CN111662888A - 一种具有高热稳定性的黄递酶突变体、基因及其制备方法 - Google Patents

一种具有高热稳定性的黄递酶突变体、基因及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有高热稳定性的黄递酶突变体、基因及其制备方法，其中，黄递酶突变体是将野生型黄递酶氨基酸序列的第122位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸获得的，黄递酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该黄递酶突变体的酶学性质与野生型黄递酶相同，且其热稳定性显著高于野生型黄递酶，pH的稳定范围较广；该黄递酶突变体的制备方法采用基因工程手段，将黄递酶突变体基因克隆到表达载体，转化宿主细胞进行原核表达，可获得大量高稳定性黄递酶突变体，为临床诊断试剂的开发提供大量原料，降低生产成本。

Description

一种具有高热稳定性的黄递酶突变体、基因及其制备方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种具有高热稳定性的黄递酶突变体、基因及其制备方法。
背景技术
黄递酶(Diaphorases)，简称DIA，又称心肌黄酶、硫辛酰胺脱氢酶。黄递酶在体内的电子传递系统中起着重要的作用，能催化二氢硫辛酰胺或二氢硫辛酸脱氢，分别成为硫辛酰胺和硫辛酸外，也可催化人工电子受体还原，如某些染料、铁氰酸盐、醌等。脱去的两个氢能将FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)还原为FADH2，再传递给NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸+)而形成NADH和H+。此外，黄递酶在体外的应用也得到了了大量的研究，例如在生产有用的材料、能源相关材料、环境保护、医学等领域中的应用，并且其中一些已经得到了实际应用。例如，在临床诊断领域，以还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸磷酸根(NADPH)为底物，利用黄递酶的特性，用于形成各种体外诊断试剂，例如可用于β-羟丁酸测定试剂盒，用来测定血清中β-羟丁酸含量。此外，黄递酶还可用作酶电池，属于燃料电池的一种。
黄递酶可从猪心肌中提取，也可以由嗜热脂肪芽孢杆菌或克氏梭菌等微生物发酵产生。而从动物的心肌中提取黄递酶不仅操作复杂，而且产量低，不便于规模化生产。而我国目前黄递酶主要依赖于进口，价格昂贵，且目前现有的黄递酶热稳定性差，用于β-羟丁酸测定试剂盒不利于准确测定β-羟丁酸含量。因此，需要一种可大量生产具有高热稳定性黄递酶的方法。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种具有高热稳定性的黄递酶突变体、基因及其制备方法，该黄递酶突变体的酶学性质与野生型黄递酶相同，且其热稳定性显著高于野生型黄递酶，pH的稳定范围较广；该黄递酶突变体的制备方法采用基因工程手段，将黄递酶突变体基因克隆到表达载体，转化宿主细胞进行原核表达，可获得大量高稳定性黄递酶突变体，为临床诊断试剂的开发提供大量原料，降低生产成本。
为了解决上述问题，本发明的一方面提供一种具有高热稳定性的黄递酶突变体，所述黄递酶突变体是将野生型黄递酶氨基酸序列的第122位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸获得的，所述黄递酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明对氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的野生型黄递酶的第122位氨基酸进行突变，将野生型黄递酶的第122位由甘氨酸突变为天冬氨酸，获得的黄递酶突变体与野生型黄递酶、现有进口的黄递酶相比，酶学性质接近，且其热稳定性显著高于野生型黄递酶，pH适用范围广。
所述SEQ ID NO：1的序列结构如下：
MAKVLYITAHPHDDTQSYSMAVGKAFIETYKQVHPDHEVIHLDLYKEYIPEIDVDVFSGWGKLRSGQSFEQLSAEEKTKVGRMNELCDQFISADKYVFVTPMWNFSFPPVLKAYIDAVAVADKTFKYTAQGPIGLLTDKKALHIQARGGFYSEGPAAQMEMGHRYLEIIMQFFGVPSFEGLFVEGHAAVPEKAEEIKANAIARAKELAHTF。
所述SEQ ID NO：3的序列结构如下：
MAKVLYITAHPHDDTQSYSMAVGKAFIETYKQVHPDHEVIHLDLYKEYIPEIDVDVFSGWGKLRSGQSFEQLSAEEKTKVGRMNELCDQFISADKYVFVTPMWNFSFPPVLKAYIDAVAVAGKTFKYTAQGPIGLLTDKKALHIQARGGFYSEGPAAQMEMGHRYLEIIMQFFGVPSFEGLFVEGHAAVPEKAEEIKANAIARAKELAHTF。
