CN104804073A - 具有改进的特异性的新型免疫球蛋白结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种修饰的免疫球蛋白结合蛋白,例如,葡萄球菌(Staphyloccocus)蛋白A,所述蛋白具有改善的免疫球蛋白结合特异性;以及所述蛋白的制备方法和使用方法。
Description
本申请是2009年8月11日提交的题为“具有改进的特异性的新型免疫球蛋白结合蛋白”的中国专利申请200910221476.7的分案申请。
相关申请
本申请要求以2008年8月11日递交的美国临时申请号61/188,549和2009年4月16日递交的美国临时申请号61/212,812为优先权的权益。上述临时申请在此均全文引入作为参考。
发明领域
本发明涉及修饰的免疫球蛋白结合蛋白,例如葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白A,其具有改进的免疫球蛋白结合特异性,以及制备和应用该蛋白的方法。
背景
葡萄球菌蛋白A(SpA),是一种来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的42kDa的多域蛋白。SpA通过其羧端的细胞壁结合域被结合到细菌的细胞壁上,该结合域被称为X结构域。在氨基端的结构域,其包括5个免疫球蛋白结合区,被称为E、D、A、B和C区(Sjodhal,Eur J Biochem.Sep;78(2):471-90(1977);Uhlen等人,J Biol Chem.Feb 10;259(3):1695-702(1984))。上述每个结构域包含大约58个氨基酸残基,且它们具有65-90%的氨基酸序列同一性。SpA的Z结构域是一个工程化了的SpA的B结构域的类似物,其在第29位上包括一个丙氨酸来替代甘氨酸残基。
基于SpA的试剂在生物技术领域具有广泛的应用,例如,在捕获和纯化抗体的亲和层析以及抗体的检测方法等方面。目前,基于SpA的亲和介质可能是应用最广泛的亲和介质,其用于从不同样品,包括细胞培养中进行单克隆抗体及其片段的分离。相应地,包括蛋白A配体的各种基质可以在市场上购买到,包括例如,High Capacity,vA Ultra、UltraPlus(Millipore)和Protein A SepharoseTM,MabSelectTM,MabSelect XtraTM以及MabSelect(GE Healthcare)。
发明概述
本发明至少部分提供新的改进的SpA变体,其相对于以前所知的SpA变体表现出或者降低、或者升高的结合免疫球蛋白Fab部分的能力,同时保留其结合免疫球蛋白Fc部分的能力。
在一些实施方式中,本发明提供新的改进的SpA变体,其相对于市场上可购买到的很多基于蛋白A的Fab结合试剂表现出降低的Fab结合活性,而后者的Fab结合活性在有些时候是人们所不希望的。
在一个实施方式中,根据本发明的免疫球蛋白结合域是基于SpA的一个或多个结构域(即E、D、A、B、C和Z),其被修饰为至少替换第29位的氨基酸。对于E、D、A、B和C结构域而言,第29位的氨基酸是甘氨酸,其被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸。对于结构域Z而言,第29位的氨基酸是丙氨酸,其被替换为除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸。在一个特定的实施方式中,第29位的甘氨酸被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸,或者第29位的丙氨酸被替换为除甘氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸。
相应地,在一个实施方式中,提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白,其包括至少SpA的E区,其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基,且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fc部分的结合活性,而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中,E区第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。
在另一个实施方式中,提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白,其包括至少SpA的D区,其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基,且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fc部分的结合活性,而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中,D区第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。
在另一个实施方式中,提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白,其包括至少SpA的A区,其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基,且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fc部分的结合活性,而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中,A区第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。
在另一个实施方式中,提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白,其包括至少SpA的B区,其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基,且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fc部分的结合活性,而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中,B区第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。
在另一个实施方式中,提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白,其包括至少SpA的C区,其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基,且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fc部分的结合活性,而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中,C区第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。
在另一个实施方式中,提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白,其包括至少SpA的Z区,其中至少第29位的丙氨酸残基被替换为除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基,且其中免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fc部分的结合活性,而相对于第29位包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,其表现出对免疫球蛋白的Fab部分降低的结合。在一个特定的实施方式中,Z区第29位的丙氨酸残基被替换为除甘氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基。
