CN113924320A - 用于增强抗体纯化的功能化ubx蛋白材料 - Google Patents

用于增强抗体纯化的功能化ubx蛋白材料 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于纯化抗体的方法和组合物。通过将蛋白A结构域(E、D、A、B、C)，或结构域Z，或其功能变体共价附接至黑腹果蝇转录因子Ultrabithorax(Ubx)材料来增加蛋白A色谱的结合容量，如此来实现纯化。所述组合物包含含有黑腹果蝇转录因子Ultrabithorax(Ubx)或其片段和免疫球蛋白结合蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白结合蛋白是蛋白A结构域、蛋白Z结构域或其片段。

Description

用于增强抗体纯化的功能化UBX蛋白材料
先前相关申请
本申请要求2019年4月2日提交的美国临时申请号62/828,142的权益，所述临时申请特此以引用的方式整体并入。
背景技术
基于抗体的疗法有效地靶向特定分子或细胞而几乎没有不良作用。然而，抗体疗法价格昂贵，而且处于临床试验中的抗体疗法比使用现有设施可以制造的还要多。因此，抗体纯化方法的工业精细化对于降低制造成本和提高效率至关重要。有许多已经建立的可以分离和纯化抗体的方法，诸如类别特异性亲和色谱法、阴离子交换色谱法或抗原特异性亲和色谱法。最常见的亲和配体是蛋白A，这是一种来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的41kD细胞壁蛋白，可结合人免疫球蛋白G(IgG)的Fc区。另外的亲和配体是蛋白G(65kD，G组链球菌的IgG结合蛋白)、蛋白L(马格努斯消化链球菌(Peptostreptococcusmagnus)的76Kd结合蛋白)和蛋白A/G(一种组合了蛋白A和蛋白G的IgG结合结构域的重组融合蛋白)，它们是金黄色葡萄球菌蛋白A的功能变体。蛋白A色谱因其高选择性(90％纯度)和容量(每1ml树脂含60mg抗体)而被广泛认为是抗体纯化的金标准。
在美国专利号6,127,526中，描述了经由蛋白A亲和色谱分离和纯化蛋白质的传统技术。纯化过程需要：(i.)将蛋白A结构域(E、D、A、B、C)或其功能变体固定在固相上；(ii.)通过用疏水性电解质溶液洗涤固相材料来消除污染物；以及(iii.)从固相中分离出所期望的蛋白质。固体载体的类型可显著影响抗体纯化过程。常用的固体基质可能由像二氧化硅或琼脂糖之类的材料组成；然而，将葡萄球菌蛋白A(SpA)附接到固体载体的方法也很重要。虽然蛋白A色谱是用于抗体纯化的主要方法，但考虑到与蛋白A色谱相关的高昂成本以及与通量、按比例放大和配体浸出(ligand leeching)相关的当前限制，替代纯化方法是必要的。
发明内容
本公开涉及通过将蛋白A结构域(E、D、A、B、C)或合成蛋白Z(例如合成Z结构域)共价附接至黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)转录因子Ultrabithorax(Ubx)材料上来增加蛋白A色谱的结合容量的组合物和方法。本发明人已经发现，与交联至相同SpA蛋白的商业色谱树脂相比，Ubx材料每克材料掺入的SpA蛋白高约1,000倍。本文提供的组合物包括含有黑腹果蝇转录因子Ultrabithorax(Ubx)或其片段和免疫球蛋白结合蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，免疫球蛋白结合蛋白是蛋白A结构域、蛋白Z结构域或其片段。
还提供了包含约2至约18个免疫球蛋白结合结构域(例如SpA或Z结构域重复序列)的亲和色谱基质。通过将多个免疫球蛋白结合结构域(例如，约2至约18个SpA或Z结构域重复序列)共价附接至Ubx蛋白或其片段上，可增加结合容量。与其他SpA应用相关的常见问题是SpA结构域与固相基质的化学固定易于遭受导致蛋白A渗出的降解影响。参见例如，美国专利申请公布号20050038231。本文提供的组合物和方法允许通过防止因配体浸出导致的SpA污染来增加免疫球蛋白纯度。一个或多个SpA结构域重复序列、一个或多个Z结构域或其片段与Ubx材料的共价附接可防止配体从基质中浸出或解离。因此，本发明提供了一种容量增加的抗体亲和分离基质，其允许分离纯度增加的免疫球蛋白。还提供了使用本文提供的任何亲和分离基质来分离或纯化抗体或含有免疫球蛋白的蛋白质的方法。
附图说明
图1是经由一个或多个短接头与Ubx融合的1个Z结构域或至多18个Z结构域的示意图。用于纯化的标签经由类似的接头附接至整个融合蛋白。
图2FITC标记抗体不能结合由普通Ubx(A)组成的纤维，但确实结合Z-Ubx纤维(B)和18Z-Ubx纤维(C)。插图：横截面展示抗体结合整个纤维。
图3是示出对Z-Ubx和18Z-Ubx的静态结合容量的量化的图。
图4是示出在被浸入沸水中30秒后Z-Ubx和18Z-Ubx的静态结合容量的量化的图。
图5示出了IgG的第一次和第二次纯化。将通过ZZ-Ubx膜PBS洗涤(泳道2和泳道5)、上样(泳道3)、流通(泳道4)和洗脱(泳道6至10)纯化IgG而获得的级分在10％SDS-PAGE凝胶上运行，其中分子量标记在泳道1中。
