CN116554285A - 一种用于分离纯化免疫球蛋白的超耐碱多肽及其分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫球蛋白分离纯化技术领域，尤其涉及一种用于分离纯化免疫球蛋白的耐碱多肽及其分离方法。用于分离纯化免疫球蛋白的超耐碱多肽利用基因工程技术，在基因水平实现定向改造，制备出性能更优的突变体。突变体的B结构域N端8个氨基酸分别突变为甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸，突变体的B结构域上第13位苯丙氨酸突变为酪氨酸。该具有耐碱特性的多肽，可用于免疫球蛋白的亲和层析，具有对碱性条件的更强耐受性，对不同种属、亚型的免疫球蛋白均具有较好的亲和力，对不同pH具有更宽的耐受范围。
Description
技术领域
本发明涉及亲和色谱的领域，尤其涉及一种用于分离纯化免疫球蛋白的超耐碱多肽及其分离方法，其可用于免疫球蛋白的亲和色谱。本发明还涉及含有该超耐碱多肽的多聚体和亲和分离的基质。
背景技术
免疫球蛋白代表全世界生产或开发的最普遍的生物制药产品，而亲和色谱在大多数情况下作为这些免疫球蛋白分子（例如单克隆或多克隆抗体）纯化关键步骤中的工具之一而使用。其中一类亲和分离的基质是能够特异性结合免疫球蛋白分子中不变部分的蛋白，这种相互作用是独立于抗体的抗原结合特异性的，该种亲和分离的基质用来从不同的样本(例如血清、血浆制备物或细胞培养物来源的原料)中回收免疫球蛋白。
葡萄球菌蛋白A(SpA)含有能够结合来自不同物种IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的结构域，这些结构域通常被称为E-、D-、A-、B-和C-结构域，基于葡萄球菌蛋白A的高亲和性和选择性，已广泛用于生物技术领域，例如用于抗体的捕获和纯化的亲和色谱以及用于检测或定量。含有葡萄球菌蛋白A的亲和分离的基质是最广泛使用的从不同样本分离单克隆抗体及其片段的亲和基质。在分离纯化抗体的应用中需要保证分离抗体的活性,从葡萄球菌蛋白A的亲和分离的基质上将分离得到的抗体洗脱需要低PH条件,例如PH为3.0的甘氨酸洗脱缓冲液,而有些抗体会在低PH值下发生沉淀失活。因此，工程改造的蛋白配体的开发，配体表现出改进的高pH值情况下分离纯化抗体的能力十分重要。
发明内容
本发明旨在解决上述缺陷，提供一种用于分离纯化免疫球蛋白的超耐碱多肽。
本发明的另一个目的是提供一种在高pH值情况下分离纯化免疫球蛋白的多聚体，其包含多个上述超耐碱多肽。
本发明的再一个目的是提供一种在高pH值情况下分离纯化免疫球蛋白的亲和分离的基质。
本发明还提供一种在高pH值情况下分离纯化免疫球蛋白的方法。
为了克服背景技术中存在的缺陷，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于分离纯化免疫球蛋白的超耐碱多肽，超耐碱多肽包含葡萄球菌蛋白A 的Fc-结合结构域的突变体，或基本由葡萄球菌蛋白A 的Fc-结合结构域的突变体组成，所述突变体的序列由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所定义，或者与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2在与免疫球蛋白结合区域有至少90%、例如至少95%或98%的同一性的相应序列。
根据本发明的一个方面，所述突变体还包含在对应于SEQ ID NO.1-2中11位的位置上天冬酰胺或丝氨酸残基已经突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。
根据本发明的一个方面，所述突变体是B结构域的突变体，突变体是在葡萄球菌蛋白A 的Fc-结合结构域中B结构域上第5和第13位苯丙氨酸进行突变，降低葡萄球菌蛋白A的Fc-结合结构域对免疫球蛋白的疏水作用，提高其电荷介导的pH依赖性，使其可以高pH值情况下分离纯化免疫球蛋白。一种高PH条件下洗脱的多肽，此部分是原理。
根据本发明的一个方面，所述突变体的B结构域N端8个氨基酸分别突变为甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸，突变体的B结构域上第13位苯丙氨酸突变为酪氨酸。
一种包含上述超耐碱多肽的多聚体，所述多聚体为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体中的一种，多聚体是由上述两个或两个以上超耐碱多肽形成的多聚体，或者由上述超耐碱多肽与其他蛋白形成的多聚体，多聚体直接通过超耐碱多肽的C-末端和N-末端之间的肽键彼此连接，该多聚体可以在高pH值情况下分离纯化免疫球蛋白，其中二聚体和六聚体的氨基酸序列分别由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所定义，或者分别由SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4在与免疫球蛋白结合区域有至少90%、例如至少95%或98%的同一性的相应序列。
