CN107923889A - 亲和载体和将免疫球蛋白分离的方法 - Google Patents

亲和载体和将免疫球蛋白分离的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供与配体目标物质的结合性提高的亲和载体。所述亲和载体含有固相载体和蛋白质配体，该蛋白质配体由式(1)：R－R1表示(式(1)中，R表示与该固相载体化学键合且含有聚脯氨酸的连接子，R1表示对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质，该R键合于该R1的氨基酸序列的C末端或N末端)。

Description

亲和载体和将免疫球蛋白分离的方法
技术领域
本发明涉及亲和载体和将免疫球蛋白分离的方法。特别是涉及能够提高亲和载体的免疫球蛋白纯化效率的配体对载体的固定化方法。
背景技术
亲和色谱是使用填充有配体固定化载体的色谱柱的色谱，所述配体固定化载体是将与要分离或纯化的物质特异性结合的物质(配体)固定化于不溶性载体而成的。亲和色谱被用于例如蛋白质、核酸等生物相关物质的分离·纯化(专利文献1)。作为亲和色谱用载体，例如可使用以琼脂糖凝胶为代表的糖链的交联粒子、以合成聚合物为主成分的粒子。
在亲和色谱中，需要将与目标物质特异性作用的物质即配体固定化于载体。配体对载体的固定化经常使用如下方法：对存在于载体表面的各种官能团，介由配体侧的官能团使配体与载体化学键合。然而，在亲和色谱所使用的配体中，一般而言有多个官能团，该多个官能团与载体表面上的官能团无序地键合。因此，现有的亲和色谱存在无法充分地有效利用已固定化的配体这样的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平6－281638号公报
发明内容
本发明所要解决的课题在于提供将蛋白质配体有效地固定化于亲和载体的表面且以高的比例保持固定化后的该配体对目标物质的结合能力的方法。
在一个实施方式中，本发明提供一种亲和载体，含有固相载体和蛋白质配体，
该蛋白质配体由下述式(1)表示，
R－R1 (1)
(式(1)中，
R表示与该固相载体键合且含有聚脯氨酸的连接子，
R1表示对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质，
该R键合于该R1的氨基酸序列的C末端或N末端)。
优选所述聚脯氨酸中的脯氨酸的数量为3～300。
优选所述连接子的长度为0.9nm～91nm。
在另一个实施方式中，本发明提供一种亲和载体，含有固相载体和蛋白质配体，
该蛋白质配体由下述式(1)表示，
R－R1 (1)
(式(1)中，
R表示与该固相载体键合且长度为0.9nm～91nm的连接子，
R1表示对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质，
该R键合于该R1的氨基酸序列的C末端或N末端)。
优选所述连接子含有聚脯氨酸。
优选所述聚脯氨酸中的脯氨酸的数量为3～300。
在本发明的亲和载体的一个实施方式中，所述连接子在与所述固相载体键合的末端含有具有氨基或硫醇基的氨基酸残基。
在本发明的亲和载体的一个实施方式中，所述对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质含有来自Fc结合性蛋白质或蛋白A的免疫球蛋白结合结构域。
在本发明的亲和载体的一个实施方式中，所述对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质含有选自由序列号3所示的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域、由序列号3所示的氨基酸序列的部分序列构成的免疫球蛋白结合结构域以及由与序列号3所示的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域中的至少1个。
在本发明的亲和载体的一个实施方式中，所述对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质含有2个以上的所述免疫球蛋白结合结构域。
在本发明的亲和载体的一个实施方式中，所述固相载体具有与硫醇基或氨基进行键合的反应性基团。
在本发明的亲和载体的一个实施方式中，所述反应性基团为环氧基。
在进一步的实施方式中，本发明提供免疫球蛋白的分离方法，使用上述亲和载体。
在进一步的实施方式中，本发明提供抗体医药品的制造方法，使用上述亲和载体。
在进一步的实施方式中，本发明提供一种亲和配体，含有连接子R和蛋白质配体R1，
该连接子R含有聚脯氨酸，
该R1表示对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质，
该R键合于该R1的氨基酸序列的C末端或N末端。
在本发明的亲和载体中，通过介由特定的连接子使配体蛋白质键合于载体，能够以一定的取向性使配体蛋白质固定化于载体。其结果，在本发明的亲和载体中，能够防止因配体与载体的无序键合所致的配体的变性、不适当的取向性，提高配体对目标物质的结合性。因此，根据本发明，能够将亲和配体有效地固定化于载体表面，并且固定化后的配体被有效地用于目标物质的纯化。本发明的亲和载体的免疫球蛋白的结合容量高，能够以低成本实施免疫球蛋白纯化的工艺。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有专利文献、非专利文献以及其它刊物其整体在本说明书中作为参考被引用。
在本说明书中，氨基酸序列和核苷酸序列的序列同源性通过李普曼-皮尔森法(Lipman-Pearson法；Science，227，1435－41，1985)进行计算。具体而言，通过使用遗传信息处理软件Genetyx-Win(Ver.5.1.1；软件开发)的同源性解析(Search homology)程序，将进行比较的单位大小(ktup)作为2进行解析而算出。
