CN108905990A - 一种突变蛋白A（Protein A）亲和层析介质 - Google Patents

一种突变蛋白A（Protein A）亲和层析介质 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种突变蛋白A（Protein A）（protein A）亲和层析介质，所述蛋白A（Protein A）亲和层析介质作为层析介质应用于抗体及Fc融合蛋白的分离纯化中，所述突变蛋白A（Protein A）亲和层析介质以含基因工程修饰葡萄球菌蛋白A（Protein A）、琼脂糖或葡聚糖凝胶微球为基质，经亲水性树枝状大分子修饰、活化、偶联蛋白A（Protein A）配基并封尾后得到，所述蛋修饰白A亲和层析介质为多孔微球介质。本发明中的蛋白A（Protein A）层析介质结构稳定、软硬适中、粒径分布在一定范围内，因此使用时装柱重复性好，机械强度高，流速大幅度提高，成本低廉，适宜大规模工业化广泛使用。

Description

一种突变蛋白A(Protein A)亲和层析介质
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种突变蛋白A(Protein A)亲和层析介质。
背景技术
近年来，抗体药物发展迅速。2018年，全球销售额前10位的药物中有6个是抗体药物，且前5位均是抗体类药物。抗体药物的纯化通常采用经典的三步或两步层析法，而蛋白A(Protein A)亲和介质以蛋白A(Protein A)配基上多个区域对抗体Fc段独特的专一吸附能力，可用作抗体捕获步骤，一步工艺即可去除细胞发酵液中大部分的杂质，可达99％以上的纯度。随着抗体药物的发展，用作抗体捕获的亲和层析介质也取得了快速发展。
但蛋白A(Protein A)亲和层析介质较昂贵，可占抗体药物下游纯化工艺中层析介质成本的85％。因此，亲和层析介质的选择，不仅关系到产品的质量，还关系到产品的市场竞争力。蛋白A(Protein A)亲和层析介质在抗体纯化过程中会出现蛋白A(Protein A)配基脱落，这些工艺相关杂质若不能在后续工艺中很好地去除，则存在引起免疫反应的风险。早期的蛋白A(Protein A)亲和层析配基脱落严重，填料生产商致力于增加介质的化学耐受性，由此可降低填料的使用成本及提高制品的质量。因此，目前主流蛋白A(Protein A) 亲和层析介质如GE的MabSelect SuRe，为耐碱性介质，可耐0.1-0.5M NaOH清洗。这些稳定性增强的蛋白A(Protein A)亲和层析介质的清洗和消毒，可采用金标准氢氧化钠溶液进行，从而高效、低成本地除去附着在填料上的蛋白沉淀物、疏水性蛋白、核酸、内毒素和病毒等。
目前，国内抗体生产大都采用进口蛋白A(Protein A)亲和层析介质。如GE的MabSelect SuRe，其基质为高交联的琼脂糖微球，优点是亲水性极佳，生物相容性好，非常适合抗体类生物大分子的分离纯化；但缺点是：其一，结构偏软，粒径分布较宽，在实际使用过程中存在装柱重复性差，机械强度低等问题；其二，Mabselect Sure 在生物制药中一般使用0.1M NaOH清洗，其耐碱性能还有差距；其三， MabSelect Sure的动态载量>30g/L，对于大规模抗体生产的需求还有一点的差距。
Millipore公司的Prosep Ultra Plus也是一种使用较为广泛的蛋白A(ProteinA)亲和层析介质，基质为孔道可控的玻璃珠结构，物理稳定好，载量很高。但是，玻璃珠结构有一致命缺陷为其不可耐高浓度NaOH清洗这一金标准，因而限制其在大规模生物样品中应用。
因此，有必要解决上述技术问题。
发明内容
本发明提供一种突变蛋白A(Protein A)亲和层析介质，可以有效解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种突变蛋白A (Protein A)亲和层析介质，所述突变蛋白A(Protein A)亲和层析介质作为层析介质应用于抗体及Fc融合蛋白的分离纯化中；所述突变蛋白A(Protein A)亲和层析介质使用基因工程修饰葡萄球菌蛋白A(Protein A)、琼脂糖或葡聚糖凝胶的微球为基质，经亲水性树枝状大分子修饰、活化、偶联蛋白A(Protein A)配基并封尾后得到；所述突变蛋白A(Protein A)亲和层析介质为多孔微球介质，所述亲水性树枝状大分子修饰为在所述微球表面功能团上接枝亲水性树枝状大分子；所述亲水性树枝状大分子包括但不限于超支化聚乙烯醇或聚甘油类大分子；所述活化为在所述微球表面接上功能团，所述功能团包括但不限于环氧、氨基、羧基类功能团；所述偶联突变蛋白A(Protein A)配基，为将突变蛋白A(Protein A)配基偶联到所述微球活化后的表面功能团上；所述封尾指利用含有羟基、巯基或氨基类的小分子与偶联突变蛋白A(Protein A)配基后的微球表面的活性功能团进行反应，消除未反应的活性功能团。