在一些实施方式中,根据本发明的一种免疫球蛋白结合蛋白包括多于一个修饰的SpA结构域或其已知的变体(例如,多于一个的E、D、A、B、C和/或Z结构域以及其任意组合)其中每个结构域包括将第29位的甘氨酸(即,对于E、D、A、B和C结构域而言)或丙氨酸(即,对于Z结构域而言)替换为另一个氨基酸,例如,除丙氨酸、甘氨酸或色氨酸以外的一个氨基酸。在一个特定的实施方式中,第29位的甘氨酸或丙氨酸被替换为除丙氨酸、甘氨酸、色氨酸和苏氨酸以外的氨基酸。
在一些实施方式中,一种或多种分离的E、D、A、B和C结构域的第29位的甘氨酸(G)或分离的Z结构域的第29位的丙氨酸被替换为选自下列组的氨基酸:亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、丝氨酸(S),半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、脯氨酸(P)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)或其功能性变体或衍生物。
在一个特定的实施方式中,根据本发明的一种免疫球蛋白结合蛋白包括一个或多个分离的E、D、A、B、C或Z结构域,其中所述的一个或多个分离的结构域包括将第29位的甘氨酸残基(例如,对于E、D、A、B和C结构域而言)或第29位的丙氨酸(例如,对于Z结构域而言)替换为选自下列组的氨基酸:亮氨酸,赖氨酸和精氨酸或其功能性变体或衍生物。
在一个进一步的实施方式中,根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白进一步包括至少一部分SpA的羧基端区域(特指X结构域)。
在一些实施方式中,根据本发明的一种免疫球蛋白结合蛋白进一步包括一个天冬酰胺,例如,在第23位处,其被替换为另一个氨基酸。
在一个可选的实施方式中,提供了一种分离的免疫球蛋白结合蛋白,其包括葡萄球菌蛋白A的一个或多个分离的E、D、A、B、C或Z结构域,其中一个或多个分离的结构域包括:(i)当所述结构域是E、D、A、B或C的时候,至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸外的氨基酸残基;或(ii)当所述结构域是Z的时候,至少第29位的丙氨酸残基被替换为除甘氨酸外的氨基酸残基,其中免疫球蛋白结合蛋白能够结合免疫球蛋白的Fc部分,且相对于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,其表现出对免疫球蛋白的Fab部分增强的结合活性。
在一些实施方式中,根据本发明的一种分离的免疫球蛋白结合蛋白包括第29位的苏氨酸或色氨酸,其中免疫球蛋白结合蛋白能够结合免疫球蛋白的Fc部分,且相对于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,其表现出对免疫球蛋白的Fab部分增强的结合活性。在一些实施方式中,所述Fc部分可以是Fc融合蛋白的一部分。
在此描述的能够被不同种类的免疫球蛋白结合蛋白所结合的免疫球蛋白包括一种或多种IgG、IgA和IgM。
在其它的实施方式中,提供了一种可用于分离免疫球蛋白或抗体的层析基质。在一个实施方式中,根据本发明的一种层析基质包括在此描述的一种分离的免疫球蛋白结合蛋白,其偶联于一种固体载体上。
在此还提供了编码不同的所述免疫球蛋白结合蛋白的核酸分子,以及包含这些核酸分子的宿主细胞。在一些实施方式中,宿主细胞是原核细胞。在其它的实施方式中,宿主细胞是真核细胞。
另外,本发明还包括了一种多肽文库,其包括一种或多种所述的免疫球蛋白结合蛋白及其功能性变体。在另一个实施方式中,本发明提供一种核酸分子文库,其编码一种或多种本发明所涵盖的免疫球蛋白结合蛋白,或编码其功能性变体。
在此还提供一种应用所述免疫球蛋白结合蛋白的方法。在一些实施方式中,提供了一种从样品中亲和纯化一种或多种免疫球蛋白的方法,其包括以下步骤:(a)提供包括一种或多种免疫球蛋白的样品;(b)使样品接触层析基质,该层析基质包括一种所述的免疫球蛋白结合蛋白,接触的条件使得所述的一种或多种免疫球蛋白与基质结合;以及通过在合适的pH下进行洗脱,回收所述的一种或多种结合的免疫球蛋白。
在此描述的各种实施方式中,将一种或多种结合的免疫球蛋白进行洗脱的合适的pH是酸性pH。
附图简述
图1描述了SpA的野生型(wt)IgG结合域的核酸序列,如SEQ ID NOs:1-5所示。SEQ ID NO:1表示wt E区的核酸序列;SEQ ID NO:2表示wt D区的核酸序列;SEQ ID NO:3表示wt A区的核酸序列;SEQ ID NO:4表示wt B区的核酸序列;以及SEQ ID NO:5表示wt C区的核酸序列。
图2描述了SpA的Z区的核酸序列,如SEQ ID NO:6所示。
图3描述了SpA(E、D、A、B和C)的野生型(wt)IgG结合区的氨基酸序列比对,其包括第29位的甘氨酸。SEQ ID NO:7表示wt E区的氨基酸序列;SEQ ID NO:8表示wt D区的氨基酸序列;SEQ ID NO:9表示wt A区的氨基酸序列;SEQ ID NO:10表示wt B区的氨基酸序列;SEQ ID NO:11表示wt C区的氨基酸序列。
图4描述了Z区的氨基酸序列,如SEQ ID NO:12所示。
图5描述了质粒pJ56:8620的示意图,其中“His6”如SEQ ID NO:22所示。
图6描述了三个SpA的B区突变体的核酸序列,其中第29位的甘氨酸被替换为亮氨酸、赖氨酸或精氨酸。SEQ ID NO:13表示SpA突变体G29L的核酸序列;SEQ ID NO:14表示SpA突变体G29K的核酸序列;以及SEQ IDNO:15表示SpA突变体G29R的核酸序列。
图7描述了三个SpA的B区突变体的氨基酸序列,其中第29位的甘氨酸被替换为亮氨酸、赖氨酸或精氨酸。SEQ ID NO:16表示SpA的B区突变体G29L的氨基酸序列;SEQ ID NO:17表示SpA的B区突变体G29K的氨基酸序列;以及SEQ ID NO:18表示SpA的B区突变体G29R的氨基酸序列。
图8描述了一个示例性的蛋白质印迹(Western Blot)实验,其中在大肠杆菌(E.Coli)BL21(DE3)细胞中表达自载体PET11a:8620的蛋白A通过鸡IgY抗-蛋白A抗体进行检测。
图9描述了一个代表性的实验结果,其评价了免疫球蛋白的Fc和F(ab)2部分与单独的镍树脂(阴性对照)的结合,或与MabSelect层析介质(阳性对照)的结合,继而进行SDS-PAGE分析,如图所示。E表示层析后的洗脱物或结合的部分,S表示层析后的上清液或未结合的部分。自左至右:第1道表示分子量标准;第2-5道表示F(ab)2(第2(E)、3(S)道)或Fc(第4(E)、5(S)道)与镍树脂的结合;第6-9道表示F(ab)2(第6(S)、7(E)道)或Fc(第8(S)、9(E)道)与MabSelect的结合;第10和11道表示单独的F(ab)2和Fc。F(ab)2作为二聚体在SDS-PAGE上大约为18和20kDa,Fc在SDS-PAGE上大约为22kDa。如第2(E)和4(E)道分别所示,F(ab)2和Fc都表现出与镍树脂(阴性对照)弱到无的结合活性。同样,如第7(E)道所示,F(ab)2表现出能与MabSelect结合,而Fc则表现出与MabSelect(阳性对照)的显著结合。