在本说明书中，关于氨基酸序列和核苷酸序列的“至少70％的同源性”是指70％以上的同源性、优选80％以上的同源性、更优选85％以上的同源性、进一步优选90％以上的同源性、进一步更优选95％以上的同源性、再进一步优选98％以上的同源性、再进一步优选99％以上的同源性。
在本说明书中，氨基酸序列和核苷酸序列上的“相当的位置”可以通过将目标序列和参照序列(例如，序列号3所示的氨基酸序列)以对各氨基酸序列或核苷酸序列中存在的保守氨基酸残基或核苷酸赋予最大的同源性的方式排列(alignment，比对)来决定。比对可以使用公知的算法执行，其顺序是本领域技术人员公知的。例如，比对也可以基于上述的李普曼-皮尔森法等通过手动进行，但可以通过以默认设定使用Clustal W多重序列比对程序(Thompson，J.D.et al，1994，Nucleic Acids Res.，22：4673－4680)来进行。或者也可以使用作为Clustal W的修订版的Clustal W2、Clustal omega。Clustal W、Clustal W2和Clustal omega例如可以在欧州生物信息研究所(European Bioinformatics Institute：EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])或国立遗传学研究所经营的日本DNA数据库(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome－j.html])的网站上利用。
在本说明书中，“蛋白质”是指具有肽结构单元的所有分子，例如是包含天然型蛋白质的部分片段、将天然型蛋白质的氨基酸序列进行人工改性而成的变异体的概念。蛋白质可以用糖链、脂质之类的来自生物体的物质、聚乙二醇等聚合物等进行修饰。
在本说明书中，蛋白A是指作为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁成分的蛋白A。
在本说明书中，“免疫球蛋白结合结构域”是指单独具有免疫球蛋白结合活性的多肽的功能单位。本说明书中的“免疫球蛋白结合”是指与免疫球蛋白分子的互补性决定区(CDR)以外的区域结合、特别是至少与Fc片段结合。优选的是，作为本说明书中的“免疫球蛋白结合结构域”的例子，可以举出来自Fc结合性蛋白质和蛋白A的免疫球蛋白结合结构域。作为来自该蛋白A的免疫球蛋白结合结构域的例子，可以举出蛋白A的A结构域、B结构域、C结构域、D结构域、E结构域和作为B结构域的改性型结构域的Z结构域以及来自它们的变异体。作为该变异体的例子，可以举出与上述A～E和Z结构域中的任一者在氨基酸序列中具有至少70％以上同源性且具有免疫球蛋白结合能力的多肽。
在本说明书中，“对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质”或“免疫球蛋白结合蛋白质”是指对免疫球蛋白具有特异性的亲和性且具有免疫球蛋白结合能力的蛋白质。优选含有至少1个上述“免疫球蛋白结合结构域”的蛋白质，更优选含有2个以上上述“免疫球蛋白结合结构域”的蛋白质。
1.亲和载体
本发明的一个实施方式涉及的亲和载体含有固相载体和蛋白质配体，该蛋白质配体由下述式(1)表示。
R－R1 (1)
(式(1)中，
R表示与该固相载体化学键合的连接子，
R1表示对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质，
该R键合于该R1的氨基酸序列的C末端或N末端)
1.1.载体
1.1.1.构成
本发明的亲和载体中所含的上述固相载体优选为不溶于水的基材。作为该固相载体的形状，可以为粒子的形态，该粒子可以为多孔性，也可以为非多孔性。粒子状的载体可以作为填充床使用，也可以以悬浮形态使用。悬浮形态包含作为流动层(expanded bed，膨胀床)以及纯粹悬浮物所熟知的悬浮形态，在该形态中，粒子可以自由地运动。在整体式、填充床和流动层的情况下，分离顺序一般按照利用了浓度梯度的现有色谱法。在纯粹悬浮物的情况下，使用分批法。优选本发明的载体为填充剂。或者，该载体可以为片、毛细管或过滤器这样的形态。另外，也可以使用磁性粒子作为固相载体。作为磁性粒子，只要是可通过磁感应而容易被磁化的物质就没有特别限制，例如可以举出四氧化三铁(Fe3O4)、三氧化二铁(γ－Fe2O3)、各种铁氧体、铁、锰、镍、钴、铬等金属、由钴、镍、锰等的合金构成的磁性体微粒或在内部含有这些磁性体的疏水性聚合物、亲水性聚合物等。作为合适的例子，可以举出日本特开2008－32411号公报中记载的以下磁性粒子：在含有超顺磁性微粒的母粒子的表面形成疏水性的第1聚合物层，在该第1聚合物层上形成至少在表面具有缩水甘油基的第2聚合物层，通过对该缩水甘油基进行化学修饰从而导入极性基团，该极性基团含有1个以上选自氧原子、氮原子和硫原子中的至少1种原子。在优选的实施方式中，本发明的亲和载体为亲和色谱用载体。
在本发明的一个实施方式中，上述固相载体优选具有20～200μm的粒径，载体为合成聚合物时，更优选具有20～100μm的粒径，进一步优选具有30～80μm的粒径，载体为多糖时，更优选具有50～200μm的粒径，进一步优选具有60～150μm的粒径。如果粒径小于20μm，则高流速下柱压变高，不耐实用。如果粒径大于200μm，则有时免疫球蛋白结合于亲和载体的量(结合容量)差。应予说明，本说明书中的“粒径”是指利用激光衍射散射式粒度分布测定装置得到的体积平均粒径。
