WO2017018437A1 - アフィニティー担体およびイムノグロブリンを単離する方法 - Google Patents

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敬 市居
中村　聡
潤一 安岡
佳織 板谷
知範 塩谷
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Definitions

  • the present invention relates to an affinity carrier and a method for isolating immunoglobulins.
  • the present invention relates to a method for immobilizing a ligand on a carrier, which can improve the efficiency of immunoglobulin purification of the affinity carrier.
  • Affinity chromatography is chromatography using a column packed with a ligand-immobilized carrier in which a substance (ligand) that specifically binds to a substance intended for separation or purification is immobilized on an insoluble carrier.
  • Affinity chromatography is used, for example, for separation and purification of biological materials such as proteins and nucleic acids (Patent Document 1).
  • the carrier for affinity chromatography for example, cross-linked particles of sugar chains typified by agarose gel and particles mainly composed of a synthetic polymer are used.
  • a ligand which is a substance that specifically acts on a target substance
  • a carrier For immobilization of a ligand on a carrier, a method in which a ligand is chemically bonded to a carrier via a functional group on the ligand side with respect to various functional groups present on the surface of the carrier is frequently used.
  • a ligand used for affinity chromatography generally has a plurality of functional groups, and the plurality of functional groups are randomly bonded to the functional groups on the surface of the support. For this reason, the conventional affinity chromatography has a problem that the immobilized ligand cannot be sufficiently effectively used.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for efficiently immobilizing a protein ligand on the surface of an affinity carrier and retaining a high binding capacity of the immobilized ligand to a target substance. .
  • an affinity carrier comprising: Comprising a solid support and a protein ligand,
  • the protein ligand is represented by the following formula (1): RR 1 (1) (In the formula (1), R represents a linker that binds to the solid phase carrier and includes polyproline; R 1 represents a protein having affinity for immunoglobulin; R is bound to the C-terminal or N-terminal of the amino acid sequence of R 1 ) Represented by An affinity carrier is provided.
  • the number of prolines in the polyproline is 3 to 300.
  • the linker has a length of 0.9 nm to 91 nm.
  • the present invention is an affinity carrier comprising: Comprising a solid support and a protein ligand,
  • the protein ligand is represented by the following formula (1): RR 1 (1) (In the formula (1), R represents a linker that binds to the solid phase carrier and has a length of 0.9 nm to 91 nm, R 1 represents a protein having affinity for immunoglobulin; R is bound to the C-terminal or N-terminal of the amino acid sequence of R 1 ) Represented by An affinity carrier is provided.
  • the linker comprises polyproline.
  • the number of prolines in the polyproline is 3 to 300.
  • the linker includes an amino acid residue having an amino group or a thiol group at a terminal that is bonded to the solid phase carrier.
  • the protein having affinity for immunoglobulin includes an Fc-binding protein or an immunoglobulin-binding domain derived from protein A.
  • the protein having affinity for immunoglobulin consists of an immunoglobulin binding domain consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3 and a partial sequence of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3.
  • the protein having affinity for immunoglobulin includes two or more of the immunoglobulin binding domains.
  • the solid phase carrier has a reactive group that binds to a thiol group or an amino group.
  • the reactive group is an epoxy group.
  • the present invention provides a method for isolating immunoglobulin using the affinity carrier.
  • the present invention provides a method for producing an antibody drug using the affinity carrier.
  • the present invention provides: A linker R and a protein ligand R 1 ,
  • the linker R comprises polyproline;
  • R 1 represents a protein having affinity for immunoglobulin;
  • the R is bound to the C-terminal or N-terminal of the amino acid sequence of the R 1 ;
  • An affinity ligand is provided.
  • the ligand protein can be immobilized on the carrier with a certain orientation by binding the ligand protein to the carrier via a specific linker.
  • the affinity carrier of the present invention it is possible to prevent the ligand from being denatured or inappropriately oriented due to disordered binding between the ligand and the carrier, and to improve the binding property of the ligand to the target substance. Therefore, according to the present invention, the affinity ligand can be efficiently immobilized on the surface of the carrier, and the immobilized ligand is efficiently used for purification of the target substance.
  • the affinity carrier of the present invention has a high immunoglobulin binding capacity, and enables the immunoglobulin purification process to be carried out at a low cost.
  • sequence identity of amino acid sequences and nucleotide sequences is calculated by the Lippman-Pearson method (Lipman-Pearson method; Science, 227, 1435-41, 1985). Specifically, using the homology analysis (Search homology) program of genetic information software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; software development), the unit size to compare (ktup) is set to 2. Is calculated by the homology analysis (Search homology) program of genetic information software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; software development).
  • “at least 70% identity” with respect to amino acid sequences and nucleotide sequences refers to 70% or more identity, preferably 80% or more identity, more preferably 85% or more identity, even more preferably Means 90% or more identity, even more preferably 95% or more identity, still more preferably 98% or more identity, still more preferably 99% or more identity.
  • the “corresponding position” on the amino acid sequence and the nucleotide sequence means that the target sequence and the reference sequence (for example, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3) are conserved in each amino acid sequence or nucleotide sequence. It can be determined by aligning amino acid residues or nucleotides to give maximum homology. The alignment can be performed using known algorithms, the procedures of which are known to those skilled in the art. For example, the alignment can be performed manually based on the above-mentioned Lippmann-Person method or the like, but the Clustal W multiple alignment program (Thompson, JD et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22: 4673-). 4680) with default settings.
  • Clustal W2 or Clustal omega which is a revised version of Clustal W.
  • Clustal W, Clustal W2, and Clustal omega are, for example, European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and Japanese DNA data operated by the National Institute of Genetics. It can be used on the bank (DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]) website.
  • protein refers to any molecule having a peptide structural unit, for example, a concept including a partial fragment of a natural protein or a variant obtained by artificially modifying the amino acid sequence of a natural protein.
  • the protein may be modified with a biological substance such as a sugar chain or lipid, or a polymer such as polyethylene glycol.
  • protein A refers to protein A which is a cell wall component of Staphylococcus aureus.
  • the “immunoglobulin binding domain” refers to a functional unit of a polypeptide having an immunoglobulin binding activity alone.
  • “immunoglobulin binding” refers to binding to a region other than the complementarity determining region (CDR) of an immunoglobulin molecule, particularly at least an Fc fragment.
  • examples of “immunoglobulin binding domain” herein include Fc binding proteins and immunoglobulin binding domains derived from protein A.
  • immunoglobulin binding domains derived from the protein A include the A domain, the B domain, the C domain, the D domain, the E domain, and the Z domain that is a modified domain of the B domain, and the domain derived therefrom. Mutants are mentioned. Examples of the mutant include a polypeptide having at least 70% identity in amino acid sequence with any of the above A to E and Z domains and having an immunoglobulin binding ability.
  • the “protein showing affinity for immunoglobulin” or “immunoglobulin binding protein” refers to a protein having affinity specific for immunoglobulin and having immunoglobulin binding ability. Preferably, it refers to a protein comprising at least one, more preferably two or more of the above-mentioned “immunoglobulin binding domains”.
  • the affinity carrier includes a solid phase carrier and a protein ligand, and the protein ligand is represented by the following formula (1): RR 1 (1) (In the formula (1), R represents a linker chemically bonded to the solid phase carrier; R 1 represents a protein having affinity for immunoglobulin; R is bound to the C-terminal or N-terminal of the amino acid sequence of R 1 ) It is represented by
  • the solid phase carrier contained in the affinity carrier of the present invention is preferably a substrate insoluble in water.
  • the solid support can be in the form of particles, which can be porous or non-porous.
  • the particulate carrier can be used as a packed bed or in a suspended form. Suspension forms include what are known as expanded beds and pure suspensions, in which the particles can move freely. For monoliths, packed beds, and fluidized beds, the separation procedure generally follows conventional chromatographic methods with a concentration gradient. For pure suspensions, a batch method is used.
  • the carrier of the present invention is a filler.
  • the carrier may be in the form of a chip, capillary or filter. Further, magnetic particles may be used as the solid support.
  • the magnetic particles are not particularly limited as long as they can be easily magnetized by magnetic induction.
  • iron trioxide Fe 3 O 4
  • iron trioxide ⁇ -Fe 2 O 3
  • various ferrites Magnetic fine particles composed of metals such as iron, manganese, nickel, cobalt, chromium, and alloys such as cobalt, nickel, manganese, or hydrophobic polymers and hydrophilic polymers containing these magnetic materials inside Can be mentioned.
  • a hydrophobic first polymer layer is formed on the surface of a mother particle containing superparamagnetic fine particles described in JP-A-2008-32411, and at least on the surface of the first polymer layer.
  • a second polymer layer having a glycidyl group is formed, and by chemically modifying the glycidyl group, a polar group containing at least one kind of atom selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom and a sulfur atom Introduced magnetic particles.
  • the affinity carrier of the present invention is an affinity chromatography carrier.