本发明的另一方面提供一种具有高热稳定性的黄递酶突变体基因，所述黄递酶突变体基因编码上述的具有高热稳定性的黄递酶突变体。
按照大肠杆菌的密码子偏好性对上述氨基酸序列的编码基因进行优化，获得适合大肠杆菌表达的DNA序列，优选地，黄递酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述SEQ ID NO：2的序列结构如下：
atggctaaagttctgtacatcaccgctcacccgcacgacgacacccagtcttactctatggctgttggtaaagctttcatcgaaacctacaaacaggttcacccggaccacgaagttatccacctggacctgtacaaagaatacatcccggaaatcgacgttgacgttttctctggttggggtaaactgcgttctggtcagtctttcgaacagctgtctgctgaagaaaaaaccaaagttggtcgtatgaacgaactgtgcgaccagttcatctctgctgacaaatacgttttcgttaccccgatgtggaacttctctttcccgccggttctgaaagcttacatcgacgctgttgctgttgctgacaaaaccttcaaatacaccgctcagggtccgatcggtctgctgaccgacaaaaaagctctgcacatccaggctcgtggtggtttctactctgaaggtccggctgctcagatggaaatgggtcaccgttacctggaaatcatcatgcagttcttcggtgttccgtctttcgaaggtctgttcgttgaaggtcacgctgctgttccggaaaaagctgaagaaatcaaagctaacgctatcgctcgtgctaaagaactggctcacaccttc。
本发明的再一方面提供一种重组载体，所述重组载体含有上述的黄递酶突变体基因。所述重组载体可以为质粒、λ噬菌体的衍生物或动植物病毒，优选地，所述重组载体为质粒。质粒优选为pET28a。
本发明的再一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的黄递酶突变体基因。所述宿主细胞可以是大肠杆菌，枯草杆菌，土壤农杆菌，酵母菌和动植物细胞中的一种。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明的再一方面提供一种试剂盒，包含上述的具有高热稳定性的黄递酶突变体。优选地，所述试剂盒为β-羟丁酸测定试剂盒。
本发明的再一方面提供一种制备高热稳定性黄递酶突变体的方法，包括以下步骤：
S1.构建高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株，所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株含有上述的黄递酶突变体基因；
S2.将所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株接种于种子培养基中，进行种子培养；
S3.将种子培养后的所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株接种于发酵培养基中，进行发酵培养，得到所述高热稳定性黄递酶突变体。
本发明利用基因工程方法，先构建出具有黄递酶突变体基因的基因工程菌株，然后对基因工程菌株进行培养并发酵，以实现黄递酶突变体的原核表达，经分离、纯化可获得大量黄递酶突变体，该黄递酶突变体的酶学性质与野生型黄递酶相同，且其热稳定性显著高于野生型黄递酶，pH适用范围广，可通过该方法大量生产，为临床诊断试剂的开发提供大量原料，降低生产成本。
优选地，步骤S1包括以下步骤：
S101.合成所述的黄递酶突变体基因；
S102.将所述黄递酶突变体基因克隆至表达载体，得到重组载体，所述表达载体为pET28a；
S103.将所述重组载体转入感受态细胞，筛选阳性转化子，得到所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株，所述感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
进一步优选地，步骤S1包括以下步骤：
S101.根据如SEQ ID NO：2的序列合成黄递酶突变体基因，并通过上游引物、下游引物以所述黄递酶突变体基因为模板扩增所述黄递酶突变体基因，其中，所述上游引物具有如SEQ ID NO：4所述的序列，所述下游引物具有如SEQ ID NO：5所述的序列，
所述SEQ ID NO：4的序列结构如下：
5’-GGGAATTCCATATGATGGCTAAACTGCTG-3’。
所述SEQ ID NO：5的序列结构如下：
5’-CCGCTCGAGTTAGAAGTTTTTAGC-3’。
S102.将扩增产物与表达载体分别进行双酶切后，用连接酶进行连接，使所述黄递酶突变体基因克隆至表达载体；
S103.将所述表达载体转入感受态细胞，筛选阳性转化子，得到所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株，所述感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