一种编码上述的超耐碱多肽或多聚体的核酸，其中超耐碱多肽单体核苷酸序列由SEQ ID NO.5所定义，二聚体和六聚体核苷酸序列分别由SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所定义。
一种用于亲和分离的基质，其中含有多个上述的超耐碱多肽或多聚体的配体已经偶联于固相支持体，可用来分离免疫球蛋白或其它含有Fc的蛋白，并且由于超耐碱多肽或多聚体的改进，该基质可以在高pH值情况下分离纯化免疫球蛋白。
根据本发明的一个方面，所述配体通过硫醚键与固相支持体偶联。
根据本发明的一个方面，所述固相支持体为高度交联的琼脂糖微球。
一种分离免疫球蛋白的方法，其中使用上述的基质分离免疫球蛋白，包括以下步骤：
1）装柱：向层析柱管中定量准确的加入1ml耐碱多肽柱料，待柱料全部自然沉淀直至上清清澈。将柱管接入AKTA purifier蛋白纯化仪上。
2）平衡：通过AKTA purifier用10ml平衡液平衡柱料，平衡速度约1ml/min，待基线平直平稳后准备上样。其中，所述平衡液为20mM磷酸盐，0.15M NaCl，pH7.0。
3）上样：按照1ml/min的速度上样，让填料吸附饱和，收集流出液。
4）洗杂：上样结束后，更换洗杂液冲洗柱料，洗掉杂质以及未结合的目的抗体直至吸光度值处于稳定不变化为止，流速约1ml/min，其中，所述洗杂液20mM磷酸盐，0.15MNaCl，pH7.0。
5）洗脱：洗杂完毕后，更换洗脱液，流速1ml/min，收集洗脱液，即的目的蛋白。其中，所述洗脱液0.1M甘氨酸，pH3.0。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过对天然ProteinA的结构的Fc-结合结构域的进行定点突变改造，获得的突变体具有更广泛的IgG吸附范围；
2、本发明对B结构域中11位的氨基酸进行突变，突变后的氨基酸是对碱性条件更加敏感的氨基酸序列，增加了结构域B的耐碱性。把B结构域上的第5和15位苯丙氨酸依次突变，获得了耐碱性的提升。与现有技术相比，具有对碱性条件更强的耐受性、更高的动态吸附载量以及更广泛的吸附范围。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为纯化表达的超耐碱多肽 SDS-PAGE电泳图；
图2为含有超耐碱多肽的亲和基质纯化兔血清、羊血清、人血清IgG SDS-PAGE电泳图；
图3为含有超耐碱多肽的亲和基质不同碱接触时间后纯化兔IgG SDS-PAGE电泳图；
图4 为含有超耐碱多肽的二聚体和六聚体作为亲和分离的基质的配体结合免疫球蛋白后高PH值下洗脱产物SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
含有超耐碱多肽的二聚体和六聚体的编码基因的载体的构建:
根据大肠杆菌密码子的偏好性以及避免mRNA编码区形成二级结构的倾向设计出编码含有超耐碱多肽二聚体和六聚体的核苷酸序列，分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，其对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，将核苷酸序列提交给通用系统生物公司，交由其合成并亚克隆到pet30a表达载体中。
实施例2：
含有超耐碱多肽的二聚体和六聚体的表达:
序列鉴定：将实施例1中的亚克隆产物Pet30a转化进大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗AMP）作筛选，挑取单克隆，小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
双酶切反应体系如下：
测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确后，以此重组质粒DNA转化表达超耐碱多肽的二聚体和六聚体的感受态。
诱导表达：
1）挑取重组质粒的菌体单斑至2ml LB中，37℃过夜培养，后转入到220ml LB培养基中，37℃震荡培养至OD约0.6。
2）加入IPTG诱导，继续37℃震荡培养，至耐碱多肽表达。并取部分菌液作为未诱导的对照组。
3）配基纯化：
菌体的溶解：按菌体（湿重）：菌体破碎液=1:10（kg：L）将菌体溶解于菌体破碎液中，至无可见的块状菌体；
破菌：使用高压均质机破碎已溶解的菌体，破碎压力800±100bar，破碎次数2次；
第一次去除杂蛋白：将已破碎的菌体pH调节至2.0±0.2，离心后收集离心上清液；