进一步的，所述作为基质的含乙烯基单体、琼脂糖或葡聚糖凝胶的微球是粒径均一、多孔的微球。
进一步的，所述含乙烯基单体包含至少一种单乙烯基单体，或包含至少一种多乙烯基单体。
进一步的，所述含乙烯基单体高流速琼脂糖微球的直径范围为 5～150μm；所述含乙烯基单体的高流速琼脂糖微球的孔径范围为 50～100nm。
进一步的，所述突变蛋白A(Protein A)亲和层析介质，为对天然葡萄球菌蛋白A(Protein A)的B区域进行基因工程点突变，对碱性敏感的氨基酸序列进行基因工程点突变，将不耐碱的氨基酸取代，提高突变后蛋白的耐碱性>1M NaOH 15-30min。
进一步的，所述突变蛋白A(Protein A)亲和层析介质，为对天然葡萄球菌蛋白A(Protein A)的B区域进行基因工程点突变，提高蛋白A(Protein A)亲和层析介质的载量>55g/L。
进一步的，所述突变蛋白A(Protein A)亲和层析介质，作为层析介质应用于抗体及Fc融合蛋白的分离纯化时，以20mM PBS+150mM NaCl，pH7.0-pH8.0或50mM磷酸二氢钠+100mMNaAc+150mM NaCl， pH7.0-pH8.0等缓冲液作为平衡相，以50mM Gly，pH3.0-pH4.0等缓冲液作为洗脱相。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的蛋白A(Protein A)层析介质作为一种全新的材料用作层析介质，相对于现有技术中分离抗体及Fc融合蛋白的层析介质，流速大幅度提高，无论是分离效率，还是样品分离时间，都显示出了比较理想的分离效果，并能降低所需仪器的使用及维护成本，适合于抗体及Fc融合蛋白的快速、高效、大规模分离纯化。
本发明的蛋白A(Protein A)层析介质以含乙烯基单体高流速琼脂糖的微球为基质，粒径均一，孔径分布集中，使制备出来的蛋白A(Protein A)层析介质的粒径较均一，孔径分布集中，再加上蛋白A(Protein A)层析介质表面蛋白A (Protein A)配基，特别适合于分离抗体及Fc融合蛋白这类生物大分子。
本发明中的蛋白A(Protein A)层析介质结构稳定、软硬适中、粒径分布在一定范围内，因此使用时装柱重复性好，机械强度高，流速大幅度提高，成本低廉，适宜大规模工业化广泛使用。
附图说明
图1 构建大肠杆菌Pet32a质粒图(6PS1配基制备大肠杆菌表达质粒设计)。
图2 6PS1配基制备的琼脂糖亲和层析介质，在NaoH孵育下动态载量的变化(6PS1配基制备的亲和层析介质在0.1/0.5M NaOH孵育后，动态载量的变化)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一种突变蛋白A(Protein A)亲和层析介质，所述突变蛋白A (Protein A)亲和层析介质作为层析介质应用于抗体及Fc融合蛋白的分离纯化中；所述蛋白A(Protein A)亲和层析介质以含乙烯基单体、琼脂糖或葡聚糖凝胶的微球为基质，合适的含乙烯基单体包括、但不限于已知用于聚合过程的乙烯基单体，典型的乙烯基单体包括：苯乙烯、甲基苯乙烯、乙烯基甲苯的所有异构体、以及对乙烯基甲苯、乙基苯乙烯的所有异构体、丙基苯乙烯、乙烯基萘、乙烯基蒽、和其混合物。乙烯基单体也可以和其他可共聚的单体结合。该类单体的例子包括、但不限于烯腈类和丙烯酸酯类单体，如丙烯腈、甲基丙烯腈、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、及其混合物。
