CN114605508A

CN114605508A - 能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN114605508A
Application number: CN202210510303.2A
Authority: CN
Inventors: 肖秀孝; 刘鹏飞; 郑长龙; 赵占勇
Original assignee: Beijing Dacheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Dacheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-11
Filing date: 2022-05-11
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-05-11
Also published as: CN114605508B

Abstract

本发明公开了能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白，为如下（a）或（b）或（c）或（d）的蛋白质：（a）如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，（b）如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，（c）如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，（d）如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有与免疫球蛋白抗体分子Fc区域的结合能力增强的各自分别衍生的蛋白质。本发明还公开了抗体结合蛋白于分离免疫球蛋白抗体和/或试剂盒制备中的应用。本发明的抗体结合蛋白在制作为基质后，可长时间承受在位清洗，并保持较长的使用寿命，为工业抗体行业带来便利及减少了生产成本。

Description

能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质领域，具体涉及能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白及其应用。

背景技术

抗体（antibody, Ab）是由效应淋巴B细胞分泌，机体用于鉴别与中和外来物质，如病毒、细菌等抗原，结构呈“Y”字型的球状蛋白质，因此也叫免疫球蛋白。凡是能够跟抗体结合的物质，均被称作抗原，因此对于抗抗体（能够结合抗体的抗体）来说，抗体也是一种抗原物质。普通的免疫球蛋白具有2条重链（H链），分子量约为50kD，有μ、δ、γ、ε和α五种重链亚型，对应的免疫球蛋白名称分别为IgM、IgD、IgG、IgE和IgA。单克隆抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值，如免疫检验和生物治疗。

金黄色葡萄球菌蛋白A（staphylococcal protein A，SPA）是表达于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁上的一种表面蛋白。SPA包含五个同源的结构域（EDABC），每个结构域有大约58个氨基酸残基组成，呈反向平行的3股α螺旋结构。螺旋结构彼此靠近，形成疏水的核心并包含大多数疏水残基，进一步保证了结构的稳定性。五个SPET-A结构域对Fc片段表现出不同的亲和力，也能结合IgA和IgM。SPET-A在生物技术领域具有广泛的应用，如亲和抗体纯化，抗体检测。

许多生物技术产品需要从含有抗体的样品中去除污染物。抗体需要用亲和层析捕获和纯化抗体，对产品纯度以及杂质残留量（宿主蛋白HCP，宿主核酸，内毒素，脱落ProteinA）要求非常严格。根据实验设计理念，抗体最终质量源于生产过程的设计和控制。而在抗体的生产纯化过程中，如何做到有效的在位清洗以避免细菌，内毒素以及病毒的污染是至关重要的。一般0.1-1 M NaOH可以有效的对系统以及层析介质进行在位清洗（cleaning-in-place，CIP），可以有效的防止因清洗不彻底导致产品的交叉污染现象。然而，特别地，基于野生型蛋白A的色谱基质在暴露于碱性条件后显示出对免疫球蛋白的结合能力的损失。这就需要突变改造后的耐碱填料可承受0.5-1 M 的 NaOH 进行在位清洗，同时保持较长的使用寿命，为工业抗体行业带来极大的便利以及减少生产成本。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

因此，本发明还有一个目的是提供一种能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白。其在强碱pH值下显示出提高的稳定性，因此与亲本分子相比对在碱性条件下的在位清洗有提高的耐受性。

本发明另有一个目的是提供能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白的多聚体，其特异性地结合于抗体IgG的Fc片段。

本发明另有一个目的是提供DNA分子。

本发明另有一个目的是提供用于亲和纯化的基质。

本发明另有一个目的是提供一种分离免疫球蛋白抗体的方法。

本发明另有一个目的是提供所述的抗体结合蛋白或所述的抗体结合蛋白的多聚体于分离免疫球蛋白抗体和/或试剂盒制备中的应用。

为此，本发明提供的技术方案为：

能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白，所述抗体结合蛋白在与免疫球蛋白抗体分子Fc区域的结合中提供增强的结合能力，所述抗体结合蛋白为如下（a）或（b）或（c）的蛋白质：