图10描述了一个代表性的实验结果,其评价了免疫球蛋白的F(ab)2和Fc部分结合带有组氨酸标签的野生型SpA(wtSpA),或结合带有组氨酸标签的B-结构域变体,该变体包括第29位上用丙氨酸取代甘氨酸(G29A),其中使用镍亲和层析,继而进行SDS-PAGE分析,如图所示。F表示蛋白A加样;FT表示蛋白A流出物;S表示Fc或Fab结合步骤后的上清液(未结合的部分);E表示洗脱部分(结合的部分)。自左至右:第1道表示分子量标准;第2道表示评价wt SpA与F(ab)2或Fc结合的实验中的F组分;第3-5道描述了在FT(第3道)、S(第4道)和E(第5道)组分中wt SpA与F(ab)2的结合;第6-8道描述了在FT(第6道)、S(第7道)和E(第8道)组分中wt SpA与Fc的结合;第9道表示评价G29A与F(ab)2或Fc结合的实验中的F组分;第10-12道表示在FT(第10道)、S(第11道)和E(第12道)组分中G29A与F(ab)2的结合;第13-15道表示在FT(第13道)、S(第14道)和E(第15道)组分中G29A与Fc的结合。
图11描述了一个代表性的实验结果,其评价了免疫球蛋白的F(ab)2和Fc部分结合带有组氨酸标签的B-结构域变体,该变体包括第29位上用亮氨酸取代甘氨酸(G29L),其中使用镍亲和层析,继而进行SDS-PAGE分析,如图所示。F表示蛋白A加样;FT表示蛋白A流出物;S表示Fc或Fab结合步骤后的上清液(未结合的部分);E表示洗脱部分(结合的部分)。自左至右:第1道表示分子量标准;第2道表示F组分;第3-5道描述了在FT(第3道)、S(第4道)和E(第5道)组分中F(ab)2与G29L的结合;第6-8道表示在FT(第6道)、S(第7道)和E(第8道)组分中Fc与G29L的结合。
图12描述了一个代表性的实验结果,其评价了免疫球蛋白的F(ab)2和Fc部分结合带有组氨酸标签的B-结构域变体,该变体包括第29位上用赖氨酸取代甘氨酸(G29K)以及第29位上用精氨酸取代甘氨酸(G29R),其中使用镍亲和层析,继而进行SDS-PAGE分析,如图所示。F表示蛋白A加样;FT表示蛋白A流出物;S表示Fc或Fab结合步骤后的上清液(未结合的部分);E表示洗脱部分(结合的部分)。自左至右:第1道表示分子量标准;第2道表示表示评价G29K与F(ab)2或Fc结合的实验中的F组分;第3-5道表示在FT(第3道)、S(第4道)和E(第5道)组分中F(ab)2与G29K的结合;第6-8道表示在FT(第6道)、S(第7道)和E(第8道)组分中Fc与G29K的结合;第9道表示G29R与F(ab)2或Fc结合实验中的F组分;第10-12道表示在FT(第10道)、S(第11道)和E(第12道)组分中G29R与F(ab)2的结合;第13-15道表示在FT(第13道)、S(第14道)和E(第15道)组分中G29R与Fc的结合。
图13A-13E描述了一个代表性的实验结果,其中使用表面等离子共振分析进一步评价了本发明的SpA变体与免疫球蛋白的Fc部分的结合。这些附图描述了浓度范围45nM-185pM的Fc与对照组野生型蛋白A(图13A)和G29A(图13B),以及与构建体G29K(图13C)、G29R(图13D)和G29L(图13E)的结合。
图14A-14E描述了一个代表性的实验结果,其中使用表面等离子共振分析进一步评价了本发明的SpA变体与免疫球蛋白的F(ab)2部分的结合。这些附图描述了浓度范围45nM-185pM的F(ab)2与各种蛋白A构建体的结合。对于野生型蛋白A观察到强的结合(图14A),对于G29A对照观察到弱的结合(图l4B)。对于G29K(图14C)、G29R(图14D)和G29L(图14E)没有检测到结合。
图15A-15B描述了用于SpA层析树脂的Fc和Fab脉冲实验的代表性实验结果。在图15A中,Fc的未结合部分出现于7个柱体积(CV),结合的Fc洗脱出现于23CV。在图15B中,F(ab)2的未结合部分出现于7CV,结合的Fc洗脱出现于23-25CV之间。
发明详述
至少在某种程度上,本发明提供SpA变体,其结合免疫球蛋白的Fab部分的亲和性低于野生型SpA和之前所述的SpA变体,而保留与免疫球蛋白的Fc部分结合的能力。在一些实施方式中,在此所述的SpA变体结合免疫球蛋白的Fab部分的亲和力高于第29位上具有丙氨酸的SpA。
I.定义
为了使当前公开的内容更容易理解,对一些术语进行了首次定义。额外的定义贯穿于详细描述中。
在此所使用的,术语“免疫球蛋白结合蛋白”指一种“SpA”或“金黄色葡萄球菌蛋白A”的氨基酸序列变体,包括一个或多个修饰的SpA结构域(例如,一种或多种修饰的E、D、A、B、C或Z结构域),其相对于野生型SpA(wt SpA)或已知的变体SpA结构域(例如,Z结构域),表现出降低的结合免疫球蛋白Fab部分或Ig分子的结合活性。在一些实施方式中,本发明的免疫球蛋白结合蛋白包括一个或多个修饰的E、D、A、B、C或Z结构域,其中每个结构域包括对第29位的氨基酸进行替换。对于E、D、A、B或C结构域而言,第29位的甘氨酸被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸;对于结构域Z而言,第29位的丙氨酸被替换为除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸。在一些实施方式中,第29位的甘氨酸被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸,第29位的丙氨酸被替换为除甘氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸。在一些实施方式中,变体的氨基酸序列可以不同于作为其衍生来源的亲代氨基酸序列,其中在亲代氨基酸序列的任何位置进行替换、删除和/或插入一种或多种氨基酸,且包括至少在第29位进行氨基酸残基的替换。在一些实施方式中,氨基酸序列变体相对于亲代序列(即wt SpA结构域或Z结构域)具有至少大约70%,或至少大约80%,或至少大约85%,或至少大约90%,或至少大约95%,或至少大约96%,或至少大约97%,或至少大约98%的同一性,其中所述变体结合免疫球蛋白的Fc部分,然而,其相对于在第29位包括甘氨酸或丙氨酸的SpA氨基酸序列,表现出与免疫球蛋白的Fab部分的降低的结合活性。
在一个可选的实施方式中,第29位的甘氨酸或丙氨酸被苏氨酸或色氨酸所取代,其中免疫球蛋白结合蛋白能够结合免疫球蛋白的Fc部分,且相对于在第29位包括丙氨酸的SpA氨基酸序列,表现出对免疫球蛋白的Fab部分增强的结合活性。
术语“序列同一性”表示对于两个核苷酸或两个氨基酸序列,当使用缺省空位权重通过例如GAP或BESTFIT等程序进行最优化对齐的时候,具有至少70%序列同一性,或至少80%序列同一性,或至少85%序列同一性,或至少90%序列同一性,或至少95%或以上的序列同一性。对于序列对比,一般采用一个序列作为参考序列(例如,亲代序列),将待测序列与其进行对比。当使用序列比对算法时,将待测和参考序列输入计算机,如果需要的话指定相应的亚序列,然后指定序列算法程序参数。接下来序列比对算法根据指定的程序参数计算得出待测序列(们)相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的最佳序列比对可以通过例如Smith和Waterman的局部同源性算法得出,Adv.Appl.Math.2:482(1981),或由Needleman和Wunsch的同源性比对算法得出,J.Mol.Biol.48:443(1970),或由Pearson和Lipman的相似性查找方法得出,Proc.Natl.Acad Sci.USA 85:2444(1988),或由这些算法的计算机化运行得出(威斯康星遗传软件包(the Wisconsin Genetics SoftwarePackage)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,遗传计算机小组(GeneticsComputer Group),575Science Dr.,Madison,威斯康星),或由目测方法得出(大致参见Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology)。适用于测定序列同一性和序列相似性的一个算法的例子是BLAST算法,其记载于Altschul等,J.Mol.Biol.215:403(1990)。进行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)为公众所获得(通过登录国家健康研究所(National Institutes of Health)NCBI网络服务器进入)。一般的,可以使用缺省程序参数进行序列比对,虽然也可以使用设定的参数。对于氨基酸序列,BLAST程序使用缺省的字长(W)为3,期望值(E)为10,以及BLOSUM62分数矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