在本发明的一个实施方式中，上述固相载体优选为多孔，具有50～150m2/g、更优选80～130m2/g的比表面积。在此，如果比表面积小于50m2/g，则有时结合容量差，另一方面，如果大于150m2/g，则有时由于载体的强度差而在高流速下载体被破坏，柱压力上升。应予说明，本说明书中的“比表面积”是指利用压汞仪得到的具有细孔径10～5000nm的细孔的表面积除以粒子的干燥重量而得到的值。
在本发明的一个实施方式中，上述固相载体优选具有100～1400nm的体积平均细孔径，载体为合成聚合物时，更优选具有100～400nm的体积平均细孔径、进一步优选具有200～300nm的体积平均细孔径，载体为多糖时，更优选具有500～1400nm的体积平均细孔径、进一步优选具有800～1200nm的体积平均细孔径。在此，如果体积平均细孔径小于100nm，则有时高流速下的结合容量降低变得显著，另一方面，如果大于1400nm，则有时不论流速如何结合容量均降低。应予说明，本说明书中的“体积平均细孔径”是指利用压汞仪得到的细孔径10～5000nm的细孔的体积平均细孔径。
上述固相载体满足上述范围的粒径、比表面积和细孔径分布时，成为纯化对象溶液流路的粒子间的间隙和粒子内的较大的细孔径与纯化对象分子的结合表面积的平衡达到最佳化，高流速下的结合容量维持在高的水平。
作为上述固相载体的材质，例如为具有亲水性表面的聚合物，例如在外表面(以及存在的情况下也在内表面)具有羟基(－OH)、羧基(－COOH)、氨基羰基(－CONH2或N取代型)、氨基(－NH2或取代型)、或者低聚乙烯氧基或聚乙烯氧基的聚合物。在一个实施方式中，该聚合物可以为聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇系等合成聚合物，优选为利用多官能(甲基)丙烯酸酯、二乙烯基苯等多官能单体进行交联而成的共聚物这样的合成聚合物。该合成聚合物可通过公知的方法而容易地制造(例如，参照J.MATER.CHEM1991，1(3)，371－374中记载的方法)。或者，也可以使用Toyopearl(东曹公司)这样的市售品。其它实施方式中的聚合物为葡聚糖、淀粉、纤维素、普鲁兰多糖、琼脂糖等多糖类。该多糖类可通过公知的方法而容易地制造(例如参照日本专利第4081143号中记载的方法)。或者，也可以使用Sepharose(GE Healthcare Biosciences社)这样的市售品。在其它实施方式中，也可以为二氧化硅、氧化锆等无机载体。
在本发明的一个实施方式中，作为用作上述固相载体的多孔性粒子的一个具体例，例如可以举出含有20～50质量％的交联性乙烯基单体与3～80质量％的含环氧基乙烯基单体、20～80质量％的含二醇基乙烯基单体的共聚物且粒径为20～80μm、比表面积为50～150m2/g、体积平均细孔径为100～400nm的多孔性有机聚合物粒子。
应予说明，利用压汞仪对上述固相载体测定时的细孔径10～5000nm的细孔的浸入体积(细孔体积)优选为1.3～7.0mL/g，载体为合成聚合物时，更优选为1.3～2.5mL/g，载体为多糖时，更优选为3.0～6.0mL/g。
1.1.2.与配体的键合
作为配体对上述固相载体的键合方法，可以使用将蛋白质固定化于载体的一般方法来进行。作为固定化的方法，例如可以举出配体对载体的物理性吸附、载体与配体的化学键合等。作为载体与配体的化学键合的方法，可以举出共价键合。例如，配体的连接子介由它的羧基、氨基、羟基或硫醇基与载体共价键合。进而，也可以将用于共价键合的反应性基团导入载体。作为该反应性基团，优选羧基、氨基、羟基、马来酰亚胺基或环氧基，这些反应性基团中，从在温和的条件下进行与配体的反应这方面考虑，更优选环氧基。作为配体对载体的键合方法的具体例，可以举出使用具有羧基的载体，利用N－羟基琥珀酸酰亚胺使该羧基活化而与配体的氨基反应的方法；使用具有氨基或羧基的载体，在水溶性碳二亚胺等脱水缩合剂存在下与配体的羧基或氨基反应而形成酰胺键的方法；使用具有羟基的载体，用溴化氰等卤化氰使其活化而与配体的氨基反应的方法；将载体的羟基进行甲苯磺酰化或三氟乙磺酰化而与配体的氨基反应的方法；使用具有马来酰亚胺基的载体，与配体的硫醇基反应而形成硫醚键的方法；利用双环氧化物、表氯醇等将环氧基导入载体，与配体的氨基或羟基或硫醇基反应的方法；以及使用具有环氧基的载体，与配体的氨基或羟基或硫醇基反应的方法等。上述中，从在实施反应的水溶液中的稳定性的观点考虑，优选经由环氧基导入配体的键合方法。
环氧基开环而生成的开环环氧基即醇性羟基发挥如下作用：将载体表面亲水化而防止蛋白质等的非特异吸附，并且在水中提高载体的韧性，防止高流速下的载体的破坏。因此，在使配体固定化后载体中存在未与配体键合的剩余环氧基时，优选使该剩余环氧基开环。作为载体中的环氧基的开环方法，例如可以举出在水溶剂中利用酸或碱在加热或室温下搅拌该载体的方法。另外，也可以利用巯基乙醇、硫代甘油等具有巯基的封端剂、单乙醇胺等具有氨基的封端剂使环氧基开环。最优选的开环环氧基为利用硫代甘油使载体中所含的环氧基开环而得到的开环环氧基。硫代甘油具有如下优点：作为原料与巯基乙醇等相比毒性低，加成了硫代甘油的环氧开环基与利用具有氨基的封端剂而得的开环基相比，非特异吸附低并且载体的动态结合量变高。
1.2.配体
1.2.1.连接子
本发明的亲和载体中所含的蛋白质配体含有连接子R和蛋白质配体R1，由下述通式(1)表示。
R－R1 (1)
如上所述可以通过使该蛋白质配体与例如载体上的环氧基等反应而使配体固定化于载体。
上述式(1)中的连接子R为在其一端含有与固相载体的反应性官能团进行反应的官能团的连接子。该连接子可以用于将后述的对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质R1与载体连接并固定化。另外，该连接子用于将该R1有效地固定化于载体上，另一方面，适于实质上维持该R1的免疫球蛋白亲和性。即，使用该连接子时，与未使用连接子的情况相比，能够在载体上有效地例如25％以上有效地导入蛋白质R1。另外，使用该连接子有效导入了的蛋白质R1能够在载体上维持其活性、例如免疫球蛋白结合性。