本发明的微球为多孔型，一般琼脂糖微球的孔径与琼脂糖的浓度成反比，即琼脂糖浓度越高，孔径越小。但是在实际琼脂糖微球的应用中，某些大颗粒样品(如病毒，质粒等)载量极低。这就影响层析介质的载量。在抗体分子量在150KD，直径在10-15nm左右；相对于传统的琼脂糖微球的孔径，抗体分子直径偏大；通过琼脂糖微球的改进，增加孔径的同时，不降低琼脂微球的结构。在微球乳化时加入制孔剂，可以有效的直径微球的孔径。适合本发明的制孔剂有C4～C10 的链烷醇包括丁醇，直链或支链的戊醇，己醇庚醇、辛醇、壬醇，癸醇，例如4一甲基戊基一2一醇(甲基异丁基甲醇)；七个或更多碳原子的烷基酯例如乙酸己酯，乙酸一2一乙基己酯，油酸甲酯，癸二酸二丁酯，己二酸二丁酯及碳酸二丁酯；脂肪族酮例如甲基异丁基酮，二异丁基甲酮；以及芳族烃例如甲苯，对位、邻位二甲苯，或以上所提的适当混合物。
本发明中所述蛋白A(Protein A)亲和层析介质的制备方法如下：将作为原料或基质的含乙烯基单体的高流速琼脂糖微球放入反应釜中，修饰亲水性树枝状大分子，清洗；然后，加入带有活性功能团的单体活化1～3h，清洗；加入待偶联的蛋白A(Protein A)配基，反应16-24h，清洗；最后，加入封尾试剂反应2-6h，清洗后即可得到蛋白A(Protein A)亲和层析介质。
其中，亲水性树枝状大分子包括但不限于超支化聚乙烯醇或聚甘油类大分子。
其中，活性功能团包括但不限于环氧、氨基、羧基类功能团。
其中，所述偶联的蛋白A(Protein A)可以为含有巯基的蛋白A (Protein A)分子。
其中，所述的封尾试剂可以是用含有羟基、巯基或氨基类的小分子试剂。
其中，得到的蛋白A(Protein A)亲和层析介质依次用磷酸缓冲盐、醋酸缓冲盐、水洗涤，即得制备好的蛋白A(Protein A)亲和层析介质，并用20％乙醇保存。
层析技术，随着不断地改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学及生物分离分析的重要手段。层析法是基于待分离的混合物在相对运动物的两相之间分布时，化学或物理性质的差异而使混合物相互分离的一类分离或分析方法。
取本实施例制备的蛋白A(Protein A)亲和层析介质1mL PP柱，用平衡液冲洗。AKTA purifier仪器在使用前，先用纯水冲洗并平衡，平衡后基线归零。20mM PBS，150mMNaCl，pH7.0和50mM Gly，pH3.0 分别作为平衡相及洗脱相，系统Pump Wash。将小柱连接至系统AKTA purifier，注意连接过程中防止气泡进入，连接时泵以一定流速运行，接头部分用流动相充分润湿，小柱上端也用流动相充满，然后连接。小柱依次用50mM Gly，pH3.0和20mM PBS，150mM NaCl，pH7.0各 10CV冲洗至基线平衡。开始以0.25mL/min进抗体细胞培养上清样，以5mL定量环进样mL，并用洗脱液洗脱抗体，待洗脱峰出现开始用事先放入0.1mL1M NaAc溶液的50mL EP管收集4.9mL，调pH值至 5.5。若电导高于5mS/cm，用纯水调至5mS/cm以下。可见，制备的蛋白A(Protein A)亲和层析介质可将抗体快速有效分离富集。
本实施例选用粒径为50μm，孔径为约100nm的乙烯基高流速琼脂糖微球为基球，使得制备的蛋白A(Protein A)亲和层析介质的直径和孔径也在一个大致范围内，用作为液相色谱的固定相，相对于现有技术中蛋白A(Protein A)亲和层析介质，流速可大幅度提高，无论是分离效率，还是样品分离时间，都显示出了理想的分离效果，适合于抗体快速高效分离富集。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
表1为突变蛋白A序列PS1蛋白序列。
表1：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 Val Asp Ala lys Phe ala Lys Glu Gln Gln
10 Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His leu Pro
20 asn leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe
30 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln
40 Ser ala asn leu leu ala glu ala lys lys
50 leu asn asp ala gln ala pro lys

Claims (10)