在一个实施方式中,根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白是基于分离的wtSpA的结构域(即,E、D、A、B或C),其包括至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基,其中相对于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,所述免疫球蛋白结合蛋白表现出对Ig分子的Fab部分降低的结合活性。在另一个实施方式中,根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白是基于SpA的Z结构域,其包括至少第29位的丙氨酸残基被替换为除甘氨酸或色氨酸以外的氨基酸残基。在另一个实施方式中,第29位的甘氨酸残基(即,对于E、D、A、B和C结构域而言)被替换为除丙氨酸、苏氨酸和色氨酸外的氨基酸残基,或第29位的丙氨酸残基(即,对于Z结构域而言)被替换为除甘氨酸、苏氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基,其中相对于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,所述免疫球蛋白结合蛋白表现出对Ig分子的Fab部分降低的结合活性。
在一些实施方式中,根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白包括至少两个或以上,或至少三个或以上,或至少四个或以上,或至少五个或以上所述的E、D、A、B、C和Z结构域,其中所述的每个两个或以上,或三个或以上,或四个或以上,或五个或以上的结构域包括至少第29位的甘氨酸(例如,对结构域E、D、A、B和C而言)或丙氨酸(对Z结构域而言)被替换为除甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和苏氨酸的氨基酸残基,且其中相对于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,所述免疫球蛋白结合蛋白表现出对Ig分子的Fab部分降低的结合活性。
在一些实施方式中,根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白包括相同结构域的多聚体(例如,两个或以上的E区;两个或以上的D区;两个或以上的A区;两个或以上的B区;两个或以上的C区;以及两个或以上的Z区),其中任何一个单体包括至少第29位的甘氨酸或丙氨酸被替换为除甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和苏氨酸的氨基酸残基,其中相对于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,所述免疫球蛋白结合蛋白表现出对Ig分子的Fab部分降低的结合活性。
替代第29位甘氨酸或丙氨酸的合适的氨基酸包括任何标准的天然产生的氨基酸,但不包括甘氨酸、丙氨酸和色氨酸,且在特定的实施方式中,不包括甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和苏氨酸。在一些实施方式中,所述天然产生的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和亮氨酸之一。在其它的实施方式中,所述天然产生的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丝氨酸、缬氨酸和酪氨酸之一。本领域所熟知的非天然产生的氨基酸和氨基酸衍生物同样可以被用于替代第29位的甘氨酸或丙氨酸。
示例性的SpA结构域修饰如表I所示。本发明所包括的免疫球蛋白结合蛋白可以包括任何下列组合:一个或以上,两个或以上,三个或以上,四个或以上,五个或以上,或六个或以上的结构域(E、D、A、B、C和Z),其中每个结构域包括对第29位的修饰,且其中第29位的甘氨酸或丙氨酸被替换为除甘氨酸、丙氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基,且在一些实施方式中,被替换为除甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和苏氨酸以外的氨基酸残基。本发明还涵盖了包括两个或以上相同种类的结构域(例如,两个或以上E区;两个或以上D区;两个或以上A区;两个或以上B区;两个或以上C区;以及两个或以上Z区)的免疫球蛋白结合蛋白,其中每个区包括对第29位的修饰,其中第29位的氨基酸残基被替换为除甘氨酸、丙氨酸和色氨酸以外的氨基酸残基,且在一些实施方式中,被替换为除甘氨酸、丙氨酸、色氨酸和苏氨酸以外的氨基酸残基。
表I
在此可交换使用的,术语“E区”、“SpA的E区”和“葡萄球菌蛋白A的E区”,指如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的多肽,或由例如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的多肽。所述“E区”是一种51个氨基酸的多肽,其折叠成一种三螺旋束结构。其能够通过螺旋1和2表面的残基结合Fc,或通过螺旋2和3表面的残基结合Fab。在一些实施方式中,根据本发明的E区与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少70%的同一性,或至少80%的同一性,或至少90%的同一性,或至少95%或以上的同一性。
在此可交换使用的,术语“D区”、“SpA的D区”和“葡萄球菌蛋白A的D区”,指如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的多肽,或由例如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码的多肽。所述“D区”是一种61个氨基酸的多肽,其折叠成一种三螺旋束结构。其能够通过螺旋1和2表面的残基结合Fc,或通过螺旋2和3表面的残基结合Fab。在一些实施方式中,根据本发明的D区与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少70%的同一性,或至少80%的同一性,或至少90%的同一性,或至少95%或以上的同一性。
在此可交换使用的,术语“A区”、“SpA的A区”和“葡萄球菌蛋白A的A区”,指如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽,或由例如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列编码的多肽。所述“A区”是一种58个氨基酸的多肽,其折叠成一种三螺旋束结构。其能够通过螺旋1和2表面的残基结合Fc,或通过螺旋2和3表面的残基结合Fab。在一些实施方式中,根据本发明的A区与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少70%的同一性,或至少80%的同一性,或至少90%的同一性,或至少95%或以上的同一性。