图6是Z-Z-Ubx对照(泳道1)和洗脱(泳道2)的蛋白质印迹。一抗是兔抗蛋白A Z结构域(1:150)。二抗是山羊抗兔HRP缀合物(1:20000)。
图7A是SDS-PAGE凝胶，其显示抗体从杂交瘤培养基中被纯化出来(泳道2)并被洗脱(泳道3)。
图7B是杂交瘤培养基中的IgG(泳道1)和纯化的IgG(泳道2)的蛋白质印迹。抗体在ZZ-Ubx膜上纯化后能够保留活性。
图7C显示纯的商业抗体被用作一抗以在蛋白质印迹中检测白蛋白。二抗是山羊抗兔IgG(HRP)。
图7D显示从杂交瘤培养基纯化出来的抗体被用作一抗以在蛋白质印迹中检测白蛋白。二抗是山羊抗兔IgG(HRP)。
定义
本文提供了固定到Ubx材料支架上的抗体亲和蛋白。这是通过由抗体结合结构域和形成Ubx蛋白的材料组成的融合蛋白实现的。还提供了Ubx材料用于纯化免疫球蛋白的用途。本发明基于亲和纯化结合容量因为Ubx材料每克材料掺入的SpA蛋白比交联至相同SpA蛋白的商业色谱树脂高出约1,000倍而可以显著提高的发现。另外，抗体亲和结构域与Ubx材料的共价结合可防止配体从载体中浸出，从而提高产品纯度。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指代氨基酸残基的聚合物。所述术语涵盖包括全长蛋白质在内的任何长度的氨基酸链，其中氨基酸残基由共价肽键连接。所述定义还包括本文所述的任何多肽的片段和变体。所述蛋白质可以是抗体。所述蛋白质可由宿主细胞产生。
术语“抗体亲和结构域”和“免疫球蛋白结合蛋白”可互换使用，并且可以是例如蛋白A结构域(例如E、D、A、B、C或Z)，或蛋白G结构域、蛋白L结构域、蛋白A/G结构域或其功能变体。在一些实施方案中，所述抗体亲和结构域可以是葡萄球菌蛋白A(SpA)结构域。在一些实施方案中，所述抗体亲和结构域包含以下、基本上由以下组成，或由以下组成：Z结构域，例如合成Z结构域，诸如SEQ ID NO:1(HMVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK)，或其片段。在一些实施方案中，所述亲和域包含以下、基本上由以下组成，或由以下组成：SpA结构域E(AQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK(SEQ ID NO:2))、SpA结构域A(ADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPK(SEQ ID NO:3))、SpA结构域B(ADNKFNKEQ QNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO:4))、SpA结构域C(ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO:5))、SpA结构域D(SEQ ID NO:14)、蛋白G结构域(例如，蛋白G C1结构域(TYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE)(SEQ ID NO:6))；蛋白G C2结构域(TYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE)(SEQ ID NO:7)；蛋白G C3结构域(TYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE(SEQ ID NO:8))、蛋白L结构域(例如，B1:(VTIKANLIFADGSTQNAEFKGTFAKAVSDAYAYADALKKDNGEYTVDVADKGLTLNIKFAG)(SEQ ID NO:9))；B2:(VTIKVNLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAKAYAYADLLAKENGEYTADLEDGGNTINIKFAG)(SEQ ID NO:10))；B3:(VTIKVNLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAKAYAYANLLAKENGEYTADLEDGGNTINIKFAG)(SEQ ID NO:11))或B4:(VTIKVNLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKVNGEYTADLEDGGYTINIKFAG)(SEQ ID NO:12)；蛋白A/G结构域(例如，(AQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK)(SEQ ID NO:13))；(ADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK)(SEQ ID NO:14))；(ADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPK)(SEQ ID NO:15))；(ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK)(SEQ ID NO:16))；(ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK)(SEQ ID NO:17))；(TYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE)(SEQ ID NO:18))或(TYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE)(SEQ ID NO:19))，或其片段。任选地，本文所述的免疫球蛋白结合蛋白的任何片段可以是结合片段。