在一个实施方式中，上述连接子R优选具有0.9nm～91nm的长度、更优选具有1.8nm～15.4nm的长度、进一步优选3.6nm～7.3nm的长度。在此，连接子的长度是指该连接子的三维立体结构中的从与上述R1键合的部位到与上述固相载体键合的部位为止的距离。在一个实施方式中，该连接子具有螺旋结构，该螺旋的总长度具有上述长度。
优选上述连接子R为含有至少2个脯氨酸的肽连接子。更优选该连接子R为含有至少2个脯氨酸且含有在侧链具有氨基或硫醇基的氨基酸残基的多肽。进一步优选该连接子R为含有至少2个脯氨酸且在与上述固相载体键合的末端具有至少1个、更优选1个以上的半胱氨酸(C)或赖氨酸残基(K)的多肽。连接子R含有多个半胱氨酸残基时，需要考虑在半胱氨酸间不会形成二硫键，为了避免该半胱氨酸间的二硫键的形成，例如优选使用还原剂。上述还原剂只要是将二硫键还原的还原剂就没有特别限制，例如可以举出2－巯基乙醇、二硫苏糖醇、1－硫代甘油、三(2－羧基乙基)膦盐酸盐等。
在优选的实施方式中，上述连接子R含有具有至少3个连续的脯氨酸残基的聚脯氨酸。该聚脯氨酸中所含的脯氨酸残基的数量优选为3～300个，更优选为6～51个，进一步优选为12～24个。聚脯氨酸由于可构成以3个脯氨酸为1个单位的聚脯氨酸螺旋，因此，上述连接子R可含有由优选3～300个、更优选6～51个、进一步优选12～24个脯氨酸构成的聚脯氨酸螺旋。换言之，由3个脯氨酸形成约1圈(在本说明书中，也称为1螺距)聚脯氨酸螺旋，因此，上述连接子R可含有优选具有1～100的螺距数、更优选具有2～17的螺距数、进一步优选具有4～8的螺距数的聚脯氨酸螺旋。但是，在本发明中，该连接子R的聚脯氨酸螺旋的螺距数并不限定于整数。聚脯氨酸螺旋每1螺距的长度约为0.9nm(J.AM.CHEM.SOC.，2007，129(4)：873－880)。
在进一步优选的实施方式中，上述连接子R除聚脯氨酸以外，还可以具有1个或2个以上的脯氨酸以外的氨基酸残基。优选该连接子R在聚脯氨酸与跟上述固相载体键合的连接子末端之间具有1个或2个以上的脯氨酸以外的氨基酸残基，更优选在聚脯氨酸与跟上述固相载体键合的连接子末端之间含有1个或2个以上的具有氨基或硫醇基的氨基酸残基。作为该脯氨酸以外的氨基酸残基，优选1～3个半胱氨酸(C)或赖氨酸残基(K)。优选连接子R为在跟该固相载体键合的末端含有至少1个、更优选1～3个半胱氨酸(C)或赖氨酸残基(K)且含有由3～300个、更优选6～51个、进一步优选12～24个脯氨酸构成的聚脯氨酸的连接子。
1.2.2.免疫球蛋白结合蛋白质
上述式(1)中的R1为对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质(或免疫球蛋白结合蛋白质)。作为R1的例子，可以举出结合于免疫球蛋白Fc区域的Fc结合性蛋白质以及含有至少1个选自来自蛋白A的免疫球蛋白结合结构域中的免疫球蛋白结合结构域的蛋白质。R1只要工业上没有问题，则含有几个免疫球蛋白结合结构域均可。
优选R1含有至少1个来自蛋白A的免疫球蛋白结合结构域。更优选R1含有选自蛋白A的A结构域、B结构域、C结构域、D结构域、E结构域、Z结构域和它们的变异体中的至少1个免疫球蛋白结合结构域。
上述A～E和Z结构域的变异体可通过对蛋白A的A～E和Z结构域实施氨基酸残基的附加、删除、取代或缺失、氨基酸残基的化学修饰等改性而制作。作为氨基酸残基的附加、删除、取代或缺失的方法，可以举出针对编码上述结构域的多核苷酸的部位特异性突变(Site－specific mutaion)等公知的方法。
在优选的一个实施方式中，R1含有选自由序列号1所示的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域、由序列号1所示的氨基酸序列的部分序列构成的免疫球蛋白结合结构域以及由与序列号1所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域中的至少1个。
在优选的一个实施方式中，R1含有选自由序列号2所示的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域、由序列号2所示的氨基酸序列的部分序列构成的免疫球蛋白结合结构域以及由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域中的至少1个。
在优选的一个实施方式中，R1含有选自由序列号3所示的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域、由序列号3所示的氨基酸序列的部分序列构成的免疫球蛋白结合结构域以及由与序列号3所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域中的至少1个。
在优选的一个实施方式中，R1含有2个以上、更优选2～12个、进一步优选3～8个的上述举出的免疫球蛋白结合结构域。该免疫球蛋白结合结构域各自可以相同，也可以不同。优选该免疫球蛋白结合结构域各自其N末端与邻接的结构域的C末端连接。各结构域可以与邻接的结构域直接连接，或者也可以介由具有1～10个氨基酸残基的肽进行连接。
在另一个实施方式中，虽然R1只要含有1个以上的上述免疫球蛋白结合结构域即可，但从免疫球蛋白结合容量、免疫球蛋白结合蛋白质的生产率的观点考虑，R1的免疫球蛋白结合结构域数优选为10以下，更优选为2～8，进一步优选为4～6。
优选R1中所含的免疫球蛋白结合结构域在相当于序列号1～3中任一者所示的氨基酸序列的1位的位置具有Val残基和/或在相当于序列号1～3中任一者所示的氨基酸序列的29位的位置具有Ala残基。