优选地，步骤S2具体为：
取所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株接种到LB培养基，于25-40℃、100-200rpm的搅拌条件下培养10-20h。
进一步优选地，步骤S2具体为：
取所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株接种到LB培养基，于37℃、120rpm的搅拌条件下培养12h。
优选地，步骤S3包括以下步骤：
S301.将步骤S2中种子培养得到的菌液以1％-10％的接种量转入TB液体培养基中，于25-40℃、100-200rpm搅拌条件下，培养至OD600为0.7-0.8；
S302.将步骤S301所得菌液于10-20℃、100-200rpm搅拌条件下培养18-20h得到发酵液；
S303.离心处理所述发酵液，除去上清液，加入磷酸钾缓冲悬浮细胞，并对细胞进行破碎处理；
S304.对破碎后的细胞进行离心分离，取离心分离上清液用亲和层析的方法进行纯化，得到所述高热稳定性黄递酶突变体。
进一步优选地，步骤S3包括以下步骤：
S301.将步骤S2中种子培养得到的菌液按5％的接种量转入1L的TB液体培养基(50μg/mL卡那霉素)中，于37℃、120rpm搅拌条件下，培养至OD600为0.7-0.8；
S302.将步骤S301所得菌液于16℃、120rpm搅拌条件下培养18-20h得到发酵液；
S303.6000rpm离心处理20min所述发酵液，除去上清液，加入0.1M的磷酸钾悬浮细胞，在冰浴条件下利用超声波细胞粉碎机对细胞进行破碎处理；
S304.于4℃、10000rpm的条件下对破碎后的细胞进行离心分离30min，取离心分离上清液，用亲和层析的方法进行纯化，得到所述高热稳定性黄递酶突变体。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1.本发明对野生型黄递酶的第122位氨基酸进行突变，将野生型黄递酶的第122位由甘氨酸突变为天冬氨酸，获得的黄递酶突变体与野生型黄递酶、现有进口的黄递酶相比，酶学性质接近，且其热稳定性显著高于野生型黄递酶，pH适用范围广。
2.本发明利用基因工程方法，先构建出具有黄递酶突变体基因的基因工程菌株，然后对基因工程菌株进行培养并发酵，以实现黄递酶突变体的原核表达，经分离、纯化可获得大量黄递酶突变体，该黄递酶突变体的酶学性质与野生型黄递酶相同，且其热稳定性显著高于野生型黄递酶，pH适用范围广，可通过该方法大量生产，为临床诊断试剂的开发提供大量原料，降低生产成本。
附图说明
图1是本发明实施例2中pET28a-DIA质粒的电泳图；
图2是本发明实施例2中纯化高热稳定性的黄递酶突变体的SDS-PAGE电泳图；
图3是本发明实施例3中高热稳定性的黄递酶突变体的Km曲线；
图4是本发明实施例3中高热稳定性的黄递酶突变体的最适pH曲线；
图5是本发明实施例3中高热稳定性的黄递酶突变体的pH稳定性曲线；
图6是本发明实施例3中高热稳定性的黄递酶突变体的最适温度曲线；
图7是本发明实施例3中高热稳定性的黄递酶突变体的温度稳定性曲线；
图8是本发明实施例4中高热稳定性的黄递酶突变体用于β-羟丁酸测定试剂盒中测定样本β-羟丁酸含量图；
图9是本发明实施例4中高热稳定性的黄递酶突变体用于β-羟丁酸测定试剂盒中稳定性测试图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1具有高热稳定性的黄递酶突变体基因的设计
以本发明的具有高热稳定性的黄递酶突变体的氨基酸序列为基础，对该序列按照大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，得到具有高热稳定性的黄递酶突变体基因，具有高热稳定性的黄递酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，优化后的黄递酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述SEQ ID NO.1的序列结构如下：
MAKVLYITAHPHDDTQSYSMAVGKAFIETYKQVHPDHEVIHLDLYKEYIPEIDVDVFSGWGKLRSGQSFEQLSAEEKTKVGRMNELCDQFISADKYVFVTPMWNFSFPPVLKAYIDAVAVADKTFKYTAQGPIGLLTDKKALHIQARGGFYSEGPAAQMEMGHRYLEIIMQFFGVPSFEGLFVEGHAAVPEKAEEIKANAIARAKELAHTF。
所述SEQ ID NO.2的序列结构如下：