1.一种突变蛋白A（Protein A）（protein A）亲和层析介质，所述蛋白A（Protein A）亲和层析介质作为层析介质应用于抗体及Fc融合蛋白的分离纯化中，所述蛋白A（Protein A）亲和层析介质以含基因工程修饰葡萄球菌蛋白A（Protein A）、琼脂糖或葡聚糖凝胶的微球为基质，经亲水性树枝状大分子修饰、活化、偶联蛋白A（Protein A）配基并封尾后得到，所述修饰蛋白A（Protein A）亲和层析介质为多孔微球介质；所述亲水性树枝状大分子修饰为在所述微球表面功能团上接枝亲水性树枝状大分子，所述亲水性树枝状大分子包括但不限于超支化聚乙烯醇或聚甘油类大分子，所述活化为在所述微球表面接上功能团，所述功能团包括但不限于环氧、氨基、羧基类功能团，所述偶联突变蛋白A（Protein A）配基，为将蛋白A（Protein A）配基偶联到所述微球活化后的表面功能团上，所述封尾指利用含有羟基、巯基或氨基类的小分子与偶联蛋白A（Protein A）配基后的微球表面的活性功能团进行反应，消除未反应的活性功能团。
2.根据权利要求1所述的一种突变蛋白A（Protein A）亲和层析介质，其特征在于，所述作为基质琼脂糖或葡聚糖凝胶的物微球，是粒径均一多孔微球。
3.根据权利要求2所述的一种突变蛋白A（Protein A）亲和层析介质，其特征在于，所述含基因工程突变的蛋白A（Protein A），此蛋白A（Protein A）氨基酸序列来源于金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白，经过基因突变对NaoH敏感的氨基酸，替换为耐受NaOH的氨基酸，使得此蛋白A（Protein A）亲和层析介质具有耐受NaoH的能力。
4.根据权利要求2所述的一种蛋白A（Protein A）亲和层析介质，其特征在于，所述含乙烯基单体的微球的直径范围为5～150μm；所述含乙烯基单体的微球的孔径范围为50～100nm。
5.根据权利要求2所述的一种蛋白A（Protein A）亲和层析介质，其突变蛋白A（ProteinA）的特征在于所述蛋白A（Protein A）亲和层析介质的配基突变蛋白A（Protein A），为基因工程修饰的，突变的位点为，N3A-N6A-N23T，突变体PS1。
6.根据权利要求2所述的一种蛋白A（Protein A）亲和层析介质，其突变蛋白A（ProteinA）的特征在于，所述蛋白A（Protein A）亲和层析介质的配基突变蛋白A（Protein A），突变体以6 x PS1的基因系列，构建在大肠杆菌质粒中，形成6 x PS1突变体。
7.根据权利要求2所述的一种蛋白A（Protein A）亲和层析介质，其突变蛋白A（ProteinA）的特征在于，此6PS1突变体配基，基因工程修饰的主要目的是：使其具对氢氧化钠有更高的稳定性。
8.根据权利要求1所述的一种蛋白A（Protein A）亲和层析介质，其特征在于，此 6PS1突变体配基与含乙烯基单体的高流速琼脂糖微球偶联后形成的亲和层析介质，提高了对氢氧化钠的稳定性,此蛋白A（Protein A）亲和层析介质耐受>1M NaOH 。
9.根据权利要求1所述的一种蛋白A（Protein A）亲和层析介质，其特征在于，所述蛋白A（Protein A）亲和层析介质作为层析介质应用于抗体及Fc融合蛋白的分离纯化时，以20mMPBS+150mM NaCl，pH7.0-pH8.0或50mM磷酸二氢钠+100mMNaAc+150mM NaCl，pH7.0-pH8.0等缓冲液作为平衡相，以50mM Gly，pH3.0-pH4.0等缓冲液作为洗脱相。
10.根据权利要求1所述的一种蛋白A（Protein A）亲和层析介质，其特征在于，所述蛋白A（Protein A）亲和层析介质作为层析介质应用于抗体及Fc融合蛋白的分离纯化时，以此6PS1突变体制备的琼脂糖亲和层析介质具有更高的载量，一般对于抗体分子动态载量>55g/L, 一般对于Fc融合蛋白分子动态载量>45g/L。
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Dordick Patents and literature
Dordick Patents and literature: Affinity-based separations and purifications

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