  • the solid phase carrier is preferably 20 to 200 ⁇ m, when the carrier is a synthetic polymer, more preferably 20 to 100 ⁇ m, still more preferably 30 to 80 ⁇ m, and more preferably when the carrier is a polysaccharide. It has a particle size of 50 to 200 ⁇ m, more preferably 60 to 150 ⁇ m. When the particle size is less than 20 ⁇ m, the column pressure becomes high under a high flow rate, which is not practical. If the particle diameter exceeds 200 ⁇ m, the amount of binding of immunoglobulin to the affinity carrier (binding capacity) may be inferior.
  • the “particle size” in this specification is a volume average particle size obtained by a laser diffraction / scattering particle size distribution measuring apparatus.
  • the solid phase carrier is preferably porous and has a specific surface area of 50 to 150 m 2 / g, more preferably 80 to 130 m 2 / g.
  • the specific surface area is less than 50 m 2 / g, the binding capacity may be inferior.
  • the strength of the carrier is inferior and the carrier is destroyed under a high flow rate. Column pressure may increase.
  • the “specific surface area” in the present specification is a value obtained by dividing the surface area of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm obtained by a mercury porosimeter by the dry weight of the particles.
  • the solid phase carrier is preferably 100 to 1400 nm, more preferably 100 to 400 nm, still more preferably 200 to 300 nm when the carrier is a synthetic polymer, and more preferably when the carrier is a polysaccharide.
  • the “volume average pore diameter” is a volume average pore diameter of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm obtained by a mercury porosimeter.
  • the gap between the particles to be the flow path of the solution to be purified and the relatively large pore size in the particle and the binding of the molecule to be purified The surface area balance is optimized and the binding capacity under high flow rates is maintained at a high level.
  • the material of the solid phase carrier is, for example, a polymer having a hydrophilic surface, for example, a hydroxy group (—OH), a carboxy group (—COOH) on the outer surface (and on the inner surface if present).
  • a polymer having a hydrophilic surface for example, a hydroxy group (—OH), a carboxy group (—COOH) on the outer surface (and on the inner surface if present).
  • An aminocarbonyl group (—CONH 2 , or N-substituted type), an amino group (—NH 2 , or substituted type), or a polymer having an oligo or polyethyleneoxy group.
  • the polymer may be a synthetic polymer such as polymethacrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol, and the like, preferably a co-polymer crosslinked with a polyfunctional monomer such as polyfunctional (meth) acrylate, divinylbenzene.
  • a synthetic polymer such as a polymer.
  • Such synthetic polymers are easily produced by known methods (see, for example, the method described in J. MATER. CHEM 1991, 1 (3), 371-374). Alternatively, a commercial product such as Toyopearl (Tosoh Corporation) is also used.
  • the polymer in other embodiments is a polysaccharide such as dextran, starch, cellulose, pullulan, agarose and the like.
  • polysaccharides are easily produced by known methods (for example, see the method described in Japanese Patent No. 4081143).
  • commercially available products such as Sepharose (GE Healthcare Bioscience) are also used.
  • inorganic carriers such as silica and zirconium oxide may be used.
  • porous particles used as the solid phase carrier include, for example, 20 to 50% by mass of a crosslinkable vinyl monomer and 3 to 80% by mass of an epoxy group.
  • a vinyl monomer and a copolymer of 20 to 80% by weight of a diol group-containing vinyl monomer has a particle size of 20 to 80 ⁇ m, a specific surface area of 50 to 150 m 2 / g, and a volume average
  • porous organic polymer particles having a pore diameter of 100 to 400 nm.
  • the infiltration volume (pore volume) of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm when the solid phase carrier is measured with a mercury porosimeter is preferably 1.3 to 7.0 mL / g, and the carrier is a synthetic polymer. In this case, it is more preferably 1.3 to 2.5 mL / g, and when the carrier is a polysaccharide, more preferably 3.0 to 6.0 mL / g.
  • the ligand can be bound to the solid phase carrier by using a general method for immobilizing a protein on the carrier.
  • the immobilization means include physical adsorption of the ligand to the carrier, chemical binding between the carrier and the ligand, and the like.
  • the method for chemical bonding between the carrier and the ligand include covalent bonding.
  • the linker of the ligand is covalently bonded to the carrier via its carboxy group, amino group, hydroxyl group or thiol group.
  • a reactive group for covalent bonding may be introduced into the carrier.
  • a carboxy group, an amino group, a hydroxyl group, a maleimide group, or an epoxy group is preferable, and among these, an epoxy group is more preferable because a reaction with a ligand proceeds under mild conditions.
  • Specific examples of a method for binding a ligand to a carrier include using a carrier having a carboxy group, activating this carboxy group with N-hydroxysuccinimide and reacting with the amino group of the ligand, an amino group or a carboxy group.
  • a dehydrating condensing agent such as a water-soluble carbodiimide
  • the group introduced into the carrier a method of reacting with an amino group or a hydroxyl group or a thiol group of the ligand, and using a carrier having an epoxy group, and a method of reacting with an amino group or a hydroxyl group or a thiol group of the ligand.
  • a binding method in which a ligand is introduced via an epoxy group is desirable.
  • the alcoholic hydroxyl group which is a ring-opened epoxy group formed by the ring opening of the epoxy group, makes the surface of the carrier hydrophilic, prevents non-specific adsorption of proteins, etc., and improves the toughness of the carrier in water. It plays a role in preventing the destruction of the carrier. Therefore, when the residual epoxy group which is not couple
  • the ring opening method of the epoxy group in the carrier include a method of heating or stirring the carrier at room temperature with an acid or alkali in an aqueous solvent.
  • the epoxy group may be ring-opened with a blocking agent having a mercapto group such as mercaptoethanol or thioglycerol or a blocking agent having an amino group such as monoethanolamine.
  • a blocking agent having a mercapto group such as mercaptoethanol or thioglycerol or a blocking agent having an amino group such as monoethanolamine.
  • the most preferred ring-opening epoxy group is a ring-opening epoxy group obtained by opening the epoxy group contained in the carrier with thioglycerol.
  • Thioglycerol is less toxic than mercaptoethanol as a raw material, and the epoxy ring-opening group added with thioglycerol has lower non-specific adsorption than the ring-opening group by a blocking agent having an amino group, and the dynamics of the carrier. There is an advantage that the amount of coupling becomes high.
  • the protein ligand contained in the affinity carrier of the present invention includes a linker R and a protein ligand R 1 and is represented by the following general formula (1).
  • RR 1 (1) As described above, the ligand can be immobilized on the carrier by reacting the protein ligand with, for example, an epoxy group on the carrier.
  • the linker R in the above formula (1) is a linker containing a functional group that reacts with the reactive functional group of the solid phase carrier at one end thereof.
  • the linker can be used for linking and immobilizing a protein R 1 having affinity for immunoglobulin, which will be described later, to a carrier.
  • the linker is used to efficiently immobilize the R 1 on a carrier while being suitable for substantially maintaining the immunoglobulin affinity of the R 1 . That is, when the linker is used, the protein R 1 can be efficiently introduced onto the carrier, for example, 25% or more more efficiently than when the linker is not used. Further, the protein R 1 efficiently introduced using the linker can maintain its activity, for example, immunoglobulin binding property, on the carrier.
  • the linker R has a length of preferably 0.9 nm to 91 nm, more preferably 1.8 nm to 15.4 nm, and even more preferably 3.6 nm to 7.3 nm.
  • the length of the linker in the three-dimensional conformation of the linker, refers to the distance from the site which binds to the R 1 to the site of binding to the solid phase support.
  • the linker has a helical structure and the entire length of the helix has the length described above.
  • the linker R is a peptide linker containing at least two prolines. More preferably, the linker R is a polypeptide containing an amino acid residue containing at least two prolines and having an amino group or a thiol group in the side chain. More preferably, the linker R contains at least two prolines and has at least one, more preferably one or more cysteine (C) or lysine residue (K) at the terminal end bound to the solid phase carrier. It is a polypeptide. When the linker R includes a plurality of cysteine residues, it is necessary to consider that a disulfide bond is not formed between cysteines.
  • a reducing agent may be used.
  • the reducing agent is not particularly limited as long as it can reduce disulfide bonds, and examples thereof include 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, 1-thioglycerol, and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride. .
  • the linker R comprises polyproline having at least 3 consecutive proline residues.
  • the number of proline residues contained in the polyproline is preferably 3 to 300, more preferably 6 to 51, and still more preferably 12 to 24. Since polyproline can constitute a polyproline helix having three prolines as one unit, the linker R is preferably 3 to 300, more preferably 6 to 51, and still more preferably 12 to 24 A polyproline helix consisting of proline may be included.
  • the linker R preferably has a pitch number of 1 to 100, more preferably 2 to 17 A polyproline helix having a pitch number of 4 to 8, more preferably 4-8.
  • the pitch number of the polyproline helix of the linker R is not limited to an integer.
  • the length per pitch of the polyproline helix is about 0.9 nm (J. AM. CHEM. SOC., 2007, 129 (4): 873-880).
  • the linker R may have one or more amino acid residues other than proline in addition to polyproline.
  • the linker R has one or more amino acid residues other than proline between polyproline and the linker terminal bonded to the solid phase carrier, more preferably polyproline.
  • one or two or more amino acid residues having an amino group or a thiol group are included between the solid phase carrier and the linker terminal bonded to the solid phase carrier.