Atggctaaagttctgtacatcaccgctcacccgcacgacgacacccagtcttactctatggctgttggtaaagctttcatcgaaacctacaaacaggttcacccggaccacgaagttatccacctggacctgtacaaagaatacatcccggaaatcgacgttgacgttttctctggttggggtaaactgcgttctggtcagtctttcgaacagctgtctgctgaagaaaaaaccaaagttggtcgtatgaacgaactgtgcgaccagttcatctctgctgacaaatacgttttcgttaccccgatgtggaacttctctttcccgccggttctgaaagcttacatcgacgctgttgctgttgctgacaaaaccttcaaatacaccgctcagggtccgatcggtctgctgaccgacaaaaaagctctgcacatccaggctcgtggtggtttctactctgaaggtccggctgctcagatggaaatgggtcaccgttacctggaaatcatcatgcagttcttcggtgttccgtctttcgaaggtctgttcgttgaaggtcacgctgctgttccggaaaaagctgaagaaatcaaagctaacgctatcgctcgtgctaaagaactggctcacaccttc。
实施例2具有高热稳定性的黄递酶突变体的制备
本实施例所述的具有高热稳定性的黄递酶突变体的制备方法包括以下步骤：
S1.构建高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株：
S101.根据如SEQ ID NO：2的序列对黄递酶突变体基因进行全基因合成，并通过上游引物、下游引物以黄递酶突变体基因为模板扩增黄递酶突变体基因，其中，所述上游引物具有如SEQ ID NO：4所述的序列，所述下游引物具有如SEQ ID NO：5所述的序列，
所述SEQ ID NO：4的序列结构如下：
5’-GGGAATTCCATATGATGGCTAAACTGCTG-3’。
所述SEQ ID NO：5的序列结构如下：
5’-CCGCTCGAGTTAGAAGTTTTTAGC-3’。
S102.将扩增产物与表达载体(pET28a)分别进行双酶切后，用连接酶TaKaRa进行连接，将黄递酶突变体基因克隆至表达载体pET28a上，得到重组质粒，记为pET28a-DIA，如图1所示为重组质粒pET28a-DIA的电泳图，其中1为标准DNA分子量，2、3为pET28a-DIA质粒；
S103.将重组质粒pET28a-DIA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司)，并在卡那霉素抗性平板进行阳性转化子筛选，得到高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株。
S2.高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株种子培养：
挑取筛选得到的单克隆黄递酶突变体基因工程菌株接种到LB培养基，于37℃、120rpm的条件下培养12h。
S3.高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株发酵培养：
S301.将种子培养得到的菌液按5％的接种量转入1L的TB液体培养基(50μg/mL卡那霉素)中，于37℃、120rpm的条件下，培养至OD600为0.7-0.8；
S302.将步骤S301所得菌液转至16℃、120rpm的条件下培养18-20h得到发酵液；
S303.6000rpm离心处理发酵液20min，除去上清液，加入0.1M的磷酸钾(pH7.5，含5mg/L FAD)缓冲悬浮细胞，在冰浴条件下利用超声波细胞粉碎机对重组大肠杆菌进行破碎处理；
S304.于4℃、10000rpm的条件下对破碎后的悬浮液进行离心分离30min，取离心分离上清液，用亲和层析的方法对上清液中的黄递酶突变体进行纯化，得到高热稳定性黄递酶突变体，亲和层析的方法具体为：先用0.1M磷酸钾(pH7.5，含5mg/L FAD)缓冲液冲洗平衡镍柱，以5ml/min流速上样；上样完成后用0.1M磷酸钾(pH7.5，含5mg/L FAD、10mM咪唑)缓冲液洗去杂蛋白；用0.1M磷酸钾(pH7.5，含5mg/L FAD、500mM咪唑)缓冲液洗脱黄递酶突变体。洗脱下的黄递酶突变体过G25凝胶柱脱盐即得到纯的高热稳定性黄递酶突变体，于-20℃保存。如图2所示为SDS-PAGE分析图，其中，1为标准蛋白质分子量；2为过镍柱后的流出液；3、4为纯化后的高热稳定性黄递酶突变体，由图可见，已达到纯化效果。
实施例3高热稳定性黄递酶突变体的酶学性质测定
黄递酶突变体的测活方法：
步骤一、反应混合液配置：0.50ml的0.2M KH2PO4-NaOH溶液(pH 7.5)、0.10ml的0.25％(W/V)NTB(四唑硝基蓝)溶液、0.10ml的1％(W/V)BSA溶液、0.10ml的10mM NADH溶液、0.20ml蒸馏水。反应混合液需现配现用，放置在冰上。
步骤二、酶活的测定：取上述反应混合液1ml，置于1.2ml比色皿中，放入分光光度计37℃保温3min，加入100μL稀释的酶，37℃反应7分钟，550nm持续测定吸光度。记录1min内的吸光度变化ΔA。
黄递酶突变体酶活力定义：1个酶活单位等于在以上反应条件下1min氧化1μMNADH所需的酶量。
黄递酶突变体活力计算公式：
酶活(U/L)＝ΔA×Vt×df×1000/(12.4×Vs)＝887.1×ΔA×df
ΔA：1min内吸光度的变化，Vt：反应液总体积，df：酶液稀释倍数，12.4：甲臜在550nm的毫摩尔吸光系数，Vs加入酶液体积。