第二次去除杂蛋白：将第一次离心的上清液pH调节至4.2±0.1，离心后收集离心上清液。
UNIGEL 80SP层析：
上样液处理：将第二次离心的上清液pH调节至4.1±0.05，使用0.45um的滤膜过滤；
上样：过滤后的上样液上样，上样体积流速20ml/min；
上样后平衡：A液冲洗3CV（column volume）以上至UV280值趋平；
4）洗杂：洗杂液冲洗2CV；
5）洗脱：洗脱液冲洗，起峰收集：UV280值50±10mAU~50±10mAU；
再生：B液冲洗2CV以上至UV280值趋平；
CIP：1M NaOH清洗10分钟；
水洗：纯化水清洗2CV；
保存：10mM NaOH冲洗至少1CV。
纯化的产物如如图1所示。由图可以看出构建表达的耐碱多肽表达量大，产物纯度较高，无其他杂蛋白污染。
实施例3：
不同碱处理时间处理含有超耐碱多肽的二聚体和六聚体作为亲和分离的基质的配体纯化免疫球蛋白：
1）装柱：向层析柱管中定量准确的加入1ml耐碱多肽柱料，待柱料全部自然沉淀直至上清清澈，将柱管接入AKTA purifier蛋白纯化仪上；
2）平衡：通过AKTA purifier用10ml平衡液平衡柱料，平衡速度约1ml/min，待基线平直平稳后准备上样。其中，所述平衡液为20mM磷酸盐，0.15M NaCl，pH7.0；
3）上样：取出样品（分别是兔血清、羊血清和人血清），按照1ml/min的速度分别上样，让填料吸附饱和，收集流出液；
4）洗杂：上样结束后，更换洗杂液冲洗柱料，洗掉杂质以及未结合的目的抗体直至吸光度值处于稳定不变化为止，流速约1ml/min，其中，所述洗杂液20mM磷酸盐，0.15MNaCl，pH7.0；
5）洗脱：洗杂完毕后，更换洗脱液，流速1ml/min，收集洗脱液，即的目的蛋白。其中，所述洗脱液0.1M甘氨酸，pH3.0。如图2所示。由图可看出使用本方法构建的超耐碱多肽偶联亲和分离的基质，可以用来纯化兔、羊、人不同种属的免疫球蛋白，并且可以用于不同种属免疫球蛋白的分离纯化。
实施例4：
含有超耐碱多肽的二聚体和六聚体作为亲和分离的基质的配体结合免疫球蛋白后耐碱性测试。
1）装柱：先把微球匀浆到合适的水溶比，然后用滴管缓慢滴入柱子中，测试所使用的柱子为1 ml PP柱，柱管下端用注射器缓慢抽取，让球缓慢沉积，沉积到1 ml左右的时候，停止滴入，然后放入上筛板，并用柱塞塞紧。然后把装好的柱子用平衡液(Ph7.4的PBS缓冲液)进行平衡，平衡至UV线平，且数值不变的时候结束；
2）测载量：仪器AKTA purifier抗体浓度：2.15mg/ml 流速：0.5ml/min
测量结束后，先把载量图保存起来，然后用0.5mol氢氧化钠通入柱子中，通入碱的时间分别是0.5h、1h、2h、3h、6h、12h、16h、18h、24h，通过碱之后，把柱子放在25℃恒温箱中，保存24h，24h之后，再用同一抗体再次进行测其载量，洗脱的pH均为3.0。产物SDS-PAGE电泳，如图3所示。结果显示不同碱处理时间，超耐碱多肽偶联亲和配基在纯化免疫球蛋白仍然具有较高的载量，且纯化的产物无杂带，纯度高。
实施例5：
含有超耐碱多肽的二聚体和六聚体作为亲和分离的基质的配体碱处理前后洗脱产物活性测试：
1）抗体制备：正常配制抗体的比例为抗体（多抗）：缓冲液=1:50。其中，缓冲液的配制方法为100 mM NaCl和20 mM PB， pH值为7.0。配制好缓冲液后，用0.22um滤膜过滤后使用。
用体积适合的量筒量取10ml抗体置于烧杯中，然后量取500ml的过滤后的缓冲液加入烧杯中，混合均匀，然后用注射器注入上样环中，并且排空上样环中的气泡。
2）装柱：先把微球匀浆到合适的水溶比，然后用滴管缓慢滴入柱子中，
测试所使用的柱子为1 ml PP柱，柱管下端用注射器缓慢抽取，让球缓慢沉积，沉积到1 ml左右的时候，停止滴入，然后放入上筛板，并用柱塞塞紧。然后把装好的柱子用平衡液(Ph7.4的PBS缓冲液)进行平衡，平衡至UV线平，且数值不变的时候结束。
3）碱处理：仪器AKTA purifier抗体浓度：2.15mg/ml 流速：0.5ml/min测量结束后，先把载量图保存起来，然后用0.5mol氢氧化钠通入柱子中，通入碱的总量为30ml，通过碱之后，把柱子放在25℃恒温箱中，保存24h，24h之后，再用同一抗体再次进行测其载量。
3）洗脱：仪器AKTA purifier，抗体浓度为2mg/ml ,流速为0.5ml/min，洗脱的pH分别为3.0。测量数值如下表1所示。
表1:
| 编号 | 处理前浓度值 | 处理后浓度值 |
| 1 | 9.48 | 9.9 |
| 2 | 8.83 | 8.22 |
| 3 | 9.76 | 9.71 |
| 4 | 10.98 | 10.90 |
| 5 | 10.69 | 10.69 |
| 6 | 9.9 | 9.8 |