  • the amino acid residue other than proline is preferably 1 to 3 cysteine (C) or lysine residue (K).
  • the linker R comprises at least one, more preferably 1 to 3 cysteine (C) or lysine residue (K) at the end that binds to the solid phase carrier, and 3 to 300, more preferably Is a linker containing polyproline consisting of 6 to 51, more preferably 12 to 24 proline.
  • Immunoglobulin binding protein R 1 in the above formula (1) is a protein (or immunoglobulin binding protein) showing affinity for immunoglobulin.
  • R 1 include a protein comprising at least one immunoglobulin binding domain selected from the group consisting of an Fc binding protein that binds to an immunoglobulin Fc region and an immunoglobulin binding domain derived from protein A.
  • R 1 may contain any number of immunoglobulin binding domains as long as it does not cause industrial problems.
  • R 1 comprises at least one immunoglobulin binding domain derived from protein A. More preferably, R 1 comprises at least one immunoglobulin binding domain selected from the group consisting of A domain, B domain, C domain, D domain, E domain, Z domain, and variants thereof of protein A. .
  • mutants of the above A to E and Z domains can be modified by adding, deleting, substituting or deleting amino acid residues, and chemically modifying amino acid residues with respect to the A to E and Z domains of protein A. It can produce by applying.
  • means for adding, deleting, substituting or deleting amino acid residues include known means such as site-specific mutation for the polynucleotide encoding the domain.
  • R 1 is an immunoglobulin binding domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, an immunoglobulin binding domain consisting of a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 1. At least one selected from the group consisting of immunoglobulin binding domains consisting of an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence.
  • R 1 is an immunoglobulin binding domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, an immunoglobulin binding domain consisting of a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 2. At least one selected from the group consisting of immunoglobulin binding domains consisting of an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence.
  • R 1 is an immunoglobulin binding domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, an immunoglobulin binding domain consisting of a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the SEQ ID NO: 3 At least one selected from the group consisting of immunoglobulin binding domains consisting of an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence.
  • R 1 comprises two or more of the immunoglobulin binding domains listed above, more preferably 2-12, even more preferably 3-8.
  • Each of the immunoglobulin binding domains may be the same or different.
  • each of the immunoglobulin binding domains is linked at its N-terminus to the C-terminus of an adjacent domain.
  • Each domain may be linked directly to an adjacent domain or may be linked via a peptide having 1 to 10 amino acid residues.
  • R 1 may contain one or more of the immunoglobulin binding domains. From the viewpoint of immunoglobulin binding capacity and productivity of immunoglobulin binding protein, R 1 immunoglobulin binding The number of domains is preferably 10 or less, more preferably 2 or more and 8 or less, and further preferably 4 or more and 6 or less.
  • the immunoglobulin binding domain contained in R 1 has a Val residue at a position corresponding to position 1 of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 3, and / or 3 has an Ala residue at a position corresponding to position 29 of the amino acid sequence shown in any one of 3 above.
  • R 1 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is a polypeptide comprising four immunoglobulin binding domains comprising the amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, wherein 1-position Ala is substituted with Val and 29-position Gly is substituted with Ala. .
  • Val has a position corresponding to position 1 of SEQ ID NO: 3 with at least 70% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a position corresponding to position 29 And a polypeptide containing 3 to 8 immunoglobulin binding domains consisting of an amino acid sequence having Ala.
  • the linker can be attached or fused to its end so that the function of the immunoglobulin binding protein is substantially retained. Therefore, the linker R is preferably bound to the C-terminal or N-terminal of the amino acid sequence of the immunoglobulin binding protein R 1 . Alternatively, two linkers R may be bonded to both ends of the amino acid sequence of R 1 , respectively, or the linker R may be bonded to an amino acid residue that is not a terminal residue of the amino acid sequence of R 1 .
  • the protein ligand RR 1 represented by the above formula (1) contained in the affinity carrier of the present invention is a fusion polypeptide comprising the linker R and the immunoglobulin binding protein R 1 .
  • R 1 contained in the protein ligand is a fusion polypeptide containing one or more immunoglobulin binding domains, preferably 2 to 12, more preferably 3 to 8. These fusion polypeptides can be produced by recombinant methods known in the art.
  • the host for transformation is not particularly limited, and a known host used for expressing recombinant proteins such as bacteria such as E. coli, fungi, insect cells, and mammalian cells can be used.
  • any method known in the art may be used depending on each host.
  • Molecular Cloning Cold Spring Harbor edited by Sambrook et al. A well-known method described in Laboratory Press, 3rd edition, 2001
  • Methods for recovering the expressed protein by culturing transformed recombinants are well known to those skilled in the art and are exemplified in the examples of the present invention.
  • the invention therefore also the expression polynucleotide encoding a protein ligand R-R 1 represented by (1) (DNA, etc.), to provide the vector, and recombinants containing them comprising the same.
  • the linker R is bound to the solid phase carrier by chemical means, by a recombinant method or using an enzyme prior to binding to the immunoglobulin binding protein R 1, and then bound to the linker R.
  • R 1 may be bonded.
  • Suitable solid phase carriers for the binding of the linker R are as described in 1.1 above.
  • the affinity carrier according to one embodiment of the present invention has a large amount of ligand immobilized on the carrier and a high initial IgG static binding capacity (SBC), the immunoglobulin binding calculated according to the following formula:
  • the effective utilization E of protein [%] is high.
  • E [%] [(SBC / antibody molecular weight) / (immunoglobulin binding protein introduction amount / immunoglobulin binding protein molecular weight)] ⁇ 100
  • Method for isolating immunoglobulins A method for isolating immunoglobulins according to one embodiment of the present invention will be described. Methods for isolating immunoglobulin according to the present embodiment, a protein ligand R-R 1 represented by immobilized affinity support by the above formula (1), contacting the sample containing the immunoglobulins, to the carrier A step of adsorbing globulin (first step) and a step of eluting the immunoglobulin from the carrier (second step), preferably after the second step, washing the carrier with an alkaline solution
  • the process (3rd process) to include is further included.
  • the affinity carrier of the present invention used in the immunoglobulin isolation method of the present invention may be in the form of a suspension, packed in a column, or in the form of a chip, capillary or filter. There may be.
  • the sample containing the immunoglobulin is brought into contact with the ligand under conditions such that the immunoglobulin is adsorbed on a column packed with the affinity carrier.
  • the carrier may be washed with a neutral buffer containing a salt such as NaCl in order to remove a part of the substance weakly held by the ligand.
  • an appropriate buffer solution having a pH of 2 to 5 is flowed to elute the immunoglobulin adsorbed on the ligand.
  • immunoglobulin can be isolated from the sample.
  • the third step is performed subsequent to the second step.
  • the carrier is washed with an alkaline solution (CIP washing).
  • alkaline liquid used in the third step include a sodium hydroxide aqueous solution, a potassium hydroxide aqueous solution, triethylamine, and tetrabutylammonium hydroxide.
  • the affinity carrier of the present invention can stably retain the immunoglobulin binding ability even after washing in the third step, it can be used repeatedly in the immunoglobulin isolation method of the present invention.
  • the immunoglobulin to be isolated can be an antibody or a medicament containing it.
  • the present invention provides a method for producing an antibody drug using the affinity carrier of the present invention. The procedure of the method is basically the same as that of the immunoglobulin isolation method described above, except that a sample containing the target antibody drug is used.
  • the obtained aqueous solution was put into a 7 L separable flask, a thermometer, a stirring blade, and a cooling pipe were attached, set in a hot water bath, and stirring was started at 600 rpm in a nitrogen atmosphere. Subsequently, the separable flask was heated with a hot water bath, and when the temperature of the aqueous solution reached 85 ° C., the organic monomer solution was added to the aqueous solution using a dropping funnel, followed by stirring for 5 hours.
  • PB1 porous particles
  • PB1 had a volume average particle size of 53 ⁇ m according to the light scattering method, and a specific surface area of 95 m 2 / g according to mercury porosimeter measurement.
  • Comparative Example 1 (1) Preparation of recombinant immunoglobulin-binding protein A plasmid encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of an immunoglobulin-binding protein without a linker was prepared by chemical synthesis, introduced into E. coli BL21 (manufactured by STRATAGENE), and transformed. did. The transformed E. coli is incubated at 37 ° C. until the absorbance (OD600) reaches about 10, then IPTG (manufactured by Sigma-Aldrich) is added to a final concentration of 1 mM, and further incubated at 37 ° C. for 4 hours. Recombinant immunoglobulin binding protein was then expressed.
  • SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of an immunoglobulin-binding protein without a linker was prepared by chemical synthesis, introduced into E. coli BL21 (manufactured by STRATAGENE), and transformed. did. The transformed E. coli is incubated at 37 ° C. until the
  • Comparative Example 2 Recombinant immunoglobulin in the same procedure as in Comparative Example 1 except that E. coli BL21 was transformed with a plasmid encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of an immunoglobulin binding protein containing a cysteine linker shown in Table 1. A binding protein was prepared and then immobilized on porous particles PB1.