黄递酶突变体米氏常数Km值的测定：将底物NADH进行2倍梯度稀释，测定在不同浓度NADH条件下的黄递酶突变体活力。以NADH浓度为横坐标，酶活为纵坐标，采用GraphPadPrism 6软件分析米氏常数Km(如图3所示)。结果表明，该黄递酶突变体的米氏常数Km值为0.1347。
最适pH和pH稳定性：采用不同pH的0.2M缓冲液代替反应混合液的0.2M KH2PO4-NaOH溶液(pH 7.5)，其他条件不变的情况下测量黄递酶突变体酶活，以pH为横坐标，酶活为纵坐标作图，最高点即最适pH为6.5(如图4所示)。将酶液以不同pH的0.1M缓冲液稀释，37℃放置1h，按照标准酶活测定方法测定其酶活。以pH为横坐标，酶活为纵坐标作图(如图5所示)。结果表明，pH在5-9保持较高的稳定性，pH在小于5和大于10的缓冲液中迅速降低。表明该黄递酶突变体pH的稳定范围较广，在弱酸性和弱碱性条件下酶活都很稳定。
最适温度和温度稳定性：将酶放置在不同温度下反应测量酶活，以温度为横坐标，酶活为纵坐标作图(如图6所示)，结果表明，在20-40度之间酶活不断上升，最适酶活可能为40℃或者更高。将酶稀释后放置在不同温度下反应15min，按照标准测活方法测量酶活，以温度为横坐标，酶活为纵坐标作图(如图7所示)，结果表明，该黄递酶突变体在小于等于60℃时能保持较好的活性，大于60℃酶活开始降低。该黄递酶突变体具有较高的温度稳定性。
实施例4高热稳定性黄递酶突变体在β-羟丁酸测定试剂盒中应用效果评价
将上述实施例2得到的高热稳定性黄递酶突变体添加到β-羟丁酸测定试剂盒中，与进口的黄递酶(野生型黄递酶)(购自于东洋纺公司)对比测量同一血清样本中β-羟丁酸含量，结果显示，以水为对照(S1)，本发明的高热稳定性黄递酶突变体和进口黄递酶检测数值ΔA和K值相近(如图8所示)。而在37℃加热14天后，本发明的高热稳定性黄递酶突变体依然能准确测量数值，且稳定性高于进口的黄递酶(如图9所示)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 北京达成生物科技有限公司
<120> 一种具有高热稳定性的黄递酶突变体、基因及其制备方法
<130> 2020
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Met Ala Lys Val Leu Tyr Ile Thr Ala His Pro His Asp Asp Thr Gln
1 5 10 15
Ser Tyr Ser Met Ala Val Gly Lys Ala Phe Ile Glu Thr Tyr Lys Gln
20 25 30
Val His Pro Asp His Glu Val Ile His Leu Asp Leu Tyr Lys Glu Tyr
35 40 45
Ile Pro Glu Ile Asp Val Asp Val Phe Ser Gly Trp Gly Lys Leu Arg
50 55 60
Ser Gly Gln Ser Phe Glu Gln Leu Ser Ala Glu Glu Lys Thr Lys Val
65 70 75 80
Gly Arg Met Asn Glu Leu Cys Asp Gln Phe Ile Ser Ala Asp Lys Tyr
85 90 95
Val Phe Val Thr Pro Met Trp Asn Phe Ser Phe Pro Pro Val Leu Lys
100 105 110
Ala Tyr Ile Asp Ala Val Ala Val Ala Asp Lys Thr Phe Lys Tyr Thr
115 120 125
Ala Gln Gly Pro Ile Gly Leu Leu Thr Asp Lys Lys Ala Leu His Ile
130 135 140
Gln Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Ser Glu Gly Pro Ala Ala Gln Met Glu
145 150 155 160
Met Gly His Arg Tyr Leu Glu Ile Ile Met Gln Phe Phe Gly Val Pro
165 170 175
Ser Phe Glu Gly Leu Phe Val Glu Gly His Ala Ala Val Pro Glu Lys
180 185 190
Ala Glu Glu Ile Lys Ala Asn Ala Ile Ala Arg Ala Lys Glu Leu Ala
195 200 205
His Thr Phe
210
<210> 2
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atggctaaag ttctgtacat caccgctcac ccgcacgacg acacccagtc ttactctatg 60
gctgttggta aagctttcat cgaaacctac aaacaggttc acccggacca cgaagttatc 120