在此可交换使用的,术语“B区”、“SpA的B区”和“葡萄球菌蛋白A的B区”,指如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的多肽,或由例如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列编码的多肽。所述“B区”是一种58个氨基酸的多肽,其折叠成一种三螺旋束结构。其能够通过螺旋1和2表面的残基结合Fc,或通过螺旋2和3表面的残基结合Fab。在一些实施方式中,根据本发明的B区与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少70%的同一性,或至少80%的同一性,或至少90%的同一性,或至少95%或以上的同一性。
在此可交换使用的,术语“C区”、“SpA的C区”和“葡萄球菌蛋白A的C区”,指如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的多肽,或由例如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列编码的多肽。所述“C区”是一种58个氨基酸的多肽,其折叠成一种三螺旋束结构。其能够通过螺旋1和2表面的残基结合Fc,或通过螺旋2和3表面的残基结合Fab。在一些实施方式中,根据本发明的C区与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少70%的同一性,或至少80%的同一性,或至少90%的同一性,或至少95%或以上的同一性。
在此可交换使用的,术语“Z区”、“SpA的Z区”和“葡萄球菌蛋白A的Z区”,指三个螺旋、59个氨基酸的多肽,其为蛋白A的B区的变体。Z区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。示例性的Z区记载于Nilsson等,ProteinEngng.,1:107-113(1997),在此全文引入作为参考。
术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“抗体”(在此可交换使用),均指一种蛋白,其具有基本的四-多肽链结构,包括2条重链和2条轻链,所述链通过例如链间的二硫键被稳定化,其能够特异性结合抗原。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(在此可交换使用)指具有双-多肽链结构的蛋白,包括一个重链和一个轻链,所述链通过例如链间的肽接头被稳定化,其能够特异性结合抗原。术语“结构域”指重链或轻链多肽的球形结构域,包括肽环(例如,包括3到4个肽环),后者通过例如层状折叠和/或链间的二硫键被稳定化。在此这些结构域进一步被称为“恒定的”或“可变的”,其中对于“恒定的”结构域而言,不同种类的相关结构域的序列相对缺乏变化;或对于“可变的”结构域而言,不同种类的相关结构域的序列发生显著的变化。抗体或多肽“结构域(domains)”在本领域通常可交换地被称为抗体或多肽“区(regions)”。抗体轻链的“恒定的”结构域可交换地被称为“轻链恒定区”、“轻链恒定域”、“CL”区或“CL”域。抗体重链的“恒定的”结构域可交换地被称为“重链恒定区”、“重链恒定域”、“CH”区或“CH”域。抗体轻链的“可变的”结构域可交换地被称为“轻链可变区”、“轻链可变域”、“VL”区或“VL”域。抗体重链的“可变的”结构域可交换地被称为“重链可变区”、“重链可变域”、“VH”区或“VH”域。
免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆,并可以单体或多聚体的形式存在,例如,以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。术语“片段”指抗体或抗体链的一部分,其包括少于完整抗体或抗体链的氨基酸残基。片段可以通过对完整抗体或抗体链进行化学处理或酶处理来获得。片段也可以通过重组的方式获得。当对片段进行重组表达的时候,其可以被单独表达,或作为更大的蛋白的一部分进行表达,所述更大的蛋白称为融合蛋白。示例性的片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc和/或Fv片段。示例性的融合蛋白包括Fc融合蛋白。
术语“抗原结合片段”指免疫球蛋白或抗体的一个多肽部分,其结合抗原,或与完整的抗体(即,作为所述片段来源的完整的抗体)竞争性结合抗原(即,特异性结合)。结合片段可以通过重组DNA技术或通过酶法或化学方法裂解完整的免疫球蛋白来进行生产。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链和单链抗体。
术语“聚核苷酸”和“核酸分子”在此可交换使用,指任何长度的多聚形式的核苷酸,不论是核糖核酸或脱氧核糖核酸。这些术语包括单链、双链或三链的DNA,染色体DNA,cDNA,RNA,DNA-RNA杂交体,或包括嘌呤和嘧啶碱基的聚合物,或其他天然的、化学或生物修饰的、非天然或衍生的核苷酸基团。聚核苷酸的骨架可以包括糖和磷酸基团(如一般的可发现于RNA或DNA中),或修饰的或取代的糖或磷酸基团。另外,双链聚核苷酸可以通过化学合成的单链聚核苷酸产品获得,其中可以通过合成互补链并在合适的条件下进行退火,或通过使用合适的引物及DNA聚合酶重新合成互补链。核酸分子可以具有多种形式,例如,基因或基因片段、一种或多种外显子、一种或多种内含子、mRNA、cDNA、重组聚核苷酸、分支聚核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。聚核苷酸可以包括修饰的核苷酸,例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其它糖类和连接基团例如氟代核糖(fluororibose)和硫酯(thioate)、以及分支核苷酸。在此使用的,“DNA”或“核苷酸序列”不仅包括碱基A、T、C和G,还包括任何它们的类似物或这些碱基的修饰形式,例如甲基化的核苷酸,核苷酸内修饰例如不带电的连接和硫酯化,糖的类似物的使用,以及修饰的和/或可选的骨架结构,例如聚酰胺。在一个特定的实施方式中,核酸分子包括编码SpA变体的核苷酸序列。
在此所使用的,术语“降低的结合”指相对于第29位包括丙氨酸或甘氨酸残基的免疫球蛋白结合蛋白,根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白与免疫球蛋白分子的Fab(或F(ab)2)部分的结合活性的任何降低。例如,相对于第29位包括丙氨酸或甘氨酸残基的免疫球蛋白结合蛋白,与Fab部分的结合可以被降低大约10%,或大约20%,或大约30%,或大约40%,或大约50%,或大约60%,或大约70%,或大约80%,或大约90%,或大约95%,或大约96%,或大约97%,或大约98%,或大约99%或以上。在一些实施方式中,相对于第29位包括丙氨酸或甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,与免疫球蛋白分子的Fab部分的结合被降低至少50%或以上。在另一个实施方式中,与免疫球蛋白分子的Fab部分的结合被降低至少70%或以上。在另一个实施方式中,与免疫球蛋白分子的Fab部分的结合被降低至少90%或以上,或至少95%或以上,或至少99%或以上。在一个实施方式中,使用本领域常规技术手段和在此描述的手段无法检测到与免疫球蛋白分子的Fab部分的结合。与免疫球蛋白分子的结合可以使用公知的技术进行检测,包括在此描述的那些技术以及包括但不限于,例如,亲和层析和表面等离子共振分析。在一些实施方式中,本发明的免疫球蛋白结合蛋白与免疫球蛋白分子的Fc部分结合的解离常数如下:对于单一的IgG结合区,为至少大约10-8M;或对于5个串联的IgG结合区,为大约10-11M。在其它的实施方式中,根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白与免疫球蛋白分子的Fab部分结合的解离常数如下:对于单一的免疫球蛋白结合区,为大约10-5M;或对于具有5个串联的结合区的完整的蛋白A,为大约10-6。