（a）如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，突变体A(N4E/N11T)-Cys，

（b）如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，突变体A(N4E/N11T/N21A) -Cys，

（c）如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，突变体A(N4E/N11T/N21A/N28E)-Cys，

（d）如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有与免疫球蛋白抗体分子Fc区域的结合能力增强的各自分别衍生的蛋白质。SEQ IDNO：1为金黄色葡萄球菌protein A的A结构域。与亲本分子相比，所述抗体结合蛋白显示出在碱性pH值下提高的化学稳定性。

能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白的多聚体，所述多聚体为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体。优选的是，各个抗体结合蛋白单体的四聚体。

DNA分子，所述DNA分子编码所述的抗体结合蛋白。如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列编码如如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列编码如如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列编码如如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列编码如如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

一种重组载体，其含有所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。

宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的DNA分子或所述的重组载体。

用于亲和纯化的基质，所述基质负载有所述的抗体结合蛋白或所述的抗体结合蛋白的多聚体。该突变蛋白可作为配基生产的抗体亲和填料。该基质含有能够优选地通过它们的 Fc片段结合抗体IgG的突变蛋白配体，这些配体与亲本分子相比在强碱pH下显示出提高的耐受性。

优选的是，用于亲和纯化的基质，所述基质为所述的抗体结合蛋白通过硫醚键偶联于琼脂糖固相载体上形成。

一种分离免疫球蛋白抗体的方法，利用所述的抗体结合蛋白或所述的抗体结合蛋白的多聚体或所述的基质进行分离。

优选的是，所述的分离免疫球蛋白抗体的方法中，所述抗体是IgG。

所述的抗体结合蛋白或所述的抗体结合蛋白的多聚体于分离免疫球蛋白抗体和/或试剂盒制备中的应用。

本发明的突变的抗体结合蛋白，与亲本分子相比，至少两个天冬酰胺残基突变为除了谷氨酰胺残基之外的其它氨基酸，该突变在pH值为12-14时赋予了增加的化学稳定性，该突变蛋白可来自诸如protein A，且优选地为金黄色葡萄球菌protein A的A结构域。本发明也涉及一种用于亲和层析的基质，其含有采用定点偶联的方法进行偶联的配基——抗体结合蛋白，其中的配基至少两个天冬酰胺残基突变为除了谷氨酰胺残基之外的其它氨基酸。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明的抗体结合蛋白，在pH值为12-14时表现出增加的化学稳定性，适合作为亲和纯化的配体。并且，本发明的抗体结合蛋白在制作为基质后，可长时间承受0.5-1M 的NaOH的在位清洗，同时保持较长的使用寿命，为工业抗体客户带来极大的便利以及减少了生产成本。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明实施例中质粒pET-A(N4E/N11T/N21A/N28E)-CyS的图谱，其编码A(N4E/N11T/N21A/N28E)-CyS的基因。

图2为本发明实施例中质粒pET-A(N4E/N11T/N21A/N28E)四聚体-CyS的图谱，其编码A(N4E/N11T/N21A/N28E)四聚体-CyS的基因。

图3为本发明其中一个实施例中的优选突变蛋白进行碱处理（原位清洗）之后获得的与不稳定的A结构域蛋白相比较的结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明涉及一种能够结合于抗体分子的Fc区的抗体结合蛋白，其中至少两个天冬酰胺残基突变为除了谷氨酰胺残基之外的其它氨基酸，与亲本分子相比该突变增加了在碱性pH值下的化学稳定性。

对于增加的pH值，例如10-14通常表示碱性的条件。或者，碱性条件可通过NaOH的浓度来定义，通常地在0.5M-1.0M的范围内。

本发明的突变蛋白的增加的化学稳定性可被本领域的技术人员很容易地证实，例如通过用NaOH以1M 浓度进行常规处理，增加的稳定性是指与亲本分子相比初始稳定性被保持较长的一段时间。尽管文献专利已经报道了关于结合葡萄球菌蛋白A的结构域的类似的突变，比如Z结构域，以及在Z结构域基础上的突变蛋白。然而，本发明把A结构域的多个天冬酰胺残基的突变令人惊讶地提供了增加的化学稳定性以及在碱性pH环境中的降低的降解速率。