在一些实施方案中，一个或多个抗体亲和结构域存在于本文所述的任何融合蛋白中。任选地，亲和结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：一个或多个选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:19组成的组的序列或其功能片段。
术语“固相”、“载体”、“支架”和“基质”在本文中可互换使用，并且是指提供用于固定抗体亲和结构域的物理结构的固体材料。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)分子、其抗原结合片段或其结合衍生物。抗体的抗原结合片段含有特异性地结合抗原的抗原结合位点。抗体(Abs)可以是单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。抗体的实例包括免疫球蛋白(Ig)型IgG、IgD、IgE、IgA和IgM。抗体可以是天然抗体或重组抗体。抗体可由宿主细胞产生。
如本文所用的术语“融合蛋白”是指含有两种或更多种多肽的蛋白质，所述多肽来源于不同蛋白质，但是是作为单一多肽由包括编码这两种蛋白质的核苷酸序列并且在一些实施方案中包括连接序列的多核苷酸在单个启动子控制下产生的。本文所述的融合蛋白中的两种或更多种多肽任选地经由接头缀合或连接。
术语“核酸”或“核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或
核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非另外指定，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指定的序列。
“启动子”被定义为指导核酸转录的一个或多个核酸控制序列。如本文所用，启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，诸如在II型聚合酶启动子的情况下的TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或抑制子元件，其可位于离转录起始位点远至数千碱基对的位置。
当核酸被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，所述核酸被“可操作地连接”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子可操作地连接到该序列；或者如果核糖体结合位点被定位成促进翻译，则所述核糖体结合位点可操作地连接到编码序列。
术语“Ubx材料(Ubx material)”或“Ubx材料(Ubx materials)”是指由黑腹果蝇转录因子Ultrabithorax(US2010/0143436)或US20180222949A1中描述的Ultrabithorax的任何改进合成型式的自组装制成的生物材料。在一些实例中，Ubx材料含有两种或更多种自组装Ubx蛋白质分子。在本文所述的任何Ubx材料中，UBX蛋白可包括选自由基因库登录号AAN13717、基因库登录号AAN13718、基因库登录号AAN13719、基因库登录号AAF55355、基因库登录号AAF55356和基因库登录号AAS65158所示的氨基酸序列或其片段组成的组的氨基酸序列。出于与其他色谱载体进行比较的目的，1mL Ubx材料意指与1mL沉降的琼脂糖基树脂等效的质量的Ubx材料。
在一些实施方案中，全长Ubx蛋白被用于产生融合蛋白。参见例如，Uniprot号P83949。在其他实施方案中，被用于产生Ubx融合蛋白的Ubx蛋白是包含Ubx同源结构域的Ubx蛋白片段，例如包含或含有SEQ ID NO:20(LRRRGRQTYTRYQTLELEKEFHTNHYLTRRRRIEMAHALCLTERQIKIWFQNRRMKLKKEI)的Ubx蛋白片段。在其他实施方案中，Ubx融合蛋白包含含有SEQ ID NO:20和SEQID NO:21(MNSYFEQA)的Ubx蛋白片段。在其他实施方案中，Ubx融合蛋白包含含有SEQ ID NO:22(VRPSACTPDSRVGGYLDTS)和/或SEQ ID NO:23(FYPWMAIA)的Ubx蛋白片段。应理解，术语“Ubx蛋白”意指全长Ubx蛋白或其片段。
术语“功能材料”是指由含有免疫球蛋白结合蛋白和Ubx蛋白或其片段的融合蛋白制成的Ubx生物材料。在一些实施方案中，Ubx生物材料包含两种或更多种含有免疫球蛋白结合蛋白和Ubx蛋白的自组装融合蛋白。
具体实施方式
组合物