在此所使用的,术语“增加的结合”指相对于第29位包括丙氨酸或甘氨酸残基的免疫球蛋白结合蛋白,根据本发明的免疫球蛋白结合蛋白与免疫球蛋白分子的Fab(或F(ab)2)部分的结合活性的任何增加。例如,相对于第29位包括丙氨酸残基的免疫球蛋白结合蛋白,与Fab部分的结合可以被增加大约10%,或大约20%,或大约30%,或大约40%,或大约50%,或大约60%,或大约70%,或大约80%,或大约90%,或大约95%,或大约96%,或大约97%,或大约98%,或大约99%或以上。在一些实施方式中,相对于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,与免疫球蛋白分子的Fab部分的结合被增加至少50%或以上。在另一个实施方式中,相对于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,与免疫球蛋白分子的Fab部分的结合被增加至少70%或以上。在另一个实施方式中,相对于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白结合蛋白,与免疫球蛋白分子的Fab部分的结合被增加至少90%或以上,或至少95%或以上,或至少99%或以上。在示例性的实施方式中,相对于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白结合蛋白表现出增加的Fab结合活性的免疫球蛋白结合蛋白,在第29位包括苏氨酸或色氨酸。与免疫球蛋白分子的结合可以使用公知的技术进行检测,包括在此描述的那些技术以及包括但不限于,例如,亲和层析和表面等离子共振分析。
术语“Fc-结合”、“结合到Fc部分”指在此描述的免疫球蛋白结合蛋白结合到抗体的可结晶部分(Fc)的能力。在一些实施方式中,根据本发明的一种免疫球蛋白结合蛋白与抗体(例如,人IgG1,IgG2或IgG4)的Fc部分结合,其亲和力为至少10-7M,或至少10-8M,或至少10-9M。
在此使用的术语“亲和分离”或“亲和纯化”,指任何纯化或分析技术,其中包括添加含有目标分析物(例如,免疫球蛋白)的样品至固体载体上,该载体携带在此描述的免疫球蛋白结合蛋白。
在此所使用的术语“层析”,指任何种类的技术,其从混合物中的其它分子中分离待测物(例如,免疫球蛋白),使之被分离出来。
在此所使用的术语“亲和层析”,指一种层析模型,其中要分离的待测物通过其与一种分子(例如,免疫球蛋白结合蛋白)的反应被分离出来,所述分子特异性地与待测物进行反应。
II.SpA的结构和免疫球蛋白结合位点
SpA是一种来自细菌金黄色葡萄球菌的大约42kDa的蛋白,在N端包括5个串联的高度同源的胞外免疫球蛋白(Ig)结合区,命名为E、D、A、B和C。每个SpA的胞外结构域具有不同的Ig结合位点。一个位点结合Fcγ(Ig中IgG类的恒定区),另一个结合特定Ig分子的Fab部分(Ig的该部分用于抗原识别)。已有报道每个结构域包括Fab结合位点。SpA的非-Ig结合部分位于C末端,命名为X区或X-结构域。
编码SpA基因的克隆在美国专利号5,151,350中已有描述,在此将其全文引入作为参考。
III.SpA变体的产生与表达
本发明的SpA变体可以通过本领域公知的任何合适的方法进行制备。例如,可以使用核酸定点突变的标准技术,其在一些文献中已有描述,例如名为分子克隆(Molecular Cloning,Sambrook,Fritsch和Maniatis)的实验手册中。另外,可以使用包括聚合酶链式反应(PCR)的标准分子生物技术。
在一些实施方式中,使用了标准的遗传工程技术合成SpA变体。例如,可以将编码SpA的结构域或其部分的核酸分子克隆到一个合适的载体中,用于在合适的宿主细胞中表达。合适的表达载体是本领域所熟知的,其一般包括用于变体SpA编码序列转录和翻译的必需元素。
在此描述的SpA变体也可以使用本领域所熟知的方法用氨基酸前体使用化学方法合成片段,所述方法包括固相肽合成方法,例如Boc(叔丁氧羰基)或Fmoc(9-芴甲氧羰基)方法(参见,例如,美国专利号6,060,596;4,879,378;5,198,531;5,240,680)。
SpA变体的表达可以使用真核宿主细胞进行,例如酵母、昆虫或哺乳动物,或使用原核宿主细胞,例如,细菌,例如大肠杆菌。
在一些实施方式中,SpA变体可以在噬菌体表面进行表达,使每个噬菌体包含一个DNA序列,后者编码在噬菌体表面展示的一个SpA变体。在这种方法中,通过在SpA序列的选定位点处合成随机或半随机的寡核苷酸,在所选择的这些位点产生多种氨基酸,从而构建了SpA变体文库。编码的DNA被插入合适的噬菌体载体,包装入噬菌体颗粒并用于感染合适的细菌宿主。如此将每个序列克隆到一个噬菌体载体中,感兴趣的SpA变体(例如,在第29位具有突变的)可以通过筛选能够结合Fc但不结合Fab的那些噬菌体得到(例如,通过公知的淘选方法)。用这种方法回收的噬菌体可以进行扩增和重复筛选。同样,这些噬菌体可以被分离出来,编码选定的SpA变体的核苷酸序列可以通过核苷酸测序进行确定。
IV.SpA变体与Fc和Fab的结合
产生SpA变体之后,使用本领域的标准技术和在此描述的那些技术检测了SpA变体与免疫球蛋白的Fab或Fc部分的结合特异性。
例如,可以构建携带组氨酸标签((His)6-标签(SEQ IDNO:22))的SpA变体用于镍亲和层析固定。继而,可以通过向树脂加入合适的片段来测试镍结合的SpA与Fc和Fab的结合。未结合的材料被冲洗下去,在洗脱样品中的Fc和Fab通过凝胶电泳进行检测。
可选的,可以通过表面等离子共振分析来测定Fc和Fab的结合。使用胺反应化学的方法将SpA变体固定到芯片上,用Fc或Fab片段流过芯片。如果Fc或Fab结合上去,能够观察到表面等离子共振信号的增加。
也可以将SpA固定到层析珠上。Fc或Fab的结合可以通过比较SpA树脂的流出物和洗脱峰来进行观测。
V.SpA及其变体用于制备层析基质的用途
本发明还提供一种制备层析基质的方法,其包括至少一种免疫球蛋白结合蛋白,后者对于抗体的Fc部分具有亲和能力,而对于抗体的Fab部分具有降低的或零亲和能力。在一个实施方式中,所述方法包括:(a)提供一种编码分离的SpA结构域(例如,E、D、A、B、C或Z)的核酸序列;(b)将该核酸序列突变为编码一种变体蛋白,其中至少第29位的甘氨酸被替换为除丙氨酸或色氨酸以外的氨基酸;(c)在宿主细胞(例如,合适的原核细胞或真核细胞)中表达该变体蛋白;(d)从宿主细胞中回收该变体蛋白;和(e)将变体蛋白偶联到固体载体上。
固体载体基质包括但不限于,可控表面多孔玻璃,琼脂糖,甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯。蛋白可以通过例如胺反应或硫醇反应化学被偶联到基质上。
本发明通过下述实施例进行进一步的阐述,其不应当被视为是一种限定。本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请、以及图形等内容被引入作为参考。
实施例
实施例1:包含SpA变体的载体构建
用DNA合成仪采用标准方法合成了一种编码蛋白A的“B结构域”基因。基因的5’端包含起始的甲硫氨酸密码子,3’端包含6个组氨酸的密码子。该基因由载体pJ56:8620提供。这种亲代载体pJ56具有氨苄青霉素,卡那霉素,氯霉素和庆大霉素抗性。为了接下来将基因克隆到表达载体,在5’和3’端引入适当的限制性酶切位点。载体的质粒图谱在图5中显示。