4）为了确认含有超耐碱多肽的二聚体和六聚体作为亲和分离的基质的配体结合免疫球蛋白后高PH值下洗脱产物免疫球蛋白的亲和力，通过ELISA的方法，将该耐碱多肽进行包被，利用生物素化的不同种属IgG来结合耐碱多肽，最后使用HRP标记的链霉亲和素进行检测。通过酶标仪检测OD450读数来判断亲和力的强弱。如图4所示。碱处理前，表达的SRBD与SLAB05结合的EC50位0.06ug/ml，碱处理后，表达的SRBD与SLAB05结合的EC50位0.06ug/ml，从EC50上来看并没有太大的区别，说明碱处理前后纯化出来的抗体具有相同的效价。说明本发明提供的免疫球蛋白结合的耐碱多肽纯化的产物依然具有相同的活性。
序列表：
SEQ ID NO.1：
ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKA；
SEQ ID NO.2：
GDAQHDEAQQNAYYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
二聚体氨基酸序列：
SEQ ID NO.3：
GDAQHDEAQQNAYYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGDAQHDEAQQNAYYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
六聚体氨基酸序列：
SEQ ID NO.4：
GDAQHDEAQQNAYYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGDAQHDEAQQNAYYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGDAQHDEAQQNAYYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGDAQHDEAQQNAYYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGDAQHDEAQQNAYYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGDAQHDEAQQNAYYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
超耐碱多肽单体核苷酸序列：
SEQ ID NO.5：
GGCGATGCTCAGCACGACGAGGCTCAGCAGAACGCTTATTATGAAATCCTGCACCTGCCGAACCTGACCGAAGAACAGCGTAACGCTTTCATTCAGAGCCTGAAGGATGACCCAAGCCAGAGCGCTAACCTGCTGGCTGAAGCGAAAAAACTGAACGACGCGCAGGCCCCGAAA；
二聚体核苷酸序列：
SEQ ID NO.6：
GGTGACGCACAGCATGACGAAGCGCAGCAGAACGCTTATTACGAAATCCTGCACCTGCCTAACCTGACCGAAGAACAGCGTAACGCTTTTATTCAATCTCTGAAAGACGACCCGAGCCAGTCCGCGAACCTGCTGGCAGAAGCGAAAAAACTGAACGACGCTCAGGCGCCGAAAGGTGATGCTCAGCACGACGAAGCTCAGCAGAACGCATACTACGAGATTCTGCACCTGCCGAACCTGACTGAAGAACAGCGTAACGCGTTCATCCAGTCTCTGAAAGACGATCCGTCTCAGTCTGCTAATCTGCTGGCAGAGGCCAAAAAACTGAACGATGCACAGGCTCCTAAA；
六聚体核苷酸序列：
SEQ ID NO.7：
GGTGATGCACAACACGACGAAGCGCAACAGAATGCATACTACGAAATTCTGCACCTGCCGAACCTGACCGAAGAACAGCGCAACGCATTCATCCAGTCTCTGAAAGACGACCCGTCTCAGTCTGCTAACCTGCTGGCAGAAGCGAAAAAACTGAACGATGCTCAGGCGCCGAAAGGCGATGCCCAGCACGACGAAGCCCAGCAGAACGCTTATTATGAAATCCTGCACCTGCCGAACCTGACCGAGGAACAGCGTAACGCCTTCATCCAGAGCCTGAAAGACGATCCGTCTCAGTCCGCGAACCTGCTGGCAGAGGCGAAAAAACTGAACGATGCTCAAGCACCGAAGGGTGATGCGCAACACGACGAAGCTCAGCAGAACGCTTACTACGAAATCCTGCACCTGCCGAACCTGACTGAAGAACAGCGTAATGCTTTTATCCAGTCTCTGAAGGACGACCCGTCCCAATCCGCAAACCTGCTGGCGGAAGCGAAAAAACTGAACGATGCTCAGGCGCCTAAAGGCGATGCACAGCACGACGAGGCCCAGCAGAACGCTTACTACGAAATCCTGCACCTGCCGAACCTGACCGAAGAACAGCGTAACGCGTTCATCCAGTCTCTGAAAGACGACCCGTCTCAGTCTGCCAACCTGCTGGCAGAGGCGAAAAAACTGAATGACGCGCAGGCCCCTAAAGGTGACGCGCAGCACGACGAAGCCCAGCAGAACGCTTATTATGAGATCCTGCACCTGCCGAACCTGACGGAAGAGCAGCGCAACGCATTCATTCAGAGCCTGAAAGATGACCCGTCCCAATCCGCTAACCTGCTGGCTGAGGCGAAAAAACTGAATGACGCACAGGCCCCGAAAGGTGACGCACAGCACGACGAAGCACAACAGAACGCATATTATGAAATCCTGCACCTGCCGAACCTGACTGAAGAACAGCGTAACGCTTTCATCCAGAGCCTGAAAGATGATCCGTCCCAGTCTGCAAATCTGCTGGCCGAAGCGAAGAAACTGAACGACGCGCAGGCTCCGAAA。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于分离纯化免疫球蛋白的超耐碱多肽，其特征在于：所述超耐碱多肽包含葡萄球菌蛋白A 的Fc-结合结构域的突变体，或基本由葡萄球菌蛋白A 的Fc-结合结构域的突变体组成，所述突变体的序列由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所定义。
2.如权利要求1所述的用于分离纯化免疫球蛋白的超耐碱多肽，其特征在于：所述突变体还包含在对应于SEQ ID NO.1-2中11位的位置上天冬酰胺或丝氨酸残基已经突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。
3.如权利要求1所述的用于分离纯化免疫球蛋白的超耐碱多肽，其特征在于：所述突变体是B结构域的突变体，突变体是在葡萄球菌蛋白A 的Fc-结合结构域中B结构域上第5和第13位苯丙氨酸进行突变。
4.如权利要求1所述的用于分离纯化免疫球蛋白的超耐碱多肽，其特征在于：所述突变体的B结构域N端8个氨基酸分别突变为甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸，突变体的B结构域上第13位苯丙氨酸突变为酪氨酸。
5.一种包含权利要求1-4中任一所述的超耐碱多肽的多聚体，其特征在于：所述多聚体为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体中的一种。
6.一种编码权利要求1-5中任一所述的超耐碱多肽或多聚体的核酸。
7.一种用于亲和分离的基质，其中含有多个权利要求1-5中任一所述的超耐碱多肽或多聚体的配体已经偶联于固相支持体。
8.如权利要求7所述的一种用于亲和分离的基质，其特征在于：所述配体通过硫醚键与固相支持体偶联。
9.如权利要求8所述的一种用于亲和分离的基质，其特征在于：所述固相支持体为聚合物微球、琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、聚碳酸脂、消化纤维、二氧化硅、磁性微球等和多孔板表面载体。
10.一种分离免疫球蛋白的超耐碱多肽的方法，其特征在于，使用权利要求7-9中任一所述的基质分离免疫球蛋白，该方法包括以下步骤:
1）装柱：向层析柱管中定量准确的加入1ml耐碱多肽柱料，待柱料全部自然沉淀直至上清清澈，盖上柱管盖，将柱管接入AKTA purifier蛋白纯化仪上；
2）平衡：通过AKTA purifier用10ml平衡液平衡柱料，平衡速度为1ml/min，待基线平直平稳后准备上样，其中，所述平衡液为20mM磷酸盐，0.15M NaCl，pH7.0；
3）上样：按照1ml/min的速度上样，让填料吸附饱和，抗体样品中的IgG与填料上的耐碱多肽亲和吸附，其他流出，收集流出液；
4）洗杂：上样结束后，更换洗杂液冲洗柱料，洗掉杂质以及未结合的目的抗体直至吸光度值处于稳定不变化为止，流速约1ml/min，其中，所述洗杂液为20mM磷酸盐，0.15M NaCl，pH7.0；
5）洗脱：洗杂完毕后，更换洗脱液0.1M甘氨酸，pH3.0，流速1ml/min，收集洗脱液，即目的蛋白。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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