cacctggacc tgtacaaaga atacatcccg gaaatcgacg ttgacgtttt ctctggttgg 180
ggtaaactgc gttctggtca gtctttcgaa cagctgtctg ctgaagaaaa aaccaaagtt 240
ggtcgtatga acgaactgtg cgaccagttc atctctgctg acaaatacgt tttcgttacc 300
ccgatgtgga acttctcttt cccgccggtt ctgaaagctt acatcgacgc tgttgctgtt 360
gctgacaaaa ccttcaaata caccgctcag ggtccgatcg gtctgctgac cgacaaaaaa 420
gctctgcaca tccaggctcg tggtggtttc tactctgaag gtccggctgc tcagatggaa 480
atgggtcacc gttacctgga aatcatcatg cagttcttcg gtgttccgtc tttcgaaggt 540
ctgttcgttg aaggtcacgc tgctgttccg gaaaaagctg aagaaatcaa agctaacgct 600
atcgctcgtg ctaaagaact ggctcacacc ttc 633
<210> 3
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Met Ala Lys Val Leu Tyr Ile Thr Ala His Pro His Asp Asp Thr Gln
1 5 10 15
Ser Tyr Ser Met Ala Val Gly Lys Ala Phe Ile Glu Thr Tyr Lys Gln
20 25 30
Val His Pro Asp His Glu Val Ile His Leu Asp Leu Tyr Lys Glu Tyr
35 40 45
Ile Pro Glu Ile Asp Val Asp Val Phe Ser Gly Trp Gly Lys Leu Arg
50 55 60
Ser Gly Gln Ser Phe Glu Gln Leu Ser Ala Glu Glu Lys Thr Lys Val
65 70 75 80
Gly Arg Met Asn Glu Leu Cys Asp Gln Phe Ile Ser Ala Asp Lys Tyr
85 90 95
Val Phe Val Thr Pro Met Trp Asn Phe Ser Phe Pro Pro Val Leu Lys
100 105 110
Ala Tyr Ile Asp Ala Val Ala Val Ala Gly Lys Thr Phe Lys Tyr Thr
115 120 125
Ala Gln Gly Pro Ile Gly Leu Leu Thr Asp Lys Lys Ala Leu His Ile
130 135 140
Gln Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Ser Glu Gly Pro Ala Ala Gln Met Glu
145 150 155 160
Met Gly His Arg Tyr Leu Glu Ile Ile Met Gln Phe Phe Gly Val Pro
165 170 175
Ser Phe Glu Gly Leu Phe Val Glu Gly His Ala Ala Val Pro Glu Lys
180 185 190
Ala Glu Glu Ile Lys Ala Asn Ala Ile Ala Arg Ala Lys Glu Leu Ala
195 200 205
His Thr Phe
210
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gggaattcca tatgatggct aaactgctg 29
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ccgctcgagt tagaagtttt tagc 24

Claims (10)

1.一种具有高热稳定性的黄递酶突变体，其特征在于，所述黄递酶突变体是将野生型黄递酶氨基酸序列的第122位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸获得的，所述黄递酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种具有高热稳定性的黄递酶突变体基因，其特征在于，所述黄递酶突变体基因编码如权利要求1所述的具有高热稳定性的黄递酶突变体。
3.根据权利要求2所述的具有高热稳定性的黄递酶突变体基因，其特征在于，所述黄递酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有如权利要求2或3所述的黄递酶突变体基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求2或3所述的黄递酶突变体基因。