  • Comparative Example 3 Recombinant immunoglobulin in the same procedure as Comparative Example 1 except that E. coli BL21 was transformed with a plasmid encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of an immunoglobulin binding protein containing the polylysine linker shown in Table 1. A binding protein was prepared and then immobilized on porous particles PB1.
  • Example 1 A recombinant immunogen was prepared in the same manner as in Comparative Example 1, except that E. coli BL21 was transformed with a plasmid encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) of an immunoglobulin binding protein containing the polyproline linker shown in Table 1. A globulin binding protein was prepared and then immobilized on porous particles PB1.
  • Example 2 Recombinant immunogens were prepared in the same manner as in Comparative Example 1 except that E. coli BL21 was transformed with a plasmid encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) of an immunoglobulin binding protein containing the polyproline linker shown in Table 1. A globulin binding protein was prepared and then immobilized on porous particles PB1.
  • Example 3 A recombinant immunogen was prepared in the same manner as in Comparative Example 1, except that E. coli BL21 was transformed with a plasmid encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) of an immunoglobulin binding protein containing the polyproline linker shown in Table 1. A globulin binding protein was prepared and then immobilized on porous particles PB1.
  • Example 4 Recombinant type was obtained in the same manner as in Comparative Example 1, except that E. coli BL21 was transformed with a plasmid encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) of an immunoglobulin binding protein containing the polyproline linker shown in Table 1. An immunoglobulin binding protein was prepared and then immobilized on porous particles PB1.
  • Example 5 Recombinant type was obtained by the same procedure as in Comparative Example 1 except that E. coli BL21 was transformed with a plasmid encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) of an immunoglobulin binding protein containing the polyproline linker shown in Table 1. An immunoglobulin binding protein was prepared and then immobilized on porous particles PB1.
  • Comparative Example 4 The particle PB1 prepared in Reference Example 1 was allowed to react with an excessive amount of thioglycerol to open an epoxy group, and then 1,4-bis (2,3-epoxypropoxy) butane (BDDDGE) (carbon number) 10) was allowed to act in an equimolar amount with the surface hydroxyl group to introduce a carbon chain linker. This particle was designated as PB2. About 8 mg of PB2, recombinant immunoglobulin binding protein (SEQ ID NO: 4) was immobilized in substantially the same manner as in Comparative Example 1 to obtain 400 ⁇ L of the particle suspension.
  • BDDDGE 1,4-bis (2,3-epoxypropoxy) butane
  • Comparative Example 5 The particle PB1 prepared in Reference Example 1 was allowed to react with an excessive amount of thioglycerol to open an epoxy group, and then 1,2-bis (2,3-epoxypropoxy) ethane (EGDG) (carbon number) 8) was allowed to act in an equimolar amount with the surface hydroxyl group to introduce a carbon chain linker.
  • This particle was designated as PB3.
  • Test Example 1 Measurement of Ligand Binding Amount
  • the particle suspensions of Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 to 5 were collected from 400 ⁇ L to 50 ⁇ L, and the amount of immunoglobulin binding protein bound to the particles was measured using a BCA Assy kit (PIERCE). Then, the relative value with the binding amount of Comparative Example 1 as 100 was determined.
  • Test Example 2 (Measurement of static binding capacity of immunoglobulin G (IgG)) 400 ⁇ L to 150 ⁇ L of the particle suspensions of Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 to 5 were collected and put into filter tubes (Millpore), respectively, and 0.1 M phosphate buffer pH 7 containing 5 mg of IgG was added thereto. 0.5 ⁇ l was added and shaken at 25 ° C. for 1 hour to adsorb IgG onto the particles. After centrifugation, the particles were washed with 450 ⁇ L of 0.1 M phosphate buffer pH 7.5, and IgG adsorbed on the particles was eluted with 0.1 M citrate buffer pH 3.2. From the absorbance at 280 nm, the static binding capacity (SBC) of IgG of the particles was measured.
  • SBC static binding capacity
  • Test Example 3 Utilization Efficiency of Immunoglobulin Binding Protein From the ligand binding amount and SBC value measured in Test Example 1 and Test Example 2, according to the following formula, the immunoassay in the porous particles of Examples 1-5 and Comparative Examples 1-5
  • the effective utilization E [%] of the globulin binding protein was calculated according to the following formula.
  • E [%] [(SBC / molecular weight of antibody) / (immunoglobulin binding protein introduction amount / molecular weight of immunoglobulin binding protein)] ⁇ 100
  • Table 2 shows the results of Test Examples 1 to 3.
  • the particles to which the immunoglobulin protein containing the polyproline linker prepared in Examples 1 to 5 was immobilized had an improved ligand binding amount and SBC compared to Comparative Examples 1 to 3. Furthermore, when the length of polyproline was longer, SBC was further improved, and the utilization efficiency E [%] tended to be higher. Furthermore, as shown in Examples 4 to 5, substantially the same amount of introduction was obtained regardless of whether the functional group used for bonding between the linker and the carrier was an amino group derived from lysine or a thiol group derived from cysteine. . On the other hand, as shown in Comparative Examples 5 to 6, the carbon chain linker did not contribute at all to increase the ligand binding amount and SBC.
  • the present invention includes substantially the same configuration (for example, a configuration having the same function, method and result, or a configuration having the same purpose and result) as the configuration of the embodiment described above.
  • the present invention also includes a configuration in which a non-essential part of the configuration of the embodiment described above is replaced.
  • the present invention includes a configuration that achieves the same effect as the configuration of the embodiment described above, or a configuration that can achieve the same object.