本发明涉及含有用于纯化抗体的生物材料的组合物。在一些实施方案中，生物材料包括Ubx蛋白或其片段。本文提供的生物材料具有通过抗体或免疫球蛋白结合蛋白与Ubx蛋白或其片段的融合而被赋予的功能特性。免疫球蛋白结合蛋白可以是具有天然免疫球蛋白结合能力的任何蛋白，诸如葡萄球菌蛋白A(SpA)、链球菌蛋白G(Streptococcal proteinG)(SpG)、消化链球菌蛋白L(Peptostreptococcusprotein L)、蛋白A/G，或含有这些蛋白质的IgG结合结构域的重组蛋白。有关此类蛋白质的综述，请参见例如，Kronvall和Jonsson(Receptins:a novel term for an expanding spectrum of natural and engineeredmicrobial proteins with binding properties for mammalian proteins,J.Mol.Recognit.1999年1月-2月；12(1):38-44)。免疫球蛋白结合蛋白可含有SpA的E、D、A、B和C结构域中的一者或多者。在一些实施方案中，免疫球蛋白结合蛋白含有蛋白A的结构域B，或工程化的合成蛋白Z结构域。在一些实施方案中，多聚配体含有两个或更多个，诸如2-18个来自蛋白A的结构域E、D、A、B或C，或结构域Z的相同单体结构域的拷贝(图1)。在其他实施方案中，可使用含有两个或更多个诸如2-18个选自蛋白A的结构域E、D、A、B和C，或结构域Z的不同单体结构域的多聚体配体。蛋白A的结构域E、D、A、B或C，或结构域Z的功能性变体可用于本文所述的任何实施方案中。
在一些实施方案中，抗体结合的功能特性通过包含免疫球蛋白、抗体结合蛋白和Ubx蛋白或其片段的融合蛋白而被赋予。编码功能融合蛋白的核酸或基因被克隆到用于表达蛋白质的质粒中，一般被克隆到编码肽标签(例如组氨酸标签)的DNA序列的3’以促进蛋白质纯化。还可使用本领域已知的其他标签，例如化学部分，诸如荧光标签。融合蛋白可在细胞例如真核或原核细胞中表达。还提供了包含编码本文任何融合蛋白的核酸序列的细胞。任选地，核酸序列在载体中。任选地，核酸序列被稳定地整合到细胞的基因组中。融合蛋白的表达可以处在适当启动子(例如本领域技术人员已知的任何组成型或可调控启动子)的控制下。
在一些实施方案中，接头被放置于编码免疫球蛋白结合蛋白的核酸序列的3'端。此接头的长度和序列可以变化。例如，接头的长度可以是约两个至约二十个氨基酸。在一些实施方案中，接头含有甘氨酸和丝氨酸的交替重复，例如，(SGSG)n(SEQ ID NO:24)或(GSGS)n(SEq ID NO:25)，其中n是整数。当存在接头时，编码Ubx蛋白或其片段的核酸位于接头的3'端处，之后是基因融合中仅有的一个或多个终止密码子。融合基因在宿主细胞中的表达产生融合蛋白，其可用于制备功能化材料。参见例如，美国专利公布号20180222949中关于制备融合蛋白和功能化材料的方法。
由于Ubx材料每克材料掺入的蛋白质比交联到相同蛋白质的商业色谱树脂高出1,000倍，因此通过使用本文所述的组合物和方法，抗体可以比先前报道的使用抗体结合技术获得的容量(图3)更高的容量与功能性生物材料(图2)结合。
本文提供了包含至少一种Ubx蛋白和免疫球蛋白结合蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，免疫球蛋白结合蛋白包含葡萄球菌蛋白A(SpA)的单结构域、结构域Z，或它们的功能变体。在一些实施方案中，葡萄球菌蛋白A(SpA)的结构域是E、D、A、B或C结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白结合蛋白含有葡萄球菌蛋白A(SpA)的两个或更多个不同的单体结构域、结构域Z，或它们的功能变体。
在一些实施方案中，葡萄球菌蛋白A(SpA)的两个或更多个不同的单体结构域是E、D、A、B或C结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白结合蛋白含有葡萄球菌蛋白A(SpA)的两个或更多个单体结构域、结构域Z，或它们的功能变体，其中所述单体结构域相同。在一些实施方案中，葡萄球菌蛋白A(SpA)的两个或更多个不同的单体结构域是E、D、A、B或C结构域。
本文还提供了包含本文所述的任何融合蛋白的固体基质。在一些实施方案中，免疫球蛋白结合蛋白从固体基质中的浸出得以防止或减少。例如，可以使浸出减少至少55％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，1mL材料的结合容量大于1g/mL。
在一些实施方案中，融合蛋白包括包含或含有SEQ ID NO:20(LRRRGRQTYTRYQTLELEKEFHTNHYLTRRRRIEMAHALCLTERQIKIWFQNRRMKLKKEI)的Ubx蛋白片段。在其他实施方案中，Ubx融合蛋白由含有SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21(MNSYFEQA)的Ubx蛋白片段组成。在其他实施方案中，Ubx融合蛋白包括含有SEQ ID NO:22(VRPSACTPDSRVGGYLDTS)和/或SEQ IDNO:23(FYPWMAIA)的Ubx蛋白片段。一种融合蛋白，其包含与以下中任一个具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21。还提供了SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:23。如在多核苷酸或多肽序列的上下文中所使用的术语“同一性”是指与参考序列具有至少60％序列同一性的序列。可替代地，同一性百分比可以是60％到100％的任何整数。利用本文所述的程序，优选使用如下所述的标准参数进行的BLAST与参考序列进行比较，示例性实施方案包括至少：60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的对应身份。