作为R1的优选的例子，可以举出由序列号4所示的氨基酸序列构成的多肽。序列号4所示的氨基酸序列为含有4个免疫球蛋白结合结构域的多肽，该免疫球蛋白结合结构域由将序列号3所示的氨基酸序列的1位Ala取代为Val、将29位Gly取代为Ala的氨基酸序列构成。
作为R1的另一优选的例子，可以举出含有3～8个免疫球蛋白结合结构域的多肽，该免疫球蛋白结合结构域由与序列号3所示的氨基酸序列具有至少70％同源性且在相当于序列号3的1位的位置具有Val、在相当于29位的位置具有Ala的氨基酸序列构成。
在一般的蛋白质配体中，连接子能够以实质上保持免疫球蛋白结合蛋白质的功能的方式键合或融合于其末端。因此，上述连接子R优选键合于上述免疫球蛋白结合蛋白质R1的氨基酸序列的C末端或N末端。或者，2个连接子R可以分别键合于R1的氨基酸序列的两末端，或者连接子R可以键合于不是R1的氨基酸序列的末端残基的氨基酸残基。
1.2.3.配体的制造
本发明的亲和载体中所含的上述式(1)所示的蛋白质配体R－R1为含有上述连接子R和上述免疫球蛋白结合蛋白质R1的融合多肽。另外，如上所述，该蛋白质配体中所含的R1为含有1个以上、优选2～12个、更优选3～8个免疫球蛋白结合结构域的融合多肽。这些融合多肽可以通过本领域中公知的重组法而生成。
作为用于制造上述蛋白质配体的标准技术，例如可以利用Frederick M.Ausbel等的Current Protocols In Molecular Biology、Sambrook等编辑的Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press，3rd edition，2001)等中记载的公知的基因重组技术。即，将含有编码上述蛋白质配体的核酸序列的表达载体转化至大肠杆菌等宿主，将得到的重组体在适当的液体培养基中进行培养，由此能够从培养后的细胞大量且经济地获得目标蛋白质配体。作为优选的表达载体，能够在宿主细胞内复制的已知的载体均可以使用，例如可以举出美国专利第5151350号说明书中记载的质粒、Sambrook等编辑的Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press，3rd edition，2001)等中记载的质粒。另外，作为用于转化的宿主，没有特别限定，可以使用大肠杆菌等细菌、真菌类、昆虫细胞、哺乳类细胞等为了表达重组蛋白质而使用的公知的宿主。为了向宿主中导入核酸而将宿主转化，可以根据各宿主而使用该技术领域中已知的任一方法，例如，可以利用Sambrook等编辑的Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press，3rdedition，2001)等中记载的公知的方法。对转化的重组体(细菌等)进行培养而回收表达的蛋白质的方法是本领域技术人员熟知的，在本发明的实施例中也有例示。
因此，本发明还提供编码上述式(1)所示的蛋白质配体R－R1的多核苷酸(DNA等)、含有其的载体以及含有它们的重组体。
得到将上述连接子R与上述免疫球蛋白结合蛋白质R1键合或融合而成的融合多肽R－R1后，将其固定化于上述固相载体，由此能够制造本发明的亲和载体。或者，可以在将上述连接子R与上述免疫球蛋白结合蛋白质R1键合之前，通过化学方法、通过重组法或使用酶而键合于上述固相载体，接着，将R1键合于该连接子R。适合于该连接子R的键合的固相载体如上述1.1所述。
1.3.作用效果
本发明的一个实施方式涉及的亲和载体，固定化于载体的配体量多且初期的IgG静态结合容量(SBC)高，因此，依照下述式算出的免疫球蛋白结合蛋白质的有效利用度E[％]高。E[％]＝[(SBC/抗体的分子量)/(免疫球蛋白结合蛋白质导入量/免疫球蛋白结合蛋白质的分子量)]×100
2.将免疫球蛋白分离的方法
对本发明的一个实施方式涉及的将免疫球蛋白分离的方法进行说明。本实施方式涉及的将免疫球蛋白分离的方法包含：使含有免疫球蛋白的试样与固定化有上述式(1)所示的蛋白质配体R－R1的亲和载体接触，使免疫球蛋白吸附于该载体的工序(第一工序)；以及使该免疫球蛋白从该载体洗脱的工序(第二工序)，优选在该第二工序之后进一步包含将该载体用碱性液进行清洗的工序(第三工序)。本发明的免疫球蛋白分离方法所使用的本发明的亲和载体可以为悬浮形态，也可以为填充于柱的状态，或者也可以为片、毛细管或过滤器这样的形态。
在上述第一工序中，使含有免疫球蛋白的试样在免疫球蛋白吸附于配体的条件下与填充有上述亲和载体的柱等接触。在该第一工序中，试样中的免疫球蛋白以外的物质几乎不会吸附于配体，不会残留于载体上。然后，根据需要为了将较弱地保持于配体的一部分物质除去，可以将载体用含有NaCl等盐的中性缓冲液进行清洗。
在上述第二工序中，流过pH2～5的适当的缓冲液使吸附于配体的免疫球蛋白洗脱。通过回收该洗脱液，能够从试样分离免疫球蛋白。
在本实施方式涉及的将免疫球蛋白分离的方法中，优选在上述第二工序后接着进行第三工序。在第三工序中，用碱性溶液对载体进行清洗(CIP清洗)。作为第三工序所使用的碱性溶液，例如可以举出氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、三乙胺、四丁基氢氧化铵等。
本发明的亲和载体在上述第三工序中的清洗后也能够稳定地保持免疫球蛋白结合能力，因此，能够在本发明的免疫球蛋白分离方法中重复使用。
在本发明的免疫球蛋白分离方法的一个实施方式中，应分离的免疫球蛋白可以为抗体或含有该抗体的医药品。因此，在一个实施方式中，本发明提供使用本发明的亲和载体的抗体医药品的制造方法。该方法的顺序除使用含有目标抗体医药品的试样以外，基本上与上述的免疫球蛋白分离方法的顺序同样。
实施例
以下，举出实施例对本发明进一步具体地进行说明。另外，以下的记载概括地表示本发明的方式，在没有特别说明的情况下，本发明不受该记载限定。