  • the present invention includes a configuration in which a known technique is added to the configuration of the embodiment described above.

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Abstract

リガントの目的物質との結合性が向上したアフィニティー担体の提供。固相担体とタンパク質リガンドとを含み、該タンパク質リガンドは、式（１）：Ｒ－Ｒ1（式（１）中、Ｒは、該固相担体と化学結合するリンカーであって、ポリプロリンを含むリンカーを示し、Ｒ1は、イムノグロブリンに親和性を示す含むタンパク質を示し、該Ｒは、該Ｒ1のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に結合している）で表される、アフィニティー担体。

Description

アフィニティー担体およびイムノグロブリンを単離する方法
　本発明は、アフィニティー担体およびイムノグロブリンを単離する方法に関する。特に、アフィニティー担体のイムノグロブリン精製効率を高めることができる、担体へのリガンド固定化方法に関する。
　アフィニティークロマトグラフィーは、分離または精製を目的とする物質と特異的に結合する物質（リガンド）を不溶性担体に固定化したリガンド固定化担体を充填したカラムを用いるクロマトグラフィーである。アフィニティークロマトグラフィーは、例えばタンパク質、核酸などの生体関連物質の分離・精製に用いられている（特許文献１）。アフィニティークロマトグラフィー用担体としては、例えば、アガロースゲルに代表される糖鎖の架橋粒子や、合成ポリマーを主成分とする粒子が用いられている。
　アフィニティークロマトグラフィーにおいては、目的物質と特異的に作用する物質であるリガンドを担体に固定化する必要がある。担体へのリガンドの固定化には、担体表面に存在する種々の官能基に対して、リガンド側の官能基を介してリガンドを担体に化学結合させる方法が頻用されている。しかしながら、アフィニティークロマトグラフィーに用いられるリガンド中には、一般的には複数の官能基があり、この複数の官能基が担体表面上の官能基に無秩序に結合する。そのため、従来のアフィニティークロマトグラフィーには、固定化したリガンドを十分に有効利用できないという問題があった。
特開平６－２８１６３８号公報
　本発明が解決しようとする課題は、アフィニティー担体の表面にタンパク質リガンドを効率的に固定化し、かつ固定化された該リガンドの目的物質に対する結合能を高い割合で保持させる方法を提供することである。
　一実施形態において、本発明は、
　アフィニティー担体であって、
　固相担体とタンパク質リガンドとを含み、
　該タンパク質リガンドは、下記式（１）：
　　Ｒ－Ｒ1　　　　　（１）
　（式（１）中、
　　Ｒは、該固相担体と結合するリンカーであって、ポリプロリンを含むリンカーを示し、
　　Ｒ1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
　　該Ｒは、該Ｒ1のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に結合している）
で表される、
アフィニティー担体、を提供する。
　好ましくは、前記ポリプロリンにおけるプロリンの数は３～３００である。
　好ましくは、前記リンカーの長さは０．９ｎｍ～９１ｎｍである。
　別の一実施形態において、本発明は、アフィニティー担体であって、
　固相担体とタンパク質リガンドとを含み、
　該タンパク質リガンドは、下記式（１）：
　　Ｒ－Ｒ1　　　　　（１）
　（式（１）中、
　　Ｒは、該固相担体と結合するリンカーであって、長さ０．９ｎｍ～９１ｎｍであるリンカーを示し、
　　Ｒ1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
　　該Ｒは、該Ｒ1のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に結合している）
で表される、
アフィニティー担体、を提供する。
　好ましくは、前記リンカーはポリプロリンを含む。
　好ましくは、前記ポリプロリンにおけるプロリンの数は３～３００である。
　本発明のアフィニティー担体の一実施形態において、前記リンカーは、前記固相担体と結合する末端に、アミノ基またはチオール基を有するアミノ酸残基を含む。
　本発明のアフィニティー担体の一実施形態において、前記イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質は、Ｆｃ結合性タンパク質、またはプロテインＡに由来するイムノグロブリン結合ドメインを含む。
　本発明のアフィニティー担体の一実施形態において、前記イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質は、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、配列番号３で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、および配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインからなる群より選択される少なくとも１つを含む。
　本発明のアフィニティー担体の一実施形態において、前記イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質は、前記イムノグロブリン結合ドメインを２個以上含む。
　本発明のアフィニティー担体の一実施形態において、前記固相担体はチオール基またはアミノ基と結合する反応性基を有する。
　本発明のアフィニティー担体の一実施形態において、前記反応性基はエポキシ基である。
　さらなる実施形態において、本発明は、上記アフィニティー担体を用いる、イムノグロブリンの単離方法を提供する。
　さらなる実施形態において、本発明は、上記アフィニティー担体を用いる、抗体医薬の製造方法を提供する。
　さらなる実施形態において、本発明は、
　リンカーＲとタンパク質リガンドＲ1とを含み、
　該リンカーＲはポリプロリンを含み、
　該Ｒ1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
　該Ｒは、該Ｒ1のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に結合している、
アフィニティーリガンド、を提供する。
　本発明のアフィニティー担体においては、特定のリンカーを介してリガンドタンパク質を担体に結合させることで、リガンドタンパク質を一定の配向性をもって担体に固定化させることができる。その結果、本発明のアフィニティー担体においては、リガンドと担体の無秩序な結合に起因するリガンドの変性や不適切な配向性を防止し、リガンドの目的物質に対する結合性を向上させることができる。したがって、本発明によれば、アフィニティーリガンドを効率的に担体表面に固定化することができ、かつ、固定化したリガンドが目的物質の精製に効率的に利用される。本発明のアフィニティー担体は、イムノグロブリンの結合容量が高く、イムノグロブリン精製のプロセスを低コストで実施することを可能にする。
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、およびその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の配列同一性は、リップマン－パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ―Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５－４１，１９８５）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ―Ｗｉｎ（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出される。
　本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列に関する「少なくとも７０％の同一性」とは、７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、さらにより好ましくは９５％以上の同一性、なお好ましくは９８％以上の同一性、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
　本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列またはヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基またはヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン－パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ　Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ２およびＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。
　本明細書において、「タンパク質」とは、ペプチド構造単位を有するあらゆる分子をいい、例えば、天然型タンパク質の部分的断片や天然型タンパク質のアミノ酸配列を人為的に改変した変異体を含む概念である。タンパク質は、糖鎖、脂質といった生体由来物質や、ポリエチレングリコールなどのポリマー等で修飾されていてもよい。
　本明細書において、プロテインＡとは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分であるプロテインＡをいう。
　本明細書において、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位をいう。本明細書における「イムノグロブリン結合」とは、イムノグロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域、特に少なくともＦｃフラグメントに結合することをいう。好ましくは、本明細書における「イムノグロブリン結合ドメイン」の例としては、Ｆｃ結合性タンパクおよびプロテインＡに由来するイムノグロブリン結合ドメインが挙げられる。該プロテインＡに由来するイムノグロブリン結合ドメインの例としては、プロテインＡのＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、およびＢドメインの改変型ドメインであるＺドメイン、ならびにそれらに由来する変異体が挙げられる。該変異体の例としては、上記Ａ～ＥおよびＺドメインのいずれかとアミノ酸配列において少なくとも７０％以上の同一性を有し、かつイムノグロブリン結合能を有するポリペプチドが挙げられる。
　本明細書において、「イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質」または「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、イムノグロブリン結合能を有するタンパク質をいう。好ましくは、上記「イムノグロブリン結合ドメイン」を少なくとも１つ、より好ましくは２つ以上含むタンパク質をいう。
１．アフィニティー担体
　本発明の一実施形態に係るアフィニティー担体は、固相担体とタンパク質リガンドとを含み、該タンパク質リガンドは、下記式（１）：
　　Ｒ－Ｒ1　　　　　（１）
　（式（１）中、
　　Ｒは、該固相担体と化学結合するリンカーを示し、
　　Ｒ1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
　　該Ｒは、該Ｒ1のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に結合している）
で表される。
　１．１．担体
　１．１．１．構成
　本発明のアフィニティー担体に含まれる上記固相担体は、好ましくは、水に対して不溶性の基材である。該固相担体の形状としては、粒子の形態であることができ、かかる粒子は多孔性でも非多孔性でもよい。粒子状の担体は充填ベッドとして使用することもできるし、懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には流動層（ｅｘｐａｎｄｅｄ　ｂｅｄ）および純然たる懸濁物として知られるものが包含され、該形態中では粒子が自由に運動できる。モノリス、充填床および流動層の場合、分離手順は一般に濃度勾配による従来のクロマトグラフィー法に従う。純然たる懸濁物の場合は、回分法が用いられる。好ましくは、本発明の担体は充填剤である。あるいは、該担体は、チップ、キャピラリーまたはフィルターのような形態であってもよい。また、固相担体として磁性粒子を用いてもよい。磁性粒子としては、磁気誘導により容易に磁化され得るものであれば特に制限はされず、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、三二酸化鉄（γ－Ｆｅ2Ｏ3）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属や、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる磁性体微粒子、又はこれらの磁性体を内部に含んだ疎水性重合体、親水性重合体などが挙げられる。好適な例としては、特開２００８－３２４１１号公報に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層が形成され、当該第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含む極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のアフィニティー担体は、アフィニティークロマトグラフィー用担体である。