对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或者可以指定可替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算出测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用的“比较窗口”包括具有选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150组成的组的许多邻接位置中的任一个邻接位置的区段的参考物，其中可在一个序列与具有相同数目的邻接位置的参考序列最佳地对齐之后对这两个序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的最佳序列比对可通过Smith和Waterman Add.APL.Math.2:482(1981)的局部同源算法，通过Needleman和Wunsch J.MolBiol.48:443(1970)的同源比对算法，通过Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实现(例如BLAST)，或通过手动比对和目视检查来进行。
适于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschuel等人(1977)NucleicAcids Res.25:3389-3402中有描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心研究中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)网站公开获得。所述算法涉及首先通过鉴定查询序列中的在与数据库序列中具有相同长度的字段比对时匹配或满足某个正值阈值分数T的长度为W的短字段(word)来鉴定高分数序列对(HSP)。T被称为邻域字段分数阈值(Altschul等人，同上)。这些初始邻域字段命中物充当用于启动搜索以找到含有它们的较长HSP的种子。然后使所述字段命中物沿着每条序列在两个方向延伸，直到累积比对分数可以增加为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积分数。所述字段命中物在每个方向上的延伸在下列情况下将停止：累积比对分数由其达到的最大值降低了数量X；累积分数由于一个或多个负评分残基比对的积累而变为0或0以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定所述比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下作为默认值：字段大小(W)为28，期望值(E)为10，M＝1，N＝-2和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作为默认值：字段大小为3(W)、期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
BLAST算法还执行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或核酸序列之间偶然配对的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.01、更优选小于约10-5并且最优选小于约10-20，则认为该核酸与参考序列相似。
本文描述的多肽中的氨基酸可以是20种天然存在的氨基酸、天然存在的氨基酸的D-立体异构体、非天然存在的或非天然的氨基酸和经化学修饰的氨基酸中的任一种。非天然氨基酸(即不是天然存在于蛋白质中的那些)也是本领域已知的，例如在Zhang等人“Protein engineering with unnatural amino acids,”Curr.Opin.Struct.Biol.23(4):581-587(2013)；Xie等人“Adding amino acids to the genetic repertoire,”9(6):548-54(2005))；以及其中引用的所有参考文献中所阐述。Β和γ氨基酸是本领域已知的并且在本文中也被考虑为非天然氨基酸。本文所述的任何合成肽，例如合成结构域Z可以衍生自或工程化自SpA的结构域，例如结构域E、D、A、B或C。
如本文所用，经化学修饰的氨基酸是指侧链已被化学修饰的氨基酸。例如，侧链可被修饰成包含信号部分，诸如荧光团或放射性标记。侧链还可以被修饰成包含新的官能团，诸如硫醇、羧酸或氨基。翻译后修饰的氨基酸也包括在经化学修饰的氨基酸的定义中。