因此，本发明提供了一种突变抗体结合蛋白，例如作为蛋白配体用于亲和吸附抗体IgG，吸附的目的可用于生产高纯度抗体，诸如纯化含有羊多抗的血清，或细胞培养上清中的单抗。本发明的配体显示出足以耐受常规的碱洗达较长的一段时间的化学稳定性，这使得该配体成为有较大成本效益的能大量生产的候选物。

相应地，在本发明的蛋白中，其中至少两个天冬酰胺（N）残基己经突变为选自由下列氨基酸组成的氨基酸：甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸(Ile）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、组氨酸（His）、赖氨酸（Lys）或脯氨酸（Pro)。

抗体结合蛋白可以是任意的具有天然抗体结合能力的蛋白，诸如金黄色葡萄球菌蛋白 A( SPA）或链球菌G蛋白（SPG）。

在一个实施方案中，本发明为一种突变蛋白，其至少包括抗体结合蛋白的结合区域并且其中在所述区域内存在至少两个天冬酰胺突变。

在本文的说明书中，SEQ ID NO: 1限定了SPA的A结构域的氨基酸序列。

在一个实施方案中，突变蛋白含有SEQ ID NO: 1氨基酸序列，或是其功能性变体。术语“功能性变体”包括任意类似的氨基酸序列，该序列包含两个或多个天冬酰胺突变，具体表现为在增加 pH 值的条件下维持更长的时间且不影响突变体蛋白对抗体的亲合力或增加的化学稳定性。

在一个有利的实施方案中，本发明的突变选自由N4E/N11T、N4E/N11T/N21A和N4E/N11T/N21A/N28E组成的组；其中亲本分子包括由SEQ ID NO: 1所限定的序列。在一个实施方案中，在位置21处的天冬酰胺残基没有突变。在一个实施方案中，序列SEQ ID NO: 1的位置28处的天冬酰胺残基己突变为例如丝氨酸残基。本发明的关于可以认为 SPA的A结构域的不同天冬酰胺残基对突变蛋白的亲合力和稳定性特性具有卓越的贡献的发现是完全出乎意料的。

因此，本发明包括上述讨论的单体突变体蛋白。然而，这种蛋白单体可结合为多聚体蛋白，诸如二聚体、四聚体等。相应地，本发明的另一个方面是一种由至少一个本发明的突变体蛋白与一个或多个其它的单元，优选地同样为本发明的突变体蛋白组成的多聚体。因此，本发明是例如由四个重复或非重复单元组成的四聚体。

在目前最好的实施方案中，多聚体是含有突变N4E/N11T/N21A/N28E的SPA的A结构域的四聚体。

在进一步的方面，本发明涉及编码上述突变体蛋白或多聚体的核酸。相应地，本发明包括了用生物技术方法在重组的大肠杆菌宿主中生产突变体蛋白核酸。因此，本发明的另一个方面是一种表达系统，其能够产生上述的突变体蛋白。优选地，该表达系统是原核表达系统。

当然，本发明的突变体蛋白或多聚体可选择地通过合成方法来生产。相应地，本发明同样包括生产本发明的突变体蛋白或多聚体的合成方法。

在另一个方面，本发明涉及一种用于亲合分离的基质，该基质包含与固相载体偶联的作为配体的抗体结合蛋白，其中在该蛋白中至少两个天冬酰胺残基己突变为除了谷氨酰胺之外的氨基酸。本发明的基质，当与由作为配体的亲本分子组成的基质相比时，在多次CIP过程中显示出增加的结合能力。突变的蛋白配体优选地为结合 Fc片段的蛋白，优选抗体是IgG。

本发明的基质可含有如上所述的任意实施方案中作为配体的突变体蛋白。在最优选的实施方案中，配体为如上所述的多聚体。

本发明的基质的固相载体可以是任意合适的种类。在一个实施方案中，载体可以例如基于多糖，诸如纤维素、支链淀粉、交联琼脂糖等。在最优选的实施方案中，固相载体是多孔的琼脂糖珠。在一个有利的实施方案中，载体己被改造来增加其刚性，由此使得基质更适用于高流速。