　本発明の一実施形態において、上記固相担体は、好ましくは２０～２００μｍ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは２０～１００μｍ、さらに好ましくは３０～８０μｍ、担体が多糖の場合、より好ましくは５０～２００μｍ、さらに好ましくは６０～１５０μｍの粒径を有する。粒径が２０μｍ未満であると、高流速下でカラム圧力が高くなり、実用に耐えない。粒径が２００μｍを超えると、イムノグロブリンがアフィニティー担体に結合する量（結合容量）に劣る場合がある。なお、本明細書における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる体積平均粒径である。
　本発明の一実施形態において、上記固相担体は、好ましくは、多孔質であり、５０～１５０ｍ2／ｇ、より好ましくは、８０～１３０ｍ2／ｇの比表面積を有する。ここで、比表面積が５０ｍ2／ｇ未満であると、結合容量が劣る場合があり、一方、１５０ｍ2／ｇを超えると、担体の強度が劣るために高流速下で担体が破壊されて、カラム圧力が上昇する場合がある。なお、本明細書における「比表面積」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥重量で除した値である。
　本発明の一実施形態において、上記固相担体は、好ましくは、１００～１４００ｎｍ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは１００～４００ｎｍ、さらに好ましくは２００～３００ｎｍ、担体が多糖の場合、より好ましくは５００～１４００ｎｍ、さらに好ましくは８００～１２００ｎｍの体積平均細孔径を有する。ここで、体積平均細孔径が１００ｎｍ未満であると、高流速下の結合容量低下が顕著になる場合があり、一方、１４００ｎｍを超えると、流速にかかわらず結合容量が低下する場合がある。なお、本明細書における「体積平均細孔径」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の体積平均細孔径である。
　上記固相担体が上記範囲の粒径、比表面積、および細孔径分布を満たす場合、精製対象溶液の流路となる粒子間の隙間および粒子内の比較的大きな細孔径と、精製対象分子の結合表面積のバランスが最適化され、高流速下の結合容量が高いレベルに維持される。
　上記固相担体の材質としては、例えば、親水性表面を有するポリマーであり、例えば、外表面に（および存在する場合には内表面にも）ヒドロキシ基（－ＯＨ）、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、アミノカルボニル基（－ＣＯＮＨ2、またはＮ置換型）、アミノ基（－ＮＨ2、または置換型）、またはオリゴもしくはポリエチレンオキシ基を有するポリマーである。一実施形態において、該ポリマーは、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール系等の合成ポリマーであり得、好ましくは、多官能（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼン等の多官能モノマーで架橋された共重合体のような合成ポリマーである。かかる合成ポリマーは公知の方法により容易に製造される（例えば、Ｊ．ＭＡＴＥＲ．ＣＨＥＭ１９９１，１（３），３７１－３７４に記載の方法を参照されたい）。あるいは、トヨパール（東ソー社）のような市販品も使用される。他の実施形態におけるポリマーはデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロース等の多糖類である。かかる多糖類は公知の方法により容易に製造される（例えば特許第４０８１１４３号に記載の方法を参照されたい）。あるいは、セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のような市販品も使用される。その他の実施形態ではシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機担体であってもよい。
　本発明の一実施形態において、上記固相担体として使用される多孔性粒子の一具体例としては、例えば、２０～５０質量％の架橋性ビニル単量体と３～８０質量％のエポキシ基含有ビニル単量体、２０～８０質量％のジオール基含有ビニル単量体との共重合体を含有し、粒径が２０～８０μｍであり、比表面積が５０～１５０ｍ2／ｇであり、体積平均細孔径が１００～４００ｎｍである多孔性有機重合体粒子が挙げられる。
　なお、上記固相担体を水銀ポロシメーターで測定した場合の細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の浸入体積（細孔体積）は、好ましくは、１．３～７．０ｍＬ／ｇ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは１．３～２．５ｍＬ／ｇ、担体が多糖の場合、より好ましくは３．０～６．０ｍＬ／ｇである。
　１．１．２．リガンドとの結合
　上記固相担体へのリガンドの結合方法としては、タンパク質を担体に固定化する一般的方法を用いて行うことができる。固定化の手段としては、例えば、担体へのリガンドの物理的吸着、担体とリガンドとの化学的結合などが挙げられる。担体とリガンドとの化学的結合のための方法としては、共有結合が挙げられる。例えば、リガンドのリンカーは、そのカルボキシ基、アミノ基、水酸基またはチオール基を介して担体と共有結合する。さらに、共有結合のための反応性基を担体に導入してもよい。該反応性基としては、カルボキシ基、アミノ基、水酸基、マレイミド基、またはエポキシ基が好ましく、これらの中でも、温和な条件でリガンドとの反応が進行する点で、エポキシ基がより好ましい。担体へのリガンドの結合方法の具体例としては、カルボキシ基を有する担体を用い、このカルボキシ基をＮ－ヒドロキシコハク酸イミドにより活性化させリガンドのアミノ基と反応させる方法、アミノ基またはカルボキシ基を有する担体を用い、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤存在下でリガンドのカルボキシ基またはアミノ基と反応させアミド結合を形成する方法、水酸基を有する担体を用い、臭化シアンなどのハロゲン化シアンで活性化させてリガンドのアミノ基と反応させる方法、担体の水酸基をトシル化もしくはトレシル化しリガンドのアミノ基と反応させる方法、マレイミド基を有する担体を用い、リガンドのチオール基と反応させチオエーテル結合を形成する方法、ビスエポキシド、エピクロロヒドリンなどによりエポキシ基を担体に導入し、リガンドのアミノ基または水酸基またはチオール基と反応させる方法、およびエポキシ基を有する担体を用い、リガンドのアミノ基または水酸基またはチオール基と反応させる方法などが挙げられる。上記のうち、反応を実施する水溶液中での安定性の観点からは、エポキシ基を介してリガンドを導入する結合方法が望ましい。
　エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基であるアルコール性水酸基は、担体表面を親水化し、タンパク質などの非特異吸着を防止すると共に、水中で担体の靱性を向上させ、高流速下の担体の破壊を防止する役割を果たす。したがって、リガンドを固定化させた後の担体中にリガンドと結合していない残余のエポキシ基が存在している場合、当該残余のエポキシ基を開環させることが好ましい。担体中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中で、酸またはアルカリにより、加熱または室温下で該担体を撹拌する方法を挙げることができる。また、メルカプトエタノール、チオグリセロールなどのメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミンなどのアミノ基を有するブロッキング剤で、エポキシ基を開環させても良い。最も好ましい開環エポキシ基は、担体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる開環エポキシ基である。チオグリセロールは、原料としてメルカプトエタノールなどよりも毒性が低く、チオグリセロールが付加したエポキシ開環基は、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が低い上に、担体の動的結合量が高くなるといった利点を有する。
　１．２．リガンド
　１．２．１．リンカー
　本発明のアフィニティー担体に含まれるタンパク質リガンドは、リンカーＲとタンパク質リガンドＲ1とを含み、下記一般式（１）で表される。
　　Ｒ－Ｒ1　　　　　（１）
このタンパク質リガンドを、上述のように、例えば担体上のエポキシ基等と反応させることにより、担体にリガンドを固定化させることができる。
　上記式（１）中のリンカーＲは、その一端に固相担体の反応性官能基と反応する官能基を含むリンカーである。該リンカーは、後述するイムノグロブリンに親和性を示すタンパク質Ｒ1を担体に連結して固定化するために使用され得る。さらに該リンカーは、該Ｒ1を担体上に効率的に固定化するために用いられる一方で、該Ｒ1のイムノグロブリン親和性を実質的に維持するのに適している。すなわち、該リンカーを用いた場合、リンカーを使用しない場合と比べて、担体上に効率的に、例えば２５％以上効率的に、タンパク質Ｒ1を導入できる。また、該リンカーを用いて効率的に導入されたタンパク質Ｒ1は、担体上で、その活性、例えば、イムノグロブリン結合性を維持することができる。
　一実施形態において、上記リンカーＲは、好ましくは０．９ｎｍ～９１ｎｍ、より好ましくは１．８ｎｍ～１５．４ｎｍ、さらに好ましくは３．６ｎｍ～７．３ｎｍの長さを有する。ここで、リンカーの長さとは、該リンカーの三次元的な立体構造における、上記Ｒ1に結合する部位から上記固相担体に結合する部位までの距離をいう。一実施形態において、該リンカーはらせん構造を有し、該らせんの全長が上記長さを有する。
　好ましくは、上記リンカーＲは、少なくとも２つのプロリンを含むペプチドリンカーである。より好ましくは、該リンカーＲは、少なくとも２つのプロリンを含み、かつ側鎖にアミノ基またはチオール基を有するアミノ酸残基を含むポリペプチドである。さらに好ましくは、該リンカーＲは、少なくとも２つのプロリンを含み、かつ上記固相担体に結合する末端に、少なくとも１つ、より好ましくは１以上のシステイン（Ｃ）またはリジン残基（Ｋ）を有するポリペプチドである。リンカーＲがシステイン残基を複数含む場合、システイン間でジスルフィド結合が形成されないように考慮する必要があり、当該システイン間のジスルフィド結合の形成を回避するために、例えば、還元剤を使用することが好ましい。上記還元剤は、ジスルフィド結合を還元するものであれば特に制限はされず、例えば、２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、１－チオグリセロール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩などが挙げられる。
　好ましい実施形態において、上記リンカーＲは、少なくとも３つの連続するプロリン残基を有するポリプロリンを含む。該ポリプロリンに含まれるプロリン残基の数は、好ましくは３～３００個、より好ましくは６～５１個、さらに好ましくは１２～２４個である。ポリプロリンは、３つのプロリンを１単位とするポリプロリンへリックスを構成し得るので、上記リンカーＲは、好ましくは３～３００個、より好ましくは６～５１個、さらに好ましくは１２～２４個のプロリンからなるポリプロリンへリックスを含み得る。言い換えると、３つのプロリンによりポリプロリンヘリックス約１回転（本明細書において、１ピッチともいう）が形成されるので、上記リンカーＲは、好ましくは１～１００のピッチ数、より好ましくは２～１７のピッチ数、さらに好ましくは４～８のピッチ数を有するポリプロリンへリックスを含み得る。ただし、本発明において、該リンカーＲのポリプロリンへリックスのピッチ数は整数に限定されない。ポリプロリンへリックス１ピッチあたりの長さは約０．９ｎｍである（Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．，２００７，１２９（４）：８７３－８８０）。
　さらに好ましい実施形態において、上記リンカーＲは、ポリプロリンに加えて、プロリン以外のアミノ酸残基を１個または２個以上有していてもよい。好ましくは、該リンカーＲは、ポリプロリンと、上記固相担体と結合するリンカー末端との間に、プロリン以外のアミノ酸残基を１個または２個以上有しており、より好ましくは、ポリプロリンと、上記固相担体と結合するリンカー末端との間に、アミノ基またはチオール基を有するアミノ酸残基を１個または２個以上含んでいる。かかるプロリン以外のアミノ酸残基としては、１～３個のシステイン（Ｃ）またはリジン残基（Ｋ）が好ましい。好ましくは、リンカーＲは、該固相担体と結合する末端に少なくとも１つ、より好ましくは１～３個のシステイン（Ｃ）またはリジン残基（Ｋ）を含み、かつ３～３００個、より好ましくは６～５１個、さらに好ましくは１２～２４個のプロリンからなるポリプロリンを含むリンカーである。
　１．２．２．イムノグロブリン結合タンパク質
　上記式（１）中のＲ1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質（またはイムノグロブリン結合タンパク質）である。Ｒ1の例としては、イムノグロブリンＦｃ領域に結合するＦｃ結合性タンパク質、およびプロテインＡに由来するイムノグロブリン結合ドメインからなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むタンパク質が挙げられる。Ｒ1は、工業的に問題にならない限りにおいて、イムノグロブリン結合ドメインをいくつ含んでいてもよい。
　好ましくは、Ｒ1は、プロテインＡに由来するイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含む。より好ましくは、Ｒ1は、プロテインＡのＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、Ｚドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも１つのイムノグロブリン結合ドメインを含む。
　上記Ａ～ＥおよびＺドメインの変異体は、プロテインＡのＡ～ＥおよびＺドメインに対して、アミノ酸残基の付加、削除、置換または欠失や、アミノ酸残基の化学的修飾等の改変を施すことによって作製することができる。アミノ酸残基の付加、削除、置換または欠失の手段としては、上記ドメインをコードするポリヌクレオチドに対する部位特異的突然変異（Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｉｏｎ）等の公知の手段が挙げられる。