使用Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,Ipswich,MA),通过基于PCR的方法,将第29位的甘氨酸突变为其它19种氨基酸。磷酸化引物购买自IDT DNA(Coralville,IA),以浓度100μM溶于Tris EDTA缓冲液中。诱变引物具有序列:5’(P)GAAGAACAACGCAACNNNTTCATTCAGA(SEQID NO:19),其中NNN表示编码第29位氨基酸的3个碱基。非诱变引物具有序列5’(P)GTTCAGGTTCGGCAGATGCAGGAT(SEQ ID NO:20)。PCR的反应体系为50μL,包括dNTPs(每种0.2mM),各种引物0.5mM,模板质粒10pg,和1U的Phusion酶。PCR按照表2列出的方案实施。
表2:PCR条件
PCR反应使用限制性内切酶DpnI(New England Biolabs,Ipswich,MA)处理用来减少野生型的背景。对于每一个50μL的PCR反应,在样品中加入大约1μL的DpnI酶,37℃反应大约1个小时。
使用2μL DpnI处理的PCR反应液转化感受态细胞大肠杆菌NEB5α(New England Biolabs,Ipswich,MA)。细胞置于冰上解冻,将2μLPCR反应物加入25μL细胞中。在冰上温育大约30分钟后,在大约42℃下热休克细胞30秒。在冰上让细胞复苏大约5分钟,接下来加入125μL的SOC培养基(New England BioLabs)。在37℃下培养细胞大约1小时,然后涂布100μl至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板(Northeast Laboratory Services,Winslow,ME),在大约37℃下培养过夜。为了获得纯化的DNA,挑选单菌落,在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB中培养过夜。使用来自Qiagen(Valencia,CA)的spin小量制备试剂盒进行DNA纯化。使用引物pJR(5’GAATATGGCTCATAACACCCCTTG)(SEQ ID NO:21)对小量制备的DNA进行测序,以鉴定每个克隆(MWG Biotech,Huntsville AL)。
在确定不同克隆的序列后,每个SpA变体的基因被亚克隆到质粒中,在细菌细胞中进行变体的表达。使用合适的质粒限制性内切酶(New EnglandBiolabs,Ipswieh,MA)消化质粒,插入部分在1%琼脂糖Reliant FastLane凝胶(Lonza Inc.,Allendale,NJ)上进行凝胶纯化。从胶上切下相关的条带,使用来自Qiagen(Valencia,CA)的凝胶抽提试剂盒进行纯化。纯化后的插入物使用T4DNA连接酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)连接入合适的表达载体骨架。得到的质粒用于转化大肠杆菌NEB5α感受态细胞,如上所述。
实施例2:蛋白A变体的表达和纯化
可以使用任何适合的细菌表达系统表达各种SpA变体。例如,蛋白可以在大肠杆菌(Escherichia coli),例如菌株BL21(DE3)(Promega,Madison WI)中使用pET载体,例如pET11a(Novagen,Madison WI)进行表达。从平板上挑取单菌落,大约37℃下在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB中培养过夜。过夜培养物稀释100倍接入新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基,培养至600nm处的光密度为~0.8的细胞密度。在添加1mM异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷后,细胞继续生长2小时。使用SDS-PAGE分析和蛋白质印迹来确认蛋白表达。示例性的蛋白A的蛋白质印迹如图8所示,其显示使用鸡IgY抗-蛋白A抗体检测到在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中来自PET11a:8620载体的蛋白表达。
离心(4000rpm,4℃,5分钟)收获细胞,重悬于3mL含有20mM咪唑的磷酸盐缓冲液中。通过超声裂解细胞,离心去除细胞碎片(4000rpm,4℃,30分钟)。使用NiNTA spin柱(Qiagen)纯化SpA变体,每个spin柱中加入400μL细胞裂解液。使用2x600μL含有20mM咪唑的磷酸盐缓冲液冲洗柱子,用2x200μL含有200mM咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱SpA。在PBS中将SpA透析过夜。蛋白浓度使用Dc蛋白分析(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)相对于利用牛血清白蛋白制作的标准曲线确定。
实施例3:SpA变体与Fc和Fab片段的结合
然后,使用NiNTA琼脂糖树脂(Qiagen)检测每个SpA变体结合Fc和Fab的能力。Fc和F(ab)2片段来自于Jackson ImmunoResearch(West Grove,PA)。在含有20mM咪唑的磷酸盐缓冲液中,将每个SpA变体稀释至浓度为0.11mg/mL,Fc稀释至浓度为0.44mg/mL,F(ab)2稀释至浓度为0.92mg/mL。重悬NiNTA琼脂糖树脂,将大约20μL树脂浆吸入一个0.5ml的微量离心管中。然后沉淀树脂颗粒,弃上清液。用大约100μL含有20mM咪唑的PBS洗涤树脂,室温下孵育大约15分钟,再次沉淀树脂颗粒。弃上清液。将约250μL的0.11mg/ml的每个SpA变体或PBS对照上载至树脂柱,做两个平行样,室温下孵育大约30分钟。沉淀树脂颗粒,保存上清液用于分析。沉淀物洗涤三次,每次用加入20mM咪唑的100μL PBS,孵育5分钟,再次沉淀。弃上清液。将大约100μL的Fc或F(ab)2与树脂一起孵育大约30分钟,检测其与每个SpA变体或PBS对照的结合。接下来沉淀树脂颗粒,保存上清液用于分析。再次将树脂洗涤三次,每次用加入20mM咪唑的100μL PBS,孵育5分钟,进行沉淀。这一次弃上清液。结合的部分使用大约100μL含有20mM咪唑的PBS进行洗脱,孵育大约15分钟后沉淀。保存上清液用于进一步分析。然后在购自Bio-Rad Laboratories,CA的4-15%梯度凝胶上使用SDS-PAGE分析样品,如图9-12所示。
通过表面等离子共振生物传感器分析检测了5种蛋白A变体与Fc和F(ab)2的结合。所有的实验是在含有0.005%Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行的。蛋白A变体通过胺化学反应被固定于ProteOn GLC传感器芯片(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA),偶联度为500RU。制备了三种稀释度的Fc和F(ab)2片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA),其蛋白浓度范围为45nM至185pM,每个浓度分析两个平行样品。每个浓度的Fc或F(ab)2注射250秒,然后用3.5小时注入PBS,检测离解速率。将数据代入非均匀两点模型,得到结合和分解速率(kon和koff)。如图13A-13E所示,野生型的甘氨酸29蛋白,和G29A、G29R、G29K以及G29L每个蛋白均结合Fc。图14A-l4E显示野生型G29被观察到与Fab结合,G29A显示出微弱但可测的F(ab)2结合。对于G29R、G29K或G29L没有观测到其与F(ab)2的结合。