还考虑了在本文所述的任一多肽中的一个或多个保守性氨基酸取代。举例来说，保守性氨基酸取代可以在一个或多个氨基酸残基中，例如在本文提供的任何多肽的一个或多个赖氨酸残基中进行。本领域技术人员将知道保守性取代是一个氨基酸残基被生物学和/或化学上类似的另一个氨基酸残基替换。以下八个组各自含有互为彼此的保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷酰酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)。
举例来说，当提到精氨酸到丝氨酸时，还考虑了丝氨酸的保守性取代(例如苏氨酸)。还考虑了非保守性取代，例如用天冬酰胺取代赖氨酸。
方法
本文还提供了用于从液体或溶液中分离出含有一种或多种免疫球蛋白的蛋白质的方法。所述方法包括(a)使所述液体与含有一种或多种被固定到载体上的配体(即免疫球蛋白结合蛋白)的分离基质接触；(b)使含有免疫球蛋白的蛋白质通过与所述一种或多种配体的相互作用吸附到基质上；(c)洗涤吸附的含有免疫球蛋白的蛋白质；以及(d)通过使所述基质与使蛋白质释放出来的洗脱液接触来回收含有免疫球蛋白的蛋白质。所述方法使配体与免疫球蛋白分子的结合容量增加，其是通过使用各自包含葡萄球菌蛋白A(SpA)的一个或多个结构域(即单体)(E、D、A、B、C或Z)，或其功能变体的配体来实现的。
在本文所述的方法中，通过将蛋白质配体与Ubx蛋白质或其片段融合来将配体(即免疫球蛋白结合蛋白)固定在基于蛋白质的生物材料，即Ubx材料上。在本文提供的方法中，基质由作为固体载体的Ubx材料构成。在所有实施方案中，生物材料由Ubx蛋白、包含Ubx蛋白的融合蛋白，或其片段的自组装制成。
在所有实施方案中，在基质中的配体存在于固体载体上。。固体载体的非限制性实例包括活性氧化铝、粉状纤维素、硅酸、凝胶、纸、玻璃纤维、塑料、琼脂糖、琼脂糖凝胶、二氧化硅及其衍生物，以及任何其他合适的固体载体。出乎意料地发现，当配体由Ubx材料支撑时，配体的结合容量增加到约1,000倍。通过经由基因融合向Ubx材料中加入配体的重复序列，即通过产生含有Ubx和一个或多个配体的重复序列的融合蛋白，可进一步增加结合容量。例如但非限制性地，可通过使用包含固定在Ubx材料上的18个SpA或Z结构域重复序列的融合蛋白来增加结合容量(图3)。
本文提供的组合物和方法还可用于通过与Ubx材料的共价附接来稳定配体。在所有实施方案中，配体从固体载体中的浸出或解离得以防止或减少，因为配体是通过蛋白质融合附接并且与形成Ubx蛋白质的材料结合在一起产生的。如图4所示，这种稳定性体现在即使在暴露于高温之后，本文所述的基质仍具有始终如一的较高结合容量(图4)。
还提供了分离免疫球蛋白(诸如IgG、IgA和/或IgM)的方法，其中使用了根据本发明的配体或基质。因此，本发明涵盖色谱过程，其中至少一种目标化合物通过吸附到上述配体或基质上而从液体中被分离出来。因此，本发明的这个方面涉及亲和色谱，这是一种广泛使用且众所周知的分离技术。简而言之，在第一步骤中，在允许目标化合物(优选如上所提到的抗体)吸附到存在于分离基质上的配体上的条件下使包含所述目标化合物的溶液从所述分离基质上通过。此类条件例如通过pH和/或盐浓度(即溶液中的离子强度)来控制。应注意不要超过基质的容量，即流速应足够慢以允许令人满意的吸附而不损坏基质。在此步骤中，所述溶液的其他组分原则上将不受阻碍地通过。任选地，然后洗涤基质，例如用水溶液洗涤，以去除保留的和/或松散结合的物质。目前的基质任选地与利用添加剂(诸如溶剂、盐或去污剂或它们混合物)的中间洗涤步骤一起使用。在下一步骤中，在提供解吸(即目标化合物的释放)的条件下，使第二溶液(洗脱液)从基质上通过。此类条件通常通过改变pH、盐浓度(即离子强度)、疏水性等来提供。已知各种洗脱方案，诸如梯度洗脱和逐步洗脱。还可由包含竞争性物质的第二溶液提供洗脱，所述竞争性物质将替换基质上的期望抗体。
公开了可用于所公开的方法和组合物中，可与所公开的方法和组合物结合使用，可用于所公开的方法和组合物的制备中；以及是所公开的方法和组合物的产物的材料、组合物和组分。本文公开了这些材料及其他材料，并且应理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、群组等时，虽然可能没有明确地公开对这些化合物的各种单独和集体的组合和排列中的每一个的具体提及，但是每一个均被本文具体地考虑和描述。例如，如果公开并讨论了一种方法并且讨论了可以对包括在所述方法中的一个或多个分子进行的许多修饰，则除非明确另外指定，否则具体地考虑了所述方法的每个组合和排列以及可能的修改。同样，还具体地考虑并公开了这些的任何子集或组合。这个概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在各种可执行的额外步骤，则应理解，这些额外步骤中的每一个均可与所公开的方法的任何具体方法步骤或方法步骤的组合一起执行，并且每种此类组合或组合的子集均被具体地考虑并应被视为得到公开。
本文引用的出版物和引用它们的材料特此以引用的方式整体具体地并入。
实施例
抗体结合测试