　好ましい一実施形態において、Ｒ1は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、および配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインからなる群より選択される少なくとも１つを含む。
　好ましい一実施形態において、Ｒ1は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、および配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインからなる群より選択される少なくとも１つを含む。
　好ましい一実施形態において、Ｒ1は、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、配列番号３で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、および配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインからなる群より選択される少なくとも１つを含む。
　好ましい一実施形態において、Ｒ1は、上記に挙げたイムノグロブリン結合ドメインを２個以上、より好ましくは２～１２個、さらに好ましくは３～８個含む。該イムノグロブリン結合ドメインの各々は、同じものでも異なるものであってもよい。好ましくは、該イムノグロブリン結合ドメインの各々は、そのＮ末端が、隣接するドメインのＣ末端に連結されている。各ドメインは、隣接するドメインと直接連結してもよく、または１～１０個のアミノ酸残基を有するペプチドを介して連結してもよい。
　別の一実施形態において、Ｒ1は、上記イムノグロブリン結合ドメインを１つ以上含んでいればよいが、イムノグロブリン結合容量やイムノグロブリン結合タンパク質の生産性の観点からは、Ｒ1のイムノグロブリン結合ドメイン数は、好ましくは１０以下であり、より好ましくは２以上８以下であり、さらに好ましくは４以上６以下である。
　好ましくは、Ｒ1に含まれるイムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列の１位に相当する位置にＶａｌ残基を有し、および／または、配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＡｌａ残基を有する。
　Ｒ1の好ましい例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列の１位ＡｌａをＶａｌに、２９位ＧｌｙをＡｌａに置換したアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインを４個含むポリペプチドである。
　Ｒ1の別の好ましい例としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号３の１位に相当する位置にＶａｌを、２９位に相当する位置にＡｌａを有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインを、３～８個含むポリペプチドが挙げられる。
　一般的なタンパク質リガンドにおいては、リンカーは、イムノグロブリン結合タンパク質の機能が実質的に保持されるように、その末端に結合もしくは融合され得る。したがって、上記リンカーＲは、好ましくは、上記イムノグロブリン結合タンパク質Ｒ1のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に結合される。あるいは、２つのリンカーＲが、Ｒ1のアミノ酸配列の両末端に各々結合されてもよく、またはリンカーＲは、Ｒ1のアミノ酸配列の末端残基ではないアミノ酸残基に結合されてもよい。
　１．２．３．リガンドの製造
　本発明のアフィニティー担体に含まれる、上記式（１）で示されるタンパク質リガンドＲ－Ｒ1は、上記リンカーＲと上記イムノグロブリン結合タンパク質Ｒ1とを含む融合ポリペプチドである。また上述したように、該タンパク質リガンドに含まれるＲ1は、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上、好ましくは２～１２個、より好ましくは３～８個含む融合ポリペプチドである。これらの融合ポリペプチドは、当該分野で公知のリコンビナント法により生成され得る。
　上記タンパク質リガンドを製造するための標準技術としては、例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．　ＡｕｓｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙやＳａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。すなわち、上記タンパク質リガンドをコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、得られた組換え体を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、目的のタンパク質リガンドを大量かつ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　２００１）などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、形質転換のための宿主としては、特に限定されないが、大腸菌などのバクテリア、真菌類、昆虫細胞、ほ乳類細胞等の組換えタンパク質を発現させるために用いられる公知の宿主を用いることができる。宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した組換え体（細菌等）を培養して発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られており、本発明の実施例にも例示されている。
　したがって、本発明はまた、上記式（１）で示されるタンパク質リガンドＲ－Ｒ1をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）、それを含むベクター、及びそれらを含む組換え体を提供する。
　上記リンカーＲと上記イムノグロブリン結合タンパク質Ｒ1とを結合または融合した融合ポリペプチドＲ－Ｒ1を得た後、それを上記固相担体に固定化することによって、本発明のアフィニティー担体を製造することができる。あるいは、上記リンカーＲを、上記イムノグロブリン結合タンパク質Ｒ1との結合より前に、化学的手段により、リコンビナント法により、または酵素を使用して、上記固相担体に結合し、次いで該リンカーＲにＲ1を結合してもよい。該リンカーＲの結合に適切な固相担体は、上記１．１で述べたとおりである。
　１．３．作用効果
　本発明の一実施形態に係るアフィニティー担体は、担体に固定化されたリガンド量が多く、かつ初期のＩｇＧ静的結合容量（ＳＢＣ）が高いことから、下記式に従って算出されるイムノグロブリン結合タンパク質の有効利用度Ｅ［％］が高い。　Ｅ［％］＝［（ＳＢＣ／抗体の分子量）／（イムノグロブリン結合タンパク質導入量／イムノグロブリン結合タンパク質の分子量）］×１００
　２．イムノグロブリンを単離する方法
　本発明の一実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法を説明する。本実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法は、上記式（１）で示されるタンパク質リガンドＲ－Ｒ1を固定化したアフィニティー担体に、イムノグロブリンを含有する試料を接触させ、該担体にイムノグロブリンを吸着させる工程（第一の工程）、および、該担体から該イムノグロブリンを溶出させる工程（第二の工程）を含み、好ましくは該第二の工程の後に、該担体をアルカリ性液で洗浄する工程（第三の工程）をさらに含む。本発明のイムノグロブリン単離方法に用いられる本発明のアフィニティー担体は、懸濁形態であってもよく、カラムに充填された状態であってもよく、あるいはチップ、キャピラリーまたはフィルターのような形態であってもよい。
　上記第一の工程では、上記アフィニティー担体を充填したカラム等にイムノグロブリンを含有する試料を、リガンドにイムノグロブリンが吸着する条件にて接触させる。この第一の工程では、試料中のイムノグロブリン以外の物質のほとんどは、リガンドに吸着されず担体上に残留しない。この後、必要に応じて、リガンドに弱く保持された一部の物質を除去するため、担体をＮａＣｌなどの塩を含む中性の緩衝液で洗浄してもよい。
　上記第二の工程では、ｐＨ２～５の適切な緩衝液を流し、リガンドに吸着されたイムノグロブリンを溶出させる。この溶出液を回収することで、試料からイムノグロブリンを単離することができる。
　本実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法においては、好ましくは、上記第二の工程に続いて第三の工程が行われる。第三の工程では、アルカリ性液で担体を洗浄（ＣＩＰ洗浄）する。第三の工程に使用されるアルカリ性液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、トリエチルアミン、水酸化テトラブチルアンモニウム等が挙げられる。
　本発明のアフィニティー担体は、上記第三の工程での洗浄後もイムノグロブリン結合能を安定に保持することができるので、本発明のイムノグロブリン単離方法に繰り返し使用することができる。
　本発明のイムノグロブリン単離方法の一実施形態において、単離すべきイムノグロブリンは、抗体またはそれを含む医薬であり得る。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明のアフィニティー担体を用いる抗体医薬の製造方法を提供する。当該方法の手順は、目的とする抗体医薬を含有する試料を用いる以外は、基本的に上述したイムノグロブリン単離方法の手順と同様である。
　以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
参考例１　多孔質粒子の合成
　グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）８．２ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）６５．９ｇおよびグリセリンモノメタクリレート（日油社製）９０．６ｇを２－オクタノン（東洋合成工業社製）２４５．８ｇおよびアセトフェノン（和光純薬工業社製）６２ｇに溶解させ、２，２'－アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）２ｇを添加し、有機モノマー溶液を調製した。
　次に、４２４０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製　ＰＶＡ－２１７）８．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製　エマール１０Ｇ）０．４３ｇおよび硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）２１．３ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液を調製した。
　次いで、得られた水溶液を７Ｌセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、撹拌翼、および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、６００ｒｐｍで撹拌を開始した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、水溶液の温度が８５℃になったところで、この水溶液に滴下ロートを用いて上記有機モノマー溶液を添加し、５時間撹拌を行った。
　次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液を５Ｌのポリプロピレン製ビンに移し、粒子が浮遊するまで静置し、下方から余分な水を吸い出して廃棄した。さらに、この反応液にアセトンを加えて粒子を沈降させた。次に、反応液を３分間静置して、デカンテーションによりアセトンを除去した。この操作を２回繰り返したのち水を加えて、粒子を沈降させた。さらに、３分間静置してデカンテーションを行った。この操作を２回繰り返して粒子を洗浄した。さらに、粒子の分散液をアセトンで再び置換して、一晩風乾したのち、真空乾燥機にて乾燥を行い、多孔質粒子（以下、ＰＢ１と記す）９０ｇを得た。ＰＢ１の光散乱方式による体積平均粒径は５３μｍ、水銀ポロシメーター測定によると比表面積は９５ｍ2／ｇであった。
比較例１
（１）組換え型イムノグロブリン結合タンパク質の調製
　リンカーなしのイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）をコードするプラスミドを化学合成により調製し、大腸菌ＢＬ２１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）に導入して形質転換した。形質転換した大腸菌を、吸光度（ＯＤ６００）が約１０に到達するまで３７℃でインキュベートし、次いで終濃度で１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、さらに４時間３７℃でインキュベートして、組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を発現させた。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ９．５のトリス緩衝液中でリゾチームを用いて破砕した。得られた組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を含む大腸菌破砕液から、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ－セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）および陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ－セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によって組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を精製した。精製したイムノグロブリン結合タンパク質を、１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．６に対して１６時間透析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認されたイムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。該イムノグロブリン結合タンパク質の理論分子量［ｋＤａ］を、ＥｘＰＡＣｙ（[ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｏｍｐｕｔｅ＿ｐｉ／]）を用いて求めた。
