＤａを示したたが（図２Ａ、レーン６および８、図３Ａ、レーン３および５）、これらの高分子量種が、全てのＩｇＧ−ｄｓＦｖサンプルにおいて存在しなかった（図２Ａ、レーン９〜１２、図３Ａ、レーン６〜９）。

プロテイン−Ａ精製、ＨＥＫ２９３発現、ＩｇＧ＃２−ｄｓＦｖ＃１およびＩｇＧ＃２−ｄｓｓｃＦｖ＃１のＳ２００ＳＥ−ＨＰＬＣ分析
１０μｇ精製タンパク質サンプル（ＰＢＳで希釈した０．１ｍｇ／ｍｌストックの１００μｌ）を、精製後３日にＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１０/３００ＧＬＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に注入し、１ｍｌ／分で、２８０ｎｍの吸光度によって連続検出で、ＰＢＳｐＨ７．４のアイソクラチック勾配を発現させた。

プロテイン−Ａ精製後、ＩｇＧ＃２（ＨＣ）−ｄｓｓｃＦｖ＃１サンプルは、６４〜７５％モノマーであり、ＩｇＧ＃２（ＬＣ）−ｄｓｓｃＦｖ＃１は、５３〜５４％モノマーであり、；一方、ＩｇＧ＃２（ＨＣ）−ｄｓＦｖ＃１（ＨＣ−ｖＨ結合）は、９１〜９２％モノマーであり、ＩｇＧ＃２（ＨＣ）−ｄｓＦｖ＃１（ＨＣ−ｖＬ結合）は、９７〜９９％モノマーであり、ＩｇＧ＃２（ＬＣ）−ｄｓＦｖ＃１（ＬＣ−ｖＨ結合）は、６０〜７６％モノマーであり、ＩｇＧ＃２（ＬＣ）−ｄｓＦｖ＃１（ＬＣ−ｖＬ結合）は、１００％モノマーであった。

Ｆｖ＃１は、特に多量体化する傾向があることが知られている。ＩｇＧ−ｄｓｓｃＦｖ多量体は、ｄｓｓｃＦｖリンカーによって物理的に結合され、ｄｓｓｃＦｖ＃１を（ｓｃＦｖリカンーを欠く）ｄｓＦｖ＃１で置換することによって、得られたモノマーのレベルが有意に増加した（場合によっては１００％）。
多量体化するＦｖの傾向に依存して、いくつかの例において、ｄｓｓｃＦｖの代わりにｄｓＦｖを使用することが有利であろう。ｖＬとｖＨの間のリンカーの欠如は、不適切な分子間ドメイン相互作用の可能性を排除し、それゆえ、発現中および発現後に多量体および凝集体を形成する傾向を低下させる。ｄｓＦｖとのジスルフィド結合の存在は、生成物が安定であることを保証する。

Claims

ａ）式（Ｉ）：Ｖ_Ｈ−ＣＨ_１−ＣＨ_２−ＣＨ_３−Ｘ−（Ｖ_１）_ｐのポリペプチド鎖；および
ｂ）式（ＩＩ）：Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ−Ｙ−（Ｖ_２）_ｑのポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子であって、
ここで、Ｖ_Ｈは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ_１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
ＣＨ_２は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン２を表し；
ＣＨ_３は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン３を表し；
Ｘは、結合またはリンカーを表し；
Ｙは、結合またはリンカーを表し；
Ｖ_１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖを表し；
Ｖ_Ｌは、可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインを表し；
Ｃ_Ｌは、定常領域からのドメイン、例えば、Ｃκなどの軽鎖定常領域ドメインを表し；
Ｖ_２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖを表し；
ｐは、０または１を表し；
ｑは、０または１を表し；
ここで、ｐまたは１の少なくとも１つは、１であり、および
ここで、Ｖ_１またはＶ_２の少なくとも１つは、ｄｓＦｖでり、および
Ｖ_１がｄｓＦｖであり、ｐが１であり、ｑが０である場合、該分子は、式（Ｉ）の２つの重鎖および式（ＩＩ）の２つの関連する軽鎖を有する二量体として提供される。
ｐが１である、請求項１に記載の多重特異性抗体分子。
ｑが０である、請求項１または２に記載の多重特異性抗体分子。
ｑが１である、請求項１または２に記載の多重特異性抗体分子。
Ｖ_２がｄｓＦｖである、請求項１または４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
Ｖ_２がｄｓｓｃＦｖである、請求項１または４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
Ｖ_１がｄｓＦｖである、請求項１または６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
Ｖ_１がｄｓｓｃＦｖである、請求項１または６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
Ｘがペプチドリンカー、例えば、配列番号１または配列番号２の配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
Ｘが結合である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
Ｙがペプチドリンカー、例えば、配列番号１または配列番号２の配列である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
Ｙが結合である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
Ｖ_１および／またはＶ_２の可変領域内ジスルフィド結合は、独立して、Ｖ_Ｈ３７およびＶ_Ｌ９５、Ｖ_Ｈ４４およびＶ_Ｌ１００、Ｖ_Ｈ４４およびＶ_Ｌ１０５、Ｖ_Ｈ４５およびＶ_Ｌ８７、Ｖ_Ｈ１００およびＶ_Ｌ５０、Ｖ_Ｈ１００ｂおよびＶ_Ｌ４９、Ｖ_Ｈ９８およびＶ_Ｌ４６、Ｖ_Ｈ１０１およびＶ_Ｌ４６、Ｖ_Ｈ１０５およびＶ_Ｌ４３およびＶ_Ｈ１０６およびＶ_Ｌ５７を含む、またはからなる群から選択され、ここで、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ値は、独立して、所定のＶ_１またはＶ_２内で、例えば、Ｖ_Ｈ４４およびＶ_Ｌ１００である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
Ｖ_１および／またはＶ_２における可変領域内ジスルフィド結合は、位置Ｖ_Ｈ４４およびＶ_Ｌ１００である、請求項１３に記載の多重特異性抗体分子。
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子またはそのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド。
請求項１５で定義されるポリヌクレオチドを含むベクター。
それぞれ請求項１４または１５のベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子の異なるポリペプチド鎖をコードするヌクレオチドを各々含む３つのベクターを含む宿主細胞。
請求項１７または１８で定義される宿主細胞からの多重特異性抗体分子を発現することを含む方法。
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子および少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物。
治療に使用するための請求項１〜１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子または請求項２０に記載の医薬組成物。
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子または請求項２０に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、それを必要とする患者を治療する方法。