参考例1多孔粒子的合成
使甲基丙烯酸缩水甘油酯(三菱丽阳公司制)8.2g、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(Sartomer公司制)65.9g和甘油单甲基丙烯酸酯(日油公司制)90.6g溶解于2－辛酮(东洋合成工业公司制)245.8g和苯乙酮(和光纯药工业公司制)62g，添加2,2’－偶氮异丁腈(和光纯药工业公司制)2g，制备有机单体溶液。
接着，在4240g的纯水中添加聚乙烯醇(Kuraray公司制PVA－217)8.5g、十二烷基硫酸钠(花王公司制Emal 10G)0.43g和硫酸钠(和光纯药工业公司制)21.3g，搅拌一晚而制备水溶液。
接着，将得到的水溶液投入到7L可分离式烧瓶内，安装温度计、搅拌叶片和冷却管，设置在温水浴中，在氮气氛下，以600rpm开始搅拌。接着，利用温水浴对可分离式烧瓶进行加热，在水溶液的温度成为85℃时，使用滴液漏斗向该水溶液中添加上述有机单体溶液，进行5小时搅拌。
接着，将反应液冷却后，将该反应液移至5L的聚丙烯制瓶，进行静置直至粒子悬浮，从下方吸出多余的水并废弃。进而，向该反应液中加入丙酮，使粒子沉降。接着，将反应液静置3分钟，通过倾析除去丙酮。将该操作重复2次后，加入水，使粒子沉降。进而，静置3分钟进行倾析。将该操作重复2次，对粒子进行清洗。进而，将粒子的分散液用丙酮再次置换，风干一晚后，利用真空干燥机进行干燥，得到多孔粒子(以下，记为PB1)90g。PB1通过光散射方式得到的体积平均粒径为53μm，通过压汞仪测定，比表面积为95m2/g。
比较例1
(1)重组型免疫球蛋白结合蛋白质的制备
通过化学合成来制备编码没有连接子的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列(序列号4)的质粒，导入到大肠杆菌BL21(STRATAGENE制)中进行转化。将转化后的大肠杆菌在37℃下进行培育直至吸光度(OD600)达到约10为止，接着，以最终浓度为1mM的方式添加IPTG(Sigma－Aldrich制)，进一步在37℃下培育4小时，使重组型免疫球蛋白结合蛋白质表达。蛋白质表达后，将细胞回收，在pH9.5的Tris缓冲液中使用溶菌酶破碎。利用阴离子交换色谱(Q－Sepharose FF、GE Healthcare Biosciences公司制)和阳离子交换色谱(SP－Sepharose FF、GE Healthcare Biosciences公司制)从得到的含有重组型免疫球蛋白结合蛋白质的大肠杆菌破碎液纯化重组型免疫球蛋白结合蛋白质。将纯化后的免疫球蛋白结合蛋白质相对于10mM柠檬酸酸缓冲液pH6.6进行16小时透析。利用SDS－PAGE确认的免疫球蛋白结合蛋白质的纯度为95％以上。使用ExPACy([www.expasy.org/compute＿pi/])求出该免疫球蛋白结合蛋白质的理论分子量[kDa]。
(2)免疫球蛋白结合蛋白质对载体的固定化
使8mg的参考例1中制备的PB1悬浮于150μL的纯水中，移至滤管(Millipore公司)，进行离心而除去纯水。在其中加入溶解了(1)中制备的重组型免疫球蛋白结合蛋白质1mg的含有0.85M硫酸钠的0.1M碳酸缓冲液(pH9.8)450μL，在25℃下振荡5小时，使免疫球蛋白结合蛋白质键合于PB1。将生成的粒子过滤后，与1M硫代甘油450μL混合，在25℃下反应16小时，将残余的环氧基封端，用0.5M NaOH清洗后，用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.2)清洗，最后加入400μL的磷酸缓冲生理盐水(BupHTM Modified Dulbecco’s PBS，PIERCE公司)，使固定化有免疫球蛋白结合蛋白质的多孔粒子分散，得到该粒子的悬浮液400μL。
比较例2
使用编码表1所示的含有半胱氨酸连接子的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列(序列号5)的质粒对大肠杆菌BL21进行转化，除此以外，通过与比较例1同样的步骤制备重组型免疫球蛋白结合蛋白质，接着，将其固定化于多孔粒子PB1。
比较例3
使用编码表1所示的含有聚赖氨酸连接子的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列(序列号6)的质粒对大肠杆菌BL21进行转化，除此以外，通过与比较例1同样的步骤制备重组型免疫球蛋白结合蛋白质，接着，将其固定化于多孔粒子PB1。
实施例1
使用编码表1所示的含有聚脯氨酸连接子的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列(序列号7)的质粒对大肠杆菌BL21进行转化，除此以外，通过与比较例1同样的步骤制备重组型免疫球蛋白结合蛋白质，接着，将其固定化于多孔粒子PB1。
实施例2
使用编码表1所示的含有聚脯氨酸连接子的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列(序列号8)的质粒对大肠杆菌BL21进行转化，除此以外，通过与比较例1同样的步骤制备重组型免疫球蛋白结合蛋白质，接着，将其固定化于多孔粒子PB1。
实施例3
使用编码表1所示的含有聚脯氨酸连接子的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列(序列号9)的质粒对大肠杆菌BL21进行转化，除此以外，通过与比较例1同样的步骤制备重组型免疫球蛋白结合蛋白质，接着，将其固定化于多孔粒子PB1。
实施例4