6.一种试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的具有高热稳定性的黄递酶突变体。
7.一种制备高热稳定性黄递酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.构建高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株，所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株含有如权利要求2或3所述的黄递酶突变体基因；
S2.将所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株接种于种子培养基中，进行种子培养；
S3.将种子培养后的所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株接种于发酵培养基中，进行发酵培养，得到所述高热稳定性黄递酶突变体。
8.根据权利要求7所述的制备高热稳定性黄递酶突变体的方法，其特征在于，步骤S1包括以下步骤：
S101.合成所述黄递酶突变体基因；
S102.将所述黄递酶突变体基因克隆至表达载体，得到重组载体，所述表达载体为pET28a；
S103.将所述重组载体转入感受态细胞，筛选阳性转化子，得到所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株，所述感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
9.根据权利要求7所述的制备高热稳定性黄递酶突变体的方法，其特征在于，步骤S2具体为：
取所述高热稳定性黄递酶突变体基因工程菌株接种到LB培养基，于25-40℃、100-200rpm的条件下培养10-20h。
10.根据权利要求7所述的制备高热稳定性黄递酶突变体的方法，其特征在于，步骤S3包括以下步骤：
S301.将步骤S2中种子培养得到的菌液以1％-10％的接种量转入TB液体培养基中，于25-40℃、100-200rpm的条件下，培养至OD600为0.7-0.8；
S302.将步骤S301所得菌液于10-20℃、100-200rpm的条件下培养18-20h得到发酵液；
S303.离心处理所述发酵液，除去上清液，加入磷酸钾缓冲悬浮细胞，并对细胞进行破碎处理；
S304.对破碎后的细胞进行离心分离，取离心分离上清液用亲和层析的方法进行纯化，得到所述高热稳定性黄递酶突变体。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114605508A (zh) * 2022-05-11 2022-06-10 北京达成生物科技有限公司 能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白及其应用
CN114990087A (zh) * 2022-04-29 2022-09-02 西北工业大学 一种固定化fad合成酶及用于催化制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法
CN115786289A (zh) * 2022-09-27 2023-03-14 北京达成生物科技有限公司 抗坏血酸氧化酶

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107267474A (zh) * 2017-08-02 2017-10-20 中国农业大学 一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107267474A (zh) * 2017-08-02 2017-10-20 中国农业大学 一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114990087A (zh) * 2022-04-29 2022-09-02 西北工业大学 一种固定化fad合成酶及用于催化制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法
CN114990087B (zh) * 2022-04-29 2024-03-12 陕西永磊生物科技有限公司 一种固定化fad合成酶及用于催化制备黄素腺嘌呤二核苷酸的方法
CN114605508A (zh) * 2022-05-11 2022-06-10 北京达成生物科技有限公司 能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白及其应用
CN114605508B (zh) * 2022-05-11 2022-07-29 北京达成生物科技有限公司 能够结合于抗体分子Fc区域的抗体结合蛋白及其应用
CN115786289A (zh) * 2022-09-27 2023-03-14 北京达成生物科技有限公司 抗坏血酸氧化酶
CN115786289B (zh) * 2022-09-27 2023-06-06 北京达成生物科技有限公司 抗坏血酸氧化酶

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