可以通过利用例如存在于配体中的巯基、氨基和/或羧基基团的常规偶联技术将配体附着于载体。三(2-羧乙基)膦（TECP）、溴化氰、马来酰亚胺、环氧乙烷基、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、三嗪（triazine）、高碘酸盐（periodate）、羰酰二咪唑（carbonyldiimidazole）、2,4,6-三氟5-氯吡啶（FCP）、乙二酸酰肼（adipic acid dihydrazide）、二乙烯砜（divinylsulfone）等是公知的偶联试剂。可选择地，配体可通过非共价键附着于载体上。

在一个有利的实施方案中，为配体提供一个用于偶联的C末端半胱氨酸残基，配体通过硫醚键与载体相偶联。进行这种偶联的方法在本领域是众所周知的。

如上所述，对抗体的亲和性即配体的结合特性，基质的载量在通过用碱性试剂处理时基本没有改变。通常进行亲和性分离时对基质的在位清洗，所用的碱性试剂为 NaOH且其浓度最高达1M。

因此，另一种表征本发明基质的方式是，上述的突变在用1M NaOH处理12h之后，其结合能力将减少到大约60 %，优选地大约70％，且更优选地大约75%。

在进一步的方面，本发明涉及一种分离抗体，诸如lgG的方法，其中使用了本发明的抗体结合蛋白、多聚体或基质。因此，本发明包含了抗体亲和层析分离的方法，其中通过吸附于如上所述的抗体结合蛋白或多聚体或基质来从液体中分离抗体。因此，本发明在此方面涉及了亲和层析，其是一种广泛使用且众所周知的分离技术。即，让含有上述抗体的溶液，在一定的保留时间和离子强度条件下流经分离基质。然而，溶液的其它组分将基本上不受阻碍地通过。然后用PB溶液洗涤基质，来除去保留的或结合不牢固的杂质。随后，用洗脱液流经该基质来释放抗体。此条件通常通过改变pH、离子强度、疏水性等来提供。

最后，本发明也包括上述突变体蛋白的其它应用，诸如用于分析方法、用于临床诊断等。

以下参照具体的实施例方式来描述本发明。本领域技术人员能够理解；下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

为了分析在碱性条件下造成不稳定性的A结构域中的天冬酰胺，进行了突变分析。已报道天冬氨酸在碱性条件中是敏感的。

实施例1：A结构域的突变、载体构建、表达和纯化

结构域A-Cys基因由上海朗晶合成，突变体A(N4E/N11T)-Cys、A(N4E/N11T/N21A)-Cys和A(N4E/N11T/N21A/N28E)-Cys先后由两步聚合酶链式反应技术进行定点诱变，克隆到质粒pET-30a(+)中。在克隆过程中使用大肠杆菌菌株DH5α，而蛋白表达用BL21(DE3)。

载体pET-A(N4E/N11T)-Cys构建，将质粒pET-A-Cys用作模板。通过寡核苷酸对ggagatatacatatgGCTGACAACGAATTCAACAAAGAACAGCAGACC（SEQ ID NO: 9）和agccggatcctcgagttaGCATTTCGGAGCCTGAGAT（SEQ ID NO: 10）进行PCR扩增A(N4E/N11T)-Cys，同源重组得到载体pET-A(N4E/N11T)-Cys。

载体pET-A(N4E/N11T/N21A)-Cys构建，将质粒pET-A(N4E/N11T)-Cys用作模板。通过寡核苷酸对ggagatatacatatgGCTGACAACGAATTCAACAAAGAACAGCAGACCGCTTTCTACGAAATCCTGAACATGCCGGCT（SEQ ID NO: 11）和agccggatcctcgagttaGCATTTCGGAGCCTGAGAT（SEQ IDNO: 12）进行PCR扩增A(N4E/N11T/N21A)-Cys，同源重组得到载体pET-A(N4E/N11T/N21A)-Cys。