使用编码表1所示的含有聚脯氨酸连接子的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列(序列号10)的质粒对大肠杆菌BL21进行转化，除此以外，通过与比较例1同样的步骤制备重组型免疫球蛋白结合蛋白质，接着，将其固定化于多孔粒子PB1。
实施例5
使用编码表1所示的含有聚脯氨酸连接子的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列(序列号11)的质粒对大肠杆菌BL21进行转化，除此以外，通过与比较例1同样的步骤制备重组型免疫球蛋白结合蛋白质，接着，将其固定化于多孔粒子PB1。
比较例4
使过量的硫代甘油与参考例1中制备的粒子PB1作用而使环氧基开环后，使1,4－双(2,3－环氧丙氧基)丁烷(BDDGE)(碳原子数10)与表面羟基进行等摩尔量作用，导入了碳链的连接子。将该粒子作为PB2。对8mg的PB2与比较例1实质上同样地固定化重组型免疫球蛋白结合蛋白质(序列号4)，得到该粒子的悬浮液400μL。
比较例5
使过量的硫代甘油与参考例1中制备的粒子PB1作用而使环氧基开环后，使1,2－双(2,3－环氧丙氧基)乙烷(EGDG)(碳原子数8)与表面羟基进行等摩尔量作用，导入了碳链的连接子。将该粒子作为PB3。对8mg的PB3与比较例1实质上同样地固定化重组型免疫球蛋白结合蛋白质(序列号4)，得到该粒子的悬浮液400μL。
[表1]
试验例1(配体键合量的测定)
从实施例1～5和比较例1～5的粒子悬浮液400μL分取50μL，使用BCA Assy试剂盒(PIERCE公司)分别测定键合于该粒子的免疫球蛋白结合蛋白质的量，求出将比较例1的键合量设为100时的相对值。
试验例2(免疫球蛋白G(IgG)静态结合容量的测定)
从实施例1～5和比较例1～5的粒子悬浮液400μL分取150μL，分别投入到滤管(Millpore公司)中，在其中投入300μL的含有5mg IgG的0.1M磷酸缓冲液pH7.5，在25度下振荡1小时，使IgG吸附于该粒子。离心后，使用pH7.5的0.1M磷酸缓冲液450μL对该粒子进行清洗，使用0.1M柠檬酸缓冲液pH3.2使吸附于该粒子的IgG洗脱，由洗脱液的280nm的吸光度测定该粒子的IgG的静态结合容量(SBC)。
试验例3免疫球蛋白结合蛋白质的利用效率
依照下述式由试验例1和试验例2中测定的配体键合量和SBC的值算出实施例1～5和比较例1～5的多孔粒子中的免疫球蛋白结合蛋白质的有效利用度E[％]。
E[％]＝[(SBC/抗体的分子量)/(免疫球蛋白结合蛋白质导入量/免疫球蛋白结合蛋白质的分子量)]×100
将试验例1～3的结果示于表2。
[表2]
实施例1～5中制备的固定化有含有聚脯氨酸连接子的免疫球蛋白蛋白质的粒子与比较例1～3相比，配体键合量和SBC提高。进而，如果聚脯氨酸的长度更长，则存在SBC更加提高、利用效率E[％]也更加变高的趋势。进而，如实施例4～5所示，不论连接子与载体的键合所使用的官能团为来自赖氨酸的氨基还是来自半胱氨酸的硫醇基，均得到实质上相同程度的导入量。另一方面，如比较例5～6所示，碳链连接子对于配体键合量和SBC提高没有任何贡献。
本发明的实施方式涉及的说明如上所述。然而，本发明并不限定于上述的实施方式，能够进行本发明的进一步的各种变形。另外，本发明包含与上述说明的实施方式的构成实质上相同的构成(例如，功能、方法和结果相同的构成或者目的和结果相同的构成)。另外，本发明包含替换了上述说明的实施方式的构成的非本质的部分的构成。另外，本发明包含与上述说明的实施方式的构成发挥相同的作用效果的构成或能够实现相同目的的构成。另外，本发明包含对上述中说明的实施方式的构成附加了公知技术的构成。
序列表
<110> JSR株式会社; JSR生命科学株式会社
<120> 亲和载体和将免疫球蛋白分离的方法
<130> JSR0075
<150> JP 2015-148670
<151> 2015-07-28
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<223> 蛋白 A, B 结构域
<400> 1
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<223> 蛋白 A, Z 结构域
<400> 2
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<223> 蛋白 A, C 结构域
<400> 3
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 4
<211> 242
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 4
Ala Gln Gly Thr Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
1 5 10 15
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
20 25 30
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Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala
225 230 235 240
Pro Lys
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<211> 243
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 5
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165 170 175
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180 185 190