（２）担体へのイムノグロブリン結合タンパク質の固定化
　１５０μＬの純水に参考例１で調製したＰＢ１を８ｍｇ懸濁させ、フィルターチューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移し、遠心して純水を除いた。ここに（１）で調製した組換え型イムノグロブリン結合タンパク質１ｍｇを溶解した、０．８５Ｍ硫酸ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）４５０μＬを加え、２５℃で５時間振盪させ、イムノグロブリン結合タンパク質をＰＢ１に結合させた。生成した粒子を濾過した後、１Ｍチオグリセロール４５０μＬと混合し、２５℃で１６時間反応させて残余のエポキシ基をブロッキングし、０．５Ｍ　ＮａＯＨで洗浄後、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、最後にリン酸緩衝生理的食塩水（ＢｕｐＨTM Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ　ＰＢＳ、ＰＩＥＲＣＥ社）を４００μＬ加えて、イムノグロブリン結合タンパク質が固定化された多孔質粒子を分散させ、該粒子の懸濁液４００μＬを得た。
比較例２
　表１に示すシステインリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号５）をコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換したこと以外は、比較例１と同様の手順で組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子ＰＢ１に固定化した。
比較例３
　表１に示すポリリジンリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）をコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換したこと以外は、比較例１と同様の手順で組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子ＰＢ１に固定化した。
実施例１
　表１に示すポリプロリンリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号７）をコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換したこと以外は、比較例１と同様の手順で組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子ＰＢ１に固定化した。
実施例２
　表１に示すポリプロリンリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）をコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換したこと以外は、比較例１と同様の手順で組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子ＰＢ１に固定化した。
実施例３
　表１に示すポリプロリンリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）をコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換したこと以外は、比較例１と同様の手順で組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子ＰＢ１に固定化した。
実施例４
　表１に示すポリプロリンリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）をコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換したこと以外は、比較例１と同様の手順で、組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子ＰＢ１に固定化した。
　実施例５
　表１に示すポリプロリンリンカーを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１）をコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換したこと以外は、比較例１と同様の手順で、組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を調製し、次いでそれを多孔質粒子ＰＢ１に固定化した。
　比較例４
　参考例１で調製した粒子ＰＢ１に対して、過剰量のチオグリセロールを作用させてエポキシ基を開環させたのち、１，４－ビス（２，３－エポキシプロポキシ）ブタン（ＢＤＤＧＥ）（炭素数１０）を表面水酸基と等モル量作用させて、炭素鎖のリンカーを導入した。この粒子をＰＢ２とした。８ｍｇのＰＢ２について、比較例１と実質的に同様に組換え型イムノグロブリン結合タンパク質（配列番号４）を固定化し、該粒子の懸濁液４００μＬを得た。
比較例５
　参考例１で調製した粒子ＰＢ１に対して、過剰量のチオグリセロールを作用させてエポキシ基を開環させたのち、１，２－ビス（２，３－エポキシプロポキシ）エタン（ＥＧＤＧ）（炭素数８）を表面水酸基と等モル量作用させて、炭素鎖のリンカーを導入した。この粒子をＰＢ３とした。８ｍｇのＰＢ３について、比較例１と実質的に同様に組換え型イムノグロブリン結合タンパク質（配列番号４）を固定化し、該粒子の懸濁液４００μＬを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
試験例１（リガンド結合量の測定）
　実施例１～５および比較例１～５の粒子懸濁液４００μＬから５０μＬを分取し、ＢＣＡ　Ａｓｓｙキット（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて、該粒子に結合したイムノグロブリン結合タンパク質の量をそれぞれ測定し、比較例１の結合量を１００とした相対値を求めた。
試験例２（イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）静的結合容量の測定）
　実施例１～５および比較例１～５の粒子懸濁液４００μＬから１５０μＬを分取し、それぞれフィルターチューブ（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ社）に投入し、これに５ｍｇのＩｇＧを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．５を３００μＬ投入し、１時間２５度で振盪させてＩｇＧを該粒子に吸着させた。遠心後、ｐＨ７．５の０．１Ｍリン酸緩衝液４５０μＬを用いて該粒子を洗浄し、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．２を用いて該粒子に吸着したＩｇＧを溶出させ、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度から該粒子のＩｇＧの静的結合容量（ＳＢＣ）を測定した。
試験例３　イムノグロブリン結合タンパク質の利用効率
　試験例１および試験例２で測定したリガンド結合量とＳＢＣの値から、下記式に従って、実施例１～５および比較例１～５の多孔質粒子におけるイムノグロブリン結合タンパク質の有効利用度Ｅ［％］を、下記式に従って算出した。
　Ｅ［％］＝[（ＳＢＣ／抗体の分子量）／（イムノグロブリン結合タンパク質導入量／イムノグロブリン結合タンパク質の分子量）]×１００
　試験例１～３の結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例１～５で調製したポリプロリンリンカーを含むイムノグロブリンタンパク質が固定化された粒子は、リガンド結合量およびＳＢＣが比較例１～３に比べて向上した。さらに、ポリプロリンの長さがより長くなると、ＳＢＣがより向上し、利用効率Ｅ［％］もより高くなる傾向があった。さらに、実施例４～５に示されるとおり、リンカーと担体との結合に使用される官能基がリジン由来のアミノ基でもシステイン由来のチオール基でも、実質的に同程度の導入量が得られた。一方で、比較例５～６に示されるとおり、炭素鎖リンカーは、リガンド結合量およびＳＢＣ向上には何ら貢献しなかった。
　本発明の実施形態に係る説明は以上である。しかしながら、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明のさらなる種々の変形が可能である。また本発明は、上記で説明した実施形態の構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、上記で説明した実施形態の構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、上記で説明した実施形態の構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、上記で説明した実施形態の構成に公知技術を付加した構成を含む。

Claims (15)

  1. 　アフィニティー担体であって、
    　固相担体とタンパク質リガンドとを含み、
    　該タンパク質リガンドは、下記式（１）：
    　　Ｒ－Ｒ1　　　　　（１）
    　（式（１）中、
    　　Ｒは、該固相担体と結合するリンカーであって、ポリプロリンを含むリンカーを示し、
    　　Ｒ1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
    　　該Ｒは、該Ｒ1のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に結合している）
    で表される、
    アフィニティー担体。
  2. 　前記ポリプロリンにおけるプロリンの数が３～３００である、請求項１記載のアフィニティー担体。
  3. 　前記リンカーの長さが０．９ｎｍ～９１ｎｍである、請求項１又は２記載のアフィニティー担体。
  4. 　アフィニティー担体であって、
    　固相担体とタンパク質リガンドとを含み、
    　該タンパク質リガンドは、下記式（１）：
    　　Ｒ－Ｒ1　　　　　（１）
    　（式（１）中、
    　　Ｒは、該固相担体と結合するリンカーであって、長さ０．９ｎｍ～９１ｎｍであるリンカーを示し、
    　　Ｒ1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
    　　該Ｒは、該Ｒ1のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に結合している）
    で表される、
    アフィニティー担体。
  5. 　前記リンカーがポリプロリンを含む、請求項４記載のアフィニティー担体。
  6. 　前記ポリプロリンにおけるプロリンの数が３～３００である、請求項５記載のアフィニティー担体。
  7. 　前記リンカーが、前記固相担体と結合する末端に、アミノ基またはチオール基を有するアミノ酸残基を含む、請求項１～６のいずれか１項記載のアフィニティー担体。
  8. 　前記イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質が、Ｆｃ結合性タンパク質、またはプロテインＡに由来するイムノグロブリン結合ドメインを含む、請求項１～７のいずれか１項記載のアフィニティー担体。
  9. 　前記イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質が、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、配列番号３で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、および配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインからなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１～８のいずれか１項記載のアフィニティー担体。
  10. 　前記イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質が、前記イムノグロブリン結合ドメインを２個以上含む、請求項８又は９記載のアフィニティー担体。
  11. 　前記固相担体がチオール基またはアミノ基と結合する反応性基を有する、請求項１～１０のいずれか１項記載のアフィニティー担体。
  12. 　前記反応性基がエポキシ基である、請求項１１記載のアフィニティー担体。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項記載のアフィニティー担体を用いる、イムノグロブリンの単離方法。
  14. 　請求項１～１２のいずれか１項記載のアフィニティー担体を用いる、抗体医薬の製造方法。
  15. 　リンカーＲとタンパク質リガンドＲ1とを含み、
    　リンカーＲはポリプロリンを含み、
    　Ｒ1は、イムノグロブリンに親和性を示すタンパク質を示し、
    　該Ｒは、該Ｒ1のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に結合している、
    アフィニティーリガンド。
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