载体pET-A(N4E/N11T/N21A/N28E)-Cys构建，将质粒pET-A(N4E/N11T/N21A)-Cys用作模板。通过寡核苷酸对ggagatatacatatgGCTGACAACGAATTCAAC（SEQ ID NO: 13）和ttcacgctgttcttcGTTC（SEQ ID NO: 14）进行PCR扩增片段1，通过寡核苷酸对gaagaacagcgtgaaGGCTTCATCCAGTCTC（SEQ ID NO: 15）和agccggatcctcgagttaGCATTTCGGAGCCTGAGAT（SEQ ID NO: 16）进行PCR扩增片段2，同源重组得到载体pET-A(N4E/N11T/N21A/N28E)-Cys。如图1所示。

所有的A变体都在大肠杆菌中成功表达，由凝胶电泳并考马斯亮蓝染色估计产量大约为70 mg/L。通过IgG亲和层析纯化变体蛋白。

实施例2：突变蛋白四聚体的载体构建、表达和纯化

把突变蛋白A(N4E/N11T)四聚体-Cys、A(N4E/N11T/N21A)四聚体-Cys和A(N4E/N11T/N21A/N28E)四聚体-Cys的基因克隆到pET-30a(+)载体中。在克隆过程中使用大肠杆菌菌株DH5α，而蛋白表达用BL21(DE3)。

载体pET-A(N4E/N11T/N21A/N28E)四聚体-Cys构建，将质粒pET-A(N4E/N11T/N21A/N28E)-Cys用作模板。通过寡核苷酸对ggagatatacatatgGCTGACAACGAATTCAAC（SEQ IDNO: 17）和ttgtcagcTTTCGGAGCCTGAGATTC（SEQ ID NO: 18）进行PCR扩增片段3，通过寡核苷酸对ctccgaaaGCTGACAACGAATTCAAC（SEQ ID NO: 19）和agccggatcctcgagttaGCATTTCGGAGCCTGAGAT（SEQ ID NO: 20）进行PCR扩增片段4，通过寡核苷酸对ctccgaaaGCTGACAACGAATTCAAC（SEQ ID NO: 21）和ttgtcagcTTTCGGAGCCTGAGATTC（SEQ IDNO: 22）进行PCR扩增片段5，分别胶回收后，加入酶切后的pET-30a(+)：片段3：片段4：片段5的摩尔比为1：3：3：(3-9)。同源重组后菌落PCR鉴定得到二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等一系列不同的多聚体，筛选得到载体pET-A(N4E/N11T/N21A/N28E)-Cys。如图2所示。

载体pET-A(N4E/N11T/N21A)四聚体-Cys和pET-A(N4E/N11T)四聚体-Cys构建同理上述方法。通过擎科生物的测序设备进行分析来验证正确的序列。