还通过将SpA变体固定于层析树脂上对Fc和Fab的结合进行了评价。根据国际PCT申请号WO 90/09237所述的偶联蛋白A到固体载体上的方法,将可控表面多孔玻璃珠(每个50mL,平均颗粒大小为60μm,平均孔径为 )用蛋白A或蛋白A变体进行功能化,上述文献在此全文引入作为参考。在配体偶联后,将样品洗涤三次,每次用150mL的下述溶液(按次序):含有0.15M NaCl的0.1M Tris,pH 8,然后是0.05M乙酸。然后平衡样品,在加入叠氮化物的PBS中保藏。
用固定有相应配体的可控表面多孔玻璃亲和树脂装入6.6mm id x 70mm L的OmniFit柱中。实验中所用的缓冲液为:(A)50mM磷酸钠缓冲液,pH 7.2;和(B)50mM磷酸钠,pH 2,流速为1.2mL/min。用起始缓冲液A平衡柱子后,将100μL缓冲液A中的1~2mg/mL的F(ab)2或Fc(JacksonImmunoResearch,West Grove,PA)注射入柱子中。在10个柱体积(CV)的缓冲液A后,用线性梯度混合入缓冲液B至超过20CV。再用10个柱体积的缓冲液B流过柱子,然后用2CV的6M盐酸胍进行柱子再生。如图15A和15B所示,野生型甘氨酸29蛋白和G29A、G29R、G29K以及G29L均结合Fc。观察到野生型G29与Fab结合,G29A显示出微弱但可测的F(ab)2结合。对于G29R、G29K或G29L没有观测到其与F(ab)2的结合。
在另一个示例性的实验中,通过在NiNTA琼脂糖树脂(Qiagen)上进行捕获,对于全套的蛋白A变体检测了Fc和Fab的结合。简而言之,将在wt SpA的第29位具有氨基酸替换的带有组氨酸标签的蛋白A变体加入树脂至过量,用含有20mM咪唑的100μL PBS洗涤树脂,然后加入免疫球蛋白的Fc或Fab部分。再用含有20mM咪唑的100μL PBS洗涤树脂,然后用含有200mM咪唑的PBS洗脱SpA和IgG片段。得到的洗脱部分在4-20%梯度凝胶(BioRad)上进行分析,然后进行考马斯蓝染色(Pierce)。使用不含蛋白A的树脂作为阴性对照。一个示例性的实验结果归纳于下表III。虽然在不同变体中对于Fc的结合没有观察到明显差异,但是大部分变体对于Fab的结合显著降低。与野生型相比,大部分变体显示出少于15%的Fab结合。对于三种变体(G29A、G29T和G29W)观察到24%或更高的Fab残基结合。
表III
本说明书在其引用的参考文献的教导下可以被透彻地理解,因此将这些文献引入作为参考。说明书中的实施方式提供了本发明实施方式的一种示例,不应理解为对其范围的限制。本领域所属技术人员容易理解本发明还包括了很多其它的实施方式。所有出版物和发明被整体引入作为参考。对于引入作为参考的材料与本说明书发生矛盾或不一致的情况,用本说明书代替任何所述材料。在此引用的任何参考文献并不意味着这些文献是本发明的现有技术。
除非另有注明,所有用于表达在说明书、包括权利要求中所使用的成分、细胞培养、处理条件等相关数量的数字,应当被理解为在全部的情况下都使用术语“大约”来进行修饰。相应地,除非另有相反的说明,数字化的参数都是近似值,可以根据适合本发明所期望得到的属性进行变化。除非另有注明,在一系列元素之前的术语“至少”应当被理解为指该系列中的每一个元素。本领域技术人员能够理解,或通过不超过常规的实验即可确定很多与所述本发明特定的实施方式等价的实施方式。这些等价的实施方式也包括于下述权利要求的范围中。
本发明的许多修饰和变化可以在不背离其精神和范围的情况下获得,这对于本领域技术人员是显而易见的。在此提供的特定的实施方式仅用作示例,并不意味着任何方式的限定。说明书和实施例都应当被认为仅仅是示例性的,本发明真正的范围和精神如下列权利要求所述。
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Claims (19)
1.一种分离的免疫球蛋白结合蛋白,包含一个或多个分离的葡萄球菌(Staphyloccocus)蛋白A的E、D、A、B、C或Z结构域,所述一种或多种分离的结构域中包括:(i)当所述结构域为E、D、A、B或C结构域时,至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸或色氨酸外的氨基酸残基;或(ii)当结构域为Z结构域时,至少第29位的丙氨酸被替换为除甘氨酸或色氨酸外的氨基酸,其中免疫球蛋白结合蛋白与免疫球蛋白的Fc部分结合,而相对于第29位处包括丙氨酸或者甘氨酸的免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白Fab部分的降低的结合。
2.权利要求1中的免疫球蛋白结合蛋白,其中除丙氨酸、甘氨酸或色氨酸外的氨基酸选自由下列氨基酸组成的组:亮氨酸,赖氨酸和精氨酸。
3.权利要求1中的免疫球蛋白结合蛋白,其中至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸、色氨酸和苏氨酸以外的氨基酸残基,或至少第29位的丙氨酸被替换为除甘氨酸、色氨酸和苏氨酸以外的氨基酸。
4.权利要求1中的免疫球蛋白结合蛋白,其中至少第29位的甘氨酸残基或第29位的丙氨酸被替换为选自由下列氨基酸组成的组的氨基酸:赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、缬氨酸和酪氨酸。
5.权利要求1中的分离的免疫球蛋白结合蛋白,进一步包含葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白A的羧基端结构域的至少一部分。
6.一种层析基质,包含偶联于固体载体的权利要求1所述的分离的免疫球蛋白结合蛋白。
7.一种多肽文库,包含权利要求1所述的免疫球蛋白结合蛋白。
8.权利要求1中的免疫球蛋白结合蛋白,进一步包含在一个或多个分离的结构域中用其它氨基酸残基对天冬酰胺的替换。
9.权利要求8中的免疫球蛋白结合蛋白,其中天冬酰胺在第23位。
10.权利要求1中的免疫球蛋白结合蛋白,其中所述的免疫球蛋白是IgG或其片段。
11.一种核酸分子,其编码权利要求1所述的免疫球蛋白结合蛋白。
12.一种宿主细胞,其包含权利要求11所述的核酸分子。
13.一种从样品中亲和纯化一种或多种免疫球蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)提供包含一种或多种免疫球蛋白的样品;
(b)在使得所述的一种或多种免疫球蛋白与权利要求6的基质结合的条件下使样品接触所述基质;和
(c)通过在适宜的条件下进行洗脱,回收所述的一种或多种结合的免疫球蛋白。
14.一种分离的免疫球蛋白结合蛋白,包含一个或多个分离的葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B、C或Z结构域,其中一个或多个分离的结构域包括:(i)当所述结构域是E、D、A、B或C结构域时,至少第29位的甘氨酸残基被替换为除丙氨酸以外的氨基酸残基;或(ii)当所述结构域是Z结构域的时候,至少第29位的丙氨酸残基被替换为除甘氨酸外的氨基酸残基,其中免疫球蛋白结合蛋白与免疫球蛋白的Fc部分结合,且相对于第29位包括丙氨酸的免疫球蛋白结合蛋白表现出对免疫球蛋白的Fab部分增加的结合。
15.权利要求14中的分离的免疫球蛋白结合蛋白,其中至少第29位的甘氨酸或第29位的丙氨酸被替换为苏氨酸或色氨酸。
16.一种层析基质,包括偶联于固体载体的权利要求14所述的分离的免疫球蛋白结合蛋白。
17.一种从样品中亲和纯化一种或多种免疫球蛋白的方法,该方法包括以下步骤:
(a)提供包括一种或多种免疫球蛋白的样品;
(b)在使得所述的一种或多种免疫球蛋白与权利要求16的基质结合的条件下使样品接触所述基质;和
(c)通过在适宜的条件下进行洗脱,回收所述一种或多种结合的免疫球蛋白。
18.权利要求14中的免疫球蛋白结合蛋白,其中所述免疫球蛋白选自由IgG、IgA或IgM、或它们的片段所组成的组。
19.权利要求1中的免疫球蛋白结合蛋白,其中所述免疫球蛋白的Fc部分是Fc融合蛋白的一部分。
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