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225 230 235 240
Pro Lys Cys
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<211> 241
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<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 6
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Lys
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<213> 金黄色葡萄球菌
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<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
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Cys
<210> 11
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<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 11
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Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
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Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Pro Pro
225 230 235 240
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
245 250 255
Lys Lys Lys

Claims (15)

1.一种亲和载体，含有固相载体和蛋白质配体，
该蛋白质配体由下述式(1)表示，
R－R1 (1)
式(1)中，
R表示与该固相载体键合且含有聚脯氨酸的连接子，
R1表示对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质，
该R键合于该R1的氨基酸序列的C末端或N末端。
2.根据权利要求1所述的亲和载体，其中，所述聚脯氨酸中的脯氨酸的数量为3～300。
3.根据权利要求1或2所述的亲和载体，其中，所述连接子的长度为0.9nm～91nm。
4.一种亲和载体，含有固相载体和蛋白质配体，
该蛋白质配体由下述式(1)表示，
R－R1 (1)
式(1)中，
R表示与该固相载体键合且长度为0.9nm～91nm的连接子，
R1表示对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质，
该R键合于该R1的氨基酸序列的C末端或N末端。
5.根据权利要求4所述的亲和载体，其中，所述连接子含有聚脯氨酸。
6.根据权利要求5所述的亲和载体，其中，所述聚脯氨酸中的脯氨酸的数量为3～300。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的亲和载体，其中，所述连接子在与所述固相载体键合的末端含有具有氨基或硫醇基的氨基酸残基。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的亲和载体，其中，所述对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质含有来自Fc结合性蛋白质或蛋白A的免疫球蛋白结合结构域。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的亲和载体，其中，所述对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质含有选自由序列号3所示的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域、由序列号3所示的氨基酸序列的部分序列构成的免疫球蛋白结合结构域以及由与序列号3所示的氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域中的至少1个。
10.根据权利要求8或9所述的亲和载体，其中，所述对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质含有2个以上的所述免疫球蛋白结合结构域。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的亲和载体，其中，所述固相载体具有与硫醇基或氨基进行键合的反应性基团。
12.根据权利要求11所述的亲和载体，其中，所述反应性基团为环氧基。
13.一种免疫球蛋白的分离方法，使用权利要求1～12中任一项所述的亲和载体。
14.一种抗体医药品的制造方法，使用权利要求1～12中任一项所述的亲和载体。
15.一种亲和配体，含有连接子R和蛋白质配体R1，
连接子R含有聚脯氨酸，
R1表示对免疫球蛋白显示亲和性的蛋白质，
该R键合于该R1的氨基酸序列的C末端或N末端。
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