所有的A变体四聚体蛋白都在大肠杆菌中成功表达，由凝胶电泳并考马斯亮蓝染色估计产量大约为65 mg/L。通过IgG亲和层析纯化变体蛋白四聚体。

实施例 3：BIACORE分析耐碱性

为了检测不同突变蛋白及突变蛋白四聚体的耐碱性能，通过标准的亲和性基质来分析作为亲和配体的结构域A的变体的特性。

使用BIACORE 3000仪器（GE Healthcare）监测暴露于NaOH后每个纯化重组蛋白与人IgG结合能力的变化。根据制造商的建议，使用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N-乙基-N′-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）化学，通过氨基偶联将人IgG固定在CM5传感器芯片（GEHealthcare）的羧化葡聚糖表面。在NHS/EDC活化后，立即用乙醇胺封闭芯片上多余的有活性的羧基。通过在含有0.15 M NaCl的20 mM磷酸钠（pH 7.4）中稀释制备1 mg/mL人IgG溶液。在用于该固定化过程之前，将IgG溶液进一步稀释在10 mM醋酸钠（pH4.5）中。为了分析IgG结合亲和力，使用流动缓冲液（20 mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，150 mM NaCl，0.005% P-20，pH7.4）为每种蛋白质制备三种不同蛋白质浓度（10至1000 nM）的溶液，并将每种蛋白质溶液添加到传感器芯片上。为了分析它们的耐碱性，将每种蛋白质调节到一个共同的浓度后，诸如30 µM，与特定量的1M NaOH，并在室温下孵育特定时间。随后，向每种混合物中添加1 MHCl以中和溶液。在流动缓冲液（20 mM磷酸钠，0.15 mNaCl，0.005% P-20，pH7.4）中进一步将溶液稀释1:1。在碱处理之前，也以相同的方式制备蛋白质溶液。碱处理前后的每种蛋白质溶液以20 µL/min的流速应用于传感器芯片，并使用50 mM NaOH再生表面。使用BIA评估软件对数据进行分析。采用1:1朗缪尔模型计算结合速率常数k_on（M⁻¹s⁻¹），解离速率常数k_off（s⁻¹），以及结合常数K_a（M⁻¹）。全局拟合法用于确定每个突变体对IgG的亲和常数，局部拟合法用于分析其碱性稳定性。对于碱性稳定性分析，在拟合分析中，将浓度设置为处理前后保持恒定。通过计算每个突变体碱处理后的R_max相对于碱处理前的R_max值，即残余IgG结合活性（%），评估耐碱性。

结果（实施例 3）

对照A-Cys蛋白经过24 h碱处理后，残余IgG结合活性仅为9%；而突变体A(N4E/N11T)-Cys的亲和力与对照蛋白相近，但经过24 h碱处理后，残余IgG结合活性为60%；而突变体A(N4E/N11T/N21A)-Cys的亲和力比对照蛋白更强，在经过24 h碱处理后，残余IgG结合活性为67%；进一步增加N28E突变后，突变体A(N4E/N11T/N21A/N28E)-Cys的高亲和力没有降低，在经过24 h碱处理后，残余IgG结合活性为75%，表现出极强的耐碱性。这些数据使得A(N4E/N11T)、A(N4E/N11T/N21A)和A(N4E/N11T/N21A/N28E)成为亲和纯化的配体。

表1.动力学数据

实施例4：亲和基质的制备

为了证明优选地突变蛋白的可靠性，根据BIACORE 3000仪器对突变蛋白动力学和耐碱性的实验结果，选择A-Cys作为对照配基，A(N4E/N11T/N21A/N28E)-Cys和A(N4E/N11T/N21A/N28E)四聚体-Cys作为优选配基，首先发酵生产上述蛋白，收获菌体并纯化。

制备亲和填料。SulfoLink偶联树脂是一种已经过碘乙酸基团活化的多孔交联6%微珠状琼脂糖，用于实现半胱氨酸蛋白和其他巯基分子的共价固定。根据供应商的建议，用含还原半胱氨酸残基的A-Cys和优选变体蛋白溶液孵育，SulfoLink树脂碘乙酸基团与暴露的巯基 (-SH) 发生特异性高效反应，形成永久性地将突变蛋白连接到树脂的共价且不可逆硫醚键。将基质装柱，使种体积为5 ml。

以下缓冲液在使用前用 0.45 μm 滤膜过滤并超声脱气。

结合/洗杂缓冲液：0.15 M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH7.0

洗脱缓冲液： 0.1 M 甘氨酸，pH3.0

中和缓冲液：1 M Tris-HCl，pH8.5

终止缓冲液：50 mM Tris-HCl， pH7.5

再生缓冲液：1 M NaOH

在结合/洗杂缓冲液缓冲液中配制人的IgG1并过量注射到亲和柱上。在纯化仪上进行标准的亲和层析流程24个循环。将一个CIP步骤整合到每一循环之间。再生缓冲液清洗亲和柱，每一次清洗的接触时间为60分钟，结果形成24小时的总接触时间。在280纳米处检测洗脱的物质。在每一循环之后测定洗脱的hIgG1的量来测定柱的总容量。

如图3所示，A(N4E/N11T/N21A/N28E)-Cys和A(N4E/N11T/N21A/N28E)四聚体-Cys与A-Cys相比显示出提高的耐碱性。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京达成生物科技有限公司

<120> 能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白及其应用

<130> 2021

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 59

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌蛋白 A（staphylococcal protein A，SPA）

<400> 1

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<212> PRT

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Leu Asn Met Pro Ala Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Cys