对融合到Ubx材料的Z结构域的功能性进行了测试。将普通Ubx、Z-Ubx和18Z-Ubx纤维组装并放置在4孔板中。将每根纤维在250μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中与抗髓鞘碱性蛋白人抗体(Abcam，Cambridge，UK；1:300)一起孵育。将纤维用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗三次，然后使用用异硫氰酸荧光素(FITC)(Abcam)标记的山羊抗人IgG进行检测。由于二酪氨酸键也发出蓝色荧光，因此普通纤维在4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光下呈蓝色。在NikonEclipse Ti A1R倒置共聚焦显微镜上使用DAPI和FITC设置捕获图像，并使用NikonElements成像软件进行分析。图2A显示普通Ubx材料未能结合抗体；然而，Z-Ubx和18Z-Ubx都结合了相当多的量的FITC标记抗体。这个初始测试表明抗体可以被融合到Ubx材料的Z结构域特异性地结合，而不是被该材料本身结合。
结合容量
Z-Ubx和18Z-Ubx的静态结合容量是通过将Z-Ubx和18Z-Ubx纤维与纯化的IgG(1mg/mL)一起孵育15分钟来测定的。将纤维在PBS中冲洗3次，然后用100μl 2.5M碘化钾pH7洗脱。将洗脱液在8％SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶上运行。结合容量是使用NIH Image J图像分析软件进行的光密度分析来测量的。图3显示Z-Ubx纤维的静态结合容量为7.43g/mL，而18Z-Ubx纤维的静态结合容量为67.86g/mL。
耐用性
为了检查Ubx材料的耐用性和融合到Ubx材料的Z结构域的稳定性，进行了相同的实验；但是将纤维在水中煮沸30秒并让其在室温下冷却一分钟，然后才使其结合纯化的IgG。煮沸后，Z-Ubx纤维的静态结合容量为5.35g/mL，而18Z-Ubx纤维的静态结合容量为46.14g/mL(图4)。这表明虽然失去了一些结合，但Ubx材料上的Z结构域的固定化即使在暴露于极端高温后仍保留功能。为了进一步测试低pH缓冲液是否影响Z-Z-Ubx材料，使用相同的膜对IgG进行了两次纯化。以0.5ml/min的流速用10ml PBS洗涤Z-Z-Ubx膜。以0.5ml/min的流速在所述膜中加载单克隆IgG并收集流出液。以0.5ml/min的流速用PBS彻底洗涤所述膜。以0.5ml/min的流速用0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱结合的IgG，并取出级分。用PBS彻底洗涤所述膜，并且如上所述的那样再次将IgG加载到膜上。将级分在SDS-PAGE凝胶上运行(图5)。从这些凝胶中可得出两个观察结果：(1)第二次运行时IgG与膜的结合即使不比第一次运行好，但也能和第一次运行一样好，(2)在任一运行的洗涤步骤，泳道2和5中均未观察到Z-Z-Ubx寡聚体。这些观察结果表明，洗脱缓冲液的低pH不会影响Z-Z-Ubx的结合容量，也不会导致材料浸出。另外，再用50mL洗脱缓冲液洗涤Z-Z-Ubx膜，然后收集级分并将紧邻作为对照的纯化的Z-Z-Ubx单体在10％SDS-PAGE凝胶上运行。将凝胶转移到硝酸纤维素膜上进行蛋白质印迹分析。将硝酸纤维素膜用5％牛奶封闭。为了确认没有发生浸出，使用抗Z结构域抗体来寻找从膜的降解和浸出(图6)。从这些数据可观察到，在用低pH缓冲液处理后，蛋白A配体不会从膜中浸出。
纯度和活性
测量了Z-Z-Ubx膜从杂交瘤培养基中纯化单克隆人抗胰岛素抗体(Abcam)的能力。将Z-Z-Ubx膜用PBS以0.5ml/min的流速洗涤。然后使掺有抗胰岛素抗体的杂交瘤培养基以0.5ml/min流过膜。用PBS彻底洗涤所述膜，然后用0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱抗体。从开始和洗脱2收集级分，并将其在10％SDS-PAGE凝胶上运行(图7A)。也将来自开始和洗脱2的级分转移到硝酸纤维素膜上用于蛋白质印迹分析。将硝酸纤维素膜用5％牛奶封闭。为了确认IgG的存在(图7B)，使用了山羊抗人二抗。从这些数据可以观察到抗体纯度>90％。最后，抗体保留了活性。使用蛋白质印迹分析比较了未经处理的人抗胰岛素抗体(Abcam)(图7C)与使用Z-Z-Ubx膜纯化的抗体(图7D)的功效。将胰岛素在20％丙烯酰胺凝胶上运行并转移到硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜用5％牛奶封闭。将未在膜上运行的抗体和从Z-Z-Ubx膜上洗脱的抗体作为一抗来检测胰岛素。用山羊抗人二抗(abcam)来检测一抗，并且用BioradImager对硝酸纤维素膜进行成像。纯化的抗体表现出接近野生型的活性。
序列表
<110> 邦德韦尔科技公司(Bondwell Technologies Inc.)
<120> 用于增强抗体纯化的功能化UBX蛋白材料
<130> 1043444-1187897
<150> US 62/828,142
<151> 2019-04-02
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 18
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr
20 25 30
Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr
35 40 45
Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
50 55
<210> 19
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr
20 25 30
Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr
35 40 45
Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
50 55
<210> 20
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Leu Arg Arg Arg Gly Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Glu Lys Glu Phe His Thr Asn His Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg
20 25 30
Ile Glu Met Ala His Ala Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile
35 40 45
Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Leu Lys Lys Glu Ile
50 55 60
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Met Asn Ser Tyr Phe Glu Gln Ala
1 5
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Val Arg Pro Ser Ala Cys Thr Pro Asp Ser Arg Val Gly Gly Tyr Leu
1 5 10 15
Asp Thr Ser
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Phe Tyr Pro Trp Met Ala Ile Ala
1 5
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Ser Gly Ser Gly
1
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gly Ser Gly Ser
1

Claims (13)

1.一种融合蛋白，其包含至少一种Ubx蛋白和免疫球蛋白结合蛋白。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白结合蛋白包含葡萄球菌蛋白A(SpA)的单一结构域、结构域Z或其功能变体。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其中所述葡萄球菌蛋白A(SpA)的所述结构域是E、D、A、B或C结构域。
4.如权利要求2所述的融合蛋白，其中功能性变体是蛋白G、蛋白L或蛋白A/G。
5.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白结合蛋白含有葡萄球菌蛋白A(SpA)的两个或更多个不同的单体结构域、结构域Z，或其功能变体。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其中所述葡萄球菌蛋白A(SpA)的所述两个或更多个不同的单体结构域是所述E、D、A、B或C结构域。
7.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白结合蛋白含有葡萄球菌蛋白A(SpA)的两个或更多个单体结构域、结构域Z，或其功能变体，其中所述单体结构域相同。
8.如权利要求7所述的融合蛋白，其中所述葡萄球菌蛋白A(SpA)的所述两个或更多个不同的单体结构域是E、D、A、B、C或Z结构域。
9.如权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，其中所述Ubx蛋白包含SEQ ID NO:20或其片段，并且其中所述免疫球蛋白结合蛋白包含SEQ ID NO:1或其片段。
10.一种固体基质，其包含如权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白。
11.如权利要求9所述的基质，其中所述免疫球蛋白结合蛋白从所述固体基质中的浸出得以防止或减少。
12.如权利要求9或10所述的基质，其中1mL材料的结合容量大于1g/mL。
13.一种从含有免疫球蛋白的溶液中分离出免疫球蛋白的方法，其包括：
a)使含有免疫球蛋白的溶液与权利要求10-12中任一项所述的固体基质在使所述溶液中含有的免疫球蛋白被吸附到所述基质上的条件下接触；
b)洗涤吸附的免疫球蛋白；以及
c)从所述基质中洗脱所述免疫球蛋白。
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