50 55

<210> 4

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ala Asp Asn Glu Phe Asn Lys Glu Gln Gln Thr Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Ala Leu Asn Glu Glu Gln Arg Glu Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Cys

50 55

<210> 5

<211> 177

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌蛋白 A（staphylococcal protein A，SPA）

<400> 5

gctgacaaca acttcaacaa agaacagcag aacgctttct acgaaatcct gaacatgccg 60

aacctgaacg aagaacagcg taacggtttc atccagtctc tgaaagacga cccgtctcag 120

tctgctaacc tgctgtctga agctaaaaaa ctgaacgaat ctcaggctcc gaaatgc 177

<210> 6

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctgacaacg aattcaacaa agaacagcag accgctttct acgaaatcct gaacatgccg 60

aacctgaacg aagaacagcg taacggtttc atccagtctc tgaaagacga cccgtctcag 120

tctgctaacc tgctgtctga agctaaaaaa ctgaacgaat ctcaggctcc gaaatgc 177

<210> 7

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctgacaacg aattcaacaa agaacagcag accgctttct acgaaatcct gaacatgccg 60

gctctgaacg aagaacagcg taacggtttc atccagtctc tgaaagacga cccgtctcag 120

tctgctaacc tgctgtctga agctaaaaaa ctgaacgaat ctcaggctcc gaaatgc 177

<210> 8

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctgacaacg aattcaacaa agaacagcag accgctttct acgaaatcct gaacatgccg 60

gctctgaacg aagaacagcg tgaaggtttc atccagtctc tgaaagacga cccgtctcag 120

tctgctaacc tgctgtctga agctaaaaaa ctgaacgaat ctcaggctcc gaaatgc 177

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggagatatac atatggctga caacgaattc aacaaagaac agcagacc 48

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agccggatcc tcgagttagc atttcggagc ctgagat 37

<210> 11

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggagatatac atatggctga caacgaattc aacaaagaac agcagaccgc tttctacgaa 60

atcctgaaca tgccggct 78

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agccggatcc tcgagttagc atttcggagc ctgagat 37

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggagatatac atatggctga caacgaattc aac 33

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttcacgctgt tcttcgttc 19

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaagaacagc gtgaaggctt catccagtct c 31

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agccggatcc tcgagttagc atttcggagc ctgagat 37

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggagatatac atatggctga caacgaattc aac 33

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttgtcagctt tcggagcctg agattc 26

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctccgaaagc tgacaacgaa ttcaac 26

<210> 20

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agccggatcc tcgagttagc atttcggagc ctgagat 37

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctccgaaagc tgacaacgaa ttcaac 26

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttgtcagctt tcggagcctg agattc 26

Claims

1.能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白，所述抗体结合蛋白在与免疫球蛋白抗体分子Fc区域的结合中提供增强的结合能力，所述抗体结合蛋白为如下（a）或（b）或（c）或（d）的蛋白质：

（a）如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，

（b）如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，

（c）如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，

（d）如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有与免疫球蛋白抗体分子Fc区域的结合能力增强的各自分别衍生的蛋白质。

2.如权利要求1所述的能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白的多聚体，其特征在于，所述多聚体为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体。

3.DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码如权利要求1所述的抗体结合蛋白。

4.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求3所述的DNA分子和与所述DNA分子可操作地连接的用于表达的调节序列。

5.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的DNA分子或权利要求4所述的重组载体。

6.用于亲和纯化的基质，其特征在于，所述基质负载有如权利要求1所述的抗体结合蛋白或如权利要求2所述的抗体结合蛋白的多聚体。

7.一种分离免疫球蛋白抗体的方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的抗体结合蛋白或如权利要求2所述的抗体结合蛋白的多聚体或如权利要求6所述的基质进行分离。

8.如权利要求7所述的分离免疫球蛋白抗体的方法，其特征在于，所述抗体是IgG。

9.如权利要求1所述的抗体结合蛋白或如权利要求2所述的抗体结合蛋白的多聚体于分离免疫球蛋白抗体和/或试剂盒制备中的应用。